JP2023521831A - 急性呼吸窮迫症候群の処置のためのマトリックス結合小胞（ｍｂｖ） - Google Patents

急性呼吸窮迫症候群の処置のためのマトリックス結合小胞（ｍｂｖ） Download PDF

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Abstract

急性呼吸窮迫症候群の処置を必要とする対象における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ＣＯＶＩＤ－１９）等、ウイルス感染症に関連する急性呼吸窮迫症候群等、急性呼吸窮迫症候群を処置するための方法が開示される。このような方法は、細胞外マトリックスに由来する単離されたマトリックス結合小胞（ＭＢＶ）を含む医薬調製物を対象に投与するステップを含む。一実施形態では、本発明は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を発症するリスクがある対象におけるＡＲＤＳを処置または予防する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年４月１６日に出願された米国特許仮出願第６３／０１１，１７７号の利益を主張する。
発明の分野
本出願は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ＣＯＶＩＤ－１９）に起因する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）等のＡＲＤＳを処置するための、細胞外マトリックスに由来するマトリックス結合小胞（ＭＢＶ）の投与に関する。
背景
２０１９－新型コロナウイルスまたは２０１９－ｎＣｏＶとしても当技術分野で公知の重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染症から生じるコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）パンデミックは、現在、世界中の公衆衛生上の懸念の源である。処置は、多くの患者で臨床的に困難であった（Mehta et al. (2020) COVID-19: Consider Cytokine Storm Syndromes and Immunosuppression. Lancet. 395 (10229): 1033-1034）。抗ウイルス薬、抗炎症薬、免疫抑制薬およびワクチンを開発するために大量の資源が動員されたが、山のように増える証拠は、サイトカイン放出症候群またはサイトカインストーム症候群としても公知の高サイトカイン血症が、最も重度の疾患を有するＣＯＶＩＤ－１９患者の共通の特色および死亡の主因であることを示唆する（Tian, S. et al. (2020) Pulmonary Pathology of Early-Phase 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Pneumonia in Two Patients With Lung Cancer. J. Thorac. Oncol. S1556-0864(20)30132-5）。さらに、高サイトカイン血症は、典型的に急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に起因する患者死亡の強力な指標である。高サイトカイン血症およびＡＲＤＳの両方が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症によって引き起こされる免疫系の病的調節不全を反映する。現在の治療薬は、免疫抑制または特異的な炎症メディエーターの阻害により異常炎症に対処するが、これは、二次感染症に対する感受性増加を許してしまう。
Ｍｅｈｔａら、Ｌａｎｃｅｔ．（２０２０）３９５（１０２２９）：１０３３～１０３４ Ｔｉａｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｏｎｃｏｌ．（２０２０）Ｓ１５５６－０８６４（２０）３０１３２～５
したがって、依然として、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因するＡＲＤＳ等のウイルス感染症から生じる免疫系障害等、免疫系障害の場合に免疫系をモジュレートするための新たなかつ有効な処置に対して重要な必要性が存在する。
概要
急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を処置または予防する方法が本明細書に提供される。
一実施形態では、本発明は、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を発症するリスクがある対象におけるＡＲＤＳを処置または予防する方法を提供する。方法は、細胞外マトリックスに由来する単離されたマトリックス結合小胞（ＭＢＶ）の治療有効量を含む医薬組成物を対象に投与し、これにより、対象におけるＡＲＤＳを処置または予防するステップを伴う。開示されている方法は、ＡＲＤＳを有するまたはそのリスクがある対象を選択するステップを含むことができる。
患者におけるＡＲＤＳは、幾つもの起源となる状態に起因し得る。例えば、一実施形態では、対象は、起源がウイルス、細菌または真菌である肺感染症を有する。例えば、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルスまたはヘルペスウイルスから選択されるウイルスによる肺感染症を有し得る。前述の実施形態のいずれかでは、対象は、肺炎を有し得る。一実施形態では、対象は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣＯＶＩＤ－１９に感染している。別の実施形態では、対象は、インフルエンザを有する。別の実施形態では、対象は、ＳＡＲＳまたはＭＥＲＳを有する。さらに別の実施形態では、対象は、煙、化学物質煙霧またはベイピングによる（例えば、電子たばこからの）蒸気等の毒性物質を吸入した。さらに別の実施形態では、対象は、肺内に吸引した水、嘔吐物または食物を有する。別の実施形態では、対象は、肺または呼吸を制御する脳の一部分を損傷する頭部または胸部傷害を有する。他の実施形態では、対象は、敗血症を有する。さらに他の実施形態では、対象は、膵炎を有する。別の実施形態では、対象は、重症熱傷を有する。別の実施形態では、対象は、輸血を受けた。
本発明にしたがって、一部の実施形態では、本発明の方法は、高サイトカイン血症を経験している対象において実施される。例えば、本発明に係るＭＢＶの投与は、対象における高サイトカイン血症の影響を逆転させる。一部の実施形態では、ＭＢＶは、ＡＲＤＳの開始を予防するために、ＡＲＤＳの開始に先立ち対象に投与される。また、他の実施形態では、ＭＢＶは、ＡＲＤＳを処置しＡＲＤＳの進行を予防するために、ＡＲＤＳの開始後に対象に投与される。
本発明の方法の一実施形態では、対象は、ヒト対象である。
本発明の一実施形態にしたがって、ＭＢＶを含む医薬組成物は、全身性静脈内（ＩＶ）注射によって投与される。例えば、全身性静脈内注射は、標準ＩＶラインまたは中心ライン経由である。一部の実施形態では、中心ラインは、末梢挿入中心カテーテル（ＰＩＣＣ）、トンネル型カテーテルまたは植え込み型ポートである。一部の実施形態では、標準ＩＶラインは、手首、腕または手の静脈内にある。さらに他の実施形態では、静脈内注射は、ボーラス注射または持続性点滴またはポンプ注射である。
別の実施形態にしたがって、医薬組成物は、対象の肺に投与される。例えば、医薬組成物は、ネブライザーによるエアロゾルとして投与される。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、気管内滴下注入によって投与される。例えば、投与は、対象に配置された気管内チューブ経由である。さらに他の実施形態では、医薬組成物は、定量吸入器によって肺に投与される。
別の実施形態にしたがって、ＭＢＶ（ｉ）は、ＣＤ６３、ＣＤ８１および／もしくはＣＤ９のうち１種もしくは複数を発現しないか、または辛うじて検出可能なレベルのＣＤ６３、ＣＤ８１および／もしくはＣＤ９を有する；ならびに／または（ｉｉ）ＭＢＶは、（ａ）少なくとも５５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せを含むリン脂質含量；（ｂ）１０％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン（ＳＭ）を含むリン脂質含量；（ｃ）２０％もしくはそれ未満のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリン脂質含量；および／または（ｄ）１５％もしくはそれよりも高いホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含むリン脂質含量を含む。
さらに別の実施形態では、ＭＢＶは、膀胱、小腸、心臓、真皮、肝臓、腎臓、子宮、脳、血管、肺、骨、筋肉、膵臓、胎盤、胃、脾臓、結腸、脂肪組織または食道の細胞外マトリックスに由来する。一実施形態では、ＭＢＶは、膀胱、小腸、心臓、真皮、肝臓、腎臓、子宮、脳、血管、肺、筋肉、膵臓、胎盤、胃、脾臓、結腸、脂肪組織または食道の細胞外マトリックスに由来する。一実施形態では、ＭＢＶは、骨細胞外マトリックスに由来しない。
さらに別の実施形態では、ＭＢＶは、膀胱マトリックス（ＵＢＭ）、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）または膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）に由来する。一実施形態では、ＭＢＶは、膀胱マトリックス（ＵＢＭ）に由来する。一実施形態では、ＭＢＶは、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）に由来する。一実施形態では、ＭＢＶは、膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）に由来する。
さらに別の実施形態では、ＭＢＶは、ヒト、サル、ブタ、ウシまたはヒツジから選択される哺乳類の脊椎動物由来の細胞外マトリックスに由来する。
別の実施形態では、ＭＢＶは、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０１２個のＭＢＶの量で投与される。
一部の実施形態では、対象は、抗生物質、抗ウイルスまたは抗炎症薬物療法を受ける。例えば、対象は、レムデシビル、ファビピラビル、アジスロマイシンまたはヒドロキシクロロキンを受ける。例えば、対象は、レムデシビル、ファビピラビル、アジスロマイシンまたはヒドロキシクロロキンを受け、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９を有する。例えば、一部の実施形態では、対象は、トシリズマブ、アナキンラまたはヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤を受ける。例えば、対象は、トシリズマブ、アナキンラまたはヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤を受け、対象は、ＣＯＶＩＤ－１９を有する。
別の実施形態では、対象は、免疫抑制剤で処置された対象と比較して、ＭＢＶによる処置の結果として低下した二次感染症リスクを有する。例えば、二次感染症は、肺感染症である。例えば、二次感染症は、血液における感染症である。例えば、二次感染症は、心臓、腎臓または肝臓におけるものである。例えば、二次感染症は、細菌感染症である。例えば、二次感染症は、ウイルス感染症である。
さらなる実施形態では、対象は、医薬組成物の投与後に、対象の酸素飽和度の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超の増加を経験する。別の実施形態では、対象は、医薬組成物の投与後に、対象の酸素飽和度指数の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超の増加を経験する。別の実施形態では、対象は、医薬化合物の投与後に、対象の酸素指数の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超の増加を経験する。増加は、医薬組成物の投与後１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間または２４時間以内に起こることができる。
別の実施形態では、対象は、ＭＢＶの投与後に、炎症促進性サイトカインの産生の減少を経験する。例えば、炎症促進性サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－８、ＩＬ－６、ＩＬ－１βまたはＩＬ－１２のうち１種または複数である。別の実施形態では、対象は、ＭＢＶの投与後に、抗炎症性サイトカインの産生の増加を経験する。例えば、抗炎症性サイトカインは、ＴＧＦ－β、ＩＬ－４またはＩＬ－１０である。一実施形態では、増加または減少は、ＭＢＶの投与の前および後に対象の肺から気管支肺胞洗浄液をサンプリングすることにより測定される。さらに別の実施形態では、増加または減少は、ＭＢＶの投与の前および後に対象の血液をサンプリングすることにより測定される。別の実施形態では、処置の有効性は、ＡＲＤＳおよび／または高サイトカイン血症に関連する症状の低下によって測定される。
本発明の前述および他の目的、特色および利点は、添付の図面を参照しつつ進む次の詳細な説明から、より明らかとなるであろう。
図１Ａ～１Ｇは、液相細胞外小胞（ＥＶ）およびマトリックス結合小胞（ＭＢＶ）の形態学的特徴付けを示す。図１Ａは、膀胱マトリックス（ＵＢＭ）に由来するＥＣＭ足場の走査型電子顕微鏡画像を示し、図中、直径がおよそ１００ｎｍの別個の球体が、マトリックスのあらゆる場所に分散されている。スケールバー＝１μｍ。図１Ｂは、液相（ＥＶ）または固相細胞外区画（ＭＢＶ）から小胞を選択的に収集するために使用した３Ｔ３線維芽細胞細胞培養物モデルの図を示す。図１Ｃは、脱細胞化（decellularization）後の細胞の非存在およびインタクトな細胞核の非存在を実証する、位相差顕微鏡、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、ならびに４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色を示す。図１Ｄは、３Ｔ３線維芽細胞細胞培養物モデルから単離された液相ＥＶおよびＭＢＶの透過型電子顕微鏡画像を示す。スケールバー＝１００ｎｍ。図１Ｅは、３Ｔ３線維芽細胞細胞培養物から単離された液相ＥＶおよびＭＢＶのナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ）からのサイズ分布プロットを示す。図１Ｆは、液相ＥＶおよびＭＢＶにおけるＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＨｓｐ７０発現レベルを比較するイムノブロット解析を示す。図１Ｇは、液相ＥＶおよびＭＢＶにおける電気泳動的に分離されたタンパク質の銀染色解析を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２Ａ～２Ｅは、ＥＶとＭＢＶとの間でのｍｉＲＮＡカーゴにおける差異を示す。図２Ａは、３Ｔ３親細胞、それらが分泌した液相ＥＶおよびそれらのＭＢＶから単離された総ＲＮＡのバイオアナライザー解析を示す。図２Ｂは、液相ＥＶ（緑色）、ＭＢＶ（青色）および細胞（赤色）のＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを比較する主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図２Ｃは、液相ＥＶ、ＭＢＶおよび親細胞におけるｍｉＲＮＡの差次的発現を実証するボルケーノプロットを示す。組み入れ基準は、いずれかの方向でのｌｏｇ２の２倍の差異（倍数変化（fold change））であり、Ｐ値＜０．０５であった。各ドットは、特定のｍｉＲＮＡ転写物を示す；垂直な破線の右側（かつ水平な破線の上）の緑色のドットは、発現レベルにおける相対的増加に対応し、左側（かつ水平な破線の上）の赤色のドットは、発現レベルにおける相対的減少に対応する。青色のドット（これは、水平な破線の下に現れる）は、発現レベルにおける有意な変化がなかったｍｉＲＮＡを示す。図２Ｄは、ｍｉＲＮＡ配列決定の結果のＲＴ－ｑＰＣＲ検証を示し、＊ｐ＜０．０５、ｎ＝４である。図２Ｅは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ機能解析）を示す。ＩＰＡ機能解析によって同定された有意に富化された分子機能を、ＭＢＶ（赤色 － 下の棒）および液相ＥＶ（青色 － 上の棒）において差次的に発現されたｍｉＲＮＡを考慮して決定した。細胞の成長および増殖、細胞形態学、細胞から細胞へのシグナル伝達、ならびに組織発生については、赤色の棒は存在しない；消化器系の発生および機能、肝臓系の発生および機能ならびに臓器の発生および機能については、青色の棒は存在しない。 同上。 同上。 同上。
図３Ａ～３Ｈは、ＭＢＶの細胞起源に基づくＭＢＶのｍｉＲＮＡカーゴにおける差異を示す。図３Ａは、細胞の非存在を示す、脱細胞化したＢＭＳＣ細胞培養プレートの位相差顕微鏡画像を示す。図３Ｂは、脱細胞化したＢＭＳＣ培養プレートから単離されたＭＢＶの透過型電子顕微鏡画像を示す。スケールバー＝１００ｎｍ。図３Ｃ～図３Ｅは、ＢＭＳＣ（図３Ｃ）、ＡＳＣ（図３Ｄ）およびＵＣＳＣ（図３Ｅ）の脱細胞化した培養プレートから単離されたＭＢＶのナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ）からのサイズ分布プロットを示す。図３Ｆは、ＢＭＳＣ、ＡＳＣおよびＵＣＳＣ由来のＭＢＶから単離された総ＲＮＡのバイオアナライザー解析を示す。図３Ｇは、ＢＭＳＣ ＭＢＶ（緑色；中央左）、ＵＣＳＣ ＭＢＶ（青色；右上）およびＡＳＣ ＭＢＶ（赤色；右下）のＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを比較する主成分分析（ＰＣＡ）を示す。図３Ｈは、ＢＭＳＣ、ＡＳＣおよびＵＣＳＣ由来のＭＢＶにおけるｍｉＲＮＡの差次的発現を実証するボルケーノプロットを示す。組み入れ基準は、いずれかの方向でのｌｏｇ２の２倍の差異（倍数変化）であり、Ｐ値＜０．０５であった。各ドットは、特定のｍｉＲＮＡ転写物を示す；垂直な破線の右側（かつ水平な破線の上）の緑色のドットは、発現レベルにおける相対的増加に対応し、左側（かつ水平な破線の上）の赤色のドットは、発現レベルにおける相対的減少に対応する。青色のドット（水平な破線の下）は、発現レベルにおける有意な変化がなかったｍｉＲＮＡを示す。 同上。 同上。 同上。
図４Ａ～４Ｅは、ＭＢＶと液相ＥＶと親細胞との間でのリン脂質のＬＣ／ＭＳ特徴付けを示す。図４Ａは、ＭＢＶから得られたリン脂質の典型的な全イオンクロマトグラムを示す。図４Ｂは、ＭＢＶにおける主要リン脂質クラスの質量スペクトルを示す。評価は、飽和（二重結合数＝０）、一価不飽和（二重結合数＝１）および多価不飽和（二重結合数＝２～１０）種のリン脂質の定量化を含んだ。図４Ｃは、主要リン脂質の総含量を示す円グラフを示す。データは、総リン脂質の％として示される。図４Ｄおよび図４Ｅは、異なるリン脂質分子種の含量を示す。データは、Ｚ－スコアに自動スケーリングし、青色（低い値）から赤色（高い値）までコード化したヒートマップとして示される。略称は次の通りである：ＥＶ、エキソソーム小胞；ＭＢＶ、マトリックス結合小胞；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＰＣｄ、ＰＣジアシル種；ＰＣｐ、ＰＣプラズマローゲン；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥｄ、ＰＥジアシル種；ＰＥｐ、ＰＥプラズマローゲン；ＰＩ、ホスファチジルイノシトール；ＰＳ、ホスファチジルセリン；ＢＭＰ、ビス－モノアシルグリセロホスフェート；ＰＡ、ホスファチジン酸；ＰＧ、ホスファチジルグリセロール；およびＳＭ、スフィンゴミエリン。 同上。 同上。 同上。
図５Ａ～５Ｄは、ＭＢＶと液相ＥＶと親細胞との間でのＬＰＥ、ＬＰＡおよびＬＰＧにおける差異を試験するＬＣ／ＭＳ特徴付けおよび追跡解析を示す。図５Ａは、ＭＢＶから得られた主要リゾ－リン脂質の典型的な質量スペクトルを示す。図５Ｂは、主要リゾ－リン脂質の総含量を示す円グラフである。データは、総リゾ－リン脂質の％として示される。図５Ｃおよび図５Ｄは、リゾ－リン脂質分子種の含量を示す。データは、Ｚ－スコアに自動スケーリングし、青色（低い値）から赤色（高い値）までコード化したヒートマップとして示され、ｎ＝３である。略称は次の通りである：ＥＶ、エキソソーム小胞；ＭＢＶ、マトリックス結合小胞；ＬＰＣ、リゾ－ホスファチジルコリン；ＬＰＥ、リゾ－ホスファチジルエタノールアミン；ＬＰＩ、リゾ－ホスファチジルイノシトール；ＬＰＳ、リゾ－ホスファチジルセリン；ＬＰＡ、リゾ－ホスファチジン酸；ＬＰＧ、リゾ－ホスファチジルグリセロール；およびｍＣＬ、モノ－リゾ－カルジオリピン。 同上。 同上。
図６Ａ～６Ｃは、ＰＵＦＡ含有リン脂質およびそれらの酸化的に修飾された分子種のレベルが、液相ＥＶにおけるレベルと比較して、ＭＢＶにおいてより高いことを実証している。親細胞、液相ＥＶおよびＭＢＶにおける遊離ＰＵＦＡ（図６Ａ）およびそれらの酸素化された代謝物（図６Ｂ）の含量を評価した。データは、平均±ｓ．ｄ．として示され、＊ｐ＜０．０５であり、細胞またはＭＢＶと比較されており、ｎ＝３である。図６Ｃは、親細胞、液相ＥＶおよびＭＢＶにおける一重に、二重におよび三重に酸素化されたリン脂質種の含量を示す。データは、Ｚ－スコアに自動スケーリングし、青色（低い値）から赤色（高い値）までコード化したヒートマップとして示される。略称は次の通りである：ＥＶ、エキソソーム小胞；ＭＢＶ、マトリックス結合小胞；ＰＬ、リン脂質；ＰＣ、ホスファチジルコリン；ＰＥ、ホスファチジルエタノールアミン、ＰＩ、ホスファチジルイノシトール；ＰＳ、ホスファチジルセリン；ＢＭＰ、ビス－モノアシルグリセロホスフェート；ＰＡ、ホスファチジン酸；ＰＧ、ホスファチジルグリセロール；およびＣＬ、カルジオリピン。 同上。
図７は、ラット動物モデルにおける関節リウマチの処置のためのＭＢＶの投与の経路を示す。
図８Ａ～８Ｅは、対照、およびプリスタンのみ、腹腔内（ＩＰ）メトトレキサート（ＭＴＸ）、関節周囲（ＰＡ）ＭＢＶまたは静脈内（ＩＶ）ＭＢＶで処置した関節炎ラットモデルの、個々の関節炎スコアを示す。図８Ａは、７日目における処置群にわたる関節炎スコアを示し、図８Ｂは、１０日目における処置群にわたる関節炎スコアを示し、図８Ｃは、１３日目における処置群にわたる関節炎スコアを示し、図８Ｄは、１７日目における処置群にわたる関節炎スコアを示し、図８Ｅは、２１日目における処置群にわたる関節炎スコアを示す。
図９Ａは、プリスタンを介して臨床的関節炎を表現型模写するように誘導し、プリスタンのみ、ＩＰメトトレキサート、ＰＡ ＭＢＶまたはＩＶ ＭＢＶで処置したＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットの、複数の視点から撮影した写真を示す。図９Ｂは、疾患対照および関節周囲ＭＢＶ処置したラット足の、より近接した画像を示す。 同上。
図１０は、対照、およびプリスタンのみ、ＩＰメトトレキサート、ＰＡ ＭＢＶまたはＩＶ ＭＢＶで処置した関節炎ラットモデルにおける、処置の最初の２１日間にわたる平均関節炎スコアを示す。
図１１Ａは、対照、ならびにＩＰメトトレキサート、ＰＡ ＭＢＶおよびＩＶ ＭＢＶで処置した関節炎ラットモデルから撮影した足の写真を示す。図１１Ｂは、ＩＰメトトレキサート、ＰＡ ＭＢＶおよびＩＶ ＭＢＶで処置した関節炎ラットモデルにおける、処置の最初の７７日間にわたる平均関節炎スコアを示す。
図１２Ａ～１２Ｂは、ＩＰメトトレキサート、ＰＡ ＭＢＶおよびＩＶ ＭＢＶで処置した関節炎ラットモデルにおけるＴＮＦα（図１２Ａ）およびＩＬ１β（図１２Ｂ）の血清レベルを示す。
図１３は、ビヒクル対照またはＭＢＶで処置した乾癬のマウスイミキモドモデルの組織学的画像を示す。
図１４は、ビヒクル対照またはＭＢＶで処置した乾癬のマウスイミキモドモデルにおける、ＴＲＥＧ細胞のマーカーとしてのＦＯＸＰ３ ＲＮＡレベルを示す。
図１５は、食塩水（陰性対照）、ＭＢＶまたはシクロホスファミド（陽性対照）で処置したキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）ラットモデルにおける、ＥＬＩＳＡによって決定した抗ＫＬＨ ＩｇＧを示す。
図１６Ａは、ＣＤ４５＋ＣＤ３－Ｂ２２０－ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－細胞についての蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって決定した、ＩＬ－３３を含有するＭＢＶによる処置後の心臓毒傷害の部位に浸潤する炎症性マクロファージについてのドットプロットを示す。図１６Ｂは、炎症性マクロファージ頻度を示す。図１６Ｃは、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｂ２２０－ＣＤ４＋細胞についての蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって決定した、ＩＬ－３３を含有するＭＢＶによる処置後の心臓毒傷害の部位に浸潤するＳＴ２＋ＴＲＥＧについてのドットプロットを示す。図１６Ｄは、ＳＴ２＋ＴＲＥＧの頻度を示す。 同上。
図１７は、炎症促進性応答を促進するＴｈ１活性化因子、抗炎症性応答を促進するＴｈ２活性化因子、炎症促進性応答を促進するＴｈ１７活性化因子、またはＭＢＶで刺激したＴ細胞についての、ＥＬＩＳＡによって決定したＩＬ４産生を示す。
図１８は、１０９粒子／ｍＬの用量でのエアロゾルによる蛍光標識したＭＢＶ（緑色）投与後の、ホルマリン固定パラフィン包埋マウス肺組織の免疫蛍光顕微鏡画像を示す。ＭＢＶが、処置された肺組織の大きな気道および小さな気道、特に、実質ではなく上皮において、容易に検出可能であること（矢頭）を示す、代表的な画像（左および中央のパネル）。未処置の対照肺組織（右パネル）は、ＭＢＶ処置された組織とは似ていない散在性のパターンを有する、非特異的な低レベルの自己蛍光を示す。
図１９Ａ～１９Ｃは、マトリックス結合ナノ小胞の全身性投与が、感染後７日目に、ウイルス媒介性肺病理および単核好中球細胞浸潤を緩和することを示している。図１９Ａ：肺全体病理の２０×ヘマトキシリンおよびエオシン画像のモザイク編集は、肺の間質空間中へのびまん性の単核細胞浸潤に関連する、感染後７日目における間質性肺炎を実証した。ＭＢＶによる全身性処置は、感染の７日後に、肺間質中への全体的細胞浸潤を低下させ、急性肺炎症の消散を示した。Ｈ＋Ｅ画像に隣接する細胞密度ヒートマップは、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＭＢＶ群における全体的細胞密度における低下と共に、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳ群における高密度の細胞浸潤を示した。図１９Ｂ：全身性ＭＢＶは、洗浄（ＢＡＬ）、肺間質および脾臓におけるＣＤ４５＋好中球の全体的頻度を有意に低下させた。図１９Ｃ：全身性ＭＢＶは、炎症促進性サイトカインおよびケモカインＧＣＳＦ、ＩＬ－６、Ｉｌ－１ｂ、ＴＮＦαおよびＩＦＮ－γの濃度を有意に低下させた。 同上。 同上。
図２０Ａ～２０Ｄは、ＭＢＶの全身性投与が、ＣＤ４＋ｔ－細胞の肺および脾臓集団を減少させ、活性化された抗ウイルスＣＤ８＋Ｔ－細胞の存在を増加させることを示している。図２０Ａ：全身性ＭＢＶは、肺組織におけるＣＤ４＋ｔ－細胞の頻度を有意に低下させ、ＣＤ８＋Ｔ－細胞の頻度を増加させた。図２０Ｂ：全身性ＭＢＶは、脾臓におけるＣＤ４ Ｔ－細胞の頻度を有意に減少させ、脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ－細胞の頻度を有意に増加させた。図２０Ｃ：全身性ＭＢＶは、それぞれ脾臓およびリンパ節における末梢に位置するＣＤ６９＋およびＴｂｅｔ＋ＣＤ４＋Ｔ－細胞の頻度を増加させることによって、抗ウイルスＣＤ４応答の活性化を誘導した。図２０Ｄ：全身性ＭＢＶは、ＣＤ６９＋およびＴｂｅｔ＋ＣＤ８ Ｔ－細胞の頻度の増加によって示されるように、抗ウイルスＣＤ８＋Ｔ－細胞応答の末梢活性化を誘導した。 同上。
図２１Ａ～２１Ｄは、ＭＢＶの全身性投与が、減少した細胞浸潤を介して慢性ウイルス感染後肺炎症を低下させ、炎症促進性サイトカイン産生を減少させることを示している。図２１Ａ：肺全体病理の２０×ヘマトキシリンおよびエオシン画像のモザイク編集は、感染後２１日目に、気管支および大きな気道周囲の集中的な単核細胞浸潤に関連する気管支肺炎を実証した。ＭＢＶによる全身性処置は、感染の７日後に、肺間質中への全体的細胞浸潤を低下させ、急性肺炎症の消散を示した。Ｈ＋Ｅ画像に隣接する細胞密度ヒートマップは、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＭＢＶ群における全体的細胞密度における低下と共に、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳ群における高密度の細胞浸潤を示した。図２１Ｂ：全身性ＭＢＶは、肺間質および脾臓におけるＣＤ４５＋好中球の全体的頻度を有意に低下させた。図２１Ｃ：全身性ＭＢＶは、肺におけるＣＤ１１ｂ樹状細胞の割合を有意に増加させた。図２１Ｄ：全身性ＭＢＶは、炎症促進性サイトカインおよびケモカインＩｌ－１２、Ｉｌ－１ｂ、ＭＣＰ－１およびＫＣの濃度を有意に低下させた。 同上。 同上。 同上。
図２２は、ＭＢＶの全身性投与が、長期抗ウイルス耐性を支持するＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４４＋メモリーＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ－細胞の割合を有意に増加させたことを示す棒グラフのセットである。
図２３は、ＭＢＶの全身性投与が、感染後２１日目に、Ｈ１Ｎ１関連の硬化（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）および間質線維症を有意に低下させることを示すデジタル画像およびグラフのセットである。上の画像は、トリクローム染色およびｑｕＰａｔｈレンダリングした画像を示す。病理組織学的解析を、ＱｕＰａｔｈソフトウェアを使用して行った。簡潔に述べると、マッソントリクローム染色した細胞を、光学密度データを使用して計数し、ランダムツリー機械学習アーキテクチャによって、表現型に基づいて分類した。ＭＬ分類器を、６つの代表的な画像でトレーニングし、複数の（ｎ＞１０）トレーニング領域は、４つの可能なクラスを示す：結合組織、血管、肺間質組織、罹患組織。下のセクションにおいて、肺の表面積当たりの総組織線維症／硬化のパーセントを計算したところ、Ｈ１Ｎ１を有する未処置の動物と比較して、ＭＢＶ処置した動物において、総罹患組織における有意な減少が示された。
図２４は、マウスエキソソーム、マウス骨マトリックス小胞（骨ＭＶ）およびマウスマトリックス結合ナノ小胞（ＭＢＶ）における注目した種々のマーカーのレベルを比較するＥＸＯ－ＣＨＥＣＫ（商標）エキソソーム抗体アレイ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の結果を示す。上パネルは、アレイのデジタル画像を提供し、下パネルは、エキソソーム 対 骨ＭＶ 対 ＭＢＶにおける注目したマーカーの各々の相対的発現を示すグラフである。
図２５は、骨ＭＶマーカーアネキシンＶおよび組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）の発現を検出するための血漿エキソソームおよび筋肉ＭＢＶのウエスタンブロット解析の結果を示す。
図２６は、種々の細胞型 － 未処置の（Ｍ０）、あるいはＩＦＮγ＋ＬＰＳ（Ｍ１）もしくはＩＬ－４（Ｍ２）、または血漿に由来するエキソソーム、１７Ａ細胞に由来する骨ＭＶ、または筋肉から単離されたＭＢＶで処置した骨髄由来マクロファージにおける種々の遺伝子の発現の倍数変化を示す棒グラフである。
配列表
添付の配列表に収載されている核酸およびアミノ酸配列は、連邦規則集３７巻１．８２２規則（37 C.F.R. 1.822）に定義されている通り、ヌクレオチド塩基のための標準文字略語およびアミノ酸のための３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、表示されている鎖の何らかの参照によって含まれていると理解される。配列表は、参照により本明細書に組み込まれるＡＳＣＩＩテキストファイル［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ、２０２１年４月１５日、１．０７ＫＢ］として提出される。添付の配列表において、
配列番号１～３は、ｍｉＲＮＡ配列である。
詳細な説明
本開示は、高サイトカイン血症、例えば、ウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症に関連する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）等、ＡＲＤＳの処置においてマトリックス結合ナノ小胞（nanovesicle）（ＭＢＶ）を使用する方法を提供する。本発明の様々な態様が、下のセクションに示される；しかし、ある１つの特定のセクションに記載される本発明の態様は、いずれか特定のセクションに限定されるべきではない。
本明細書におけるデータが例証する通り、ＭＢＶは、マクロファージの抗炎症特性を誘導する、マクロファージ活性の強力なモジュレーターである。マクロファージは、炎症性刺激に曝露されると、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－６、Ｉ－８およびＩＬ－１２等のサイトカインを分泌する。斯かるサイトカインは、ＡＲＤＳ等の状態に寄与する、炎症性細胞の血管透過性および動員を増加させる。しかし、本明細書に例証される通り、ＭＢＶと接触したマクロファージは、炎症促進性サイトカインの産生を下方調節すると共に、炎症の負の制御因子を上方調節する能力を有し、ＭＢＶが、高サイトカイン血症の「サイトカインストーム」を弱める能力を有することを示唆する。ＭＢＶのこれらの特有の特性のため、ＭＢＶは、本明細書に記載されているウイルス感染症から傷害にわたる多数の因子に起因し得る高サイトカイン血症による、肺における広汎な炎症から生じるＡＲＤＳの処置において有用である。ウイルスに対する免疫応答が、サイトカインストームおよび結果として生じるＡＲＤＳを引き起こす、ＣＯＶＩＤ－１９等の疾患において、ＭＢＶは、ＡＲＤＳ等のサイトカインストームの壊滅的な効果を予防するまたは逆転させる能力を有する。
概観
本明細書に開示されている通り、本開示のマトリックス結合ナノ小胞（ＭＢＶ）は、高サイトカイン血症、例えば、感染症に関連する高サイトカイン血症に関連する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）等、ＡＲＤＳを処置する方法において使用される。ある特定の実施形態では、高サイトカイン血症は、病原体、例えば、細菌、ウイルス、真菌または原生動物（例えば、アメーバ）による感染の結果である。ある特定の実施形態では、細胞内病原体によって媒介される疾患または障害は、急性感染症である。一部の実施形態では、ＡＲＤＳは、ＭＥＲＳ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２等のウイルス感染症の結果である。一実施形態では、ＡＲＤＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の結果である。一実施形態では、ＡＲＤＳは、インフルエンザの結果である。
治療適用
世界人口における既存の免疫の非存在下で、ＣＯＶＩＤ－１９はパンデミックとなり、初めての症例が報告されてから４ヶ月間未満で世界経済を破壊した。この短期間で、ＣＯＶＩＤ－１９は、季節性インフルエンザの３００％～４００％の死亡率を有する高度に致死的な感染症として出現した（WHO (2020) Coronavirus disease 2019 (COVID-19): Situation Report, 67）。現在、ＣＯＶＩＤ－１９の処置は主に支持的な性質であり、ＡＲＤＳによる呼吸不全が死亡の主因である（Ruan Q, et al. (2020) Clinical predictors of mortality due to COVID-19 based on an analysis of data of 150 patients from Wuhan, China. Intensive Care Medicine: 1-3.）。ウイルス感染症および結果的な組織損傷は、結果的にＡＲＤＳになり得るサイトカインストームを惹起することが公知である（Ware LB & Matthay MA (2000) The acute respiratory distress syndrome. NEJM. 342(18):1334-1349; Matthay MA, et al. (2012) The acute respiratory distress syndrome. Journal of Clin Inves. 122(8):2731-2740; Wheeler AP & Bernard GR (2007) Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome: a clinical review. Lancet 369(9572):1553-1564）。ＡＲＤＳの決定的な特色は、血管外好中球の蓄積をもたらす、血漿または気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）における炎症性サイトカイン（ケモカイン）増加として現れる、局所および全身性炎症の調節不全によるびまん性肺胞損傷、肺浮腫および低酸素血症を含む（Matthay MA et al. (2012) The acute respiratory distress syndrome. Journal Clin Inves. 122(8):2731-2740）。炎症促進性マクロファージおよび単球も、ＡＲＤＳにおける原因となる役割を果たし、局所炎症増加により肺組織損傷を惹起および伝播する；次いでこの炎症は、上皮および内皮組織透過性増加に寄与する（Aggarwal NR et al. (2014) Diverse macrophage populations mediate acute lung inflammation and resolution. Amer Journal of Phys Lung Cell and Mol Phys. 306(8):L709-L725; Zemans RL & Matthay MA (2017) What drives neutrophils to the alveoli in ARDS? (BMJ Publishing Group Ltd); Thompson BT et al. (2017) Acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Med. 377(6):562-572）。
対象における集約的な基礎研究および臨床試験にもかかわらず、依然として、ＡＲＤＳを予防または消散するための有効な処置を欠いており、初期炎症を低下させる支持的な手順が、患者転帰における一貫した改善を提供するための唯一の手段である（Bellani G, et al. (2016) Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries. Jama 315(8):788-800）。
呼吸器ウイルス感染症（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）に対する初期応答は、重度ＡＲＤＳを誘導し、より多くの免疫細胞を動員し、ウイルスに感染した細胞を貪食する、炎症促進性サイトカインを放出するマクロファージを含む（Conti P, et al. (2020) Induction of pro-inflammatory cytokines (IL-1 and IL-6) and lung inflammation by Coronavirus-19 (COVID-19 or SARS-CoV-2): anti-inflammatory strategies. J Biol Regul Homeost Agents. 34(2)）。中華人民共和国の武漢における患者のレトロスペクティブコホート試験は、ＣＯＶＩＤ－１９関与の急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）および肺における過剰炎症による約９３％の死亡を示す（Zhou F, et al. (2020) Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study. Lancet. 395(10229):1054-1062）。動員された単球は、ウイルスに対する宿主防御において優位な役割を果たすマクロファージへと分化するが、この同じ細胞はまた、炎症の消散および肺修復を容易にする。抗ウイルス免疫応答の初期に、Ｍ１様マクロファージは、より多くの免疫細胞を動員し、ウイルスに感染した細胞を貪食し、一部の場合では、ＡＲＤＳを誘導する炎症促進性サイトカインを放出する（Conti P, et al. (2020) Induction of pro-inflammatory cytokines (IL-1 and IL-6) and lung inflammation by Coronavirus-19 (COVID-19 or SARS-CoV-2): anti-inflammatory strategies. J Biol Regul Homeost Agents. 34(2)）。Ｍ１様（炎症促進性）マクロファージ活性化状態からＭ２様抗炎症性リモデリング促進性（pro-remodel）表現型への移行は、呼吸窮迫を軽減し、上皮バリア機能を回復し、１４日間以内のウイルスに対する獲得免疫の発生を容易にすることができる（He W, et al. (2017) Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nat Commun. 8(1):846）。しかし、マクロファージ表現型スイッチがなければ、上皮バリア機能は破壊され、細胞死および浮腫がＡＲＤＳをもたらし得る。ヒドロキシクロロキン（hydroxycholorquine）（ＨＣＱ）等の薬物は、臨床パイロット試験におけるＣＯＶＩＤ－１９のための処置として研究中である；しかし、重要なことに、ＨＣＱは、免疫抑制により、ＡＲＤＳ症例に見られる過剰炎症等の過剰炎症に対処する（Liang N, et al. (2018) Immunosuppressive effects of hydroxychloroquine and artemisinin combination therapy via the nuclear factor-kappaB signaling pathway in lupus nephritis mice. Exp Ther Med 15(3):2436-2442）。よって、ＨＣＱおよび同様の免疫抑制薬は、二次感染症、例えば、続発性肺炎のより大きいリスクに患者を置き、抗ウイルス免疫の発生を阻害する（Liang N, et al. (2018) Immunosuppressive effects of hydroxychloroquine and artemisinin combination therapy via the nuclear factor-kappa B signaling pathway in lupus nephritis mice. Exp Ther Med 15(3):2436-2442）。よって、ＣＯＶＩＤ－１９の満足のいく処置は、サイトカインストームの消散および保護的な抗体媒介性免疫の同時の発生を要求する。ＥＣＭ内の因子は、炎症促進性からリモデリング促進性状態への、マクロファージおよびＴヘルパー細胞の表現型移行をモジュレートするため、本発明は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に包埋された分子因子によって促進される、宿主免疫系のモジュレーション／リプログラミング（免疫適格性を損なうことのない）を対象にする（Hussey GS, et al. (2018) Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Rev Mater; Allman AJ, et al. (2002) The Th2-restricted immune response to xenogeneic small intestinal submucosa does not influence systemic protective immunity to viral and bacterial pathogens. Tissue Eng Part A. 8(1):53-62）。ＥＣＭ足場の分解産物は、骨格筋修復、潰瘍性大腸炎の齧歯類モデル、視神経および上気道における強力なかつ臨床的に関連する抗炎症性および治癒促進性（pro-healing）効果を有する（例えば、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１７／１５１８６２およびＷＯ２０１８／２０４８４８を参照）。
したがって、ＣＯＶＩＤ－１９の満足のいくかつ好まれる処置は、免疫を損なうことのない高サイトカイン血症の消散を要求する。本明細書に開示されている通り、本開示のＭＢＶは、高サイトカイン血症（例えば、ウイルス感染症に関連する高サイトカイン血症）に関連する過剰炎症等の過剰炎症を処置する方法において使用される。
本開示のＭＢＶ療法の前述および他の目的、特色および利点は、病院および非病院環境の両方で投与することができることである。一部の実施形態では、本開示のＭＢＶ療法は、ＣＯＶＩＤ－１９関連サイトカインストーム症候群を有する患者を処置するために投与される。炎症を限定し、機能的組織リモデリングを促進する応答に向けてデフォルトの炎症性治癒応答をリダイレクトするために患者に安全にかつ容易に投与され得る斯かる治療プラットフォームは、現在存在せず、したがって、長年にわたる切実な満たされていない必要である。
ＭＢＶは、ＥＣＭの内在性構成成分であり、エキソソームとは別個のものであり、前臨床モデルにおいて過剰炎症を有効にリダイレクトする（Hussey GS, et al. (2020) Lipidomics and RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials. Sci Adv 6(12):eaay4361; van der Merwe Y, et al. (2019) Matrix-bound nanovesicles prevent ischemia-induced retinal ganglion cell axon degeneration and death and preserve visual function. Sci Rep 9(1):3482)）。ＭＢＶはまた、骨生成および石灰化に関与する骨マトリックス小胞とも別個のものである。例えば、骨マトリックス小胞は、アルカリホスファターゼを発現する一方で、ＭＢＶはこれを発現しない。一部の実施形態では、ＭＢＶは、免疫調節性ｍｉＲＮＡ、タンパク質および脂質を含有し、マクロファージによって急速に取り入れられ、シグナル伝達カスケードを引き起こし、ＥＣＭに基づく生体材料の文脈でよく研究されている現象である表現型スイッチングに必須の遺伝子発現をモジュレートする（Hussey GS, et al. (2019) Matrix bound nanovesicle-associated IL-33 activates a pro-remodeling macrophage phenotype via a non-canonical, ST2-independent pathway. J Immunol Regen Med 3:26-35; Huleihel L, et al. (2017) Macrophage phenotype in response to ECM bioscaffolds. Semin Immunol 29:2-13）。さらに、一部の実施形態では、ＭＢＶ投与は、ＥＣＭに基づく生体材料の文脈で以前に特徴付けられた現象である調節性Ｔ細胞（ＴＲＥＧ）の上方調節をもたらす。ＭＢＶは、関節リウマチ、外傷性筋肉傷害、潰瘍性大腸炎および食道がんを含む過酷な環境における修復的免疫応答を急速にかつ有効に誘導する（Huleihel L, et al. (2017) Matrix-Bound Nanovesicles Recapitulate Extracellular Matrix Effects on Macrophage Phenotype. Tissue Eng Part A 23(21-22):1283-1294; Dziki JL, et al. (2016) Immunomodulation and Mobilization of Progenitor Cells by Extracellular Matrix Bioscaffolds for Volumetric Muscle Loss Treatment. Tissue Eng Part A 22(19-20):1129-1139; Keane TJ, et al. (2017) Restoring Mucosal Barrier Function and Modifying Macrophage Phenotype with an Extracellular Matrix Hydrogel: Potential Therapy for Ulcerative Colitis. J Crohns Colitis 11(3):360-368; Saldin LT, et al. (2019) Extracellular Matrix Degradation Products Downregulate Neoplastic Esophageal Cell Phenotype. Tissue Eng Part A 25(5-6):487-498.）。
ＭＢＶ内に貯蔵されたサイトカインカーゴは、修復的および調節性Ｍ２マクロファージを支持し、細菌感染症および急性肺傷害後の炎症を制御する（Liu Q, et al. (2019) IL-33-mediated IL-13 secretion by ST2+ TREG controls inflammation after lung injury. JCI Insight 4(6)）。ＥＣＭ生体足場（bioscaffold）は、筋骨格、胃腸、泌尿生殖器およびＣＮＳ組織が関与する種々の臨床適用において有用である（Badylak SF (2007) The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28(25):3587-3593）。ＥＣＭは、組織の正体を規定する、各組織の常在性細胞の分泌された構造的および機能的分子からなる。斯かる異種足場は、有害な自然免疫応答も適応免疫応答も誘発せず、その代わりに、抗炎症性および修復的な自然および適応免疫応答を支持する（Brown BN, et al. (2009) Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30(8):1482-1491）。このような天然に存在する生体材料の使用は典型的に、機能的な部位適切な組織の（少なくとも）部分的回復に関連する；これは、「構築的リモデリング」と称されるプロセスである（Badylak SF (2007) The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28(25):3587-3593）。ＥＣＭ生体足場またはＥＣＭ生体足場の分解産物は、抗炎症性Ｍ２様マクロファージおよびＴヘルパー２型（Ｔｈ２）細胞応答の動員を介して組織修復を方向付けることが示されており、斯かる応答は、多くの場合、低下した局所炎症および前駆細胞との構築的クロストークに関連する。
マトリックス結合ナノ小胞（ＭＢＶ）は、Ｍ２様修復的および抗炎症性マクロファージ表現型を活性化する。試験は、ＭＢＶが、体液中に見出されるエキソソームとは別の細胞外小胞の別個のクラスであることを示した（Hussey GS, et al. (2020) Lipidomics and RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials. Sci Advances. 6(12):eaay4361）。ＭＢＶは、過酷な組織脱細胞化プロセスであっても残存するため、組織および臓器発生ならびに種をわたる恒常性における基礎的役割、ならびに傷害に対する組織応答における調節的役割を果たすことができる。ＭＢＶは、複数の多様な組織供給源に由来し得る。ＭＢＶは、豊富であり、凍結乾燥することができ、高度に安定しており、気管滴下注入または噴霧により容易に投与することができる。
ＭＢＶは、リモデリング促進性マクロファージ表現型の促進に対するＥＣＭの効果を再現することができる。マクロファージ遺伝子およびタンパク質発現、細胞表面マーカー、ならびに観察される食作用活性、一酸化窒素（ＮＯ）産生および抗菌活性によって決定される機能的能力は、ＭＢＶによる処置後の調節性／抗炎症性表現型の最も代表的なものであり、これは、マクロファージ表現型および機能に対するＥＣＭに基づく生体足場の効果について記載する以前の報告と一致した（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／１５１８６２Ａ１を参照）。ＭＢＶは、ｍｉＲＮＡ、タンパク質およびリン脂質カーゴの組合せを介して免疫調節性効果を発揮することが示された。例えば、体液中に存在するエキソソームと比較して、ＭＢＶは、細胞外環境の炎症促進性／抗炎症性の文脈に依存した異なるホスホリパーゼによって活性化される消散促進性（pro-resolving）脂質メディエーターが高度に濃縮されている（Hussey GS, et al. (2020) Lipidomics and RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials. Sci Adv 6(12):eaay4361）。さらに、ＭＢＶは、免疫細胞が修復的Ｍ２様表現型へと向かうようにシグナルを伝達し方向付けるＩＬ－３３の豊富かつ安定した供給源であり、一方で、損傷した肺においてＴＲＥＧによる修復および調節性機能も刺激する（Liu Q, et al. (2019) IL-33-mediated IL-13 secretion by ST2+ TREG controls inflammation after lung injury. JCI Insight 4(6)）。ＩＬ－３３送達は、細菌クリアランスを改善することにより、Ｈ１Ｎ１感染後の細菌重感染を低下させる（Robinson KM, et al. (2018) Novel protective mechanism for interleukin-33 at the mucosal barrier during influenza-associated bacterial superinfection. Mucosal immunology. 11(1):199-208）。その上、ＭＢＶは、ｍｉＲＮＡ １２５ｂ－５ｐ、１４３－３ｐおよび１４５－５ｐが濃縮されている。マクロファージ内のこれらのｍｉＲＮＡの阻害は、抗炎症性／調節性表現型よりもむしろ炎症促進性と一致した、遺伝子およびタンパク質発現プロファイルに関連する（Huleihel L, et al. (2017) Matrix bound nanovesicles recapitulate extracellular matrix effects on macrophage phenotype. Tissue Eng Part A）。
実施例２に記載されている通り、プリスタン誘導性関節炎（ＰＩＡ）の齧歯類モデルを利用して、ＭＢＶが関節炎スコアを軽減することができるか評価した。８週齢スプラーグドーリーラットは、試験０日目に３００μＬプリスタン（２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン（tetramethypentadecane））の皮内注射を受けた。４日目に、３００μＬプリスタンの第２の用量を皮内投与した。次に、プリスタンを受けている動物を次の実験群へとランダム化した：プリスタンのみ、メトトレキセートの腹腔内注射（ＩＰ ＭＴＸ）、ＭＢＶの関節周囲注射（ＰＡ ＭＢＶ）およびＭＢＶの静脈内注射（ＩＶ ＭＢＶ）。７、１０、１４、１７および２１日目に処置を投与した。７日目に始まり、動物毎に、７、１０、１４、１７、２１、２８日目におよび１００日間にわたりその後毎週、関節炎スコアを決定した。試験の結果は、ＭＢＶのＰＡおよびＩＶ投与の両方が、プリスタン（pristine）のみの対照動物と比較して、関節炎スコアを有意に低下させたことを示した。２１日目の後に、動物は、いかなるさらなる処置も受けなかったが、長期的に追跡されて、二次的な突然の再発（flare-up）を評価した。１００日目の結果は、ＭＢＶ処置動物が、追加的な処置が与えられなかったとしても、対照（非処置）群と比較して、関節炎スコアの持続的な低下を示すことを示した。さらに、足の肉眼的形態学的検査は、ＭＢＶ処置群における低下した発赤および浮腫を示した。加えて、実施例４に示す通り、齧歯類ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）免疫化アッセイは、免疫抑制により異常炎症に対処する現在の治療薬とは対照的に、ＭＢＶ療法が、免疫適格性を損なうことのない、宿主免疫系のモジュレーション／リプログラミングに方向付けられることを示した。実施例１０～１３は、ＭＢＶの全身性投与が、インフルエンザ感染症の動物モデルにおける急性ウイルス媒介性肺病理および長期炎症を軽減することのさらなる証拠を提供する。これらのデータが実証する通り、ＭＢＶ療法は、ＡＲＤＳ等、異常炎症性応答が関与する多くの障害の処置において使用される潜在力を有する。
膀胱マトリックス（ＵＢＭ）の脱細胞化した粉末の気管滴下注入は、ブレオマイシン誘導性肺線維症のマウスモデルにおける肺上皮細胞走化性、遊走および修復を促進する（Manni ML, et al. (2011) Extracellular matrix powder protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Tissue Eng Part A. 17(21-22):2795-2804）。その上、脱細胞化したＥＣＭ粉末の気管滴下注入は、細菌負荷を有意に減少させ、細菌誘導性サイトカイン／ケモカイン分泌を減弱することによって、接種したマウスを重度細菌誘導性肺感染症から保護し、よって、ＥＣＭ足場が、細菌誘導性感染症等、急性呼吸窮迫症候群から生じる二次合併症からの保護を提供することができることを示唆する（Chen C, et al. (2019) Urinary bladder matrix protects host in a murine model of bacterial-induced lung infection. Tissue Eng Part A. 25(3-4):257-270）。加えて、気管滴下注入または噴霧のいずれかによってラット肺内に送達された脱細胞化したＥＣＭは、持続性高酸素条件における減弱された肺胞中隔肥厚、細胞アポトーシスおよび酸化的損傷を含む、持続性高酸素曝露によって誘導される急性肺損傷に対する改善効果を示した。しかし、ＩＰＦの処置のためのＥＣＭ粉末の臨床移行の潜在力は、噴霧され得る斯かるＥＣＭ懸濁物の最大濃度および体積により限定される（Wu J, et al. (2017) Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PloS One 12(2):e01711650）。そのナノメートルサイズを考慮すると、ＭＢＶは、肺へのＥＣＭ粉末送達に関連する課題を克服し、肺への直接的な気管滴下注入または噴霧によりＭＢＶを投与することができることを示唆する。
体液または細胞培養上清からのエキソソーム単離とは対照的に、ＥＣＭ構造分子の複雑な超微細構造は、ＥＣＭ足場材料からのＭＢＶの単離に関する特有の課題を提示する。
一部の実施形態では、ＭＢＶは噴霧、および吸入または静脈内注射により送達され、急速な標的化または全身性送達を可能にする。ＭＢＶは、傷害後の初期免疫応答の強力な天然の制御因子であり、局所および全身性平衡状態を回復する。よって、ＭＢＶは、ネイティブの免疫を損なうことなく、ＡＲＤＳを軽減することができる。ＭＢＶは、免疫抑制なしで炎症消散を促進する。サイトカインスクリーニングは、ＭＢＶ内に貯蔵された大量の抗炎症性サイトカインを示し、ＭＢＶが、平衡状態を回復し、ＡＲＤＳに対するレジリエンスを付与する免疫表現型を促進することを指し示し、ネイティブの免疫を損なわないという利点を有する。よって、ＭＢＶは、免疫抑制なしで炎症の消散を促進する。さらに、脱細胞化したブタ組織または臓器に由来するＭＢＶおよびＥＣＭは、容易に入手でき、安全であり、有害免疫応答を生じず、結果的に、本技術は、臨床移行の用意ができている。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で構成された生物学的足場は、外科用メッシュ材料として開発されており、腹壁ヘルニア修復（Alicuban et al., Hernia. 2014;18(5):705-712）、筋骨格再建（Mase et al., Orthopedics. 2010;33(7):511）、食道再建（Badylak et al., Tissue Eng Part A. 2011; 17(11-12):1643-50）、硬膜置換術（Bejjani et al., J Neurosurg. 2007;106(6):1028-1033）、腱修復（Longo et al., Stem Cells Int. 2012;2012:517165）、乳房再建（Salzber, Ann Plast Surg. 2006;57(1):1-5）およびその他（Badylak et al., Acta Biomater. 2009; 5(1):1-13）を含む臨床適用において使用されている。
マトリックス結合ナノ小胞（ＭＢＶ）は、ＥＣＭの細線維ネットワーク内に包埋されている。このようなナノ粒子は、ＥＣＭ足場製造プロセスの際の分解および変性からそのカーゴを遮蔽する。
対照的に、エキソソーム（または細胞外小胞「ＥＶ」）は、ほとんど排他的に体液および細胞培養上清中において以前に同定されたマイクロ小胞である。ＭＢＶおよびエキソソームが別個のものであることが実証された。ＭＢＶは、例えば、界面活性剤および／または酵素消化に対して抵抗性であり、特有の脂質プロファイルを有し、異なるマイクロＲＮＡのクラスターを含有するため、他の小胞とは異なる。ＭＢＶは、エキソソーム等の他の小胞に見出される同じ特徴的表面タンパク質を有しない。
本明細書に開示されている通り、ＭＢＶは、例えば、生物学的機能を保存または回復するように、全身性免疫応答をモジュレートする（全身性投与による等）。例えば、ＭＢＶの投与は、過剰炎症性免疫応答、例えば、ウイルス感染症に関連する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）等のＡＲＤＳをモジュレートするため等、免疫応答を保存または回復することができる。
ウイルス感染症に関連するＡＲＤＳの処置
ある特定の実施形態では、ＡＲＤＳは、ウイルス感染症に関連する。ある特定の実施形態では、ウイルスは、レトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＴＬＶ－３、ＨＴＬＶ－４）、エボラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス）、アデノウイルス、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、インフルエンザウイルスＤ、ソゴトウイルス）、フラビウイルス（例えば、デングウイルス、ジカウイルス）、ウエストナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、アレナウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＭＥＲＳまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、ワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス、軟属腫ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ポリオーマウイルス（例えば、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス）、アルファウイルスおよびルビウイルス（例えば、風疹ウイルス）からなる群より選択される。一部の実施形態では、ウイルスは、コロナウイルスである。一部の実施形態では、ウイルス感染症に関連するＡＲＤＳは、高サイトカイン血症に関連する。一実施形態では、ＡＲＤＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する。別の実施形態では、ＡＲＤＳは、インフルエンザウイルスに起因する。一部の実施形態では、ＡＲＤＳは、細菌感染症に起因する敗血症に関連する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているＭＢＶは、ウイルス感染症に関連するＡＲＤＳ、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症／熱帯性痙性不全対麻痺症、エボラウイルス疾患、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペス、帯状疱疹、急性水痘、単核球症、呼吸器感染症、肺炎、インフルエンザ、デング熱、脳炎（例えば、日本脳炎）、ウエストナイル熱、リフトバレー熱、クリミア・コンゴ出血熱、キャサヌール森林病、黄熱、ジカ熱、無菌性髄膜炎、ＳＡＲＳ、心筋炎、感冒、肺感染症、伝染性軟属腫（molloscum contagiosum）、地方病性ウシ白血病（enzootic bovine leucosis）、コロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）、ムンプス、胃腸炎、麻疹、風疹、りんご病（slapped-cheek disease）、天然痘、疣贅（例えば、性器疣贅）、伝染性軟属腫、ポリオ、狂犬病およびばら色粃糠疹からなる群より選択されるウイルス感染症に関連するＡＲＤＳの処置に使用される。一部の実施形態では、ウイルス感染症に関連するＡＲＤＳは、高サイトカイン血症に関連する。一部の実施形態では、本明細書に記載されているＭＢＶは、エボラウイルスに関連するＡＲＤＳの処置に使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているＭＢＶは、インフルエンザに関連するＡＲＤＳの処置に使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているＭＢＶは、ＳＡＲＳに関連するＡＲＤＳの処置に使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているＭＢＶは、ＣＯＶＩＤ－１９に関連するＡＲＤＳの処置に使用される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているＭＢＶは、ウイルス感染症に起因する敗血症に関連するＡＲＤＳの処置に使用される。
一部の実施形態では、感染症に関連するウイルスは、ＲＮＡウイルス（ＲＮＡで構成されたゲノムを有する）である。ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり得る。ＲＮＡポリメラーゼは、プルーフリーディング能力を欠如するため、ＲＮＡウイルスは、ＤＮＡウイルスと比較して高い変異率を有する（Steinhauer DA, Holland JJ (1987). "Rapid evolution of RNA viruses". Annu. Rev. Microbiol. 41: 409-33を参照）。例示的なＲＮＡウイルスは、ブニヤウイルス（例えば、ハンタウイルス）、コロナウイルス（例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、フラビウイルス（例えば、黄熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス）、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス）、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエンザウイルスＣ型）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ノロウイルス（例えば、ノーウォークウイルス）、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、レトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１））およびトロウイルスを限定することなく含む。一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、インフルエンザウイルス、例えば、インフルエンザＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、ＲＳＶである。一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶである。一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶである。一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である。一部の実施形態では、ＲＮＡウイルスは、ジカである。
ＲＮＡウイルスは、ゲノムの型（二本鎖、マイナス（－）またはプラス（＋）一本鎖）によって分類される。二本鎖ＲＮＡウイルスは、１種または複数のウイルスタンパク質をそれぞれコードする、多数の異なるＲＮＡ分子を含有する。プラスセンスｓｓＲＮＡウイルスは、そのゲノムを直接的にｍＲＮＡとして利用する；宿主細胞内のリボソームは、ｍＲＮＡを単一のタンパク質へと翻訳し、タンパク質は次いで修飾されて、ウイルス複製に必要とされる様々なタンパク質を形成する。斯かるタンパク質の１種は、二本鎖複製形態を形成するためにウイルスＲＮＡをコピーするＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡレプリカーゼ）である。マイナスセンスｓｓＲＮＡウイルスは、そのゲノムをＲＮＡレプリカーゼ酵素によってコピーさせて、複製のためにプラスセンスＲＮＡを産生する。したがって、ウイルスは、ＲＮＡレプリカーゼ酵素を含む。結果としてのプラスセンスＲＮＡは次いで、ウイルスｍＲＮＡとして作用し、宿主リボソームによって翻訳される。一部の実施形態では、ウイルスは、ｄｓＲＮＡウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスは、マイナスｓｓＲＮＡウイルスである。一部の実施形態では、ウイルスは、プラスｓｓＲＮＡウイルスである。一部の実施形態では、プラスｓｓＲＮＡウイルスは、コロナウイルスである。
時に２０１９年の新型コロナウイルスまたは２０１９－ｎＣｏＶとも称されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は、プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は、Ｓ（スパイク）、Ｅ（エンベロープ）、Ｍ（膜）およびＮ（ヌクレオカプシド）タンパク質として公知の、４種の構造タンパク質を有する。Ｎタンパク質は、ＲＮＡゲノムを保持する；一緒になって、Ｓ、ＥおよびＭタンパク質は、ウイルスエンベロープを形成する。スパイクは、ウイルスが、ヒト細胞におけるＡＣＥ２受容体等、宿主細胞の膜に付着することを可能にする（Kruse R.L. (2020), Therapeutic strategies in an outbreak scenario to treat the novel coronavirus originating in Wuhan, China (version 2). F1000Research, 9:72）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２は、世界的パンデミックであるコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）の高度に伝染性の原因となるウイルス性因子である。一部の実施形態では、急性呼吸窮迫症候群は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する。一部の実施形態では、処置されているＡＲＤＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する。一部の実施形態では、処置されているＡＲＤＳは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する高サイトカイン血症に関連する。
一部の実施形態では、感染症に関連するウイルスは、ＤＮＡウイルス（ＤＮＡで構成されたゲノムを有する）である。例示的なＤＮＡウイルスは、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、アデノウイルス、アスファウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ－１およびＨＳＶ－２）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ））、パピローマウイルス（papillomoviruses）（例えば、ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス（例えば、サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０））およびポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、天然痘ウイルス、鶏痘ウイルス、羊痘ウイルス、粘液腫ウイルス）を限定することなく含む。ある特定の実施形態では、ＤＮＡウイルスは、アデノウイルス、例えば、ＡｄＶ５である。ある特定の実施形態では、ＤＮＡウイルスは、エンテロウイルス、例えば、ＥＶ７１である。ある特定の実施形態では、ＤＮＡウイルスは、ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶ－１である。
一部の実施形態では、感染は、全身性である。一部の実施形態では、感染は、例えば、臓器にまたは例えば、組織に局在化される。一部の実施形態では、感染は、眼、耳、内耳、肺、気管、気管支、細気管支、肝臓、胆嚢、胆管、腎臓、膀胱、精巣、子宮頸部、卵巣、子宮、皮膚または脳を含むがこれらに限定されない、臓器に局在化される。ある特定の実施形態では、感染は、肺に局在化される。
他の病原体感染症に関連するＡＲＤＳの処置
ある特定の実施形態では、ＡＲＤＳは、細菌感染症に関連する。ある特定の実施形態では、ＡＲＤＳは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（例えば、Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（例えば、腸管病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、腸管出血性（enterohemmorhagic）Ｅ．ｃｏｌｉ、尿路疾患性Ｅ．ｃｏｌｉ、腸管侵入性Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（例えば、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ（例えば、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂ．ａｎｔｈｒｉｃｉｓ）、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ（例えば、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（例えば、Ｃ．ｔｅｔａｎ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（例えば、Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）、Ｂｏｒｒｉｅｌｉａ（例えば、Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、ＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａからなる群より選択される細菌に関連する。一部の実施形態では、細菌感染症に関連するＡＲＤＳは、高サイトカイン血症に関連する。一部の実施形態では、ＡＲＤＳは、細菌感染症に起因する敗血症に関連する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているＭＢＶは、細菌感染症に関連するＡＲＤＳ、例えば、細胞内細菌感染症に関連するＡＲＤＳの処置に、例えば使用される。本明細書に記載されている方法は、例えば、クラミジア、結核、消化性潰瘍、ハンセン病、リステリア症、唾液腺炎、細菌によって引き起こされる下痢または食中毒、連鎖球菌性咽頭炎（ｓｔｒｅｐ ｔｈｒｏａｔ）、猩紅熱、膿痂疹、蜂巣炎、肺炎、髄膜炎、細菌性心内膜炎、憩室炎、播種性淋菌敗血症、敗血性関節炎、淋菌性新生児眼炎、尿路感染症、軟部組織感染症、脊椎関節症（例えば、強直性脊椎炎）、レジオネラ症（例えば、レジオネラ病、ポンティアック熱）、ジフテリア、サルモネラ症、炭疽、コレラ、テタヌス、ボツリヌス症、筋膜炎、ガス壊疽、プラーク、ライム病、ブルセラ症、類鼻疽、Ｑ熱、野兎病、淋病、チフス、マイコプラズマ肺炎、胃腸炎および歩行性肺炎（walking pneumonia）からなる群より選択される細菌性疾患または障害に関連するＡＲＤＳの処置に使用することができる。一部の実施形態では、細菌感染症に関連するＡＲＤＳは、高サイトカイン血症に関連する。一部の実施形態では、ＭＢＶは、細菌感染症に起因する敗血症に関連するＡＲＤＳの処置における使用のためのものである。
ある特定の実施形態では、ＡＲＤＳは、真菌感染症に関連する。ある特定の実施形態では、ＡＲＤＳは、真菌感染症に関連し、ここで、真菌は、Ｃａｎｄｉｄａ（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ、Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃ．ｇａｔｔｉｉ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（例えば、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ（例えば、Ｍ．ｍｕｃｏｒ、Ｍ．ａｂｓｉｄｉａ、Ｍ．ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ（例えば、Ｓ．ｓｃｈｅｎｋｉｉ）、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ（例えば、Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ（例えば、Ｃ．ｉｍｍｉｔｉｓ）、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ（例えば、Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ（例えば、Ｂ．ｒａｎａｒｕｍ）、Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ（例えば、Ｃ．ｂａｎｔｉａｎａ）、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ（例えば、Ｃ．ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａｅ）、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ、Ｆｏｎｓｅｃａｅａ（例えば、Ｆ．ｐｅｄｒｏｓｏｉ）、Ｈｏｒｔａｅａ（例えば、Ｈ．ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、Ｌａｃａｚｉａ（例えば、Ｌ．ｌｏｂｏｉ）、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ（例えば、Ｌ．ｍａｃｕｌａｎｓ）、Ｍａｄｕｒｅｌｌａ（例えば、Ｍ．ｍｙｃｅｔｏｍａｔｉｓ）、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｏｔｅｓｔｕｄｉｎａ、Ｏｎｙｃｈｏｃｏｌａ、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ、Ｐｉｅｄｒａｉａ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ（例えば、Ｐ．ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ（例えば、Ｐ．ｂｏｙｄｉｉ）、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ、ＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎおよびＺｙｇｏｍｙｃｅｔｅからなる群より選択される。一部の実施形態では、真菌感染症に関連するＡＲＤＳは、高サイトカイン血症に関連する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているＭＢＶは、細胞内真菌感染症に関連するＡＲＤＳ、例えば、カンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギルス症、ムコール症、スポロトリクス症、ブラストミセス症、パラコクシジオイデス症、コクシジオイデス症、ヒストプラスマ症、真菌腫、爪真菌症、ヒアロヒホ真菌症、皮下接合真菌症、脳膿瘍、フェオヒフォミコーシス、クロモブラストミコーシス、菌腫、肺ムコール症、体部白癬、頭部白癬、股部白癬、足部白癬、爪白癬、黒癬、ローボ病、黒脚症（ｂｌａｃｋｌｅｇ ｄｉｓｅａｓｅ）、菌腫、癜風、マラセチア毛包炎、ステロイドざ瘡、脂漏性皮膚炎、新生児頭部膿疱症、ムコール症、マズラミコーシス、黒色砂毛、ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ肺炎、シュードアレシェリア症、スケドスポリウム症、スポロトリコーシスおよび接合真菌症からなる群より選択される細胞内真菌感染症に関連するＡＲＤＳの処置に使用される。一部の実施形態では、真菌感染症に関連するＡＲＤＳは、高サイトカイン血症に関連する。一部の実施形態では、ＡＲＤＳは、真菌感染症に起因する敗血症に関連する。
ある特定の実施形態では、ＡＲＤＳは、細胞内原生動物感染症に関連する。一部の実施形態では、原生動物は、アメーバである。ある特定の実施形態では、アメーバは、Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａｎｓ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｉ）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ（例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）およびＬｅｉｓｈｍａｎｉａ（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｄｏｎｏｖａｎｉ）からなる群より選択される。一部の実施形態では、原生動物感染症に関連するＡＲＤＳは、高サイトカイン血症に関連する。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されているＭＢＶは、細胞内アメーバ感染症に起因する疾患または障害、例えば、バベシア症、マラリア、クリプトスポリジウム症、シクロスポラ症、シストイソスポーラ症（ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒｉａｓｉｓ）、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症、シャーガス病およびリーシュマニア症からなる群より選択されるアメーバ感染症に関連するＡＲＤＳの処置に使用される。一部の実施形態では、アメーバ感染症に関連するＡＲＤＳは、高サイトカイン血症に関連する。
サイトカイン放出のためのアッセイ
ケモカイン等のサイトカインの発現は、本明細書に開示されている方法において評価することができる。一部の実施形態では、ケモカインとして当技術分野で公知の炎症促進性サイトカインが試験される。ケモカインの例は、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１およびＣＸＣＬ１０を限定することなく含む。一部の実施形態では、サイトカイン放出は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、細胞培養において試験される。ある特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏサイトカイン放出は、細胞培養上清から定量化される。一部の実施形態では、サイトカイン放出は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、動物モデルにおいて試験される。ある特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏサイトカイン放出は、体液、例えば、全血、血清、血漿またはリンパ液から定量化される。ある特定の実施形態では、動物モデルは、マウスモデルである。ある特定の実施形態では、動物モデルは、非ヒト霊長類である。ある特定の実施形態では、サイトカイン放出は、ヒト患者において試験される。
一部の実施形態では、サイトカイン放出は、サイトカイン発現レベルの定量化により評価される。一部の実施形態では、サイトカイン発現レベルは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して定量化される。一部の実施形態では、サイトカイン発現レベルは、マルチプレックスイムノアッセイ、例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘを使用して定量化される。一部の実施形態では、サイトカイン発現レベルは、サイトカインアレイを使用して定量化される。一部の実施形態では、サイトカイン発現レベルは、ウエスタンブロットを使用して定量化される。一部の実施形態では、サイトカイン発現レベルは、質量分析を使用して定量化される。
一部の実施形態では、サイトカイン放出は、免疫系の変化をモニタリングすることによりアッセイされる。免疫系を試験する方法は、当技術分野で公知であり、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、トランスクリプトームプロファイリング（例えば、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ Ｓｅｑ）による）、血液スメア、全血球数およびヘマトクリットを限定することなく含む。
ある特定の実施形態では、発熱、肺炎、息切れおよび低い血液酸素レベル等、疾患または障害の症状は、免疫系の変化を指し示す。ある特定の実施形態では、発熱、肺炎、息切れおよび低い血液酸素レベル等、疾患または障害の症状の減少、すなわち、本明細書に開示されているＭＢＶ療法による処置後の症状の減少は、免疫系の変化を指し示す。
急性呼吸窮迫症候群の処置
本発明はまた、本明細書に記載されているＭＢＶにより急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を処置する方法を提供する。
急性呼吸窮迫症候群は、不十分な血液酸素化、肺への流体浸潤および開始の重症度によって特徴付けられる障害である（Diamond et al. (2020). Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS). StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing）。ＡＲＤＳ開始は通常、原因となる事象の７日間以内に起こる。ＡＲＤＳは、動脈血における患者の酸素レベル（ＰａＯ２）の吸気における酸素（ＦｉＯ２）に対する比によって臨床的に定義される。ＡＲＤＳは、３００未満のＰａＯ２／ＦｉＯ２比を示す患者として定義される。ＡＲＤＳは、高い罹患率および高い死亡率を有する。臨床ＡＲＤＳは、例えば、Fan et al. (2018). Acute Respiratory Distress Syndrome: Advances in Diagnosis and Treatment. JAMA. 319 (7): 698-710にさらに記載されている。
ＡＲＤＳのリスク因子は、感染性疾患または障害（例えば、ウイルス感染症、例えば、細菌感染症）、移植片対宿主病、大量輸血、臓器外傷、組織外傷（例えば、重症熱傷）、慢性アルコール中毒、血球貪食性リンパ組織球症、敗血症、全身性炎症性応答症候群、溺水（drowning）（例えば、水の吸引）、薬物過量服薬（例えば、嘔吐物の吸引）、食物の吸引、脂肪塞栓症、毒性煙霧（例えば、煙または化学物質煙霧）の吸入、および膵炎を限定することなく含む。「ベイピング」として公知の電子たばこの喫煙もまた、ＡＲＤＳ発症のリスク因子として決定された。ある特定の実施形態では、対象は、呼吸を制御する脳の一部分を損傷する頭部傷害を有する。ある特定の実施形態では、対象は、肺を損傷する胸部傷害を有する。一部の実施形態では、ＡＲＤＳのリスク因子は、感染性疾患または障害、例えば、ウイルス、例えば、コロナウイルス、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である。一部の実施形態では、ＡＲＤＳのリスク因子は、感染性疾患または障害、例えば、ウイルス、例えば、エボラウイルスである。一部の実施形態では、ＡＲＤＳのリスク因子は、感染性疾患または障害、例えば、細菌、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅである。一部の実施形態では、ＡＲＤＳは、高サイトカイン血症に関連する。特定の実施形態では、ＡＲＤＳは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２（ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する高サイトカイン血症に関連する。一部の実施形態では、ＡＲＤＳは、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２（ＣＯＶＩＤ－１９）に関連する死亡に関連する。これらの対象のいずれかを、本明細書に開示されている方法による処置のために選択することができる。
ＡＲＤＳを有する患者のための既存の治療法は、シャント率（shunt fraction）の低下、酸素運搬の増加、酸素消費量の減少、ならびに罹患組織および臓器に対するさらなる傷害の回避を限定することなく含む、支持的および／または対症的ケアを含む。一部の実施形態では、ＡＲＤＳを有する患者は、人工呼吸器につながれている。ある特定の実施形態では、人工呼吸器につながれた患者は、本明細書に記載されているＭＢＶを投与される。ある特定の実施形態では、人工呼吸器につながれた患者は、本明細書に記載されているＭＢＶを静脈内投与される。ある特定の実施形態では、患者にＡＲＤＳのリスクがある場合、患者は、ＡＲＤＳの開始前にＭＢＶの投与を受ける。
本発明は、ＭＢＶが、ウイルス感染症によって引き起こされる疾患または障害等、免疫系の病的調節不全によって特徴付けられた疾患または障害を患う対象に投与されたときに、免疫系をモジュレートする能力を有するという発見に基づく。特に、全身性に送達されたＭＢＶが、罹患組織へのＭＢＶの局所投与から達成される治療効果に釣り合う、炎症性障害の症状の処置における治療効果を有することが発見された。さらに、ＭＢＶは、免疫系を抑制するのではなくモジュレートするため、ＭＢＶ投与の治療効果は、免疫抑制により観察されることが多い二次感染症のリスクを呈さない。したがって、このことは、炎症性障害、例えば、急性呼吸窮迫症候群のための特有の全身性治療法としてＭＢＶを位置付ける。本発明の方法は、自然免疫系を抑制せず、疾患を撃退し、二次感染症を予防する機能を維持するため、伝統的な抗炎症または免疫抑制薬とは対照的に、ＭＢＶにより処置された患者は、したがって、感染による二次感染症を発症するリスクの減少を経験することができる。例えば、ＣＯＶＩＤ－１９誘導ＡＲＤＳを患う患者は、ＡＲＤＳの処置のためにＭＢＶを投与されたときに、ＡＲＤＳを処置するために伝統的な抗炎症または免疫抑制薬を受ける同様の状況の患者と比較して、二次感染症を発症するリスクの減少を経験する。
後述する実施例２に記載されている通り、例示的な炎症性疾患としての関節リウマチのラットモデルにおいて、尾静脈の静脈内注射による全身性または関節周囲注射による局所のいずれかで、ＭＢＶを投与されたラットにおける関節炎スコアは、関節リウマチのための処置の絶対的な標準である関節周囲メトトレキセートを受けているラットの関節炎スコアと比較して改善された。驚いたことに、関節炎スコア改善は、全身性注射または局所注射のいずれかを受けているラットの間で同等であった。実施例１０～１３は、ＭＢＶの全身性投与が、インフルエンザ感染症の動物モデルにおける急性ウイルス媒介性肺病理および長期炎症を軽減することをさらに証明する。
したがって、ＭＢＶの全身性投与を使用して、身体の一部に局在化されないまたは局所処置に適さない、異常免疫応答から生じる障害、例えば、ＡＲＤＳを処置することができる。ＡＲＤＳ等、免疫機能亢進の場合、根底にある原因（例えば、高サイトカイン血症）は、循環中に存在し、よって、全身性障害である。したがって、一部の実施形態では、全身性治療法は、身体全体にわたり免疫応答をモジュレートするための効率的な機構を提供する。
一部の実施形態では、投与は、全身性であり得る。全身性投与は、静脈内投与、経口投与、経腸投与、非経口投与、鼻腔内投与、気管内投与、直腸投与、舌下投与、頬側投与、口唇下（sublabial）投与、腹腔内投与または筋肉内投与であり得る。具体的かつ非限定的な例では、全身性投与は、静脈内投与である。ある特定の実施形態では、投与は、肺への等、局所的なものである。例えば、局所投与は、吸入または気管内である。例えば、投与は、噴霧による吸入または鼻腔内投与による吸入である。
一部の実施形態では、ＭＢＶの投与は、対象の肺におけるＣＤ４５＋好中球の数の低下をもたらす。他の実施形態では、ＭＢＶの投与は、対象の肺におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加およびＣＤ４＋Ｔ細胞の数の低下をもたらす。他の実施形態では、ＭＢＶの投与は、対象の脾臓におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加およびＣＤ４＋Ｔ細胞の数の低下をもたらす。さらなる実施形態では、投与は、対象の脾臓におけるＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加をもたらす。さらに他の実施形態では、投与は、対象のリンパ節における抗ウイルスＴｂｅｔ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加をもたらす。さらに他の実施形態では、投与は、対象の脾臓における抗ウイルスＴｂｅｔ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加をもたらす。さらなる実施形態では、投与は、対象の脾臓におけるＣＤ６９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加をもたらす。より多くの実施形態では、投与は、対象の肺における免疫調節性ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞の数の増加をもたらす。一部の実施形態では、投与は、対象の肺におけるＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４４＋メモリーＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の数の増加をもたらす。投与は、対象におけるこれらの効果のうち１つまたは複数をもたらすことができる。増加は、ＭＢＶの投与前の対象におけるパラメーターと比較してまたは標準値と比較して、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超の増加であり得る。減少は、ＭＢＶの投与前の対象におけるパラメーターと比較してまたは標準値と比較して、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超の減少であり得る。
より多くの実施形態では、投与は、対象におけるウイルス関連の組織損傷を低下させる。例えば、投与は、対象の肺への損傷低下をもたらすことができる。一部の実施形態では、ウイルス関連の組織損傷は、ＭＢＶの投与前の対象における組織と比較して、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％を超えて減少する。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に由来するナノ小胞
ＥＣＭに由来するナノ小胞（マトリックス結合ナノ小胞、「ＭＢＶ」とも呼ばれる）は一般に、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／１５１８６２、ＷＯ２０１８／２０４８４８およびＷＯ２０１９／２１３４８２に記載されている。ＭＢＶが細胞外マトリックスに包埋されることが開示されている。このようなＭＢＶは単離することができ、生物学的に活性がある。一部の実施形態では、ＭＢＶは、アルカリホスファターゼ、オステオポンチン、オステオプロテジェリン（osteoprogeterin）、補体Ｃ５および／またはｃ反応性タンパク質を含有しない。このようなＭＢＶは、単独でまたはＥＣＭと共に、治療目的で使用することができる。
細胞外マトリックスは、哺乳動物組織内の細胞を取り囲み支持する、構造タンパク質、特殊化タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよび増殖因子を含むがこれらに限定されない、構造および機能的生体分子および／または生体高分子の複合混合物であり、他に指示がなければ、無細胞である。一般に、開示されているＭＢＶは、いずれかの型の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に包埋されており、この場所から単離することができる。よって、ＭＢＶは、ＥＣＭの表面に脱離可能に存在している訳ではなく、また、エキソソーム（細胞外小胞またはＥＶとしても公知）でもない。
細胞外マトリックスは、例えばであって、限定することなく、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９０２，５０８号；同第４，９５６，１７８号；同第５，２８１，４２２号；同第５，３５２，４６３号；同第５，３７２，８２１号；同第５，５５４，３８９号；同第５，５７３，７８４号；同第５，６４５，８６０号；同第５，７７１，９６９号；同第５，７５３，２６７号；同第５，７６２，９６６号；同第５，８６６，４１４号；同第６，０９９，５６７号；同第６，４８５，７２３号；同第６，５７６，２６５号；同第６，５７９，５３８号；同第６，６９６，２７０号；同第６，７８３，７７６号；同第６，７９３，９３９号；同第６，８４９，２７３号；同第６，８５２，３３９号；同第６，８６１，０７４号；同第６，８８７，４９５号；同第６，８９０，５６２号；同第６，８９０，５６３号；同第６，８９０，５６４号；および同第６，８９３，６６６号に開示されている。しかし、ＥＣＭは、いずれかの組織から、またはいずれかのｉｎ ｖｉｔｒｏ供給源から産生することができ、この場合、ＥＣＭは、培養細胞によって産生され、ネイティブＥＣＭの１種または複数のポリマー構成成分（構成物）を含む。ＥＣＭ調製物は、細胞が供給源組織または培養物から除去されたことを意味する、「脱細胞化された」または「無細胞」であると考えることができる。
一部の実施形態では、ＥＣＭは、脊椎動物から、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ等を含むがこれらに限定されない、哺乳類の脊椎動物から単離される。ＥＣＭは、膀胱、腸（小腸または大腸等）、心臓、真皮、肝臓、腎臓、子宮、脳、血管、肺、骨、筋肉、膵臓、胎盤、胃、脾臓、結腸、脂肪組織または食道を限定することなく含む、いずれかの臓器または組織に由来し得る。一部の実施形態では、ＥＣＭは、骨を除くいずれかの組織に由来し得る。具体的かつ非限定的な例では、細胞外マトリックスは、食道組織、膀胱（膀胱マトリックスまたは膀胱粘膜下組織等）、小腸粘膜下組織、真皮、臍帯、心膜、心組織または骨格筋から単離される。ＥＣＭは、例えばであって、限定することなく、粘膜下組織、上皮基底膜、固有層（tunica propria）等を含む、臓器から得られるいずれか一部分または組織を含むことができる。非限定的な一実施形態では、ＥＣＭは、膀胱から単離される。一部の実施形態では、ＥＣＭは、ヒト対象に由来する。他の実施形態では、ＥＣＭは、ブタ対象に由来する。
ＥＣＭは、基底膜を含んでも含まなくてもよい。別の非限定的な実施形態では、ＥＣＭは、基底膜の少なくとも一部分を含む。ＥＣＭ材料は、毛細血管内皮細胞または線維細胞等、本来の組織を構成した細胞エレメントの一部を保持しても保持しなくてもよい。一部の実施形態では、ＥＣＭは、基底膜表面および非基底膜表面の両方を含有する。
一部の実施形態では、ＥＣＭは、ブタ膀胱から収集される（膀胱マトリックスまたはＵＢＭとしても公知）。簡潔に説明すると、ＥＣＭは、ブタ等の哺乳動物から膀胱組織を除去し、脂肪組織を含む残渣の外側結合組織をそぎ落とすことによって調製される。水道水による反復洗浄によって、残渣尿を全て除去する。先ず、組織を上皮除去溶液、例えばであって、限定することなく、高張性食塩水（例えば、１．０Ｎ食塩水）に、１０分間～４時間に及ぶ期間にわたり浸すことにより、組織を層間剥離する。高張性食塩水溶液への曝露は、根底にある基底膜から上皮細胞を除去する。必要に応じて、食塩水溶液にカルシウムキレート剤を添加することができる。初期層間剥離手順後に残っている組織は、上皮基底膜および上皮基底膜に対して反管腔側の組織層を含む。比較的脆い上皮基底膜は、管腔表面におけるいかなる機械的摩耗によっても、常に損傷および除去される。この組織は次に、反管腔側組織の大部分を除去するが、上皮基底膜および固有層を維持するためのさらなる処置に付される。外側漿膜、外膜、筋層粘膜（tunica muscularis mucosa）、粘膜下組織（tunica submucosa）、および粘膜筋板の大部分は、機械的摩耗によってまたは酵素処置（例えば、トリプシンまたはコラゲナーゼを使用した）とそれに続く水分補給および摩耗の組合せによって、残っている上皮除去された組織から除去される。これらの組織の機械的除去は、例えばであって、限定することなく、Ａｄｓｏｎ－Ｂｒｏｗｎ鉗子およびＭｅｔｚｅｎｂａｕｍハサミを用いた腸間膜組織の除去、ならびに湿ったガーゼに包まれたメスの柄または他の硬い物体を用いた長手方向の拭き取り動作を使用した筋層および粘膜下組織の拭き取りによって達成される。切断刃、レーザーおよび他の組織分離方法が関与する自動ロボット手順も企図される。これらの組織が除去された後に、結果として生じるＥＣＭは、主に、上皮基底膜および下にある固有層からなる。
別の実施形態では、メスの柄および湿ったガーゼを用いた長手方向の拭き取り動作を使用して、ブタ膀胱組織を摩耗して、漿膜および筋層の両方を含む外側層を除去することにより、ＥＣＭが調製される。組織セグメントの外転後に、粘膜の管腔部分は、同じ拭き取り動作を使用して、根底にある組織から層間剥離される。粘膜下組織の穿孔を防ぐように注意する。これらの組織が除去された後に、結果として生じるＥＣＭは、主に、粘膜下組織からなる（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，２７７，９９９号の図２を参照）。
ＥＣＭは、粉末として調製することもできる。斯かる粉末は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Gilbert et al., Biomaterials 26 (2005) 1431-1435の方法に従って作製することができる。例えば、ＵＢＭシートを凍結乾燥し、次いで、液体窒素中への浸漬のために、小さいシートへと刻むことができる。次に、ＥＣＭが粉末化される回転ナイフ製粉機の中に配置されるのに十分なほど、粒子が小さくなるように、瞬間凍結された材料を粉砕することができる。同様に、ＥＣＭ組織内のＮａＣｌを沈殿させることによって、材料は、瞬間凍結、凍結乾燥および粉末化され得る、均一なサイズの粒子へと破砕するであろう。
非限定的な一実施形態では、ＥＣＭは、小腸粘膜下組織またはＳＩＳに由来する。市販の調製物は、ＳＵＲＧＩＳＩＳ（商標）、ＳＵＲＧＩＳＩＳ－ＥＳ（商標）、ＳＴＲＡＴＡＳＩＳ（商標）およびＳＴＲＡＴＡＳＩＳ－ＥＳ（商標）（Ｃｏｏｋ Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）およびＧＲＡＦＴＰＡＴＣＨ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｉｎｃ．；Ｃａｎｔｏｎ Ｍａｓｓ．）を含むがこれらに限定されない。別の非限定的な実施形態では、ＥＣＭは、真皮に由来する。市販の調製物は、ＰＥＬＶＩＣＯＬ（商標）（欧州ではＰＥＲＭＡＣＯＬ（商標）として販売；Ｂａｒｄ、Ｃｏｖｉｎｇｔｏｎ、Ｇａ．）、ＲＥＰＬＩＦＯＲＭ（商標）（Ｍｉｃｒｏｖａｓｉｖｅ；Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）およびＡＬＬＯＤＥＲＭ（商標）（ＬｉｆｅＣｅｌｌ；Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）を含むがこれらに限定されない。別の実施形態では、ＥＣＭは、膀胱に由来する。市販の調製物は、ＵＢＭ（ＡＣｅｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｊｅｓｓｕｐ、Ｍｄ．）を含むがこれらに限定されない。
ＭＢＶは、下に開示されている方法を使用して、細胞外マトリックスから得る（これから放出される）ことができる。一部の実施形態では、ＥＣＭは、ペプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼまたはプロテイナーゼＫ等の酵素で消化され、ＭＢＶが単離される。他の実施形態では、グリシンＨＣＬ、クエン酸、水酸化アンモニウム等の溶液によりｐＨを変化させることにより、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等が挙げられるがこれらに限定されない、キレート剤の使用により、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム等が挙げられるがこれらに限定されない、塩の使用によるイオン強度および／もしくはカオトロピック効果によって、またはグアニジンＨＣｌもしくは尿素等の変性条件にＥＣＭを曝露することにより、ＭＢＶは、ＥＣＭから放出および分離される。
特定の実施形態では、ＭＢＶは、ペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロテイナーゼＫ、塩溶液またはコラゲナーゼ等の酵素によるＥＣＭの消化後に調製される。ＥＣＭは、凍結融解することができる、または機械的分解に付すことができる。
一部の実施形態では、ＣＤ６３、ＣＤ８１および／またはＣＤ９の発現は、ＭＢＶにおいて検出することができない。よって、一部の実施形態では、ＭＢＶは、ＣＤ６３および／またはＣＤ８１および／またはＣＤ９を発現しない。特異的な一例では、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ９は、ナノ小胞において検出することができない。他の実施形態では、ＭＢＶは、ウエスタンブロットによって検出可能なもの等、辛うじて検出可能なレベルのＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ９を有する。このようなＭＢＶは、ＣＤ６３ｌｏＣＤ８１ｌｏＣＤ９ｌｏである。他の実施形態では、ＭＢＶは、検出可能レベルの、ＣＤ６３、ＣＤ８１またはＣＤ９のうち１種または複数を発現しない。他の実施形態では、ＭＢＶは、辛うじて検出可能なレベルの、ＣＤ６３、ＣＤ８１またはＣＤ９のうち１種または複数を発現する。当業者は、例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ９に特異的に結合する抗体を使用して、ＣＤ６３ｌｏおよび／またはＣＤ８１ｌｏおよび／またはＣＤ９ｌｏであるＭＢＶを容易に同定することができる。これらのマーカーが低レベルであることは、ＣＤ６３、ＣＤ８１およびＣＤ９の少ないおよび多い量の閾値を決定するための、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および蛍光標識された抗体等の手順を使用して確立することができる。さらなる実施形態では、ＭＢＶは、検出可能なアルカリホスファターゼ、オステオポンチン、オステオプロテジェリン、補体Ｃ５および／またはｃ反応性タンパク質を含有しない。ｉｎ ｖｉｖｏでＭＢＶはＥＣＭに結合しており、生体液中に見出されないため、開示されているＭＢＶは、生体液中におけるその存在によりＥＣＭの表面に一過性に付着され得るエキソソーム等のナノ小胞とは異なる。
ＭＢＶは、例えば、エキソソームと比較して、特徴的なリン脂質含量を有する。一部の実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％もしくは９０％、または約５０％～９０％、５０％～６５％、５０％～６０％、５０％～７０％、６０％～７０％、６０％～９０％もしくは７０％～９０％のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せである。具体的な実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、少なくとも５５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せである。具体的な実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、少なくとも６０％のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せである。一部の実施形態では、ＭＢＶのリン脂質含量は、８未満：１（例えば、７未満：１、６未満：１、５未満：１、４未満：１、３未満：１または２未満：１）のホスファチジルコリン（ＰＣ）対ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）比を含む。一部の実施形態では、ＭＢＶのリン脂質含量は、０．５～１：１の範囲または１：０．５～１の範囲または０．５～１：２の範囲または２：０．５～１の範囲または０．８～１：１の範囲または１：０．８～１の範囲のホスファチジルコリン（ＰＣ）対ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）比を含む。一実施形態では、ＭＢＶのリン脂質含量は、約１：１のホスファチジルコリン（ＰＣ）対ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）比を含む。具体的な実施形態では、ＭＢＶのリン脂質含量は、約０．９：１のホスファチジルコリン（ＰＣ）対ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）比を含む。
一部の実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％もしくはそれ未満のまたは約５％～１０％、５％～１５％、１０％～１５％もしくは８％～１２％のスフィンゴミエリン（ＳＭ）である。具体的な実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、１０％またはそれ未満のスフィンゴミエリン（ＳＭ）である。一部の実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、１５％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン（ＳＭ）、１４％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン、１３％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン、１２％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン、１１％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン、１０％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン、９％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン、８％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン、７％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン、６％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン、５％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリンまたは４％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリンである。
一部の実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％もしくは１０％もしくはそれ未満または約１０％～２０％、１５％～２０％、１４％～１８％もしくは１２％～１６％のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である。具体的な実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、２０％またはそれ未満のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）である。
一部の実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、５％、１０％、１２％、１５％、１８％、２０％、２５％もしくは３０％もしくはそれよりも高いまたは約５％～３０％、１０％～２０％、１０～２５％、１５％～２５％もしくは１２％～１８％のホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である。具体的な実施形態では、ＭＢＶは、１５％またはそれよりも大きいホスファチジルイノシトール（ＰＩ）のリン脂質含量を含む。具体的な実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、１５％またはそれよりも高いホスファチジルイノシトール、２０％またはそれ未満のホスファチジルエタノールアミンおよび１０％またはそれ未満のスフィンゴミエリンを含む。具体的な実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、１５％またはそれよりも高いホスファチジルイノシトールおよび２０％またはそれ未満のホスファチジルエタノールアミンである。具体的な実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、１５％またはそれよりも高いホスファチジルイノシトールおよび１０％またはそれ未満のスフィンゴミエリンである。具体的な実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、２０％またはそれ未満のホスファチジルエタノールアミンおよび１０％またはそれ未満のスフィンゴミエリンを含む。具体的な実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、１５％超のホスファチジルイノシトール、２０％またはそれ未満のホスファチジルエタノールアミン、１０％またはそれ未満のスフィンゴミエリン、ならびに少なくとも５５％のホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルコリンの組合せである。一実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、少なくとも５５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せ、ならびに１０％またはそれ未満のスフィンゴミエリン（ＳＭ）である。具体的な実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、少なくとも５５％のホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルコリンの組合せ、ならびに１５％超のホスファチジルイノシトールである。具体的な実施形態では、ＭＢＶの総リン脂質含量は、５５％のホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルコリンの組合せ、ならびに２０％またはそれ未満のホスファチジルエタノールアミンである。
ＭＢＶは、リジルオキシダーゼ（Ｌｏｘ）を含むこともできる。一般に、ＥＣＭに由来するナノ小胞は、エキソソームよりも高いＬｏｘ含量を有する。Ｌｏｘは、ＭＢＶの表面に発現される。Ｎａｎｏ－ＬＣ ＭＳ／ＭＳプロテオミクス解析を使用して、Ｌｏｘタンパク質を検出することができる。Ｌｏｘの定量化を行うことができる（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Hill RC, et al., Mol Cell Proteomics. 2015;14(4):961-73を参照）。
ある特定の実施形態では、ＭＢＶは、１種または複数のｍｉＲＮＡを含む。具体的かつ非限定的な例では、ＭＢＶは、ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１４５およびｍｉＲ－１８１のうち１、２または全３種を含む。ｍｉＲ－１４３、ｍｉＲ－１４５およびｍｉＲ－１８１は、当技術分野で公知である。
ｍｉＲ－１４５核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるＭｉＲｂａｓｅ受託番号ＭＩ００００４６１に提供される。ｍｉＲ－１４５核酸配列は、ＣＡＣＣＵＵＧＵＣＣＵＣＡＣＧＧＵＣＣＡＧＵＵＵＵＣＣＣＡＧＧＡＡＵＣＣＣＵＵＡＧＡＵＧＣＵＡＡＧＡＵＧＧＧＧＡＵＵＣＣＵＧＧＡＡＡＵＡＣＵＧＵＵＣＵＵＧＡＧＧＵＣＡＵＧＧＵＵ（配列番号１）である。ｍｉＲ－１８１核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるｍｉＲｂａｓｅ受託番号ＭＩ００００２６９に提供される。ｍｉＲ－１８１核酸配列は、ＡＧＡＡＧＧＧＣＵＡＵＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＧＡＣＵＣＣＡＡＧＧＡＡＣＡＵＵＣＡＡＣＧＣＵＧＵＣＧＧＵＧＡＧＵＵＵＧＧＧＡＵＵＵＧＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣＵＧＡＣＣＧＵＵＧＡＣＵＧＵＡＣＣＵＵＧＧＧＧＵＣＣＵＵＡ（配列番号２）である。ｍｉＲ－１４３核酸配列は、参照により本明細書に組み込まれるＮＣＢＩ受託番号ＮＲ＿０２９６８４．１、２０１８年３月３０日に提供される。ｍｉＲ－１４３核酸配列をコードするＤＮＡは、ＧＣＧＣＡＧＣＧＣＣ ＣＴＧＴＣＴＣＣＣＡ ＧＣＣＴＧＡＧＧＴＧ ＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡ ＴＣＴＣＴＧＧＴＣＡ ＧＴＴＧＧＧＡＧＴＣ ＴＧＡＧＡＴＧＡＡＧ ＣＡＣＴＧＴＡＧＣＴ ＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡ ＧＡＡＧＴＴＧＴＴＣ ＴＧＣＡＧＣ（配列番号３）である。
投与後に、ＭＢＶは、対象のマクロファージ表面におけるＦ４／８０（マクロファージマーカー）およびＣＤ－１１ｂの発現を維持する。ナノ小胞処置マクロファージは優勢にＦ４／８０＋Ｆｉｚｚ１＋であり、Ｍ２表現型を指し示す。
本明細書に開示されているＭＢＶは、薬学的送達のための組成物へと製剤化することができる。ＭＢＶは、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１７／１５１８６２にさらに開示および記載されている。
ＥＣＭからのＭＢＶの単離
ＭＢＶを産生するために、上に記載されている通り、ＥＣＭは、いずれかの目的の細胞によって産生することができる、または商業的供給源から利用することができる。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Quijano et al., Tissue Eng, Part C 2020; (10):528-540. DOI: 10.1089/ten.tec.2020.0243. PMID: 33012221も参照されたい。ＭＢＶは、処置されている対象と同じ種またはそれとは異なる種から産生することができる。一部の実施形態では、このような方法は、ＥＣＭを酵素で消化して、消化されたＥＣＭを産生するステップを含む。具体的な実施形態では、ＥＣＭは、ペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、メタロプロテイナーゼおよび／またはプロテイナーゼＫのうち１種または複数で消化される。具体的かつ非限定的な例では、ＥＣＭは、エラスターゼおよび／またはメタロプロテイナーゼのみで消化される。別の非限定的な例では、ＥＣＭは、コラゲナーゼおよび／またはトリプシンおよび／またはプロテイナーゼＫで消化されない。他の実施形態では、ＥＣＭは、界面活性剤で処置される。さらなる実施形態では、方法は、酵素の使用を含まない。具体的かつ非限定的な例では、方法は、塩化カリウム等の塩等、カオトロピック剤またはイオン強度を利用して、ＭＢＶを単離する。追加的な実施形態では、ＥＣＭは、ＭＢＶの単離に先立ち、ＭＢＶ含量を増加させるように操作することができる。ＥＣＭからＭＢＶを単離するための技法は、例えば、国際特許出願ＷＯ２０１７／１５１８６２に記載されている。
一部の実施形態では、ＥＣＭは、酵素で消化される。ＥＣＭは、約１２～約３６時間等、約１２～約４８時間にわたり酵素で消化することができる。ＥＣＭは、約１２、約２４、約３６または約４８時間にわたり酵素で消化することができる。具体的かつ非限定的な一例では、ＥＣＭは、室温にて酵素で消化される。しかし、消化は、約４℃でまたは約４℃～２５℃の間のいずれかの温度で起こることができる。一般に、ＥＣＭは、コラーゲン原線維の除去に十分な、いずれかの長さの時間にわたりいずれかの温度にて、酵素で消化される。消化プロセスは、組織供給源に応じて変動され得る。必要に応じて、ＥＣＭは、酵素による消化の前または後のいずれかに、凍結および解凍によって処理される。ＥＣＭは、イオン性および／または非イオン性界面活性剤を含む界面活性剤で処置することができる。
次に、消化されたＥＣＭを、遠心分離等によって処理して、原線維不含上清を単離する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭは、例えば、第１のステップのため、約３００～約１０００ｇで遠心分離される。よって、消化されたＥＣＭは、約４００ｇ、約４５０ｇ、約５００ｇまたは約６００ｇ等、約４００ｇ～約７５０ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約１０、約１１、約１２、約１４、約１４または約１５分間等、約１０～約１２分間等、約１０～約１５分間にわたり起こることができる。消化されたＥＣＭを含む上清は、収集される。
一部の実施形態では、ＭＢＶは、Ｌｏｘを含む。一部の実施形態では、斯かるＭＢＶを単離するための方法は、細胞外マトリックスをエラスターゼおよび／またはメタロプロテイナーゼで消化して、消化された細胞外マトリックスを産生するステップと、消化された細胞外マトリックスを遠心分離して、コラーゲン原線維レムナントを除去し、よって、原線維不含上清を産生するステップと、原線維不含上清を遠心分離して、固体材料を単離するステップと、担体に固体材料を懸濁するステップとを含む。
一部の実施形態では、消化されたＥＣＭは、第２のステップのため、約２０００ｇ～約３０００ｇで遠心分離することもできる。よって、消化されたＥＣＭは、約２，０００ｇ、２，５００ｇ、２，７５０ｇまたは３，０００ｇ等、約２，５００ｇ～約３，０００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９または約３０分間等、約２０～約２５分間等、約２０～約３０分間にわたり起こることができる。消化されたＥＣＭを含む上清は、収集される。
追加的な実施形態では、消化されたＥＣＭは、第３のステップのため、約１０，０００～約１５，０００ｇで遠心分離することができる。よって、消化されたＥＣＭは、約１０，０００ｇ、１１，０００ｇまたは１２，０００ｇ等、約１０，０００ｇ～約１２，５００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約２５～約３０分間、例えば、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９または約４０分間等、約２５～約４０分間にわたり起こることができる。消化されたＥＣＭを含む上清は、収集される。これらの遠心分離ステップのうち１、２または全３種を独立して利用することができる。一部の実施形態では、全３種の遠心分離ステップが利用される。遠心分離ステップは、２、３、４または５回等、反復することができる。一実施形態では、全３種の遠心分離ステップは、３回反復される。
一部の実施形態では、消化されたＥＣＭは、約５００ｇで約１０分間にわたり遠心分離される、約２，５００ｇで約２０分間にわたり遠心分離される、および／または約１０，０００ｇで約３０分間にわたり遠心分離される。全３種のステップ等、これらのステップ（複数可）は、３回等、２、３、４または５回反復される。よって、非限定的な一例では、消化されたＥＣＭは、約５００ｇで約１０分間にわたり遠心分離され、約２，５００ｇで約２０分間にわたり遠心分離され、約１０，０００ｇで約３０分間にわたり遠心分離される。これら３種のステップは、３回反復される。よって、原線維不含上清が産生される。次に、原線維不含上清を遠心分離して、ＭＢＶを単離する。一部の実施形態では、原線維不含上清は、約１００，０００ｇ～約１５０，０００ｇで遠心分離される。よって、原線維不含上清は、約１００，０００ｇ、約１０５，０００ｇ、約１１０，０００ｇ、約１１５，０００ｇまたは約１２０，０００ｇ等、約１００，０００ｇ～約１２５，０００ｇで遠心分離される。この遠心分離は、約７０～約８０分間、例えば、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５または約９０分間等、約６０～約９０分間にわたり起こることができる。非限定的な一例では、線維（fiber）不含上清は、約１００，０００ｇで約７０分間にわたり遠心分離される。ＭＢＶである固体材料が収集される。次に、このようなＭＢＶは、緩衝液等が挙げられるがこれに限定されない、いずれかの目的の担体に再懸濁することができる。
さらなる実施形態では、ＥＣＭは、酵素で消化されない。このような方法において、ＥＣＭは、リン酸緩衝食塩水等の等張性食塩水溶液に懸濁される。次に、塩の最終濃度が、約０．１Ｍよりも大きくなるように、塩が懸濁物に添加される。濃度は、例えば、最大約３Ｍ、例えば、約０．１Ｍ塩～約３Ｍまたは約０．１Ｍ～約２Ｍであり得る。塩は、例えば、約０．１Ｍ、０．１５Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．７Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍまたは２Ｍであり得る。一部の非限定的な例では、塩は、塩化カリウム、塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムである。他の実施形態では、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、ヨウ化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウム、ナトリウム塩、リチウム塩、セシウム塩またはカルシウム塩である。
一部の実施形態では、ＥＣＭは、約１５分間～約１時間、約３０分間～約１時間または約４５分間～約１時間等、約１０分間～約２時間にわたり塩溶液に懸濁される。ＥＣＭは、約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５または１２０分間にわたり塩溶液に懸濁することができる。ＥＣＭは、約４℃～約２５℃または約４℃～約３７℃等が挙げられるがこれらに限定されない、４℃～約５０℃の温度で塩溶液に懸濁することができる。具体的かつ非限定的な例では、ＥＣＭは、約４℃で塩溶液に懸濁される。他の具体的かつ非限定的な例では、ＥＣＭは、約２２℃または約２５℃（室温）で塩溶液に懸濁される。さらなる非限定的な例では、ＥＣＭは、約３７℃で塩溶液に懸濁される。
一部の実施形態では、方法は、約０．４Ｍよりも高い塩濃度で細胞外マトリックスをインキュベートするステップと、消化された細胞外マトリックスを遠心分離して、コラーゲン原線維レムナントを除去するステップと、上清を単離するステップと、上清を遠心分離して、固体材料を単離するステップと、担体に固体材料を懸濁し、これにより、細胞外マトリックスからＭＢＶを単離するステップとを含む。
塩溶液におけるインキュベーション後に、ＥＣＭを遠心分離して、コラーゲン原線維を除去する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭは、約２０００ｇ～約５０００ｇで遠心分離することもできる。よって、消化されたＥＣＭは、約２，５００ｇ、約３，０００ｇ、３，５００、約４，０００ｇまたは約４，５００ｇ等、約２，５００ｇ～約４，５００ｇで遠心分離することができる。具体的かつ非限定的な一例では、遠心分離は、約３，５００ｇで為される。この遠心分離は、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０分間、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５分間等、約２５～約３５分間等、約２０～約４０分間にわたり起こることができる。次に、上清が収集される。
追加的な実施形態では、次に、上清は、第３のステップのため、約１００，０００～約１５０，０００ｇで遠心分離することができる。よって、消化されたＥＣＭは、約１００，０００ｇ、１１０，０００ｇまたは１２０，０００ｇ等、約１００，０００ｇ～約１２５，０００ｇで遠心分離することができる。この遠心分離は、約１時間～約３時間、例えば、約３０分間、約４５分間、約６０分間、約９０分間または約１２０分間（２時間）等、約３０分間～約２．５時間にわたり起こることができる。固体材料は収集され、緩衝食塩水等の溶液に懸濁され、これにより、ＭＢＶを単離する。
さらに他の実施形態では、ＥＣＭは、リン酸緩衝食塩水等が挙げられるがこれに限定されない、等張性緩衝塩溶液に懸濁される。遠心分離または他の方法を使用して、大きい粒子を除去することができる（下記を参照）。次に、限外濾過を利用して、約１０ｎｍ～約３００ｎｍの間等、約１０～約１，０００ｎｍの間等、約１０ｎｍ～約１０，０００ｎｍの間の粒子であるＭＢＶをＥＣＭから単離する。
具体的かつ非限定的な例では、等張性緩衝食塩水溶液は、約０．１６４ｍＭの総塩濃度および約７．２～約７．４のｐＨを有する。一部の実施形態では、等張性緩衝食塩水溶液は、約０．００２７Ｍ ＫＣｌ（リン酸緩衝食塩水におけるＫＣＬの濃度）等、０．００２Ｍ ＫＣｌ～約０．１６４Ｍ ＫＣＬを含む。次に、この懸濁物は、超遠心分離によって処理される。
等張性緩衝塩溶液におけるインキュベーション後に、ＥＣＭを遠心分離して、コラーゲン原線維を除去する。一部の実施形態では、消化されたＥＣＭは、約２０００ｇ～約５０００ｇで遠心分離することもできる。よって、消化されたＥＣＭは、約２，５００ｇ、約３，０００ｇ、３，５００、約４，０００ｇまたは約４，５００ｇ等、約２，５００ｇ～約４，５００ｇで遠心分離することができる。具体的かつ非限定的な一例では、遠心分離は、約３，５００ｇで為される。この遠心分離は、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０分間、約３１、約３２、約３３、約３４または約３５分間等、約２５～約３５分間等、約２０～約４０分間にわたり起こることができる。
精密濾過（microfiltration）および遠心分離を使用および組み合わせて、懸濁物から大きい分子量の材料を除去することができる。一実施形態では、２００ｎｍ超等、大きいサイズの分子材料は、精密濾過を使用して除去される。別の実施形態では、大きいサイズの材料は、遠心分離の使用によって除去される。第３の実施形態では、精密濾過および超遠心分離の両方を使用して、大きい分子量の材料を除去する。約１０，０００ｎｍよりも大きい、約１，０００ｎｍよりも大きい、約５００ｎｍよりも大きいまたは約３００ｎｍよりも大きい材料等、大きい分子量の材料は、懸濁されたＥＣＭから除去される。
次に、精密濾過の流出液または上清は、限外濾過に付される。よって、約１０，０００ｎｍ未満、約１，０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満または約３００ｎｍ未満の粒子を含む流出液が収集され、利用される。次に、この流出液は、３，０００～１００，０００の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜による限外濾過に付される。１００，０００ＭＷＣＯを実施例において使用した。
急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を処置するための方法
それを必要とする対象におけるＡＲＤＳを処置するための方法が本明細書に開示されている。これらの方法は、炎症を減少させるための処置を必要とする対象を選択するステップと、対象に治療有効量のＭＢＶを投与し（治療有効量のＭＢＶを含む医薬調製物を投与することによる等）、これにより、ＡＲＤＳを処置するステップとを含む。
対象は、哺乳動物であり得る。対象は、ヒトであり得る。対象は、獣医学対象であり得る。対象は、ネコ、イヌまたはウサギ等、鳥類または飼育愛玩動物であり得る。対象は、非ヒト霊長類（サル等）、またはブタ、反芻動物、ウマおよび家禽を含む家畜であり得る。方法は、炎症を減少させるための処置を必要とする対象を選択するステップと、対象に治療有効量のＭＢＶを投与するステップと（治療有効量のＭＢＶを含む医薬調製物を投与することによる等）を含む。一部の実施形態では、ＭＢＶは、全身性投与することができる。他の実施形態では、ＭＢＶは、局所投与することができる。ＭＢＶは、炎症の減少を必要とする対象と同じまたは異なる種に由来し得る。ＭＢＶは、自家であり得る。
本明細書に開示されている方法は、対象における炎症の減少をもたらすことができる。一部の実施形態では、高サイトカイン血症等の過剰炎症性障害の徴候または症状が低下または排除される。例えば、本明細書における方法は、対象におけるＡＲＤＳの処置をもたらすことができる。一部の実施形態では、本明細書における方法を使用して、対象におけるＡＲＤＳの進行を予防するまたは対象におけるＡＲＤＳを逆転させることができる。
一実施形態において、ＡＲＤＳの処置は、関連する臨床徴候（indicia）に従って測定することができる。一部の実施形態では、ＡＲＤＳは、重度であり得、例えば、急性肺傷害、低酸素血症ＰａＯ２／ＦｉＯ２、ＰＥＥＰ（ｃｍＨ２Ｏ）、コンプライアンス（ｍｌ／ｃｍＨ２Ｏ）およびＣＸＲ浸潤四分円（quadrant）のためのＭｕｒｒａｙスコアを使用してスコア化することができる。一部の実施形態では、ＡＲＤＳは、例えば、呼吸数、チアノーゼ、退縮、呻吟および空気流入（ａｉｒ ｅｎｔｒｙ）によって決定される修正ダウネ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｏｗｎｅ’ｓ）スコア化システムを使用してスコア化することができる。一部の実施形態では、ＡＲＤＳは、例えば、当技術分野で公知の別のスコア化システムを使用してスコア化することができる。ＭＢＶによる処置によるＡＲＤＳにおける改善は、ＡＲＤＳ症状における改善に関連するスコア化の変化によって指し示すことができる。
一実施形態において、ＡＲＤＳの処置は、関連する臨床徴候に従うことによって測定することができる。例えば、ＡＲＤＳの処置は、例えば、酸素指数（ＯＩ）、酸素飽和度指数（ＯＳＩ）または酸素飽和度（ＯＳ）における改善によって測定することができる。ＡＲＤＳの処置における有効性は、例えば、ＯＩ、ＯＳＩまたはＯＳの増加によって測定することができる。例えば、一実施形態では、対象における酸素飽和度は、ＭＢＶの投与後に、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超増加する。別の実施形態では、対象における酸素飽和度指数は、ＭＢＶの投与後に、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超増加する。さらに別の実施形態では、対象における酸素指数は、ＭＢＶの投与後に、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超増加する。さらなる実施形態では、ＡＲＤＳの処置は、対象における炎症促進性サイトカインのレベルを測定することにより指し示すことができる。例えば、炎症促進性サイトカインの減少は、ＡＲＤＳの処置の有効性を指し示すことができる。例えば、ＭＢＶの投与後のＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－６および／またはＩＬ－１βの減少は、ＡＲＤＳの処置における有効性を指し示すことができる。別の実施形態では、ＩＬ－１０、ＩＬ－４および／またはＴＧＦ－β等の抗炎症性サイトカインの増加は、ＡＲＤＳの処置における有効性の指標として使用することができる。サイトカインレベルは、前述の実施形態では、例えば、ＭＢＶによる処置の前および後に、対象の回収された気管支肺胞洗浄液からサンプリングすることにより決定することができる。サイトカインレベルは、前述の実施形態では、例えば、ＭＢＶによる処置の前および後に、血液からサンプリングすることにより決定することができる。体液または細胞試料におけるサイトカインレベルは、当業者にとって公知の従来方法によって決定される。例えば、細胞培養上清および気管支肺胞洗浄液におけるサイトカイン濃度は、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）の製造業者によって推奨される通りに測定することができる。
ＭＢＶによる処置の有効性は、当業者にとって公知の方法によって肺機能をモニタリングすることにより測定することができる。例えば、肺機能の様々な測定可能なパラメーターは、処置の前、その間またはその後に試験することができる。肺機能は、吸気流量、呼気流量および肺容量を含むがこれらに限定されない、肺のいくつかの物理的に測定可能な働きのいずれかを検査することによりモニターすることができる。これらのパラメーターの１種または複数の、当業者にとって周知の数式によって決定される統計的に有意な増加は、ＭＢＶ処置の有効性を指し示す。
臨床診療において最も一般的に用いられる肺機能を測定する方法は、特異的パラメーターを測定するための吸気および呼気操作の時限測定を伴う。例えば、ＦＶＣは、初期深吸気から力強く患者によって吐き出されるリットル単位の総体積を測定する。このパラメーターは、ＦＥＶ１と併せて評価される場合、気管支収縮が定量的に評価されることを可能にする。ＦＶＣまたはＦＥＶ１の、当業者にとって周知の数式によって決定される統計的に有意な増加は、気管支収縮の減少を反映し、ＭＢＶ療法が有効であることを指し示す。
努力肺活量決定に伴う問題は、努力肺活量操作（すなわち、最大吸気から最大呼気への努力呼息）が大部分は技法依存性であることである。換言すると、所与の対象は、一連の連続したＦＶＣ操作の間に異なるＦＶＣ値を産生し得る。努力呼息操作の中央部にわたり決定されるＦＥＦ ２５－７５または努力呼気流量は、ＦＶＣよりも技法依存性が低くなる傾向がある。同様に、ＦＥＶ１は、ＦＶＣよりも技法依存性が低くなる傾向がある。よって、ＦＥＦ ２５－７５またはＦＥＶ１の、当業者にとって周知の数式によって決定される統計的に有意な増加は、気管支収縮の減少を反映し、ＭＢＶ療法が有効であることを指し示す。
肺機能の指標としての吐き出された空気の体積の測定に加えて、呼気サイクルの異なる部分にわたり測定された１分間当たりのリットル単位での流量は、患者の肺機能の状態の決定において有用であり得る。特に、努力最大呼息中の１分間当たりのリットル単位での最高気流速度として受け取られたピーク呼気流量は、喘息および他の呼吸器疾患を有する患者における全体的な肺機能と十分に相関する。よって、ＭＢＶの投与後のピーク呼気流量の、当業者にとって周知の数式によって決定される統計的に有意な増加は、治療法が有効であることを指し示す。
対象は、処置の経過を構成する、ＭＢＶの１回または複数の投与を投与することができる。処置の経過は、全身性投与することができる。処置の経過は、ＡＲＤＳが鎮まるまで１日１回のＭＢＶの投与であり得る。あるいは、処置の経過は、ＡＲＤＳが鎮まるまで１日２回のＭＢＶの投与であり得る。処置の経過は、１回、または数時間の期間にわたり投与することができる。例えば、ＭＢＶは、ボーラスＩＶ投与もしくはボーラス気管滴下注入によって投与することができる、または数分間もしくは数時間にわたる持続性投与のために人工呼吸器もしくは酸素マスクの酸素ストリーム中に注入することができる。例えば、ＭＢＶは、持続性ＩＶ点滴によって投与することができる。
一部の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり約１×１０１～約１×１０２０個のＭＢＶを投与される。対象は、例えば、吸入のため等、マイクロリットル体積へと濃縮された、約１×１０１～約１×１０２個のＭＢＶ等、約１×１０１～約１×１０３個のＭＢＶを投与することができる。例えば、一実施形態では、体積は、５０μＬ～５００μＬである。例えば、一実施形態では、体積は、１００μＬ～３００μＬである。例えば、一実施形態では、体積は、２００μＬ～４００μＬである。例えば、一実施形態では、体積は、３００μＬ～４００μＬである。さらなる実施形態では、体積は、２５０μＬである。さらなる実施形態では、体積は、３００μＬである。より多くの実施形態では、体積は、約１μＬ～約４μＬ、約１μＬ～約３μＬまたは約１μＬ～約２μＬ等、約１μＬ～約５μＬであり得る。一実施形態では、約１×１０１～約１×１０３個のＭＢＶが、約５０～５００μＬの体積で吸入投与のために提供される。
追加的な実施形態において、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり約１×１０６～約１×１０１２個のＭＢＶ等、約１×１０６～約１×１０２０個のＭＢＶ／ｋｇ体重を投与される。実施形態では、対象は、約１×１０６～約１×１０１９個のＭＢＶ、約１×１０６～約１×１０１８個のＭＢＶ、約１×１０６～約１×１０１７個のＭＢＶ、約１×１０６～約１×１０１６個のＭＢＶ、約１×１０６～約１×１０１５個のＭＢＶ、約１×１０６～約１×１０１４個のＭＢＶ、約１×１０６～約１×１０１３個のＭＢＶまたは約１×１０６～約１×１０１２個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり約１×１０７～約１×１０１１個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０７～１×１０８個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０８～１×１０１０個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０９～１×１０１０個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０８個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０７～１×１０９個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０８～１×１０１１個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０９～１×１０１１個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１０～１×１０１１個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１１～１×１０１２個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０１４個のＭＢＶを投与される。別の実施形態では、対象は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１２～１×１０１４個のＭＢＶを投与される。一実施形態では、上述の量のいずれかに従ったＭＢＶの投与は、全身性投与によって為される。例えば、一実施形態では、投与は、静脈内である。別の実施形態では、投与は、吸入によって為される。一実施形態では、吸入は、ネブライザーまたは吸入器ポンプによって為される。
別の実施形態では、ＭＢＶは、鼻腔内投与による設定体積の液体における用量当たりの量で投与される。例えば、一実施形態では、体積は、５０μＬ～５００μＬである。例えば、一実施形態では、体積は、１００μＬ～３００μＬである。例えば、一実施形態では、体積は、２００μＬ～４００μＬである。例えば、一実施形態では、体積は、３００μＬ～４００μＬである。さらなる実施形態では、体積は、２５０μＬである。さらなる実施形態では、体積は、３００μＬである。より多くの実施形態では、体積は、約１μＬ～約４μＬ、約１μＬ～約３μＬまたは約１μＬ～約２μＬ等、約１μＬ～約５μＬであり得る。一実施形態では、約１×１０１～約１×１０３個のＭＢＶが、約５０～５００μＬの体積で鼻腔内投与のために提供される。一実施形態では、対象は、経鼻スプレーポンプによる等、鼻腔内投与のため、食塩水等の５０～２００μＬ担体へと濃縮された約１×１０１～約１×１０３個のＭＢＶを投与される。一実施形態では、投与された全用量が総計で、体重１ｋｇ当たり約１×１０８～約１×１０２０個のＭＢＶの量のＭＢＶを提供するように、対象は、ＭＢＶ濃縮溶液の複数の用量を投与することができる。
一実施形態では、用量におけるＭＢＶの数は、１×１０８～１×１０１０個のＭＢＶである。例えば、一実施形態では、用量におけるＭＢＶの数は、１×１０９個のＭＢＶである。一実施形態では、ＭＢＶは、生理学的に許容される担体、例えば、生理的食塩水中で噴霧される。例えば、噴霧されるべき用量におけるＭＢＶの数は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０２０個のＭＢＶである。例えば、噴霧されるべき用量におけるＭＢＶの数は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０１２個のＭＢＶである。例えば、用量は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０７～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０７～１×１０８個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０８～１×１０１０個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０９～１×１０１０個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０８個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０７～１×１０９個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０８～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０９～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１０～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１１～１×１０１２個のＭＢＶである。
別の実施形態では、ＭＢＶは、気管内投与による設定体積の液体における用量当たり、１×１０７～１×１０１１個のＭＢＶの量で投与される。例えば、一実施形態では、体積は、０．５ｍＬ～５．０ｍＬである。他の実施形態では、体積は、マイクロリットル量である。別の実施形態では、体積は、１ｍＬ～３ｍＬである。例えば、一実施形態では、体積は、２ｍＬ～４ｍＬである。さらに別の実施形態では、体積は、３ｍＬである。例えば、一実施形態では、用量におけるＭＢＶの数は、１×１０８～１×１０１０個のＭＢＶである。例えば、一実施形態では、用量におけるＭＢＶの数は、１×１０９個のＭＢＶである。例えば、一実施形態では、用量におけるＭＢＶの数は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１０～１×１０１１個のＭＢＶである。例えば、一実施形態では、用量におけるＭＢＶの数は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１１～１×１０１２個のＭＢＶである。
別の実施形態では、ＭＢＶは、静脈内投与による設定体積の液体における用量当たり、量１×１０７～１×１０１１個のＭＢＶで投与される。例えば、一実施形態では、体積は、０．５ｍＬ～１０．０ｍＬである。別の実施形態では、体積は、１ｍＬ～５ｍＬである。別の実施形態では、体積は、３ｍＬ～８ｍＬである。さらに別の実施形態では、体積は、３ｍＬである。例えば、一実施形態では、用量におけるＭＢＶの数は、１×１０８～１×１０１０個のＭＢＶである。例えば、一実施形態では、用量におけるＭＢＶの数は、１×１０９個のＭＢＶである。例えば、静脈内投与されるべき用量におけるＭＢＶの数は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０２０個のＭＢＶである。例えば、静脈内投与されるべき用量におけるＭＢＶの数は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０１２個のＭＢＶである。例えば、用量は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０７～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０７～１×１０８個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０８～１×１０１０個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０９～１×１０１０個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０８個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０７～１×１０９個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０８～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０９～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１０～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１１～１×１０１２個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１２～１×１０１４個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１４～１×１０２０個のＭＢＶである。
別の実施形態では、ＭＢＶは、腹腔内投与による設定体積の液体における用量当たり、量１×１０７～１×１０１１個のＭＢＶで投与される。例えば、一実施形態では、体積は、１０ｍＬ～２００ｍＬである。別の実施形態では、体積は、５０ｍＬ～１００ｍＬである。別の実施形態では、体積は、５０ｍＬ～１２５ｍＬである。さらに別の実施形態では、体積は、５０ｍＬである。例えば、一実施形態では、用量におけるＭＢＶの数は、１×１０８～１×１０１０個のＭＢＶである。例えば、一実施形態では、用量におけるＭＢＶの数は、１×１０９個のＭＢＶである。例えば、腹腔内投与されるべき用量におけるＭＢＶの数は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０２０個のＭＢＶである。例えば、用量は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０１２個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０７～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０７～１×１０８個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０８～１×１０１０個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０９～１×１０１０個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０８個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０７～１×１０９個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０８～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０９～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１０～１×１０１１個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１１～１×１０１２個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１２～１×１０１４個のＭＢＶまたは投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０１４～１×１０２０個のＭＢＶである。
一部の実施形態では、投与は、全身性である。全身性投与の例示的な経路は、静脈内投与、経口投与、経腸投与、非経口投与、鼻腔内投与、吸入性投与、気管内投与、直腸投与、舌下投与、頬側投与、腟投与、腹腔内投与、経皮、経粘膜または筋肉内投与を含むがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、全身性投与は、静脈内投与を含む。一部の実施形態では、静脈内投与は、全身性静脈内（ＩＶ）注射を含む。ある特定の実施形態では、ＩＶは、ボーラス注射、持続性点滴またはポンプ注射を含む。一部の実施形態では、全身性静脈内注射は、標準ＩＶラインまたは中心ラインの使用を含む。ある特定の実施形態では、標準ＩＶラインは、手首、腕または手の静脈内に配置される。ある特定の実施形態では、中心ラインは、末梢挿入中心カテーテル（ＰＩＣＣ）、鎖骨下ライン、内部頸静脈ライン（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｊｕｇｕｌａｒ ｌｉｎｅ）、大腿ライン、トンネル型カテーテルまたは植え込み型ポートからなる群より選択される。特定の実施形態では、予想される長期治療法、すなわち、長期入院による患者、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者は、全身性静脈内注射のための中心ラインに配置される。
一部の実施形態では、投与は、例えば、肺への局所的なものである。例えば、投与は、鼻および／または口を経由した吸入性である。例えば、投与は、気管内である。ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者において、例えば、気管内投与または鼻および／もしくは口による吸入性投与を使用することができる。
吸入性投与は、口腔および／または鼻腔を通して媒介することができる。ある特定の実施形態では、吸入は、ＭＢＶを含む医薬組成物のエアロゾル投与により容易にされる。一部の実施形態では、吸入は、ネブライザーまたは吸入器（例えば、定量吸入器または乾燥粉末吸入器）の補助を含む。一部の実施形態では、投与は、液体ミストの吸入を含む。一部の実施形態では、投与は、固体形態の吸入による。ある特定の実施形態では、固体は、ナノサイズであり、ナノ粒子、ナノダイヤモンドもしくはナノカーボンと組み合わせて製剤化される、またはリポソームもしくはリポソームに基づくパッケージ中にパッケージされる。一部の実施形態では、全身性投与は、気管内滴下注入としても公知の気管内投与を含む。ある特定の実施形態では、ＭＢＶの全身性投与は、それを必要とする対象、例えば、重度ＡＲＤＳを有する対象、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する重度ＡＲＤＳを有する対象の肺への急速投与のための気管内チューブを経由した投与を含む。
吸入による投与のため、ＭＢＶは、適した噴霧体、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスの使用により、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレー提示の形態で簡便に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを設けることにより決定することができる。吸入器または吹送器（insufflator）における使用のためのカプセルおよびカートリッジは、化合物と、ラクトースまたはデンプン等の適した粉末基剤との粉末ミックスを含有して製剤化することができる。吸入性調製物は、エアロゾル、微粒子その他を含むことができる。一般に、医薬品が、吸収のための肺の肺胞領域に達することができるように、吸入のための粒子サイズのための目標は、約１μｍまたはそれ未満である。しかし、粒子サイズは、肺における配置領域を調整するために修飾することができる。よって、より大きい粒子を利用（約１～約５μｍの直径等）して、呼吸細気管支および気腔における沈着を達成することができる。
活性成分として本明細書に記載されているＭＢＶを含む医薬組成物は通常、選ばれた特定の投与様式に応じて適切な固体または液体担体と共に製剤化されるであろう。例えば、水、生理食塩水、他の平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールその他等、薬学的にかつ生理学的に許容される流体ビヒクルは、注射用製剤、または噴霧もしくはエアロゾル化製剤のために使用することができる。含まれ得る賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物等のタンパク質である。所望に応じて、投与されるべき医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存料およびｐＨ緩衝化剤その他、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート（sorbitan monolaurate）等、少量の無毒性補助物質を含有することもできる。斯かる剤形を調製する実際の方法は、公知である、または当業者には明らかであろう。
ＭＢＶを含む医薬組成物は、一部の実施形態では、正確な投薬量の個々の投与に適した単位剤形で製剤化されるであろう。投与される活性化合物（複数可）の量は、処置されている対象、疾患の重症度および投与様式に依存するであろう、また、処方臨床医の判断に委ねられることが最良である。これらの限界内で、投与されるべき製剤は、処置されている対象において所望の効果を達成するのに有効な量で、活性構成成分（複数可）の含量を含有するであろう。
例として、個体の肺への投与の一方法は、ネブライザーまたは吸入器の使用による吸入による。例えば、ＭＢＶは、エアロゾルまたは微粒子において製剤化され、当業者にとって周知の標準ネブライザーを使用して肺内に引き込まれる。
投薬量処置は、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０１２個のＭＢＶ（すなわち、小胞の絶対数）を最終的に送達するための単一の用量スケジュールまたは複数の用量スケジュールであり得る。投与は、単一の投与、定期的ボーラスとして、または持続放出薬物もしくは薬物送達デバイスからの特異的な期間にわたる持続性放出による等の持続性注入として提供することができる。対象は、適切な数の用量を投与することができる。複数の用量が投与される場合、投与は、間欠的であり得る。例としての実施形態では、治療有効量のＭＢＶの投与（全身性投与、例えば、静脈内投与または他のいずれかの投与経路等）は、１回行うことができる、または１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０回等、反復して行うことができる。例としての実施形態では、投与は、ＡＲＤＳの症状が鎮まるまで、１日１回、１日２回、２日ごとに行うことができる。他の実施形態では、単一の投与のみが、治療利益の達成に要求される。
個々の用量は典型的に、対象における測定可能な効果の産生に要求される量以上のものであり、対象組成物またはその副産物の吸収、分布、代謝および排泄（「ＡＤＭＥ」）のための薬物動態および薬理学に基づき、よって、対象内の組成物の配置に基づき決定することができる。これは、投与経路、ならびに局所および全身性（例えば、静脈内）適用のために調整され得る投薬量の量の考慮を含む。用量の有効量および／または用量レジメンは、前臨床アッセイ、安全性および漸増および用量範囲治験、個々の臨床医－患者関係性ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイから経験的に容易に決定することができる。一般に、これらのアッセイは、炎症性障害（脳炎またはアトピー性皮膚炎等）を評価するであろう。
治療有効量のＭＢＶは、薬学的に許容される担体に（医薬調製物中等）、例えば、約３．０～約８．０のｐＨ、好ましくは、約３．５～約７．４、３．５～６．０または３．５～約５．０のｐＨの等張性緩衝溶液に懸濁することができる。有用な緩衝液は、クエン酸ナトリウム－クエン酸およびリン酸ナトリウム－リン酸および酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液を含む。保存料および抗細菌剤等、他の薬剤を組成物に添加することができる。このような組成物は、静脈内等、局所または全身性投与することができる。
治療有効量のＭＢＶを含む医薬調製物は、正確な投薬量の個々の投与に適した単位剤形で製剤化することができる。投与される活性化合物（複数可）の量は、処置されている対象、苦痛の重症度および投与様式に依存するであろう、また、処方臨床医の判断に委ねられることが最良である。これらの限界内で、投与されるべき製剤は、処置されている対象において所望の効果を達成するのに有効な量で、活性構成成分（複数可）の含量を含有するであろう。一部の実施形態では、ＭＢＶによる処置は、投与時に存在する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の徴候または症状の減少または低下をもたらす。
一部の例では、ＭＢＶによる処置は、ＭＢＶの投与前の炎症のレベルよりも、対象における炎症の減少または低下をもたらすことができる。一部の例では、ＭＢＶによる処置は、ＡＲＤＳ、例えば、ウイルス感染症、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に関連するＡＲＤＳの徴候または症状の低下または排除をもたらすことができる。
併用療法
本発明のＭＢＶ処置方法は、単独療法として、または疾患もしくは障害、例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）もしくはＡＲＤＳに関連する感染症の処置に使用することができる１種もしくは複数の他の治療法（例えば、抗ウイルス剤等の抗感染剤）と組み合わせて使用することができる。用語「組合せ（併用）」は、本明細書で使用される場合、ある時点で患者における処置の効果が重複するように、２種またはそれよりも多い異なる処置が、障害による対象の苦痛の経過中に対象に送達されることを意味するものと理解される。ある特定の実施形態では、投与の観点から重複が生じるように、第２の処置の送達が始まるときに、１種の処置の送達はまだ起こっている。これは時に、「同時」または「同時発生的送達」と本明細書で称される。他の実施形態では、他の処置の送達が始まる前に、１種の処置の送達は終わる。いずれかの場合のある特定の実施形態では、組み合わせた投与のため、処置は、より有効である。例えば、第２の処置は、より有効である、例えば、少ない第２の処置により、等価の効果が見られる、または第２の処置は、第１の処置の非存在下で第２の処置が投与された場合に見られるよりも大きい程度で、症状を低下させる、または第１の処置と類似の状況が見られる。ある特定の実施形態では、送達は、障害に関係する症状または他のパラメーターの低下が、他の処置の非存在下で送達される１種の処置により観察されるものよりも大幅であるようなものである。２種の処置の効果は、部分的に相加的、完全に相加的または相加的よりも大きくなることができる。送達は、第２の処置が送達されたときに、送達された第１の処置の効果が、まだ検出可能であるようなものであり得る。
対象は、同じまたは異なる組成物または医薬調製物において追加的な治療剤を投与することができる。一部の実施形態では、対象は、ＡＲＤＳを有し、対象は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ、例えば、アスピリン、イブプロフェンおよびナプロキセン）、抗ロイコトリエン剤（antileukotriene）、免疫選択的抗炎症薬誘導体（ＩｍＳＡＩＤ）、生理活性化合物、ステロイド（コルチコステロイド等）およびオピオイド等、抗炎症剤等の追加的な治療剤を投与される。
したがって、ある特定の実施形態では、対象は、疾患または障害の処置における使用に適した１種または複数の他の治療法を受けた、受けている、または受ける予定である。ある特定の実施形態では、本発明の処置方法は、疾患または障害、例えば、感染症の処置における使用に適した１種または複数の他の治療法を対象に投与するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、１種または複数の他の治療法は、細胞内病原体による感染症の１種または複数の症状を改善する薬剤を含む。ある特定の実施形態では、１種または複数の他の治療法は、感染した組織の外科的除去を含む。
本明細書に開示されている使用方法は、細胞内病原体に関連する疾患または障害の１種または複数の症状を改善する薬剤、例えば、抗感染剤と組み合わせて使用することができることが理解される。例えば、本明細書に開示されている使用方法は、抗ウイルス剤と組み合わせて使用することができる。
細胞内病原体による感染症の処置に適した治療法は一般に、当技術分野で公知であり、例えば、Kamaruzzaman et al. (2017) Br. J. Pharmacol. 174(14): 2225-36およびDe Clercq et al. (2016) Clin. Microbiol. Rev. 29(3): 695-747によって概説されている。ある特定の実施形態では、抗感染剤は、細胞内病原体の生存率、増殖、感染力および／またはビルレンスを阻害または低下させる。細胞内病原体は、潜伏状態で宿ることにより、免疫監視および負荷（challenge）を逃れることができる。したがって、ある特定の実施形態では、宿主の免疫系によって感染が認識され得るように、抗感染剤は、細胞内病原体の潜伏を逆転させる。
ある特定の実施形態では、細胞内病原体は、ウイルスであり、抗感染剤は、抗ウイルス剤である。組合せにおいて使用することができる例示的な抗ウイルス剤は、アバカビル、アシクロビル、アデホビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドホビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、エトラビリン、ファムシクロビル、ファビピラビル、ホスカルネット、ホミビルセン、ガンシクロビル、インジナビル、イドクスウリジン、ラミブジン、ロピナビル、マラビロク、ＭＫ－２０４８、ネルフィナビル、ネビラピン、ペンシクロビル、ラルテグラビル、リルピビリン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、テノホビルトリフルリジン、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビダラビン、イバシタビン、アマンタジン、オセルタミビル、リマンタジン（rimantidine）、チプラナビル、ザルシタビン、ザナミビル、ペラミビル、ダノプレビル、レムデシビルおよびジドブジンを含むがこれらに限定されない。特に、細胞内病原体がＨＩＶである場合、組合せにおいて使用することができる例示的な抗ＨＩＶ剤は、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（例えば、ラミブジン、アバカビル、ジドブジン、スタブジン、ジダノシン、エムトリシタビンおよびテノホビル）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリンおよびネビラピン）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、アンプレナビル、ホスアンプレナビル、アタザナビル、ダルナビル、インジナビル、ロピナビル、リトナビル、ネルフィナビル、サキナビルおよびチプラナビル）、融合または侵入阻害剤（例えば、エンフビルチドおよびマラビロク）、インテグラーゼ阻害剤（例えば、ラルテグラビルおよびカボテグラビル）および潜伏反転剤（latency-reversing agent）（例えば、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ボリノスタット）およびＴＬＲ７アゴニスト（例えば、ＧＳ－９６２０、例えば、米国特許公開番号ＵＳ２０１６０００８３７４Ａ１に記載されている通り））を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２であり、併用療法は、ヒドロキシクロロキンを含む。ある特定の実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２であり、併用療法は、抗ウイルス剤を含む。ある特定の実施形態では、ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２であり、併用療法は、二次感染症に対する予防的処置として抗細菌剤を含む。
ある特定の実施形態では、細胞内病原体は、細菌であり、抗感染剤は、抗細菌剤である。組合せにおいて使用することができる例示的な抗細菌剤は、アジスロマイシン、バンコマイシン、メトロニダゾール、ゲンタマイシン、コリスチン、フィダキソマイシン、テラバンシン、オリタバンシン、ダルババンシン、ダプトマイシン、セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフトビプロール、シプロ（cipro）、レバキン（Levaquin）、フロキシン（floxin）、テキン（tequin）、アベロックス、ノルフロックス（norflox）、テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン、アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、メチシリン、エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、パロモマイシン、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォキソチン（cefoxotin）およびストレプトマイシンを含むがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、細胞内病原体は、真菌であり、抗感染剤は、抗真菌剤である。組合せにおいて使用することができる例示的な抗真菌剤は、ナタマイシン、リモシジン（rimocidin）、フィリピン、ニスタチン、アンホテリシンＢ、カンジシン（candicin）およびハミシン（hamycin）、ミコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、オモコナゾール、ビホナゾール、ブトコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、フルコナゾール、イトラコナゾール、イサブコナゾール、ラブコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾール、テルコナゾールおよびアルバコナゾール、アバファンギン（abafungin）、テルビナフィン、ナフチフィン、ブテナフィン、アニデュラファンギン、カスポファンギン、ミカファンギン、ポリゴジアール（polygodial）、安息香酸、シクロピロクス、トルナフテート、ウンデシレン酸、フルシトシンまたは５－フルオロシトシン、グリセオフルビンおよびハロプロジンを含むがこれらに限定されない。
ある特定の実施形態では、細胞内病原体は、原生動物であり、抗感染剤は、抗原生動物剤である。組合せにおいて使用することができる例示的な抗原生動物剤は、キニーネ（必要に応じてクリンダマイシンと組み合わせた）、クロロキン、アモジアキン、アルテミシニンおよびその誘導体（例えば、アルテメテル、アーテスネート、ジヒドロアルテミシニン、アルテテル）、ドキシサイクリン、ピリメタミン、メフロキン、ハロファントリン、ヒドロキシクロロキン、エフロルニチン、ニタゾキサニド、オルニダゾール、パロモマイシン、ペンタミジン、プリマキン、ピリメタミン、プログアニル（必要に応じてアトバコンと組み合わせた）、スルホンアミド（例えば、スルファドキシン、スルファメトキシピリダジン）、タフェノキン（tafenoquine）およびチニダゾールを含むがこれらに限定されない。具体的な実施形態では、細胞内病原体は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（例えば、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｏｖａｌｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）であり、抗感染剤は、抗マラリア剤である。組合せにおいて使用することができる例示的な抗マラリア剤は、キニーネ（必要に応じてクリンダマイシンと組み合わせた）、クロロキン、アモジアキン、アルテミシニンおよびその誘導体（例えば、アルテメテル、アーテスネート、ジヒドロアルテミシニン、アルテテル）、ドキシサイクリン、ハロファントリン、メフロキン、プリマキン、プログアニル（必要に応じてアトバコンと組み合わせた）、スルホンアミド（例えば、スルファドキシン、スルファメトキシピリダジン）、タフェノキンを含むがこれらに限定されない。これらの抗マラリア剤は、ＡＲＤＳを処置するためにＭＢＶと組み合わせて使用することができる。
ＡＲＤＳまたはＡＲＤＳに関連する高サイトカイン血症の処置における併用療法の一部として使用することができる薬剤の追加的なクラスは、抗炎症剤および／または免疫抑制剤、例えば、サイトカイン阻害剤、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤またはステロイドである：一部の実施形態では、抗炎症剤は、カルシニューリン阻害剤、例えば、タクロリムスおよびシクロスポリンを含む。一部の実施形態では、抗炎症剤は、ｍＴＯＲ阻害剤、例えば、シロリムスを含む。一部の実施形態では、抗炎症剤は、ステロイド、例えば、プレドニゾンを含む。一部の実施形態では、抗炎症剤は、サイトカイン阻害剤、例えば、ＩＬ－６アンタゴニスト、ＩＬ－１アンタゴニスト、可溶性腫瘍壊死因子受容体、ＩＬ－１受容体アゴニストおよびＴＧＦ－β１潜伏関連ペプチドを含む。ある特定の実施形態では、サイトカイン阻害剤は、トシリズマブ、サリルマブ、アナキンラまたはシルツキシマブを含む。ある特定の実施形態では、抗炎症剤は、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤、例えば、トファシチニブ、ルキソリチニブまたはバリシチニブを含む。
適切な治療法は、特異的感染症の診断に従って選択することができる。対象が、複数の病原体（例えば、複数の細胞内病原体、例えば、複数のウイルス感染症、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２および二次感染症）に感染している場合、これらの感染症を処置するための２種またはそれよりも多い適切な治療法を、本明細書に開示されているＭＢＶ療法と組み合わせて使用することができる。
一実施形態では、本発明の組成物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する抗体療法、例えば、バムラニビマブ、エテセビマブ、カシリビマブもしくはイムデビマブまたはこれらの組合せによる併用療法の一部として使用される。
一部の実施形態では、方法は、治療利益が達成されたことを検出するステップを含む。治療有効性の尺度は、修飾されている特定の疾患に適用可能となり、当業者は、治療有効性の測定に使用するための適切な検出方法を認識するであろう。対象は、当技術分野で公知のいずれかの方法を使用して、応答について評価され得る。例としての実施形態では、対象は、炎症性障害（脳炎またはアトピー性皮膚炎等）を有し、対象における治療応答は、白血球数、多形核好中球（ＰＭＮ）の数、ＰＭＮ活性化の程度（ルミノール増強ケミルミネッセンス等）、サイトカインの量、Ｃ反応性タンパク質および当技術分野で公知の他の尺度によって測定することができる。
用語
用語および方法の次の説明は、本開示をより十分に表し、本開示の実施において当業者を導くために示される。単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、１個または１個超を指す。例えば、用語「１つの細胞（a cell）を含む」は、単一のまたは複数の細胞を含み、語句「少なくとも１個の細胞を含む」と均等と考えられる。用語「または／もしくは」は、文脈がそれ以外を明らかに指し示さない限り、記述されている二者択一の（alternative）エレメントまたは２個もしくはそれよりも多いエレメントの組合せのうち単一のエレメントを指す。本明細書で使用される場合、「を含む（comprises）」は、「を含む（includes）」を意味する。よって、「ＡまたはＢを含む（comprising）」は、追加的なエレメントを除外することなく、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含む（including）」を意味する。本明細書に参照されているＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号の日付は、少なくとも早くも２０１５年９月１６日には利用できる配列である。本明細書に引用されているあらゆる参考文献、特許出願および刊行物ならびにＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号は、参照により本明細書に組み込まれる。他に指示がなければ、「約」は、５パーセント以内を指し示す。本開示の様々な実施形態の概説を容易にするために、特異的な用語の次の説明が示される：
急性呼吸窮迫症候群：急性呼吸窮迫症候群または「ＡＲＤＳ」は、肺における広汎な炎症の急速な開始によって特徴付けられる呼吸不全の一型を指し、重度低酸素血症が特徴症状である。徴候および症状は通常、原因となる事象の数時間以内であるが、数日間または最大１週間以内に起こり得る。ＡＲＤＳにおいて、流体は、肺における最小の血管から肺の肺胞へと漏出する。正常生理学において、肺胞毛細血管膜は、斯かる流体から肺を保護する。しかし、肺胞毛細血管膜への重度肺および／または全身性損傷の場合、膜が損なわれるようになり、ＡＲＤＳをもたらす場合がある。ある特定の実施形態では、ＡＲＤＳは、肺感染症に関連する。
ＡＲＤＳの症状は、息切れ、速い呼吸、減少した血液酸素化、頭痛、低血圧、発熱、咳、錯乱、極度の疲労、ならびに低酸素血症により変色した皮膚および／または爪を限定することなく含むことができる。ＡＲＤＳは、酸素および二酸化炭素を交換する肺の能力を損なう。ＡＲＤＳ患者の胸部Ｘ線検査は、例えば、両方の肺における広汎な「すりガラス（ground-glass）」に見える陰影により、肺における両側性浸潤を明らかにする。診断の観点から、ベルリン（Berlin）判断基準に従って、５ｃｍ Ｈ２Ｏ超の呼気終末陽圧換気（ＰＥＥＰ）にもかかわらず、ＰａＯ２／ＦｉＯ２（動脈酸素の分圧および吸入酸素の分率の比）が３００ｍｍ Ｈｇ未満の場合、ＡＲＤＳが診断される。軽症例では、ＰａＯ２／ＦｉＯ２は、２００ｍｇ Ｈｇ超かつ３００ｍｇ未満である。中等症例では、ＰａＯ２／ＦｉＯ２は、１００ｍｇ Ｈｇ超かつ２００ｍｇ未満である。重症例では、ＰａＯ２／ＦｉＯ２は、１００ｍｍ Ｈｇ未満である。一次処置は、酸素の投与および／または機械的人工呼吸を伴う。
投与：選ばれた経路による対象への組成物（ＭＢＶまたはＭＢＶを含む医薬調製物等）の導入。経路は、局所または全身性であり得る。例えば、選ばれた経路が静脈内である場合、組成物は、対象の静脈へと組成物を導入することにより投与される。選ばれた経路が局所的なものである場合、組成物は、対象の組織へと直接的に組成物を導入することにより投与することができる。
動物：例えば、哺乳動物およびトリを含むカテゴリーである、生きている多細胞の脊椎のある生物。用語「哺乳動物」は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、用語「対象」は、ヒトおよび獣医学対象の両方を含む。
関節炎：関節炎は、身体における１個または複数の関節の滑膜が罹患する炎症性疾患である。これは、最も一般的な型の関節疾患であり、関節の炎症によって特徴付けられる。この疾患は通常、少数関節性（oligoarticular）（数個の関節に罹患する）であるが、全般性となる場合もある。一般的に関与する関節は、股関節、膝関節、下部腰椎および頸椎、手指の近位および遠位指節間関節、第一手根中手関節、ならびに足の第一足根中足関節を含む。症状は、罹患関節の関節痛および硬直、発赤、温感、腫脹および減少した可動域を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されている組成物および方法を使用して、関節炎を処置することができる。関節炎の型は、関節リウマチおよび乾癬性関節炎を限定することなく含む。
生体適合性：哺乳動物対象に植え込まれたときに、対象において有害な応答を引き起こさない、いずれかの材料。生体適合性材料は、個体の中に導入されたときに、その意図される機能を行うことができ、当該個体にとって毒性でも傷害性でもなく、対象において材料の免疫学的拒絶を誘導することもない。
濃縮された：プロセスを指し、これによって、混合物中に存在するナノ小胞等の目的の構成成分は、濃縮プロセス前と比較して、濃縮プロセス後に、当該混合物における当該構成成分の量の他の望まれない構成成分の量に対する比が増加する。
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）：組織内で細胞を取り囲み支持し、他に指示がなければ、無細胞である、構造タンパク質、特殊化タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンおよび増殖因子を含むがこれらに限定されない、構造および機能的な生体分子および／または生体高分子の複合混合物。ＥＣＭ調製物は、本明細書に記載されておりかつ当技術分野で公知のプロセスにより供給源組織から細胞が除去されたことを意味する、「脱細胞化された」または「無細胞」であると考えることができる。「ＥＣＭ由来ナノ小胞」、「マトリックス結合ナノ小胞」、「ＭＢＶ」または「ＥＣＭに由来するナノ小胞」等の「ＥＣＭ由来材料」とは、天然のＥＣＭから、または培養細胞によってＥＣＭが産生されるｉｎ ｖｉｔｒｏ供給源から調製されたナノ小胞である。ＥＣＭ由来ナノ小胞は、下に定義されている。
高サイトカイン血症または「サイトカイン放出症候群」：「サイトカインストーム」または「サイトカインストーム症候群」としても当技術分野で公知の、免疫系の急性過剰反応；斯かる免疫応答は、感染性疾患または障害から生じ得る全身性炎症性応答症候群である。病原性炎症の正のフィードバックループにおいて、多数の白血球細胞が活性化され、炎症性サイトカインを放出し、これが次いでさらにより多くの白血球細胞を活性化すると、高サイトカイン血症が起こる。加えて、免疫細胞上のその同族受容体に結合する炎症促進性サイトカインは、さらなるサイトカイン産生の活性化および刺激をもたらす。高サイトカイン血症病理は、局所部位において始まり、例えば、全身性循環経由で身体全体にわたり伝播する炎症に関連し、多臓器不全をもたらし得る。ウイルス感染症から生じる高サイトカイン血症病理は、急性肺傷害および急性呼吸窮迫症候群に関連する。高サイトカイン血症病理は、例えば、Tisonick et al., (2012) "Into the Eye of the Cytokine Storm," Microbiol. Mol. Biol. Rev., 76(1):16-32に記載されている。過剰に放出されるサイトカインは、例えば、ＩＬ－６、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－８（ＣＸＣＬ８）、ＩＬ－１０、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＩＰ－１α／β、ＭＣＰ－１（ＣＣＬ２）、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０を含むことができるがこれらに限定されない。
感染：宿主、例えば、患者内に正常には存在しない、または宿主における特定の場所に正常には存在しないが宿主における別の場所に侵入する（例えば、消化管内に正常に存在する病原体が、尿路に進入する場合、または皮膚表面に正常に存在する病原体が、血流に進入する場合）、病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌または原生動物の侵入および増殖を指す。感染は、症状を引き起こさず、無症状性であり得る、または症状を引き起こし、臨床的に明らかであり得る。感染は、局在化されたままであり得る、または例えば、血管またはリンパ管を通って伝播して、全身性であり得る。
炎症：炎症は、炎症性因子を隔離するように働く、組織への傷害によって誘発される局在化された防御応答である。炎症は、病原体、損傷した細胞または刺激物等、有害な刺激に対する脈管組織の複雑な生物学的応答によって編成される。これは、生物による、傷害性刺激を除去すると共に、組織のための治癒プロセスを惹起する防御的な試みである。炎症性応答は、全身性の、または炎症部位における局所の、白血球細胞の蓄積によって特徴付けられる。炎症性応答は、白血球細胞の数、多形核好中球（ＰＭＮ）の数、ルミノール増強ケミルミネッセンス等のＰＭＮ活性化の程度の尺度、または存在するサイトカインの量の尺度の測定を含むがこれらに限定されない、多くの方法によって測定することができる。Ｃ反応性タンパク質は、全身性炎症性応答のマーカーである。
炎症性障害は、炎症が正常なまたは通常の生理学的機能を破壊する障害の一属である。炎症性障害は、自己免疫性障害（内在性抗原に対する不適切な炎症性応答）、および外傷または外来性抗原による炎症に起因する障害等、種々の状態を含むことができる。原発性炎症性障害は、炎症それ自体に起因する疾患または障害である。続発性炎症性障害は、別の障害の結果である炎症である。炎症は、炎症性障害、例えば、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）をもたらすことができる。
一部の実施形態では、炎症性疾患または障害、例えば、ＡＲＤＳを処置するために、抗炎症剤が投与される。抗炎症剤は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ、例えば、アスピリン、イブプロフェンおよびナプロキセン）、抗ロイコトリエン剤、免疫選択的抗炎症薬誘導体（ＩｍＳＡＩＤ）、生理活性化合物、ステロイド（コルチコステロイド等）およびオピオイドを限定することなく含む。
インフルエンザ：インフルエンザ（「フルー（flu）」としても公知）は、インフルエンザウイルスに起因する感染性疾患である。３つの型のインフルエンザウイルスが、ヒトに感染することができる：Ａ型、Ｂ型およびＣ型；Ｄ型は、ヒトに感染することが示されていない。インフルエンザウイルスは、高度に伝染性である；非限定的な例では、インフルエンザウイルスは、感染した個体の咳またはくしゃみの飛沫（air in droplet）を介して伝播される。インフルエンザは、毎年の大流行において世界的に伝播し、重度疾病の約３００万～５００万件の症例および約２９０，０００～６５０，０００人の死亡をもたらす（"Influenza (Seasonal)". World Health Organization (WHO). 6 November 2018）。高リスクの人について、世界保健機関（World Health Organization）（ＷＨＯ）によってインフルエンザに対する毎年のワクチン接種が推奨されている。毒性インフルエンザ株のより大規模な世界的大流行が起こり得る、例えば、１９１８年のスペイン風邪（Spanish influenza）（１７００万～１億人の死亡をもたらした）、１９５７年のアジアインフルエンザ（２００万人の死亡をもたらした）、および１９６８年の香港（Hong Kong）インフルエンザ（１００万人の死亡をもたらした）。２００９年６月に、ＷＨＯは、インフルエンザＡ、Ｈ１Ｎ１（「ブタインフルエンザ」としても公知）の新型の大流行が、パンデミックであることを宣言した（Chan M. (2009). "World now at the start of 2009 influenza pandemic". World Health Organization (WHO). Archived from the original on 12 June 2009）。インフルエンザ感染症の症状は、発熱、鼻汁、咽頭炎、筋肉および関節痛、頭痛、咳ならびに疲労を限定することなく含む。ある特定の実施形態では、インフルエンザは、ウイルス性肺炎に関連する。ある特定の実施形態では、インフルエンザは、続発性細菌性肺炎に関連する。
単離された：「単離された」生物学的構成成分（核酸、タンパク質、細胞またはナノ小胞等）は、構成成分が天然に存在する生物の細胞またはＥＣＭにおける他の生物学的構成成分から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。単離されたＭＢＶは、ＥＣＭの線維性材料から除去されている。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸も包含する。
リジルオキシダーゼ（Ｌｏｘ）：コラーゲンおよびエラスチン前駆体におけるリシン残基からアルデヒドの形成を触媒する銅依存性酵素。このようなアルデヒドは、高度に反応性であり、他のリジルオキシダーゼ由来アルデヒド残基または無修飾リシン残基と自発的な化学反応を起こす。ｉｎ ｖｉｖｏでは、この反応は、コラーゲンおよびエラスチンの架橋をもたらし、この架橋は、コラーゲン原線維の安定化におけるならびに成熟エラスチンの完全性および弾性のための役割を果たす。コラーゲン（３個のリシン残基に由来するピリジノリン）およびエラスチン（４個のリシン残基に由来するデスモシン）において複雑な架橋が形成され、これらは構造が異なる。種々の生物からＬｏｘ酵素をコードする遺伝子がクローニングされた（Hamalainen et al., Genomics 11:508, 1991；Trackman et al., Biochemistry 29:4863, 1990；参照により本明細書に組み込まれる）。ヒトリジルオキシダーゼの配列の残基１５３～４１７および残基２０１～４１７が、触媒機能に重要であることが示された。ＬｏｘＬ１、ＬｏｘＬ２、ＬｏｘＬ３およびＬｏｘＬ４と呼ばれる４種のＬｏｘ様アイソフォームが存在する。
マクロファージ：細胞デブリ、異物、微生物およびがん細胞を貪食および分解する白血球細胞の一型。ファゴサイトーシスにおけるその役割に加えて、このような細胞は、発生、組織維持および修復における、ならびにリンパ球等の免疫細胞を含む他の細胞を動員し影響を与えるという点において、自然および適応免疫の両方における重要な役割を果たす。マクロファージは、Ｍ１およびＭ２と称されてきた表現型を含む多くの表現型で存在することができる。主に炎症促進性機能を果たすマクロファージは、Ｍ１マクロファージ（ＣＤ８６＋／ＣＤ６８＋）と呼ばれ、一方、炎症を減少させ、組織修復を促し調節するマクロファージは、Ｍ２マクロファージ（ＣＤ２０６＋／ＣＤ６８＋）と呼ばれる。マクロファージの様々な表現型を同定するマーカーは、種間で変動する。マクロファージ表現型が、Ｍ１およびＭ２の両極端の間の範囲に及ぶスペクトルによって表されることに留意されたい。Ｆ４／８０（接着型Ｇタンパク質共役受容体Ｅ１（ＡＤＧＲＥ１）遺伝子によってコードされる）は、マクロファージマーカーである。両者共に参照により本明細書に組み込まれる、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＰ＿００１２４３１８１．１、２０１８年４月６日、およびＮＰ＿００１９６５、２０１８年３月５日を参照されたい。理論に制約されることは望まないが、ＭＢＶが、マクロファージの表現型をモジュレートする能力を有し、Ｍ２様、調節性またはリモデリング促進性マクロファージの増加をもたらすと考えられる。マクロファージにおけるＭＢＶの効果は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１５１８６２Ａ１においてさらに特徴付けられる。一部の実施形態では、本発明のＭＢＶを使用して、マクロファージにおけるＭ２表現型を誘導し、対象におけるＭ１マクロファージを阻害することができる。
マイクロＲＮＡ：標的ｍＲＮＡ翻訳を典型的に抑制することにより遺伝子発現を転写後調節する、約１７～約２５ヌクレオチド塩基の長さである小分子非コードＲＮＡ。より多量の特異的ｍｉＲＮＡが、より低レベルの標的遺伝子発現と相関することになるように、ｍｉＲＮＡは、負の制御因子として機能することができる。ｍｉＲＮＡの３種の形態、一次ｍｉＲＮＡ（pri-ｍｉＲＮＡ）、未熟ｍｉＲＮＡ（pre-ｍｉＲＮＡ）および成熟ｍｉＲＮＡが存在する。一次ｍｉＲＮＡ（pri-ｍｉＲＮＡ）は、約数百塩基～１ｋｂ超のステムループ構造の転写物として発現される。pri-ｍｉＲＮＡ転写物は、ステムループの基部付近でステムの両方の鎖を切断するドローシャと呼ばれるＲＮａｓｅ ＩＩエンドヌクレアーゼによって核内で切断される。ドローシャは、互い違いのカット(staggered cut)でＲＮＡ二重鎖を切断し、５’リン酸および３’末端における２ヌクレオチドオーバーハングを残す。切断生成物、未熟ｍｉＲＮＡ（pre-ｍｉＲＮＡ）は、折り返す（fold-back）様式で形成されたヘアピン構造を有する約６０～約１１０ヌクレオチド長である。pre-ｍｉＲＮＡは、Ｒａｎ－ＧＴＰおよびエクスポーチン－５によって核から細胞質へと輸送される。pre-ｍｉＲＮＡは、ダイサーと呼ばれる別のＲＮａｓｅ ＩＩエンドヌクレアーゼによって細胞質においてさらにプロセシングされる。ダイサーは、５’リン酸および３’オーバーハングを認識し、ステムループ接合部からループを切断して、ｍｉＲＮＡ二重鎖を形成する。ｍｉＲＮＡ二重鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合し、そこで、アンチセンス鎖が優先的に分解され、センス鎖成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＩＳＣをその標的部位に方向付ける。これが、ｍｉＲＮＡの生物学的に活性がある形態であり、約１７～約２５ヌクレオチドの長さである、成熟ｍｉＲＮＡである。
ナノ小胞：約１０～約１，０００ｎｍの直径のナノ粒子である細胞外小胞。ナノ小胞は、いくつかある分子の中でもとりわけ、生物学的に活性があるシグナル伝達分子（例えば、マイクロＲＮＡ、タンパク質）を運搬する、脂質膜結合粒子である。一般に、ナノ小胞は、脂質二重層によって限定され、生物学的分子は、二重層に封入されるおよび／または包埋され得る。よって、ナノ小胞は、原形質膜によって取り囲まれた腔を含む。小胞の異なる型は、細胞外マトリックス由来または分泌された等、直径、細胞内起源（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｒｉｇｉｎ）、密度、形状、沈降速度、脂質組成、タンパク質マーカー、核酸含量および起源に基づき区別することができる。ナノ小胞は、ＥＣＭ由来のマトリックス結合ナノ小胞等のその起源（上述を参照）、タンパク質含量および／またはｍｉＲ含量によって同定することができる。
「エキソソーム」または「液相細胞外小胞（ＥＶ）」は、細胞によって分泌される膜性小胞であり、直径１０～１５０ｎｍの範囲に及ぶ。一般に、後期エンドソームまたは多胞体は、限定されたエンドソーム膜からこのような封入された小胞への、小胞の内向き出芽および分断によって形成された腔内（ｉｎｔｒａｌｕｍｅｎａｌ）小胞を含有する。次に、このような腔内小胞は、原形質膜との融合後のエキソサイトーシスの際に、多胞体腔から細胞外環境へと、典型的には、血液、脳脊髄液または唾液等の体液へと放出される。膜のセグメントが陥入し、エンドサイトーシスされる場合、エキソソームは、細胞内に創出される。より小型の小胞へと破壊され最終的に細胞から排出される、内部移行されたセグメントは、タンパク質ならびにｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ等のＲＮＡ分子を含有する。血漿由来エキソソームは、大部分はリボソームＲＮＡを欠如する。細胞外マトリックス由来エキソソームは、特異的ｍｉＲＮＡおよびタンパク質構成成分を含み、血液、尿、唾液、精液および脳脊髄液等、事実上全ての体液に存在することが示された。エキソソームは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６３、ＣＤ８１および／またはＣＤ９を発現することができ、よって、ＣＤ１１ｃ＋および／またはＣＤ６３＋および／またはＣ８１＋および／またはＣＤ９＋であり得る。エキソソームは、その表面に高レベルのリジルオキシダーゼを有しない。
「ＥＣＭに由来するナノ小胞」、「マトリックス結合ナノ小胞」、「ＭＢＶ」または「ＥＣＭ由来ナノ小胞」は全て、細胞挙動に影響を与えるタンパク質、脂質、核酸、増殖因子およびサイトカイン等の生物学的に活性があるシグナル伝達分子を含有する、細胞外マトリックスに存在する１０ｎｍ～１０００ｎｍのサイズに及ぶ、同じ膜結合粒子を指す。これらの用語は互換的であり、同じ小胞を指す。このようなナノ小胞は、ＥＣＭ内に包埋され、これに結合しており、表面に単純に付着されている訳でも、体液中を自由に循環している訳でもない。このようなナノ小胞は、凍結融解、ならびにペプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、プロテイナーゼＫおよびコラゲナーゼ等のプロテアーゼによる消化、ならびに界面活性剤による消化等、過酷な単離条件に対して抵抗性である。ＭＢＶは、エキソソームを含む他の細胞外小胞とは別個のものであり、エキソソームとは別個のリン脂質組成を有する。ある特定の状況では、ＭＢＶは、エキソソームに一般的に起因するある特定のマーカーの非存在に基づきエキソソームから区別することもできる。ＭＢＶはまた、アルカリホスファターゼを発現する、骨の生成および石灰化に関与する骨マトリックス小胞とも別個のものである。ＭＢＶは、アルカリホスファターゼを発現しない。
一部の実施形態では、ＭＢＶは、タンパク質発現または脂質含量の次の特色のうち１つまたは複数によって特徴付けられる：
（ｉ）ＭＢＶは、ＣＤ６３および／もしくはＣＤ８１および／もしくはＣＤ９のうち１種もしくは複数を発現することができない、またはエキソソーム等の他の小胞と比較して、低いもしくは辛うじて検出可能なレベルのＣＤ６３および／もしくはＣＤ８１および／もしくはＣＤ９を有する（ＣＤ６３ｌｏおよび／またはＣＤ８１ｌｏおよび／またはＣＤ９ｌｏ）（例えば、実施例１を参照）（実施例１７および図２４も参照）。種々の方法、例えば、ウエスタンブロッティングまたはフローサイトメトリー等の抗体に基づく方法を使用して、ＭＢＶにおけるＣＤ６３および／またはＣＤ８１および／またはＣＤ９の低い発現、辛うじて検出可能な発現または発現なしを区別することができる（例えば、Bashashati and Brinkman, Adv Bioinformatics, 2009: 584603を参照）。一部の実施形態では、ＭＢＶにおけるＣＤ６３および／またはＣＤ８１および／またはＣＤ９の発現が、エキソソーム等の他の小胞の平均発現を少なくとも１標準偏差または少なくとも２標準偏差下回る場合、ＣＤ６３および／またはＣＤ８１および／またはＣＤ９のＭＢＶ発現は、他の小胞と比較して、低いまたは辛うじて検出可能と考えられる；
（ｉｉ）ＭＢＶは、総リン脂質の少なくとも５５％が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せを含む、リン脂質含量を有する；
（ｉｉｉ）ＭＢＶは、総リン脂質の１０％またはそれ未満が、スフィンゴミエリン（ＳＭ）を含む、リン脂質含量を有する；
（ｉｖ）ＭＢＶは、総リン脂質の２０％またはそれ未満が、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む、リン脂質含量を有する；
（ｖ）ＭＢＶは、総リン脂質含量の１５％またはそれよりも多くが、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含む、リン脂質含量を有し、パーセントは、脂質濃度のパーセントを表す。
一部の実施形態では、ＭＢＶは、次の特色の全てによって特徴付けられる：
（ｉ）ＣＤ６３および／もしくはＣＤ８１および／もしくはＣＤ９のうち１種もしくは複数を発現しない、または低いもしくは辛うじて検出可能なレベルのＣＤ６３および／もしくはＣＤ８１および／もしくはＣＤ９を有する（ＣＤ６３ｌｏおよび／またはＣＤ８１ｌｏおよび／またはＣＤ９ｌｏ）（上にさらに記載されている通り）；
（ｉｉ）総リン脂質の少なくとも５５％が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せを含む、リン脂質含量；
（ｉｉｉ）総リン脂質の１０％またはそれ未満が、スフィンゴミエリン（ＳＭ）を含む、リン脂質含量；
（ｉｖ）総リン脂質の２０％またはそれ未満が、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む、リン脂質含量；ならびに
（ｖ）総リン脂質含量の１５％またはそれよりも多くが、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である、リン脂質含量。
一部の実施形態では、ＭＢＶは、次の特色の全てによって特徴付けられる：
（ｉ）総リン脂質の少なくとも５５％が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せを含む、リン脂質含量；
（ｉｉ）総リン脂質の１０％またはそれ未満が、スフィンゴミエリン（ＳＭ）を含む、リン脂質含量；
（ｉｉｉ）総リン脂質の２０％またはそれ未満が、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む、リン脂質含量；ならびに
（ｉｖ）総リン脂質含量の１５％またはそれよりも多くが、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である、リン脂質含量。
一部の実施形態では、ＭＢＶは、次の特色のうち１つまたは複数によって特徴付けられる：
（ｉ）総リン脂質の少なくとも５５％が、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せを含む、リン脂質含量；
（ｉｉ）総リン脂質の１０％またはそれ未満が、スフィンゴミエリン（ＳＭ）を含む、リン脂質含量；
（ｉｉｉ）総リン脂質の２０％またはそれ未満が、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む、リン脂質含量；ならびに
（ｉｖ）総リン脂質含量の１５％またはそれよりも多くが、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）である、リン脂質含量。
ＭＢＶが単離されるＥＣＭは、組織由来のＥＣＭであり得る、培養中の細胞から産生することができる、または商業的供給源から購入することができる。
一部の実施形態では、ＭＢＶは、次の特色のうち１つまたは複数によって特徴付けられる：
（ｉ）検出可能レベルのアルカリホスファターゼを含有しない；
（ｉｉ）検出可能レベルのオステオポンチンを含有しない；
（ｉｉｉ）検出可能レベルのオステオプロテジェリンを含有しない；
（ｉｖ）検出可能レベルの補体Ｃ５を含有しない；および／または
（ｖ）検出可能レベルのｃ反応性タンパク質を含有しない。
一部の実施形態では、ＭＢＶは、次の特色のうち１つまたは複数によって特徴付けられる：
（ｉ）ＥｐＣＡＭを低いレベルで含有するもしくはこれを検出可能レベルで含有しない、
（ｉｉ）ＡＮＸＡ５を低いレベルで含有するもしくはこれを検出可能レベルで含有しない、
（ｉｉｉ）ＴＳＧ１０１を低いレベルで含有するもしくはこれを検出可能レベルで含有しない；
（ｉｖ）ＦＬＯＴ１を低いレベルで含有するもしくはこれを検出可能レベルで含有しない；
（ｖ）ＩＣＡＭ１を低いレベルで含有するもしくはこれを検出可能レベルで含有しない；
（ｖｉ）ＧＭ１３０を低いレベルで含有するもしくはこれを検出可能レベルで含有しない；および／または
（ｖｉｉ）ＡＬＩＸを低いレベルで含有するもしくはこれを検出可能レベルで含有しない。
一実施形態では、ＭＢＶは、低いまたは検出不能なレベルのＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１およびＩＣＡＭ１によって特徴付けられる。
一実施形態では、ＭＢＶは、低いまたは検出不能なレベルのＣＤ８１、ＣＤ６３、ＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１およびＩＣＡＭ１によって特徴付けられる。
酸素飽和度指数（ＯＳＩ）：酸素飽和度指数は、比酸素レベル（specific oxygen level）（ＳｐＯ２）を使用して計算される、酸素指数（ＯＩ）の非侵襲的代替物である。ＯＳＩ＝（ＦｉＯ２×平均気道圧×１００）／ＳｐＯ２。ＳｐＯ２（酸素飽和度）は、非侵襲的に、例えば、パルスオキシメトリによって測定することができ、血液における総ヘモグロビン（不飽和および飽和）に対する酸素飽和ヘモグロビンの分率の尺度である。
酸素指数（ＯＩ）：酸素指数＝（ＦｉＯ２×平均気道圧×１００）／ＰａＯ２であり、ＯＳＩとは異なり、侵襲的である動脈血ガス測定を要求する。
薬学的に許容される担体：特許請求されている医薬調製物において有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は、本明細書に開示されている融合タンパク質の薬学的送達に適した組成物および製剤について記載する。
一般に、担体の性質は、用いられている特定の投与様式に依存するであろう。例えば、非経口製剤は通常、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールその他等の薬学的にかつ生理学的に許容される流体を含む注射用流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤またはカプセル形態）のため、従来の無毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与されるべき医薬調製物は、湿潤剤または乳化剤、保存料およびｐＨ緩衝化剤その他、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート等、少量の無毒性補助物質を含有することができる。
医薬剤：対象または細胞に適切に投与されたときに、所望の治療または予防的効果を誘導することができる化合物または組成物。
リン脂質：２本の疎水性脂肪酸尾部と、リン酸基からなる親水性頭部とからなる構造を有する脂質のクラス。リン脂質の主要なクラスは、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、カルジオリピン（ＣＬ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびビス－モノアシルグリセロホスフェート（ＢＭＰ）を含む。リン脂質は、種々の仕方で測定することができる。例えば、ＬＣ－ＭＳに基づく網羅的リピドミクスおよびレドックスリピドミクスを使用することができる。一部の実施形態では、比リン脂質含量（specific phospholipid content）は、総リン脂質（ＭＢＶにおける総リン脂質等）のパーセント濃度として指し示され、パーセント濃度は、重量／重量である。
肺炎：一方または両方の肺における肺胞（空気嚢）に炎症を起こさせる感染症。一部の実施形態では、肺は、流体または膿汁で満たされる。一部の実施形態では、肺炎は、ウイルス感染症、例えば、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、例えば、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ）、例えば、エボラウイルスに関連する。一部の実施形態では、肺炎は、細菌感染症、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに関連する。一部の実施形態では、肺炎は、真菌感染症、例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉに関連する。一部の実施形態では、肺炎は、二次感染症である、すなわち、既存の感染症（例えば、ＣＯＶＩＤ－１９）を有する患者が、肺炎を発症する。一部の実施形態では、肺炎は、院内感染による。一部の実施形態では、肺炎は、市中感染による。肺炎の症状は、咳、発熱、速い呼吸、息切れ、胸部痛および疲労を限定することなく含む。ある特定の実施形態では、肺炎は、ＡＲＤＳに関連する。
ポリヌクレオチド：いずれかの長さの核酸配列（線状配列等）。したがって、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含み、また、染色体中に見出される遺伝子配列も含む。「オリゴヌクレオチド」は、ネイティブホスホジエステル結合によって繋がれた、複数の繋がれたヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、６～３００ヌクレオチドの間の長さのポリヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドアナログは、オリゴヌクレオチドと同様に機能するが、天然に存在しない一部分を有する部分を指す。例えば、オリゴヌクレオチドアナログは、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド等、変更された糖部分または糖間（inter-sugar）連結等、天然に存在しない一部分を含有することができる。天然に存在するポリヌクレオチドの機能的アナログは、ＲＮＡまたはＤＮＡに結合し、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子を含むことができる。
予防的：本明細書で使用される場合、疾患または障害が起こるのを防止するように設計および使用された薬物療法または処置を指す。本明細書で使用される場合、用語「予防的」および「予防」は、互換的に使用される。
精製された：用語「精製された」は、絶対的な純度を要求しない；むしろ、これは、相対的な用語として意図される。よって、例えば、精製された核酸分子調製物は、参照されている核酸（nucleic）が、細胞内のその天然の環境における核酸（nucleic）よりも純粋である調製物である。例えば、核酸の調製物は、核酸が、調製物の総タンパク質含量の少なくとも５０％となるように精製されている。同様に、精製されたＭＢＶ調製物は、エキソソームが、マイクロ小胞およびエキソソームが存在する細胞を含む環境中よりも純粋である調製物である。核酸またはＭＢＶの精製された集団は、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を超えて純粋である、またはそれぞれ他の核酸または細胞構成成分を含まない。
疾患を予防または処置すること：疾患を「予防すること」は、例えば、疾患の素因を有することが分かっている人物における疾患の発症を阻害することを指す。分かっている素因を有する人物の例は、家族に疾患の病歴がある者、または対象をある状態に罹り易くする因子に曝露された者である。「処置」は、発症が始まった後に疾患または病的状態の徴候または症状を改善する治療介入を指す。
２０１９－新型コロナウイルスまたは２０１９－ｎＣｏＶとしても当技術分野で公知の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２または重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、２０１９年後期に中華人民共和国の武漢で起こった新型コロナウイルスであり、２０２０年の世界的パンデミックの原因である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に起因する疾患は、コロナウイルス疾患２０１９またはＣＯＶＩＤ－１９と呼ばれる。ＣＯＶＩＤ－１９は、咳、発熱、疲労、体の痛みおよび息切れを含む種々の症状を引き起こす。重度疾患を有するＣＯＶＩＤ－１９患者は、急性呼吸窮迫症候群を経験し、機械的人工呼吸を要求し得る。
敗血症：敗血症は、血流中に放出された（例えば、感染、例えば、細胞内病原体またはウイルスと戦うために）サイトカインおよびケモカインが、身体全体にわたり全身性炎症を生じる際に起こり得る障害である。敗血症は、広汎な臓器損傷、臓器不全および死亡をもたらし得る。敗血症の症状は、上昇した心拍数、錯乱または失見当識、極度の疼痛または不快感、発熱および息切れを限定することなく含む。一部の実施形態では、敗血症は、ＡＲＤＳに関連する。一部の実施形態では、敗血症は、高サイトカイン血症に関連する。
対象：非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類および爬虫類等、哺乳動物および非哺乳動物等、あらゆる脊椎動物を含む、ヒトおよび非ヒト動物。記載されている方法の多くの実施形態では、対象は、ヒトである。「対象」は、用語「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患もしくは障害、例えば、感染性疾患もしくは障害を発症する高いリスクがあると診断された個体（例えば、免疫低下個体、医療従事者）、疾患もしくは障害、例えば、感染性疾患もしくは障害を有すると診断された者、疾患もしくは障害、例えば、感染性疾患もしくは障害を以前に患ったことがある者、または疾患もしくは障害、例えば、感染性疾患もしくは障害の症状もしくは徴候について評価された個体であり得る。
治療有効量：処置されている対象における所望の効果の達成に十分な、ＭＢＶ等の特異的な物質の含量。対象に投与される場合、所望のｉｎ ｖｉｔｒｏ効果を達成することが示された、標的組織濃度（例えば、肺における）を達成するであろう投薬量が一般に使用されるであろう。
総リン脂質含量：「総リン脂質」または「総リン脂質含量」は、ＭＢＶに関して本明細書で使用される場合、単離されたＭＢＶ、すなわち、ＥＣＭから単離されたＭＢＶの所与の含量において存在する全リン脂質の和を指す。ＭＢＶは、例えば、脱細胞化したＥＣＭの酵素消化および分画遠心分離によって単離することができる。総リン脂質含量は、ＬＣ－ＭＳに基づく網羅的リピドミクスおよびレドックスリピドミクス等の方法によって決定することができる。総リン脂質含量は、重量によって測定される。総リン脂質含量のパーセンテージは、重量／重量基準でのパーセント濃度を指す。
移植すること：それを必要とする対象へのＭＢＶ等の生体適合性基材の配置。
処置すること、処置および治療法：症状の緩解、軽快、縮小等、いずれかの客観的もしくは主観的パラメーターを含む、傷害、病理もしくは状態の減弱もしくは改善、患者にとって状態をより耐えられるものとすること、変性もしくは減退の速度を遅くすること、変性の最終地点の衰弱を抑えること、または対象の身体的もしくは精神的福祉を改善することにおける、いずれかの成功または成功の徴候。処置は、身体検査、神経学的検査または精神医学的評価の結果を含む、客観的または主観的パラメーターによって評価することができる。
特に断りのない限り、技術用語は、従来用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；およびRobert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見出すことができる。
上述は、本発明の複数の態様および実施形態について記載する。本特許出願は、本態様および実施形態のあらゆる組合せおよび並べ替えを特に企図する。
本開示は、ここで全般的に記載されているが、次の実施例を参照することによりさらに容易に理解され、実施例は、単に本開示のある特定の態様および実施形態を説明する目的で含まれており、決して本開示の範囲の限定を意図するものではない。
（実施例１）
リピドミクスおよびＲＮＡ配列決定によるマトリックス結合小胞（ＭＢＶ）および細胞外小胞（ＥＶ）の識別
マトリックス結合ナノ小胞（ＭＢＶ）は、ＥＣＭ生体足場の内在性構成成分として報告された。液相細胞外小胞（ＥＶ）は、集中的な研究の対象であったが、ＭＢＶに対するその類似性は、サイズおよび形状に限定される。本実施例は、ＬＣ－ＭＳに基づくリピドミクスおよびレドックスリピドミクスを利用して、液相ＥＶおよびＭＢＶリン脂質の詳細な比較を行った。小胞内カーゴの包括的ＲＮＡ配列決定およびバイオインフォマティクス解析と組み合わせて、本実施例は、ＭＢＶが、ＥＶの別個かつ特有の亜集団であること、およびＥＣＭに基づく生体材料の際立った特色を示す。
本実施例は、ＥＶの液相（すなわち、エキソソーム）およびマトリックス結合形態（すなわち、ＭＢＶ）の間の類似性および差を同定する。しかし、生体液中に存在するＥＶ、ならびにネイティブ組織ＥＣＭおよびＥＣＭに基づく生体材料中に存在するＭＢＶが、複数の細胞供給源から分泌される異種性集団を表すことを考慮すると、これらの推定ＥＶ集団の間の直接比較ｉｎ ｖｉｖｏ解析は問題がある。体液または組織由来小胞を使用することの代替として、培養細胞によってｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＥＣＭおよび馴化培地を単離することができる（Fitzpatrick et al., Biomater Sci., 3, 12-24 (2015)）。このアプローチは、単一の細胞型供給源の使用（これにより、小胞起源に関するいかなる疑いも取り除く）；液相または固相区画のいずれかから小胞を選択的に収集する能力；ならびに細胞培養環境を制御する、よって、小胞組成およびカーゴも制御する能力等、いくつかの利点を提供する。
材料および方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞由来ＥＣＭの調製：ヒト骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）、ヒト脂肪幹細胞（ＡＳＣ）およびヒト臍帯幹細胞（ＵＣＳＣ）ＥＣＭプレートは、ＳｔｅｍＢｉｏＳｙｓ（Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ、Ｔｅｘａｓ）によって提供され、発表されたプロトコール（Lai et al., Stem cells and development 19, 1095-1107 (2010)）に従って調製された。簡潔に説明すると、ヒトＢＭＳＣ、ヒトＡＳＣまたはヒトＵＣＳＣを、３，５００個の細胞／ｃｍ２の細胞密度で、ヒトフィブロネクチンでコーティングされた（３７℃で１時間）７５ｃｍ２細胞培養フラスコに播種し、２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補充したα－ＭＥＭ培地において１４日間培養した。培地は、初期播種の翌日に、次いで３日毎に新しくした。７日目に、アスコルビン酸２－ホスフェート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０μＭの最終濃度で培地に添加した。１４日目に、５分間にわたり２０ｍＭ水酸化アンモニウムにおける０．５％Ｔｒｉｔｏｎを使用してプレートを脱細胞化し、カルシウムおよびマグネシウムの両方を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ＋／＋）で２回、超高純度Ｈ２Ｏで１回リンスした。マウスＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞を、３，５００個の細胞／ｃｍ２の細胞密度で７５ｃｍ２細胞培養フラスコに播種し、エキソソーム枯渇ＦＢＳ（G. V. Shelke, et al, Journal of extracellular vesicles 3, 24783 (2014)）、１％ペニシリン－ストレプトマイシンおよび５０μＭの最終濃度のアスコルビン酸２－ホスフェート（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＤＭＥＭ培地において７日間培養した。７日目に、培養された３Ｔ３線維芽細胞由来の上清を収集し、プレーティングされた培養物をＰＢＳで３回洗浄し、５分間にわたり２０ｍＭ水酸化アンモニウムにおける０．５％Ｔｒｉｔｏｎを使用して脱細胞化し、次いで、超高純度Ｈ２Ｏで３回リンスした。
ＭＢＶおよび液相ＥＶの単離：ＭＢＶを単離した（L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)）。簡潔に説明すると、脱細胞化したＥＣＭを、１時間３７℃で緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）における１００ｎｇ／ｍｌリベラーゼ（Liberase）ＤＬ（Ｒｏｃｈｅ）で酵素消化した。液相ＥＶを含有する細胞培養上清、およびＭＢＶを含有する消化されたＥＣＭを、５００ｇ（１０分間）、２５００ｇ（２０分間）および１０，０００ｇ（３０分間）における分画遠心分離に付し、上清を０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通した。次に、遊離したＭＢＶまたは液相ＥＶを含有する清澄化された上清を１００，０００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ超遠心分離機）で４℃にて７０分間遠心分離して、小胞をペレットにした。次に、小胞ペレットを１×ＰＢＳにおいて洗浄および再懸濁し、さらなる使用まで－２０℃で貯蔵した。
膀胱マトリックス（ＵＢＭ）の調製：市場出荷体重の（market-weight）ブタ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｕｒｃｅ；ＬＬＣ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＩＮ）からＵＢＭを調製した（L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)）。簡潔に説明すると、機械的層間剥離によって漿膜、外筋層、粘膜下組織および粘膜筋板を除去し、脱イオン水による洗浄によって粘膜の尿路上皮細胞を基底膜から解離した。残っている基底膜および粘膜固有層（まとめてＵＢＭと称される）を、２時間３００ｒｐｍでの４％エタノールを有する０．１％過酢酸における撹拌によって脱細胞化し、続いて、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）およびタイプ（type）１水で洗浄した。次に、ＵＢＭを凍結乾燥し、＃６０メッシュスクリーンを備えるＷｉｌｅｙ Ｍｉｌｌを使用して製粉した。
走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）：冷２．５％グルタルアルデヒドにおいてＵＢＭを２４時間固定し、続いて、１×ＰＢＳにおいて３回の３０分間洗浄を行った。次に、段階的アルコール系列（３０％、５０％、７０％、９０％、１００％エタノール）において洗浄毎に３０分間にわたり試料を脱水し、次いで、一晩４℃で１００％エタノールに置いた。１００％エタノールにおいてさらに３回、各回３０分間にわたり試料を洗浄し、移行媒体（transitional medium）としての二酸化炭素を用いるＬｅｉｃａ ＥＭ ＣＰＤ０３０ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｐｏｉｎｔ Ｄｒｙｅｒ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して臨界点乾燥した。次に、Ｓｐｕｔｔｅｒ Ｃｏａｔｅｒ １０８ Ａｕｔｏ（Ｃｒｅｓｓｉｎｇｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を使用して、４．５ｎｍ厚さ（thick）の金／パラジウム合金コーティングで試料をスパッタコーティングし、ＪＥＯＬ ＪＳＭ６３３０ｆ走査型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ、Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）で撮像した。
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）：炭素コーティングされたグリッド上にロードされ、４％パラホルムアルデヒドにおいて固定されたＭＢＶまたは液相ＥＶにおいて、ＴＥＭイメージングを行った（L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)）。高分解能Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓデジタルカメラを備えるＪＥＯＬ １２１０ ＴＥＭにより８０ｋＶでグリッドを撮像した。ＪＥＯＬ ＴＥＭソフトウェアを使用して、代表的画像からＭＢＶのサイズを決定した。
ナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ）：高速ビデオキャプチャーおよび粒子追跡ソフトウェアを備えたＮａｎｏｓｉｇｈｔ（ＮＳ３００）機器を使用して、液相ＥＶおよびＭＢＶの粒子サイズおよび濃度を計算した。粒子不含水を使用して１０００μｌの最終体積となるように試料を１：５００希釈した。シリンジポンプを使用して、システムへと試料を分注した。各試料４５秒間の３つのキャプチャーから測定を行った。ビデオ加工および粒子計算のため、検出閾値を４に調整した。データは、評価されている試料のそれぞれについて濃度 対 粒子サイズとして提示される。
ＲＮＡ単離：製造業者の使用説明書に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、３Ｔ３細胞、液相ＥＶおよびＭＢＶから全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ単離の前に、液相ＥＶおよびＭＢＶ試料を、ＲＮａｓｅ Ａ（１０μｇ／ｍｌ）で３７℃にて３０分間処置して、いかなる混入ＲＮＡも分解した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用してＲＮＡ含量を決定し、その品質をＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって決定した。
ＲＮＡ配列決定およびバイオインフォマティクス解析：製造業者の使用説明書に従って、１００ｎｇの各試料およびＱＩＡＳＥＱ（商標）ｍｉＲＮＡライブラリーキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｍｉＲＮＡライブラリー調製を開始した。簡潔に説明すると、成熟ｍｉＲＮＡを、その３’および５’末端においてアダプターにライゲーションした。次に、特有の分子指標（ＵＭＩ）を有する逆転写（ＲＴ）プライマーを使用して、ライゲーションされたｍｉＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写した。次に、ｃＤＮＡを浄化して、アダプタープライマーを除去し、続いて、ユニバーサルフォワードプライマー、および試料指標を割り当てる４８種のリバースプライマーのうち１種により、ライブラリーの増幅を行った。Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、プレ配列決定品質管理を行った。２．５ｐＭのローディング濃度により、ＮｅｘｔＳｅｑ ５００機器において次世代配列決定を行った。Ｇｅｎｅｖｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔａｍｐｅｒｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）によってバイオインフォマティクス解析を行った。ＦａｓｔＱＣソフトウェアを使用して、配列決定読み取りデータの品質を点検した。デフォルト設定を用いて、全試料において、ＴｒｉｍＧａｌｏｒｅ！［バージョン０．４．５；］を使用してアダプター配列を除去した。全読み取りデータは、ｆａｓｔｘ＿ｔｒｉｍｍｅｒソフトウェア（ＦＡＳＴＸ Ｔｏｏｌｋｉｔ、Ｈａｎｎｏｎ Ｌａｂによる；バージョン０．０．１４）を使用して、マイクロＲＮＡの典型的なサイズである２１塩基へと短縮された。
次に、各試料の読み取りデータを、対応する参照ゲノム（ｈｇ３８、ＧＲＣｍ３８）に対して整列した。ソフトウェアｂｏｗｔｉｅ［バージョン１．２．２］およびｍｉＲＤｅｅｐ２［バージョン０．０．８］を使用して、試料にわたるｍｉＲＮＡ計数の表を作成した。このプロセスにおいて、試験に関与する種毎の前駆体ｍｉＲＮＡおよび成熟ｍｉＲＮＡ配列をｍｉＲｂａｓｅから取得した。それらに関連する全ての前駆体ｍｉＲＮＡの中央値を取得することにより、成熟ｍｉＲＮＡの計数を得た。ＤＥＳｅｑ２を使用して、全試料の成熟ｍｉＲＮＡの計数を正規化した。さらなる解析前にデータ品質を確実にするために、マウスおよびヒト試料について別々に、主成分解析（ＰＣＡ）を行い、ｇｇｐｌｏｔ２を使用して結果を可視化した。
成熟ｍｉＲＮＡデータの正規化および試料群間の統計的検定をＤＥＳｅｑ２により行った。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ方法を使用して多重検定のためにＰ値を補正した。調整されたｐ値＜０．０５および絶対的なｌｏｇ２の倍数変化＞１を有するｍｉＲＮＡは、有意に差次的に発現されたと考えられた。実験により検査されたｍｉＲＮＡ－標的相互作用のｍｉｒＴＡＲｂａｓｅデータベースを使用して、差次的に発現されたｍｉＲＮＡの表は、それらの標的およびそれらの信頼度でアノテートされた。ＲパッケージｍｉＲＮＡｔａｐを使用して、差次的に発現されたｍｉＲＮＡはまた、予測される標的によりアノテートされた。ｍｉＲＮＡｔａｐは、５種の異なるデータベース（ＰｉｃＴａｒ、ＤＩＡＮＡ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ｍｉＲａｎｄａ、ｍｉＲＤＢ）からｍｉＲＮＡ標的予測を集約し、全体的なｍｉＲＮＡ標的スコアを計算する。アノテーションに含まれるべき潜在的ｍｉＲＮＡ標的相互作用に要求されるデータベース供給源の最小量は、３であった。
Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析（ＩＰＡ）：差次的に発現された（ＤＥ）ｍｉＲＮＡの機能解析のために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析ソフトウェア（バージョン０１－１４）を使用した。ＩＰＡコア解析を使用して、ｍｉＲＮＡ標的を同定した。実験により観察される知見にフィルターを設定して、ｍｉＲＮＡによって影響された、有意に濃縮された分子および細胞機能ならびに生理系発生機能に関する情報を得た。
ｑＰＣＲ検証：ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡアッセイプロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、逆転写（ＲＴ）および定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を行った。簡潔に説明すると、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡ ｃＤＮＡ合成キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ２８００７）と共に１０ｎｇの全ＲＮＡを使用して、ｍｉＲＮＡに３’－ポリ（Ａ）テイルを合成して加えた。ポリ（Ａ）テイルを認識するユニバーサルＲＴプライマーを使用して、ＲＴ反応においてｃＤＮＡを合成し、続いて、ｍｉＲ－ＡＭＰフォワードおよびリバースユニバーサルプライマーを使用してｍｉＲ－ＡＭＰステップを行って、ｃＤＮＡ分子の数を増加させた。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ Ｎｏ．４４４４５５６）、ならびにｍｍｕ－ｍｉＲ－１６３－５ｐ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｍｕ－ｍｉＲ－９３－５ｐおよびｍｍｕ－ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐを認識する特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍｉＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ａ２５５７６）を使用して、ＱＵＡＮＴＳＴＵＤＩＯ（商標）システム機械においてｑＰＣＲを行った。参照として液相ＥＶを使用して、特異的標的のそれぞれについて、ＭＢＶ試料における倍数変化の発現が計算された。
イムノブロットおよび銀染色アッセイ：３Ｔ３線維芽細胞の３種の別々の培養物に由来する液相ＥＶおよびＭＢＶをそれぞれプールし、ナノトラッキング（nanotracking）粒子解析によって定量化した。イムノブロットおよび銀染色解析の両方について、液相ＥＶおよびＭＢＶ試料の両方の同数の小胞を、ゲルにロードした。２１×１０１１個のＭＢＶまたは液相ＥＶを、５％βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する２×レムリ（Laemmli）緩衝液（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と混合し、４～２０％勾配ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）において分離し、次いで、ＰＶＤＦ膜に転写した。膜を、次の一次抗体と共に一晩インキュベートした：ウサギ抗ＣＤ６３、ウサギ抗ＣＤ８１、ウサギ抗ＣＤ９およびウサギ抗Ｈｓｐ７０、１：１０００希釈（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。１：５，０００希釈のヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートされる前および後に各１５分間で３回、膜を洗浄した。洗浄された膜を化学発光基質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に曝露し、次いで、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して可視化した。製造業者の使用説明書に従ってＳｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用してゲルの銀染色を行い、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して可視化した。
リン脂質のＬＣ／ＭＳ解析：Ｆｏｌｃｈの手順（J. Folch, et al, J biol Chem 226, 497-509 (1957)）によって、３Ｔ３細胞、エキソソームおよびＭＢＶから脂質を抽出した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）においてリン脂質およびその酸素化産物のＭＳ解析を行った（Y. Y. Tyurina et al., ACS nano 5, 7342-7353 (2011)）。簡潔に説明すると、ＤＩＯＮＥＸ ＵＬＴＩＭＡＴＥ ３０００ ＨＰＬＣシステムにおいて、０．２ｍｌ／分の流速の順相カラム（Ｌｕｎａ ３μｍシリカ（２）１００Å １５０×２．０ｍｍ、（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））においてリン脂質を分離した。カラムを３５℃で維持した。１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する勾配溶媒（ＡおよびＢ）を使用して解析を行った。溶媒Ａは、プロパノール：ヘキサン：水（２８５：２１５：５、ｖ／ｖ／ｖ）を含有し、溶媒Ｂは、プロパノール：ヘキサン：水（２８５：２１５：４０、ｖ／ｖ／ｖ）を含有した。全ての溶媒がＬＣ／ＭＳグレードであった。１０％～３２％Ｂの直線勾配による０～２３分目；３２～６５％Ｂの直線勾配を使用した２３～３２分目；６５～１００％Ｂの直線勾配による３２～３５分目；１００％Ｂにおける３５～６２分目の保持；１００％～１０％Ｂの直線勾配による６２～６４分目、続いて１０％Ｂにおける６４～８０分目の平衡化で、カラムを溶出した。負イオンモードでスペクトルを獲得した。内部標準として重水素化リン脂質を使用した（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。試料毎に３回の技術的反復を実行して、再現性を評価した。所内で作成された解析ワークフローおよび非酸化／酸化リン脂質データベースを用いて、ソフトウェアパッケージＣｏｍｐｏｕｎｄ ＤＩＳＣＯＶＥＲＥＲ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＬＣ／ＭＳデータの解析を行った。保持時間によって脂質をさらにフィルタリングし、断片化質量スペクトルによって確認した。
遊離脂肪酸およびその酸化産物のＬＣ／ＭＳ解析：Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極－オービトラップ（orbitrap）質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）にオンラインで繋がれたＤＩＯＮＥＸ ＵＬＴＩＭＡＴＥ（商標）３０００ ＨＰＬＣシステム使用したＬＣ／ＭＳによって、遊離脂肪酸を解析した（Y. Y. Tyurina et al., Nature chemistry 6, 542 (2014).）。簡潔に説明すると、溶媒の勾配（Ａ：メタノール（２０％）／水（８０％）（ｖ／ｖ）およびＢ：メタノール（９０％）／水（１０％）（ｖ／ｖ）、両者共に、５ｍＭ酢酸アンモニウムを含有）を使用したＣ１８カラム（Ａｃｃｌｉａｍ ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ、３００μｍ １５ｃｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、脂肪酸およびその酸化的誘導体を分離した。７０分間にわたる３０％溶媒Ｂ～９５％溶媒Ｂの直線勾配、７０～８０分目の９５％Ｂにおける保持、続いて、８３分目までに初期条件に戻る、および追加的な７分間にわたる再平衡化を使用して、１２μＬ／分の流速でカラムを溶出した。負イオンモードでスペクトルを獲得した。Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアを使用して、解析データを獲得および解析した。試料毎に最小で３回の技術的反復を実行して、再現性を増加させた。
結果
液相ＥＶおよびマトリックス結合ナノ小胞の単離：走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）を行って、ブタ膀胱マトリックス（ＵＢＭ）に由来するＥＣＭ生体足場内に包埋されたＭＢＶの高分解能、高拡大率イメージングを提供した。ＳＥＭ画像は、コラーゲン線維全体にわたり分散したおよそ１００ｎｍの直径の個別の球を明らかにした（図１Ａ）。固体ＥＣＭ基材中に沈着したＭＢＶが、液相へと分泌されるＥＶとは別の、細胞外小胞の特有のクラスであるか検査するために、液相または固相細胞外区画からの小胞の選択的な収集を可能にするｉｎ ｖｉｔｒｏ ３Ｔ３線維芽細胞培養モデルを使用した（図１Ｂ）。位相差顕微鏡、ならびにＨ＆ＥおよびＤＡＰＩ染色された切片の代表的な画像は、細胞培養プレートの脱細胞化後に残渣細胞も無傷核も目に見えないことを示した（図１Ｃ）。細胞培養上清から収集された液相ＥＶおよび脱細胞化したＥＣＭから単離されたＭＢＶのＴＥＭイメージング（図１Ｄ）は、これらの２種の小胞集団が、同様の形態を共有することを示した。さらに、ナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ）分布プロットは、液相ＥＶおよびＭＢＶの両方の同様の小胞サイズを示し、大部分の小胞は、直径＜２００ｎｍを有した（図１Ｅ）。
ＭＢＶが、エキソソームに一般的に起因するマーカーを含有するか決定するために、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９およびＨｓｐ７０に関してイムノブロット解析を行った（J. Loetvall et al. (Taylor & Francis, 2014)）。結果は、液相ＥＶとは対照的に、ＭＢＶが、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９の顕著な減少を示したことを示した。ＭＢＶは、イムノブロットアッセイにおいて辛うじて検出可能であり、ＥＶにおいて発現されるレベルと比べて顕著に減少した、ＣＤ９およびＣＤ８１のレベルを発現した。ＭＢＶはまた、ＥＶにおいて観察されるものよりも有意に低いＣＤ６３発現を呈した（図１Ｆ）。換言すると、液相ＥＶ（すなわち、エキソソーム）は、ＭＢＶと比較して、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９の発現されるレベルが濃縮されている。さらに、電気泳動により分離されたタンパク質の銀染色は、ＭＢＶが、液相ＥＶとは明らかに異なるタンパク質カーゴを含有したことを示し（図１Ｇ）、ＭＢＶが、ナノ小胞の特有の亜集団であり得ることを示唆する。
ｍｉＲＮＡは、３Ｔ３線維芽細胞に由来する液相ＥＶおよびＭＢＶ中に選択的にパッケージされる：包括的次世代ＲＮＡ－配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を用いて、ＭＢＶおよび液相ＥＶにおいて、これらの小胞が由来する３Ｔ３線維芽細胞親細胞と比べて差次的に発現されたｍｉＲＮＡの目録を作った。バイオアナライザー解析は、液相ＥＶおよびＭＢＶから単離された全ＲＮＡにおける、１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡの非存在、ならびに小型のＲＮＡ分子（＜２００ｎｔ）の濃縮を明らかにした。しかし、液相ＥＶにおける１００～２００ｎｔの間の小型のＲＮＡ分子の顕著な濃縮により、液相ＥＶの小型のＲＮＡサイズ分布は、ＭＢＶよりもはるかに広かった（図２Ａ）。解析は、親細胞ＲＮＡ、液相ＥＶおよびＭＢＶ単離物（群毎にｎ＝３）から生成されたｍｉＲＮＡライブラリーの次世代配列決定を行うことにより、差次的ｍｉＲＮＡシグネチャーに焦点を置いた。主成分解析（ＰＣＡ）は、それぞれの群内で、反復ｍｉＲＮＡプロファイルが、互いに近くにクラスター形成したことを示した（図２Ｂ）。
親細胞および液相ＥＶおよびＭＢＶ単離物の間に、ｍｉＲＮＡ含量の広範な差が観察された。全体的に見て、２８種の（５０．９１％）ｍｉＲＮＡが、少なくとも２倍、液相ＥＶと比較してＭＢＶにおいて差次的に発現されることが見出された（図２Ｃ）。その上、それぞれの液相ＥＶまたはＭＢＶおよび親細胞ｍｉＲＮＡプロファイルは、明らかに別個のものであった（図２Ｂ、図２Ｃ）。ｍｉＲＮＡ配列決定の結果を検証するために、ＲＴ－ｑＰＣＲを行って、３Ｔ３線維芽細胞から単離された液相ＥＶと比較して、ＭＢＶにおいて、３種の上方調節されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－１６３－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ）および３種の下方調節されたｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－９３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－５ｐ）を検出した（図２Ｄ）。結果は、液相ＥＶと比較して、ＭＢＶにおいて、ｍｉＲ－１６３－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐおよびｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐのレベルが上方調節され、ｍｉＲ－４５１ａ、ｍｉＲ－９３ｂ－５ｐおよびｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが下方調節されたことを示し、これにより、ｍｉＲＮＡ配列決定データの結果を確証する。液相ＥＶと比較してＭＢＶにおいて差次的に濃縮されたｍｉＲＮＡのＩｎｇｅｎｕｉｔｙ経路解析（ＩＰＡ）は、臓器および系の発生および機能との強い関連を示した。対照的に、ＭＢＶと比較して液相ＥＶにおいて差次的に濃縮されたｍｉＲＮＡは、細胞の成長、発生、増殖および形態に関与する経路に関連した（図２Ｅ）。
ＭＢＶ ｍｉＲＮＡ含量は、細胞起源に特有である：３Ｔ３線維芽細胞モデルによる結果は、細胞培養上清中に分泌された液相ＥＶと比較した、ＥＣＭに沈着したＭＢＶ内のｍｉＲＮＡの選択的パッケージングを示した。ＭＢＶ ｍｉＲＮＡカーゴが、細胞起源に特有であるか決定するために、異なるヒトドナーから単離された骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ）、脂肪幹細胞（ＡＳＣ）および臍帯幹細胞（ＵＣＳＣ）によってｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＥＣＭから単離されたＭＢＶのｍｉＲＮＡ組成を、次世代配列決定方法により特徴付けおよび比較した。脱細胞化したＢＭＳＣ細胞培養プレートの代表的位相差顕微鏡画像は、細胞の非存在および分枝状の細線維構造の存在を示した（図３Ａ）。脱細胞化したＢＭＳＣ細胞培養プレート由来の単離されたＭＢＶのＴＥＭイメージングは、細胞外小胞に起因する特徴的な形態を示した（図３Ｂ）。さらに、ナノ粒子追跡解析は、ＢＭＳＣ、ＡＳＣおよびＵＣＳＣ由来ＭＢＶの間の同様の分布プロットを示し、大部分の小胞は、直径＜２００ｎｍを有する（図３Ｃ～図３Ｅ）。これらの試料からの全ＲＮＡの単離後に、バイオアナライザー解析は、リボソームＲＮＡの非存在および小型のＲＮＡ分子（＜２００ｎｔ）の濃縮を示した（図３Ｆ）。試料（ＢＭＳＣ、ｎ＝３名のヒトドナー；ＡＳＣ、ｎ＝３名のヒトドナー；ＵＣＳＣ、ｎ＝３名のヒトドナー）からｍｉＲＮＡライブラリーを生成し、ｍｉＲＮＡ配列決定に付した。主成分解析は、試料が、主に、それらが由来する細胞型によってクラスター形成したことを示した（図３Ｇ）。ＭＢＶ試料の生成に使用された細胞型毎に３名の別々のヒトドナーの使用にもかかわらず、主成分解析は、それぞれの群内のｍｉＲＮＡプロファイルにおいて高い程度の均一性を示した（図３Ｇ）。加えて、ボルケーノ（volcano）プロットは、ＢＭＳＣ－ＡＳＣおよびＵＣＳＣ－ＡＳＣの間よりも少ないｍｉＲＮＡが、ＢＭＳＣおよびＵＣＳＣ由来ＭＢＶの間で差次的に発現されることが見出されたことを示した。
液相ＥＶ、ＭＢＶおよび親細胞のリン脂質プロファイル：いくつかの試験が、ＥＶの脂質組成を特徴付けた（T. Skotland, et al, Journal of lipid research 60, 9-18 (2019)）。しかし、ＭＢＶのリン脂質組成に関するデータは存在しない。したがって、ＬＣ－ＭＳに基づく網羅的リピドミクスおよびレドックスリピドミクス解析を行って、それらの３Ｔ３線維芽細胞親細胞と比較して、ＭＢＶおよび液相ＥＶのリン脂質組成を比較により評価した（図４Ａ、図４Ｄ）。試料の３つの型にわたり、９種の主要なリン脂質クラスが検出され、検出された分子種の総数５３６が、次の主要なクラスの間に分布された：ビス－モノアシルグリセロホスフェート（ＢＭＰ） － ５９種、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ） － ３７種、カルジオリピン（ＣＬ） － １１７種、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ） － ３３種、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ） － １０２種、ホスファチジルセリン（ＰＳ） － ４５種、ホスファチジン酸（ＰＡ） － ２６種、ホスファチジルコリン（ＰＣ） － １０７種およびスフィンゴミエリン（ＳＭ） － １０種（図４Ｄ）。その多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）残基含量の観点から、ＰＥ、ＰＩ、ＰＣおよびＰＳは、４～７個の二重結合を含有するこれらの多価不飽和ＰＬ種の主要リザーバーを表した（図４Ｂ）。これらのＰＵＦＡリン脂質は、シグナル伝達脂質メディエーターの可能性のある前駆体を表す。メディエーターの形成は、５－リポキシゲナーゼまたは１５－リポキシゲナーゼによるＰＵＦＡリン脂質の触媒作用による酸素化により起こって、酸素化リン脂質を生じ、これはその後、特殊化ホスホリパーゼＡ２の１種によって加水分解されて、酸素化脂肪酸（脂質メディエーター）を放出する（Z. Zhao et al., Endocrinology 151, 3038-3048 (2010)；Y. Y. Tyurina et al., Journal of leukocyte biology, (2019)）。加えて、酸化ＰＵＦＡリン脂質は、アポトーシス、フェロトーシスおよび炎症を含む、多くの細胞内プロセスおよび細胞応答を協調させるシグナル伝達分子として作用する（Y. Y. Tyurina et al., Antioxidants & redox signaling 29, 1333-1358 (2018).）。これらのリン脂質の分子種分化およびそれらの相対的含量における有意差が、液相ＥＶおよびＭＢＶの間に観察された（図４Ｅ）。ＳＭを明らかな例外として、アラキドン酸（ＡＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）残基は、全リン脂質において検出された（図４Ｅ）。リン脂質の多くについて、量は、液相ＥＶおよび親細胞に対してＭＢＶにおいて有意により高く（図４Ｅ）、このことは、ＰＵＦＡ－リン脂質の豊富なリザーバーとしてＭＢＶを同定する。ＰＵＦＡリン脂質をＰＬＡ２によって加水分解し、遊離ＰＵＦＡおよびＬＰＬの放出をもたらすことができる（V. D. Mouchlis, et al, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1864, 766-771 (2019)）。前者は、２種の主要オキシゲナーゼ、ＣＯＸおよびＬＯＸによってさらに利用されて、炎症促進性または抗炎症性能力を有する脂質メディエーターを産生することができる（Y. Y. Tyurina et al., Redox (phospho) lipidomics of signaling in inflammation and programmed cell death. Journal of leukocyte biology, (2019)；C. A. Rouzer, et al., Chemical reviews 103, 2239-2304 (2003).；H. Kuhn, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1851, 308-330 (2015)）。この知見は、細胞／組織文脈に依存して、これらの脂質メディエーターの合成のための潜在的な前駆体としてＭＢＶを認定する（Y. Y. Tyurina et al., Journal of leukocyte biology, (2019).）。定量的に、ＭＢＶは、ＰＩ、ＰＳ、ＰＧおよびＢＭＰが濃縮された（図４Ｃおよび表２）。図４Ｃに示すリン脂質含量は、表１にも提示されている。
表1. 総リン脂質のパーセントとしてのリン脂質含量
Figure 2023521831000002
対照的に、ＰＥ、ＰＡおよびＳＭの含量は、液相ＥＶにおいてより高かった。ＰＣは、細胞および液相ＥＶにおける優勢なリン脂質であった。特有のミトコンドリアリン脂質、カルジオリピン（ＣＬ）の含量は、ＭＢＶおよび親細胞と比較して、液相ＥＶにおいて有意により低かった（図４Ｆ）。ＣＬは、ミトコンドリア内膜において優勢に局在化した特有のミトコンドリア特異的リン脂質であるため（M. Schlame, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1862, 3-7 (2017)）、この知見は、細胞のミトコンドリア区画とＭＢＶ新生の可能なリンクを表す。プラスマローゲンリン脂質（またはエーテルリン脂質）は、ジアシル－リン脂質（またはエステル－リン脂質）とは構造的に異なる（M. Schlame, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1862, 3-7 (2017)）。プラスマローゲンにおいて、ビニルエーテル結合は、ｓｎ－１飽和または一不飽和鎖を、リン脂質のグリセロール骨格に連結している（N. E. Braverman, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease 1822, 1442-1452 (2012)）。エーテル脂質、ＰＥおよびＰＣプラスマローゲンが、膜融合を容易にし（P. E. Glaser, et al., Biochemistry 33, 5805-5812 (1994)）、細胞外小胞の膜の厚さを増加させることができ（X. Han, et al., Biochemistry 29, 4992-4996 (1990)；T. Rog, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 1858, 97-103 (2016)）、したがって、細胞によるナノ小胞取込みにおいて役割を果たすことができることが示された。詳細なＭＳ／ＭＳ解析は、液相ＥＶおよびＭＢＶの両方における高レベルのエーテルＰＥおよびＰＣ種（プラスマローゲン）を示した。これらの種は、それぞれＰＥ－１６：０ｐ／２０：４、ＰＥ－１６：１ｐ／２０：４、ＰＥ－１８：１ｐ／２０：４、ＰＥ－１８：１ｐ／２２：６およびＰＣ－１６：０ｐ／２０：４、ＰＣ－１８：０ｐ／２０：４、ＰＣ－２０：０ｐ／２０：４、ＰＣ－１８：０ｐ／２２：６として同定された（図４Ｅ）。
表2. MBV、エキソソームおよび親3T3細胞におけるカルジオリピン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロールおよびビス-モノグリセロホスフェートの含量。データは、リン脂質１nmolあたりのpmol、平均±s.d.として提示されている。*細胞に対してp<0.05、#液相EVに対してp<0.05。
Figure 2023521831000003
液相ＥＶ、ＭＢＶおよび親細胞のリゾリン脂質プロファイル：ホスホリパーゼＡによって創出されるリン脂質の加水分解性代謝物である、リゾリン脂質（ＬＰＬ）は、とりわけマクロファージ活性化（R. Ray, et al., Blood 129, 1177-1183 (2017)）、炎症および線維症（A. M. Tager et al., Nature medicine 14, 45 (2008)）組織修復およびリモデリング（K. Masuda, et al., The FEBS journal 280, 6600-6612 (2013)）ならびに創傷治癒（K. M. Hines et al., Analytical chemistry 85, 3651-3659 (2013)）を含む種々の生理学的応答をモジュレートする生理活性シグナル伝達分子である。ＬＣ－ＭＳ解析は、ＭＢＶおよび液相ＥＶにおけるそれらの総含量は、親細胞と比較して１．７～１．８倍大きいものの、ＬＰＬが、試料の３つの型全てに存在することを示した。より具体的には、ＬＰＬの７種のクラスが同定された：リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）、リゾホスホイノシトール（ＬＰＩ）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）およびモノリゾカルジオリピン（ｍＣＬ）（図５Ａ）。ＭＢＶは、親細胞と比較して、ＬＰＥ、ＬＰＡおよびＬＰＧが濃縮されていた（図５Ｂ）。ＬＰＩおよびｍＣＬの含量は、細胞に対してＭＢＶおよび液相ＥＶにおいて有意により低かった。ＬＰＡおよびＬＰＧの含量は、ＥＶと比較して、ＭＢＶにおいて有意により高かった。ＭＢＶにおけるｍＬＣＬおよびＬＰＩのレベルは、ＥＶよりも３および６．３倍高かったが、細胞と比較して３．３分の１および１．９分の１であった（図５Ｃ、図５Ｄ）。ＭＢＶおよびＥＶの間にＬＰＥ、ＬＰＣおよびＬＰＳの含量の有意な変化は見出されなかった。１６：０、１６：１、１８：０および１８：１を含有する酸化できない分子種は、検出される全ＬＰＬ種に見出される主要な型であった（図５Ｃ）。これらの知見は、マクロファージ分化、組織修復、リモデリングおよび創傷治癒に重要である生理活性分子であるリゾリン脂質の高レベルが、ＭＢＶの特徴的な特色であることを示唆する。
ＭＢＶおよび液相ＥＶの遊離および酸素化脂肪酸の解析：ＭＢＶへのマウス骨髄由来マクロファージの曝露は、構築的マクロファージ表現型に関連する、Ｍ２様マーカー、Ｆｉｚｚ１およびＡｒｇ１の発現をもたらすため（L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)）、ＭＢＶ 対 液相ＥＶおよび親細胞におけるＰＵＦＡおよびその酸素化産物のＬＣ／ＭＳ解析を行った。ＭＢＶは、アラキドン酸（２０：４、ＡＡ）、ドコサヘキサエン酸（２２：６、ＤＨＡ）およびドコサペンタエン酸（２２：５、ＤＰＡ）脂肪酸が強く濃縮されていた（図６Ａ）。換言すると、ＭＢＶは、それぞれの酵素機構 － ＣＯＸおよびＬＯＸによる、シグナル伝達脂質メディエーターの生合成のための基質のリザーバーを表す。液相ＥＶにおいて、主要なＰＵＦＡは、リノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）であった（図６Ａ）。
細胞外小胞は、ＡＡ由来脂質メディエーターの生合成のための酵素の仕組みを含有するため（E. Boilard, Journal of lipid research 59, 2037-2046 (2018)）、酸素化脂肪酸のレドックスリピドミクス解析を行った。１２－ＨＥＴＥ、１５－ＨＥＴＥ、リポキシンＡ４等、ＡＡ代謝物のより高いレベルが、ＭＢＶに対して液相ＥＶにおいて見出された（図６Ｂ）。組織修復の文脈において、リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）およびＤ－シリーズレゾルビンＤ１（ＲｖＤ１）（アラキドン酸（２０：４、ＡＡ）およびドコサヘキサエン酸（２２：６、ＤＨＡ）から１２／１５－ＬＯＸによって産生）は、Ｍ２様表現型へとマクロファージ活性化を刺激する（C. N. Serhan, The American journal of pathology 177, 1576-1591 (2010)）。最後に、ＭＢＶおよび液相ＥＶにおける酸素化ＡＡおよびＤＨＡを含有する酸化リン脂質が特徴付けられた。酸素化種のレベルは、ＭＢＶにおいて、液相ＥＶよりも高く、ＰＳ、ＰＩおよびＰＣは、一酸素化種によって表された。ＢＭＰ、ＰＧおよびＣＬは、単独でおよび二重に酸素化されたＡＡおよびＤＨＡ残基を含有した；三重に酸素化されたＰＵＦＡは、ＰＥのみにおいて見出された（図６Ｃ）。全体的に見て、リピドミクスおよび酸化的リピドミクス結果は、遊離ＡＡ、ＤＨＡおよびＤＰＡならびにＰＵＦＡ含有リン脂質、ならびにそれらの酸化的に修飾された分子種のレベルが、液相ＥＶにおけるレベルと比較して、ＭＢＶにおいてより高いことを示す。ＭＢＶではＰＵＦＡ非酸素化および酸素化リン脂質が濃縮されているが、液相ＥＶでは濃縮されておらず、したがって、ＭＢＶは、細胞外環境の炎症促進性／抗炎症性の文脈に依存して、異なるホスホリパーゼによって活性化される脂質メディエーターの潜在的な供給源を表す、酸化されたおよび酸化できるエステル化ＰＬ種の潜在的なリザーバーを表す。
上述のＬＣ－ＭＳに基づくリピドミクスおよびレドックスリピドミクス試験に着手して、液相ＥＶおよびＭＢＶリン脂質の詳細な比較を行った。小胞内カーゴの包括的ＲＮＡ配列決定およびバイオインフォマティクス解析と組み合わせて、これらのデータは、ＭＢＶが、ＥＶの別個かつ特有の亜集団であり、液相ＥＶ（すなわち、エキソソーム）とは別個のものであり、小胞のサイズおよび形状に限定される類似性を有するＥＣＭに基づく生体材料の際立った特色であることを反映する。
本明細書において、小胞集団は、液相細胞培養培地または固相ＥＣＭ基材のいずれかへのその区画化に基づき分画された。組成の観点から、３Ｔ３線維芽細胞のＥＣＭから単離されたＭＢＶは、液相ＥＶとおよび親細胞と比較して、差次的なｍｉＲＮＡおよび脂質シグネチャーを含有した。これらのデータは、小胞新生の際に分子選別が起こって、異なる細胞外の場所に運命付けられた小胞にｍｉＲＮＡおよび脂質を特異的に分布させるというシナリオを示唆する。さらに、液体界面および固体基材の間を識別し、別個の脂質シグネチャーを有する適合した小胞亜集団をこれらの異種の区画へと選択的に沈着させる細胞の能力は、液相へと分泌されるＥＶの新生とは異なるかつ独立したＭＢＶの膜新生の証拠を提供する。ＭＢＶが、細胞外マトリックスの高密度細線維ネットワーク内に組み込まれることが示されたことを考慮して、ＭＢＶは、組織発生および恒常性の際のマトリックス沈着の際に、ならびに傷害後の動的マトリックスリモデリングの際に、ＥＣＭ構成成分と協力して細胞によって分泌されるはずである。さらに、ＥＣＭが、組織特異的３Ｄアーキテクチャに配置されたタンパク質、プロテオグリカンおよびグリコサミノグリカンの複合混合物であることを考慮すると（Hussey et al., Nature Review Materials, 3(7):159-173, 2018）、ＭＢＶカーゴおよび脂質含量も、組織および細胞起源に特有のものであるはずである。解剖学的に別個の供給源組織に由来するＥＣＭ生体足場から単離されたＭＢＶは、差次的なｍｉＲＮＡシグネチャーを有する（Huleihel et al., Science Advances, 2, e1600502, 2016）。本試験の結果は、異なるヒトドナーに由来する骨髄由来幹細胞、脂肪幹細胞および臍帯幹細胞によってｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたＥＣＭから単離されたＭＢＶが、細胞供給源に特異的な、特徴的なｍｉＲＮＡシグネチャーを含有したことをさらに示す。加えて、ＢＭＳＣ－ＡＳＣおよびＵＣＳＣ－ＡＳＣの間よりも少ないｍｉＲＮＡが、ＢＭＳＣおよびＵＣＳＣ由来ＭＢＶの間で差次的に発現されることが見出され、これは、脂肪幹細胞の組織特異的分化能に起因し得る知見である（L. Xu et al., Stem cell research & therapy 8, 275 (2017)）。これらの知見は、ドナーの固有の可変性によって有意に影響されなかった、ＭＢＶ ｍｉＲＮＡプロファイルの細胞特異的特色をさらに強調する。しかし、３名のヒトドナーが全員男性であったことを考慮すると、幹細胞試料由来のＭＢＶのｍｉＲＮＡカーゴにおける性別関連の変動を決定するためのさらなる試験が必要とされる。重要なことに、主成分解析は、異なるヒトドナーから単離された特異的な細胞型によって沈着されたＭＢＶ由来のｍｉＲＮＡカーゴの高い程度のバッチ間の一貫性を示し、このことは、研究ツールまたは臨床治療薬としてのＭＢＶおよびＥＣＭ生体材料製造を支持する。本試験は、マトリックスへ組み込まれたＭＢＶが、ＥＶの特有の亜集団であることを確立する。加えて、ＭＢＶは、エキソソームに一般的に起因するタンパク質（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９）の顕著な減少を示した。
体液中に分泌され、細胞間情報交換に容易に利用できるＥＶとは対照的に、組織ＥＣＭ内に包埋されるＭＢＶは、マトリックスに安定に会合し、ＥＣＭ材料の分解後のみに単離することができる（Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)）。ＭＢＶを放出するためのマトリックス分解の要件は、消散促進性脂質メディエーターを生成するその能力に関するものを含む、その作用機構を部分的に規定することができる。脱細胞化の後であっても、ＭＢＶは、無傷で、ＥＣＭに付着されたままであるため、その構成物リン脂質の分子種分化は、斯かるＭＢＶ－ＥＣＭ相互作用を容易にする可能性がある。ＬＣ－ＭＳに基づくリピドミクスおよびレドックスリピドミクスアプローチを使用して、ＭＢＶリン脂質、リゾリン脂質ならびに酸素化および非酸素化ＰＵＦＡの分子種分化の詳細な特徴付けを行った。マクロファージ分化、組織修復、リモデリングおよび創傷治癒に重要な生理活性分子であるリゾリン脂質が高レベルであることは、ＭＢＶの特徴的な特色である。加えて、融合性脂質として、リゾリン脂質は、細胞内標的への小胞内容物の移動を容易にすることができる。ＭＢＶではＰＵＦＡ非酸素化および酸素化リン脂質が濃縮されているが、液相ＥＶでは濃縮されておらず、したがって、ＭＢＶは、酸化されたおよび酸化できるエステル化ＰＬ種の潜在的なリザーバーを表す。注目すべきことに、ＰＵＦＡ濃縮ＭＢＶは、細胞外環境の炎症促進性／抗炎症性の文脈に依存した異なるホスホリパーゼによって活性化される脂質メディエーターの重要な供給源である。
（実施例２）
プリスタン誘導性関節炎の処置のためのＭＢＶの使用
実施例１に記載されている方法論を使用して、膀胱マトリックスを調製した。
２４時間室温でオービタル揺動機（ｏｒｂｉｔａｌ ｒｏｃｋｅｒ）において、緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）におけるリベラーゼＴＬ（高度に精製されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩ）による酵素消化によって、研究室で産生されたブタＵＢＭからＭＢＶを単離した。次に、消化されたＥＣＭを、１０，０００×ｇで３０分間の遠心分離に付して、ＥＣＭデブリを除去した。次に、遊離したＭＢＶを含有する清澄化された上清を、１００，０００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ超遠心分離機）で４℃にて２時間遠心分離して、ＭＢＶをペレットにした。
本実施例では、炎症性因子（inflammatory agent）プリスタンで処置したマウスモデルにおけるＭＢＶの全身性または局所投与の後に、抗炎症性効果を評価した。ラットにおけるプリスタン誘導性関節炎モデルは、関節リウマチを試験するための臨床的に関連する動物モデルとして確立された（Tuncel et al. PLoS One. 2016; 11(5):e0155936）。プリスタン誘導性関節炎は、試験０日目に、基部に対して１ｃｍ遠位で、尾の背側における３００μＬプリスタン（２，６，１０，１４－テトラメチルペンタデカン）の皮内注射によって、８週齢、雌のスプラーグドーリーラットにおいて誘導された。対照動物は、０日目にプリスタンの皮内注射を受けなかった。３００μＬプリスタンの第２の用量を、４日目に、背側尾基部に対しておよそ１ｃｍ遠位に、皮内投与した。プリスタンを受けている動物は、ケージに一緒に収容した。プリスタンを受けている動物を、次の実験群へとランダム化した：プリスタンのみ、メトトレキセート、関節周囲ＭＢＶおよび静脈内ＭＢＶ。関節周囲および静脈内ＭＢＶ投与経路の描写を図７に示す。
動物毎に、７、１０、１４、１７、２１、２８日目に、および１００日間のエンドポイントに至るまでその後毎週、関節炎スコアを決定した。それぞれ手掌および足底視点から見られるように、各前肢および後肢の写真を撮った。６０ポイント関節炎スコア化判断基準を使用して、関節炎を評価した：炎症した指関節または足指毎に１ポイントを与え、罹患した足首に最大５ポイントを割り当てた（足毎に１５ポイント、各ラットに６０ポイント）。プリスタンのみとして指定された動物は、７、１０、１４、１７および２１日目にいかなる処置も受けなかった。メトトレキセート動物は、７、１０、１４、１７および２１日目に腹腔内送達される、１×滅菌ＰＢＳにおける０．１ｍｇ／ｋｇメトトレキセートを受けた。関節周囲ＭＢＶ動物は、それぞれ後肢および前肢の足底および手掌表面において送達される、２５μＬの５００μｇ／ｍＬブタ由来ＵＢＭ ＭＢＶを受けた。静脈内ＭＢＶ群は、動物の側方尾静脈へと静脈内送達される、１００μＬの５００μｇ／ｍＬ ＵＢＭ ＭＢＶを受けた。各群における４匹の動物を２８日間の短期試験に割り当て、４匹の動物を１００日間試験に割り当てた。試料サイズは、予め決定されたアルファ０．０５およびベータ０．８０により、メトトレキセートの以前に発表された効果サイズを使用して決定した。関節炎スコアは、平均＋／－平均の標準誤差として表した。７～２１日目は、群毎に８のｎを表し、次いで、２８日目および以降は、群毎に４のｎを表す。テューキーの事後補正による分散の二元配置解析を使用して、群における差を解析した。０．０５のアルファにより試験前に有意性を決定した。
標的化されたＰＡ（関節周囲）および全身性ＩＶ投与の両方による、ＭＢＶの投与は、ラットにおける関節炎の重症度を有意に低下させ、ケアの絶対的な標準であるメトトレキセートと同様の有効性を呈した。全ラットが、７日目に０の関節炎スコアを呈したが（図８Ａ）、早くも１０日目に、プリスタンのみラットにおいて高い関節炎スコアが観察され、処置を受けている全ラットは、より低い関節炎スコアを呈した（図８Ｂ）。驚いたことに、１３日目に始まり、ＭＢＶ処置は、関節炎処置の絶対的な標準であるメトトレキセートと同じほどに効率的であった（図８Ｃおよび図８Ｄ）。２１日目までに、ＭＢＶ処置ラット（ＩＶおよびＰＡ処置の両方）は、メトトレキセート処置ラットよりも低い関節炎スコアを呈した（図８Ｅ）。ラット足の撮られた写真は、プリスタンのみおよびメトトレキセートおよびＭＢＶ処置ラットにおける紅斑および浮腫の差を実証する（図９Ａ～図９Ｂ）。実験の最初の２１日間にわたる処置群に及ぶ平均関節炎スコアを図１０に示す。ＭＢＶ投与のＰＡ投与は、プリスタンのみラットと比較して、関節炎スコアの匹敵する低下を呈し、メトトレキセート処置に匹敵する低下した関節炎スコアを呈したが、静脈内投与が、関節炎スコアの低下において、ＰＡおよびメトトレキセートと同じ有効性を有することが予想外に発見された。ＩＶ投与は、ＭＢＶの効力の希釈をもたらし、よって、炎症した関節に、あるとしても限定的な効果を有することが予測されたが、そのようなことは観察されなかった。驚いたことに、ＭＢＶ投与のＰＡおよびＩＶ経路の両方が、プリスタンのみラットと比較して、関節炎スコアの匹敵する低下を呈し、両者共に、メトトレキセート処置に匹敵して関節炎スコアを低下させた。炎症部位における関節周囲注射は有痛性であり、個体における多くの関節が炎症し得るため、ＭＢＶの静脈内投与が、ＰＡ投与と全く同じように有効であるという予想外の知見は、投与当たり単一の注射のみを要求し（関節当たり複数の注射ではなく）、したがって患者にとってより快適である、侵襲性が低いが等しく有効な治療効果のために、全身性送達経路を使用することができることを示唆する。
予想外なことに、ＩＶおよびＰＡ投与の両方によりＭＢＶを受けているラットにおいて、炎症再発も減少した。実験７７日目に至るまで収集されたデータは、炎症の慢性および再燃期における関節炎のための効率的な治療法としてのＭＢＶ処置を支持する。図１１Ａの写真に示す通り、表現型的には、ＰＡまたはＩＶ ＭＢＶで処置したラット足は、メトトレキセートで処置したものと等価な紅斑および浮腫を呈する。ＰＡおよびＩＶ ＭＢＶは、関節リウマチのためのケアの絶対的な標準であるメトトレキセートと等しい有効性で、炎症の慢性および再燃期におけるプリスタン誘導性関節炎臨床スコア化を低下させる（図１１Ｂ）。関節リウマチのラットモデル由来の組織の解析は、組織炎症および組織間の減少した間隙をもたらした。ＭＢＶ処置試料において、メトトレキセート処置により観察されるものに匹敵する間隙の回復および減少した炎症が見られ、生物および組織レベルの両方におけるＭＢＶの有効性を明らかにする。
２４日目にマウスから収集された血清試料を使用して、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって炎症促進性サイトカインの解析を評価した。図１２に示す通り、プリスタンのみ動物と比較して、関節周囲または静脈内のいずれかで投与されたＭＢＶは、ＩＬ－１－ベータ血清レベルを有意に減少させた（図１２Ｂ）。その上、局所投与されたＭＢＶ（すなわち、ＰＡ ＭＢＶ）は、ＴＮＦアルファ血清レベルの減少をもたらした（図１２Ａ）。これらのデータは、ＭＢＶが、免疫系のモジュレーターであることを強く示唆する。
まとめると、これらの実験由来のデータは、全身性または局所のいずれかのＭＢＶの初期処置経過が、ＭＢＶの初期処置経過が終わった後に数週間～数ヶ月間にわたり、関節炎症状の緩和において治療効果を有し、これにより、関節リウマチ症状のその後のフレアの重症度または頻度を低下させ、またはさらには、これらを排除し、軽快をもたらすことができることを示唆する。
データは、一般に、炎症性免疫応答をモジュレートするためのＭＢＶの有用性も示唆し、ＭＢＶが、炎症促進性サイトカインの産生を下方調節することができることを示す。このことは、サイトカインストーム等の過剰炎症性事象の軽減におけるＭＢＶの有効性を示唆し、これにより、ＭＢＶを、肺における過剰炎症から生じるＡＲＤＳ等の状態の処置に有用なものにする。
（実施例３）
イミキモド誘導性乾癬の処置のためのＭＢＶの使用
ＵＢＭおよびＵＢＭに由来するＭＢＶは、実施例２（上記参照）に記載されている方法論を使用して調製される。
外用適用されるとマウスにおいて乾癬様状態を誘導することが公知の化合物であるイミキモド（ＩＭＱ）を、１５日間にわたりマウスの剪毛した背中および右耳介への６２．５ｍｇの５％イミキモドクリームの毎日の外用適用によって８週齢雌Ｃ５７／ｂｌ６マウスに投与した。対照動物は、試験全体を通して外用イミキモドを受けず、代わりに、剪毛した背中および右耳介へのワセリンの外用投与を受けた。処置群および治療法パラダイムを、乾癬フレアの予防および既存のフレアの管理へと分けた。予防的治療法を受けている動物は、試験０～１６日目の間に処置を受け、管理治療法を受けている動物は、試験７～１６日目の間に処置を受けた。処置群は、腹腔内ＭＢＶおよびビヒクルのみ対照からなった。腹腔内ＭＢＶを受けている動物は、処置予定表によって指定される通り、試験の各日に、１０９個のブタ由来ＵＢＭ ＭＢＶを受けた。
７日目に、組織試料を収集し、組織学によって評価した。ＭＢＶが腹腔内注射によって投与される場合（７日間の処置期間にわたる、１０９個のＭＢＶの１日用量）、図１３に示す通り、乾癬性病変は消散される。
Ｆｏｘｐ３発現細胞は、ＴＲＥＧ細胞によって直接的に調節されるため、処置がＴＲＥＧ活性に影響を与えたか決定するために、Ｆｏｘｐ３ ＲＮＡを定量化した。製造業者の使用説明書に従ってトリゾールを使用して、試験部位の組織生検材料からＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ）を使用して、ＲＮＡ含量およびＡ２６０／２８０を決定した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素を使用した第１鎖逆転写によってｃＤＮＡを合成した。Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｆｏｘｐ３のためのｑＰＣＲを行った。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用して行われた全ｑＰＣＲは、５０℃２分間、９５℃１０分間、ならびに４０サイクルの９５℃１５秒間および６０℃１分間で行った。ＤｅｌｔａＤｅｌｔａＣＴ方法によってｑＰＣＲを解析し、Ｌｏｇ（倍数変化）は、陰性対照（イミキモドなし＋ＰＢＳビヒクル）におけるｆｏｘｐ３発現と比較したものである。Ｆｏｘｐ３プライマー（フォワード：５’－ＴＣＴＣＣＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＡＡＧＴＣ－３’およびリバース：５’－ＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＣＴＴＴＡＧＧ－３’）およびＧａｐｄｈプライマー（フォワード：５’－ＣＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡ－３’およびリバース：５’－ＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＴＴＣＡ－３’）。図１４に示す通り、ＭＢＶによる処置は、Ｆｏｘｐ３ ＲＮＡレベルを有意に増加させており、ＭＢＶが、ＴＲＥＧ細胞を刺激することを指し示す。まとめると、これらのデータは、ＭＢＶ処置が、全身性投与された場合であっても、同じ組織における増加した数の抗炎症性細胞表現型をもたらすことを指し示す。よって、局所および全身性投与の両方をＡＲＤＳの処置に使用することができる。
（実施例４）
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）マウスモデルにおけるＭＢＶの使用
ＵＢＭおよびＵＢＭに由来するＭＢＶは、実施例２（上記参照）に記載されている方法論を使用して調製される。
本実験では、免疫抑制および免疫毒性のキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）ラットモデルを使用して、全身性送達されたＭＢＶの免疫毒性を評価した。８週齢スプラーグドーリーラットを、４種の別々の群へと分けた：ＫＬＨ対照は、ＫＬＨによる免疫化後の正常な抗ＫＬＨ応答の実証に使用され、ビヒクル対照は、処置にもＫＬＨ免疫化にも関係しないいずれか潜在的な効果の制御に使用され、シクロホスファミド陽性対照は、強力な免疫抑制薬として使用され、ＭＢＶ処置群は、全身性免疫におけるＭＢＶ投与の効果の評価に使用された。－７日目に、シクロホスファミド処置動物は、腹腔内に２００ｍｇ／ｋｇを受けた。ＭＢＶ処置動物は、－７、－４および－１日目に、静脈内に１×１０９個の粒子のＭＢＶを受けた。０日目に、ビヒクル対照以外の全群を、フロイント不完全アジュバントにおける０．４ｍＬの１０００μｇ／ｍｌ再構成ＫＬＨで免疫化した。免疫化後７、１４および２１日目に、側方尾静脈から全血を収集し、抗ＫＬＨ ＩｇＧの解析のために血清を単離した。図１５に示す通り、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、全動物の血清における抗ＫＬＨ ＩｇＧを評価した。まとめると、これらのデータは、ＭＢＶで処置された動物が、依然として免疫適格性であり、免疫グロブリンに基づく応答を開始することができることを示唆する。
この知見は、抗炎症性処置としてのＭＢＶの有用性のための広い意義を有する。例えば、高サイトカイン血症から生じる過剰炎症を含む炎症を低下させるための多くの標準処置は、免疫抑制薬であり、対象を二次感染症のリスクにさらし、免疫応答を引き起こす薬剤に対して十分な免疫応答を開始する能力を減少させ、免疫の回復および発生に干渉する。しかし、ＭＢＶは、免疫応答を開始する対象の能力に干渉しないことが実証されているため、ＭＢＶは、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等のウイルス感染症に起因する、例えば、ＡＲＤＳにおける、抗炎症性処置として有用である。なぜなら、ＭＢＶが、依然として、炎症性サイトカインの産生を低下させ、修復および治癒に向かって免疫応答をモジュレートする一方で、ウイルスに対する免疫応答を開始する対象の能力には干渉しないはずだからである。
（実施例５）
ＭＢＶの投与は、ｉｎ ｖｉｖｏでＴＲＥＧを増加させる
ＵＢＭおよびＵＢＭに由来するＭＢＶは、実施例２（上記参照）に記載されている方法論を使用して調製される。
ノックアウトまたは野生型Ｃ５７／ｂｌ６マウスにおいて心臓毒筋肉傷害外科手術を行った；マウスは、野生型ＩＬ－３３発現Ａｒｇ－１ＧＦＰ（「ＷＴ Ｂ６」）またはノックアウトＩＬ－３３欠損Ａｒｇ－１ＧＦＰＢ６（「ＫＯ Ｂ６」）であった。これらのマウスの細胞におけるアルギナーゼ発現は、ＧＦＰ発現によって検出することができ、Ｍ２様表現型の同定を可能にする。ＩＬ－３３を天然に含有するＭＢＶ（国際特許出願公開番号ＷＯ２０１９／２１３４８２を参照）を、１×１０９個のＭＢＶの含量で筋肉傷害部位に投与した。手術後日数（ＰＯＤ）がＰＯＤ３およびＰＯＤ７に、傷害された腹横（transverse abdominal）（ＴＡ）筋を、マウスから外科的に収集し、組織検体を刻み、ディスパーゼで処置し、食塩水においてリンスし、このプロセスを反復して、非細胞デブリを除去した。フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）によって浸潤白血球を評価した。
図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＣＤ４５＋ＣＤ３－Ｂ２２０－ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ－ゲートにおける炎症性マクロファージの代表的なドットプロットおよび頻度を示す。ＩＬ－３３がないと、増加した数のマクロファージが存在し、これらは、Ｍ１炎症促進性表現型のものである。ＩＬ－３３を含有するＭＢＶは、有意に炎症性応答を減少させる。
図１６Ｃおよび図１６Ｄは、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｂ２２０－ＣＤ４＋ゲートにおけるＳＴ２＋ＴＲＥＧの代表的なドットプロットおよび頻度を示す。これらの結果は、ＩＬ－３３が、Ｆｏｘｐ３陽性であるＴＲＥＧ細胞の数の増加に必要とされることを示す。全ｐ値は、一元配置ＡＮＯＶＡを使用して計算した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
（実施例６）
ＭＢＶの投与は、ＩＬ－４産生を誘導する
ＵＢＭおよびＵＢＭに由来するＭＢＶは、実施例２（上記参照）に記載されている方法論を使用して調製される。
本実験では、正常マウスの脾臓からナイーブＴリンパ球を単離した。Ｔリンパ球を刺激して、Ｔ細胞応答を誘導した。一次標識試薬としてＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ１０５、抗ＭＨＣ－クラスＩＩ、Ｔｅｒ－１１９およびＴＣＲに対するビオチンコンジュゲート抗体のカクテルを使用した非ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇によって、８週齢Ｃ５７／Ｂｌ６Ｊマウスの脾臓から初代マウスＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。抗ビオチンマイクロビーズにより細胞を磁気標識し、磁石支援細胞選別を使用して非標識ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。単離されたＣＤ４＋細胞を、１０％ウシ胎仔血清、完全ＲＰＭＩ １６４０培地においてウェル毎に１．０×１０６個の細胞／ｍＬの最終濃度で、抗マウスＣＤ３イプシロン（３μｇ／ｍＬ）で予めコーティングされた１２ウェルプレートにおいて培養した。
それぞれのＴｈ（Ｔヘルパー）サブセットをそれぞれ、次の培養条件における５日間の培養によって誘導した。Ｔｈ１：抗マウスＣＤ２８（３μｇ／ｍｌ）、抗マウスＩＬ－４、クローン（１０μｇ／ｍＬ）、組換えマウスＩｌ－２（５ｎｇ／ｍＬ）および組換えマウスＩｌ－１２（１０ｎｇ／ｍＬ）。Ｔｈ２：抗マウスＣＤ２８（３μｇ／ｍｌ）、抗マウスＩＦＮ－ガンマ（１０μｇ／ｍＬ）、組換えマウスＩｌ－２（５ｎｇ／ｍＬ）および組換えマウスＩｌ－４（１０ｎｇ／ｍｌ）。Ｔｈ１７：抗マウスＣＤ２８（３μｇ／ｍｌ）、組換えマウスＴＧＦｂ（２．５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ６（２０ｎｇ／ｍｌ）、抗ＩＦＮｇ（１０μｇ／ｍｌ）、抗ＩＬ４（１０μｇ／ｍｌ）および抗ＩＬ２（１０μｇ／ｍｌ）。ＴｈＭＢＶ：抗マウスＣＤ２８（３μｇ／ｍｌ）、組換えマウスＩｌ－２（５ｎｇ／ｍＬ）および１×１０９個の粒子のＭＢＶ。これらの条件においてＴ細胞を５日間培養した。５日目に、細胞を洗浄し、無血清完全ＲＰＭＩ １６４０に交換し、５０ｎｇ／ｍＬホルボール１２－ミリステート１３－アセテートで２４時間刺激した。２４時間後に、細胞培養上清を収集し、Ｉｌ－４のＥＬＩＳＡを行った。
図１７に示す通り、Ｔｈ１の公知活性化因子（炎症促進性応答）で刺激された場合、このような細胞によって最小のＩＬ－４（強力な抗炎症性シグナル伝達分子）が産生された。Ｔｈ２の活性化因子（抗炎症性応答）が与えられた場合、予想通り細胞によって大量のＩＬ－４が産生された。細胞が、炎症促進性Ｔｈ１７表現型に向かって活性化された場合、ＩＬ－４は産生されなかった。細胞が、ＭＢＶ（１０９個のＭＢＶ／ウェル）に曝露された場合、ＩＬ－４産生の顕著な増加が起こった。まとめると、これらのデータは、ＭＢＶによる処置が、Ｔヘルパー細胞の強い抗炎症性表現型を誘導することを指し示す。
（実施例７）
ＭＢＶは、マクロファージにおいてサイトカインストームのメディエーターを下方調節し、サイトカインストームの負の制御因子の発現を増加させる
ＵＢＭおよびＵＢＭに由来するＭＢＶは、実施例２（上記参照）に記載されている方法論を使用して調製される。
６～８週齢Ｂ６マウスからマウス骨髄を収集した。骨髄から収集された細胞を洗浄し、２×１０６個の細胞／ｍＬでプレーティングし、４８時間毎の完全培地交換により、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）の存在下で７日間にわたりマクロファージへと分化させた。次に、１×１０９個のＭＢＶ／ｍｌありまたはなしで、マクロファージを処置した（群毎にｎ＝３）。３７℃における２４時間インキュベーション期間の後に、細胞を滅菌ＰＢＳで洗浄し、全ＲＮＡを収集し、ＲＮＡ配列決定を使用して解析した。Ｇｅｎｅｖｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔａｍｐｅｒｅ、Ｆｉｎｌａｎｄ）によってバイオインフォマティクス解析を行った。ＲパッケージＤＥＳｅｑ２、バージョン１．２４．０（Love et al., 2014. Genome Biology 15: 550）を使用して、差次的発現（ＤＥ）解析を行った。独立したフィルタリングの最適化に使用される有意性カットオフとして設定された０．０５のｐによる統計的検定のためにＷａｌｄ検定を使用し、帰無仮説は、対比群の間のｌｏｇ２の倍数変化が、ゼロに等しいことである。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順（Benjamini et al. 1995. Journal of the Royal Statistical Society B 57: 289-300）を使用した多重検定のためにＰ値を調整した。次に、調整されたｐ値のための閾値としての０．０５および絶対的なｌｏｇ２の倍数変化のための閾値としての１を使用して、得られた結果を事後フィルタリングした。遺伝子はまた、ｂｉｏｍａＲｔ、バージョン２．４０．５（Durinck et al. 2009. Nature Protocols, 4: 1184-1191）を使用して、ＭＧＩ記号、遺伝子の説明および遺伝子バイオタイプによりアノテートされた。配列決定結果は、ＭＢＶ処置が、表３に示す通り、ＣＤ１６３、Ｉｇｆ１、Ｎｌｒｐインフラマソーム、Ｃ５ａｒ２、Ｈｒｈ１、Ｈｄａｃ９、Ｉｇｆｂｐ４およびＰｐａｒｇを含む、サイトカインストームの決定的なメディエーターであることが公知の遺伝子の発現を有意に減少させたことを示した。さらに、ＭＢＶは、表４に示す通り、ＩＬ－１０およびＳｏｃｓ１－３を含む、サイトカインストームの負の制御因子の発現を増加させることが示された。
表3: MBVは、サイトカインストームに関与する遺伝子の発現を減少させた。
Figure 2023521831000004
 表4: MBVは、サイトカインストームの負の制御因子として作用する遺伝子の発現を増加させた。
Figure 2023521831000005
本データが実証する通り、ＭＢＶは、炎症促進性サイトカイン産生、特に、高サイトカイン血症（「サイトカインストーム」）に寄与する炎症促進性サイトカインの強力なモジュレーターであることが示される。ＭＢＶのこの特色は、肺における過剰炎症から生じるサイトカインストームおよびＡＲＤＳの処置または軽減のための候補としてのその有用性を示唆する。
（実施例８）
マウスインフルエンザモデルにおけるウイルス誘導性免疫応答の処置のためのＭＢＶの使用
ＵＢＭおよびＵＢＭに由来するＭＢＶは、実施例２（上記参照）に記載されている方法論を使用して調製される。
肺に局在化するＭＢＶの能力を決定するために、ＰＫＨ６７蛍光標識ＭＢＶを、１０９個の粒子／ｍＬの用量で、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへと鼻腔内にエアロゾル形態で２５０μｌ投与した。際立ったことに、マウス組織の免疫蛍光顕微鏡は、肺気道および肺胞におけるＭＢＶの有意な濃縮を示した。図１８に示す通り、ＭＢＶは、処置された肺組織の大小の気道において、特に、上皮において、明らかに検出可能であった（矢印で指し示される）が、実質においては観察されなかった。無処置対照肺組織（右パネル）は、ＭＢＶ処置組織に似ていない拡散したパターンで、非特異的な低レベル自己蛍光を示し、左および中央パネルにおける蛍光が、ＭＢＶ局在化を実際に指し示すことを実証する。
ＣＯＶＩＤ－１９に関連する急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）等、ウイルス誘導性ＡＲＤＳに対するＭＢＶの治療有効性を評価するために、Ｈ１Ｎ１のマウスモデルが使用される。インフルエンザＨ１Ｎ１は、ＣＯＶＩＤ－１９患者において観察されるものと同様の肺病理を誘導し、無症状期間、急速ＡＲＤＳ様肺傷害、および数週間または数ヶ月間持続する持続性肺胞炎を含む同様の発病時間経過をたどる。２００９ Ｈ１Ｎ１パンデミックウイルスは、その高い感染力および世界的伝播の観点からＳＡＲＳ－ＣｏＶ２にさらに似ている。
雄および雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、生存試験のための１０６ｐｆｕの致死用量または免疫学試験のための１０４ｐｆｕの亜致死用量のいずれかにおける中咽頭吸引によって、インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１パンデミックインフルエンザ）を感染させる。感染後３日目または５日目に、マウスを、鼻腔内または静脈内送達によってＭＢＶで処置する。
マウスを、次の６つの実験群にランダムに割り当てる（群毎に８匹のマウス、４匹のマウス／群の２つのコホート、雄および雌マウスの両方で実施）：１）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９のみ；２）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋対照（ビヒクルのみ）；３）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋鼻腔内ＭＢＶ処置 用量２５０μＬの１×１０６個のＭＢＶ／ｍｌ；４）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋鼻腔内ＭＢＶ処置 用量２５０μＬの１×１０９個のＭＢＶ／ｍｌ；５）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋静脈内ＭＢＶ処置 用量２５０μＬの１×１０６個のＭＢＶ／ｍｌ；６）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋静脈内ＭＢＶ処置 用量２５０μＬの１×１０９個のＭＢＶ／ｍｌ。健康なマウスの群が、ベースライン対照に使用される。マウスは、罹患率の代用としての毎日の体重追跡によって経過観察され、マウスは、２５％体重減少が観察された場合に屠殺される。これらの生存試験は、ウイルス誘導性死亡率に対するＭＢＶの有効性を実証し、投薬量および送達経路に基づくＭＢＶの有効性をさらに実証する。
３つの実験群に対して、上で決定された最も効果的な投薬戦略を使用して、免疫学的試験を行う：１）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９；２）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋対照；３）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋ＭＢＶ。マウス組織試料（肺およびリンパ節（ＬＮ）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）および血清を含むがこれらに限定されない）を感染後７および２１日目に収集する。ＦＬＥＸＩＶＥＮＴ（登録商標）（ＳＣＩＲＥＱ、Ｑｕｅｂｅｃ、ＣＡ）によって各時点で肺機能を測定して、炎症および浮腫の尺度としての準静的肺コンプライアンスを決定する。製造業者の使用説明書に従って肺機能測定を行う。
製造業者の使用説明書に従ってＢｉｏ－Ｐｌｅｘ（商標）サイトカインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって、局所サイトカインレベルを決定するために肺タンパク質ホモジネートを使用して、肺傷害および炎症を評価する。病理学的評価のための肺葉のヘマトキシリンおよびエオシン染色等の組織学的解析を行う。白血球数、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による抗体アイソタイプおよびレベルの定量化、抗ヘマグルチニン抗体レベル、ならびに血清サイトカインのＢｉｏ－Ｐｌｅｘ（商標）サイトカインアッセイ評価を含む血液評価を行う。その上、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ（商標）サイトカインアッセイによる気腔サイトカインレベルおよび鑑別（differential）炎症性細胞計数を決定するための試料の収集のために、気管支肺胞洗浄を行う。
肺消化物、ＬＮ懸濁物およびＢＡＬＦ由来の単一細胞を、蛍光標識された抗体で染色し、製造業者の使用説明書に従ってＣｙｔｅｋ（登録商標）Ａｕｒｏｒａを使用して、マルチパラメータースペクトルフローサイトメトリーを完了する。フローサイトメトリー評価を使用して、骨髄系区画（すなわち、炎症促進性サイトカイン分泌Ｍ１マクロファージならびに／または修復的および調節性Ｍ２マクロファージ）およびリンパ系区画（すなわち、調節性Ｔ細胞と共にウイルス特異的Ｔエフェクター細胞）の両方の変化を定量化する。ＬＮおよび肺組織の単一細胞ＲＮＡ配列決定解析も行って、ウイルス感染症およびＭＢＶ療法が、一緒におよび独立して、分子レベルで組織および免疫細胞集団をどのように形作っているのかを同定する。
結果は、ＭＢＶで処置された動物が、無処置対照動物と比較して、有意に減少したウイルス罹患率を示すことを示す。さらに驚いたことに、ＭＢＶで処置された感染した動物は、白血球数およびサイトカインレベルに見られる通り、減少した肺傷害および炎症を呈する。これらのデータは、ＭＢＶの投与が、急性呼吸窮迫をもたらす疾患および障害の免疫調節に有効な治療法であることと、ならびにＭＢＶが、ウイルス感染症によって誘導されたＡＲＤＳの重症度または発生率を低下させることができることを示す。これは、他の適応症の中でもとりわけ、パンデミックＨ１Ｎ１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２等、治療法が存在しないウイルス疾患、ならびに他のインフルエンザおよびコロナウイルス誘導性呼吸器疾患のための効果的な治療法を提供する。
（実施例９）
クリニックにおけるＣＯＶＩＤ－１９関連の急性呼吸窮迫症候群の処置のためのＭＢＶの使用
ＵＢＭおよびＵＢＭに由来するＭＢＶを、上記実施例２に記載された方法論を使用して調製する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２誘導性急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）と診断された患者、ＣＯＶＩＤ－１９陽性患者を、ＭＢＶで処置する。自力で呼吸ができる患者は、ネブライザー器具によって噴霧され、鼻および／または口を介して肺中に吸入される、３ｍＬの生理食塩水中およそ１×１０９のＭＢＶの用量を受ける。挿管された患者は、気管内送達される、３ｍＬの生理食塩水中１×１０９のＭＢＶの用量を受ける。腹腔内注射が好ましい投与様式であると決定された一部の患者は、腹腔内投与によって、約５０ｍＬの生理食塩水中１×１０９のＭＢＶを受ける。
血液酸素化レベルを、ＭＢＶ療法の用量を受ける前および受けた後に各患者において測定して、処置の治療有効性を決定する。さらに、洗浄により肺から流体試料を得、サイトカイン発現レベル、例えば、上記表３および４中に提供されるサイトカインを、ＥＬＩＳＡによって決定する。継続的な人工呼吸も酸素サポートもなしに酸素レベルを維持する能力、ならびに肺からの流体のクリアランスを示す胸部Ｘ線における改善および／または洗浄液試験から決定された炎症促進性サイトカインレベルにおける減少を含む改善の徴候を患者が示すまで、患者は、６～２４時間毎にこの用量を受け続ける。
（実施例１０）
実施例１１～１５のための材料および方法
ウイルス誘導性急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、例えば、ＣＯＶＩＤ－１９に関連するＡＲＤＳに対するＭＢＶの治療有効性を評価するために、Ｈ１Ｎ１のマウスモデルを使用した。インフルエンザＨ１Ｎ１は、ＣＯＶＩＤ－１９患者において観察されたものと同様の肺病理を誘導し、無症状期間、迅速なＡＲＤＳ様肺傷害、および数週間または数ヶ月持続する持続性肺胞炎を含む、同様の発病時間経過に従う。２００９ Ｈ１Ｎ１パンデミックウイルスは、その高い感染性および世界的伝播の観点から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２とさらに似ている。
雄および雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、生存試験のためには１０６ｐｆｕの致死用量、または免疫学試験のためには１０４ｐｆｕの亜致死用量のいずれかで、中咽頭吸引によってインフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１パンデミックインフルエンザ）を感染させた。感染後の３日目および５日目に、マウスを、静脈内送達によってＭＢＶで処置した。
マウスを、次の６つの実験群にランダムに割り当てた（群毎に８匹のマウス、４匹のマウス／群の２つのコホート、雄および雌マウスの両方で実施）：１）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９のみ；２）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋対照（ビヒクルのみ）；３）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋静脈内ＭＢＶ処置 用量２５０μＬの１×１０６ＭＢＶ／ｍｌ；４）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋静脈内ＭＢＶ処置 用量２５０μＬの１×１０９ＭＢＶ／ｍｌ。健康なマウスの群を、ベースライン対照として使用した。マウスを、罹患率の代用として毎日の体重追跡によって経過観察され、２５％の体重減少が観察された時点でマウスを屠殺する。これらの生存試験は、ウイルス誘導性死亡率に対するＭＢＶの有効性を実証し、投薬量および送達経路に基づくＭＢＶの有効性をさらに実証する。
３つの実験群に対して、上で決定した最も効果的な投薬戦略を使用して免疫学的試験を行った：１）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９；２）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋対照；３）インフルエンザＡ／ＣＡ／０７／２００９＋ＭＢＶ。マウス組織試料（肺およびリンパ節（ＬＮ）、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）、ならびに血清が含まれるがこれらに限定されない）を、感染後７および２１日目に収集する。
製造業者の使用説明書に従ってＢＩＯ－ＰＬＥＸ（商標）サイトカインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって、局所サイトカインレベルを決定するために肺タンパク質ホモジネートを使用して、肺傷害および炎症を評価した。病理学的評価のために、肺葉の組織学的解析、例えば、ヘマトキシリンおよびエオシン染色ならびにトリクローム染色を行った。白血球数、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）による抗体アイソタイプおよびレベルの定量化、抗ヘマグルチニン抗体レベル、ならびに血清サイトカインのＢＩＯ－ＰＬＥＸ（商標）サイトカインアッセイ評価を含む血液評価を行った。さらに、気管支肺胞洗浄を、ＢＩＯ－ＰＬＥＸ（商標）サイトカインアッセイによる気腔サイトカインレベルおよび鑑別炎症細胞計数を決定するための試料の収集のために行った。
肺消化物、ＬＮ懸濁物およびＢＡＬＦからの単一細胞を、蛍光標識した抗体で染色し、製造業者の使用説明書に従ってＣＹＴＥＫ（登録商標）Ａｕｒｏｒａを使用して、マルチパラメータースペクトルフローサイトメトリーを完了する。フローサイトメトリー評価を使用して、骨髄性区画（即ち、炎症促進性サイトカイン分泌Ｍ１マクロファージならびに／または修復性および調節性Ｍ２マクロファージ）およびリンパ系区画（即ち、調節性Ｔ細胞、ならびにウイルス特異的Ｔエフェクター細胞）の両方の変化を定量化した。ＬＮおよび肺組織の単一細胞ＲＮＡ配列決定解析も行って、ウイルス感染およびＭＢＶ療法が、一緒におよび独立して、分子レベルで組織および免疫細胞集団をどのように形作っているかを同定する。
（実施例１１）
ＭＢＶの全身性投与は、急性ウイルス媒介性肺病理を緩和する。
Ｈ１Ｎ１による気管内接種の７日後、マトリックス結合ナノ小胞の全身性投与は、肺組織のＨ＋Ｅ染色上で明らかなように、急性ウイルス関連肺病理を実質的に緩和した。７日目に、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳビヒクル対照群は、肺間質空間における細胞密度および硬化における増加を実証したが、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＭＢＶ群は、細胞密度における低下ならびに間質炎症性浸潤物における低下を示す（図１９Ａ）。ヒートマップの形態で細胞密度を可視化するためにｑｕＰａｔｈ人工知能を使用すると、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＭＢＶ群は、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳ群と比較して、細胞密度における低下を示した（図１９Ａ）。インフルエンザ感染後の肺の細胞浸潤物の組成のさらなる調査により、細気管支洗浄液（ＢＡＬＦ）、肺間質空間および脾臓におけるＣＤ４５＋好中球における増加が示された（図１９Ｂ、ｐ＜．０５）。静脈内ＭＢＶは、ＢＡＬＦ、肺間質空間および脾臓におけるＣＤ４５＋好中球の頻度を有意に低下させた（図１９Ｂ、ｐ＜．０５）。全身性ＭＢＶ投与による細胞浸潤および好中球存在における低下は、炎症促進性サイトカインおよびケモカインにおける低下に関連していた（図１９Ｃ）。具体的には、全身性ＭＢＶは、感染症における組織への好中球および骨髄性細胞動員に関与する、肺で産生されたＧ－ＣＳＦを低下させた（図１９Ｃ、ｐ＜．０５）。ＭＢＶの全身性投与は、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳ群と比較して、Ｉｌ－６、Ｉｌ－１ｂ、ＴＮＦ－アルファおよびＩＦＮ－ガンマを含む炎症促進性サイトカインの肺濃度を減少させた（図１９Ｃ、ｐ＜．０５）。
（実施例１２）
ＭＢＶは、Ｈ１Ｎ１接種後の抗ウイルスＣＤ４およびＣＤ８表現型を促進する。
気管内Ｈ１Ｎ１接種後の７日目に、ＭＢＶの全身性投与は、ＰＢＳのみの対照におけるベースライン比と比較して、肺におけるＣＤ４：ＣＤ８ Ｔ－細胞の比を有意に変更した（図２０Ａ、ｐ＜．０５）。ＭＢＶ投与による増加したＣＤ８：ＣＤ４ Ｔ－細胞比のこの促進は、肺では感染の部位において局所的に見られ、脾臓でも全身性に見られた（図２０Ａおよび２０Ｂ、ｐ＜．０５）。ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ－細胞のさらなる調査により、ＭＢＶは、ＰＢＳのみの対照と比較して、ＣＤ８：ＣＤ４ Ｔ－細胞の増加した比を支持するシフトを促進しただけでなく、活性化された（ＣＤ６９＋）および抗ウイルス（Ｔｂｅｔ＋）の両方のＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ－細胞における増加もまた促進した（図２０Ｃおよび２０Ｄ、ｐ＜．０５）。具体的には、脾臓のレベルでは、ＭＢＶは、ＰＢＳのみの群およびインフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳ群と比較して、ＣＤ６９＋ＣＤ４ Ｔ－細胞の頻度を増加させた（図２０Ｃ、ｐ＜．０５）。全身性ＭＢＶは、ＰＢＳのみの群およびインフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳ群と比較して、リンパ節における抗ウイルスＴｂｅｔ＋ＣＤ４ Ｔ－細胞の頻度も増加させた（図２０Ｃ、ｐ＜．０５）。ＭＢＶは、ＰＢＳのみの群およびインフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳ群の両方と比較して、脾臓におけるＣＤ６９＋の活性化されたＣＤ８ Ｔ－細胞の頻度も増加させた（図２０Ｄ、ｐ＜．０５）。有意ではないが、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳ群と比較して、全身性ＭＢＶ群において、脾臓におけるＴｂｅｔ＋の抗ウイルスＣＤ８ ｔ－細胞の漸増する頻度の傾向が存在した（図２．Ｄ、ｐ＞．０５）。
（実施例１３）
ＭＢＶは、長期ウイルス媒介性肺炎症を緩和する
Ｈ１Ｎ１による気管内接種の２１日後に、ＭＢＶの全身性投与は、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳ群と比較して、肺組織における全体的細胞密度を実質的に低下させた（図２１Ａ）。感染後の７日目と同様に、ＭＢＶの全身性投与は、肺では局所的レベルで、ならびに脾臓では全身性に、ＣＤ４５＋好中球の全体的頻度を有意に低下させた（図２１Ｂ）。炎症促進性好中球の低下と組み合わせて、肺における免疫調節性ＣＤ１１＋樹状細胞の頻度における同時発生的な増加が存在する（図２１Ｃ）。さらに、ＭＢＶの全身性投与は、長期ウイルス炎症において上昇したものと比較して、炎症促進性ケモカインおよびサイトカインを低下させる（図３．Ｄ、ｐ＜．０５）。具体的には、ＭＢＶは、ＩＬ１２、Ｉｌ１－ベータ、ＭＣＰ１およびＫＣの肺濃度を低下させる（図３．Ｄ、ｐ＜．０５）。
（実施例１４）
ＭＢＶの全身性投与は、ＣＤ４ Ｔ－細胞およびＣＤ８ Ｔ－細胞の両方において、プロメモリー（Ｐｒｏ－Ｍｅｍｏｒｙ）免疫応答を誘導する。
インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳと比較して、ＭＢＶ ｉ．ｖ．の投与は、ウイルス媒介性肺病理において炎症および細胞浸潤の消散を促進しただけでなく、メモリー免疫応答もまた促進した。具体的には、ＭＢＶの全身性投与は、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳ群と比較して、ＣＤ６２ｌ＋／ＣＤ４４＋メモリーＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ－細胞の頻度を増加させた（図２２Ａおよび２２Ｂ、ｐ＜．０５）。
（実施例１５）
ウイルス関連の組織損傷および細胞外マトリックス堆積は、ＭＢＶの全身性投与によって減少される。
Ｈ１Ｎ１接種の２１日後に、インフルエンザ＋ｉ．ｖ．ＰＢＳと比較した全身性ＭＢＶは、ｑｕＰａｔｈ人工知能で定量化したトリクローム画像上で可視化されたように、ウイルス関連の組織損傷および新たな細胞外マトリックス堆積を有意に低下させた（図２３Ａおよび２３Ｂ、ｐ＜．０５）。
結果は、ＭＢＶで処置した動物が、未処置の対照動物と比較して、有意に減少したウイルス罹患率を示したことを示している。さらに驚いたことに、ＭＢＶで処置した感染動物は、白血球数およびサイトカインレベルにおいて見られたように、減少した肺傷害および炎症を示す。これらのデータは、ＭＢＶの投与が、急性呼吸窮迫をもたらす疾患および障害の免疫調節のための有効な治療法であったこと、ならびにＭＢＶがウイルス感染によって誘導されるＡＲＤＳの重症度または発生率を低下させることができることを示した。これは、他の適応症の中でもとりわけ、ＡＲＤＳ、治療法が存在しないウイルス疾患、例えば、Ｈ１Ｎ１またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２によって引き起こされる疾患のための効果的な治療を提供する。データは、他のインフルエンザおよびコロナウイルス誘導性呼吸器疾患を処置するための方法もまた提供する。
（実施例１６）
実施例１７～１９のための材料および方法
四頭筋を、０．０２％トリプシンおよび０．０５％ＥＤＴＡで最初に脱細胞化し、０．０１％過酢酸で消毒した後、ＥＣＭからＭＢＶを放出するための室温で一晩の緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）中でのリベラーゼＴＨによる酵素消化を行う。
エキソソームを、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈから得たＣ５７Ｂｌ６マウス血漿から単離した。
ｃＭＶを、Chaudhary et al. Matrix Biol. 52-54:284-300, 2016中に以前に記載されたように、１７ＩＩＡプレ－象牙芽細胞（ｐｒｅ－ｏｄｏｎｔｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）から単離した。簡潔に述べると、１７ＩＩＡ細胞の骨形成性分化を、２４時間にわたって１０ｍＭ Ｎａ－Ｐｉ緩衝液（ｐＨ７．４）および５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を用いて誘導し、その後、緩衝液中１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＡによる３７℃で２時間の酵素消化を行った。
小胞の単離：次いで、上記のような適切な調製の後に、試料を、５００×ｇで１０分間、２，５００×ｇで２０分間および１０，０００×ｇで３０分間の遠心分離に供して、細胞およびＥＣＭデブリを除去し、上清を０．２２μｍフィルターに通過させた。次いで、小胞を含有する清澄化した上清を、１００，０００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－９０Ｋ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）で４℃、７０分間遠心分離して、小胞をペレットにした。小胞ペレットを、１×ＰＢＳ中に再懸濁し、アリコートに分け、さらなる使用まで－２０℃で貯蔵した。
小胞タンパク質マーカーの特徴付け：小胞サブタイプを分析して、エキソソームに共通して関連するタンパク質マーカーの発現レベルを決定した。タンパク質マーカーを、５０μｇの小胞タンパク質を用いてＥｘｏ－Ｃｈｅｃｋ（商標）エキソソーム抗体アレイ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して解析した。ＩｍａｇｅＪを使用して、解析した各タンパク質の相対的発現を定量化した。
マウス骨髄由来マクロファージの単離および処置：骨髄由来マクロファージを、Sicari et al., Biomaterials 35:8605-8612, 2014によって以前に記載されたように、Ｃ５７Ｂｌ６マウスの脛骨および大腿骨から単離した。収集した単核細胞を、２×１０６細胞／ｍＬの比で播種し、単球を、マクロファージコロニー刺激因子（ＭＣＳＦ）含有培地との３７℃および５％ＣＯ２で７日間の培養によって、マクロファージへと分化させた。得られた細胞を、ナイーブマクロファージと称した。ナイーブマクロファージを、２４時間にわたり、次の処置のうちの１つに曝露させた：１）Ｍ１マクロファージを誘導するためのＬＰＳ／ＩＦＮγ、２）Ｍ２マクロファージを誘導するためのＩＬ－４、３）１×１０９粒子／ｍＬの血漿エキソソーム、４）１×１０９粒子／ｍＬの１７ＩＩＡ ｃＭＶ、または５）１×１０９粒子／ｍＬの筋肉ＭＢＶ。
遺伝子発現：２４時間後、ＲＮＡを、トリゾールを用いて回収した。１０００ｎｇのＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従ってＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｃＤＮＡに変換した。リアルタイムｑＰＣＲを、ＰｏｗｅｒＵｐ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎマスターミックスを使用して実施した。相対的遺伝子発現を、処置なし（Ｍ０）対照と比較して、２－ΔΔＣｔ法によって決定した。
統計的解析：二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびテューキー補正を伴う事後解析により、群間の有意な比較を決定した。全ての統計的解析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて完了させた。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜．００１。
（実施例１７）
ＭＢＶは、共通のエキソソームマーカーであるＣＤ６３もＣＤ８１も発現しない。
ＥＸＯ－ＣＨＥＣＫ（商標）エキソソーム抗体アレイ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、マウスエキソソーム、マウス骨髄骨マトリックス小胞（骨ＭＶ）およびマウスマトリックス結合ナノ小胞（ＭＢＶ）上の共通のエキソソームマーカーの存在または非存在を比較した。結果は、図２４の上パネルに示され、ＭＢＶが、エキソソームの標準的で十分に受容されたマーカー、例えば、ＣＤ６３およびＣＤ８１を事実上欠くことを明らかに示している。さらに、図２４の上パネルで同定された他のシグナル伝達分子は、ＭＢＶ中には存在しなかったが、これらは、骨マイクロ小胞およびエキソソームにおいて、中等度の程度または高い程度のいずれかまで存在した。発現値のデンシトメトリープロットは、図２４の下パネルに示される。
データは、エキソソームおよび骨ＭＶが、これらのマーカーの中等度～高い発現を有する同様の発現プロファイルを共有するが、ＭＢＶは、これらのＥＶマーカーの発現において有意に異なることを示している。例えば、ＭＢＶはまた、エキソソームウェル上の同じ位置にある濃いリングまたは塗りつぶしの濃いスポットの存在と比較してブランクウェルによって、および下パネルのグラフ中に示されるこれらのマーカーの相対的発現レベルによって示されるように、ＥｐＣＡＭ、ＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１、ＦＬＯＴ１、ＩＣＡＭ１およびＡＬＩＸのうち１種または複数を事実上欠く、即ち、「低い」または「検出不能な」レベルの、ＥｐＣＡＭ、ＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１、ＦＬＯＴ１、ＩＣＡＭ１およびＡＬＩＸのうち１種または複数を有する。骨ＭＶは、ウェル上の濃いスポットによっておよび下パネルのグラフ中に示されるこれらのマーカーの相対的発現レベルによって示されるように、ＭＢＶと比較して、これらのマーカーの全ての、より高いレベルの発現もまた有する。
一実施形態では、ＭＢＶは、ＥＸＯ－ＣＨＥＣＫ（商標）エキソソーム抗体アレイの陽性対照と比較して低いまたは検出不能なレベルの、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＥｐＣＡＭ、ＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１、ＦＬＯＴ１、ＩＣＡＭ１およびＡＬＩＸのうち１種または複数を有する。一実施形態では、ＭＢＶは、エキソソーム、例えば血漿エキソソームと比較して低いまたは検出不能なレベルの、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＥｐＣＡＭ、ＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１、ＦＬＯＴ１、ＩＣＡＭ１およびＡＬＩＸのうち１種または複数を有する。一実施形態では、ＭＢＶが、骨ＭＶと比較して低いまたは検出不能なレベルの、Ｃｄ６３、ＣＤ８１、ＥｐＣＡＭ、ＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１、ＦＬＯＴ１、ＩＣＡＭ１およびＡＬＩＸのうち１種または複数を有する。一実施形態では、ＭＢＶは、エキソソームまたは骨ＭＶと比較して低いまたは検出不能なレベルの、ＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１およびＩＣＡＭ１によって特徴付けられる。一実施形態では、ＭＢＶは、骨ＭＶまたは血漿エキソソームと比較して低いまたは検出不能なレベルの、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１およびＩＣＡＭ１によって特徴付けられる。
（実施例１８）
ＭＢＶは、骨ＭＶマーカーの低い発現を有するまたは発現を有さない。
骨ＭＶマーカーアネキシンＶおよび組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）の発現を、ウエスタンブロット解析によって評価した。結果は図２５に示される。１７１１Ａ細胞から調製した溶解物を、陽性対照として使用した。この実験の結果は、マトリックス結合ナノ小胞（ＭＢＶ）が、骨マイクロ小胞の両方のマーカー、ＴＮＡＰおよびアネキシンＶのいずれの発現をも欠くことを示している。血漿エキソソームは、アネキシンＶを発現するが、ＴＮＡＰは発現しない。これらの結果は、エキソソームおよび骨マイクロ小胞の両方からＭＢＶを明らかに識別する。
（実施例１９）
ＭＢＶは、エキソソームまたは骨ＭＶと比較して、差次的な免疫調節効果を有する。
マウスから収集した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を、未処置とした（Ｍ０）、または次の試験物品で２４時間処置した：Ｍ１表現型を誘導するためのＩＦＮγ＋ＬＰＳ（Ｍ１）、Ｍ２様表現型を誘導するためのＩＬ－４（Ｍ２）、血漿に由来するエキソソーム、１７Ａ細胞に由来する骨ＭＶ、または筋肉から単離されたＭＢＶ。処置後、示された遺伝子の発現における倍数変化を、ｑＰＣＲによって評価した。図２６に示される結果は、ＭＢＶによる炎症促進性マーカーＩＬ－６およびＴＮＦ－αの下方調節が、エキソソームおよび骨マイクロ小胞による同じ２種の炎症性メディエーターの下方調節から明らかに識別されることを示している。ＭＢＶは、強力な抗炎症効果を有した；しかし、エキソソームおよび骨マイクロ小胞は有さなかった。
参照による組み込み
反対の主張がなされない限り、本明細書で言及される特許文献および科学論文の各々の全開示が、全ての目的のために参照により組み込まれる。
均等物
本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなしに、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、上述の実施形態は、全ての態様において、本明細書に記載される発明を限定するのではなく例示するとみなすべきである。したがって、本発明の範囲は、上述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内に入る全ての変化が、本明細書で容認されることが意図される。

Claims (60)

  1. 急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を発症するリスクがある対象におけるＡＲＤＳを処置または予防する方法であって、細胞外マトリックスに由来する単離されたマトリックス結合小胞（ＭＢＶ）の治療有効量を含む医薬組成物を前記対象に投与し、これにより、前記対象におけるＡＲＤＳを処置または予防するステップを含む、方法。
  2. 前記対象が、起源がウイルス、細菌または真菌である肺感染症を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、エボラウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルスまたはヘルペスウイルスからなる群より選択されるウイルスによる肺感染症を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記対象が、肺炎を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣＯＶＩＤ－１９に感染している、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記対象が、インフルエンザを有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記対象が、ＳＡＲＳまたはＭＥＲＳを有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記対象が、毒性物質を吸入した、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記毒性物質が、煙、化学物質煙霧、またはベイピングによる蒸気である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記対象が、肺内に吸引した水、嘔吐物または食物を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記対象が、肺または呼吸を制御する脳の一部分を損傷する頭部または胸部傷害を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記対象が、敗血症を有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記対象が、膵炎を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記対象が、重症熱傷を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記対象が、大量輸血を受けた、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記対象が、高サイトカイン血症を経験する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ＭＢＶの投与が、前記対象における高サイトカイン血症を逆転させる、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ＭＢＶが、ＡＲＤＳの開始を予防するために、ＡＲＤＳの開始に先立ち前記対象に投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＭＢＶが、前記ＡＲＤＳを処置しＡＲＤＳの進行を予防するために、ＡＲＤＳの開始後に前記対象に投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記対象が、ヒト対象である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記医薬組成物が、全身性静脈内（ＩＶ）注射によって投与される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記全身性静脈内注射が、標準ＩＶラインまたは中心ライン経由である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記中心ラインが、末梢挿入中心カテーテル（ＰＩＣＣ）、トンネル型カテーテルまたは植え込み型ポートである、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記標準ＩＶラインが、手首、腕または手の静脈内にある、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記静脈内注射が、ボーラス注射または持続性点滴またはポンプ注射である、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記医薬組成物が、ネブライザーによるエアロゾルとして前記対象の肺に投与される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記医薬組成物が、前記対象に配置された気管内チューブ経由の気管内滴下注入によって投与される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記医薬組成物が、鼻腔内投与により定量吸入器によって肺に投与される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  29. （ｉ）前記ＭＢＶが、ＣＤ６３、ＣＤ８１および／もしくはＣＤ９のうち１種もしくは複数を発現しないか、または辛うじて検出可能なレベルのＣＤ６３、ＣＤ８１および／もしくはＣＤ９を有する、ならびに／または
    （ｉｉ）前記ＭＢＶが、以下：
    （ａ）少なくとも５５％のホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の組合せを含むリン脂質含量、
    （ｂ）１０％もしくはそれ未満のスフィンゴミエリン（ＳＭ）を含むリン脂質含量、
    （ｃ）２０％もしくはそれ未満のホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリン脂質含量、および／または
    （ｄ）１５％もしくはそれよりも高いホスファチジルイノシトール（ＰＩ）を含むリン脂質含量
    を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記ＭＢＶが、膀胱、小腸、心臓、真皮、肝臓、腎臓、子宮、脳、血管、肺、骨、筋肉、膵臓、胎盤、胃、脾臓、結腸、脂肪組織または食道の細胞外マトリックスに由来する、請求項１～２９のいずれかに記載の方法。
  31. 前記ＭＢＶが、膀胱マトリックス（ＵＢＭ）、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）または膀胱粘膜下組織（ＵＢＳ）に由来する、請求項１～３０のいずれかに記載の方法。
  32. 前記ＭＢＶが、ヒト、サル、ブタ、ウシまたはヒツジから選択される哺乳類の脊椎動物由来の細胞外マトリックスに由来する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ＭＢＶが、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０２０個のＭＢＶの量で投与される、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ＭＢＶが、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０６～１×１０１２個のＭＢＶの量で投与される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ＭＢＶが、投与当たり体重１ｋｇ当たり１×１０９～１×１０１４個のＭＢＶの量で投与される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記対象が、抗生物質、抗ウイルスまたは抗炎症薬物療法を受ける、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記対象が、レムデシビル、ファビピラビル、アジスロマイシンまたはヒドロキシクロロキンを受ける、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記対象が、トシリズマブ、アナキンラまたはヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤を受ける、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記対象が、免疫抑制剤で処置された対象と比較して、ＭＢＶによる処置の結果として低下した二次感染症リスクを有する、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記二次感染症が、肺感染症である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記二次感染症が、血液における感染症である、請求項３９に記載の方法。
  42. 前記二次感染症が、心臓、腎臓または肝臓におけるものである、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記二次感染症が、細菌感染症である、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記二次感染症が、ウイルス感染症である、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記対象における酸素飽和度が、前記医薬組成物の投与後に、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超増加する、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記対象における酸素飽和度指数が、前記医薬組成物の投与後に、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超増加する、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記対象における酸素指数が、前記医薬化合物の投与後に、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％超増加する、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記増加が、前記医薬組成物の投与後１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１８時間または２４時間以内に起こる、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記対象が、ＭＢＶの前記投与後に、炎症促進性サイトカインの産生の減少を経験する、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記炎症促進性サイトカインが、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－８、ＩＬ－６、ＩＬ－１βまたはＩＬ－１２のうち１種または複数である、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記対象が、ＭＢＶの前記投与後に、抗炎症性サイトカインの産生の増加を経験する、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記抗炎症性サイトカインが、ＴＧＦ－β、ＩＬ－４またはＩＬ－１０である、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記増加または減少が、前記ＭＢＶの投与の前および後に前記対象の肺から気管支肺胞洗浄液をサンプリングすることにより測定される、請求項５０～５２に記載の方法。
  54. 前記増加または減少が、前記ＭＢＶの投与の前および後に前記対象の血液をサンプリングすることにより測定される、請求項５０～５３に記載の方法。
  55. 前記対象に前記医薬組成物を投与するステップが、以下：
    ａ）前記対象の肺におけるＣＤ４５＋好中球の数の低下、
    ｂ）前記対象の肺または脾臓におけるＣＤ８＋細胞の数の増加およびＣＤ４＋Ｔ細胞の数の低下、
    ｃ）前記対象の脾臓におけるＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加、
    ｄ）前記対象のリンパ節における抗ウイルスｔｂｅｔ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加、
    ｄ）前記対象の脾臓における抗ウイルスｔｂｅｔ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加、
    ｅ）前記対象の脾臓におけるＣＤ６９＋ＣＤ８＋ｔ細胞の数の増加、
    ｆ）肺における免疫調節性ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞の数の増加、ならびに
    ｇ）肺におけるＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４４＋メモリーＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の数の増加
    のうち１つまたは複数をもたらす、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記対象に前記医薬組成物を投与するステップが、前記対象におけるウイルス関連の組織損傷を低下させる、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 前記ＭＢＶが、低いまたは検出不能なレベルの、次のマーカー：ＥｐＣＡＭ、ＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１、ＦＬＯＴ１、ＩＣＡＭ１、ＧＭ１３０またはＡＬＩＸのうち１種または複数を発現する、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記ＭＢＶが、低いまたは検出不能なレベルの、次のマーカー：ＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１またはＩＣＡＭ１のうち１種または複数を発現する、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記ＭＢＶが、低いまたは検出不能なレベルのＣＤ８１、ＣＤ６３、ＡＮＸＡ５、ＴＳＧ１０１およびＩＣＡＭ１を発現する、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  60. 急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を処置するための、細胞外マトリックスに由来する単離されたマトリックス結合小胞（ＭＢＶ）の使用。
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