JP2022513371A - ポリデオキシヌクレオチド合成のための改変テンプレート非依存性酵素 - Google Patents

ポリデオキシヌクレオチド合成のための改変テンプレート非依存性酵素 Download PDF

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Abstract

本発明は、ポリメラーゼ（例えば、テンプレートを使用することなく、除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング部分を含むヌクレオチドを核酸イニシエーターに結合し得る改変された末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ））を同定するための方法を包含する。本発明はさらに、上記同定されたポリメラーゼ、および所定のオリゴヌクレオチド配列のデノボ合成のために上記ポリメラーゼを使用する方法を包含する。本発明は、テンプレートの非存在下でオリゴヌクレオチドのデノボ配列決定のために使用され得る改変された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素を開示する。

Description

関連出願
本出願は、２０１８年１０月１９日出願の米国特許出願第１６／１６５，４６５号（その内容は、本明細書に参考として援用される）に基づく優先権を主張する。
発明の分野
本発明は、所望の配列を有するポリヌクレオチドの、テンプレートを使用せずにデノボ合成するための改変された酵素に関する。よって、本発明は、研究、遺伝子工学、および遺伝子治療のための種々の配列および種々の長さのポリヌクレオチドのライブラリーを作製する能力を提供する。
背景
大部分のデノボ核酸配列は、３０年より前に開発された固相ホスホルアミダイト技術を使用して合成される。その技術は、天然の（または非天然の）核酸塩基に対応するホスホルアミダイト試薬から構築される配列の連続的脱保護および合成を伴う。しかし、ホスホルアミダイト核酸合成は、長さにおいて２００塩基対（ｂｐ）を超える核酸が、高率の破損および副反応を経験するという点において長さに制限がある。さらに、ホスホルアミダイト合成は、毒性の副生成物を生じ、この廃棄物の処分は、核酸合成器の利用可能性を制限し、契約オリゴ生成の費用を増大させる（オリゴヌクレオチド合成の年間需要は、３００，０００ガロン超もの危険な化学廃棄物（アセトニトリル、トリクロロ酢酸、トルエン、テトラヒドロフラン、およびピリジンが挙げられる）の原因であると予測される。ＬｅＰｒｏｕｓｔら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ． ３８（８）， ｐ．２５２２－２５４０， （２０１０）（本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。従って、オリゴヌクレオチド合成のためのより効率的でかつ費用効果的な方法が必要である。
ＬｅＰｒｏｕｓｔら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ｖｏｌ． ３８（８）， ｐ．２５２２－２５４０， （２０１０）
要旨
本発明は、テンプレートの非存在下でオリゴヌクレオチドのデノボ配列決定のために使用され得る改変された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）酵素を開示する。計算によるガイダンスおよび飽和変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）とその後のスクリーニングとの組み合わせを通じて、テンプレート非依存性ポリメラーゼを作り出して、機能的変異体を同定するための方法がまた、開示される。いくつかの実施形態において、上記改変されたＴｄＴは、合成の間にヌクレオチドと相互作用する、ＧＧＦＲＲまたはＴＧＳＲモチーフにおいて変異を含む。
得られた酵素を使用すると、デノボポリヌクレオチドをより迅速にかつより安価に合成することが可能である。よって、本発明は、特注の核酸を合成するコスト全体を劇的に低減する。特に、上記方法は、改変された３’ヒドロキシル－ブロックされたヌクレオチドを使用する段階的様式において、特注のオリゴを合成し得るテンプレート非依存性トランスフェラーゼを作り出すために使用され得る。末端基が原因で、合成は、各新たな塩基の付加に伴って一旦停止し、その際に、その末端基は、天然に存在するヌクレオチドに本質的に同一なポリヌクレオチドを残して切断される（すなわち、さらなるヌクレオチド取り込みのための基質として酵素によって認識される）。
本発明の方法および酵素は、合成生物学において重要な前進である。なぜならその酵素は、水相、テンプレート非依存性オリゴヌクレオチド合成を可能にするからである。このような方法は、これらが、より長いポリヌクレオチドの生成を可能にすると同時に、オリゴヌクレオチド合成の間に生成される化学廃棄物を大きく低減するという点で、先行技術を超える改善を示す。さらに、上記方法は、化学的プロセスを生物学的プロセスで置き換えることから、費用が低減され、自動化合成システムの複雑性も低減される。一実施形態において、単純な５つの試薬送達システムが、段階的様式においてオリゴヌクレオチドを構築するために使用され得、未使用の試薬のリサイクルを可能にする。
図１は、Ｔｊｏｎｇら，「Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｏｎ－ｃｈｉｐ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｕｒｆａｃｅ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．， ２０１１； ８３：５１５３－５１５９（２０１１）の種々の時点での末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）および蛍光鎖イニシエーター５’－Ｃｙ５－ｄＡ１０から構成される液相重合反応のアガロースゲルを示す。
図２は、（Ａ）切断可能な３’－Ｏ－ブロッキング基（Ｒによって示される）を含むヌクレオチドアナログの取り込み、および（Ｂ）３’－Ｏ－ブロッキング基を除去し、従って、次の３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドアナログが取り込まれることを可能にする（ここでＮ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）ことを含む、支持体に結合したイニシエーターおよび３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチド三リン酸を使用する、例示的な改変された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介性ポリヌクレオチド合成サイクルを図示する。
図３は、市販のＴＤＴおよび核酸イニシエーターと３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰまたは３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰとの液相反応時間経過のポリアクリルアミドゲル分析を示す。レーン１－ １００ｂｐラダーサイズの鎖、レーン２－ オリゴヌクレオチド鎖、レーン３－ ３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ ＋ ＴｄＴ １５’ 反応時間、レーン４－ １時間、レーン５－ ２時間、レーン６－ ４時間、レーン７－ ２４時間、レーン８－ ３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ ＋ ＴｄＴ １５’ 反応時間、レーン９－ １時間、レーン１０－ ２時間、レーン１０－ ４時間、レーン１１－ ２４時間、レーン１２－ ｄＡＴＰ ＋ ＴｄＴ １５’ 反応時間、レーン１３－ １時間、レーン１４－ ４時間、レーン１５－ ２４時間。
図４は、３’－Ｏ－ｄＡＴＰアナログの計算上ドッキングした触媒的に有効な位置（青色、赤色、橙色のフレーム）を示し、その２つの活性部位金属イオン（大きな緑の球）に各々複合体化される、ＰＤＢ結晶構造４１２９を使用するＴｄＴの活性部位のコンピューター生成画像を示す。入ってくるｄＮＴＰの直ぐ近傍にあり、変異誘発およびスクリーニングの標的である残基が示される。
図５は、選択された本明細書で記載されるとおりの３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログの増大した取り込みのために選択したＴｄＴ改変体の表を示す。
図６は、本明細書で記載されるように、改変されたＴｄＴｓを使用して特注のＤＮＡオリゴマーを合成するために使用され得る例示的な３’－Ｏ－アジドメチルデオキシヌクレオチドを示す。
図７は、３’－Ｏ－アジドメチルデオキシアデノシン三リン酸（３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ）を生成するための合成スキームを示す。
図８は、３’－Ｏ－アジドメチルデオキシチミジン三リン酸（３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰ）を生成するための合成スキームを示す。
図９は、３’－Ｏ－アジドメチルデオキシシチジン三リン酸（３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ）を生成するための合成スキームを示す。
図１０は、３’－Ｏ－アジドメチルデオキシグアノシン三リン酸（３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰ）を生成するための合成スキームを示す。
図１１は、３’－Ｏ－メトキシメチルデオキシチミジン三リン酸（３’－Ｏ－ＭＯＭ－ｄＴＴＰ）を生成するための合成スキームを示す。
図１２は、３’－Ｏ－チオメチルデオキシシチジン三リン酸（３’－Ｏ－ＭＴＭ－ｄＣＴＰ）を生成するための合成スキームを示す。
発明の詳細な説明
本発明は、核酸アナログとともに使用され得る改変された酵素を提供することによって、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の合成を容易にする。開示される方法を使用すると、改変されたテンプレート非依存性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）が得られ、これは、デノボオリゴデオキシヌクレオチドの酵素媒介性合成を可能にし、それによって、遺伝子合成のための慣用的なアセンブリにおけるそれらの使用を可能にする。本発明の酵素は、固体支持体上で所定の配列のポリヌクレオチドを合成する水性ベースの酵素媒介性の方法にふさわしい。
本発明の改変された酵素は、３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログが、開始核酸をユーザー定義の配列へと伸長するために段階的方法において使用されることを可能にする（図２を参照のこと）。さらに、各ヌクレオチド伸長工程の後に、その反応物は、回収され得、固体支持体から元の試薬リザーバーへと戻ってリサイクルされ得る。その工程が一旦完了すると、その３’－Ｏ－ブロッキング基が除去され、そのサイクルが新たに開始することを可能にする。伸長－回収－脱ブロック－洗浄のｎサイクルの終了時には、全長の単一鎖ポリデオキシヌクレオチドが、固体支持体から切断され、その後の使用のために単離される。種々の３’－Ｏ－ブロックされたデオキシヌクレオチドが使用され得るが、具体的な３’－Ｏ－ブロッキング基の選択は、以下によって規定される： １）ＴｄＴによる基質利用を最大にする最小の可能なかさ高さ、および２）最短期間において最も温和で、好ましい水性条件でのブロッキング基の除去。
このアプローチによる費用節約は、既存の産業標準として現在使用されているより低い開始スケール（すなわち、１ナノモル未満）において最終オリゴヌクレオチド生成物のより高い収量を利用することによって達成され得る。アレイベースのフォーマットへのこの酵素アプローチのさらなる適合は、より高度な並行合成によって達成可能な長いオリゴヌクレオチドの合成の費用においてなおさらに、かつより劇的な費用の低減を可能にする。さらに、本発明者らが提唱する酵素による合成プロセスは、緩衝液および塩のような水性ベースの化学物質のみを使用し、従って、既存のホスホルアミダイト法によって生じた有機性廃棄物の環境負荷を大いに低減する。
本発明の方法は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を改変するために使用され得るが、他の酵素が、類似の方法で改変され得る。ＴｄＴは、成功裡の開始酵素であるようである。なぜならそれは、テンプレート非依存性重合において単一鎖開始プライマーを使用する３’－伸長活性の能力があるからである。しかし、本明細書で記載される発明の前に、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドがテンプレートの非存在下で酵素によって１本鎖オリゴヌクレオチドへと取り込まれるという報告はなかった。実際に、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｂｏｌｌｕｍが報告したように、３’－ヒドロキシル基の置換は、利用可能なトランスフェラーゼ酵素の完全な不活性を生じる。Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｂｏｌｌｕｍ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｖｏｌ． ２１（１）， ｐ．２７－５２ （１９８６）（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと。にもかかわらず、ＴｄＴが天然のｄＮＴＰｓ（すなわち、３’－Ｏ－ブロックされていない）とともにかつテンプレートなしで使用される場合、オリゴヌクレオチド伸長は、停止することなく継続する。このような制御されない取り込みは、図１に示される時間依存性ゲル電気泳動画像によって証明される。図１は、種々の時点での、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）および蛍光鎖イニシエーター、５’－Ｃｙ５－ｄＡ１０から構成される液相重合反応のアガロースゲルを示す（Ｔｊｏｎｇら，「Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｏｎ－ｃｈｉｐ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｕｒｆａｃｅ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．， ２０１１； ８３：５１５３－５１５９（２０１１）（その全体において本明細書に参考として援用される）からの許可を得て改訂）。さらに、ＴｄＴは、数千ものヌクレオチドの付加を生じるほぼ定量的様式においてプライマーを伸長し得ると同時に、ＴｄＴは、効率的基質として、広く種々の改変されかつ置換されたｄＮＴＰｓを受容するようである。さらに、ＴｄＴに関する機構的および構造的情報の実質的なライブラリーが、既に存在する。Ｄｅｌａｒｕｅら， ＥＭＢＱ Ｊ． ２００２ ；２１（３）：４２７－３９； Ｇｏｕｇｅら， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０１３ Ｎｏｖ １５；４２５（２２）：４３３４－５２およびＲｏｍａｉｎら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００９；３７（１４）：４６４２－５６（これらはともに、それらの全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと。
ＴｄＴが、デオキシリボース糖環、ならびにプリン／ピリミジン核塩基において改変および／または置換を有する基質を使用し得ることは、公知である。例えば、ＴｄＴは、ピリミジンのＣ５およびプリンのＣ７においてかさ高い改変を受容する。Ｓｏｒｅｎｓｅｎら， 「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｏ ＤＮＡ」， ＡＣＳ Ｎａｎｏ ２０１３， ７（９）：８０９８－１０４； Ｆｉｇｅｙｓら， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． １９９４， ６６（２３）：４３８２－３； Ｌｉら， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， １９９５， ２０（２）： １７２－８０（これらは全て、それらの全体において参考として援用される）を参照のこと。場合によっては、ＴｄＴは、非ヌクレオチド三リン酸すら受容し得る。Ｂａｒｏｎｅら， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２００１， ２０（４－７）： １１４１－５、およびＡｌｅｘａｎｄｒｏｖａら， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．， ２００７， １８（３）：８８６－９３（これらは全て、それらの全体において参考として援用される）を参照のこと。しかし、ＴｄＴが３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチドを受容し得ることは、先行技術においてほとんど証明されていない。例えば、Ｋｎａｐｐら， Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．， ２０１１， １７：２９０３（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと。ＴｄＴの活性の欠如がＫｎａｐｐらの焦点ではなかったが、その著者らは、彼らが、３’－ＯＨ改変されたアナログをＴｄＴで試験したところ、オリゴヌクレオチドへのこの比較的小さな３’－ＯＨ改変の取り込みを認めなかったことを報告した。
天然のＴｄＴは、非常に効率的な酵素である。ＴｄＴは、１０００～１０，０００ヌクレオチドの長さの極めて長いホモポリデオキシヌクレオチドを重合し得ることが示された（Ｈｏａｒｄら， Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， １９６９ ２４４（１９）：５３６３－７３； Ｂｏｌｌｕｍ， Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｖｏｌｕｍｅ １０， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； １９７４． ｐ． １４１－７１； Ｔｊｏｎｇら， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２０１１， ８３：５１５３－５９（これらは全てそれらの全体において参考として援用される）を参照のこと）。全４種のヌクレオチドからなるランダム配列オリゴマーはまた、ＴｄＴによって重合されているが、注文されたポリヌクレオチドがテンプレートの非存在下で合成されているという報告は存在しない。Ｄａｍｉａｎｉら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， １９８２， １０（２０）：６４０１－１０（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと。ＴｄＴによるポリヌクレオチドの支持体に結合させた合成は、金表面上の自己アセンブルする単層に共有結合させた１５０ｂｐのイニシエーターのホモポリマー合成の報告によってさらに裏付けられる。Ｃｈｏｗら， Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２００５； １２７：１４１２２－３、およびＣｈｏｗ ａｎｄ Ｃｈｉｌｉｋｏｔｉ， Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００７， ２３：１１７１２－７（これらはともに、それらの全体において参考として援用される）を参照のこと。これらの著者らはまた、ホモポリマーの取り込みに関してｄＡＴＰ＞ｄＴＴＰ≫ｄＧＴＰ ｄＣＴＰというＴｄＴの優先度を観察した。より近年の報告では、Ｔｊｏｎｇらは、ＴｄＴが、硝子表面に固定化したイニシエータープライマーから、長い（＞１Ｋｂ）ホモポリマーｓｓＤＮＡの合成を媒介したことを示した。
ＴｄＴの分配挙動は、１～１．５ｋｂ ホモポリマーの液相合成の時間経過を示す図３によって強固にされる。改変されていない（天然の）ｄＮＴＰの各付加の後に、その酵素は解離し、従って、その集団における任意の鎖のランダム伸長を可能にする。このようなシステムにおける生成物の長さの分布は、１９７４年にＢｏｌｌｕｍらによって報告されたように、ポワソン分布に倣うはずである。ＴｄＴは、終結ヌクレオチド種（すなわち、３’－Ｏ－位置がブロックされたもの）とともに使用されたので、その反応は、完了するまで進行し、生成物の長さの分布ではなく、単一ヌクレオチド付加の本質的に純粋な生成物を生じるはずである。
それにもかかわらず、上記で記載されるように、３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰｓでのヌクレオチド合成は、市販のＴｄＴタンパク質では進行しない。この事実は、市販の組換えＴｄＴを使用する３’－Ｏ－アジドメチルｄＡＴＰおよび３’－Ｏ－アジドメチルｄＣＴＰの液相取り込み動態をモニターするために使用されるゲルシフトアッセイを示す図３によって強化される。図３におけるデータは、いずれの３’－Ｏ－改変されたｄＮＴＰアナログも、ＴｄＴの基質ではない、すなわち、陽性コントロールとしてｄＡＴＰを含む反応（レーン１２～１５）と比較した場合に、ポリヌクレオチド伸長が存在しないことを明らかに示す。図３は、従って、市販のＴｄＴが、改変された３’－ＯＨを有するｄＮＴＰｓを組み込むことによってオリゴマーを合成できないというさらなる証拠を追加する。
適切に改変すると、種々の異なる３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログが、ＴｄＴによるヌクレオチドの制御された付加に適切である。改変された３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログとしては、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ＮＨ２、および３’－ＯＣＨ２ＣＮブロッキング基が挙げられるが、これらに限定されない。全体的に、３’－Ｏ－ブロッキング基の選択は、以下によって規定される： １）ＴｄＴによる基質利用を最大にする最小の可能なかさ高さ（これは、動的な取り込みに影響を及ぼすようである）、および２）最短期間において最も温和な除去条件、好ましくは水性条件を有するブロッキング基。本発明とともに使用するために適した３’－Ｏ－ブロッキング基は、ＷＯ ２００３／０４８３８７； ＷＯ ２００４／０１８４９７； ＷＯ １９９６／０２３８０７； ＷＯ ２００８／０３７５６８； Ｈｕｔｔｅｒ Ｄら， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， ２０１０， ２９（１１）： ８７９－９５；およびＫｎａｐｐら， Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．， ２０１１， １７：２９０３（これらは全てそれらの全体において参考として援用される）に記載される。
マウスＴｄＴの活性部位の計算上のモデルは、ＴｄＴが３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰｓを利用しないという構造的基本を理解するために作成された。さらに、そのコンピューターモデルは、種々の改変されたｄＮＴＰｓをその活性部位に「フィットさせる」ことを可能にした。図４は、ＰＤＢ結晶構造４１２９およびＡｕｔｏＤｏｃｋ ４．２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を使用して、－ｄＡＴＰ（青色、赤色、マゼンタ、または橙色で示される）とマウスＴｄＴ（以下の配列番号９を参照のこと）とのドッキングを示す。
ｄＡＴＰｓ（橙色）のホスフェート部分は、触媒金属イオン（緑色）と複合体化した状態にある一方で、αホスフェートは、結合したオリゴヌクレオチドの３’－ＯＨによって攻撃される位置にある。図４に示されるモデルは、アミノ酸残基の選択が、３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰが存在する場合に触媒的に有効な複合体の形成に干渉するようであることを示す。Ｇｌｕ１８０またはＭｅｔ１９２のような、最も近い残基と相互作用し得る他の残基はまた、改変の標的である。アミノ酸番号付けおよび位置は、配列番号９のマウスＴｄＴを参照して提供されるが、その参照されたアミノ酸改変は、ＧＧＦＲＲまたはＴＧＳＲモチーフを含む類似の配列を有する任意のＴｄＴに適用可能である。
ＡｕｔｏＤｏｃｋの推定結合モードは、その３’－ＯＨに対する改変が、２つの残基、Ａｒｇ３３６とＡｒｇ４５４との間の静電相互作用を変化させることを示唆する。Ａｒｇ３３６は、活性部位の反応中心の近傍にあるが、Ａｒｇ３３６は高度に保存されており、初期の研究から、Ａｒｇ３３６をＧｌｙまたはＡｌａで置き換えると、ｄＮＴＰ活性が１／１０に低減することが見出された（Ｙａｎｇ Ｂら Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １９９４； ２６９（１６）： １１８５９－６８）。よって、改変のための１つのモチーフは、上記の構造モデルにおいてＡｒｇ ３３６を含むＧＧＦＲＲモチーフである。
さらに、Ｇｌｙ４５２およびＳｅｒ４５３は、ｃｉｓ－ペプチド結合コンホメーションにおいて存在し（Ｄｅｌａｒｕｅら， ＥＭＢＱ Ｊ．， ２００２； ２１（３）：４２７－３９（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）、Ａｒｇ３３６のグアニジウム基が、このコンホメーションの安定化を補助すると考えられる。Ａｒｇ３３６によって提供される安定性は、この位置における置換が改変されたＴｄＴタンパク質の反応性に対して負の影響を有する理由を説明する一助となり得る。場合によっては、位置３３６を改変することによって作り出される不安定性は、ｃｉｓ－ペプチド結合コンホメーションを安定化させるためにプロリン残基を使用することによって克服され得る。しかし、Ａｒｇ３３６が、例えば、アラニンまたはグリシンで置換される場合、ＴＧＳＲモチーフ全体（位置４５１、４５２、４３５、４５４）はまた、この変化を補償するように改変されなければならないこともある。例えば、ＴＧＳＲモチーフは、ＴＰＳＲまたはＴＧＰＲへと改変され得る。従って、ＴＧＳＲモチーフは、上記の構造モデルにおけるＧｌｙ４５２を含め、改変のために標的化された。
他方で、ＴｄＴファミリーの配列分析は、位置４５４において融通され得る広い範囲のアミノ酸を示す。この分析は、位置４５４および周りの残基における構造上の融通性を示唆する。別の実施形態において、３’－Ｏ－ブロッキング基の立体的かさ高さを融通するＡｒｇ４５４における置換は、Ａｒｇ４５４におけるグリシンまたはアラニンの置換を補償するために、α１４領域に対してさらなる改変を要求し得る。他の実施形態において、α１１領域における他の残基に対する置換は、ＴＧＳＲモチーフの改変の代わりに、またはその改変に加えてかのいずれかで、Ａｒｇ３３６に対する置換を補償するために必要とされ得る。
Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ４５４に対する改変は、３’－Ｏ－改変されたｄＮＴＰｓの結合相互作用を変化させ得るが、それはまた、３’－Ｏ－改変されたｄＮＴＰｓとＴｄＴとの改善された立体的相互作用を生じる置換を探索するために必要であり得る。３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰｓの増大した基質利用を示す計算上推測された酵素改変体を試験するために、特異的アミノ酸置換を特定する合成遺伝子を、適切なプラスミドベクターにおいて生成し、細胞に導入した。発現および単離の後、タンパク質改変体を、選択された３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログでのポリメラーゼ取り込みアッセイによって、活性に関してスクリーニングした。図５は、種々の合成して生成したマウスＴｄＴ改変体のスクリーニングの結果を示す。いくつかの実施形態において、単一のアミノ酸配変化が、重要であるが、他に、１個および２個のアミノ酸の組み合わせがまた、３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰｓの増大した取り込みを生じる。マウスＴｄＴのＧｌｙ３３２、Ｇｌｙ３３３、Ｇｌｙ４５２、Ｔｈｒ４５１、Ｔｒｐ４５０、Ｓｅｒ４５３、およびＱ４５５のような残基との相互作用は、重要である。これらの残基の各々は、代表的なｄＮＴＰの３’－ＯＨの０．６ｎｍ以内にある。これらの残基はまた、３’－Ｏ－アジドメチルまたは３’－Ｏ－アミノオキシのような３’－ブロッキング基の特別な立体的かさ高さを許容する置換の潜在的な標的である。Ｇｌｕ４５７、Ａｌａ５１０、Ａｓｐ５０９、Ａｒｇ５０８、Ｌｙｓ１９９、Ｓｅｒ１９６、Ｍｅｔ１９２、Ｇｌｕ１８０またはＬｅｕ１６１のような３’－ＯＨの１．２ｎｍ以内にある残基はまた、３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰの基質利用に潜在的に干渉し得るので、Ａｒｇ３３６およびＡｒｇ４５４に加えて、または組み合わせにおいて、置換の標的である。目的のさらなる残基としては、Ａｒｇ４６１およびＡｓｎ４７４が挙げられる。
ＴＧＳＲおよびＧＧＦＲＲモチーフがここで強調されるが、隣接するアミノ酸（例えば、Ｔｈｒ３３１、Ｇｌｙ３３７、Ｌｙｓ３３８、Ｇｌｙ３４１、またはＨｉｓ３４２）に対する改変はまた、本明細書で考察されるとおりの３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰｓの増大した取り込みを提供する（単独でまたは組み合わせにおいて）ことに関して企図される。増大した取り込みの能力がある種々のインシリコモデル化ＴｄＴ改変は、以下の実施例２において考察される。
位置５００～５１０におけるアミノ酸改変に加えて、３’－Ｏ－ブロッキング基との干渉を除去するために残基を欠失させることが必要であり得る。これらのアミノ酸は、タンパク質のＣ末端付近に位置し、比較的個増加されていない領域に存在することから、それらは、上記で記載される改変の代わりに、または組み合わせとのいずれかにおいて、１つずつまたはまとめて欠失され得る。ある特定の実施形態において、改変されたＴｄＴへの残基の挿入、例えば、ＧＧＦＲＲもしくはＴＧＳＲモチーフまたは隣接する領域への残基の挿入は、改変されたＴｄＴによる３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰの増大した取り込み率を可能にし得る。ＴｄＴ改変は、ＧＧＦＲＲモチーフのＰｈｅ３３４残基とＡｒｇ３３５残基（またはその置換）との間へのチロシン残基の挿入を含み得る。
本発明の改変されたＴｄＴは、図５において記載されるものを含む。改変されたＴｄＴは、Ｅ１８０Ｌ、Ｅ１８０Ｒ、Ｅ１８０Ｄ、またはＥ１８０Ｋを含むＧｌｕ１８０に対する改変のうちの１またはこれより多くを含み得る。Ｍｅｔ１９２に対する企図された改変としては、例えば、Ｍ１９２Ｅ、Ｍ１９２Ｗ、Ｍ１９２Ｋ、またはＭ１９２Ｒが挙げられる。Ｇｌｎ４５５に対する企図された改変としては、例えば、Ｑ４５５Ｉが挙げられる。Ｔｒｐ４５０に対する企図された改変としては、例えば、Ｗ４５０Ｈが挙げられる。ＡＲＧ４５４に対する企図された改変としては、例えば、Ｒ４５４Ｉ、Ｒ４５４Ｋ、Ｒ４５４Ａ、またはＲ４５４Ｔが挙げられる。Ａｒｇ４６１に対する企図された改変としては、例えば、Ｒ４６１Ｖが挙げられ、Ａｓｎ４７４に対する改変としては、Ｎ４７４Ｒが挙げられ得る。種々の実施形態において、２またはこれより多くの改変された残基の組み合わせが使用され得る（例えば、Ｅ１８０Ｄ＋Ｗ４５０Ｈ、Ｅ１８０Ｋ＋Ｒ４５４Ａ、Ｍ１９２Ｋ＋Ｅ１８０Ｋ、Ｅ１８０Ｋ＋Ｒ４５４Ｉ、Ｅ１８０Ｄ＋Ｍ１９２Ｅ、Ｅ１８０Ｄ＋Ｍ１９２Ｅ＋Ｒ４５４Ｔ、またはＥ１８０Ｋ＋Ｗ４５０Ｈのような）。
以下で示されるように、大部分のＴｄＴｓは、ＧＧＦＲＲおよびＴＧＳＲモチーフを含む。以下の配列において、そのＧＧＦＲＲおよびＴＧＳＲモチーフは、容易な参照のために太字および下線が付されている。天然の仔ウシ胸腺ＴｄＴは、適切なテンプレート非依存性ポリメラーゼを達成するための、一次構造の変更の候補である。しかし、種々の他のタンパク質が、３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログとの使用に適した候補を同定するために探索され得る（ヒトおよびマウスＴｄＴが挙げられる）。天然の仔ウシＴｄＴに対応するアミノ酸配列は、表１において配列番号１として列挙される一方で、その核酸配列は、表２において配列番号２として列挙される。いくつかの実施形態において、３’－Ｏ－改変されたｄＮＴＰｓおよびＮＴＰｓでの配列特異的デノボポリヌクレオチド合成に適合された、得られたタンパク質は、配列番号１と少なくとも８５％ 同一、すなわち、少なくとも９０％ 同一、すなわち、少なくとも９３％ 同一、すなわち、少なくとも９５％ 同一、すなわち、少なくとも９７％ 同一、すなわち、少なくとも９８％ 同一、すなわち、少なくとも９９％ 同一である。さらに、ウシＴｄＴのアミノ酸配列の一部を短縮し、触媒活性をなお維持することは可能であり得る。
Figure 2022513371000002
Figure 2022513371000003
Figure 2022513371000004
さらに、組換えタンパク質の単離をより容易にするために、アフィニティーカラム（Ｈｉｔｒａｐ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）と組み合わせて使用されるＮ末端Ｈｉｓタグ配列を組換えタンパク質に付加することは一般的である（Ｂｏｕｌｅ Ｊ－Ｂら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９８；１０：１９９－２０８（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。あるいは、Ｈｉｓタグ配列を付加した酵素のＮ末端短縮化形態は、本発明で機能する（例えば、米国特許第７，４９４，７９７号（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。Ｈｉｓタグ化ウシＴｄＴアミノ酸配列は、以下の表３、５、および７において示される一方で、Ｈｉｓタグ化ウシＴｄＴ核酸配列は、以下の表４、６、および８に示される。Ｈｉｓタグは、必要とされる場合に、他の位置において操作され得る。いくつかの実施形態において、３’－Ｏ－改変されたｄＮＴＰｓおよびＮＴＰｓでの配列特異的デノボポリヌクレオチド合成に適合された、得られたタンパク質は、配列番号３、５、または７と少なくとも８５％ 同一、すなわち、少なくとも９０％ 同一、すなわち、少なくとも９３％ 同一、すなわち、少なくとも９５％ 同一、すなわち、少なくとも９７％ 同一、すなわち、少なくとも９８％ 同一、すなわち、少なくとも９９％ 同一である。
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種々の３’－Ｏ－改変されたｄＮＴＰｓおよびＮＴＰｓは、デノボ合成のために開示されるタンパク質とともに使用され得る。いくつかの実施形態において、好ましい除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング基は、３’－Ｏ－アミノ、３’－Ｏ－アリルまたは３’－Ｏ－アジドメチルである。他の実施形態において、上記除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング部分は、Ｏ－フェノキシアセチル；Ｏ－メトキシアセチル；Ｏ－アセチル；Ｏ－（ｐ－トルエン）－スルホネート；Ｏ－ホスフェート；Ｏ－ニトレート；Ｏ－［４－メトキシ］－テトラヒドロチオピラニル；Ｏ－テトラヒドロチオピラニル；Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロフラニル；Ｏ－［２－メチル，４－メトキシ］－テトラヒドロピラニル；Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロピラニル；およびＯ－テトラヒドロチオフラニルからなる群より選択される（米国特許第８，１３３，６６９号を参照のこと）。他の実施形態において、上記除去可能なブロッキング部分は、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カーボネート、カルバメート、ヒドロキシルアミン、ボレート、ニトレート、糖、ホスホルアミド、ホスホルアミデート、フェニルスルフェネート、スルフェート、スルホンおよびアミノ酸からなる群より選択される（Ｍｅｔｚｋｅｒ ＭＬら Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９４；２２（２０）：４２５９－６７、米国特許第５，７６３，５９４号、同第６，２３２，４６５号、同第７，４１４，１１６号；および同第７，２７９，５６３号（これらは全て、それらの全体において参考として援用される）を参照のこと）。
例示的な３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログの合成
図６は、４つの例示的な３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログ、すなわち、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰ、および３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰを示す。各３’－Ｏ－アジドメチルアナログの合成は、以下に記載され、図７～１２に詳述される。上記３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログはまた、専門業者（例えば、Ａｚｃｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ， ＣＡ）から購入され得る。対応する３’－Ｏ－ブロックされたリボヌクレオチドが、特注のＲＮＡオリゴの作製を可能にするために類似の合成法で形成され得ることは、理解されるべきである。
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ： 図７を参照すると、ＤＭＳＯ（１２ｍｌ）、酢酸（５．５ｍｌ）および無水酢酸（１７．６ｍｌ）中のＮ６－ベンゾイル－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシアデノシン（３．０ｇ； ６．３８ｍｍｏｌ）［ＣＮＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ］の溶液を調製した。その混合物を、室温において４８時間撹拌した。およそ１００ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液を添加し、その水性層を、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。その合わせた有機抽出物を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。その残渣を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、１：１～１：４）によって精製して、Ｎ６－ベンゾイル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシアデノシン（図７に化合物１として示される）を白色粉末として回収した（２．４ｇ； ７１％ 収率）。４００ｍｇのＮ６－ベンゾイル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシアデノシンを、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（７ｍｌ）中に窒素下で溶解して、溶液（０．７６ｍｍｏｌ）を作製した。次いで、シクロヘキサン（４００μｌ）、およびＳＯ２Ｃｌ２（１５５μｌ； １．９１ｍｍｏｌ， 再蒸留）を添加した。その反応混合物を、０℃において２時間撹拌した。次いで、その溶媒を減圧下で、次いで、高真空ポンプ下で１０分間除去した。その得られた残渣を、乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解し、ＮａＮ３（４００ｍｇ； ６．６ｍｍｏｌ）と室温において３時間反応させた。その反応混合物を、蒸留水（５０ｍｌ）中に分散させ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。その合わせた有機層を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。その残渣をＭｅＯＨ（５ｍｌ）中に溶解し、ＮＨ４Ｆ（３００ｍｇ； ８．１ｍｍｏｌ）とともに室温において２４時間撹拌した。次いで、その溶媒を減圧下で除去した。その反応混合物を減圧下で濃縮し、水とＣＨ２Ｃｌ２との間で分配した。その有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濃縮後、その粗製生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール）によって精製して、Ｎ６－ベンゾイル－３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシアデノシン（化合物２；図７）を白色粉末として生成した（１５０ｍｇ； ４８％ 収率）。次いで、Ｎ６－ベンゾイル－３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシアデノシン（１２３ｍｇ； ０．３ｍｍｏｌ）およびプロトンスポンジ（７５．８ｍｇ； ０．３５ｍｍｏｌ）を、真空デシケーター中で、Ｐ２Ｏｓで一晩乾燥させ、その後、トリメチルメチルホスフェート（６００μｌ）中に溶解した。次に、新たに蒸留したＰＯＣｌ３（４０μｌ； ０．３５ｍｍｏｌ）を、０℃において滴下し、その混合物を、０℃において２時間撹拌した。その後、無水ＤＭＦ（２．３３ｍｌ）中のトリブチルアンモニウムピロホスフェート（５５２ｍｇ）およびトリブチルアミン（０．５５ｍｌ； ２．３１ｍｍｏｌ）の混合物を、室温において添加し、３０分間撹拌した。次いで、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液溶液（ＴＥＡＢ）（０．１Ｍ； ｐＨ８．０； １５ｍｌ）を添加し、その混合物を、１時間、室温において撹拌した。その後、濃ＮＨ４ＯＨ（１５ｍｌ）を添加し、一晩室温において撹拌した。得られた混合物を真空下で濃縮し、その残渣を５ｍｌの水で希釈した。次いで、その粗製混合物を、４℃において、ＴＥＡＢの勾配（ｐＨ８．０； ０．１～１．０Ｍ）を使用して、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５上でのアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。その粗製生成物を、逆相ＨＰＬＣで精製して、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ（図７， 化合物３）、後の合成に使用されるヌクレオチドアナログを生成した。
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰ： 酢酸（４．８ｍｌ）および無水酢酸（１５．４ｍｌ）を、ＤＭＳＯ中の５’－Ｏ－（ｔｅｒｔブチルジメチルシリル）チミジン（２．０ｇ； ５．６ｍｍｏｌ）［ＣＮＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ］の撹拌溶液に添加した。その反応混合物を、室温において４８時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍｌ）を添加し、その水性層を酢酸エチルで抽出した（３×１００ｍｌ）。その合わせた有機抽出物を、ＮａＨＣＯ３の飽和溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濃縮後、その粗製生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって精製して、３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）チミジン（図８； 化合物４）を白色粉末として生成した（１．７５ｇ； ７５％ 収率）。次いで、およそ１グラムの３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）チミジンを、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）中に窒素下で溶解した。この混合物に、シクロヘキサン（１．３３ｍｌ）およびＳＯ２Ｃｌ２（２８４ｍ１； ３．５ｍｍｏｌ， 再蒸留）を添加した。次いで、その得られた混合物を、０℃において１．５時間撹拌した。次いで、その溶媒を減圧下で、次いで、高真空下で１０分間除去した。その残渣を乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解し、ＮａＮ３（９２６ｍｇ； １５．４ｍｍｏｌ）と室温において３時間反応させた。次に、その反応混合物を、蒸留水（５０ｍｌ）中に分散させ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３×５０ｍｌ）。その合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。その残渣をＭｅＯＨ（５ｍｌ）中に溶解し、ＮＨ４Ｆ（６００ｍｇ； １６．２ｍｍｏｌ）と室温において２４時間反応させた。その反応混合物を減圧下で濃縮し、水とＣＨ２Ｃｌ２との間で分配した。次いで、その有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濃縮後、その残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって精製して、３’－Ｏ－（アジドメチル）チミジン（図８， 化合物５）を白色粉末として生成した（５５０ｍｇ； ７１％ 収率）。次に、その３’－Ｏ－（アジドメチル）チミジンおよびプロトンスポンジ（０．３５ｍｍｏｌ）を、真空デシケーター中で、Ｐ２Ｏ５で一晩乾燥させ、その後、トリメチルメチルホスフェート（６００μｌ）中に溶解した。次に、新たに蒸留したＰＯＣｌ３（４０μｌ； ０．３５ｍｍｏｌ）を０℃において滴下し、その混合物を０℃において２時間撹拌した。その後、無水ＤＭＦ（２．３３ｍｌ）中のトリブチルアンモニウムピロホスフェート（５５２ｍｇ）およびトリブチルアミン（０．５５ｍｌ； ２．３１ｍｍｏｌ）の混合物を、室温において添加し、３０分間撹拌した。次いで、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（ＴＥＡＢ）（０．１Ｍ； ｐＨ８．０； １５ｍｌ）を添加し、その混合物を１時間、室温において撹拌した。その後、濃ＮＨ４ＯＨ（１５ｍｌ）を添加し、一晩室温において撹拌した。その得られた混合物を真空下で濃縮し、その残渣を５ｍｌの水で希釈した。次いで、その粗製混合物を、４℃において、ＴＥＡＢの勾配（ｐＨ８．０； ０．１～１．０Ｍ）を使用して、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５上でのアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。その粗製生成物を、逆相ＨＰＬＣで精製して、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰ（図８， 化合物６）、後の合成に使用されるヌクレオチドアナログを生成した。
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ： ３．５グラムのＮ４－ベンゾイル－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシシチジン［ＣＮＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ］を、１４．７ｍｌのＤＭＳＯに添加して、７．６５ｍｍｏｌ 溶液を生成した。この溶液に、酢酸（６．７ｍｌ）および無水酢酸（２１．６ｍｌ）を添加し、その反応混合物を室温において４８時間撹拌した。次いで、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍｌ）を添加し、その水性層をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３×１００ｍｌ）。その合わせた有機抽出物をＮａＨＣＯ３の飽和溶液で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濃縮後、その粗製生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、Ｎ４－ベンゾイル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシシチジン（図９； 化合物７）を白色粉末として生成した（２．９ｇ； ７３％ 収率）。８ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中に、Ｎ４－ベンゾイル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシシチジン（５５８ｍｇ； １．０４ｍｍｏｌ）を溶解し、次いで、シクロヘキサン（５６０ｍ１）およびＳＯ２Ｃｌ２（２２０ｍｌ； ２．７ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を０℃において１時間撹拌した。次いで、その揮発物を減圧下で除去した。その残留する残渣を、乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解し、ＮａＮ３（４００ｍｇ； ６．６ｍｍｏｌ）と室温において２時間反応させた。その反応混合物を蒸留水（５０ｍｌ）中に分散させ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３×５０ｍｌ）。その合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。その残渣をＭｅＯＨ（５ｍｌ）中に溶解し、ＮＨ４Ｆ（６００ｍｇ； １６．２ｍｍｏｌ）と室温において２４時間反応させた。その溶媒を減圧下で除去した。その得られた残渣を、水（５０ｍｌ）の中に懸濁し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３×５０ｍｌ）。その合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。その粗製生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって精製して、Ｎ４－ベンゾイル－３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシシチジン（図９， 化合物８）を白色粉末として生成した（２００ｍｇ； ５０％ 収率）。次に、そのＮ４－ベンゾイル－３’－Ｏ－（アジドメチル）－２’－デオキシシチジンおよびプロトンスポンジ（０．３５ｍｍｏｌ）を真空デシケーター中で、Ｐ２Ｏｓで一晩乾燥させ、その後、トリメチルメチルホスフェート（６００μｌ）中に溶解した。次いで、新たに蒸留したＰＯＣｌ３（４０μｌ； ０．３５ｍｍｏｌ）を０℃において滴下し、その混合物を０℃において２時間撹拌した。その後、無水ＤＭＦ（２．３３ｍｌ）中のトリブチルアンモニウムピロホスフェート（５５２ｍｇ）およびトリブチルアミン（０．５５ｍｌ； ２．３１ｍｍｏｌ）の混合物を室温において添加し、３０分間撹拌した。次いで、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（ＴＥＡＢ）（０．１Ｍ； ｐＨ８．０； １５ｍｌ）を添加し、その混合物を１時間、室温において撹拌した。その後、濃ＮＨ４ＯＨ（１５ｍｌ）を添加し、一晩室温において撹拌した。その得られた混合物を真空下で濃縮し、その残渣を５ｍｌの水で希釈した。次いで、その粗製混合物を、４℃において、ＴＥＡＢの勾配（ｐＨ８．０； ０．１～１．０Ｍ）を使用して、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５上でのアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。その粗製生成物を、逆相ＨＰＬＣで精製して、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＣＴＰ（図９， 化合物９）、後の合成に使用されるヌクレオチドアナログを生成した。
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰ： 乾燥ＤＭＳＯ（２１ｍｌ）中のＮ２－イソブチリル－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシグアノシン（５ｇ； １１．０ｍｍｏｌ）［ＣＮＨ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｗｏｂｕｒｎ， ＭＡ］の撹拌溶液に、酢酸（１０ｍｌ）および無水酢酸（３２ｍｌ）を添加した。その反応混合物を室温において４８時間撹拌した。飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１００ｍｌ）を添加し、その水性層を酢酸エチルで抽出した（３×１００ｍｌ）。その合わせた有機抽出物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濃縮後、その粗製生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ）によって精製して、Ｎ２－イソブチリル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシグアノシン（図１０， 化合物１０）を白色粉末として生成した（３．９ｇ； ６９％ 収率）。１グラムのＮ－イソブチリル－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシグアノシンを、その後、乾燥ピリジン（２２ｍｌ； ２．０ｍｍｏｌ）に、ジフェニルカルバモイルクロリド（６７７ｍｇ； ２．９２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；ＳＩＧＭＡ）（１．０２ｍｌ； ５．９ｍｍｏｌ）とともに添加した。その反応混合物を、窒素雰囲気下で室温において３時間撹拌した。その溶媒を高真空下で除去した。その粗製生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、Ｎ２－イソブチリル－Ｏ６－（ジフェニルカルバモイル）－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシグアノシン（図１０， 化合物１１）を生成したところ、これは、黄色が買った粉末として出現した（１．０９ｇ； ８０％ 収率）。次いで、Ｎ２－イソブチリル－Ｏ６－（ジフェニルカルバモイル）－３’－Ｏ－（メチルチオメチル）－５’－Ｏ－（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）－２’－デオキシグアノシンを、乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１．１ｍｍｏｌ）中に溶解し、窒素雰囲気下で０℃において１．５時間撹拌した。その溶媒を、減圧下で、次いで、高真空下で１０分間除去した。その得られた残渣を乾燥ＤＭＦ（５ｍｌ）中に溶解し、ＮａＮ３（６００ｍｇ； １０ｍｍｏｌ）と室温において３時間反応させた。次いで、その反応混合物を蒸留水（５０ｍｌ）中に分散させ、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３×５０ｍｌ）。その合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。その得られた残渣をＭｅＯＨ（５ｍｌ）中に溶解し、ＮＨ４Ｆ（５００ｍｇ； １３．５ｍｍｏｌ）と室温において２４時間反応させた。その溶媒を減圧下で除去した。その残渣を水（５０ｍｌ）の中に懸濁し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（３×５０ｍｌ）。その合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。その粗製生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって精製して、Ｎ２－イソブチリル－Ｏ６－（ジフェニルカルバモイル）－３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシグアノシン（図１０， 化合物１２）を白色粉末として生成した（２３０ｍｇ； ３６％ 収率）。最後に、そのＮ２－イソブチリル－Ｏ６－（ジフェニルカルバモイル）－３’－Ｏ－アジドメチル－２’－デオキシグアノシンおよびプロトンスポンジ（０．３５ｍｍｏｌ）を、真空デシケーター中で、Ｐ２Ｏｓで一晩乾燥させ、その後、トリメチルメチルホスフェート（６００μｌ）中に溶解した。次いで、新たに蒸留したＰＯＣｌ３（４０μｌ； ０．３５ｍｍｏｌ）を０℃において滴下し、その混合物を０℃において２時間撹拌した。その後、無水ＤＭＦ（２．３３ｍｌ）中のトリブチルアンモニウムピロホスフェート（５５２ｍｇ）およびトリブチルアミン（０．５５ｍｌ； ２．３１ｍｍｏｌ）の混合物を室温において添加し、３０分間撹拌した。次いで、炭酸水素トリエチルアンモニウム溶液（ＴＥＡＢ）（０．１Ｍ； ｐＨ８．０； １５ｍｌ）を添加し、その混合物１時間、室温において撹拌した。その後、濃ＮＨ４ＯＨ（１５ｍｌ）を添加し、一晩室温において撹拌した。その得られた混合物を真空下で濃縮し、その残渣を５ｍｌの水で希釈した。次いで、その粗製混合物を、４℃において、ＴＥＡＢの勾配（ｐＨ８．０； ０．１～１．０Ｍ）を使用して、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５上でのアニオン交換クロマトグラフィーで精製した。その粗製生成物を、逆相ＨＰＬＣで精製して、３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰ（図１０， 化合物１３）、後の合成に使用されるヌクレオチドアナログを生成した。
図２に関して記載されるように、３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰまたは３’－Ｏ－ブロックされたｒＮＴＰが一旦添加されたら、さらなるｄＮＴＰｓまたはｒＮＴＰｓが添加され得るように、ブロッキング基を除去することは必要である。いくつかの実施形態において、その３’－Ｏ－ブロッキング基を、高温の中性の水性溶液中のパラジウム触媒、ｐＨ２までの塩酸、還元剤（例えば、メルカプトエタノール）で、またはトリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィンの添加によって除去し得る。例えば、米国特許第６，６６４，０７９号； Ｍｅｎｇら， Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．． ２００６， ７１（８１）：３２４８－５２； Ｂｉら， Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ２００６： ２５４２－２５４３、米国特許第７，２７９，５６３号、および米国特許第７，４１４，１１６号（これらは全て、それらの全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと。他の実施形態において、３’－置換基は、ＵＶ照射によって除去され得る（例えば、ＷＯ ９２／１０５８７（その全体において本明細書に参考として援用される）を参照のこと）。いくつかの実施形態において、３’－Ｏ－ブロッキング基の除去は、化学的切断を含まないが、アルカリホスファターゼのような切断酵素を使用する。
３’－Ｏ－メトキシメチル－ｄＴＴＰ： ５’－Ｏ－ベンゾイルチミジン（１７３ｍｇ， ０．５ｍｍｏｌ， １当量）を、１０ｍＬのジクロロメタン中、アルゴン下で周囲温度において溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（１２８ｍｇ， １ｍｍｏｌ， ２当量）を添加し、続いて、メトキシメチルブロミド（１２４ｍｇ、１ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。その混合物を周囲温度において１８時間撹拌した。その混合物を１０ｍＬ ジクロロメタンで希釈し、これを、２０ｍＬの５％ 水性ＨＣｌ、およびブラインで連続して洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、エバポレートした。５’－Ｏ－ベンゾイル－３’－Ｏ－メトキシメチルチミジン（５０ｍｇ， ０．１３ｍｍｏｌ）を５ｍＬの濃水酸化アンモニウム中に周囲温度において溶解した。その混合物を周囲温度において一晩撹拌した。その混合物を希釈し、１０ｍＬ 部分のジクロロメタンで３回抽出した。その合わせた抽出物をブラインで洗浄した。その有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、エバポレートした。３’－Ｏ－メトキシメチルチミジン（２３ｍｇ， ０．０８ｍｍｏｌ）を、ピリジン（１．５ｍＬ×３）と共エバポレートし、一晩高真空下で乾燥させた。そのヌクレオシドを、１．５ｍＬのトリメチルホスフェートおよび０．６ｍＬ 乾燥ピリジンの混合物中に、Ａｒ下で溶解した。その混合物を、アイスバスの中で冷却し、１０μＬのＰＯＣｌ３の第１のアリコートを滴下した。５分後に、１０μＬの第２のアリコートを添加した。その混合物をさらに３０分間撹拌した。乾燥ＤＭＦ（１．２５ｍＬ）中のＴＢＡリン酸塩の溶液を、バイアルに入れてＡｒ下でアイスバスの中で冷却した。これを、ｒｘｎ混合物に１０秒間かけて滴下した。直ぐに、予め秤量しておいた固体プロトンスポンジ（２１ｍｇ， １．２５当量）を、固体として一度に添加した。その混合物を、この添加の後に２５分間撹拌し、５ｍＬの冷ＴＥＡＢ緩衝液でクエンチした。その混合物をアイスバスの中で１０分間撹拌し、次いで、ＦＰＬＣ分離のために小さなＲＢフラスコに移した。最終分離を、０．１ｍＭ ギ酸を含む水／アセトニトリル勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって達成した。
３’－Ｏ－メチルチオメチル－ｄＣＴＰ： ２５ｍＬのメタノール中のデオキシシチジン（１ｇ， ４．４ｍｍｏｌ）の懸濁物に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（１．７５ｍＬ， １３．２ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を一晩周囲温度において撹拌した。その反応混合物をエバポレートし、その残渣を、溶離液としてＤＣＭ／メタノール勾配を使用してフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。Ｎ６－ホルムアミジノ－５’－Ｏ－ベンゾイルデオキシ－３’－Ｏ－メチルチオメチルデオキシシチジン（２５０ｍｇ， ０．４１ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬのメタノールおよび１０ｍＬの水性濃水酸化アンモニウム中に溶解した。その混合物を周囲温度において１８時間撹拌し、次いで、減圧下でエバポレートした。その残渣を、カラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／メタノール ９８：２～９０：１０）によって精製して、１７０ｍｇ（９３％）の所望のヌクレオシドをわずかに黄色の固体として得た。２５ｍＬ バイアル中の３’－Ｏ－メチルチオメチルデオキシシチジン（２５．０ｍｇ， ０．０９ｍｍｏｌ）を、無水ピリジンと共エバポレートし（３×ｌｍＬ）、週末にわたって乾燥させた。トリメチルホスフェート（０．７ｍＬ）を添加して、そのヌクレオシドを溶解し、アイスバスの中で０℃へと冷却した。塩化ホスホリル（２８μＬ， ０．３ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し（１２μＬ、５分後に８μＬ、３０分後に８μＬ）、その反応物を２時間、０℃において撹拌した。ピロリン酸水素ジ（テトラブチルアンモニウム）を無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中に溶解し、この混合物を０℃へと冷却し、その反応混合物に添加した。プロトンスポンジ（９．２ｍｇ， ０．０４ｍｍｏｌ）を添加し、その反応物を０℃において２時間撹拌した。その反応混合物に、１Ｍ 炭酸水素トリエチルアンモニウム緩衝液（ＴＥＡＢ）（２ｍＬ）を添加し、その混合物を１時間撹拌した。次いで、その混合物を丸底フラスコに移し、５０ｍＬ×３のｍｉｌｉＱ水を添加し、混合物を乾燥するまで濃縮した。その残渣をｍｉｌｉＱ水（１１ｍＬ）中に溶解し、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣへと室温において載せた。そのトリホスフェートを含む画分（Ｆ４８～Ｆ５２）を、減圧下で４０℃においてエバポレートし、次いで、その残渣を凍結乾燥した。そのトリホスフェートを乾燥させて、所望のトリホスフェート（１２ｍｇ， １６．５％）を得た。
実施例１： タンパク質改変
マウス（ｍｕｒ）ＴｄＴ改変体は、３８０ａａの合成遺伝子に由来した。この骨格は、ＷＴマウスＴｄＴの短縮化バージョンであり、ＥＴ配列のアミノ酸ＸＸで出発し、アミノ酸ＸＸＸで終了する触媒コアを表す。化学合成したＴｄＴ構築物を、Ｎ末端６×ヒスチジンタグおよびエンテロキナーゼ切断部位を特徴とするｐＲＳＥＴ Ａ細菌発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｅｎｅＡｒｔ Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）にクローニングした。合成ＴｄＴプラスミドを、１００μｇ／ｍｌ カルベニシリンを含むＬＢアガープレート上にプレートしたＤＨ５α細胞（Ｂｉｏｐｉｏｎｅｅｒ）において維持した。発現のために、そのｐＲＳＥＴ Ａ－マウスＴｄＴプラスミドを、プラスミドおよび細胞を氷上で２０分間インキュベートし、続いて、４２℃において３０秒間のヒートショック、続いて、ＳＯＣ培地の添加および３７℃において３０～６０分間振盪しながらのインキュベーションによって、ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）へと形質転換した。ＳＯＣ培地を細胞に添加した後に、全体の容積（代表的には６０μｌ）を、１００μｇ／ｍＬ カルベニシリン＋３４μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを含むＬＢアガープレート上にプレートした。
１０ｍＬ培養物（２４ウェルプレート， Ｃｏｒｎｉｎｇ）からの細胞を、遠心分離（３０００×ｇ， １５分間）によって採取し、次いで、リゾチーム、プロテアーゼインヒビター、および１００ｍＭ ＮａＣｌを含むＢ－ＰＥＲ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）中で溶解した。ペレットをＴＢＳ緩衝液中に１×６０分間浸し、精製のために上清を集めた。その上清を、２４ウェルプレート中の５０μＬ Ｎｉ－ＮＴＡビーズ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）スラリーに３０分間結合させた。次いで、そのビーズスラリーを、３×５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭ ＮａＣｌ（５００μＬ）で洗浄し、続いて、４×５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ イミダゾール（２００μＬ）で洗浄した。次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール（５０μＬ）で、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ イミダゾール（１３０μＬ）で、最後に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１Ｍ イミダゾール（５０μＬ）で処理することによって、タンパク質を回収した。
回収した画分を、２．５μｌ サンプルを取り出し、８％ ＮｕＰａｇｅゲル（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）上で２００Ｖ、５０分間、変性条件で泳動することによって分析した。クーマシーブルーでゲル染色した。その溶離したタンパク質を、７．５ ＭＷＣＯ脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して緩衝液交換し、－８０℃において貯蔵した（貯蔵緩衝液＝２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ； ０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および１０％ グリセロール）。
活性スクリーニング：
ＴｄＴ活性スクリーニングを、種々の３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログおよびビオチン化オリゴヌクレオチドを使用するｄＮＴＰポリメラーゼ伸長反応を介して行った：
５Ｂｉｏｓ Ｇ／ＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＴ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
反応を、代表的には、９６ウェルプレートの中で提供した。反応を、以下の構成要素の最終濃度を有するマスターミックスを作製することによって行った： ０．２Ｕ ＰＰａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、１０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチド、７５μＭ ｄＮＴＰ（以下を参照のこと）、１×ＴｄＴ反応緩衝液（ＴｈｅｒｍＯ－Ｆｉｓｈｅｒの５×）を最終容積１０μｌになるまで。反応を、規定の容積（代表的には２μｌ）のＴｄＴ改変体を異なるウェルに添加し、その反応ミックスを３７℃において５分および６０分の時点にわたってインキュベートすることによって開始した。１０μｌ アリコートを除去し、５μｌの２５０ｍＭ ＥＤＴＡを添加することによって反応を終結させた。
試験したｄＮＴＰｓ：
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＴＴＰ（上記を参照のこと）
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＡＴＰ（上記を参照のこと）
３’－Ｏ－アジドメチル－ｄＧＴＰ（上記を参照のこと）
３’－Ｏ－ＭＯＭ－ｄＴＴＰ（上記を参照のこと）
３’－Ｏ－ＭＴＭ－ｄＣＴＰ（上記を参照のこと）
３’－アミノオキシ－ｄＴＴＰ（Ｆｉｒｅｂｉｒｄ ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＥＥＣ）
３’－アミノオキシ－ｄ ＡＴＰ（Ｆｉｒｅｂｉｒｄ ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ）
３’－アミノオキシ－ｄＧＴＰ（Ｆｉｒｅｂｉｒｄ ＢｉｏＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＥＥＣ）
３’－Ｏ－メチル－ｄＡＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＬＬＣ）
３’－Ｏ－メチル－ｄＧＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＬＬＣ）
３’－Ｏ－メチル－ｄＣＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＬＬＣ）
そのクエンチした反応ミックス中のビオチン化オリゴを、ストレプトアビジンビーズ（０．７７μｍ， Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）に結合させた。次いで、そのビーズをフィルタープレート（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に移し、水で数回洗浄した。そのオリゴヌクレオチドを、そのプレートを切断緩衝液（メタノール中の１０％ ジイソプロピル－アミン）とともに５０℃において３０分間インキュベートし、続いて、水中で溶離することによって、その固体支持体から切断した。その溶離したサンプルを乾燥させ、オリゴヌクレオチドサイズ分け標準（出発の４２－マーオリゴヌクレオチドよりおよそ１５～２０塩基小さいかまたは大きい２つのオリゴヌクレオチド（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を含む３０μｌ 水中に溶解した。次いで、オリゴヌクレオチドを、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（Ｏｌｉｇｏ Ｐｒｏ ＩＩ， Ａｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）によって伸長効率に関して分析した。
実施例２： インシリコモデル化
ＧＧＦＲＲおよびＴＧＳＲモチーフ、ならびに上記で考察した隣接するアミノ酸に対するいくつかのアミノ酸改変を、インシリコでモデル化して、上記で記載されるとおりの３’－Ｏ－ブロックされたｄＮＴＰアナログの増大した取り込みの能力のある改変を決定した。一重、二重、および三重のアミノ酸置換、ならびにアミノ酸挿入をモデル化した。以下の表１０は、増大した取り込みを誘発することが見出された改変を示す。アミノ酸位置を、マウスＴｄＴに言及して提供するが、任意のＴｄＴの保存された配列に適用可能である。表１０における行は、ＧＧＦＲＲモチーフにおけるかまたはそのモチーフに隣接する１またはこれより多くのアミノ酸に対する塩基改変を記載する。列は、他のアミノ酸（ＴＧＳＲモチーフにおけるかまたはそのモチーフに隣接するもの）に対する改変のさらなる組み合わせを含む。
Figure 2022513371000014
Figure 2022513371000015
Figure 2022513371000016
Figure 2022513371000017
援用の表示
他の文書（例えば、特許、特許出願、特許公報、学術雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ）への言及および引用は、本開示全体を通じて行われている。全てのこのような文書は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書に参考として援用される。
均等物
本発明の種々の改変およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本明細書で引用される科学文献および特許文献への言及を含めて、本文書の全内容から当業者に明らかになる。本明細書中の主題は、その種々の実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合され得る、重要な情報、説明およびガイダンスを含む。

Claims (20)

  1. ＧＧＦＲＲアミノ酸モチーフにおいて変異を含む改変された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）であって、前記改変されたＴｄＴは、除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング部分を含むヌクレオチドアナログを核酸イニシエーターの３’－ＯＨに付加し得る、改変された末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ。
  2. 前記改変されたＴｄＴは、天然のＴｄＴと比較して、増大した速度で前記除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング部分を含むヌクレオチドアナログを前記核酸イニシエーターの３’－ＯＨに付加し得る、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  3. 前記改変されたＴｄＴは、ＴＧＳＲアミノ酸モチーフにおいて変異をさらに含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  4. 前記改変されたＴｄＴは、Ｎ末端ｔ－１３８ウシＴｄＴおよび前記Ｎ末端に融合されたタンパク質タグ配列を含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  5. 前記改変されたＴｄＴは、Ｎ末端ｔ－１５１ウシＴｄＴおよび前記Ｎ末端に融合されたタンパク質タグ配列を含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  6. 前記改変されたＴｄＴは、Ｎ末端ｔ－１６０ウシＴｄＴおよび前記Ｎ末端に融合されたタンパク質タグ配列を含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  7. 前記改変されたＴｄＴは、除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング部分で改変された、アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンデオキシリボヌクレオチドを付加し得る、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  8. 前記ヌクレオチドは、２’－デオキシリボヌクレオチドである、請求項７に記載の改変されたＴｄＴ。
  9. 前記改変されたＴｄＴは、除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング部分で改変されたアデニン、シトシン、グアニン、およびウラシルリボヌクレオチドを付加し得る。請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  10. 前記除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング部分は、３’－Ｏ－アジドメチル基を含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  11. 前記除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング部分は、３’－Ｏ－アミノ基を含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  12. 前記除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング部分は、３’－Ｏ－アリル基を含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  13. 前記除去可能な３’－Ｏ－ブロッキング部分は、Ｏ－フェノキシアセチル；Ｏ－メトキシアセチル；Ｏ－アセチル；Ｏ－（ｐ－トルエン）スルホネート；Ｏ－ホスフェート；Ｏ－ニトレート；Ｏ－［４－メトキシ］－テトラヒドロチオピラニル；Ｏ－テトラヒドロチオピラニル；Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロフラニル；Ｏ－［２－メチル，４－メトキシ］－テトラヒドロピラニル；Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロピラニル；およびＯ－テトラヒドロチオフラニルからなる群より選択される、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  14. 前記改変されたＴｄＴは、３’－Ｏ－ブロックされたヌクレオチド５’－トリホスフェートを取り込み得、前記除去可能なブロッキング部分は、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カーボネート、カルバメート、ヒドロキシルアミン、ボレート、ニトレート、糖、ホスホルアミド、ホスホルアミデート、フェニルスルフェネート、スルフェート、スルホンおよびアミノ酸から選択される基を含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  15. 前記改変されたＴｄＴは、約３０℃の反応温度で改変されたヌクレオチドを取り込み得る、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  16. 前記改変されたＴｄＴは、３０℃～８０℃の反応温度で改変されたヌクレオチドを取り込み得る、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  17. 前記改変されたＴｄＴは、１０００μＭまたはこれ未満の濃度で改変されたヌクレオチドを取り込み得る、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  18. 前記改変されたＴｄＴは、１００μＭまたはこれ未満の濃度で改変されたヌクレオチドを取り込み得る、請求項１７に記載の改変されたＴｄＴ。
  19. 前記改変されたＴｄＴは、配列番号２、４、６、または８と少なくとも９０％同一である核酸配列を含むゲノムを有する生物によって発現される、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
  20. 前記ＧＧＦＲＲモチーフは、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、またはＨから選択される変異を含む、請求項１に記載の改変されたＴｄＴ。
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