JP2023539785A - 非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法及びその使用 - Google Patents

非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法及びその使用 Download PDF

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Abstract

本願は、非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法及びその使用に関し、該当製造方法は、非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインが発現されないか又は正確に発現されないようにするステップと、非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１つ、２つ、３つ、４つ又は４つ以上の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップとを含む。得られた非ヒト哺乳動物又はその子孫は、重鎖抗体の生産に使用できる。本願の製造方法を用いて取得した非ヒト哺乳動物は、いずれの抗体重鎖可変領域及び定常領域をコードする外来遺伝子を導入せず、それ自体のゲノム中の抗体重鎖可変領域をコードするすべてのＶＤＪ遺伝子を直接利用することにより、重鎖可変領域の再配列により多様性がよりよい重鎖抗体を生成することができる。【選択図】図２

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年９月４日に提出された、出願番号が２０２０１０９２４０９５．１であり、発明名称が「非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法及びその使用」の中国特許出願の優先権を主張しており、そのすべての内容は、引用で本発明に取り込まれる。
本願は、バイオ技術の分野に関し、具体的には、重鎖抗体の生産に使用できる非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法及びその使用に関する。
抗体は、２本の同じ重鎖（Ｈ鎖）と２本の同じ軽鎖（Ｌ鎖）とが鎖間の非共有結合又はジスルフィド結合により連結されてなる４本のペプチド鎖構造である。抗体重鎖には、重鎖定常領域（ＣＨ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）が含まれ、ここで、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡの重鎖定常領域にはＣＨ１、ヒンジ領域Ｈｉｎｇｅ、ＣＨ２及びＣＨ３という４つのドメインが含まれ、ＩｇＭ及びＩｇＥにはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４という４つのドメインが含まれ（Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、重鎖定常領域のＣＨ１ドメインは、ジスルフィド結合により軽鎖定常ドメインに連結され、重鎖可変領域には、相補性決定領域（ＣＤＲ）の超可変領域及び相対的に保存されているフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が含まれ、重鎖可変領域には、アミノ基末端からカルボキシル基末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で排列した３つのＣＤＲ及び４つのＦＲが含まれる。
抗体の重鎖定常領域の抗原特異性の違いに応じて、抗体には、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡという５つのクラスがある。同じクラスの抗体は、依然としてその重鎖定常領域の抗原特異性に若干の差異があるため、幾つかのサブクラスに分類でき、例えば、人のＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４等が含まれ、人のＩｇＡにはＩｇＡ１、ＩｇＡ２等が含まれ、異なる哺乳動物の間（例えば人、アルパカ及びマウス）、異なる品種のマウスの間（例えばＣ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃマウス）の抗体のサブクラスの種類は異なる可能性がある。
抗体重鎖に関連する遺伝子は、Ｌ、Ｖ、Ｄ、Ｊ、Ｃという５つの遺伝子断片を含み、ここで、重鎖可変領域はＶ、Ｄ、Ｊという３つの遺伝子断片によってコードされ、重鎖定常領域はＣ遺伝子断片によってコードされる。ヒトの抗体重鎖遺伝子には、機能的な約４０個のＶ遺伝子、２３個のＤ遺伝子、６個のＪ遺伝子及び９個のＣ遺伝子（ソース：Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｇｅ １７７）を含む。ＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子はＩｇｈｍ遺伝子（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｍｕ）であり、ＩｇＤ重鎖定常領域をコードする遺伝子はＩｇｈｄ遺伝子（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｅｌｔａ）であり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする遺伝子はＩｇｈｇ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｇａｍｍａ）であり、ＩｇＡ重鎖定常領域をコードする遺伝子はＩｇｈａ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ ａｌｐｈａ）などであり、対応して、ＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする遺伝子はＩｇｈｇ１（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｇａｍｍａ １）であり、ＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子はＩｇｈｇ３（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｇａｍｍａ ３）であり、ＩｇＧ２ｂ重鎖定常領域をコードする遺伝子はＩｇｈｇ２ｂ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｇａｍｍａ ２ｂ）である。重鎖可変領域の再配列により、多様性を有する抗体が生成される。成熟Ｂ細胞は、抗原に刺激された後に分泌型抗体ＩｇＭを生成し、再度抗原に刺激された後に２回目の再配列が起こり、膜上に発現と分泌される免疫グロブリンの種類は、親和性の低いＩｇＭから親和性の高いＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ等の他のクラス又はサブクラスの免疫グロブリンにスイッチし、このような現象はクラススイッチ（Ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈ）又はアイソタイプスイッチ（Ｉｓｏｔｙｐｅ ｓｗｉｔｃｈ）と呼ばれる。
重鎖抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、重鎖のみを有する抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、２本の重鎖のみからなる免疫グロブリン抗体を指す。天然に存在する重鎖抗体は、自然界のラクダ科動物及びサメの体内に存在する。ラクダ科動物の生殖系列における重鎖遺伝子座には、重鎖定常領域をコードする遺伝子断片が含まれ、成熟期間中に、再配列されたＶＤＪ結合領域は、ＩｇＧヒンジ領域をコードする遺伝子断片の５’末端にスプライシングされることにより、軽鎖との結合を媒介するＣＨ１領域が欠如するようになったため、軽鎖と結合することができず、ＩｇＧ２及びＩｇＧ３重鎖抗体が生成される。遺伝子を利用して動物を修飾する方法も重鎖抗体を生成することができ、生成された重鎖抗体の分類方式も抗体の重鎖定常領域における抗原特異性の違いに応じたものである。
重鎖抗体は、従来の抗体の分子量（１５０～１６０ｋＤａ）と比べて、はるかに小さく、ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体の１本の重鎖は約４０ｋＤａであり、それにより、抗原識別特異性の重鎖可変領域は約１５ｋＤａしかないことが決定される。重鎖抗体の特徴は、分子量が小さく、一部の隠れたエピトープと結合することができ、抗体を得にくい標的点に特に適している。
当該背景技術部分に開示されている情報は、本願の全体的な背景に対する理解を高めることを意図するだけで、当業者に知られている従来技術を構成することを認めるか、又はそのような情報を何らかの形で暗示するものとみなされるべきではない。
本願は、非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法及びその使用を提供することを目的とする。
本願の目的を実現するために、本願は、下記の技術案を提供する。
本願の第１態様では、非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法を提供し、当該方法は、
非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインが発現されないか又は正確に発現されないようにするステップと、
非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１つ、２つ、３つ、４つ又は４つ以上の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップと、を含む。
上記の製造方法は、可能な実現形態において、非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインが発現されないか又は正確に発現されないようにするステップは、
非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインのみが発現されないか又は正確に発現されないようにするステップ、又は
非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＭ重鎖定常領域及びＩｇＤ重鎖定常領域が発現されないか又は正確に発現されないようにするステップである。
上記の製造方法は、可能な実現形態において、非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１つ、２つ、３つ、４つ又は４つ以上の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップは、
非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を発現しないか又は正確に発現しないようにし、且つ、非ヒト哺乳動物体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目又は３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ、２つ又は３つが、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
非ヒト哺乳動物体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目及び２個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を発現しないか又は正確に発現しないようにし、且つ、非ヒト哺乳動物体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ又は２つが、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
非ヒト哺乳動物体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目、２個目及び３個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を発現しないか又は正確に発現しないようにし、且つ、非ヒト哺乳動物体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
非ヒト哺乳動物体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を正確に発現するようにし、且つ、非ヒト哺乳動物体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目又は３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ、２つ又は３つが、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
非ヒト哺乳動物体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目及び２個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を正確に発現するようにし、且つ、非ヒト哺乳動物体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ又は２つが、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
非ヒト哺乳動物体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目、２個目及び３個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を正確に発現するようにし、且つ、非ヒト哺乳動物体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップである。
本願は、非ヒト哺乳動物をさらに提供し、その体内でＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインが発現されないか又は正確に発現されず、その体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１つ、２つ、３つ、４つ又は４つ以上の遺伝子はＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しない。
上記の非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、その体内でＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインが発現されないか又は正確に発現されないステップは、
ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインのみが発現されないか又は正確に発現されないステップ、又は、
ＩｇＭ重鎖定常領域及びＩｇＤ重鎖定常領域が発現されないか又は正確に発現されないステップである。
上記の非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、その体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１つ、２つ、３つ、４つ又は４つ以上の遺伝子がＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないステップは、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子がＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないステップ、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子が、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を発現しないか又は正確に発現しなく、且つ、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目又は３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ、２つ又は３つがＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないステップ、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目及び２個目の遺伝子が、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を発現しないか又は正確に発現しなく、且つ、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ又は２つがＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないステップ、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目、２個目及び３個目の遺伝子が、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を発現しないか又は正確に発現しなく、且つ、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子がＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないステップ、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子が、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を正確に発現し、且つ、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目又は３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ、２つ又は３つがＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないステップ、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目及び２個目の遺伝子が、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を正確に発現し、且つ、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ又は２つがＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないステップ、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目、２個目及び３個目の遺伝子が、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を正確に発現し、且つ、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子がＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないステップである。
本願の第２態様では、非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法を提供し、当該方法は、
非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列をノックアウトするステップと、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１つ、２つ、３つ、４つ又は４つ以上の遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む目標遺伝子をノックアウトするステップとを含む。
本願は、さらに、非ヒト哺乳動物を提供し、そのゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列及び目標遺伝子がノックアウトされ、前記目標遺伝子は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１つ、２つ、３つ、４つ又は４つ以上の遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。
上記の製造方法又は非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列をノックアウトするステップは、
非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のみをノックアウトするステップ、又は、
非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域及びＩｇＤ重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列をノックアウトするステップである。
上記の製造方法又は非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、前記目標遺伝子が、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする最後の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列である。
上記の製造方法は、可能な実現形態において、
非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列をノックアウトするステップと、
目標遺伝子をノックアウトするステップと、を同じ操作ステップで完了するか、又は異なる操作ステップで完了する。
上記の製造方法又は非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、前記非ヒト哺乳動物は齧歯類動物であり、選択可能に、前記齧歯類動物はラット又はマウスであり、さらに選択可能に、前記齧歯類動物はマウスであり、より一層、前記マウスはＣ５７ＢＬ／６マウス又はＢＡＬＢ／ｃマウスである。
上記の製造方法又は非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子はＩｇｈｇ３である。
上記の製造方法又は非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、非ヒト哺乳動物がＣ５７ＢＬ／６マウスである場合、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子はＩｇｈｇ３であり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子はＩｇｈｇ１であり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子はＩｇｈｇ２ｂであり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子はＩｇｈｇ２ｃであり、
非ヒト哺乳動物がＢＡＬＢ／ｃマウスである場合、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子はＩｇｈｇ３であり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子はＩｇｈｇ１であり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子はＩｇｈｇ２ｂであり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子はＩｇｈｇ２ａである。
上記の製造方法又は非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、前記非ヒト哺乳動物のゲノムにはκ軽鎖及び／又はλ軽鎖をコードする完全な遺伝子を含み、選択可能に、前記非ヒト哺乳動物でκ軽鎖及び／又はλ軽鎖を正常に発現することができる。
上記の製造方法又は非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、遺伝子をノックアウトする方法には、遺伝子ターゲティング技術、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ法、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ法のうちの１つ又は複数が含まれる。
上記の製造方法又は非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、前記非ヒト哺乳動物又はその子孫は、重鎖抗体の生産に使用される。
本願の第３態様では、Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫の製造方法を提供し、当該方法は、
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムのうち、抗体ＩｇＭ重鎖定常領域及びＩｇＤ重鎖定常領域をコードする遺伝子をノックアウトするステップと、
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムのうち、ＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子からＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列をノックアウトするステップとを含む。
本願は、さらに、そのゲノムのうち、抗体ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列と、ゲノムのうち、抗体ＩｇＧ２ｃの重鎖定常領域をコードする遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列とがノックアウトされるＣ５７ＢＬ／６マウスを提供する。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、前記Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムには、κ軽鎖及び／又はλ軽鎖をコードする完全な遺伝子を含み、選択可能に、前記Ｃ５７ＢＬ／６マウスがκ軽鎖及び／又はλ軽鎖を正常に発現することができる。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、遺伝子をノックアウトする方法には、遺伝子ターゲティング技術、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ法、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ法のうちの１つ又は複数が含まれる。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソンからＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソンまでのすべてのヌクレオチド配列がノックアウトされた。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、遺伝子をノックアウトするステップにおいて、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡ及びマウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡを使用した。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流の標的配列は配列番号１及び配列番号２を含み、及び／又は、ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流の標的配列は配列番号３及び配列番号４を含む。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号９及び配列番号１０であり、及び／又は、マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡは配列番号１１、配列番号１２である。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、前記Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫は、重鎖ＩｇＧ２ｃ抗体の生産に使用される。
本願の第４態様では、Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫の製造方法を提供し、当該方法は、
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムのうち、ＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列をノックアウトするステップと、
Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムのうち、ＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子からＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列をノックアウトするステップと、を含む。
本願は、さらに、そのゲノムのうち、ＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列と、そのゲノムのうち、ＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子からＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列とがノックアウトされるＣ５７ＢＬ／６マウスを提供する。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、前記Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムには、κ軽鎖及び／又はλ軽鎖をコードする完全な遺伝子を含み、選択可能に、前記Ｃ５７ＢＬ／６マウスがκ軽鎖及び／又はλ軽鎖を正常に発現することができる。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、遺伝子をノックアウトする方法には、遺伝子ターゲティング技術、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ法、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ法のうちの１つ又は複数が含まれる。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、遺伝子をノックアウトするステップにおいて、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソンをノックアウトし、さらに、マウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソンからＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソンまでのすべてのヌクレオチド配列をノックアウトする。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、遺伝子をノックアウトするステップにおいて、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流及び下流を標的とするｓｇＲＮＡを使用し、さらに、マウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡ及びマウスのＩｇＧ２ｃをコードする１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡを使用した。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流の標的配列は配列番号１及び配列番号２を含み、及び／又は、
ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流の標的配列は配列番号５及び配列番号６を含み、及び／又は、
ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流の標的配列は配列番号７及び配列番号８を含み、及び／又は、
ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流の標的配列は配列番号３及び配列番号４を含む。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号９及び配列番号１０であり、及び／又は、
マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１３及び配列番号１４であり、及び／又は、
マウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１５及び配列番号１６であり、及び／又は、
マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１１及び配列番号１２である。
上記の製造方法又はＣ５７ＢＬ／６マウスは、可能な実現形態において、前記Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫は、重鎖ＩｇＧ２ｃ抗体の生産に使用される。
本願の第５態様では、非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法を提供し、当該方法は、非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列をノックアウトするステップを含む。
本願は、さらに、ゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列がノックアウトされた非ヒト哺乳動物を提供する。
上記の製造方法又は非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、前記非ヒト哺乳動物は齧歯類動物であり、選択可能に、前記齧歯類動物はラット又はマウスであり、さらに選択可能に、前記齧歯類動物はマウスであり、より一層、前記マウスはＣ５７ＢＬ／６マウス又はＢＡＬＢ／ｃマウスである。
上記の製造方法又は非ヒト哺乳動物は、可能な実現形態において、前記非ヒト哺乳動物又はその子孫は、上記の非ヒト哺乳動物又はその子孫の構築に使用される。
本願の第６態様では、上記の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫、上記の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫、及び上記の非ヒト哺乳動物、上記のＣ５７ＢＬ／６マウスの目標重鎖抗体のスクリーニングにおける使用を提供する。
上記の使用は、可能な実現形態において、目標重鎖抗体のスクリーニングの際に、ファージディスプレイ法を採用する。
上記の使用は、可能な実現形態において、前記目標重鎖抗体のスクリーニングは、Ｃ反応性タンパク質、コロナウイルスＳタンパク質又はコロナウイルスＮタンパク質抗原特異性ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体をスクリーニングすることである。
本願の第７態様では、目標重鎖抗体のスクリーニングの方法を提供し、当該方法は、上記の第１態様に記載の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫、上記の第２態様に記載の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫、上記の第３態様に記載の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫、又は上記の第４態様に記載の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫を、免疫動物として使用してスクリーニングすることを含む。
上記の方法は、可能な実現形態において、目標重鎖抗体のスクリーニングの際に、ファージディスプレイ法を採用する。
上記の方法は、可能な実現形態において、前記目標重鎖抗体のスクリーニングは、Ｃ反応性タンパク質、コロナウイルスＳタンパク質又はコロナウイルスＮタンパク質抗原特異性ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体をスクリーニングすることである。
本願の第８態様では、非ヒト哺乳動物細胞又は細胞株又は初代細胞培養物を提供し、前記非ヒト哺乳動物細胞又は細胞株又は初代細胞培養物は上記の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来するか、又は上記の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫に由来する。
本願の第９態様では、上記の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来するか、上記の的製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫に由来する摘出組織又は摘出器官又はその培養物を提供する。
本願の第１０態様では、ｓｇＲＮＡ組成物を提供し、前記ｓｇＲＮＡ組成物は、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡ、及び、マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡ、又は、
マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流及び下流を標的とするｓｇＲＮＡ、又は、
マウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡ、及び、マウスのＩｇＧ２ｃをコードする１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡ、を含む。
上記のｓｇＲＮＡ組成物は、可能な実現形態において、ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流の標的配列は配列番号１及び配列番号２を含み、及び／又は、
ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流の標的配列は配列番号３及び配列番号４を含み、及び／又は、
ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流の標的配列は配列番号５及び配列番号６を含み、及び／又は、
ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流の標的配列は配列番号７及び配列番号８を含む。
上記のｓｇＲＮＡ組成物は、可能な実現形態において、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号９及び配列番号１０であり、及び／又は、
マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１３及び配列番号１４であり、及び／又は、
マウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１５及び配列番号１６であり、及び／又は、
マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１１及び配列番号１２である。
本願の第１１態様では、ｓｇＲＮＡをコードする１セグメント以上のＤＮＡ配列を含むノックアウトベクターを提供し、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、
マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするもの、又は、
マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするもの、又は、
又は、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするもの、又は、
又は、マウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするものから選択される１つである。
上記のノックアウトベクターは、可能な実現形態において、前記ノックアウトベクターの骨格は、ｓｇＲＮＡ発現ベクターである。
本願の第１２態様では、上記のノックアウトベクターを含む細胞を提供する。
正確に発現しないということについて、正確に発現しないということに対照的なのは正確に発現するということであり、本願において、正確に発現するということ及び正確に発現しないということは、実際には、両方とも本分野で一般的に理解される意味を有する。例えば、ＣＨ１ドメインを正確に発現しないということとは、ゲノムレベルの突然変異又は欠失により重鎖定常領域のＣＨ１ドメインを正確に発現しなく、それによりＣＨ１ドメインが軽鎖との結合能力を喪失するということを意味する。例えば、重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするエクソンの上流と下流の各１０個のヌクレオチド内の突然変異又は欠失により、ＣＨ１ドメインが軽鎖との結合能力を喪失する。また例えば、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を正確に発現しないということは、当該遺伝子の発現により得られた免疫グロブリン抗体は抗体効果を有さないということを意味し、これに対して、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を正確に発現するということは、当該遺伝子の発現により得られた免疫グロブリン抗体が抗体効果を有するということを意味する。
ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子とは、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする遺伝子座上に、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする各遺伝子が上流から下流の順に配列されている順番を意味する。
本願は、非ヒト哺乳動物がＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインが発現されないか又は正確に発現されないようにするステップと、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１つ以上の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップとにより、非ヒト哺乳動物又はその子孫を製造し、得られた非ヒト哺乳動物又はその子孫は、重鎖抗体の生産に使用できる。本願の製造方法を用いて取得した非ヒト哺乳動物は、いずれの抗体重鎖可変領域及び定常領域をコードする外来遺伝子を導入せず、それ自体のゲノム中の抗体重鎖可変領域をコードするすべてのＶＤＪ遺伝子を直接利用することにより、重鎖可変領域の再配列により多様性がよりよい重鎖抗体を生成することができる。
免疫学では、一般に、ＩｇＭはＢ細胞の発育に対して極めて重要であり、Ｂ細胞の発育は抗体の生成に対して極めて重要であると考えている。本願は、実験により、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードする遺伝子を発現しなくても、さらには、ＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子及びＩｇＤ重鎖定常領域をコードする遺伝子を削除しても、非ヒト哺乳動物の免疫成熟に有意な影響を与えず、すべてのマウスが正常に生存し、依然として力価の高い免疫反応を発生でき、且つ、発明者は、スクリーニングにより特異性が強く、親和性が高い重鎖抗体を得た。
遺伝子改変の、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする遺伝子を選択することにより、特定のサブクラスの重鎖ＩｇＧ抗体を取得できる。
１つ以上の実施例は、それに対応する図面における写真で例示的な説明を行い、これらの例示的な説明は、実施例を限定するものではない。本明細書に使用される単語「例示的」は、「例、実施例又は説明性として使用される」ことを意味する。本明細書で「例示的」として説明されるいずれの実施例も、必ずしも他の実施例よりも好ましいまたは優れるものとして解釈されるべきではない。
本願の実施例１に係るマウスの抗体重鎖可変領域及び定常領域の遺伝子部位の模式図である。 本願の実施例１における、Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇマウスを製造するｓｇＲＮＡ標的決定戦略の模式図である。第２行中のボックスはエクソンを示し、白色ボックスはノックアウトされた遺伝子断片を示し、数字はエクソン番号である。五角星形はｓｇＲＮＡの標的点の位置を示す。矢印は、遺伝子型同定のプライマーに対する位置を表す。 本願の実施例１における、Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇマウスに対して遺伝子型同定を行ったＰＣＲのゲル電気泳動図の模式図であり、ｗｔ：野生型、＋／－：ヘテロ接合体、－／－：ノックアウトホモ接合体である。 本願の実施例２における、抗原タンパク質としてＣＲＰ（ヒトＣ反応性タンパク質）を使用してＩｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスを免疫させた後の血清力価検出結果の模式図であり、１回目免疫後及び未免疫時の血清力価はいずれも低く、両線は重なっている。 本願の実施例５における、Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスのＩｇＧ２ｃ抗体重鎖遺伝子のＶＨセグメントのコロニーＰＣＲ図である。 本願の実施例５における、Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスが発現したＩｇＧ２ｃ抗体の重鎖アミノ酸配列の比較図である。 本願の実施例６における、重鎖抗体ファージライブラリーから陽性クローンをスクリーニングしてシークエンシングを行った比較図である。 本願の実施例７における、精製Ｄ４－１２の抗原ＣＲＰに対する特異性識別のＥＬＩＳＡ結果である。 本願の実施例８における精製５Ｓ－１２の抗原ＣＲＰに対する特異性識別のＥＬＩＳＡ結果であり、ここで、ＯＶＡ－Ｄ５Ｓ－１２及びＢＳＡ－Ｄ５Ｓ－１２の両線のＯＤ４５０値が非常に低く、線は重なっている。 本願の実施例８における、Ｄ５Ｓ－１２重鎖抗体の親和性測定結果である。 本願の実施例９における、ＩｇｈＭマウスを製造するｓｇＲＮＡ標的決定戦略の模式図である。黒色ボックスはエクソンを示し、ここで、数字はエクソン番号である。五角星形記号はｓｇＲＮＡの標的点の位置を示す。矢印は遺伝子型同定のプライマーを示す。 本願の実施例９におけるＰＣＲ同定のＩｇｈＭマウス遺伝子型の例示である。Ｉｇｈｍ野生型遺伝子は約６００ｂｐバンドを生成し、Ｉｇｈｍノックアウト遺伝子は、約３００ｂｐバンドを生成する。数字はマウスサンプル番号を示し、＋：野生型対照、－：ブランク対照である。 本願の実施例１０におけるＩｇｈＭホモ接合型マウスが発現したＩｇＭ抗体重鎖アミノ酸配列図である。 本願の実施例１１におけるＩｇｈＭ－３Ｇ３マウスを製造するｓｇＲＮＡ標的決定戦略の模式図である。黒色ボックスはエクソンを示し、ここで、数字は、エクソン番号である。五角星形記号はｓｇＲＮＡの標的点の位置を示す。矢印は遺伝子型同定のプライマーを示す。 本願の実施例１１におけるＩｇｈＭ－３Ｇ３マウスに対して遺伝子型同定を行ったＰＣＲゲル電気泳動図の模式図であり、ｗｔ：野生型、＋／－：ヘテロ接合体、－／－：ノックアウトホモ接合体である。 本願の実施例１２におけるＣＲＰ（ヒトＣ反応性タンパク質）を抗原タンパク質として使用してＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスを免疫させた後の血清力価検出結果の模式図であり、１回目免疫後及び２回目免疫後の血清力価は両方とも非常に低く、両線が重なっている。 本願の実施例１３におけるＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスのＩｇＧ２ｃ抗体重鎖遺伝子のＶＨセグメントのコロニーＰＣＲ図である。 本願の実施例１３におけるＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスが発現したＩｇＧ２ｃ抗体の重鎖アミノ酸配列の比較図である。 本願の実施例１５に言及された、コロナウイルスＳタンパク質抗原を用いてＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスを免疫させる状況で、それぞれ、未免疫、２回目の免疫１週間後、３回目の免疫１週間後及び４回目の免疫１週間後に採血し、ＰＢＳを用いて血清を倍率希釈した後、ＥＬＩＳＡで血清力価を検出した結果図である。 本願の実施例１６に言及された、コロナウイルスＳタンパク質抗原で免疫させたＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスのＩｇＧ２ｃ抗体重鎖遺伝子のコロニーＰＣＲ同定図である。 本願の実施例１７に言及された、コロナウイルスＳタンパク質抗原で免疫させたＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスのＩｇＧ２ｃ抗体重鎖遺伝子がファージディスプレイライブラリの構築及び抗体パンニングを経た後に得られた陽性クローンのＣＤＲ領域のアミノ酸配列の比較図である。 本願の実施例１７に言及された、ＥＬＩＳＡ法で抗体Ｓ－９、Ｓ－１９、Ｓ－２７及びＳ－４７が抗原コロナウイルスＳタンパク質を特異性識別し且つそれと結合することができるか否かを検出した結果図である。 本願の実施例１８における、コロナウイルスＳタンパク質抗原を用いてＩｇｈＭ－ＤＧ１ホモ接合型マウスを免疫させる状況で、それぞれ、未免疫、２回目の免疫１週間後、３回目の免疫１週間後及び４回目の免疫１週間後に採血し、ＰＢＳを用いて血清を倍率希釈した後、ＥＬＩＳＡで血清力価を検出した結果図である。 上記のコロナウイルスＳタンパク質抗原で免疫させたＩｇｈＭ－ＤＧ１ホモ接合型マウスについて、ファージディスプレイライブラリの構築及び抗体パンニング後に得られた陽性クローンのＣＤＲ領域のアミノ酸配列の比較図である。 本願の実施例１８に言及された、ＥＬＩＳＡ法で抗体Ｓ－１、Ｓ－７、Ｓ－１２、Ｓ－１７、Ｓ１９、Ｓ－２５、Ｓ－５１及びＳ－６５が抗原コロナウイルスＳタンパク質を特異性識別し且つそれと結合することができるか否かを検出した結果図である。 本願の実施例１９に言及された、コロナウイルスＮタンパク質抗原を用いてＩｇｈＭ－ＤＧ１ホモ接合型マウスを免疫させる状況で、それぞれ、未免疫、２回目の免疫１週間後、３回目の免疫１週間後及び４回目の免疫１週間後に採血し、ＰＢＳを用いて血清を倍率希釈した後、ＥＬＩＳＡで血清力価を検出した結果図である。 上記のコロナウイルスＮタンパク質抗原で免疫させたＩｇｈＭ－ＤＧ１ホモ接合型マウスについて、ファージディスプレイライブラリの構築及び抗体パンニング後に得られた陽性クローンのＣＤＲ領域のアミノ酸配列の比較図である。 本願の実施例１９に言及された、ＥＬＩＳＡ法で抗体Ｎ－１、Ｎ－２、Ｎ－３、Ｎ－５及びＮ－２３が抗原コロナウイルスＳタンパク質を特異性識別し且つそれと結合できるか否かを検出した結果図である。 本願の実施例２０に言及された、ＭＤＧ１マウス及び野生型マウスの骨髄における各免疫グロブリン遺伝子の相対的な発現量の比較である。Ａ～Ｄ図は、それぞれ、両遺伝子型マウスの骨髄中でμ遺伝子、γ２ｃ遺伝子、γ２ｃ遺伝子がμ遺伝子、α遺伝子に対する相対的な発現量である。ＭＤＧ１はホモ接合体ノックアウトマウスであり、ＷＴは野生型マウスであり、ＢＭは骨髄であり、ハウスキーピング遺伝子であるＧａｐｄｈ遺伝子を内部標準とし、ｎ＝４であり、２－ΔΔＣｔの計算方法でデータ分析を行い、２尾Ｔ検定を用いて統計学的分析を行い、＊＊＊はｐ＜０．０１を意味する。 本願の実施例２０に言及された、ＭＤＧ１マウス及び野生型マウスの脾臓における各免疫グロブリン遺伝子の相対的な発現量の比較である。Ａ～Ｄ図は、それぞれ、両遺伝子型マウスの脾臓中でμ遺伝子、γ２ｃ遺伝子、γ２ｃ遺伝子のμ遺伝子、α遺伝子に対する相対的な発現量である。ＭＤＧ１はホモ接合体ノックアウトマウスであり、ＷＴは野生型マウスであり、ハウスキーピング遺伝子であるＧａｐｄｈ遺伝子を内部標準とし、ｎ＝４であり、２－ΔΔＣｔの計算方法でデータ分析を行い、２尾Ｔ検定を用いて統計学的分析を行い、＊＊はｐ＜０．０１を意味する。 本願の実施例２０に言及された、ＭＤＧ１マウス及び野生型マウスの小腸における各免疫グロブリン遺伝子の相対的な発現量の比較である。Ａ～Ｄ図は、それぞれ、両遺伝子型マウスの小腸中でμ遺伝子、γ２ｃ遺伝子、γ２ｃ遺伝子のμ遺伝子、α遺伝子に対する相対的な発現量である。ＭＤＧ１はホモ接合体ノックアウトマウスであり、ＷＴは野生型マウスであり、ＳＩは小腸であり、ハウスキーピング遺伝子であるＧａｐｄｈ遺伝子を内部標準とし、ｎ＝４であり、２－ΔΔＣｔの計算方法でデータ分析を行い、２尾Ｔ検定を用いて統計学的分析を行った。 本願の実施例２１に言及された、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＢｌｏｔでＭＤＧ１マウスの血清中でのＩｇＧ２ｃの発現パターンを検出する。ＷＴは野生型マウスを表し、ＭＤＧ１はホモ接合体ノックアウトマウスを表す。図Ａは、還元条件でのＩｇＧ２ｃの発現パターンの検出であり、図Ｂは、非還元条件でのＩｇＧ２ｃの発現パターンの検出であり、野生型マウスの血清を２０倍希釈し、ＭＤＧ１マウスの血清を１００倍希釈し、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｃ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ（ＨＲＰ）を１００００倍希釈する。 本願の実施例２２に言及された、静止状態下でＭＤＧ１マウス及び野生型マウスの血清における各免疫グロブリンの発現量の比較である。Ａ～Ｆ図は、それぞれ、両遺伝子型マウスの血清でＩｇＭ、ＩｇＧ２ｃ、野生型マウスのＩｇＭ、ＭＤＧ１マウスのＩｇＧ２ｃ、総ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの発現量である。ｎ＝２０であり、２尾Ｔ検定を用いて統計学的分析を行い、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊＊＊はｐ＜０．０１を意味する。 本願の実施例２３に言及された、ＭＤＧ１マウスの骨髄におけるＢ細胞の発育状況である。Ａ～Ｃ図は、それぞれ、骨髄Ｂ細胞、未熟Ｂ細胞／成熟Ｂ細胞、ｐｒｏ－Ｂ細胞／ｐｒｅ－Ｂ細胞の集団分け状態であり、Ｄ～Ｆ図は、それぞれ、骨髄Ｂ細胞、ｐｒｏ－Ｂ細胞及びｐｒｅ－Ｂ細胞の比率及び数である。ＷＴは野生型マウスであり、ＭＤＧ１はホモ接合体ノックアウトマウスであり、ｐｒｏ－Ｂ ｃｅｌｌはｐｒｏ－Ｂ細胞であり、ｐｒｅ－Ｂ ｃｅｌｌはｐｒｅ－Ｂ細胞である。ｎ＝６であり、２尾Ｔ検定を用いて統計学的分析を行い、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊＊はｐ＜０．０１を意味する。 本願の実施例２３に言及された、ＭＤＧ１マウスの脾臓におけるＢ細胞の発育状況である。Ａ～Ｄ図は、それぞれ脾臓Ｂ細胞、ＩｇＧ２ｃ＋／ＩｇＭ＋Ｂ細胞、濾胞Ｂ細胞／辺縁Ｂ細胞／移行期Ｂ細胞、形質細胞の集団分け状態であり、Ｅ～Ｈ図は、それぞれ脾臓Ｂ細胞、ＩｇＧ２ｃ＋／ＩｇＭ＋Ｂ細胞、形質細胞、濾胞Ｂ細胞／辺縁Ｂ細胞／移行期Ｂ細胞の比率及び数である。ＷＴは野生型マウスであり、ＭＤＧ１はホモ接合体ノックアウトマウスであり、ＦＯ Ｂは濾胞Ｂ細胞であり、Ｔ Ｂは移行期Ｂ細胞であり、ＭＺ Ｂは辺縁Ｂ細胞であり、ｐｌａｓｍａは形質細胞であり、ｎ＝４であり、２尾Ｔ検定を用いて統計学的分析を行い、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊はｐ＜０．０１を意味する。 本願の実施例２３に言及された、ＭＤＧ１マウスの腹膜腔におけるＢ細胞の発育状況である。図Ａ及び図Ｂは、それぞれ、腹膜腔Ｂ細胞、Ｂ１ａ／Ｂ１ｂ／Ｂ２細胞の集団分け状態であり、図Ｃは、それぞれ腹膜腔Ｂ細胞、Ｂ１ａ細胞、Ｂ１ｂ細胞及びＢ２細胞の比率である。ＷＴは野生型マウスであり、ＭＤＧ１はホモ接合体ノックアウトマウスである。ｎ＝７であり、２尾Ｔ検定を用いて統計学的分析を行い、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊はｐ＜０．０１を意味する。 本願の実施例２５に言及された、クロラムフェニコール免疫後の野生型マウス及びＭＤＧ１マウスの血清における抗原特異性抗体の相対的な発現量の変化傾向である。Ａ～Ｅは、それぞれ、クロラムフェニコール特異性のＩｇＭ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの相対的な発現量であり、横座標は免疫回数を表し、ＬＭＳはクロラムフェニコールを表し、ＭＤＧ１はホモ接合体ノックアウトマウスであり、ＷＴは野生型マウスであり、ｎ＝７である。 本願の実施例２５に言及された、アトラジン免疫後の野生型マウス及びＭＤＧ１マウスの血清における抗原特異性抗体の相対的な発現量の変化傾向である。Ａ～Ｅは、それぞれアトラジン特異性のＩｇＭ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの相対的な発現量であり、横座標は免疫回数を表し、ＡＴＬＪはアトラジンを表し、ＭＤＧ１はホモ接合体ノックアウトマウスであり、ＷＴは野生型マウスであり、ｎ＝３である。 本願の実施例２６に言及された、抗原免疫後の野生型マウス及びＭＤＧ１マウスの脾臓における胚芽中心Ｂ細胞及び形質細胞の発育である。Ａ～Ｅ図は、それぞれ免疫後の脾臓Ｂ細胞、胚芽中心Ｂ細胞、ＩｇＧ２ｃ＋胚芽中心Ｂ細胞、形質細胞、ＩｇＧ２ｃ＋形質細胞の発育状況であり、Ｆ～Ｊ図は、それぞれ免疫後の脾臓Ｂ細胞、胚芽中心Ｂ細胞、ＩｇＧ２ｃ＋胚芽中心Ｂ細胞、形質細胞、ＩｇＧ２ｃ＋形質細胞の比率及び数である。ＷＴは野生型マウスであり、ＭＤＧ１はホモ接合体ノックアウトマウスであり、ｎ＝６であり、２尾Ｔ検定を用いて統計学的分析を行い、＊はｐ＜０．０５を意味し、＊＊はｐ＜０．０１を意味する。
本願の目的、技術案及び利点をより明確にするために、以下、本願の実施例の技術案について明確で、完全に説明するが、説明される実施例は、本願の一部の実施例にすぎず、全部の実施例ではないことは明らかである。当業者が本願の実施例に基づいて創造的な労働なしに得られたすべての他の実施例は、いずれも本願の保護範囲内に属する。
また、本願をよいよく説明するために、以下の具体的な実施形態では、多くの具体的な詳細が与えられた。当業者であれば、一部の具体的な詳細がなくても、本願を同様に実施できることを理解するべきであろう。一部の実施例において、本願の趣旨を突出させるために、当業者によく知られている原材料、要素、方法、手段などについては詳細に説明していない。
特に明示した場合を除き、本明細書及び特許請求の範囲を通じて、「含む」又は「含有する」又は「含んでいる」などの変形などは、他の要素又は他の構成部分を排除せず、述べられた要素又は構成部分を含むと理解されるべきである。
以下の実施例に用いられる実験材料及びその供給源は、
ｐｘ３３０プラスミドベクター、Ａｄｄｇｅｎｅから購入、プラスミド番号＃５８７７８、
ｐＥＡＳＹ－Ｔ５ Ｚｅｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇベクター、全式金生物技術有限公司（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）から購入、製品番号：ＣＴ５０１－０１、
ＴＯＰ１０コンピテント細胞、天根生化学技有限公司から購入、製品番号：ＣＢ１０４、
ＰＥＴ２８ベクター、武漢ビョウ霊生物科技有限公司から購入、製品番号：Ｐ３１００３、
ＨｉＰｕｒｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｌｕｓｍｉｎｉ Ｋｉｔ、美基美から購入、製品番号Ｒ４１２１、
ＨｉＰｕｒｅ Ｇｅｌ Ｐｕｒｅ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ、美基美から購入、製品番号Ｄ２１１０、
ＨｉＰｕｒｅ Ｔｉｓｓｕｅ ＤＮＡｍｉｎｉ Ｋｉｔ、美基美から購入、製品番号Ｄ３１２１、
２×Ｍ５ Ｈｉｐｅｒ ｐｌｕｓ Ｔａｑ ＨｉＦｉ ＰＣＲ ｍｉｘ、聚合美から購入、製品番号ＭＦ００２－ｐｌｕｓ、
逆転写試薬５Ｘ Ａｌｌ－Ｉｎ－Ｏｎｅ ＲＴ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、ａｂｍｇｏｏｄから購入、製品番号４９０、
ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ 東盛から購入、製品番号Ｍ１０６１／Ｍ１０６２）、
タンパク質ｍａｒｋｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏから購入、製品番号２６６１７、
Ｈｉｅｆｆ ｑＰＣＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｙｅａｓｅｎから購入、製品番号１１２０１ＥＳ０８、
ＡＰＣ／Ｃｙ７ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＣＤ３８ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入、製品番号１０２７２７、
ＡＰＣ／Ｃｙ７ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入、製品番号４０６５１５、
ＣＤ４５Ｒ （Ｂ２２０） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＲＡ３－６Ｂ２）， ＡＰＣ、 ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、製品番号８５－１７－０４５２－８２
ａｎｔｉ－ＣＤ２３ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、Ａｂｃａｍから購入、製品番号ａｂ２５４５７、
ＣＤ４５Ｒ （Ｂ２２０） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ＲＡ３－６Ｂ２）， ｅＦｌｕｏｒ ４５０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、製品番号８５－４８－０４５２－８２、
ＢＶ４２１ Ｒａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＣＤ１３８、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎから購入、製品番号 ５６２６１０、
ＣＤ１９ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ｅＢｉｏ１Ｄ３ （１Ｄ３））， ｅＦｌｕｏｒ ５０６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、製品番号８５－６９－０１９３－８０、
ＣＤ４３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ｅＢｉｏＲ２／６０）， ＰＥ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、製品番号８５－１２－０４３１－８１、
ＣＤ２３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （Ｂ３Ｂ４）， ＰＥ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、製品番号 ８５－１２－０２３２－８２、
Ａｎｔｉ－ＣＤ５ ａｎｔｉｂｏｄｙ ［５３－７．３］ （Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、Ａｂｃａｍから購入、製品番号 ａｂ１１４０７８、
ＣＤ２１／ＣＤ３５ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ｅＢｉｏ８Ｄ９ （８Ｄ９））， ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、製品番号８５－２５－０２１１－８０、
ＰＥ－ＣｙTM７ Ｈａｍｓｔｅｒ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＣＤ９５、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入、製品番号５５３６５３、
ＣＤ１９ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、製品番号２５－０１９３－８２、
ＩｇＭ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ｅＢ１２１－１５Ｆ９）， ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、製品番号８５－２５－５８９０－８２、
ＣＤ４３ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ （ｅＢｉｏＲ２／６０）， ＦＩＴＣ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、製品番号８５－１１－０４３１－８５、
Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ － ＦＩＴＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ、Ａｖｉｖａ ｓｙｓｔｅｍ ｂｉｏｌｏｇｙから購入、製品番号ＯＡＳＡ０６６２８、
７－ＡＡＤ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入、製品番号８５－００－６９９３－５０、
Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｃ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ （ＨＲＰ）、Ａｂｃａｍから購入、製品番号ａｂ９７２５５、
ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｄｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ、ＧＥから購入、製品番号ＲＰＮ２２３６、
Ｍｏｕｓｅ ＩｇＭ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ、ｂｅｔｈｙｌから購入、製品番号Ｅ９０－１０１、
Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｃ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ、ｂｅｔｈｙｌから購入、製品番号Ｅ９０－１３６、
Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ、ｂｅｔｈｙｌから購入、製品番号Ｅ９０－１３１、
Ｍｏｕｓｅ ＩｇＡ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ、ｂｅｔｈｙｌから購入、製品番号Ｅ９０－１０３、
Ｍｏｕｓｅ ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｓｅｔ、ｂｅｔｈｙｌから購入、製品番号Ｅ９０－１１５、
ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｅｔ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入、製品番号４２１１０１、
Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｃｏｍｐｌｅｔｅ、ｓｉｇｍａから購入、製品番号Ｆ５８８１、
Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ、ｓｉｇｍａから購入、製品番号Ｆ５５０６である。
第１部分、Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウス及びその免疫結果
実施例１、Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウス（本明細書では、ＭＤＧ１マウスとも呼ばれる）の製造
Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇマウスとは、Ｉｇｈｍ遺伝子、Ｉｇｈｄ遺伝子、Ｉｇｈｇ３遺伝子、Ｉｇｈｇ１遺伝子、Ｉｇｈｇ２ｂ遺伝子及びＩｇｈｇ２ｃ遺伝子上に位置する１個目エクソンがノックアウトされたＣ５７ＢＬ／６マウスを指し、当該エクソンは、ＩｇＧ２ｃ重鎖のＣＨ１ドメインをコードすることを担当する。以下のステップにより、Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスを製造する。
（１）核酸分子の取得
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの抗体重鎖可変領域及び定常領域の遺伝子部位の模式図は図１に示すとおりであり、図２に示すような標的決定戦略を設計して、マウスＩｇｈｍ、Ｉｇｈｄ、Ｉｇｈｇ３、Ｉｇｈｇ１、Ｉｇｈｇ２ｂ遺伝子及びＩｇｈｇ２ｃ中のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列をノックアウトする。発明者は、マウスのＩｇｈｍ遺伝子の１個目エクソンの上流からｓｇＲＮＡの標的配列（配列番号１、配列番号２）を選択し、マウスのＩｇｈｇ２ｃの１個目エクソンの下流からｓｇＲＮＡ標的配列（配列番号３、配列番号４）を選択して、標的配列に応じてｓｇＲＮＡ配列を設計し、具体的には、表１に示すとおりである。
Figure 2023539785000002
（２）核酸分子を骨格プラスミドに構築して、インビトロ転写でｓｇＲＮＡを得た。
ｓｇＲＮＡ配列をコードする合成した正方向及び逆方向のＤＮＡ ｏｌｉｇｏをアニーリングにより相補的な二本鎖に形成し、Ｔ４リガーゼを利用してｓｇＲＮＡ発現ベクター（ｐｘ３３０）に連結し、連結後に、専門的なシークエンシング会社のシークエンシングにより検証し、結果は、目的のプラスミドを取得したことを表し、さらに、インビトロ転写によりｓｇＲＮＡが得られた。
（３）宿主動物の受精卵に前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を導入する。
マウスの排卵を誘発し、インビトロ受精を行い、受精卵をインキュベートし、その後、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを混合し、マウスの受精卵を電気トランスフェクションする方法又は微量注射する方法でＣａｓ９タンパク質（又はＣａｓ９ ｍＲＮＡ、市場で購入可能）をｓｇＲＮＡと一緒にマウスの受精卵に注射した。
（４）上記のｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を含有する細胞を宿主動物の体内に植え込んだ。
上記の受精卵細胞を代理母マウスの体内に植え込んで、Ｆ０世代キメラマウスを製造できた。マウスの尾からのゲノムＤＮＡの抽出及びＰＣＲ検出により、Ｆ０世代マウスのうちノックアウトを受けた個体を検出した。遺伝子ノックアウトマウスに対してシークエンシングを行い、標的配列が削除されたことを確認した。遺伝子が正確にノックアウトされたＦ０世代キメラマウスを選別して、後続の繁殖及び同定に使用した。
ＰＣＲ用プライマーＩｇｈｍ－ｄ－ｇ－１Ｆ及びＩｇｈｍ－ｄ－ｇ－１Ｒで、ノックアウト遺伝子（図２の矢印に示すとおり）を検出でき、プライマーＩｇｈｄ－２Ｆ及びＩｇｈｄ－２Ｒで野生型遺伝子（図２の矢印に示すとおり）を検出でき、各プライマーの配列は表２に示すとおりであり、Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇマウスのうちノックアウトを受けた個体を検出する際のＰＣＲ結果の模式図は図３に示すとおりである。Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合体ノックアウト遺伝子を、プライマーＩｇｈｍ－ｄ－ｇ－１Ｆ及びＩｇｈｍ－ｄ－ｇ－１Ｒを用いて増幅することで、大きさが約７００ｂｐの目的のバンドを取得でき（左図に示すとおり）、プライマーＩｇｈｄ－２Ｆ及びＩｇｈｄ－２Ｒを用いて増幅することで、バンドを取得できず（右図に示すとおり）、Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇ野生型遺伝子を、プライマーＩｇｈｍ－ｄ－ｇ－１Ｆ及びＩｇｈｍ－ｄ－ｇ－１Ｒを用いて増幅することで、バンドを取得できず（左図に示すとおり）、プライマーＩｇｈｄ－２Ｆ及びＩｇｈｄ－２Ｒを用いて増幅することで、大きさが約６００ｂｐの目的のバンドを取得した（右図に示すとおり）。
Figure 2023539785000003
（５）ヘテロ接合、ホモ接合の遺伝子ノックアウトマウスの繁殖
標的遺伝子がノックアウトされたＦ０世代マウスを野生型マウスと交尾させてＦ１世代マウスを取得し、マウスの尾からのゲノムの抽出及びＰＣＲ検出により、安定的に遺伝できる遺伝子ノックアウト陽性Ｆ１世代ヘテロ接合体マウスを選別した。続いて、Ｆ１世代ヘテロ接合体マウスを互いに交尾させると、遺伝子ノックアウト陽性Ｆ２世代ホモ接合体マウス、即ちＩｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスを取得できた。取得したＦ１世代ヘテロ接合又はＦ２世代ホモ接マウスに対して遺伝子型同定を行う方法は、ステップ（４）と同じである。
実施例２、抗原免疫反応及び力価検出
ヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を用いてＩｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスを免疫させた。
免疫方法は、次のとおりである。６～８週齢の雄マウスを選択して、抗原ヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ、Ａ－５１７２、佰橋瑞景）に等量の完全フロイントアジュバント（Ｆ５８８１、Ｓｉｇｍａ）を添加して、水を滴下して融解しない状態に乳化し、マウスへの初回免疫のための皮下多点注射に使用され、初回免疫注射量は１００μｇ／匹マウスであり、初回免疫後、２週間毎に後続の皮下免疫を行い、ＣＲＰ抗原に等量のフロイント不完全アジュバント（Ｆ５５０６、Ｓｉｇｍａ）を加えて乳化した後、マウスに皮下多点注射し、毎回の注射量は１００μｇ／匹マウスである。
血清力価の検出方法は次のとおりである。ＣＲＰ抗原を２μｇ／ｍＬに希釈し、１００μｌを取ってポリスチレン酵素結合検出プレートに入れてからプレートをコーティングし、ＨＲＰ－ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５－０３５－０７１）を用いて血清中でＣＲＰ抗原と特異的に結合する特異性ＩｇＧ２ｃ抗体重鎖を検出する。
図４に示すように、それぞれ未免疫、１回目の免疫１週間後、２回目の免疫１週間後、３回目の免疫１週間後に採血し、ＰＢＳで血清を希釈し、１：５００希釈度から始まって倍率希釈を行い、ＥＬＩＳＡで検出した血清力価は、未免疫及び１回目免疫のマウス体内には抗原ＣＲＰと結合する特異性抗体が現れず、２回目免疫後から、マウス体内に抗原と結合する特異性ＩｇＧ２ｃ抗体が現れ、３回目免疫後には、力価がさらに向上せず、その血清力価は１：８０００程度で、次のステップの抗体遺伝子の調用実験に使用できる。
実施例３、未免疫Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウス及びＣＲＰ抗原免疫後のＩｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスの脾臓、胸腺、リンパ節及び器官の検査
上記の実施例２に続き、マウスを二酸化炭素無呼吸法により安楽死させた。解剖して胸腺、脾臓、腸間膜リンパ節、顎下リンパ節など、及び、心、肝、肺、腎臓などの複数の器官の大きさ及び形態を観察し、解剖学的に、未免疫Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウス及び抗原免疫後のＩｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスの胸腺、腸間膜リンパ節、顎下リンパ節、主要臓器のいずれにも明らかな異常がないことを示した。
実施例４、抗原免疫により特異性ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体を生成する
上記の実施例２に続き、ＣＲＰ抗原免疫マウスの血清タンパク質ブロッティングを行う。免疫後のマウス血清２μＬを取って、１００μＬのＰＢＳを入れ、１０μＬのＣＲＰ抗原－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅフィラーと室温で６０分間反応させた後、６０００ｒｐｍで３０秒遠心分離して、上清を捨てる。フィラーをＰＢＳで３回洗浄し、１０μＬのＰＢＳで再懸濁させて煮沸し、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を経て、ＰＶＤＦ膜に移行した後、それぞれＨＲＰ－ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１１５－０３５－０７１、重鎖の検出に使用）抗体及びＨＲＰ－ヤギ抗マウスＩｇ軽鎖（Ｊａｃｋｓｏｎ、１１５－０３５－１７４）抗体で反応させて、さらに発色させる。
本願の設計により、マウスＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の遺伝子がノックアウトされたため、抗原タンパク質でＩｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスを免疫させると、ＩｇＧ２ｃサブクラス抗体のみを生成し、且つ、ＩｇＧ２ｃ重鎖のＣＨ１遺伝子がノックアウトされたため、抗原タンパク質でＩｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスを免疫させると、ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体（ＣＨ１ドメインを含まない）を生成でき、ＩｇＧ２ｃ単独１本の重鎖の分子量は約４０ＫＤ程度である。抗原タンパク質で免疫させた後のＩｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスに生成された抗体は、分離、電気泳動及び発色等のステップを経た後、大きさが８０ＫＤのバンドの左右に抗原ＣＲＰと特異的に結合するバンドが現れ、これは、理論のＩｇＧ２ｃ重鎖の二量体分子量に一致し、且つ、ＨＲＰ－ヤギ抗マウスＩｇ軽鎖（Ｊａｃｋｓｏｎ、１１５－０３５－１７４）抗体と結合しなかった二量体を含んだ。
実施例５、ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体遺伝子の調用
上記の実施例２に続き、ＣＲＰ抗原でＩｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスを免疫させて、血清力価を検出した後、マウスを安楽死させて、脾臓細胞を採取し、Ｔｒｉｚｏｌ溶解を経て、総ＲＮＡを抽出して逆転写してｃＤＮＡを得、下記のようなＩｇＧ２ｃサブ型抗体特異性プライマーを使用して、ＰＣＲにより重鎖可変領域及びそれに連結されている重鎖定常領域を増幅する。
ＭＨＶ１：ＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＴＳＴＴＣＴＴＣ（配列番号２１）、
ＭＨＶ２：ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＲＴＡＴＣＡＴＳＹＴＣＴＴ（配列番号２２）、
ＭＨＶ３：ＡＴＧＡＡＧＷＴＧＴＧＧＴＴＡＡＡＣＴＧＧＧＴＴＴＴＴ（配列番号２３）、
ＭＨＶ４：ＡＴＧＲＡＣＴＴＴＧＧＧＹＴＣＡＧＣＴＴＧＲＴＴＴ（配列番号２４）、
ＭＨＶ５：ＡＴＧＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴＣＣＴＴ（配列番号２５）、
ＭＨＶ６： ＡＴＧＧＣＴＴＧＴＣＹＴＴＲＧＳＧＣＴＲＣＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号２６）、
ＭＨＶ７： ＡＴＧＧＲＡＴＧＧＡＧＣKＧＧＲＧＴＣＴＴＴＭＴＣＴＴ（配列番号２７）、
ＭＨＶ８： ＡＴＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＧＴＧ（配列番号２８）、
ＭＨＶ９： ＡＴＧＧＭＴＴＧＧＧＴＧＴＧＧＡＭＣＴＴＧＣＴＴＡＴＴＣＣＴＧ（配列番号２９）、
ＭＨＶ１０： ＡＴＧＧＧＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧ（配列番号３０）、
ＭＨＶ１１： ＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＧ（配列番号３１）、
ＭＨＶ１２： ＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＴＣＣＴＴＣＴＧＴＡＣＣ（配列番号３２）、
組み合わせＢ６_ＩｇＧ２ｃ_ＣＨ２ Ｒ１：５’- ＴＧＧＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＡＧＧＴＣＴＧ-３’（配列番号３３）。
ＰＣＲ反応体系は、表３に示すとおりである。
Figure 2023539785000004
ＰＣＲ反応プロセス：９８°Ｃで、２ｍｉｎ--３０回の循環（各循環は９８°Ｃで、１０ｓ--５０°Ｃで、２０ｓ--７２°Ｃで、４０ｓ）--７２°Ｃで、５ｍｉｎ--１６°Ｃ。
取得したＰＣＲ増幅産物をｐＥＡＳＹ－Ｔ５ Ｚｅｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇベクターに連結し、ＴＯＰ１０のコンピテント細胞を形質転換してＬＢプレートに塗り、１１個のクローンをランダムに選択して、コロニーＰＣＲで陽性であると同定したクローンに対してシークエンシングを行った（図５Ａに示すように、大きさが６５０ｂｐであるバンドが陽性バンドである）。
陽性クローンのシークエンシング結果（図５Ｂに示すように）により、Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスに生成されたＩｇＧ２ｃ抗体重鎖可変領域であるＦＲ４領域は、ＩｇＧ２ｃ Ｈｉｎｇｅ領域（抗体ヒンジ領域）に直接連結され、抗体重鎖の構造がＶＨ－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３であるため、ＶＨ領域はまた詳細にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４に分けられ得ることが示され、図５Ｂから分かるように、Ｉｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスに生成されたＩｇＧ２ｃ抗体重鎖可変領域であるＦＲ４領域は、Ｈｉｎｇｅ領域（抗体ヒンジ領域）に直接連結され、ＩｇＧ２ｃ ＣＨ１エクソンのノックアウトに成功したことを説明する。
実施例６、ＣＲＰ抗原特異性ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体可変領域のファージディスプレイライブラリの構築及びパンニング
Ｉ、ファージディスプレイライブラリの構築
上記の実施例２に続き、ＣＲＰ免疫したＩｇｈｍ－ｄ－ｇホモ接合型マウスの脾臓から総ＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ（Ｄｔ）を使用してｃＤＮＡ（ＴＡＫＡＲ ６１１０Ａ ｃＤＮＡ合成キット）を製造し、入れ子式ＰＣＲを用いてＰＣＲ増幅を２回行って重鎖抗体遺伝子を得た。
１回目のＰＣＲ過程は、実施例５で言及したＰＣＲ過程と完全に同じである。
２回目のＰＣＲに使用されるプライマー、反応体系、反応プロセスは下記のとおりである。
ＭＨＶＦ１-ＳｆｉＩ：ＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴｇｇｃｃｃａｇｇｃｇｇｃｃ ＧＡＧ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧ（配列番号３４）、
ＭＨＶＦ２-ＳｆｉＩ：ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴｇｇｃｃｃａｇｇｃｇｇｃｃ ＳＡＧ ＧＴＳ ＣＡＧ ＣＴＧ ＭＡＧ ＧＡＧ ＴＣＷＧＧ（配列番号３５）、
ＭＨＶＦ３-ＳｆｉＩ：ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴｇｇｃｃｃａｇｇｃｇｇｃｃ ＧＣＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＡ ＣＡＡ ＴＣＴ ＧＧ（配列番号３６）、
ＭＨＶＦ４-ＳｆｉＩ：ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴｇｇｃｃｃａｇｇｃｇｇｃｃ ＳＡＧ ＧＴＹ ＣＡＲ ＣＴＫ ＣＡＧ ＣＡＧ ＹＣＴ ＧＧ（配列番号３７）、
ＭＨＶＦ５-ＳｆｉＩ：ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＡＣＴＧＴ ｇｇｃｃｃａｇｇｃｇｇｃｃ ＧＡＲ ＧＴＧ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＷＧ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＧ（配列番号３８）、
Ｂ６－ＩｇＧ２ｃ－Ｈｉｎ－Ｓｆｉ１：ＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＴＧＧＧＣＡＣＴＣＴＧＧＧ（配列番号３９）、
反応体系は、表４に示すとおりである。
Figure 2023539785000005
ＰＣＲ反応プロセス：９８°Ｃで、２ｍｉｎ--３０回の循環（各循環は、９８°Ｃで、１０ｓ--６５°Ｃで、２０ｓ--７２°Ｃで、４０ｓ）--７２°Ｃで、５ｍｉｎ--１６°Ｃ。
ＰＣＲ増幅産物をＳｆｉＩ（ＦＤ１８２４、Ｔｈｅｒｍｏ）で酵素切断し、アガロース・ゲル電気泳動して、目的の産物ゲルを回収してから、ゲルが回収された目的の断片をＳｆｉＩで酵素切断したｐＣｏｍｂ３ＸＳＳベクター上にクローンした。Ｒ２７３８電気コンピテント細胞を電気トランスフェクションし、ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体ライブラリーを製造してパンニングを複数回行う。複数の陽性クローンを選択して、シークエンシングと同定のために送り、結果は図６に示すとおりである。
ＩＩ、パンニング
１．パンニング
１）コーティング：ＣＲＰ抗原をコーティング液で１００μｇ／ｍＬに希釈し、酵素標識プレート（１００μＬ／ウェル）の２つのウェルに入れ、４℃でコーティングして一晩置いた。
２）密閉：コーティング液を吸い出し、ＰＢＳでプレートを３回洗い、３００μＬの４％脱脂ミルクを用いて密閉し（２回目、３回目、４回目、５回目の密閉液は４％ＢＳＡである）、３７℃で２ｈインキュベートした。
３）結合：密閉液を吸い出し、ＰＢＳでプレートを３回洗い、１００μＬのファージディスプレイライブラリを入れ、３７℃で１ｈインキュベートした。
４）洗浄：結合していないファージを吸出し、ＰＢＳＴで洗浄した（本願では、パンニングを計５回行い、１回目、２回目ではそれぞれＰＢＳＴで３回洗浄し、３回目、４回目、５回目ではそれぞれＰＢＳＴで１０回洗浄した）。
５）溶出：１００μＬのＧｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を入れ、３７℃で、分注器を用いて５ｍｉｎ間緩やかに数回ピペットした。
６）中和：ウェル中の液体を遠心分離管に吸い出し、１５μＬの中和緩衝液（１ＭのＴｉｒｓ－Ｈｃｌ、ＰＨ＝８．８）を予め加えて均一に混合した。
７）１０μＬの中和後の溶出液を取ってタイターを測定し、残りの溶出液を増幅して培養した後、次の回のパンニングに使用した。
２．ファージの増幅と精製
１）中和後の溶出液を５ｍＬのＥＲ２７３８菌液（菌株を市場で購入、ＯＤ６００は約０．５～０．７である）に加え、均一に混合した。
２）３７℃の恒温槽に３０ｍｉｎ静置し、その後、３７℃の条件で、１８０ｒｐｍで１ｈ培養した。
３）培養物を２０ｍＬのＬＢ培地に入れ、３７℃の条件で、１８０ｒｐｍで２ｈ培養した。
４）２０μＬのヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（２×１０９ｃｆｕ）（ＮＥＢ社から購入、製品番号はＮ０３１５８である）を入れて、均一に混合した。
５）３７℃の恒温槽に３０ｍｉｎ静置し、その後、３７℃の条件で、１８０ｒｐｍで１ｈ培養した後にアンピシリン抗生物質を入れた。
６）３７℃で、１８０ｒｐｍで１ｈ培養した後に８０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。
７）２５ｍＬのＬＢ培地／Ａｍｐ／ｋａｎを用いて再懸濁させて、沈殿させ、３０℃の条件で、１８０ｒｐｍで一晩（約１４ｈ）培養した。
８）４℃で、８０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を採集した。
９）１／５体積のＰＥＧ－ＮａＣｌ溶液を入れ、４℃で約４～６ｈ静置した。
１０）４℃で、１２０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。
１１）沈殿物を１ｍＬで再懸濁させ、１０μＬを取ってタイターを測定した。
３．タイターの測定
１）ＰＢＳで被検ファージを希釈し（１０μＬのファージを９９０μＬのＰＢＳに入れて１０－２にする）、それぞれ、１０μＬの希釈後のファージを取って２００μＬのＥＲ２７３８菌液に入れ、均一に混合した。
２）感染された培養物を３７℃で３０ｍｉｎ静置培養した。
３）ＬＢ＋Ａｍｐ＋耐性プレートに塗った。
４）３７℃で逆置きして、一晩培養した。
５）コロニーをカウントし、タイターを計算した。
ＩＩＩ、ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体可変領域ライブラリーを製造してパンニングを５回行った後の結果は、表５に示すとおりである。
Figure 2023539785000006
パンニングを合計５回行い、上記の表から分かるように、出力されたファージに有意な濃縮があり、ＰＨＡＧＥ－ＥＬＩＳＡ実験により陽性クローンを選別してシークエンシングと同定のために送った。
実施例７、ＣＲＰ抗原特異性ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体可変領域の原核での発現と生物学的活性の同定
上記の実施例６に続き、シークエンシング配列を分析し、前の５回のパンニングで繰り返して出現したＤ４－１２（表６に示すようなヌクレオチド配列及びアミノ酸配列）を選択してＢＬ２１大腸菌にトランスフェクションし、１６℃で、異なる濃度のＩＰＴＧを入れて原核での発現を誘導し、超音波破砕を経て上清を採集してニッケル親和性カラム精製を行った。
特異性抗原ＣＲＰ及び無関係のタンパク質ＯＶＡ（２μｇ／ｍＬ）をコーティングし、精製されたＤ４－１２を用いて段階希釈を行い、ＥＬＩＳＡで検出し、結果は、精製されたＤ４－１２重鎖抗体可変領域は、抗原ＣＲＰを特異性識別し且つそれと結合することができ、良い濃度依存性を示すことを示し、図７に示すとおりである。
Figure 2023539785000007
実施例８、ＣＲＰ抗原特異性ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体可変領域の真核での発現と生物学的活性の同定
上記の実施例６に続き、シークエンシング配列をさらに分析し、最も多く繰り返して出現した配列Ｄ５Ｓ－１２（表７に示すようなヌクレオチド配列及びアミノ酸配列）を選択して真核での発現及び生物学的活性の同定を行った。ＫＯＰ２９３細胞（珠海凱瑞）にトランスフェクションし、六日目に培養細胞の上清液を採集して、目的のタンパク質のニッケル親和性カラム精製を行った。
Figure 2023539785000008
１、特異性抗原ＣＲＰ及び無関係のタンパク質ＯＶＡ又はＢＳＡ（２μｇ／ｍＬ）をコーティングし、精製されたＤ５Ｓ－１２抗体を段階希釈し、ＥＬＩＳＡで検出し、結果は、精製されたＤ５Ｓ－１２重鎖抗体は、抗原ＣＲＰを特異性識別し且つそれと結合することができ、良い濃度依存性を示すことを示し、結果は図８に示すとおりである。
２、Ｄ５Ｓ－１２重鎖抗体の親和性の測定：ＦＯＲＴＥＢＩＯ－ＯＣＴＥＴで、精製されたＤ５Ｓ－１２重鎖抗体の抗原ＣＲＰに対する親和性を測定し、抗体を１０μｇ／ｍＬに希釈し、抗原ＣＲＰを２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１３ｎＭに希釈し、測定により、その親和性定数は、ＫＤ（Ｍ）＝９．８７Ｅ－１０、Ｋｏｎ（１／Ｍｓ）＝８．５５Ｅ＋０４、Ｋｏｆｆ（１／ｓ）＝８．４４Ｅ－０５であり、重鎖抗体Ｄ５Ｓ－１２は抗原ＣＲＰに対して高い親和性を有し、結果は図９に示すとおりである。
第２部分、ＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスの製造及びその免疫結果
ＩｇｈＭ－３Ｇ３マウスとは、Ｉｇｈｍ遺伝子上の１個目エクソン、Ｉｇｈｇ３遺伝子、Ｉｇｈｇ１遺伝子、Ｉｇｈｇ２ｂ遺伝子、及びＩｇｈｇ２ｃ遺伝子上に位置する１個目エクソンがノックアウトされたＣ５７ＢＬ／６マウスを指す。ＩｇｈＭホモ接合型マウス（即ちＩｇｈｍ遺伝子上の１個目エクソンがノックアウトされたＣ５７ＢＬ／６マウス）を先に製造してから、ＩｇｈＭホモ接合型マウスに基づいてＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスを製造した。
実施例９、ＩｇｈＭホモ接合型マウスの製造
ＩｇｈＭホモ接合型マウスの製造には、以下のステップが含まれる。
（１）核酸分子の取得
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの抗体重鎖可変領域及び定常領域の遺伝子部位の模式図は図１に示すとおりであり、図１０に示すような標的決定戦略を設計して、マウスのＩｇｈｍ遺伝子中のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列をノックアウトした。
マウスのＩｇｈｍ遺伝子中のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列をノックアウトするために、マウスのＩｇｈｍ遺伝子の１個目エクソンの上流と下流から標的点を選択し、発明者は、マウスのＩｇｈｍ遺伝子上の１個目エクソンの上流からｓｇＲＮＡの標的配列（配列番号１、配列番号２）を選択し、マウスのＩｇｈｍ遺伝子中の１個目エクソン下流からｓｇＲＮＡ標的配列（配列番号５、配列番号６）を選択し、標的配列に基づいてｓｇＲＮＡ配列を設計し、具体的には、表８に示すとおりである。
Figure 2023539785000009
（２）核酸分子を骨格プラスミドに構築して、インビトロ転写でＲＮＡを得た。
ｓｇＲＮＡ配列の合成した正方向及び逆方向のＤＮＡ ｏｌｉｇｏをアニーリングにより相補的な二本鎖に形成し、Ｔ４リガーゼでｓｇＲＮＡ発現ベクター（ｐｘ３３０）に連結し、連結した後、シークエンシング専門会社によりシークエンシングして検証し、結果は、目的のプラスミドを取得したことを表し、さらにインビトロ転写によりｓｇＲＮＡを取得した。
（３）宿主動物の受精卵に前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を導入した。
マウスの排卵を誘発し、インビトロ受精を行い、受精卵をインキュベートし、その後、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを混合し、マウスの受精卵を電気トランスフェクションする方法又は微量注射する方法でＣａｓ９タンパク質（又はＣａｓ９ ｍＲＮＡ、市場で購入可能）をｓｇＲＮＡと一緒にマウスの受精卵に注射した。
（４）上記のｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を含有する細胞を代理母動物の体内に植え込んだ。
上記の受精卵細胞を代理母マウスの体内に組み込んで、Ｆ０世代キメラマウスを製造できた。マウスの尾からのゲノムＤＮＡの抽出及びＰＣＲ検出により、Ｆ０世代マウスのうちノックアウトを受けた個体を検出した。遺伝子ノックアウトマウスに対してシークエンシングを行い、標的配列が削除されたことを確認した。遺伝子が正確にノックアウトされたＦ０世代キメラマウスを選別して、後続の繁殖及び同定に使用した。
ＰＣＲ用プライマーＩｇｈｍ－Ｆ及びＩｇｈｍ－Ｒで、ノックアウト遺伝子を検出でき（如図１０の矢印に示すとおり）、プライマー配列は、表９を参照できる。
Figure 2023539785000010
検出結果は、図１１を参照する。以上のプライマーを使用してＰＣＲ検出を行う際に、Ｉｇｈｍ野生型遺伝子の増幅により約６００ｂｐのバンドを取得でき、Ｉｇｈｍ ＣＨ１ノックアウト遺伝子の増幅により約３００ｂｐのバンドを取得できる。図１１から分かるように、クローン＃１、＃２、＃３及び＃６は、Ｉｇｈｍ ＣＨ１ノックアウト遺伝子を含有する。遺伝子ノックアウトマウスに対してシークエンシングを行い、ノックアウトマウスのＩｇｈｍ遺伝子の１個目エクソンが削除されたことを確認した。
（５）繁殖ヘテロ接合、ホモ接合の遺伝子ノックアウトマウス
標的遺伝子がノックアウトされたＦ０世代マウスと野生型マウスとを交尾させてＦ１世代マウスを取得し、マウスの尾からのゲノムの抽出及びＰＣＲ検出により、安定的に遺伝できる遺伝子ノックアウト陽性Ｆ１世代ヘテロ接合体マウスを選別した。続いて、Ｆ１世代ヘテロ接合体マウスを互いに交尾させると、遺伝子ノックアウト陽性Ｆ２世代ホモ接合体マウス、即ちＩｇｈＭホモ接合型マウスを取得できる。取得したＦ１世代ヘテロ接合又はＦ２世代ホモ接マウスに対して遺伝子型同定を行う方法は、ステップ４と同じである。
実施例１０、ＩｇＭ重鎖抗体遺伝子の調用
上記の実施例２にしたがってＣＲＰ抗原免疫を行った後、ＩｇｈＭホモ接合型マウスを安楽死させて脾臓細胞を採集し、Ｔｒｉｚｏｌ溶解し、総ＲＮＡの抽出、及び逆転写によりｃＤＮＡを得、ＩｇＭサブ型抗体特異性プライマーを使用してＰＣＲにより重鎖可変領域及びそれに連結された重鎖定常領域を増幅し、使用されるプライマー及びその配列は、
ＭＨＶ１、ＭＨＶ２、ＭＨＶ３、ＭＨＶ４、ＭＨＶ５、ＭＨＶ６、ＭＨＶ７、ＭＨＶ８、ＭＨＶ９、ＭＨＶ１０、ＭＨＶ１１、ＭＨＶ１２（いずれも実施例５を参照できる）、
組み合わせＢ６ ＩｇｈＭ ＣＨ２ Ｒ４：ＧＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧＣＧＡＣＡＧＣ（配列番号４６）である。
ＰＣＲ反応体系は表１０に示すとおりである。
Figure 2023539785000011
ＰＣＲ反応プロセス：９８°Ｃで、２ｍｉｎ--３０回の循環（各循環は９８°Ｃで、１０ｓ--５０°Ｃで、２０ｓ--７２°Ｃで、４０ｓ）--７２°Ｃで、５ｍｉｎ--１６°Ｃ。
ＰＣＲ増幅産物をｐＥＡＳＹ－Ｔ５ Ｚｅｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇベクターに連結し、ＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換して、ＬＢプレート（アンピシリン抗性）に塗り、クローンを選択してコロニーＰＣＲを行った。陽性クローンをシークエンシングのために送り、シークエンシング結果から分かるように、ＩｇｈＭホモ接合型マウスに発現されたＩｇＭ抗体重鎖可変領域ＦＲ４はＣＨ２（開始アミノ酸配列ＡＶＡＥＭＮ）に直接連結され、結果は図１２に示すとおりであり、ゲノムＩｇＭ ＣＨ１のエクソンのノックアウトに成功した。
実施例１１、ＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスの製造
ＩｇｈＭ－３Ｇ３マウスホモ接合型の製造方法であって、当該方法は、下記のステップを含む。
（１）核酸分子の取得
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの抗体重鎖可変領域及び定常領域の遺伝子部位の模式図は図１に示すとおりであり、図１３に示すような標的決定戦略を設計して、実施例９で取得したＩｇｈＭホモ接合型マウスを基に、Ｉｇｈｇ３遺伝子、Ｉｇｈｇ１遺伝子、Ｉｇｈｇ２ｂ遺伝子、及びＩｇｈｇ２ｃ遺伝子上に位置する１個目エクソンをさらにノックアウトした。
マウスのＩｇｈｍ上のＣＨ１ドメインをコードする第１エクソン、Ｉｇｈｇ３、Ｉｇｈｇ１、Ｉｇｈｇ２ｂ遺伝子、及びＩｇｈｇ２ｃ上のＣＨ１ドメインをコードする１個目エクソンをノックアウトするために、発明者は、ＩｇｈＭホモ接合型マウスを基に、マウスＩｇｈｇ３遺伝子の１個目エクソンの上流からｓｇＲＮＡの標的配列（配列番号７、配列番号８）を選択し、マウスのＩｇｈｇ２ｃ遺伝子の１個目エクソン下流からｓｇＲＮＡ標的配列（配列番号３、配列番号４）を選択して、標的配列に応じてｓｇＲＮＡ配列を設計し、具体的には、表１１に示すとおりである。
Figure 2023539785000012
（２）核酸分子を骨格プラスミドに構築して、インビトロ転写でＲＮＡを得た。
合成したｓｇＲＮＡ配列の正方向及び逆方向のＤＮＡ ｏｌｉｇｏをアニーリングにより相補的な二本鎖に形成し、Ｔ４リガーゼでｓｇＲＮＡ発現ベクター（ｐｘ３３０）に連結し、連結した後、シークエンシング専門会社によりシークエンシングして検証し、結果は、目的のプラスミドを取得したことを表し、さらにインビトロ転写によりｓｇＲＮＡを取得した。
（３）宿主動物の受精卵に前記ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を導入した。
マウスの排卵を誘発し、インビトロ受精を行い、受精卵をインキュベートし、その後、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とを混合し、マウスの受精卵を電気トランスフェクションする方法又は微量注射する方法でＣａｓ９タンパク質（又はＣａｓ９ ｍＲＮＡ、市場で購入可能）をｓｇＲＮＡと一緒にマウスの受精卵に注射した。
（４）上記のｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を含有する細胞を宿主動物体内に植え込んだ。
上記の受精卵細胞を代理母マウスの体内に組み込んで、Ｆ０世代キメラマウスを製造できた。マウスの尾からのゲノムＤＮＡの抽出及びＰＣＲ検出により、Ｆ０世代マウスのうちノックアウトを受けた個体を検出した。遺伝子ノックアウトマウスに対してシークエンシングを行い、標的配列が削除されたことを確認した。遺伝子が正確にノックアウトされたＦ０世代キメラマウスを選別して、後続の繁殖及び同定に使用した。
ＰＣＲ用プライマーＩｇｈｇ－１Ｆ及びＩｇｈｇ－１Ｒで、ノックアウト遺伝子を検出でき、プライマーＩｇｈｇ－２Ｒ及びＩｇｈｇ－１Ｆで、野生型遺伝子（図１３の矢印）を検出できる。プライマーの配列は、表１２に示すとおりである。
Figure 2023539785000013
ＰＣＲにより、ＩｇｈＭ－３Ｇ３マウスに対して遺伝子型同定を行い（図１４）、Ｉｇｈｍ遺伝子型のプライマーＩｇｈｍ－Ｆ及びＩｇｈｍ－Ｒを用いる同定：Ｉｇｈｍ野生型遺伝子を増幅すると約６００ｂｐの目的の産物を取得できるため、ノックアウト遺伝子を増幅すると約３００ｂｐの目的の産物を取得できる。Ｉｇｈｇ遺伝子型のプライマーＩｇｈｇ－１Ｆ、Ｉｇｈｇ－１Ｒ及びＩｇｈｇ－２Ｒを用いる同定：Ｉｇｈｇノックアウト遺伝子を、プライマーＩｇｈｇ－１Ｆ及びＩｇｈｇ－２Ｒ用いて増幅することで約５００ｂｐの目的の産物を取得でき、プライマーＩｇｈｇ－１Ｆ及びＩｇｈｇ－１Ｒを用いて増幅することでバンドを取得することができず、Ｉｇｈｇ野生型遺伝子をプライマーＩｇｈｇ－１Ｆ及びＩｇｈｇ－２Ｒで増幅することでバンドを取得できず、プライマーＩｇｈｇ－１Ｆ及びＩｇｈｇ－１Ｒで増幅することで約４６０ｂｐの目的の産物を取得できる。＋／－：ヘテロ接合体、ｗｔ：野生型、－／－：ノックアウトホモ接合体である。
（５）ヘテロ接合、ホモ接合の遺伝子ノックアウトマウスの繁殖
標的遺伝子がノックアウトされたＦ０世代マウスと野生型マウスとを交尾させてＦ１世代マウスを取得し、マウスの尾からのゲノムの抽出及びＰＣＲ検出により、安定的に遺伝できる遺伝子ノックアウト陽性Ｆ１世代ヘテロ接合体マウスを選別した。続いて、Ｆ１世代ヘテロ接合体マウスを互いに交尾させると、遺伝子ノックアウト陽性Ｆ２世代ホモ接合体マウス、即ちＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスを取得できた。取得したＦ１世代ヘテロ接合又はＦ２世代ホモ接マウスに対して遺伝子型同定を行う方法は、ステップ４と同じである。
実施例１２、ＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスの抗原免疫反応及び力価検出
ヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を用いてＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスを免疫させた。
免疫方法は次のとおりである。６～８週齢の雄マウスを選択して、抗原ヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ、Ａ－５１７２、佰橋瑞景）に等量の完全フロイントアジュバント（Ｆ５８８１、Ｓｉｇｍａ）を加え、水を滴下して融解しない状態に乳化すると、マウスへの初回免疫皮下多点注射に使用するものにすることができ、初回免疫注射量は１００μｇ／匹マウスであり、初回免疫後、２週間毎に後続の皮下免疫を行い、ＣＲＰ抗原に等量のフロイント不完全アジュバント（Ｆ５５０６、Ｓｉｇｍａ）を加えて乳化した後、マウスに皮下多点注射を行い、毎回の注射量は１００μｇ／匹マウスである。
血清力価の検出
血清力価の検出方法は次のとおりである。ＣＲＰ抗原を２μｇ／ｍＬに希釈し、１００μｌを取ってポリスチレン酵素結合検出プレートに入れてからプレートをコーティングし、ＨＲＰ－ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１１５－０３５－０７１）を用いて血清中でＣＲＰ抗原と特異的に結合する特異性ＩｇＧ抗体を検出する。
図１５に示すように、それぞれ未免疫、１回目の免疫１週間後、３回目の免疫１週間後に採血し、ＰＢＳで血清を希釈し、１：５００希釈度から始まって倍率希釈を行い、ＥＬＩＳＡで検出した血清力価は、未免疫及び１回目免疫のマウス体内には抗原ＣＲＰと結合した特異性抗体が発生せず、３回目免疫後のその血清力価は１：３２０００程度であることを示した。
実施例１３、ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体遺伝子の調用
ＣＲＰ抗原でＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスを免疫させて、血清力価を検出した後、マウスを安楽死させて脾臓細胞を採集し、Ｔｒｉｚｏｌ溶解、総ＲＮＡの抽出、逆転写によりｃＤＮＡを得、下記のようなＩｇＧ２ｃサブ型抗体特異性プライマーを使用して、ＰＣＲにより重鎖可変領域及びそれに連結されている重鎖定常領域を増幅した。
ＭＨＶ１、ＭＨＶ２、ＭＨＶ３、ＭＨＶ４、ＭＨＶ５、ＭＨＶ６、ＭＨＶ７、ＭＨＶ８、 ＭＨＶ９、ＭＨＶ１０、ＭＨＶ１１、ＭＨＶ１２、組み合わせＢ６＿ＩｇＧ２ｃ＿ＣＨ２ Ｒ１の何れは、実施例５を参照し、
ＰＣＲ反応体系、ＰＣＲ反応プロセスは実施例５に示すとおりである。
取得したＰＣＲ増幅産物をｐＥＡＳＹ－Ｔ５ Ｚｅｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇベクターに連結し、ＴＯＰ１０のコンピテント細胞を形質転換してＬＢプレートに塗り、７個のクローンをランダムに選択して、コロニーＰＣＲで陽性に同定されたものをシークエンシングのために送った（図１６Ａに示すように、大きさが６５０ｂｐのバンドが陽性バンドである）。
陽性クローンのシークエンシング結果は、ＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスに生成されたＩｇＧ２ｃ抗体重鎖可変領域であるＦＲ４領域はＩｇＧ２ｃ Ｈｉｎｇｅ領域（抗体ヒンジ領域）に直接連結され、抗体重鎖の構造がＶＨ－ＣＨ１－Ｈｉｎｇｅ－ＣＨ２－ＣＨ３であり、ここで、ＶＨ領域はまた詳細にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４に分けられ得ることを示し（図１６Ｂに示すように）、ＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスに生成されたＩｇＧ２ｃ抗体重鎖可変領域であるＦＲ４領域はＨｉｎｇｅ領域（抗体ヒンジ領域）に直接連結され、ＩｇＧ２ｃのＣＨ１エクソンのノックアウトに成功したことを説明する。
実施例１４、ＣＲＰ抗原特異性ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体可変領域のファージディスプレイライブラリの構築及びパンニング
上記の実施例１３に続き、ファージディスプレイライブラリの構築及び抗体パンニングのステップは実施例６と完全に同じであり、表１３内のパラメータのみを調整し、パンニングを５回行った後の結果は、表１３に示すとおりである。
Figure 2023539785000014
パンニングを合計５回行い、表１３から分かるように、出力されたファージに有意な濃縮があり、ＰＨＡＧＥ－ＥＬＩＳＡ実験により陽性クローンを選択してシークエンシングと同定のために送り、表１４に示すとおりである。
Figure 2023539785000015
実施例１５、ＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスの抗原免疫反応及び力価検出
本実施例はコロナウイルスＳタンパク質抗原でＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスを免疫させた。
免疫方法は次のとおりである。６～８週齢の雄マウスを選択して、抗原コロナウイルスＳタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ （２０１９－ｎＣｏＶ） Ｓｐｉｋｅ Ｓ１－Ｈｉｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、４０５９１－Ｖ０８Ｈ、義翹神州）に等量の完全フロイントアジュバント（Ｆ５８８１、Ｓｉｇｍａ）を加え、水を滴下して融解しない状態に乳化すると、マウスへの初回免疫皮下多点注射に使用するものにすることができ、初回免疫注射量は１００μｇ／匹マウスであり、初回免疫後、２週間毎に後続の皮下免疫を行い、毎回の注射量は、いずれも１００μｇ／匹マウスである。
血清力価の検出
血清力価の検出方法は次のとおりである。コロナウイルスＳタンパク質抗原を２μｇ／ｍＬに希釈し、１００μＬを取ってポリスチレン酵素結合検出プレートに入れてからプレートをコーティングし、ＨＲＰ－ヤギ抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５－０３５－０７１）を用いて血清中でＣＲＰ抗原と特異的に結合する特異性ＩｇＧ抗体を検出する。
それぞれ未免疫、２回目の免疫１週間後、３回目の免疫１週間後及び４回目の免疫１週間後に採血し、ＰＢＳで血清を希釈し、１：５００希釈度から始まって倍率希釈を行い、ＥＬＩＳＡで血清力価を検出し、その結果は図１７に示すとおりであり、図１７は、未免疫マウス体内では、抗原コロナウイルスＳタンパク質と結合した特異性抗体が現れず、２回目免疫後のその血清力価は１：６４０００程度であることを示した。
実施例１６、ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体遺伝子の調用
上記の実施例１５にしたがって、コロナウイルスＳタンパク質抗原でＩｇｈＭ－３Ｇ３ホモ接合型マウスを免疫させ、血清力価を検出した後、マウスを安楽死させて、その脾臓細胞を採集し、脾臓細胞に対してＴｒｉｚｏｌ溶解、総ＲＮＡの抽出、逆転写を行ってｃＤＮＡを得、下記のようなＩｇＧ２ｃサブ型抗体特異性プライマーを使用して、ＰＣＲにより重鎖可変領域及びそれに連結されている重鎖定常領域を増幅した。
ＭＨＶ１、ＭＨＶ２、ＭＨＶ３、ＭＨＶ４、ＭＨＶ５、ＭＨＶ６、ＭＨＶ７、ＭＨＶ８、 ＭＨＶ９、ＭＨＶ１０、ＭＨＶ１１、ＭＨＶ１２、組み合わせＢ６＿ＩｇＧ２ｃ＿ＣＨ２ Ｒ１の何れは、実施例５を参照し、
ＰＣＲ反応体系、ＰＣＲ反応プロセスは、実施例５に示すとおりである。
取得したＰＣＲ増幅産物をｐＥＡＳＹ－Ｔ５ Ｚｅｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇベクターに連結し、ＴＯＰ１０のコンピテント細胞に形質転換してＬＢプレートに塗り、２３個のクローンをランダムに選択して、コロニーＰＣＲにより陽性と同定されたクローンをシークエンシングのために送る（ＰＣＲ結果は図１８Ａに示すとおりであり、ここで、大きさが６５０ｂｐのバンドが陽性バンドである）。
実施例１７、コロナウイルスＳタンパク質抗原特異性ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体可変領域のファージディスプレイライブラリの構築及びパンニング
上記の実施例１６に続き、ファージディスプレイライブラリの構築及び抗体パンニングのステップは、実施例６と完全に同じであり、パンニングを合計５回行い、毎回の出力されたファージに有意な濃縮があり、ＰＨＡＧＥ－ＥＬＩＳＡ実験により陽性クローンを選択してシークエンシングと同定のために送り、表１５に示すとおりである。これらの配列のＣＤＲ領域の類似点と相違点を分析し、その結果は図１８Ｂに示すとおりである。
Figure 2023539785000016
シークエンシング配列を分析し、前の５回のパンニングで出現したＳ－９、Ｓ－１９、Ｓ－２７及びＳ－４７（表１５に示すようなアミノ酸配列）を選択してＢＬ２１大腸菌にトランスフェクションし、３０℃で、異なる濃度のＩＰＴＧを加えて、原核での発現を誘導し、超音波破砕により上清液を採集して、ニッケル親和性カラム精製を行った。
特異性抗原コロナウイルスＳタンパク質及び無関係のタンパク質ＯＶＡ（２μｇ／ｍＬ）をコーティングし、精製した後のＳ－９、Ｓ－１９、Ｓ－２７及びＳ－４７抗体を段階希釈して、ＥＬＩＳＡ法で検出し、結果は、今回調用した重鎖抗体可変領域は抗原コロナウイルスＳタンパク質を特異性識別し且つそれと結合しることができ、良い濃度依存性を表し、図１９に示すとおりである。
実施例１８、ＩｇｈＭ－ＤＧ１ホモ接合型マウスの抗原免疫反応及び力価検出
本実施例では、コロナウイルスＳタンパク質抗原を用いてＩｇｈＭ－ＤＧ１ホモ接合型マウスを免疫させた。
マウスの抗原免疫操作及び血清力価検出のステップは、実施例１５と完全に同じであり、その血清力価の検出結果は図２０Ａに示すとおりであり、ファージディスプレイライブラリの構築及び抗体パンニングのステップは、実施例６と完全に同じであり、パンニングを合計５回行い、毎回の出力されたファージに有意な濃縮があり、ＰＨＡＧＥ－ＥＬＩＳＡ実験により陽性クローンを選択してシークエンシングと同定のために送り、表１６に示すとおりである。そして、これらの配列のＣＤＲ領域の類似点と相違点を分析し、その結果は図２０Ｂに示すとおりである。
Figure 2023539785000017
Figure 2023539785000018
シークエンシング配列を分析し、前の５回のパンニングで出現したＳ－１、Ｓ－２、Ｓ－７、Ｓ－１２、Ｓ－１７、Ｓ１９及びＳ－６５抗体（表１６に示すようなアミノ酸配列）のＤＮＡ配列を選択してＰＥＴ２８ベクターにクローンして、ＢＬ２１大腸菌にトランスフェクションし、１６℃で、異なる濃度のＩＰＴＧを加えて原核での発現を誘導し、超音波破砕を経て上清を採取し、ニッケル親和性カラム精製を行った。
特異性抗原コロナウイルスＳタンパク質及び無関係のタンパク質ＯＶＡ（２μｇ／ｍＬ）をコーティングし、精製した後のＳ－１、Ｓ－７、Ｓ－１２、Ｓ－１７、Ｓ１９、Ｓ－２５、Ｓ－５１及びＳ－６５抗体を段階希釈して、ＥＬＩＳＡ法により検出し、結果は、今回調用した重鎖抗体可変領域は抗原コロナウイルスＳタンパク質を特異性識別し且つそれと結合することができ、良い濃度依存性を表すことを示し、図２１に示すとおりである。
実施例１９、ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体遺伝子の調用
本実施例では、コロナウイルスＮタンパク質抗原を用いてＭＤＧ１ホモ接合型マウスを免疫させた。
免疫方法及び血清力価の検出方法は、実施例１５と完全に同じであり、免疫後の血清力価の検出結果は図２２Ａに示すとおりである。本実施例に使用される抗原はコロナウイルスＮタンパク質（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ （２０１９－ｎＣｏＶ） Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ－Ｈｉｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ、４０５８８－Ｖ０８Ｂ－Ｂ、義翹神州）である。
ファージディスプレイライブラリの構築及び抗体パンニングのステップは実施例６と完全に同じであり、パンニングを合計５回行い、毎回の出力されたファージに有意な濃縮があり、ＰＨＡＧＥ－ＥＬＩＳＡ実験により陽性クローンを選択してシークエンシングと同定のために送り、表１７に示すとおりである。そして、これらの配列のＣＤＲ領域の類似点と相違点を分析し、図２２Ｂに示すとおりである。
Figure 2023539785000019
陽性クローンのＤＮＡ配列をＰＥＴ２８ベクターにクローンし、ＢＬ２１細菌に形質転換して、発現を誘導し、その後、ニッケルカラムで目的のタンパク質を精製し、ＥＬＩＳＡ法により抗体の特異性及び結合力を検出し、その結果は図２３に示すとおりであり、図２３の結果は、今回調用した重鎖抗体可変領域は抗原コロナウイルスＳタンパク質を特異性識別し且つそれと結合することができ、良い濃度依存性を表すことを示す。
実施例２０、両遺伝子型マウスにおける各免疫グロブリン遺伝子の転写レベルの差を蛍光定量ＰＣＲで検出する
ＭＤＧ１マウス及び野生型マウスの脾臓からＲＮＡを抽出して、ｃＤＮＡに逆転写し、ｃＤＮＡを５倍希釈した後に５μＬを取って蛍光定量ＰＣＲ実験を行い、各遺伝子型から４匹の個体を選択し、各個体の各遺伝子に対して２つの技術を繰り返して行い、実験に使用されたプライマー及び増幅断片の長さは表１８に示すとおりであり、蛍光定量ＰＣＲ増幅体系は、表１９に示すとおりである。
Figure 2023539785000020
Figure 2023539785000021
増幅プロセス：
Figure 2023539785000022
溶解曲線
６５℃：１ｍｉｎ
０．１１℃／ｓの速度で９５℃まで継続的に昇温
プロセスが終了した後、溶解曲線に応じて数値の信頼度を判断し、その後、２－ΔΔＣｔ方法を用いて各免疫グロブリン遺伝子の転写産物の相対的な発現レベルを計算し、２尾Ｔ検定を利用して統計学的分析を行い、統計的結果は図２４、図２５及び図２６に示すとおりであり、これらの結果から分かるように、ＭＤＧ１マウスは野生型マウスと比較して、骨髄、脾臓及び小腸中のμ遺伝子の転写産物の発現量が低く、γ２ｃ遺伝子の転写産物の発現量が高く、且つ、ＭＤＧ１マウスの３つの免疫組織におけるγ２ｃ遺伝子の転写産物の発現量は、いずれも野生型マウスにおけるμ遺伝子の転写産物の発現量より高く、両遺伝子型マウスでは、α遺伝子の転写産物の発現量の統計学的差が見られなかった。
実施例２１、ＭＤＧ１マウスの血清におけるＩｇＧ２ｃの発現パターンをＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔで検出する
同じ遺伝的背景下で、８週齢の野生型マウス及びＭＤＧ１マウスの血清を採集してＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ検出を行い、野生型マウスの血清をＰＢＳで２０倍希釈し、ＭＤＧ１マウスの血清をＰＢＳで１００倍希釈し、還元条件で１ｍＭのＤＴＴを使用して分子内のジスルフィド結合を開き、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｃ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ （ＨＲＰ）抗体を１００００倍希釈した。Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔの検出結果は図２７に示すとおりであり、図２７から分かるように、ＭＤＧ１マウス血清におけるＩｇＧ２ｃの還元条件での分子量の大きさは約４５ｋＤａであり、非還元条件での分子量の大きさは約９５ｋＤａであり、ＣＨ１ドメイン及び軽鎖欠失の分子量の大きさに一致した。
実施例２２、ＭＤＧ１マウスの血清におけるＩｇＧ２ｃの発現量をＥＬＩＳＡで検出する
同じ遺伝的背景下で、８週齢の野生型マウス及びＭＤＧ１マウスの血清を採集して、二重抗体サンドイッチ法ＥＬＩＳＡを使用して検出する。野生型マウスのＩｇＭを２０００倍希釈し、ＩｇＧ２ｃを４０００倍希釈し、ＩｇＧを１００００倍希釈し、ＩｇＡを５０００倍希釈し、ＩｇＥを２０倍希釈し、ＭＤＧ１マウスのＩｇＭを２０００倍希釈し、ＩｇＧ２ｃを８０００倍希釈し、ＩｇＧを１００００倍希釈し、ＩｇＡを５０００倍希釈し、ＩｇＥを２０倍希釈した。マイクロプレートリーダーを使用して各サンプルウェルの４５０ｎｍでの吸光値を読み取り、ＥＬＩＳＡ Ｃａｌｃを使用して、４つのパラメータのフィッティングに応じて検量線を得、各ウェルの免疫グロブリンの含有量を計算し、２尾Ｔ検定を用いて統計的分析を行った。
結果は、図２８に示すとおりであり、図２８から分かるように、ＭＤＧ１マウスの血清ではＩｇＭが確かに発現されず、そのＩｇＧ２ｃの発現レベルは野生型マウスよりも有意に高く、野生型マウスにおけるＩｇＭの発現レベルに相当し、野生型マウスには他のＩｇＧサブ型が存在するため、その血清における総ＩｇＧの発現レベルはＭＤＧ１マウスよりも有意に高く、ＭＤＧ１マウスの血清におけるＩｇＥの発現レベルは野生型マウスよりも有意に低く、野生型マウスと比較して、ＩｇＡの発現レベルの統計学的差が見られなかった。
実施例２３、ＭＤＧ１マウスの骨髄、脾臓及び腹膜腔Ｂ細胞の発育をフローサイトメトリーで検出する
骨髄Ｂ細胞：
同じ遺伝的背景下で、８週齢の野生型マウス及びＭＤＧ１マウスを６匹ずつ準備し、その下肢の２本の大腿骨及び脛骨を取って、ＦＡＣＳを用いて骨髄細胞を遠心分離管に入れ、短時間遠心分離した後、ＡＣＫを使用して再懸濁させ、７０μｍのろ過網で細胞懸濁液をろ過し、遠心分離した後に上清を捨て、１ｍＬのＦＡＣＳを加えて細胞を再懸濁させ、それから５０μＬの細胞を取って染色に使用し、１０μＬの細胞を取って４０倍希釈してカウントし、骨髄Ｂ細胞の染色プロトコルは、表２０に示すとおりである。
脾臓Ｂ細胞：
同じ遺伝的背景下で、８週齢の野生型マウス及びＭＤＧ１マウスを４匹ずつ準備し、７０μｍろ過網を６０ｍｍ皿に置き、１ｍＬのＡＣＫを加え、その脾臓をろ過網上に置いて軽くすり、すりつぶした後の細胞懸濁液を収集して、短時間遠心分離した後、上清を捨て、１ｍＬのＦＡＣＳを加えて細胞を再懸濁させ、それから５０μＬの細胞を取って染色に使用し、１０μＬの細胞を取って４０倍希釈してカウントし、脾臓Ｂ細胞の染色プロトコルは、表２０に示すとおりである。
腹膜腔Ｂ細胞：
同じ遺伝的背景下で、８週齢の野生型マウス及びＭＤＧ１マウスを７匹ずつ準備し、それの腹部を上向きにフォームボード上に固定し、腹部の表皮を切り開いて腹膜部分を露出させ、注射器で５ｍＬのＦＡＣＳを吸い取って腹膜腔に注入し、ピペットを使用して吹き吸いを２～３回行った後、細胞懸濁液を遠心分離管に収集し、短時間遠心分離した後、ＡＣＫを使用して再懸濁させ、７０μｍのろ過網で細胞懸濁液をろ過し、遠心分離した後に上清を捨て、２００μＬのＦＡＣＳを加えて細胞を再懸濁させ、それから１００μＬの細胞を取って染色に使用し、腹膜腔Ｂ細胞の染色プロトコルは、表２０に示すとおりである。
Figure 2023539785000023
骨髄におけるＢ細胞のフローサイトメトリー結果は図２９に示すとおりであり、図２９結果は、次のことを示す。即ち、ＭＤＧ１マウスは野生型マウスと比較して、骨髄におけるＢ細胞の比率及び数の統計学的差が見られず、ｐｒｏ－Ｂ細胞及びｐｒｅ－Ｂ細胞の比率の統計学的差が見られなかったが、数が有意に低下し、ＩｇＭは成熟Ｂ細胞において高発現し、未熟Ｂ細胞において低発現し、ＭＤＧ１マウスにはＩｇＭを発現するμ遺伝子が欠失しているため、その体内での未熟Ｂ細胞及び成熟Ｂ細胞の発育状況を確認できないが、ＭＤＧ１マウスにはＩｇＧ２ｃ＋Ｂ細胞が大量存在するため、このＢ細胞群の野生型マウスにおける比率が極めて低い。
脾臓中のＢ細胞のフローサイトメトリー結果は図３０に示すとおりであり、図３０結果は、次のことを示す。即ち、ＭＤＧ１マウスは野生型マウスと比較して、脾臓におけるＢ細胞の比率が有意に低いが、数の統計学的差が見られず、ＭＤＧ１マウスの脾臓におけるＩｇＧ２ｃ＋Ｂ細胞の比率及び数は、野生型マウスにおけるＩｇＭ＋Ｂ細胞の比率及び数より有意に高く、これは、野生型マウスのＩｇＭが他の免疫グロブリンサブ型にクラススイッチして、組み換えられることが原因である可能性があり、今回のフローサイトメトリー実験に選択されたのは、未免疫刺激状態でのマウスであるため、野生型マウス及びＭＤＧ１マウスの脾臓内の形質細胞の比率及び数は両方とも低く、且つ、統計学的差が見られず、ＭＤＧ１マウスの脾臓における濾胞Ｂ細胞、移行期Ｂ細胞及び辺縁Ｂ細胞の比率及び数は、野生型マウスと比較して、統計学的差が見られなかった。
腹膜腔におけるＢ細胞のフローサイトメトリー結果は、図３１に示すとおりであり、図３１結果は、次のことを示す。即ち、ＭＤＧ１マウスは野生型マウスと比較して、腹膜腔におけるＢ細胞の比率が有意に高く、ＭＤＧ１マウス中で、ＩｇＭ＋Ｂ１ａ細胞の比率が有意に低下し、Ｂ１ｂ及びＢ２細胞の比率が有意に向上した。
実施例２４、特定の抗原を使用して野生型マウス及びＭＤＧ１マウスに対して免疫刺激を行った
同じ遺伝的背景下で、６週齢の野生型マウス及びＭＤＧ１マウスを６～７匹ずつ準備し、ＢＳＡを接合するクロラムフェニコール及びアトラジンを使用して免疫実験を行い、マウス１匹あたり、毎回１００μｇ／１００μＬで免疫した。初回免疫では、完全フロイントアジュバントを使用し、背部に５０μＬ皮下注射し、腹腔に５０μＬ注射し、免疫強化では、フロイント不完全アジュバントを使用し、腹腔に１００μＬ注射し、免疫強化を合計４回行い、初回免疫の３日前、毎回の免疫強化の３日後に内眼角採血を行った。
実施例２５、免疫刺激後のマウス血清における抗原特異性抗体の相対的な発現量の変化傾向をＥＬＩＳＡで検出する
上記の実施例２４に続き、免疫刺激後の血清に大量存在するＢＳＡ特異性の抗体が検出結果を干渉することを回避するために、今回のＥＬＩＳＡ実験では、ＯＶＡを接合するクロラムフェニコール及びアトラジンをコーティング抗原として使用し、抗原コーティング量は２００ｎｇ／１００μＬ／ウェルであり、抗原特異性ＩｇＭ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ及びＩｇＡの検出中、血清の希釈倍数は４０００倍であり、ＩｇＥの検出中、血清の希釈倍数は１００倍であり、各サンプルウェルの一致性を保証するために、ＴＭＢ発色液を加えた後、反応時間を２０ｍｉｎに厳格に制御し、その後、マイクロプレートリーダーを利用して４５０ｎｍでの吸光値を読み取り、免疫反応が発生しなかった個体を除き、抗原特異性抗体の相対的な発現量の変化傾向図をプロットした。
クロラムフェニコール及びアトラジン特異性抗体の相対的な発現量の変化は、それぞれ図３２及び図３３に示すとおりであり、その結果は、次のことを示す。即ち、免疫応答の全体状況から見ると、クロラムフェニコールがアトラジンより免疫効果が優れている。ＭＤＧ１マウスにおける抗原特異性ＩｇＧ２ｃの変化傾向が野生型マウスにおけるＩｇＧ２ｃの変化傾向に類似し、野生型マウス中で継続的に低いレベルで発現するＩｇＭと異なり、野生型マウスに他のＩｇＧサブ型が存在するため、野生型マウス中の抗原特異性総ＩｇＧの含有量は、ＭＤＧ１マウスより高く、また、ＭＤＧ１マウス中の抗原特異性ＩｇＡ及びＩｇＥの相対的な発現量は、野生型マウスよりやや高い。
実施例２６、抗原免疫後、脾臓の胚芽中心Ｂ細胞及び形質細胞の発育の検出
抗原免疫後の野生型マウス及びＭＤＧ１マウスを６匹ずつ取り、７０μｍのろ過網を６０ｍｍ皿に置き、１ｍＬのＡＣＫを加え、その脾臓を取ってろ過網上に置いて軽くすり、すりつぶした後の細胞懸濁液を収集して、短時間遠心分離した後、上清を捨て、１ｍＬのＦＡＣＳを加えて細胞を再懸濁させ、それから２０μＬの細胞を取って染色に使用し、１０μＬの細胞を取って８０倍希釈してカウントし、免疫後の脾臓Ｂ細胞の染色プロトコルは、表２１に示すとおりである。
Figure 2023539785000024
抗原免疫後のマウスの脾臓Ｂ細胞、胚芽中心Ｂ細胞及び形質細胞の発育状況は、図３４に示すとおりであり、図３４結果は、次のことを示す。即ち、ＭＤＧ１マウスは野生型マウスと比較して、免疫後の脾臓Ｂ細胞の比率が有意に低いが、数の統計学的差が見られなかった。ＭＤＧ１マウスは野生型マウスと比較して、胚芽中心Ｂ細胞の比率及び数は両方とも有意に低く、ＩｇＧ２ｃ＋ＧＣ Ｂの比率が有意に高く、数の統計学的差が見られなかった。抗原免疫後のＭＤＧ１マウス及び野生型マウスにおいて、形質細胞及びＩｇＧ２ｃ＋形質細胞の比率及び数は、両方とも統計学的差が見られなかった。
最後に説明すべきことは、以上の実施例は、本願の技術案を説明するために使用されるだけで、それを制限するものではない。前述の実施例を参照して、本願を詳細に説明したが、当業者であれば、前述の各実施例に記載の技術案を修正するか、又はそのうちの一部の技術的特徴を同等置換することができ、これらの修正や置換により、該当する技術案の本質が本願の実施例技術案の精神及び範囲から逸脱することはないことを理解すべきである。
本願の非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法を用いて取得した非ヒト哺乳動物又はその子孫は、いずれの抗体重鎖可変領域及び定常領域をコードする外来遺伝子を導入せず、それ自体のゲノム中の抗体重鎖可変領域をコードするすべてのＶＤＪ遺伝子を直接利用することにより、重鎖可変領域の再配列により多様性がよりよい重鎖抗体を生成することができる。

Claims (43)

  1. 非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインが発現されないか又は正確に発現されないようにするステップと、
    非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１つ、２つ、３つ、４つ又は４つ以上の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップと、を含む、
    ことを特徴とする非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法。
  2. 非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインが発現されないか又は正確に発現されないようにするステップは、
    非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインのみが発現されないか又は正確に発現されないようにするステップ、又は、
    非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＭ重鎖定常領域及びＩｇＤ重鎖定常領域が発現されないか又は正確に発現されないようにするステップである、
    ことを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
  3. 非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１つ、２つ、３つ、４つ又は４つ以上の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップは、
    非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
    非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を発現しないか又は正確に発現しないようにし、且つ、非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目又は３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ、２つ又は３つが、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
    非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目及び２個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を発現しないか又は正確に発現しないようにし、且つ、非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ又は２つが、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
    非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目、２個目及び３個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を発現しないか又は正確に発現しないようにし、且つ、非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
    非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を正確に発現するようにし、且つ、非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目又は３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ、２つ又は３つが、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
    非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目及び２個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を正確に発現するようにし、且つ、非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目又は４個目の遺伝子のうちの１つ又は２つが、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップ、又は、
    非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目、２個目及び３個目の遺伝子が、発現される際に、それによりコードされたＩｇＧ重鎖定常領域を正確に発現するようにし、且つ、非ヒト哺乳動物の体内でＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子が、発現される際に、ＣＨ１ドメインを発現しないか又は正確に発現しないようにするステップである、
    ことを特徴とする請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列をノックアウトするステップと、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１つ、２つ、３つ、４つ又は４つ以上の遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む目標遺伝子をノックアウトするステップと、を含む、
    ことを特徴とする非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法。
  5. 非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列をノックアウトするステップは、
    非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のみをノックアウトするステップ、又は、
    非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域及びＩｇＤ重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列をノックアウトするステップである、
    ことを特徴とする請求項４に記載の製造方法。
  6. 前記目標遺伝子は、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列、又は、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする最後の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列、又は、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列、又は、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子からＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列のすべてのヌクレオチド配列、又は、
    ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列である、
    ことを特徴とする請求項４又は５に記載の製造方法。
  7. 非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列をノックアウトするステップと、
    目標遺伝子をノックアウトするステップと、を同じ操作ステップで完了するか、又は異なる操作ステップで完了する、
    ことを特徴とする請求項４～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 前記非ヒト哺乳動物は齧歯類動物であり、選択可能に、前記齧歯類動物はラット又はマウスであり、さらに選択可能に、前記齧歯類動物はマウスであり、より一層、前記マウスはＣ５７ＢＬ／６マウス又はＢＡＬＢ／ｃマウスである、
    ことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子はＩｇｈｇ３である、
    ことを特徴とする請求項３、６、７又は８に記載の製造方法。
  10. 非ヒト哺乳動物がＣ５７ＢＬ／６マウスである場合、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子はＩｇｈｇ３であり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子はＩｇｈｇ１であり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子はＩｇｈｇ２ｂであり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子はＩｇｈｇ２ｃであり、
    非ヒト哺乳動物がＢＡＬＢ／ｃマウスである場合、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする１個目の遺伝子はＩｇｈｇ３であり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする２個目の遺伝子はＩｇｈｇ１であり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする３個目の遺伝子はＩｇｈｇ２ｂであり、ＩｇＧ重鎖定常領域をコードする４個目の遺伝子はＩｇｈｇ２ａである、
    ことを特徴とする請求項３、６、７、８又は９に記載の製造方法。
  11. 前記非ヒト哺乳動物のゲノムにはκ軽鎖及び／又はλ軽鎖をコードする完全な遺伝子を含み、選択可能に、前記非ヒト哺乳動物でκ軽鎖及び／又はλ軽鎖を正常に発現することができる、
    ことを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 遺伝子をノックアウトする方法には、遺伝子ターゲティング技術、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ法、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ法のうちの１つ又は複数が含まれる、
    ことを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  13. 前記非ヒト哺乳動物又はその子孫は、重鎖抗体の生産に使用される、
    ことを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫の製造方法であって、
    Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムのうち、抗体ＩｇＭ重鎖定常領域及びＩｇＤ重鎖定常領域をコードする遺伝子をノックアウトするステップと、
    Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムのうち、ＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子からＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列をノックアウトするステップと、を含む、
    ことを特徴とするＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫の製造方法。
  15. 前記Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムには、κ軽鎖及び／又はλ軽鎖をコードする完全な遺伝子を含み、選択可能に、前記Ｃ５７ＢＬ／６マウスがκ軽鎖及び／又はλ軽鎖を正常に発現することができる、
    ことを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
  16. 遺伝子をノックアウトする方法には、遺伝子ターゲティング技術、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ法、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ法のうちの１つ又は複数が含まれる、
    ことを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
  17. 遺伝子をノックアウトするステップにおいて、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソンからＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソンまでのすべてのヌクレオチド配列をノックアウトする、
    ことを特徴とする請求項１４に記載の製造方法。
  18. 遺伝子をノックアウトするステップにおいて、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡ、及び、マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡを使用し、
    選択可能に、ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流の標的配列は配列番号１及び配列番号２を含み、及び／又は、ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流の標的配列は配列番号３及び配列番号４を含む、
    ことを特徴とする請求項１７に記載の製造方法。
  19. マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号９及び配列番号１０であり、及び／又は、マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡは配列番号１１、配列番号１２である、
    ことを特徴とする請求項１８に記載の製造方法。
  20. 前記Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫は、重鎖ＩｇＧ２ｃ抗体の生産に使用される、
    ことを特徴とする請求項１４～１９のいずれか１項に記載の製造方法。
  21. Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫の製造方法であって、
    Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムのうち、ＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列をノックアウトするステップと、
    Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムのうち、ＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子からＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子までの遺伝子上の、ＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列をノックアウトするステップと、を含む、
    ことを特徴とするＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫の製造方法。
  22. 前記Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムには、κ軽鎖及び／又はλ軽鎖をコードする完全な遺伝子を含み、選択可能に、前記Ｃ５７ＢＬ／６マウスがκ軽鎖及び／又はλ軽鎖を正常に発現することができる、
    ことを特徴とする請求項２１に記載の製造方法。
  23. 遺伝子をノックアウトする方法には、遺伝子ターゲティング技術、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ法、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ法のうちの１つ又は複数が含まれる、
    ことを特徴とする請求項２２に記載の製造方法。
  24. 遺伝子をノックアウトするステップにおいて、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソンをノックアウトし、さらに、マウスの、ＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソンからＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソンまでのすべてのヌクレオチド配列をノックアウトする、
    ことを特徴とする請求項２１に記載の製造方法。
  25. 遺伝子をノックアウトするステップにおいて、マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流及び下流を標的とするｓｇＲＮＡを使用し、さらに、マウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡ、及び、マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡを使用する、
    ことを特徴とする請求項２４に記載の製造方法。
  26. ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流の標的配列は配列番号１及び配列番号２を含み、及び／又は、
    ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流の標的配列は配列番号５及び配列番号６を含み、及び／又は、
    ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流の標的配列は配列番号７及び配列番号８を含み、及び／又は、
    ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流の標的配列は配列番号３及び配列番号４を含む、
    ことを特徴とする請求項２５に記載の製造方法。
  27. マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号９及び配列番号１０であり、及び／又は、
    マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１３及び配列番号１４であり、及び／又は、
    マウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１５及び配列番号１６であり、及び／又は、
    マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１１及び配列番号１２である、
    ことを特徴とする請求項２６に記載の製造方法。
  28. 前記Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫は、重鎖ＩｇＧ２ｃ抗体の生産に使用される、
    ことを特徴とする請求項２０～２７のいずれか１項に記載の製造方法。
  29. 非ヒト哺乳動物のゲノム上の、ＩｇＭ重鎖定常領域のＣＨ１ドメインをコードするヌクレオチド配列をノックアウトするステップを含む、
    ことを特徴とする非ヒト哺乳動物又はその子孫の製造方法。
  30. 前記非ヒト哺乳動物は齧歯類動物であり、選択可能に、前記齧歯類動物はラット又はマウスであり、さらに選択可能に、前記齧歯類動物はマウスであり、より一層、前記マウスはＣ５７ＢＬ／６マウス又はＢＡＬＢ／ｃマウスである、
    ことを特徴とする請求項２９に記載の製造方法。
  31. 前記非ヒト哺乳動物又はその子孫は、請求項２１に記載の非ヒト哺乳動物又はその子孫を構築するために用いられる、
    ことを特徴とする請求項２９又は３０に記載の製造方法。
  32. 請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫、請求項４～１３のいずれか１項に記載の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫、請求項２１～２８のいずれか１項に記載の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫の、目標重鎖抗体のスクリーニングにおける使用。
  33. 目標重鎖抗体のスクリーニングの際に、ファージディスプレイ法を採用し、
    好ましくは、前記目標重鎖抗体のスクリーニングは、Ｃ反応性タンパク質、コロナウイルスＳタンパク質又はコロナウイルスＮタンパク質抗原特異性ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体をスクリーニングすることである、
    ことを特徴とする請求項３２に記載の使用。
  34. 請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫、請求項４～１３のいずれか１項に記載の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫、請求項２１～２８のいずれか１項に記載の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫を免疫動物として使用してスクリーニングすることを含む、目標重鎖抗体のスクリーニングの方法。
  35. 目標重鎖抗体のスクリーニングの際に、ファージディスプレイ法を採用し、
    好ましくは、前記目標重鎖抗体のスクリーニングは、Ｃ反応性タンパク質、コロナウイルスＳタンパク質又はコロナウイルスＮタンパク質抗原特異性ＩｇＧ２ｃ重鎖抗体をスクリーニングすることである、
    ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
  36. 請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来するか、請求項４～１３のいずれか１項に記載の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来するか、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫に由来するか、請求項２１～２８のいずれか１項に記載の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫に由来するか、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来する、
    ことを特徴とする非ヒト哺乳動物細胞又は細胞株又は初代細胞培養物。
  37. 請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来するか、請求項４～１３のいずれか１項に記載の製造方法で構築した非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来するか、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫に由来するか、請求項２１～２８のいずれか１項に記載の製造方法で構築したＣ５７ＢＬ／６マウス又はその子孫に由来するか、又は請求項２９～３１のいずれか１項に記載の製造方法での構築由来の非ヒト哺乳動物又はその子孫に由来する、
    ことを特徴とする摘出組織又は摘出器官又はその培養物。
  38. マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡ、及び、マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡ、又は、
    マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流及び下流を標的とするｓｇＲＮＡ、又は、
    マウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡ、及び、マウスのＩｇＧ２ｃをコードする１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡ、を含む、
    ことを特徴とするｓｇＲＮＡ組成物。
  39. ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流の標的配列は配列番号１及び配列番号２を含み、及び／又は、
    ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流の標的配列は配列番号３及び配列番号４を含み、及び／又は、
    ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流の標的配列は配列番号５及び配列番号６を含み、及び／又は、
    ｓｇＲＮＡが標的とするマウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流の標的配列は配列番号７及び配列番号８を含む、
    ことを特徴とする請求項３８に記載のｓｇＲＮＡ組成物。
  40. マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号９及び配列番号１０であり、及び／又は、
    マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１３及び配列番号１４であり、及び／又は、
    マウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１５及び配列番号１６であり、及び／又は、
    マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするｓｇＲＮＡは、配列番号１１及び配列番号１２である、
    ことを特徴とする請求項３８に記載のｓｇＲＮＡ組成物。
  41. ｓｇＲＮＡをコードする１セグメント以上のＤＮＡ配列を含み、前記ｓｇＲＮＡの標的配列は、
    マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするもの、又は、
    マウスのＩｇＧ２ｃ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするもの、又は、
    マウスのＩｇＭ重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン下流を標的とするもの、又は、
    マウスのＩｇＧ３重鎖定常領域をコードする遺伝子の１番目のエクソン上流を標的とするものから選択される１つである、
    ことを特徴とするノックアウトベクター。
  42. 骨格がｓｇＲＮＡ発現ベクターである、
    ことを特徴とする請求項４１に記載のノックアウトベクター。
  43. 請求項４１～４２のいずれか１項に記載のノックアウトベクターを含む、
    ことを特徴とする細胞。
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