JP2023529376A - タンパク質製造のための核酸コンストラクト - Google Patents

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Abstract

本発明は、核酸コンストラクト、および目的タンパク質の産生のための宿主細胞株を開発するための当該核酸コンストラクトの使用に関する。とりわけ、核酸コンストラクトは、生産性の高い細胞株を開発するための改良された選択を可能にする核酸コンストラクトである。

Description

発明の詳細な説明
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、米国仮出願６３／０３３，５１４号（出願日：２０２０年６月２日）の利益を主張する。同出願の内容の全体は、参照により本明細書に組込まれる。
本出願は、米国仮出願第６３／０３３，５１６号（出願日：２０２０年６月２日）の利益を主張する。同出願の内容の全体は、参照により本明細書に組込まれる。
〔発明の分野〕
本発明は、核酸コンストラクト、および目的タンパク質の産生のための宿主細胞株を開発するための当該核酸コンストラクトの使用に関する。とりわけ、核酸コンストラクトは、生産性の高い細胞株を開発するための改良された選択を可能にする核酸コンストラクトである。
〔背景技術〕
治療タンパク質医薬は、新規な療法が最も必要とされている患者に使用される医薬の重要な一分類である。様々な臨床的徴候（癌、自己免疫／炎症、感染性物質への曝露、遺伝性障害など）を処置するために、最近承認された組換えタンパク質による療法が開発されている。最新のタンパク質工学技術により、医薬の開発者および製造者は、目的のタンパク質の所望の機能特性を微調整して利用できるようになり、その一方で製品の安全性または有効性または両方を維持できる（場合によっては向上できる）ようになった。
治療タンパク質の製造および産生は、非常に複雑なプロセスである。例えば、典型的なタンパク質医薬の製造には、５０００を超える重要な工程がある。これは、小分子医薬の製造に必要な工数よりも何倍も多い。
同様に、タンパク質医薬（モノクローナル抗体、大型タンパク質、融合タンパク質など）の大きさは、小分子医薬よりも数桁大きくなり、分子量が１００ｋＤａを超えることがある。さらに、タンパク質医薬には、維持すべき複雑な二次構造および三次構造がある。タンパク質医薬は完全な化学プロセスでは合成できず、生きている細胞または生物において製造する必要がある。したがって、細胞株、起源種および培養条件はいずれも、最終産物の特性に影響を及ぼす。さらに、多くの生物活性を有しているタンパク質には翻訳後修飾が必要であるが、異種発現系を使用する場合には妥協しなければならないこともある。さらに、細胞または生物によって産物を合成するときには、複雑な精製工程が関与する。さらに、フィルタまたは樹脂を用いたウイルス粒子の除去のようなウイルスクリアランス工程、ならびに低ｐＨまたは洗浄剤を用いた不活性化工程を実施して、ウイルスによるタンパク質医薬物質の汚染という重大な安全性問題を防止する。分子サイズが大きく、翻訳後修飾を必要とし、製造工程において様々な生物材料が関与するという治療タンパク質の複雑性を考慮すると、製品の安全性および有効性を保ったまま、特定の機能をタンパク質工学によって向上させる能力が大いに望まれている。
新規な戦略およびアプローチを統合してタンパク質医薬産物を改変することは些事ではない。潜在的な治療の利点は、医薬開発におけるこのような戦略の使用の増加に駆動されてきた。今日では、多数のタンパク質工学のプラットフォーム技術を使用して、循環半減期を延長させたり、標的化したり、新規な治療タンパク質医薬に機能を与えたりする他、産物の収率および産物の純度を向上させている。例えば、今日では、タンパク質の複合体化および誘導体化のアプローチ（Ｆｃ融合化、アルブミン融合化、およびＰＥＧ化を含む）を使用して、医薬の循環半減期を延長している。
タンパク質医薬（生物製剤）の生産には、高額であり時間もかかる。この技術分野に必要とされているのは、この重要な分類の医薬を製造するための、より効率的な道具およびプロセスである。
〔発明の概要〕
本発明は、核酸コンストラクト、および目的タンパク質の産生のための宿主細胞株を開発するための当該核酸コンストラクトの使用に関する。とりわけ、核酸コンストラクトは、生産性の高い細胞株を開発するための改良された選択を可能にする核酸コンストラクトである。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、５’側から３’側の順に作動可能に関連している下記の因子を有している、目的タンパク質の発現のための核酸コンストラクトを提供する：
任意構成である第１プロモーター配列；選択マーカー配列；第２プロモーター配列；第２プロモーター配列と作動可能に連結されており第１目的タンパク質をコードする核酸配列；およびポリＡシグナル配列；
前記核酸コンストラクトは、任意構成である第１プロモーターまたは選択マーカー配列よりも５’側、ポリＡシグナル配列よりも３’側、任意構成である第１プロモーターとポリＡシグナル配列との間、選択マーカーと第２プロモーター配列との間、ならびに、任意構成である第１プロモーター配列または選択マーカー配列よりも５’側およびポリＡシグナル配列よりも３’側の両方からなる群より選択される１つ以上に位置している、１つ以上の挿入因子をさらに有する。いくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、第１プロモーター配列を含む。いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、選択マーカーと第２プロモーターとの間にポリＡシグナル配列を有していない。いくつかの好ましい実施形態では、選択マーカーは、第２プロモーターに隣接している。いくつかの好ましい実施形態では、第２プロモーターは、第１目的タンパク質をコードする核酸配列に隣接している。いくつかの好ましい実施形態では、核酸コンストラクトは、第１プロモーターと選択マーカーとの間に、コードされていない領域を有している。いくつかの好ましい実施形態では、コードされていない領域は、複数の潜在的なコザック配列および／またはＡＴＧ翻訳開始部位を有している。いくつかの好ましい実施形態では、核酸コンストラクトは、第１プロモーターと選択マーカーとの間に、拡張パッケージング領域（ＥＰＲ）を有している。いくつかの好ましい実施形態では、ＥＰＲは、複数の潜在的なコザック配列および／またはＡＴＧ翻訳開始部位を有している。
いくつかの好ましい実施形態では、第１プロモーター配列は、ＳＩＮ－ＬＴＲプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーター配列、ファージλ ＰＬプロモーター配列、ファージλ ＰＲプロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列、Ｔ７プロモーター配列、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター配列、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター配列、α－ラクトアルブミンプロモーター配列、ヒト伸長因子１α（ｈＥＦ １α）プロモーター配列、およびマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター配列からなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、第１プロモーター配列は、レトロウイルスのＬＴＲプロモーターではない。
いくつかの好ましい実施形態では、選択マーカー配列は、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）配列およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）配列からなる群より選択される増殖可能な選択マーカー配列である。いくつかの好ましい実施形態では、選択マーカー配列は、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）配列、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子配列およびプロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列からなる群より選択される抗生物質耐性のマーカー配列である。
いくつかの好ましい実施形態では、第２プロモーター配列は、ＳＶ４０プロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーター配列、ファージλ ＰＬプロモーター配列、ファージλ ＰＲプロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列、Ｔ７プロモーター配列、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター配列、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター配列、α－ラクトアルブミンプロモーター配列、ヒト伸長因子１α（ｈＥＦ １α）プロモーター配列、およびマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター配列からなる群より選択される。
いくつかの好ましい実施形態では、目的タンパク質をコードする核酸配列は、重鎖免疫グロブリン配列および軽鎖免疫グロブリン配列からなる群より選択されるタンパク質をコードする。
いくつかの好ましい実施形態では、挿入因子は、トランスポゾン挿入因子、リコンビナーゼ挿入因子、およびＨＤＲ挿入因子からなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、トランスポゾン挿入因子は、逆方向末端反復である。いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、第１プロモーターよりも５’側、およびポリＡシグナル配列よりも３’側に位置する２つの逆方向末端反復を含む。いくつかの好ましい実施形態では、リコンビナーゼ挿入因子は、付着部位（ａｔｔ）である。いくつかの好ましい実施形態では、付着部位（ａｔｔ）は、ａｔｔＢである。いくつかの好ましい実施形態では、ＨＤＲ挿入因子は、ＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー部位配列を有している。いくつかの好ましい実施形態では、ＨＤＲ挿入因子は、染色体中の標的部位に相同的な核酸配列である。いくつかの好ましい実施形態では、染色体中の標的部位に相同的な核酸配列の長さが、約３０～１０００塩基である。いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、第１プロモーターよりも５’側、およびポリＡシグナル配列よりも３’側に位置する染色体中の標的部位に相同的な２つの核酸配列を含む。いくつかの好ましい実施形態では、リコンビナーゼ挿入因子は、Ｆｌｐ組換え標的（ＦＲＴ）部位である。いくつかの好ましい実施形態では、リコンビナーゼ挿入因子は、ＬｏｘＰ配列である。
いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、ＲＮＡ輸送因子をさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、ＲＮＡ輸送因子は、目的タンパク質をコードする核酸配列よりも３’側または５’側に位置している。いくつかの好ましい実施形態では、ＲＮＡ輸送因子は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡプロセシングエンハンサー（ＰＰＥ）である。いくつかの好ましい実施形態では、ＲＮＡ輸送因子は、転写後調節因子（ＰＲＥ）である。いくつかの好ましい実施形態では、ＰＲＥ ＲＮＡ輸送因子は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）である。
いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、第１目的タンパク質と作動可能に連結されているシグナルペプチド配列をさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、シグナルペプチド配列は、組織プラスミノーゲン活性化因子シグナルペプチド配列、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド配列、ラクトフェリンシグナルペプチド配列、α－カゼインシグナルペプチド配列およびα－ラクトアルブミンシグナルペプチド配列からなる群より選択される。
いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、タンパク質精製マーカー配列をさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、タンパク質精製マーカー配列は、ヘキサヒスチジンタグまたは血球凝集素（ＨＡ）タグである。
いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、第１目的タンパク質をコードする核酸配列よりも３’側に位置する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列、および第１目的タンパク質をコードする核酸配列よりも３’側に位置する少なくとも第２目的タンパク質（例えば、第３目的タンパク質、第４目的タンパク質、第５目的タンパク質なども含む）をコードする第２核酸配列をさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、ＩＲＥＳ配列は、口蹄疫ウイルス（ＦＤＶ）ＩＲＥＳ配列、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ配列およびポリオウイルスＩＲＥＳ配列からなる群より選択される。
いくつかの好ましい実施形態では、核酸コンストラクトは、第１目的タンパク質をコードする核酸配列よりも３’側に位置する第２目的タンパク質をコードする第２核酸配列と作動可能に連結されている、第３プロモーターをさらに含む。いくつかの好ましい実施形態では、第３プロモーター配列は、ＳＶ４０プロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーター配列、ファージλ ＰＬプロモーター配列、ファージλ ＰＲプロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列、Ｔ７プロモーター配列、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター配列、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター配列、α－ラクトアルブミンプロモーター配列、ヒト伸長因子１α（ｈＥＦ １α）プロモーター配列、およびマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター配列からなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、第２目的タンパク質をコードする第２核酸配列と作動可能に関連している、ＲＮＡ輸送因子をさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、第２目的タンパク質をコードする第２核酸配列と作動可能に関連している、ポリＡシグナル配列をさらに有している。
いくつかの好ましい実施形態では、第１目的タンパク質は抗体の重鎖および軽鎖のうち一方であり、第２目的タンパク質は抗体の重鎖および軽鎖のうち他方である。
いくつかの好ましい実施形態では、核酸コンストラクトは、第１目的タンパク質をコードする核酸配列よりも３’側に位置する第２目的タンパク質をコードする第２核酸配列と作動可能に連結されている、イントロンをさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、第２目的タンパク質をコードする第２核酸配列と作動可能に関連している、ＲＮＡ輸送因子をさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、第２目的タンパク質をコードする第２核酸配列と作動可能に関連しているポリＡシグナル配列をさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、第１目的タンパク質は抗体の重鎖および軽鎖のうち一方であり、第２目的タンパク質は抗体の重鎖および軽鎖のうち他方である。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、上記の核酸コンストラクトを有するベクターを提供する。いくつかの好ましい実施形態では、ベクターは、プラスミドである。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、上記の核酸コンストラクトまたは上記のベクターを有する宿主細胞を提供する。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＡＰ細胞、ウシ乳腺上皮細胞、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞株、ベビーハムスター腎細胞、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ヒト子宮頚癌細胞、イヌ腎細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ラット線維芽細胞、ＭＤＢＫ細胞およびヒト肝細胞癌細胞株からなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＡＰ細胞からなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞株は、ＧＳノックアウト細胞株である。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞株は、ＤＨＦＲノックアウト細胞株である。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、約１～１０００コピーの核酸コンストラクトを有している。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、約１０～２００コピーの核酸コンストラクトを有している。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、約１０～１００コピーの核酸コンストラクトを有している。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、約２０～１００コピーの核酸コンストラクトを有している。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、５０～５００コピーの核酸コンストラクトを有している。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、５０～２５０コピーの核酸コンストラクトを有している。
いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、第２目的タンパク質をコードしており、それを発現させる第２核酸コンストラクトを少なくともさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、第２核酸コンストラクトは、選択マーカーを有していない。いくつかの好ましい実施形態では、第２核酸コンストラクトは選択マーカーを有しており、当該選択マーカーは第１核酸コンストラクトが有している選択マーカーとは異なっている。いくつかの好ましい実施形態では、第１核酸コンストラクトが有している第１目的タンパク質は、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のうち一方であり、第２核酸コンストラクトが有している第２タンパク質は、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のうち他方である。いくつかの好ましい実施形態では、第１目的タンパク質は、免疫グロブリンの重鎖であり、第２目的タンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖である。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、約１～１０００コピーの第２核酸コンストラクトを含む。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、約１０～２００コピーの第２核酸コンストラクトを含む。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、約１０～１００コピーの第２核酸コンストラクトを含む。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、約２０～１００コピーの第２核酸コンストラクトを含む。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、５０～５００コピーの第２核酸コンストラクトを含む。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、５０～２５０コピーの第２核酸コンストラクトを含む。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、上記の宿主細胞の集団を含んでいる、宿主細胞培養物を提供する。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、目的タンパク質が発現され、宿主細胞の培養物から目的タンパク質を精製するような条件下で、上記の宿主細胞を培養する工程を有する、目的タンパク質の作製方法を提供する。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、選択マーカーの阻害剤を含んでいる培地で成長させる。いくつかの好ましい実施形態では、選択マーカーはＧＳであり、阻害剤はホスフィノトリシンまたはメチオニンスルホキシイミン（Ｍｓｘ）である。いくつかの好ましい実施形態では、選択マーカーは、ＤＨＦＲであり、阻害剤は、メトトレキサートである。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、上記の核酸コンストラクトを含む、ベクターを提供する。いくつかの好ましい実施形態では、ベクターは、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、およびトランスポゾンベクターからなる群より選択される。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、上記の第１核酸コンストラクト；および酵素をコードする第２核酸コンストラクトを含んでいる、システムを提供する。いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、異なるベクター中に提供される。いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、同じベクター中に提供される。いくつかの好ましい実施形態では、酵素は、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼおよびニッカーゼからなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの好ましい実施形態では、ニッカーゼは、Ｃａｓニッカーゼである。いくつかの好ましい実施形態では、システムは、１つ以上のＲＮＡガイド配列をさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、酵素は、宿主細胞のゲノムへの核酸コンストラクトまたはその部分の挿入を促進する。
いくつかの好ましい実施形態では、システムは、上記の第３核酸コンストラクトを少なくともさらに有しており、当該第３核酸コンストラクトがコードする目的タンパク質は、第１核酸コンストラクトが有している目的タンパク質とは異なる。いくつかの好ましい実施形態では、第３核酸コンストラクトは、別個のベクター中に提供される。いくつかの好ましい実施形態では、第３核酸コンストラクトは、第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトと同じベクター中に提供される。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、上記の第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトを少なくとも有しており；第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトがそれぞれ、異なる目的タンパク質をコードする、システムを提供する。いくつかの好ましい実施形態では、第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトは、別個のベクター中に提供される。いくつかの好ましい実施形態では、第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトは、同じベクター中に提供される。いくつかの好ましい実施形態では、システムは、酵素をコードする第３核酸コンストラクトをさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、酵素は、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼおよびニッカーゼからなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの好ましい実施形態では、ニッカーゼは、Ｃａｓニッカーゼである。いくつかの好ましい実施形態では、システムは、１つ以上のＲＮＡガイド配列をさらに有している。いくつかの好ましい実施形態では、酵素は、宿主細胞のゲノムへの核酸コンストラクトまたはその部分の挿入を促進する。いくつかの好ましい実施形態では、第３核酸コンストラクトは、別個のベクター中に提供される。いくつかの好ましい実施形態では、第３核酸コンストラクトは、第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトと同じベクター中に提供される。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、核酸コンストラクトが宿主細胞のゲノムに組込まれるような条件下で、上記の核酸コンストラクト、ベクター、またはシステムを宿主細胞に導入する工程と；目的タンパク質を発現する宿主細胞株を構築する工程と；目的タンパク質が宿主細胞によって作製されるような条件下で、宿主細胞株から宿主細胞を培養する工程と；宿主細胞の培養物から目的タンパク質を精製する工程と、を有する、目的タンパク質の作製方法を提供する。
いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＡＰ細胞、ウシ乳腺上皮細胞、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞株、ベビーハムスター腎細胞、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ヒト子宮頚癌細胞、イヌ腎細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ラット線維芽細胞、ＭＤＢＫ細胞およびヒト肝細胞癌細胞株からなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＣＡＰ細胞からなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞株は、ＧＳノックアウト細胞株である。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞株は、ＤＨＦＲノックアウト細胞株である。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、選択マーカーの阻害剤を含んでいる培地で成長させる。いくつかの好ましい実施形態では、選択マーカーは、ＧＳであり、阻害剤は、ホスフィノトリシンまたはメチオニンスルホキシイミン（Ｍｓｘ）である。いくつかの好ましい実施形態では、選択マーカーは、ＤＨＦＲであり、阻害剤は、メトトレキサートである。いくつかの好ましい実施形態では、目的タンパク質が宿主細胞によって作製されるような条件下で、宿主細胞株から宿主細胞を培養する工程が、シャーレ、ウェルプレート、ローラーボトル、バイオリアクター、灌流システムおよび流加培養物からなる群より選択されるシステムにおいて培養する工程をさらに含んでいる。
〔図面の簡単な説明〕
図中の略称
ＡｍｐＲ ：細菌性アンピシリン耐性遺伝子
ａｔｔＢ ：細菌の付着部位
ａｔｔＰ ：ファージの付着部位
ａｔｔＲ ：組換えた上流の付着部位
Ｂａｃｋｂｏｎｅ ：プラスミド骨格
ＣＤＳ ：コーディング配列
ＥＰＲ ：ＭＭＬＶ拡張パッケージング領域
ＧＣＩ ：遺伝子コピー指数
ＧＳ ：グルタミン合成酵素
ＨまたはＨＣ ：重鎖
ｈＣＭＶ ：ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター
Ｉ ：イントロン
ＬまたはＬＣ ：軽鎖
ＭｏＭｕＳＶ５’ＬＴＲ ：モロニーマウス肉腫ウイルス５’長末端反復
Ｎｅｏ ：ネオマイシン耐性遺伝子
ＰＡまたはｐｏｌｙＡ ：ポリアデニル化シグナル
ＰｒｏＶ ＳＩＮ－ＬＴＲ：プロウイルス自己不活性化長末端反復
ｓＣＭＶ ：サルサイトメガロウイルス前初期プロモーター
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＩＮ－３’ＬＴＲ ：自己不活性化３’長末端反復
ＳＶ４０ ：シミアンウイルス４０
ＴＫ ：チミジンキナーゼ
ＵＴＲ ：非翻訳領域
ＷまたはＷＰＲＥ ：ウッドチャック転写後調節因子
〔図１〕本発明の特定の実施形態における核酸コンストラクトの設計である。
〔図２〕トランスフェクションおよびグルタミンの欠乏による選抜後における、細胞の生存曲線のグラフである。２組のトランスフェクションの平均を示す。
〔図３〕異なるプラスミドを用いて作出した細胞株プールの、生産性およびコピー数の分析を表す表である。２組のトランスフェクションの平均を示す。
〔図４〕トランスフェクションおよびグルタミンの欠乏による選抜における、細胞の生存曲線のグラフである。２組のトランスフェクションの平均を示す。
〔図５〕ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ発現プラスミドのマップである。
〔図６〕ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ発現プラスミドの配列である。
〔図７〕ドックプラスミドのマップである。
〔図８〕ドックプラスミドの配列である。
〔図９〕ドック－ＷＰＲＥプラスミドのマップである。
〔図１０〕ドック－ＷＰＲＥプラスミドの配列である。
〔図１１〕導入遺伝子－プロモーター－Ａｎｙｗａｙプラスミドのマップである。このプラスミドにおいて、ＧＳの発現は、弱いプロモーターであるモロニーマウス肉腫ウイルスの５’プロウイルス自己不活性化長末端反復に駆動されている。
〔図１２〕導入遺伝子－プロモーター－Ａｎｙｗａｙプラスミドの配列である。このプラスミドおよび以降の導入遺伝子プラスミドにおいては、ＧＳの発現を駆動するプロモーターは存在しない。
〔図１３〕導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミドのマップである。
〔図１４〕導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミドの配列である。
〔図１５〕導入遺伝子－ＭＣＳプラスミドのマップである。
〔図１６〕導入遺伝子－ＭＣＳプラスミドの配列である。
〔図１７〕導入遺伝子－ＭＣＳ－ＷＰＲＥ－イントロン－ＭＣＳプラスミドのマップである。
〔図１８〕導入遺伝子－ＭＣＳ－ＷＰＲＥ－イントロン－ＭＣＳプラスミドの配列である。
〔図１９〕導入遺伝子－ＭＣＳ－ＷＰＲＥ－ＭＣＳ－ＷＰＲＥプラスミドのマップである。
〔図２０〕導入遺伝子－ＭＣＳ－ＷＰＲＥ－ＭＣＳ－ＷＰＲＥプラスミドの配列である。
〔図２１〕導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＩＬプラスミドのマップである。
〔図２２〕導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＩＬプラスミドの配列である。
〔図２３〕導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＩＨプラスミドのマップである。
〔図２４〕導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＩＨプラスミドの配列である。
〔図２５〕導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＬＷプラスミドのマップである。
〔図２６〕導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＬＷプラスミドの配列である。
〔図２７〕導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＨＷプラスミドのマップである。
〔図２８〕導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＨＷプラスミドの配列である。
〔図２９〕ドック細胞プールにおける選抜されていないａｔｔＲの遺伝子コピー指数を表すグラフである。ドッグ細胞プールは、１細胞あたり平均して約３６個のドックを有しており、導入遺伝子－プロモーター－Ａｎｙｗａｙプラスミドにより記載の比率でトランスフェクトした。
〔図３０〕図２９に記載したいくつかのプールにおける、選抜中の生細胞の割合のグラフである。
〔図３１〕図３０に記載した全てのプールにおける、ａｔｔＲの遺伝子コピー指数およびコピー数を表す表である。
〔図３２〕ドック細胞プールにおける、選抜中の生細胞の割合を表すグラフである。ドッグ細胞プールは、１細胞あたり平均して約１３５個のドックを有しており、プロモーターを有していない導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミドとインテグラーゼプラスミドとにより記載の比率でトランスフェクトした。２組のプールの平均を示す。
〔図３３〕図３２に記載のプールの、選抜後におけるａｔｔＲの遺伝子コピー指数を表す表である。２組のプールの平均を示す。
〔図３４〕ドッククローン細胞における、選抜中の生細胞の割合を表すグラフである。ドッグクローン細胞は、１細胞あたり約１８１コピーのドックを有しており、導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＨＷプラスミドとインテグラーゼプラスミドとにより記載の比率でトランスフェクトした。２組のプールの平均を示す。
〔図３５〕図３４に記載のプールの、選抜後におけるａｔｔＲの遺伝子コピー指数を表す表である。２組のプールの平均を示す。
〔図３６〕ａｔｔＲ（充填されているドック）およびａｔｔＰ（空のドック）の遺伝子コピー指数、充填されているドックの割合、ならびにドックプールから作製したクローンの流加生産における最終力価表す表である。ドックプールは、１細胞あたり約１３５コピーのドックを有しており、導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミドとインテグラーゼプラスミドとによりトランスフェクトした。
〔図３７〕図３６に記載の２５種類のクローンの、Ｅｘｃｅｌｌにおける流加生産の力価に対するａｔｔＲの遺伝子コピー指数のグラフである。
〔図３８〕ドッククローン細胞における、選抜中の生細胞の割合を表すグラフである。ドッグクローン細胞は、１細胞あたり約１８１コピーのドックを有しており、導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＨＷプラスミド、Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＬＷプラスミド、Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＩＬプラスミド、Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＩＨプラスミドまたはＡｎｙｗａｙプラスミドのいずれかと、インテグラーゼプラスミドとによりトランスフェクトした。
〔図３９〕図３８に記載のドックプールから作製したクローンの流加生産における、ａｔｔＲの遺伝子コピー指数および最終力価を表す表である。２組のプールの平均を示す。
〔図４０〕導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙおよび導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙからの産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。左側が非還元条件における結果であり、右側が還元条件における結果である。
〔図４１〕４０世代以上にわたる流加生産における最終力価を表すグラフである。２種類の異なる培地／添加戦略と、Ａｎｙｗａｙを発現している３つのプールとを使用した。
〔定義〕
本発明の理解を促すために、下記に数々の用語を定義する。
本明細書において、用語「宿主細胞」とは、任意の真核細胞を表し（例えば、哺乳動物細胞、鳥類細胞、両生類細胞、植物細胞、魚類細胞および昆虫細胞）、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれに位置しているかは問わない。
本明細書において、用語「細胞培養物」とは、任意のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞の培養物を表す。この用語に含まれるものとしては、連続継代性細胞株（不死表現型を有しているものなど）、初代細胞培養物、有限寿命細胞株（形質転換していない細胞など）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて維持されている他の任意の細胞集団（卵母細胞および胚を含む）が挙げられる。
本明細書において、用語「ベクター」とは、適当な制御因子と関連付けられたときに複製でき、細胞間において遺伝子配列を移動させられる、任意の遺伝因子を表す（プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなど）。したがって、この用語には、クローニングおよび発現の媒体、ならびにウイルスベクターが含まれている。
本明細書において、用語「ゲノム」とは、生物の遺伝物質を表す（例えば、染色体）。
用語「目的ヌクレオチド配列」とは、任意のヌクレオチド配列を表す（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）。目的ヌクレオチド配列を操作することは、当業者によって、何らかの理由（例えば、疾患の処置、質の向上、宿主細胞における目的タンパク質の発現、リボザイムの発現）において望ましいと見做されることがある。このようなヌクレオチド配列としては、次のものが挙げられるが、これらには限定されない：構造遺伝子のコーディング配列（例えば、レポーター遺伝子、選択マーカー遺伝子、癌遺伝子、薬物耐性遺伝子、成長因子など）、およびｍＲＮＡまたはタンパク質産物をコードしない非コーディング調節配列（例えば、プロモーター配列、ポリアデニル化配列、終了配列、エンハンサー配列など）。
本明細書において、用語「目的タンパク質」とは、目的核酸によってコードされるタンパク質を表す。
本明細書において、用語「～をコードする核酸分子」「～をコードするＤＮＡ配列」「～をコードするＤＮＡ」「～をコードするＲＮＡ配列」および「～をコードするＲＮＡ」とは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序または配列を表す。これらのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序により、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序が決定される。このように、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列は、アミノ酸配列をコードしている。
本明細書において、用語「プロモーター」「プロモーター因子」または「プロモーター配列」とは、目的ヌクレオチド配列と連結された際に、当該目的ヌクレオチド配列からｍＲＮＡへの転写を制御できるＤＮＡ配列を表す。通常、プロモーターは、それによりｍＲＮＡへの転写が制御される目的ヌクレオチド配列の、５’側（上流）に位置している（ただし、必ずではない）。また、通常、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始するための他の転写因子に特異的に結合するための部位を有している。
真核生物の転写制御シグナルには、「プロモーター」因子および「エンハンサー」因子が含まれている。プロモーターおよびエンハンサーは、短いＤＮＡ配列からなる。これらは、転写に関わる細胞タンパク質と特異的に相互作用している（Maniatis et al., Science 236:1237 [1987]）。プロモーター因子およびエンハンサー因子は、様々な真核生物（酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞の遺伝子を含む）、および様々なウイルスから単離されている（制御因子アナログ（すなわち、プロモーター）は、原核生物においても発見されている）。目的タンパク質の発現にどの細胞型を使用するかに応じて、特定のプロモーターおよびエンハンサーを選択する。いくつかの真核生物のプロモーターおよびエンハンサーは幅広い宿主で利用できるが、限られた細胞型のサブセットでしか機能しないものもある（レヴュー論文として、Voss et al., Trends Biochem. Sci., 11:287 [1986]；およびManiatis et al., supraを参照されたい）。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳動物種に由来する様々な細胞型において非常に活性が高く、哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現に幅広く使用されてきた（Dijkema et al., EMBO J. 4:761 [1985]）。幅広い哺乳動物細胞において活性であるプロモーター因子の／エンハンサー因子の他の例を２つ上げると、ヒト伸長因子１α遺伝子に由来するもの（Uetsuki et al., J. Biol. Chem., 264:5791 [1989]；Kim et al., Gene 91:217 [1990]；Mizushima and Nagata, Nuc. Acids. Res., 18:5322 [1990]）と、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復に由来するもの（Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777 [1982]）およびヒトサイトメガロウイルスの長末端反復に由来するもの（Boshart et al., Cell 41:521 [1985]）とが挙げられる。
本明細書において、用語「プロモーター／エンハンサー」とは、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を与えうる配列を有しているＤＮＡの部分を意味する（すなわち、プロモーター因子およびエンハンサー因子によって与えられる機能。これらの機能に関しては上記を参照）。例えば、レトロウイルスの長末端反復は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を有している。エンハンサー／プロモーターは、「内在性」であってもよいし、「外来性」であってもよいし、「異種」であってもよい。「内在性」のエンハンサー／プロモーターとは、天然においてゲノム中の所与の遺伝子と連結されているエンハンサー／プロモーターである。「外来性」または「異種」のエンハンサー／プロモーターとは、遺伝子操作（すなわち、クローニングおよび組換えなどの分子生物学技術）によって遺伝子付近の近傍に位置に配置されたものである。この遺伝子の転写は、連結されたエンハンサー／プロモーターによって導かれるようになる。
本明細書において、用語「長末端反復」または「ＬＴＲ」とは、レトロウイルスゲノムの５’または３’のＵ３領域に位置している（または、そこから単離された）、転写制御因子を表す。本技術分野で周知の通り、長末端反復は、レトロウイルスベクターにおける制御因子として使用できる。あるいは、レトロウイルスゲノムから単離して、他の種類のベクターからの発現を制御することもできる。
本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成の規則によって関連付けられているポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を表すときに用いる。例えば、配列：５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’は、配列３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－５’に対して相補的である。相補性は、部分的であってもよい。このとき、核酸の塩基のうち一部のみが塩基対形成の規則に適合している。あるいは、相補性は、核酸間の「完全」または「全体的」な相補性であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間におけるハイブリダイゼーションの効率および強度に大きな影響を及ぼす。このことは、核酸間の結合に応じた増幅反応および検出方法において、特に重要である。
核酸に関連して用いるとき、用語「相同性」および「同一性」とは、相補性の程度を表す。相同性および同一性は、部分的な相同性（すなわち、部分的な同一性）であってもよいし、完全な相同性（すなわち、完全な同一性）であってもよい。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列と標的核酸配列とのハイブリダイズを、少なくとも部分的に阻害する配列である。このような配列のことを、機能的な用語を用いて、「実質的に相同」と称する。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、ストリンジェンシーが低い条件下におけるハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、溶液ハイブリダイゼーションなど）により試験できる。実質的に相同な配列またはプローブ（すなわち、他の目的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるオリゴヌクレオチド）は、ストリンジェンシーが低い条件下において、標的配列に対して完全に相同的な配列と競合し、結合（すなわち、ハイブリダイゼーション）を阻害する。言うまでもなく、ストリンジェンシーが低い条件においては、非特異的な結合が許容されている。ストリンジェンシーが低い条件における２つの配列の相互の結合には、特異的（選択的）な相互作用が必要である。非特異的な結合がないことを、部分的にも相補性を有していない第２標的（例えば、同一性が約３０％未満である標的）の使用によって試験してもよい。非特異的な結合がないならば、プローブは非相補的な第２標的とハイブリダイズしない。
本明細書において、用語「作動可能な組合せで」「作動可能な順序で」および「作動可能に連結されている」とは、核酸分子により所与の遺伝子が転写されうるおよび／または所望のタンパク質分子が合成されうるような、核酸配列の連結を指す。この用語は、機能性のタンパク質となりうるようなアミノ酸配列の連結も指す。
本明細書において、用語「選択マーカー」とは、酵素活性、または必須の栄養を含んでいない培地における増殖能を与える他のタンパク質をコードする遺伝子を指す。また、選択マーカーとは、当該選択マーカーが発現している細胞における、抗生物質または薬物に対する耐性を指すこともある。
本明細書において、用語「レトロウイルス」とは、細胞に侵入でき、宿主細胞のゲノムにレトロウイルスゲノムを（２本鎖のプロウイルスとして）組込めるレトロウイルス粒子を指す。細胞に侵入できるレトロウイルス粒子とは、すなわち、宿主細胞の表面に結合し当該宿主細胞の細胞質へのウイルス粒子の侵入を促進できる、エンベロープタンパク質またはウイルス性Ｇ糖タンパク質などの膜関連タンパク質を有している粒子を指す。用語「レトロウイルス」の例としては、Oncovirinae科（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）およびマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ））、Spumavirinae科、およびLentivirinae科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス）が挙げられる。Lentivirinae科に関しては、米国特許第５，９９４，１３６号および第６，０１３，５１６号を参照されたい（いずれの文献も、参照により本明細書に組込まれる）。
本明細書において、用語「レトロウイルスベクター」とは、目的遺伝子を発現するように改変されたレトロウイルスを指す。レトロウイルスベクターは、ウイルス感染プロセスを利用することにより、宿主細胞への効果的な遺伝子の移入に使用できる。レトロウイルスゲノムにクローニングした（すなわち、分子生物学技術により挿入した）外来または異種の遺伝子を、当該レトロウイルスによる感染に感受性がある宿主細胞へと効果的に送達できる。周知の遺伝子操作によって、レトロウイルスゲノムの複製能を破壊してもよい。こうして得られる複製欠損ベクターは、細胞への新規な遺伝物質の導入に使用できるが、レトロウイルスは複製できない。ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞株を使用して、ベクター粒子を組立て、細胞から放出させてもよい。このようなレトロウイルスベクターは、複製欠損レトロウイルスゲノムを有している。この複製欠損レトロウイルスゲノムは、１つ以上の目的遺伝子をコードする核酸配列（すなわち、ポリシストロン核酸配列は２つ以上の目的遺伝子をコードできる）と、レトロウイルス性の５’長末端反復（５’ＬＴＲ）と、レトロウイルス性の３’長末端反復（３’ＬＴＲ）と、を有している。
本明細書において、用語「レンチウイルスベクター」とは、Lentiviridae科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、およびヤギ関節炎脳炎ウイルス）に由来し、非分裂細胞に組込むことができるレトロウイルスベクターを指す。レンチウイルスベクターに関しては、例えば、米国特許第５，９９４，１３６号および第６，０１３，５１６号を参照されたい（いずれの文献も、参照により本明細書に組込まれる）。
本明細書において、用語「トランスポゾン」とは、ゲノム上のある位置から他の位置へと移動または置換えできる転移因子（例えば、Ｔｎ５、Ｔｎ７、およびＴｎ１０）を指す。一般的に、位置の変化はトランスポザーゼによって制御されている。本明細書において、用語「トランスポゾンベクター」とは、トランスポゾンの末端に隣接している、目的核酸をコードするベクターを指す。トランスポゾンベクターの例としては、次の文献に開示されているものが挙げられるが、これらには限定されない：米国特許第６，０２７，７２２号、第５，９５８，７７５号、第５，９６８，７８５号、第５，９６５，４４３号、および第５，７１９，０５５号（全ての文献が、参照により本明細書に組込まれる）。
本明細書において、用語「アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター）」とは、アデノ随伴ウイルスの血清型（ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶＸ７などが挙げられるが、これらには限定されない）に由来するベクターを指す。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶの野生型遺伝子のうち１つ以上の全部または一部を欠失していてもよい。好ましくは、ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子を欠失しているが、隣接する機能性のＩＴＲ配列は保存されている。
本技術分野で周知の組換え技術を利用することにより、両方の末端（５’末端および３’末端）において機能性のＡＡＶ ＩＴＲと隣接している１つ以上の異種ヌクレオチド配列を有するように、ＡＡＶベクターを構築してもよい。本発明の実施において、ＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲと、異種ヌクレオチド配列の上流に位置している好適なプロモーター配列と、当該異種配列の下流に位置している１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲと、を有していてもよい。「組換えＡＡＶベクタープラスミド」とは、ベクターにプラスミドが含まれている組換えＡＡＶベクターの一種を表す。一般的に、ＡＡＶベクターでは、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲが選択された異種ヌクレオチド配列と隣接している。
本明細書において、用語「アデノウイルスベクター」とは、アデノウイルス骨格を有している、エンベロープのない２本鎖ＤＮＡベクターを表す。
本明細書において、用語「精製」とは、通常の環境から取り除かれ、単離または分離された核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかの分子を表す。したがって、単離核酸配列とは、精製核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、当該分子が通常伴っている他の成分を、６０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上含んでいない。
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、核酸コンストラクト、および目的タンパク質の産生のための宿主細胞株を開発するための当該核酸コンストラクトの使用に関する。とりわけ、核酸コンストラクトは、生産性の高い細胞株を開発するための改良された選択を可能にする核酸コンストラクトである。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、宿主細胞株において目的タンパク質を発現させる際に使用するための核酸コンストラクトを提供する。いくつかの好ましい実施形態では、核酸コンストラクトは、最も好ましくは５’側から３’側の順に作動可能に関連している下記の因子を有している：
第１プロモーター配列－選択マーカー配列－第２プロモーター配列－第１目的タンパク質をコードする核酸配列－ポリＡシグナル配列。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明のコンストラクトは、選択マーカー配列と第２プロモーター配列との間にポリＡシグナル配列を有していない。本発明は、いかなる特定の作用機序にも限定されない。実際、本発明を実践するためには、作用機序の解明は必須ではない。それにもかかわらず、選択マーカーの後にポリＡシグナル配列を欠くコンストラクトが、宿主細胞培養物中の目的タンパク質のより良い選択および産生を提供することが見出されている。さらに他の好ましい実施形態では、選択マーカーは、第２プロモーターに隣接している。さらに他の好ましい実施形態では、第２プロモーターは、第１目的タンパク質をコードする核酸配列に隣接している。この文脈において、用語「隣接する」とは、介在する機能性因子またはイントロンのいずれも、列挙されている要素の間に存在しないことを意味する。
核酸コンストラクトは、多くの異なるベクターおよびベクターシステムと共に利用され得る。好適なベクターおよびベクターシステムとしては、レトロウイルス、レンチウイルスおよびＡＡＶシステムなどのウイルス性の遺伝子挿入技術、ならびにトランスポザーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼまたはＣＲＩＳＰＲによる遺伝子挿入などの非ウイルス性の遺伝子挿入技術が挙げられるが、これらには限定されない。本発明の核酸コンストラクトと共に使用することができる技術／酵素の具体的な例としては、ｐｉｇｇｙｂａｃｋトランスポザーゼシステム、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼシステム、Ｍｏｓ１トランスポザーゼシステム、Ｔｏｌ２トランスポザーゼシステム、Ｌｅａｐｉｎトランスポザーゼシステム、λリコンビナーゼシステム、ＦＬＰ／ＦＲＴシステム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム、ＭＭＬＶインテグラーゼシステム、Ｒｅｐ ７８インテグラーゼシステム、およびＣＲＩＳＰＲシステム（ヌクレアーゼまたはニッカーゼとガイド配列とを含み得る）が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、システムは、レトロウイルスまたはレンチウイルスＬＴＲを利用する、レトロウイルスシステムまたはレンチウイルスシステムのいずれでもないという条件での、核酸組込みシステムである。
いくつかの実施形態では、コンストラクトは、米国特許第６３／０３３，５１６号（その全内容が、参照により本明細書に組込まれる）に記載されているような組込まれたドック部位を含む、宿主細胞において有用である。組込まれたドック部位は、好ましくは１つ以上の挿入因子（「ドック部位挿入因子」とも称され得る）を含む。ドック部位挿入因子は好ましくは、ドック部位において目的タンパク質をコードする核酸配列の挿入を促進する核酸配列である。本発明の、宿主細胞中のドック部位へ挿入され得る核酸コンストラクトを以下に詳述する。
例えば、いくつかの好ましい実施形態では、リコンビナーゼドック部位挿入因子は、付着部位（ａｔｔ）を有している。いくつかの特に好ましい実施形態では、付着部位は、ａｔｔＰである。これらの付着部位は、ＰｈｉＣ３１インテグラーゼによって利用される。ＰｈｉＣ３１インテグラーゼとは、リコンビナーゼ酵素であり、好ましい実施形態ではベクターを介して宿主細胞に提供され得る。これらのドック部位は、ａｔｔＢ付着部位を有している核酸コンストラクトの組込みのためのアクセプターとして機能する。他の好ましい実施形態では、ａｔｔＲ付着部位およびａｔｔＬ付着部位を利用することができる。
他の好ましい実施形態では、リコンビナーゼドック部位挿入因子は、Ｆｌｐ組換え標的（ＦＲＴ）部位を有している。これらの部位は、フリッパーゼ酵素により利用される。フリッパーゼ酵素とは、リコンビナーゼ酵素であり、好ましい実施形態ではベクターを介して宿主細胞に提供され得る。これらのドック部位は、ＦＲＴ部位を有している核酸コンストラクトの組込みのためのアクセプターとして機能する。
他の好ましい実施形態では、リコンビナーゼドック部位挿入因子は、ＬｏｘＰ部位を含有している。これらの部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって利用される。好ましい実施形態では、Ｃｒｅリコンビナーゼとは、ベクターを介して宿主細胞に提供され得る。これらのドック部位は、ＬｏｘＰ部位を有している核酸コンストラクトの組込みのためのアクセプターとして機能する。
他の好ましい実施形態では、挿入因子は、ＨＤＲ（相同組換え修復）ドック部位挿入因子である。ＨＤＲドック部位挿入因子とは、相同な領域（「ホモロジーアーム」）を与える核酸配列である。この相同な領域は、ドック部位に挿入される核酸コンストラクトに含まれている対応するホモロジーアームと塩基対を形成する。これらのシステムでは、好ましくは、標的部位を２本鎖切断するエンドヌクレアーゼを利用する。標的部位は、好ましくは、ホモロジーアームに隣接している。いくつかの実施形態において、ＨＤＲドック部位挿入因子は、ＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー部位である。この実施形態において、ドック部位は、Ｒｅｐ７８エンドヌクレアーゼ（ニッカーゼ）に利用される。Ｒｅｐ７８エンドヌクレアーゼは、ベクターにより宿主細胞に導入され得る。Ｒｅｐ７８ニッカーゼタンパク質は、ＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー部位に対応するホモロジーアームを有している核酸配列の、部位特異的な組込みを促進する。
他の好ましい実施形態では、ＨＤＲドック部位挿入因子は、外来性配列である１つ以上のホモロジーアームを有しており、その長さは３０～１０００塩基対である。これらのドック部位は、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムと組合せて用いられる。いくつかの実施形態では、ドック部位は、ガイドＲＮＡ配列に相同な１つ以上の配列をさらに有している。これらの実施形態では、ドック部位に挿入される核酸コンストラクトは、好ましくは、ドック部位に含まれているホモロジーアームに相同であり塩基対を形成するホモロジーアームを有している。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムを利用するためには、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムに適合するヌクレアーゼを宿主細胞に導入する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムに適合するヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡによって決定される（ドック部位内の）位置に２本鎖切断を生じさせる、野生型エンドヌクレアーゼであってもよい。あるいは、２つのガイドＲＮＡによって定義されるドック部位内のずれた位置に１本鎖切断を生じさせる、変異型ヌクレアーゼ（すなわち、ニッカーゼ）であってもよい。好適なヌクレアーゼについては、核酸発現コンストラクトに関する説明において後に詳述する。
いくつかの好ましい実施形態では、ドック部位は、好ましくは、好適なプロモーターを有していてもよい。これによって、好適な核酸コンストラクトがドック部位に導入されたときに、プロモーター捕捉スキームを利用できるようになる。好適なプロモーターの例としては、ＳＩＮ－ＬＴＲプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ＥＦ１αプロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーター配列、ファージλ ＰＬプロモーター配列、ファージλ ＰＲプロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列、Ｔ７プロモーター配列、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター配列、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター配列、α－ラクトアルブミンプロモーター配列およびマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター配列が挙げられるが、これらには限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、プロモーター配列は、ドック部位に向けられている。これにより、プロモーターは、挿入された核酸コンストラクトの発現を駆動するようになる。いくつかの好ましい実施形態では、プロモーターは、ドック部位の５’側に向けられている。いくつかの特に好適な実施形態において、プロモーターは、ＳＩＮ－ＬＴＲである。この実施形態において、ＳＩＮ－ＬＴＲおよびＥＰＲはドック部位よりも５’側に位置しており、ＳＩＮ－ＬＴＲはドック部位よりも３’側に位置している。
したがって、いくつかの好ましい実施形態では、核酸コンストラクトは、挿入因子を有している。好ましくは、挿入因子は、第１プロモーターよりも５’側、ポリＡシグナル配列よりも３’側、第１プロモーターとポリＡシグナル配列との間、選択マーカーと第２プロモーター配列との間、ならびに、第１プロモーターよりも５’側およびポリＡシグナル配列よりも３’側の両方に位置し得る。好適なコンストラクトが、以下の非限定的な例に示される：
発現コンストラクト挿入因子－第１プロモーター配列（ドック部位が外来性プロモーター配列を既に有しているか否かに応じて任意構成）－選択マーカー配列－第２（すなわち、内在性）プロモーター配列－第１目的タンパク質をコードする核酸配列－ポリＡシグナル配列
第１プロモーター配列（ドック部位が外来性プロモーター配列を既に有しているか否かに応じて任意構成）－選択マーカー配列－第２プロモーター配列－第１目的タンパク質をコードする核酸配列－ポリＡシグナル配列－発現コンストラクト挿入因子
発現コンストラクト挿入因子－第１プロモーター配列（ドック部位が外来性プロモーター配列を既に有しているか否かに応じて任意構成）－選択マーカー配列－第２プロモーター配列－第１目的タンパク質をコードする核酸配列－ポリＡシグナル配列－発現コンストラクト挿入因子
第１プロモーター配列（ドック部位が外来性プロモーター配列を既に有しているか否かに応じて任意構成）－選択マーカー配列－発現コンストラクト挿入因子－第２プロモーター配列－第１目的タンパク質をコードする核酸配列－ポリＡシグナル配列。
いくつかの好ましい実施形態では、コンストラクトは、多数の目的タンパク質（例えば、第２目的タンパク質、第３目的タンパク質、第４目的タンパク質、または５目的タンパク質）をコードする核酸配列を含み得る。２つの目的タンパク質を発現するために好適なコンストラクトが、以下の非限定的な例に示される。
発現コンストラクト挿入因子－第１プロモーター配列（ドック部位が外来性プロモーター配列を既に有しているか否かに応じて任意構成）－選択マーカー配列－第２（すなわち、内在性）プロモーター配列－第１目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ（任意構成）－ポリＡシグナル配列－第３プロモーター配列またはＩＲＥＳ－第２目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ（任意構成）－ポリＡシグナル配列
第１プロモーター配列（ドック部位が外来性プロモーター配列を既に有しているか否かに応じて任意構成）－選択マーカー配列－第２プロモーター配列－第１目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ（任意構成）－ポリＡシグナル配列－第３プロモーター配列－イントロン（任意構成）－第２目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ（任意構成）－ポリＡシグナル配列－発現コンストラクト挿入因子
発現コンストラクト挿入因子－第１プロモーター配列（ドック部位が外来性プロモーター配列を既に有しているか否かに応じて任意構成）－選択マーカー配列－第２プロモーター配列－第１目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ（任意構成）－ポリＡシグナル配列－第３プロモーター配列－イントロン（任意構成）－第２目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ（任意構成）－ポリＡシグナル配列－発現コンストラクト挿入因子
第１プロモーター配列（ドック部位が外来性プロモーター配列を既に有しているか否かに応じて任意構成）－選択マーカー配列－発現コンストラクト挿入因子－第２プロモーター配列－第１目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ－ポリＡシグナル配列－第３プロモーター配列またはＩＲＥＳ－第２目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ－ポリＡシグナル配列
発現コンストラクト挿入因子－第１プロモーター配列（ドック部位が外来性プロモーター配列を既に有しているか否かに応じて任意構成）－選択マーカー配列－第２プロモーター配列－第１目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ（任意構成）－ポリＡシグナル配列－第３プロモーター配列－第２目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ（任意構成）－ポリＡシグナル配列－発現コンストラクト挿入因子
発現コンストラクト挿入因子－第１プロモーター配列（ドック部位が外来性プロモーター配列を既に有しているか否かに応じて任意構成）－選択マーカー配列－第２プロモーター配列－第１目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ（任意構成）－ポリＡシグナル配列－第３プロモーター配列－イントロン－第２目的タンパク質をコードする核酸配列－ＷＰＲＥ（任意構成）－ポリＡシグナル配列－発現コンストラクト挿入因子
いくつかの好ましい実施形態では、第１目的タンパク質は抗体の重鎖および軽鎖のうち一方であり、第２目的タンパク質は抗体の重鎖および軽鎖のうち他方である。
しかしながら、任意の好適な目的タンパク質は、本発明の宿主細胞、コンストラクトおよびシステムを介して発現され得る。例示的な目的タンパク質としては、免疫グロブリン、単鎖抗体、抗凝固タンパク質、血中因子タンパク質、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質骨格、酵素、Ｆｃ融合タンパク質、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗原、および血栓溶解タンパク質が挙げられる。他の好ましい実施形態では、本発明のコンストラクトはウイルスベクターを発現するために利用され得る。これらの実施形態では、上記の例示的なベクターに記載された目的タンパク質配列は、ウイルスベクター骨格をコードする核酸配列で置き換えられる。本発明のコンストラクトに含まれ得るウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターが挙げられるが、これらには限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、レトロウイルスベクター自体には、ベクターによって発現される上記のような目的タンパク質をコードする核酸配列が含まれている。いくつかの特に好ましい実施形態では、ベクターによって発現される目的タンパク質は、ワクチンに用いられる抗原配列である。
いくつかの好ましい実施形態では、挿入因子は、トランスポゾン、インテグラーゼ、リコンビナーゼまたはＣＲＩＳＰＲシステムとともに利用されるか、またはこれらに認識される因子である。好適な挿入因子の例としては、逆方向末端反復配列、インテグラーゼ付着部位（ａｔｔ）および相同組換えアームが挙げられるが、これらには限定されない。相同組換えアームは、本明細書に記載のコンストラクトが相同組換え挿入因子として説明できる箇所に関連して利用できる。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の核酸コンストラクトはトランスポゾン挿入因子、好ましくはトランスポゾンによって認識される逆方向末端反復を有している。いくつかの好ましい実施形態では、逆方向末端反復は、コンストラクトの５’末端および３’末端の両方に位置する。トランスポゾンは、ゲノム中の別の位置から移動または置換えできる移動性遺伝因子である。ゲノム内の位置の変化は、トランスポゾンによってコードされるトランスポザーゼ酵素によって制御される。本技術分野において公知のトランスポゾンの多くの例としては、Ｔｎ５トランスポーズシステム（例えば、de la Cruz et al., J. Bact. 175: 6932-38 [1993]を参照されたい）、Ｔｎ７トランスポーズシステム（例えば、Craig, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 204: 27-48 [1996]を参照されたい）、およびＴｎ１０トランスポーズシステム（例えば、Morisato and Kleckner, Cell 51:101-111 [1987］を参照されたい）、ならびにｐｉｇｇｙｂａｃｋトランスポザーゼシステム、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼシステム、Ｍｏｓ１トランスポザーゼシステム、Ｔｏｌ２トランスポザーゼシステム、およびＬｅａｐｉｎトランスポザーゼシステムが挙げられるが、これらには限定されない。トランスポゾンをゲノムへ組込み能力は、トランスポゾンベクターを作製するために利用されている（例えば、米国特許第５，７１９，０５５号；第５，９６８，７８５号；第５，９５８，７７５号；および第６，０２７，７２２号（これらの全てが参照によって本願明細書に組込まれる）、ならびにＳｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから供給されるもの（米国カリフォルニア州パロアルト；ｐｉｇｇｙｂａｃｋシステム）、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓから供給されるもの（ニューヨーク州シャーリー；ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙシステム）、およびＡＴＵＭから供給されるもの（カリフォルニア州ニューアーク；Ｌｅａｐｉｎシステム）を参照されたい）。
位置の変化は、（１）トランスポゾンの末端に存在する末端逆方向反復（ＩＲ）へのトランスポザーゼの配列特異的結合、（２）トランスポゾンの各端部でのＤＮＡの両鎖の切断、（３）トランスポザーゼ－トランスポザーゼ相互作用による末端のシナプス形成、（４）標的ＤＮＡの捕捉、および（５）標的に因子を挿入するための鎖転移、という順序づけられた一連の事象を含む。
トランスポザーゼは、レトロウイルスのインテグラーゼスーパーファミリーの一員である。それらの触媒領域の構造的類似性にもかかわらず、これらのタンパク質は異なる特異性を有するホスホリル転移反応を行う。いくつかのトランスポザーゼは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド２本鎖中の一方の鎖（ＤＮＡ鎖）のみを切断し、一方でＲＮａｓｅ Ｈは一方の鎖（ＲＮＡ鎖）を切断する。他のトランスポザーゼは、２本鎖ＤＮＡ切断を生成し、様々な作用機序が使用される。細菌トランスポゾンＴｎ５および細菌トランスポゾンＴｎ１０のトランスポザーゼは、加水分解によって第１鎖切断を行い、因子の各端部に３’ヒドロキシル（３’ＯＨ）を形成し、一方、第２鎖は、攻撃求核試薬としてこの３’ＯＨを使用するエステル交換反応によって切断される。これは、トランスポザーゼによって加水分解されて、鎖転移に必要な３’ＯＨを再生する因子の各端部に、ＤＮＡヘアピンを形成する。ｈＡＴファミリーの一員である、真核生物のＨｅｒｍｅｓ因子のＶ（Ｄ）Ｊの組換えおよび位置の変化は、同様の作用機序によって進行する。ただし、鎖の切断の順序は逆であり、ヘアピンは切除されたＤＮＡ上ではなく、隣接するＤＮＡ上に形成される。別の細菌トランスポゾンであるＴｎ７は、ＴｎｓＢを利用して第１鎖の切断を行い、第２タンパク質であるＴｎｓＡを動員して、非転移鎖を切断する。
トランスポゾンは感染性ではないため、トランスポゾンベクターは、当技術分野で公知の方法（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、またはマイクロインジェクション）を介して宿主細胞に導入される。したがって、宿主細胞に対するトランスポゾンベクターの比率は、高コピー数の宿主細胞を産生するために所望の感染多重度を提供するように調整され得る。本発明における使用に適したトランスポゾンベクターは一般的に、２つのトランスポゾン挿入配列の間に挿入された目的タンパク質をコードする核酸を含む。いくつかのベクターはまた、トランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列を含む。これらのベクターにおいて、挿入配列の１つは、トランスポザーゼ酵素と目的タンパク質をコードする核酸との間に位置し、その結果、組換えの間に宿主細胞のゲノムに組込まれない。あるいは、トランスポザーゼ酵素は、好適な手法（例えば、リポフェクションまたはマイクロインジェクション）によって提供されてもよい。
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の核酸コンストラクトは、リコンビナーゼによって認識されるリコンビナーゼ挿入因子を含む。好適なリコンビナーゼ挿入因子としては、付着部位（ａｔｔ）、ＬｏｘＰ部位およびＭＭＬＶ ＬＴＲ配列が挙げられるが、これらには限定されない。
いくつかの好ましい実施形態では、リコンビナーゼ挿入因子はａｔｔＢであり、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ（ＢｉｏＣａｔ ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＤＥ）またはＳｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ））と組合せて使用される。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼは、バクテリオファージｐｈｉＣ３１のゲノム内にコードされる配列特異的リコンビナーゼである。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼは、付着部位（ａｔｔ）と呼ばれる２つの３４塩基対配列の間の組換えを媒介し、一方はファージ中に見つけられ、他方は宿主中に見つけられる。このセリンインテグラーゼは、哺乳動物細胞を含む多くの異なる細胞型において効率的に機能することが示されている。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼの存在下では、ａｔｔＢを含むドナープラスミドは、天然のａｔｔＰ部位（ｐｓｅｕｄｏ ａｔｔＰ部位と呼ばれる）と類似する配列を有する部位での組換えにより、標的ゲノムに一方向に組込まれ得る。ｐｈｉＣ３１インテグラーゼは任意の大きさのプラスミドを単一のコピーとして組込むことができ、補因子を必要としない。組込まれた導入遺伝子は、安定して発現され、遺伝可能である。
さらに他の好ましい実施形態では、挿入因子は、宿主細胞中の染色体などの染色体中の標的部位に相同的な核酸配列であり、リコンビナーゼまたはＣＲＩＳＰＲなどのシステムと組合せて使用される。好適なリコンビナーゼベースシステムには、ＣＲＥ－Ｌｏｘ、ＦＬＰ－ＦＲＴ、およびλリコンビナーゼシステムが含まれる。一般的に、染色体中の標的部位に相同的な核酸配列の長さは、約３０～１０００塩基である。
いくつかの好ましい実施形態では、リコンビナーゼ挿入因子は、ｌｏｘ配列である。Ｃｒｅ－Ｌｏｘ組換えは、部位特異的リコンビナーゼ技術であり、細胞のＤＮＡ中の特異的部位で欠失、挿入、転座および逆位を行うために使用される。これは、ＤＮＡ修飾を特異的な細胞型に標的化させるか、または特異的な外部刺激によって誘発させる。それは、真核生物系および原核生物系の両方で実施される。Ｃｒｅ－ｌｏｘ組換えシステムは、神経科学者が、複雑な細胞型と神経回路とが一緒になって認知および行動を生み出す脳を研究するのを助けることに特に役立っている。このシステムは、Ｌｏｘ配列とよばれる一対の短い標的配列を組換える単一の酵素である、Ｃｒｅリコンビナーゼからなる。このシステムは、追加の支持タンパク質または配列を挿入することなく実施することができる。Ｃｒｅ酵素、およびＬｏｘＰ配列と呼ばれる元のＬｏｘ部位は、バクテリオファージＰ１に由来する。例えば、Targeted integration of DNA using mutant lox sites in embryonic stem cells. Araki, et al. Nucleic Acids Res, Feb 1997, Vol. 25, Issue 4, pp. 868-872；High-Resolution Labeling and Functional Manipulation of Specific Neuron Types in Mouse Brain by Cre-Activated Viral Gene Expression. Kuhlman, et al. PLos One, Apr 2008, Vol. 3, e2005；When reverse genetics meets physiology: the use of site-specific recombinases in mice. Tronche, et al. FEBS Letters, Aug 2002, Vol. 529, Issue 1, pp. 116-121を参照されたい。
いくつかの好ましい実施形態では、リコンビナーゼ挿入因子は、ＦＲＴ配列である。ＦＬＰ－ＦＲＴ組換えシステムは、Ｃｒｅ－ｌｏｘと概念的に非常に類似した別の部位特異的組換え技術であり、フリッパーゼ（Ｆｌｐ）および短絡フリッパーゼ認識標的（ＦＲＴ）部位は、それぞれＣｒｅおよびｌｏｘＰと類似している。例えば、Candice et al., Cre/loxP, Flp/FRT Systems and Pluripotent Stem Cell Lines (2012) Topics in Current Genetics, vol 23を参照されたい。ＦＬＰ－ＦＲＴ技術はＣｒｅ－ｌｏｘの有効な代替物であり得、それと組合せて使用されており、２つの別々の組換え事象が並行して制御されることを可能にしている。
さらに他の好ましい実施形態では、本発明の核酸コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ相同組換え（ＨＤＲ）システムと組合せて使用することができる。これらのシステムにおいて、ＨＤＲ挿入因子は、ゲノム中の標的配列と相同的であるか、または塩基対となる、ホモロジーアームを含む。ＨＤＲは、ＤＮＡ中の２本鎖切断（ＤＳＢ）の存在によって開始される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、好ましくはガイドＲＮＡ配列を介して標的化２本鎖切断を作製し、本発明の核酸コンストラクトが挿入され得るように使用される。例えば、Zhang et al., Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage (2017) Genome Biol. 18:35；Mali et al., Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nature Methods10, 957-963 (2013)；Mali et al., RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science339(6121), 823-826 (2013)；Ran et al., Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell, 155(2), 479-480(2013)を参照されたい。好適なガイドＲＮＡ配列（ｇＲＮＡ）は、当技術分野で知られているように設計することができる。いくつかの好ましい実施形態では、ＨＤＲのためのＣＲＩＳＰＲシステムは、１つまたは２つのガイド配列のいずれかを利用する。１つのガイドＲＮＡ配列が利用される場合、ガイドＲＮＡ配列によってガイドされる１本鎖２本鎖切断を行うＣａｓ９ヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを使用することが好ましい。２つのガイド配列が利用される場合、ニッカーゼを使用することが好ましく、ニッカーゼは、ガイドＲＮＡ配列の各々によってガイドされる標的ＤＮＡ配列において１本鎖切断を行うだけの変異したＣａｓ９ヌクレアーゼであり得る。１本鎖切断は、好ましくは、標的ＤＮＡ配列の異なる鎖（すなわち、センス鎖およびアンチセンス鎖）上の互い違いのポイントに位置する。この構成は一般的に、ＨＤＲ効率を改善する。
一般的に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか、またはＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性に影響する転写物および他の因子のことをまとめて指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分のｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（「直接反復」、および内在性のＣＲＩＳＰＲシステムに関連する箇所における、ｔｒａｃｒＲＮＡでプロセシングされた部分的直接反復を包含する）、ガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連する箇所おいて「スペーサー」とも称する）、またはＣＲＩＳＰＲ部位由来の他の配列および転写物を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の因子は、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムに由来する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の因子は化膿レンサ球菌などの内在性のＣＲＩＳＰＲシステムを有している特定の生物に由来する。一般的に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムに関連する箇所において、ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒとも呼ばれる）において、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する因子によって特徴づけられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関連する箇所において、「標的配列」とは、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。完全な相補性は必ずしも必要ではないが、ただし、ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性が存在することを条件とする。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えばＤＮＡポリヌクレオチドまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置する。いくつかの実施形態では、標的配列は、真核生物の細胞小器官（例えば、ミトコンドリアまたは葉緑体）内にあってもよい。標的配列を含む標的部位への組換えのために使用され得る配列または鋳型は、「編集鋳型」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と称される。本発明の態様において、外来性の鋳型ポリヌクレオチドは、編集鋳型と称され得る。本発明の一態様において、組換えは、相同組換えである。
典型的には、内在性のＣＲＩＳＰＲシステムに関連する箇所において、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズされ、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化されたガイド配列を有する）の形成は、標的配列中またはその付近（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、もしくはそれ以上の塩基対内）の一方または両方の鎖の切断をもたらす。理論に拘束されることを望むものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全てまたは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、またはそれ以上のヌクレオチド）を含むか、またはそれからなり得、また、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿って、ガイド配列に作動可能に連結されたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の全部または一部にハイブリダイゼーションすることによって、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部を形成し得る。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、ハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関与するのに十分なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に対する相補性を有する。標的配列と同様で、完全な相補性は、機能的であるのに十分であるならば、必要とされないと考えられる。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、最適に整列された場合、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の因子の発現を駆動する１つ以上のベクターが宿主細胞に導入され、その結果、ＣＲＩＳＰＲシステムの因子の発現が、１つ以上の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を指示する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別々のベクター上の別々の調節因子に作動可能に連結され得る。あるいは、同じまたは異なる調節因子から発現される２つ以上の因子を、単一のベクター中で１つ以上のさらなるベクターと組合せてもよく、当該１つ以上のさらなるベクターは第１ベクターには含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の要素を提供する。単一ベクター内で組合わされるＣＲＩＳＰＲシステム因子は、第２因子に対して５’側（第２因子の「上流」）、または第２因子に対して３’側（第２因子の「下流」）に位置する１つの因子など、任意の好適な配向で配列され得る。１つの因子のコード配列は、第２因子のコード配列の同じまたは反対の鎖上に位置し得、同じまたは反対方向に配向され得る。いくつかの実施形態では、単一のプロモーターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ならびにガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列（ガイド配列に作動可能に任意に連結される）、およびｔｒａｃｒ配列のうちの１つ以上（１つ以上のイントロン配列内に埋め込まれている（例えば、それぞれが異なるイントロン中、２つ以上が少なくとも１つのイントロン中、もしくはすべてが単一のイントロン中に埋め込まれている））をコードする転写産物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、およびｔｒａｃｒ配列は、同じプロモーターに作動可能に連結され、同じプロモーターから発現される。
本発明に有用なＣａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、それらの修飾されたバージョンが挙げられる。これらの酵素は公知であり、例えば、化膿レンサ球菌 Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列はアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２でＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに見つけることができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９などの修飾さていないＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ切断活性を有する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であり、化膿レンサ球菌または肺炎レンサ球菌に由来するＣａｓ９であってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内および／または標的配列の相補体内などの標的配列の位置で、一方の鎖または両方の鎖の切断を誘導する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、対象配列の最初または最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、またはそれ以上の塩基対内の一方の鎖または両方の鎖の切断を誘導する。いくつかの実施形態では、ベクターは、対応する野生型酵素に対して変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、その結果、変異したＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方の鎖または両方の鎖を切断する能力に欠けることになる。例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒領域におけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を、両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（１本鎖を切断する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例としては、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、およびＮ８６３Ａが挙げられるが、これらには限定されない。本発明の態様において、ニッカーゼは、相同組換えを介したゲノム編集に使用することができる。
いくつかの好ましい実施形態では、ＨＤＲ挿入因子は、ＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー部位配列を有し、Ｒｅｐ ７８インテグラーゼと組合せて使用される。特に好ましい実施形態では、ＨＤＲ挿入因子は、ＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー部位配列と塩基対であるホモロジーアームを有する。アデノ随伴ウイルス血清型２（ＡＡＶ２）Ｒｅｐ ７８タンパク質は、ＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー部位配列に対応するホモロジーアームを有する、導入遺伝子配列の部位特異的組込みを促進する鎖特異的エンドヌクレアーゼ（ニッカーゼ）である。例えば、Ramachandra et al., Efficient recombinase-mediated cassette exchange at the AAVS1 locus in human embryonic stem cells using baculoviral vectors (2011) Nucleic Acids Research, 39(16):e107; WO1998027207)を参照されたい。
上記のように、いくつかの好ましい実施形態では、本発明の核酸コンストラクトは、第１プロモーター配列および第２プロモーター配列を有する。第１プロモーター配列および第２プロモーター配列は、同じでもよく、異なっていてもよい。好適な第１プロモーター配列および第２のプロモーター配列としては、ＭＭＬＶ ＬＴＲプロモーター配列、ＭｏＭｕＳＶ ＬＴＲプロモーター配列、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター配列、ＳＩＮ ＬＴＲプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター配列、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター配列、α－ラクトアルブミンプロモーター配列、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター配列、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター配列、β－アクチンプロモーター配列、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター配列、およびＥＦ１αプロモーター配列、ならびにこれらの組合せが挙げられるが、これらには限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、第１プロモーター配列はレトロウイルスＬＴＲプロモーターではなく、すなわち、第１プロモーターはレトロウイルスＬＴＲプロモーター配列以外のプロモーター配列である。しかしながら、プロモーターがレトロウイルスプロモーター配列である場合、それはＳＩＮ（自己不活性化）ＬＴＲプロモーター配列であり得る。例えば、同時係属中の出願であるＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６４４２３（その全体が参照により、本明細書に組込まれる）を参照されたい。好適なＳｉｎ ＬＴＲプロモーターは当技術分野で公知であり、ＬＴＲのＵ３領域の全てまたは一部を除去することによって調製される。
ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６４４２３に記載されているように、いくつかの好ましい実施形態では、選択マーカーを駆動する第１プロモーターは、弱いプロモーターである。いくつかの好ましい実施形態では、弱いプロモーターは、選択マーカー配列に作動可能に連結された場合に、目的宿主（例えば、ＣＨＯ細胞）におけるＳＩＮ ＬＴＲプロモーターの活性と同等またはそれ未満の活性を有するプロモーター、好ましくは構成的プロモーターである。さらに他の好ましい実施形態では、弱いプロモーターは、選択マーカー配列に作動可能に連結された場合に、目的宿主（例えば：ＣＨＯ細胞）におけるヒトユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーターの活性と同等またはそれ未満の活性を有するプロモーター、好ましくは構成的プロモーターである。プロモーター強さを評価するための適切な方法は、当技術分野で公知である。例えば、Dandindorj et al. (2014) A Comparative Analysis of Constitutive Promoters Located in Adeno-Associated Viral Vectors, PLoS One 9(8): e106472；Zhang and Baum (2005) Evaluation of Viral and Mammalian Promoters for Use in Gene Delivery to Salivary Glands Mol. Ther. 12(3):528-536；Qin et al. (2010) Systematic Comparison of Constitutive Promoters and the Doxycycline-Inducible Promoter PLoS 5(5): e10611；Jeyaseelan et al. (2001) Real-time detection of gene promoter activity: quantitation of toxin gene transcription, Nucleic Acids Research. 29 (12): 58e-58を参照されたい。いくつかの実施形態では、弱いプロモーターは、プロモーター活性を低下させるように改変されている。したがって、いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、第１の弱いプロモーター配列、または改変されていないもしくは野生型バージョンの第１プロモーター配列と比較してプロモーター活性を低下させるように改変されているプロモーターと作動可能に関連している選択マーカーをコードする核酸配列、ならびに第２プロモーター配列と作動可能に連結している目的タンパク質をコードする核酸配列を有する、目的タンパク質の発現のためのベクターを提供する。このような例として、ＳＩＮ ＬＴＲプロモーター配列がある。上記の他のプロモーター配列もまた、活性を低下させ、弱いプロモーターを提供するように改変され得るか、または弱いプロモーターは、ＵＢＣプロモーターなどの天然に存在する弱いプロモーターであり得る。
いくつかの好ましい実施形態では、核酸コンストラクトは、選択マーカーを有する。好適な選択マーカーとしては、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）などが挙げられるが、これらには限定されない。これらの遺伝子は、米国特許第５，７７０，３５９号；第５，８２７，７３９号；第４，３９９，２１６号；第４，６３４，６６５号；第５，１４９，６３６号；および第６，４５５，２７５号に記載されており、これらの全ては参照により、本明細書に組込まれる。いくつかの好ましい実施形態では、利用される選択マーカーは、選択マーカー核酸配列によってコードされる酵素の産生が欠けている宿主細胞株と適合する。好適な宿主細胞株を以下に、より詳しく記載する。他の実施形態では、選択マーカーは、抗生物質耐性マーカー、すなわち、抗生物質に対する耐性を有するタンパク質を発現する細胞を提供するタンパク質を産生する遺伝子である。好適な抗生物質耐性マーカーには、ネオマイシン（ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ））、ハイグロマイシン（ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ピューロマイシン（ピューロマイシンＮ－アセチル－トランスフェラーゼ）などに対する耐性を提供する遺伝子が含まれる。
本発明の他の実施形態では、目的タンパク質の分泌が所望される場合、核酸コンストラクトは、目的タンパク質と作動可能に関連するシグナルペプチド配列を有する。いくつかの好適なシグナルペプチド配列は、当業者に公知であり、このようなシグナルペプチド配列として、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長ホルモン、ラクトフェリン、α－カゼイン、およびα－ラクトアルブミンに由来するものが挙げられるが、これらには限定されない。
本発明に他の実施形態において、核酸コンストラクトは、目的タンパク質をコードする核酸配列よりも３’側または５’側に位置しているＲＮＡ輸送因子（例えば、米国特許第５，９１４，２６７；第６，１３６，５９７号；および第５，６８６，１２０号、ならびにＷＯ９９／１４３１０（これらの全ては、参照により本明細書に組込まれる）を参照されたい）を有する。ＲＮＡ輸送因子の使用は、目的タンパク質をコードする核酸配列中にスプライスシグナルまたはイントロンを組込むことなく、目的タンパク質の高いレベルの発現を可能にすることが意図される。
さらに他の実施形態では、核酸コンストラクトは、少なくとも１つの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を有する。いくつかの好適なＩＲＥＳの配列が入手可能であり、例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＤＶ）、脳心筋炎ウイルス、ポリオウイルスに由来するものが挙げられるが、これらには限定されない。ＩＲＥＳ配列は、２つの転写ユニット（例えば、異なる目的タンパク質をコードする核酸、または抗体などのマルチ－サブユニットタンパク質のサブユニット）の間に挿入され、ポリシストロン配列を形成し得、その結果、２つの転写ユニットが同じプロモーターから転写され得る。
本発明は、任意の特定の目的タンパク質の発現に限定されない。いくつかの好ましい実施形態では、目的タンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、アルブミン融合体、成長因子、タンパク質受容体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単鎖Ｆｃ（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）、ダイアボディ、およびミニボディ（ｓｃＦｖ－ＣＨ３）、Ｆａｂ、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、免疫グロブリン重鎖、および免疫グロブリン軽鎖、ならびに他の抗原結合タンパク質からなる群より選択される。
いくつかの好ましい実施形態では、核酸コンストラクトは、核酸発現ベクターに組込まれる。ベクターとしては、１本鎖、２本鎖または部分的に２本鎖の核酸分子；１つ以上の自由端を有している核酸分子、自由端がない核酸分子（環状核酸分子など）；ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは両方を含む核酸分子；および本技術分野で周知のポリヌクレオチドの他の変化形が挙げられるが、これらには限定されない。ベクターの一例は、「プラスミド」であり、これは標準的な分子クローニング技術などによって追加のＤＮＡ断片を挿入することができる環状の２本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの他の例は、ウイルスベクターであり、ここでウイルス由来のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）に格納されてベクター中に存在する。ウイルスベクターはまた、宿主細胞にトランスフェクションするための、ウイルスにより送達されるポリヌクレオチドも含まれている。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自発的に複製できる（例えば、細菌性複製開始点を有している細菌ベクター、哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクターは、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組込まれ、宿主ゲノムと共に複製される（哺乳動物の非エピソームベクターなど）。さらに、特定のベクターは、当該ベクターに作動可能に連結している遺伝子の発現を誘導できる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と称する。組換えＤＮＡ技術における通常の発現ベクターの利用は、プラスミドの形態をとることが多い。
したがって、好適な発現ベクターとしては、上記のトランスポゾンベクター、ならびにプラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、ファージベクターなどが挙げられるが、これらには限定されない。宿主において複製可能であり、かつ生存可能である限り、任意のベクターが使用され得ることが意図される。好ましい実施形態では、ベクターは哺乳動物の発現ベクターであり、このベクターは、本明細書に記載される他の因子の中で、複製開始点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、転写終了配列、ならびに５’隣接非転写配列を有している。
本発明の核酸コンストラクトを組込むために適合させることができる好適なベクターとしては、トランスポゾンベクター、Ｆｌｐ－ＦＬＴシステム、Ｃｒｅ－Ｌｏｘシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム、リコンビナーゼシステムおよびインテグラーゼシステムのための、特定のプラスミドシステム、ならびにｐＣＩｎｅｏ、ｐＶＡＸ１、ｐＡＣＴ、Ｇａｔｅｗａｙプラスミド、ｐＡｄｖａｎｔａｇｅ、ｐＢＩＮＤ、ｐＧ５ｌｕｃ、ｐＴＮＴ、ｐＴａｒｇｅｔ、ｐＣａｔ３、ｐＳＩ、ｐＣＭＶ、ｐＳＶなどに由来するプラスミドベクターが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ベクターはレトロウイルスベクターである。最も一般的に使用される組換えレトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来する（例えば、Miller and Baltimore Mol. Cell. Biol. 6:2895 [1986]を参照されたい）。ＭｏＭＬＶシステムは、１）この特異的レトロウイルスが多くの異なる細胞型に感染し得ること、２）確立されたパッケージング細胞株が組換えＭｏＭＬＶウイルス粒子の産生に利用可能であること、および３）導入された遺伝子が標的細胞染色体に永続的に組込まれること、のいくつかの長所を有する。確立されたＭｏＭＬＶベクターシステムは、レトロウイルス配列の小部分（例えば、ウイルスの長い末端反復もしくは「ＬＴＲ」、およびパッケージングもしくは「ｐｓｉ」シグナル）ならびにパッケージング細胞株を有する、ＤＮＡベクターを有する。導入される遺伝子は、ＤＮＡベクターに挿入される。ＤＮＡベクター上に存在するウイルス配列は、ウイルス粒子へのベクターＲＮＡの挿入もしくはパッケージング、および挿入された遺伝子の発現に必要なシグナルを提供する。パッケージ細胞株は、粒子集合体に必要なタンパク質を提供する（Markowitz et al., J. Virol. 62:1120 [1988]）。
いくつかの好ましい実施形態では、レトロウイルスベクターは偽型であり、例えば、膜関連タンパク質としてＶＳＶのＧタンパク質を利用する。細胞への侵入を獲得するために特異的細胞表面タンパク質受容体に結合するレトロウイルスエンベロープタンパク質とは異なり、ＶＳＶ Ｇタンパク質は原形質膜のリン脂質成分と相互作用する（Mastromarino et al., J. Gen. Virol. 68:2359 [1977]）。ＶＳＶの細胞への侵入は、特異的タンパク質受容体の存在に依存しないため、ＶＳＶは極めて広い宿主域を有する。ＶＳＶ Ｇタンパク質を有する偽型レトロウイルスベクターは、ＶＳＶに特徴的な改変された宿主域を有する（すなわち、それらは、脊椎動物、無脊椎動物および昆虫細胞のほとんどすべての種に感染し得る）。重要なことに、ＶＳＶ Ｇ偽型レトロウイルスベクターは感染性の有意な損失なしに超遠心分離によって２０００倍以上濃縮することができる（Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033 [1993]）。
いくつかの好ましい実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクター（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス）は、非分裂細胞に組込むことができるレトロウイルスのサブファミリーである。レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスＤＮＡは、すべてのレトロウイルスにおいて見られる３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを有し、それらは２つのＬＴＲ配列に隣接している。ｇａｇ遺伝子は内部構造タンパク質（例えば、マトリックスタンパク質、カプシドタンパク質、ヌクレオカプシドタンパク質）をコードし、ｐｏｌ遺伝子は逆転写酵素タンパク質、プロテアーゼタンパク質、およびインテグラーゼタンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’側および３’側のＬＴＲは、ウイルスＲＮＡの転写およびポリアデニル化を制御する。レンチウイルスゲノム中のさらなる遺伝子には、ｖｉｆ遺伝子、ｖｐｒ遺伝子、ｔａｔ遺伝子、ｒｅｖ遺伝子、ｖｐｕ遺伝子、ｎｅｆ遺伝子、およびｖｐｘ遺伝子が含まれる。
様々なレンチウイルスベクターおよびパッケージング細胞株は当技術分野において公知であり、本発明において使用が見出されている（例えば、米国特許第５，９９４，１３６号および第６，０１３，５１６号（これらの両方は参照によって本明細書に組込まれる）を参照されたい）。さらに、ＶＳＶ Ｇタンパク質は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に基づいて、レトロウイルススベクターを偽型化するためにも使用されている（Naldini et al., Science 272:263 [1996]）。したがって、ＶＳＶ Ｇタンパク質は、様々な偽型レトロウイルスベクターを作製するために使用することができ、ＭｏＭＬＶに基づくベクターに限定されない。レンチウイルスベクターはまた、様々な調節配列（例えば、シグナルペプチド配列、ＲＮＡ輸送因子、およびＩＲＥＳ）を含むように、上記のように修飾され得る。レンチウイルスベクターが産生された後、それらを使用して、レトロウイルスベクターについて上述したように宿主細胞をトランスフェクトすることができる。
いくつかの好ましい実施形態では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶゲノムは、約４６８０塩基を含む線状の１本鎖ＤＮＡ分子から構成される。ゲノムは、ＤＮＡ複製の起点として、およびウイルスのパッケージングシグナルとして、シスで機能する逆方向末端反復（ＩＴＲ）を、各端部に含む。ゲノムの内部の非反復部分は、それぞれＡＡＶ ｒｅｐおよびキャップ領域として知られる２つの大きなオープンリーディングフレームを含む。これらの領域は、ビリオンの複製およびパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。少なくとも４つのウイルスタンパク質のファミリーは、それらの見かけの分子量に従って命名された、ＡＡＶ ｒｅｐ領域、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０から合成される。ＡＡＶキャップ領域は少なくとも３つのタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする（ＡＡＶゲノムの詳細な説明については、例えば、Muzyczka, Current Topics Microbiol. Immunol. 158:97-129 [1992]；Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 [1994]を参照されたい）。
ＡＡＶは、増殖性感染が起こるために、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアなどの非関連ヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。このような共感染がない場合には、ＡＡＶは、宿主細胞染色体にそのゲノムを挿入することによって潜伏状態を確立する。ヘルパーウイルスによるその後の感染は組込まれたコピーを救出し、次いで、複製して感染性ウイルス子孫を産生することができる。非偽型レトロウイルスとは異なり、ＡＡＶは広範な宿主域を有し、任意の種においても増殖するヘルパーウイルスとの共感染がある限り、その種から細胞中に複製することができる。したがって、例えば、ヒトＡＡＶは、イヌアデノウイルスに共感染したイヌ細胞において複製する。さらに、レトロウイルスとは異なり、ＡＡＶはいかなるヒトまたは動物の疾患とも関連せず、組込み時に宿主細胞の生物学的特性を改変させないようであり、非分裂細胞に組込むことができる。また、近年、ＡＡＶは宿主細胞ゲノムに部位特異的に組込むことができることが見出された。
上記の特性に照らして、多数の組換えＡＡＶベクターが遺伝子送達のために開発されている（例えば、米国特許第５，１７３，４１４号；第５，１３９，９４１号；ＷＯ９２／０１０７０およびＷＯ９３／０３７６９（両方が参照によって本明細書に組込まれる）；Lebkowski et al., Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996 [1988]；Carter, Current Opinion in Biotechnology 3:533-539 [1992]；Muzyczka, Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129 [1992]；Kotin, (1994) Human Gene Therapy 5:793-801；Shelling and Smith, Gene Therapy 1:165-169 [1994]；およびZhou et al., J. Exp. Med. 179:1867-1875 [1994]を参照されたい）。
組換えＡＡＶビリオンは、ＡＡＶヘルパープラスミドおよびＡＡＶベクターの両方でトランスフェクトされた好適な宿主細胞中で産生することができる。ＡＡＶヘルパープラスミドは一般的に、ＡＡＶ ｒｅｐおよびキャップコード領域を有するが、ＡＡＶ ＩＴＲを有さない。したがって、ヘルパープラスミドは、それ自体の複製もパッケージングもできない。ＡＡＶベクターは一般的に、ウイルスの複製およびパッケージング機能を提供するＡＡＶ ＩＴＲによって結合された、選択された目的遺伝子を含む。ヘルパープラスミド、および選択された遺伝子を有するＡＡＶベクターの両方が、一過性のトランスフェクトによって好適な宿主細胞に導入される。次いで、トランスフェクトされた細胞を、ＡＡＶ ｒｅｐおよびキャップ領域の転写および翻訳を誘導するヘルパープラスミド上に存在するＡＡＶプロモーターをトランス活性化させる、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。選択された遺伝子を保有する組換えＡＡＶビリオンが形成され、調製物から精製することができる。一旦ＡＡＶベクターが産生されると、それらは、高コピー数の宿主細胞を産生するために、所望の感染多重度で宿主細胞をトランスフェクトするために使用され得る（例えば、米国特許第５，８４３，７４２号（参照により、本明細書に組込まれる）を参照されたい）。当業者によって理解されるように、ＡＡＶベクターはまた、様々な調節配列（例えば、シグナルペプチド配列、ＲＮＡ輸送因子、およびＩＲＥＳ）を含むように、上記のように修飾され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、宿主細胞および宿主細胞の培養物を提供し、当該宿主細胞は上記の核酸コンストラクトに由来する目的タンパク質を発現している。好ましい実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。多くの哺乳動物宿主細胞株が、当技術分野で公知である。一般的に、これらの宿主細胞は、以下により詳しく記載されるように、適切な栄養および成長因子を含んでいる培地中で単層培養または懸濁培養したときに、増殖・生存できる。典型的には、細胞は、特定の目的タンパク質を大量に発現し、培養培地中に分泌することができる。好適な哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ－Ｋ１、ＡＴＣＣ ＣＣｌ－６１）；ウシ乳腺上皮細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０２７４；ウシ乳腺上皮細胞）；ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎細胞株（２９３細胞、または懸濁液培養物中で増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞であり、例えば、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 [1977]を参照されたい）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 [1980]）；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＬ ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]）；ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ラット線維芽細胞（２０８Ｆ細胞）；ＭＤＢＫ細胞（ウシ腎細胞）；ＣＡＰ（ＣＥＶＥＣの羊膜細胞産生）細胞；およびヒト肝細胞癌細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられるが、これらには限定されない。
いくつかの特に好適な実施形態において、宿主細胞は、選択剤の存在下における細胞の増殖または生存に必要な酵素活性を欠損するように改変されているか、元から欠損しており、これにより選択マーカーが与えられる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＧＳを欠損するように改変されている。ベクターがＧＳ選択マーカーを有しているいくつかの好適な実施形態において、宿主細胞株は、ＧＳを欠損している。いくつかの特に好適な実施形態において、ＧＳを欠損している宿主細胞株は、メルク株式合資会社から入手できるＣＨＯＺＮ（登録商標）ＧＳ－／－細胞株である。例えば選択マーカーがＤＨＦＲである他の実施形態では、細胞株は、好ましくはＤＨＦＲ活性を欠損していてもよい（すなわち、ＤＨＦＲ－）。好適なＤＨＦＲ－細胞株としては、ＣＨＯ－ＤＧ４４およびその誘導体が挙げられるが、これらには限定されない。
本発明の核酸コンストラクトおよびベクターは、トランスフェクション、形質転換または形質導入などの任意の好適な手段によって宿主細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、トランスフェクションまたは形質導入の後、細胞を増殖させ、次いでトリプシン処理し、再度培養する。次いで、個々のコロニーを選択して、クローン的に選択された細胞株を提供する。さらに別の実施形態では、クローン的に選択された細胞株をサザンブロッティングまたはＰＣＲアッセイによってスクリーニングして、所望の番号の組込み事象が起こったことを確認する。クローン的な選択は、優れたタンパク質産生細胞株の同定を可能にすることも意図される。他の実施形態では、細胞は、トランスフェクション後にクローン的に選択されない。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、異なる目的タンパク質をコードするベクターでトランスフェクトされる。異なる目的タンパク質をコードするベクターを使用して、細胞を同時にトランスフェクトすることができる（例えば、宿主細胞を異なる目的タンパク質をコードするベクターを含有する溶液に暴露する）か、またはトランスフェクションを連続的に行うことができる（例えば、宿主細胞を第１目的タンパク質をコードするベクターを用いて最初にトランスフェクトし、ある期間をおいて、次いで、宿主細胞を第２目的タンパク質をコードするベクターを用いてトランスフェクトする）。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞を第１目的タンパク質をコードする組込みベクターを用いてトランスフェクトし、組込みベクターの多数の組込まれたコピーを含有する、高発現の細胞株を選択し（例えば、クローン的に選択し）、選択した細胞株を、第２目的タンパク質をコードする組込みベクターを用いてトランスフェクトする。この処理を繰り返して、多数の目的タンパク質を導入することができる。いくつかの実施形態では、感染の多重度を操作して（例えば、増加または低下させて）、目的タンパク質の発現を増加または低下させることができる。同様に、異なるプロモーターを利用して、目的タンパク質の発現を変化させることができる。これらのトランスフェクト方法は、外来性の代謝経路全体を含む宿主細胞株を構築するために、またはタンパク質を処理する能力が増加した宿主細胞を提供するために使用することができる（例えば、宿主細胞は、翻訳後の修飾に必要な酵素を提供することができる）ことが意図される。
本発明のいくつかの実施形態では、好適な宿主株の形質転換、および培地中の適切な細胞密度への宿主株の増殖の後、目的タンパク質は宿主細胞の培養の途中で分泌される。増幅可能なマーカーが利用される、いくつかの好ましい実施形態では、形質導入された宿主細胞を、阻害剤を含む培地中で培養することが意図される。好適な阻害剤としては、ＤＨＦＲの阻害のためのメトトレキサート、およびＧＳの阻害のためのメチオニンスルホキシイミン（Ｍｓｘ）もしくはホスフィノトリシンが挙げられるが、これらには限定されない。これらの阻害剤の濃度が細胞培養システムにおいて増加するにつれて、より高いコピー数の増幅可能なマーカー（したがって、遺伝子または目的遺伝子）を有する細胞、またはより高い産生挿入を含む細胞が選択されることが意図される。
したがって、上記のベクターを含む宿主細胞は、好ましくは当技術分野で公知の方法に従って培養される。哺乳動物細胞に好適な培養条件は、当技術分野で周知である（例えば、J. Immunol. Methods (1983) 56:221-234 [1983], Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. Oxford University Press, New York [1992]を参照されたい）。
本発明の宿主細胞培養物は、培養される特定の細胞に好適な培地で調製される。ＡｃｔｉＰｒｏ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ＥｘＣｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｅｄ Ｂａｔｃｈ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＡＦＣ）、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、例示的な栄養溶液である。好適な培地は、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第５，１２２，４６９号；第４，５６０，６５５号；ならびにＷＯ９０／０３４３０およびＷＯ８７／００１９５にも記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組込まれる。これらの培地のいずれも、必要に応じて、血清、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸など）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン(gentamycin)（ゲンタマイシン(gentamicin)）など）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、脂質（リノール酸または他の脂肪酸など）、ならびにそれらの好適な担体、ならびにグルコースまたは同等のエネルギ源を、補充することができる。ＧＳなどの選択マーカーが利用される、いくつかの好ましい実施形態では、例えば、培地はグルタミンを欠く。任意の他の必要な補充物もまた、当業者に知られている適切な濃度で含まれ得る。
本発明はまた、トランスフェクトされた宿主細胞のための様々な培養システム（例えば、シャーレ、９６ウェルプレート、ローラーボトル、およびバイオリアクター）の使用が意図される。例えば、トランスフェクトされた宿主細胞を灌流システムにおいて培養し得る。灌流培養とは、高い細胞密度で維持される培養物を通して、培養培地の断続的な流れを提供することを指す。細胞は、懸濁され、増殖するために固体支持を必要としない。一般的に、毒性代謝物の同時除去、および理想的には死滅した細胞の選択的除去に続いて、新鮮な栄養物を供給しなければならない。濾過方法、捕捉方法およびマイクロカプセル化方法は全て、培養環境を十分な速度でリフレッシュするのに好適である。
別の例として、いくつかの実施形態では、流加培養法を用いることができる。好ましい流加培養では、哺乳動物宿主細胞および培養培地が最初に培養容器に供給され、培養の終了前、定期的な細胞および／または産物の回収を伴って、または伴わずに、連続的に、または個別の増分で、培養物に追加の培養栄養が供給される。流加培養物としては例えば、半連続流加培養物を含むことができ、定期的に全培養物（細胞および培地を含む）を取り出し、新鮮な培地に置き換える。流加培養は、細胞培養のための全ての要素（細胞および全ての培養栄養を含む）が培養処理の最初に培養容器に供給される簡単なバッチ培養とは区別される。流加培養は、処理中に上清が培養容器から除去されない限り、潅流培養からさらに区別することができる（潅流培養において、細胞は例えば、ろ過、カプセル化、マイクロキャリアへの固着などによって、培養中に拘束され、培養培地は連続的または断続的に導入されて、かつ培養容器から除去される）。いくつかの特に好ましい実施形態では、バッチ培養は、ローラーボトル中で実施される。
さらに、培養物の細胞は、特定の宿主細胞および特定の産生プランに対して好適になり得る任意のスキームまたはルーティンにしたがって、増殖させることができる。したがって、本発明は、単一工程または多工程の培養方法を意図する。単一工程の培養では、宿主細胞を培養環境中に接種し、細胞培養の単一の産生段階の間に本発明のプロセスを使用する。あるいは、多段階培養が想定される。多段階培養において、細胞は、いくつかの工程または段階で培養され得る。例えば、細胞を第一工程において増殖させてもよく、または、おそらく保管から取り出された細胞を増殖および高生存率を促進するのに好適な培地に接種する増殖期の培養物中で増殖させてもよい。細胞は、宿主細胞培養物に新鮮な培地を加えることによって、好適な期間、増殖期において維持され得る。
細胞培養の増殖期における哺乳動物細胞の増殖を増強するために、流加培養または連続細胞培養の条件が考案される。増殖期において、細胞を、増殖のための条件下、かつ増殖のために最大化された期間、増殖させる。温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ２）などの培養条件は、特定の宿主で使用されるものであり、当業者にとって明らかであろう。一般的に、酸（例えば、ＣＯ２）または塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３もしくはＮａＯＨ）のいずれかを用いて、ｐＨを約６．５～７．５のレベルに調整する。ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞を培養するために好適な温度域は、約３０℃～３８℃であり、好適なｄＯ２は、空気飽和度の５～９０％である。
ポリペプチド産生段階の後、当該技術分野において十分に確立されている技術を用いて、目的ポリペプチドを培養培地から回収する。目的タンパク質は好ましくは、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが（例えば、目的タンパク質の分泌はシグナルペプチド配列によって誘導される）、宿主細胞溶解物からも回収され得る。第一工程として、培養培地または溶解物を遠心分離して、粒子状細胞破片を除去する。その後、ポリペプチドを、汚染物質可溶性タンパク質およびポリペプチドから精製し、以下の手順が好適な精製手順の例である：免疫アフィニティーまたはイオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカでのクロマトグラフィー、またはＤＥＡＥなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５を使用する、ゲルろ過；ならびにタンパク質Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用して、ＩｇＧなどの汚染物質を除去する。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼ阻害剤もまた、精製中のタンパク質分解を阻害するのに有用であり得る。さらに、目的タンパク質を、目的タンパク質の精製を可能にするマーカー配列にフレーム中で融合させることができる。マーカー配列の非限定的な例としては、ベクター、好ましくはｐＱＥ－９ベクターによって供給され得るヘキサヒスチジンタグ、およびヘマグルチニン（ＨＡ）タグが挙げられる。ＨＡタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応する（例えば、Wilson et al., Cell, 37:767 [1984]を参照されたい）。当業者は、目的ポリペプチドに好適な精製方法が、組換え細胞培養における発現時のポリペプチドの特性の変化を考慮するための修飾を必要とし得ることを理解するであろう。
いくつかの好ましい実施形態では、核酸コンストラクトはシステムに組込まれる。いくつかの実施形態では、システムは、宿主細胞への導入を意図する、複数の上記のような核酸コンストラクトまたはベクターを含む。他の好ましい実施形態では、システムは、核酸、または宿主細胞ゲノムへの核酸コンストラクトの組込みに必要な酵素をコードするベクターに加えて、宿主細胞への導入が意図される、１つ以上の上記のような核酸コンストラクトまたはベクターを含む。例示的な酵素としては、トランスポゾンベクターシステムで使用するためのトランスポザーゼ、ＰｈｉＣ３１システム、ＭＭＬＶシステムなどの組込み配列を利用するシステムで使用するためのインテグラーゼ、Ｃｒｅ－ｌｏｃ、ＦＬＰ－ＦＲＴなどのベクターシステムで使用するためのリコンビナーゼ、およびＣＲＩＳＰ系システムで使用するためのＣａｓ９ヌクレアーゼが挙げられるが、これらには限定されない。
〔実施例〕
本発明が提供する特有の方法は、ＳＩＮ－ＬＴＲレトロウイルス発現カセットとグルタミンシンターゼ（ＧＳ）ノックアウトＣＨＯ細胞株系とを組合せ、ランダムな組込みを利用して細胞株の開発方法を改良する。これにより、遺伝子のコピー数を増加させ、コピーあたりの生産性を向上させる。この方法は、プールをより厳しく選抜して、滴定量を増加させプールをさらに豊富にし、クローンを大量生産するための、改良された予期せぬ方法を提供する。また、この方法は、ＣＨＯゲノムにある上述の部位（ドック）に発現カセット（導入遺伝子）を標的化して組込むことにより、生産性の高い細胞株を開発するための、迅速かつ効果的な方法を提供する。
〔実施例１〕
５種類の独立したプラスミドで一過的にトランスフェクトすることにより、３つの細胞株プールを作出した（図１）。いずれの細胞株プールも、試験タンパク質であるＡｎｙｗａｙを発現するように設計した。これらのプラスミドは、ＧＳの発現を駆動させるのに利用したプロモーターに基づいて命名した。第１プラスミド（ＳＶ４０）は、従来の細胞株開発方法を表す。このプラスミドは、強力なＳＶ４０プロモーターに駆動された選択マーカー遺伝子（ＧＳ）を有しており、ＳＶ４０イントロンおよびポリＡシグナルをさらに有していた。第２プラスミド（ＷＴ－ＬＴＲ）は、ＧＳの発現を駆動させるのに野生型のプロウイルスＬＴＲを利用した。ＧＳの発現セットは、ＧＰＥｘベクターを挿入する際に類似した構成とした。ＷＴ－ＬＴＲは比較的強力なプロモーターと考えられているが、このプロモーターの転写産物はＧＳで終了せずに、ｓＣＭＶ、ＡｎｙｗａｙおよびＷＰＲＥまで続き、ＴＫポリＡ配列が利用される。第３プラスミド（ＳＩＮ－ＬＴＲ）は、短縮されたＬＴＲでありプロモーター活性が低いＳＩＮ－ＬＴＲ（Ｓｅｌｆ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ－ＬＴＲ）を有している点を除けば、理想的な第２コンストラクトである。第４プラスミド（ｐＳＩＮ）は、ＧＳの発現を駆動する強力なプロモーターの代わりにＳＩＮ－ＬＴＲ由来の弱いプロモーター因子を利用している点を除けば、理想的な第１プラスミドである。第５プラスミドは、ＧＦＰを発現するがＧＳ遺伝子を有していない、ネガティヴ・コントロールである。
上述のプラスミドをトランスフェクトすることにより作出したプールを、グルタミン欠乏下における生存により選抜した。選抜したプールを通常に流加生産して、Ａｎｙｗａｙタンパク質の産生能を測定した。
［ＣＨＯＺＮ細胞株の開発］
ＣＨＯＺＮ細胞のトランスフェクション：Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯを用いて上述のプラスミドを細胞にトランスフェクトすることにより、各プラスミドがランダムに組込まれている細胞株プールを作出した。２０μｇのプラスミドを１ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ培地に加えた。８０μＬのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯを９２０μＬのＯｐｔｉＰｒｏに加えた。これら２つの溶液を１分間混合した。次に、３０００万個のＣＨＯＺＮ細胞が含まれている３ｍＬのＣＨＯ－Ｇｒｏ培地に混合物を加えた。２５０ｒｐｍで振盪しながら、３７℃にて一晩、細胞をインキュベートした。翌朝、６ｍＭのグルタミンを添加した１５ｍＬのＥｘｃｅｌｌ ＣＤ Ｆｕｓｉｏｎ培地を加えた。トランスフェクションから細胞が回復するまで、この培地中で細胞を継代した。
ＣＨＯＺＮ細胞の選抜：細胞の生存率が９６％超に達した時点において培地を完全に交換して、ＣｌｏｎａＣｅｌｌ－ＣＨＯ ＡＣＦ（２％）を添加するがグルタミンを添加していないＥｘｃｅｌｌ ＣＤ Ｆｕｓｉｏｎ培地中で継代した。定期的に細胞の生存率および生細胞密度をモニタリングした。１ｍＬあたりの細胞数が１００万個に達し、定常的に継代するようになるまで、毎週培地を交換した。
流加生産：流加生産に先立ち、各プールを３世代以上にわたってＡｃｔｉＰｒｏ培地に馴化させた。流加生産に際しては、ＡｃｔｉＰｒｏ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ）中の６００，０００個／ｍＬの細胞を、５０ｍＬの遠心チューブに播種した。そして、加湿条件下（７０～８０％）、２５０ｒｐｍ、５％ＣＯ２存在下、３７℃（最初の５日間は３４℃）にて、振盪インキュベーターでインキュベートした。生産の間、２種類の異なる栄養サプリメントを用いて、栄養を６回補充した。グルコースを毎日モニタリングして、５ｇ／Ｌ未満にレベルが低下したときにはこれを補った。生存率が７０％以下になった時点で培養を終了させた。
［結果］
図２に示すように、ＳＶ４０プール、ＷＴ－ＬＴＲプールおよびＳＩＮ－ＬＴＲプールは、選抜からの回復プロファイルが顕著に異なっていた。ＳＶ４０プールは、回復が最も速かった（生存率：９０％超）。これが意味するのは、選抜前のプールに含まれる細胞のうち比較的多くの部分が選抜を通過したということである。ＷＴ－ＬＴＲプールは、回復が遅かった。これが意味するのは、選抜前のプールのうち小部分が選抜を通過したということである。ＳＩＮ－ＬＴＲプールは、回復が顕著に遅かった。これが意味するのは、選抜前のプールのうちごく小部分しか選抜を通過しなかったということである。
図３に示すように、ＳＩＮ－ＬＴＲプールの力価は、ＷＴ－ＬＴＲプールおよびＳＶ４０プールの力価よりも顕著に高かった。逆に、遺伝子のコピー数は、同じような傾向を示した。これらのデータが意味するのは、ＳＩＮ－ＬＴＲプラスミドにより、コピー数および挿入部位が多く、活性が高いものが選抜されたということである。
別の実験を図４に示す。驚くべきことに、ｐＳＩＮプールの回復時間は、ＳＶ４０プールまたはＷＴ－ＬＴＲプールと同程度であった。つまり、回復時間の違いは、プロモーター活性のみでは説明できない。なぜならば、ｐＳＩＮは非常に弱いプロモーターでありながらも、迅速な回復を見せたからである。ＳＩＮ－ＬＴＲプラスミドに含まれている他の因子が、強力な選択圧の原因であるに違いない。何らかの特定の作用機序に限定するものではないが、弱いプロモーターと長い転写物（これには第２オープンリーディングフレームも含まれている）との組合せが、ＧＳの転写効率または翻訳効率に影響しているのではないかと考えられる。同様に、何らかの特定の作用機序に限定するものではないが、ＥＰＲに弱いコザック配列が存在すると判明しているものは、翻訳に異常を来し、ＧＳタンパク質の翻訳効率が低下する。
〔実施例２〕
ＧＰＥｘブーストの概念は、他の非ウイルス性の遺伝子挿入技術（トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼまたはＣＲＩＳＰＲによる遺伝子挿入）と組合せて利用することもできる。ＧＰＥｘ技術は、ゲノムの中でも活性の高い部位に、非ウイルス性挿入技術のための認識配列を多数配置できる。そして、得られる「ドック」細胞株を、トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼまたはＣａｓ９の発現プラスミドと、同系の認識配列、ＧＳ選択マーカーおよび発現させるべき遺伝子産物を有している導入遺伝子プラスミドとで、一時的にコトランスフェクトできる。トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼまたはＣａｓ９は、導入遺伝子プラスミドの一部または全部がドック部位に挿入されるのを仲介する。得られる細胞株は、ゲノム中でも活性が高いドック部位に挿入された導入遺伝子プラスミドを、複数コピー有している。利用できる技術／酵素のいくつかの例としては、ｐｉｇｇｙｂａｃｋトランスポザーゼ、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ、Ｍｏｓ１トランスポザーゼ、Ｔｏｌ２トランスポザーゼ、Ｌｅａｐｉｎトランスポザーゼ、λリコンビナーゼ、ＦＬＰ／ＦＲＴ、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、ｍＭＬＶインテグラーゼ、Ｒｅｐ７８インテグラーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、および種々のＣＲＩＳＰＲが挙げられる。本発明者らが最初にこの概念を試験した際には、Ｐｈｉ３１インテグラーゼシステムとＧＰＥｘ技術との組合せを利用した。
レトロベクターの産生および形質導入によるドック親細胞株の作出：ドックコンストラクト（図７、８）を、ＭＬＶ ｇａｇタンパク質、ｐｒｏタンパク質およびｐｏｌタンパク質を構成的に産出しているＨＥＫ２９３細胞株に導入した。発現プラスミドが格納されているエンベロープと、各遺伝子コンストラクトとをコトランスフェクトした。コトランスフェクションにより、機能不全のレトロベクターが高力価で複製された。これを超遠心により濃縮して、ＣＨＯＺＮチャイニーズハムスター卵巣親細胞株への形質導入に利用した（１，２）。５ラウンドの連続する形質導入を実施した。６ｍＭのグルタミンを添加した培地で細胞を定常的に維持した。同じ方法を利用して、第２のドック細胞株プールを首尾よく作出した。このドック細胞株プールは、若干異なるドック遺伝子コンストラクトを使用したものである（図９、１０を参照）。
トランスフェクションおよびドック細胞株プールの選抜：組込み前混合物により、１５００万個の細胞をインキュベートした。組込み前混合物には、合計１μｇのプラスミド導入遺伝子（図１１、１２）およびインテグラーゼＤＮＡ（図５、６）と、４μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ（ＴＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とが含まれており、最終体積は２５０μＬであった。６ｍＭのグルタミンを添加した培地の存在下において、生存率が９５％超に戻るまで細胞株プールを回復させた。次に、グルタミンを含んでいない培地に細胞を移植した。選抜した細胞プールの生存率が９５％超に戻るまで、生存率をモニタリングし、毎週培地を交換した。
組換えの定量化：Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＥａｓｙ ｋｉｔを用いて、３００万個の細胞からゲノムＤＮＡを単離した。組換えの結果、ＡｔｔＲは、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間に存在することになる。ｓｙｂｒ－ｇｒｅｅｎ ｄｙｅを用いた定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）により、細胞中のａｔｔＲを定量した。この際、ドックに含まれているａｔｔＰ配列中のフォワードプライマーと、導入遺伝子プラスミドに含まれているａｔｔＢ配列中のリバースプライマーとを使用した。このプライマー対を用いて増幅すると、ドックに組換えられた導入遺伝子プラスミドのみが検出され、遊離状態の導入遺伝子プラスミド、ランダムに組込まれた導入遺伝子プラスミドおよびｐｓｅｕｄｏ ａｔｔＰに組込まれた導入遺伝子プラスミドは検出されない。また、このプライマー対によれば、組換えられていない（空の）ドック配列も検出されない。このプライマーセットおよびＣＨＯに内在するレファレンス遺伝子のプライマーセットについて、蛍光強度閾値を超えるために必要なＰＣＲのサイクル数（Ｃｔ値）を決定した。ａｔｔＲプライマーセットのＣｔ値からレファレンス遺伝子のＣｔ値を引いて、遺伝子コピー指数（ＧＣＩ）を計算した。注意されたいことには、その性質上、ＧＣＩ値は対数であって線形ではない。それゆえ、スケールの下限における１単位の変化（例えば、ＧＣＩ＝１からＧＣＩ＝３への変化）は、ごく少数のコピー数の違いを表している。一方、スケールの上限における１単位の変化（例えば、ＧＣＩ＝６からＧＣＩ＝７への変化）は、大量のコピー数の違いでありうる。いくつかの例では、既知の濃度の所望のアンプリコンを有しているプラスミドをＱＰＣＲに課した。このデータを線形回帰分析して、存在するコピー数をより正確に決定した。
［結果］
ＧＰＥｘ技術を利用した５ラウンドの連続する形質導入により、ＰｈｉＣ３１ ａｔｔＰ認識配列（図７、８）を有しているドックをＣＨＯＺＮ細胞のゲノム中に配置した。得られた細胞プールは、１細胞あたり平均して、約３６個のドックのコピーを有していた。ドック細胞プールを、導入遺伝子－プロモーター－Ａｎｙｗａｙプラスミド（図１１、１２）およびインテグラーゼプラスミド（図５、６）でコトランスフェクトした。両者の比率は、（１：５０）～（１：１）の範囲で変化させた（この範囲は、既報（Groth, 2000: Andreas, 2002: Farruggio, 2012）において示唆されていた範囲である）。導入遺伝子－プロモーター－Ａｎｙｗａｙプラスミドは、ＰｈｉＣ３１ ａｔｔＢ認識配列、弱いｐｒｏｖｉｒａｌ－ＳＩＮ－ＬＴＲ（自己不活性化長末端反復）プロモーターに駆動されたグルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子、試験物質であるＦｃ融合タンパク質、強力なプロモーターに駆動されたＡｎｙｗａｙを有している。トランスフェクションから３日後かつ選抜前にＱＰＣＲを行い、組換えを定量した。しかし、バックグラウンド（遺伝子コピー指数（ＧＣＩ）：約－１０）を超えるａｔｔＲ（組換えの上流産物であり、ａｔｔＰおよびａｔｔＢの間に位置する）のレベルは検出不能であった。トランスフェクトした細胞をグルタミン欠乏選抜にかけると、２５日間以上は回復しなかった。これは、組込みおよびＧＳ発現が充分なレベルで発生しなかったことを表している。
組換え頻度を向上させる試みの中で本発明者らが推論したところによると、インテグラーゼと導入遺伝子プラスミドとの比率が効率的な組換えにとって重要なパラメータとなる。この可能性を検討するために、ある比率範囲の導入遺伝子－プロモーター－Ａｎｙｗａｙプラスミドおよびインテグラーゼプラスミドで、ドック細胞プールをコトランスフェクトした。トランスフェクションから３日後かつ選抜前にＱＰＣＲを行い、組換えを定量した（図２９）。導入遺伝子：インテグラーゼ比率が低いとき（１：２０～１００）、ａｔｔＲのＧＣＩはバックグラウンドレベルに近い－１０であった（この導入遺伝子：インテグラーゼ比率は、先行文献において通常に使われていたものである）。驚くべきことに、本発明者らが見出したところによると、導入遺伝子：インテグラーゼ比率が高いとき（５～１００：１）、ａｔｔＲのＧＣＩは－３であった。これは、導入遺伝子：インテグラーゼ比率が低い場合よりも、コピー数が約２００倍多いことになる。
次に、予備選抜におけるａｔｔＲのＧＣＩが最も高かったサンプルに対して、グルタミンを欠乏させる選抜を実施した（図３０）。このプールでは、選抜から９日目に回復が始まった。完全に回復した後に、ＱＰＣＲを実施した（図３１）。その結果、このプールは、１細胞あたり最大で約２８コピーの導入遺伝子を有していることが分かった。このデータが表すところによると、導入遺伝子：インテグラーゼ比率を高くすることにより効率的に組込みを生じさせることができ、平均して約３６個のドックを有しているプールにおいて、１細胞あたり平均して２８個の導入遺伝子を組込める。さらに、先行文献に見られる導入遺伝子：インテグラーゼ比率が低いときの組換えのレベルよりも、この組換えのレベルは約２桁高い。
〔実施例３〕
１細胞あたり約３６個のコピーを有しているドックプールのうち約８０％が充填されたことを観察した。そこで、本発明者らは次に、３６個超のドック有しているドックプールを使用すれば、組込まれる導入遺伝子プラスミドの数をさらに増やせるかどうかを探索することにした。また、本発明者らは、ＧＳプロモーターを有していない導入遺伝子プラスミドでもこのシステムで使用できるかどうかを探索することにした。このようなプラスミドは、ドックに組換えられた場合にのみＧＳを発現し耐性を確立する。そして、ランダムに組込まれた場合やｐｓｅｕｄｏ ａｔｔＰに組込まれた場合にはＧＳを発現しない。
レトロベクターの産生および形質導入によるドック親細胞株の作出：ドックコンストラクト（図７、８）を、ＭＬＶ ｇａｇタンパク質、ｐｒｏタンパク質およびｐｏｌタンパク質を構成的に産出しているＨＥＫ２９３細胞株に導入した。発現プラスミドが格納されているエンベロープと、各遺伝子コンストラクトとをコトランスフェクトした。コトランスフェクションにより、機能不全のレトロベクターが高力価で複製された。これを超遠心により濃縮して、ＣＨＯＺＮチャイニーズハムスター卵巣親細胞株への形質導入に利用した（１，２）。９ラウンドの連続する形質導入を実施した。６ｍＭのグルタミンを添加した培地で細胞を定常的に維持した。
トランスフェクションおよびドック細胞株プールの選抜：組込み前混合物により、３００万個の細胞をインキュベートした。組込み前混合物には、合計２μｇのプラスミド導入遺伝子およびインテグラーゼプラスミドＤＮＡと、８μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ（ＴＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とが含まれており、最終体積は５００μＬであった。６ｍＭのグルタミンを添加した培地の存在下において、生存率が９５％超に戻るまで細胞株プールを回復させた。次に、グルタミンを含んでいない培地に細胞を移植した。選抜した細胞プールの生存率が９５％超に戻るまで、生存率をモニタリングし、毎週培地を交換し、細胞を継代培養した。
組換えの定量化：Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＥａｓｙ ｋｉｔを用いて、３００万個の細胞からゲノムＤＮＡを単離した。組換えの結果、ＡｔｔＲは、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間に存在することになる。ｓｙｂｒ－ｇｒｅｅｎ ｄｙｅを用いた定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）により、細胞中のａｔｔＲを定量した。この際、ドックに含まれているａｔｔＰ配列中のフォワードプライマーと、導入遺伝子に含まれているａｔｔＢ配列中のリバースプライマーとを使用した。このプライマー対を用いて増幅すると、ドックに組換えられた導入遺伝子プラスミドのみが検出され、遊離状態の導入遺伝子プラスミド、ランダムに組込まれた導入遺伝子プラスミドおよびｐｓｅｕｄｏ ａｔｔＰに組込まれた導入遺伝子プラスミドは検出されない。また、このプライマー対によれば、組換えられていない（空の）ドック配列も検出されない。このプライマーセットおよびＣＨＯに内在するレファレンス遺伝子のプライマーセットについて、蛍光強度閾値を超えるために必要なＰＣＲのサイクル数（Ｃｔ値）を決定した。ａｔｔＲプライマーセットのＣｔ値からレファレンス遺伝子のＣｔ値を引いて、遺伝子コピー指数（ＧＣＩ）を計算した。注意されたいことには、その性質上、ＧＣＩ値は対数であって線形ではない。それゆえ、スケールの下限における１単位の変化（例えば、ＧＣＩ＝１からＧＣＩ＝３への変化）は、ごく少数のコピー数の違いを表している。一方、スケールの上限における１単位の変化（例えば、ＧＣＩ＝６からＧＣＩ＝７への変化）は、大量のコピー数の違いでありうる。いくつかの例では、既知の濃度の所望のアンプリコンを有しているプラスミドをＱＰＣＲに課した。このデータを線形回帰分析して、存在するコピー数をより正確に決定した。
［結果］
ＧＰＥｘ技術を利用した９ラウンドの連続する形質導入により、ＰｈｉＣ３１ ａｔｔＰ認識配列を有しているドックをＣＨＯＺＮ細胞のゲノム中に配置した。得られた細胞プールにおけるＥＰＲのＧＣＩは６．７であり、１細胞あたり平均して約１３５個のドックのコピーを有していた。ドック細胞プールを、導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミド（図１３、１４）およびインテグラーゼプラスミド（図５、６）でコトランスフェクトした。両者の比率は、（５０：１）～（４００：１）の範囲で変化させた。次に、グルタミンを欠乏させて選抜した。最低点（最小値）における生存率は、１細胞あたり約３６個のコピーを有しているドック株よりも高かった（図３２）。ＡｔｔＲのＧＣＩも、約３６個のコピーを有しているドック細胞株より高かった（図３３）。導入遺伝子：インテグラーゼ比率を高めるとＧＣＩが増加することから示唆されるように、導入遺伝子：インテグラーゼ比率を高めドック数を増やしたならば、組込まれた導入遺伝子の数をさらに増加させられる可能性がある。また、ＧＳ用のプロモーターを有していない導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミド（図１３、１４）を用いた場合における、選抜からの回復のロバスト性も実証された。この回復は、ドックに含まれている弱いＳＩＮ－ＬＴＲプロモーターに依っているに違いない。
〔実施例４〕
ドック部位をさらに増やし、導入遺伝子：インテグラーゼ比率をさらに高めることにより、組込まれた導入遺伝子の数を増加させることができた。そこで、本発明者らは次に、ドックのコピー数が１３５個以上であるドックプールから、ドックのコピー数が多いクローンを単離し、導入遺伝子プラスミド：インテグラーゼプラスミド比率をさらに高めるにより、組込まれた導入遺伝子プラスミドの数がさらに増加するかどうかを探索することにした。また、本発明者らは、より大型のプラスミドをこの技術により挿入できるかどうかを探索することにした。
ドック親細胞株のクローニング：Ｂｅａｃｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ）を用いて、９ラウンドの連続する形質導入により作出したドック細胞プールをクローニングした。クローンを増殖させ、ＱＰＣＲによってスクリーニングした。ドックの挿入数が最も多いクローンを選抜した。
トランスフェクションおよびドック細胞株プールの選抜：組込み前混合物により、３００万個の細胞をインキュベートした。組込み前混合物には、合計２μｇのプラスミド導入遺伝子およびインテグラーゼＤＮＡと、８μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ（ＴＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とが含まれており、最終体積は５００μＬであった。６ｍＭのグルタミンを添加した培地の存在下において、生存率が９５％超に戻るまで細胞株プールを回復させた。次に、グルタミンを含んでいない培地に細胞を移植した。選抜した細胞プールの生存率が９５％超に戻るまで、生存率をモニタリングし、毎週培地を交換した。
組換えの定量化：Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＥａｓｙ ｋｉｔを用いて、３００万個の細胞からゲノムＤＮＡを単離した。組換えの結果、ＡｔｔＲは、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間に存在することになる。ｓｙｂｒ－ｇｒｅｅｎ ｄｙｅを用いた定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）により、細胞中のａｔｔＲを定量した。この際、ドックに含まれているａｔｔＰ配列中のフォワードプライマーと、導入遺伝子に含まれているａｔｔＢ配列中のリバースプライマーとを使用した。このプライマー対を用いて増幅すると、ドックに組換えられた導入遺伝子プラスミドのみが検出され、遊離状態の導入遺伝子プラスミド、ランダムに組込まれた導入遺伝子プラスミドおよびｐｓｅｕｄｏ ａｔｔＰに組込まれた導入遺伝子プラスミドは検出されない。また、このプライマー対によれば、組換えられていない（空の）ドック配列も検出されない。このプライマーセットおよびＣＨＯに内在するレファレンス遺伝子のプライマーセットについて、蛍光強度閾値を超えるために必要なＰＣＲのサイクル数（Ｃｔ値）を決定した。ドックのＥＰＲ部位（図５、６）に特異的なプライマーを用いて、ＥＰＲのＧＣＩに基づいてクローンをランク付けした。ａｔｔＲプライマーセットのＣｔ値からレファレンス遺伝子のＣｔ値を引いて、遺伝子コピー指数（ＧＣＩ）を計算した。注意されたいことには、その性質上、ＧＣＩ値は対数であって線形ではない。それゆえ、スケールの下限における１単位の変化（例えば、ＧＣＩ＝１からＧＣＩ＝３への変化）は、ごく少数のコピー数の違いを表している。一方、スケールの上限における１単位の変化（例えば、ＧＣＩ＝６からＧＣＩ＝７への変化）は、大量のコピー数の違いでありうる。いくつかの例では、既知の濃度の所望のアンプリコンを有しているプラスミドをＱＰＣＲに課した。このデータを線形回帰分析して、存在するコピー数をより正確に決定した。
流加生産：流加生産に際しては、２０ｍＬのＥｘ－Ｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｄ－Ｂａｔｃｈ（ＴＭ）培地（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）中の６００，０００個／ｍＬの細胞を、５０ｍＬの遠心チューブに播種した。そして、加湿条件下（７０～８０％）、２５０ｒｐｍ、５％ＣＯ２存在下、３７℃（最初の４日間は３４℃）にて、振盪インキュベーターでインキュベートした。第２日以降、培地を１日おきに供給した。供給量は、供給する培地が６．２５％（ｖ／ｖ）となる量とした。供給する培地は、６６％のＥｘ－ｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ １（ＴＭ）と、３３％のＣｅｌｌｖｅｎｔｏ ４Ｆｅｅｄ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）とを含んでいた。グルコースを毎日モニタリングして、５ｇ／Ｌ未満にレベルが低下したときにはこれを補った。生存率が７０％以下になった時点または第２０日が終了した時点で培養を終了させた。
［結果］
ドックのコピー数が多いクローンを単離するために、Ｂｅａｃｏｎ（Ｒ） ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ）を用いて、９ラウンドの形質導入により作出したドック細胞プールを１細胞クローニングした。クローンを単離し、増殖させ、ドックのＥＰＲ領域に特異的なプライマーを用いてＱＰＣＲに課した。クローン１Ｆ７は、１細胞あたり約１８１コピーのドックプラスミドを有しており、これを以降の実験のために選抜した。ドッククローン１Ｆ７を、抗体の軽鎖および重鎖を発現している導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＨＷプラスミド（図２７、２８）と、インテグラーゼプラスミド（図５、６）とでコトランスフェクトした。両者の比率は、（５０：１）～（８０００：１）の範囲で変化させた。得られたプールを、グルタミンを欠乏させて選抜した（図３４）。２種類のプラスミドの比率が４０００：１または８０００：１であったプールは、選抜を通過できなかった。選抜を通過したプールおいて、ａｔｔＲをＱＰＣＲ分析した（図３５）。これが示すように、少なくとも９．８キロ塩基までの大型のプラスミドは、この技術によって効率的に組込める。このサイズにおける導入遺伝子プラスミド：インテグラーゼプラスミド比率の最適値は、５００：１である。
〔実施例５〕
ドッククローン１Ｆ７においては組込み効率が比較的高いことを確認した。そこで、本発明者らは次に、組込まれた導入遺伝子が高レベルであったプールに由来するクローンにより、導入遺伝子の組込みレベルをさらに高められるかどうかを探索することにした。また、これらのクローンの生産能力を決定することにした。
トランスフェクションおよびドック細胞株プールの選抜：組込み前混合物により、３００万個の細胞をインキュベートした。組込み前混合物には、合計２μｇのプラスミド導入遺伝子（図１３、１４）およびインテグラーゼＤＮＡ（図５、６）と、８μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ（ＴＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とが含まれており、最終体積は５００μＬであった。６ｍＭのグルタミンを添加した培地の存在下において、生存率が９５％超に戻るまで細胞株プールを回復させた。次に、グルタミンを含んでいない培地に細胞を移植した。選抜した細胞プールの生存率が９５％超に戻るまで、生存率をモニタリングし、毎週培地を交換した。
組込まれた導入遺伝子を有しているプールのクローニング：Ｂｅａｃｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ）を用いて、組込まれた導入遺伝子を有しているプールをクローニングした。Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（Ｒ） ａｓｓａｙにより、クローンの相対的な生産性を測定した。生産性が最も高いクローンを機器から取出して増殖させた。
組換えの定量化：Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＥａｓｙ ｋｉｔを用いて、３００万個の細胞からゲノムＤＮＡを単離した。組換えの結果、ＡｔｔＲは、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間に存在することになる。ｓｙｂｒ－ｇｒｅｅｎ ｄｙｅを用いた定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）により、細胞中のａｔｔＲを定量した。この際、ドックに含まれているａｔｔＰ配列中のフォワードプライマーと、導入遺伝子に含まれているａｔｔＢ配列中のリバースプライマーとを使用した。このプライマー対を用いて増幅すると、ドックに組換えられた導入遺伝子プラスミドのみが検出され、遊離状態の導入遺伝子プラスミド、ランダムに組込まれた導入遺伝子プラスミドおよびｐｓｅｕｄｏ ａｔｔＰに組込まれた導入遺伝子プラスミドは検出されない。また、このプライマー対によれば、組換えられていない（空の）ドック配列も検出されない。このプライマーセットおよびＣＨＯに内在するレファレンス遺伝子のプライマーセットについて、蛍光強度閾値を超えるために必要なＰＣＲのサイクル数（Ｃｔ値）を決定した。組込まれていないドックにのみ存在するａｔｔＰに特異的なプライマーを用いて、ドックの充填率を推定した。ａｔｔＲプライマーセットのＣｔ値からレファレンス遺伝子のＣｔ値を引いて、遺伝子コピー指数（ＧＣＩ）を計算した。注意されたいことには、その性質上、ＧＣＩ値は対数であって線形ではない。それゆえ、スケールの下限における１単位の変化（例えば、ＧＣＩ＝１からＧＣＩ＝３への変化）は、ごく少数のコピー数の違いを表している。一方、スケールの上限における１単位の変化（例えば、ＧＣＩ＝６からＧＣＩ＝７への変化）は、大量のコピー数の違いでありうる。いくつかの例では、既知の濃度の所望のアンプリコンを有しているプラスミドをＱＰＣＲに課した。このデータを線形回帰分析して、存在するコピー数をより正確に決定した。
［結果］
ドッククローン１Ｆ７に、導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミド（図１３、１４）およびインテグラーゼプラスミド（図５、６）をコトランスフェクトした。得られたプールを、グルタミンを欠乏させて選抜した。選抜されたプールにおけるａｔｔＲのＧＣＩは、６．９であった。Ｂｅａｃｏｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ）を用いて、このプールを１細胞クローニングした。Ｓｐｏｔｌｉｇｈｔ（Ｒ） ａｓｓａｙにより、相対的なＡｎｙｗａｙの発現に基づいてクローンをランク付けし、取出した。２７種類のクローンを増殖させた。これらのクローンにおけるＡｔｔＲのＧＣＩは、５．２～７．５であった（図３６）。また、空のドックを測定するために、これらのクローンにおけるＡｔｔＰのＧＣＩも測定した。これにより、各クローンにおけるドックの充填率が推定できた（図３６）。クローンの平均充填率は、６５％であった。つまり、組込まれた導入遺伝子プラスミドは、約１１８コピーであった。クローン１Ｂ７におけるａｔｔＲのＧＣＩは、７．５であった。これは、親であるドッククローン１Ｆ７におけるａｔｔＰ（空のドック）のＧＣＩと同等であった。驚くべきことに、２種類の異なるプライマー対を用いても、このクローンからはａｔｔＰが検出されなかった。このデータが表すところによると、驚くべきことに、１回のみのトランスフェクション後であっても、導入遺伝子が充填されたドック部位を約１８１個有しているクローンが得られる。
クローンのタンパク質産生能を決定するために、全てのクローンに対して、一般的な流加生産性分析を実施した。最終的な力価を図３６に示す。ａｔｔＲのＧＣＩレベルが高いことと、最終力価が高いことの間に関連性が見られた（図３７）。このことが示すところによると、予想通り、活性の高いドック部位への導入遺伝子の標的化された組込みが増加すると、細胞株におけるタンパク質産生能も向上する。また、このデータが示唆するところによると、約１８１コピーが組込まれた状態であっても、細胞の産生能は飽和していない。
〔実施例６〕
ドッククローン１Ｆ７における組込み効率および融合タンパク質の発現が比較的高いことを確認した。そこで、本発明者らは次に、同じ導入遺伝子プラスミドに重鎖および軽鎖が含まれているモノクローナル抗体の組込みおよび発現に、このシステムを利用できるかどうかを決定した。
トランスフェクションおよびドック細胞株プールの選抜：組込み前混合物により、３００万個の細胞をインキュベートした。組込み前混合物には、合計２μｇのプラスミド導入遺伝子およびインテグラーゼＤＮＡと、８μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ（ＴＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とが含まれており、最終体積は５００μＬであった。６ｍＭのグルタミンを添加した培地の存在下において、生存率が９５％超に戻るまで細胞株プールを回復させた。次に、グルタミンを含んでいない培地に細胞を移植した。選抜した細胞プールの生存率が９５％超に戻るまで、生存率をモニタリングし、毎週培地を交換した。
組換えの定量化：Ｑｉａｇｅｎ ＤＮＥａｓｙ ｋｉｔを用いて、３００万個の細胞からゲノムＤＮＡを単離した。組換えの結果、ＡｔｔＲおよびａｔｔＬは、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間に存在することになる。ｓｙｂｒ－ｇｒｅｅｎ ｄｙｅを用いた定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）により、細胞中のａｔｔＲを定量した。この際、ドックに含まれているａｔｔＰ配列中のフォワードプライマーと、導入遺伝子に含まれているａｔｔＢ配列中のリバースプライマーとを使用した。このプライマー対を用いて増幅すると、ドックに組換えられた導入遺伝子プラスミドのみが検出され、遊離状態の導入遺伝子プラスミド、ランダムに組込まれた導入遺伝子プラスミドおよびｐｓｅｕｄｏ ａｔｔＰに組込まれた導入遺伝子プラスミドは検出されない。また、このプライマー対によれば、組換えられていない（空の）ドック配列も検出されない。このプライマーセットおよびＣＨＯに内在するレファレンス遺伝子のプライマーセットについて、蛍光強度閾値を超えるために必要なＰＣＲのサイクル数（Ｃｔ値）を決定した。組込まれていないドックにのみ存在するａｔｔＰに特異的なプライマーを用いて、ドックの充填率を推定した。ａｔｔＲプライマーセットのＣｔ値からレファレンス遺伝子のＣｔ値を引いて、遺伝子コピー指数（ＧＣＩ）を計算した。注意されたいことには、その性質上、ＧＣＩ値は対数であって線形ではない。それゆえ、スケールの下限における１単位の変化（例えば、ＧＣＩ＝１からＧＣＩ＝３への変化）は、ごく少数のコピー数の違いを表している。一方、スケールの上限における１単位の変化（例えば、ＧＣＩ＝６からＧＣＩ＝７への変化）は、大量のコピー数の違いでありうる。いくつかの例では、既知の濃度の所望のアンプリコンを有しているプラスミドをＱＰＣＲに課した。このデータを線形回帰分析して、存在するコピー数をより正確に決定した。
流加生産：２０ｍＬのＥｘ－Ｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｄ－Ｂａｔｃｈ（ＴＭ）培地（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）中の６００，０００個／ｍＬの細胞を、５０ｍＬの遠心チューブに播種した。そして、加湿条件下（７０～８０％）、２５０ｒｐｍ、５％ＣＯ２存在下、３７℃（最初の４日間は３４℃）にて、振盪インキュベーターでインキュベートした。第２日以降、培地を１日おきに供給した。供給量は、供給する培地が６．２５％（ｖ／ｖ）となる量とした。供給する培地は、６６％のＥｘ－ｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ １（ＴＭ）と、３３％のＣｅｌｌｖｅｎｔｏ ４Ｆｅｅｄ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）とを含んでいた。グルコースを毎日モニタリングして、５ｇ／Ｌ未満にレベルが低下したときにはこれを補った。生存率が７０％以下になった時点または第２０日が終了した時点で培養を終了させた。
タンパク質のゲル電気泳動：流加生産（上記を参照）の上清を回収して清澄化させた。３μｇの各抗体またはＦｃ融合タンパク質をＬＤＳローディングバッファと混合した。このとき、変性剤を加える群と加えない群とを用意した。変性させたサンプルは、電気泳動に先立って、７０℃にて１０分間加熱した。全てのサンプルをＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードし、１×ＭＥＳバッファ中で、６０Ｖにて１５分間電気泳動させ、その後１００Ｖにて１０５分間電気泳動させた。ゲルを脱イオン水でリンスして、ＳＹＰＲＯ－Ｒｕｂｙで染色した。染色したゲルを画像化した。そのネガ像（色反転像）を図４０に示す。
［結果］
モノクローナル抗体の発現および精製は、発現する軽鎖および重鎖の相対量に敏感に反応することがよく知られている。本発明者らのシステムは、軽鎖および重鎖の遺伝子比率が１：１で組込まれるように設計されている。各鎖の相対な発現を最適化するために、遺伝子の順序およびエンハンサー因子が異なる４種類の発現コンストラクトを設計および試験した（図２１～２８を参照）。試験したコンストラクトは全て、ＧＳのプロモーターを有しておらず、重鎖および軽鎖の遺伝子に対しては強力なプロモーターおよびポリＡ配列を有していた。第１コンストラクトをＨＷＩＬと称する（コンストラクト間の違いをハイライトで表している）。ＨＷＩＬにおいて、重鎖コーディング配列（Ｈ）は、プロモーターの上流において発現しており、ウッドチャック転写後調節因子（ＷまたはＷＰＲＥ）がその後に存在する。軽鎖コーディング配列（Ｌ）は、プロモーターの下流において発現しており、その前にイントロン配列（Ｉ）がその前に存在する。残る３種類の発現コンストラクトでも、同じ表記法を採用している。ドックのコピーを約１８１個有しているドッククローン１Ｆ７を、４種類の導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙプラスミド（図２１および２２、図２３および２４、図２５および２６、図２７および２８）または導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミド（図１３、１４）の各々と、インテグラーゼプラスミド（図５、６）とでコトランスフェクトした。得られたプールを、グルタミンを欠乏させて選抜した（図３８）。興味深いことに、ＬＷＩＨプラスミドでトランスフェクトしたプールは、他のプラスミドでトランスフェクトしたプールよりも、選抜からの回復が遅かった。得られたプールをＱＰＣＲ分析した（図３８）。これの示すところによると、高レベルでの導入遺伝子の組込みが達成できた。この点は、プラスミドのサイズが大きくなったにも関わらず、これまでの実施例と同様である。また、流加生産性により、これらのプールのタンパク質産生能を決定した（図３９）。４種類の発現プラスミドのうち３種類までにおいて強力な発現が見られ、最も高い力価はＨＷＩＬおよびＬＷＨＷで見られた。得られたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析した（図４０）。このとき、還元した群と還元しなかった群とを用意した。これにより、重鎖および軽鎖の相対的な発現および成熟抗体への組立てを評価した。４種類の発現プラスミドの全てにおいて、遊離した軽鎖および重鎖よりも、成熟抗体（１５０ｋＤａ）を形成した割合の方が高かった。４種類の抗体発現プラスミドの全てにおいては、軽鎖の発現の方が僅かに過剰であった。このことは、タンパク質Ａの精製において遊離重鎖の精製を最小化するためには望ましい。同様に、単鎖の融合タンパク質（Ａｎｙｗａｙ）の発現から分かるように、力価が高く（図３９）、予想される大きさの成熟した二量体化タンパク質に大部分がなっていた。
〔実施例７〕
本発明者らは次に、この技術により作出したプールの生産安定性を決定しようとした。生産安定性は、工業化に必要な条件である。
レトロベクターの産生および形質導入によるドック親細胞株の作出：ドックコンストラクト（図７、８）を、ＭＬＶ ｇａｇタンパク質、ｐｒｏタンパク質およびｐｏｌタンパク質を構成的に産出しているＨＥＫ２９３細胞株に導入した。発現プラスミドが格納されているエンベロープと、各遺伝子コンストラクトとをコトランスフェクトした。コトランスフェクションにより、機能不全のレトロベクターが高力価で複製された。これを超遠心により濃縮して、ＣＨＯＺＮチャイニーズハムスター卵巣親細胞株への形質導入に利用した（１，２）。５ラウンドの連続する形質導入を実施した。６ｍＭのグルタミンを添加した培地で細胞を定常的に維持した。
トランスフェクションおよびドック細胞株プールの選抜：組込み前混合物により、３００万個の細胞をインキュベートした。組込み前混合物には、合計２μｇのプラスミド導入遺伝子およびインテグラーゼプラスミドＤＮＡと、８μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ（ＴＭ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とが含まれており、最終体積は５００μＬであった。６ｍＭのグルタミンを添加した培地の存在下において、生存率が９５％超に戻るまで細胞株プールを回復させた。次に、グルタミンを含んでいない培地に細胞を移植した。選抜した細胞プールの生存率が９５％超に戻るまで、生存率をモニタリングし、毎週培地を交換した。
流加生産（Ｅｘ－Ｃｅｌｌ）：２０ｍＬのＥｘ－Ｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｄ－Ｂａｔｃｈ（ＴＭ）培地（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）中の６００，０００個／ｍＬの細胞を、５０ｍＬの遠心チューブに播種した。そして、加湿条件下（７０～８０％）、２５０ｒｐｍ、５％ＣＯ２存在下、３７℃（最初の４日間は３４℃）にて、振盪インキュベーターでインキュベートした。第２日以降、培地を１日おきに供給した。供給量は、供給する培地が６．２５％（ｖ／ｖ）となる量とした。供給する培地は、６６％のＥｘ－ｃｅｌｌ Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣＨＯ Ｆｅｅｄ １（ＴＭ）と、３３％のＣｅｌｌｖｅｎｔｏ ４Ｆｅｅｄ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）とを含んでいた。グルコースを毎日モニタリングして、５ｇ／Ｌ未満にレベルが低下したときにはこれを補った。生存率が７０％以下になった時点または第２０日が終了した時点で培養を終了させた。
流加生産（ＡｃｔｉＰｒｏ）：２０ｍＬのＨｙＣｌｏｎｅ ＡｃｔｉＰｒｏ（ＴＭ）培地（Ａｃｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）中の６００，０００個／ｍＬの細胞を、５０ｍＬの遠心チューブに播種した。そして、加湿条件下（７０～８０％）、２５０ｒｐｍ、５％ＣＯ２存在下、３７℃（最初の５日間は３４℃）にて、振盪インキュベーターでインキュベートした。第２日以降、培地を１日おきに供給した。供給量は、供給する各培地が３％（ｖ／ｖ）となる量とした。供給する培地は、Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ＡおよびＨｙｃｌｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ７ｂ（Ａｃｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とした。グルコースを毎日モニタリングして、５ｇ／Ｌ未満にレベルが低下したときにはこれを補った。生存率が７０％以下になった時点で培養を終了させた。
［結果］
Ａｎｙｗａｙ融合タンパク質を発現しているプールの生産安定性を決定するために、導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミド（図１３、１４）およびインテグラーゼプラスミド（図５、６）を、９ラウンドの形質導入により作出したドック細胞プールにコトランスフェクトした。得られたプールを、グルタミンを欠乏させて選抜した。３つのプールを継続的に継代して、４０世代以上にわたってアリコートを毎週凍結した。全てのプールが４０世代に到達した時点で、過去に凍結した世代のバイアルを解凍した。そして、２種類の異なる培地／添加戦略によって流加生産性を検討した。流加生産における最終力価を図４１に示す。同図から分かるように、３つのプールの全てにおいて、４０世代以上継代した培養物であってもタンパク質の力価は安定していた。このことは、組込まれた導入遺伝子プラスミドの遺伝的安定性が強固であることと、組込まれた導入遺伝子プラスミドからの発現が安定していることを表している。これらはいずれも、この技術を薬物の生産に利用するためには必要な事項である。
上記の明細書において言及した全ての出版物および特許は、参照により本明細書に組込まれる。上記に記載した本発明の方法およびシステムの種々の変更および変形例は、当業者にとって明白である。これらの変更および変形例は、本発明の範囲および趣旨を超え出るものではない。特定の好適な実施形態に絡めて本発明を説明した。しかし、理解すべきことには、特許請求の範囲に記載の発明を、特定の実施形態に過度に限定してはならない。また、本発明を実施するための上述の実施形態の種々の変形例であって、本発明の当業者にとって自明である変形例も、後述する特許請求の範囲に含まれることが意図される。
本発明の特定の実施形態における核酸コンストラクトの設計である。 トランスフェクションおよびグルタミンの欠乏による選抜後における、細胞の生存曲線のグラフである。２組のトランスフェクションの平均を示す。 異なるプラスミドを用いて作出した細胞株プールの、生産性およびコピー数の分析を表す表である。２組のトランスフェクションの平均を示す。 トランスフェクションおよびグルタミンの欠乏による選抜における、細胞の生存曲線のグラフである。２組のトランスフェクションの平均を示す。 ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ発現プラスミドのマップである。 ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ発現プラスミドの配列である。 ドックプラスミドのマップである。 ドックプラスミドの配列である。 ドック－ＷＰＲＥプラスミドのマップである。 ドック－ＷＰＲＥプラスミドの配列である。 導入遺伝子－プロモーター－Ａｎｙｗａｙプラスミドのマップである。このプラスミドにおいて、ＧＳの発現は、弱いプロモーターであるモロニーマウス肉腫ウイルスの５’プロウイルス自己不活性化長末端反復に駆動されている。 導入遺伝子－プロモーター－Ａｎｙｗａｙプラスミドの配列である。このプラスミドおよび以降の導入遺伝子プラスミドにおいては、ＧＳの発現を駆動するプロモーターは存在しない。 導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミドのマップである。 導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミドの配列である。 導入遺伝子－ＭＣＳプラスミドのマップである。 導入遺伝子－ＭＣＳプラスミドの配列である。 導入遺伝子－ＭＣＳ－ＷＰＲＥ－イントロン－ＭＣＳプラスミドのマップである。 導入遺伝子－ＭＣＳ－ＷＰＲＥ－イントロン－ＭＣＳプラスミドの配列である。 導入遺伝子－ＭＣＳ－ＷＰＲＥ－ＭＣＳ－ＷＰＲＥプラスミドのマップである。 導入遺伝子－ＭＣＳ－ＷＰＲＥ－ＭＣＳ－ＷＰＲＥプラスミドの配列である。 導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＩＬプラスミドのマップである。 導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＩＬプラスミドの配列である。 導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＩＨプラスミドのマップである。 導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＩＨプラスミドの配列である。 導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＬＷプラスミドのマップである。 導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＬＷプラスミドの配列である。 導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＨＷプラスミドのマップである。 導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＨＷプラスミドの配列である。 ドック細胞プールにおける選抜されていないａｔｔＲの遺伝子コピー指数を表すグラフである。ドッグ細胞プールは、１細胞あたり平均して約３６個のドックを有しており、導入遺伝子－プロモーター－Ａｎｙｗａｙプラスミドにより記載の比率でトランスフェクトした。 図２９に記載したいくつかのプールにおける、選抜中の生細胞の割合のグラフである。 図３０に記載した全てのプールにおける、ａｔｔＲの遺伝子コピー指数およびコピー数を表す表である。 ドック細胞プールにおける、選抜中の生細胞の割合を表すグラフである。ドッグ細胞プールは、１細胞あたり平均して約１３５個のドックを有しており、プロモーターを有していない導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミドとインテグラーゼプラスミドとにより記載の比率でトランスフェクトした。２組のプールの平均を示す。 図３２に記載のプールの、選抜後におけるａｔｔＲの遺伝子コピー指数を表す表である。２組のプールの平均を示す。 ドッククローン細胞における、選抜中の生細胞の割合を表すグラフである。ドッグクローン細胞は、１細胞あたり約１８１コピーのドックを有しており、導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＨＷプラスミドとインテグラーゼプラスミドとにより記載の比率でトランスフェクトした。２組のプールの平均を示す。 図３４に記載のプールの、選抜後におけるａｔｔＲの遺伝子コピー指数を表す表である。２組のプールの平均を示す。 ａｔｔＲ（充填されているドック）およびａｔｔＰ（空のドック）の遺伝子コピー指数、充填されているドックの割合、ならびにドックプールから作製したクローンの流加生産における最終力価表す表である。ドックプールは、１細胞あたり約１３５コピーのドックを有しており、導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙプラスミドとインテグラーゼプラスミドとによりトランスフェクトした。 図３６に記載の２５種類のクローンの、Ｅｘｃｅｌｌにおける流加生産の力価に対するａｔｔＲの遺伝子コピー指数のグラフである。 ドッククローン細胞における、選抜中の生細胞の割合を表すグラフである。ドッグクローン細胞は、１細胞あたり約１８１コピーのドックを有しており、導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＨＷプラスミド、Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＬＷプラスミド、Ｙｏｕｒｗａｙ－ＨＷＩＬプラスミド、Ｙｏｕｒｗａｙ－ＬＷＩＨプラスミドまたはＡｎｙｗａｙプラスミドのいずれかと、インテグラーゼプラスミドとによりトランスフェクトした。 図３８に記載のドックプールから作製したクローンの流加生産における、ａｔｔＲの遺伝子コピー指数および最終力価を表す表である。２組のプールの平均を示す。 導入遺伝子－Ｙｏｕｒｗａｙおよび導入遺伝子－Ａｎｙｗａｙからの産物のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。左側が非還元条件における結果であり、右側が還元条件における結果である。 ４０世代以上にわたる流加生産における最終力価を表すグラフである。２種類の異なる培地／添加戦略と、Ａｎｙｗａｙを発現している３つのプールとを使用した。

Claims (99)

  1. ５’側から３’側の順に作動可能に関連している下記の因子を有している、目的タンパク質の発現のための核酸コンストラクトであって：
    任意構成である、第１プロモーター配列；
    選択マーカー配列；
    第２プロモーター配列；
    第２プロモーター配列と作動可能に連結されており第１目的タンパク質をコードする核酸配列；および
    ポリＡシグナル配列；
    上記核酸コンストラクトは、上記任意構成である第１プロモーターまたは選択マーカー配列よりも５’側、上記ポリＡシグナル配列よりも３’側、上記任意構成である第１プロモーターと上記ポリＡシグナル配列との間、上記選択マーカーと上記第２プロモーター配列との間、ならびに、上記任意構成である第１プロモーター配列または選択マーカー配列よりも５’側および上記ポリＡシグナル配列よりも３’側の両方からなる群より選択される１つ以上に位置している、１つ以上の挿入因子をさらに有する、
    核酸コンストラクト。
  2. 上記核酸コンストラクトが、上記選択マーカーと上記第２プロモーターとの間にポリＡシグナル配列を有していない、請求項１に記載の核酸コンストラクト。
  3. 上記選択マーカーが、上記第２プロモーターに隣接している、請求項１または２に記載の核酸コンストラクト。
  4. 上記第２プロモーターが、上記第１目的タンパク質をコードする核酸配列に隣接している、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  5. 上記核酸コンストラクトが、上記第１プロモーターと上記選択マーカーとの間に、拡張パッケージング領域を有している、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  6. 上記ＥＰＲが、複数の潜在的なコザック配列および／またはＡＴＧ翻訳開始部位を有している、請求項５に記載の核酸コンストラクト。
  7. 上記第１プロモーター配列が、弱いプロモーター配列である、請求項１～６のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  8. 上記第１プロモーター配列が、ＳＩＮ－ＬＴＲプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーター配列、ファージλ ＰＬプロモーター配列、ファージλ ＰＲプロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列、Ｔ７プロモーター配列、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター配列、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター配列、α－ラクトアルブミンプロモーター配列、ヒト伸長因子１α（ｈＥＦ １α）プロモーター配列、およびマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター配列からなる群より選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  9. 上記第１プロモーター配列が、レトロウイルスのＬＴＲプロモーターではない、請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  10. 上記選択マーカー配列が、グルタミンシンターゼ（ＧＳ）配列およびジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）配列からなる群より選択される増殖可能な選択マーカー配列である、請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  11. 上記選択マーカー配列が、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）配列、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子配列およびプロマイシンＮ－アセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列からなる群より選択される抗生物質耐性のマーカー配列である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  12. 上記第２プロモーター配列が、ＳＶ４０プロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃプロモーター配列、Ｅ． ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーター配列、ファージλ ＰＬプロモーター配列、ファージλ ＰＲプロモーター配列、Ｔ３プロモーター配列、Ｔ７プロモーター配列、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター配列、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター配列、α－ラクトアルブミンプロモーター配列、ヒト伸長因子１α（ｈＥＦ １α）プロモーター配列、およびマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター配列からなる群より選択される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  13. 上記目的タンパク質をコードする核酸配列が、重鎖免疫グロブリン配列および軽鎖免疫グロブリン配列からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項１～１２のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  14. 上記挿入因子が、トランスポゾン挿入因子、リコンビナーゼ挿入因子、およびＨＤＲ挿入因子からなる群より選択される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  15. 上記トランスポゾン挿入因子が、逆方向末端反復である、請求項１４に記載の核酸コンストラクト。
  16. 上記コンストラクトが、上記第１プロモーターよりも５’側、および上記ポリＡシグナル配列よりも３’側に位置する２つの逆方向末端反復を含む、請求項１５に記載の核酸コンストラクト。
  17. 上記リコンビナーゼ挿入因子が、付着部位（ａｔｔ）である、請求項１４に記載の核酸コンストラクト。
  18. 上記付着部位（ａｔｔ）が、ａｔｔＢである、請求項１７に記載の核酸コンストラクト。
  19. 上記ＨＤＲ挿入因子が、ＡＡＶＳ１セーフ・ハーバー部位配列を有している、請求項１４に記載の核酸コンストラクト。
  20. 上記ＨＤＲ挿入因子が、染色体中の標的部位に相同的な核酸配列である、請求項１４に記載の核酸コンストラクト。
  21. 上記染色体中の標的部位に相同的な核酸配列の長さが、約３０～１０００塩基である、請求項２０に記載の核酸コンストラクト。
  22. 上記コンストラクトが、上記第１プロモーターよりも５’側、および上記ポリＡシグナル配列よりも３’側に位置する染色体中の標的部位に相同的な２つの核酸配列を含む、請求項２１に記載の核酸コンストラクト。
  23. 上記リコンビナーゼ挿入因子が、Ｆｌｐ組換え標的（ＦＲＴ）部位である、請求項１４に記載の核酸コンストラクト。
  24. 上記リコンビナーゼ挿入因子が、ＬｏｘＰ配列である、請求項１４に記載の核酸コンストラクト。
  25. ＲＮＡ輸送因子をさらに有している、請求項１～２４のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  26. 上記ＲＮＡ輸送因子が、上記目的タンパク質をコードする核酸配列よりも３’側または５’側に位置している、請求項２５に記載の核酸コンストラクト。
  27. 上記ＲＮＡ輸送因子が、ｐｒｅ－ｍＲＮＡプロセシングエンハンサー（ＰＰＥ）である、請求項２６に記載の核酸コンストラクト。
  28. 上記ＲＮＡ輸送因子が、転写後調節因子（ＰＲＥ）である、請求項２６に記載の核酸コンストラクト。
  29. 上記ＰＲＥ ＲＮＡ輸送因子が、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（ＷＰＲＥ）である、請求項２８に記載の核酸コンストラクト。
  30. 上記第１目的タンパク質と作動可能に連結されているシグナルペプチド配列をさらに有している、請求項１～２９のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  31. 上記シグナルペプチド配列が、組織プラスミノーゲン活性化因子シグナルペプチド配列、ヒト成長ホルモンシグナルペプチド配列、ラクトフェリンシグナルペプチド配列、α－カゼインシグナルペプチド配列およびα－ラクトアルブミンシグナルペプチド配列からなる群より選択される、請求項１～３０のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  32. タンパク質精製マーカー配列をさらに有している、請求項１～３１のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  33. 上記タンパク質精製マーカー配列が、ヘキサヒスチジンタグまたは血球凝集素（ＨＡ）タグである、請求項３２に記載の核酸コンストラクト。
  34. 上記第１目的タンパク質をコードする上記核酸配列よりも３’側に位置する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列、および上記第１目的タンパク質をコードする上記核酸配列よりも３’側に位置する第２目的タンパク質をコードする第２核酸配列をさらに有している、請求項１～３３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  35. 上記ＩＲＥＳ配列が、口蹄疫ウイルス（ＦＤＶ）ＩＲＥＳ配列、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ配列およびポリオウイルスＩＲＥＳ配列からなる群より選択される、請求項３４に記載の核酸コンストラクト。
  36. 上記核酸コンストラクトが、上記第１目的タンパク質をコードする上記核酸配列よりも３’側に位置する第２目的タンパク質をコードする第２核酸配列と作動可能に連結されている、第３プロモーターをさらに含む、請求項１～３３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  37. 第２目的タンパク質をコードする上記第２核酸配列と作動可能に関連している、ＲＮＡ輸送因子をさらに有している、請求項３６に記載の核酸コンストラクト。
  38. 第２目的タンパク質をコードする上記第２核酸配列と作動可能に関連している、ポリＡシグナル配列をさらに有している、請求項３６に記載の核酸コンストラクト。
  39. 上記第１目的タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖のうち一方であり、上記第２目的タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖のうち他方である、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  40. 上記核酸コンストラクトが、上記第１目的タンパク質をコードする上記核酸配列よりも３’側に位置する第２目的タンパク質をコードする第２核酸配列と作動可能に連結されている、イントロンをさらに有している、請求項１～３３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  41. 第２目的タンパク質をコードする上記第２核酸配列と作動可能に関連している、ＲＮＡ輸送因子をさらに有している、請求項４０に記載の核酸コンストラクト。
  42. 第２目的タンパク質をコードする上記第２核酸配列と作動可能に関連している、ポリＡシグナル配列をさらに有している、請求項４０に記載の核酸コンストラクト。
  43. 上記第１目的タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖のうち一方であり、上記第２目的タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖のうち他方である、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト。
  44. 前記１～４３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクトを有している、プラスミド。
  45. 前記１～４３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクトを有している、宿主細胞。
  46. 上記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＡＰ細胞、ウシ乳腺上皮細胞、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞株、ベビーハムスター腎細胞、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ヒト子宮頚癌細胞、イヌ腎細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ラット線維芽細胞、ＭＤＢＫ細胞およびヒト肝細胞癌細胞株からなる群より選択される、請求項４５に記載の宿主細胞。
  47. 上記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＣＡＰ細胞からなる群より選択される、請求項４５または４６に記載の宿主細胞。
  48. 上記宿主細胞株が、ＧＳノックアウト細胞株である、請求項４５または４６に記載の宿主細胞。
  49. 上記宿主細胞株が、ＤＨＦＲノックアウト細胞株である、請求項４５～４７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  50. 上記宿主細胞が、約１～１０００コピーの上記核酸コンストラクトを有している、請求項４５～４９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  51. 上記宿主細胞が、約１０～２００コピーの上記核酸コンストラクトを有している、請求項４５～４９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  52. 上記宿主細胞が、約１０～１００コピーの上記核酸コンストラクトを有している、請求項４５～４９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  53. 上記宿主細胞が、約２０～１００コピーの上記核酸コンストラクトを有している、請求項４５～４９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  54. 上記宿主細胞が、第２目的タンパク質をコードしており、それを発現させる第２核酸コンストラクトを少なくともさらに有しており、
    上記第２核酸コンストラクトは、選択マーカーを有していない、請求項４５～５３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  55. 上記宿主細胞は、第２目的タンパク質をコードしており、それを発現させる第２核酸コンストラクトを少なくともさらに有しており、
    上記第２核酸コンストラクトは選択マーカーを有しており、当該選択マーカーは第１核酸コンストラクトが有している選択マーカーとは異なっている、
    請求項４５～５３のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  56. 第１核酸コンストラクトが有している上記第１目的タンパク質は、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のうち一方であり、
    第２核酸コンストラクトが有している上記第２タンパク質は、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖のうち他方である、請求項５４または５５に記載の宿主細胞。
  57. 上記第１目的タンパク質は、免疫グロブリンの重鎖であり、
    上記第２目的タンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖である、
    請求項５６に記載の宿主細胞。
  58. 上記宿主細胞が、約１～１０００コピーの上記第２核酸コンストラクトを含む、請求項５４～５７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  59. 上記宿主細胞が、約１０～２００コピーの上記第２核酸コンストラクトを含む、請求項５４～５７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  60. 上記宿主細胞が、約１０～１００コピーの上記第２核酸コンストラクトを含む、請求項５４～５７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  61. 上記宿主細胞が、約２０～１００コピーの上記第２核酸コンストラクトを含む、請求項５４～５７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
  62. 請求項４５～６１のいずれか１項に記載の宿主細胞を含んでいる、宿主細胞培養物。
  63. 請求項４５～６１のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養する工程と、
    上記宿主細胞の培養物から上記目的タンパク質を精製する工程と、
    を有する、目的タンパク質の作製方法。
  64. 上記宿主細胞を、選択マーカーの阻害剤を含んでいる培地で成長させる、請求項６３に記載の作製方法。
  65. 上記選択マーカーは、ＧＳであり、
    上記阻害剤は、ホスフィノトリシンまたはメチオニンスルホキシイミン（Ｍｓｘ）である、
    請求項６４に記載の作製方法。
  66. 上記選択マーカーは、ＤＨＦＲであり、
    上記阻害剤は、メトトレキサートである、
    請求項６４に記載の作製方法。
  67. 上記１～４３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクトを含む、ベクター。
  68. 上記ベクターが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＡＡＶベクター、およびトランスポゾンベクターからなる群より選択される、請求項６７に記載のベクター。
  69. 請求項１～３０のいずれか１項に記載の第１核酸コンストラクト；および
    酵素をコードする第２核酸コンストラクト
    を含んでいる、システム。
  70. 上記酵素が、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼおよびニッカーゼからなる群より選択される、請求項６９に記載のシステム。
  71. 上記ヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼである、
    請求項７０に記載のシステム。
  72. 上記ニッカーゼが、Ｃａｓニッカーゼである、
    請求項７０に記載のシステム。
  73. １つ以上のＲＮＡガイド配列をさらに有している、請求項７１または７２記載のシステム。
  74. 上記酵素が、宿主細胞のゲノムへの核酸コンストラクトまたはその部分の挿入を促進する、請求項６９～７３のいずれか１項に記載のシステム。
  75. 上記第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトが、別個のベクター中に提供される、請求項６９～７４のいずれか１項に記載のシステム。
  76. 上記第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトが、同じベクター中に提供される、請求項６９～７４のいずれか１項に記載のシステム。
  77. 請求項１～４３のいずれか１項に記載の第３核酸コンストラクトを少なくともさらに有しており、
    当該第３核酸コンストラクトがコードする目的タンパク質が、上記第１核酸コンストラクトが有している目的タンパク質とは異なる、
    請求項６９～７６のいずれか１項に記載のシステム。
  78. 上記第３核酸コンストラクトが、別個のベクター中に提供される、請求項７７に記載のシステム。
  79. 上記第３核酸コンストラクトが、上記第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトと同じベクター中に提供される、請求項７７に記載のシステム。
  80. 請求項１～３５のいずれか１項に記載の第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトを有しており、
    上記第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトがそれぞれ、異なる目的タンパク質をコードする、
    システム。
  81. 上記第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトが、別個のベクター中に提供される、請求項８０に記載のシステム。
  82. 上記第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトが、同じベクター中に提供される、請求項８０に記載のシステム。
  83. 酵素をコードする第３核酸コンストラクトをさらに有している、請求項８０～８２のいずれか１項に記載のシステム。
  84. 上記酵素が、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼおよびニッカーゼからなる群より選択される、請求項８３に記載のシステム。
  85. 上記ヌクレアーゼが、Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項８４に記載のシステム。
  86. 上記ニッカーゼが、Ｃａｓニッカーゼである、請求項８４に記載のシステム。
  87. １つ以上のＲＮＡガイド配列をさらに有している、請求項８５または８６に記載のシステム。
  88. 上記酵素が、宿主細胞のゲノムへの核酸コンストラクトまたはその部分の挿入を促進する、請求項８３～８７のいずれか１項に記載のシステム。
  89. 上記第３核酸コンストラクトが、別個のベクター中に提供される、請求項８３～８７のいずれか１項に記載のシステム。
  90. 上記第３核酸コンストラクトが、上記第１核酸コンストラクトおよび第２核酸コンストラクトと同じベクター中に提供される、請求項８３～８７のいずれか１項に記載のシステム。
  91. 上記核酸コンストラクトが宿主細胞のゲノムに組込まれるような条件下で、請求項１～４３のいずれか１項に記載の核酸コンストラクト、請求項６７または６８に記載のベクター、または請求項６９～９０のいずれか１項に記載のシステムを宿主細胞に導入する工程と、
    上記目的タンパク質を発現する宿主細胞株を構築する工程と、
    上記目的タンパク質が宿主細胞によって作製されるような条件下で、宿主細胞株から宿主細胞を培養する工程と、
    上記宿主細胞の培養物から上記目的タンパク質を精製する工程と、
    を有する、目的タンパク質の作製方法。
  92. 上記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＡＰ細胞、ウシ乳腺上皮細胞、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞株、ベビーハムスター腎細胞、マウスセルトリ細胞、サル腎細胞、アフリカミドリザル腎細胞、ヒト子宮頚癌細胞、イヌ腎細胞、バッファローラット肝細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝細胞、マウス乳癌、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ラット線維芽細胞、ＭＤＢＫ細胞およびヒト肝細胞癌細胞株からなる群より選択される、請求項９１に記載の作製方法。
  93. 上記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびＣＡＰ細胞からなる群より選択される、請求項９２に記載の作製方法。
  94. 上記宿主細胞株が、ＧＳノックアウト細胞株である、請求項９１～９３のいずれか１項に記載の作製方法。
  95. 上記宿主細胞株が、ＤＨＦＲノックアウト細胞株である、請求項９１～９３のいずれか１項に記載の作製方法。
  96. 上記宿主細胞を、選択マーカーの阻害剤を含んでいる培地で成長させる、請求項９１～９５のいずれか１項に記載の作製方法。
  97. 上記選択マーカーは、ＧＳであり、
    上記阻害剤は、ホスフィノトリシンまたはメチオニンスルホキシイミン（Ｍｓｘ）である、
    請求項９６に記載の作製方法。
  98. 上記選択マーカーは、ＤＨＦＲであり、
    上記阻害剤は、メトトレキサートである、
    請求項９６に記載の作製方法。
  99. 上記目的タンパク質が宿主細胞によって作製されるような条件下で、宿主細胞株から宿主細胞を培養する工程が、シャーレ、ウェルプレート、ローラーボトル、バイオリアクター、灌流システムおよび流加培養物からなる群より選択されるシステムにおいて培養する工程をさらに含んでいる、請求項９１～９８のいずれか１項に記載の作製方法。
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