JP2023530336A

JP2023530336A - β－ヒドロキシ－β－メチルブチレート（ＨＭＢ）および化学療法剤の組成物および使用法

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Publication number: JP2023530336A
Application number: JP2022577392A
Authority: JP
Inventors: ボッテガ・フェリペ，カリナ; ゴレティ・エッカート・ドレハー，ラクエル; クリ・ペドロサ，ロナジェラ; ピッチフォード，リサ
Original assignee: メタボリック・テクノロジーズ，エルエルシー
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2021-06-15
Publication date: 2023-07-14
Also published as: US20230263751A1; KR20230130600A; WO2021257562A1; AU2021292490A1; CN116685315A; CA3182874A1; EP4164623A1; MX2022016000A

Abstract

本発明は、化学療法治療を受けているかまたは化学療法剤を投与されている哺乳動物に、ＨＭＢを投与して、腫瘍増殖を阻害し、動物生存を増加させ、化学療法誘導性体重減少に対して防御し、化学療法誘導性炎症に対して防御し、そして／または抗悪液質治療を提供する方法を提供する。【選択図】図１

Description

本出願は、２０２０年６月１５日出願の米国仮特許出願第６３／０３８，９８９号の恩典を請求し、そして米国仮特許出願第６３／０３８，９８９号を本明細書に援用する。

１．分野
本発明は、腫瘍増殖を阻害し、動物生存を増加させ、化学療法誘導性体重減少に対して防御し、化学療法誘導性炎症に対して防御し、そして／または抗悪液質（ａｎｔｉ－ｃａｃｈｅｘｉａ）治療を提供するためのβ－ヒドロキシ－β－メチルブチレート（ＨＭＢ）および化学療法剤の組成物および使用法に関する。

２．背景
慢性炎症は、いくつかのタイプの癌で起こり、そしてこのプロセスは腫瘍進行に関連する。新生物細胞は、サイトカインおよびケモカインを合成して、これらがマクロファージおよび他の炎症性細胞を誘引し、これが腫瘍微小環境を構成する；これらの細胞は、腫瘍増殖、転移および血管新生に寄与する、細胞傷害仲介因子（ＲＯＳ、ＴＮＦα、インターロイキン類およびインターフェロン類）を産生する［１、２］。

腫瘍増殖と関連する炎症状態はまた、タンパク質異化の増加および悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）発展のリスクにも寄与する［３］。悪液質の病理生理学的および生化学的機構は複雑であり、脂質およびタンパク質可動化、腫瘍の存在に対する宿主反応としての慢性炎症状態、ならびにエネルギー代謝の変化を増加させる要因を伴う［４、５］。この背景において、炎症促進性サイトカイン、例えばＩＬ－１およびＩＬ－６の合成は、これらがターゲット組織に直接作用し、骨格筋および脂肪組織の枯渇を促進することを考慮すると、悪液質の増悪に寄与する。さらに、これらは中枢神経系と相互作用し、食品摂取およびエネルギー代謝に干渉する［６］。

さらなる研究はまた、化学療法が悪液質の発展に寄与しうることも示唆する［７］。第一選択化学療法剤としてのドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）は、骨格筋および心筋の減少を引き起こし、そしてｐ５３－ｐ２１－ＲＥＤＤ１（発生およびＤＮＡ損傷反応において制御されるタンパク質１）経路の活性化に関連付けられた。ドキソルビシンはまた、タンパク質合成を減少させ、そしてタンパク質分解およびアポトーシスシグナル伝達を活性化し、そしてまた脂肪生成、ＰＵＦＡ（多価不飽和脂肪酸）生合成および脂肪酸取り込みに関連する遺伝子の発現を抑制しうる［８、９］。これらの知見、ならびにドキソルビシンおよびシクロホスファミドで治療され、化学療法の開始時および終了時を比較すると栄養障害の診断増加があった（それぞれ、１５および３８％）乳癌女性の臨床試験の結果［１０］を考慮すると、Ｄｏｘｏは悪液質を誘導しうると考えられる。

悪液質は、予後悪化、入院長期化および患者死亡率の増加に関連する［１１、１２］。この意味で、α－ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）経路によって細胞質においてｉｎｖｉｖｏで産生されるロイシン代謝産物であるＨＭＢは、ｍＴＯＲ／ｐ７０Ｓ６ｋ経路を通じてタンパク質合成を刺激するため、栄養障害においていくつかの研究の対象となってきている［１３］。ＨＭＢがアスリートにおいて筋肉量増加を促進可能であるとともに、寝たきりの高齢者において抗異化効果を発揮することが可能であることもまた見出されてきている［１４］。ロイシン代謝の唯一の産物は、ケトイソカプロエート（ＫＩＣ）である。ＫＩＣ代謝の少量の産物は、β－ヒドロキシ－β－メチルブチレート（ＨＭＢ）である。ＨＭＢは多様な適用の背景内で有用であることが見出されてきている。特に、米国特許第５，３６０，６１３号（Ｎｉｓｓｅｎ）において、ＨＭＢは総コレステロールおよび低密度リポタンパク質コレステロールの血中レベルを減少させるために有用であると記載される。米国特許第５，３４８，９７９号（Ｎｉｓｓｅｎら）において、ＨＭＢは、ヒトにおいて窒素保持を促進するために有用と記載される。米国特許第５，０２８，４４０号（Ｎｉｓｓｅｎ）は、動物における除脂肪組織発展を増加させる際のＨＭＢの有用性を論じる。また、米国特許第４，９９２，４７０号（Ｎｉｓｓｅｎ）において、ＨＭＢは、哺乳動物の免疫反応を増進させる際に有効であると記載される。米国特許第６，０３１，０００号（Ｎｉｓｓｅｎら）は、疾患関連消耗を治療するためのＨＭＢおよび少なくとも１つのアミノ酸の使用を記載する。

何人かの研究者らは、腫瘍生物学における改変に対するＨＭＢの特徴的な効果を記載してきている。Ｓｍｉｔｈら［１５］は、体重減少に対する用量依存性効果を有することに加え、ＨＭＢはまた、腫瘍増殖速度の有意な減少も導くことを示した。Ｃａｐｅｒｕｔｏら［１６］は、皮下腫瘍を移植されたラットにおける生存時間の増進、および腹腔内に腫瘍が注入された場合、４２％の生存改善を示した。ＨＭＢはまた、腫瘍増殖速度［１７］、腫瘍重量を減少させ、そしてラットにおいて、アポトーシスを増進させることにより腫瘍細胞増殖速度を減少させた［１８］。

近年、ＨＭＢの抗炎症効果もまた、放射線照射に供された動物モデル、および放射線療法を受けている頭頸部癌患者において、論じられてきている［１９、２０］。

本発明は、化学療法治療を受けている哺乳動物にＨＭＢを投与して、腫瘍増殖を阻害し、動物生存を増加させ、化学療法誘導性体重減少に対して防御し、化学療法誘導性炎症に対して防御し、そして／または抗悪液質治療を提供する方法を提供する。

発明の概要
本発明の１つの目的は、化学療法剤およびＨＭＢの併用治療を提供して、腫瘍増殖を阻害することである。

本発明の別の目的は、化学療法剤およびＨＭＢの併用治療を提供して、動物生存を増加させることである。

本発明のさらなる目的は、化学療法剤およびＨＭＢの併用治療を提供して、化学療法誘導性体重減少に対して防御することである。

本発明のさらなる目的は、化学療法誘導性炎症に対して防御することである。

本発明の別の目的は、抗悪液質活性のため、化学療法治療を受けている哺乳動物にＨＭＢを提供することである。

課題を解決するための手段
本発明は、これまでに遭遇した困難を克服することを意図する。この目的に向けて、化学療法措置と併用して（ｉｎａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈ）投与されるＨＭＢを含む組成物を提供する。該組成物は、その必要がある被験体に投与される。すべての方法は、化学療法と併用して、動物にＨＭＢを投与する工程を含む。本発明に含まれる被験体には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物が含まれる。組成物は、その必要がある被験体によって消費される。

図１（Ａ）は腫瘍増殖阻害（％）を示す。図１（Ｂ）はマウスの生存を示す。図２は、ＥＡＣ細胞において誘導される細胞死のタイプおよび細胞死に関連するタンパク質の発現を示す。図３は、マウスの体組成評価を示す。図４は、マウスの筋肉および全身炎症パラメータを示す。

驚くべきことに、そして予期せぬことに、化学療法プロトコルと組み合わせたＨＭＢの投与は、腫瘍増殖阻害および動物生存増加を生じることが発見されてきている。ＨＭＢは、化学療法誘導性体重減少および炎症に対して防御性である。防御効果は、化学療法剤の抗腫瘍作用に干渉しない。

ＨＭＢ
β－ヒドロキシ－β－メチル酪酸、またはβ－ヒドロキシ－イソ吉草酸は、（ＣＨ_３）_２（ＯＨ）ＣＣＨ_２ＣＯＯＨとして、その遊離酸型で示されてもよい。用語「ＨＭＢ」は、遊離酸および塩型の両方の前述の化学式を有する化合物、ならびにその誘導体を指す。本発明の背景内で、任意の型のＨＭＢを用いてもよい一方、好ましくは、ＨＭＢは、遊離酸、塩、エステル、およびラクトンを含む群より選択される。ＨＭＢエステルには、メチルおよびエチルエステルが含まれる。ＨＭＢラクトンには、イソバレリルラクトンが含まれる。ＨＭＢ塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、クロム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アルカリ金属塩、および土類金属塩が含まれる。

ＨＭＢおよびその誘導体を産生するための方法は、当該技術分野に周知である。例えば、ＨＭＢは、ジアセトンアルコールの酸化によって合成されてもよい。１つの適切な方法は、Ｃｏｆｆｍａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８０：２８８２－２８８７（１９５８）によって記載される。該文献に記載されるように、ＨＭＢは、ジアセトンアルコールのアルカリ性次亜塩素酸ナトリウム酸化によって合成される。産物を遊離酸型で回収し、これを塩に変換してもよい。例えば、ＨＭＢはＣｏｆｆｍａｎら（１９５８）のものと類似の方法によって、カルシウム塩として調製されてもよく、ここで、ＨＭＢの遊離酸を水酸化カルシウムで中和し、そして水性エタノール溶液からの結晶化によって回収する。ＨＭＢのカルシウム塩は、ＭｅｔａｂｏｌｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、アイオワ州エイムスより商業的に入手可能である。

カルシウムβ－ヒドロキシ－β－メチルブチレート（ＨＭＢ）補充
２０年以上前、ＨＭＢのカルシウム塩は、ヒト用の栄養補助剤として開発された。研究によって、平均的なヒトには、体重キログラムあたり、３８ｍｇのＣａＨＭＢが有効投薬量であるようであることが示されてきている。

ＨＭＢがタンパク質分解を減少させ、そしてタンパク質合成を増加させる分子機構が、報告されてきている。Ｅｌｅｙらはｉｎｖｉｔｒｏ研究を行い、ＨＭＢが、ｍＴＯＲリン酸化を通じて、タンパク質合成を刺激することを示した。他の研究は、筋肉タンパク質異化がタンパク質分解誘導因子（ＰＩＦ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、およびアンギオテンシンＩＩによって刺激された際、ユビキチン－プロテオソームタンパク質分解経路の誘導の減弱を通じて、ＨＭＢが、タンパク質分解を減少させることを示してきている。さらに他の研究は、ＨＭＢがまた、カスパーゼ－３および－８プロテアーゼの活性化を減弱させることも立証してきている。

ＨＭＢ遊離酸型
大部分の場合、臨床研究で利用され、そしてエルゴジェニック補助として市販されるＨＭＢは、カルシウム塩型であった。近年の進歩により、栄養補助剤としての使用のため、ＨＭＢが遊離酸型で製造されることが可能になってきている。ＨＭＢの遊離酸型が開発されており、これはＣａＨＭＢより、より迅速に吸収され、より迅速でそしてより高いピーク血清ＨＭＢレベル、ならびに改善された組織への血清クリアランスを生じることが示された。

したがって、ＨＭＢ遊離酸は、特に激しい運動直前に投与される際には、カルシウム塩型よりもより有効なＨＭＢ投与法でありうる。しかし、一般の当業者は、本発明が任意の型のＨＭＢを含むことを認識するであろう。

約０．５グラムＨＭＢ～約３０グラムＨＭＢの典型的な投薬範囲を生じるような方式で、任意の型のＨＭＢを送達および／または投与型に取り込んでもよい。

ＨＭＢの任意の適切な用量を、本発明の背景内で用いてもよい。適切な用量を計算する方法は、当該技術分野に周知である。適切な用量を計算する方法は、当該技術分野に周知である。ＨＭＢの投薬量は、Ｃａ－ＨＭＢの対応するモル量に関して表されてもよい。ＨＭＢが経口でまたは静脈内に投与されてもよい投薬範囲は、２４時間あたり、体重キログラムあたり、０．０１～０．２グラムＨＭＢ（Ｃａ－ＨＭＢ）の範囲内である。成人に関しては、約１００～２００ポンドの体重と仮定して、ＨＭＢの経口または静脈内投薬量（Ｃａ－ＨＭＢ基準）は、２４時間あたり、被験体あたり、０．５～３０グラムの範囲であってもよい。

一般の当業者には、ＨＭＢおよび化学療法剤（単数または複数）は、請求される方法を実行するために、同じ組成中でまたは同時に投与される必要はないことが理解されるであろう。

用語、投与するまたは投与には、組成物を哺乳動物に提供すること、組成物を消費することおよびその組み合わせが含まれる。

以下の実施例は、本発明をさらに詳細に例示する。本明細書の実施例に一般的に記載され、そして例示されるような、本発明の組成物は、多様な配合物および投薬型で合成されてもよいことが容易に理解されるであろう。したがって、本発明の方法、配合物および組成物の現在好ましい態様の以下のより詳細な説明は、請求されるような本発明の範囲を限定することを意図されず、単に、本発明の現在好ましい態様の代表である。

材料および方法
動物および実験設計
サンタ・カタリナ連邦大学（ブラジル）のセクター別の生物飼育場（ｂｉｏｔｅｒｉｕｍ）で行われた管理された生殖から得た、メス（１８～２３ｇ体重、６０日齢）Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）を、管理された環境条件（１２時間明暗サイクル、２５±２℃、相対湿度６０％）下、プラスチックケージ中で維持し、市販の餌および水を自由に与えた。

マウスを５群（ｎ＝６）：正常（健康な動物）、対照（生理食塩水）、Ｄｏｘｏ（１ｍｇ／ｋｇ／日）、ＨＭＢ（６１７．３ｍｇカルシウムＨＭＢ／ｋｇ／日）およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ（それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ／日および６１７．３ｍｇ／ｋｇ／日）に分けた。対照、Ｄｏｘｏ、ＨＭＢおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ群に属する動物に、腹腔内注射によって、ＥＡＣ細胞（２００μＬ、５ｘ１０^６細胞）を接種し、そして９６時間後に動物の処置を開始した。ＨＭＢの用量は、７０ｋｇの成人男性に関する推奨に基づいて定義され、すなわち３ｇ／日（補助剤型（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙｆｏｒｍ））であった［２１］。

法的要件（ＮＩＨ刊行物＃８０－２３、１９８５年改訂）および動物使用のための地域倫理委員会（認可プロトコルＣＥＵＡ／ＵＦＳＣＰＰＯＯ７８４）にしたがって飼育され、そして処置を受けた同質遺伝子Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、動物研究を行った。

抗腫瘍効果の評価
腫瘍増殖阻害および生存評価
腫瘍を接種する直前、腹囲を測定した。９日連続で治療を腹腔内投与した。最後の処置の２４時間後、すべてのマウスの体重を測定し、そして再び、それらの腹囲を測定した。腫瘍増殖の阻害（％）を以下のように計算した［２２］：［（処置群の胴囲の平均ｘ１００）／対照群の胴囲の平均］－１００。

さらに、麻酔後、すべての腹水を収集して、体積および重量を測定した。最後に、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝１２）をランダムに選択し、そしてＫａｐｌａｎおよびＭｅｉｅｒ（１９５８）［２３］にしたがって生存時間に対するＨＭＢ、ＤｏｘｏおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢの効果を評価するため、生存したまま維持した；３０日後に生存評価を打ち切った。

死のタイプの評価
採取した腫瘍細胞（５ｘ１０^６）を、ヨウ化プロピジウム（１００μｇ／ｍＬ）およびアクリジンオレンジ（１００μｇ／ｍＬ）の溶液（１：１）１μＬで染色した。緑色（４６０ｎｍで励起および５２０ｎｍで発光）および赤色（４９２ｎｍで励起および６２０ｎｍで発光）フィルター上、蛍光顕微鏡によって試料を読み取り、そして結果を生存（緑色）、アポトーシス（オレンジ）および壊死（赤色）細胞の割合として表した［２４］。

ウェスタンブロッティング
アポトーシスマーカーをウェスタンブロッティングによって評価した。ＥＡＣ細胞をＰＢＳで洗浄し、そして１％プロテアーゼおよび３％ホスファターゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液中でタンパク質をさらに変性し、そして等量をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動に供した後、ＰＶＤＦ膜上でエレクトロブロッティングした。膜をブロッキングし、そして次いで、一次モノクローナル抗体：ｐ５３（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＤＯ－１；ｓｃ－１２６）、Ｂａｘ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂ－９；ｓｃ－７４８０）およびＢｃＬ－ｘｌ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈ－５；ｓｃ－８３９２）とインキュベーションし、そして続いて、ペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体（ＤａｋｏａｎｄＣｈｅｍｉｃｏｎ）とインキュベーションした。化学発光決定キットを用いて免疫検出を行い、そしてβ－アクチンを装填対照として用いた。ＣｈｅｍｉＤｏｃＭＰ（ＢｉｏＲａｄ）システムで画像を得た［２５］。

悪液質評価
平均一日食物摂取を決定するため、消費された食餌の重量を各ケージ中の動物の数で割った［２６］。体重減少パーセントを評価するため、標準化等式にしたがって、「初期体重」（ＥＡＣの接種前）、「最終体重」（処置の９日後）および「死体体重」（最終体重－腹水重量）を考慮した［２７］。

ヒラメ筋および腓腹筋を迅速に取り除き、そして分析天秤上で重量測定した（湿質量）。ヒラメ筋試料を用いて、６０℃で３日後、乾燥重量を決定し、そして腓腹筋をサイトカインの決定のため－８０℃で維持した。腓腹筋およびヒラメ筋の湿質量（ｍｇ）を、マウスの脛骨の長さ（ｍｍ）によって標準化した［２８］。皮下脂肪沈着、腸間膜および褐色脂肪組織もまた取り除き、そして直ちに重量測定した。

炎症プロファイルの評価
ＥＡＣ細胞におけるＣＯＸ－２発現を項目２．２．３に記載されるようにウェスタンブロッティングによって評価した。ＣＯＸ－２に対する抗体をＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ（＃４８４２）から購入した。

サイトカインの決定のため、腓腹筋を、１％プロテアーゼおよび３％ホスファターゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡ緩衝液中、１ｍｇ組織：１０μｌ緩衝液の比率でホモジナイズし、その後、ホモジネートを１２，０００ｇおよび４℃で１０分間遠心分離した。上清のアリコットを用いて、製造者の推奨にしたがい、ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）キット（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ、米国）を用いて、ＥＬＩＳＡイムノアッセイによって、サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－６を決定した。

血清中のＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の決定を、製造者の指示にしたがってＵｌｔｒａＴｕｒｂｉｑｕｅｓｔＰｌｕｓ（登録商標）ＣＲＰキットによって行った。

統計分析
Ｔｕｋｅｙ事後検定を伴う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用い、ｐ＜０．０５の最小有意レベルを仮定して、Ｐｒｉｓｍ５ｆｏｒＷｉｎｄｏｗｓ、バージョン５．００を用いて、統計分析を行った。

結果
ＨＭＢと併用するドキソルビシンの抗腫瘍効果の特徴づけ
すべての処置は、体重の変動（腫瘍接種前および安楽死の日の体重の間の相違）および腹水体積の有意な減少を促進した。Ｄｏｘｏでの処置は、対照群に比較して、体重変動を３９％、そして腹水体積を５４％減少させた。Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢでの処置は、同じパラメータを、それぞれ、４３％および３７％減少させた（表１）。これらの結果は、ＥＡＣにおける併用Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢの抗腫瘍潜在能力を強調する。ＤｏｘｏおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ群間では統計的相違はなかった。

表１．健康な（正常）Ｂａｌｂ／ｃマウス、ならびに生理食塩水（対照）、Ｄｏｘｏ（１ｍｇ／ｋｇ／日）、ＨＭＢ（６１７．３ｍｇ／ｋｇ／日）、およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ（それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ／日および６１７．３ｍｇ／ｋｇ／日）で９日間処置した、ＥＡＣを有するマウスの形態学的評価。結果を平均±標準偏差として表す。ｎ＝６、陰性対照（α）およびＤｏｘｏ（β）に比較して、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

ＤｏｘｏおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢでの処置は、対照群に比較して、それぞれ、４２％および３９％、腫瘍増殖を阻害可能であったが、これらの間に統計的な相違はなく、ＨＭＢがＤｏｘｏの抗腫瘍効果に干渉しないことが立証された（図１Ａ）。図１は、健康なＢａｌｂ／ｃマウス、ならびに生理食塩水（対照）、Ｄｏｘｏ（１ｍｇ／ｋｇ／日）、ＨＭＢ（６１７．３ｍｇ／ｋｇ／日）、およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ（それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ／日および６１７．３ｍｇ／ｋｇ／日）で９日間処置した、ＥＡＣを有するマウスの（Ａ）腫瘍増殖の阻害（％）および（Ｂ）生存を示す。結果を平均±標準偏差として表す。ｎ＝６（Ａ）およびｎ＝１２（Ｂ）、陰性対照（α）に比較して、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

動物平均生存時間は、１６日（対照）、１３．５日（ＨＭＢ）および２６日（ＤｏｘｏおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ）であった（図１Ｂ）。この実験モデルにおいて、ＤｏｘｏおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢでの処置は、対照群に比較して、動物生存を増加させることが可能であったが、観察期間の終了時、Ｄｏｘｏ群では３匹の生存動物、そしてＤｏｘｏ＋ＨＭＢでは５匹の動物がいた。

３．２併用Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢは、アポトーシスによる細胞死を誘導する
図２は、ＥＡＣ細胞において誘導される細胞死のタイプ、および細胞死に関連するタンパク質の発現を示す。（Ａ）誘導される細胞死のタイプ、（Ｂ）ｐ５３、ＢａｘおよびＢｃｌ－ｘｌの発現、（Ｃ）ｐ５３／アクチンの発現、ならびに（Ｄ）Ｂａｘ／Ｂｃｌ－ｘｌ比。結果を平均±標準偏差として表す。ｎ＝６、対照（α）およびＤｏｘｏ（β）に比較して、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

Ｄｏｘｏは、生存細胞数を有意に減少させ（６０％）、壊死（３６％）およびアポトーシス細胞死（４％）を誘導した（図２Ａ）。一方、Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢでの処置は、有意な壊死を誘導せず（９％）、アポトーシス細胞の数を増加させる（３９％）ことによって、生存細胞数を同様に減少させた（５２％）。ＤｏｘｏおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢはどちらも、対照に比較して、Ｂａｘ／Ｂｃｌ－ｘＬ比を有意に増加させ（Ｄｏｘｏ３８％およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ６０％）、Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢおよびＤｏｘｏの間には有意な相違があった（図２Ｂおよび２Ｄ）。すべての処置は、対照群に比較して、ｐ５３の発現を同様に増加させた（Ｄｏｘｏ２０％、ＨＭＢ１０％およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ１９％；図２Ｂおよび２Ｃ）。壊死による細胞死が炎症プロセスに関連する一方、アポトーシスは炎症を誘導しないことに注目することが重要である。

３．３ドキソルビシンおよびＨＭＢでの同時処置は、腫瘍悪液質を調節する
図３は、健康なＢａｌｂ／ｃマウス、ならびに生理食塩水（対照）、Ｄｏｘｏ（１ｍｇ／ｋｇ／日）、ＨＭＢ（６１７．３ｍｇ／ｋｇ／日）、およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ（それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ／日および６１７．３ｍｇ／ｋｇ／日）で９日間処置した、ＥＡＣを有するマウスの体組成評価を示す。（Ａ）食物摂取（ｇ／日）および（Ｂ）体重減少（％）。結果を平均±標準偏差として表す。ｎ＝６（ＡおよびＢ）およびｎ＝１２（Ｃ）、対照（α）およびＤｏｘｏ（β）に比較して、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

群間の平均１日食物摂取（図３Ａ）は以下の通りであった：正常群に関しては３．３０±０．６０ｇ／日；対照群に関しては２．１７±０．６９ｇ／日；Ｄｏｘｏ群に関しては２．２２±０．６３ｇ／日；ＨＭＢ群に関しては２．８１±１．０５ｇ／日；およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ群に関しては３．３９±１．０６ｇ／日。ＤｏｘｏおよびＨＭＢ単独で処置した群の食物摂取は、対照群と有意には異ならなかった；が、Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢでの同時処置は、対照およびＤｏｘｏ群に比較して、食物摂取の増加を促進した。

ＥＡＣ細胞の接種は、有意な体重減少（１１％）を引き起こした。ＤｏｘｏおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢでの処置は、対照に比較して体重減少を減弱させた（それぞれ、５４％および７５％）。さらに、本発明者らは、ＤｏｘｏおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ群間の統計的相違を観察し、体重を保持することにおいて、Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢがＤｏｘｏ単独よりもより有効であることを示した（図３Ｂ）。

湿または乾燥ヒラメ筋の筋肉量に関して、群間での統計的な相違はなかった（表２）；が、ＥＡＣ細胞接種は、正常群に比較して、腓腹筋の湿筋肉量を３５％減少させた。ＤｏｘｏまたはＨＭＢはどちらも、単独では腓腹筋の筋肉量に影響を及ぼさなかったが、Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢの同時処置は、それぞれ、対照群およびＤｏｘｏ単独に比較して、筋肉量を４７％および２６％増加させた（表２）。

表２．Ｄｏｘｏ（１ｍｇ／ｋｇ／日）、ＨＭＢ（６１７．３ｍｇ／ｋｇ／日）、およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ（それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ／日および６１７．３ｍｇ／ｋｇ／日）で９日間処置した、ＥＡＣを有するＢａｌｂ／ｃマウスの体区画（腓腹筋およびヒラメ筋の湿重量および乾燥重量、皮下および腸間膜の脂肪ならびに褐色脂肪組織の重量）評価。結果を平均±標準偏差として表す。ｎ＝６、陰性対照（α）およびＤｏｘｏ（β）に比較して、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

健康な動物に比較して、ＥＡＣの接種は、それぞれ９４％および６６％の皮下および腸間膜脂肪沈着の枯渇を促進した。しかし、Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢは、対照およびＤｏｘｏ群に比較して、皮下脂肪沈着を増加させ、ＥＡＣおよび化学療法によって誘導される脂肪枯渇に対して防御した（表２）。Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢはまた、Ｄｏｘｏ群に比較して、腸間膜脂肪の増加も促進した。しかし、ＤｏｘｏまたはＨＭＢ単独での処置は、対照に比較して、皮下および腸間膜の脂肪を維持する際に有効ではなかった。

３．４ＨＭＢは、ＥＡＣおよび骨格筋の両方で、炎症経路を調節する
図４は、健康なＢａｌｂ／ｃマウス、ならびに生理食塩水（対照）、Ｄｏｘｏ（１ｍｇ／ｋｇ／日）、ＨＭＢ（６１７．３ｍｇ／ｋｇ／日）、およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ（それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ／日および６１７．３ｍｇ／ｋｇ／日）で９日間処置した、ＥＡＣを有するマウスにおける、筋肉および全身炎症パラメータを示す。（Ａ）ＥＡＣ細胞におけるＣＯＸ－２／アクチンの発現、（Ｂ）腓腹筋におけるＩＬ－１βの発現および（Ｃ）ＩＬ－６の発現、ならびに（Ｄ）血清Ｃ反応性タンパク質レベル（ｍｇ／Ｌ）。結果を平均±標準偏差として表す。ｎ＝６、陰性対照（α）およびＤｏｘｏ（β）に比較して、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

ＨＭＢおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ処置は、対照に比較した際、ＣＯＸ－２のＥＡＣ細胞発現を減少させた（それぞれ、４％および５５％）。Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢ処置はまた、Ｄｏｘｏ単独に比較して、ＣＯＸ－２の発現を５３％減少させた（図４Ａ）。

さらに、ＥＡＣ細胞の接種は、正常群に比較して、腓腹筋中のＩＬ－１βの発現を１０３％増加させることが観察された。ＤｏｘｏおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ処置は、このサイトカインの含量を、対照に比較して、それぞれ６％および４７％減少させた。最後に、併用Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢは、Ｄｏｘｏ単独に比較して、ＩＬ－１βの発現を４３％減少させた（図４Ｂ）。

ＥＡＣはまた、腓腹筋中のＩＬ－６の発現を、健康な動物に比較して１１６％増加させたが、このサイトカインは、Ｄｏｘｏ、ＨＭＢおよびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ処置において、それぞれ、４３％、６４％および５１％減少し、処置間に統計的相違はなかった（図４Ｃ）。

血清Ｃ反応性タンパク質レベルは、０．０７ｍｇ／Ｌ（正常）、１．６３ｍｇ／Ｌ（対照）、２．３９ｍｇ／Ｌ（Ｄｏｘｏ）、０．３１ｍｇ／Ｌ（ＨＭＢ）および０．２ｍｇ／Ｌ（Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢ）であった（図４Ｄ）。統計分析は、Ｄｏｘｏは対照群のものよりもＣ反応性タンパク質の血清レベルをさらに増加させる一方、ＨＭＢ単独およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢはどちらも、対照およびＤｏｘｏ群の両方に比較して、このパラメータを減少させることを示した。

考察
Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢの投与は、対照、ＤｏｘｏおよびＨＭＢ（単独）群に比較して、腫瘍増殖を阻害し、そして動物生存を増加させた。ＨＭＢはＤｏｘｏ誘導性体重減少および炎症に対して防御性であり、Ｄｏｘｏの抗腫瘍作用には干渉しなかった。

Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢの同時処置は、Ｄｏｘｏ化学療法によって誘導される細胞死のタイプを壊死からアポトーシスにシフトしたが、各処置によって誘導される死の割合は同様であったため、細胞死の総量は改変しなかった（Ｄｏｘｏ３６％およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢ３９％）。Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢの併用は、対照群およびＤｏｘｏ群に比較して、Ｂａｘ発現を増加させ、そしてＢｃｌ－ｘｌ発現を減少させて、Ｂａｘ／Ｂｃｌ－ｘｌ比を調節し、そして内在性アポトーシスを促進した。こうした併用の利点は、アポトーシスを誘導し、そして腫瘍微小環境における炎症の減少に寄与することである。

ＣＯＸ－２は、いくつかのタイプの癌において過剰発現され、突然変異、細胞増殖、化学耐性の誘導およびアポトーシスの減少（Ｂｃｌ－２ファミリーの抗アポトーシスタンパク質の発現増加および同じファミリーのアポトーシス促進性メンバーの発現減少に関連する）を支持することによって、より劣った予後に関連する。さらに、ＣＯＸ－２阻害は、いくつかの細胞株において、ｐ５３の調節に関連する［２９、３０］。

ＥＡＣ細胞において、Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢは、対照（５５％）およびＤｏｘｏ（５３％）に比較して、ＣＯＸ－２の発現を減少させた。ＨＭＢは、アラキドン酸経路を調節し、ＣＯＸ－２の減少を導き、そしてその結果、ｐ５３およびＢａｘ発現の増加、それと同時にＢｃｌ－ｘｌ発現の減少を導き、それによってアポトーシスの内在性経路を誘発した。Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢでの処置において、壊死による細胞死の強いプロセスがあり（図２Ａにおいて、顕微鏡検査が、視野あたり、はるかに少ない細胞数を示すことに注目されたい）、そしてしたがって、この細胞死プロセスが炎症反応をシグナル伝達するため、壊死した細胞はマクロファージによって除去されることから、検出可能な細胞はアポトーシスのもののみであった。

悪液質の診断に関するパラメータ（すなわち体重減少、食物摂取の改変および炎症パラメータの増加）を考慮すると、Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢの組み合わせは、対照およびＤｏｘｏ群に比較して、体重、腓腹筋の筋肉量および皮下脂肪量を保持することに有効であったことが見出された。併用Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢはまた、Ｄｏｘｏに比較して、腸間膜脂肪の沈着も保持し、そして動物の食物摂取を増加させた。食物摂取が、癌に関連する体重減少の重要な構成要素であり、これは特に、より低いタンパク質合成がまた、栄養のより低い利用可能性に関連するためであることは注目に値する［６］。

Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢ処置は、ＥＡＣを有する動物の血清および筋肉における炎症パラメータの調節と関連した。炎症促進性サイトカインは、腫瘍進行および悪液質の発展と関連する［３１、３２］。骨格筋におけるＩＬ－６の過剰発現は、卵巣癌患者で同定されてきており、この場合、ＩＬ－６は、タンパク質の半減期を減少させ、そして２６Ｓプロテオソームの活性を増加させることによって、筋委縮に寄与する［３３、３４］。近年の研究によって、ＨＭＢが食道癌細胞株において、ＩＬ－６の発現を減少させることが見出された［３５］。本研究において、Ｄｏｘｏ単独、ＨＭＢ単独、およびＤｏｘｏ＋ＨＭＢでの処置は、すべて、対照群に比較して、腓腹筋におけるＩＬ－６の発現を減少させ、群間には相違はなく、ＨＭＢおよびＤｏｘｏが同じ機構を通じて筋ＩＬ－６発現を減少させることが立証された。

Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢは、対照およびＤｏｘｏ単独に比較して、腓腹筋におけるＩＬ－１β含量を、それぞれ、４７％および４３％減少させた。ＩＬ－１経路はまた、癌患者において過活性であり、そしていくつかの方式で、悪液質の発展に寄与する。例えば、ＩＬ－１経路は、アクチビンＡの合成を誘導し、アクチビンＡはＮＦκＢおよびｐ３８ＭＡＰＫを通じて骨格筋委縮に関連し、どちらもタンパク質合成の阻害に関連するＭＵＲＦ－１およびアトロギン（Ａｔｒｏｇｉｎ）－１を活性化するＥ３リガーゼを正に制御する。最後に、トリプトファンの血漿濃度の増加もまた、視床下部におけるセロトニン合成を増加させ、これは次に、食欲の減少に寄与する［３１、３６］。Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢ群で観察される最高の食物摂取（図３Ａ）は、Ｉｌ－１ｂレベルがより低いためである。

健康な動物において、Ｃ反応性タンパク質の血清レベルは０．０７ｍｇ／Ｌであり、一方、ＴＡＥの動物においては、得られるレベルは１．６３ｍｇ／Ｌであった。ＤｏｘｏおよびＨＭＢの単独で処置した動物において、見られる値は、それぞれ、２．３９ｍｇ／Ｌおよび０．３１ｍｇ／Ｌである一方、併用処置した群では、最低レベルが認められ、０．２ｍｇ／Ｌであった（図４Ｄ）。得られる結果は、対照群中の動物が正常よりおよそ２３倍高いＣ反応性タンパク質を有することを示し、腫瘍発展に関連する全身炎症の発生を示す。この結果は、有意な体重減少、食物摂取減少、筋肉および脂肪量の減少、ならびに以前観察された炎症促進性サイトカイン上昇と関連して、Ｂａｌｂ／ｃマウス腹腔におけるＥＡＣ細胞の接種によって悪液質が誘導されるという仮説を補強する。

Ｄｏｘｏ処置は、対照に比較してＣ反応性タンパク質レベルの増加を促進した（４７％）が、Ｄｏｘｏ＋ＨＭＢ処置は、Ｄｏｘｏ単独に比較して、このパラメータを９２％減少させた。全身炎症は、体の貯蔵のより多い可動化、食物摂取減少、癌治療に対するより低い反応、およびその結果のより劣った予後に関連する。

本研究の知見は、ドキソルビシン処置にＨＭＢを添加すると、該組み合わせが食物摂取を増加させ、そして体重を保持するため、抗悪液質効果を有することを立証する。ＨＭＢの添加はまた、Ｄｏｘｏ処置単独に比較して、腓腹筋におけるＩＬ－１βの発現、およびＣ反応性タンパク質の血清レベルを減少させ、それによって、この化学療法に関連する炎症駆動性異化潜在能力に対して防御する［３７、３８］。近年のＬＰＳ誘導性筋萎縮に供されたブタでの研究において、著者らは、ＨＭＢ補充が体重増加を促進し、そして食物摂取を改善して、そして血清ＩＬ－１βレベルおよび筋分解を低下させたことを見出し［３９］、本研究の結果をさらに実証した。

ＨＭＢは、ＥＡＣ細胞において、アラキドン酸経路を調節し、ＣＯＸ－２の発現を減少させ、アポトーシスミトコンドリア経路を誘導し、そしてｐ５３およびＢａｘの発現を増加させる一方、Ｂｃｌ－ｘｌの発現を減少させた。したがって、本研究は、ＨＭＢが、ＥＡＣを有する動物の食物摂取を増加させる一方、体貯蔵の保持および腫瘍悪液質に対する防御に寄与するような方式で、Ｃ反応性タンパク質の血清レベルおよび腓腹筋におけるＩＬ－１βの発現を減少させるため、ＨＭＢは、Ｄｏｘｏ化学療法の設定において、抗悪液質活性を有することを見出した。

前述の説明および図は、本発明の例示的な態様を含む。前述の態様および本明細書記載の方法は、当業者の能力、経験、および好みに基づいて多様でありうる。特定の順序での方法工程の単なる列挙は、方法工程の順序に対するいかなる制限も構成しない。前述の説明および図は、単に、本発明を説明し、そして例示し、そして本発明は、請求項がそのように限定しない限りそれに限定されない。本開示を提供された当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、その修飾および変動を行うことが可能であろう。

参考文献

Claims

化学療法治療を受けている動物において、腫瘍増殖を阻害するための方法であって、化学療法剤で治療されている、その必要がある動物に、約０．５ｇ～約３０ｇのβ－ヒドロキシ－β－メチルブチレート（ＨＭＢ）を投与する工程を含む、前記方法。
前記ＨＭＢが、その遊離酸型、その塩、そのエステルおよびそのラクトンからなる群より選択される、請求項１の方法。
前記ＨＭＢがカルシウム塩である、請求項１の方法。
ＨＭＢが遊離酸型である、請求項１の方法。
化学療法剤がドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）である、請求項１の方法。
化学療法治療を受けている動物の生存を増加させるための方法であって、化学療法剤で治療されている、その必要がある動物に、約０．５ｇ～約３０ｇのβ－ヒドロキシ－β－メチルブチレート（ＨＭＢ）を投与する工程を含む、前記方法。
前記ＨＭＢが、その遊離酸型、その塩、そのエステルおよびそのラクトンからなる群より選択される、請求項６の方法。
前記ＨＭＢがカルシウム塩である、請求項６の方法。
ＨＭＢが遊離酸型である、請求項６の方法。
化学療法剤がドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）である、請求項６の方法。
化学療法治療を受けている動物において、化学療法誘導性体重減少に対して防御するための方法であって、化学療法剤で治療されている、その必要がある動物に、約０．５ｇ～約３０ｇのβ－ヒドロキシ－β－メチルブチレート（ＨＭＢ）を投与する工程を含む、前記方法。
前記ＨＭＢが、その遊離酸型、その塩、そのエステルおよびそのラクトンからなる群より選択される、請求項１１の方法。
前記ＨＭＢがカルシウム塩である、請求項１１の方法。
ＨＭＢが遊離酸型である、請求項１１の方法。
化学療法剤がドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）である、請求項１１の方法。
化学療法治療を受けている動物において、化学療法誘導性炎症に対して防御するための方法であって、化学療法剤で治療されている、その必要がある動物に、約０．５ｇ～約３０ｇのβ－ヒドロキシ－β－メチルブチレート（ＨＭＢ）を投与する工程を含む、前記方法。
前記ＨＭＢが、その遊離酸型、その塩、そのエステルおよびそのラクトンからなる群より選択される、請求項１６の方法。
前記ＨＭＢがカルシウム塩である、請求項１６の方法。
ＨＭＢが遊離酸型である、請求項１６の方法。
化学療法剤がドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）である、請求項１６の方法。
化学療法治療を受けている動物において、抗悪液質治療を提供するための方法であって、化学療法剤で治療されている、その必要がある動物に、約０．５ｇ～約３０ｇのβ－ヒドロキシ－β－メチルブチレート（ＨＭＢ）を投与する工程を含む、前記方法。
前記ＨＭＢが、その遊離酸型、その塩、そのエステルおよびそのラクトンからなる群より選択される、請求項２１の方法。
前記ＨＭＢがカルシウム塩である、請求項２１の方法。
ＨＭＢが遊離酸型である、請求項２１の方法。
化学療法剤がドキソルビシン（Ｄｏｘｏ）である、請求項２１の方法。