JP2023522454A - ルシフェラーゼ結合免疫吸着アッセイ - Google Patents

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Abstract

本発明は、- ラクダ類重鎖抗体の可変ドメイン(VHH)又は1本鎖可変断片(scFV)であり、免疫グロブリンに向けられた抗体を含むN末端ドメイン、及び- ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含むC末端ドメインであり、配列番号1のアミノ酸配列を有するか、又は- 配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、C末端ドメインを含む、融合タンパク質に関する。

Description

本発明は、試料中の免疫グロブリン、この方法において使用する融合タンパク質、並びにこの方法において特に使用可能に特性を向上させた変異ルシフェラーゼを検出するための方法に関する。
対象における感染に対する過去又は現在の適応免疫応答のエビデンスを検査するためには、迅速診断検査又は実験室ベースの免疫測定法のいずれかのフォーマットを使用する、感染病原体又はアレルゲンに対する血清学的アッセイを実施しなければならない。
広範な血清学的検査が市場に存在する。例えば、実験室ベースの免疫測定法は、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、蛍光免疫測定法(FIA)、化学発光免疫測定法(CLIA)又は電気発光アッセイ(ECL)であり得る。
しかし、血清学的検査にいかなるプロトコールを使用しても、安全性、品質及び性能基準を(分析的及び臨床的感度及び特異性の両方に関して)満たさなければならない。
過去又は現在の感染を示す免疫グロブリンを検出及び/又は定量するための市場の最も標準的な血清学的検査は、高感度であるが、相対的に大量のプラズマを必要とし(幼児を検査する場合に問題となり得る)、また、これらのコスト及び検査結果を分析するための特定の機器の必要性により制限される。したがって、必要とされる試料の容量及びコストを顕著に減少させると同時に、アッセイの堅牢性、再現性及び精度を犠牲とすることなく、血清学的検査の感度を向上させるために、更なる開発が必要とされる。
国際公開第2018/197727号 国際公開第2012/061530号 国際公開第2014/087010号 米国特許第10,259,886号明細書
Shimomura O、Masugi T、Johnson FH、Haneda Y.、Properties and reaction mechanism of the bioluminescence system of the deep-sea shrimp Oplophorus gracilirostris、Biochemistry. 1978 Mar 21;17(6):994～8頁 Inouye S、Sato J、Sahara-Miura Y、Yoshida S、Hosoya T、Luminescence enhancement of the catalytic 19 kDa protein (KAZ) of Oplophorus luciferase by three amino acid substitutions. Biochem Biophys Res Commun. 2014;445(1):157～162頁 Hall MP、Unch J、Binkowski BF、Valley MP、Butler BL、Wood MG、Otto P、Zimmerman K、Vidugiris G、Machleidt T、Robers MB、Benink HA、Eggers CT、Slater MR、Meisenheimer PL、Klaubert DH、Fan F、Encell LP、Wood KV、Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem Biol. 2012 Nov 16;7(11):1848～57頁 Coutantら、2019、2020 blast.ncbi.nlm.nih.gov ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/HowTo_BLASTGuide.pdf Chu J、Oh Y、Sens A、Ataie N、Dana H、Macklin JJ、Laviv T、Welf ES、Dean KM、Zhang F、Kim BB、Tang CT、Hu M、Baird MA、Davidson MW、Kay MA、Fiolka R、Yasuda R、Kim DS、Ng HL、Lin MZ Nat Biotechnol. 2016 Jul;34(7):760～7頁 Hamers-Castermanら1993 Nature、363、446～448頁 Harmsen及びDe Haard 2007 Appl Microbiol Biotechnol.、77、13～22頁 Muyldermans 2001 J Biotechnol.、74、277～302頁 Lafayeら2009 Mol Immuno.、46、695～704頁 Wernery 2001 J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.、48、561～568頁 Thysら2010 Antiviral Res.、87、257～264頁 Lafayeら1995 Res Immunol.、146、373～82頁 Erratum in: 1996、Res Immunol.、147、61 Coutantら1999 Shaner Nc、Campbell Re、Steinbach Pa、Giepmans Bng、Palmer Ae、Tsien Ry (2004). Nature Biotechnology、22(12)、1567～1572頁 peanut oral immunotherapy study: safety, efficacy and discovery; ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02103270、米国 Jabs F、Plum M、Laursen NS、Jensen RK、Molgaard B、Miehe M、らTrapping IgE in a closed conformation by mimicking CD23 binding prevents and disrupts FcepsilonRI interaction. Nat Commun 2018; 9:7 Hamilton RGら2008 Tsai CTら、2018
ここで出願人は、ラクダ類重鎖抗体の可変ドメイン(VHH)を、オキヒオドシエビ(Oplophorus gracilirostris)ルシフェラーゼの触媒ドメインに由来するルシフェラーゼに融合させることによって、ダイナミックレンジの向上及びアッセイ時間の短縮とともに、必要とされる特異性及び感度を維持しながら、試料量の減少下において特定の免疫グロブリンの検出が実施可能であることを見出した。本出願による血清学的アッセイの設計は、迅速診断検査において使用し得る。したがって、目的の任意の感染性疾患だけでなくアレルギー又は自己免疫疾患にも特異的な免疫グロブリンを検出及び/又は定量するために、アッセイを設計することが可能である。
したがって、本発明の主題は、
- ラクダ類重鎖抗体の可変ドメイン(VHH)又は1本鎖可変断片(scFV)であり、免疫グロブリンに向けられた抗体を含むN末端ドメイン、及び
- ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含むC末端ドメインであり、
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するか、又は
- 配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、C末端ドメイン
を含む、融合タンパク質である。
また出願人は、この血清学的検査の結果が、NanoKAZルシフェラーゼの特異的変異体を使用すると、それまで以上に向上することを見出した。
したがって、本発明はまた、配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有し、
- 配列番号1の18番目に対応する位置におけるチロシン(Y)のアルギニン(R)との置換、
- 配列番号1の48番目に対応する位置におけるロイシン(L)のリジン(K)との置換、
- 配列番号1の56番目に対応する位置におけるイソロイシン(I)のアラニン(A)との置換、
- 配列番号1の116番目に対応する位置におけるチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)との置換、
- 配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)の、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸との置換、
- 配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)の、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸との置換、
並びに
- 配列番号1の166番目に対応する位置におけるシステイン(C)のセリン(S)との置換
からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、ルシフェラーゼに関する。
IgEのFc部分に結合する抗IgEナノボディ-ルシフェラーゼタンデム(sdAb026-nanoKAZ)を示す模式図の提示である。 イエダニアレルゲンDer p 2に対して生成した組換えIgE、IgG1又はIgG4のPBSによる希釈系列のIgE LuLISAを使用した分析を示すグラフである。RLU:相対光単位。 組換えヒト抗オボアルブミン(OVA)IgEのPBSによる希釈系列のIgE LuLISAを使用した分析を示すグラフである。 組換え抗オボアルブミン(OVA)IgEを使用したIgE LuLISAとIgE ELISAとの間の感度の比較を示すグラフである。 組換えOVA sIgEを使用したIgE LuLISA対標準的ImmunoCAPのダイナミックレンジ及び感度の比較を示すグラフである。 高度ピーナツアレルギー対象由来の血漿試料を使用したIgE LuLISA対標準的ImmunoCAPのダイナミックレンジ及び感度の比較を示すグラフである。 LuLISAによるIgEの生物発光検出に対する抗IgEナノボディ-ルシフェラーゼ融合タンパク質の濃度の影響を示すグラフである。灰色の領域は、この研究の他のすべての実験に使用したsdAb026-nanoKAZ濃度において得た値を示す。 PBSで指示濃度に希釈し、プレート結合ピーナツ抽出物とともにインキュベートした、ピーナツアレルギー対象6人由来の血漿の希釈系列を使用したLuLISAによるピーナツsIgEの検出を示すグラフである。ピーナツsIgEレベルの生物発光検出は、LuLISAにより実施した。矢印は、図9において使用した血漿希釈物を示す。灰色の領域は、ピーナツsIgE LuLISAの検出の線形範囲を示す。 健常ドナー及びピーナツ-アレルギー対象由来の血漿1μLを使用した全ピーナツ抽出物に対するsIgEの測定を示すグラフである。 健常ドナー及びピーナツ-アレルギー対象由来の血漿1μLを使用したピーナツアレルゲンAra h 1に対するsIgEの測定を示すグラフである。 健常ドナー及びピーナツ-アレルギー対象由来の血漿1μLを使用したピーナツアレルゲンAra h 2に対するsIgEの測定を示すグラフである。 アレルギー患者におけるピーナツsIgEに対するLuLISAとImmunoCAPとの間の比較を示すグラフである。 アレルギー患者におけるAra h 1 sIgEに対するLuLISAとImmunoCAPとの間の比較を示すグラフである。 アレルギー患者におけるAra h 2 sIgEに対するLuLISAとImmunoCAPとの間の比較を示すグラフである。 ストリップについてのIgE LuLISA(A)、ストリップについてのIgE LuLISA対ImmunoCAPの相関性(B)、ストリップ対プレートについてのIgE LuLISA間の相関性(C)を示す図である。 SARS-CoV2のNタンパク質に特異的なIgGに対するLuLISAのひげ図である(ひげの最小及び最大値;箱:中央値で分けられる第2及び第3四分位値)。 SARS-CoV2のSタンパク質に特異的なIgGに対するLuLISAのひげ図である。 APHP-Cochin(n=20)及びEFS(n=4)由来の血清におけるSARS-CoV2のNタンパク質特異的IgG対SARS-CoV2のSタンパク質特異的IgGの滴定間の相関性を示すグラフである。 APHP-Cochin(n=20)及びEFS(n=4)由来の血清におけるSARS-COV1のNタンパク質特異的IgG対SARS-CoV2のNタンパク質特異的IgGの滴定間の相関性を示すグラフである。 APHP-Cochin(n=20)及びEFS(n=4)由来の血清におけるSARS-CoV1のSタンパク質特異的IgG対SARS-CoV2のSタンパク質特異的IgGの滴定間の相関性を示すグラフである。 クイック検査(5分)対通例の検査(120分)におけるSARS-CoV2のNタンパク質特異的IgGの滴定間の相関性を示すグラフである。平均値は重複である。 本発明の方法の3つの実施形態(吸着による支持体上の抗原の固定化、共有結合、非共有結合)の模式図である。
ルシフェラーゼ変異体
「ルシフェラーゼ」は、本明細書において使用する場合、生物発光を生成する酸化酵素の一種を指す。生物発光は、酵素による基質の酸化を含む生化学反応により生成される光の放出である。
ルシフェラーゼは、下等生物、例えば、細菌、真菌、昆虫、渦鞭毛藻類、放散虫類、刺胞動物、甲殻類、クラゲ及び頭足類に一般に見出されるものを包含する。このような種々のルシフェラーゼの中でも、深海エビ由来のOplophorusルシフェラーゼは、有望な特性を有していた(Shimomura O、Masugi T、Johnson FH、Haneda Y.、Properties and reaction mechanism of the bioluminescence system of the deep-sea shrimp Oplophorus gracilirostris、Biochemistry. 1978 Mar 21;17(6):994～8頁)。しかし、このヘテロ二量体構造のルシフェラーゼ活性を有する19kDaのサブユニット(KAZ)は、制御性サブユニットの非存在下において不安定且つ発現が不十分であるため、天然酵素の多くの望ましい特徴を保持しない。活性は、天然基質セレンテラジンを用いて、KAZの配列における3つのアミノ酸置換V44I、A54I及びY138I(eKAZ)により、7倍高まっている(Inouye S、Sato J、Sahara-Miura Y、Yoshida S、Hosoya T、Luminescence enhancement of the catalytic 19 kDa protein (KAZ) of Oplophorus luciferase by three amino acid substitutions. Biochem Biophys Res Commun. 2014;445(1):157～162頁)。
酵素の折畳みは、タンパク質表面における親水性残基による疎水性アミノ酸の変異:A4E、F68D、L72Q、M75K、P115E及び/又はN166Rによって最適化している。
次いで、Hallらは、Oplophorus由来のルシフェラーゼの19kDaのサブユニットに由来するルシフェラーゼを改変した。これは、安定性が向上し、nanoLuc、NLuc並びにnanoKAZと呼ばれ、次の変異: A4E、Q11R、Q18L、L27V、A33N、K43R、V44I、A54I、F68D、L72Q、M75K、I90V、P115E、Q124K、Y138I及びN166Rを有する(Hall MP、Unch J、Binkowski BF、Valley MP、Butler BL、Wood MG、Otto P、Zimmerman K、Vidugiris G、Machleidt T、Robers MB、Benink HA、Eggers CT、Slater MR、Meisenheimer PL、Klaubert DH、Fan F、Encell LP、Wood KV、Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chem Biol. 2012 Nov 16;7(11):1848～57頁)。
しかし、nanoKAZルシフェラーゼの特性は、なお向上させる必要を有する。
ここで出願人は、nanoKAZの特異的変異体が、特に、新たに特許を取得した基質を用いたnanoKAZと比較して、溶解性及び/又は触媒活性及び/又は触媒基質1molあたりの光子放出が向上することを見出した(国際公開第2018/197727号、Coutantら、2019、2020)。
したがって、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し、
- 配列番号1の18番目に対応する位置におけるチロシン(Y)のアルギニン(R)との置換、
- 配列番号1の48番目に対応する位置におけるロイシン(L)のリジン(K)との置換、
- 配列番号1の56番目に対応する位置におけるイソロイシン(I)のアラニン(A)との置換、
- 配列番号1の116番目に対応する位置におけるチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)との置換、
- 配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)の、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸との置換、
- 配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)の、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸との置換、
並びに
- 配列番号1の166番目に対応する位置におけるシステイン(C)のセリン(S)との置換
からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、ルシフェラーゼに関する。
2つの近縁のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を比較する目的のために、第1の配列と第2の配列との間の「%同一性」は、アラインメントプログラム、例えば、BLAST(登録商標)(blast.ncbi.nlm.nih.govにおいて入手可能、最終アクセス2015年3月9日)により、標準設定を使用して算出し得る。%同一性は、同一残基の数を参照配列の残基の数で割り、100を乗じたものである。上述及び特許請求の範囲における%同一性の数値は、この方法により算出した百分率である。%同一性の代替定義は、同一残基の数をアラインメントした残基の数で割り、100を乗じたものである。代替方法は、ギャップ方法の使用を含み、ここで、アラインメントにおけるギャップ、例えば、一方の配列における、他方の配列に対する欠失は、スコアリングパラメータにおけるギャップスコア又はギャップコストを構成する。更なる情報については、ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/factsheets/HowTo_BLASTGuide.pdfにおいて入手可能なBLAST(登録商標)fact sheet、最終アクセス2015年3月9日を参照されたい。
ルシフェラーゼは、
- 配列番号1の18番目に対応する位置におけるチロシン(Y)のアルギニン(R)との置換、
- 配列番号1の48番目に対応する位置におけるロイシン(L)のリジン(K)との置換、
- 配列番号1の56番目に対応する位置におけるイソロイシン(I)のアラニン(A)との置換、
- 配列番号1の116番目に対応する位置におけるチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)との置換、
- 配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)の、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸との置換、
- 配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)の、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸との置換、
並びに
- 配列番号1の166番目に対応する位置におけるシステイン(C)のセリン(S)との置換
からなる群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ若しくは少なくとも7つ又は1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ若しくは7つのアミノ酸置換を含み得る。
一実施形態では、配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、スレオニン(T)と置換する。代替実施形態では、配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、グルタミン酸(E)と置換する。
一実施形態では、配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、スレオニン(T)と置換する。代替実施形態では、配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、グルタミン酸(E)と置換する。
一実施形態では、配列番号1の116番目に対応する位置におけるチロシン(Y)は、フェニルアラニン(F)と置換する。
一実施形態では、配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、スレオニン(T)と置換する。
一実施形態では、配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、スレオニン(T)と置換する。
一実施形態では、配列番号1の56番目に対応する位置におけるイソロイシン(I)は、アラニン(A)と置換する。
一実施形態では、配列番号1の116番目に対応する位置におけるチロシン(Y)は、フェニルアラニン(F)と置換し、配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、スレオニン(T)と置換する。
一実施形態では、配列番号1の116番目に対応する位置におけるチロシン(Y)は、フェニルアラニン(F)と置換し、配列番号1の166番目に対応する位置におけるシステイン(C)は、セリン(S)と置換する。
一実施形態では、配列番号1の18番目に対応する位置におけるチロシン(Y)は、アルギニン(R)と置換し、配列番号1の48番目に対応する位置におけるロイシン(L)は、リジン(K)と置換し、配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、グルタミン酸(E)と置換し、配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、グルタミン酸(E)と置換する。
一実施形態では、配列番号1の18番目に対応する位置におけるチロシン(Y)は、アルギニン(R)と置換し、配列番号1の48番目に対応する位置におけるロイシン(L)は、リジン(K)と置換し、配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、グルタミン酸(E)と置換し、配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、グルタミン酸(E)と置換し、配列番号1の166番目に対応する位置におけるシステイン(C)は、セリン(S)と置換する。
一実施形態では、配列番号1の18番目に対応する位置におけるチロシン(Y)は、アルギニン(R)と置換し、配列番号1の48番目に対応する位置におけるロイシン(L)は、リジン(K)と置換し、配列番号1の116番目に対応する位置におけるチロシン(Y)は、フェニルアラニン(F)と置換し、配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、グルタミン酸(E)と置換し、配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、グルタミン酸(E)と置換する。
一実施形態では、配列番号1の18番目に対応する位置におけるチロシン(Y)は、アルギニン(R)と置換し、配列番号1の48番目に対応する位置におけるロイシン(L)は、リジン(K)と置換し、配列番号1の116番目に対応する位置におけるチロシン(Y)は、フェニルアラニン(F)と置換し、配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、グルタミン酸(E)と置換し、配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)は、グルタミン酸(E)と置換し、配列番号1の166番目に対応する位置におけるシステイン(C)は、セリン(S)と置換する。
また、本発明は、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16及び配列番号17からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼに関する。
種々のルシフェラーゼのアミノ酸配列は、以下のtable 1(表1)に開示する。
Figure 2023522454000001
Figure 2023522454000002
Figure 2023522454000003
Figure 2023522454000004
Figure 2023522454000005
好ましくは、ルシフェラーゼは、配列番号1から配列番号11、より好ましくは、配列番号2、配列番号6、配列番号8、配列番号10又は配列番号11のアミノ酸配列を有する。最も好ましくは、ルシフェラーゼは、配列番号8、配列番号11又は配列番号6のアミノ酸配列を有する。
また、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16及び配列番号17からなる群から選択される2つ又は3つのアミノ酸配列を含む、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
このようなポリペプチドは、配列番号42、配列番号43、配列番号44及び配列番号45からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。
また、本発明は、配列番号46のアミノ酸配列を有する、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。
Figure 2023522454000006
Figure 2023522454000007
Figure 2023522454000008
本発明のルシフェラーゼは、N末端、C末端、又はこの両方に1つ又は複数の異種アミノ酸配列を有してもよく、これは、任意選択で、目的の分子と直接又は間接的に相互作用する。異種配列は、タグ、例えば、精製目的のためのタグ、又は目的のペプチド若しくはタンパク質であり得る。また、ルシフェラーゼは、有機分子(例えば、有機分子バインダー)に結合させ得る。
親和性タグは、精製のため、二次結合プローブのため、ビーズ結合のため、固体基質を結合させる目的のために、ルシフェラーゼアミノ酸配列のC末端に使用し得る。このようなタグのアミノ酸配列の例は、以下のtable 3(表3)に示す。
Figure 2023522454000009
目的のペプチド又はタンパク質は、ラクダ類重鎖抗体の可変ドメイン(VHH)、1本鎖可変断片(scFv)、重鎖の可変領域(VH)、免疫グロブリン(Ig)、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、受容体外部ドメイン、ペプチド抗原、ペプチドアレルゲン、受容体外部ドメイン、ウイルスカプシドペプチド断片、細菌表面ペプチド断片及び細胞表面ペプチド断片からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
リンカーは、目的のペプチド(例えば、限定されないが、VHH、scFv、VH、Ig)又は有機分子バインダーのアミノ末端とカルボキシ末端ルシフェラーゼとの間に挿入して、2つのドメインを繋ぎ得る。リンカーは、0～10個の残基を有し得る。
一実施形態では、目的のペプチド又は有機分子バインダーのアミノ末端及びカルボキシ末端ルシフェラーゼアミノ酸配列は、リンカーを使用せずに、直接結合させて、2つのドメインを繋ぎ得る。
リンカーのアミノ酸配列は、以下のtable 4(表4)に開示する。
Figure 2023522454000010
検出又は測定目的のために必要であるか又は要求される場合、リンカーは、アミノ末端タンパク質バインダードメイン(限定されないが、VHH、scFv、VH、Ig)、有機分子バインダー又は目的のペプチド配列とカルボキシ末端ルシフェラーゼとの間に挿入して、ルシフェラーゼを放出する目的のためのプロテアーゼ特異的切断部位を有する2つのドメインを繋ぐ。このようなトロンビン特異的切断リンカーのアミノ酸配列は、以下の通りであり、5～14個の残基を有する。トロンビン切断部位は、以下のtable 5(表5)に開示する。
Figure 2023522454000011
特には、本発明はまた、本発明のルシフェラーゼを含む融合タンパク質に関する。ルシフェラーゼは、目的のペプチドに結合し得る。
上記のように、目的のペプチドは、ラクダ類重鎖抗体の可変ドメイン(VHH)、1本鎖可変断片(scFv)、重鎖の可変領域(VH)、免疫グロブリン(Ig)、インターロイキン、サイトカイン、ケモカイン、受容体外部ドメイン、ペプチド抗原、ペプチドアレルゲン、受容体外部ドメイン、ウイルスカプシドペプチド断片、細菌表面ペプチド断片及び細胞表面ペプチド断片からなる群から選択され得るが、これらに限定されない。
好適には、ルシフェラーゼ又は本発明のルシフェラーゼを含む融合タンパク質は、組換えである。組換えは、ルシフェラーゼ又は融合タンパク質が、変異若しくはクローニング工程、又は天然に見出されるルシフェラーゼとは異なる、特に、天然に見出されるOplophorusのルシフェラーゼとは異なるルシフェラーゼが生じる他の手順の少なくとも1つの産物であることを意味する。
また、本発明は、本発明のルシフェラーゼ又は本発明のルシフェラーゼを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
好適には、本発明のポリヌクレオチドは、組換えである。上記のように、組換えは、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限若しくはライゲーション工程、又は天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドが生じる他の手順の少なくとも1つの産物であることを意味する。
ポリヌクレオチドは、ルシフェラーゼに結合する目的のポリペプチドを更にコードしてもよく、ここで、目的のポリペプチド及びルシフェラーゼは、融合タンパク質として発現することが可能である。
有利には、ポリヌクレオチドは、宿主細胞における本発明のルシフェラーゼ又はこのルシフェラーゼを含む融合タンパク質の発現についてコドン最適化し得る。
目的のポリヌクレオチドは、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号60、配列番号61及び配列番号62からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み得る。発現最適化ポリヌクレオチドの実施形態のこのようなヌクレオチド配列は、以下のtable 6(表6)に要約する。
Figure 2023522454000012
Figure 2023522454000013
Figure 2023522454000014
Figure 2023522454000015
Figure 2023522454000016
Figure 2023522454000017
Figure 2023522454000018
Figure 2023522454000019
Figure 2023522454000020
Figure 2023522454000021
また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
本明細書において使用する場合、ベクター(又はプラスミド)は、その発現又は複製のいずれかのために細胞に異種DNAを導入するのに使用する別々のエレメントを指す。このような媒体の選択及び使用は、当業者に周知である。発現ベクターは、このようなDNA断片の発現に影響することが可能な制御配列、例えば、プロモーターと動作可能に結合するDNAを発現させることが可能なベクターを含む。したがって、発現ベクターは、組換えDNA構築物、例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、又は適切な宿主細胞への導入時にクローンDNAの発現が生じる他のベクターを指す。適切な発現ベクターは、当業者に周知である。
組換えベクターは、組換えポリヌクレオチドを含むベクターである。
有利には、ベクターは、プロモーターに動作可能に結合するポリヌクレオチドを含む。
本明細書において使用する場合、動作可能に結合するとは、ヌクレオチドの制御及びエフェクター配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写及び翻訳終止部位、並びに他のシグナル配列とのDNAの機能的関連性を指す。
例えば、DNAのプロモーターへの動作的結合は、このようなDNAの転写が、DNAに対して特異的に認識、結合及び転写するRNAポリメラーゼによってプロモーターから開始されるような、DNAとプロモーターとの間の物理的及び機能的関連性を指す。
本明細書において使用する場合、プロモーターは、それが動作可能に結合するDNAの転写を調節するDNAのセグメントを指す。
本発明のポリヌクレオチド又はベクターは、細胞、典型的には、原核又は真核細胞内に存在し得る。ベクターは、細胞質において保存的であり得るか、又はポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター又はゲノム編集(すなわち、限定されないが、CRISPR-Cas9)を使用してゲノムに組み込み得る。
したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明の発現ベクターを含む細胞に関する。
一実施形態では、ルシフェラーゼ又はこのルシフェラーゼを含む融合タンパク質は、原核又は真核細胞から分泌され、細胞質において又は細菌の場合は周辺質において発現する。
一実施形態では、ルシフェラーゼ又はこのルシフェラーゼを含む融合タンパク質は、転写及び翻訳キットを使用してin vitroで合成する。
また、本発明は、本発明の細胞又はポリヌクレオチド又はベクターを含む非ヒト遺伝子導入動物に関する。
また、本発明は、
- ルシフェラーゼ、このルシフェラーゼを含む融合タンパク質、ポリヌクレオチド、発現ベクター又は本発明の細胞
- ルシフェラーゼのための基質
を含むキットに関する。
好ましくは、キットは、ルシフェラーゼ又は融合タンパク質及び基質を含む。
セレンテラジンは、エビOplophorusルシフェラーゼのための天然基質であるが、増大したシグナルは、フリマジン(furimazine)により得られ得る。
結果として、基質は、セレンテラジン、フリマジン又はこれらの誘導体からなる群から選択され得る。
プロ基質として安定状態のフリマジンの誘導体及びこれらのO-アセチル化部分は、国際公開第2018/197727号の特許出願に開示されている。このようなフリマジン誘導体により、強度、シグナル対ノイズ比及び/又は持続時間に関してより良い生物発光シグナルが生成される。
結果として、基質は、
8-ベンジル-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((4,5-ジメチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-6-(2-フルオロフェニル)-2-(フラン-2-イルメチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-(3-メチルベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-(3-メトキシベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2,8-ジベンジル-6-(2-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-6-(2,6-ジフルオロフェニル)-2-(フラン-2-イルメチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-6-フェニル-2-((5-(トリフルオロメチル)フラン-2-イル)メチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2,8-ジベンジル-6-(2,6-ジフルオロフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-6-(2-フルオロフェニル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((5-シクロプロピルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-(3-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-6-(2-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-6-(3-フルオロフェニル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-(2-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((5-エチルチオフェン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((4,5-ジメチルフラン-2-イル)メチル)-6-(2-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-ベンジル-8-(2-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-ベンジル-8-(3-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(3-フルオロベンジル)-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2-フルオロベンジル)-2-(3-メチルベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2-フルオロベンジル)-2-(3-メトキシベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2-フルオロベンジル)-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2-フルオロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(3-フルオロベンジル)-2-(3-メトキシベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(3-フルオロベンジル)-2-(3-メチルベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-8-(3-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2-クロロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(3-フルオロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-8-(2-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(3-フルオロベンジル)-6-(2-フルオロフェニル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-ベンジル-8-(2,3-ジフルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,6-ジフルオロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((4,5-ジメチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,6-ジフルオロベンジル)-2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-((4,5-ジメチルフラン-2-イル)メチル)-8-(2-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-((4,5-ジメチルフラン-2-イル)メチル)-8-(3-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((4-エチル-5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((5-エチル-4-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン及び
8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-(3-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
からなる群から選択され得る。
このような基質は、次の名称Q3、Q12、Q16、Q21、Q14、Q18、Q20、Q27、Q28、Q29、Q34、Q36、Q41、Q51、Q54、Q56、Q58、Q61、Q72、Q73、Q81、Q82、Q83、Q84、Q85、Q101、Q100、Q99、Q98、Q97、Q96、Q105、Q107、Q108、Q117、Q121、Q124、Q127、Q129、Q131、Q132、Q135、Q143及びQ149で国際公開第2018/197727号にそれぞれ開示されている。
好ましい実施形態では、基質は、8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(国際公開第2018/197727号129頁の表1に開示されているQ-108)である。
また、本発明は、
- 配列番号1のアミノ酸配列、又は配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有するこのバリアントを有するルシフェラーゼを生成する工程と、
- 配列番号1の18番目に対応する位置におけるチロシン(Y)をアルギニン(R)と置換する工程、
- 配列番号1の48番目に対応する位置におけるロイシン(L)をリジン(K)と置換する工程、
- 配列番号1の56番目に対応する位置におけるイソロイシン(I)をアラニン(A)と置換する工程、
- 配列番号1の116番目に対応する位置におけるチロシン(Y)をフェニルアラニン(F)と置換する工程、
- 配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)を、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸と置換する工程、
- 配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)を、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸と置換する工程、並びに
- 配列番号1の166番目に対応する位置におけるシステイン(C)をセリン(S)と置換する工程、或いはこれらの組合せ
からなる群から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つの工程と
を含む、本発明のルシフェラーゼを生成するための方法に関する。
また、本発明は、
- ルシフェラーゼの発現が可能となる条件下で細胞に本発明のベクターを導入する工程、及び/又は
- ルシフェラーゼの発現が可能となる条件下で本発明の細胞を増殖させる工程
を含む、本発明のルシフェラーゼ又は本発明のルシフェラーゼを含む融合タンパク質を生成する方法に関する。
また、本発明は、発光反応における本発明のルシフェラーゼ又は本発明のルシフェラーゼを含む融合タンパク質の使用に関し、この使用は、ルシフェラーゼのための基質の追加を含む。
本発明では、
(a)ルシフェラーゼ又は融合タンパク質を基質に曝露する工程と、
(b)発光を検出する工程と
を含む方法を提供する。
曝露前に、本発明によるポリヌクレオチドを細胞に導入してもよく、及び/又はルシフェラーゼ若しくは融合タンパク質を発現させてもよい。
方法は、in vitro、ex vivo又はin vivoであり得る。
融合タンパク質
発明の概要に言及するように、本発明は、
- ラクダ類重鎖抗体(VHH)又は1本鎖可変断片(scFV)の可変ドメインであり、免疫グロブリンに向けられた抗体を含むN末端ドメイン、
及び
- ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含むC末端ドメインであり、
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するか、又は
- 配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、C末端ドメイン
を含む、融合タンパク質に関する。
一実施形態では、融合タンパク質は、
- 1本鎖可変断片(scFV)を含み、免疫グロブリンに向けられたN末端ドメイン、
及び
- ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含むC末端ドメインであり、
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するか、又は
- 配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、C末端ドメイン
を含む。
1本鎖可変断片(scFv)は、リンカーに結合する、免疫グロブリンの重(VH)及び軽鎖(VL)の可変領域の融合タンパク質である。
別の実施形態では、融合タンパク質は、
- ラクダ類重鎖抗体(VHH)の可変ドメインを含み、免疫グロブリンに向けられたN末端ドメイン、
及び
- ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含むC末端ドメインであり、
- 配列番号1のアミノ酸配列を有するか、又は
- 配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有する、C末端ドメイン
を含む。
VHHは、ラクダ類重鎖抗体の可変ドメインである。実際、ラクダ科(Camelidae)ファミリーのメンバーでは、かなりの割合の血清抗体が、約80kDの分子量を有するホモ二量体IgGである(Hamers-Castermanら1993 Nature、363、446～448頁)。このような重鎖免疫グロブリン(Ig)は、3つのドメインを含み、これらの可変領域は、VHHと呼ばれる。組換えVHH(サイズ約12～14kD)は、インタクトな抗原結合ドメインを構成し、広範な抗原結合レパトワを示す。これらの高頻度可変領域は、拡張され、ユニークな特性、例えば、より親水性のアミノ酸による3～4つの疎水性フレームワーク残基(従来抗体のVLと相互作用する)の置換を示す。拡大したCDRを安定化するために、VHHは、正準のジスルフィド結合に加えて、ヒトコブラクダのCDR1とCDR3及びラマのCDR2とCDR3の間に更なるジスルフィド結合を有し得る(Harmsen及びDe Haard 2007 Appl Microbiol Biotechnol.、77、13～22頁; Muyldermans 2001 J Biotechnol.、74、277～302頁)。伸張したCDR3ループは、凸構造をとり得るが、従来のパラトープは、凹又は平板構造に制限される(Muyldermans 2001 J Biotechnol.、74、277～302頁)。このような特徴により、VHHが、従来の抗体に対して低免疫原性のユニークなエピトープを認識することが可能となる(Lafayeら2009 Mol Immuno.、46、695～704頁; Wernery 2001 J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.、48、561～568頁)。VHHは定義上、いかなる結合活性作用をもデフォルトで除外する一価抗体であるが、in vitroでIC50として測定したこれらの生物学的活性は、従来の二価抗体分子に類似し得る(Thysら2010 Antiviral Res.、87、257～264頁)。
VHHは、公知のVHHの中から選択され得る。本発明に従って使用し得る公知のVHHの例は、以下のtable 3(表7)に開示する。
Figure 2023522454000022
したがって、本発明による融合タンパク質のVHHは、配列番号57、配列番号58及び配列番号59からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。
また、本発明に従って使用するVHHは、ライブラリーから選択され得る。
ファージディスプレイのような方法では、免疫したラクダ又はラマのVHHライブラリーから抗原特異的VHHを選択することが記載されている。VHH遺伝子は、ファージディスプレイベクターによりクローニングし、抗原バインダーは、パニングにより得られ、選択されたVHHは、細菌により発現させる。組換えVHHは、唯一のドメインをクローニングすればよく、また、このようなVHHが良好に発現し、水性環境において高度に可溶性であり、高温で安定であるため、従来の抗体断片(Fab又はscFv)と比較して多数の利点を有する。
また、VHHは、カスタム設計し、ラクダ類VHH足場又はヒト化scFv足場から誘導体化した合成ライブラリーからスクリーニングし得る。
例えば、VHHは、
(a)ラクダ類、好ましくは、アルパカ(Lama pacos)を免疫グロブリン又はこの断片により免疫する工程と、
(b)免疫化ラクダ類の末梢リンパ球を単離し、全RNAを得、対応するcDNAを合成する工程と(方法は当技術分野において公知であり、例えば、Lafayeら1995 Res Immunol.、146、373～82頁; Erratum in: 1996、Res Immunol.、147、61を参照)、
(c)VHHドメインをコードするcDNA断片のライブラリーを構築する工程と、
(d)工程(c)において得られたVHHドメインコードcDNAを、PCRを使用してmRNAに転写し、mRNAをリボソームディスプレイフォーマットに変換し、リボソームディスプレイによりVHHドメインを選択する工程と
を含む方法により得られる。
VHHをコードするポリヌクレオチド及びルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ベクターに挿入し得る。VHHをコードするポリヌクレオチド及びルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、結合させて、本発明の融合タンパク質を発現させる。
次いで、ベクターを、例えば、細菌細胞の形質転換により、細胞に導入して、細胞に融合タンパク質を発現させ得る。
融合タンパク質のN末端ドメイン及びC末端ドメイン並びに/又はVHH及びルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、リンカーを介して結合させ得る。好ましいリンカーは、GS、AAA、配列番号24、配列番号25及び配列番号26からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
融合タンパク質は、N末端、C末端、又はこの両方に1つ又は複数の異種アミノ酸配列を含み得る。特には、精製目的のためのタグ、例えば、ポリ-ヒスチジンタグを含み得る。
また、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びにこのポリヌクレオチドを含むベクターに関する。
好適には、本発明の融合タンパク質又はこれをコードするポリヌクレオチドは、組換えである。
有利には、ベクターは、プロモーターに動作可能に結合するポリヌクレオチドを含む。
有利には、ポリヌクレオチドは、融合タンパク質の発現についてコドン最適化し得る。
本発明のポリヌクレオチド又はベクターは、細胞内に存在し得る。
したがって、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを含む細胞に関する。
VHHを生成する免疫グロブリンは、ヒト又は非ヒト動物、好ましくは、ヒト由来であり得る。
免疫グロブリンは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD又はIgEであり得る。好ましくは、免疫グロブリンは、IgG、IgE、IgM又はIgAである。目的の免疫グロブリンは、アッセイの目的に依存する。例えば、アッセイの目的がアレルギーの診断である場合、主にIgE、第2にIgGが好ましい。IgMは、新鮮血液感染の診断に使用し得る。IgGは、陳旧性血液感染の診断に使用し得る。IgAは、血液、粘膜又は唾液における感染の診断に使用し得る。
典型的には、免疫グロブリンは、抗原に対して生成する。
抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫又はこれらの断片若しくは一部からなる群から選択され得る。
例えば、アレルゲンは、乳、特には、牛乳、ダイズ、卵、コムギ、タラ、シーフード、甲殻類、魚類、木の実、ピーナツ、ヤケヒョウヒダニ(D. pteronyssinus)、アルテルナリア(Alternaria)、ネコ、イヌ、草又はカバノキの花粉、チリダニ、麻酔薬(限定されないが、クラーレ)、抗生物質(限定されないが、アモキシシリン)、ラテックス、布、毒液(限定されないが、スズメバチ及びミツバチ由来)の成分、主に、タンパク質であり得る。
ウイルスは、例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS CoV2)又は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス1(SARS CoV1)であり得る。ウイルスの断片は、組換えとして合成若しくは発現させた、ウイルス由来の単離タンパク質、例えば、スパイクタンパク質(S)又は核タンパク質(N)、又は構造若しくは機能ドメインに対応する断片、又は任意のサイズの断片を含み得る。
また、免疫グロブリンは、自己抗体であり得る。
好ましい実施形態では、VHHは、免疫グロブリンの定常断片(Fc)に対して生成される。
一実施形態では、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有するルシフェラーゼである。
ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有し得る。
一実施形態では、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、上に開示する変異ルシフェラーゼである。
したがって、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%のアミノ酸配列同一性を有してもよく、
- 配列番号1の18番目に対応する位置におけるチロシン(Y)のアルギニン(R)との置換、
- 配列番号1の48番目に対応する位置におけるロイシン(L)のリジン(K)との置換、
- 配列番号1の56番目に対応する位置におけるイソロイシン(I)のアラニン(A)との置換、
- 配列番号1の116番目に対応する位置におけるチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)との置換、
- 配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)の、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸との置換、
- 配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)の、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸との置換、
並びに
- 配列番号1の166番目に対応する位置におけるシステイン(C)のセリン(S)との置換
からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。
ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16及び配列番号17からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。
また、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45及び配列番号46からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し得る。
また、本発明は、
- 本発明の融合タンパク質、及び
- ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドのための基質
を含むキットに関する。
上に言及するように、セレンテラジンは、エビOplophorusルシフェラーゼのための天然基質であるが、増大したシグナルは、フリマジンにより得られ得る。
結果として、基質は、セレンテラジン、フリマジン又はこれらの誘導体からなる群から選択され得る。
フリマジンの誘導体は、国際公開第2018/197727号の特許出願に開示されている。このようなフリマジンの誘導体により、強度、シグナル対ノイズ比及び/又は持続時間に関してより良い生物発光シグナルが生成される。
結果として、基質は、
8-ベンジル-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((4,5-ジメチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-6-(2-フルオロフェニル)-2-(フラン-2-イルメチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-(3-メチルベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-(3-メトキシベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2,8-ジベンジル-6-(2-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-6-(2,6-ジフルオロフェニル)-2-(フラン-2-イルメチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-6-フェニル-2-((5-(トリフルオロメチル)フラン-2-イル)メチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2,8-ジベンジル-6-(2,6-ジフルオロフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-6-(2-フルオロフェニル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((5-シクロプロピルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-(3-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-6-(2-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-6-(3-フルオロフェニル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-(2-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((5-エチルチオフェン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-ベンジル-2-((4,5-ジメチルフラン-2-イル)メチル)-6-(2-フルオロフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-ベンジル-8-(2-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-ベンジル-8-(3-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(3-フルオロベンジル)-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2-フルオロベンジル)-2-(3-メチルベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2-フルオロベンジル)-2-(3-メトキシベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2-フルオロベンジル)-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2-フルオロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(3-フルオロベンジル)-2-(3-メトキシベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(3-フルオロベンジル)-2-(3-メチルベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-8-(3-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2-クロロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(3-フルオロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-8-(2-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(3-フルオロベンジル)-6-(2-フルオロフェニル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-ベンジル-8-(2,3-ジフルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,6-ジフルオロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((4,5-ジメチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,6-ジフルオロベンジル)-2-((5-エチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-((4,5-ジメチルフラン-2-イル)メチル)-8-(2-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
2-((4,5-ジメチルフラン-2-イル)メチル)-8-(3-フルオロベンジル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((4-エチル-5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((5-エチル-4-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン及び
8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-(3-ヒドロキシフェニル)イミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン
からなる群から選択され得る。
このような基質は、次の名称Q3、Q12、Q16、Q21、Q14、Q18、Q20、Q27、Q28、Q29、Q34、Q36、Q41、Q51、Q54、Q56、Q58、Q61、Q72、Q73、Q81、Q82、Q83、Q84、Q85、Q101、Q100、Q99、Q98、Q97、Q96、Q105、Q107、Q108、Q117、Q121、Q124、Q127、Q129、Q131、Q132、Q135、Q143及びQ149で国際公開第2018/197727号にそれぞれ開示されている。
好ましい実施形態では、基質は、8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン(国際公開第2018/197727号129頁の表1に開示されているQ-108)である。
また、キットは、ルシフェラーゼ活性の検出のための試薬、対照及び/又は支持体を含み得る。
好ましくは、抗原は、支持体上に固定化する。支持体は、スライド、プレート、例えば、マルチウェルプレート、ストリップ、例えば、ニトロセルロース若しくはPVDF膜又は紙のストリップ、チューブ、ディスク、ループ、スティック、プロペラ、繊維又は繊維の集合であり得る。
また、本発明は、試料中の免疫グロブリンを検出及び/又は定量するための、本発明の融合タンパク質の使用に関する。
試料は、例えば、全血、血清、血漿、脳脊髄液、精液、尿、鼻咽頭スメア、中咽頭スメア、膣スメア、便、汗、唾液、気管洗浄液及び気管支洗浄液からなる群から選択され得る。
また、本発明は、
(a)試料を本発明の融合タンパク質に接触させる工程と、
(b)ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドのための基質を加える工程と、
(c)発光を検出する工程と
を含む、試料中の免疫グロブリンの存在を検出するための方法に関する。
典型的には、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、本発明の融合タンパク質のルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである。
試料中の免疫グロブリンレベルは、放出発光に対する平均値によっても測定し得るため、本発明は、試料中の免疫グロブリンレベルを定量するための方法であって、
(a)試料を本発明の融合タンパク質に接触させる工程と、
(b)ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドのための基質を加える工程と、
(c)発光を定量する工程と
を含む、方法にも関する。
典型的には、ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、本発明の融合タンパク質のルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである。
また、本発明の方法は、抗原を支持体に固定化する工程、及び/又は抗原を固定化する支持体を供給する工程を含み得る。
固定化は、表面吸着、化学結合又は非共有相互作用のいずれかにより実施し得る。
方法は、試料を固定化抗原に接触させる工程を含み得る。
融合タンパク質と免疫グロブリンとの相互作用は、希釈、加熱、或いは塩、酸、塩基、又は有機若しくは無機緩衝液、又は相互作用の任意の競合物の追加、或いは側方流動又は音響周波数のいずれかにより検証し得る。
発光を検出する場合、1秒毎の光子の数は、これらの波長に従って最終的に計数し得る。
また、方法は、対照に対する放出発光と比較する工程を含み得る。
また、本発明は、ポリクローナル免疫グロブリン混合物の親和性範囲を評価するための、試料における1親和性区間あたりの免疫グロブリンレベルを定量するための方法であって、
(a)遊離抗原の希釈系列の存在下で試料を固定化抗原と接触させる工程と、
(b)試料を本発明の融合タンパク質と接触させる工程と、
(c)ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドのための基質を加える工程と、
(d)発光を定量し、抗原濃度に対する光強度をプロットする工程と
を含む、方法に関する。
典型的には、レベルを定量する免疫グロブリンは、融合タンパク質の抗体を生成する免疫グロブリンである。抗原は、免疫グロブリンを生成する抗原である。ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドは、本発明の融合タンパク質のルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドである。
本発明は、次の図及び実施例により、更に例示する。ただし、このような実施例及び図は、本発明の範囲を制限するものとして決して解釈されるべきではない。
(実施例1)
特性が向上した変異ルシフェラーゼ
nanoKAZ/nanoLucは、オキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼの触媒ドメインからの酵素生成及び最短の光強度を最適化するための集中的変異誘発の結果として生じる。しかし、酵素の触媒活性の向上の他に、1)反応産物による酵素の不活性化、2)高基質濃度による反応の阻害、3)酸化反応の低量子収率、4)材料表面(チューブ、ウェル、膜等)に吸着される酵素の傾向を克服する4つの知見により、変異の発見がもたらされる。
材料及び方法
nanoKAZ(配列番号1)は、オキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼの触媒ドメインの最適化配列である(国際公開第2012/061530号)。
NanoKAZ遺伝子(配列番号33[jaz526])は、Eurofins社(独国)により合成されたものであり、カルボキシ末端His6タグ、及びpET23配列(Novagen社)に対応する隣接領域を有する。PCR精製pET23ベクター及び合成遺伝子は、相補断片を構築するGibsonの方法に従って、NEBuilder HiFiアセンブリーマスターミックス(New England BioLabs社)を使用して構築した。単一又は二重変異をPCRにより配列番号2[jaz544]、3[jaz583]、4[jaz584]、5[jaz560]、6[jaz585]、7[jaz619]に導入した。配列番号40の遺伝子[jaz536]は、Eurofins社(独国)により合成されたものであり、カルボキシ末端His6タグ、及びpET23配列(Novagen社)に対応する隣接領域を有する。単一又は二重変異である配列番号41[jaz570]、42[jaz572]、43[jaz573]は、PCRにより導入した。多重変異は、特定の変異を保有する遺伝子の相補断片を構築するGibsonの方法により、NEBuilder HiFiアセンブリーマスターミックス(New-England Biolabs社)を使用して導入した。
配列番号1の重複を有する配列番号42の遺伝子[JAZ621]、配列番号1の重複における116番目のチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)による二重置換を有する配列番号43[JAZ622]、配列番号1の三重複を有する配列番号44[JAZ476]、配列番号1の三重複における116番目のチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)による三重置換を有する配列番号45[JAZ620]及び配列番号1を包含するAntares配列における116番目のチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)による置換を有する配列番号46[Scoprii68]はすべて、Eurofins社(独国)により合成されたものであり、カルボキシ末端His6タグ、及びpET23配列(Novagen社)に対応する隣接領域を有する。
産物(5mL)を使用してNEB 5アルファコンピテント大腸菌(E.coli)を形質転換し、ペトリ皿内のLB/アガー/アンピシリン上で一晩増殖させた。単離したコロニーを液体培地中で増殖させ、プラスミドを単離し、ヌクレオチドのシーケンシングを実施して正しい位置における変異の存在を確認した。
結果
フェニルアラニンによる116番目のチロシン残基の変異(配列番号2[JAZ544])によって、nanoKAZの触媒活性が、nanoKAZ/フリマジンを参照して、フリマジンにより250%、Q108により1400%増加した。変異触媒ドメインの重複(配列番号45)又は三重複(配列番号45)により、触媒活性がそれぞれ2600%及び3500%増加する。基質拡散率により、単一ドメイン活性の予想された上昇が2又は3倍に制限されている(1400%)。本発明者らは、ルシフェラーゼ活性が、基質の性質に応じて一定の比率で経時的に低下することを示している(Coutantら1999)。活性の低下は、Q80では早く、Q103では遅い。残念なことには、発光が強くなるほど、酵素の不活性化が早くなる。光強度(フラッシュ)又は寿命の長さ(グロー)の間に妥協点が存在する。本発明者らは、低下は酵素の不活性化が原因であることを示している。セリン残基によるシステイン166の変異(配列番号7[JAZ619])により、不活性化の比率が減少する。
疎水性バックポケットの近傍におけるスレオニンによる134番目のトリプトファンの変異(配列番号3[JAZ583])により、高濃度の基質による阻害が穏やかに減少する。本発明者らは、最大反応率におけるフリマジン濃度で室温においてnanoKAZ(配列番号1)分子により触媒されたフリマジン1460分子毎の1光子を計数した(54マイクロM)。基質の選択により、この量子収率を超低から中程度に調節する。基質濃度が低くなるほど量子収率が高くなるが、残念なことに、反応率が低くなるほど光子放出が減少する。フェニルアラニンによる116番目のチロシン残基の変異(配列番号2[JAZ544])により、光子放出数が中程度に増加する。タンパク質表面を示す134(配列番号3[JAZ583])及び163番目(配列番号4[JAZ584])のトリプトファンの変異は、アッセイに高ノイズの影響を与える酵素の溶解性の向上及び表面吸着の低下に最も有効である。
変異の組合せは、光強度、寿命、及び溶解性に関する特性の向上を付与している。最良の妥協点は、光強度/予想感度、寿命/実験持続時間、溶解性/実験条件の適用に必要とされる特定の特性に従って選択する。
- 配列番号1[nanoKAZ、JAZ526]触媒活性はフリマジンにより100%、Q108により250%。
- 配列番号2[JAZ544]配列番号1の116番目におけるチロシン(Y)の置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の200%、Q108により1450%。
- 配列番号3[JAZ583]配列番号1の134番目におけるトリプトファン(W)のスレオニン(T)による置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の100%。
- 配列番号4[JAZ584]配列番号1の163番目におけるトリプトファン(W)のスレオニン(T)による置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の50%。
- 配列番号5[JAZ560]配列番号1の56番目におけるイソロイシン(I)のアラニン(A)による置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の120%、Q108により600%。
- 配列番号6[JAZ585]配列番号1の116番目におけるチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)による及び134番目におけるトリプトファン(W)のスレオニン(T)による置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の200%、Q108により1400%。
- 配列番号7[JAZ619]配列番号1の116番目におけるチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)による及び166番目におけるシステイン(C)のセリン(S)による置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の200%。
- 配列番号8[JAZ536]配列番号1の18番目におけるチロシン(Y)のアルギニン(R)による、48番目におけるロイシン(L)のリジン(K)による、134番目におけるトリプトファン(W)のグルタミン酸(E)による及び163番目におけるトリプトファン163(W)のグルタミン酸(R)による置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の80%。
- 配列番号9[JAZ570]配列番号1の18番目におけるチロシン(Y)のアルギニン(R)による、48番目におけるロイシン(L)のリジン(K)による、134番目におけるトリプトファン(W)のグルタミン酸(E)による、163番目におけるトリプトファン163(W)のグルタミン酸(E)による及び166番目におけるシステイン(C)のセリン(S)による置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の150%。
- 配列番号10[JAZ572]配列番号1の18番目におけるチロシン(Y)のアルギニン(R)による、48番目におけるロイシン(L)のリジン(K)による、134番目におけるトリプトファン(W)のグルタミン酸(E)による、163番目におけるトリプトファン163(W)のグルタミン酸(E)による及び116番目におけるチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)による置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の180%。
- 配列番号11[JAZ573]配列番号1の18番目におけるチロシン(Y)のアルギニン(R)による、48番目におけるロイシン(L)のリジン(K)による、134番目におけるトリプトファン(W)のグルタミン酸(E)による、163番目におけるトリプトファン(W)のグルタミン酸(E)による、116番目におけるチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)による及び166番目におけるシステイン(C)のセリン(S)による置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の150%。
いくつかの配列によって、触媒ドメインの重複又は三重複によるシグナルの増大が可能となる。これらは、ライブイメージング、高速動力学、又は深部組織観察のための光強度を必要とするin vitro又はin vivoでのイメージングの適用のために主に使用する。診断では、アッセイにおけるこれらの適用は、シグナル及びノイズが増大するため、有用ではない。著しくは、基質濃度が低い場合、基質の活性部位に対する拡散率により、活性が制限されている。
- 配列番号42[JAZ621]配列番号1の重複。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の150%。
- 配列番号43[JAZ622]配列番号1の重複における116番目のチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)による二重置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の560%、Q108により2600%。
- 配列番号44[JAZ476]配列番号1の三重複。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の250%。
- 配列番号45[JAZ620]配列番号1の三重複における116番目のチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)による三重置換。触媒活性はフリマジンにより配列番号1の2500%、Q108により3500%。
基質は単一であるがレポーターとしてのルシフェラーゼは2つによる2色の適用を、配列番号1～15及びAntares、又はnanoKAZからイソギンチャクモドキ(Discosoma sp.)赤色蛍光タンパク質に由来するmOrangeへのエネルギー共鳴移動により赤方偏移光子を放出するScorpii(配列番号48)の配列のうちの1つを使用することにより実施することができる(Shaner Nc、Campbell Re、Steinbach Pa、Giepmans Bng、Palmer Ae、Tsien Ry (2004). Nature Biotechnology、22(12)、1567～1572頁)。
- 配列番号46[Scorpii68]Antaresキメラにおける配列番号1の116番目のチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)による置換(Chu J、Oh Y、Sens A、Ataie N、Dana H、Macklin JJ、Laviv T、Welf ES、Dean KM、Zhang F、Kim BB、Tang CT、Hu M、Baird MA、Davidson MW、Kay MA、Fiolka R、Yasuda R、Kim DS、Ng HL、Lin MZ、Nat Biotechnol. 2016 Jul;34(7):760～7頁)。活性は、Q108により562nmで800%であるが、nanoKAZは、460nmで光子を放出する。単一基質による2色適用の他に、レポーターとして使用するScorpiiは、厚い組織を透過する赤方偏移光によるin vivoでのイメージングに効率的である。
(実施例2)
アレルゲン特異的IgEを測定するための生物発光方法
材料及び方法
ヒト血漿
ピーナツアレルギーを有する患者由来の血漿試料を、ピーナツアレルギーを有する小児及び成人における経口免疫療法の施設内審査委員会認可臨床試験の登録者の一部として得た(ピーナツ経口免疫療法試験:安全性、有効性及び発見(peanut oral immunotherapy study: safety, efficacy and discovery); ClinicalTrials.gov識別子:NCT02103270、米国)。ピーナツアレルギーは、ピーナツに対する二重盲検プラセボ対照食物負荷試験に対する反応(ピーナツタンパク質≦500mgにより誘発される反応を有する)及びピーナツに対する陽性皮膚プリックテスト応答(膨疹≧5mm)を有するものとして定義した。健常ドナー由来の血漿試料は、仏国血液バンク(Etablissement Francais du Sang、EFS)から得た。
融合タンパク質抗IgE sdAb026-nanoKAZ
抗IgEナノボディ-ルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするプラスミド(pET23-sdAb026-nanokaz)の設計及び合成
nanoKAZは、オキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼの触媒ドメインの最適化配列である(国際公開第2012/061530号)。
nanoKAZ遺伝子は、Eurofins社(独国)により合成されたものであり、カルボキシ末端His6タグ、及びpET23配列(Novagen社)に対応する隣接領域を有する。pET23プラスミドは、フォワード及びリバースオリゴヌクレオチド(Fwd:5'CTCGAGCACCACCACCACCACCAC3'(配列番号47); Rvr:5'GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC3'(配列番号48)、Eurofins社)により、Q5 DNAポリメラーゼ、dNTPミックス(New England BioLabs社)を使用して増幅した。PCR産物は、電気泳動によりアガロースゲル(1%、Macherey Nagel社)上で精製した。精製pET23ベクター及び合成遺伝子は、NEBuilder HiFiアセンブリーマスターミックス(New England BioLabs社)を使用して構築した(pET23-nanoKAZ)。
sIgE結合部分は、sIgEに対して選択されたアルパカのヒト化重鎖抗体(単一ドメイン抗体、sdAb026)から得られる(Jabs F、Plum M、Laursen NS、Jensen RK、Molgaard B、Miehe M、らTrapping IgE in a closed conformation by mimicking CD23 binding prevents and disrupts FcepsilonRI interaction. Nat Commun 2018; 9:7、国際公開第2014/087010号)。sdAb026は、ヒトIgEの定常Cε3領域を認識する。sdAb026は、抗IgE治療抗体オマリズマブのそれに類似してIgEに対する親和性を有し(KD 1.4nM対2.6nM、それぞれ3,5)、IgEと2つの受容体FcεRI及びCD23との間の相互作用を阻害することが報告されていた。
sdab026遺伝子は、Eurofins社により合成されたものであり、pET23-nanoKAZ配列に対応する隣接領域を有する。sdab026合成遺伝子は、対応するフォワード及びリバースオリゴヌクレオチド(Fwd:5'ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTC3'(配列番号49); Rvr:5'CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAA3'(配列番号50);Eurofins社)により、Q5 DNAポリメラーゼ及びdNTPミックスを使用して増幅した。
PCR産物は、電気泳動によりアガロースゲル上で精製した。精製pET23-nanoKAZベクター及びsdAb026合成遺伝子は、NEBuilder HiFiアセンブリーマスターミックス(New-England Biolabs社)を使用して構築した。
構築した産物(5mL)を使用してNEB 5アルファコンピテント大腸菌を形質転換し、ペトリ皿内のLB/アガー/アンピシリン上で一晩増殖させた。単離したコロニーを液体培地中で増殖させ、プラスミドを単離し、ヌクレオチドのシーケンシングを実施してsdab026-nanoKAZ挿入物の存在を確認した。
抗IgEナノボディルシフェラーゼタンデムsdAb026-nanoKAZ([ナノボディ抗IgE]-[nanoKAZ]-[His6])の完全配列を以下の表に示す。
Figure 2023522454000023
配列から算出したsdAb026-nanoKAZの推定分子量(MW)は、34.1kDである。
抗IgEナノボディ-ルシフェラーゼ融合タンパク質(sdAb026-nanoKAZ)の発現、精製及び検証
pET23-sdab026-nanokazを使用し、大腸菌BL21(DE3、New-England Biolabs社)を形質転換して、大腸菌における高発現を達成した。細胞を18℃で増殖させ、IPTG(Sigma-Aldrich社)を加えてsdAb026-nanoKAZ生成を誘導した。細胞を遠心分離により回収後(1.5L)、ペレットを、プロテアーゼ阻害剤(Sigma-Aldrich社)及びリゾチーム(0.1mg/mL、Sigma-Aldrich社)を加えた50mMのTris-HCl pH8.0、50mMのNaCl中に再懸濁した。細胞は、凍結融解サイクル溶解方法により破壊された。次いで、DNase I(Sigma-Aldrich社)を加えて試料からDNAを除去した。
粗製抽出物を30分1250gで遠心分離した。上清を採取し、NaCl(500mM)、イミダゾール(20mM、Sigma-Aldrich社)及びTritonX-100(0.1%、Sigma-Aldrich社)を加えた。清澄化溶解物を平衡化Hi-Trap 5mLカラム(GE-Healthcare社)上に4mL/分で添加して、AKTA pureクロマトグラフィーシステム(GE-Healthcare社)を使用した。カラムは、20容量のカラムにより、ランニング緩衝液(50mMのTris-HCl pH8.0、50mMのNaCl、20mMのイミダゾール)を用いて5mL/分で洗浄した。sdAb026-nanoKAZは、50mMのTris-HCl pH8.0、50mMのNaCl中20mM～200mMのイミダゾールによる勾配により5mL/分で溶出し、画分1mLを96深型ウェルプレート(GE-Healthcare社)に採取した。画分の触媒活性を、ルミノメーターHydexを使用して、27μMのフリマジンを加えたPBSに画分を107倍に希釈することによってプロファイリングした。高活性の画分は貯蔵し、50mMのTris-HCl pH8.0、50mMのNaClにより平衡化した1mL HiTrap Qカラム(GE-Healthcare社)上に添加した。AKTA pureクロマトグラフィーシステムを使用して、タンパク質を50mMのMES pH6.5、50mMのNaClにより1mL/分、18℃で溶出した。画分500μLを96深型ウェルプレートに採取し、これらの活性を上記のように定量した。高活性の画分を貯蔵した。精製タンパク質の品質は、一定分量(10μL)をstain-free SDSゲル(4～15%のMini-PROTEAN(登録商標)TGX Stain-Free(商標)Protein Gels、Bio-Rad社)上に添加することにより評価した。
ゲルは、5分間のUVトランスイルミネーション(Bio--Gel Doc XRイメージングシステム)により活性化した。トリプトファン残基をトリハロ化合物によるUV誘導反応に供し、蛍光シグナルを画像化する。UVスペクトル(240～300nm)を得て、280nmにおける吸収溶液のsdAb026-nanoKAZ濃度を評価した。特異的活性は、23℃のPBS中のフリマジンによりsdAb026-nanoKAZ約1015獲得光子/秒/mgである。最適活性は、基質(フリマジン)濃度10～30μMに達する(KMの約10倍=2μMでプラトー)。nanoKAZ触媒部位の中でも30μMを超える基質の双極子モーメントにより、活性部位における触媒基質の光子放出をクエンチする。クエンチ効率は、基質の双極子モーメントに依存する。基質触媒作用によりnanoKAZが確率的に不活性化され、酵素の寿命は、基質及び触媒作用の比率に依存する。発光強度は、nanoKAZ及びこの変異体30種並びに異なる基質172種の触媒作用の徹底的酵素研究からの特定の基質の動態パラメータによる最適条件を使用することにより最適化した。
IgEルシフェラーゼ免疫吸着アッセイ(LuLISA)プロトコール
平底の白色96ウェルプレート(Fluoronunc C96 Maxisorp、Nunc社)は、NaHCO3 50mM緩衝液pH9.5(Sigma社)中10μg/mLのピーナツ抽出物(F171、Greer laboratories社)、10μg/mLのAra H1(NA-AH1-1、Indoor Technology社)、10μg/mLのAra H2(RP-AH2-1、Indoor Technology社)、5μg/mLのオボアルブミン(OVA、Sigma-Aldrich社)又は1μg/mLのチリダニDER p2(2B12NA-DP2-1、Indoor Technology社)のいずれかを50μL/ウェルで用いた吸着により、室温で2時間コーティングした。sIgEが結合するのに接触可能なアレルゲンドメインを提示させる一方、標的を最大限固定化すべきであるため、標的固定化は、方法の成功又は失敗の主な因子である。Maxisorp(登録商標)プレート上での吸着では、電荷相互作用が好都合である。吸着の代替は、カルボキシ、アミン若しくはスルフヒドリル部分による標的の共有結合、又は官能化ウェル表面におけるグリコシル化である。ウェルは空にし、コーティングは、NaHCO3中100μg/mLのウシ血清アルブミン(Sigma社)により室温で1時間飽和させた。ウェルは0.1%のPBS/Tween20 100μLで4回洗浄した。組換え抗OVAヒトキメラIgE(クローンX4A4D12/G9/H8、Arkab社から寄贈)、抗チリダニp2ヒトキメラIgE(クローンCH1、Arkab社から寄贈)又はピーナツアレルギー対象由来の血漿を、示すようにPBS又は健常ドナー由来の血漿の貯蔵物により希釈した。試料希釈物は、50μL/ウェルで、それぞれのアレルゲンによりコーティングしたウェル内に、室温で1時間インキュベートした。ウェルは0.1%のPBS/Tween20 100μLで4回洗浄した。PBS中1ng/mLの精製sdAb026-nanoKAZ(1.109RLU.s-1.mL-1)を添加し(50μL/ウェル)、室温で30分インキュベートした。ウェルは0.1%のPBS/Tween20 100μLで4回洗浄した。プレートは、この工程において測定までPBSに貯蔵することができる。読取り直前に、各ウェルを空にし、27μM(nanoKAZのKMの約10倍、2μM)のフリマジン(8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン)50μLを添加した。プレートを5秒間軌道振盪し、マルチウェルプレートルミノメーター(LB960 Centro、Berthold社)を使用して、発光強度を1ウェルあたり1秒積分した。
LuLISA競合アッセイによる親和性スペクトルの処理では、混合物は、50μL中0.5μLの同一濃度の血清又は血漿試料から、384ウェルプレートのアレルゲンコーティングウェル16種によるPBS中10μM～0.7pMの遊離アレルゲンの3対3希釈系列、又は96ウェルプレートのアレルゲンコーティングウェル8種による10μM～1pMの遊離アレルゲンの10対10希釈系列によって生成した。値は、IgE親和性に適合させるべきである。1～3時間インキュベートして平衡又はその最近接点に到達させた。ウェルは0.1%のPBS/Tween20 100μLで4回洗浄した。特に、高濃度の遊離アレルゲンでは、非常に長いインキュベーション時間において固定化アレルゲンへのIgE結合は弱いが、シグナルがより強くバックグラウンドがより弱いため、精製sdAb026-JAZ572(1ng/mL)がsdAb026-nanoKAZよりも好ましい。最終的には、0.1%のTween 20、0.1mg/mLのBSA又は0.1mg/mLのゼラチンを使用してバックグラウンドを減少させ得る。潜在的アレルギー患者におけるIgEアッセイでは、乳は回避すべきである。ウェルは0.1%のPBS/Tween20 100μLで4回洗浄した。読取り直前に、各ウェルを空にし、13.5μMのヒカジン(hikazine)-108(8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン)50μLを添加した。プレートを1秒間軌道振盪し、マルチウェルプレートルミノメーター(LB960 Centro、Berthold社)を使用して、発光強度を1ウェルあたり0.5秒積分した。生物発光強度は、棒グラフとして、標的濃度に対して示す。
IgE ImmunoCAP
ImmunoCAP分析は、Thermo Fisher社のPhadiaにより、出荷された試料に対して実施した。
IgE ELISAプロトコール
透明な平底の96又は384ウェルプレート(Maxisorp、Nunc社)を上記のように室温で2時間コーティングした。ウェルを空にし、コーティングをPBS中100μg/mLのウシ血清アルブミン(Sigma社)50μLにより室温で1時間飽和させた。ウェルは0.1%のPBS/Tween20(Sigma社)100μLで4回洗浄した。組換え抗OVAヒトキメラIgE(クローンX4A4D12/G9/H8、Arkab社から寄贈)、抗チリダニp2ヒトキメラIgE(クローンCH1、Arkab社から寄贈)又はピーナツアレルギー対象由来の血漿をPBSで希釈し、50μL/ウェルで、それぞれのアレルゲンによりコーティングしたウェル内に室温で1時間インキュベートした。ウェルは0.1%のPBS/Tween 20 100μLで4回洗浄した。希釈したアルカリホスファターゼ(PBSにより1:700、Sigma-Aldrich社)でコンジュゲートしたヤギIgG抗ヒトIgE 50μLを各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした。ウェルは0.1%のPBS/Tween 20 100μLで4回洗浄した。すべてのウェルを空にし、1mg/mLのホスファターゼ基質pNPP(4-ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム塩、Sigma-Aldrich社)50μLをウェル毎に加え、室温で3時間又は4℃で一晩インキュベートした。吸光度を405nmでマルチウェルプレート分光光度計(Sapphire、Tecan社)により測定し、LuLISA結果と比較した。
統計学的分析
健常ドナー及びピーナツアレルギー対象由来の血漿試料間のIgEレベルの差を、独立マン・ホイットニーU検定を使用して比較した。P値<0.05を統計学的に有意であると考える。
指先の血液試料
検査を健常なボランティアにより実施し、適用プロジェクトを設定し、Trousseau病院のアレルギー患者の縮小コホートから血液試料を採取して、IgE LuLISAアッセイと並行してImmunoCAP及びELISAを行った。
検査は、アルコールによる指先の除菌後に、糖尿病患者の自己調査のためのグルコースアッセイに通常実施する、滅菌した使い捨てランセットを有する穿刺デバイスを使用して実施した。一定μLをピペットで移し、末端がポリエチレンのフィルタープラグまで紙フィルターに囲まれた1000μLチップ(単一使用)内に事前に添加したPBS、BSA(50μg/mL)、ヘパリン(10UI/mL)、sdAb026-nanoKAZ(1ng)の溶液50μLに混合する。希釈した血液を、チップ末端を通して濾過し、特定のアレルゲンにより事前にコーティングした96ウェルプレートに添加し、室温で5分間インキュベートする。ウェルはPBSで洗浄し、ルシフェラーゼ基質(フリマジン類似体)100μLを加え、生物発光を、プレートルミノメーター(LB960 centro、Berthold社)を使用して1秒以内に直ちに測定する。測定は、内部較正のための陰性及び陽性対照と並行して実施する。
結果
ルシフェラーゼ結合免疫吸着アッセイ(LuLISA)によるアレルゲン特異的IgEの感度及び特異的検出
LuLISAを使用してsIgEの特異的検出のための概念実証を確立するために、イエダニアレルゲンDer p 2に対して生成した組換えIgE、IgG1(主要IgGサブクラス)又はIgG4(アレルゲン特異的免疫療法の間に高生成される主なIgGサブクラス)のPBSによる希釈系列を調製した。3群の試料を、IgE LuLISAを使用して分析した。
予想通りに、濃度依存性シグナルが、抗Der p 2 sIgEを含む試料についてのみ生じ、検出限界は、約5×10-13M sIgE(約1pg/mL;約0.0004kUA/L)であった(図2)。
類似の実験を組換えヒト抗オボアルブミンIgEに対して実施した。組換えヒト抗オボアルブミン(OVA)IgEを指示濃度でPBSに希釈し、プレート結合OVAとともにインキュベートした。抗体レベルの生物発光検出をLuLISAにより抗IgE sdAb026-nanoKAZを使用して実施した。
また、組換え抗オボアルブミン(OVA)IgEにより高感度が得られ、これは、LuLISAによって5pg/mL(約0.002kUA/L)と同等に低い濃度で検出可能であった(図3及び図4)。
組換え抗オボアルブミン(OVA)IgEを指示濃度でPBSに希釈した。同一希釈試料の一定分量中のOVA sIgEのレベルを、LuLISA又はELISAを使用して評価した。また、LuLISAの感度は、sIgEの検出のための標準的ELISAのそれよりもはるかに高かった(図4)。
次いで、健常ドナー30人から貯蔵した血漿により希釈した組換えOVA sIgEを使用して、IgE LuLISAのダイナミックレンジ及び感度を標準的ImmunoCAPに対して比較した(図5)。この直接比較により、ImmunoCAPと比較したLuLISAの分析感度の顕著な上昇(約250倍)が明らかとなった(図5)。
高度ピーナツアレルギー対象由来の血漿試料の希釈系列による類似の実験を実施し、これは、健常ドナー30人由来の血漿の貯蔵物により再度希釈した(図6)。ImmunoCAPでは、最大4,050倍まで希釈した血漿中のピーナツsIgEの検出が可能となったが、LuLISAでは、ピーナツsIgEは、100,000～300,000倍に希釈したアレルギー血漿中で更に検出された(図6)。
次いで、LuLISAによるIgEの生物発光検出に対する抗IgEナノボディ-ルシフェラーゼ融合タンパク質の濃度の影響を調査した。ピーナツアレルギー対象由来の血漿(ピーナツ特異的IgE ImmunoCAP値:2186kU/L)1μLをPBS 50μLに希釈し、プレート結合ピーナツ抽出物とともにインキュベートした(PBS単独を対照として使用した)。ピーナツ特異的IgEレベルの生物発光検出は、指示濃度の抗IgEナノボディ-ルシフェラーゼタンデム(sdAb026-nanoKAZ)によるLuLISAによって実施した。固定(1:50)希釈のこのピーナツアレルギー血漿試料による抗IgEナノボディ-ルシフェラーゼ融合タンパク質の希釈系列によって濃度依存性シグナルが生成され、IgE LuLISAの非常に低い生物発光バックグラウンドシグナルが確認された(図7)。
まとめると、このような結果は、IgE LuLISAが非常に高い感度及び特異性を有し、このため、非常に低いsIgEを有する患者由来の試料中のIgEの定量に潜在的に使用可能であることを示す。ImmunoCAPを上回るIgE LuLISAの主な利点は、極めて少量の試料しか必要としないことである。図6で使用したピーナツアレルギー患者由来の試料の場合では、ピーナツsIgEは、1ナノリットル未満の初期患者試料を使用して、更に検出することができた。したがって、患者試料サイズが制限される場合であっても、IgE LuLISAを使用して、一連の潜在的アレルゲンに対するsIgEの非常に大規模なスクリーニングを想定することができる。
次いで、健常ドナー31人(仏国血液バンクEFSから得、未知のアレルギー状態を有する)及びピーナツアレルギー対象82～105人(施設内審査委員会認可ピーナツ経口免疫療法試験:安全性、有効性及び発見試験; ClinicalTrials.gov識別子:NCT02103270の登録時に採取)由来の血漿1μLを使用して、全ピーナツ抽出物又は主要なピーナツアレルゲンであるAra h 1及びAra h 2に対してsIgEを測定することにより、この手法の更なる検証を求めた。
滴定した高ピーナツsIgEによる参照試料の希釈系列をアッセイの較正に使用して、すべての血漿試料を本発明者らの方法による検出の線形範囲内において分析したことを確かめた(図8)。
予想通りに、健常ドナーと比較して有意に高いレベルのピーナツsIgE、Ara h 1 sIgE及びAra h 2 sIgEをピーナツアレルギー対象由来の血漿試料中で検出した(図9、図10及び図11)。
アレルギー患者におけるLuLISAとImmunoCAPとの間の直接比較は、両方法間の高い相関性を示した(ピーナツsIgE、Ara h 1 sIgE及びAra h 2 sIgEについてそれぞれR2=0.89、0.84及び0.83)(図12、図13及び図14)。このような相関性は、sIgEレベルがImmunoCAPの検出カットオフ(0.1kUA/L)を超えるすべての血漿試料を使用して算出した。これは、すべての試料がピーナツsIgEである場合であった。しかし、Ara h 1 sIgEでは試料82種のうちの17種(19.7%)、Ara h 2 sIgEでは試料96種のうちの3種(3.1%)が、ImmunoCAPの検出限界未満であった(図12、図13及び図14)。しかし、このようなすべての対象は、二重盲検プラセボ対照食物負荷試験(DBPCFC)及び皮膚プリックテストを実施することにより評価した場合、ピーナツに対する明白な臨床反応を有した(table 4(表9))。
Figure 2023522454000024
まとめると、このような結果は、IgE LuLISAが高感度であり、sIgEの臨床検出に対して的確であり、非常に少量の血漿しか必要としないことを実証する。
ImmunoCAPに加えて、sIgEの検出のための他のいくつかの方法が報告されており、IMMULITE、より最近では、アイソタイプ特異的凝集PCR(ISAP)を含む(Hamilton RGら2008、Tsai CTら、2018)。IMMULITEは、化学発光の手法を使用してsIgEを検出するため、LuLISAに最も近い方法であると思われる。しかし、IMMULITEによるsIgEの報告された検出限界は、ImmunoCAPのものと同一である(0.1kUA/L)。LuLISAに類似して、ISAPによるsIgEの検出は、臨床試料1μlを使用して実施することができる。しかし、ISAPでは、化学合成アレルゲンDNA(各種のアレルゲンについて)及び二次抗IgE抗体DNAコンジュゲートを必要として、定量的PCRによりsIgEを検出するように、2つの検査は、異なる手法に基づく。
IgE LuLISAは、乳に対してアレルギーを有する乳児について検査する血清IgEに対するストリップ検査(側方流動)に使用した。結果は、図15に示す。
このような検査は、手術を受ける患者におけるクラーレ(麻酔薬)、アモキシシリン(抗生物質)及びラテックス(手袋)に、又は小児救急における新生児の乳化合物に対するアレルギー検出に特異的なIgEを検出するための、緊急条件におけるLuLISA適用のプルーフィングを目的とする。
指先の血液試料は、オマリズマブで処置した患者のsIgE LuLISAに日常的且つ適時に適合させて、検出した遊離sIgEの量により注入用量を調整する。
必要とされる少量の試料及びELISAに対するLuLISAの性能の拡大により、潜在的に2つ以上のIgE分子種を有する血清の親和性プロファイル又はスペクトルをプロットする場合の適用の拡大が可能となる。LuLISA競合アッセイは、一定濃度の血清と混合した一連のアレルゲン希釈物を使用して実施する。IgE検出量は、光強度と相関する。アレルゲン濃度間隔毎のIgE検出量は、アレルゲンに対して非常に高(ピコモル未満)、高(ナノモル)、中(10～100ナノモル)又は低(マイクロモル以上)親和性の免疫グロブリンの存在を評価する方法である。親和性が高いほど、マスト細胞、好塩基球及びマクロファージの表面におけるIgE受容体の飽和及び凝集が強力であり、ヒスタミン及びサイトカイン応答が強くなってアナフィラキシーショックのリスクが高くなる。親和性スペクトルは、上昇量のアレルゲンによる負荷試験を中止するか、抗ヒスタミン薬により短期的応答を調節するか、又はIgG Fc受容体結合部位の競合物(オマリズマブ)により高親和性IgEを除去する治療戦略を方向づけるための除感作治療下の患者の経過観察に適切なツールである。
要約すると、IgE LuLISAは、非常に少量(1μL以下)の血漿試料しか必要としない、超高感度のsIgEの検出のための新たな方法である。生物発光の使用により、古典的比色分析(ELISA)又は蛍光(ImmunoCAP)IgE検出方法を上回る感度の顕著な向上とともに、濃度のダイナミックレンジの拡大がもたらされる。この方法は、完全に自動化可能であり、IgEの生物発光検出に市販のプレート及び標準的ルミノメーターを使用する。したがって、IgE LuLISAは、従来のImmunoCAPを上回って対費用効果が非常に高いはずである。
(実施例3)
SARS COv-2血清学的検査のためのルシフェラーゼ免疫吸着アッセイ
材料及び方法
ヒト血漿及び血清
試料は、CORSERコホートの血清(n=164; IcareB)から、長期的経過観察中のAssistance Publique des Hopitaux de Paris(APHP) Cochinの集中治療医学及び蘇生術の観察及び監視プロトコールによる血清(n=20)から、並びに2019年12月に試料採取したEtablissement Francais du Sang(EFS)の健常ドナーの血漿及び血清(凍結血漿n=20、凍結血清n=20)から得た。健常ドナー664人由来のプレパンデミック凍結血清は、仏国血液バンク(Etablissement Francais du Sang、EFS)から得た。
融合タンパク質抗IgGナノボディ-ルシフェラーゼ
抗IgGナノボディ-ルシフェラーゼ融合タンパク質をコードするプラスミド(配列番号62をコードするfc1及び配列番号63をコードするfc10及び配列番号10をコードするjaz572をそれぞれ有するpET23-fc1-nanoKAZ若しくはpET23-fc10-nanoKAZ、又は配列番号62をコードするfc1及び配列番号63をコードするfc10及び配列番号10をコードするjaz572をそれぞれ有するpET23-fc1-jaz572若しくはpET23-fc10-jaz572)の設計及び合成
nanoKAZは、オキヒオドシエビ由来ルシフェラーゼの触媒ドメインの最適化配列である(国際公開第2012/061530号)。Jaz572(配列番号10)は、nanoKAZに由来し、光子放出及びシグナルを増大させる触媒活性の向上、並びにノイズを減少させる凝集及び表面吸着挙動の減少を有し、これらは、より良いシグナルノイズ比に寄与している。
nanoKAZ及びJAZ572遺伝子は、Eurofins社(独国)により合成されたものであり、カルボキシ末端His6タグ、及びpET23配列(Novagen社)に対応する隣接領域を有する。pET23プラスミドは、フォワード及びリバースオリゴヌクレオチド(Fwd:5'CTCGAGCACCACCACCACCACCAC3'(配列番号47);Rvr:5'GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC3'(配列番号48)、Eurofins社)により、Q5 DNAポリメラーゼ、dNTPミックス(New England BioLabs社)を使用して増幅した。PCR産物は、電気泳動によりアガロースゲル(1%、Macherey Nagel社)上で精製した。精製pET23ベクター及び合成遺伝子は、NEBuilder HiFiアセンブリーマスターミックス(New-England Biolabs社)を使用して構築した(pET23-nanoKAZ又はpET23-jaz572)。
IgG結合部分は、IgGに対して選択されたアルパカのヒト化重鎖抗体(単一ドメイン抗体)から得られる(米国特許第10,259,886号明細書)。FC1は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4の定常断片領域を、平衡状態において次の解離定数: KD 0.57nM、1.73nM、47.8nM、0.30nMでそれぞれ認識し、全IgGのKDは3.25nMである(米国特許第10,259,886号明細書)。FC10は、ヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4の定常断片領域を、平衡状態において次の解離定数:KD 2.62nM、7.29nM、8.99nM、12.3nMでそれぞれ認識し、全IgGのKDは3.25nMである(米国特許第10,259,886号明細書)。
fc1及びfc10遺伝子は、Eurofins社により合成されたものであり、pET23-nanoKAZ配列に対応する隣接領域を有する。fc1又はfc10合成遺伝子は、対応するフォワード及びリバースオリゴヌクレオチドにより、Q5 DNAポリメラーゼ及びdNTPミックスを使用して増幅した。
PCR産物は、電気泳動によりアガロースゲル上で精製した。精製pET23-nanoKAZ及びpET23-jaz572ベクター並びにfc1又はfc10合成遺伝子は、NEBuilder HiFiアセンブリーマスターミックス(New-England Biolabs社)を使用して構築した。
構築した産物(5mL)を使用してNEB 5アルファコンピテント大腸菌を形質転換し、ペトリ皿内のLB/アガー/アンピシリン上で一晩増殖させた。単離したコロニーを液体培地中で増殖させ、プラスミドを単離し、ヌクレオチドのシーケンシングを実施してfc1-nanoKAZ又はfc10-nanoKAZ、fc1-jaz573、fc10-jaz573挿入物の存在を確認した。
抗IgGナノボディルシフェラーゼタンデムFC1-nanoKAZ又はFC10-nanoKAZ([ナノボディ抗IgG]-[nanoKAZ]-[His6])の完全配列を例として以下の表に示す。
Figure 2023522454000025
Figure 2023522454000026
配列から算出したFC1-nanoKAZ及びFC10-nanoKAZの推定分子量(MW)はそれぞれ、34115及び33588ダルトンである。
抗IgGナノボディ-ルシフェラーゼ融合タンパク質の発現、精製及び検証は、抗IgEナノボディnanoKAZ(sdAb026-nanoKAZ)のものと同一であった
ルシフェラーゼ結合免疫吸着アッセイ(LuLISA)によるSARS-COV2のN及びSタンパク質に特異的なIgG検出のプロトコール
IgGルシフェラーゼ免疫吸着アッセイ(LuLISA)プロトコール
平底の白色96又は384ウェルプレート(Fluoronunc C96 Maxisorp、Nunc社)は、リン酸緩衝食塩水pH7.4(Sigma社)中1μg/mLの核タンパク質、スパイク又はこれらの断片のいずれかを50μL/ウェルで用いた吸着により、室温で2時間又は4℃で一晩コーティングした。Maxisorp(登録商標)プレート上での吸着では、電荷相互作用が好都合である。吸着の代替は、カルボキシ、アミン若しくはスルフヒドリル部分による標的の共有結合、又は官能化ウェル表面におけるグリコシル化、又はポリ-リジンによるコーティングである。ウェルは最終的に空にするが、BSA(1mg/mL)又は3%の無脂肪乳により必ずしも中和するとは限らなかった。ウェルは0.1%のPBS/Tween20 100μLで3～6回洗浄した。3%の無脂肪乳、1mg/mLのウシ血清アルブミン、1～3%のウシ血清及び/又は0.1%のTween20を最終的に加えたリン酸緩衝食塩水中の血清(典型的には、1/200)、血漿又は体液の希釈物は、50μL/ウェルで、それぞれのアレルゲンによりコーティングしたウェル内に、室温で30分～1時間インキュベートした。ウェルは0.1%のPBS/Tween20 100μLで3～6回洗浄した。3%の無脂肪乳、1mg/mLのウシ血清アルブミン又は1～3%のウシ血清及び/又は0.1%のTween20を最終的に加えたリン酸緩衝食塩水中1ng/mLの精製VHH-nanoKAZ(5.107RLU.s-1.mL-1)を添加し(50μL/ウェル)、室温で20～30分インキュベートした。ウェルは0.1%のPBS/Tween20 100μLで4回洗浄した。プレートは、この工程において測定までPBSに貯蔵することができる。読取り直前に、各ウェルを空にし、27μMのフリマジン(8-ベンジル-2-(フラン-2-イルメチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オン)50μL又は13μMのQ108を添加した。プレートを5秒間軌道振盪し、マルチウェルプレートルミノメーター(LB960 Centro、Berthold社)を使用して、発光強度を1ウェルあたり0.5～1秒積分した。
結果
SARS-CoV2のNタンパク質に特異的なIgGは、CORSERコホートの血清(n=164; IcareB)、長期的経過観察中のAssistance Publique des Hopitaux de Paris(APHP) Cochinの集中治療医学及び蘇生術の観察及び監視プロトコールによる血清(n=20)、並びに2019年12月に試料採取したEtablissement Francais du Sang(EFS)の健常ドナーの血清及び血漿(凍結血漿n=20、凍結血清n=20)による、ルシフェラーゼ結合免疫吸着アッセイ(LuLISA)によって滴定した。
結果は、図16に示す。
SARS-CoV2のスパイク(S)タンパク質に特異的なIgGは、Assistance Publique des Hopitaux de Paris(APHP) Cochinの集中治療医学及び蘇生術の観察及び監視プロトコールによる血清(n=20)並びにEFSの健常ドナー由来の凍結血清(n=4)によるLuLISAによって滴定した。
結果は、図17に示す。
APHP-Cochin(n=20)及びEFS(n=4)由来の血清におけるSARS-CoV2のNタンパク質特異的IgG及びSARS-CoV2のSタンパク質特異的IgGの滴定間の相関性は、図18に示す。
次いで、SARS-CoV1 Nタンパク質及びSARS CoV2 Nタンパク質並びにSARS CoV1 Sタンパク質及びSARS-CoV2 Sタンパク質に対して特異的な、患者由来の血清(APHP-Cochin n=20)及び健常ドナーの凍結血清(EFS n=4)のIgGを比較した。
結果は、図19及び図20に示す。
5分以内に実施し得る96ウェルプレート上での緊急検査は、APHP-Cochin(n=20)及びEFS(n=4)由来の血清に対して2つ組でインキュベーション時間を短縮することにより定量し、室温又は更に良好には37℃での血清のインキュベーションは3分、洗浄工程(プレート洗浄機Zoom HT、Berthold社)毎に17秒、及び抗IgG VHH-nanoKAZのインキュベーションは1分であった。決定係数R2は0.75であった。結果は、図21に示す。
参考文献
本出願を通じて、種々の参考文献によって本発明が関係する先行技術を記載する。このような参考文献の開示は、本明細書によって、参照により本出願に組み込む。

Claims (17)

  1. - ラクダ類重鎖抗体(VHH)又は1本鎖可変断片(scFV)の可変ドメインであり、免疫グロブリンに向けられた抗体を含むN末端ドメイン、及び
    - ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドを含むC末端ドメインであり、
    - 配列番号1のアミノ酸配列を有するか、又は
    - 配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する、C末端ドメイン
    を含む融合タンパク質。
  2. ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドが、
    配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16及び配列番号17
    からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の融合タンパク質。
  3. VHHが、免疫グロブリンの定常断片(Fc)に対して生成される、請求項1又は2に記載の融合タンパク質。
  4. 抗体がVHHである、請求項1から3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  5. 免疫グロブリンが、アレルゲンに向けられたIgEである、請求項1から4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  6. 免疫グロブリンが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2のN又はSタンパク質に向けられたIgM又はIgGである、請求項1から4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
  7. - 請求項1から6のいずれか一項に記載の融合タンパク質、及び
    - ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドのための基質
    を含むキット。
  8. 試料中の免疫グロブリンを検出及び/又は定量するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の融合タンパク質の使用。
  9. (a)試料を、請求項1から6のいずれか一項に記載の融合タンパク質と接触させる工程と、
    (b)ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドのための基質を加える工程と、
    (c)発光を検出する工程と
    を含む、試料中の免疫グロブリンの存在を検出するための方法。
  10. 試料中の免疫グロブリンレベルを定量するための方法であって、
    (a)試料を、請求項1から6のいずれか一項に記載の融合タンパク質と接触させる工程と、
    (b)ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドのための基質を加える工程と、
    (c)発光を定量する工程と
    を含む、方法。
  11. ポリクローナル免疫グロブリン混合物の親和性範囲を評価するための、試料における1親和性区間あたりの免疫グロブリンレベルを定量するための方法であって、
    (a)遊離抗原の希釈系列の存在下で試料を抗原と接触させる工程と、
    (b)試料を、請求項1から6のいずれか一項に記載の融合タンパク質と接触させる工程と、
    (c)ルシフェラーゼ活性を有するポリペプチドのための基質を加える工程と、
    (d)発光を定量し、抗原濃度に対する光強度をプロットする工程と
    を含む、方法。
  12. 配列番号1のアミノ酸配列に対する少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有し、
    - 配列番号1の18番目に対応する位置におけるチロシン(Y)のアルギニン(R)との置換、
    - 配列番号1の48番目に対応する位置におけるロイシン(L)のリジン(K)との置換、
    - 配列番号1の56番目に対応する位置におけるイソロイシン(I)のアラニン(A)との置換、
    - 配列番号1の116番目に対応する位置におけるチロシン(Y)のフェニルアラニン(F)との置換、
    - 配列番号1の134番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)の、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸との置換、
    - 配列番号1の163番目に対応する位置におけるトリプトファン(W)の、スレオニン(T)及びグルタミン酸(E)からなる群から選択されるアミノ酸との置換、並びに
    - 配列番号1の166番目に対応する位置におけるシステイン(C)のセリン(S)との置換
    からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、ルシフェラーゼ。
  13. 配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16及び配列番号17からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するルシフェラーゼ。
  14. 発光反応における請求項12又は13に記載のルシフェラーゼの使用。
  15. (a)請求項12又は13に記載のルシフェラーゼを基質に曝露する工程と、
    (b)発光を検出する工程と
    を含む方法。
  16. 請求項12又は13に記載のルシフェラーゼ及び
    - ルシフェラーゼのための基質を含む、キット。
  17. 基質が8-(2,3-ジフルオロベンジル)-2-((5-メチルフラン-2-イル)メチル)-6-フェニルイミダゾ[1,2-a]ピラジン-3(7H)-オンである、請求項7又は16に記載のキット。
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