JP2023550742A - エリスロポエチンバリアント及びその使用 - Google Patents

エリスロポエチンバリアント及びその使用 Download PDF

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チュラポーン ファンデーション
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Abstract

ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）バリアントが開示される。ＥＰＯバリアントは、免疫原性を低下させる１つ以上の変異を含む。ＥＰＯバリアントは、ＥＰＯに関連する障害、例えば貧血を治療又は予防するために使用され得る。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月１８日に出願された米国仮出願第６３／１１５，２０８号の優先権を主張する。前述の出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２１年１１月１２日に作成された当該ＡＳＣＩＩコピーの名称はＣ２２３８－７０００ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは５１，４９８バイトである。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、腎臓によって産生されるタンパク質ホルモンであり、肺から体の残りの部分に酸素を運ぶ赤血球（ＲＢＣ）の産生及び成熟において必須の役割を果たす。組換えヒトエリスロポエチン（ｒＨｕＥＰＯ）は、ヘモグロビンレベルが不十分な対象、例えば貧血を有する対象及び／又は十分な量の内因性ＥＰＯを産生することができない対象、例えば慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）、ＨＩＶ感染症又は悪性腫瘍を有する対象、及び透析に依存する対象に投与することができる。ｒＨｕＥＰＯはまた、手術、化学療法後及び移植後の赤血球生成を促進するために使用されている（Ｎｇ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｐｏｓｔｇｒａｄ．Ｍｅｄ．Ｊ．（２００３）７９：３６７－３７６）。ｒＨｕＥＰＯによる治療は、貧血を有する対象の生活の質（ＱｏＬ）を改善することが示されている（Ｈｏｒｌ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（１９９６）１１：２４６－２５０；Ｋａｎｅｋｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．（２００３）６３：１０８６－１０９３）。しかしながら、ｒＨｕＥＰＯを用いた貧血の治療の進歩にもかかわらず、ＥＰＯ欠乏に関連する貧血又は関連障害を含む貧血を治療及び予防するための新しい薬剤（例えば、ＥＰＯポリペプチドバリアント）を含む新しいアプローチを開発する必要性が満たされていない。
一態様では、本開示は、本明細書に開示される位置に変異を含むＥＰＯ分子、例えば本明細書に開示される１つ以上の機能的特性を有するＥＰＯ分子を特徴とする。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１２～１５２位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の７４～８２位、１０２～１１６位又は１４２～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の７４～８２位又は１０２～１１６位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の７４～８２位又は１４２～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１０２～１１６位又は１４２～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の７４～８２位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１０２～１１６位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１０２～１１０位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１０８～１１６位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１４２～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１４２～１５０位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１４５～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の７４、７５、７６、７７、７９、８０、８１、８２、１０２、１０５、１０６、１０９、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１４２、１４５、１４６、１４８、１４９、１５２、又は１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１２、１５、６７、７０、７４、１０２、１０５、１０６、１０９、１１４、１４６、１４９、又は１５２位のいずれかに対応する位置に変異を含む。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、複数の位置（例えば、本明細書に開示される複数の変異）に複数の変異（例えば、本明細書に開示される複数の変異）を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、本明細書に開示される第２の位置に第２の変異を更に含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、本明細書に開示される第３の位置に第３の変異を更に含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、本明細書に開示される第４の位置に第４の変異を更に含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、本明細書に開示される第５の位置に第５の変異を更に含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、本明細書に開示される第６の位置に第６の変異を更に含む。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１２位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＬ１２Ａ置換である。一実施形態では、変異はＬ１２Ｉ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１５位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＹ１５Ｉ置換である。一実施形態では、変異はＹ１５Ｗ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の６７位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＬ６７Ｄ置換である。一実施形態では、変異はＬ６７Ｎ置換である。一実施形態では、変異はＬ６７Ｖ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の７０位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＬ７０Ｖ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の７４位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＶ７４Ｄ置換である。一実施形態では、変異はＶ７４Ｌ置換である。一実施形態では、変異はＶ７４Ｎ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１０２位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＬ１０２Ｄ置換である。一実施形態では、変異はＬ１０２Ｎ置換である。一実施形態では、変異はＬ１０２Ｉ置換である。一実施形態では、変異はＬ１０２Ｔ置換である。一実施形態では、変異はＬ１０２Ｖ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１０５位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＬ１０５Ｆ置換である。一実施形態では、変異はＬ１０５Ｓ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１０６位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＴ１０６Ａ置換である。一実施形態では、変異はＴ１０６Ｇ置換である。一実施形態では、変異はＴ１０６Ｈ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１０９位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＬ１０９Ａ置換である。一実施形態では、変異はＬ１０９Ｃ置換である。一実施形態では、変異はＬ１０９Ｗ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１１４位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＡ１１４Ｃ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１４６位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＳ１４６Ｎ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１４９位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＬ１４９Ｖ置換である。一実施形態では、変異はＬ１４９Ｗ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の１５２位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異はＫ１５２Ｑ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１の６７及び１０２位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異は、Ｌ６７Ｖ及びＬ１０２Ｖ置換である。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、７０、７４、及び１０２位に対応する位置に変異を含む。
一実施形態では、変異は、Ｌ７０Ｖ、Ｖ７４Ｌ及びＬ１０２Ｉ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、６７、７４、及び１０２位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異は、Ｌ６７Ｎ、Ｖ７４Ｎ及びＬ１０２Ｄ置換である。一実施形態では、変異は、Ｌ６７Ｄ、Ｖ７４Ｄ及びＬ１０２Ｎ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、１２、１５，１０５、及び１４９位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異は、Ｌ１２Ａ、Ｙ１５Ｉ、Ｌ１０５Ｆ及びＬ１４９Ｗ置換である。一実施形態では、変異は、Ｌ１２Ｉ、Ｙ１５Ｗ、Ｌ１０５Ｓ及びＬ１４９Ｖ置換である。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、１０９及び１１４位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異は、Ｌ１０９Ｃ及びＡ１１４Ｃ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、１０２、１０５、１０６及び１０９位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異は、Ｌ１０２Ｔ、Ｌ１０５Ｓ、Ｔ１０６Ｈ及びＬ１０９Ｗ置換である。一実施形態では、変異はＬ１０２Ｔ、Ｌ１０５Ｓ、Ｔ１０６Ｇ及びＬ１０９Ｗ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、１４６及び１５２位に対応する位置に変異を含む。一実施形態では、変異は、Ｓ１４６Ｎ及びＫ１５２Ｑ置換である。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を有する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９６％の相同性を有する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％の相同性を有する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を有する。
一実施形態では、本明細書に開示される位置（単数又は複数）における変異（単数又は複数）以外に、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と１５以下の位置で異なる。一実施形態では、本明細書に開示される位置（単数又は複数）における変異（単数又は複数）以外に、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と１０以下の位置で異なる。一実施形態では、本明細書に開示される位置（単数又は複数）における変異（単数又は複数）以外に、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と５以下の位置で異なる。一実施形態では、本明細書に開示される位置（単数又は複数）における変異（単数又は複数）以外に、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と４以下の位置で異なる。一実施形態では、本明細書に開示される位置（単数又は複数）における変異（単数又は複数）以外に、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と３以下の位置で異なる。一実施形態では、本明細書に開示される位置（単数又は複数）における変異（単数又は複数）以外に、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と２以下の位置で異なる。一実施形態では、本明細書に開示される位置（単数又は複数）における変異（単数又は複数）以外に、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と１以下の位置で異なる。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と１５以下の位置で異なる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と１０以下の位置で異なる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と５以下の位置で異なる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と４以下の位置で異なる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と３以下の位置で異なる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と２以下の位置で異なる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１のアミノ酸配列と１以下の位置で異なる。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３若しくは３５のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるか、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５のいずれかのアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号３３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、配列番号３５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで決定される場合、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、対象において低下した免疫原性を有する。一実施形態では、免疫原性は、参照ＥＰＯ分子と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低下している。一実施形態では、対象はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を保有する。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで決定される場合、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、同じ又は実質的に同じ生物学的活性を有する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は２％以下低下した生物学的活性を有する。一実施形態では、生物学的活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＦ－１増殖アッセイで決定される。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、より多くのグリコフォーム、例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、又は５個多いグリコフォームを有することができる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、６個、７個、８個、９個、１０個又はより多くのグリコフォームを有することができる。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、７個、８個又はより多くのグリコフォームを有することができる。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、同じ又は実質的に同じ血清半減期を有する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、増加した血清半減期、例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０倍増加した血清半減期を有する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、低下した血清半減期、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以下に低下した血清半減期を有する。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は、ＥＰＯポリペプチドの血清半減期を延長する部分を含む。一実施形態では、ＥＰＯ分子は融合タンパク質である。一実施形態では、ＥＰＯ分子はＩｇＧのＦｃドメインを含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＥＰＯポリペプチドに共有結合的に融合されている。一実施形態では、ＦｃドメインのＮ末端は、ＥＰＯポリペプチドのＣ末端に直接的又は間接的に共有結合的に融合されている。
一実施形態では、ＥＰＯ分子は単離されたＥＰＯ分子である。一実施形態では、ＥＰＯ分子は組換えＥＰＯ分子である。一実施形態では、ＥＰＯ分子は合成ＥＰＯ分子である。
一態様では、本開示は、本明細書に開示されるＥＰＯ分子と、薬学的に許容され得る担体とを含む医薬組成物を特徴とする。
一態様では、本開示は、本明細書に開示されるＥＰＯ分子を含む調製物を特徴とする。一実施形態では、調製物は治療的使用に適している。
一態様では、本開示は、本明細書に開示されるＥＰＯ分子と、使用説明書とを含むキットを特徴とする。
一態様では、本開示は、本明細書に開示されるＥＰＯ分子をコードする核酸を特徴とする。
一態様では、本開示は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４若しくは３６のいずれかのヌクレオチド配列、又はそれらと５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ヌクレオチド以下で異なるか、又はそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸を特徴とする。一実施形態では、核酸は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、又は３６のいずれかのヌクレオチド配列を含む。
一態様では、本開示は、本明細書に開示される核酸を含むベクターを特徴とする。一実施形態では、ベクターは、核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。
一態様では、本開示は、本明細書に開示される核酸又は本明細書に開示されるベクターを含む細胞を特徴とする。
一態様では、本開示は、ＥＰＯポリペプチドの発現を可能にする条件下で本明細書に開示される細胞を培養し、それによってＥＰＯ分子を産生することを含む、ＥＰＯ分子を産生する方法を特徴とする。
一態様では、本開示は、有効量の本明細書に開示されるＥＰＯ分子を対象に投与し、それにより障害を治療することを含む、対象の障害を治療する方法を特徴とする。
一実施形態では、障害は、ＥＰＯに関連する障害、例えばＥＰＯの欠乏又は異常である。一実施形態では、障害は貧血である。一実施形態では、貧血は、慢性腎臓疾患（例えば、慢性腎不全）、ジドブジン治療、化学療法、又は手術に関連するか、又はそれに起因する。
一実施形態では、方法は、対象におけるＨＬＡ遺伝子型、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９遺伝子型を同定する遺伝子型情報を取得することを更に含み、ＨＬＡ遺伝子型の存在は、対象がＥＰＯ療法に対する免疫原性の増加を有するか、又は有するリスクがあることを同定する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、遺伝子型情報の取得に応答して投与される。
一実施形態では、対象は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を保有するか、又は保有すると判定されている。一実施形態では、対象は、慢性腎臓疾患、ＨＩＶ感染症、又はがんを有する。一実施形態では、対象は、ジドブジンを受けるか、又は受けたことがある。一実施形態では、対象は、化学療法（例えば、骨髄抑制化学療法）、手術、又は同種異系ＲＢＣ輸血を受けるか、又は受けたことがある。一実施形態では、対象は、抗ＥＰＯ抗体を有するか、又は有すると判定されている。一実施形態では、対象は、異なる組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯを投与されたことがある。一実施形態では、異なるｒＨｕＥＰＯの投与を中止又は終了する。
一態様では、本開示は、対象における免疫原性応答を低下させる方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に開示されるＥＰＯ分子を投与し、それにより免疫原性応答を低下させることを含む方法を特徴とする。
一実施形態では、方法は、対象におけるＨＬＡ遺伝子型、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９遺伝子型を同定する遺伝子型情報を取得することを更に含み、ＨＬＡ遺伝子型の存在は、対象がＥＰＯ療法に対する免疫原性の増加を有するか、又は有するリスクがあることを同定する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、遺伝子型情報の取得に応答して投与される。
一実施形態では、対象は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を保有するか、又は保有すると判定されている。一実施形態では、対象は、慢性腎臓疾患、ＨＩＶ感染症、又はがんを有する。一実施形態では、対象は、ジドブジンを受けるか、又は受けたことがある。一実施形態では、対象は、化学療法（例えば、骨髄抑制化学療法）、手術、又は同種異系ＲＢＣ輸血を受けるか、又は受けたことがある。一実施形態では、対象は、抗ＥＰＯ抗体を有するか、又は有すると判定されている。一実施形態では、対象は、異なる組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯを投与されたことがある。一実施形態では、異なるｒＨｕＥＰＯの投与を中止又は終了する。
一態様では、本開示は、対象の赤芽球癆（ＰＲＣＡ）を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に開示されるＥＰＯ分子を投与し、それによりＰＲＣＡを治療又は予防することを含む方法を特徴とする。
一実施形態では、方法は、対象におけるＨＬＡ遺伝子型、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９遺伝子型を同定する遺伝子型情報を取得することを更に含み、ＨＬＡ遺伝子型の存在は、対象がＥＰＯ療法に対する免疫原性の増加を有するか、又は有するリスクがあることを同定する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、遺伝子型情報の取得に応答して投与される。
一実施形態では、対象は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を保有するか、又は保有すると判定されている。一実施形態では、対象は、慢性腎臓疾患、ＨＩＶ感染症、又はがんを有する。一実施形態では、対象は、ジドブジンを受けるか、又は受けたことがある。一実施形態では、対象は、化学療法（例えば、骨髄抑制化学療法）、手術、又は同種異系ＲＢＣ輸血を受けるか、又は受けたことがある。一実施形態では、対象は、抗ＥＰＯ抗体を有するか、又は有すると判定されている。一実施形態では、対象は、異なる組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯを投与されたことがある。一実施形態では、異なるｒＨｕＥＰＯの投与を中止又は終了する。
一態様では、本開示は、対象における同種異系赤血球（ＲＢＣ）輸血を減少させる方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に開示されるＥＰＯ分子を投与し、それにより同種異系ＲＢＣ輸血を減少させることを含む方法を特徴とする。
一実施形態では、方法は、対象におけるＨＬＡ遺伝子型、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９遺伝子型を同定する遺伝子型情報を取得することを更に含み、ＨＬＡ遺伝子型の存在は、対象がＥＰＯ療法に対する免疫原性の増加を有するか、又は有するリスクがあることを同定する。一実施形態では、ＥＰＯ分子は、遺伝子型情報の取得に応答して投与される。
一実施形態では、対象は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を保有するか、又は保有すると判定されている。一実施形態では、対象は、慢性腎臓疾患、ＨＩＶ感染症、又はがんを有する。一実施形態では、対象は、ジドブジンを受けるか、又は受けたことがある。一実施形態では、対象は、化学療法（例えば、骨髄抑制化学療法）、手術、又は同種異系ＲＢＣ輸血を受けるか、又は受けたことがある。一実施形態では、対象は、抗ＥＰＯ抗体を有するか、又は有すると判定されている。一実施形態では、対象は、異なる組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯを投与されたことがある。一実施形態では、異なるｒＨｕＥＰＯの投与を中止又は終了する。
一態様では、本開示は、対象を評価する方法であって、対象におけるＨＬＡ遺伝子型、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９遺伝子型を同定する遺伝子型情報を取得することを含み、ＨＬＡ遺伝子型の存在は、対象がＥＰＯ分子を含む治療法に対する免疫原性の増加を有するか、又は有するリスクがあることを同定する方法を特徴とする。
一実施形態では、方法は、本明細書に開示されるＥＰＯ分子による治療の候補として対象を分類することを更に含む。一実施形態では、方法は、有効量の本明細書に開示されるＥＰＯ分子を対象に投与することを更に含む。
一実施形態では、対象は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を保有するか、又は保有すると判定されている。一実施形態では、対象は、慢性腎臓疾患、ＨＩＶ感染症、又はがんを有する。一実施形態では、対象は、ジドブジンを受けるか、又は受けたことがある。一実施形態では、対象は、化学療法（例えば、骨髄抑制化学療法）、手術、又は同種異系ＲＢＣ輸血を受けるか、又は受けたことがある。一実施形態では、対象は、抗ＥＰＯ抗体を有するか、又は有すると判定されている。一実施形態では、対象は、異なる組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯを投与されたことがある。一実施形態では、異なるｒＨｕＥＰＯの投与を中止又は終了する。
一態様では、本開示は、医薬として使用するための本明細書に記載のＥＰＯ分子を特徴とする。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の方法に従って対象（例えば、本明細書に記載される対象）の障害を治療する際に使用するための本明細書に記載のＥＰＯ分子を特徴とする。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の方法に従って対象（例えば、本明細書に記載される対象）における免疫原性応答を低下させるのに使用するための本明細書に記載のＥＰＯ分子を特徴とする。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の方法に従って、対象（例えば、本明細書に記載される対象）における赤芽球癆（ＰＲＣＡ）の治療又は予防に使用するための本明細書に記載のＥＰＯ分子を特徴とする。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の方法に従って対象（例えば、本明細書に記載される対象）における同種異系赤血球（ＲＢＣ）輸血を減少させるのに使用するための本明細書に記載のＥＰＯ分子を特徴とする。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の方法に従って対象（例えば、本明細書に記載される対象）の障害を治療するための医薬品の製造における本明細書に記載のＥＰＯ分子の使用を特徴とする。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の方法に従って対象（例えば、本明細書に記載される対象）における免疫原性応答を低下させるための医薬の製造における本明細書に記載のＥＰＯ分子の使用を特徴とする。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の方法に従って対象（例えば、本明細書に記載される対象）の純粋な赤芽球癆（ＰＲＣＡ）を治療又は予防するための薬剤の製造における本明細書に記載のＥＰＯ分子の使用を特徴とする。
一態様では、本開示は、本明細書に記載の方法に従って対象（例えば、本明細書に記載される対象）における同種異系赤血球（ＲＢＣ）輸血を減少させるための薬剤の製造における本明細書に記載のＥＰＯ分子の使用を特徴とする。
列挙される実施形態
１．本明細書に開示される位置に変異を含むＥＰＯ分子。
２．配列番号１の１２～１５２位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１のＥＰＯ分子。
３．配列番号１の７４～８２、１０２～１１６、又は１４２～１５３のいずれかの位置に対応する位置に変異を含む、実施形態１又は２のＥＰＯ分子。
４．配列番号１の７４～８２又は１０２～１１６のいずれかの位置に対応する位置に変異を含む、実施形態１～３のいずれかのＥＰＯ分子。
５．配列番号１の７４～８２位又は１４２～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１～４のいずれかのＥＰＯ分子。
６．配列番号１の１０２～１１６位又は１４２～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１～５のいずれかのＥＰＯ分子。
７．配列番号１の７４～８２位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１～６のいずれかのＥＰＯ分子。
８．配列番号１の１０２～１１６位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１～７のいずれかのＥＰＯ分子。
９．配列番号１の１０２～１１０位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１～８のいずれかのＥＰＯ分子。
１０．配列番号１の１０８～１１６位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１～９のいずれかのＥＰＯ分子。
１１．配列番号１の１４２～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１～１０のいずれかのＥＰＯ分子。
１２．配列番号１の１４２～１５０位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１～１１のいずれかのＥＰＯ分子。
１３．配列番号１の１４５～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１～１２のいずれかのＥＰＯ分子。
１４．配列番号１の７４、７５、７６、７７、７９、８０、８１、８２、１０２、１０５、１０６、１０９、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１４２、１４５、１４６、１４８、１４９、１５２、又は１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１～１３のいずれかのＥＰＯ分子。
１５．配列番号１の１２、１５、６７、７０、７４、１０２、１０５、１０６、１０９、１１４、１４６、１４９、又は１５２位のいずれかに対応する位置に変異を含む、実施形態１～１４のいずれかのＥＰＯ分子。
１６．複数の位置（例えば、本明細書に開示される複数の位置）に複数の変異（例えば、本明細書に開示される複数の変異）を含む、実施形態１～１５のいずれかのＥＰＯ分子。
１７．本明細書に開示される第２の位置に第２の変異を更に含む、実施形態１６のＥＰＯ分子。
１８．本明細書に開示される第３の位置に第３の変異を更に含む、実施形態１７のＥＰＯ分子。
１９．本明細書に開示される第４の位置に第４の変異を更に含む、実施形態１８のＥＰＯ分子。
２０．本明細書に開示される第５の位置に第５の変異を更に含む、実施形態１９のＥＰＯ分子。
２１．配列番号１の１２位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～２０のいずれかのＥＰＯ分子。
２２．変異がＬ１２Ａ置換である、実施形態２１のＥＰＯ分子。
２３．変異がＬ１２Ｉ置換である、実施形態２１のＥＰＯ分子。
２４．配列番号１の１５位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～２３のいずれかのＥＰＯ分子。
２５．変異がＹ１５Ｉ置換である、実施形態２４のＥＰＯ分子。
２６．変異がＹ１５Ｗ置換である、実施形態２４のＥＰＯ分子。
２７．配列番号１の６７位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～２６のいずれかのＥＰＯ分子。
２８．変異がＬ６７Ｄ置換である、実施形態２７のＥＰＯ分子。
２９．変異がＬ６７Ｎ置換である、実施形態２７のＥＰＯ分子。
３０．変異がＬ６７Ｖ置換である、実施形態２７のＥＰＯ分子。
３１．配列番号１の７０位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～３０のいずれかのＥＰＯ分子。
３２．変異がＬ７０Ｖ置換である、実施形態３１のＥＰＯ分子。
３３．配列番号１の７４位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～３２のいずれかのＥＰＯ分子。
３４．変異がＶ７４Ｄ置換である、実施形態３３のＥＰＯ分子。
３５．変異がＶ７４Ｌ置換である、実施形態３３のＥＰＯ分子。
３６．変異がＶ７４Ｎ置換である、実施形態３３のＥＰＯ分子。
３７．配列番号１の１０２位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～３６のいずれかのＥＰＯ分子。
３８．変異がＬ１０２Ｄ置換である、実施形態３７のＥＰＯ分子。
３９．変異がＬ１０２Ｎ置換である、実施形態３７のＥＰＯ分子。
４０．変異がＬ１０２Ｉ置換である、実施形態３７のＥＰＯ分子。
４１．変異がＬ１０２Ｔ置換である、実施形態３７のＥＰＯ分子。
４２．変異がＬ１０２Ｖ置換である、実施形態３７のＥＰＯ分子。
４３．配列番号１の１０５位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～４２のいずれかのＥＰＯ分子。
４４．変異がＬ１０５Ｆ置換である、実施形態４３のＥＰＯ分子。
４５．変異がＬ１０５Ｓ置換である、実施形態４３のＥＰＯ分子。
４６．配列番号１の１０６位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～４５のいずれかのＥＰＯ分子。
４７．変異がＴ１０６Ａ置換である、実施形態４６のＥＰＯ分子。
４８．変異がＴ１０６Ｇ置換である、実施形態４６のＥＰＯ分子。
４９．変異がＴ１０６Ｈ置換である、実施形態４６のＥＰＯ分子。
５０．配列番号１の１０９位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～４９のいずれかのＥＰＯ分子。
５１．変異がＬ１０９Ａ置換である、実施形態５０のＥＰＯ分子。
５２．変異がＬ１０９Ｃ置換である、実施形態５０のＥＰＯ分子。
５３．変異がＬ１０９Ｗ置換である、実施形態５０のＥＰＯ分子。
５４．配列番号１の１１４位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～５３のいずれかのＥＰＯ分子。
５５．変異がＡ１１４Ｃ置換である、実施形態５４のＥＰＯ分子。
５６．配列番号１の１４６位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～５５のいずれかのＥＰＯ分子。
５７．変異がＳ１４６Ｎ置換である、実施形態５６のＥＰＯ分子。
５８．配列番号１の１４９位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～５７のいずれかのＥＰＯ分子。
５９．変異がＬ１４９Ｖ置換である、実施形態５８のＥＰＯ分子。
６０．変異がＬ１４９Ｗ置換である、実施形態５８のＥＰＯ分子。
６１．配列番号１の１５２位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～６０のいずれかのＥＰＯ分子。
６２．変異がＫ１５２Ｑ置換である、実施形態６１のＥＰＯ分子。
６３．配列番号１の６７及び１０２位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～６２のいずれかのＥＰＯ分子。
６４．変異が、Ｌ６７Ｖ及びＬ１０２Ｖ置換である、実施形態６３のＥＰＯ分子。
６５．７０、７４及び１０２位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～６４のいずれかのＥＰＯ分子。
６６．変異がＬ７０Ｖ、Ｖ７４Ｌ及びＬ１０２Ｉ置換である、実施形態６５のＥＰＯ分子。
６７．６７、７４及び１０２位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～６６のいずれかのＥＰＯ分子。
６８．変異がＬ６７Ｎ、Ｖ７４Ｎ及びＬ１０２Ｄ置換である、実施形態６７のＥＰＯ分子。
６９．変異が、Ｌ６７Ｄ、Ｖ７４Ｄ及びＬ１０２Ｎ置換である、実施形態６７のＥＰＯ分子。
７０．１２、１５、１０５、及び１４９位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～６９のいずれかのＥＰＯ分子。
７１．変異が、Ｌ１２Ａ、Ｙ１５Ｉ、Ｌ１０５Ｆ及びＬ１４９Ｗ置換である、実施形態７０のＥＰＯ分子。
７２．変異が、Ｌ１２Ｉ、Ｙ１５Ｗ、Ｌ１０５Ｓ及びＬ１４９Ｖ置換である、実施形態７０のＥＰＯ分子。
７３．１０９及び１１４位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～７２のいずれかのＥＰＯ分子。
７４．変異が、Ｌ１０９Ｃ及びＡ１１４Ｃ置換である、実施形態７３のＥＰＯ分子。
７５．１０２、１０５、１０６及び１０９位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～７４のいずれかのＥＰＯ分子。
７６．変異が、Ｌ１０２Ｔ、Ｌ１０５Ｓ、Ｔ１０６Ｈ及びＬ１０９Ｗ置換である、実施形態７５のＥＰＯ分子。
７７．変異がＬ１０２Ｔ、Ｌ１０５Ｓ、Ｔ１０６Ｇ及びＬ１０９Ｗ置換である、実施形態７５のＥＰＯ分子。
７８．１４６及び１５２位に対応する位置に変異を含む、実施形態１～７７のいずれかのＥＰＯ分子。
７９．変異が、Ｓ１４６Ｎ及びＫ１５２Ｑ置換である、実施形態７８のＥＰＯ分子。
８０．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する、実施形態１～７９のいずれかのＥＰＯ分子。
８１．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有する、実施形態１～８０のいずれかのＥＰＯ分子。
８２．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する、実施形態１～８１のいずれかのＥＰＯ分子。
８３．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を有する、実施形態１～８２のいずれかのＥＰＯ分子。
８４．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９６％の相同性を有する、実施形態１～８３のいずれかのＥＰＯ分子。
８５．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する、実施形態１～８４のいずれかのＥＰＯ分子。
８６．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％の相同性を有する、実施形態１～８５のいずれかのＥＰＯ分子。
８７．配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を有する、実施形態１～８６のいずれかのＥＰＯ分子。
８８．本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と１５以下の位置で異なる、実施形態１～８７のいずれかのＥＰＯ分子。
８９．本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と１０以下の位置で異なる、実施形態１～８８のいずれかのＥＰＯ分子。
９０．本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と５以下の位置で異なる、実施形態１～８９のいずれかのＥＰＯ分子。
９１．本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と４以下の位置で異なる、実施形態１～９０のいずれかのＥＰＯ分子。
９２．本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と３以下の位置で異なる、実施形態１～９１のいずれかのＥＰＯ分子。
９３．本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と２以下の位置で異なる、実施形態１～９２のいずれかのＥＰＯ分子。
９４．本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と１以下の位置で異なる、実施形態１～９３のいずれかのＥＰＯ分子。
９５．配列番号１のアミノ酸配列と１５以下の位置で異なる、実施形態１～９４のいずれかのＥＰＯ分子。
９６．配列番号１のアミノ酸配列と１０以下の位置で異なる、実施形態１～９５のいずれかのＥＰＯ分子。
９７．配列番号１のアミノ酸配列と５以下の位置で異なる、実施形態１～９６のいずれかのＥＰＯ分子。
９８．配列番号１のアミノ酸配列と４以下の位置で異なる、実施形態１～９７のいずれかのＥＰＯ分子。
９９．配列番号１のアミノ酸配列と３以下の位置で異なる、実施形態１～９８のいずれかのＥＰＯ分子。
１００．配列番号１のアミノ酸配列と２以下の位置で異なる、実施形態１～９９のいずれかのＥＰＯ分子。
１０１．配列番号１のアミノ酸配列と１以下の位置で異なる、実施形態１～１００のいずれかのＥＰＯ分子。
１０２．配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３若しくは３５のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるか、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０１のいずれかのＥＰＯ分子。
１０３．配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５のいずれかのアミノ酸配列を含む、実施形態１～１０２のいずれかのＥＰＯ分子。
１０４．配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１０５．配列番号５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１０６．配列番号７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１０７．配列番号９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１０８．配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１０９．配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１１０．配列番号１５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１１１．配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１１２．配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１１３．配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１１４．配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１１５．配列番号２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１１６．配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１１７．配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１１８．配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１１９．配列番号３３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１２０．配列番号３５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、実施形態１～１０３のいずれかのＥＰＯ分子。
１２１．例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで決定される場合、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、対象において低下した免疫原性を有する、実施形態１～１２０のいずれかのＥＰＯ分子。
１２２．免疫原性が、参照ＥＰＯ分子と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低下している、実施形態１２１のＥＰＯ分子。
１２３．対象がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を保有する、実施形態１２１又は１２２のＥＰＯ分子。
１２４．例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで決定される場合、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、同じ又は実質的に同じ生物学的活性を有する、実施形態１～１２３のいずれかのＥＰＯ分子。
１２５．例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで決定される場合、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は２％以下低下した生物学的活性を有する、実施形態１～１２４のいずれかのＥＰＯ分子。
１２６．生物学的活性がｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＦ－１増殖アッセイにおいて測定される、実施形態１２４又は１２５のいずれかのＥＰＯ分子。
１２７．参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、より多くのグリコフォーム、例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、又は５個多いグリコフォームを有することができる、実施形態１～１２６のいずれかのＥＰＯ分子。
１２８．６個、７個、８個、９個、１０個又はより多くのグリコフォームを有することができる、実施形態１～１２７のいずれかのＥＰＯ分子。
１２９．７個、８個又はより多くのグリコフォームを有することができる、実施形態１～１２８のいずれかのＥＰＯ分子。
１３０．参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、同じ又は実質的に同じ血清半減期を有する、実施形態１～１２９のいずれかのＥＰＯ分子。
１３１．参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、増加した血清半減期、例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０倍増加した血清半減期を有する、実施形態１～１３０のいずれかのＥＰＯ分子。
１３２．参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、低下した血清半減期、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以下に低下した血清半減期を有する、実施形態１～１３１のいずれかのＥＰＯ分子。
１３３．ＥＰＯポリペプチドの血清半減期を延長する部分を含む、実施形態１～１３２のいずれかのＥＰＯ分子。
１３４．融合タンパク質である、実施形態１～１３３のいずれかのＥＰＯ分子。
１３５．ＩｇＧのＦｃドメインを含む、実施形態１～１３４のいずれかのＥＰＯ分子。
１３６．Ｆｃドメインが、ＥＰＯポリペプチドに共有結合的に融合されている、実施形態１３５のＥＰＯ分子。
１３７．ＦｃドメインのＮ末端が、ＥＰＯポリペプチドのＣ末端に直接的又は間接的に共有結合的に融合されている、実施形態１３６のＥＰＯ分子。
１３８．実施形態１～１３７のいずれかのＥＰＯ分子と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
１３９．実施形態１～１３７のいずれかのＥＰＯ分子を含む、調製物。
１４０．治療的使用に適している、実施形態１３９の調製物。
１４１．実施形態１～１３７のいずれかのＥＰＯ分子と、使用説明書とを含む、キット。
１４２．実施形態１～１３７のいずれか一項のＥＰＯ分子をコードする、核酸。
１４３．配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４若しくは３６のいずれかのヌクレオチド配列、又はそれらと５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ヌクレオチド以下で異なるか、又はそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、核酸。
１４４．配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、又は３６のいずれかのヌクレオチド配列を含む、実施形態１４３の核酸。
１４５．実施形態１４２～１４４のいずれかの核酸を含む、ベクター。
１４６．核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、実施形態１４５のベクター。
１４７．実施形態１４２～１４４のいずれかの核酸を含む、細胞。
１４８．ＥＰＯポリペプチドの発現を可能にする条件下で、実施形態１４７の細胞を培養し、それによりＥＰＯ分子を産生することを含む、ＥＰＯ分子を産生する方法。
１４９．対象において障害を治療する方法であって、有効量の実施形態１～１３７のいずれかのＥＰＯ分子を対象に投与し、それにより障害を治療することを含む、上記方法。
１５０．障害が、ＥＰＯに関連する障害、例えば、ＥＰＯの欠乏又は異常である、実施形態１４９の方法。
１５１．障害が貧血である、実施形態１５０の方法。
１５２．貧血が、慢性腎臓疾患（例えば、慢性腎不全）、ジドブジン治療、化学療法、又は手術に関連するか、又はそれに起因する、実施形態１５１の方法。
１５３．対象において免疫原性応答を低下させる方法であって、それを必要とする対象に有効量の実施形態１～１３７のいずれかのＥＰＯ分子を投与し、それにより免疫原性応答を低下させることを含む、上記方法。
１５４．対象において赤芽球癆（ＰＲＣＡ）を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に有効量の実施形態１～１３７のいずれかのＥＰＯ分子を投与し、それによりＰＲＣＡを治療又は予防することを含む、上記方法。
１５５．対象において同種異系赤血球（ＲＢＣ）輸血を減少させる方法であって、それを必要とする対象に有効量の実施形態１～１３７のいずれかのＥＰＯ分子を投与し、それにより同種異系ＲＢＣ輸血を減少させることを含む、上記方法。
１５６．対象におけるＨＬＡ遺伝子型、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９遺伝子型を同定する遺伝子型情報又は配列を取得することを更に含み、ＨＬＡ遺伝子型の存在が、対象がＥＰＯ療法に対する免疫原性の増加を有するか、又は有するリスクがあることを同定する、実施形態１４８～１５５のいずれかの方法。
１５７．ＥＰＯ分子が、遺伝子型情報の取得に応答して投与される、実施形態１５６の方法。
１５８．対象を評価する方法であって、対象におけるＨＬＡ遺伝子型、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９遺伝子型を同定する遺伝子型情報を取得することを含み、ＨＬＡ遺伝子型の存在が、対象がＥＰＯ分子を含む治療法に対する免疫原性の増加を有するか、又は有するリスクがあることを同定する、上記方法。
１５９．本明細書に開示されるＥＰＯ分子による治療の候補として対象を分類することを更に含む、実施形態１５８の方法。
１６０．有効量の本明細書に開示されるＥＰＯ分子を対象に投与することを更に含む、実施形態１５８又は１５９の方法。
１６１．対象がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を保有するか、又は保有すると判定されている、実施形態１４８～１６０のいずれかの方法。
１６２．対象が、慢性腎臓疾患、ＨＩＶ感染症、又はがんを有する、実施形態１４８～１６１のいずれかの方法。
１６３．対象が、ジドブジンを受けるか、又は受けたことがある、実施形態１４８～１６２のいずれかの方法。
１６４．対象が、化学療法（例えば、骨髄抑制化学療法）、手術、又は同種異系ＲＢＣ輸血を受けるか、又は受けたことがある、実施形態１４８～１６３のいずれかの方法。
１６５．対象が抗ＥＰＯ抗体を有するか、又は有すると判定されている、実施形態１４８～１６４のいずれかの方法。
１６６．対象が、異なる組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯを投与されたことがある、実施形態１４８～１６５のいずれかの方法。
１６７．異なるｒＨｕＥＰＯの投与を中止又は終了する、実施形態１６６の方法。
図１Ａは、ＥＰＯのアミノ酸配列の図であり、ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ－Ｒ）が接触すると予測される（太字）；ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９－ＤＱＢ１＊０３：０９アレル（対立遺伝子）（網掛け）への結合について、中和抗体によって認識される（下線）；アミノ酸修飾（上にアスタリスクを付した）について考慮される例示的な部位を示す。図１Ａは、配列番号４６を開示する。 図１Ｂは、例示的なアレル（対立遺伝子）結合部位を含む相互作用する疎水性アミノ酸のネットワークを示すＥＰＯ－Ｒ結合界面の構造を示す。 図２Ａ～２Ｂは、クーマシーブルー染色（図２Ａ）及びウエスタン免疫ブロッティング（図２Ｂ）後の、例示的ＥＰＯポリペプチドのドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分離の画像である。 図３は、例示的なＥＰＯポリペプチドの等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル分離の画像であり、それぞれのアイソフォームの数を示す。 図４は、ＴＦ－１細胞における例示的なＥＰＯポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性を示す対数用量応答曲線である。 図５Ａ～５Ｃは、ＥＬＩＳＡを使用したインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）放出の測定によって決定される例示的なＥＰＯポリペプチドのｅｘ ｖｉｖｏ免疫原性を示す棒グラフであり、相対応答（図５Ａ）のパーセンテージを提供し、アスタリスクは、ｔ検定による有意差を示す（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１）。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陽性ボランティアのＩＦＮ－γレベル（図５Ｂ）；ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陰性ボランティアのＩＦＮ－γレベル（図５Ｃ）。棒グラフは平均±標準誤差として示される。
組換えヒトエリスロポエチン（ｒＨｕＥＰＯ）は、低レベルのヘモグロビンを有する対象、例えば、慢性腎臓疾患、がん、ＨＩＶ感染症又は貧血を有する対象に投与される生物医薬品として使用することができる。しかしながら、ｒＨｕＥＰＯを繰り返し投与された一部の対象は、ｒＨｕＥＰＯに対する免疫応答及び抗ｒＨｕＥＰＯ中和抗体の形成を発症し得、これにより、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）を発症し得る。理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態では、ＥＰＯに対する免疫原性応答は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面に提示される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したＥＰＯエピトープを認識するＴ細胞によって引き起こされると考えられる。一実施形態では、抗ｒＨｕＥＰＯ関連ＰＲＣＡの発現とＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９遺伝子との間に関連性があり、これはいくつかの集団、例えばタイ人集団に組み込まれていると更に考えられる。例えば、タイのバンコクに住むボランティアにおけるＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９のスクリーニングにより、２２％のボランティアがＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９を有することが見出され、タイにおけるこの特定のＨＬＡの高頻度が確認された。
本開示は、少なくとも部分的に、ＥＰＯポリペプチドのアミノ酸配列を改変することにより、ＥＰＯポリペプチドの構造的完全性又は生物活性を破壊することなく、ＥＰＯポリペプチドの免疫原性を低下させることができるという発見に基づく。免疫原性が低下した改変ＥＰＯポリペプチド又はＥＰＯバリアントを本明細書に開示する。有利には、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、天然ＥＰＯの１つ以上の生物学的機能を模倣することができ、例えば、対象における内因性ＥＰＯを補足又は置換し、及び／又は対象における貧血又はＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）を治療又は予防することができ、組換えヒトエリスロポエチン（ｒＨｕＥＰＯ）の他の形態で起こり得る免疫反応をもたらすことはない。理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態では、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、ｒＨｕＥＰＯに対する免疫原性のリスクが高い対象、例えばｒＨｕＥＰＯに依存する対象及び／又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９等の特定のクラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）を発現する対象に使用することができると考えられる。例えば、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを使用して、ｒＨｕＥＰＯに対する免疫原性のリスクが高い集団、例えばタイ人集団の患者を治療することができる。
ＭＨＣアレル（対立遺伝子）（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９）によって認識されるＥＰＯポリペプチド中の免疫原性ホットスポットの同定及び特性決定のためにＥＰＯポリペプチド（例えば、計算的及び／又は実験的に）をスクリーニングする方法も本明細書に記載される。これらの方法を、例えばアレル（対立遺伝子）に対する親和性を低下させる１つ以上（例えば、２、３、４、又はそれ以上）の変異を有する突然変異体を予測するために更に使用することができる。さらに、ＥＰＯポリペプチドをコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、組成物（例えば、医薬組成物）、キット、容器、デバイス、及びＥＰＯポリペプチドの作製方法も本開示で提供される。本明細書に開示されるＥＰＯポリペプチド及び医薬組成物は、単独で、又は他の薬剤若しくは治療様式と組み合わせて使用して、障害及び状態、例えば、ＥＰＯ欠乏に関連する貧血又は状態、例えば、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）を治療及び／又は予防することができる。
定義
本明細書で使用される場合、冠詞１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、冠詞の文法的対象の１つ又は２つ以上（例えば、少なくとも１まで）を指す。
「又は」という用語は、文脈上他に明確に示されない限り、本明細書では「及び／又は」という用語を意味するために使用され、これと互換的に使用される。
「約（Ａｂｏｕｔ）」及び「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、一般に、測定の性質又は精度を考慮して、測定された量の許容可能な程度の誤差を意味するものとする。例示的な誤差の程度は、所与の値又は値の範囲の２０％（％）以内、典型的には１０％以内、より典型的には５％（例えば、４％、３％、２％、又は１％以内）以内である。
本明細書で使用される「取得する」又は「取得すること」は、物理的実体又は値を「直接取得する」又は「間接的に取得する」ことによって、物理的実体又は値、例えば数値の所有を得ることを指す。「直接取得すること」は、物理的実体又は値を得るためのプロセス（例えば、合成又は分析方法を実行すること）を行うことを意味する。「間接的に取得する」とは、別の団体又は供給源（例えば、物理的実体又は価値を直接取得した第三者の研究所）から物理的実体又は値を受け取ることを指す。物理的実体を直接得ることは、物理的物質、例えば出発物質の物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。例示的な変化には、２つ以上の出発物質から物理的実体を作製すること、物質を剪断又は断片化すること、物質を分離又は精製すること、２つ以上の別個の実体を混合物に組み合わせること、共有結合又は非共有結合を破壊又は形成することを含む化学反応を行うことが含まれる。値を直接取得することは、試料又は別の物質の物理的変化を含むプロセスを実行すること、例えば、物質、例えば試料、分析物、又は試薬の物理的変化を含む分析プロセスを実行すること（本明細書では「物理的分析」と呼ぶこともある）、分析方法、例えば、物質、例えば分析物、又はその断片若しくは他の誘導体を別の物質から分離又は精製することのうちの１つ以上を含む方法を実行すること；分析物、又はその断片若しくは他の誘導体を別の物質、例えば緩衝液、溶媒、又は反応物と組み合わせること；又は、例えば、分析物の第１の原子と第２の原子との間の共有結合又は非共有結合を破壊又は形成することによって、分析物、又はその断片若しくは他の誘導体の構造を変化させること；又は、例えば、試薬の第１の原子と第２の原子との間の共有結合若しくは非共有結合を破壊若しくは形成することによって、試薬、又はその断片若しくは他の誘導体の構造を変化させること、を含む。
「配列を取得する」は、この用語が本明細書で使用される場合、配列を「直接取得する」又は「間接的に取得する」ことによって、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の所有を得ることを指す。「配列を直接得る」とは、配列決定方法（例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）方法）を行う等、配列を得るためのプロセス（例えば、合成又は分析方法を実行すること）を行うことを意味する。「配列を間接的に取得する」とは、別の団体又は供給源（例えば、配列を直接取得した第三者の研究所）から配列の情報若しくは知識を受け取ること、又は配列を受け取ることを指す。取得される配列は、完全な配列である必要はなく、例えば、少なくとも１つのヌクレオチドの配列決定、又は対象に存在するとして本明細書に開示される融合分子を同定する情報若しくは知識を得ることは、配列を取得することを構成する。
配列を直接取得することは、物理的物質、例えば出発物質、例えば組織試料、例えば生検物又は核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）試料の物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。例示的な変化には、２つ以上の出発物質から物理的実体を作製すること、物質を剪断又は断片化すること（ゲノムＤＮＡ断片等）、物質を分離又は精製すること（例えば、組織から核酸試料を単離すること）、２つ以上の別個の実体を混合物に組み合わせること、共有結合又は非共有結合を破壊又は形成することを含む化学反応を行うことが含まれる。
本明細書に開示される組成物及び方法は、指定された配列、又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば指定された配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又はそれ以上の配列を有するポリペプチド及び核酸を包含する。
アミノ酸配列と関連して、「実質的に同一」という用語は、本明細書では、第１及び第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメイン及び／又は共通の機能活性を有することができるように、ａ）第２のアミノ酸配列と同一である、又はｂ）第２のアミノ酸配列中の整列したアミノ酸残基の保存的置換である十分な又は最小数のアミノ酸残基を含む第１のアミノ酸を指すために使用される。例えば、参照配列、例えば本明細書で提供される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の同一性を有する共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列。
ヌクレオチド配列と関連して、「実質的に同一」という用語は、第１及び第２のヌクレオチド配列が共通の機能活性を有するポリペプチドをコードするか、又は共通の構造ポリペプチドドメイン若しくは共通の機能性ポリペプチド活性をコードするように、第２の核酸配列中の整列したヌクレオチドと同一である十分な又は最小数のヌクレオチドを含む第１の核酸配列を指すために本明細書で使用される。例えば、参照配列、例えば本明細書で提供される配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％の同一性を有するヌクレオチド配列。
「機能的バリアント」という用語は、天然に存在する配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、又は実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされ、天然に存在する配列の１つ以上の活性を有することができるポリペプチドを指す。
配列間の相同性又は配列同一性の計算（これらの用語は、本明細書では交換可能に使用される）は、以下のように行われる。
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、最適な比較目的で配列をアライメントする（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる）。典型的な実施形態では、比較目的でアラインメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、分子はその位置で同一である。
２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。
配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。一実施形態では、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２０１１；７：５３９）を使用して決定される。一実施形態では、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、Ｋａｌｉｇｎ２（Ｌａｓｓｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００９；３７（３）：８５８－６５；Ｌａｓｓｍａｎｎ ａｎｄ Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒ ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００５；６：２９８）を使用して決定される。一実施形態では、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＭＡＦＦＴ（Ｋａｔｏｈ ａｎｄ Ｓｔａｎｄｌｅｙ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ．２０１３；３０（４）：７７２－８０）を使用して決定される。一実施形態では、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＭＵＳＣＬＥ（Ｅｄｇａｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４；３２（５）：１７９２－７；Ｅｄｇａｒ ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００４；５：１１３）を使用して決定される。一実施形態では、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＭＶｉｅｗ（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１９９８；１４（４）：３８０－１）を使用して決定される。２つの配列間の同一性パーセントを決定するための他の方法も、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１５；４３（Ｗ１）：Ｗ５８０－４；ＭｃＷｉｌｌｉａｍ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３；４１（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５９７－６００に記載されている。
一実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ ２５０マトリックスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップ重み付けと、１、２、３、４、５、又は６の長さ重み付けとを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９７０；４８（３）：４４３－５３）アルゴリズムを使用して決定される。一実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムを使用して決定される。ＣＭＰマトリックス及び４０、５０、６０、７０、又は８０のギャップ重み付け、及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重み付け。パラメータの１つの適切なセット（及び特に指定されない限り使用されるべきもの）は、ギャップペナルティが１２、ギャップ拡張ペナルティが４、フレームシフトギャップペナルティが５のＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスである。
２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１９８８；４（１）：１１－７）のアルゴリズムを使用して決定することができる。
本明細書に記載の核酸及びタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公開データベースに対して検索を実行するための「クエリ配列」として使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．１９９０；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴ ｐｒｏｇｒａｍｓ（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施して、本明細書に記載の核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施して、本明細書に記載のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７；２５：３３８９－３４０２．に記載されるような、ギャップＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照されたい。
本明細書に記載される分子は、それらの機能に実質的な影響を及ぼさない追加の保存的又は非必須アミノ酸置換を有し得ることが理解される。
本明細書で使用される場合、「アレル（対立遺伝子）」という用語は、遺伝子の代替形態を指す。例えば、本明細書に記載のアレル（対立遺伝子）は、ヒト遺伝子の天然に存在する配列バリアントであり得る。一実施形態では、ヒト遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子、例えばＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－ＤＲ、又は－ＤＱアレル（対立遺伝子）、例えばＤＲＡ、ＤＲＢ１、ＤＲＢ３／４／５、ＤＱＡ－Ｉ、ＤＱＢ１、ＤＰＡ－Ｉ、又はＤＰＢ１アレル（対立遺伝子）、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９である。
「アミノ酸」という用語は、天然又は合成にかかわらず、アミノ官能性及び酸官能性の両方を含み、天然に存在するアミノ酸のポリマーに含めることができる全ての分子を包含することを意図している。例示的なアミノ酸としては、天然に存在するアミノ酸；その類似体、誘導体及び同族体；変異型側鎖を有するアミノ酸類似体；並びに前述のいずれかの全ての立体異性体が挙げられる。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、Ｄ－又はＬ－光学異性体とペプチド模倣体の両方を含む。
「抗原提示細胞」又は「ＡＰＣ」という用語は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）、例えばＭＨＣ－ＩＩ－エピトープ複合体と複合体形成した抗原をその表面に提示するアクセサリー細胞等（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞等）の免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこれらの複合体を認識し得る。ＡＰＣは、抗原を内部移行及び（例えば、ペプチド（エピトープ）へと）プロセシングし、それらをＴ細胞に提示する。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。
本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、対象において免疫応答（例えば、体液性及び／又は細胞性の免疫応答）を誘発する分子（例えば抗原、エピトープ又はタンパク質、例えばＥＰＯポリペプチド）の能力を指す。免疫応答は、とりわけ、抗体（例えば、中和抗体又は非中和抗体）の産生、免疫複合体の形成、補体活性化、肥満細胞活性化、炎症、及び／又はアナフィラキシーを含み得る。当業者は、物質の免疫原性を容易に測定又は決定することができる。例えば、体液性媒介免疫学的応答は、とりわけウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ又は同様の技術を使用して、生物学的試料（例えば、血液）中の抗体のレベルを測定することによって決定することができる。細胞媒介性免疫学的応答は、例えば、増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、又は免疫組織化学法を使用して決定することができる。
本明細書で使用される場合、「免疫原性の低下」という用語は、参照分子（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）の免疫原性と比較して、免疫応答を誘発する能力の低下を指す。例えば、分子（例えば、タンパク質、例えば、ＥＰＯポリペプチド）は、参照分子（例えば、野生型ＥＰＯ）と比較して、例えば、抗体価によって決定される場合には、より少ない中和抗体又は非中和抗体を誘発する場合；１つ以上のＭＨＣアレル（対立遺伝子）に対する結合の減少を示す場合；又はより少ないＴ細胞活性化を誘導するか、若しくは数が減少した対象においてＴ細胞活性化を誘導する場合、免疫原性が低下し得る。
本明細書で使用される場合、「ＭＨＣ結合エピトープ」という用語は、ＭＨＣエピトープ－Ｔ細胞受容体複合体の形成を可能にし、Ｔ細胞活性化を開始するのに十分な親和性で１つ以上のクラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）に結合することができるエピトープ（例えば、ペプチド）を指す。本明細書に記載のＭＨＣ結合エピトープは、少なくとも約９アミノ酸残基、例えば少なくとも約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８アミノ酸残基を含むペプチド配列（例えば、直鎖状ペプチド配列）であり得る。一実施形態では、ＭＨＣ結合エピトープは、約９アミノ酸残基を含むペプチド配列である。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」（一本鎖の場合）という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状又は分岐鎖状であってもよく、改変アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。この用語はまた、改変されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分とのコンジュゲーション等の任意の他の操作を包含する。ポリペプチドは、天然源から単離することができ、真核生物若しくは原核生物宿主から組換え技術によって産生することができ、又は合成手順の産物とすることができる。
「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、又は「ポリヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体等の改変ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーション等によって、重合後に更に改変され得る。核酸は、組換えポリヌクレオチド、又は天然に存在しないか若しくは非天然配列で別のポリヌクレオチドに連結されているゲノム、ｃＤＮＡ、半合成若しくは合成起源のポリヌクレオチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、その元の環境又はネイティブ環境（例えば、天然に存在する場合、自然環境）から除去された材料を指す。例えば、生きている動物に存在する天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されておらず、ヒトの介入によって天然系中の共存物質の一部又は全部から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、及び／又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部であり得、そのようなベクター又は組成物が自然界で見出される環境の一部ではないという点で依然として単離されているものとなり得る。
本明細書で使用される場合、「対象」は、ヒト又は動物を指す。動物は、典型的には、脊椎動物、例えば霊長類、げっ歯類、家畜、又は遊戯用動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモサル、及びマカク（例えば、アカゲザル）が含まれる。齧歯動物には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが含まれる。家畜及び遊戯用動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種（例えば、家庭用ネコ）、イヌ種（例えば、イヌ、キツネ、オオカミ）、鳥類種（例えば、ニワトリ、エムー、ダチョウ）、及び魚類（例えば、マス、ナマズ及びサケ）が含まれる。本開示の特定の実施形態では、対象は哺乳動物（例えば霊長類、例えばヒト）である。対象は雄性又は雌性であり得る。特定の実施形態では、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。一実施形態では、「対象」という用語は、免疫応答が誘発され得る（例えば、哺乳動物、例えばヒト対象）生物を含むことを意図している。
本明細書で使用される場合、例えば、貧血又はＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）（例えば、赤芽球癆）を「治療する」という用語は、障害、例えば貧血又はＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）を有する及び／又は障害、例えば貧血又はＥＰＯ関連（例えば、ＥＰＯ欠乏関連）障害の症状を経験する対象（例えば、ヒト）が、一実施形態では、ＥＰＯポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチド）が投与された場合、ＥＰＯポリペプチドが全く投与されなかった場合よりも、より重篤でない症状を患い、及び／又はより速く回復するであろうことを意味する。一実施形態では、貧血又はＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）が治療される場合、ヘモグロビンのレベル又は活性は、同等の未治療の対象と比較して、治療された対象において増加し得る。ヘモグロビンレベルを決定する方法が記載されている（例えば、Ｂｉｌｌｅｔｔ Ｈ．Ｈ．（１９９０）Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｎｄ Ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ．（Ｗａｌｋｅｒ ＨＫ，Ｈａｌｌ ＷＤ，Ｈｕｒｓｔ ＪＷ，ｅｄｉｔｏｒｓ）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ Ｈｉｓｔｏｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ，ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓ．３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５１．Ｂｏｓｔｏｎ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）を参照されたい）。治療は、例えば、部分的又は完全に、障害、例えば貧血又はＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）の効果若しくは症状、特徴及び／又は原因の１つ以上の症状発現を緩和、改善、軽減、阻害、又は重症度を低下及び／又は発生率を低下、並びに任意に、その発症を遅延させることができる。
一実施形態では、治療は、対象において、ＥＰＯポリペプチド（例えば、組換えヒトＥＰＯ又は内因性ヒトＥＰＯ）に対する免疫原性を部分的又は完全に緩和し、改善し、軽減し、阻害し、若しくは重症度を低下させ、及び／又は発生率を低下させ、任意に、発症を遅延させることができる。一実施形態では、貧血又はＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）がＥＰＯポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチド）で治療される場合、対象における免疫応答は、異なるＥＰＯポリペプチド（例えば、ｒＨｕＥＰＯ、例えば、エポエチンアルファ、ベータ、デルタ又はオメガ）で治療された同等の対象における免疫応答と比較して減少又は排除され得る。例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用する診断方法は、ＥＰＯポリペプチドの免疫原性の尺度として、異なるＥＰＯポリペプチドに起因するＴ細胞応答のレベルを検出することができる（例えば、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）放出のレベルを定量することによる）。他のアッセイ、例えば抗体力価を使用して、患者の治療を監視するか、又は免疫応答の存在を検出することができる。
一実施形態では、治療は、障害、例えば貧血若しくはＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）の特定の徴候を示さない対象、及び／又は障害、例えば貧血若しくはＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）の初期徴候のみを示す対象の治療である。一実施形態では、治療は、障害、例えば貧血又はＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）の１つ以上の確立された徴候を示す対象の治療である。一実施形態では、治療は、障害、例えば貧血又はＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）を患っていると診断された対象の治療である。一実施形態では、障害は、本明細書に記載のＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）である。一実施形態では、障害は赤芽球癆である。
本明細書で使用される場合、障害、例えば貧血又はＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）（例えば、赤芽球癆）を「予防する」という用語は、対象がＥＰＯポリペプチド（例えば、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチド）を投与された場合、対象（例えば、ヒト）が障害、例えば貧血又はＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）を有する可能性が低いことを意味する。一実施形態では、対象は、障害、例えば貧血又はＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）を発症するリスクがある。一実施形態では、対象は、赤芽球癆を発症するリスクがある。一実施形態では、障害は、本明細書に記載のＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）である。一実施形態では、障害は赤芽球癆である。
「バリアントエリスロポエチン（ＥＰＯ）ポリペプチド」、「改変ＥＰＯポリペプチド」、「ＥＰＯバリアント」、「ＥＰＯ突然変異体」、及び「ＥＰＯムテイン」は、本明細書において互換的に使用され、参照ＥＰＯポリペプチド、例えば野生型又は親ＥＰＯポリペプチドと少なくとも１つの残基が異なる（例えば、少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失又は置換によって異なる）天然に存在しないポリペプチドを指す。ＥＰＯバリアントは、タンパク質をＥＰＯポリペプチド配列の天然に存在するアレル（対立遺伝子）又は種間変異から区別する変異の所定の性質を特徴とする。本明細書に記載のＥＰＯバリアントは、天然に存在するＥＰＯに匹敵する１つ以上の生物学的特性（例えば、１つ以上の生物学的活性）を示し得る。さらに、本明細書に記載のＥＰＯバリアントは、参照ＥＰＯポリペプチド、例えば野生型又は天然に存在するＥＰＯと比較して、１つ以上の異なる生物学的特性（例えば、免疫原性の低下）を有するように操作されていてもよい。一実施形態では、ＥＰＯバリアントは、アミノ酸配列の任意の位置、例えばＮ末端、Ｃ末端又は内部にあり得る挿入、欠失及び／又は置換を含む。一実施形態では、ＥＰＯバリアントは、参照ＥＰＯポリペプチド、例えば野生型又は天然に存在するＥＰＯポリペプチドとは異なる少なくとも１つの残基、例えば少なくとも１、２、３、４、５、又はそれ以上のアミノ酸残基の差異を含む。一実施形態では、ＥＰＯバリアントは、参照ＥＰＯポリペプチド、例えば野生型又は天然に存在するＥＰＯポリペプチドとは異なる１、２、３又は４個のアミノ酸残基を含む。一実施形態では、ＥＰＯバリアントは、同時翻訳又は翻訳後修飾、例えば、１つ以上のアミノ酸側鎖又は末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、環状置換、環化、タンパク質又はタンパク質ドメイン（例えば、免疫グロブリン）への融合、又はペプチドタグ若しくは標識の付加に供される。
本明細書で使用される場合、「エリスロポエチン分子」又は「ＥＰＯ分子」という用語は、全長ＥＰＯポリペプチド又はその機能的断片を含む分子を指すことができる。
本明細書で使用される場合、「バリアントエリスロポエチン（ＥＰＯ）核酸」、「改変ＥＰＯ核酸」及び「バリアントＥＰＯ核酸」という用語は、本明細書で互換的に使用され、エリスロポエチンタンパク質バリアント（又は改変ＥＰＯポリペプチド）をコードする核酸を指す。遺伝暗号の縮重のために、多数の核酸が、例えば、対応するバリアントエリスロポエチンタンパク質のアミノ酸配列を変化させないように１つ以上のコドンの配列を改変することによって、本開示のバリアントエリスロポエチンタンパク質をコードし得る。
本明細書で使用される場合、「野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）」、「野生型（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ）」又は「ＷＴ」という用語は、改変又は操作されていないアミノ酸配列又はヌクレオチド配列等のアレル（対立遺伝子）バリエーションを含む、天然に存在するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を含むポリペプチド、タンパク質又は核酸を指す。例えば、野生型ＥＰＯポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列を含む任意のＥＰＯポリペプチド（単離されたＥＰＯポリペプチド、組換えＥＰＯポリペプチド、又は天然に存在するアミノ酸配列を含む合成ＥＰＯポリペプチドを含む）を指し得る。
範囲：本開示を通して、様々な実施形態を範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜及び簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、全ての可能な部分範囲並びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したとみなされるべきである。例えば、１～６等の範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の部分範囲、並びにその範囲内の個々の数、例えば１、２、３．７、３、４、５、５．６、及び６を具体的に開示しているとみなされるべきである。別の例として、９５～９９％の同一性等の範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するものを含み、９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％、及び９８～９９％の同一性等の部分範囲を含む。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
本明細書の組成物及び方法の様々な実施形態を以下に更に詳細に記載する。更なる定義は、本明細書全体を通して示されている。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）
ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、腎臓で産生される糖タンパク質ホルモンであり、赤血球（ＲＢＣ）の産生及び成熟において必須の役割を果たす。ヒトＥＰＯの成熟アミノ酸配列は、典型的には１６５アミノ酸残基を含み、約３０，６００ダルトンの相対分子量を有する。ＥＰＯ構造は、ヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを含む４らせん束トポロジーを有する。ＥＰＯのグリコシル化は、翻訳後修飾中に起こり、３つのＮ結合炭水化物鎖及び１つのＯ結合炭水化物鎖の付加、並びに元の分子量のおよそ４０％の増加を伴う。ＥＰＯのグリコシル化は、タンパク質の安定性、溶解性、及び生物活性に影響を及ぼすことが知られている。
ヒトＥＰＯのアミノ酸及びヌクレオチド配列は当技術分野で公知である。野生型ヒトＥＰＯの例示的なアミノ酸配列を以下に提供する。
本明細書で使用されるＥＰＯアミノ酸位置のナンバリングは、通常、配列番号１のアミノ酸配列に基づく。
組換えヒトエリスロポエチン（ｒＨｕＥＰＯ）
赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）として知られることもある組換えヒトエリスロポエチン（ｒＨｕＥＰＯ又はｒｈＥＰＯ）は、例えば、ヒトＥＰＯと同じ又は変化したアミノ酸配列を有する、ＥＰＯの操作された形態を含む生物医薬品であり得る。ｒＨｕＥＰＯは、例えば、基礎疾患又は治療法のために、ヘモグロビンレベルが低い（貧血）対象に一般的に投与される。ｒＨｕＥＰＯ等の外因性ＥＰＯポリペプチドには、いくつかの疾患領域及び関連する用途がある。例えば、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を有する対象は、一般に、関連する貧血を治療するためにｒＨｕＥＰＯを投与される。ｒＨｕＥＰＯ治療に一般的に関連する他の疾患には、ＨＩＶ感染症、ＡＩＤＳ、及びがんが含まれる。さらに、透析に依存しているか、又は化学療法、放射線、若しくはＡＩＤＳ若しくはＨＩＶ療法を受けている対象は、一般にｒＨｕＥＰＯで治療される。さらに、ｒＨｕＥＰＯは、赤血球生成を促進するために、手術又は移植（例えば、骨髄移植）を受けている又は受けたことがある対象に投与することができる。ｒＨｕＥＰＯは、パフォーマンス向上薬としても使用することができ、いくつかの形態のＥＰＯは、Ｗｏｒｌｄ Ａｎｔｉ－Ｄｏｐｉｎｇ Ａｇｅｎｃｙによってスポーツでの使用が禁止されている。ｒＨｕＥＰＯの非限定的な例としては、エポエチンアルファ（例えば、ＥＰＯＧＥＮ（登録商標）、ＥＰＯＡＤＥ（登録商標）、ＥＰＯＰＥＮ（登録商標）、ＥＰＯＸＩＴＩＮ（登録商標）、ＥＰＲＥＸ（登録商標）、ＥＲＹＰＲＯ（登録商標）、ＥＳＰＯ（登録商標）、ＧＬＯＢＵＲＥＮ（登録商標）、ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標））、エポエチンベータ（例えば、ＥＰＯＣＨ，ＥＰＯＧＩＮ（登録商標）、ＥＲＡＮＴＩＮ（登録商標）、ＥＲＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、ＭＡＲＯＧＥＮ（登録商標）、ＮＥＯＲＥＣＯＲＭＯＮ（登録商標）、ＲＥＣＯＲＭＯＮ（登録商標）、）、エポエチンデルタ（例えば、ＤＹＮＥＰＯ（登録商標）、）及びエポエチンオメガ（例えばＥＰＯＭＡＸ（登録商標）、ＨＥＭＡＸ（登録商標）、）が挙げられる。
本明細書でより詳細に記載されるように、ｒＨｕＥＰＯは、医薬製剤（例えば、凝集物の存在）及び／又は投与頻度（例えば、ｒＨｕＥＰＯ依存性対象において）に関連する因子に加えて、特に遺伝的因子に起因して、一部の個体において免疫反応をもたらし得る。ｒＨｕＥＰＯの免疫原性は、例えば、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）を引き起こす等、深刻な結果をもたらし得る。実際、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）を有する患者の貧血の治療のためのｒＨｕＥＰＯの使用がより普及しているため、以前にｒＨｕＥＰＯを使用したことがある又は現在使用している一部のＣＫＤ患者は、疑われる又は確認されたＰＲＣＡを示すことが報告されている。例えば、２００５年の報告は、ｒＨｕＥＰＯ療法を受けたタイ人患者４人が確認された抗ｒＨｕＥＰＯ関連ＰＲＣＡを有し、各対象がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）も示したことを示した（Ｐｒａｄｉｔｐｏｒｎｓｉｌｐａ ｅｔ ａｌ．，前出）。本明細書に記載されるように、ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）は、東南アジア諸国の間で高い頻度を有する。理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態では、ＥＰＯエピトープとＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９分子との間の破壊は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９を有する患者における免疫原性を低下させ得ると考えられる。
ＥＰＯバリアント
本明細書には、例えば、ＥＰＯに関連する貧血及び／又は障害、例えば、ＥＰＯ欠乏、又はその症状を治療又は予防するために使用することができるバリアントＥＰＯポリペプチドが開示される。例えば、ＥＰＯポリペプチドは、本明細書に記載の１つ以上の構造的及び／又は機能的特性を有することができる。一実施形態では、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、１つ以上の変異、例えば本明細書に記載の１つ以上の変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、例えば参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物、例えば野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対する生物学的参照調製物（ＢＲＰ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチドと比較して、より低い免疫原性を有する。ＥＰＯに対するＢＲＰは、例えば、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍｅｕｒ Ｂｉｏ Ｓｃｉ Ｎｏｔｅｓ．２０１９；２０１９：２７－３３；Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍｅｕｒ Ｂｉｏ Ｓｃｉ Ｎｏｔｅｓ．２０１５；２０１５：２４６－５３；Ｂｅｈｒ－Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍｅｕｒｏｐａ Ｂｉｏ．２００７ Ｄｅｃ；２００７（１）：４９－６６；Ｂｅｈｒ－Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍｅｕｒｏｐａ Ｂｉｏ．２００４ Ｄｅｃ；２００４（１）：２３－３３に記載されている。
一実施形態では、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、例えば、ｒＨｕＥＰＯに典型的に関連する免疫原性を回避若しくは低減するため、及び／又は内因性ＥＰＯを補うために、例えば内因性ＥＰＯが欠損している対象において、従来のｒＨｕＥＰＯの代替物として使用することができる。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドを、赤芽球癆（例えば、ｒＨｕＥＰＯ誘発性ＰＲＣＡ）を有する、又は有するリスクがある対象に投与する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドを使用して、対象、例えばヒト対象における赤芽球癆（例えば、ｒＨｕＥＰＯ誘発性ＰＲＣＡ）を治療又は予防する。
クラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）結合部位
一実施形態では、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、対象における免疫原性を低下させるように調整されたアミノ酸配列を含む。例えば、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを対象に投与して、参照ｒＨｕＥＰＯを投与した同等の対象において誘発される免疫応答と比較して、対象における免疫応答を低下させる（例えば、排除する）ことができる。一実施形態では、対象は、ｒＨｕＥＰＯに対する免疫原性に感受性であり、例えば、本明細書に記載の遺伝的背景を有する対象、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を有する対象である。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯバリアントがクラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子））に対してより低い親和性を示すように、改変された結合部位を含む。結合部位は、約９アミノ酸残基の領域を含み得る。例えば、本明細書に記載される方法によって予測される結合部位は、ＥＰＯアミノ酸配列の７４～８２位、１０２～１１０位、１０８～１１６位、１４２～１５０位又は１４５～１５３位の１つ以上に存在し得る。一実施形態では、結合部位は、表１に提供されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号３７～４１のうち１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）において１つ以上（例えば、２、３、４、又は全て）の変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号３７において１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）の変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号３８において１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）の変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号３９において１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）の変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号４０において１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）の変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号４１において１つ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）の変異を含む。
ＥＰＯ変異
変異をＥＰＯポリペプチドアミノ酸配列に導入して、その生物学的特性、例えば生物活性及び／又は免疫原性に影響を及ぼすことができる。例えば、ＥＰＯ配列の結合部位（例えば、本明細書に記載の方法によって予測される）を、例えば、ＥＰＯ結合部位と１つ以上のクラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）との間の結合を破壊する、又は親和性を低下させるために、例えばアミノ酸の置換、挿入、又は欠失によって改変することができる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、結合側の１つ以上の残基に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯアミノ酸配列の１２～１５２位から選択される１つ以上のアミノ酸位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯアミノ酸配列の７４～８２、１０２～１１６、又は１４２～１５３位から選択される１つ以上のアミノ酸位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、７４～８２位から選択される１つ以上のアミノ酸位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、１０２～１１０位から選択される１つ以上のアミノ酸位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドが、１０８～１１６位から選択される１つ以上のアミノ酸位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、１４２～１５０位から選択される１つ以上のアミノ酸位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、１４５～１５３位から選択される１つ以上のアミノ酸位置に変異を含む。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯアミノ酸配列の７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、又は８２位から選択される１つ以上（例えば、２、３、４、又はそれ以上）のアミノ酸位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯアミノ酸配列１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５又は１１６位から選択される１つ以上（例えば、２、３、４、又はそれ以上）のアミノ酸位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯアミノ酸配列の１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、又は１５３位から選択される１つ以上（例えば、２、３、４、又はそれ以上）のアミノ酸位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯアミノ酸配列の７４、７５、７６、７７、７９、８０、８１、８２、１０２、１０５、１０６、１０９、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１４２、１４５、１４６、１４８、１４９、１５２及び１５３位から選択される１つ以上（例えば、２、３、４、又はそれ以上）のアミノ酸位置に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、１２、１５、６７、７０、７４、１０２、１０５、１０６、１０９、１１４、１４６、１４９、又は１５２位から選択される１つ以上（例えば、２、３、４、又はそれ以上）のアミノ酸残基に変異を含む。
一実施形態では、ＥＰＯバリアントは、ヒトＥＰＯアミノ酸配列の１つ以上の位置に置換を含むアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは、１２位の置換、例えばＬ１２Ａ又はＬ１２Ｉ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１５位の置換、例えばＹ１５Ｉ又はＹ１５Ｗ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、６７位の置換、例えばＬ６７Ｄ、Ｌ６７Ｎ、又はＬ６７Ｖ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、７０位の置換、例えばＬ７０Ｖ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、７４位の置換、例えばＶ７４Ｄ、Ｖ７４Ｌ、又はＶ７４Ｎ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１０２位に置換、例えばＬ１０２Ｄ、Ｌ１０２Ｉ、Ｌ１０２Ｎ、Ｌ１０２Ｔ又はＬ１０２Ｖ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１０５位の置換、例えばＬ１０５Ｆ又はＬ１０５Ｓ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１０６位の置換、例えばＴ１０６Ａ、Ｔ１０６Ｇ、又はＴ１０６Ｈ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１０９位の置換、例えばＬ１０９Ａ、Ｌ１０９Ｃ又はＬ１０９Ｗ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１１４位の置換、例えばＡ１１４Ｃ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１４６位の置換、例えばＳ１４６Ｎ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１４９位の置換、例えばＬ１４９Ｖ又はＬ１４９Ｗ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１５２位の置換、例えばＫ１５２Ｑ置換を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは、６７及び１０２位に変異（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、７０、７４、及び１０２位に変異（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１０２位に変異（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、６７、７４、及び１０２位に変異（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１２、１５、１０５、及び１４９位に変異（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１０５位に変異（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１０６位に変異（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１０９位に変異（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１０９及び１１４位に変異（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１０２、１０５、１０６及び１０９位に変異（例えば、置換）を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、１４６及び１５２位に変異（例えば、置換）を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは、例えば、６７、７０、１０２、及び／又は１４９位におけるロイシンのバリンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば７４位におけるバリンのロイシンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１２及び／又は１０２位におけるロイシンのイソロイシンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１０２位におけるロイシンのトレオニンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば６７及び／又は１０２位におけるアスパラギンへのロイシンの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば６７及び／又は１０２位におけるアスパラギン酸へのロイシンの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１２及び／又は１０９位におけるロイシンのアラニンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１０５位におけるロイシンのフェニルアラニンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１０５位におけるロイシンのセリンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１０９及び／又は１４９位におけるトリプトファンへのロイシンの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１０９位におけるロイシンのシステインへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１０６位におけるトレオニンのアラニンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１０６位におけるトレオニンのグリシンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１０６位におけるトレオニンのヒスチジンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば７４位におけるバリンのアスパラギンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば７４位におけるバリンのアスパラギン酸への置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１５位におけるチロシンのイソロイシンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１５位におけるチロシンのトリプトファンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１１４位におけるアラニンからシステインへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１４６位におけるセリンからアスパラギンへの置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、例えば１５２位におけるリジンのグルタミンへの置換を含む。
一実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ６７Ｖ及びＬ１０２Ｖ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ７０Ｖ、Ｖ７４Ｌ、及びＬ１０２Ｉ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドはＬ１０２Ｔ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ６７Ｎ、Ｖ７４Ｎ、及びＬ１０２Ｄ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ６７Ｄ、Ｖ７４Ｄ及びＬ１０２Ｎ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ１２Ａ、Ｙ１５Ｉ、Ｌ１０５Ｆ及びＬ１４９Ｗ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ１２Ｉ、Ｙ１５Ｗ、Ｌ１０５Ｓ及びＬ１４９Ｖ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドはＬ１０５Ｆ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドはＴ１０６Ａ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドはＴ１０６Ｇ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドはＴ１０６Ｈ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドはＬ１０９Ａ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドはＬ１０９Ｗ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ１０９Ｃ及びＡ１１４Ｃ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ１０２Ｔ、Ｌ１０５Ｓ、Ｔ１０６Ｈ及びＬ１０９Ｗ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ１０２Ｔ、Ｌ１０５Ｓ、Ｔ１０６Ｇ及びＬ１０９Ｗ置換を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｓ１４６Ｎ及びＫ１５２Ｑ置換を含む。
本明細書に記載のＥＰＯポリペプチド（例えば、ＥＰＯバリアント）は、４つのヘリックスのいずれか１つに変異を含み得る。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、１つ以上Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤヘリックス内に変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ヘリックスＡ内の変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ヘリックスＢ内の変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドはヘリックスＣ内の変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドはヘリックスＤ内の変異を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドはヘリックスＢ及びＣ内の変異を含む。一実施形態では、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性（例えば、表２に示すＥＰＯ－１．２、ＥＰＯ－３．１、ＥＰＯ－３．２、ＥＰＯ－３．３又はＥＰＯ－４．１）を有するＥＰＯバリアントが有する変異は、ヘリックスＢ及び／又はヘリックスＣ内に位置する。
理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態では、アミノ酸位置７４、１０２、１０６及び１０９は、ＨＬＡ－ＤＲ－Ｂ１のエピトープであると考えられる。一実施形態では、７０位でのロイシンのバリンへの置換、７４位でのバリンのロイシンへの置換、１０２位でのロイシンのイソロイシンへの置換（ＥＰＯ－１．２）、及び１０９位でのロイシンのアラニンへの置換（ＥＰＯ－４．１）は、ＥＰＯの疎水性ネットワークを維持する。非極性アミノ酸基間の任意の適切な置換を、ＥＰＯポリペプチド、例えばアラニン、ロイシン、バリンとイソロイシンとの間に組み込むことができる。
一実施形態では、単一の変異（例えば、表２のＥＰＯ－３．１、ＥＰＯ－３．２及びＥＰＯ－３．３におけるように）がネイティブアミノ酸特性を変化させる。例えば、トレオニン、例えば１０６位のトレオニン等の極性ヒドロキシル含有アミノ酸を、アラニン（例えば、ＥＰＯ－３．１において）又はグリシン（例えば、ＥＰＯ－３．２において）等のより小さい及び／又は非極性アミノ酸に置換することができる。さらに、ＭＨＣ ＩＩアレル（対立遺伝子）（例えば、ＥＰＯ－３．３において）による認識を回避又は低減するために、例えば位置１０６にヘテロ芳香族部分（例えば、イミダゾール）を導入することができる。例えば、これらの変異配列を含む本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、ＭＨＣ ＩＩ分子による認識を回避又は低減し、当該ＥＰＯポリペプチドを受容するＭＨＣ ＩＩ分子を有する対象における免疫原性応答を低下させ得る。
一実施形態では、変異は、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯ、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、ＨＬＡ結合親和性が低下したＥＰＯポリペプチドをもたらす。一実施形態では、変異は、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）に対する結合親和性が低下したＥＰＯポリペプチドをもたらす。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯ、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）のＨＬＡ結合親和性に対して、約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．５％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％のＨＬＡ結合親和性（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）結合親和性）を有する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯ、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）のＨＬＡ結合親和性に対して約９０％未満、例えば約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又はそれ未満のＨＬＡ結合親和性を有する。
ＥＰＯアイソフォーム
本明細書に記載のＥＰＯ調製物は、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドの１つ以上のアイソフォーム（例えば、グリコフォーム）を含むことができる。例えば、ｒＨｕＥＰＯポリペプチドは、一般に複雑なグリコシル化パターンを有し、いくつかの異なるアイソフォームとして存在し、完全にグリコシル化されたＥＰＯは、１４個ものアイソフォームを含むことが知られている。一実施形態では、ＥＰＯの生物学的参照調製物（Ｂｕｒｎｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍｅｕｒ．Ｂｉｏ．Ｓｃｉ．Ｎｏｔｅｓ（２０１５）２４６－２５３）は、６個の異なるアイソフォームを含む。一実施形態では、ＥＰＯ調製物は、６個以上の異なるアイソフォーム、例えば６～８個のアイソフォームを含む。理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態では、このアイソフォーム（例えば、グリコフォーム）プロファイルの変動は、例えばトランスフェクト細胞の異なる継代による、グリカン部分のタンパク質配列及び／又は翻訳後修飾の違いに起因し得ると考えられる。
一実施形態では、ＥＰＯ調製物は単一アイソフォームを含む。一実施形態では、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、アイソフォーム、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個又はそれ以上のアイソフォームの混合物を含む。一実施形態では、ＥＰＯ調製物は、未改変ＥＰＯポリペプチド（例えば、野生型又は天然に存在するＥＰＯポリペプチド）を含むＥＰＯ調製物と比較して、より多くのアイソフォームを含む。一実施形態では、ＥＰＯ調製物は６個のアイソフォームを含む。一実施形態では、ＥＰＯ調製物は７個のアイソフォームを含む。一実施形態では、ＥＰＯ調製物は８個のアイソフォームを含む。
一実施形態では、ＥＰＯ調製物はグリコフォームの混合物を含み、各グリコフォームは様々なグリカン部分、例えばグリカンの分岐度、グリカン構造（例えば、異なる炭水化物又はグリコシド結合）、Ｎ－及びＯ－結合グリカンの数、及び／又はシアル酸部分の数の変動を有する。
ＥＰＯポリペプチドのアイソフォーム（例えば、グリコフォーム）分布は、公知の技術を使用して、例えば等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルを使用した分離によって決定することができる。例えば、アイソフォームの混合物を含むＥＰＯ調製物をＩＥＦゲルによって分離することができ、ゲル上に可視化された異なるバンドの数を使用して、アイソフォームの数を決定することができる。異なるアイソフォームは、例えば、それらの相対的な酸性度又は塩基性度に従って分離することができる。
理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態では、アイソフォーム分布は、ＥＰＯポリペプチド間のグリコシル化の微小不均一性の違いによって引き起こされ得ると考えられる。ＥＰＯポリペプチドのグリコフォーム、例えばシアル酸分子の数の変動は、受容体結合親和性及び血清クリアランスを含むＥＰＯポリペプチドの生物学的活性に大きく影響することがある。したがって、望ましい特徴は、例えば、ＥＰＯポリペプチドの生物活性を増加させ、及び／又は血清クリアランスを減少させるために、特定のグリコシル化プロファイルを有するＥＰＯポリペプチドを選択することによって得ることができる。そのような利点は、従来の治療法（例えば、ｒＨｕＥＰＯを使用する）と比較して、より低い頻度でＥＰＯポリペプチドを投与する機会を提供し得る。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、未改変ＥＰＯポリペプチド（例えば、野生型又は天然に存在するＥＰＯ）、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯと比較して、同じ血清半減期を有する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、未改変ＥＰＯポリペプチド（例えば、野生型又は天然に存在するＥＰＯ）、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯと比較して、血清半減期が減少している。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、未改変ＥＰＯポリペプチド（例えば、野生型又は天然に存在するＥＰＯ）、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯと比較して、血清半減期が増加している。
追加のＥＰＯポリペプチド
一実施形態では、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、例えば翻訳後修飾によって改変される。一実施形態では、改変は、グリコシル化、脱グリコシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、カルバミル化、硫酸化、プレニル化、ファルネシル化、又は別の分子、例えばポリマー、ポリペプチド若しくはタンパク質（例えば、アルブミン、免疫グロブリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又はヒドロキシアルキルデンプン）へのコンジュゲーションを含む。例えば、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、タンパク質又はタンパク質ドメインにコンジュゲート（例えば、共有結合している）され得る。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドはアルブミンにコンジュゲートされる。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドはヒスチジンタグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ（配列番号４３））にコンジュゲートされる。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、ヘマグルチニン、ＦＬＡＧエピトープ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質等の１つ以上にコンジュゲートされる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、抗体（例えば、免疫グロブリン（ＩｇＧ）分子）に共有結合している。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドはＩｇＧ分子に共有結合している。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に共有結合している。
ＥＰＯポリペプチドは、任意の適切な化学的手段によって別の分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド又はポリマー）に連結することができる。ＥＰＯポリペプチドは、他の分子に直接（例えば、共有結合によって）又はリンカーによって連結され得る。例えば、ＥＰＯポリペプチドの別の分子（例えば、タンパク質）への連結は、例えばトレオニン、セリン、プロリン、グリシン、アスパラギン酸、リジン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アルギニン、フェニルアラニン、若しくはアラニン、又はそれらの組み合わせを含むアミノ酸又はポリペプチドリンカー等の適切なリンカーの使用を含み得る。ＥＰＯポリペプチドは、チオール結合（例えば、ジスルフィド又はチオエーテル結合）によって、又はアミン若しくはアルコール基を介して、別の分子（例えば、タンパク質）に結合することができる。ＥＰＯポリペプチドの別の分子への連結は、任意の適切な連結部分、例えば、アリールアジド、マレイミド、カルボジイミド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドラジド、ＰＦＰ－エステル、ホスフィン又はヒドロキシメチルホスフィン、ソラレン、イミドエステル、ピリジルジスルフィド、イソシアネート又はビニルスルホンを介したものであり得る。
理論に拘束されることを望むものではないが、ＥＰＯポリペプチドを別の分子（例えば、アルブミン又はＩｇＧ分子等のタンパク質）にコンジュゲートすることにより、ＥＰＯポリペプチドの血清半減期を延長し、精製又は単離を容易にし、細胞からのＥＰＯポリペプチドの分泌を修飾（例えば、改善する）し、エピトープタグを提供し、検出可能なシグナルを提供し、及び／又は二量体化若しくは多量体化を提供することができると考えられる。
例示的なＥＰＯ配列
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、以下の１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、又は全て）を達成するように適合されたアミノ酸配列を含む：（ｉ）参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物と比較したクラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子））に対する結合親和性の低下；（ｉｉ）ＥＰＯ受容体に対する結合親和性の維持；（ｉｉｉ）保存された構造的完全性；（ｉｖ）参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物と比較して、血清半減期が維持されるか、又は増加する；及び／又は（ｖ）参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物と比較して、生物活性が維持されているか、又は改善されている（例えば、細胞増殖アッセイによって、又は対象におけるヘモグロビンの増加によって測定される場合）。一実施形態では、参照ＥＰＯポリペプチドは、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチドを含むか、又はそれからなる。一実施形態では、参照ＥＰＯ調製物は、ＥＰＯに対するＢＲＰである。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、表２に提供されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、又は９９．９％又はそれ以上同一のアミノ酸配列）、又はそれに対する機能的断片を含む。





一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるアミノ酸配列、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列、又は配列番号３と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドが配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列、又は配列番号５と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列、又は配列番号７と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号７のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列、又は配列番号９と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号１１と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号１１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列、又は配列番号１３と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号１３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列、又は配列番号１５と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号１５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列、又は配列番号１７と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号１７のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列、又は配列番号１９と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号１９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列、又は配列番号２１と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号２１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列、又は配列番号２３と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号２３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列、又は配列番号２５と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号２５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列、又は配列番号２７と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号２７のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号２９のアミノ酸配列、又は配列番号２９と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号２９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列、又は配列番号３１と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号３１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸配列、又は配列番号３３と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号３３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列、又は配列番号３５と１、２、５、１０、１５若しくは２０個以下のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるそのバリアント、又はその機能的断片を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは配列番号３５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はその機能性断片からなる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、

のアミノ酸配列（Ｘ１２はＬ、Ａ、又はＩであり、Ｘ１５はＹ、Ｉ、又はＷであり、Ｘ６７はＬ、Ｄ、Ｎ、又はＶであり、Ｘ７０はＬ又はＶであり、Ｘ７４はＶ、Ｄ、Ｌ、又はＮであり、Ｘ１０２はＬ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｔ、又はＶであり、Ｘ１０５はＬ、Ｆ、又はＳであり、Ｘ１０６はＴ、Ａ、Ｇ、又はＨであり、Ｘ１０９はＬ、Ａ、Ｃ、又はＷであり、Ｘ１１４はＡ又はＣであり、Ｘ１４６はＳ又はＮであり、Ｘ１４９はＬ、Ｖ、又はＷであり、Ｘ１５２はＫ又はＱである、但し、ＥＰＯポリペプチドは配列番号１を含まない）を含む。
ＥＰＯバリアントの計算設計
本開示の別の態様は、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯ、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較してより低い免疫原性を有するＥＰＯポリペプチドを設計する方法を特徴とする。例えば、計算研究を行って、１つ以上のクラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９又はＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９－ＤＱＢ１＊０３：０９アレル（対立遺伝子））と結合すると予測されるヒトＥＰＯアミノ配列中の部位を同定することができる。これらの予測された結合部位を使用して、結合部位に１つ以上の変異を有するＥＰＯバリアントを、クラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）に対するＥＰＯポリペプチドバリアントの結合の親和性を低下させる（例えば、排除する）ように設計することができる。計算ツールはまた、例えば、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯ、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、ＥＰＯポリペプチドの生物活性又は血清半減期の減少を回避するために、構造的完全性を保存するタンパク質を設計するために使用することができる。一実施形態では、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏツール（例えば、ＮｅｔＭＨＣＩＩ ２．２）を使用して、ＭＨＣＩＩアレル（対立遺伝子）（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子））への結合に有利なＥＰＯ上の部位を予測する。一実施形態では、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏツール（例えば、ＮｅｔＭＨＣＩＩ ２．２）を使用して、例えば、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯ、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、ＭＨＣＩＩアレル（対立遺伝子）（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子））に対する親和性が低いために、免疫原性が低下したＥＰＯポリペプチドをもたらすＥＰＯポリペプチド配列を設計する。
ＥＰＯバリアントの発現及び精製
本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、公知の技術を使用して、例えば宿主細胞、例えば本明細書に記載の細胞における組換え発現によって産生され得る。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドの発現は、ＥＰＯポリペプチドをコードする配列を含む適切な発現ベクターを調製することを含む。ベクターは、本明細書に記載の任意のベクターであり得る。例えば、ＥＰＯポリペプチドをコードする配列を含むｐｃＤＮＡ発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ ３．３発現ベクター）又は適切な代替物を使用することができる。生成され、任意に精製されると、発現ベクターはその後、適切な細胞にトランスフェクトされ得る。任意の適切な宿主細胞を使用することができ、とりわけ、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、又はヒト細胞であり得る。一実施形態では、宿主細胞はヒト細胞である。一実施形態では、宿主細胞はＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３－Ｆ細胞である。一実施形態では、トランスフェクトされた細胞を、例えば細胞の要件に従って培養して、ＥＰＯポリペプチドを産生する。次いで、培養物から産生されたＥＰＯポリペプチドを、公知の技術を使用して、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して単離及び精製してもよい。
ＥＰＯバリアントの生物活性
エリスロポエチン（天然型及び組換え型の両方）は、ＥＰＯ応答性細胞の表面に見出されるタンパク質であるＥＰＯ受容体（ＥＰＯ－Ｒ）と結合し、これを活性化することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドによるＥＰＯ－Ｒの結合及び活性化は、赤血球生成の刺激に関与すると考えられる。より具体的には、ＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯ－Ｒの細胞外ドメインに結合して、受容体の立体配座変化をもたらし、細胞内シグナル伝達事象、すなわち受容体のリン酸化並びにＪＡＫ－ＳＴＡＴ、ＲＡＳ及びＰ１３キナーゼ経路の活性化を引き起こすことができる。これらの事象は、赤血球前駆細胞の赤血球への促進及び分化をもたらし、ヘモグロビンＣ合成を刺激し、ヘマトクリット値を増加させることができる。
ＥＰＯ－Ｒは、赤血球細胞並びにいくつかの種類の非赤血球細胞、例えば骨髄細胞、リンパ球、巨核球、内皮細胞、メサンギウム細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、神経細胞、前立腺細胞及び腎細胞において（例えば、それらの表面に）見出すことができる。したがって、ＥＰＯは、赤血球生成の促進に加えて、とりわけ、新しい血管の発達、並びに脳、卵巣、卵管、子宮及び精巣を含む他の重要な過程を含むいくつかの生物学的過程に関連し、腫瘍に影響を及ぼし得る。
一部には、ＥＰＯポリペプチドの構造的変異及び確認のために、異なるアイソフォームの効果に加えて、ＥＰＯポリペプチドは様々な生物活性を有することができる。例えば、ＥＰＯポリペプチドバリアントは、未改変ＥＰＯポリペプチド（例えば、野生型又は天然に存在するＥＰＯ）と比較して、異なる結合親和性及び／又はＥＰＯ－Ｒを活性化する能力を有し得る、及び／又は異なる血清半減期を有し得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でＥＰＯポリペプチドの生物活性を測定する方法が記載されている。例えば、ＥＰＯポリペプチドの生物活性は、細胞増殖アッセイを使用して、例えばＥＰＯ受容体を発現する細胞株を使用して決定することができる。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドの生物活性は、例えばＴＦ－１細胞増殖アッセイを含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して決定される。赤白血病患者に由来するＴＦ－１細胞株は、ＥＰＯと接触すると刺激され、成熟赤血球に分化することができ、したがって、ＥＰＯポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性をスクリーニングするための有用なプラットフォームを提供する。特に、この細胞型は、その表面にＥＰＯ受容体を示し、赤血球系統への関与を示し、無傷のＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５経路を有し、ＥＰＯを含む様々な成長因子に応答して細胞増殖を媒介する（例えば、Ｂｒｏｕｄｙ，Ｖ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（１９８８）８５：６５１３－６５１７；Ｃｈｒｅｔｉｅｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（１９９４）８３：１８１３－１８２１を参照）。
本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、例えば、ＴＦ－１細胞株アッセイによって決定されるように、様々な程度の生物活性を有し得る。ＥＰＯポリペプチドの生物活性は、野生型ＥＰＯと比較した相対的生物活性に関して表すことができる。一実施形態では、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチド（例えば、表２に示されるようなＥＰＯ－１．２、ＥＰＯ－３．１、ＥＰＯ－３．２、ＥＰＯ－３．３及びＥＰＯ－４．１）は、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯ、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、同じ又は実質的に同じｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性を示す。理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態では、ＴＦ－１細胞上の生物活性の変動は、タンパク質配列、全体的なタンパク質立体配座及び／又はグリコシル化パターンの違いに起因し得ると考えられる。本明細書でより詳細に記載されるように、ＥＰＯポリペプチドのアイソフォームパターンは、生物活性、効力及び／又は安定性において重要な役割を有することができる（例えば、Ｅｇｒｉｅ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ Ｐａｒｋ）（２００２）１６：１３－２２を参照）。例えば、非グリコシル化ＥＰＯのｉｎ ｖｉｖｏ活性は低下するが、高レベルのグリコシル化はＥＰＯの持続性を増加させ、血清半減期の延長をもたらすと考えられている（例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（２００４）３２：１１４６－１１５５；Ｋａｕｓｈｉｋ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．（２０１１）２０：４６５－４８１；Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２００９）２０：６７８－６８４；Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（２００５）９４：１６２６－１６３５；ａｎｄ Ｓｕ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ（２０１０）９１：２３８－２４４を参照）。理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態では、各ＥＰＯポリペプチド中のアイソフォーム分布及びアイソフォーム存在量の変動もまた、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチド間の生物活性の変動を説明し得ると考えられる。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯ、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して実質的に同じ生物活性を有する。一実施形態では、ＥＰＯバリアントは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯ、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、より大きな（例えば、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０倍大きい）生物活性を有する。一実施形態では、ＥＰＯバリアントは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して低い（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％以下低い）生物活性を有する。一実施形態では、ＥＰＯバリアントは、本明細書に記載の方法、例えば細胞増殖アッセイ（例えば、ＴＦ－１細胞増殖アッセイ）によって決定される場合、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と実質的に同じ生物活性を有する。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドバリアントは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して少なくとも２％の生物活性、例えば、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して少なくとも３％、４％、５％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は少なくとも９９．９％の生物活性を有する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドバリアントは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド。）に対して約１～１０％、約１０～２０％、約３０～４０％、約４０～５０％、約５０～６０％、約６０～７０％、約７０～８０％、約８０～９０％、約９０～１００％、約４０～４５％、約２０～２５％、約２～４％、又は約５～７％の生物活性を有する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドバリアントは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型ＥＰＯ）と比較してより大きな生物活性、例えば、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、又は５００％又はそれを超える生物活性を有する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドバリアントは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して同じ又は実質的に同じ生物活性を有する。
一実施形態では、ＥＰＯバリアントは、例えば、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの半減期の増加によって決定される安定性の増加を有する。一実施形態では、ＥＰＯバリアントは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、より大きい血清半減期、例えば、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、又は５００％又はそれを超える血清半減期を有する。
ＥＰＯポリペプチドの免疫原性
一態様では、本開示は、例えば参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、対象における免疫応答を減少させる（例えば、排除する）ように調整されたアミノ酸配列を含むＥＰＯポリペプチドを特徴とする。
外因性タンパク質の投与は、対象の免疫系を刺激し、免疫反応を引き起こすことがある。例えば、従来のｒＨｕＥＰＯ処置（例えば、エポエチンアルファの投与）の投与は、免疫反応及び内因性ＥＰＯと交差反応し得る抗ｒＨｕＥＰＯ中和抗体の発生をもたらし得る。ＥＰＯに対する免疫原性の結果は重度であり得、罹患した対象において赤芽球癆をもたらし得る。そのような有害事象は、特定の危険因子に関連している。特に、遺伝的要因は、例えば、ｒＨｕＥＰＯ誘発性赤芽球癆（ＰＲＣＡ）を発症するリスクと関連している対象における特定のクラスＩＩ ＭＨＣ－アレル（対立遺伝子）の発現に起因して、ｒＨｕＥＰＯに対する免疫原性のリスクを大幅に増加させ得る。さらに、ｒＨｕＥＰＯの医薬製剤等の他の因子は、例えば免疫反応を誘発し得るタンパク質凝集体に起因して、免疫原性のリスクを増加させ得る。さらに、投与の頻度は、免疫反応を形成するリスクを高め、ＥＰＯ依存性対象（例えば、慢性腎臓疾患を有する対象）を赤芽球癆等のｒＨｕＥＰＯ誘発障害を発症するリスクをより高する可能性がある。
理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドに対する免疫原性の原因は、対象において免疫原性抗体応答を誘因するＡＰＣの細胞表面に提示されたＭＨＣ分子による特定のＥＰＯエピトープの認識によって引き起こされ得ると考えられる。特定のクラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）は、ｒＨｕＥＰＯ誘導性ＰＲＣＡを発症するより高いリスクに関連している。例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）は、ｒＨｕＥＰＯ誘発性の赤芽球癆を発症するリスクが高いタイ人集団において高頻度で発現される。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を有する対象において低い免疫応答を回避又は誘発するように調整されたアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、低下したＨＬＡ結合親和性（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）結合親和性の低下）を有する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ｒＨｕＥＰＯと比較してより低い免疫原性を有する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドを対象に投与して、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）を投与した同等の対象において誘発される免疫原性と比較して、対象における免疫原性を低下させる（例えば、排除する）。一実施形態では、対象は、ｒＨｕＥＰＯに対する免疫原性に対して感受性であり、例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を有する対象である。
ＥＰＯポリペプチドの免疫原性は、公知の方法を用いて決定することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ 又はｅｘ ｖｉｖｏアッセイを使用して、例えば、ＥＰＯポリペプチドによって誘発されるＴ細胞応答を測定することができる。一実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏヒト初代モデルが使用される。例えば、血液を対象（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）について陽性又は陰性であることが知られている対象）から得て、処理して前駆樹状細胞及び／又はＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）を得ることができる。一実施形態では、前駆樹状細胞を培養物中で未成熟樹状細胞に変換し、次いで、ＥＰＯポリペプチドと接触させて（例えば、パルス）抗原提示細胞を得る。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドと接触させた樹状細胞と、血液試料から得られたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞）とを共培養する。樹状細胞及びＴ細胞を、任意の適切な比、例えば、それぞれ約１：４０、１：３０、１：２０又は１：１０の比で共培養することができる。一実施形態では、樹状細胞及びＴ細胞は、それぞれ約１：２０の比で共培養される。Ｔ細胞応答は、共培養物から放出されたインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）の量を定量することによって測定することができる。一実施形態では、非パルスＤＣ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との間の共培養からのＩＦＮ－γのレベルを、Ｔ細胞応答のバックグラウンド尺度として使用する。一実施形態では、Ｔ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体とインキュベートして、活性化Ｔ細胞応答の陽性対照を得る。次いで、参照タンパク質（例えば、野生型ＥＰＯ又は生物学的基準調製物（ＢＲＰ））と比較したＥＰＯポリペプチドの相対的Ｔ細胞応答の統計的比較を使用して、ＥＰＯポリペプチドの相対的免疫原性を決定し得る。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して低下したＴ細胞応答を誘発する。一実施形態では、ＥＰＯは、例えばＩＦＮ－γ放出の大きさによって測定される場合、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）によって誘発される応答の約９０％、例えば、ＩＦＮ－γ放出によって決定される場合、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）によって誘発されるＴ細胞応答と比較して、約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％又はそれ未満であるＴ細胞応答を示す。
一実施形態では、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）は、ＥＰＯバリアント（例えば、本明細書に記載のＥＰＯバリアント）によって誘発されるＴ細胞応答よりも約１倍大きい、例えばＥＰＯポリペプチドによって誘発されるＴ細胞応答よりも約２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍又は１００，０００倍大きいＴ細胞応答を誘発する。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、約１００～約５０，０００ｐｇ／ｍＬ、例えば約１５０～約４５，０００ｐｇ／ｍＬ又は約２００～約４０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ放出をもたらすＴ細胞応答を誘発する。一実施形態では、ＥＰＯバリアントは、約２００，２２０，２４０，２６０，２８０，３００，４００，５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、又は４０，０００ｐｇ／ｍＬのＩＦＮ－γ放出をもたらすＴ細胞応答を誘発する。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、アミノ酸配列の７４、７５、７６、７７、７９、８０、８１、８２、１０２、１０５、１０６、１０９、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１４２、１４５、１４６、１４８、１４９、１５２、又は１５３位に１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は全て）のアミノ酸変異を有し、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して免疫原性の低下をもたらす。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドで観察される免疫原性の大きさは、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陰性対象と比較した場合、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陽性対象で有意に減少する。一実施形態では、免疫原性が低下したＥＰＯポリペプチドは、低下したＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９結合親和性に関連する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドが有する変異は、ＥＰＯエピトープとＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９パラトープとの間の結合を減少させるように調整される。一実施形態では、免疫原性が低下したＥＰＯポリペプチドは、野生型ＥＰＯポリペプチドに関して、同様の生物作用能及び／又は影響を受けない生物学的機能を示す。
動物モデル
本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、例えば様々な動物モデルを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。例えば、動物モデルを使用して、ＥＰＯ受容体を活性化すること、及び／又は本明細書に記載の障害、例えば貧血又はＥＰＯ欠乏関連障害、例えば赤芽球癆を治療又は予防することにおける本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドの薬物動態学的及び／又は薬力学的特性を試験することができる。動物モデルはまた、例えば、副作用を調査するため、ＥＰＯポリペプチドの濃度をｉｎ ｓｉｔｕで測定するため、又はＥＰＯポリペプチドの免疫原性を測定するために使用することができる。
本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを評価するために使用することができる、本明細書に記載のＥＰＯ欠乏関連障害の例示的な動物モデルには、げっ歯類（例えば、マウス又はラット、例えば、Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット）が含まれるが、これらに限定されない。例えば、慢性腎臓疾患に関連する貧血のラットモデルは、例えば、Ｌａｎｄａｕ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１８）１３（５）：ｅ０１９６６８４に記載されており、ｒＨｕＥＰＯ誘発性赤芽球癆（ＰＲＣＡ）のラットモデルは、例えば、Ｗｏｏｄｂｕｒｎ，Ｋ．Ｗ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（２００７）３５（８）：１２０１－１２０８に記載されている。
本明細書に記載の障害の例示的な動物モデルも当技術分野で公知である。本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを評価するために使用することができる例示的な種類の動物には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ及びサルが含まれるが、これらに限定されない。
核酸及びベクター
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本明細書に記載の核酸は、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか１つをコードするヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の配列（例えば、本明細書に記載される配列と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％、９９．９％若しくはそれ以上同一であるか、又は３、６、１５、３０若しくは４５ヌクレオチド以下異なる配列）を含み得る。一実施形態では、核酸は、表２に記載のＥＰＯポリペプチド又はその断片をコードする。一実施形態では、本明細書に記載される核酸は、ＥＰＯ－１．１、ＥＰＯ－１．２、ＥＰＯ－１．３、ＥＰＯ－１．４、ＥＰＯ－１．５、ＥＰＯ－２．１、ＥＰＯ－２．２、ＥＰＯ－２．３、ＥＰＯ－３．１、ＥＰＯ－３．２、ＥＰＯ－３．３、ＥＰＯ－４．１、ＥＰＯ－４．２、ＥＰＯ－４．３、ＥＰＯ－５．１、ＥＰＯ－５．２若しくはＥＰＯ－６．１、又はそれらの機能的断片をコードする。
一実施形態では、核酸は、表２に示されるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４及び配列番号３６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、核酸は、表２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一実施形態では、核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３及び配列番号３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
本明細書に記載される核酸は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はそれらの類似体を含み得る。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であり得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含む。本明細書に記載の核酸中のヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。一実施形態では、核酸は、標識成分とのコンジュゲーション等によって、重合後に更に改変される。核酸は、組換えポリヌクレオチド、又はゲノム、ｃＤＮＡ、半合成若しくは合成起源のポリヌクレオチドであり得る。一実施形態では、本明細書に記載の核酸は、計算方法（例えば、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏツール）を使用して設計される。一実施形態では、核酸は、遺伝子合成を使用して生成され、宿主細胞における形質転換のために発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ ３．３発現ベクター）にクローニングされる。
本開示は更に、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを特徴とする。一実施形態では、ベクターは、表２に提供されるＥＰＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書に記載のベクターには、ウイルス、プラスミド、コスミド、ラムダファージ、又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、発現ベクター、例えばｐｃＤＮＡ（商標）発現ベクター、例えばｐｃＤＮＡ（商標）３．３である。多数のベクター系、例えばサイトメガロウイルス、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルス等の動物ウイルスに由来するＤＮＡ要素を利用するベクターを用いることができる。ＲＮＡウイルスに由来するＲＮＡ要素は、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、及びフラビウイルス等、本明細書に記載のベクターによって利用され得る。
さらに、ＤＮＡをその染色体に安定に組み込んだ細胞（すなわち、トランスフェクトされた宿主細胞）の選択を可能にするマーカーが導入され得る。マーカーは、例えば、栄養要求性宿主に対するプロトトロピー、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）、又は銅等の重金属に対する耐性等を提供し得る。選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結され得るか、又は共形質転換によって同じ細胞に導入され得る。ｍＲＮＡの最適な合成のために、追加の要素も必要とされ得る。これらの要素は、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサー及び終結シグナルを含み得る。
コンストラクトを含む発現ベクター又は核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を、適切な宿主細胞にトランスフェクト又は導入してもよい。様々なトランスフェクション技術、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、遺伝子銃、脂質ベースのトランスフェクション又は他の従来技術を使用してもよい。プロトプラスト融合の場合、細胞を培地中で増殖させ、適切な活性についてスクリーニングしてもよい。得られたトランスフェクト細胞を培養し、所望のタンパク質（例えば、ＥＰＯポリペプチド）を回収するための方法及び条件は当業者に公知であり、本明細書に基づいて、使用される特定の発現ベクター及び哺乳動物宿主細胞に応じて変更又は最適化され得る。
細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドをコードする核酸を含む細胞（例えば、宿主細胞）を特徴とする。一実施形態では、宿主細胞は、表２に提供されるアミノ酸配列、又はそれに実質的に相同な配列（例えば、それと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％以上同一の配列）、又は当該配列の１つの一部をコードする核酸を含む。一実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドをコードする核酸を含むように遺伝子操作される。一実施形態では、宿主細胞は、ＥＰＯ－１．１、ＥＰＯ－１．２、ＥＰＯ－１．３、ＥＰＯ－１．４、ＥＰＯ－１．５、ＥＰＯ－２．１、ＥＰＯ－２．２、ＥＰＯ－２．３、ＥＰＯ－３．１、ＥＰＯ－３．２、ＥＰＯ－３．３、ＥＰＯ－４．１、ＥＰＯ－４．２、ＥＰＯ－４．３、ＥＰＯ－５．１、ＥＰＯ－５．２若しくはＥＰＯ－６．１、又はそれらの機能的断片をコードする核酸を含むように遺伝子操作される。
一実施形態では、宿主細胞は、発現カセットを使用して遺伝子操作される。「発現カセット」という語句は、そのような配列に適合する宿主細胞において遺伝子の発現を行うことができるヌクレオチド配列を指す。発現カセットは、プロモーター、イントロンを含む又は含まないオープンリーディングフレーム、及び終結シグナルを含み得る。発現を行うのに必要又は有用な追加の因子、例えば誘導性プロモーターも使用され得る。一実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載のベクターを含む。
細胞（例えば、宿主細胞）は、とりわけ、真核細胞、細菌細胞、昆虫細胞、又はヒト細胞であり得る。適切な真核細胞としては、とりわけ、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＢＨＫ細胞及びＭＤＣＫＩＩ細胞が挙げられる。適切な昆虫細胞としては、限定されないが、Ｓｆ９細胞が挙げられる。適切な細菌細胞としては、とりわけ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が挙げられる。一実施形態では、細胞（例えば、宿主細胞）は単離された細胞である。一実施形態では、細胞（例えば、宿主細胞）は（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。一実施形態では、細胞（例えば、宿主細胞）は哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）である。一実施形態では、細胞（例えば、宿主細胞）はヒト細胞である。一実施形態では、細胞（例えば、宿主細胞）は、初代胚性ヒト腎臓に由来する。一実施形態では、細胞（例えば、宿主細胞）はＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞である。
ＥＰＯバリアントの使用
本明細書に開示されるＥＰＯポリペプチド、並びに本明細書に開示される医薬組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｖｏでの治療的、予防的、及び／又は診断的有用性を有する。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、例えば赤血球生成を刺激するために、１つ以上のＥＰＯ受容体を調節する（例えば、活性化する）。例えば、これらのＥＰＯポリペプチドは、１つ以上のＥＰＯ受容体を調節（例えば、活性化する）するために、培養中の細胞に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏで、又は対象、例えばヒト対象に、例えばｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯ受容体、例えばヒトＥＰＯ受容体を活性化又は実質的に活性化して赤血球生成を刺激し、例えば赤血球を形成し、ヘモグロビンＣ合成を刺激し、及び／又はヘマトクリット値を増加させる。したがって、一態様では、本開示は、対象において障害、例えば本明細書に記載の障害（例えば、貧血）を治療又は予防する方法であって、障害が治療又は予防されるように、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本開示は、障害、例えば本明細書に記載の障害、例えばＥＰＯに関連する障害（例えば、ＥＰＯ欠乏）又は貧血、例えばＥＰＯに関連する貧血又は障害（例えば、ＥＰＯ欠乏）を治療又は予防するために、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを培養中の細胞と、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ 又はｅｘ ｖｉｖｏで接触させること、又は本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを対象に、例えばｉｎ ｖｉｖｏで投与することを含む方法を提供する。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、参照ＥＰＯポリペプチド又は調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、１つ以上のクラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９）に対する結合親和性が低下している。例えば、１つ以上のクラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９）に対する結合親和性は、参照ＥＰＯポリペプチド（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上低下する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、１つ以上のクラスＩＩ ＭＨＣアレル（対立遺伝子）（例えば、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９）に対して結合親和性を有さない。例えば、これらのＥＰＯポリペプチドは、免疫応答を誘導することなく、又は参照ＥＰＯポリペプチド若しくは調製物（例えば、野生型若しくは天然に存在するＥＰＯポリペプチド、ＥＰＯに対するＢＲＰ、又は本明細書に記載の１つ以上（例えば、全て）の変異を欠く改変ＥＰＯポリペプチド）と比較して低下した免疫応答を誘導する、培養中、ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏで免疫細胞（例えば、抗原提示細胞及び／又はＴ細胞）に、又は対象、例えばヒト対象に、例えばｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。したがって、一態様では、本開示は、対象において障害、例えば本明細書に記載の障害（例えば、赤芽球癆）を治療又は予防する方法であって、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを対象に投与することを含む方法を提供する。例えば、本開示は、障害、例えば本明細書に記載の障害、例えばＥＰＯに関連する障害（例えば、ＥＰＯ欠乏）、例えば赤芽球癆を治療又は予防するために、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを培養中の細胞と、例えば ｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏで接触させること、又は本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを対象に、例えばｉｎ ｖｉｖｏで投与することを含む方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を含むことを意図している。一実施形態では、対象は、ヒト対象、例えば、ＥＰＯに関連する貧血若しくは障害（例えば、ＥＰＯ欠乏）を有するか、或いはＥＰＯに関連する貧血、又は障害（例えば、本明細書に記載のＥＰＯ欠乏症）を有するリスクがあるヒト患者である。「非ヒト動物」という用語は、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類を含む。一実施形態では、対象はヒトである。本明細書に記載の方法及び組成物は、本明細書に記載のＥＰＯに関連する貧血又は障害（例えば、ＥＰＯ欠乏）を有するヒト患者を治療するのに適している。本明細書に記載のＥＰＯに関連する貧血又は障害（例えば、ＥＰＯ欠乏）を有する患者には、本明細書に記載のＥＰＯに関連する貧血若しくは障害（例えば、ＥＰＯ欠乏）を発症したが（少なくとも一時的に）無症候性である患者、本明細書に記載のＥＰＯに関連する貧血若しくは障害（例えば、ＥＰＯ欠乏）の症状を呈した患者、又は本明細書に記載の貧血に関連する障害若しくはＥＰＯに関連する障害（例えば、ＥＰＯ欠乏）を有する患者が含まれる。
一実施形態では、ＥＰＯ関連障害（例えば、ＥＰＯ欠乏関連障害）は、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、例えば抗体陽性ＰＲＣＡである。
一実施形態では、対象は、貧血を有するか、又は貧血を有するリスクがある。一実施形態では、対象を貧血について治療する。一実施形態では、対象は、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、例えば抗体陽性ＰＲＣＡを有するか、又は有するリスクがある。一実施形態では、対象は、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、例えば、抗体陽性ＰＲＣＡについて治療される。
障害を治療又は予防する方法
本明細書に記載のＥＰＯポリペプチド（例えば、ＥＰＯバリアント）を、ＥＰＯに関連する障害、例えば貧血及び／又はＥＰＯ欠乏に関連する障害、又はその症状を治療又は予防するために使用することができる。
一実施形態では、障害はＥＰＯ欠乏に関連する。一実施形態では、障害は、ＥＰＯに関連するか又はＥＰＯによって媒介される。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、本明細書に記載の障害を有するか、又は本明細書に記載の障害を発症するリスクがある対象を治療するために使用される。
例示的な障害、例えば、ＥＰＯに関連する又はＥＰＯによって媒介される障害には、貧血（例えば、腎不全に関連する貧血；慢性腎臓疾患；慢性炎症；がん；ＨＩＶ又はＡＩＤＳ；化学療法（例えば、シス－白金誘発性貧血）ＡＩＤＳ又はＨＩＶ療法（例えば、ＡＺＴ治療）；放射線治療；及び骨髄移植）、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、鉄貯蔵障害、非リチウム性貧血、過剰な血球破壊、過剰な失血、サラセミア、鎌状赤血球症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、嚢胞性線維症、糖尿病性腎症、敗血症、脳の低酸素症又は虚血、リウマチ性疾患、骨髄異形成症候群、うっ血性心不全、ゴーシェ病、又はキャッスルマン病が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、典型的には、患者が回復するまで患者の系におけるＥＰＯポリペプチドの治療有効レベル及び／又は活性を維持する頻度で投与される。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、患者の生存期間中、患者の系内で治療有効レベルのＥＰＯポリペプチドを維持する頻度で投与される。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、患者の血液中のヘモグロビンの十分なレベル（例えば、１０ｇ／ｄＬ超、例えば、１１、１２、１３、１４又は１５ｇ／ｄＬ超、例えば、女性では約１２～１５．５ｇ／ｄＬ、又は男性では約１３．５～約１７．５ｇ／ｄＬ）を維持する頻度で投与される。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、若しくは７日毎、１、２、３、４、５、若しくは６週間毎、又は１、２、３、４、５、若しくは６ヶ月毎に投与される。
様々なＥＰＯポリペプチドを投与する方法は当技術分野で公知であり、以下に記載される。使用されるＥＰＯポリペプチドの適切な投与量は、対象の年齢及び体重並びに使用される特定の組成物に依存する。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドを対象（例えば、ヒト対象）に静脈内投与する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドを対象（例えば、ヒト対象）に皮下投与する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドを、約１０単位／ｋｇ～５００単位／ｋｇの間、例えば、約１５単位／ｋｇ～４００単位／ｋｇの間、約２０単位／ｋｇ～３５０単位／ｋｇの間、約２５単位／ｋｇ～３５０単位／ｋｇの間、約５０単位／ｋｇ～３００単位／ｋｇの間、約７５単位／ｋｇ～３００単位／ｋｇの間、約１００単位／ｋｇ～３００単位／ｋｇの間、約１００単位／ｋｇ～２５０単位／ｋｇの間、約１５０単位／ｋｇ～２５０単位／ｋｇの間、約５０単位／ｋｇ～１５０単位／ｋｇの間、又は約５０単位／ｋｇ～１００単位／ｋｇの間の用量で対象に投与する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドを、約１０００単位～６０，０００単位、例えば、約２０００単位～４０，０００単位、約３０００単位～４０，０００単位、約４０００単位～４０，０００単位、約１０，０００単位～４０，０００単位、約２０，０００単位～３０，０００単位、又は約３０，０００単位～４０，０００単位の固定用量で対象に投与する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、８週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、又は６ヶ月に１回投与される。
赤芽球癆（ＰＲＣＡ）
本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）を治療又は予防するために使用することができる。
ＰＲＣＡは、ウイルス感染、免疫学的媒介、妊娠、前段階の悪性腫瘍、毒性曝露及び薬物作用を含むいくつかの原因に関連する貧血の一種である。ＰＲＣＡ症状の特徴は、一般に、非常に低い網状赤血球及び赤血球前駆細胞を含むが、他の血球パラメータは比較的正常である。ｒＨｕＥＰＯに関連するＰＲＣＡは、例えば、重度のｒＨｕＥＰＯ耐性、輸血依存性、高血清フェリチン、赤血球前駆体の非存在及び抗ｒＨｕＥＰＯ抗体の存在を示す骨髄を含む明確な特徴を有する（例えば、Ｍｅａｎｓ，Ｒ．Ｔ．，Ｊｒ．Ｂｌｏｏｄ（２０１６）１２８：２５０４－２５０９；Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ（２００８）３：１９３－１９９を参照）。ＥＰＯ関連ＰＲＣＡの発生は、世界中で、特にタイ等の国で、罹患集団に大きな負担となっている（例えば、Ｐｒａｄｉｔｐｏｒｎｓｉｌｐａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２００９）２４：１５４５－１５４９を参照）。
内因性ＥＰＯに対する中和抗体の発現及び組換え赤血球生成促進剤（ＥＳＡ）に起因するＰＲＣＡの報告症例数は世界中で増加している（例えば、Ａｓａｒｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．（２００４）１５：２２０４－２２０７；Ｂｏｖｅｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．（２００５）６７：２３４６－２３５３；Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００２）３４６：４６９－４７５；Ｈｏｗｍａｎ，Ｒ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２００７）２２：１４６２－１４６４；Ｋｒｕｇｅｒ，Ａ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ（２００３）１８：１０３３－１０３４；Ｌａｃｒｅｔａ，Ｇ．Ｊ．Ｂｒａｓ．Ｎｅｆｒｏｌ．（２０１９）４１：１４５－１５１；ａｎｄ Ｓｉａ，Ｃ．Ａｎｎ Ａｃａｄ Ｍｅｄ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（２０２０）４９：４６－４８を参照）。ＰＲＣＡのこれらの症例は、ＣＫＤ関連貧血の治療のためにｒＨｕＥＰＯを投与されている患者において特に一般的である。理論に拘束されることを望むものではないが、ＥＳＡで治療されたことがない患者における内因性ＥＰＯに対する自己抗体の発現はまれであるが、抗ｒＨｕＥＰＯ中和抗体は内因性ＥＰＯと交差反応し得ると考えられる。
理論に拘束されることを望むものではないが、一実施形態では、ｒＨｕＥＰＯによって活性化される免疫原性抗体応答は、Ｔ細胞依存性であると考えられており（例えば、Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｃ．前出；Ｍａｚｏｒ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ（２０１８）１８８：１７３６－１７４３）、（ｉ）樹状細胞（ＤＣ）等のプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原の内在化；（ｉｉ）成熟ＡＰＣによるペプチド（エピトープ）への抗原のプロセシング、及びＡＰＣ表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子によるナイーブＴ細胞への提示；（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＭＨＣ ＩＩ－エピトープ複合体との相互作用；（ｉｖ）Ｂ細胞活性化のためのサイトカインを放出するためのＴ細胞の活性化；（ｖ）Ｂ細胞による特異的Ｔ細胞エピトープ／ＭＨＣ：ＴＣＲ相互作用を介して結合した抗原の認識；（ｖｉ）Ｔ細胞によるサイトカインの送達及び形質細胞に向けて増殖及び成熟するためのＢ細胞の刺激；並びに（ｖｉｉ）クローン増殖及び抗体分泌形質細胞へのＢ細胞の分化後の抗体の産生の段階を伴う。
証明された抗ｒＨｕＥＰＯ関連ＰＲＣＡを有するタイ人患者におけるＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、－ＤＲ及び－ＤＱアレル（対立遺伝子）の遺伝子頻度の分布に関する研究は、腎臓移植待機リストの対象（例えば、慢性腎臓疾患を有する対象）及び全国幹細胞ドナー登録の対象（例えば、正常な集団）におけるＨＬＡアレル（対立遺伝子）の遺伝子頻度と比較して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９と抗ｒＨｕＥＰＯ関連ＰＲＣＡのリスクとの間の関連性を実証した。この研究はまた、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を発現したＰＲＣＡを有する全ての対象がＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０３：０９アレル（対立遺伝子）も発現したことを示した（例えば、前出のＰｒａｄｉｔｐｏｒｎｓｉｌｐａを参照）。理論に拘束されることを望むものではないが、タイ人集団におけるＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）のより高い頻度（他の地域よりもおよそ１０倍高い）が、抗ｒＨｕＥＰＯ関連ＰＲＣＡのより高い有病率に寄与し得ると考えられる。
医薬組成物及びキット
別の態様では、本開示は、薬学的に許容され得る担体と共に製剤化された、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを含む組成物、例えば薬学的に許容され得る組成物を特徴とする。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、生理学的に適合性であるありとあらゆる溶媒、分散媒、等張剤及び吸収遅延剤等を含む。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、直腸、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入によって）に適し得る。一実施形態では、医薬組成物中のＥＰＯポリペプチドの約５％未満、例えば約４％、３％、２％、又は１％未満が凝集体として存在する。一実施形態では、凝集体のレベルは、クロマトグラフィー、例えば高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ－ＳＥＣ）によって決定される。
本明細書に記載の組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体及び固体剤形、例えば、液体溶液（例えば、注射可能及び注入可能な溶液）、分散液又は懸濁液、リポソーム及び坐剤が含まれる。適切な形態は、意図される投与様式及び治療用途に依存する。典型的な適切な組成物は、注射可能又は注入可能な溶液の形態である。１つの適切な投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、静脈内注入又は注射によって投与される。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは皮下注射によって投与される。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは筋肉内注射によって投与される。
本明細書で使用される場合、「非経口投与」及び「非経口投与される」という語句は、通常は注射による経腸及び局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内の注射及び注入が含まれるが、これらに限定されない。
治療用組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高タンパク質（例えば、ＥＰＯポリペプチド）濃度に適した他の秩序構造として製剤化することができる。滅菌注射液は、必要量の活性化合物（例えば、ＥＰＯポリペプチド）を、必要に応じて上に列挙した成分の１つ又は組み合わせと共に適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより、活性成分及び任意の追加の所望の成分の粉末が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、様々な方法によって投与することができる。いくつかは当技術分野で公知であり、多くの治療、予防、又は診断用途のために、適切な投与経路／投与様式は静脈内注射若しくは注入、又は皮下注射である。当業者によって理解されるように、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変化する。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、タンパク質を急速放出から保護する担体、例えばインプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤で調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法は、当業者に特許されているか又は一般に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、例えば、不活性希釈剤又は吸収可能な食用担体と共に経口投与することができる。ＥＰＯポリペプチド（及び必要に応じて他の成分）はまた、ハードシェルゼラチンカプセル又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、又は対象の食事に直接組み込まれてもよい。経口治療的投与のために、ＥＰＯポリペプチドを賦形剤と共に組み込み、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で使用することができる。非経口投与以外によってＥＰＯを投与するためには、タンパク質をその不活性化を防止するための材料で被覆するか、又はタンパク質をその不活性化を防止するための材料と同時投与することが必要であり得る。治療用、予防用、又は診断用組成物は、医療機器と共に投与することもでき、いくつかが当技術分野で公知である。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、１つ以上の結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、非水性ビヒクル、及び防腐剤、例えばマルトース又はステアリン酸マグネシウムを含む組成物で投与される。
投与レジメンは、所望の応答（例えば、治療応答、予防応答又は診断応答）を提供するように調整することができる。例えば、単回ボーラスを投与することができ、いくつかの分割用量を経時的に投与することができ、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少又は増加させることができる。投与の容易さ及び投薬量の均一性のために、非経口組成物を投薬単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される投薬単位形態は、治療される対象のための単位投薬量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体と会合して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。単位剤形の仕様は、（ａ）ＥＰＯポリペプチドの固有の特徴、及び達成される特定の治療、予防、又は診断効果、並びに（ｂ）個体における感受性の治療のためにそのようなＥＰＯポリペプチドを配合する技術に固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
ＥＰＯポリペプチドの治療上、予防上、又は診断上有効量の例示的な非限定的範囲は、対象の体重１ｋｇ当たり約１０単位～５００単位、例えば約１５単位／ｋｇ～４００単位／ｋｇ、約２０単位／ｋｇ～３５０単位／ｋｇ、約２５単位／ｋｇ～３５０単位／ｋｇ、約５０単位／ｋｇ～３００単位／ｋｇ、約７５単位／ｋｇ～３００単位／ｋｇ、約１００単位／ｋｇ～３００単位／ｋｇ、約１００単位／ｋｇ～２５０単位／ｋｇ、約１５０単位／ｋｇ～２５０単位／ｋｇ、約５０単位／ｋｇ～１５０単位／ｋｇ、又は約５０単位／ｋｇ～１００単位／ｋｇである。投与量値は、緩和される状態の種類及び重症度によって異なり得ることに留意されたい。任意の特定の対象について、特定の投与レジメンは、個々の必要性及び組成物の投与を管理又は監督する者の専門的判断に従って経時的に調整されるべきであり、本明細書に記載される投与量範囲は例示的なものにすぎず、特許請求される組成物の範囲又は実施を限定することを意図するものではないことを更に理解されたい。
本明細書の医薬組成物は、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドの「治療有効量」又は「予防有効量」を含み得る。
「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な投与量及び期間で有効な量を指す。ＥＰＯポリペプチドの治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別及び体重、並びにＥＰＯポリペプチドが個体において所望の応答を誘発する能力等の因子によって異なり得る。治療有効量はまた、ＥＰＯポリペプチドの任意の毒性又は有害な効果が治療上有益な効果によって上回る量である。「治療有効投与量」は、典型的には、未治療の対象と比較して、測定可能なパラメータを少なくとも約５％、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、又は少なくとも約８０％増加させる。測定可能なパラメータは、例えば、ヘモグロビンレベルであり得る。例えば、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、約１０ｇ／ｄＬ超、例えば約１１ｇ／Ｌ超、約１２ｇ／Ｌ、約１３ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌ、約１５ｇ／Ｌ、約１６ｇ／Ｌ、又は約１７ｇ／Ｌ以上のヘモグロビンレベルを達成するために投与することができる。測定可能なパラメータを増加させるＥＰＯポリペプチドの能力は、貧血の治療又は予防における有効性を予測する動物モデル系で評価することができる。或いは、組成物のこの特性は、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより、例えばＴＦ－１細胞増殖を測定することにより、ＥＰＯ受容体を活性化するＥＰＯポリペプチドの能力を調べることによって評価することができる。
「予防有効量」は、所望の予防結果を達成するために、必要な投与量及び期間で有効な量を指す。典型的には、予防用量が疾患の前又は初期段階で対象に使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少ない。
本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドを含むキットも本開示内にある。キットは、以下を含む１つ以上の他の要素：使用説明書；他の試薬、例えば、標識、治療剤、又はＥＰＯポリペプチドを標識若しくは治療剤、又は放射線防護組成物にキレート化するか、そうでなければカップリングするのに有用な薬剤；投与のためにＥＰＯポリペプチドを調製するための装置又は他の材料；薬学的に許容され得る担体；及び対象に投与するための装置又は他の材料を含むことができる。
併用療法
本明細書に記載のＥＰＯポリペプチドは、他の治療法と組み合わせて使用することができる。例えば、併用療法は、１つ以上の追加の治療剤、例えば本明細書に記載の１つ以上の追加の治療剤と同時製剤化及び／又は同時投与されるＥＰＯポリペプチドを含み得る。他の実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、他の治療処置様式、例えば本明細書に記載の他の治療処置様式と組み合わせて投与される。そのような併用療法は、有利には、投与される治療剤のより低い投与量を利用してもよく、したがって、様々な単剤療法に関連する起こり得る毒性又は合併症を回避し得る。
本明細書で使用される場合、「組み合わせて」投与されるとは、２つ（又はそれ以上）の異なる治療が、障害による対象の苦痛の前又はその間に対象に送達されることを意味する。一実施形態では、２つ以上の治療は、例えば、対象が障害を有するか又は障害と診断される前に、予防的に送達される。別の実施形態では、２つ以上の治療は、対象が障害を発症した後又は障害と診断された後に送達される。一実施形態では、第２の治療の送達が始まるときに１つの治療の送達が依然として行われているため、重複が存在する。これは、本明細書では「同時」又は「同時送達」と呼ばれることがある。他の実施形態では、一方の治療の送達は、他方の治療の送達が始まる前に終了する。いずれの場合の一実施形態でも、併用投与のために治療はより効果的である。例えば、第２の治療は、第２の治療が第１の治療の非存在下で投与された場合、又は第１の治療で類似の状況が見られる場合に見られるよりも、より少ない第２の治療で同等の効果が見られる、又は第２の治療は症状をより大きく軽減する。一実施形態では、送達は、症状又は障害に関連する他のパラメータの減少が、一方の治療を他方の非存在下で送達した場合に観察されるものよりも大きくなるようなものである。２つ以上の治療の効果は、部分的に相加的であってもよく、完全に相加的であってもよく、又は相加的よりも大きいものであってもよい。一実施形態では、２つ以上の治療の効果は相乗的であり得る。送達は、送達される第１の治療の効果は、第２の治療が送達されるときに依然として検出可能であるようなものであり得る。
一実施形態では、追加の薬剤は、第２のＥＰＯポリペプチド、例えば、第１のＥＰＯポリペプチドとは異なるＥＰＯポリペプチドである。組み合わせて使用することができる例示的なＥＰＯポリペプチドとしては、例えば、表２に列挙されるような、本明細書に記載されるＥＰＯポリペプチドの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、ＥＰＯに関連する又はＥＰＯによって媒介される疾患又は障害、例えば貧血（例えば、腎不全、慢性炎症、がん、又はＨＩＶ若しくはＡＩＤＳに関連する貧血）、サラセミア、鎌状赤血球症、化学療法に関連する貧血（例えば、シス－白金誘発性貧血）、放射線療法に関連する貧血、骨髄移植に関連する貧血、鉄貯蔵障害、再生不良性貧血、過剰な血球破壊、過剰な失血、ＡＩＤＳ又はＨＩＶ療法（例えば、ＡＺＴ治療）に関連する貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、嚢胞性線維症、糖尿病性腎症、敗血症、脳低酸素症又は虚血、リウマチ性疾患、骨髄異形成症候群、うっ血性心不全、ゴーシェ病、又はキャッスルマン病を治療又は予防するために第２の治療法と組み合わせて投与される。
本明細書に記載されるＥＰＯポリペプチド又は組成物と組み合わせて使用することができる例示的な治療法は、例えば、ヘモグロビン、補充鉄（例えば、元素状鉄；第二鉄塩若しくは第一鉄塩、又はそれらの組成物、例えば硫酸第一鉄、グルコン酸第一鉄、フマル酸第一鉄；鉄デキストラン；ヘム鉄ポリペプチド、例えばＰＲＯＦＥＲＲＩＮ（登録商標））、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン及び造血成長因子を含むコロニー刺激因子（例えば、インターロイキン－１β（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ））を含み得る。さらに、本明細書に記載のＥＰＯポリペプチド又は組成物は、別のＥＰＯポリペプチド、例えば組換えＥＰＯポリペプチドと組み合わせて使用することができる。組換えＥＰＯポリペプチドの非限定的な例としては、エポエチンアルファ（例えば、ＥＰＯＧＥＮ（登録商標）、ＥＰＯＡＤＥ（登録商標）、ＥＰＯＰＥＮ（登録商標）、ＥＰＯＸＩＴＩＮ（登録商標）、ＥＰＲＥＸ（登録商標）、ＥＲＹＰＲＯ（登録商標）、ＥＳＰＯ（登録商標）、ＧＬＯＢＵＲＥＮ（登録商標）、ＰＲＯＣＲＩＴ（登録商標））、エポエチンベータ（例えば、ＥＰＯＣＨ（登録商標）、ＥＰＯＧＩＮ（登録商標）、ＥＲＡＮＴＩＮ（登録商標）、ＥＲＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、ＭＡＲＯＧＥＮ（登録商標）、ＮＥＯＲＥＣＯＲＭＯＮ（登録商標）、ＲＥＣＯＲＭＯＮ（登録商標））、エポエチンオメガ（例えば、ＥＰＯＭＡＸ（登録商標）、ＨＥＭＡＸ（登録商標））、エポエチンデルタ（例えば、ＤＹＮＥＰＯ（登録商標））及びダルベポエチンアルファ（例えば、ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標））が挙げられる。ＥＰＯポリペプチドはまた、連続エリスロポエチン受容体活性化因子（ＣＥＲＡ）又は合成赤血球生成タンパク質（ＳＥＰ）と組み合わせることができる。一実施形態では、ＥＰＯポリペプチドは、化学療法剤、例えばホルモン、光増感剤、放射性核種、毒素、代謝拮抗物質、シグナル伝達調節剤、抗体（例えば、抗がん抗体）、ペプチド又はオリゴペプチド（例えば、抗がんオリゴペプチド）、オリゴヌクレオチド（例えば、抗がんオリゴヌクレオチド）、又は血管新生阻害剤等の別の治療法と組み合わせて使用される。
本明細書に記載の開示をより完全に理解することができるように、以下の例を記載する。これらの例は、例示のみを目的として提供されており、特に明記しない限り、限定することを意図しない。したがって、本開示は、決して以下の例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形例を包含すると解釈されるべきである。
以下の例では、計算設計を使用して、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ １＊０９によって認識される免疫原性ホットスポットをスクリーニングし、構造的完全性及び生物活性を破壊することなく、アレル（対立遺伝子）に対する親和性を低下させる１～４個の変異のいずれかを有する１７個の突然変異体を予測した。１７の突然変異体のうち５つは、参照組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）と同様又はわずかに低下した生物活性を保持しながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏで免疫原性が低いことが分かった。これらの操作されたタンパク質は、ｒＨｕＥＰＯ依存性であり、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を発現する患者を治療するために使用され得る。
例１：組換えヒトＥＰＯバリアントの設計
ＭＨＣエピトープ予測分析
タンパク質構造及びＥＰＯ受容体との結合を維持しながら、ＭＨＣ ＩＩアレル（対立遺伝子）との結合を破壊するエリスロポエチン（ＥＰＯ）アミノ酸配列の変異を予測するために計算評価を行った。具体的には、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏツール（ＮｅｔＭＨＣＩＩ ２．２）を使用して、ＥＰＯエピトープと主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩアレル（対立遺伝子）ＨＬＡ－ＤＲＢ １＊０９－ＤＱＢ１＊０３：０９（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１８），１５４：３９４－４０６）との間の結合に関与するアミノ酸残基を予測した。５つのコア結合部位は、ＶＬＲＧＱＡＬＬＶ（配列番号３７）（位置７４～８２）、ＬＲＳＬＴＴＬＬＲ（配列番号３８）（位置１０２～１１０）、ＬＬＲＡＬＧＡＱＫ（配列番号３９）（位置１０８～１１６）、ＦＲＶＹＳＮＦＬＲ（配列番号４０）（位置１４２～１５０）、及びＹＳＮＦＬＲＧＫＬ（配列番号４１）（位置１４５～１５３）であると予測され、これらは３つの異なる非重複領域（残基７４～８２（ＶＬＲＧＱＡＬＬＶ（配列番号３７））、１０２～１１６（ＬＲＳＬＴＴＬＬＲＡＬＧＡＱＫ（配列番号４４））及び１４２～１５３（ＦＲＶＹＳＮＦＬＲＧＫＬ（配列番号４５）））にマッピングされた。
予測されたアレル（対立遺伝子）は、共結晶構造（ＰＤＢ：１ＥＥＲ）から推測される２つの細胞表面エリスロポエチン受容体によって認識される部位と重複していた。文献からの抗ＥＰＯ抗体を中和する既知の部位もマッピングした。例えば、図１Ａは、ＥＰＯのアミノ酸配列を提供し、受容体が接触する部位（ＰＤＢ：１ ＥＥＲ）を太字で示し、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９－ＤＱＢ１＊０３：０９アレル（対立遺伝子）への結合についてＮｅｔＭＨＣＩＩ ２．２によって予測される領域を網掛けで示す。中和抗体によって認識される部位に下線が引かれている。アミノ酸修飾のために考慮される部位は、上にアスタリスクで示される。さらに、図１Ｂは、アレル（対立遺伝子）結合部位７４及び１０２のうちの２つを含む、相互作用する疎水性アミノ酸のネットワークの一例を提供する。次いで、７４及び／又は１０２への改変は、このネットワーク内の他の位置での適切な置換によって補償された。
予測されるアレル（対立遺伝子）結合領域における残基の改変
ＥＰＯバリアントの生物活性を保存するために、ＥＰＯポリペプチドのＥＰＯ－Ｒ結合界面又は構造的完全性に関与する残基、例えばアルファらせん束（図１Ｂ）の高度に網目構造化されたらせん（Ｂ－Ｃ－Ｄ）内に位置する残基の改変を回避しながら、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を減少させ、抗体結合を中和するために、予測されるアレル（対立遺伝子）結合領域に対する改変を設計した。具体的には、既知の中和抗体部位と重複するか又は近接する領域１０２～１１６及び１４２～１５３を選択し、合計２５個の部位：７４、７５、７６、７７、７９、８０、８１、８２、１０２、１０５、１０６、１０９、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１４２、１４５、１４６、１４８、１４９、１５２及び１５３（図１Ａ）を含めた。非受容体結合部位（非ＲＢＳ）残基を改変のために選択し、ＥＰＣＮ法の変形を使用して原子間接触を最適化した（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１５）１６２：４９３－５０４）。表２に示すように、ＨＬＡ親和性破壊設計を有する１７のＥＰＯバリアントを考案した。
例２：ＥＰＯバリアントの発現及び精製
次いで、例１で設計し、表２に示したＥＰＯバリアントを、以下の手順を用いて組換え発現及び精製した。
プラスミドの作製及び調製
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、変異・置換部位が１箇所のみのＥＰＯバリアントをコードする配列を含むｐｃＤＮＡ ３．３発現ベクターを作製した。２つ以上の変異／置換部位を有するＥＰＯバリアントをコードする配列を、遺伝子合成を使用して生成し、ｐｃＤＮＡ ３．３発現ベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ２．０）に形質転換した。精製プラスミドをＤＮＡ配列決定（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に供して変異を確認した。
タンパク質の発現及び精製
ＥＰＯ野生型（ＥＰＯ－ＷＴ）又はＥＰＯバリアントをコードする配列を含む精製ｐｃＤＮＡ ３．３発現ベクターを、２５ｋＤ線形ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３－Ｆ細胞に一過性にトランスフェクトした。６日後、Ｈｉｔｒａｐ Ｂｌｕｅ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上清からＥＰＯポリペプチドを精製し、１．５Ｍ ＮａＣｌで溶出し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．４５）に緩衝液交換した。次に、試料をＨｉｔｒａｐ Ｑ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、カラムを２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）で洗浄し、続いて２０ｍＭ Ｔｒｉｓで２回目の洗浄を行った。次いで、ＥＰＯポリペプチドを１Ｍ ＮａＣｌで溶出し、精製ＥＰＯポリペプチドを保存緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７、１．５％グリシン及び０．００３％ Ｔｗｅｅｎ－２０）に緩衝液交換した。
細胞培養：ＦＲＥＥＳＴＹＬＥ（商標）２９３－Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１３０ ＲＰＭのシェーカーを使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、８％ＣＯ２下、３７℃で培養した。ヒト赤白血病細胞株ＴＦ－１（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ及び２ｎｇ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦを添加したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。
例３：ＥＰＯバリアントの特性決定
次いで、例２で得られたＥＰＯバリアントを定量し、以下の手順に従って特性決定を行った。
ＥＰＯポリペプチドの定量
ＥＰＯ野生型及びＥＰＯバリアントタンパク質の両方の定量のためにサンドイッチＥＬＩＳＡを開発した。事前に吸収されたＭａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２．５μｇ／ｍＬの捕捉抗体（ヒトＥＰＯに対するマウスモノクローナルＩｇＧ２Ａ、ＭＡＢ ２８７１；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）のブロッキング溶液を添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した。ＥＰＯバッチ４（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ＆Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｆｒａｎｃｅ；Ｂｕｒｎｓ ｅｔ ａｌ．（前出））の生物学的基準調製物（ＢＲＰ）を使用して、標準曲線を作成した。ＥＰＯ標準又はＥＰＯ試料の連続希釈（２．５倍）は、それぞれ１０，０００国際単位（ＩＵ）又は未希釈濃度の開始濃度で達成された。希釈をＰＢＳＴ中で、２連で行った。ＢＲＰ及び試料の両方を室温で２時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで洗浄した。ＰＢＳＴ中１μｇ／ｍＬの濃度の一次抗体（ヒトＥＰＯ、ＡＢ－２８６－ＮＡに対するウサギポリクローナルＩｇＧ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで洗浄した。続いて、ＰＢＳＴ中の二次抗体（ウサギＩｇＧに対するヤギポリクローナル二次Ａｂ－Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）、事前吸収、ａｂ９７０８０；Ａｂｃａｍ）を０．１μｇ／ｍＬ添加し、室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで洗浄した。検出のため、ＴＭＢ基質（ＳｅｒａＣａｒｅ）を添加した。クエンチングは、１Ｎ硫酸を添加することによって達成された。プレートを、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して４５０ｎｍで読み取った。
ＥＰＯポリペプチドの特性決定
ＦＰＬＣからの精製ＥＰＯポリペプチド中のタンパク質含有量を、クーマシーブルー染色と共にＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して決定した。１２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルを用いてタンパク質試料を分離し、次いで、一定の１７５電圧で１．５時間、分子量に従って分離した。電気泳動したゲルをＩＮＳＴＡＮＴＢＬＵＥ（商標）タンパク質染色剤（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色した。ＩｍａｇｅＪプログラム（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）９：６７１－６７５）を使用して各レーンのバンド強度を測定することにより、タンパク質バンドの純度を分析した。精製タンパク質の純度は９４～９９％であった。脱グリコシル化及びグリコシル化ＥＰＯポリペプチドのサイズは、それぞれ３０．６ｋＤａ及び３６～４０ｋＤａと推定される。ＢＲＰ、精製ＥＰＯ－ＷＴ及びＥＰＯバリアントの両方が、予想される分子量を示した。
次いで、抗ＥＰＯ抗体を用いたウエスタンブロット分析を行って、タンパク質の同一性を確認した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル中のタンパク質をニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に転写し、膜をウサギポリクローナルＩｇＧと共にヒトＥＰＯ、ＡＢ－２８６－ＮＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベーションし、その後、ロバ由来のＥＣＬ（商標）抗ウサギＩｇＧ、ペルオキシダーゼ結合種特異的全抗体、ＮＡ９３４Ｖ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とインキュベーションした。ＥＣＬ（商標）Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてシグナルを展開した。化学発光シグナルを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して検出及び分析した。ＢＲＰ、ＥＰＯ－ＷＴ及びＥＰＯバリアントタンパク質は全て陽性バンドを示した。
例えば、図２Ａ～２Ｂは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量にしたがった分離後の、ＥＰＯ標準、野生型及び突然変異体タンパク質を含むＥＰＯポリペプチドのクーマシーブルー染色ゲル（図２Ａ）、及びウエスタン免疫ブロッティング（図２Ｂ）を提供する。使用した材料は、ＢＲＰ、ＥＰＯ標準、マーカー、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ；ＷＴ、ＥＰＯ－ＷＴ；１．２，ＥＰＯ－１．２（Ｌ７０Ｖ、Ｖ７４Ｌ、Ｌ１０２Ｉ）；３．１，ＥＰＯ－３．１（Ｔ１０６Ａ）；３．２，ＥＰＯ－３．２（Ｔ１０６Ｇ）；３．３，ＥＰＯ－３．３（Ｔ１０６Ｈ）；４．１、ＥＰＯ－４．１（Ｌ１０９Ａ）を組んだ。
ＥＰＯアイソフォームの特性決定
ＥＰＯポリペプチドのアイソフォーム分布を、Ｗｏｒｌｄ Ａｎｔｉ－Ｄｏｐｉｎｇ Ａｇｅｎｃｙ（ｗｗｗ．ｗａｄａ－ａｍａ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｃｉｅｎｃｅ－ｍｅｄｉｃｉｎｅ／ｔｄ２０１４ｅｐｏ）によって概説されたＴＤ２０１４ＥＰＯ技術文書に従って決定した。上に概説した方法によって調製した精製ＥＰＯ試料をＭｉｌｌｉＱ水に緩衝液交換し、フラットベッド電気泳動セル－ＭｕｌｔｉｐｈｏｒＩＩ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、２～６のｐＨ勾配で、それらのｐＩに従って等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルで分離した。次いで、電気泳動した試料を、セミドライＮｏｖａｂｌｏｔ転写システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ａｒｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ（商標）－Ｐ ＰＶＤＦ転写膜（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。ブロッティング後、膜を本明細書に記載されるウエスタンブロット分析によって処理した。
ＥＰＯポリペプチドのＩＥＦによるアイソフォーム分析を、ＥＰＯ標準、野生型及び突然変異体タンパク質を含めて図３に示す。タンパク質の分離されたバンドは、それらの既存のグリコフォームの数を表す。精製ＥＰＯポリペプチドの異なるアイソフォームの分布を、ＥＰＯ標準であるＢＲＰと比較した。ＢＲＰ、ＥＰＯ標準；ＷＴ、ＥＰＯ－ＷＴ；１．２，ＥＰＯ－１．２（Ｌ７０Ｖ、Ｖ７４Ｌ、Ｌ１０２Ｉ）；３．１，ＥＰＯ－３．１（Ｔ１０６Ａ）；３．２，ＥＰＯ－３．２（Ｔ１０６Ｇ）；３．３，ＥＰＯ－３．３（Ｔ１０６Ｈ）；４．１、ＥＰＯ－４．１（Ｌ１０９Ａ）。
ＢＲＰ及び６つのＥＰＯ試料（１つの野生型及び５つの突然変異体）の間のグリコフォーム分布を、ゲルの塩基性領域（図３）で観察した。ＢＲＰは、予想通り６つのアイソフォームを示した。しかしながら、ＥＰＯ試料間のアイソフォームの数は変動した（また、ＥＰＯ－３．３は６つのアイソフォームを示し、ＥＰＯ－ＷＴ、ＥＰＯ－３．１及びＥＰＯ－３．２は７つのアイソフォームを示し、一方、ＥＰＯ－１．２及びＥＰＯ－４．１は８つのアイソフォームを示した）。ＥＰＯ－３．１、ＥＰＯ－３．２、ＥＰＯ－３．３及びＥＰＯ－４．１は、アイソフォーム分布の塩基性アイソフォームへのシフトを示した。これらのＥＰＯ試料の２つの最も塩基性のバンドは、ＥＰＯ－ＷＴよりも有意に高かった。一方、ＥＰＯ－１．２は、同等のプロファイル又は酸性アイソフォームへのわずかなシフトを示した。
例４：ＥＰＯバリアントのＩｎ Ｖｉｔｒｏ生物活性
例２で得られたＥＰＯバリアントタンパク質（表２に示す）の生理活性を、赤白血病患者由来のＴＦ－１細胞株を用いて、以下の手順で細胞増殖アッセイにより測定した。合計２．５×１０４個のＴＦ－１細胞を９６ウェル平底プレート（Ｎｕｎｃ）にプレーティングした。ＢＲＰ又はＥＰＯポリペプチド（５０ＩＵ／ｍＬ）を３倍希釈した。全ての希釈を四連で行った。７２時間のインキュベーション後、ＷＳＴ－１細胞増殖試薬（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。反応物を５％ＣＯ２中で４時間インキュベートした。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）を用いて４５０ｎｍ及び６９０ｎｍの吸光度を測定した。ＧＥＮ５（商標）データ分析ソフトウェア（Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して、４パラメータロジスティック回帰関数を用いてＥＣ５０及びＲ２を計算した。ＥＰＯ－ＷＴに対するＥＰＯバリアントの相対効力（ＲＥＰ）を評価するために、平行度分析を行った。４パラメータロジスティック回帰のｌｏｇ用量－反応曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）によって作成した。
ＥＰＯ－１．２（Ｌ７０Ｖ、Ｖ７４Ｌ及びＬ１０２３Ｉ）、ＥＰＯ－３．１（Ｔ１０６Ａ）、ＥＰＯ－３．２（Ｔ１０６Ｇ）、ＥＰＯ－３．３（Ｔ１０６Ｈ）及びＥＰＯ－４．１（Ｌ１０９Ａ）を含む、ＴＦ－１細胞を有する選択されたＥＰＯバリアントのｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性を、図４の対数用量応答曲線に示す。５つ全てのＥＰＯバリアントは、野生型ＥＰＯと比較して低い生物活性を示した。特に、ＥＰＯ－１．２及びＥＰＯ－４．１は、ＥＰＯ－ＷＴに対する相対生物活性（ＲＥＰ）がそれぞれ０．０５９（又はＥＰＯ－ＷＴと比較して５．９％の活性）及び０．０３２（又はＥＰＯ－ＷＴと比較して３．２％の活性）であった。ＥＰＯ－３．１は、ＲＥＰが０．４３１のＥＰＯバリアントの中で最も高い生物活性を有していた（又はＥＰＯ－ＷＴと比較して４３．１％の活性）。ＥＰＯ－３．２及びＥＰＯ－３．３は同じ範囲の生物活性であり、ＲＥＰはそれぞれ０．２４３（又はＥＰＯ－ＷＴと比較して２４．３％の活性）及び０．２２９（又はＥＰＯ－ＷＴと比較して２２．９％の活性）であった。
例５：ＥＰＯバリアントの免疫原性
本明細書に記載の方法（ＥＰＯ－ＷＴ、ＥＰＯ－１．２、ＥＰＯ－３．１、ＥＰＯ－３．２、ＥＰＯ－３．３及びＥＰＯ－４．１）によって調製した例示的なＥＰＯバリアントの免疫原性を以下の手順によって試験した。図５Ａ～５Ｃによって例示されるように、試験された５つ全てのＥＰＯバリアントは、ＢＲＰ及び野生型ＥＰＯと比較してより低い免疫原性を示した。
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の調製
ＥＤＴＡ処理真空管（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で５０人の健康なボランティアから血液を採取した。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９遺伝子並びにＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、梅毒及びＨＩＶを含む一般的な感染症の存在を、タイのＣｈｕｌａｌｏｎｇｋｏｒｎ大学の医学部で決定した。５０名のボランティアのうち１１名（２２％）がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９を有しており、そのうち４名が女性（３６％）であり、７名が男性（６４％）であった。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陰性及び陽性の全てのボランティアを免疫原性試験のために無作為に選択し、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、梅毒及びＨＩＶを含む一般的な感染症について陰性であることを確認した。ＩｓｏＰｒｅｐ溶液（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、３人のＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陰性ボランティア及び３人のＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陽性ボランティアの血液からＰＢＭＣを単離した。
樹状細胞の培養及びフローサイトメトリー分析
完全ＲＰＭＩ培地（３ｍＬ）中のＰＢＭＣの合計１０×１０６細胞を６ウェルプレートの各ウェルに播種した。３７℃、５％ＣＯ２下で２時間インキュベートした後、前駆樹状細胞（ＤＣ）をプラスチックへの接着によって他の免疫細胞から分離し、非接着細胞をＣＤ４＋Ｔ細胞の供給源として収集した。ＧＭ－ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍＬ；ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）を含有する完全ＲＰＭＩ培地を、前駆樹状細胞（ＤＣ）を表す接着細胞に添加した。細胞をインキュベートし、７５％の使用済み培地を２日毎にサイトカインを含む新鮮な培地に交換した。前駆体ＤＣから未成熟ＤＣへの分化を、ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）を使用してＢＤ ＦＡＣＳＣＡＮＴＯ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってモニターした。両群の未成熟ＤＣ成熟の割合は、ＤＣ培養の７日目に５０．７～８０．４の範囲であった。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）として成熟ＤＣを生成するために、未成熟ＤＣを回収し、完全ＲＰＭＩ培地で洗浄した。次いで、合計１０５個の細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、１０μｇ／ｍＬのＢＲＰ又はＥＰＯポリペプチド（ＥＰＯ－ＷＴ、ＥＰＯ－１．２、ＥＰＯ－３．１、ＥＰＯ－３．２、ＥＰＯ－３．３及びＥＰＯ－４．１）と共に４８時間インキュベート（パルス）した。タンパク質なしでインキュベートした未成熟な（Ｉｍｍｕｔｕｒｅ）ＤＣを対照ＤＣ（非パルスＤＣ）として使用した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞の分離及び活性化
ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＤＣ培養のために単球を提供した同じボランティアからのＰＢＭＣの非接着性細胞画分から、ＭＡＣＳ Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた陰性選択によって単離した。生存率は９０％超であった。エフェクター免疫細胞を活性化するために、同じボランティア由来のＥＰＯパルス処理（成熟）ＤＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞を１：２０の比で共培養した。陽性対照には、５μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ３及び２μｇ／ｍＬ抗ヒトＣＤ２８（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）を補充した非パルスＤＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞の共培養が含まれた。バックグラウンド対照には、非パルスＤＣ及びＣＤ４＋Ｔ細胞単独の共培養が含まれた。全ての共培養物をＩＬ－２（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－１２（３０ｎｇ／ｍＬ）ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）の存在下で４日間インキュベートし、次いで採取した。
Ｔ細胞応答を表すインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）のレベルを、ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）によって定量した。非パルスＤＣ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との間の共培養からのＩＦＮ－γのレベルを、Ｔ細胞応答のバックグラウンドとみなした。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陰性群と陽性群との間のＢＲＰと比較したＥＰＯポリペプチドの相対的Ｔ細胞応答の統計的比較により、試験した５つのＥＰＯバリアント全てが、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陽性群において有意に低いＴ細胞応答を有することが実証された。
ＥＰＯポリペプチドのｅｘ ｖｉｖｏ免疫原性アッセイの結果を図５Ａ～５Ｃに示す。３名のＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陰性ボランティア及び３名のＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陽性ボランティアからの平均値を、それぞれ陰性群又は陽性群として組み合わせた。各群をＢＲＰに対する応答と比較し、ＥＰＯポリペプチドの相対応答のパーセンテージで示した（図５Ａ）。棒グラフを、各群の３人の個体から計算した平均±ＳＥＭとして示す。アスタリスク記号は、ｔ検定による有意差を示す（＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１）。各ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陽性ボランティアのＩＦＮ－γレベルを図５Ｂに示し、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陰性ボランティアを図５Ｃに示す。棒グラフを、二重の実験から計算された平均±ＳＥＭとして示す。
ｐ値は、ＥＰＯ－１．２が０．００３８、ＥＰＯ－３．１が０．００００２４、ＥＰＯ－３．２が０．００００３７、ＥＰＯ－３．３が０．０００３１、ＥＰＯ－４．１が０．００１２であった。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陰性群及び陽性群の両方において、ＥＰＯ－ＷＴを使用したＴ細胞応答に差はなかった。ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陽性群及び陰性群の両方において、ＢＲＰ及びＥＰＯ－ＷＴは、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と同じ様式でＴ細胞応答を刺激することができた。ＥＰＯ－１．２、ＥＰＯ－３．１、ＥＰＯ－３．２、ＥＰＯ－３．３及びＥＰＯ－４．１を含むＥＰＯバリアントは、はるかに低いＴ細胞応答を示し、ＩＦＮ－γ放出は２２０～３７，０００ｐｇ／ｍＬの範囲であった。理論に拘束されることを望むものではないが、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陽性群及びＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陰性群に見られるＥＰＯ特異的Ｔ細胞応答の異なる背景は、個体におけるＨＬＡアレル（対立遺伝子）分布の違いによるものであり得る（例えば、Ｐｒａｄｉｔｐｏｒｎｓｉｌｐａ ｅｔ ａｌ．前出；及びＴａｎｇｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００５）１７４：３１８７－３１９６を参照）。
統計分析：Ｔ検定分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．を使用して行った。例えば、ｔ検定を使用して、ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９陰性群と陽性群との間の相対的Ｔ細胞応答の差の統計学的有意性を決定した。
ヒト対象：ヒト対象を含む研究は、タイのＣｈｕｌａｂｈｏｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの倫理審査委員会によって承認されたプロトコルの下で行われた。全てのボランティアが書面によるインフォームドコンセントを提出した。
参照による組み込み
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び受託番号は、あたかも各個々の刊行物又は特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
均等物
本開示の特定の実施形態を説明したが、上記の明細書は例示的なものであり、限定的なものではない。本明細書及び以下の特許請求の範囲を検討することにより、本開示の多くの変形が当業者に明らかになるであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲、その均等物の全範囲と共に、及び明細書、並びにそのような変形例を参照することによって決定されるべきである。
配列表３ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表４ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表５ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表６ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表７ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表８ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表９ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表１０ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表１１ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表１２ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表１３ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表１４ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表１５ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表１６ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表１７ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表１８ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表１９ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表２０ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表２１ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表２２ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表２３ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表２４ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表２５ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表２６ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表２７ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表２８ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表２９ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表３０ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表３１ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表３２ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表３３ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表３４ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表３５ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表３６ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリヌクレオチド
配列表４２ ＜２２３＞人工配列の記載：合成ポリペプチド
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ａ」又は「Ｉ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ｉ」又は「Ｗ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ｄ」、「Ｎ」、又は「Ｖ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ｖ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ｄ」、「Ｌ」、又は「Ｎ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ｄ」、「Ｉ」、「Ｎ」、「Ｔ」、又は「Ｖ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ｆ」又は「Ｓ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ａ」、「Ｇ」、又は「Ｈ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ａ」、「Ｃ」、又は「Ｗ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ｃ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ｎ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ｖ」又は「Ｗ」
配列表４２ ＜２２３＞置き換え＝「Ｑ」
配列表４２ ＜２２３＞配列内で指定されるバリアント残基は、バリアント位置のアノテーション内のバリアント残基に対して優先されない
配列表４２ ＜２２３＞置換及び好ましい実施形態の詳細な説明については出願時の明細書を参照されたい。
配列表４３ ＜２２３＞人工配列の記載：合成 ６×Ｈｉｓタグ

Claims (167)

  1. 配列番号１の１２～１５２位のいずれかに対応する位置に変異を含む、エリスロポエチン（ＥＰＯ）分子。
  2. 配列番号１の７４～８２位、１０２～１１６位又は１４２～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１に記載のＥＰＯ分子。
  3. 配列番号１の７４～８２位又は１０２～１１６位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１又は２に記載のＥＰＯ分子。
  4. 配列番号１の７４～８２位又は１４２～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１～３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  5. 配列番号１の１０２～１１６位又は１４２～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１～４のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  6. 配列番号１の７４～８２位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１～５のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  7. 配列番号１の１０２～１１６位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１～６のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  8. 配列番号１の１０２～１１０位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１～７のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  9. 配列番号１の１０８～１１６位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１～８のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  10. 配列番号１の１４２～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１～９のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  11. 配列番号１の１４２～１５０位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１～１０のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  12. 配列番号１の１４５～１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１～１１のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  13. 配列番号１の７４、７５、７６、７７、７９、８０、８１、８２、１０２、１０５、１０６、１０９、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１４２、１４５、１４６、１４８、１４９、１５２、又は１５３位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１～１２のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  14. 配列番号１の１２、１５、６７、７０、７４、１０２、１０５、１０６、１０９、１１４、１４６、１４９、又は１５２位のいずれかに対応する位置に変異を含む、請求項１～１３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  15. 複数の位置に複数の変異を含む、請求項１～１４のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  16. 本明細書に開示される第２の位置に第２の変異を更に含む、請求項１５に記載のＥＰＯ分子。
  17. 本明細書に開示される第３の位置に第３の変異を更に含む、請求項１６に記載のＥＰＯ分子。
  18. 本明細書に開示される第４の位置に第４の変異を更に含む、請求項１７に記載のＥＰＯ分子。
  19. 本明細書に開示される第５の位置に第５の変異を更に含む、請求項１８に記載のＥＰＯ分子。
  20. 本明細書に開示される第６の位置に第６の変異を更に含む、請求項１９に記載のＥＰＯ分子。
  21. 配列番号１の１２位に対応する位置に変異を含む、請求項１～２０のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  22. 変異がＬ１２Ａ置換である、請求項２１に記載のＥＰＯ分子。
  23. 変異がＬ１２Ｉ置換である、請求項２１に記載のＥＰＯ分子。
  24. 配列番号１の１５位に対応する位置に変異を含む、請求項１～２３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  25. 変異がＹ１５Ｉ置換である、請求項２４に記載のＥＰＯ分子。
  26. 変異がＹ１５Ｗ置換である、請求項２４に記載のＥＰＯ分子。
  27. 配列番号１の６７位に対応する位置に変異を含む、請求項１～２６のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  28. 変異がＬ６７Ｄ置換である、請求項２７に記載のＥＰＯ分子。
  29. 変異がＬ６７Ｎ置換である、請求項２７に記載のＥＰＯ分子。
  30. 変異がＬ６７Ｖ置換である、請求項２７に記載のＥＰＯ分子。
  31. 配列番号１の７０位に対応する位置に変異を含む、請求項１～３０のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  32. 変異がＬ７０Ｖ置換である、請求項３１に記載のＥＰＯ分子。
  33. 配列番号１の７４位に対応する位置に変異を含む、請求項１～３２のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  34. 変異がＶ７４Ｄ置換である、請求項３３に記載のＥＰＯ分子。
  35. 変異がＶ７４Ｌ置換である、請求項３３に記載のＥＰＯ分子。
  36. 変異がＶ７４Ｎ置換である、請求項３３に記載のＥＰＯ分子。
  37. 配列番号１の１０２位に対応する位置に変異を含む、請求項１～３６のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  38. 変異がＬ１０２Ｄ置換である、請求項３７に記載のＥＰＯ分子。
  39. 変異がＬ１０２Ｎ置換である、請求項３７に記載のＥＰＯ分子。
  40. 変異がＬ１０２Ｉ置換である、請求項３７に記載のＥＰＯ分子。
  41. 変異がＬ１０２Ｔ置換である、請求項３７に記載のＥＰＯ分子。
  42. 変異がＬ１０２Ｖ置換である、請求項３７に記載のＥＰＯ分子。
  43. 配列番号１の１０５位に対応する位置に変異を含む、請求項１～４２のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  44. 変異がＬ１０５Ｆ置換である、請求項４３に記載のＥＰＯ分子。
  45. 変異がＬ１０５Ｓ置換である、請求項４３に記載のＥＰＯ分子。
  46. 配列番号１の１０６位に対応する位置に変異を含む、請求項１～４５のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  47. 変異がＴ１０６Ａ置換である、請求項４６に記載のＥＰＯ分子。
  48. 変異がＴ１０６Ｇ置換である、請求項４６に記載のＥＰＯ分子。
  49. 変異がＴ１０６Ｈ置換である、請求項４６に記載のＥＰＯ分子。
  50. 配列番号１の１０９位に対応する位置に変異を含む、請求項１～４９のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  51. 変異がＬ１０９Ａ置換である、請求項５０に記載のＥＰＯ分子。
  52. 変異がＬ１０９Ｃ置換である、請求項５０に記載のＥＰＯ分子。
  53. 変異がＬ１０９Ｗ置換である、請求項５０に記載のＥＰＯ分子。
  54. 配列番号１の１１４位に対応する位置に変異を含む、請求項１～５３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  55. 変異がＡ１１４Ｃ置換である、請求項５４に記載のＥＰＯ分子。
  56. 配列番号１の１４６位に対応する位置に変異を含む、請求項１～５５のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  57. 変異がＳ１４６Ｎ置換である、請求項５６に記載のＥＰＯ分子。
  58. 配列番号１の１４９位に対応する位置に変異を含む、請求項１～５７のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  59. 変異がＬ１４９Ｖ置換である、請求項５８に記載のＥＰＯ分子。
  60. 変異がＬ１４９Ｗ置換である、請求項５８に記載のＥＰＯ分子。
  61. 配列番号１の１５２位に対応する位置に変異を含む、請求項１～６０のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  62. 変異がＫ１５２Ｑ置換である、請求項６１に記載のＥＰＯ分子。
  63. 配列番号１の６７及び１０２位に対応する位置に変異を含む、請求項１～６２のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  64. 変異が、Ｌ６７Ｖ及びＬ１０２Ｖ置換である、請求項６３に記載のＥＰＯ分子。
  65. ７０、７４、及び１０２位に対応する位置に変異を含む、請求項１～６４のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  66. 変異が、Ｌ７０Ｖ、Ｖ７４Ｌ及びＬ１０２Ｉ置換である、請求項６５に記載のＥＰＯ分子。
  67. ６７、７４、及び１０２位に対応する位置に変異を含む、請求項１～６６のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  68. 変異が、Ｌ６７Ｎ、Ｖ７４Ｎ及びＬ１０２Ｄ置換である、請求項６７に記載のＥＰＯ分子。
  69. 変異が、Ｌ６７Ｄ、Ｖ７４Ｄ及びＬ１０２Ｎ置換である、請求項６７に記載のＥＰＯ分子。
  70. １２、１５、１０５、及び１４９位に対応する位置に変異を含む、請求項１～６９のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  71. 変異が、Ｌ１２Ａ、Ｙ１５Ｉ、Ｌ１０５Ｆ及びＬ１４９Ｗ置換である、請求項７０に記載のＥＰＯ分子。
  72. 変異が、Ｌ１２Ｉ、Ｙ１５Ｗ、Ｌ１０５Ｓ及びＬ１４９Ｖ置換である、請求項７０に記載のＥＰＯ分子。
  73. １０９及び１１４位に対応する位置に変異を含む、請求項１～７２のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  74. 変異が、Ｌ１０９Ｃ及びＡ１１４Ｃ置換である、請求項７３に記載のＥＰＯ分子。
  75. １０２、１０５、１０６及び１０９位に対応する位置に変異を含む、請求項１～７４のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  76. 変異が、Ｌ１０２Ｔ、Ｌ１０５Ｓ、Ｔ１０６Ｈ及びＬ１０９Ｗ置換である、請求項７５に記載のＥＰＯ分子。
  77. 変異が、Ｌ１０２Ｔ、Ｌ１０５Ｓ、Ｔ１０６Ｇ及びＬ１０９Ｗ置換である、請求項７５に記載のＥＰＯ分子。
  78. １４６及び１５２位に対応する位置に変異を含む、請求項１～７７のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  79. 変異が、Ｓ１４６Ｎ及びＫ１５２Ｑ置換である、請求項７８に記載のＥＰＯ分子。
  80. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する、請求項１～７９のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  81. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性を有する、請求項１～８０のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  82. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の相同性を有する、請求項１～８１のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  83. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を有する、請求項１～８２のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  84. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９６％の相同性を有する、請求項１～８３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  85. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９７％の相同性を有する、請求項１～８４のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  86. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９８％の相同性を有する、請求項１～８５のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  87. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を有する、請求項１～８６のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  88. 本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と１５以下の位置で異なる、請求項１～８７のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  89. 本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と１０以下の位置で異なる、請求項１～８８のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  90. 本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と５以下の位置で異なる、請求項１～８９のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  91. 本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と４以下の位置で異なる、請求項１～９０のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  92. 本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と３以下の位置で異なる、請求項１～９１のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  93. 本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と２以下の位置で異なる、請求項１～９２のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  94. 本明細書に開示される位置（単数又は複数の位置）における変異（単数又は複数の変異）以外に、配列番号１のアミノ酸配列と１以下の位置で異なる、請求項１～９３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  95. 配列番号１のアミノ酸配列と１５以下の位置で異なる、請求項１～９４のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  96. 配列番号１のアミノ酸配列と１０以下の位置で異なる、請求項１～９５のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  97. 配列番号１のアミノ酸配列と５以下の位置で異なる、請求項１～９６のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  98. 配列番号１のアミノ酸配列と４以下の位置で異なる、請求項１～９７のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  99. 配列番号１のアミノ酸配列と３以下の位置で異なる、請求項１～９８のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  100. 配列番号１のアミノ酸配列と２以下の位置で異なる、請求項１～９９のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  101. 配列番号１のアミノ酸配列と１以下の位置で異なる、請求項１～１００のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  102. 配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３若しくは３５のいずれかのアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるか、又はそれと１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個以下のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を含む、請求項１～１０１のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  103. 配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３又は３５のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１～１０２のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  104. 配列番号３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  105. 配列番号５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  106. 配列番号７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  107. 配列番号９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  108. 配列番号１１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  109. 配列番号１３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  110. 配列番号１５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  111. 配列番号１７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  112. 配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  113. 配列番号２１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  114. 配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  115. 配列番号２５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  116. 配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  117. 配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  118. 配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  119. 配列番号３３のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  120. 配列番号３５のアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる、請求項１～１０３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  121. 例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで決定される場合、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、対象において低下した免疫原性を有する、請求項１～１２０のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  122. 免疫原性が、参照ＥＰＯ分子と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％低下している、請求項１２１に記載のＥＰＯ分子。
  123. 対象がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を保有する、請求項１２１又は１２２に記載のＥＰＯ分子。
  124. 例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで決定される場合、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、同じ又は実質的に同じ生物学的活性を有する、請求項１～１２３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  125. 例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで決定される場合、参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、又は２％以下に低下した生物学的活性を有する、請求項１～１２４のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  126. 生物学的活性がｉｎ ｖｉｔｒｏ ＴＦ－１増殖アッセイにおいて測定される、請求項１２４又は１２５のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  127. 参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、より多くのグリコフォーム、例えば、少なくとも１個、２個、３個、４個、又は５個多いグリコフォームを有することができる、請求項１～１２６のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  128. ６個、７個、８個、９個、１０個又はより多くのグリコフォームを有することができる、請求項１～１２７のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  129. ７個、８個又はより多くのグリコフォームを有することができる、請求項１～１２８のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  130. 参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、同じ又は実質的に同じ血清半減期を有する、請求項１～１２９のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  131. 参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、増加した血清半減期、例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０倍増加した血清半減期を有する、請求項１～１３０のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  132. 参照ＥＰＯ分子、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯ分子と比較して、低下した血清半減期、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以下に低下した血清半減期を有する、請求項１～１３１のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  133. ＥＰＯポリペプチドの血清半減期を延長する部分を含む、請求項１～１３２のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  134. 融合タンパク質である、請求項１～１３３のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  135. ＩｇＧのＦｃドメインを含む、請求項１～１３４のいずれかに記載のＥＰＯ分子。
  136. Ｆｃドメインが、ＥＰＯポリペプチドに共有結合的に融合されている、請求項１３５に記載のＥＰＯ分子。
  137. ＦｃドメインのＮ末端が、ＥＰＯポリペプチドのＣ末端に直接的又は間接的に共有結合的に融合されている、請求項１３６に記載のＥＰＯ分子。
  138. 請求項１～１３７のいずれかに記載のＥＰＯ分子と、薬学的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
  139. 請求項１～１３７のいずれかに記載のＥＰＯ分子を含む、調製物。
  140. 治療的使用に適している、請求項１３９に記載の調製物。
  141. 請求項１～１３７のいずれかに記載のＥＰＯ分子と、使用説明書とを含む、キット。
  142. 請求項１～１３７のいずれか一項に記載のＥＰＯ分子をコードする、核酸。
  143. 配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４若しくは３６のいずれかのヌクレオチド配列、又はそれらと５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５若しくは５０ヌクレオチド以下で異なるか、又はそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、核酸。
  144. 配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、又は３６のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１４３に記載の核酸。
  145. 請求項１４２～１４４のいずれかに記載の核酸を含む、ベクター。
  146. 核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１４５に記載のベクター。
  147. 請求項１４２～１４４のいずれかに記載の核酸を含む、細胞。
  148. ＥＰＯポリペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項１４７に記載の細胞を培養し、それによりＥＰＯ分子を産生することを含む、ＥＰＯ分子を産生する方法。
  149. 対象において障害を治療する方法であって、有効量の請求項１～１３７のいずれかに記載のＥＰＯ分子を対象に投与し、それにより障害を治療することを含む、上記方法。
  150. 障害が、ＥＰＯに関連する障害、例えば、ＥＰＯの欠乏又は異常である、請求項１４９に記載の方法。
  151. 障害が貧血である、請求項１５０に記載の方法。
  152. 貧血が、慢性腎臓疾患（例えば、慢性腎不全）、ジドブジン治療、化学療法、又は手術に関連するか、又はそれに起因する、請求項１５１に記載の方法。
  153. 対象において免疫原性応答を低下させる方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１～１３７のいずれかに記載のＥＰＯ分子を投与し、それにより免疫原性応答を低下させることを含む、上記方法。
  154. 対象において赤芽球癆（ＰＲＣＡ）を治療又は予防する方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１～１３７のいずれかに記載のＥＰＯ分子を投与し、それによりＰＲＣＡを治療又は予防することを含む、上記方法。
  155. 対象において同種異系赤血球（ＲＢＣ）輸血を減少させる方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１～１３７のいずれかに記載のＥＰＯ分子を投与し、それにより同種異系ＲＢＣ輸血を減少させることを含む、上記方法。
  156. 対象におけるＨＬＡ遺伝子型、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９遺伝子型を同定する遺伝子型情報又は配列を取得することを更に含み、ＨＬＡ遺伝子型の存在が、対象がＥＰＯ療法に対する免疫原性の増加を有するか、又は有するリスクがあることを同定する、請求項１４８～１５５のいずれかに記載の方法。
  157. ＥＰＯ分子が、遺伝子型情報の取得に応答して投与される、請求項１５６に記載の方法。
  158. 対象を評価する方法であって、対象におけるＨＬＡ遺伝子型、例えばＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９遺伝子型を同定する遺伝子型情報を取得することを含み、ＨＬＡ遺伝子型の存在が、対象がＥＰＯ分子を含む治療法に対する免疫原性の増加を有するか、又は有するリスクがあることを同定する、上記方法。
  159. 本明細書に開示されるＥＰＯ分子による治療の候補として対象を分類することを更に含む、請求項１５８に記載の方法。
  160. 有効量の本明細書に開示されるＥＰＯ分子を対象に投与することを更に含む、請求項１５８又は１５９に記載の方法。
  161. 対象がＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０９アレル（対立遺伝子）を保有するか、又は保有すると判定されている、請求項１４８～１６０のいずれかに記載の方法。
  162. 対象が、慢性腎臓疾患、ＨＩＶ感染症、又はがんを有する、請求項１４８～１６１のいずれかに記載の方法。
  163. 対象が、ジドブジンを受けるか、又は受けたことがある、請求項１４８～１６２のいずれかに記載の方法。
  164. 対象が、化学療法（例えば、骨髄抑制化学療法）、手術、又は同種異系ＲＢＣ輸血を受けるか、又は受けたことがある、請求項１４８～１６３のいずれかに記載の方法。
  165. 対象が抗ＥＰＯ抗体を有するか、又は有すると判定されている、請求項１４８～１６４のいずれかに記載の方法。
  166. 対象が、異なる組換えヒトＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むＥＰＯを投与されている、請求項１４８～１６５のいずれかに記載の方法。
  167. 異なるｒＨｕＥＰＯの投与を中止又は終了する、請求項１６６に記載の方法。

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