CN116075593A - 用于聚脱氧核苷酸合成的经修饰的非模板依赖性酶 - Google Patents
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Abstract
本发明包含用于鉴定如经修饰的末端核苷酸基转移酶(TdT)等能够在不使用模板的情况下将包括可移除的3'‑O‑封闭部分的核苷酸与核酸引发剂结合的聚合酶的方法。本发明进一步包含所鉴定的聚合酶以及使用这些聚合酶从头合成预定寡核苷酸序列的方法。
Description
相关申请
本申请要求于2020年6月3日提交的美国申请序列第16/891,449号的优先权和权益,该美国申请的内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于从头合成具有期望序列并且不使用模板的多核苷酸的经修饰的酶。因此,本发明提供了制备用于研究、基因工程和基因疗法的不同序列和不同长度的多核苷酸文库的能力。
背景技术
大多数从头核酸序列是使用30多年前开发的固相亚磷酰胺技术合成的。该技术涉及对由对应于天然(或非天然)核酸碱基的亚磷酰胺试剂构建的序列进行顺序脱保护和合成。然而,亚磷酰胺核酸合成是长度受限的,因为长度大于200个碱基对(bp)的核酸经历高断裂速率和副反应。另外,亚磷酰胺合成产生有毒性副产物,并且这种废物的处置限制了核酸合成器的可用性,并且增加了合同低聚核苷酸生产的成本。(据估计,每年对寡核苷酸合成的需求造成了超过300,000加仑的危险化学废物,包含乙腈、三氯乙酸、甲苯、四氢呋喃和吡啶)。参见LeProust等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》,第38(8)卷,第2522-2540页,(2010),该文献通过引用整体并入本文)。因此,需要更有效且更具成本效益的寡核苷酸合成方法。
发明内容
本发明公开了经修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)酶,其可以用于在不存在模板的情况下从头合成寡核苷酸。
还公开了通过计算指导和饱和诱变的组合,以及随后的筛选以鉴定功能性突变体来产生非模板依赖性聚合酶的方法。天然TdT酶要么是无效率的,要么完全不能掺入在非模板依赖性合成方案中使用的不同的封闭的核苷酸类似物。本发明提供了各种TdT修饰,这些修饰扩展了酶关于封闭的核苷酸类似物,尤其是具有3'-O-封闭基团的核苷酸类似物的功能性。具体地,本发明的经修饰的TdT可以用于掺入3'-O-磷酸酯封闭的核苷酸类似物,其中野生型TdT可能无法这样做。
本发明的方法包含使用3'-O-封闭的核苷酸类似物和虾碱性磷酸酶(SAP)控制性地添加所选择核苷酸的核酸合成。
使用本发明的酶和方法,将可以更快且更廉价地合成从头多核苷酸。因此,本发明显著降低了合成定制核酸的总成本。具体地,该方法可以用于产生非模板依赖性转移酶,该转移酶可以使用经修饰的3'羟基封闭的核苷酸以逐步的方式合成定制寡核苷酸。由于存在终止基团,所以合成随着每个新碱基的添加而暂停,随后终止基团被切割,从而留下与天然存在的核苷酸基本上相同的多核苷酸(即,被酶识别为用于进一步核苷酸掺入的底物)。
本发明的方法和酶表示推进合成生物学向前发展的重要步骤,因为这些酶将允许水相、非模板依赖性寡核苷酸合成。此类方法表示对现有技术的改进,因为这些方法将大大减少在寡核苷酸合成期间产生的化学废物,同时允许产生较长的多核苷酸。此外,因为这些方法用生物方法替代化学方法,所以成本将降低,并且自动化合成系统的复杂性也将降低。在一实施例中,简单的五试剂递送系统可以用于以逐步的方式构建寡核苷酸并且将使得能够回收未使用的试剂。
附图说明
图1示出了来自以下文献的在不同时间点处由末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)和荧光链引发剂5'-Cy5-dA10构成的溶液相聚合反应的琼脂糖凝胶:Tjong等人“通过表面引发的酶聚合扩增DNA杂交的芯片上荧光检测(Amplified on-chipfluorescence detection of DNAhybridization by surface-initiated enzymaticpolymerization)”,《分析化学(Anal.Chem.)》,2011;83:5153-5159(2011)。
图2展示了示例性经修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的多核苷酸合成循环,其使用载体结合的引发剂和3'-O-封闭的核苷酸三磷酸,包含(A)掺入包括可切割的3'-O-封闭基团(由R表示)的核苷酸类似物和(B)去除3'-O-封闭基团,从而使下一个3'-O-封闭的核苷酸类似物能够被掺入,其中N=A、G、C或T。
图3示出了可商购获得的TDT和具有3'-O-叠氮基甲基-dCTP或3'-O-叠氮基甲基-dATP的核酸引发剂的溶液相反应时间进程的聚丙烯酰胺凝胶分析。泳道1-100bp序列梯大小标准,泳道2-寡核苷酸标准,泳道3-3'-O-叠氮基甲基-dCTP+TdT 15'反应时间,泳道4-1小时,泳道5-2小时,泳道6-4小时,泳道7-24小时,泳道8-3'-O-叠氮基甲基-dATP+TdT 15'反应时间,泳道9-1小时,泳道10-2小时,泳道10-4小时,泳道11-24小时,泳道12-dATP+TdT15'反应时间,泳道13-1小时,泳道14-4小时,泳道15-24小时。
图4示出了使用PDB晶体结构4129的TdT的活性位点的计算机生成的图像,该图像示出了各自络合到两种活性位点金属离子(大绿球)的3'-O-dATP类似物(蓝框、红框、橙框)的计算对接的催化生产位置。示出了非常接近引入的dNTP的残基以及诱变和筛选的靶标。
图5示出了被选择用于增加如本文所述的所选择的3'-O-封闭的dNTP类似物的掺入的TdT变体的表。
图6示出了可以用于使用如本文所述的经修饰的TdT合成定制DNA低聚物的示例性3'-O-叠氮基甲基脱氧核苷酸。
图7示出了用于产生3'-O-叠氮基甲基脱氧腺苷三磷酸(3'-O-叠氮基甲基-dATP)的合成方案。
图8示出了用于产生3'-O-叠氮基甲基脱氧胸苷三磷酸(3'-O-叠氮基甲基-dTTP)的合成方案。
图9示出了用于产生3'-O-叠氮基甲基脱氧胞苷三磷酸(3'-O-叠氮基甲基-dCTP)的合成方案。
图10示出了用于产生3'-O-叠氮基甲基脱氧鸟苷三磷酸(3'-O-叠氮基甲基-dGTP)的合成方案。
图11示出了用于产生3'-O-甲氧基甲基脱氧胸苷三磷酸(3'-O-M0M-dTTP)的合成方案。
图12示出了用于产生3'-O-硫代甲基脱氧胞苷三磷酸(3'-O-MTM-dCTP)的合成方案。
图13示出了CGE(毛细管凝胶电泳)迹线,该迹线示出了与化学合成的B)5'-FAM-TAATAATAATAATAATTTTTT-PO4-3'的真实标准物相比,化学合成的A)5'-FAM-TAATAATAATAATAATTTTT的真实标准物的迁移。
图14示出了CGE迹线,该迹线示出了通过用虾碱性磷酸酶处理去除3'-PO4。A)在用虾碱性磷酸酶处理之前化学合成的5'-TAATAATAATAATAATTTTT-PO4-3',以及在用B)4.1x10-4U/ul、C)1.23x 10-3U/ul、D)3.7x 10-3U/ul、E)1.1x 10-2、F)3.33x 10-2U/ul、G)1.0x10-1U/ul的虾碱性磷酸酶在37℃下处理1分钟之后化学合成的5'-TAATAATAATAATAATTTTT-PO4-3'。
图15示出了对以下进行比较的CGE迹线:A)用鼠WT TdT和无dNTP处理之后的5'-FAM-TAATAATAATAATAATTTTT;B)在37℃下用鼠WT TdT和500uM3'-PO4-dTTP处理60分钟之后的5'-FAM-TAATAATAATAATAATTTTT;C)在37℃下用鼠WT TdT和500uM 3'-PO4-dTTP处理60分钟,随后在37℃下用0.2单位的虾碱性磷酸酶处理15分钟之后的5'-FAM-TAATAATAATAATAATTTTT。
图16示出了对以下进行比较的CGE迹线:A)在37℃下用鼠WT TdT和无dNTP处理60分钟之后的5'-FAM-TAATAATAATAATAATTTTT-3';B)在37℃下用鼠TdT E180K+M192K+L381K+R454K+N474R和500uM 3'-PO4-dTTP处理60分钟之后的5'-FAM-TAATAATAATAATAATTTTT;C)在37℃下用鼠WT TdT和500uM 3'-PO4-dTTP处理60分钟,随后在37℃下用0.2单位的虾碱性磷酸酶处理15分钟之后的5'-FAM-TAATAATAATAATAATTTTT-3';D)通过用鼠WT TdT和dTTP处理5'-FAM-TAATAATAATAATAATTTTT-3'产生的均聚物dT延伸序列梯。
具体实施方式
本发明通过提供可以与核酸类似物一起使用的经修饰的酶来促进如DNA等多核苷酸的合成。使用所公开的方法,获得经修饰的非模板依赖性末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),其允许酶促介导的从头寡脱氧核苷酸的合成,由此使这些寡脱氧核苷酸能够用于基因合成的常规组装。本发明的酶本身适用于在固体载体上合成预定序列的多核苷酸的水基、酶介导的方法。
本发明的经修饰的酶将允许以逐步方法使用3'-O-封闭的dNTP类似物,以将起始核酸延伸到用户定义的序列中(参见图2)。此外,在每个核苷酸延伸步骤之后,反应物可以从固相载体回收并且再循环回原始试剂储库。一旦完成该步骤,将去除3'-O-封闭基团,从而允许循环重新开始。在延伸-恢复-去封闭-洗涤的n个循环结束时,全长单链聚脱氧核苷酸将从固相载体上切割并且分离以供后续使用。可以使用多种3'-O-封闭的脱氧核苷酸,但特定的3'-O-封闭基团的选择由以下决定:1)通过TdT使底物利用率最大化的最小可能体积,以及2)在最短时间段内在最温和并且优选地水性条件下去除封闭基团。
这种方法的成本节约将通过以比当前用作现有工业标准(即,小于1纳摩尔)的起始规模更低的起始规模利用最终寡核苷酸产物的更高产率来实现。这种酶法对基于阵列的形式的未来适应将允许甚至进一步并且更显著地降低可通过高度平行合成实现的长寡核苷酸的合成成本。此外,所提出的酶促合成方法仅使用水基化学物质(如缓冲液和盐),从而大大减少了由现有亚磷酰胺方法产生的有机废物的环境负担。
本发明的方法可以用于修饰末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),然而其它酶可以通过类似方法进行修饰。TdT可能是成功的起始酶,因为其能够在非模板依赖性聚合中使用单链引发引物进行3'-延伸活性。然而,在本文所述的本发明之前,尚未报道在不存在模板的情况下,3'-O-封闭的核苷酸通过酶掺入单链寡核苷酸中。事实上,如Chang和Bollum所报道的,3'-羟基的取代导致可用的转移酶完全无活性。参见Chang和Bollum,“末端转移酶的分子生物学(Molecular Biology of Terminal Transferase)”,《CRC生物化学评论(CRC Critical Reviews in Biochemistry),第21(1)卷,第27-52页(1986),该文献通过引用整体并入本文。尽管如此,当TdT与天然dNTP一起使用时(即,非3'-O-封闭的),并且在没有模板的情况下,寡核苷酸延伸继续而不停止。这种不受控制的掺入由图1所示的时间依赖性凝胶电泳图像证明。图1示出了在不同时间点处由末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)和荧光链引发剂5'-Cy5-dA10构成的溶液相聚合反应的琼脂糖凝胶。(经授权改编Tjong等人“通过表面引发的酶聚合扩增DNA杂交的芯片上荧光检测”,《分析化学》,2011;83:5153-5159(2011),该文献通过引用整体并入本文。)另外,TdT可以以接近定量的方式延伸引物,从而导致添加数千个核苷酸,而TdT可能接受多种经修饰和经取代的dNTP作为有效底物。此外,已经存在关于TdT的机械和结构信息的大量文库。参见Delarue等人,《欧洲分子 生物学学会杂志(EMBO J.)》2002;21(3):427-39;Gouge等人,《分子生物学杂志(J Mol Biol.)》2013年11月15日;425(22):4334-52以及Romain等人,《核酸研究》2009;37(14):4642-56,这两个文献均通过引用整体并入。
已知TdT可以使用在脱氧核糖糖环以及嘌呤/嘧啶核碱基处具有修饰和/或取代的底物。例如,TdT接受嘧啶的C5和嘌呤的C7的大量修饰。参见Sorensen等人,“大生物分子与DNA的酶促连接(Enzymatic Ligation of Large Biomolecules to DNA)”,《ACS纳米(ACS Nano)》2013.7(9):8098-104;Figeys等人,《分析化学》1994,66(23):4382-3;Li等人,《血细 胞计数(Cytometry)》,1995,20(2):172-80,所有这些文献均通过引用整体并入。在一些实例中,TdT可以甚至接受非核苷酸三磷酸。参见Barone等人,《核苷酸与核酸(Nucleotides and Nucleic Acids)》2001,20(4-7):1141-5,以及Alexandrova等人,《生物共轭化学 (Bioconjug Chem.)》,2007,18(3):886-93,这两个文献均通过引用整体并入。然而,现有技术中几乎没有证据表明TdT可以接受3'-O-封闭的核苷酸。参见例如,Knapp等人,《欧洲化学 杂志(Chem.Eur.J.)》,2011,17:2903,该文献通过引用整体并入本文。虽然缺乏TdT活性不是Knapp等人关注的焦点,但这些作者报道称他们用TdT测试了其3'-OH经修饰的类似物,并且没有看到这种相对较小的3'-OH修饰掺入寡核苷酸中。
天然TdT是非常有效的酶。已经证明,TdT可以使长度为1000至10,000个核苷酸的极长均聚脱氧核苷酸聚合(参见Hoard等人,《生物化学杂志(JofBiolChem)》,1969244(19):5363-73;Bollum,《酶(TheEnzymes)》,第10卷,纽约:学术出版社(New York:AcademicPress);1974.第141-71页;Tjong等人,《分析化学》,2011,83:5153-59,所有文献均通过引用整体并入)。由所有四个核苷酸组成的随机序列低聚物也已通过TdT聚合,然而没有报道在不存在模板的情况下合成有序的多核苷酸。参见Damiani等人,《核酸研究》,1982,10(20):6401-10,该文献通过引用整体并入本文。TdT对多核苷酸的载体结合的合成还受到与金表面上的自组装单层共价连接的150bps引发剂的均聚物合成的报道的支持。参见Chow等人,《美国化学学会杂志(JAmChemSoc)》2005;127:14122-3,以及Chow和Chilikoti,《朗缪尔 (Langmuir)》2007,23:11712-7,这两个文献均通过引用整体并入。这些作者还观察到dATP>dTTP>>dGTP≈dCTP的TdT对于掺入均聚物的偏好。在最近的报道中,Tjong等人证明了TdT介导的来自固定在玻璃表面上的引发剂引物的长(>1Kb)均聚物ssDNA的合成。
TdT的分布行为通过图3得以增强,该图示出了1-1.5kb均聚物的溶液相合成的时间进程。在每次添加未修饰的(天然)dNTP之后,酶解离,从而允许群体中任何链的随机延伸。此类系统中的产物长度的分布应遵循泊松分布(Poisson distribution),如由Bollum及其同事在1974年所报道的。如果TdT与终止核苷酸物种(即,3'-O-位置封闭的核苷酸物种)一起使用,则反应应进行完全,从而产生不是产物长度的分布,而是基本上单个核苷酸添加的纯产物。
尽管如此,如上所述,用3'-O-封闭的dNTP进行的核苷酸合成并不能用可商购获得的TdT蛋白进行。此事实通过图3得以增强,该图示出了用于使用可商购获得的重组TdT监测3'-O-叠氮基甲基dATP和3'-O-叠氮基甲基dCTP的溶液相掺入动力学的凝胶移位测定。图3中的数据清楚地表明,3'-O-经修饰的dNTP类似物是TdT的底物,即,与含有dATP作为阳性对照的反应相比,不存在多核苷酸延伸(泳道12至15)。图3因此补充了另外的证据:可商购获得的TdT不能通过掺入具有经修饰的3'-OH的dNTP来合成低聚物。
通过合适的修饰,各种不同的3'-O-封闭的dNTP类似物将适合于通过TdT控制核苷酸的添加。经修饰的3'-O-封闭的dNTP类似物包含但不限于3'-O-烯丙基、3'-O-叠氮基甲基、3'-O-NH2、S'-O-CH2N3、3'-O-ONHC(O)H、3'-O-CH2SSCH3和3'-O-CH2CN封闭基团。总的来说,3'-O-封闭基团的选择由以下决定:1)通过TdT使底物利用率最大化的最小可能体积,这可能影响动力学吸收,以及2)在最温和的去除条件下,优选地水性并且在最短时间内封闭基团。适用于本发明的3'-O-封闭基团描述于WO 2003/048387;WO 2004/018497;WO 1996/023807;WO 2008/037568;Hutter D等人《核苷、核苷酸与核酸(Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids)》,2010,29(11):879-95;以及Knapp等人,《欧洲化学杂志》,2011,17:2903,所有这些文献均通过引用整体并入。
建立鼠TdT活性位点的计算模型,以了解TdT缺乏利用3'-O-封闭的dNTP的结构基础。另外,计算机模型使得有可能将各种经修饰的dNTP“拟合”到活性位点中。图4示出了使用PDB晶体结构4129和AutoDock 4.2(加利福尼亚州拉荷亚的斯克里普斯研究所分子图形实验室(Molecular Graphics Laboratory,Scripps Research Institute,La Jolla,CA))使a-dATP(以蓝色、红色、品红色、橙色示出)与鼠TdT(参见下文的SEQ ID NO.9)对接。
dATP的磷酸酯部分(橙色)与催化金属离子(绿色)络合,而α磷酸酯被定位成由所结合的寡核苷酸的3'-OH攻击。图4中所示的模型表明,当存在3'-O-封闭的dNTP时,选择可能干扰催化生产性络合物形成的氨基酸残基。可能与最接近的残基相互作用的其它残基(如Glu 180或Met 192)也是修饰的靶标。参考SEQ ID NO.9的鼠TdT提供了氨基酸编号和位置,但所提及的氨基酸修饰适用于具有包含GGFRR或TGSR基序的类似序列的任何TdT。
AutoDock的预测的结合模式表明,对3'-OH的修饰将改变两个残基Arg336和Arg454之间的静电相互作用。尽管Arg336位于活性位点中的反应中心附近,但Arg336是高度保守的,并且早期研究发现,用Gly或Ala替代Arg336使dNTP活性降低了10倍(Yang B等人《分子生物学杂志》1994;269(16):11859-68)。因此,用于修饰的一个基序是包含以上结构模型中的Arg336的GGFRR基序。
另外,据认为,Gly452和Ser453以顺式肽键构象存在(参见Delarue等人,《欧洲分 子生物学学会杂志》,2002;21(3):427-39,该文献通过引用整体并入本文),并且Arg336的胍基有助于这种构象的稳定化。Arg336提供的稳定性可能有助于解释为什么在此位置的取代对经修饰的TdT蛋白的反应性有负面影响。在一些实例中,通过使用脯氨酸残基来稳定顺式肽键构象可以克服由修饰位置336产生的不稳定性。然而,如果Arg336被例如丙氨酸或甘氨酸取代,则可能还必须修饰整个TGSR基序(位置451、452、435、454)以补偿此变化。例如,TGSR基序可以被修饰为TPSR或TGPR。因此,包含以上结构模型中的Gly452的TGSR基序被靶向用于修饰。
另一方面,TdT家族的序列分析表明可以在位置454处容纳的宽范围的氨基酸。此分析表明位置454和周围残基处的结构柔性。在另一个实施例中,为了容纳3'-O-封闭基团的空间体积,Arg454处的取代可能需要对α14区域进行另外的修饰,以补偿Arg454处甘氨酸或丙氨酸的取代。在其它实施例中,可能需要对α11区域中的其它残基进行取代,以补偿对Arg336的取代,代替对TGSR基序的修饰或除了对TGSR基序的修饰之外。
虽然对Arg336和Arg454的修饰可能改变3'-O-经修饰的dNTP的结合相互作用,但也有必要探索将导致3'-O-经修饰的dNTP与TdT的空间相互作用改善的取代。为了测试显示3'-O-封闭的dNTP增加的底物利用的计算预测的酶变体,在适当的质粒载体中产生指定特定氨基酸取代的合成基因并且将其引入细胞中。在表达和分离之后,通过聚合酶掺入测定用所选择的3'-O-封闭的dNTP类似物筛选蛋白质变体的活性。图5示出了筛选各种合成产生的鼠TdT变体的结果。在一些实施例中,单氨基酸变化很重要,而在其它中,一个和两个氨基酸的组合也会产生3'-O-封闭的dNTP的增加的掺入。与鼠TdT的如Gly332、Gly333、Gly452、Thr451、Trp450、Ser453和Q455等残基的相互作用是重要的。这些残基中的每个残基都在典型的dNTP的3'-OH的0.6nm内。这些残基也是潜在的取代靶标,以允许如3'-O-叠氮基甲基或3'-O-氨氧基等3'-封闭基团的额外空间体积。在3'-OH的1.2nm内的残基,如Glu457、Ala510、Asp509、Arg508、Lys199、Ser196、Met192、Glu180或Leu161,也可能潜在地干扰3'-O-封闭的dNTP的底物利用,并且因此是除了Arg336和Arg454之外或与其组合的取代靶标。所关注的另外的残基包含Arg461和Asn474。
虽然这里突出了TGSR和GGFRR基序,但还考虑了对侧接氨基酸如Thr331、Gly337、Lys338、Gly341或His342的修饰用于提供(单独地或组合地)如本文所讨论的3'-O-封闭的dNTP的增加的掺入。下文实例2中讨论了能够增加掺入的各种计算机模拟的TdT修饰。
除了位置500-510处的氨基酸取代之外,可能有必要缺失残基以去除3'-O-封闭基团的干扰。由于这些氨基酸位于蛋白质的C末端附近并且存在于相对非结构化区域中,因此这些氨基酸可以单独地或全部地缺失,代替上述修饰或与上述修饰组合。在某些实施例中,将残基插入到经修饰的TdT中。例如,在GGFRR或TGSR基序或侧接区域中插入残基可以允许通过经修饰的TdT增加3'-O-封闭的dNTP的掺入速率。TdT修饰可以包含在GGFRR基序的Phe334与Arg335残基(或其取代)之间插入酪氨酸残基。
本发明的经修饰的TdT包含在图5中所描述的TdT。经修饰的TdT可以包含对包含E180L、E180R、E180D或E180K的Glu180的一种或多种修饰。对Met192的预期修饰包含例如M192E、M192W、M192K或M192R。对Gln455的预期修饰包含例如Q455I。对Trp450的预期修饰包含例如W450H。对ARG454的预期修饰包含例如R454I、R454K、R454A或R454T。对Arg461的预期修饰包含例如R461V,并且对Asn474的修饰可以包含N474R。在各个实施例中,可以使用两种或更多种经修饰的残基的组合,例如,E180D+W450H、E180K+R454A、M192K+E180K、E180K+R454I、E180D+M192E、E180D+M192E+R454T或E180K+W450H。
如下所示,大多数TdT包含GGFRR和TGSR基序。在以下序列中,GGFRR和TGSR基序已被加粗并加下划线,以便于参考。
天然小牛胸腺TdT是改变一级结构以获得合适的非模板依赖性聚合酶的候选物。然而,可以探索各种其它蛋白质来鉴定适合于与3'-O-封闭的dNTP类似物(包含人和鼠TdT)一起使用的候选物。对应于天然小牛TdT的氨基酸序列在表1中列为SEQ ID NO.1,而核酸序列在表2中列为SEQ ID NO.2。在一些实施例中,适于与3'-O-经修饰的dNTP和NTP进行的序列特异性从头多核苷酸合成的所得蛋白质将与SEQ ID NO.1至少85%相同,即,至少90%相同,即,至少93%相同,即,至少95%相同,即,至少97%相同,即,至少98%相同,即,至少99%相同。此外,可以截短牛TdT的氨基酸序列的一部分,并且仍然保持催化活性。
表1:牛TdT的氨基酸序列SEQ ID NO.1:(520aa)
表2:牛TdT的核酸序列
SEQ ID NO.2:(1923nt)
另外,为了使重组蛋白的分离更容易,通常将N末端His标签序列附加到重组蛋白上(参见Boule J-B等人,《分子生物技术(Molecular Biotechnology)》,1998;10:199-208,该文献通过引用整体并入本文),该重组蛋白与亲和柱(Hitrap,瑞典乌普萨拉的安发玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden))组合使用。可替代地,具有附加的His标签序列的N末端截短形式的酶将与本发明一起起作用(参见例如US 7,494,797,该文献通过引用整体并入本文)。下表3、5和7中示出了His标记的牛TdT氨基酸序列,而下表4、6和8中示出了His标记的牛TdT核酸序列。可以根据需要在其它位置处设计His标签。在一些实施例中,适于与3'-O-经修饰的dNTP和NTP进行的序列特异性从头多核苷酸合成的所得蛋白质将与SEQ ID NO.3、5或7至少85%相同,即,至少90%相同,即,至少93%相同,即,至少95%相同,即,至少97%相同,即,至少98%相同,即,至少99%相同。
表3:Δ138和His标记的牛TdT的氨基酸序列。SEQ ID No.3:(392aa)
表4:Δ138和His标记的牛TdT的核苷酸序列。SEQ ID No.4:(1187nt)
表5:Δ151和His标记的牛TdT的氨基酸序列。
SEQ ID No.5:(379aa)
表6:Δ151和His标记的牛TdT的核苷酸序列。
SEQ ID No.6:(1148nt)
表7:Δ160和His标记的牛TdT的氨基酸序列。
SEQ ID No.7:(370aa)
表8:Δ160和His标记的牛TdT的核苷酸序列。
SEQ ID No.8:(1121nt)
表9:鼠TdT的氨基酸序列SEQ ID NO.9:(510aa)
在某些实施例中,相对于其相应天然TdT酶,本发明的经修饰的酶可以包含N末端截短。例如,在优选实施例中,天然酶可以是如在上文SEQ ID NO.9中提供的鼠TdT。经修饰的TdT可以在天然鼠TdT的位置147或131的等效物处被截短,分别如SEQ IDNo.10和11所示。经修饰的TdT可以包含蛋白质标签序列,如His标签和其N末端处的另外的连接子,如SEQ IDNo.10和11所展示。如果给这些序列中的每个序列以及连接子加下划线,则His标签部分以粗体提供。
SEQ ID No.10:具有His标签和连接子的鼠缺失-147
SEQ ID No.11:具有His标签和连接子的鼠缺失-131
下表10中列出了可以增加3'-O-封闭的或其它核苷酸类似物的掺入效率的另外的TdT修饰。虽然参考SEQ ID NO.9中列出的鼠TdT描述了这些修饰,但本发明考虑将此类修饰应用于任何TdT中的等效氨基酸,包含在上文SEQ ID NO.10和11中公开的截短酶,具有或不具有His标签和连接子。在各个实施例中,预期修饰包含S420至E424氨基酸的缺失。表10中的1至175每行中列出了本发明的氨基酸取代的各种组合。
表10
各种3'-O-经修饰的dNTP和NTP可以与所公开的蛋白质一起用于从头合成。在一些实施例中,优选的可移除的3'-O-封闭基团是3'-O-氨基、3'-O-烯丙基或3'-O-叠氮基甲基。在其它实施例中,可移除的3'-O-封闭部分选自由以下组成的组:O-苯氧基乙酰基;O-甲氧基乙酰基;O-乙酰基;O-(对甲苯)-磺酸酯;O-磷酸酯;O-硝酸酯;O-[4-甲氧基]-四氢硫代吡喃基;O-四氢硫代吡喃基;O-[5-甲基]-四氢呋喃基;O-[2-甲基,4-甲氧基]-四氢吡喃基;O-[5-甲基]-四氢吡喃基以及O-四氢硫代呋喃基(参见US 8,133,669)。在其它实施例中,可移除的封闭部分选自由以下组成的组:酯、醚、腈、磷酸酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、羟胺、硼酸酯、硝酸酯、糖、磷酰酯、磷酰胺酯、苯基次磺酸酯、硫酸酯、砜和氨基酸(参见Metzker ML等人《核酸研究》1994;22(20):4259-67,U.S.P.N.5,763,594、6,232,465、7,414,116;和7,279,563,所有这些文献均通过引用整体并入)。
示例性3'-O-封闭的dNTP类似物的合成
图6示出了四种示例性3'-O-封闭的dNTP类似物,即3'-O-叠氮基甲基-dATP、3'-O-叠氮基甲基-dCTP、3'-O-叠氮基甲基-dGTP和3'-O-叠氮基甲基-dTTP。每种3'-O-叠氮基甲基类似物的合成如下所述,并且详述于图7-12。3'-O-封闭的dNTP类似物也可以从专业供应商购买,如加利福尼亚州欧申赛德的Azco生物技术公司(Azco Biotech,Oceanside,CA)。应当理解,可以用类似的合成方法形成对应的3'-O-封闭的核糖核苷酸,以能够产生定制RNA寡核苷酸。
3'-O-叠氮基甲基-dATP:参考图7,制备N6-苯甲酰基-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧腺苷(3.0g;6.38mmol)[马萨诸塞州沃本的CNH技术公司(CNH Technologies,Woburn,MA)]于DMSO(12ml)、乙酸(5.5ml)和乙酸酐(17.6ml)中的溶液。将混合物在室温下搅拌48小时。添加大约100ml的饱和NaHCO3溶液,并且将水层用CH2Cl2萃取。将合并的有机萃取物用饱和NaHCO3溶液洗涤并经Na2SO4干燥。通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯,1:1至1:4)对残余物进行纯化,以回收呈白色粉末的N6-苯甲酰基-3'-O-(甲硫基甲基)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧腺苷(如图7中的化合物1所示)(2.4g;71%产率)。在氮气下将400mg的N6-苯甲酰基-3'-O-(甲硫基甲基)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧腺苷溶解于干燥CH2Cl2(7ml)中,以产生溶液(0.76mmol)。然后添加环己烯(400μl)和SO2Cl2(155μl;1.91mmol,再蒸馏)。将反应混合物在0℃下搅拌2小时。然后在减压下并且然后在高真空泵下去除溶剂,持续10分钟。将所得残余物溶解于干燥DMF(5ml)中并且在室温下与NaN3(400mg;6.6mmol)反应3小时。将反应混合物分散在蒸馏水(50ml)中并且用CH2Cl2萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物溶解于MeOH(5ml)中并且与NH4F(300mg;8.1mmol)在室温下搅拌24小时。然后在减压下去除溶剂。将反应混合物在减压下浓缩并且在水与CH2Cl2之间分配。将有机层分离并且经Na2SO4干燥。浓缩后,通过快速柱色谱法(乙酸乙酯/甲醇)对粗产物进行纯化,以产生呈白色粉末的N6-苯甲酰基-3'-O-(叠氮基甲基)-2'-脱氧腺苷(化合物2;图7)(150mg;48%产率)。然后在溶解于磷酸三甲酯(600μl)中之前,将N6-苯甲酰基-3'-O-(叠氮基甲基)-2'-脱氧腺苷(123mg;0.3mmol)和质子海绵(75.8mg;0.35mmol)在真空干燥器中经P2O5干燥过夜。接着,在0℃下逐滴添加新蒸馏的POCl3(40μl;0.35mmol),并且将混合物在0℃下搅拌2小时。随后,在室温下添加三丁基焦磷酸铵(552mg)和三丁胺(0.55ml;2.31mmol)于无水DMF(2.33ml)中的混合物并搅拌30分钟。然后添加三乙基碳酸氢铵溶液(TEAB)(0.1M;pH 8.0;15ml),并且将混合物在室温下搅拌1小时。随后,添加浓NH4OH(15ml)并且在室温下搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩,并且将残余物用5ml水稀释。然后使用TEAB梯度(pH 8.0;0.1-1.0M),在4℃下,在DEAE-SephadexA-25上用阴离子交换色谱法对粗混合物进行纯化。用反相HPLC对粗产物进行纯化,以产生3'-O-叠氮基甲基-dATP(图7,化合物3),即用于稍后合成的核苷酸类似物。
3'-O-叠氮基甲基-dTTP:将乙酸(4.8ml)和乙酸酐(15.4ml)添加到5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷(2.0g;5.6mmol)[马萨诸塞州沃本的CNH技术公司]于DMSO中的搅拌溶液中。将反应混合物在室温下搅拌48小时。添加饱和NaHCO3溶液(100ml),并且将水层用乙酸乙酯(3x 100ml)萃取。将合并的有机萃取物用饱和NaHCO3溶液洗涤,并且经Na2SO4干燥。浓缩后,通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯)对粗产物进行纯化,以产生呈白色粉末的3'-O-(甲硫基甲基)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷(图8;化合物4)(1.75g;75%产率)。然后在氮气下,将大约1克的3'-O-(甲硫基甲基)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)胸苷溶解于干燥CH2Cl2(10ml)中。向该混合物中添加环己烯(1.33ml)和SO2Cl2(284μl;3.5mmol,再蒸馏)。然后将所得混合物在0℃下搅拌1.5小时。然后在减压下并且然后在高真空下去除溶剂,持续10分钟。将残余物溶解于干燥DMF(5ml)中并且在室温下与NaN3(926mg;15.4mmol)反应3小时。接着将该反应混合物分散在蒸馏水(50ml)中并且用CH2Cl2(3x 50ml)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物溶解于MeOH(5ml)中并且在室温下与NH4F(600mg;16.2mmol)反应24小时。将反应混合物在减压下浓缩并且在水与CH2Cl2之间分配。然后将有机层分离并且经Na2SO4干燥。浓缩后,通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯)对残余物进行纯化,以产生呈白色粉末的3'-O-(叠氮基甲基)胸苷(图8,化合物5)(550mg;71%产率)。接着在溶解于磷酸三甲酯(600μl)中之前,将3'-O-(叠氮基甲基)胸苷和质子海绵(0.35mmol)在真空干燥器中经P2O5干燥过夜。接着,在0℃下逐滴添加新蒸馏的POCl3(40μl;0.35mmol),并且将混合物在0℃下搅拌2小时。随后,在室温下添加三丁基焦磷酸铵(552mg)和三丁胺(0.55ml;2.31mmol)于无水DMF(2.33ml)中的混合物并搅拌30分钟。然后添加三乙基碳酸氢铵溶液(TEAB)(0.1M;pH 8.0;15ml),并且将混合物在室温下搅拌1小时。随后,添加浓NH4OH(15ml)并且在室温下搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩,并且将残余物用5ml水稀释。然后使用TEAB梯度(pH 8.0;0.1-1.0M),在4℃下,在DEAE-Sephadex A-25上用阴离子交换色谱法对粗混合物进行纯化。用反相HPLC对粗产物进行纯化,以产生3'-O-叠氮基甲基-dTTP(图8,化合物6),即用于稍后合成的核苷酸类似物。
3'-O-叠氮基甲基-dCTP:将三点五克的N4-苯甲酰基-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧胞苷[马萨诸塞州沃本的CNH技术公司]添加到14.7ml的DMSO中,以产生7.65mmol溶液。向该溶液中添加乙酸(6.7ml)和乙酸酐(21.6ml),并且将反应混合物在室温下搅拌48小时。然后添加饱和NaHCO3溶液(100ml)并且将水层用CH2Cl2(3x 100ml)萃取。将合并的有机萃取物用饱和NaHCO3溶液洗涤,并且然后经Na2SO4干燥。浓缩后,通过快速柱色谱法(乙酸乙酯/己烷)对粗产物进行纯化,以产生呈白色粉末的N4-苯甲酰基-3'-O-(甲硫基甲基)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧胞苷(图9;化合物7)(2.9g;73%产率)。将N4-苯甲酰基-3'-O-(甲硫基甲基)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧胞苷(558mg;1.04mmol)溶解于8ml的CH2Cl2中,并且然后添加环己烯(560μl)和SO2Cl2(220μl;2.7mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。然后在减压的情况下去除挥发物。将剩余的残余物溶解于干燥DMF(5ml)中并且在室温下与NaN3(400mg;6.6mmol)反应2小时。将反应混合物分散于蒸馏水(50ml)中并且用CH2Cl2(3x 50ml)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物溶解于MeOH(5ml)中并且在室温下与NH4F(600mg;16.2mmol)反应24小时。在减压下去除溶剂。将所得残余物悬浮于水(50ml)中并且用CH2Cl2(3x50ml)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯)对粗产物进行纯化,以产生呈白色粉末的N4-苯甲酰基-3'-O-(叠氮基甲基)-2'-脱氧胞苷(图9,化合物8)(200mg;50%产率)。接着在溶解于磷酸三甲酯(600μl)中之前,将N4-苯甲酰基-3'-O-(叠氮基甲基)-2'-脱氧胞苷和质子海绵(0.35mmol)在真空干燥器中经P2O5干燥过夜。然后,在0℃下逐滴添加新蒸馏的POCl3(40μl;0.35mmol),并且将混合物在0℃下搅拌2小时。随后,在室温下添加三丁基焦磷酸铵(552mg)和三丁胺(0.55ml;2.31mmol)于无水DMF(2.33ml)中的混合物并搅拌30分钟。然后添加三乙基碳酸氢铵溶液(TEAB)(0.1M;pH8.0;15ml),并且将混合物在室温下搅拌1小时。随后,添加浓NH4OH(15ml)并且在室温下搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩,并且将残余物用5ml水稀释。然后使用TEAB梯度(pH8.0;0.1-1.0M),在4℃下,在DEAE-Sephadex A-25上用阴离子交换色谱法对粗混合物进行纯化。用反相HPLC对粗产物进行纯化,以产生3'-O-叠氮基甲基-dCTP(图9,化合物9),即用于稍后合成的核苷酸类似物。
3'-O-叠氮基甲基-dGTP:向N2-异丁酰基-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧鸟苷(5g;11.0mmol)[马萨诸塞州沃本的CNH技术公司]于干燥DMSO(21ml)中的搅拌溶液中添加乙酸(10ml)和乙酸酐(32ml)。将反应混合物在室温下搅拌48小时。添加饱和NaHCO3溶液(100ml)并且将水层用乙酸乙酯(3x 100ml)萃取。将合并的有机萃取物用饱和NaHCO3溶液洗涤,并且经Na2SO4干燥。浓缩后,通过快速柱色谱法(CH2Cl2/MeOH)对粗产物进行纯化,以产生呈白色粉末的N2-异丁酰基-3'-O-(甲硫基甲基)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧鸟苷(图10,化合物10)(3.9g;69%产率)。随后将一克N2-异丁酰基-3'-O-(甲硫基甲基)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧鸟苷连同二苯氨基甲酰氯(677mg;2.92mmol)和DIEA(N,N-二异丙基乙胺;西格玛公司(SIGMA))(1.02ml;5.9mmol)一起添加到干燥吡啶(22ml;2.0mmol)中。将反应混合物在室温下在氮气气氛下搅拌3小时。在高真空下去除溶剂。通过快速柱色谱法(乙酸乙酯/己烷)对粗产物进行纯化,以产生呈淡黄色粉末的N2-异丁酰基-O6-(二苯氨基甲酰基)-3'-O-(甲硫基甲基)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧鸟苷(图10,化合物11)(1.09g;80%产率)。然后将N2-异丁酰基-O6-(二苯氨基甲酰基)-3'-O-(甲硫基甲基)-5'-O-(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2'-脱氧鸟苷溶解于干燥CH2Cl2(1.1mmol)中,并且在0℃下在氮气气氛下搅拌1.5小时。在减压下并且然后在高真空下去除溶剂,持续10分钟。将所得残余物溶解于干燥DMF(5ml)中,并且在室温下与NaN3(600mg;10mmol)反应3小时。然后将反应混合物分散于蒸馏水(50ml)中并且用CH2Cl2(3x 50ml)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将所得残余物溶解于MeOH(5ml)中并且在室温下与NH4F(500mg;13.5mmol)反应24小时。在减压下去除溶剂。将残余物悬浮于水(50ml)中并且用CH2Cl2(3x 50mL)萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过快速柱色谱法(己烷/乙酸乙酯)对粗产物进行纯化,以产生呈白色粉末的N2-异丁酰基-O6-(二苯氨基甲酰基)-3'-O-叠氮基甲基-2'-脱氧鸟苷(图10,化合物12)(230mg;36%产率)。最后,在溶解于磷酸三甲酯(600μl)中之前,将N2-异丁酰基-O6-(二苯氨基甲酰基)-3'-O-叠氮基甲基-2'-脱氧鸟苷和质子海绵(0.35mmol)在真空干燥器中经P2O5干燥过夜。然后,在0℃下逐滴添加新蒸馏的POCl3(40μl;0.35mmol),并且将混合物在0℃下搅拌2小时。随后,在室温下添加三丁基焦磷酸铵(552mg)和三丁胺(0.55ml;2.31mmol)于无水DMF(2.33ml)中的混合物并搅拌30分钟。然后添加三乙基碳酸氢铵溶液(TEAB)(0.1M;pH8.0;15ml),并且将混合物在室温下搅拌1小时。随后,添加浓NH4OH(15ml)并且在室温下搅拌过夜。将所得混合物在真空下浓缩,并且将残余物用5ml水稀释。然后使用TEAB梯度(pH8.0;0.1-1.0M),在4℃下,在DEAE-Sephadex A-25上用阴离子交换色谱法对粗混合物进行纯化。用反相HPLC对粗产物进行纯化,以产生3'-O-叠氮基甲基-dGTP(图10,化合物13),即用于稍后合成的核苷酸类似物。
如关于图2所描述的,一旦添加3'-O-封闭的dNTP或3'-O-封闭的rNTP,将有必要去除封闭基团,使得可以添加另外的dNTP或rNTP。在一些实施例中,可以用钯催化剂在中性水溶液中在升高的温度盐酸至pH 2、还原剂(如巯基乙醇)或通过添加三-(2-羧乙基)膦来去除3'-O-封闭基团。参见,例如U.S.P.N.6,664,079;Meng等人《有机化学杂志 (J.Org.Chem.)》,2006,71(81):3248-52;Bi等人,《美国化学学会杂志 (J.Amer.Chem.Soc.)》2006;2542-2543,U.S.P.N.7,279,563和U.S.P.N.7,414,116,所有文献均通过引用整体并入本文。在其它实施例中,可以通过UV照射去除3'-取代基团(参见例如,WO 92/10587,该文献通过引用整体并入本文)。通过氧化、还原或水解化学反应去除大多数3'-O-封闭基团。在一些实施例中,通过40%w/v的硫化铵溶液在室温下在<5分钟内从寡核苷酸中去除3'-O-NO2基团。在一些实施例中,通过在70℃下用0.5M KOH处理从寡核苷酸中去除3'-O-CH2CN基团。在一些实施例中,去除3'-O-封闭基团并不包含化学切割,而是使用切割酶,如碱性磷酸酶。
在优选实施例中,酶促反应用于去除3'-封闭基团。虾碱性磷酸酶(SAP)可以用于某些实施例中。SAP具有文献中报道的最快的酶促速率之一并且具有宽范围的底物利用。
3'-O-甲氧基甲基-dTTP:在环境温度下在氩气下,将5'-O-苯甲酰基胸苷(173mg,0.5mmol,1当量)溶解于10mL的二氯甲烷中。添加二异丙基乙胺(128mg,1mmol,2当量),随后添加甲氧基甲基溴(124mg,1mol,2当量)。将混合物在环境温度下搅拌18小时。将混合物用10mL二氯甲烷稀释,并且将其依次用20mL 5% HCl水溶液和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥并蒸发。在环境温度下,将5'-O-苯甲酰基-3'-O-甲氧基甲基胸苷(50mg,0.13mmol)溶解于5mL的浓氢氧化铵中。将混合物在环境温度下搅拌过夜。将混合物用10mL的部分二氯甲烷稀释萃取3次。将合并的萃取物用盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥并蒸发。将3'-O-甲氧基甲基胸苷(23mg,0.08mmol)与吡啶(1.5mL x 3)共蒸发并在高真空下干燥过夜。在Ar下,将核苷溶解于1.5mL磷酸三甲酯和0.6mL干燥吡啶的混合物中。将混合物在冰浴中冷却,逐滴添加第一等分试样的10uL POCl3。五分钟后,添加第二等分试样的10uL。将混合物再搅拌30分钟。将TBA磷酸盐于干燥DMF(1.25mL)中的溶液在Ar下在小瓶中的冰浴中冷却。将其经10秒逐滴添加到rxn混合物中。立即一次性添加作为固体的预先称重的固体质子海绵(21mg,1.25当量)。在此添加之后,将混合物搅拌25分钟并用5mL冷TEAB缓冲液淬灭。将混合物在冰浴中搅拌10分钟,并且然后转移到小型RB烧瓶中以进行FPLC分离。使用含有0.1mM甲酸的水/乙腈梯度,通过反相HPLC完成最终分离。
3'-O-甲硫基甲基-dCTP:向脱氧胞苷(1g,4.4mmol)于25mL甲醇中的悬浮液中添加N,N-二甲基甲酰胺二甲缩醛(1.75mL,13.2mmol)。将混合物在环境温度下搅拌过夜。将反应混合物蒸发,并且使用DCM/甲醇梯度作为洗脱液通过快速色谱法对残余物进行纯化。将N6-甲脒基-5'-O-苯甲酰基脱氧-3'-O-甲硫基甲基脱氧胞苷(250mg,0.41mmol)溶解于10mL甲醇和10mL浓氢氧化铵水溶液中。将混合物在环境温度下搅拌18小时,并且然后在减压下蒸发。通过柱色谱法(DCM/甲醇98:2至90:10)对残余物进行纯化,以得到170mg(93%)呈略微黄色固体的期望核苷。将25mL小瓶中的3'-O-甲硫基甲基脱氧胞苷(25.0mg,0.09mmol)与无水吡啶(3x 1mL)共蒸发并经周末干燥。添加磷酸三甲酯(0.7mL)以溶解核苷并在冰浴中冷却到0℃。缓慢添加磷酰氯(28μL,0.3mmol)(12μL,5分钟后8μL,30分钟后8μL),并且在0℃下将反应搅拌2小时。将二(四丁基铵)焦磷酸氢盐溶解于无水DMF(1mL)中,将该混合物冷却到0℃并添加到反应混合物中。添加质子海绵(9.2mg,0.04mmol),并且在0℃下将反应搅拌2小时。向反应混合物中添加1M三乙基碳酸氢铵缓冲液(TEAB)(2mL),并且将混合物搅拌1小时。然后将混合物转移到圆底烧瓶中,添加50mL x 3miliQ水,并且将混合物浓缩至干燥。将残余物溶解于miliQ水(11mL)中,并且在室温下加载到AKTA FPLC上。将含有三磷酸盐(F48-F52)的级分在40℃下在减压下蒸发,并且然后将残余物冻干。将三磷酸盐干燥,以得到期望的三磷酸盐(12mg,16.5%)。
实例
实例1:蛋白质修饰:
鼠(mur)TdT变体来源于380aa合成基因。该骨架是WT鼠TdT的截短形式,并且表示ET序列的催化核心。将化学合成的TdT构建体克隆到pRSET A细菌表达载体中,其以N末端6x-组氨酸标签和肠激酶切割位点为特征(赛默飞世尔科技公司GeneArt基因合成(ThermoFisher Scientific GeneArt Gene Synthesis))。将合成的TdT质粒保持在铺板在含有100ug/ml羧苄青霉素的LB琼脂板上的DH5α细胞(Biopioner)中。为了表达,将pRSETA鼠TdT质粒通过以下方式转化到BL21(DE3)pLysS细胞(赛默飞世尔公司(Thermo-Fisher))中:将质粒和细胞在冰上温育20分钟,随后在42℃下进行30秒热休克,随后添加SOC培养基并在37℃下在振荡的情况下温育30至60分钟。在将SOC培养基添加到细胞中之后,将整个体积(典型地60ul)铺板于含有100ug/mL的羧苄青霉素加上34ug/mL的氯霉素的LB琼脂板上。
通过离心(3000xg,15分钟)收获来自10mL培养物(24孔板,康宁公司(Corning))的细胞,然后在含有溶菌酶、蛋白酶抑制剂和100mM NaCl的B-PER裂解缓冲液(赛默飞世尔公司)中裂解。将团粒在TBS缓冲液中浸泡1x 60分钟,并且收集上清液进行纯化。将上清液结合到24孔板中的50uL Ni-NTA珠(通用电气生命科学公司(GE Life Sciences)))浆料上持续30分钟。然后将珠浆料用3x 50mM Tris-HCl,pH 8,500mM NaCl(500uL)洗涤,随后用4x50mM Tris-HCl,pH 8,500mM NaCl,50mM咪唑(200uL)洗涤。然后通过用50mM Tris-HCl,pH8,500mM NaCl,300mM咪唑(50uL),然后用50mM Tris-HCl,pH 8,500mM NaCl,300mM咪唑(130uL),并且最后用50mM Tris-HCl,pH 8,500mM NaCl,1M咪唑(50uL)处理来回收蛋白质。
通过取2.5ul样品并且在8% NuPage凝胶(赛默飞世尔公司)上、200V、变性条件运行50分钟来分析所回收的级分。用考马斯蓝对凝胶进行染色。将经洗脱的蛋白质使用7.5MWCO脱盐柱(赛默飞世尔公司)进行缓冲液交换,并且在-80℃下储存(储存缓冲液=20mM Tris-HCl,pH 6.8,50mM NaOAc;0.01% Triton X-100和10%甘油)。
活性筛选:
使用不同的3'-O-封闭的dNTP类似物和生物素化的寡核苷酸,通过dNTP聚合酶延伸反应进行TdT活性筛选:
5BiosG/TAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATAATTTTTT(美国化学基因公司(ChemGenes Corporation))SEQ ID NO.12
反应通常建立在96孔板中。通过制备具有最终浓度的以下组分的主混合物进行反应:0.2U PPase(赛默飞世尔公司)、10pmol的寡核苷酸、75uM dNTP(参见下文)、1X TdT反应缓冲液(5X,来自赛默飞世尔公司)至10ul的最终体积。通过在不同孔中添加限定体积(典型地2ul)的TdT变体,并且将反应混合物在37℃下温育5分钟和60分钟时间点来开始反应。通过去除10ul等分试样并添加至5ul 250mM EDTA来终止反应。
所测试的dNTP:
将经淬灭的反应混合物中的生物素化的寡核苷酸与链霉亲和素珠(0.77um,Spherotech公司(Spherotech))连接。然后将珠转移到滤板(颇尔公司(PallCorporation))并用水洗涤若干次。通过将板与切割缓冲液(含10%二异丙胺的甲醇)在50℃下温育30分钟,随后在水中进行洗脱,从固相载体上切割寡核苷酸。将经洗脱的样品干燥并且溶解于30μl含有寡核苷酸大小标准(两种寡核苷酸(美国化学基因公司)的水中,这两种寡核苷酸比起始42聚体寡核苷酸小或大大约15至20个碱基)。然后通过毛细管凝胶电泳(Oligo Pro II,先进分析技术股份有限公司(Advanced Analytical TechnologiesInc.))分析寡核苷酸的延伸效率。
实例2:计算机模拟建模
通过计算机模拟对以上讨论的GGFRR和TGSR基序和侧接氨基酸的若干氨基酸修饰进行建模,以确定能够增加如上所述的3'-O-封闭的dNTP类似物的掺入的修饰。对单氨基酸、双氨基酸和三氨基酸取代以及氨基酸插入进行建模。下表11示出了发现引起掺入增加的修饰。参考鼠TdT提供了氨基酸位置,但适用于任何TdT的保守序列。表11中的各行描述了对GGFRR基序中或侧接GGFRR基序的一个或多个氨基酸的碱基修饰。列包含对其它氨基酸的修饰的另外的组合,如TGSR基序中和侧接TGSR基序的氨基酸。
表11:
实例3:dNTP与磷酸酯封闭基团的掺入
DNA和包括DNA的核苷酸由于核苷酸内的磷酸酯基团而高度带负电荷。参见Lipfert J,Doniach S,Das R,Herschlag D.了解核酸-离子相互作用(UnderstandingNucleic Acid-Ion Interactions),《生物化学年度评论(Annu Rev Biochem.)》2014;83:813-841,该文献通过引用并入本文。由于在3'-位置处的另外的磷酸酯基团,3'-PO4-dNTP相对于天然核苷酸具有甚至更大的负电荷。所增加的负电荷可能影响TdT掺入经修饰的核苷酸的能力。在某些实施例中,本发明的经工程化的TdT酶可以通过用经修饰的TdT上的正电荷中和负电荷而被修饰以有效地掺入3'-磷酸-dNTP。
使用罗塞塔蛋白软件套件3(Rosetta protein software suite3)内的每侧链原子的平均相邻原子数(AvNAPSA)算法来鉴定将增加TdT的酶活性位点中和周围的正电荷的突变。通过增加AvNAPSA算法的关键参数,称为surface_atom_cutoff,靶向TdT活性位点中的序列位置。通过将暴露于溶剂的极性残基突变成带电荷的残基来操纵蛋白质的表面电荷,其中暴露于溶剂的量由相邻非自身原子的数量确定。参见Miklos AE等人,超负荷的高度耐热抗体的基于结构的设计(Structure-Based Design of Supercharged,HighlyThermoresistant Antibodies),《化学与生物学(Chemistry&Biology)》,第19卷,第4期,2012年4月20日,第449-455页;Kaufmann KW等人,实际上有用的:罗塞塔蛋白建模套件可以为您做什么(Practically useful:what the Rosetta protein modeling suite can dofor you),《生物化学(Biochemistry.)》2010年4月13日;49(14):2987-98;这些文献中的每个文献的内容通过引用并入本文。增加surface_atom_cutoff项允许AvNAPSA考虑具有更高数量的相邻原子的序列位置,如酶活性位点内的位置。表12中示出了使用AvNAPSA在TdT中鉴定为对于更有效地掺入3'-磷酸-dNTP潜在有用的位置的概括。
表12:用于掺入磷酸酯封闭的dNTP的TdT修饰
图13至16展示了关于3'-PO4-dNTP,经修饰的TdT相较于野生型的更好的核苷酸掺入。图13,图A是化学合成的寡核苷酸(IDT)(21聚体;5'-FAM-TAATAATAATAATAATTTTTT-PO4-3')的CGE分析,而图B显示,添加一个携带3'-PO4基团的核苷酸导致比相当的20聚体(IDT)(5'-FAM-TAATAATAATAATAATTTTT)更快的电泳迁移率。图14是表明虾碱性磷酸酶(SAP)(NEB#P0757)在1分钟或更短时间内以1.23x 10-3U/ul/pmol寡核苷酸的浓度定量去除3'-PO4基团的CGE分析。该图示出了SAP的量从0U/ul(图A)增加到1.0x 101U/ul(图G)的滴定系列。图15,图B是表明即使如图A中所示的起始材料寡核苷酸无变化所证明的,在500uM 3'-PO4-dTTP(MyChem有限责任公司(MyChem LLC))存在下也没有聚合酶介导的延伸的鼠WTTdT反应混合物的CGE分析。如寡核苷酸起始材料缺乏反应性所证明的(图A),图15的图C中示出了3'-PO4-dTTP缺乏底物利用的进一步证据。图16是由如图B中所示的变体TdT酶(E180K+M192K+L381K+R454K+N474R)部分掺入3'-PO4-dTTP的CGE分析,该分析证明了具有更快电泳迁移率的新寡核苷酸物种(所圈出的新峰)的出现,如将基于图13中所示的结果预期的。变体TdT掺入3'-PO4的进一步证据通过以下证明:通过用SAP处理3'-PO4的延伸后去除和新寡核苷酸物种(图C-所圈出的新峰)的出现,该新寡核苷酸物种具有比寡核苷酸起始材料更慢的电泳迁移速率,如将从图D中所示的聚-dT大小序列梯以及在图B中形成的物种的消失(如由图C中的箭头所示)预期的。在另一实施例中,通过变体酶(E180K+M192K+R454K+R461V+N474R)证明3'-PO4-dTTP的掺入增加。
通过引用并入
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等效物
对于本领域的技术人员而言,根据本文档的全部内容(包含对本文所引用的科学文献和专利文献的参考),对本发明的各种修改以及本发明的除了在本文中示出且描述的实施例之外的许多另外实施例将变得显而易见。本文中的主题含有重要信息、例示和指南,其可以适于在本发明的各个实施例及其等效物中实践本发明。
Claims (27)
1.一种经修饰的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT),其包括选自由以下组成的组的突变:E33K、E180L、E180K、M192E、M192K、M192W、W3O3H、L381K、L381Q、L381R、L381V、W450H、R454I、R454T、R454K、E457K、R461V、R461Q、R461V、N474R和N474K,所述经修饰的TdT能够在不存在核酸模板的情况下将核苷酸类似物添加到核酸引发剂的3'-OH,所述核苷酸类似物在所述类似物的3'-O处包括可移除的封闭部分。
2.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括突变E457K。
3.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变E180K、M192W、L381R和W450H。
4.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变L381Q和W450H。
5.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变E180L、M193E、L381K、R461Q和N457K。
6.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变E180K、L381Q、W450H和R461V。
7.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变L381Q和W450H。
8.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变E180L、M192E、L381K、R461Q和N457K。
9.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变E180K、M192E、L381K、R454T和N47K。
10.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变E180K、M192K、L381K、R454T和N457R。
11.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变E180K、M192K、L381K、R454K和N457K。
12.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变M192E、L381V、R454I和R461V。
13.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变E180K和L381R。
14.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其包括所述突变E180K、M192K、L381K、R454K和N474R。
15.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其中与天然TdT相比,所述经修饰的TdT能够以增加的速率将包括所述可移除的3'-O-封闭部分的所述核苷酸类似物添加到所述核酸引发剂的所述3'-OH。
16.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,相对于天然TdT,其包括N末端截短。
17.根据权利要求15所述的经修饰的TdT,其中所述经修饰的TdT包括N末端t-131鼠TdT和与N末端连接的蛋白质标签序列。
18.根据权利要求15所述的经修饰的TdT,其中所述经修饰的TdT包括N末端t-147鼠TdT和与N末端连接的蛋白质标签序列。
19.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其中所述经修饰的TdT能够添加用可移除的3'-O-封闭部分修饰的腺嘌呤脱氧核糖核苷酸、胞嘧啶脱氧核糖核苷酸、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸和胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。
20.根据权利要求18所述的经修饰的TdT,其中所述核苷酸是2'-脱氧核糖核苷酸。
21.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其中所述经修饰的TdT能够添加用可移除的3'-O-封闭部分修饰的腺嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸。
22.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其中所述可移除的3'-O-封闭部分包括选自由以下组成的组的3'-O-封闭基团:CH2N3、NH2、ONHC(O)H、烯丙基、CH2SSCH3、苯氧基乙酰基、甲氧基乙酰基、乙酰基、(对甲苯)磺酸酯、磷酸酯、硝酸酯、[4-甲氧基]-四氢硫代吡喃基、四氢硫代吡喃基、[5-甲基]-四氢呋喃基、[2-甲基,4-甲氧基]-四氢吡喃基、[5-甲基]-四氢吡喃基以及O-四氢硫代呋喃基。
23.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其中所述经修饰的TdT能够掺入3'-O-封闭的核苷酸5'-三磷酸酯,并且所述可移除的封闭部分包括选自以下的基团:酯、醚、腈、磷酸酯、碳酸酯、氨基甲酸酯、羟胺、硼酸酯、硝酸酯、糖、磷酰胺、磷酰胺酯、苯基次磺酸酯、硫酸酯、砜和氨基酸。
24.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其中所述经修饰的TdT能够在约30℃至约80℃的反应温度下掺入经修饰的核苷酸。
25.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其中所述经修饰的TdT能够以1000pM或更低的浓度掺入经修饰的核苷酸。
26.根据权利要求1所述的经修饰的TdT,其中所述经修饰的TdT能够以100pM或更低的浓度掺入经修饰的核苷酸。
27.根据权利要求14所述的经修饰的TdT,所述经修饰的TdT能够将包括可移除的3'-O-磷酸酯的核苷酸类似物添加到核酸引发剂的3'-OH。
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