JP2023528477A

JP2023528477A - ポリデオキシヌクレオチド合成のための改変された鋳型非依存的酵素

Info

Publication number: JP2023528477A
Application number: JP2022574577A
Authority: JP
Inventors: ジュリーエル．タブス，; プレムシンハ，; ボグスローステック，; マシューティー．ホールデン，; クリストファーウィルソン，; ジェイ．ウィリアムエフカビッチ，; ディアンヌダブリュー．サモンド，
Original assignee: モレキュラーアッセンブリーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2021-06-03
Publication date: 2023-07-04
Also published as: KR20240016237A; CN116075593A; WO2021247851A2; WO2021247851A3; EP4162035A2; AU2021285906A1; CA3185851A1

Abstract

本発明は、鋳型を使用せずに、除去可能な３’－Ｏ－遮断部分を含むヌクレオチドを核酸イニシエータに結合させることができる、改変された末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）等のポリメラーゼを同定するための方法を含む。本発明は、同定されたポリメラーゼ、および所定のオリゴヌクレオチド配列のｄｅｎｏｖｏ合成のためにこのポリメラーゼを使用する方法をさらに含む。本発明の方法は、選択されたヌクレオチドの制御された付加のために、３’－Ｏ－遮断ヌクレオチドアナログおよびエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を使用した核酸合成を含む。

Description

関連出願
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年６月３日に出願された米国特許出願第１６／８９１，４４９号に対する優先権およびその利益を主張する。

発明の分野
本発明は、鋳型の使用を伴わない、所望の配列を有するポリヌクレオチドのｄｅｎｏｖｏ合成のための改変された酵素に関する。そのようなものとして、本発明は、研究、遺伝子操作および遺伝子療法のための、変動する配列および変動する長さのポリヌクレオチドのライブラリーを作製する能力を提供する。

背景
大部分のｄｅｎｏｖｏ核酸配列は、３０年よりも前に開発された固相ホスホルアミダイト技法を使用して合成される。この技法は、天然（または非天然）核酸塩基に対応するホスホルアミダイト試薬から築かれた配列の逐次の脱保護および合成が関与する。しかし、２００塩基対（ｂｐ）を超える長さの核酸は、高い比率の切断および副反応を経験するという点において、ホスホルアミダイト核酸合成は、長さが限定されている。その上、ホスホルアミダイト合成は、毒性副産物を産生し、この廃棄物の処分は、核酸合成機の利用能を限定し、契約オリゴ産生のコストを増加させる（オリゴヌクレオチド合成の年間需要は、アセトニトリル、トリクロロ酢酸、トルエン、テトラヒドロフランおよびピリジンを含む、３００，０００ガロンを超える有害な化学廃棄物の原因となることが推定される。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、LeProust et al., Nucleic Acids Res., vol. 38(8), p.2522-2540, (2010)を参照されたい）。よって、オリゴヌクレオチド合成のためのより効率的でかつ対費用効果の高い方法の必要がある。

ＬｅＰｒｏｕｓｔら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１０）３８（８）２５２２～２５４０

概要
本発明は、鋳型の非存在下でオリゴヌクレオチドのｄｅｎｏｖｏ合成のために使用することができる、改変された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素を開示する。
コンピュータによるガイダンスおよび飽和変異誘発の組合せと、機能的な変異体を同定するためのその後のスクリーニングにより、鋳型非依存的ポリメラーゼを創出するための方法も開示される。ネイティブＴｄＴ酵素は、非効率的であるか、または鋳型非依存的合成スキームにおいて使用される異なる遮断ヌクレオチドアナログを取り込むことが完全に不可能である。本発明は、特に、３’－Ｏ遮断基を有する遮断ヌクレオチドアナログに対して酵素の機能性を拡大する様々なＴｄＴ改変を提供する。特に、本発明の改変されたＴｄＴは、３’－Ｏ－リン酸遮断ヌクレオチドアナログを取り込むために使用することができるが、野生型ＴｄＴはそれを行うことができない可能性がある。

本発明の方法は、選択されたヌクレオチドの制御された付加のために、３’－Ｏ－遮断ヌクレオチドアナログおよびエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を使用した核酸合成を含む。

本発明の酵素および方法を使用して、より速くかつより安く、ｄｅｎｏｖｏポリヌクレオチドを合成することが可能となるであろう。そのようなものとして、本発明は、カスタム核酸を合成する全体的なコストを劇的に低下させる。特に、本方法を使用して、改変された３’ヒドロキシル遮断ヌクレオチドを使用した段階的様式でカスタムオリゴを合成することができる、鋳型非依存的トランスフェラーゼを創出することができる。末端基が原因で、合成は、新たな塩基のそれぞれの付加により休止し、その際、末端基は切断され、天然に存在するヌクレオチドと本質的に同一である（すなわち、さらなるヌクレオチド取込みのための基質として酵素によって認識される）ポリヌクレオチドを残す。

酵素は、水相の鋳型非依存的オリゴヌクレオチド合成を可能にするであろうことから、本発明の方法および酵素は、合成生物学における重要な一歩前進を表す。斯かる方法は、より長いポリヌクレオチドの産生を可能にしつつ、オリゴヌクレオチド合成の際に産生される化学廃棄物を大幅に低下させるであろうという点において、先行技術を上回る改善を表す。さらに、本方法は、化学的プロセスを生物学的プロセスに置き換えるため、コストは低下され、自動合成系の複雑さも低下されるであろう。ある実施形態では、単純な５試薬送達系を使用して、段階的様式でオリゴヌクレオチドを築くことができ、未使用の試薬をリサイクルすることができるであろう。

図１は、Tjong et al. "Amplified on- chip fluorescence detection of DNA hybridization by surface-initiated enzymatic polymerization," Anal. Chem., 2011; 83:5153-5159 (2011)からの、異なる時点における、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）および蛍光鎖イニシエータ５’－Ｃｙ５－ｄＡ１０で構成された溶液相重合反応のアガロースゲルを示す。

図２は、（Ａ）切断可能３’－Ｏ－遮断基（Ｒによって指し示される）を含むヌクレオチドアナログの取込み、および（Ｂ）３’－Ｏ－遮断基の除去（これにより次の３’－Ｏ－遮断ヌクレオチドアナログが取り込まれることを可能にする）を含む、支持体結合イニシエータおよび３’－Ｏ－遮断ヌクレオチド三リン酸を使用した、例示的な改変された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介性のポリヌクレオチド合成サイクルを説明する（図中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ）。

図３は、市販のＴＤＴ、および３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰまたは３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰを有する核酸イニシエータの溶液相反応時間経過のポリアクリルアミドゲル解析を示す。レーン１－１００ｂｐラダーサイズ標準、レーン２－オリゴヌクレオチド標準、レーン３－３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ＋ＴｄＴの１５分間の反応時間、レーン４－１時間、レーン５－２時間、レーン６－４時間、レーン７－２４時間、レーン８－３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ＋ＴｄＴの１５分間の反応時間、レーン９－１時間、レーン１０－２時間、レーン１０－４時間、レーン１１－２４時間、レーン１２－ｄＡＴＰ＋ＴｄＴの１５分間の反応時間、レーン１３－１時間、レーン１４－４時間、レーン１５－２４時間。

図４は、それぞれ２個の活性部位金属イオン（大きい緑色の球）と複合体形成した、コンピュータによりドッキングされた触媒的に生産的な位置および３’－Ｏ－－ｄＡＴＰアナログ（青色、赤色、オレンジ色のフレーム）を示す、ＰＤＢ結晶構造４Ｉ２９を使用したＴｄＴの活性部位のコンピュータ生成画像を示す。入来ｄＮＴＰと極めて接近している残基、ならびに変異誘発およびスクリーニングの標的である残基が示されている。

図５は、本明細書に記載されている選択された３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰアナログの取込み増加のために選択されたＴｄＴバリアントの表を示す。

図６は、本明細書に記載されている改変されたＴｄＴを使用したカスタムＤＮＡオリゴマーの合成に使用することができる例示的な３’－Ｏ－アジドメチルデオキシヌクレオチドを示す。

図７は、３’－Ｏ－アジドメチルデオキシアデノシン三リン酸（３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ）を産生するための合成スキームを示す。

図８は、３’－Ｏ－アジドメチルデオキシチミジン三リン酸（３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰ）を産生するための合成スキームを示す。

図９は、３’－Ｏ－アジドメチルデオキシシチジン三リン酸（３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ）を産生するための合成スキームを示す。

図１０は、３’－Ｏ－アジドメチルデオキシグアノシン三リン酸（３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰ）を産生するための合成スキームを示す。

図１１は、３’－Ｏ－メトキシメチルデオキシチミジン三リン酸（３’－Ｏ－ＭＯＭ－ｄＴＴＰ）を産生するための合成スキームを示す。

図１２は、３’－Ｏ－チオメチルデオキシシチジン三リン酸（３’－Ｏ－ＭＴＭ－ｄＣＴＰ）を産生するための合成スキームを示す。

図１３は、Ｂ）５’－ＦＡＭ－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴ－ＰＯ４－３’の化学合成された認証済みの標準と比較した、Ａ）５’－ＦＡＭ－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴの化学合成された認証済みの標準の移動を示すＣＧＥ（キャピラリーゲル電気泳動）トレースを示す。

図１４は、エビアルカリホスファターゼによる処理による３’－ＰＯ４の除去を示すＣＧＥトレースを示す。Ａ）エビアルカリホスファターゼによる処理前の、化学合成された５’－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ－ＰＯ４－３’、およびＢ）４．１×１０－４Ｕ／ｕｌ、Ｃ）１．２３×１０－３Ｕ／ｕｌ、Ｄ）３．７×１０－３Ｕ／ｕｌ、Ｅ）１．１×１０－２、Ｆ）３．３３×１０－２Ｕ／ｕｌ、Ｇ）１．０×１０－１Ｕ／ｕｌのエビアルカリホスファターゼによる１分間３７℃での処理後の、化学合成された５’－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ－ＰＯ４－３’。

図１５は、Ａ）マウスＷＴＴｄＴおよびｄＮＴＰなしによる処理後の、５’－ＦＡＭ－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ；Ｂ）マウスＷＴＴｄＴおよび５００ｕＭ３’－ＰＯ４－ｄＴＴＰによる６０分間３７℃での処理後の、５’－ＦＡＭ－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ；Ｃ）マウスＷＴＴｄＴおよび５００ｕＭ３’－ＰＯ４－ｄＴＴＰによる６０分間３７℃での処理と、それに続く０．２ユニットのエビアルカリホスファターゼによる１５分間３７℃での処理後の、５’－ＦＡＭ－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴを比較するＣＧＥトレースを示す。

図１６は、Ａ）マウスＷＴＴｄＴおよびｄＮＴＰなしによる６０分間３７℃での処理後の、５’－ＦＡＭ－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ－３’；Ｂ）マウスＴｄＴＥ１８０Ｋ＋Ｍ１９２Ｋ＋Ｌ３８１Ｋ＋Ｒ４５４Ｋ＋Ｎ４７４Ｒおよび５００ｕＭ３’－ＰＯ４－ｄＴＴＰによる６０分間３７℃での処理後の、５’－ＦＡＭ－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ；Ｃ）マウスＷＴＴｄＴおよび５００ｕＭ３’－ＰＯ４－ｄＴＴＰによる６０分間３７℃での処理と、それに続く０．２ユニットのエビアルカリホスファターゼによる１５分間３７℃での処理後の、５’－ＦＡＭ－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ－３’；Ｄ）マウスＷＴＴｄＴおよびｄＴＴＰによる５’－ＦＡＭ－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ－３’の処理によって創出されたホモポリマーｄＴ伸長ラダーを比較するＣＧＥトレースを示す。

発明の説明
本発明は、核酸アナログと共に使用することができる改変された酵素を提供することにより、ＤＮＡ等のポリヌクレオチドの合成を容易にする。開示されている方法を使用して、ｄｅｎｏｖｏオリゴデオキシヌクレオチドの酵素により媒介された合成を可能にし、これにより、遺伝子合成のための慣用的なアセンブリーにおけるその使用を可能にする、改変された鋳型非依存的末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）が得られる。本発明の酵素は、固体支持体において所定の配列のポリヌクレオチドを合成する、水性に基づく酵素媒介方法に役立つ。

本発明の改変された酵素は、３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰアナログが、ステップ・バイ・ステップの方法において使用されて、開始核酸を使用者が定義した配列へと伸長させることを可能にするであろう（図２を参照）。さらに、各ヌクレオチド伸長ステップの後に、反応物を、固体支持体から回収およびリサイクルして、本来の試薬リザーバーに戻すことができる。このステップが完了したら、３’－Ｏ－遮断基が除去され、サイクルを新たに始めることができるであろう。ｎ回のサイクルの伸長－回収－遮断解除－洗浄の終了時に、全長の一本鎖ポリデオキシヌクレオチドが、固体支持体から切断され、その後の使用のために単離されるであろう。種々の３’－Ｏ－遮断デオキシヌクレオチドを使用することができるが、特異的な３’－Ｏ－遮断基の選択が、１）ＴｄＴによる基質利用を最大化するための最小の可能なバルク、および２）最も短い期間での最も穏和なかつ好ましくは水性条件による遮断基の除去によって指示される。

このアプローチによるコスト節約は、既存の産業標準として現在使用されているものよりも低い出発スケール（すなわち、１ナノモル未満）で、より高い収量の最終オリゴヌクレオチド生成物を活用することにより達成されるであろう。アレイに基づくフォーマットへとこの酵素アプローチを将来的に適応させると、高度に並行した合成によって達成可能な長いオリゴヌクレオチドの合成コストの、さらに大幅でより劇的な低下を可能にするであろう。さらに、本発明者らが提唱する酵素合成プロセスは、緩衝液および塩等の水性に基づく化学のみを使用し、よって、既存のホスホルアミダイト方法によって生成される有機廃棄物の環境負荷を大幅に低下させる。

本発明の方法を使用して、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を改変することができるが、同様の方法により他の酵素を改変することができる。ＴｄＴは、鋳型非依存的重合における一本鎖開始プライマーを使用した３’－伸長活性が可能であるため、成功した出発酵素である可能性がある。しかし、本明細書に記載されている発明よりも前に、鋳型の非存在下で酵素によって一本鎖オリゴヌクレオチドに取り込まれる３’－Ｏ－遮断ヌクレオチドの報告は存在しなかった。実際に、ＣｈａｎｇおよびＢｏｌｌｕｍが報告した通り、３’－ヒドロキシル基の置換は、利用できるトランスフェラーゼ酵素の完全な不活性をもたらす。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Chang and Bollum, "Molecular Biology of Terminal Transferase, CRC Critical Reviews in Biochemistry, vol. 21 (1), p. 27-52 (1986)を参照されたい。そうであるにもかかわらず、ＴｄＴが、天然ｄＮＴＰ（すなわち、３’－Ｏ－遮断されていない）とともにかつ鋳型なしで使用される場合、オリゴヌクレオチド伸長は、停止することなく続く。斯かる制御されない取込みは、図１に示す時間依存的ゲル電気泳動画像によって証明される。図１は、異なる時点における、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）および蛍光鎖イニシエータ５’－Ｃｙ５－ｄＡ１０で構成された溶液相重合反応のアガロースゲルを示す（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Tjong et al. "Amplified on-chip fluorescence detection of DNA hybridization by surface-initiated enzymatic polymerization," Anal. Chem., 2011; 83:5153-5159 (2011)から許可を得て適応）。その上、ＴｄＴは、数千個のヌクレオチドの付加をもたらすほぼ定量的な様式でプライマーを伸長することができる一方で、ＴｄＴは、効率的な基質として多種多様な改変および置換されたｄＮＴＰを受け取る可能性がある。さらに、ＴｄＴに関する機構的および構造的情報の実質的なライブラリーは、既に存在する。両者共にそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Delarue et al., EMBO J. 2002;21(3):427-39；Gouge et al., J Mol Biol. 2013 Nov 15;425(22):4334-52およびRomain et al., Nucleic Acids Res.2009;37(14):4642-56を参照されたい。

ＴｄＴは、デオキシリボース糖環ならびにプリン／ピリミジン核酸塩基に、改変および／または置換を有する基質を使用することができることが公知である。例えば、ＴｄＴは、ピリミジンのＣ５およびプリンのＣ７に、かさ高い改変を受け取る。これら全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sorensen et al., "Enzymatic Ligation of Large Biomolecules to DNA," ACS Nano 2013, 7(9):8098-104；Figeys et al., Anal. Chem. 1994, 66(23):4382-3；Li et al., Cytometry, 1995, 20(2):172-80を参照されたい。一部の実例では、ＴｄＴは、非ヌクレオチド三リン酸をさらに受け取ることができる。両者共にそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Barone et al., Nucleotides and Nucleic Acids 2001, 20(4-7):1141-5およびAlexandrova et al., Bioconjug Chem., 2007, 18(3):886-93を参照されたい。しかし、先行技術において、ＴｄＴが、３’－Ｏ－遮断ヌクレオチドを受け取ることができるという証拠はほとんどない。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Knapp et al., Chem. Eur. J., 2011, 17:2903を参照されたい。ＴｄＴの活性の欠如は、Ｋｎａｐｐらの焦点ではなかったが、著者らは、自身の３’－ＯＨ改変アナログとＴｄＴを検査したところ、オリゴヌクレオチドへのこの比較的小さい３’－ＯＨ改変の取込みが観察されなかったことを報告した。

ネイティブＴｄＴは、非常に効率的な酵素である。ＴｄＴは、１０００～１０，０００ヌクレオチドの長さの極度に長いホモポリデオキシヌクレオチドを重合することができることが実証された（これら全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hoard et al., J of Biol Chem, 1969 244(19):5363-73；Bollum, The Enzymes, Volume 10, New York: Academic Press; 1974. p. 141-71；Tjong et al., Anal Chem, 2011, 83:5153-59を参照）。全４種のヌクレオチドからなるランダム配列オリゴマーもＴｄＴによって重合されたが、鋳型の非存在下で合成される順序付けられたポリヌクレオチドの報告はない。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Damiani, et al., Nucleic Acids Res, 1982, 10(20):6401-10を参照されたい。ＴｄＴによるポリヌクレオチドの支持体結合合成は、その上、金表面における自己集合された単層に共有結合により取り付けられた１５０ｂｐイニシエータのホモポリマー合成の報告によって支持される。両者共にそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Chow et al., J Am Chem Soc 2005; 127:14122-3およびChow and Chilikoti, Langmuir 2007, 23:11712-7を参照されたい。この著者らは、ホモポリマーの取込みに関してｄＡＴＰ＞ｄＴＴＰ＞＞ｄＧＴＰ≒ｄＣＴＰのＴｄＴによる優先も観察した。さらに最近の報告において、Ｔｊｏｎｇらは、ガラス表面に固定化されたイニシエータプライマーからの長い（＞１Ｋｂ）ホモポリマーｓｓＤＮＡのＴｄＴ媒介性合成を実証した。

ＴｄＴの分布挙動は、１～１．５ｋｂホモポリマーの溶液相合成の時間経過を示す図３によって補強される。無改変（天然）ｄＮＴＰの各付加後に、酵素は解離し、よって、集団におけるいずれかの鎖のランダムな伸長を可能にする。斯かる系における生成物の長さの分布は、１９７４年にＢｏｌｌｕｍおよび共同研究者らによって報告された通り、ポアソン分布に従う筈である。ＴｄＴが、終結ヌクレオチド種、すなわち、３’－Ｏ－位が遮断された種と共に使用された場合、反応は、完了へと進み、生成物の長さの分布をもたらさないが、単一のヌクレオチド付加の本質的に純粋な生成物をもたらす筈である。

そうであるにもかかわらず、上に記載されている通り、３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰによるヌクレオチド合成は、市販のＴｄＴタンパク質では進まない。この事実は、市販の組換えＴｄＴを使用した３’－Ｏ－アジドメチルｄＡＴＰおよび３’－Ｏ－アジドメチルｄＣＴＰの溶液相取込み動態のモニターに使用されるゲルシフトアッセイを示す、図３によって補強される。図３におけるデータは、どちらの３’－Ｏ－改変ｄＮＴＰアナログも、ＴｄＴの基質ではない、すなわち、陽性対照としてのｄＡＴＰを含有する反応（レーン１２から１５）と比較して、ポリヌクレオチド伸長が存在しないことを明らかに示す。よって、図３は、市販のＴｄＴが、改変３’－ＯＨを有するｄＮＴＰを取り込むことによりオリゴマーを合成することができないことのさらなる証拠を加える。

適した改変により、種々の異なる３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰアナログが、ＴｄＴによるヌクレオチドの制御された付加に適するであろう。改変３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰアナログは、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ＮＨ_２、３’－Ｏ－ＣＨ_２Ｎ_３、３’－Ｏ－ＯＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、３’－Ｏ－ＣＨ_２ＳＳＣＨ_３および３’－Ｏ－ＣＨ_２ＣＮ遮断基を含むがこれらに限定されない。全体的に見て、３’－Ｏ－遮断基の選択は、１）動力学的な取り込みに影響を与える可能性がある、ＴｄＴによる基質利用を最大化するための最小の可能なかさ、および２）好ましくは水性であり、最も短い期間における、最も穏和な除去条件を有する遮断基によって指示されるであろう。本発明による使用に適した３’－Ｏ－遮断基は、これら全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００３／０４８３８７；ＷＯ２００４／０１８４９７；ＷＯ１９９６／０２３８０７；ＷＯ２００８／０３７５６８；Hutter D, et al. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 2010, 29(11): 879-95；およびKnapp et al., Chem. Eur. J., 2011, 17:2903に記載されている。

マウスＴｄＴの活性部位のコンピュータによるモデルを創出して、ＴｄＴによる３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰの利用の欠如に関する構造的基盤を理解した。その上、コンピュータモデルは、様々な改変ｄＮＴＰを活性部位へと「フィット」させることを可能にした。図４は、ＰＤＢ結晶構造４Ｉ２９およびＡｕｔｏＤｏｃｋ４．２（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒａｐｈｉｃｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＳｃｒｉｐｐｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を使用した、マウスＴｄＴ（下の配列番号９を参照）による－ｄＡＴＰ（青色、赤色、マゼンタ色、オレンジ色で示す）のドッキングを示す。

ｄＡＴＰのホスフェート部分（オレンジ色）は、触媒的金属イオン（緑色）と複合体形成する一方、アルファホスフェートは、結合されたオリゴヌクレオチドの３’－ＯＨによって攻撃されるように位置する。図４に示すモデルは、３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰが存在する場合に触媒的に生産的な複合体の形成に干渉する可能性があるアミノ酸残基の選択を指し示す。Ｇｌｕ１８０またはＭｅｔ１９２等、最も近い残基と相互作用することができる他の残基もまた、改変の標的である。アミノ酸ナンバリングおよび位置は、配列番号９のマウスＴｄＴを参照しつつ提供されるが、参照されるアミノ酸改変は、ＧＧＦＲＲまたはＴＧＳＲモチーフを含む同様の配列を有するいかなるＴｄＴにも適用可能である。

ＡｕｔｏＤｏｃｋの予測される結合様式は、３’－ＯＨに対する改変が、２個の残基Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ４５４の間の静電相互作用を変化させるであろうことを示唆する。Ａｒｇ３３６は、活性部位における反応中心に近いが、Ａｒｇ３３６は、高度に保存されており、初期研究は、ＧｌｙまたはＡｌａによるＡｒｇ３３６の置換えが、ｄＮＴＰ活性を１０分の１に低下させたことを見出した（Yang B et al. J. Mol. Biol. 1994; 269(16):11859-68）。したがって、改変のためのモチーフの１つは、上の構造モデルにおけるＡｒｇ３３６を含むＧＧＦＲＲモチーフである。

その上、Ｇｌｙ４５２およびＳｅｒ４５３が、シス－ペプチド結合コンフォメーションにおいて存在し（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Delarue et al., EMBO J., 2002; 21(3):427- 39を参照）、Ａｒｇ３３６のグアニジウム基が、このコンフォメーションの安定化を支援すると考えられる。Ａｒｇ３３６によってもたらされる安定性は、この位置における置換が、改変されたＴｄＴタンパク質の反応性にマイナスの影響を有する理由を説明することを助けることができる。一部の実例では、３３６位を改変することにより創出される不安定性は、シス－ペプチド結合コンフォメーションを安定化するためにプロリン残基を使用することにより克服され得る。しかし、Ａｒｇ３３６が、例えば、アラニンまたはグリシンに置換される場合、ＴＧＳＲモチーフ全体（４５１、４５２、４３５、４５４位）もまた、この変化を補償するように改変される必要がある場合がある。例えば、ＴＧＳＲモチーフは、ＴＰＳＲまたはＴＧＰＲへと改変され得る。したがって、上の構造モデルにおけるＧｌｙ４５２を含むＴＧＳＲモチーフが、改変のために標的化された。

他方では、ＴｄＴファミリーの配列解析は、４５４位に収容され得る広範囲のアミノ酸を実証する。この解析は、４５４位および周囲の残基における構造的柔軟性を示唆する。別の実施形態では、３’－Ｏ－遮断基の立体的なかさを収容するためのＡｒｇ４５４における置換は、Ａｒｇ４５４におけるグリシンまたはアラニンの置換を補償するためのα１４領域に対する追加の改変を要求することができる。他の実施形態では、ＴＧＳＲモチーフの改変の代わりにまたはそれに加えてのいずれかで、Ａｒｇ３３６への置換を補償するために、α１１領域における他の残基への置換が要求され得る。

Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ４５４に対する改変は、３’－Ｏ－改変ｄＮＴＰの結合相互作用を変化させることができるが、ＴｄＴとの３’－Ｏ－改変ｄＮＴＰの改善された立体的相互作用をもたらす置換を探索することが必要となる場合もある。３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰの増加された基質利用を示すコンピュータにより予測された酵素バリアントを検査するために、特異的アミノ酸置換を指定する合成遺伝子を適切なプラスミドベクターにおいて生成し、細胞へと導入した。発現および単離後に、選択された３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰアナログを用いたポリメラーゼ取込みアッセイによって、活性についてタンパク質バリアントをスクリーニングした。図５は、様々な合成により生成されたマウスＴｄＴバリアントのスクリーニングの結果を示す。一部の実施形態では、単一のアミノ酸変化が重要であるが、他の実施形態では、１個および２個のアミノ酸の組合せも、３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰの増加された取込みを産生する。マウスＴｄＴのＧｌｙ３３２、Ｇｌｙ３３３、Ｇｌｙ４５２、Ｔｈｒ４５１、Ｔｒｐ４５０、Ｓｅｒ４５３およびＱ４５５等の残基との相互作用が重要である。これらの残基のそれぞれは、典型的なｄＮＴＰの３’－ＯＨの０．６ｎｍ内にある。これらの残基もまた、３’－Ｏ－アジドメチルまたは３’－Ｏ－アミノオキシ（aminoxy）等の３’－遮断基の余分な立体的なかさを可能にするための置換のための潜在的な標的である。Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ４５４に加えてまたはこれらと組み合わせて、Ｇｌｕ４５７、Ａｌａ５１０、Ａｓｐ５０９、Ａｒｇ５０８、Ｌｙｓ１９９、Ｓｅｒ１９６、Ｍｅｔ１９２、Ｇｌｕ１８０またはＬｅｕ１６１等の３’－ＯＨの１．２ｎｍ内にある残基は、３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰの基質利用に潜在的に干渉することもでき、よって、置換のための標的である。追加の目的の残基は、Ａｒｇ４６１およびＡｓｎ４７４を含む。

ここではＴＧＳＲおよびＧＧＦＲＲモチーフが強調されているが、Ｔｈｒ３３１、Ｇｌｙ３３７、Ｌｙｓ３３８、Ｇｌｙ３４１またはＨｉｓ３４２等の隣接アミノ酸に対する改変もまた、本明細書で考察される３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰの増加された取込みの提供に企図される（単独でまたは組み合わせて）。増加された取込みが可能な様々なｉｎｓｉｌｉｃｏモデル化ＴｄＴ改変は、下の実施例２に考察されている。

５００～５１０位におけるアミノ酸置換に加えて、３’－Ｏ－遮断基への干渉を除去するために残基を欠失させることが必要となる場合がある。このようなアミノ酸は、タンパク質のＣ末端の近くに配置されており、相対的に構造不定の領域に存在するため、上に記載されている改変の代わりにまたはそれと組み合わせてのいずれかで、単独でまたはまとめて欠失させることができる。ある特定の実施形態では、改変されたＴｄＴへの残基の挿入、例えば、ＧＧＦＲＲもしくはＴＧＳＲモチーフまたは隣接領域における残基の挿入は、改変されたＴｄＴによる３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰの取込み速度の増大を可能にすることができる。ＴｄＴ改変は、ＧＧＦＲＲモチーフのＰｈｅ３３４およびＡｒｇ３３５残基の間へのチロシン残基の挿入（またはＰｈｅ３３４およびＡｒｇ３３５残基の置換）を含むことができる。

本発明の改変されたＴｄＴは、図５に記載されているＴｄＴを含む。改変されたＴｄＴは、Ｅ１８０Ｌ、Ｅ１８０Ｒ、Ｅ１８０ＤまたはＥ１８０Ｋを含むＧｌｕ１８０に対する改変のうち１つまたは複数を含むことができる。Ｍｅｔ１９２に対する企図される改変は、例えば、Ｍ１９２Ｅ、Ｍ１９２Ｗ、Ｍ１９２ＫまたはＭ１９２Ｒを含む。Ｇｌｎ４５５に対する企図される改変は、例えば、Ｑ４５５Ｉを含む。Ｔｒｐ４５０に対する企図される改変は、例えば、Ｗ４５０Ｈを含む。ＡＲＧ４５４に対する企図される改変は、例えば、Ｒ４５４Ｉ、Ｒ４５４Ｋ、Ｒ４５４ＡまたはＲ４５４Ｔを含む。Ａｒｇ４６１に対する企図される改変は、例えば、Ｒ４６１Ｖを含み、Ａｓｎ４７４に対する改変は、Ｎ４７４Ｒを含むことができる。様々な実施形態では、例えば、Ｅ１８０Ｄ＋Ｗ４５０Ｈ、Ｅ１８０Ｋ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｋ＋Ｅ１８０Ｋ、Ｅ１８０Ｋ＋Ｒ４５４Ｉ、Ｅ１８０Ｄ＋Ｍ１９２Ｅ、Ｅ１８０Ｄ＋Ｍ１９２Ｅ＋Ｒ４５４ＴまたはＥ１８０Ｋ＋Ｗ４５０Ｈ等、２個またはそれよりも多い改変された残基の組合せを使用することができる。

下に示す通り、大部分のＴｄＴは、ＧＧＦＲＲおよびＴＧＳＲモチーフを含む。次の配列において、参照を容易にするために、ＧＧＦＲＲおよびＴＧＳＲモチーフは、太字で示されかつ下線を引かれている。ネイティブ仔ウシ胸腺ＴｄＴは、適した鋳型非依存的ポリメラーゼを達成するための一次構造の変更のための候補である。しかし、ヒトおよびマウスＴｄＴを含む、種々の他のタンパク質を探索して、３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰアナログとの使用に適した候補を同定することができる。ネイティブ仔ウシＴｄＴに対応するアミノ酸配列は、配列番号１として表１に収載されている一方、核酸配列は、配列番号２として表２に収載されている。一部の実施形態では、３’－Ｏ－改変ｄＮＴＰおよびＮＴＰを用いた配列特異的ｄｅｎｏｖｏポリヌクレオチド合成に適応されたその結果生じるタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％同一、すなわち、少なくとも９０％同一、すなわち、少なくとも９３％同一、すなわち、少なくとも９５％同一、すなわち、少なくとも９７％同一、すなわち、少なくとも９８％同一、すなわち、少なくとも９９％同一となるであろう。さらに、ウシＴｄＴのアミノ酸配列の一部分をトランケートし、依然として、触媒活性を維持することが可能となる場合がある。
表１．ウシＴｄＴのアミノ酸配列
配列番号１：（５２０ａａ）

表２．ウシＴｄＴの核酸配列
配列番号２：（１９２３ｎｔ）

その上、組換えタンパク質の単離をより容易にするために、親和性カラム（Ｈｉｔｒａｐ、ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）と組み合わせて使用される、Ｎ末端Ｈｉｓタグ配列を組換えタンパク質に付加させることが一般的である（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Boule J-B et al., Molecular Biotechnology, 1998;10:199-208を参照）。あるいは、付加されたＨｉｓタグ配列を有する酵素のＮ末端トランケート形態は、本発明で機能するであろう（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，４９４，７９７を参照）。Ｈｉｓタグが付いたウシＴｄＴアミノ酸配列を下の表３、５および７に示す一方、Ｈｉｓタグが付いたウシＴｄＴ核酸配列は、下の表４、６および８に示す。Ｈｉｓタグは、要求に応じて、他の位置において操作することができる。一部の実施形態では、３’－Ｏ－改変ｄＮＴＰおよびＮＴＰを用いた配列特異的ｄｅｎｏｖｏポリヌクレオチド合成に適応されたその結果生じるタンパク質は、配列番号３、５または７と少なくとも８５％同一、すなわち、少なくとも９０％同一、すなわち、少なくとも９３％同一、すなわち、少なくとも９５％同一、すなわち、少なくとも９７％同一、すなわち、少なくとも９８％同一、すなわち、少なくとも９９％同一となるであろう。
表３．Δ１３８およびＨｉｓタグが付いたウシＴｄＴのアミノ酸配列
配列番号３：（３９２ａａ）

表４．Δ１３８およびＨｉｓタグが付いたウシＴｄＴのヌクレオチド配列
配列番号４：（１１８７ｎｔ）

表５：Δ１５１およびＨｉｓタグが付いたウシＴｄＴのアミノ酸配列
配列番号５：（３７９ａａ）

表６．Δ１５１およびＨｉｓタグが付いたウシＴｄＴのヌクレオチド配列
配列番号６：（１１４８ｎｔ）

表７．Δ１６０およびＨｉｓタグが付いたウシＴｄＴのアミノ酸配列
配列番号７：（３７０ａａ）

表８．Δ１６０およびＨｉｓタグが付いたウシＴｄＴのヌクレオチド配列
配列番号８：（１１２１ｎｔ）

表９．マウスＴｄＴのアミノ酸配列
配列番号９：（５１０ａａ）

ある特定の実施形態では、本発明の改変された酵素は、それぞれのネイティブＴｄＴ酵素と比べてＮ末端トランケーションを含むことができる。例えば、好まれる実施形態では、ネイティブ酵素は、上の配列番号９に提供されるマウスＴｄＴとなることができる。改変されたＴｄＴは、それぞれ配列番号１０および１１に示す通り、ネイティブマウスＴｄＴの１４７または１３１位の等価な位置でトランケートされ得る。改変されたＴｄＴは、配列番号１０および１１に説明される通り、そのＮ末端に、Ｈｉｓタグ等のタンパク質タグ配列および追加のリンカーを含むことができる。Ｈｉｓタグ部分は、配列のそれぞれにおいて下線を引かれており、リンカーは、太字で提示されている。
配列番号１０：Ｈｉｓタグおよびリンカーを有するマウスｄｅｌ－１４７

配列番号１１：Ｈｉｓタグおよびリンカーを有するマウスｄｅｌ－１３１

３’－Ｏ－遮断または他のヌクレオチドアナログの取込み効率を増加させることができる追加のＴｄＴ改変は、下の表１０に収載されている。改変は、配列番号９に収載されているマウスＴｄＴを参照しつつ記載されているが、斯かる本発明は、Ｈｉｓタグおよびリンカーを含むまたは含まない、上の配列番号１０および１１に開示されているトランケートされた酵素を含むいずれかのＴｄＴにおける等価なアミノ酸に適用される斯かる改変を企図する。様々な実施形態では、企図される改変は、Ｓ４２０～Ｅ４２４アミノ酸の欠失を含む。本発明のアミノ酸置換の様々な組合せは、表１０の各行１～１７５に収載されている。
表10

種々の３’－Ｏ－改変ｄＮＴＰおよびＮＴＰを、ｄｅｎｏｖｏ合成のために開示されているタンパク質と共に使用することができる。一部の実施形態では、好まれる除去可能な３’－Ｏ－遮断基は、３’－Ｏ－アミノ、３’－Ｏ－アリルまたは３’－Ｏ－アジドメチルである。他の実施形態では、除去可能な３’－Ｏ－遮断部分は、Ｏ－フェノキシアセチル；Ｏ－メトキシアセチル；Ｏ－アセチル；Ｏ－（ｐ－トルエン）－スルホネート；Ｏ－ホスフェート；Ｏ－ニトレート；Ｏ－［４－メトキシ］－テトラヒドロチオピラニル；Ｏ－テトラヒドロチオピラニル；Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロフラニル；Ｏ－［２－メチル，４－メトキシ］－テトラヒドロピラニル；Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロピラニル；およびＯ－テトラヒドロチオフラニル（ＵＳ８，１３３，６６９を参照）からなる群より選択される。他の実施形態では、除去可能な遮断部分は、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カーボネート、カルバメート、ヒドロキシルアミン、ボラート、ニトレート、糖、ホスホルアミド、ホスホルアミデート、フェニルスルフェネート（phenylsulfenate）、スルフェート、スルホンおよびアミノ酸（これら全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、Metzker ML et al. Nuc Acids Res. 1994;22(20):4259-67、米国特許第（U.S.P.N.）５，７６３，５９４号、同第６，２３２，４６５号、同第７，４１４，１１６号；および同第７，２７９，５６３号を参照）からなる群より選択される。

例示的な３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰアナログの合成
図６は、４種の例示的な３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰアナログ、すなわち、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰおよび３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰを示す。各３’－Ｏ－アジドメチルアナログの合成は、下に記載されており、図７～図１２に詳述されている。３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰアナログは、ＡｚｃｏＢｉｏｔｅｃｈ、Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ、ＣＡ等の専門供給業者から購入することもできる。対応する３’－Ｏ－遮断リボヌクレオチドが、カスタムＲＮＡオリゴの創出を可能するための同様の合成方法により形成され得ることを理解されたい。

３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ：図７を参照すると、ＤＭＳＯ（１２ｍｌ）、酢酸（５．５ｍｌ）および無水酢酸（１７．６ｍｌ）におけるＮ^６－ベンゾイル－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシアデノシン（３．０ｇ；６．３８ｍｍｏｌ）［ＣＮＨＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ］の溶液を調製した。混合物を室温で４８時間撹拌した。およそ１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を添加し、水層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。組み合わせた有機抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、１：１～１：４）によって精製して、Ｎ^６－ベンゾイル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシアデノシン（化合物１として図７に示す）を白色粉末として回収した（２．４ｇ；７１％収率）。４００ｍｇのＮ^６－ベンゾイル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシアデノシンを、窒素下で乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（７ｍｌ）に溶解して、溶液（０．７６ｍｍｏｌ）を創出した。次に、シクロヘキセン（４００μｌ）およびＳＯ_２Ｃｌ_２（１５５μｌ；１．９１ｍｍｏｌ、再蒸留）を添加した。反応混合物を０℃で２時間撹拌した。次に、減圧下で、次いで１０分間の高真空ポンプ下で溶媒を除去した。その結果生じる残渣を乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、ＮａＮ_３（４００ｍｇ；６．６ｍｍｏｌ）と室温で３時間反応させた。反応混合物を蒸留水（５０ｍｌ）中に分散させ、ＣＨ_２Ｃｌ_２で抽出した。組み合わせた有機層をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶解し、ＮＨ_４Ｆ（３００ｍｇ；８．１ｍｍｏｌ）と共に室温で２４時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去した。反応混合物を減圧下で濃縮し、水およびＣＨ_２Ｃｌ_２の間で分配した。有機層を分離し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。濃縮後に、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）によって精製して、Ｎ^６－ベンゾイル－３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシアデノシン（化合物２；図７）を白色粉末として産生した（１５０ｍｇ；４８％収率）。次に、Ｎ^６－ベンゾイル－３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシアデノシン（１２３ｍｇ；０．３ｍｍｏｌ）およびプロトンスポンジ（７５．８ｍｇ；０．３５ｍｍｏｌ）を、真空デシケーター内にてＰ_２Ｏ_５上で一晩乾燥させ、その後、リン酸トリメチル（６００μｌ）に溶解した。次に、新鮮に蒸留されたＰＯＣｌ_３（４０μｌ；０．３５ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して加え、混合物を０℃で２時間撹拌した。その後、無水ＤＭＦ（２．３３ｍｌ）におけるピロリン酸トリブチルアンモニウム（５５２ｍｇ）およびトリブチルアミン（０．５５ｍｌ；２．３１ｍｍｏｌ）の混合物を室温で添加し、３０分間撹拌した。次に、重炭酸トリエチルアンモニウム（Triethyl ammonium bicarbonate）溶液（ＴＥＡＢ）（０．１Ｍ；ｐＨ８．０；１５ｍｌ）を添加し、混合物を１時間室温で撹拌した。その後、濃縮ＮＨ_４ＯＨ（１５ｍｌ）を添加し、一晩室温で撹拌した。その結果生じる混合物を真空下で濃縮し、残渣を５ｍｌの水で希釈した。次に、粗混合物は、ＴＥＡＢ（ｐＨ８．０；０．１～１．０Ｍ）の勾配を使用して、４℃でＤＥＡＥ－セファデックスＡ－２５におけるアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製して、後の合成のために使用されるべきヌクレオチドアナログである、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ（図７、化合物３）を産生した。

３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰ：酢酸（４．８ｍｌ）および無水酢酸（１５．４ｍｌ）を、ＤＭＳＯにおける５’－Ｏ－（ｔｅｒｔブチルジメチルシリル）チミジン（２．０ｇ；５．６ｍｍｏｌ）［ＣＮＨＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ］の撹拌溶液に添加した。反応混合物を室温で４８時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（１００ｍｌ）を添加し、水層を酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物をＮａＨＣＯ_３の飽和溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。濃縮後に、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって精製して、３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）チミジン（図８；化合物４）を白色粉末として産生した（１．７５ｇ；７５％収率）。次に、およそ１グラムの３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）チミジンを窒素下で乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１０ｍｌ）に溶解した。この混合物に、シクロヘキセン（１．３３ｍｌ）およびＳＯ_２Ｃｌ_２（２８４μｌ；３．５ｍｍｏｌ、再蒸留）を添加した。次に、その結果生じる混合物を０℃で１．５時間撹拌した。次に、減圧下で、次いで１０分間の高真空下で溶媒を除去した。残渣を乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、ＮａＮ_３（９２６ｍｇ；１５．４ｍｍｏｌ）と室温で３時間反応させた。当該反応混合物を次に、蒸留水（５０ｍｌ）中に分散させ、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×５０ｍｌ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を、ＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶解し、ＮＨ_４Ｆ（６００ｍｇ；１６．２ｍｍｏｌ）と室温で２４時間反応させた。反応混合物を減圧下で濃縮し、水およびＣＨ_２Ｃｌ_２の間で分配した。次に、有機層を分離し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。濃縮後に、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって精製して、３’－Ｏ－（アジドメチル）チミジン（図８、化合物５）を白色粉末として産生した（５５０ｍｇ；７１％収率）。次に、３’－Ｏ－（アジドメチル）チミジンおよびプロトンスポンジ（０．３５ｍｍｏｌ）を真空デシケーター内にてＰ_２Ｏ_５上で一晩乾燥させ、その後、リン酸トリメチル（６００μｌ）に溶解した。次に、新鮮に蒸留されたＰＯＣｌ_３（４０μｌ；０．３５ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して加え、混合物を０℃で２時間撹拌した。その後、無水ＤＭＦ（２．３３ｍｌ）におけるピロリン酸トリブチルアンモニウム（５５２ｍｇ）およびトリブチルアミン（０．５５ｍｌ；２．３１ｍｍｏｌ）の混合物を室温で添加し、３０分間撹拌した。次に、重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（ＴＥＡＢ）（０．１Ｍ；ｐＨ８．０；１５ｍｌ）を添加し、混合物を１時間室温で撹拌した。その後、濃縮ＮＨ_４ＯＨ（１５ｍｌ）を添加し、一晩室温で撹拌した。その結果生じる混合物を真空下で濃縮し、残渣を５ｍｌの水で希釈した。次に、粗混合物は、ＴＥＡＢ（ｐＨ８．０；０．１～１．０Ｍ）の勾配を使用して、４℃でＤＥＡＥ－セファデックスＡ－２５におけるアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製して、後の合成のために使用されるべきヌクレオチドアナログである、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰ（図８、化合物６）を産生した。

３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ：３．５グラムのＮ^４－ベンゾイル－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシシチジン［ＣＮＨＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ］を１４．７ｍｌのＤＭＳＯに添加して、７．６５ｍｍｏｌ溶液を産生した。この溶液に、酢酸（６．７ｍｌ）および無水酢酸（２１．６ｍｌ）を添加し、反応混合物を室温で４８時間撹拌した。次に、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（１００ｍｌ）を添加し、水層をＣＨ_２Ｃｌ_２（３×１００ｍｌ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物をＮａＨＣＯ_３の飽和溶液で洗浄し、次いで、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。濃縮後に、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、Ｎ^４－ベンゾイル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシシチジン（図９；化合物７）を白色粉末として産生した（２．９ｇ；７３％収率）。８ｍｌのＣＨ_２Ｃｌ_２に、Ｎ^４－ベンゾイル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシシチジン（５５８ｍｇ；１．０４ｍｍｏｌ）を溶解し、次いで、シクロヘキセン（５６０μｌ）およびＳＯ_２Ｃｌ_２（２２０μｌ；２．７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌した。次に、揮発性物質を減圧により除去した。残っている残渣を乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、ＮａＮ_３（４００ｍｇ；６．６ｍｍｏｌ）と室温で２時間反応させた。反応混合物を蒸留水（５０ｍｌ）中に分散させ、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×５０ｍｌ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶解し、ＮＨ_４Ｆ（６００ｍｇ；１６．２ｍｍｏｌ）と室温で２４時間反応させた。溶媒を減圧下で除去した。その結果生じる残渣を水（５０ｍｌ）に懸濁し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×５０ｍｌ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって精製して、Ｎ^４－ベンゾイル－３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシシチジン（図９、化合物８）を白色粉末として産生した（２００ｍｇ；５０％収率）。次に、Ｎ^４－ベンゾイル－３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシシチジンおよびプロトンスポンジ（０．３５ｍｍｏｌ）を、真空デシケーター内にてＰ_２Ｏ_５上で一晩乾燥させ、その後、リン酸トリメチル（６００μｌ）に溶解した。次に、新鮮に蒸留されたＰＯＣｌ_３（４０μｌ；０．３５ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して加え、混合物を０℃で２時間撹拌した。その後、無水ＤＭＦ（２．３３ｍｌ）におけるピロリン酸トリブチルアンモニウム（５５２ｍｇ）およびトリブチルアミン（０．５５ｍｌ；２．３１ｍｍｏｌ）の混合物を室温で添加し、３０分間撹拌した。次に、重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（ＴＥＡＢ）（０．１Ｍ；ｐＨ８．０；１５ｍｌ）を添加し、混合物を１時間室温で撹拌した。その後、濃縮ＮＨ_４ＯＨ（１５ｍｌ）を添加し、一晩室温で撹拌した。その結果生じる混合物を真空下で濃縮し、残渣を５ｍｌの水で希釈した。次に、粗混合物は、ＴＥＡＢ（ｐＨ８．０；０．１～１．０Ｍ）の勾配を使用して、４℃でＤＥＡＥ－セファデックスＡ－２５におけるアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製して、後の合成のために使用されるべきヌクレオチドアナログである、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ（図９、化合物９）を産生した。

３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰ：乾燥ＤＭＳＯ（２１ｍｌ）におけるＮ^２－イソブチリル－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシグアノシン（５ｇ；１１．０ｍｍｏｌ）［ＣＮＨＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ］の撹拌溶液に、酢酸（１０ｍｌ）および無水酢酸（３２ｍｌ）を添加した。反応混合物を室温で４８時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（１００ｍｌ）を添加し、水層を酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物を飽和ＮａＨＣＯ_３溶液で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させた。濃縮後に、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ_２Ｃｌ_２／ＭｅＯＨ）によって精製して、Ｎ^２－イソブチリル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシグアノシン（図１０、化合物１０）を白色粉末として産生した（３．９ｇ；６９％収率）。１グラムのＮ^２－イソブチリル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシグアノシンをその後に、ジフェニルカルバモイルクロライド（６７７ｍｇ；２．９２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；ＳＩＧＭＡ）（１．０２ｍｌ；５．９ｍｍｏｌ）と共に乾燥ピリジン（２２ｍｌ；２．０ｍｍｏｌ）に添加した。反応混合物を窒素雰囲気下で、室温で３時間撹拌した。溶媒を高真空下で除去した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、黄色がかった粉末として見えたＮ^２－イソブチリル－Ｏ^６－（ジフェニルカルバモイル）－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシグアノシン（図１０、化合物１１）を産生した（１．０９ｇ；８０％収率）。次に、Ｎ^２－イソブチリル－Ｏ^６－（ジフェニルカルバモイル）－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシグアノシンを乾燥ＣＨ_２Ｃｌ_２（１．１ｍｍｏｌ）に溶解し、窒素雰囲気下で、０℃で１．５時間撹拌した。溶媒を減圧下で、次いで１０分間の高真空下で除去した。その結果生じる残渣を乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、ＮａＮ_３（６００ｍｇ；１０ｍｍｏｌ）と室温で３時間反応させた。次に、反応混合物を蒸留水（５０ｍｌ）中に分散させ、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×５０ｍｌ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。結果としての残渣をＭｅＯＨ（５ｍｌ）に溶解し、ＮＨ_４Ｆ（５００ｍｇ；１３．５ｍｍｏｌ）と室温で２４時間反応させた。溶媒を減圧下で除去した。残渣を水（５０ｍｌ）に懸濁し、ＣＨ_２Ｃｌ_２（３×５０ｍｌ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって精製して、Ｎ^２－イソブチリル－Ｏ^６－（ジフェニルカルバモイル）－３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシグアノシン（図１０、化合物１２）を白色粉末として産生した（２３０ｍｇ；３６％収率）。最後に、Ｎ^２－イソブチリル－Ｏ^６－（ジフェニルカルバモイル）－３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシグアノシンおよびプロトンスポンジ（０．３５ｍｍｏｌ）を、真空デシケーター内にてＰ_２Ｏ_５上で一晩乾燥させ、その後、リン酸トリメチル（６００μｌ）に溶解した。次に、新鮮に蒸留されたＰＯＣｌ_３（４０μｌ；０．３５ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して加え、混合物を０℃で２時間撹拌した。その後、無水ＤＭＦ（２．３３ｍｌ）におけるピロリン酸トリブチルアンモニウム（５５２ｍｇ）およびトリブチルアミン（０．５５ｍｌ；２．３１ｍｍｏｌ）の混合物を室温で添加し、３０分間撹拌した。次に、重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（ＴＥＡＢ）（０．１Ｍ；ｐＨ８．０；１５ｍｌ）を添加し、混合物を１時間室温で撹拌した。その後、濃縮ＮＨ_４ＯＨ（１５ｍｌ）を添加し、一晩室温で撹拌した。その結果生じる混合物を真空下で濃縮し、残渣を５ｍｌの水で希釈した。次に、粗混合物は、ＴＥＡＢ（ｐＨ８．０；０．１～１．０Ｍ）の勾配を使用して、４℃でＤＥＡＥ－セファデックスＡ－２５におけるアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製して、後の合成のために使用されるべきヌクレオチドアナログである、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰ（図１０、化合物１３）を産生した。

図２に関して記載されている通り、３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰまたは３’－Ｏ－遮断ｒＮＴＰが付加されたら、追加のｄＮＴＰまたはｒＮＴＰを付加することができるように、遮断基を除去することが必要となるであろう。一部の実施形態では、３’－Ｏ－遮断基は、上昇された温度での中性水溶液におけるパラジウム触媒、ｐＨ２とするための塩酸、メルカプトエタノール等の還元剤により、またはトリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィンの添加によって除去することができる。例えば、これら全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６６４，０７９号；Meng, et al. J. Org. Chem., 2006, 71(81):3248-52；Bi et al., J. Amer. Chem. Soc. 2006; 2542-2543、米国特許第７，２７９，５６３号および米国特許第７，４１４，１１６号を参照されたい。他の実施形態では、３’－置換基は、ＵＶ照射によって除去することができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９２／１０５８７を参照）。大部分の３’－Ｏ－遮断基は、酸化的、還元的または加水分解的化学反応によって除去される。一部の実施形態では、３’－Ｏ－ＮＯ２基は、＜５分間にわたる室温における硫化アンモニウムの４０％ｗ／ｖ溶液によってオリゴヌクレオチドから除去される。一部の実施形態では、３’－Ｏ－ＣＨ２ＣＮ基は、７０℃における０．５ＭＫＯＨによる処理によってオリゴヌクレオチドから除去される。一部の実施形態では、３’－Ｏ－遮断基の除去は、化学的切断を含まないが、アルカリホスファターゼ等の切断酵素を使用する。

好まれる実施形態では、酵素反応は、３’－遮断基の除去のために使用される。エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）を、ある特定の実施形態では使用することができる。ＳＡＰは、文献で報告される最も速い酵素速度の１つを有し、広範囲の基質利用を有する。

３’－Ｏ－メトキシメチル－ｄＴＴＰ：５’－Ｏ－ベンゾイルチミジン（１７３ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、１当量）を、周囲温度においてアルゴン下で１０ｍＬのジクロロメタンに溶解した。ジ－イソプロピルエチルアミン（１２８ｍｇ、１ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、続いて、メトキシメチルブロマイド（１２４ｍｇ、１ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。混合物を周囲温度で１８時間撹拌した。混合物を１０ｍＬジクロロメタンで希釈し、これを２０ｍＬの５％ＨＣｌ水溶液およびブラインで逐次的に洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。５’－Ｏ－ベンゾイル－３’－Ｏ－メトキシメチルチミジン（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を５ｍＬの濃縮水酸化アンモニウムに周囲温度で溶解した。混合物を周囲温度で一晩撹拌した。混合物を希釈し、１０ｍＬポーションのジクロロメタンで３回抽出した。組み合わせた抽出物をブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。３’－Ｏ－メトキシメチルチミジン（２３ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をピリジン（１．５ｍＬ×３）と同時蒸発させ、高真空下で一晩乾燥させた。ヌクレオシドを、Ａｒ下で１．５ｍＬのリン酸トリメチルおよび０．６ｍＬ乾燥ピリジンの混合物に溶解した。氷浴中で混合物を冷却した。１０ｕＬのＰＯＣｌ３の第１のアリコートを滴下して加えた。５分後に、１０ｕＬの第２のアリコートを添加した。さらに３０分間混合物を撹拌した。Ａｒ下でバイアルにおいて氷浴中で、乾燥ＤＭＦ（１．２５ｍＬ）におけるＴＢＡリン酸塩の溶液を冷却した。これを反応混合物に滴下して１０秒間にわたり添加した。直ちに、予め秤量された固体プロトンスポンジ（２１ｍｇ、１．２５当量）を固体として１ポーションで添加した。この添加後、混合物を２５分間撹拌し、５ｍＬの冷ＴＥＡＢ緩衝液でクエンチした。氷浴中で混合物を１０分間撹拌し、次いで、ＦＰＬＣ分離のために小さいＲＢフラスコに移した。最終分離は、０．１ｍＭギ酸を含有する水／アセトニトリル勾配を使用した逆相ＨＰＬＣによって達成された。

３’－Ｏ－メチルチオメチル－ｄＣＴＰ：２５ｍＬのメタノールにおけるデオキシシチジン（１ｇ、４．４ｍｍｏｌ）の懸濁物に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（１．７５ｍＬ、１３．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を一晩周囲温度で撹拌した。反応混合物を蒸発させ、残渣を、溶離剤としてＤＣＭ／メタノール勾配を使用したフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。Ｎ６－ホルムアミジノ（Formamidino）－５’－Ｏ－ベンゾイルデオキシ－３’－Ｏ－メチルチオメチルデオキシシチジン（２５０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬのメタノールおよび１０ｍＬ濃縮水酸化アンモニウム水に溶解した。混合物を周囲温度で１８時間撹拌し、次いで、減圧下で蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／メタノール９８：２～９０：１０）によって精製して、１７０ｍｇ（９３％）の所望のヌクレオシドをやや黄色い固体として得た。２５ｍＬバイアルにおける３’－Ｏ－メチルチオメチルデオキシ（dexoxy）シチジン（２５．０ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（３×１ｍＬ）と同時蒸発させ、週末にわたって乾燥させた。リン酸トリメチル（０．７ｍＬ）を添加して、ヌクレオシドを溶解させ、氷浴中で０℃に冷却した。塩化ホスホリル（２８μＬ、０．３ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し（１２μＬ、５分後に８μＬ、３０分後に８μＬ）、反応物を２時間０℃で撹拌した。ピロリン酸水素ジ（テトラブチルアンモニウム）を無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、この混合物を０℃に冷却し、反応混合物に添加した。プロトンスポンジ（９．２ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を０℃で２時間撹拌した。反応混合物に、１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢ）（２ｍＬ）を添加し、混合物を１時間撹拌した。次に、混合物を丸底フラスコに移し、５０ｍＬ×３のｍｉｌｉＱ水を添加し、混合物を濃縮乾固した。残渣をｍｉｌｉＱ水（１１ｍＬ）に溶解し、室温でＡＫＴＡＦＰＬＣにロードした。三リン酸塩（Ｆ４８－Ｆ５２）を含有する画分を減圧下４０℃で蒸発させ、次いで、残渣を凍結乾燥した。三リン酸塩を乾燥させて、所望の三リン酸塩（１２ｍｇ、１６．５％）を得た。

（実施例１）
タンパク質改変
マウス（ｍｕｒ）ＴｄＴバリアントは、３８０ａａ合成遺伝子に由来した。この骨格は、ＷＴマウスＴｄＴのトランケートバージョンであり、ＥＴ配列の触媒コアを表す。化学合成されたＴｄＴ構築物を、Ｎ末端６×ヒスチジンタグおよびエンテロキナーゼ切断部位を特色とするｐＲＳＥＴＡ細菌発現ベクターにクローニングした（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＧｅｎｅＡｒｔＧｅｎｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）。合成ＴｄＴプラスミドは、１００ｕｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレートで平板培養されたＤＨ５アルファ細胞（Ｂｉｏｐｉｏｎｅｅｒ）において維持した。発現のため、ｐＲＳＥＴＡ－マウスＴｄＴプラスミドを、氷上で２０分間プラスミドおよび細胞をインキュベートし、続いて４２℃における３０秒間の熱ショック、続いてＳＯＣ培地の添加および振盪しつつ３７℃で３０～６０分間のインキュベーションを行うことにより、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）へと形質転換した。細胞へのＳＯＣ培地の添加後に、全体積（典型的には６０ｕｌ）を、１００ｕｇ／ｍＬカルベニシリンおよび３４ｕｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレートで平板培養した。

１０ｍＬ培養物（２４ウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ）由来の細胞を遠心分離（３０００×ｇ、１５分間）によって収集し、次いで、リゾチーム、プロテアーゼ阻害剤および１００ｍＭＮａＣｌを含有するＢ－ＰＥＲ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）に溶解した。ペレットをＴＢＳ緩衝液に１×６０分間浸漬し、精製のために上清を採取した。上清を、２４ウェルプレートにおいて３０分間、５０ｕＬＮｉ－ＮＴＡビーズ（ＧＥＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）スラリーに結合させた。次に、ビーズスラリーを３×５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、５００ｍＭＮａＣｌ（５００ｕＬ）で洗浄し、続いて、４×５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、５００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭイミダゾール（２００ｕＬ）で洗浄した。次に、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、５００ｍＭＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール（５０ｕＬ）、次いで５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、５００ｍＭＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール（１３０ｕＬ）、最後に５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８、５００ｍＭＮａＣｌ、１Ｍイミダゾール（５０ｕＬ）で処理することにより、タンパク質を回収した。

２．５ｕｌ試料を採集し、８％ＮｕＰａｇｅゲル（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）において２００Ｖで５０分間変性条件にて泳動することにより、回収された画分を解析した。ゲルは、クーマシーブルーで染色した。溶出されたタンパク質を、７．５ＭＷＣＯ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して緩衝液交換し、－８０℃で貯蔵した（貯蔵緩衝液＝２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５０ｍＭＮａＯＡｃ；０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００および１０％グリセロール）。

活性スクリーニング：
異なる３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰアナログおよびビオチン化オリゴヌクレオチドを使用したｄＮＴＰポリメラーゼ伸長反応により、ＴｄＴ活性スクリーニングを行った：
５ＢｉｏｓＧ／ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）配列番号１２

反応は典型的に、９６ウェルプレートにおいて設定した。次の構成成分の最終濃度を有するマスターミックスを作製することにより、反応を行った：最終体積１０ｕｌとなるよう、０．２ＵＰＰａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド、７５ｕＭｄＮＴＰ（下を参照）、１×ＴｄＴ反応緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ製の５×）。異なるウェルに規定の体積（典型的に２ｕｌ）のＴｄＴバリアントを添加し、３７℃で５分間反応ミックスをインキュベートすることにより、反応を開始した。６０分間の時点において、１０ｕｌアリコートを取り出し、５ｕｌの２５０ｍＭＥＤＴＡに添加することにより、反応を終結した。
検査したｄＮＴＰ：
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰ上述を参照
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ上述を参照
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰ上述を参照
３’－Ｏ－ＭＯＭ－ｄＴＴＰ上述を参照
３’－Ｏ－ＭＴＭ－ｄＣＴＰ上述を参照
３’－アミノオキシ－ｄＴＴＰＦｉｒｅｂｉｒｄＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓＬＬＣ
３’－アミノオキシ－ｄＡＴＰＦｉｒｅｂｉｒｄＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓＬＬＣ
３’－アミノオキシ－ｄＧＴＰＦｉｒｅｂｉｒｄＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓＬＬＣ
３’－Ｏ－メチル－ｄＡＴＰＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬＬＣ
３’－Ｏ－メチル－ｄＧＴＰＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬＬＣ
３’－Ｏ－メチル－ｄＣＴＰＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＬＬＣ

クエンチされた反応ミックスにおけるビオチン化オリゴを、ストレプトアビジンビーズ（０．７７ｕｍ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）に結合させた。次に、ビーズをフィルタープレート（ＰａｌｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に移し、水で数回洗浄した。プレートを切断緩衝液（メタノールにおける１０％ジイソプロピル－アミン）と５０℃で３０分間インキュベートし、続いて、水に溶出することにより、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断した。溶出された試料を乾燥させ、オリゴヌクレオチドサイジング標準（出発４２ｍｅｒオリゴヌクレオチドよりもおよそ１５～２０塩基小さいまたは大きい、２種のオリゴヌクレオチド（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を含有する３０μｌの水に溶解した。次に、キャピラリーゲル電気泳動（ＯｌｉｇｏＰｒｏＩＩ、ＡｄｖａｎｃｅｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．）によって、伸長効率に関してオリゴヌクレオチドを解析した。

（実施例２）
ｉｎｓｉｌｉｃｏモデル化
上に考察されているＧＧＦＲＲおよびＴＧＳＲモチーフならびに隣接アミノ酸に対するいくつかのアミノ酸改変をｉｎｓｉｌｉｃｏでモデル化して、上に記載されている３’－Ｏ－遮断ｄＮＴＰアナログの増加された取込みが可能な改変を決定した。単一、二重および三重アミノ酸置換ならびにアミノ酸挿入をモデル化した。下の表１１は、増加された取込みを誘発することが見出された改変を示す。マウスＴｄＴを参照しつつアミノ酸位置を提示するが、いかなるＴｄＴの保存された配列にも適用可能である。表１１の行は、ＧＧＦＲＲモチーフにおけるまたはそれに隣接する１つまたは複数のアミノ酸に対する塩基改変を表す。列は、ＴＧＳＲモチーフにおけるおよびそれに隣接するもの等、他のアミノ酸に対する改変の追加の組合せを含む。
表11.

（実施例３）
ホスフェート遮断基を有するｄＮＴＰの取込み
ＤＮＡおよびＤＮＡを含むヌクレオチドは、ヌクレオチド内のホスフェート基が原因で、高度に負に荷電している。参照により本明細書に組み込まれる、Lipfert J, Doniach S, Das R, Herschlag D. Understanding Nucleic Acid-Ion Interactions, Annu Rev Biochem. 2014; 83: 813-841を参照されたい。３’－ＰＯ４－ｄＮＴＰは、３’位における追加のホスフェート基が原因で、天然ヌクレオチドと比べてさらにより大きい負電荷を有する。増加された負電荷は、改変ヌクレオチドを取り込むＴｄＴの能力に影響を与えることができる。ある特定の実施形態では、本発明の操作されたＴｄＴ酵素は、改変されたＴｄＴにおける正電荷で負電荷を中和することにより、３’－リン酸－ｄＮＴＰの効率的な取込みのために改変され得る。

Ｒｏｓｅｔｔａｐｒｏｔｅｉｎソフトウェアｓｕｉｔｅ３内の側鎖原子当たりの隣接原子の平均数（Average number of Neighboring Atoms Per Sidechain Atom）（ＡｖＮＡＰＳＡ）アルゴリズムを使用して、ＴｄＴの酵素活性部位におけるおよびその周囲の正電荷を増加させるであろう変異を同定した。表面＿原子＿カットオフと命名される、ＡｖＮＡＰＳＡアルゴリズムの鍵となるパラメーターを増加させることにより、ＴｄＴの活性部位における配列位置を標的化した。溶媒曝露した極性残基を荷電残基に変異させることにより、タンパク質の表面電荷を操作し、溶媒曝露の量は、隣接する非自己原子の数によって決定される。それぞれの内容が参照により本明細書に組み込まれる、Miklos AE, et al., Structure-Based Design of Supercharged, Highly Thermoresistant Antibodies, Chemistry & Biology, Volume 19, Issue 4, 20 April 2012, Pages 449-455；Kaufmann KW, et al., Practically useful: what the Rosetta protein modeling suite can do for you, Biochemistry. 2010 Apr 13; 49(14):2987-98を参照されたい。表面＿原子＿カットオフ項を増加させることは、ＡｖＮＡＰＳＡが、酵素活性部位内の位置等、より多い数の隣接する原子を有する配列位置を考慮することを可能にする。３’－リン酸－ｄＮＴＰのより効率的な取込みに潜在的に有用であると、ＡｖＮＡＰＳＡを使用してＴｄＴにおいて同定された位置の概要を表１２に示す。
表12:ホスフェート-遮断dNTPの取込みのためのTdT改変

図１３～図１６は、３’－ＰＯ４－ｄＮＴＰに関して野生型よりも優れた、改変されたＴｄＴのヌクレオチド取込みを説明する。図１３、パネルＡは、化学合成されたオリゴヌクレオチド（ＩＤＴ）（２１－ｍｅｒ；５’－ＦＡＭ－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴ－ＰＯ_４－３’）のＣＧＥ解析である一方、パネルＢは、３’－ＰＯ_４基を有する１個のヌクレオチドの付加が、匹敵する２０－ｍｅｒ（ＩＤＴ）（５’－ＦＡＭ－ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴ）よりも速い電気泳動移動度を引き起こすことを示す。図１４は、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）（ＮＥＢ＃Ｐ０７５７）が、１ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド当たり１．２３×１０^－３Ｕ／ｕｌの濃度で１分間またはそれ未満で３’－ＰＯ_４基を定量的に除去することを実証するＣＧＥ解析である。この図は、０Ｕ／ｕｌ（パネルＡ）から１．０×１０^－１Ｕ／ｕｌ（パネルＧ）へと、増加する量のＳＡＰの滴定系列を示す。図１５、パネルＢは、パネルＡに示す出発材料オリゴヌクレオチドと変化がないことによって証明される通り、５００ｕＭ３’－ＰＯ_４－ｄＴＴＰ（ＭｙＣｈｅｍＬＬＣ）の存在下であっても、ポリメラーゼが伸長を媒介しなかったことを実証する、マウスＷＴＴｄＴ反応混合物のＣＧＥ解析である。３’－ＰＯ_４－ｄＴＴＰの基質利用の欠如のさらなる証拠は、オリゴヌクレオチド出発材料の反応性の欠如によって実証される通り（パネルＡ）、図１５のパネルＣに示される。図１６は、図１３に示す結果に基づき予想される通り、より速い電気泳動移動度を有する新たなオリゴヌクレオチド種の出現（丸で囲まれた新たなピーク）を実証するパネルＢに示される通り、バリアントＴｄＴ酵素（Ｅ１８０Ｋ＋Ｍ１９２Ｋ＋Ｌ３８１Ｋ＋Ｒ４５４Ｋ＋Ｎ４７４Ｒ）による３’－ＰＯ_４－ｄＴＴＰの部分的取込みのＣＧＥ解析である。バリアントＴｄＴによる３’－ＰＯ_４の取込みのさらなる証拠は、ＳＡＰによる処理による３’－ＰＯ_４の伸長後除去、およびパネルＤに示すポリ－ｄＴサイズラダーから予想される通り、オリゴヌクレオチド出発材料よりも遅い電気泳動移動速度を有する新たなオリゴヌクレオチド種の出現（パネルＣ－丸で囲まれた新たなピーク）、およびパネルＣにおける矢印によって指し示される通り、パネルＢにおいて形成される種の消失によって実証される。別の実施形態では、３’－ＰＯ４－ｄＴＴＰの増加された取込みは、バリアント酵素（Ｅ１８０Ｋ＋Ｍ１９２Ｋ＋Ｒ４５４Ｋ＋Ｒ４６１Ｖ＋Ｎ４７４Ｒ）によって実証される。

参照による組込み
特許、特許出願、特許公開、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ等、他の文書に対する参照および引用が、本開示全体にわたり為されている。あらゆる斯かる文書は、あらゆる目的のため、それらの全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。

均等物
本発明およびその多くのさらなる実施形態の様々な改変は、本明細書に示され記載されているものに加えて、本明細書に引用されている科学および特許文献の参照を含む本文書の全内容から、当業者には明らかとなるであろう。本明細書における主題は、その様々な実施形態およびその均等物における本発明の実施に適応され得る重要な情報、例証およびガイダンスを含有する。

Claims

Ｅ３３Ｋ、Ｅ１８０Ｌ、Ｅ１８０Ｋ、Ｍ１９２Ｅ、Ｍ１９２Ｋ、Ｍ１９２Ｗ、Ｗ３０３Ｈ、Ｌ３８１Ｋ、Ｌ３８１Ｑ、Ｌ３８１Ｒ、Ｌ３８１Ｖ、Ｗ４５０Ｈ、Ｒ４５４Ｉ、Ｒ４５４Ｔ、Ｒ４５４Ｋ、Ｅ４５７Ｋ、Ｒ４６１Ｖ、Ｒ４６１Ｑ、Ｒ４６１Ｖ、Ｎ４７４ＲおよびＮ４７４Ｋからなる群より選択される変異を含む改変された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）であって、核酸鋳型の非存在下で、アナログの３’－酸素に除去可能な遮断部分を含むヌクレオチドアナログを、核酸イニシエータの３’－ＯＨに付加することができる、改変されたＴｄＴ。
変異Ｅ４５７Ｋを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｅ１８０Ｋ、Ｍ１９２Ｗ、Ｌ３８１ＲおよびＷ４５０Ｈを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｌ３８１ＱおよびＷ４５０Ｈを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｅ１８０Ｌ、Ｍ１９３Ｅ、Ｌ３８１Ｋ、Ｒ４６１ＱおよびＮ４５７Ｋを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｅ１８０Ｋ、Ｌ３８１Ｑ、Ｗ４５０ＨおよびＲ４６１Ｖを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｌ３８１ＱおよびＷ４５０Ｈを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｅ１８０Ｌ、Ｍ１９２Ｅ、Ｌ３８１Ｋ、Ｒ４６１ＱおよびＮ４５７Ｋを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｅ１８０Ｋ、Ｍ１９２Ｅ、Ｌ３８１Ｋ、Ｒ４５４ＴおよびＮ４７Ｋを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｅ１８０Ｋ、Ｍ１９２Ｋ、Ｌ３８１Ｋ、Ｒ４５４ＴおよびＮ４５７Ｒを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｅ１８０Ｋ、Ｍ１９２Ｋ、Ｌ３８１Ｋ、Ｒ４５４ＫおよびＮ４５７Ｋを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｍ１９２Ｅ、Ｌ３８１Ｖ、Ｒ４５４ＩおよびＲ４６１Ｖを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｅ１８０ＫおよびＬ３８１Ｒを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記変異Ｅ１８０Ｋ、Ｍ１９２Ｋ、Ｌ３８１Ｋ、Ｒ４５４ＫおよびＮ４７４Ｒを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
ネイティブＴｄＴと比較して増加された速度で、前記除去可能な３’－Ｏ－遮断部分を含む前記ヌクレオチドアナログを、前記核酸イニシエータの前記３’－ＯＨに付加することができる、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
ネイティブＴｄＴと比べてＮ末端トランケーションを含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
Ｎ末端ｔ－１３１マウスＴｄＴおよびＮ末端に取り付けられたタンパク質タグ配列を含む、請求項１５に記載の改変されたＴｄＴ。
Ｎ末端ｔ－１４７マウスＴｄＴおよびＮ末端に取り付けられたタンパク質タグ配列を含む、請求項１５に記載の改変されたＴｄＴ。
除去可能な３’－Ｏ－遮断部分により改変されたアデニン、シトシン、グアニンおよびチミンデオキシリボヌクレオチドを付加することができる、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記ヌクレオチドが、２’－デオキシリボヌクレオチドである、請求項１８に記載の改変されたＴｄＴ。
除去可能な３’－Ｏ－遮断部分により改変されたアデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルリボヌクレオチドを付加することができる、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記除去可能な３’－Ｏ－遮断部分が、ＣＨ_２Ｎ_３、ＮＨ_２、ＯＮＨＣ（Ｏ）Ｈ、アリル、ＣＨ_２ＳＳＣＨ_３、フェノキシアセチル、メトキシアセチル、アセチル、（ｐ－トルエン）スルホネート、ホスフェート、ニトレート、［４－メトキシ］－テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、［５－メチル］－テトラヒドロフラニル、［２－メチル，４－メトキシ］－テトラヒドロピラニル、［５－メチル］－テトラヒドロピラニル；およびＯ－テトラヒドロチオフラニルからなる群より選択される３’－Ｏ－遮断基を含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
前記改変されたＴｄＴが、３’－Ｏ－遮断ヌクレオチド５’－三リン酸を取り込むことができ、前記除去可能な遮断部分が、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カーボネート、カルバメート、ヒドロキシルアミン、ボラート、ニトレート、糖、ホスホルアミド、ホスホルアミデート、フェニルスルフェネート、スルフェート、スルホンおよびアミノ酸から選択される基を含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
約３０℃～約８０℃の反応温度で改変ヌクレオチドを取り込むことができる、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
１０００μＭまたはそれ未満の濃度で改変ヌクレオチドを取り込むことができる、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
１００μＭまたはそれ未満の濃度で改変ヌクレオチドを取り込むことができる、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
除去可能な３’－Ｏ－リン酸を含むヌクレオチドアナログを、核酸イニシエータの前記３’－ＯＨに付加することができる、請求項１４に記載の改変されたＴｄＴ。