CN115515607A - 用于治疗急性呼吸窘迫综合征的基质结合囊泡(mbv) - Google Patents

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Abstract

公开了治疗有需要的受试者的急性呼吸窘迫综合征(例如病毒感染相关的急性呼吸窘迫综合征，例如SARS‑CoV2(COVID‑19))的方法。这些方法包括向受试者施用药物制剂，该药物制剂包含源自细胞外基质的分离的基质结合囊泡(MBV)。

Description

用于治疗急性呼吸窘迫综合征的基质结合囊泡(MBV)
交叉引用的相关申请
本申请要求2020年4月16日提交的美国临时申请号63/011,177的权益，其通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本申请涉及施用源自细胞外基质的基质结合囊泡(MBV)用于治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS，例如由SARS-CoV2(COVID-19)引起的ARDS)的用途。
背景技术
冠状病毒病2019(COVID-19)大流行是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2，在本领域也称为2019-新型冠状病毒或2019-nCoV)感染引起的，目前是全球公共卫生问题的来源。许多患者的治疗在临床上具有挑战性。(Mehta等人(2020)COVID-19:Consider Cytokine Storm Syndromes and Immunosuppression.Lancet.395(10229):1033-1034)。尽管已经动员了大量资源来开发抗病毒、抗炎、免疫抑制药物和疫苗，但越来越多的证据表明，高细胞因子血症(hypercytokinemia)，也称为细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征，是患有最严重疾病的COVID-19患者的共同特征和死亡的主要原因。(Tian,S.等人(2020)Pulmonary Pathology of Early-Phase 2019 Novel Coronavirus(COVID-19)Pneumonia in Two Patients With Lung Cancer.J.Thorac.Oncol.S1556-0864(20)30132-5)。此外，高细胞因子血症是患者死亡率的强有力指标，通常由急性呼吸窘迫综合征(ARDS)引起。高细胞因子血症和ARDS均反映了由SARS-CoV-2病毒感染引发的免疫系统的病理性失调。目前的治疗方法通过免疫抑制或抑制特定炎症介质来解决异常炎症，从而增加对继发感染的敏感性。
因此，仍然迫切需要新的有效治疗方法来调节免疫系统病症，例如由病毒感染引起的那些病症，例如ARDS，例如，由SARS-CoV-2引起的ARDS。
发明内容
本文提供了治疗或预防急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防具有发展ARDS风险的受试者的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法。该方法包括向受试者施用包含治疗有效量的源自细胞外基质的分离的基质结合囊泡(MBV)的药物组合物，从而治疗或预防受试者的ARDS。公开的方法可以包括选择患有ARDS或具有患ARDS风险的受试者。
患者的ARDS可能由多种原发病状引起。例如，在一个实施方案中，受试者患有源自于病毒、细菌或真菌的肺部感染。例如，受试者可能患有肺部病毒感染，该病毒选自SARS-CoV2、SARS-CoV、MERS-CoV、埃博拉病毒、流感病毒、巨细胞病毒或疱疹病毒。在任何前述实施方案中，受试者可能患有肺炎。在一个实施方案中，受试者感染SARS-CoV-2或COVID-19。在另一个实施方案中，受试者患有流感。在另一个实施方案中，受试者患有SARS或MERS。在又另一个实施方案中，受试者吸入有毒物质，例如烟、化学烟雾或来自电子烟(例如，来自电子香烟)的蒸气。在又另一个实施方案中，受试者已经将水、呕吐物或食物吸入肺中。在另一个实施方案中，受试者患有头部或胸部损伤，肺或控制呼吸的大脑部分受损。在其他实施方案中，受试者患有败血症。在又其他实施方案中，受试者患有胰腺炎。在另一个实施方案中，受试者患有重度烧伤。在另一个实施方案中，受试者已经接受输血。
根据本发明，在一些实施方案中，本发明的方法在出现高细胞因子血症的受试者中实施。例如，根据本发明施用MBV逆转受试者的高细胞因子血症的影响。在一些实施方案中，在ARDS发作之前向受试者施用MBV以预防ARDS的发作。又在其他实施方案中，在ARDS发作之后向受试者施用MBV以治疗ARDS并预防ARDS进展。
在本发明方法的一个实施方案中，受试者是人受试者。
根据本发明的一个实施方案，包含MBV的药物组合物通过全身静脉内(IV)注射施用。例如，全身静脉内注射经由标准IV管或中心管进行。在一些实施方案中，中心管是经外周插入中心静脉导管(PICC)、隧道式导管或植入式输液港。在一些实施方案中，标准IV管在腕部、手臂或手的静脉中。在又其他实施方案中，静脉内注射是推注，或连续滴注或泵注。
根据另一个实施方案，将药物组合物施用于受试者的肺。例如，药物组合物经由喷雾器作为气雾剂施用。在又其他实施方案中，药物组合物通过气管内滴注施用。例如，经由植入受试者的气管导内管进行施用。在又其他实施方案中，药物组合物通过计量吸入器施用于肺。
根据另一个实施方案，MBV(i)不表达CD63、CD81和/或CD9中的一种或更多种，或几乎检测不到CD63、CD81和/或CD9水平；和/或(ii)MBV包含(a)至少55％的包含磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)组合的磷脂含量；(b)10％或更少的包含鞘磷脂(SM)的磷脂含量；(c)20％或更少的包含磷脂酰乙醇胺(PE)的磷脂含量；和/或(d)15％或更多的包含磷脂酰肌醇(PI)的磷脂含量。
在又另一个实施方案中，MBV源自以下各项的细胞外基质：膀胱、小肠、心脏、真皮、肝脏、肾脏、子宫、脑、血管、肺、骨、肌肉、胰腺、胎盘、胃、脾脏、结肠、脂肪组织或食道。在一个实施方案中，MBV源自以下各项的细胞外基质：膀胱、小肠、心脏、真皮、肝脏、肾脏、子宫、脑、血管、肺、肌肉、胰腺、胎盘、胃、脾脏、结肠、脂肪组织或食道。在一个实施方案中，MBV不是源自骨细胞外基质。
在又另一个实施方案中，MBV源自膀胱基质(UBM)、小肠粘膜下层(SIS)或膀胱粘膜下层(UBS)。在一个实施方案中，MBV源自膀胱基质(UBM)。在一个实施方案中，MBV源自小肠粘膜下层(SIS)。在一个实施方案中，MBV源自膀胱粘膜下层(UBS)。
在又另一个实施方案中，MBV源自哺乳类脊椎动物的细胞外基质，该哺乳类脊椎动物选自人、猴、猪、牛或羊。
在又另一个实施方案中，MBV以每次施用每kg体重1×106至1×1012MBV的量施用。
在一些实施方案中，受试者接受抗生素、抗病毒药物或抗炎药物。例如，受试者接受瑞德西韦、法维拉韦、阿奇霉素或羟氯喹。例如，受试者接受瑞德西韦、法维拉韦、阿奇霉素或羟氯喹，并且受试者患有COVID-19。例如，在一些实施方案中，受试者接受托珠单抗、阿那白滞素或Janus激酶(JAK)抑制剂。例如，受试者接受托珠单抗、阿那白滞素或Janus激酶(JAK)抑制剂，并且受试者患有COVID-19。
在另一个实施方案中，与接受免疫抑制剂治疗的受试者相比，由于接受MBV治疗，受试者具有降低的继发感染风险。例如，继发感染是肺部感染。例如，继发感染是血液中的感染。例如，继发感染在心脏、肾脏或肝脏中。例如，继发感染是细菌感染。例如，继发感染是病毒感染。
在进一步的实施方案中，在施用药物组合物后，受试者出现氧饱和度增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％。在另一个实施方案中，在施用药物组合物后，受试者出现氧饱和度指数增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％。在另一个实施方案中，在施用药物化合物后，受试者出现氧指数增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％。增加可以施用药物组合物后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时或24小时内发生。
在另一个实施方案中，受试者在施用MBV后出现促炎细胞因子的产生减少。例如，促炎细胞因子是TNF-α、IFN-γ、IL-8、IL-6、IL-1β或IL-12中的一种或更多种。在另一个实施方案中，受试者在施用MBV后出现抗炎细胞因子的产生增加。例如，抗炎细胞因子是TGF-β、IL-4或IL-10。在一个实施方案中，增加或减少通过在施用MBV之前和之后从受试者的肺取样支气管肺泡灌洗液来测量。在又另一个实施方案中，增加或减少通过在施用MBV之前和之后对受试者的血液进行取样来测量。在另一个实施方案中，治疗的有效性通过与ARDS和/或高细胞因子血症相关的症状的减轻来测量。
本发明的前述和其他目的、特征和优点将从以下参照附图进行的详细描述变得更加显而易见。
附图说明
图1A-1G显示了液相细胞外囊泡(EV)和基质结合囊泡(MBV)的形态学特征。图1A显示了源自膀胱基质(UBM)的ECM支架的扫描电子显微镜图像，其中直径约100nm的离散球体分散在整个基质中。标尺＝1μm。图1B显示了用于从液相(EV)或固相细胞外区室(MBV)选择性收获囊泡的3T3成纤维细胞培养模型的图示。图1C显示了相差显微镜检查、苏木素和伊红(H&E)染色和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，表明脱细胞化后不存在细胞和不存在完整的细胞核。图1D显示了从3T3成纤维细胞培养模型分离的液相EV和MBV的透射电子显微镜图像。标尺＝100nm。图1E显示了来自3T3成纤维细胞培养物的液相EV和MBV分离物的纳米颗粒追踪分析(NTA)的尺寸分布图。图1F显示了比较液相EV和MBV中CD9、CD63、CD81和Hsp70表达水平的免疫印迹分析。图1G显示了液相EV和MBV中电泳分离的蛋白质的银染分析。
图2A-2E描绘了EV和MBV之间miRNA运载物(cargo)的差异。图2A显示了从3T3亲代细胞分离的总RNA、它们分泌的液相EV和它们的MBV的生物分析仪分析。图2B显示了比较液相EV(绿色)、MBV(蓝色)和细胞(红色)RNA-seq数据集的主成分分析(PCA)。图2C显示了表明miRNA在液相EV、MBV和亲代细胞中的差异表达的火山图。入选标准是log2(倍数变化)在任一方向上的2倍差异，P值<0.05。每个点代表特定miRNA转录本；垂直虚线右侧(和水平虚线上方)的绿点对应于表达水平相对增加，并且左侧(和水平虚线上方)的红点对应于表达水平相对降低。蓝点(出现在水平虚线下方)表示表达水平没有显著变化的miRNA。图2D显示了miRNA测序结果的RT-qPCR验证，*p<0.05，n＝4。图2E显示了Ingenuity通路分析(IPA功能分析)。考虑到MBV(红色-底部柱)和液相EV(蓝色-顶部柱)中差异表达的miRNA，确定通过IPA功能分析识别的显著丰富的分子功能。细胞生长和增殖、细胞形态、细胞间信号传导和组织发育没有红色柱；消化系统发育和功能、肝系统发育和功能以及器官发育和功能没有蓝色柱。
图3A-3H描绘了基于MBV的细胞来源的MBV miRNA运载物的差异。图3A显示了脱细胞BMSC细胞培养板的相差显微图像，显示不存在细胞。图3B显示了从脱细胞BMSC培养板分离的MBV的透射电子显微镜图像。标尺＝100nm。图3C-3E显示了来自BMSC(图3C)、ASC(图3D)和UCSC(图3E)脱细胞培养板分离的MBV的纳米颗粒追踪分析(NTA)的尺寸分布图。图3F显示了从BMSC、ASC和UCSC来源的MBV分离的总RNA的生物分析仪分析。图3G显示了比较BMSC MBV(绿色；左中)、UCSC MBV(蓝色；右上)和ASC MBV(红色；右下)RNA-seq数据集的主成分分析(PCA)。图3H显示了表明miRNA在BMSC、ASC和UCSC来源的MBV中的差异表达的火山图。入选标准是log2(倍数变化)在任一方向上的2倍差异，P值<0.05。每个点代表特定miRNA转录本；垂直虚线右侧(水平虚线上方)的绿点对应于表达水平相对增加，并且左侧(和水平虚线上方)的红点对应于表达水平相对降低。蓝点(水平虚线下方)表示表达水平没有显著变化的miRNA。
图4A-4E显示了MBV、液相EV和亲代细胞之间磷脂的LC/MS表征。图4A显示了从MBV获得的磷脂的典型总离子色谱图。图4B显示了MBV中主要磷脂类别的质谱。评估包括定量磷脂的饱和(双键数＝0)、单不饱和(双键数＝1)和多不饱和(双键数＝2-10)种类。图4C显示了饼图，显示了主要磷脂的总含量。数据表示为总磷脂的％。图4D和图4E显示了不同磷脂分子种类的含量。数据表示为自动缩放为Z评分的热图，并将蓝色(低值)编码为红色(高值)。缩写为：EV，外泌体囊泡；MBV，基质结合囊泡；PC，磷脂酰胆碱；PCd，PC二酰基种类；PCp，PC缩醛磷脂；PE，磷脂酰乙醇胺，PEd，PE二酰基种类；Pep，PE缩醛磷脂；PI，磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；BMP，双-单酰基甘油磷酸酯；PA，磷脂酸；PG，磷脂酰甘油；和SM，鞘磷脂。
图5A-5D显示了LC/MS表征和后续分析，检查MBV、液相EV和亲代细胞之间的LPE、LPA和LPG差异。图5A显示了从MBV获得的主要溶血磷脂的典型质谱。图5B显示了饼图，显示主要溶血磷脂的总含量。数据表示为总溶血磷脂的％。图5C和图5D显示了溶血磷脂分子种类的含量。数据表示为自动缩放为Z评分的热图，并将蓝色(低值)编码为红色(高值)，n＝3。缩写为：EV，外泌体囊泡；MBV，基质结合囊泡；LPC，溶血磷脂酰胆碱；LPE，溶血磷脂酰乙醇胺；LPI，溶血磷脂酰肌醇；LPS，溶血磷脂酰丝氨酸；LPA，溶血磷脂酸；LPG，溶血磷脂酰甘油；和mCL，单溶血心磷脂。
图6A-6C表明MBV中含PUFA的磷脂及其氧化修饰的分子种类的水平高于液相EV中的水平。评估亲代细胞、液相EV和MBV中游离PUFA(图6A)及其氧化代谢物(图6B)的含量。数据表示为平均值±s.d.，*p<0.05，并且与细胞或MBV进行比较，其中n＝3。图6C显示了亲代细胞、液相EV和MBV中单氧化、双氧化和三氧化磷脂物质的含量。数据表示为自动缩放为Z评分的热图，并将蓝色(低值)编码为红色(高值)。缩写为：EV，外泌体囊泡；MBV，基质结合囊泡；PL，磷脂；PC，磷脂酰胆碱；PE，磷脂酰乙醇胺，PI，磷脂酰肌醇；PS，磷脂酰丝氨酸；BMP，双-单酰基甘油磷酸酯；PA，磷脂酸；PG，磷脂酰甘油；和CL，心磷脂。
图7描绘了MBV在大鼠动物模型中用于治疗类风湿性关节炎的施用途径。
图8A-8E显示了对照和关节炎大鼠模型的个体关节炎评分，这些模型仅用姥鲛烷(pristane)、腹腔(IP)甲氨蝶呤(MTX)、关节周围(PA)MBV或静脉内(IV)MBV处理。图8A显示了第7天各处理组的关节炎评分，图8B显示了第10天各处理组的关节炎评分，图8C显示了第13天各处理组的关节炎评分，图8D显示了第17天各处理组的关节炎评分，以及图8E显示了第21天各处理组的关节炎评分。
图9A显示了取自通过姥鲛烷诱导表型临床关节炎并仅用姥鲛烷、IP甲氨蝶呤、PAMBV或IV MBV处理的Sprague-Dawley大鼠的多个视图的照片。图9B显示了疾病控制和关节周围MBV处理的大鼠爪的更近距离视图。
图10显示了对照和仅用姥鲛烷、IP甲氨蝶呤、PA MBV或IV MBV处理的关节炎大鼠模型中处理前21天的平均关节炎评分。
图11A显示了对照和用IP甲氨蝶呤、PA MBV和IV MBV处理的关节炎大鼠模型的爪的照片。图11B显示了在用IP甲氨蝶呤、PA MBV和IV MBV处理的关节炎大鼠模型中处理前77天的平均关节炎评分。
图12A-12B显示了用IP甲氨蝶呤、PA MBV和IV MBV处理的关节炎大鼠模型中TNFα(图12A)和IL1β(图12B)的血清水平。
图13显示了用溶媒对照或MBV处理的银屑病小鼠咪喹莫特模型的组织学图像。
图14显示了在用溶媒对照或MBV处理的小鼠咪喹莫特银屑病模型中作为TREG细胞标志物的FOXP3 RNA水平。
图15显示了在用盐水(阴性对照)、MBV或环磷酰胺(阳性对照)处理的匙孔血蓝蛋白(KLH)大鼠模型中通过ELISA测定的抗KLH IgG。
图16A显示了在用含有IL-33的MBV处理后浸润心脏毒素损伤部位的炎性巨噬细胞的点图，如通过荧光激活细胞分选(FACS)CD45+CD3-B220-CD11b+Ly6G-细胞所测定。图16B显示了炎性巨噬细胞频率。图16C显示了ST2+TREG在用含有IL-33的MBV处理后浸润心脏毒素损伤部位的点图，如通过CD45+CD3+B220-CD4+细胞的荧光激活细胞分选(FACS)所测定。图16D显示了ST2+TREG的频率。
图17显示了通过ELISA测定的T细胞的IL4产生，这些T细胞用促进促炎反应的Th1激活剂、促进抗炎反应的Th2激活剂、促进促炎反应的Th17激活剂或MBV刺激。
图18显示了福尔马林固定、石蜡包埋的鼠肺组织在通过气溶胶以109颗粒/mL的剂量施用荧光标记的MBV(绿色)后的免疫荧光显微图像。代表性图像(左图和中图)显示MBV在经处理的肺组织的大和小气道中易于检出(箭头)，特别是上皮细胞，但不是肺实质。未经处理的对照肺组织(右图)显示非特异性、低水平的自发荧光，其具有与MBV处理的组织不同的漫反射模式。
图19A-19C显示了全身施用基质结合的纳米囊泡在感染后第7天减轻病毒介导的肺部病理学和单核中性粒细胞浸润。图19A：全肺病理学的20×苏木素和伊红图像的Mosaic汇总显示在感染后第7天与弥漫性单核细胞浸润到肺间质空间相关的间质性肺炎。MBV全身处理减少对肺间质的整体细胞浸润，并在感染后7天显示出急性肺部炎症消退。与H+E图像相邻的细胞密度热图显示流感+i.v.PBS组中的高密度细胞浸润以及流感+i.v.MBV组中总体细胞密度降低。图19B：全身MBV显著降低灌洗液(BAL)、肺间质和脾脏中CD45+中性粒细胞的总体频率。图19C：全身MBV显著降低促炎细胞因子和趋化因子GCSF、IL-6、IL-1b、TNFα和IFN-γ的浓度。
图20A-20D显示了全身施用MBV减少肺和脾脏CD4+t细胞群并增加激活的抗病毒CD8+T细胞的存在。图20A：全身MBV显著降低肺组织中CD4+t细胞的频率并增加CD8+T细胞的频率。图20B：全身MBV显著降低脾脏中CD4 T细胞的频率并增加脾脏中CD8+T细胞的频率。图20C：全身MBV通过分别增加脾脏和淋巴结中位于外周的CD69+和Tbet+CD4+T细胞的频率来诱导抗病毒CD4反应的激活。图20D：全身MBV诱导抗病毒CD8+T细胞反应的外周激活，如CD69+和Tbet+CD8 T细胞频率增加所示。
图21A-21D示出了全身施用MBV通过减少细胞浸润和减少促炎细胞因子产生来减少慢性病毒后肺部炎症。图21A：全肺病理学的20×苏木素和伊红图像的Mosaic汇总显示在感染后第21天与支气管和大气道周围的集中单核细胞浸润相关的支气管肺炎。MBV全身处理减少对肺间质的整体细胞浸润，并在感染后7天显示出急性肺部炎症消退。与H+E图像相邻的细胞密度热图显示流感+i.v.PBS组中的高密度细胞浸润以及流感+i.v.MBV组中总体细胞密度降低。图21B：全身MBV显著降低了肺间质和脾脏中CD45+中性粒细胞的总体频率。图21C：全身MBV显著增加肺中CD11b树突细胞的比例。图21D：全身MBV显著降低促炎细胞因子和趋化因子Il-12、Il-1b、MCP-1和KC的浓度。
图22是显示全身施用MBV显著增加支持长期抗病毒抗性的CD62L+CD44+记忆CD4和CD8 T细胞的比例的一组柱状图。
图23是显示全身施用MBV在感染后第21天显著降低H1N1相关的实变和间质纤维化的一组数字图像和图表。上图代表三色染色和quPath渲染图像。使用QuPath软件进行组织病理学分析。简言之，使用光密度数据对Mason三色染色细胞进行计数，并通过随机树机器学习架构基于表型进行分类。ML分类器在六个代表性图像上进行训练，多个(n>10)训练区域表示四个可能的类别：结缔组织、血管、肺基质组织、病变组织。在底部，计算每个肺表面积的总组织纤维化/实变百分比，并显示与未经处理H1N1的动物相比，MBV处理动物的总病变组织显著减少。
图24显示了Exo-CheckTM外泌体抗体阵列(System Biosciences)比较在鼠外泌体、鼠骨基质囊泡(骨MV)和鼠基质结合纳米囊泡(MBV)中发现的各种标志物水平的结果。上图提供了阵列的数字图像，下图是显示外泌体相对于骨MV相对于MBV中每个所述标志物的相对表达的图。
图25显示了血浆外泌体和肌肉MBV的Western印迹分析结果，以检测骨MV标志物膜联蛋白V和组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)的表达。
图26是显示各种细胞类型——未经处理(M0)或经IFNγ+LPS(M1)或IL-4(M2)处理的骨髓来源的巨噬细胞或源自血浆的外泌体、源自17A细胞的骨MV或从肌肉分离的MBV中各种基因的表达倍数变化的柱状图。
序列表
随附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和如37C.F.R.1.822中定义的氨基酸的三字母代码显示。仅显示每个核酸序列的一条链，但互补链应理解为包括在对显示链的任何引用中。序列表以ASCII文本文件[Sequence_Listing，2021年4月15日，1.07KB]的形式提交，其通过引用并入本文。在随附的序列表中：
SEQ ID NO:1-3是miRNA序列。
具体实施方式
本公开提供了使用基质结合纳米囊泡(MBV)治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS，例如与高细胞因子血症相关的ARDS，例如与病毒感染相关的高细胞因子血症)的方法。本发明的各个方面在以下按部分阐述；然而，在一个特定部分中描述的本发明的方面不限于任何特定部分。
如本文数据所例示，MBV是巨噬细胞活性的有效调节剂，诱导巨噬细胞的抗炎特性。当巨噬细胞暴露于炎症刺激时，它们分泌细胞因子，例如TNF、IL-1、IL-6、I-8和IL-12。此类细胞因子增加血管渗透性和炎症细胞的募集，这有助于病状(例如ARDS)。然而，如本文所例示，与MBV接触的巨噬细胞能够下调促炎细胞因子的产生以及上调炎症的负调节因子，表明MBV具有减弱高细胞因子血症的“细胞因子风暴”的能力。由于MBV的这些独特特性，MBV可用于治疗ARDS，ARDS是由于高细胞因子血症引起的肺部广泛炎症，如本文所述，高细胞因子血症可以由从病毒感染到损伤的多种因素引起。在疾病(例如COVID 19)中，对病毒的免疫应答导致细胞因子风暴并导致ARDS，MBV能够预防或逆转细胞因子风暴(例如ARDS)的破坏性影响。
概述
如本文所公开，本公开的基质结合纳米囊泡(MBV)用于治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS，例如与高细胞因子血症相关的ARDS，例如与感染相关的高细胞因子血症)的方法。在某些实施方案中，高细胞因子血症是病原体(例如细菌、病毒、真菌或原生动物(例如变形虫))感染的结果。在某些实施方案中，由细胞内病原体介导的疾病或病症是急性感染。在一些实施方案中，ARDS是病毒感染(例如MERS、SARS-CoV或SARS-CoV2)的结果。在一个实施方案中，ARDS是SARS-CoV2的结果。在一个实施方案中，ARDS是流感的结果。
治疗应用
在全球人群没有既存免疫力的情况下，COVID-19已成为流行病，自报告首例病例以来不到4个月就扰乱了全球经济。在这短短的时间内，COVID-19已出现高致死性感染，其致死率是季节性流感的300％至400％。(WHO(2020)冠状病毒病2019(COVID-19)：情况报告，67)。目前，COVID-19的治疗主要是支持性的，并且ARDS引起的呼吸衰竭是导致死亡的主要原因。(Ruan Q等人，(2020)Intensive Care Medicine:1-3.)。众所周知，病毒感染和后续的组织损伤引发细胞因子风暴，最终导致ARDS。(Ware LB和Matthay MA(2000)The acuterespiratory distress syndrome.NEJM.342(18):1334-1349；Matthay MA等人，(2012)Theacute respiratory distress syndrome.Journal of Clin Inves.122(8):2731-2740；Wheeler AP和Bernard GR(2007)Acute lung injury and the acute respiratorydistress syndrome:a clinical review.Lancet 369(9572):1553-1564)。ARDS的明确特征包括由于局部和全身炎症失调引起的弥漫性肺泡损伤、肺水肿和低氧血症，表现为血浆或支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞因子(趋化因子)增加，导致血管外中性粒细胞蓄积(Matthay MA等人(2012)The acute respiratory distress syndrome.Journal ClinInves.122(8):2731-2740)。促炎性巨噬细胞和单核细胞也在ARDS中发挥因果作用，通过增加局部炎症来引发和传播肺组织损伤；然后，这种炎症导致上皮和内皮组织渗透性增加。(Aggarwal NR等人(2014)Diverse macrophage populations mediate acute lunginflammation and resolution.Amer Journal of Phys Lung Cell and Mol Phys.306(8):L709-L725；Zemans RL和Matthay MA(2017)What drives neutrophils to thealveoli in ARDS？(BMJ Publishing Group Ltd)；Thompson BT等人(2017)Acuterespiratory distress syndrome.New England Journal of Med.377(6):562-572)。
尽管对该主题进行了深入的基础研究和临床研究，但仍缺少预防或缓解ARDS的有效治疗方法，而减少早期炎症的支持性程序是持续改善患者结局的唯一手段。(Bellani G等人，(2016)Epidemiology,patterns of care,and mortality for patients withacute respiratory distress syndrome in intensive care units in50countries.Jama 315(8):788-800)。
对呼吸道病毒感染(例如SARS-CoV2)的早期反应包括巨噬细胞释放促炎细胞因子，从而诱导重度ARDS、募集更多免疫细胞和吞噬病毒感染的细胞(Conti P等人，(2020)Induction of pro-inflammatory cytokines(IL-1and IL-6)and lung inflammation byCoronavirus-19(COVID-19 or SARS-CoV-2):anti-inflammatory strategies.J BiolRegul Homeost Agents.34(2))。对患者的回顾性队列研究显示，约93％的COVID-19死亡涉及急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和肺部过度炎症(Zhou F等人，(2020)Lancet.395(10229):1054-1062)。招募的单核细胞分化成在宿主防御病毒中起主要作用的巨噬细胞，但这些相同的细胞也有助于炎症的消退和肺修复。在抗病毒免疫应答的早期，M1样巨噬细胞释放促炎细胞因子，其募集更多免疫细胞和吞噬病毒感染的细胞，并且在一些情况下诱导ARDS(Conti P等人，(2020)Induction of pro-inflammatory cytokines(IL-1and IL-6)andlung inflammation by Coronavirus-19(COVID-19or SARS-CoV-2):anti-inflammatorystrategies.J Biol Regul Homeost Agents.34(2))。M1样(促炎)巨噬细胞激活状态转变为M2样、抗炎、促重塑表型可以减轻呼吸窘迫，恢复上皮屏障功能，并在14天内促进针对病毒的获得性免疫的发展(He W等人，(2017)Alveolar macrophages are critical forbroadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus inmice.Nat Commun.8(1):846)。然而，在没有巨噬细胞表型转换的情况下，上皮屏障功能被破坏并且细胞死亡和水肿可能导致ARDS。在临床探索性研究中，正在研究药物(例如羟基氯喹(HCQ))作为COVID-19的治疗方法；然而，重要的是，HCQ通过免疫抑制来解决过度炎症，例如在ARDS病例中见到的过度炎症(Liang N等人，(2018)Immunosuppressive effects ofhydroxychloroquine and artemisinin combination therapy via the nuclearfactor-kappaB signaling pathway in lupus nephritis mice.Exp Ther Med 15(3):2436-2442)。因此，HCQ和类似的免疫抑制药物使患者面临更大的继发性感染风险，例如继发性肺炎，并抑制抗病毒免疫的发展。(Liang N等人，(2018)Immunosuppressive effectsof hydroxychloroquine and artemisinin combination therapy via the nuclearfactor-kappa B signaling pathway in lupus nephritis mice.Exp Ther Med 15(3):2436-2442)。因此，令人满意的COVID-19治疗需要同时缓解细胞因子风暴和发展保护性抗体介导的免疫。由于ECM内的因子调节巨噬细胞和T辅助细胞从促炎状态到促重塑状态的表型转变，本发明针对宿主免疫系统的调节/重编程——不损害免疫能力——由嵌入细胞外基质(ECM)中的分子因子促进。(Hussey GS等人，(2018)Extracellular matrix-basedmaterials for regenerative medicine.Nature Rev Mater；Allman AJ等人，(2002)TheTh2-restricted immune response to xenogeneic small intestinal submucosa doesnot influence systemic protective immunity to viral and bacterialpathogens.Tissue Eng Part A.8(1):53-62)。ECM支架的降解产物在骨骼肌修复、溃疡性结肠炎啮齿动物模型、视神经和上呼吸道中具有有效且临床相关的抗炎和促愈合作用。(参见，例如，国际专利申请公开号WO 2017/151862和WO 2018/204848)。
因此，令人满意且优选的COVID-19治疗需要在不损害免疫力的情况下缓解高细胞因子血症。如本文所公开，本公开的MBV用于治疗过度炎症的方法，例如与高细胞因子血症相关的过度炎症(例如，与病毒感染相关的高细胞因子血症)。
本公开的MBV疗法的上述和其他目的、特征和优点能够在医院和非医院环境中施用。在一些实施方案中，施用本公开的MBV疗法以治疗患有COVID-19相关细胞因子风暴综合征的患者。这种可以安全且容易地施用于患者以将默认炎症愈合反应重定向到限制炎症和促进功能性组织重塑的治疗平台目前并不存在，因此长期以来一直存在未满足的需求。
MBV是ECM的组成部分，与外泌体不同，并且在临床前模型中有效地重定向过度炎症(Hussey GS等人，(2020)Lipidomics and RNAsequencing reveal a novelsubpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials.Sci Adv6(12):eaay4361；van der Merwe Y等人，(2019)Matrix-bound nanovesicles preventischemia-induced retinal ganglion cell axon degeneration and death andpreserve visual function.Sci Rep 9(1):3482))。MBV也不同于参与骨生成和矿化的骨基质囊泡。例如，骨基质囊泡表达碱性磷酸酶，而MBV不表达。在一些实施方案中，MBV含有免疫调节性miRNA、蛋白质和脂质，并被巨噬细胞迅速吸收，触发信号传导级联反应和调节表型转换所必需的基因表达，这种现象在基于ECM的生物材料的背景下进行充分研究(HusseyGS等人，(2019)Matrix bound nanovesicle-associated IL-33activates a pro-remodeling macrophage phenotype via a non-canonical,ST2-independent pathway.JImmunol Regen Med 3:26-35；Huleihel L等人，(2017)Macrophage phenotype inresponse to ECM bioscaffolds.Semin Immunol 29:2-13)。此外，在一些实施方案中，MBV施用导致调节性T细胞(TREG)上调，这是先前在基于ECM的生物材料的背景下表征的现象。MBV在恶劣环境中快速且有效地诱导修复性免疫应答，包括类风湿性关节炎、创伤性肌肉损伤、溃疡性结肠炎和食道癌(Huleihel L等人，(2017)Matrix-Bound NanovesiclesRecapitulate Extracellular Matrix Effects on Macrophage Phenotype.Tissue EngPart A 23(21-22):1283-1294；Dziki JL等人，(2016)Immunomodulation andMobilization of Progenitor Cells by Extracellular Matrix Bioscaffolds forVolumetric Muscle Loss Treatment.Tissue Eng Part A 22(19-20):1129-1139；KeaneTJ等人，(2017)Restoring Mucosal Barrier Function and Modifying MacrophagePhenotype with an Extracellular Matrix Hydrogel:Potential Therapy forUlcerative Colitis.J Crohns Colitis 11(3):360-368；Saldin LT等人，(2019)Extracellular Matrix Degradation Products Downregulate Neoplastic EsophagealCell Phenotype.Tissue Eng Part A 25(5-6):487-498)。
储存在MBV中的细胞因子运载物支持修复性和调节性M2巨噬细胞，并且控制急性肺损伤后的细菌感染和炎症(Liu Q等人，(2019)IL-33-mediated IL-13secretion by ST2+TREGcontrols inflammation after lung injury.JCI Insight 4(6))。ECM生物支架可用于涉及肌肉骨骼、胃肠道、泌尿生殖系统和CNS组织的多种临床应用中(Badylak SF(2007)The extracellular matrix as a biologic scaffold material.Biomaterials.28(25):3587-3593)。ECM由定义组织特性的每个组织的常驻细胞的分泌结构和功能分子组成。这种异种支架不引发不利的先天性或适应性免疫应答，而是支持抗炎和修复性先天性和适应性免疫应答(Brown BN等人，(2009)Macrophage phenotype and remodeling outcomes inresponse to biologic scaffolds with and without a cellularcomponent.Biomaterials.30(8):1482-1491)。这些天然存在的生物材料的使用通常与(至少)部分恢复功能性、适合部位的组织有关；称为“建设性重塑”的过程(Badylak SF(2007)The extracellular matrix as a biologic scaffold material.Biomaterials.28(25):3587-3593)。ECM生物支架或ECM生物支架的降解产物已显示通过募集抗炎M2样巨噬细胞和T辅助2型(Th2)细胞反应来指导组织修复，这种反应通常与减少局部炎症和与祖细胞的建设性串扰相关。
基质结合纳米囊泡(MBV)激活M2样修复性和抗炎巨噬细胞表型。研究表明，MBV是一类独特的细胞外囊泡，与体液中发现的外泌体不同(Hussey GS等人，(2020)Lipidomicsand RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle withinextracellular matrix biomaterials.Sci Advances.6(12):eaay4361)。由于MBV即使在严酷的组织脱细胞过程中也能存活，它们可以在组织和器官发育以及跨物种的体内平衡中发挥基本作用，并在组织对损伤的反应中发挥调节作用。MBV可能源自多种不同的组织来源。MBV含量丰富，可冻干，高度稳定，并且可以经由气管滴注或雾化易于施用。
MBV可以概括ECM对促进重塑巨噬细胞表型的影响。巨噬细胞基因和蛋白质表达、细胞表面标志物和由观察到的吞噬活性、一氧化氮(NO)产生和抗菌活性确定的功能能力是最能代表MBV治疗后的调节性/抗炎表型，这与先前描述基于ECM的生物支架对巨噬细胞表型和功能的影响的报道一致。(参见，例如，PCT公开号WO 2017/151862A1)。MBV已被证明通过miRNA、蛋白质和磷脂运载物的组合发挥免疫调节作用。例如，与体液中存在的外泌体相比，MBV高度富含由不同磷脂酶激活的促分解脂质介质，这些磷脂酶依赖于细胞外环境的促/抗炎背景(Hussey GS等人，(2020)Lipidomics and RNA sequencing reveal a novelsubpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials.Sci Adv6(12):eaay4361)。此外，MBV是丰富且稳定的IL-33来源，其信号引导免疫细胞向修复性M2样表型，同时还通过TREG在受损肺中刺激修复和调节功能(Liu Q等人，(2019)IL-33-mediated IL-13secretion by ST2+TREG controls inflammation after lunginjury.JCI Insight 4(6))。IL-33递送通过提高细菌清除率来减少H1N1感染后的细菌重复感染(Robinson KM等人，(2018)Novel protective mechanism for interleukin-33 atthe mucosal barrier during influenza-associated bacterialsuperinfection.Mucosal immunology.11(1):199-208)。此外，MBV富含miRNA 125b-5p、143-3p和145-5p。巨噬细胞内这些miRNA的抑制与更符合促炎而非抗炎/调节性表型的基因和蛋白质表达谱相关(Huleihel L等人，(2017)Matrix bound nanovesiclesrecapitulate extracellular matrix effects on macrophage phenotype.Tissue EngPart A)。
如实施例2中所述，利用姥鲛烷诱导的关节炎(PIA)模型来评价MBV是否可以减轻关节炎评分。8周龄Sprague-Dawley大鼠在研究的第0天接受皮内注射300μL姥鲛烷(2,6,10,14-四甲基十五烷)。在第4天，皮内注射第二剂300μL姥鲛烷。然后将接受姥鲛烷的动物随机分为以下实验组：仅使用姥鲛烷、腹腔注射甲氨蝶呤(IP MTX)、关节周围注射MBV(PAMBV)和静脉内注射MBV(IV MBV)。在第7、10、14、17和21天施用处理。从第7天开始，在第7、10、14、17、21、28天以及此后每周至100天确定每只动物的关节炎评分。研究结果表明，与仅使用姥鲛烷对照动物相比，MBV的PA和IV施用均显著降低关节炎评分。第21天后，动物未接受任何进一步处理，但被纵向跟踪以评价继发发作。第100天的结果显示，与对照组(未处理)组相比，MBV处理动物的关节炎评分表现出持续降低，即使未给予另外处理。此外，爪的大体形态学检查显示MBV处理组的红肿和水肿减少。此外，如实施例4所示，啮齿动物KLH(匙孔血蓝蛋白)免疫测定表明，与目前通过免疫抑制解决异常炎症的疗法相比，MBV疗法针对宿主免疫系统的调节/重编程而不损害免疫能力。实施例10-13提供了进一步的证据，即全身施用MBV减轻流感感染动物模型中急性病毒介导的肺部病理和长期炎症。这些数据表明，MBV疗法具有用于治疗许多涉及异常炎症反应(例如ARDS)的疾病的潜力。
膀胱基质(UBM)脱细胞粉末的气管滴注促进博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中的肺上皮细胞趋化性、迁移和修复(Manni ML等人，(2011)Extracellular matrix powderprotects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis.Tissue Eng Part A.17(21-22):2795-2804)。此外，脱细胞ECM粉末的气管滴注通过显著降低细菌负荷和减弱细菌诱导的细胞因子/趋化因子分泌来保护接种的小鼠免受重度细菌诱导的肺部感染，因此表明ECM支架可以提供保护免受急性呼吸窘迫综合征(例如细菌诱导的肺感染)引起的继发性并发症(Chen C等人，(2019)Urinary bladder matrix protects host in a murinemodel of bacterial-induced lung infection.Tissue Eng Part A.25(3-4):257-270)。此外，通过气管滴注或雾化递送至大鼠肺中的脱细胞ECM显示出对持续高氧暴露引起的急性肺损伤具有改善作用，包括减弱肺泡间隔增厚、细胞凋亡和持续高氧条件下的氧化损伤。然而，由于可以雾化的此类ECM悬浮液的最大浓度和体积，ECM粉末用于治疗IPF的转化潜力受到限制(Wu J等人，(2017)Lung protection by inhalation of exogenoussolubilized extracellular matrix.PloS One 12(2):e01711650)。鉴于它们的纳米尺寸，MBV克服了与ECM粉末进入肺部相关的挑战，并表明MBV可以经由气管滴注或雾化直接进入肺。
与从体液或细胞培养上清液中分离外泌体相比，ECM结构分子的复杂超微结构对从ECM支架材料分离MBV提出了独特的挑战。
在一些实施方案中，MBV被雾化并经由吸入或静脉注射递送，实现快速靶向或全身递送。MBV是损伤后早期免疫应答的有效天然调节剂，并且恢复局部和全身平衡。因此，MBV可以在不损害天然免疫力的情况下减轻ARDS。MBV在没有免疫抑制的情况下促进炎症消退。细胞因子筛选显示MBV内储存了丰富的抗炎细胞因子，表明MBV促进恢复平衡并赋予对ARDS的恢复力的免疫表型，其优点是不损害天然免疫。因此，MBV在没有免疫抑制的情况下促进炎症消退。此外，源自脱细胞猪组织或器官的MBV和ECM易于获得、安全、不产生不良免疫应答，因此，该技术有待用于临床转化。
由细胞外基质(ECM)组成的生物支架已被开发作为外科网状材料，并用于临床应用，包括腹疝修复(Alicuban等人，Hernia.2014；18(5):705-712)、肌肉骨骼重建(Mase等人，Orthopedics.2010；33(7):511)、食管重建(Badylak等人，Tissue Eng Part A.2011；17(11-12):1643-50)、硬脑膜置换(Bejjani等人，J Neurosurg.2007；106(6):1028-1033)、肌腱修复(Longo等人，Stem Cells Int.2012；2012:517165)、乳房重建(Salzber,Ann PlastSurg.2006；57(1):1-5)，等等(Badylak等人，Acta Biomater.2009；5(1):1-13)。
基质结合纳米囊泡(MBV)嵌入ECM的纤维状网络中。这些纳米颗粒在ECM支架生产过程中保护其运载物免受降解和变性。
相反，外泌体(或细胞外囊泡“EV”)是先前几乎仅在体液和细胞培养上清液中发现的微囊泡。已经证明MBV和外泌体是不同的。MBV与其他囊泡不同，例如，因为它们对去污剂和/或酶消化具有抗性，具有独特的脂质谱，并含有一组不同的microRNA。MBV不具有在其他囊泡(例如外泌体)中发现的相同特征表面蛋白。
如本文所公开，MBV调节全身免疫应答(例如通过全身施用)，例如，以保持或恢复生物学功能。例如，施用MBV可以保持或恢复免疫应答，例如以调节过度炎症性免疫应答，例如，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，例如病毒感染相关ARDS。
病毒感染相关ARDS的治疗
在某些实施方案中，ARDS与病毒感染相关。在某些实施方案中，病毒选自由以下组成的组：逆转录病毒(例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人类T细胞嗜淋巴细胞病毒(HTLV-1、HTLV-2、HTLV-3、HTLV-4)、埃博拉病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)(例如HSV-1、HSV-2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒)、腺病毒、正粘病毒(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、丁型流感病毒、托高土病毒(thogotovirus))、黄病毒(例如，登革热病毒、寨卡病毒)、西尼罗河病毒、裂谷热病毒、沙粒病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、埃可病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒(例如，重度急性呼吸系统综合症冠状病毒2(SARS-CoV-2)、MERS或SARS-CoV)、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒)、牛痘病毒、天花病毒、软体动物病毒、牛白血病病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、多瘤病毒(例如，JC病毒、BK病毒)、甲病毒和红疹病毒(例如，风疹病毒)。在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，病毒感染相关ARDS与高细胞因子血症相关。在一个实施方案中，ARDS由SARS-CoV-2引起。在另一个实施方案中，ARDS由流感病毒引起。在一些实施方案中，ARDS与由细菌感染引起的败血症相关。
在某些实施方案中，本文所述的MBV用于治疗病毒感染相关ARDS，例如，与选自由以下组成的组相关的ARDS：获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、HTLV-1相关脊髓病/热带痉挛性截瘫、埃博拉病毒病、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、疱疹、带状疱疹、急性水痘、单核细胞增多症、呼吸道感染、肺炎、流感、登革热、脑炎(例如，日本脑炎)、西尼罗河热、裂谷热、克里米亚-刚果出血热、科萨努尔森林病(Kyasanur Forest disease)、黄热病、寨卡热、无菌性脑膜炎、SARS、心肌炎、普通感冒、肺部感染、传染性软疣、地方性牛白血病、冠状病毒病2019(COVID-19)、腮腺炎、肠胃炎、麻疹、风疹、拍脸病(slapped-cheek disease)、天花、疣(例如，生殖器疣)、传染性软疣、脊髓灰质炎、狂犬病和玫瑰糠疹。在一些实施方案中，病毒感染相关ARDS与高细胞因子血症相关。在一些实施方案中，本文所述的MBV用于治疗埃博拉病毒相关ARDS。在一些实施方案中，本文所述的MBV用于治疗流感相关ARDS。在一些实施方案中，本文所述的MBV用于治疗SARS相关ARDS。在一些实施方案中，本文所述的MBV用于治疗COVID-19相关ARDS。在一些实施方案中，本文所述的MBV用于治疗与由病毒感染引起的败血症相关的ARDS。
在一些实施方案中，感染相关病毒是RNA病毒(具有由RNA组成的基因组)。RNA病毒可以是单链RNA(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)。与DNA病毒相比，RNA病毒具有高突变率，因为RNA聚合酶缺乏校对能力(参见Steinhauer DA,Holland JJ(1987).“Rapid evolution ofRNA viruses”.Annu.Rev.Microbiol.41:409–33)。示例性RNA病毒包括但不限于布尼亚病毒(例如，汉坦病毒)、冠状病毒(例如，MERS-CoV、SARS-CoV、SARS-CoV-2)、黄病毒(例如，黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒)、肝炎病毒(例如，甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒)、流感病毒(例如，甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、诺如病毒(例如，诺瓦克病毒)、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、逆转录病毒(例如，人类免疫缺陷病毒1(HIV-1))和环曲病毒。在一些实施方案中，RNA病毒是流感病毒，例如，甲型流感。在一些实施方案中，RNA病毒是RSV。在一些实施方案中，RNA病毒是MERS-CoV。在一些实施方案中，RNA病毒是SARS-CoV。在一些实施方案中，RNA病毒是SARS-CoV-2。在一些实施方案中，RNA病毒是SARS-CoV2。在一些实施方案中，RNA病毒是寨卡病毒(ZIKA)。
RNA病毒按基因组类型(双链、负(-)或正(+)单链)分类。双链RNA病毒包含许多不同的RNA分子，其各自编码一种或更多种病毒蛋白。正义ssRNA病毒直接利用其基因组作为mRNA；宿主细胞内的核糖体将mRNA翻译成单一蛋白质，然后对其进行修饰以形成病毒复制所需的各种蛋白质。一种此类蛋白质是RNA依赖性RNA聚合酶(RNA复制酶)，其复制病毒RNA以形成双链复制形式。负义ssRNA病毒的基因组被RNA复制酶复制，以产生用于复制的正义RNA。因此，病毒包含RNA复制酶。然后，产生的正义RNA充当病毒mRNA并由宿主核糖体翻译。在一些实施方案中，病毒是dsRNA病毒。在一些实施方案中，病毒是负ssRNA病毒。在一些实施方案中，病毒是正ssRNA病毒。在一些实施方案中，正ssRNA病毒是冠状病毒。
SARS-CoV2，有时也称为2019新型冠状病毒或2019-nCoV，是正义单链RNA病毒。SARS-CoV2有四种结构蛋白，称为S(刺突)、E(包膜)、M(膜)和N(核衣壳)蛋白。N蛋白拥有RNA基因组；S、E和M蛋白一起形成病毒包膜。刺突使得病毒附着在宿主细胞的膜上，例如人细胞中的ACE2受体(Kruse R.L.(2020),F1000Research,9:72)。SARS-CoV2是全球大流行的冠状病毒病2019(COVID-19)的高度传染性病原体病毒。在一些实施方案中，急性呼吸窘迫综合征与SARS-CoV2(COVID-19)相关。在一些实施方案中，正在治疗的ARDS与SARS-CoV2(COVID-19)相关。在一些实施方案中，正在治疗的ARDS与SARS-CoV2(COVID-19)相关的高细胞因子血症相关。
在一些实施方案中，感染相关病毒是DNA病毒(具有由DNA组成的基因组)。示例性DNA病毒包括但不限于细小病毒(例如，腺相关病毒)、腺病毒、非洲猪瘟病毒(asfarvirus)、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV))、乳头状瘤病毒(例如，HPV)、多瘤病毒(例如，猿空泡病毒40(SV40))和痘病毒(例如，牛痘病毒(vaccinia virus)、牛痘病毒(cowpox virus)、天花病毒、鸡痘病毒、羊痘病毒、粘液瘤病毒)。在某些实施方案中，DNA病毒是腺病毒，例如AdV5。在某些实施方案中，DNA病毒是肠道病毒，例如EV71。在某些实施方案中，DNA病毒是疱疹病毒，例如HSV-1。
在一些实施方案中，感染是全身性的。在一些实施方案中，感染位于例如器官或例如组织。在一些实施方案中，感染位于器官，包括但不限于眼睛、耳部、内耳、肺、气管、支气管、细支气管、肝脏、胆囊、胆管、肾脏、膀胱、睾丸、子宫颈、卵巢、子宫、皮肤或大脑。在某些实施方案中，感染位于肺。
与其他致病性感染相关的ARDS的治疗
在某些实施方案中，ARDS与细菌感染相关。在某些实施方案中，ARDS与选自由以下组成的组的细菌相关：衣原体属(例如，沙眼衣原体)、大肠杆菌属(例如，肠致病性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、泌尿致病性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌)、幽门螺杆菌属、分枝杆菌属(例如，结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、弥漫型麻风分枝杆菌)、李斯特菌属(例如，单核细胞增生李斯特菌)、志贺氏菌属(例如，福氏志贺氏菌(S.flexneri))、葡萄球菌属(例如，金黄色葡萄球菌)、链球菌属(例如，酿脓链球菌)、链霉菌属、肺炎球菌属、脑膜炎球菌属、淋球菌属、克雷伯氏菌属(例如，肺炎克雷伯菌)、变形杆菌属、沙雷氏菌属、假单胞菌属(例如，铜绿假单胞菌)、军团菌属、不动杆菌属(例如，鲍曼不动杆菌)、棒状杆菌属(例如，白喉杆菌)、柯克斯体属(例如，贝氏柯克斯体(C.burnetii))、芽孢杆菌(例如，炭疽杆菌)、拟杆菌属、鲍特菌属、肠球菌属(例如，粪肠球菌)、弗朗西斯菌属(例如，土拉弗朗西斯菌(F.tularensis))、流感嗜血杆菌属、奈瑟菌属(例如，脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌)、立克次氏体属、沙门氏菌(例如，鼠伤寒沙门氏菌)、霍乱弧菌属、梭菌属(例如，破伤风梭菌、肉毒梭菌)、耶尔森氏菌属(例如，鼠疫耶尔森氏菌)、疏螺旋体属(Borrielia)(例如，伯氏疏螺旋体(B.burgdorferi))、布鲁氏菌属、伯克霍尔德氏菌属、弯曲杆菌属和支原体属。在一些实施方案中，细菌感染相关ARDS与高细胞因子血症相关。在一些实施方案中，ARDS与由细菌感染引起的败血症有关。
在某些实施方案中，本文所述的MBV用于治疗细菌感染相关ARDS，例如，与例如细胞内细菌感染相关的ARDS。本文所述的方法可用于治疗，例如，与选自由以下组成的组的细菌疾病或病症相关的ARDS：衣原体、肺结核、消化性溃疡、麻风病、李斯特菌病、唾液腺炎、细菌引起的腹泻或食物中毒、链球菌性咽喉炎、猩红热、脓疱病、蜂窝织炎、肺炎、脑膜炎、细菌性心内膜炎、憩室炎、播散性淋球菌血症、化脓性关节炎、新生儿淋球菌性眼炎、尿路感染、软组织感染、脊柱关节病(例如，强直性脊柱炎)、军团杆菌病(例如，军团病(Legionnaires’disease)、庞蒂亚克热(Pontiac fever))、白喉、沙门氏菌病、炭疽病、霍乱、破伤风、肉毒杆菌中毒、筋膜炎、气性坏疽、斑块、莱姆病(Lyme disease)、布鲁氏菌病(brucellosis)、类鼻疽、Q热、土拉菌病(tularemia)、淋病、斑疹伤寒、支原体肺炎、肠胃炎和行走性肺炎。在一些实施方案中，细菌感染相关ARDS与高细胞因子血症相关。在一些实施方案中，MBV用于治疗与由细菌感染引起的败血症相关的ARDS。
在某些实施方案中，ARDS与真菌感染相关。
在某些实施方案中，ARDS与真菌感染相关，其中真菌选自由以下组成的组：念珠菌属(例如，白色念珠菌(C.albicans)、克氏念珠菌(C.krusei)、光滑念珠菌(C.glabrata)、热带念珠菌(C.tropicalis))、隐球菌属(例如，新型隐球菌(C.neoformans)格特隐球菌(C.gattii))、曲霉属(例如，烟曲霉(A.fumigatus)、黑曲霉(A.niger))、毛霉目(例如，毛霉菌(M.mucor)、M.absidia、根霉(M.rhizopus))、孢子丝菌属(例如，申克孢子丝菌(S.schenkii))、芽生菌属(例如，皮炎芽生菌)、副球孢子菌属(例如，巴西芽生菌(P.brasiliensis))、球孢子菌属(例如，粗球孢子菌(C.immitis))、组织胞浆菌属(例如，荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum))、支顶孢属、蛙粪霉属(例如，蛙粪霉(B.ranarum))、支孢霉属(Cladophialophora)(例如，斑替支孢霉(C.bantiana))、小克银汉霉属(例如，灰色小克银汉霉(C.bertholletiae))、表皮癣菌属、外瓶霉属(Exophiala)、突脐蠕孢属(Exserohilum)、产色芽生菌属(Fonsecaea)(例如，佩德罗索氏产色芽生菌(F.pedrosoi))、何德霉属(Hortaea)(例如，威尼克何德霉(H.werneckii))、Lacazia(例如，L.loboi)、小球腔菌属(例如，十字花科小球腔菌(L.maculans))、马杜拉分枝菌属(Madurella)(例如，马杜拉足肿菌(M.mycetomatis))、马拉色菌属(Malassezia)、小孢子菌属(Microsporum)、毛霉属、新龟甲属(Neotestudina)、Onychocola、瓶霉菌属(Phialophora)、毛结节菌属(Piedraia)、肺孢子菌属(例如，耶氏肺孢子菌(P.jirovecii))、假性阿利什利菌属(Pseudallescheria)(例如，波氏假阿利什菌属(P.boydii))、须壳孢属(Pyrenochaeta)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、丝孢菌属(Scedosporium)、柱霉属(Scytalidium)、孢子丝菌属(Sporothrix)、毛癣菌属(Trichophyton)、毛孢菌属(Trichosporon)和接合菌属(Zygomycete)。在一些实施方案中，真菌感染相关ARDS与高细胞因子血症相关。
在某些实施方案中，本文所述的MBV用于治疗与细胞内真菌感染相关的ARDS，例如，与选自由以下组成的组的细胞内真菌感染相关的ARDS：念珠菌病、隐球菌病、曲霉病、毛霉菌病、孢子丝菌病、芽生菌病、副球孢子菌病、球孢子菌病、组织胞浆菌病、真菌性足分枝菌病、甲真菌病、透明丝状真菌病、皮下接合菌病、脑脓肿、暗色丝孢霉病、着色芽生菌病、足癣、肺毛霉菌病、体癣、头癣、股癣、足癣、指甲癣、黑癣、Lobo病、黑腿病、足分枝菌病、花斑糠疹、马拉色菌毛囊炎、类固醇痤疮、脂溢性皮炎、新生儿头部脓疱病、毛霉菌病、马杜罗足分枝菌病(maduromycosis)、黑色毛结节菌病、肺孢子菌肺炎、假性阿利什利菌病、赛多孢子菌病(scedosporiosis)、孢子丝菌病和接合菌病。在一些实施方案中，真菌感染相关ARDS与高细胞因子血症相关。在一些实施方案中，ARDS与由真菌感染引起的败血症相关。
在某些实施方案中，ARDS与细胞内原生动物感染相关。在一些实施方案中，原生动物是变形虫。在某些实施方案中，变形虫选自由以下组成的组：顶复虫(疟原虫(例如，间日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、弓形虫、小隐孢子虫、小巴贝西虫、环孢子虫、贝氏孢子虫)、锥虫(例如，布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、克氏锥虫(Trypanosomacruzi))和利什曼原虫(例如，杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani))。在一些实施方案中，原生动物感染相关的ARDS与高细胞因子血症相关。
在某些实施方案中，本文所述的MBV用于治疗由细胞内变形虫感染引起的疾病或病症，例如，与选自由以下组成的组的变形虫感染相关：巴贝虫病、疟疾、隐孢子虫病、环孢子虫病、囊等孢子虫病(cystoisosporiasis)、弓形虫病、锥虫病、Chagas病和利什曼病。在一些实施方案中，变形虫感染相关的ARDS与高细胞因子血症相关。
细胞因子释放测定
可以在本文公开的方法中评估细胞因子(例如趋化因子)的表达。在一些实施方案中，研究促炎细胞因子(本领域已知为趋化因子)。趋化因子的实例包括但不限于CXCL8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11和CXCL10。在一些实施方案中，在体外(例如，在细胞培养中)研究细胞因子释放。在某些实施方案中，从细胞培养上清液定量体外细胞因子释放。在一些实施方案中，在体内(例如在动物模型中)研究细胞因子释放。在某些实施方案中，从体液(例如，全血、血清、血浆或淋巴液)定量体内细胞因子释放。在某些实施方案中，动物模型是鼠模型。在某些实施方案中，动物模型是非人灵长类动物。在某些实施方案中，在人患者中研究细胞因子释放。
在一些实施方案中，细胞因子释放通过定量细胞因子表达水平进行评估。在一些实施方案中，细胞因子表达水平使用酶联免疫吸附测定(ELISA)进行定量。在一些实施方案中，细胞因子表达水平使用多重免疫测定法(例如Luminex)进行定量。在一些实施方案中，细胞因子表达水平使用细胞因子阵列进行定量。在一些实施方案中，细胞因子表达水平使用Western印迹进行定量。在一些实施方案中，细胞因子表达水平使用质谱进行定量。
在一些实施方案中，通过监测免疫系统的变化来测定细胞因子的释放。研究免疫系统的方法是本领域已知的，并且包括但不限于：荧光激活细胞分选(FACS)、转录组分析(例如，通过RNA测序(RNA Seq))、血涂片、全血细胞计数和血细胞比容。
在某些实施方案中，疾病或病症的症状(例如发热、肺炎、呼吸急促和低血氧水平)指示免疫系统的变化。在某些实施方案中，疾病或病症的症状(例如发热、肺炎、呼吸急促和低血氧水平)的减轻，即，接受本文公开的MBV疗法治疗后症状的减轻，指示免疫系统变化。
急性呼吸窘迫综合征的治疗
本发明还提供了用本文所述的MBV治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法。
急性呼吸窘迫综合征是以血液氧合不良、液体渗入肺部和发病敏度为特征的病症(Diamond等人(2020).Acute Respiratory Distress Syndrome(ARDS).StatPearls[Internet].Treasure Island(FL):StatPearls Publishing)。ARDS发作通常发生在因果事件的7天内。ARDS的临床定义是患者动脉血中的氧水平(PaO2)与吸入空气中的氧(FiO2)的比率。ARDS定义为PaO2/FiO2比低于300的患者。ARDS具有高发病率和高死亡率。例如，临床ARDS进一步描述于Fan等人(2018).Acute Respiratory Distress Syndrome:Advances inDiagnosis and Treatment.JAMA.319(7):698–710。
ARDS的风险因素包括但不限于感染性疾病或病症(例如，病毒感染，例如，细菌感染)、移植物抗宿主病、大量输血、器官创伤、组织创伤(例如，重度烧伤)、慢性酒精中毒、噬血细胞性淋巴组织细胞增多症、败血症、全身炎症反应综合征、淹溺(例如，吸入水)、药物过量(例如，吸入呕吐物)、吸入食物、脂肪栓塞、吸入有毒烟雾(例如，烟或化学烟雾)和胰腺炎。电子烟(被称为“蒸气烟(vaping)”)的吸食也被确定为发展ARDS的风险因素。在某些实施方案中，受试者患有头部受伤，其损害控制呼吸的大脑部分。在某些实施方案中，受试者患有损害肺部的胸部损伤。在一些实施方案中，ARDS的风险因素是感染性疾病或病症，例如，病毒，例如冠状病毒，例如SARS-CoV2。在一些实施方案中，ARDS的风险因素是感染性疾病或病症，例如病毒，例如埃博拉病毒。在一些实施方案中，ARDS的风险因素是感染性疾病或病症，例如细菌，例如肺炎链球菌。在一些实施方案中，ARDS与高细胞因子血症相关。在一个具体实施方案中，ARDS与SARS-Cov2(COVID-19)相关的高细胞因子血症相关。在一些实施方案中，ARDS与SARS-Cov2(COVID-19)相关的死亡率相关。可以选择这些受试者中的任何一名受试者用本文公开的方法进行治疗。
ARDS患者的现有疗法包括支持性和/或姑息性护理，包括但不限于减少分流分数、增加氧递送、减少耗氧量和避免对受影响组织和器官的进一步损伤。在一些实施方案中，将ARDS患者置于机械呼吸机上。在某些实施方案中，向机械呼吸机上的患者施用如本文所述的MBV。在某些实施方案中，向机械呼吸机上的患者静脉内施用如本文所述的MBV。在某些实施方案中，如果患者有患ARDS的风险，则患者在ARDS发作之前接受MBV施用药。
本发明基于以下发现：当向患有以免疫系统的病理性失调为特征的疾病或病症(例如由病毒感染引发的疾病或病症)的受试者施用MBV时，MBV具有调节免疫系统的能力。具体地，已发现全身递送的MBV在治疗炎症性病症的症状方面具有与将MBV局部施用至受影响组织所获得的治疗效果相当的治疗效果。此外，由于MBV调节而不抑制免疫系统，因此MBV施用的治疗效果不存在免疫抑制经常观察到的继发感染风险。因此，这将MBV定位为炎症性病症(例如急性呼吸窘迫综合征)的独特全身疗法。因此，与传统抗炎或免疫抑制药物相比，接受MBV治疗的患者可能因感染而发生继发感染的风险降低，因为本发明的方法不抑制先天免疫系统，使其发挥抵抗疾病的作用并防止继发感染。例如，与接受传统抗炎或免疫抑制药物治疗ARDS的情况相似的患者相比，患有COVID-19诱发的ARDS的患者在施用MBV治疗ARDS时发生继发感染的风险降低。
如以下实施例2所述，在类风湿性关节炎作为示例性炎症性疾病的大鼠模型中，通过尾静脉静脉内注射全身或通过关节周围注射局部施用MBV的大鼠的关节炎评分与接受关节周围甲氨蝶呤的大鼠的关节炎评分(治疗类风湿性关节炎的金标准)相比得到改善。出乎意料的是，无论是接受全身注射还是局部注射，大鼠之间的关节炎评分改善相当。实施例10-13进一步证明MBV的全身施用减轻流感感染动物模型中急性病毒介导的肺部病理学和长期炎症。
因此，全身施用MBV可用于治疗由异常免疫应答引起的病症，例如ARDS，不局限于身体的某一部位或不适合局部治疗。在免疫机能亢进的情况下，例如ARDS，根本原因(例如，高细胞因子血症)存在于循环中，因此是全身性疾病。因此，在一些实施方案中，全身疗法提供了用于调节全身免疫应答的有效机制。
在一些实施方案中，施用可以是全身性的。全身施用可以是静脉内施用、口服施用、肠内施用、肠胃外施用、鼻内施用、气管内施用、直肠施用、舌下施用、口腔施用、唇下施用、腹腔施用或肌内施用。在具体的非限制性实例中，全身施用是静脉内施用。在某些实施方案中，施用是局部的，例如施用至肺。例如，局部施用是吸入或气管内施用。例如，施用是通过雾化吸入，或通过鼻内施用吸入。
在一些实施方案中，MBV的施用导致受试者肺中CD45+中性粒细胞数量减少。在其他实施方案中，MBV的施用导致受试者的肺中CD8+T细胞数量增加和CD4+T细胞数量减少。在其他实施方案中，MBV的施用导致受试者的脾脏中CD8+T细胞数量增加和CD4+T细胞数量减少。在进一步的实施方案中，施用导致受试者的脾脏中CD69+CD4+T细胞数量增加。在又其他实施方案中，施用导致受试者的淋巴结中抗病毒Tbet+CD4+T细胞数量增加。在又其他实施方案中，施用导致受试者的脾脏中抗病毒Tbet+CD8+T细胞数量增加。在进一步的实施方案中，施用导致受试者的脾脏中CD69+CD8+T细胞数量增加。在更多实施方案中，施用导致受试者的肺中免疫调节性CD11b+树突细胞数量增加。在一些实施方案中，施用导致受试者的肺中CD62L+/CD44+记忆CD4和CD8 T细胞数量增加。施用可以在受试者中产生一种或更多种这些作用。与施用MBV之前受试者的参数相比或与标准值相比，增加可以是10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％增加。与施用MBV之前的受试者的参数相比或与标准值相比，减少可以是10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％减少。
在更多实施方案中，施用减少受试者中病毒相关的组织损伤。例如，施用可以减少对受试者的肺损害。在一些实施方案中，与施用MBV之前受试者的组织相比，病毒相关的组织损伤减少了10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％。
源自细胞外基质(ECM)的纳米囊泡
源自ECM的纳米囊泡(也称为基质结合纳米囊泡，“MBV”)通常描述于PCT公开号WO2017/151862、WO 2018/204848和WO 2019/213482中，它们通过引用并入本文。公开了MBV嵌入细胞外基质中。这些MBV可以被分离并具有生物活性。在一些实施方案中，MBV不包含碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨保护素、补体C5和/或c-反应蛋白。这些MBV可以单独或与ECM一起用于治疗目的。
细胞外基质是结构和功能生物分子和/或生物大分子的复杂混合物，包括但不限于结构蛋白、特化蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和生长因子，它们围绕和支持哺乳动物组织内细胞，除非另有说明，否则是无细胞的。通常，公开的MBV嵌入任何类型的细胞外基质(ECM)中，并且可以从该位置分离。因此，MBV不可分离地存在于ECM表面，并且不是外泌体(也称为细胞外囊泡或EV)。
细胞外基质例如公开于但不限于美国专利号4,902,508；4,956,178；5,281,422；5,352,463；5,372,821；5,554,389；5,573,784；5,645,860；5,771,969；5,753,267；5,762,966；5,866,414；6,099,567；6,485,723；6,576,265；6,579,538；6,696,270；6,783,776；6,793,939；6,849,273；6,852,339；6,861,074；6,887,495；6,890,562；6,890,563；6,890,564；和6,893,666；其各自通过引用以其全文并入。然而，ECM可以由任何组织产生，或由任何体外来源产生，其中ECM由培养的细胞产生并且包含天然ECM的一种或更多种聚合物组分(成分)。ECM制剂可以被认为是“脱细胞的”或“无细胞的”，表示已从源组织或培养物中去除细胞。
在一些实施方案中，ECM分离自脊椎动物，例如哺乳类脊椎动物，包括但不限于人、猴、猪、牛、羊等。ECM可以源自任何器官或组织，包括但不限于膀胱、肠(例如小肠或大肠)、心脏、真皮、肝脏、肾脏、子宫、脑、血管、肺、骨、肌肉、胰腺、胎盘、胃、脾脏、结肠、脂肪组织或食道。在一些实施方案中，ECM可以源自除骨之外的任何组织。在具体的非限制性实例中，细胞外基质分离自食道组织、膀胱(例如膀胱基质或膀胱粘膜下层)、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。ECM可以包含从器官获得的任何部分或组织，包括例如但不限于粘膜下层、上皮基底膜、固有膜等。在一个非限制性实施方案中，ECM分离自膀胱。在一些实施方案中，ECM来自人受试者。在其他实施方案中，ECM来自猪受试者。
ECM可以包括也可以不包括基底膜。在另一个非限制性实施方案中，ECM包括基底膜的至少一部分。ECM材料可以保留或可以不保留一些构成原始组织的细胞成分，例如毛细血管内皮细胞或纤维细胞。在一些实施方案中，ECM包含基底膜表面和非基底膜表面。
在一些实施方案中，ECM从猪膀胱(也称为膀胱基质或UBM)收获。简言之，ECM通过从哺乳动物(例如猪)取出膀胱组织并修剪残留的外部结缔组织(包括脂肪组织)进行制备。通过用自来水反复洗涤，去除所有残留的尿液。通过首先将组织浸泡在去上皮溶液中，例如但不限于高渗盐水(例如，1.0N盐水)中，将组织分层十分钟至四小时。暴露于高渗盐水溶液从下面的基底膜上去除上皮细胞。任选地，可以将钙螯合剂添加到盐水溶液中。初始分层程序后剩余的组织包括上皮基底膜和远离上皮基底膜的组织层。相对脆弱的上皮基底膜总是因管腔表面上的任何机械磨损而受损和去除。接下来对该组织进行进一步处理以去除大部分腔外组织，但保留上皮基底膜和固有膜。外部浆膜、外膜、粘膜肌层、粘膜下层和大部分粘膜肌层通过机械磨损或通过酶处理(例如，使用胰蛋白酶或胶原酶)随后水合和磨损的组合从剩余的去上皮组织去除。这些组织的机械去除通过去除肠系膜组织完成，例如但不限于，Adson-Brown镊和Metzenbaum剪刀，用手术刀手柄或用湿纱布包裹的其他刚性物体纵向擦拭运动，擦拭肌层和粘膜下层。还设想了涉及切割刀片、激光和其他组织分离方法的自动化机器人程序。去除这些组织后，产生的ECM主要由上皮基底膜和下层固有膜组成。
在另一个实施方案中，通过使用手术刀手柄和湿润纱布进行纵向擦拭移动，通过研磨猪膀胱组织以去除外层(包括浆膜和肌层)来制备ECM。在组织段外翻后，使用相同的擦拭移动将粘膜的腔部分从下面的组织剥离。注意防止粘膜下层穿孔。去除这些组织后，所得的ECM主要由粘膜下层组成(参见美国专利号9,277,999的图2，其通过引用并入本文)。
ECM还可以制成粉末。这种粉末可以根据Gilbert等人，Biomaterials 26(2005)1431-1435的方法制备，其通过引用以其全文并入本文。例如，UBM片材可以被冻干，然后切成小片材浸入液氮中。然后可以粉碎速冻材料，使颗粒足够小，可以放入旋转刀磨机中，将ECM磨成粉末。类似地，通过在ECM组织中沉淀NaCl，材料将破碎成大小均匀的颗粒，其可以快速冷冻、冻干和粉化。
在一个非限制性实施方案中，ECM源自小肠粘膜下层或SIS。市售制剂包括但不限于SurgisisTM、Surgisis-ESTM、StratasisTM和Stratasis-ESTM(Cook Urological Inc.；Indianapolis,Ind.)和GraftPatchTM(Organogenesis Inc.；Canton Mass.)。在另一个非限制性实施例中，ECM源自真皮。市售制剂包括但不限于PelvicolTM(在欧洲以PermacolTM出售；Bard,Covington,Ga.)、RepliformTM(Microvasive；Boston,MA)和AllodermTM(LifeCell；Branchburg,N.J.)。在另一个实施方案中，ECM源自膀胱。可商购的制剂包括但不限于UBM(ACell Corporation；Jessup,Md.)。
MBV可以使用下文公开的方法源自细胞外基质(释放)。在一些实施方案中，ECM用酶消化，例如胃蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶或蛋白酶K，并且将MBV分离。在其他实施方案中，通过用溶液(例如盐酸甘氨酸、柠檬酸、氢氧化铵)改变pH值、使用螯合剂(例如但不限于EDTA、EGTA)、通过离子强度和/或使用盐(例如但不限于氯化钾(KCl)、氯化钠、氯化镁、碘化钠、硫氰酸钠)的离液效应或通过将ECM暴露于变性条件(如盐酸胍或尿素)，从ECM释放和分离MBV。
在具体实施方案中，在用酶(例如胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、蛋白酶K、盐溶液或胶原酶)消化ECM之后制备MBV。ECM可以被冻融，或经机械降解。
在一些实施方案中，在MBV上不能检测到CD63、CD81和/或CD9表达。因此，在一些实施方案中，MBV不表达CD63和/或CD81和/或CD9。在一个具体实例中，在纳米囊泡上不能检测到CD63、CD81和CD9。在其他实施方案中，MBV具有几乎不可检测的CD63、CD81和CD9水平，例如可通过Western印迹检测的水平。这些MBV是CD63loCD81loCD9lo。在其他实施方案中，MBV不表达可检测水平的CD63、CD81或CD9中的一种或更多种。在其他实施方案中，MBV表达几乎检测不到水平的CD63、CD81或CD9中的一种或更多种。本领域技术人员可以使用例如特异性结合CD63、CD81和CD9的抗体，容易地识别为CD63lo和/或CD81lo和/或CD9lo的MBV。可以使用程序(例如荧光激活细胞分选(FACS)和荧光标记抗体)来确定这些标志物的低水平，以确定低量和高量CD63、CD81和CD9的阈值。在进一步的实施方案中，MBV不包含可检测的碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨保护素、补体C5和/或c-反应蛋白。公开的MBV不同于纳米囊泡，例如由于其存在于生物流体中而可能暂时附着于ECM表面的外泌体，因为体内MBV与ECM结合而不存在于生物流体中。
例如，与外泌体相比，MBV具有独特的磷脂含量。在一些实施方案中，MBV的总磷脂含量为至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％或90％，或约50％-90％、50％-65％、50％-60％、50％-70％、60％-70％、60％-90％或70％-90％的磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)组合。在具体实施方案中，MBV的总磷脂含量为至少55％的磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)组合。在具体实施方案中，MBV的总磷脂含量为至少60％的磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)组合。在一些实施方案中，MBV的磷脂含量包含小于8:1(例如，小于7:1、小于6:1、小于5:1、小于4:1、小于3:1或小于2:1)的磷脂酰胆碱(PC)与磷脂酰肌醇(PI)比率。在一些实施方案中，MBV的磷脂含量包括在0.5-1:1范围内、或在1:0.5-1范围内、或在0.5-1:2范围内、或在2:0.5-1范围内、或在0.8-1:1范围内、或在1:0.8-1范围内的磷脂酰胆碱(PC)与磷脂酰肌醇(PI)比率。在一个实施方案中，MBV的磷脂含量包括约1:1的磷脂酰胆碱(PC)与磷脂酰肌醇(PI)比率。在具体实施方案中，MBV的磷脂含量包括约0.9:1的磷脂酰胆碱(PC)与磷脂酰肌醇(PI)比率。
在一些实施方案中，MBV的总磷脂含量为15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或更少，或约5％-10％、5％-15％、10％-15％或8％-12％的鞘磷脂(SM)。在具体实施方案中，MBV的总磷脂含量为10％或更少的鞘磷脂(SM)。在一些实施方案中，总磷脂含量为15％或更少的鞘磷脂(SM)、14％或更少的鞘磷脂、13％或更少的鞘磷脂、12％或更少的鞘磷脂、11％或更少的鞘磷脂、10％或更少的鞘磷脂，9％或更少的鞘磷脂、8％或更少的鞘磷脂、7％或更少的鞘磷脂、6％或更少的鞘磷脂、5％或更少的鞘磷脂、或4％或更少的鞘磷脂。
在一些实施方案中，MBV的总磷脂含量为20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、或10％或更少，或约10％-20％、15％-20％、14％-18％或12％-16％的磷脂酰乙醇胺(PE)。在具体实施方案中，MBV的总磷脂含量为20％或更少的磷脂酰乙醇胺(PE)。
在一些实施方案中，MBV的总磷脂含量为5％、10％、12％、15％、18％、20％、25％、或30％或更多，或约5％-30％、10％-20％、10-25％、15％-25％或12％-18％的磷脂酰肌醇(PI)。在具体实施方案中，MBV包括磷脂含量为15％或更多的磷脂酰肌醇(PI)。
在具体实施方案中，MBV的总磷脂含量包含15％或更多的磷脂酰肌醇、20％或更少的磷脂酰乙醇胺和10％或更少的鞘磷脂。在具体实施方案中，MBV的总磷脂含量为15％或更多的磷脂酰肌醇和20％或更少的磷脂酰乙醇胺。在具体实施方案中，MBV的总磷脂含量为15％或更多的磷脂酰肌醇和10％或更少的鞘磷脂。在具体实施方案中，MBV的总磷脂含量包含20％或更少的磷脂酰乙醇胺和10％或更少的鞘磷脂。在具体实施方案中，MBV的总磷脂含量为超过15％的磷脂酰肌醇、20％或更少的磷脂酰乙醇胺、10％或更少的鞘磷脂，以及至少55％的磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱组合。在一个实施方案中，MBV的总磷脂含量为至少55％的磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)组合以及10％或更少的鞘磷脂(SM)。在具体实施方案中，MBV的总磷脂含量为至少55％的磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱组合以及超过15％的磷脂酰肌醇。在具体实施方案中，MBV的总磷脂含量为55％的磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱组合以及20％或更少的磷脂酰乙醇胺。
MBV还可以包含赖氨酰氧化酶(Lox)。通常，源自ECM的纳米囊泡比外泌体具有更高的Lox含量。Lox在MBV的表面上表达。Nano-LC MS/MS蛋白质组学分析可用于检测Lox蛋白。可以进行Lox的定量(参见，例如，Hill RC等人，Mol Cell Proteomics.2015；14(4):961-73，其通过引用以其全文并入本文)。
在某些实施方案中，MBV包含一种或更多种miRNA。在具体的非限制性实例中，MBV包含miR-143、miR-145和miR-181中的一种、两种或所有三种。MiR-143、miR-145和miR-181是本领域已知的。
MiR-145核酸序列在MiRbase登录号MI0000461中提供，其通过引用并入本文。
MiR-145核酸序列是
CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGCUAAGAUGGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU(SEQ ID NO:1)。MiR-181核酸序列在miRbase登录号MI0000269中提供，其通过引用并入本文。MiR-181的核酸序列是：
AGAAGGGCUAUCAGGCCAGCCUUCAGAGGACUCCAAGGAACAUUCAACGCUGUCGGUGAGUUUGGGAUUUGAAAAAACCACUGACCGUUGACUGUACCUUGGGGUCCUUA(SEQ ID NO:2)。MiR-143核酸序列在2018年3月30日的NCBI登录号NR_029684.1中提供，其通过引用并入本文。编码miR-143核酸序列的DNA是：GCGCAGCGCC CTGTCTCCCA GCCTGAGGTG CAGTGCTGCA TCTCTGGTCA GTTGGGAGTCTGAGATGAAG CACTGTAGCT CAGGAAGAGA GAAGTTGTTC TGCAGC(SEQ ID NO:3)。
施用后，MBV维持F4/80(巨噬细胞标志物)和CD-11b在受试者巨噬细胞上的表达。纳米囊泡处理的巨噬细胞主要是F4/80+Fizz1+，指示M2表型。
本文公开的MBV可配制成用于药物递送MBV的组合物在PCT公开号WO2017/151862中进一步公开和描述，其通过引用并入本文。
从ECM分离MBV
为了产生MBV，ECM可以由任何目的细胞产生，或者可以从商业来源使用，如上文所述。另见Quijano等人，Tissue Eng,Part C 2020；(10):528-540.DOI:10.1089/ten.tec.2020.0243.PMID:33012221，其通过引用以其全文并入。MBV可以由与被治疗受试者相同或不同的物种产生。在一些实施方案中，这些方法包括用酶消化ECM以产生消化的ECM。在具体实施方案中，ECM用胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶、金属蛋白酶和/或蛋白酶K中的一种或更多种消化。在具体的非限制性实例中，ECM仅用弹性蛋白酶和/或金属蛋白酶消化。在另一个非限制性实例中，ECM不用胶原酶和/或胰蛋白酶和/或蛋白酶K消化。在其他实施方案中，ECM用去污剂处理。在进一步的实施方案中，该方法不包括使用酶。在具体的非限制性实例中，该方法利用离液剂或离子强度来分离MBV，例如盐，例如氯化钾。在另外的实施方案中，ECM可以被操纵以在分离MBV之前增加MBV含量。例如，在国际专利申请WO2017/151862中描述了用于从ECM中分离MBV的技术。
在一些实施方案中，ECM用酶消化。ECM可以用酶消化约12至约48小时，例如约12至约36小时。ECM可以用酶消化约12、约24、约36或约48小时。在一个具体的非限制性实例中，ECM在室温下用酶消化。然而，消化可以在约4℃，或约4℃至25℃之间的任何温度下进行。通常，ECM在任何温度下用酶消化任何时间长度，足以去除胶原原纤维。消化过程可能因组织来源而异。任选地，在用酶消化之前或之后，通过冻融处理ECM。ECM可以用去污剂(包括离子和/或非离子去污剂)处理。
然后处理消化的ECM，例如通过离心，以分离无原纤维的上清液。在一些实施方案中，将消化的ECM离心，例如，在约300至约1000g的第一步骤中。因此，消化的ECM可以以约400g至约750g，例如约400g、约450g、约500g或约600g离心。这种离心可以进行约10至约15分钟，例如约10至约12分钟，例如约10、约11、约12、约14、约14或约15分钟。收集上清液(包括消化的ECM)。
在一些实施方案中，MBV包含Lox。在一些实施方案中，用于分离此类MBV的方法包括用弹性蛋白酶和/或金属蛋白酶消化细胞外基质以产生消化的细胞外基质，将消化的细胞外基质离心以去除胶原原纤维残留物并由此产生无原纤维的上清液，将无原纤维的上清液离心以分离固体物质，并将固体物质悬浮于载体中。
在一些实施方案中，消化的ECM还可以以约2000g至约3000g离心用于第二步骤。因此，消化的ECM可以以约2,500g至约3,000g，例如以约2,000g、2,500g、2,750g或3,000g离心。该离心可以进行约20至约30分钟，例如约20至约25分钟，例如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30分钟。收集上清液(包括消化的ECM)。
在另外的实施方案中，消化的ECM可以以约10,000至约15,000g离心用于第三步骤。因此，消化的ECM可以以约10,000g至约12,500g，例如以约10,000g、11,000g或12,000g离心。该离心可以进行约25至约40分钟，例如约25至约30分钟，例如约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40分钟。收集上清液(包括消化的ECM)。这些离心步骤中的一个、两个或所有三个步骤可以独立使用。在一些实施方案中，使用所有三个离心步骤。可以重复离心步骤，例如2、3、4或5次。在一个实施方案中，所有三个离心步骤重复三次。
在一些实施方案中，消化的ECM以约500g离心约10分钟，以约2,500g离心约20分钟，和/或以约10,000g离心约30分钟。这些步骤，例如所有三个步骤重复2、3、4或5次，例如三次。因此，在一个非限制性实例中，消化的ECM以约500g离心约10分钟，以约2,500g离心约20分钟，并以约10,000g离心约30分钟。这三个步骤重复三次。因此，产生无原纤维的上清液。然后将无原纤维的上清液离心以分离MBV。在一些实施方案中，将无原纤维上清液以约100,000g至约150,000g离心。因此，无原纤维上清液以约100,000g至约125,000g，例如约100,000g、约105,000g、约110,000g、约115,000g或约120,000g离心。这种离心可以进行约60至约90分钟，例如约70至约80分钟，例如约60、约65、约70、约75、约80、约85或约90分钟。在一个非限制性实例中，将无纤维的上清液以约100,000g离心约70分钟。收集固体物质，即MBV。然后可以将这些MBV重悬于任何目的载体中，例如但不限于缓冲液。
在进一步的实施方案中，ECM未用酶消化。在这些方法中，将ECM悬浮于等渗盐溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)中。然后将盐添加到悬浮液中，使得盐的终浓度大于约0.1M。浓度可以是，例如，至多约3M，例如，约0.1M盐至约3M，或约0.1M至约2M。盐可以是例如约0.1M、0.15M、0.2M、0.3M、0.4M、0.7M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M、1.1M、1.2M、1.3M、1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M或2M。在一些非限制性实例中，盐是氯化钾、氯化钠或氯化镁。在其他实施方案中，盐是氯化钠、氯化镁、碘化钠、硫氰酸钠、钠盐、锂盐、铯盐或钙盐。
在一些实施方案中，ECM在盐溶液中悬浮约10分钟至约2小时，例如约15分钟至约1小时、约30分钟至约1小时、或约45分钟至约1小时。ECM可以在盐溶液中悬浮约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120分钟。ECM可以在4℃至约50℃的温度(例如但不限于约4℃至约25℃或约4℃至约37℃)下悬浮于盐溶液中。在具体的非限制性实例中，ECM在约4℃下悬浮于盐溶液中。在其他具体的非限制性实例中，ECM在约22℃或约25℃(室温)下悬浮于盐溶液中。在进一步的非限制性实例中，ECM在约37℃下悬浮于盐溶液中。
在一些实施方案中，该方法包括以大于约0.4M的盐浓度孵育细胞外基质；将消化的细胞外基质离心去除胶原原纤维残留物，并分离上清液；离心上清液以分离固体材料；并将固体物质悬浮于载体中，从而将MBV从细胞外基质中分离。
在盐溶液中孵育后，将ECM离心以去除胶原原纤维。在一些实施方案中，消化的ECM还可以以约2000g至约5000g离心。因此，消化的ECM可以以约2,500g至约4,500g，例如约2,500g、约3,000g、3,500、约4,000g或约4,500g离心。在一个具体的非限制性实例中，离心以约3,500g进行。这种离心可以进行约20至约40分钟，例如约25至约35分钟，例如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30分钟、约31、约32、约33、约34或约35分钟。然后收集上清液。
在另外的实施方案中，然后可以将上清液以约100,000至约150,000g离心用于第三步骤。因此，消化的ECM可以以约100,000g至约125,000g，例如以约100,000g、110,000g或120,000g离心。这种离心可以进行约30分钟至约2.5小时，例如约1小时至约3小时，例如约30分钟、约45分钟、约60分钟、约90分钟或约120分钟(2小时)。收集固体材料并悬浮于溶液中，例如缓冲盐水中，从而分离MBV。
在又其他实施方案中，将ECM悬浮于等渗缓冲盐溶液中，例如但不限于磷酸盐缓冲盐水。离心或其他方法可用于去除大颗粒(见下文)。然后使用超滤从ECM分离MBV，约10nm至约10,000nm之间、例如约10至约1,000nm之间、例如约10nm至约300nm之间的颗粒。
在具体的非限制性实例中，等渗缓冲盐水溶液具有约0.164mM的总盐浓度和约7.2至约7.4的pH。在一些实施方案中，等渗缓冲盐水溶液包括0.002M KCl至约0.164M KCL，例如约0.0027M KCl(磷酸盐缓冲盐水中KCL的浓度)。然后通过超速离心处理该悬浮液。
在等渗缓冲盐溶液中孵育后，将ECM离心以去除胶原原纤维。在一些实施方案中，消化的ECM还可以以约2000g至约5000g离心。因此，消化的ECM可以以约2,500g至约4,500g，例如约2,500g、约3,000g、3,500、约4,000g或约4,500g离心。在一个具体的非限制性实例中，离心以约3,500g进行。这种离心可以进行约20至约40分钟，例如约25至约35分钟，例如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30分钟、约31、约32、约33、约34或约35分钟。
可以使用微滤和离心并将其组合以从悬浮液去除大分子量的物质。在一个实施方案中，使用微滤去除大尺寸分子材料，例如大于200nm。在另一个实施方案中，通过使用离心去除大尺寸材料。在第三实施方案中，微滤和超速离心均用于去除大分子量材料。从悬浮的ECM去除大分子量材料，例如大于约10,000nm、大于约1,000nm、大于约500nm或大于约300nm的材料。
然后对用于微滤的流出物或上清液进行超滤。因此，收集和利用包括小于约10,000nm、小于约1,000nm、小于约500nm或小于约300nm的颗粒的流出物。然后用截留分子量(MWCO)为3,000至100,000的膜对该流出物进行超滤。实例中使用100,000MWCO。
治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的方法
本文公开了用于治疗有需要的受试者的ARDS的方法。这些方法包括选择需要治疗以减轻炎症的受试者并向受试者施用治疗有效量的MBV(例如通过施用包括治疗有效量的MBV的药物制剂)，从而治疗ARDS。
受试者可以是哺乳动物。受试者可以是人。受试者可以是兽医受试者。受试者可以是鸟类或家养宠物，例如猫、犬或兔。受试者可以是非人灵长类动物(例如猿猴)或家畜，包括猪、反刍动物、马和家禽。该方法包括选择需要治疗以减轻炎症的受试者并向受试者施用治疗有效量的MBV(例如通过施用包括治疗有效量的MBV的药物制剂)。在一些实施方案中，MBV可以全身施用。在其他实施方案中，MBV可以局部施用。MBV可以源自与需要减轻炎症的受试者相同或不同的物种。MBV可以是自体的。
本文公开的方法可导致受试者的炎症减少。在一些实施方案中，减少或消除高炎症性病症(例如高细胞因子血症)的体征或症状。例如，本文的方法可以治疗受试者的ARDS。在一些实施方案中，本文的方法可用于预防受试者的ARDS进展，或受试者的ARDS逆转。
根据一个实施方案，ARDS的治疗可以根据相关的临床指标进行测量。在一些实施方案中，ARDS可能是重度的，并且可以例如使用急性肺损伤的Murray评分、低氧血症PaO2/FiO2、PEEP(cmH2O)、依从性(ml/cmH2O)和浸润的CXR象限进行评分。在一些实施方案中，可以例如使用改良的Doene评分系统对ARDS进行评分，该评分系统由呼吸速率、发绀、回缩、咕噜声和空气进入来确定。在一些实施方案中，例如可以使用本领域已知的另一种评分系统对ARDS进行评分。MBV治疗对ARDS的改善可能通过与ARDS症状改善相关的评分变化来指示。
根据一个实施方案，ARDS的治疗可以根据相关的临床指标进行测量。例如，ARDS的治疗可以通过例如氧指数(OI)、氧饱和指数(OSI)或氧饱和度(OS)的改善进行测量。治疗ARDS的有效性可以通过例如OI、OSI或OS的增加进行测量。例如，在一个实施方案中，在施用MBV之后，受试者的氧饱和度增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％。在另一个实施方案中，在施用MBV之后，受试者的氧饱和度指数增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％。在又另一个实施方案中，在施用MBV之后，受试者的氧指数增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％。在进一步的实施方案中，ARDS的治疗可以通过测量受试者中促炎细胞因子的水平来指示。例如，促炎细胞因子的减少可以指示治疗ARDS的有效性。例如，在施用MBV之后，TNF-α、IFN-γ、IL-8、IL-12、IL-6和/或IL-1β的减少可以指示治疗ARDS的有效性。在另一个实施方案中，抗炎细胞因子(例如IL-10、IL-4和/或TGF-β)的增加可用作治疗ARDS有效性的指标。在前述实施方案中，细胞因子水平可以通过例如从用MBV治疗之前和之后从受试者的支气管肺泡灌洗液中回收的取样来确定。在前述实施方案中，细胞因子水平可以通过例如在用MBV治疗之前和之后从血液中取样来确定。通过本领域技术人员已知的常规方法测定体液或细胞样品中的细胞因子水平。例如，细胞培养上清液和支气管肺泡灌洗液中的细胞因子浓度可以按照ELISA试剂盒生产商(R&D systems,Minneapolis,MN)的建议进行测量。
MBV治疗的有效性可以通过本领域技术人员已知的方法监测肺功能进行测量。例如，可以在治疗之前、期间或之后研究肺功能的各种可测量参数。肺功能可以通过检测肺的几种物理可测量操作中的任何一种来监测，包括但不限于吸气流速、呼气流速和肺容积。如本领域技术人员熟知的数学公式所确定的，这些参数中的一个或更多个的统计学显著增加指示MBV治疗的疗效。
临床实践中最常用的肺功能测量方法涉及定时测量吸气和呼气动作以测量特定参数。例如，FVC测量患者从深初始吸气时用力呼出的总体积(升)。当与FEV1一起评估时，该参数实现定量评估支气管收缩。如本领域技术人员熟知的数学公式所确定的，FVC或FEV1的统计学显著增加反映支气管收缩的减少，并表明MBV疗法是有效的。
用力肺活量测定的问题是用力肺活量动作(即，从最大吸气到最大呼气的用力呼气)很大程度上依赖于技术。换言之，给定受试者可能在一系列连续的FVC动作期间产生不同的FVC值。FEF 25-75或在用力呼气动作的中间部分确定的用力呼气流量倾向于比FVC对技术的依赖程度更低。类似地，FEV1对技术的依赖程度倾向于低于FVC。因此，如本领域技术人员熟知的数学公式所确定的，FEF 25-75或FEV1的统计学显著增加反映支气管收缩减少，并表明MBV疗法是有效的。
除了测量呼出空气量作为肺功能指标外，在呼气周期的不同部分测量的以升/分钟为单位的流量可用于确定患者的肺功能状态。特别地，在用力最大呼气期间，以升/分钟为单位的最高气流速率的呼气峰值流量与患有哮喘和其他呼吸系统疾病的患者的整体肺功能密切相关。因此，如本领域技术人员熟知的数学公式所确定的，在施用MBV后峰值呼气流量的统计学显著增加表明该疗法是有效的。
可以向受试者施用构成疗程的MBV的1次或多次施用。疗程可以全身施用。疗程可以是每天施用MBV 1次，直至ARDS消退。或者疗程可以是每天施用MBV 2次，直至ARDS消退。疗程可以一次施用或在数小时内施用。例如，MBV可以通过IV推注施用或气管推注滴注施用，或者可以将其注入呼吸机或氧气面罩的氧气流中以在几分钟或几小时内连续施用。例如，MBV可以通过连续IV滴注施用。
在一些实施方案中，向受试者施用每次施用约1×101至约1×1020MBV/kg体重。可以向受试者施用例如约1×101至约1×103MBV，例如约1×101至约1×102MBV，浓缩成微升体积，例如用于吸入。例如，在一个实施方案中，体积为50μL–500μL。例如，在一个实施方案中，体积为100μL–300μL。例如，在一个实施方案中，体积为200μL–400μL。例如，在一个实施方案中，体积为300μL–400μL。在进一步的实施方案中，体积为250μL。在进一步的实施方案中，体积为300μL。在更多实施方案中，体积可以为约1μL至约5μL，例如约1μL至约4μL、约1μL至约3μL、或约1μL至约2μL。在一个实施方案中，提供约1×101至约1×103MBV以约50-500μL的体积用于吸入施用。
根据另外的实施方案，向受试者施用每次施用约1×106至约1×1020MBV/kg体重，例如约1×106至约1×1012MBV/kg体重。在实施方案中，向受试者施用约1×106至约1×1019MBV、约1×106至约1×1018MBV、约1×106至约1×1017MBV、约1×106至约1×1016MBV、约1×106至约1×1015MBV、约1×106至约1×1014MBV、约1×106至约1×1013MBV或约1×106至约1×1012MBV。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用约1×107至约1×1011MBV/kg体重。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用1×107至1×108MBV/kg体重。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用1×108至1×1010MBV/kg体重。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用1×109至1×1010MBV/kg体重。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用1×106至1×108MBV/kg体重。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用1×107至1×109MBV/kg体重。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用1×108至1×1011MBV/kg体重。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用1×109至1×1011MBV/kg体重。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用1×1010至1×1011MBV/kg体重。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用1×1011至1×1012MBV/kg体重。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用1×106至1×1014MBV/kg体重。在另一个实施方案中，向受试者施用每次施用1×1012至1×1014MBV/kg体重。在一个实施方案中，根据任何上述量施用MBV是通过全身施用。例如，在一个实施方案中，施用是静脉内施用。在另一个实施方案中，施用是通过吸入。在一个实施方案中，吸入是通过喷雾器或吸入泵。
在另一个实施方案中，MBV通过鼻内施用在设定体积的液体中以每剂量的量施用。例如，在一个实施方案中，体积为50μL–500μL。例如，在一个实施方案中，体积为100μL–300μL。例如，在一个实施方案中，体积为200μL–400μL。例如，在一个实施方案中，体积为300μL–400μL。在进一步的实施方案中，体积为250μL。在进一步的实施方案中，体积为300μL。在更多实施方案中，体积可以为约1μL至约5μL，例如约1μL至约4μL、约1μL至约3μL、或约1μL至约2μL。在一个实施方案中，提供约1×101至约1×103MBV以约50-500μL的体积用于鼻内施用。在一个实施方案中，将约1×101至约1×103MBV浓缩至50-200μL载体(例如盐水)中，用于鼻内施用，例如通过鼻喷雾泵施用。在一个实施方案中，可以向受试者施用多剂量的MBV浓缩溶液，使得施用的所有剂量的总和提供约1×108至约1×1020MBV/kg体重的量的MBV。
在一个实施方案中，剂量中MBV数量为1×108至1×1010MBV。例如，在一个实施方案中，剂量中MBV数量为1×109MBV。在一个实施方案中，MBV在生理可接受的载体(例如生理盐水)中雾化。例如，待雾化的剂量中MBV数量为每次施用1×106至1×1020MBV/kg体重。例如，待雾化的剂量中MBV数量为每次施用1×106至1×1012MBV/kg体重。例如，剂量为每次施用1×107至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×107至1×108MBV/kg体重或每次施用1×108至1×1010MBV/kg体重或每次施用1×109至1×1010MBV/kg体重或每次施用1×106至1×108MBV/kg体重或每次施用1×107至1×109MBV/kg体重或每次施用1×108至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×109至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×1010至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×1011至1×1012MBV/kg体重。
在另一个实施方案中，MBV通过气管内施用在设定体积的液体中以每剂量1×107至1×1011MBV的量施用。例如，在一个实施方案中，体积为0.5mL至5.0mL。在其他实施方案中，体积是微升量。在另一个实施方案中，体积为1mL至3mL。例如，在一个实施方案中，体积为2mL至4mL。在又另一个实施方案中，体积为3mL。例如，在一个实施方案中，剂量中MBV数量为1×108至1×1010MBV。例如，在一个实施方案中，剂量中MBV数量为1×109MBV。例如，在一个实施方案中，剂量中MBV数量为每次施用1×1010至1×1011MBV/kg体重。例如，在一个实施方案中，剂量中MBV数量为每次施用1×1011至1×1012MBV/kg体重。
在另一个实施方案中，MBV通过静脉内施用在设定体积的液体中以每剂量1×107至1×1011MBV的量施用。例如，在一个实施方案中，体积为0.5mL至10.0mL。在另一个实施方案中，体积为1mL至5mL。在另一个实施方案中，体积为3mL至8mL。在又另一个实施方案中，体积为3mL。例如，在一个实施方案中，剂量中MBV数量为1×108至1×1010MBV。例如，在一个实施方案中，剂量中MBV数量为1×109MBV。例如，待静脉内施用的剂量中MBV数量为每次施用1×106至1×1020MBV/kg体重。例如，待静脉内施用的剂量中MBV数量为每次施用1×106至1×1012MBV/kg体重。例如，剂量为每次施用1×107至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×107至1×108MBV/kg体重或每次施用1×108至1×1010MBV/kg体重或每次施用1×109至1×1010MBV/kg体重或每次施用1×106至1×108MBV/kg体重或每次施用1×107至1×109MBV/kg体重或每次施用1×108至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×109至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×1010至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×1011至1×1012MBV/kg体重或每次施用1×1012至1×1014MBV/kg体重或每次施用1×1014至1×1020MBV/kg体重。
在另一个实施方案中，MBV通过腹腔施用在设定体积的液体中以每剂量1×107至1×1011MBV的量施用。例如，在一个实施方案中，体积为10mL至200mL。在另一个实施方案中，体积为50mL至100mL。在另一个实施方案中，体积为50mL-125mL。在又另一个实施方案中，体积为50mL。例如，在一个实施方案中，剂量中MBV数量为1×108至1×1010MBV。例如，在一个实施方案中，剂量中MBV数量为1×109MBV。例如，待腹腔施用的剂量中MBV数量为每次施用1×106至1×1020MBV/kg体重。例如，剂量为每次施用1×106至1×1012MBV/kg体重或每次施用1×107至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×107至1×108MBV/kg体重或每次施用1×108至1×1010MBV/kg体重或每次施用1×109至1×1010MBV/kg体重或每次施用1×106至1×108MBV/kg体重或每次施用1×107至1×109MBV/kg体重或每次施用1×108至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×109至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×1010至1×1011MBV/kg体重或每次施用1×1011至1×1012MBV/kg体重或每次施用1×1012至1×1014MBV/kg体重或每次施用1×1014至1×1020MBV/kg体重。
在一些实施方案中，施用是全身的。全身施用的示例性途径包括但不限于静脉内施用、口服施用、肠内施用、肠胃外施用、鼻内施用、吸入施用、气管内施用、直肠施用、舌下施用、口腔施用、阴道施用、腹腔施用、经皮施用、经粘膜或肌内施用。
在一些实施方案中，全身施用包括静脉内施用。在一些实施方案中，静脉内施用包括全身静脉内(IV)注射。在某些实施方案中，IV包括推注、连续滴注或泵注。在一些实施方案中，全身静脉内注射包括使用标准IV管或中心管。在某些实施方案中，标准IV管置于腕部、手臂或手的静脉中。在某些实施方案中，中心管选自由以下组成的组：外周插入中心静脉导管(peripherally inserted central catheter，PICC)、锁骨下管、颈内静脉管、股骨管、隧道式导管或植入式输液港。在特定实施方案中，将具有预期长期治疗，即长期住院的患者，例如患有COVID 19的患者，置于中心管以进行全身静脉内注射。
在一些实施方案中，施用是局部的，例如，施用于肺。例如，施用经由鼻和/或口吸入。例如，施用是气管内的。例如，对于COVID-19患者，可以使用气管内施用或经由鼻和/或口吸入施用。
吸入施用可以通过口腔和/或鼻腔介导。在某些实施方案中，通过气雾剂施用包含MBV的药物组合物来促进吸入。在一些实施方案中，吸入包括借助喷雾器或吸入器(例如，计量剂量吸入器或干粉吸入器)。在一些实施方案中，施用包括吸入液体雾。在一些实施方案中，施用通过吸入固体形式。在某些实施方案中，固体是纳米尺寸的并与纳米颗粒、纳米金刚石或纳米碳组合配制，或包装在脂质体或基于脂质体的包装中。在一些实施方案中，全身施用包括气管内施用，也称为气管内滴注。在某些实施方案中，MBV的全身施用包括通过气管内导管施用以快速施用至有需要的受试者的肺，例如患有严重ARDS的受试者，例如，患有与COVID 19相关的重度ARDS的受试者。
对于吸入施用，MBV可以方便地以气溶胶喷雾形式从加压包装或喷雾器中递送，并使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量的量来确定。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒可以配制成含有化合物和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。吸入制剂可以包括气雾剂、微粒等。通常，吸入颗粒大小的目标是约1μm或更小，以使药物到达肺的肺泡区域进行吸收。然而，可以修改颗粒大小以调整肺中的分布区域。因此，可以使用较大的颗粒(例如直径约1至约5μm)来实现在呼吸细支气管和空气空间中的沉积。
包含如本文所述的MBV作为活性成分的药物组合物通常与合适的固体或液体载体一起配制，这取决于所选择的特定施用方式。例如，药学上和生理学上可接受的流体溶媒，例如水、生理盐水、其他平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等可用于注射制剂，或用于雾化或气雾制剂。可以包括的辅料是例如蛋白质，例如人血清白蛋白或血浆制品。如有需要，待施用的药物组合物还可以含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。制备此类剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或将是显而易见的。
在一些实施方案中，包含MBV的药物组合物将配制成单位剂型，适合于精确剂量的个体施用。施用的活性化合物的量将取决于接受治疗的受试者、疾病的严重程度和施用方式，并且最好留给开处方的临床医生来判断。在这些范围内，待施用的制剂将含有一定量的活性成分，其量可有效地在接受治疗的受试者中实现期望效果。
例如，一种向个体的肺施用的方法是通过使用喷雾器或吸入器吸入。例如，MBV被配制成气溶胶或微粒，并使用本领域技术人员熟知的标准雾化器吸入肺。
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案，以最终每次施用递送1×106至1×1012MBV(即囊泡的绝对数量)/kg体重。施用可以以单次施用、周期性推注或连续输注提供，例如通过从缓释药物或药物递送装置中连续释放特定时期。可以适当地向受试者施用尽可能多的剂量。如果施用多剂，施用可以是间歇性的。在示例性实施方案中，治疗有效量的MBV的施用(例如全身施用，例如静脉内施用，或任何其他施用途径)可以进行一次，或者可以重复进行，例如1、2、3次，4、5、6、7、8、9或10次。在示例性实施方案中，可以每天一次、每天两次、每隔一天进行施用，直至ARDS的症状消退。在其他实施方案中，仅需要单次施用即可实现治疗获益。
个体剂量通常不小于对受试者产生可测量效果所需的量，并且可以基于受试者组合物或其副产物的吸收、分布、代谢和排泄(“ADME”)的药代动力学和药理学，因此，基于受试者体内组合物的处置来确定。这包括考虑施用途径以及剂量，可以针对局部和全身(例如，静脉内)应用进行调整。有效剂量和/或剂量方案可以很容易地从临床前测定、安全性以及剂量递增和剂量范围试验、个体临床医生-患者关系以及体外和体内测定中凭经验确定。通常，这些测定将评价炎症性病症(例如脑炎或特应性皮炎)。
治疗有效量的MBV可以悬浮于药学上可接受的载体中(例如在药物制剂中)，例如，在等渗缓冲溶液中，pH为约3.0至约8.0，优选pH为约3.5至约7.4、3.5至6.0或3.5至约5.0。有用的缓冲剂包括柠檬酸钠-柠檬酸和磷酸钠-磷酸，以及乙酸钠/乙酸缓冲剂。其他试剂可以添加到组合物中，例如防腐剂和抗菌剂。这些组合物可以局部或全身施用，例如静脉内施用。
包含治疗有效量的MBV的药物制剂可以配制成单位剂型，适用于精确剂量的个体施用。施用的活性化合物的量将取决于接受治疗的受试者、疾病的严重程度和施用方式，并且最好留给开处方的临床医生来判断。在这些范围内，待施用的制剂将含有一定量的活性成分，其量可有效地在接受治疗的受试者中实现期望效果。在一些实施方案中，MBV治疗导致施用时出现的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的体征或症状减少或减轻。
在一些实例中，与施用MBV之前的炎症水平相比，MBV治疗可以导致受试者的炎症减少或减轻。在一些实例中，MBV治疗可以减轻或消除ARDS的体征或症状，例如病毒感染相关ARDS，例如COVID-19。
联合疗法
本发明的MBV治疗方法可用作单一疗法或与可用于治疗疾病或病症(例如，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或ARDS相关的感染)的一种或更多种其他疗法(例如，抗感染剂，例如抗病毒剂)联合使用。如本文所用，术语“联合”被理解为意指在受试者患有疾病的过程中向受试者递送两种或更多种不同的治疗，使得对患者的治疗效果在一个时间点重叠。在某些实施方案中，当第二治疗开始递送时，一种治疗的递送仍在进行，因此在施用方面存在重叠。这有时在本文中被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一情况的某些实施方案中，由于联合施用，治疗更有效。例如，第二治疗更有效，例如，与在没有第一治疗的情况下施用第二治疗相比，使用较少的第二治疗可以看到相同的效果，或者第二治疗在更大程度上减轻了症状，或者在使用第一治疗时看到了类似的情况。在某些实施方案中，递送使得与病症相关的症状或其他参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送的一种治疗所观察到的。两种治疗的效果可以是部分相加的、完全相加的或大于相加的。递送可以使得递送的第一治疗的效果在递送第二治疗时仍然可检测到。
可以以相同或不同的组合物或药物制剂向受试者施用另外的治疗剂。在一些实施方案中，受试者患有ARDS并且向受试者施用另外的治疗剂，例如抗炎药，例如非甾体抗炎药(NSAID，例如，阿司匹林、布洛芬和萘普生)、抗白细胞三烯、免疫选择性抗炎衍生物(ImSAID)、生物活性化合物、类固醇(例如皮质类固醇)和阿片类药物。
因此，在某些实施方案中，受试者已经接受、正在接受或计划接受一种或更多种适用于治疗疾病或病症的其他疗法。在某些实施方案中，本发明的治疗方法进一步包括向受试者施用一种或更多种适用于治疗疾病或病症(例如，感染)的其他疗法。在某些实施方案中，一种或更多种其他疗法包括改善细胞内病原体感染的一种或更多种症状的药剂。在某些实施方案中，一种或更多种其他疗法包括手术切除受感染的组织。
应当理解，本文公开的使用方法可以与药剂联合使用，例如，改善与细胞内病原体相关的疾病或病症的一种或更多种症状的抗感染剂。例如，本文公开的使用方法可以与抗病毒剂联合使用。
适用于治疗细胞内病原体感染的疗法在本领域中通常是已知的，并且例如由Kamaruzzaman等人(2017)Br.J.Pharmacol.174(14):2225-36和De Clercq等人(2016)Clin.Microbiol.Rev.29(3):695-747综述。在某些实施方案中，抗感染剂抑制或降低细胞内病原体的活力、增殖、感染性和/或毒力。细胞内病原体可以通过处于潜伏状态来逃避免疫监视和攻击。因此，在某些实施方案中，抗感染剂逆转细胞内病原体的潜伏期，从而宿主的免疫系统可以识别感染。
在某些实施方案中，细胞内病原体是病毒，并且抗感染剂是抗病毒剂。可以联合使用的示例性抗病毒剂包括但不限于阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、安普那韦(amprenavir)、阿扎那韦(atazanavir)、西多福韦(cidofovir)、达芦那韦、地拉韦定(Delavirdine)、去羟肌苷、二十二醇、依非韦伦、艾考恩丙替片、恩曲他滨、恩夫韦肽、恩替卡韦、依曲韦林(etravirine)、泛昔洛韦、法维拉韦、膦甲酸、福米韦生(Fomivirsen)、更昔洛韦、茚地那韦、碘苷、拉米夫定、洛匹那韦、马拉维若(maraviroc)、MK-2048、奈非那韦(Nelfinavir)、奈韦拉平、喷昔洛韦、雷特格韦(raltegravir)、利匹韦林、利托那韦、沙奎那韦(saquinavir)、司他夫定、替诺福韦曲氟尿苷、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、阿糖腺苷、伊巴他滨(ibacitabine)、金刚烷胺、奥司他韦、利美尼啶(rimantidine)、替拉那韦(tipranavir)、扎西他滨(zalcitabine)、扎那米韦、帕拉米韦、达诺瑞韦、瑞德西韦(remdesivir)和齐多夫定。特别地，在细胞内病原体是HIV的情况下，可联合使用的示例性抗HIV剂包括但不限于核苷/核苷酸逆转录酶抑制剂(例如，拉米夫定、阿巴卡韦、齐多夫定、司他夫定、去羟肌苷、恩曲他滨和替诺福韦)、非核苷类逆转录酶抑制剂(例如，地拉韦定(delavirdine)、依非韦伦、依曲韦林(etravirine)和奈韦拉平)、蛋白酶抑制剂(例如，安普那韦(amprenavir)、福沙那韦(fosamprenavir)、阿扎那韦(atazanavir)、达芦那韦、茚地那韦、洛匹那韦、利托那韦、奈非那韦(nelfinavir)、沙奎那韦(saquinavir)和替拉那韦(tipranavir))、融合或进入抑制剂(例如，恩夫韦肽和马拉维若(maraviroc))、整合酶抑制剂(例如，拉替拉韦和卡博特韦(cabotegravir))和潜伏期逆转剂(例如，HDAC抑制剂(例如，伏立诺他(vorinostat))和TLR7激动剂(例如，GS-9620，例如，如美国专利公开号US20160008374A1中所述))。在某些实施方案中，病毒是SARS-CoV2，并且联合疗法包括羟氯喹。在某些实施方案中，病毒是SARS-CoV2，并且联合疗法包括抗病毒剂。在某些实施方案中，病毒是SARS-CoV2，并且联合疗法包括抗菌剂作为针对继发感染的预防性治疗。
在某些实施方案中，细胞内病原体是细菌，并且抗感染剂是抗细菌剂。可联合使用的示例性抗菌剂包括但不限于阿奇霉素、万古霉素、甲硝唑、庆大霉素、黏菌素、非达霉素(fidaxomicin)、特拉万星(telavancin)、奥利万星(oritavancin)、达巴万星(dalbavancin)、达托霉素、头孢氨苄(cephalexin)、头孢呋辛、头孢羟氨苄、头孢唑林、头孢噻吩(cephalothin)、头孢克洛、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯、头孢比罗、环丙沙星、左氟沙星(Levaquin)、氧氟沙星(floxin)、加替沙星(tequin)、莫西沙星(avelox)、诺氟沙星、四环素、米诺环素、土霉素、多西环素、阿莫西林、氨苄西林、青霉素V、双氯西林、羧苄西林、甲氧西林(methicillin)、厄他培南、多尼培南(doripenem)、亚胺培南/西司他丁、美罗培南、阿米卡星、卡那霉素、新霉素、奈替米星、妥布霉素、巴龙霉素、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢他啶、头孢布烯(ceftibuten)、头孢唑肟、头孢曲松、头孢西丁(cefoxotin)、和链霉素。
在某些实施方案中，细胞内病原体是真菌，并且抗感染剂是抗真菌剂。可联合使用的示例性抗真菌剂包括但不限于那他霉素、龟裂霉素(rimocidin)、菲律宾菌素(filipin)、制霉菌素(nystatin)、两性霉素B、坎底辛(candicin)、和哈霉素(hamycin)、硝酸咪康唑、酮康唑、克霉唑、益康唑、奥莫拉唑(omoconazole)、联苯苄唑、布康唑、芬康唑(fenticonazole)、异康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑(tioconazole)、氟康唑、伊曲康唑、艾沙康唑(isavuconazole)、雷夫康唑(ravuconazole)、泊沙康唑、伏立康唑、特康唑(terconazole)和阿巴康唑(albaconazole)、阿巴芬净(abafungin)、特比萘芬、萘替芬、布替萘芬、阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净、米卡芬净、水蓼二醛(polygodial)、苯甲酸、环吡酮胺、托萘酯(tolnaftate)、十一烯酸、氟胞嘧啶或5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine)、灰黄霉素和卤苯炔醚(haloprogin)。
在某些实施方案中，细胞内病原体是原生动物，并且抗感染剂是抗原生动物剂。可联合使用的示例性抗原生动物剂包括但不限于奎宁(任选与克林霉素组合)、氯喹、阿莫地喹、青蒿素及其衍生物(如蒿甲醚、青蒿琥酯、双氢青蒿素、蒿乙醚(arteether))、多西环素、乙胺嘧啶、甲氟喹(mefloquine)、卤方特瑞(halofantrine)、羟氯喹、依氟鸟氨酸、硝唑尼特、奥硝唑、巴龙霉素、喷他脒(pentamidine)、伯氨喹、乙胺嘧啶、氯胍(proguanil)(任选地与阿托伐醌(atovaquone)联用)、磺胺类药物(例如，磺胺多辛、磺胺甲氧吡嗪)、他非诺喹(tafenoquine)和替硝唑。在具体实施方案中，细胞内病原体是疟原虫(例如，间日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫)，并且抗感染剂是抗疟剂。可联合使用的示例性抗疟剂包括但不限于奎宁(任选与克林霉素组合)、氯喹、阿莫地喹、青蒿素及其衍生物(例如蒿甲醚、青蒿琥酯、双氢青蒿素、蒿乙醚(arteether))、多西环素、卤方特瑞(halofantrine)、甲氟喹(mefloquine)、伯氨喹、氯胍(proguanil)(任选与阿托伐醌(atovaquone)组合)、磺胺类药物(例如，磺胺多辛、磺胺甲氧哒嗪)、他非诺喹(tafenoquine)。这些抗疟剂可与MBV联合用于治疗ARDS。
可用作治疗ARDS或与ARDS相关的高细胞因子血症的联合疗法的一部分的另一类药物是抗炎剂和/或免疫抑制剂，例如细胞因子抑制剂、钙调神经磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂或类固醇：在一些实施方案中，抗炎剂包含钙调神经磷酸酶抑制剂，例如他克莫司和环孢素。在一些实施方案中，抗炎剂包含mTOR抑制剂，例如西罗莫司。在一些实施方案中，抗炎剂包含类固醇，例如泼尼松。在一些实施方案中，抗炎剂包含细胞因子抑制剂，例如IL-6拮抗剂、IL-1拮抗剂、可溶性肿瘤坏死因子受体、IL-1受体激动剂和TGF-β1潜伏期相关肽。在某些实施方案中，细胞因子抑制剂包含托珠单抗、沙利鲁单抗(sarilumab)、阿那白滞素或司妥昔单抗。在某些实施方案中，抗炎剂包含Janus激酶(JAK)抑制剂，例如托法替布、芦可替尼或巴瑞替尼。
可以根据具体感染的诊断选择合适的疗法。当受试者感染多种病原体(例如，多种细胞内病原体，例如多种病毒感染，例如SARS-CoV2和继发感染)时，可以使用用于治疗这些感染的两种或更多种合适疗法与本文公开的MBV疗法联合使用。
在一个实施方案中，本发明的组合物用作与针对SARS-CoV2的抗体疗法(例如，巴尼韦单抗(bamlanivimab)、埃特司韦单抗(etesevimab)、卡西瑞单抗(casirivimab)或依米得韦单抗(imdevimab)，或它们的组合)的联合疗法的一部分。
在一些实施方案中，该方法包括检测已经实现治疗获益的步骤。治疗疗效的测量将适用于待改善的特定疾病，并且本领域技术人员将认识到用于测量治疗疗效的适当检测方法。可以使用本领域已知的任何方法评价受试者的反应。在示例性实施方案中，受试者患有炎症性病症(例如脑炎或特应性皮炎)，并且受试者的治疗反应可以通过白细胞计数、多形核中性粒细胞(PMN)的数量、PMN激活程度(例如鲁米诺增强的化学发光)、细胞因子的量、C-反应蛋白和本领域已知的其他量度进行测量。
术语
提供以下对术语和方法的解释以更好地描述本公开并指导本领域普通技术人员实施本公开。除非上下文另有明确规定，否则单数形式“a”、“an”和“the”指一个或更多个。例如，术语“包含细胞(comprising a cell)”包括单个或多个细胞并且被认为等同于短语“包含至少一个细胞”。除非上下文另有明确说明，否则术语“或”是指所述可选要素的单个要素或两个或更多个要素的组合。如本文所用，“包含”意指“包括”。因此，“包含A或B”意指“包括A、B，或A和B”，而不排除另外的要素。本文提及的
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登录号的日期是至少早在2015年9月16日可获得的序列。本文引用的所有参考文献、专利申请和出版物以及登录号均通过引用并入本文。除非另有说明，否则“约”表示在百分之五以内。为了便于对本公开的各个实施方案的综述，提供以下对特定术语的解释：
急性呼吸窘迫综合征：急性呼吸窘迫综合征或“ARDS”是指一种呼吸衰竭，其特征是肺部迅速出现广泛的炎症，以及重度低氧血症是标志性症状。体征和症状通常在刺激事件发生后的几个小时内出现，但也可能在几天或一周内出现。在ARDS中，液体从肺部最小的血管渗入肺泡。在正常生理学中，肺泡毛细血管膜保护肺部免受此类液体的侵害。然而，在肺泡-毛细血管膜出现重度肺和/或全身性损伤的情况下，膜可能受损，导致ARDS。在某些实施方案中，ARDS与肺感染有关。
ARDS的症状可以包括但不限于气短、呼吸急促、血氧饱和度降低、头痛、低血压、发热、咳嗽、精神错乱、极度疲乏以及由于低氧血症导致的皮肤和/或指甲变色。ARDS损害肺部交换氧气和二氧化碳的能力。ARDS患者的胸片显示双肺浸润，例如，双肺出现广泛的“磨玻璃”混浊。从诊断的角度来看，根据柏林标准，尽管呼气末正压(PEEP)超过5cm H2O，但当PaO2/FiO2(动脉氧分压与吸入氧分数之比)低于300mm Hg时诊断为ARDS。在轻度病例中，PaO2/FiO2大于200mg Hg且小于300mg。在中度病例中，PaO2/FiO2大于100mg Hg且小于200mg。在严重度病例中，PaO2/FiO2小于100mm Hg。初级治疗包括施用氧气和/或机械通气。
施用：通过选定途径将组合物(例如MBV或包括MBV的药物制剂)引入受试者。途径可以是局部的或全身的。例如，如果选择的途径是静脉内的，则通过将组合物引入受试者的静脉来施用组合物。如果选择的途径是局部的，则可以通过将组合物直接引入受试者的组织中来施用组合物。
动物：活的多细胞脊椎动物生物，包括例如哺乳动物和鸟类。术语“哺乳动物”包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人受试者和兽医受试者。
关节炎：关节炎是影响身体中一个或更多个关节的滑膜的炎症性疾病。它是最常见的关节疾病类型，其特征是关节发炎。该疾病通常是少关节型(影响少数关节)，但也可能是全身性的。常累及的关节包括髋、膝、下腰椎和颈椎、手指近端和远端指间关节、第一腕掌关节和足部第一跗跖关节。症状包括关节疼痛和僵硬、发红、发热、肿胀以及受影响关节的活动范围减小。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗关节炎。关节炎的类型包括但不限于类风湿性关节炎和银屑病关节炎。
生物相容性：任何材料，当植入哺乳动物受试者时，未引起受试者的不良反应。生物相容性材料在被引入个体时能够发挥其预期功能，并且对个体没有毒性或伤害性，也未诱导受试者对该材料的免疫排斥。
富集：与富集过程之前相比，在富集过程之后混合物中的目的组分(例如纳米囊泡)具有增加的该组分的量与该混合物中其他非期望组分的量的比率的过程。
细胞外基质(ECM)：结构和功能生物分子和/或生物大分子的复杂混合物，包括但不限于结构蛋白、特化蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和生长因子，它们围绕和支持组织内的细胞，除非另有说明，否则是无细胞的。ECM制剂可以被认为是“脱细胞的”或“无细胞的”，表示已经通过本文所述和本领域已知的方法从源组织去除细胞。通过“ECM来源的材料”，例如“ECM来源的纳米囊泡”，“基质结合纳米囊泡”、“MBV”或“源自ECM的纳米囊泡”是由天然ECM或体外来源制备的纳米囊泡，其中ECM由培养的细胞产生。ECM来源的纳米囊泡定义如下。
高细胞因子血症或“细胞因子释放综合征”：免疫系统的急性过度反应，在本领域也称为“细胞因子风暴”或“细胞因子风暴综合征”；这种免疫应答是全身性炎症反应综合征，可由感染性疾病或病症引起。当大量白细胞被激活并释放炎性细胞因子时，发生高细胞因子血症，这反过来又在致病性炎症的正反馈循环中激活更多的白细胞。此外，促炎细胞因子与免疫细胞上的同源受体结合，导致激活和刺激进一步细胞因子产生。高细胞因子血症病理与在局部部位开始并扩散到全身的炎症有关，例如经由过全身循环，并可能导致多器官衰竭。由病毒感染引起的高细胞因子血症病理与急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征相关。高细胞因子血症病理学例如描述于Tisonick等人，(2012)“Into the Eye of theCytokine Storm,”Microbiol.Mol.Biol.Rev.,76(1):16-32。过量释放的细胞因子可以包括但不限于，例如，IL-6、IFN-γ、IL-8(CXCL8)、IL-10、GM-CSF、MIP-1α/β、MCP-1(CCL2)、CXCL9和CXCL10。
感染：是指病原体(例如病毒、细菌、真菌或原生动物)的入侵和增殖，这些病原体通常不存在于宿主(例如患者)体内，或者通常不存在于宿主特定位置的病原体侵入宿主中另一个位置，(例如，当通常存在于消化道中的病原体进入泌尿道，或通常存在于皮肤上的病原体进入血流时)。感染可能不引起症状并且是亚临床的，或者它可能引起症状并且在临床上是明显的。感染可能保持局部化，或者可能扩散，例如通过血液或淋巴管，成为全身性感染。
炎症：炎症是局部保护性反应，由组织损伤引起，用于隔离炎症因子。炎症是由血管组织对有害刺激(例如病原体、受损细胞或刺激物)的复杂生物反应精细安排的。这是有机体消除有害刺激并启动组织愈合过程的保护性尝试。炎症反应的特征是白细胞在炎症部位全身或局部蓄积。可以通过许多方法测量炎症反应，包括但不限于测量白细胞数量、多形核中性粒细胞(PMN)数量、PMN激活程度的测量(例如鲁米诺增强的化学发光)或测量存在的细胞因子的量。C反应蛋白是全身炎症反应的标志物。
炎症性病症是炎症破坏正常或常规生理功能的一类疾病。炎症性病症可以包括多种病状，例如自身免疫性疾病(对内源性抗原的不适当炎症反应)，以及由外伤或外源性抗原引起的炎症引起的病症。原发性炎性病症是由炎症本身引起的疾病或病症。继发性炎症性疾病是由另一种病症引起的炎症。炎症可以导致炎症性病症，例如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
在一些实施方案中，施用抗炎剂以治疗炎症性疾病或病症，例如ARDS。抗炎剂包括但不限于非甾体抗炎药(NSAID，例如阿司匹林、布洛芬和萘普生)、抗白细胞三烯、免疫选择性抗炎衍生物(ImSAID)、生物活性化合物、类固醇(例如皮质类固醇)和阿片类药物。
流感：流感(influenza，也称为“流感(flu)”)是由流感病毒引起的感染性疾病。三种类型的流感病毒可能感染人：甲型、乙型和丙型；丁型尚未显示感染人。流感病毒具有高度传染性；在非限制性实例中，流感病毒通过空气中来自感染个体的咳嗽或打喷嚏的飞沫传播。流感每年爆发在全球蔓延，导致约3至500万例重症病例和约290,000至650,000例死亡(“流感(季节性)”。世界卫生组织(WHO)。2018年11月6日)。世界卫生组织(WHO)建议高风险人群每年接种流感疫苗。可能发生更大规模的全球性强流感病毒株暴发，例如1918年的流感(导致0.17-1亿例死亡)、1957年的流感(导致200万例死亡)和1968年的流感(导致100万例死亡)。2009年6月，世界卫生组织宣布新型甲型H1N1流感(也称为“猪流感”)爆发成为大流行(Chan M.(2009)。"世界正处于2009年流感大流行的开端"。世界卫生组织(WHO)。原文件于2009年6月12日存档)。流感感染的症状包括但不限于发热、流鼻涕、喉咙痛、肌肉和关节疼痛、头痛、咳嗽和疲乏。在某些实施方案中，流感与病毒性肺炎有关。在某些实施方案中，流感与继发性细菌性肺炎有关。
分离的：“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白质细胞或纳米囊泡)已与该组分天然存在的生物体细胞或ECM中的其他生物组分基本分离或纯化。已“分离”的核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。从ECM的纤维材料中去除已分离的MBV。该术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
赖氨酰氧化酶(Lox)：铜依赖性酶，可催化胶原蛋白和弹性蛋白前体中的赖氨酸残基形成醛。这些醛具有高反应性，并与其他赖氨酰氧化酶衍生的醛残基或未修饰的赖氨酸残基发生自发化学反应。在体内，这导致胶原蛋白和弹性蛋白交联，其在稳定胶原蛋白原纤维和成熟弹性蛋白的完整性和弹性方面发挥作用。复杂的交联在结构不同的胶原蛋白(源自三个赖氨酸残基的吡啶啉)和弹性蛋白(源自四个赖氨酸残基的锁链素)中形成。编码Lox酶的基因已从多种生物中克隆(Hamalainen等人，Genomics 11:508,1991；Trackman等人，Biochemistry 29:4863,1990；其通过引用并入本文)。人赖氨酰氧化酶序列的残基153-417和残基201-417已被证明对催化功能很重要。有四种类似Lox的亚型，称为LoxL1、LoxL2、LoxL3和LoxL4。
巨噬细胞：一种吞噬和降解细胞碎片、异物、微生物和癌细胞的白细胞。除了它们在吞噬作用中的作用之外，这些细胞在发育、组织维持和修复以及先天免疫和适应性免疫中均发挥着重要作用，因为它们募集和影响其他细胞，包括免疫细胞，例如淋巴细胞。巨噬细胞可以存在于许多表型中，包括被称为M1和M2的表型。主要发挥促炎功能的巨噬细胞称为M1巨噬细胞(CD86+/CD68+)，而减少炎症并促进和调节组织修复的巨噬细胞称为M2巨噬细胞(CD206+/CD68+)。识别巨噬细胞各种表型的标志物因物种而异。应该注意的是，巨噬细胞表型由介于M1和M2极端之间的光谱表示。F4/80(由粘附G蛋白偶联受体E1(ADGRE1)基因编码)是巨噬细胞标志物，参见2018年4月6日的
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登录号NP_001243181.1和2018年3月5日的NP_001965，二者均通过引用并入本文。不希望受理论束缚，认为MBV具有调节巨噬细胞表型的能力，导致M2样、调节或促重塑巨噬细胞增加。MBV对巨噬细胞的作用在WO2017/151862A1中进一步表征，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施方案中，本发明的MBV可用于诱导巨噬细胞中的M2表型并抑制受试者中的M1巨噬细胞。
MicroRNA：小非编码RNA，长度为约17至约25个核苷酸碱基，通过通常抑制靶mRNA翻译在转录后调节基因表达。miRNA可以作为负调节因子，因此更大量的特定miRNA将与更低水平的靶基因表达相关。miRNA有三种形式，初级miRNA(pri-miRNA)、早熟miRNA(pre-miRNA)和成熟miRNA。初级miRNA(pri-miRNA)以茎环结构的转录本形式表达，约几百个碱基到超过1kb。Pri-miRNA转录物在细胞核中被称为Drosha的RNase II核酸内切酶切割，该酶切割靠近茎环基部的茎的两条链。Drosha以交错切割方式切割RNA双链体，在3'末端留下5'磷酸盐和2个核苷酸突出端。切割产物，早熟miRNA(pre-miRNA)长约60至约110个核苷酸，具有以折叠方式形成的发夹结构。Pre-miRNA通过Ran-GTP和Exportin-5从细胞核转运到细胞质。Pre-miRNA在细胞质中被另一种称为Dicer的RNase II核酸内切酶进一步加工。Dicer识别5'磷酸盐和3'突出端，并在茎环连接处将环切掉以形成miRNA双链体。miRNA双链体与RNA诱导的沉默复合体(RISC)结合，其中反义链优先降解，而正义链成熟的miRNA将RISC引导至其靶位点。成熟miRNA是miRNA的生物活性形式，长度为约17至约25个核苷酸。
纳米囊泡：细胞外囊泡，其为直径约10至约1,000nm的纳米颗粒。纳米囊泡是脂质膜结合颗粒，在其他分子中携带生物活性信号分子(例如microRNA、蛋白质)。通常，纳米囊泡由脂质双层限制，并且生物分子被封闭和/或可以嵌入双层中。因此，纳米囊泡包括被质膜包围的内腔。可以基于直径、亚细胞来源、密度、形状、沉降速率、脂质组成、蛋白质标志物、核酸含量和来源(例如来自细胞外基质或分泌)来区分不同类型的囊泡。纳米囊泡可以通过其来源来识别，例如来自ECM(见上文)的基质结合纳米囊泡、蛋白质含量和/或miR含量。
“外泌体”或“液相细胞外囊泡(EV)”是由细胞分泌的膜状囊泡，直径范围为10至150nm。通常，晚期内体或多泡体含有腔内小泡，这些小泡是由小泡从有限的内体膜向内出芽和分裂成这些封闭的小泡而形成的。然后，在与质膜融合后的胞吐作用期间，这些腔内囊泡从多泡体腔释放到细胞外环境中，通常释放到体液中，例如血液、脑脊液或唾液中。当一段膜内陷并被内吞时，外泌体在细胞内产生。被分解成更小的囊泡并最终从细胞中排出的内化片段包含蛋白质和RNA分子，例如mRNA和miRNA。血浆来源的外泌体很大程度上缺乏核糖体RNA。细胞外基质来源的外泌体包括特定的miRNA和蛋白质组分，并且已被证明存在于几乎所有体液中，例如血液、尿液、唾液、精液和脑脊液。外泌体可以表达CD11c、CD63、CD81和/或CD9，因此可以是CD11c+和/或CD63+和/或C81+和/或CD9+。外泌体的表面没有高水平的赖氨酰氧化酶。
“源自ECM的纳米囊泡”、“基质结合的纳米囊泡”、“MBV”或“源自ECM的纳米囊泡”均指存在于细胞外基质中的相同的膜结合颗粒，尺寸范围为10nm-1000nm，它含有生物活性信号分子，例如影响细胞行为的蛋白质、脂质、核酸、生长因子和细胞因子。这些术语是可互换使用的，并且指的是相同的囊泡。这些纳米囊泡嵌入并结合到ECM内，而不是简单地附着在表面或在体液中自由循环。这些纳米囊泡能够耐受苛刻的分离条件，例如冻融和用蛋白酶(如胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、蛋白酶K和胶原酶)消化，以及用去污剂消化。MBV与其他细胞外囊泡(包括外泌体)不同，并且具有与外泌体不同的磷脂组成。在某些情况下，MBV还可以与外泌体相区分，因为缺乏通常归因于外泌体的某些标志物。它们也不同于参与骨生成和矿化的骨基质囊泡，后者表达碱性磷酸酶。MBV不表达碱性磷酸酶。
在一些实施方案中，MBV的特征在于蛋白质表达或脂质含量的以下一种或更多种特征：
(i)与其他囊泡(例如外泌体)比较，MBV可以不表达CD63和/或CD81和/或CD9中的一种或更多种，或者具有低水平或几乎检测不到水平的CD63和/或CD81和/或CD9(CD63lo和/或CD81lo和/或CD9lo)(见，例如，实施例1)。(另见实施例17和图24)。多种方法可用于区分MBV中CD63和/或CD81和/或CD9的低表达、几乎检测不到或不存在表达，例如基于抗体的方法，例如western印迹或流式细胞术(参见，例如，Bashashati和Brinkman,AdvBioinformatics,2009:584603)。在一些实施方案中，与其他囊泡相比，认为CD63和/或CD81和/或CD9的MBV表达低或几乎检测不到，其中MBV中CD63和/或CD81和/或CD9的表达低于其他囊泡(例如外泌体)平均表达至少一个标准偏差或至少两个标准偏差；
(ii)MBV具有的磷脂含量其中至少55％的总磷脂包含磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)组合；
(iii)MBV具有的磷脂含量其中10％或更少的总磷脂包含鞘磷脂(SM)；
(iv)MBV具有的磷脂含量其中20％或更少的总磷脂包含磷脂酰乙醇胺(PE)；
(v)MBV具有的磷脂含量其中15％或更多的总磷脂含量包含磷脂酰肌醇(PI)，百分比代表脂质浓度的百分比。
在一些实施方案中，MBV的特征在于所有以下特征：
(i)不表达CD63和/或CD81和/或CD9中的一种或更多种，或具有低水平或几乎检测不到水平的CD63和/或CD81和/或CD9(CD63lo和/或CD81lo和/或CD9lo)(进一步如上所述)；
(ii)磷脂含量中至少55％的总磷脂包含磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)组合；
(iii)磷脂含量中10％或更少的总磷脂包含鞘磷脂(SM)；
(iv)磷脂含量中20％或更少的总磷脂包含磷脂酰乙醇胺(PE)；和
(v)磷脂含量中15％或更多的总磷脂含量是磷脂酰肌醇(PI)。
在一些实施方案中，MBV的特征在于所有以下特征：
(i)磷脂含量中至少55％的总磷脂包含磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)组合；
(ii)磷脂含量中10％或更少的总磷脂包含鞘磷脂(SM)；
(iii)磷脂含量中20％或更少的总磷脂包含磷脂酰乙醇胺(PE)；和
(iv)磷脂含量中15％或更多的总磷脂含量是磷脂酰肌醇(PI)。
在一些实施方案中，MBV的特征在于以下特征中的一个或更多个：
(i)磷脂含量中至少55％的总磷脂包含磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)组合；
(ii)磷脂含量中10％或更少的总磷脂包含鞘磷脂(SM)；
(iii)磷脂含量中20％或更少的总磷脂包含磷脂酰乙醇胺(PE)；和
(iv)磷脂含量中15％或更多的总磷脂含量是磷脂酰肌醇(PI)。
从中分离MBV的ECM可以是来自组织的ECM，可以从培养的细胞中产生，或者可以从商业来源购买。
在一些实施方案中，MBV的特征在于以下特征中的一个或更多个：
(i)不含可检测水平的碱性磷酸酶；
(ii)不含可检测水平的骨桥蛋白；
(iii)不含可检测水平的骨保护素；
(iv)不含可检测水平的补体C5；和/或
(v)不含可检测水平的c-反应蛋白。
在一些实施方案中，MBV的特征在于以下特征中的一个或更多个：
(i)含有低水平或不含可检测水平的EpCAM，
(ii)含有低水平或不含可检测水平的ANXA5，
(iii)含有低水平或不含可检测水平的TSG101；
(iv)含有低水平或不含可检测水平的FLOT1；
(v)含有低水平或不含可检测水平的ICAM1；
(vi)含有低水平或不含可检测水平的GM130；和/或
(vii)含有低水平或不含可检测水平的ALIX。
在一个实施方案中，MBV的特征在于低水平或检测不到水平的ANXA5、TSG101和ICAM1。
在一个实施方案中，MBV的特征在于低水平或检测不到水平的CD81、CD63、ANXA5、TSG101和ICAM1。
氧饱和度指数(OSI)：氧饱和度指数是氧指数(OI)的非侵入性替代指标，使用特定的氧水平(SpO2)计算得出。OSI＝(FiO2×平均气道压力×100)/SpO2。SpO2(氧饱和度)可以无创测量，例如通过脉搏血氧饱和度测定法，它是血液中氧饱和血红蛋白与总血红蛋白(不饱和和饱和)的比例的量度。
氧指数(OI)：氧指数＝(FiO2×平均气道压力×100)/PaO2，与OSI不同，需要进行有创的动脉血气测量。
药学上可接受的载体：可用于要求保护的药物制剂的药学上可接受的载体是常规的。雷明顿药物科学，由E.W.Martin撰写，Mack Publishing Co.,Easton,PA,第15版(1975)描述了适用于本文公开的融合蛋白的药物递送的组合物和制剂。
通常，载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括药学和生理学可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为溶媒。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，待施用的药物制剂可以含有少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
药剂：当适当地施用于受试者或细胞时能够诱导期望的治疗或预防效果的化合物或组合物。
磷脂：一类脂质，其结构由两个疏水脂肪酸尾和由磷酸基团组成的亲水头组成。磷脂的主要类别包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、鞘磷脂(SM)、心磷脂(CL)、磷脂酸(PA)和双单酰基甘油磷酸酯(BMP)。磷脂可以通过多种方式进行测量。例如，可以使用基于LC-MS的全局脂质组学和氧化还原脂质组学。在一些实施方案中，特定磷脂含量表示为总磷脂(例如MBV中的总磷脂)的百分比浓度，其中百分比浓度是重量/重量。
肺炎：使一侧或双侧肺泡(气囊)发炎的感染。在一些实施方案中，肺部充满液体或脓液。在一些实施方案中，肺炎与病毒感染有关，例如冠状病毒(例如，SARS-CoV2、SARS-CoV、MERS-CoV)，例如流感病毒(例如，甲型流感)，例如埃博拉病毒。在一些实施方案中，肺炎与细菌感染有关，例如肺炎链球菌。在一些实施方案中，肺炎与真菌感染有关，例如，耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii)。在一些实施方案中，肺炎是继发性感染，即患有既存感染(例如，COVID-19)的患者发展为肺炎。在一些实施方案中，肺炎是医院获得的。在一些实施方案中，肺炎是社区获得的。肺炎的症状包括但不限于咳嗽、发热、呼吸急促、气短、胸痛和疲乏。在某些实施方案中，肺炎与ARDS相关。
多核苷酸：任意长度的核酸序列(例如线性序列)。因此，多核苷酸包括寡核苷酸以及染色体中发现的基因序列。“寡核苷酸”是通过天然磷酸二酯键连接的多个连接核苷酸。寡核苷酸是长度为6至300个核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸类似物是指功能类似于寡核苷酸但具有非天然存在部分的部分。例如，寡核苷酸类似物可以含有非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间键，例如硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。天然存在的多核苷酸的功能类似物可以与RNA或DNA结合，并且包括肽核酸(PNA)分子。
预防性：如本文所用，是指设计和用于预防疾病或病症发生的药物或治疗。如本文所用，术语“预防性”和“预防”可互换使用。
纯化的：术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，它是相对术语。因此，例如，纯化的核酸分子制剂是其中所指的核酸比细胞内其天然环境中的核酸更纯的一种。例如，纯化核酸制剂，使得核酸占制剂总蛋白质含量的至少50％。类似地，纯化的MBV制剂是其中外泌体比在环境(包括细胞)中更纯的制剂，其中存在微囊泡和外泌体。纯化的核酸或MBV群体的纯度分别大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或不含其他核酸酸或细胞组分。
预防或治疗疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的发展，例如在已知易患疾病的人中。具有已知易感性的人的实例是家族中有疾病史的人，或者已暴露于使受试者易患病状的因素的人。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其体征或症状的治疗干预。
SARS-CoV-2或严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，在本领域中也称为2019-新型冠状病毒或2019-nCoV，是于2019年底发现的新型冠状病毒并且是2020年全球大流行的原因。由SARS-CoV-2引起的疾病称为冠状病毒病2019或COVID-19。COVID-19引起多种症状，包括咳嗽、发热、疲乏、身体疼痛和气短。患有重度疾病的COVID-19患者可能出现急性呼吸窘迫综合征并需要机械通气。
败血症：败血症是当血液中释放的细胞因子和趋化因子(例如，对抗感染，例如细胞内病原体或病毒)在全身产生全身性炎症时可能发生的病症。败血症可以导致广泛的器官损伤、器官衰竭和死亡。败血症的症状包括但不限于心率加快、意识模糊或定向障碍、极度疼痛或不适、发热和气短。在一些实施方案中，败血症与ARDS相关。在一些实施方案中，败血症与高细胞因子血症相关。
受试者：人和非人动物，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、小鼠、兔、羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在所述方法的许多实施方案中，受试者是人。“受试者”与术语“患者”可互换使用。受试者可以是被诊断患有疾病或病症的高风险个体，例如感染性疾病或病症(例如，免疫功能低下的个体、医疗保健专业人员)，已被诊断患有疾病或病症(例如，感染性疾病或病症)的人，既往患有疾病或病症(例如感染性疾病或病症)的人，或评价疾病或病症(例如感染性疾病或病症)的症状或适应症的个体.
治疗有效量：足以在接受治疗的受试者中达到期望效果的特定物质(例如MBV)的量。当施用于受试者时，通常使用的剂量将达到靶组织浓度(例如，在肺中)，该浓度已被证明可实现期望的体外效果。
总磷脂含量：如本文所用，“总磷脂”或“总磷脂含量”在MBV方面是指存在于给定量的分离的MBV(即从ECM分离的MBV)中的所有磷脂的总和。MBV可以被分离，例如，通过脱细胞的ECM的酶消化和差速离心。总磷脂含量可以通过基于LC-MS的全局脂质组学和氧化还原脂质组学等方法确定。总磷脂含量以重量计。总磷脂含量的百分比是指基于重量/重量的百分比浓度
移植：将生物相容性基质(例如MBV)植入有需要的受试者体内。
治疗(treating、treatment)和疗法：减轻或改善损伤、病理或病状的任何成功或成功指标，包括任何客观或主观参数，例如减轻、缓解、减少症状或使患者更耐受病状，减缓退化或衰退的速度，使退化的终点虚弱较低，或改善受试者的身体或精神健康。治疗可以通过客观或主观参数进行评估；包括身体检查、神经系统检查或精神评价的结果。
除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V,由Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑)，The Encyclopedia of Molecular Biology,由BlackwellScience Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编辑)，MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
上述描述描述了本发明的多个方面和实施方案。本专利申请具体设想了各方面和实施方案的所有组合和排列。
实施例
通过参考以下实施例将更容易理解现在一般性地描述的公开内容，仅出于说明本公开的某些方面和实施方案的目的而将其包括在内，并不旨在以任何方式限制本公开的范围。
实施例1：通过脂质组学和RNA测序区分基质结合囊泡(MBV)和细胞外囊泡(EV)
已报道基质结合纳米囊泡(MBV)是ECM生物支架的组成部分。尽管液相细胞外囊泡(EV)一直是深入研究的主题，但它们与MBV的相似性仅限于大小和形状。本实施例利用基于LC-MS的脂质组学和氧化还原脂质组学对液相EV和MBV磷脂进行详细比较。结合对囊内运载物的全面RNA测序和生物信息学分析，本实施例表明MBV是EV的不同且独特的亚群，并且是基于ECM的生物材料的区别特征。
本实施例识别了EV的液相(即外泌体)和基质结合形式(即MBV)之间的异同。然而，鉴于存在于生物体液中的EV和存在于天然组织ECM和基于ECM的生物材料中的MBV代表了从多个细胞来源分泌的异源群体，因此在这些推定的EV群体之间进行直接比较的体内分析是有问题的。作为使用体液或组织来源的囊泡的替代方案，可以分离由培养细胞在体外产生的ECM和条件培养基(Fitzpatrick等人，Biomater Sci.,3,12-24(2015))。这种方法提供了几个优点，例如使用单细胞类型来源，从而消除了对囊泡来源的任何疑问；从液相或固相区室选择性收获囊泡的能力；以及控制细胞培养环境的能力，从而控制囊泡的组成和运载物。
材料和方法
体外细胞来源的ECM的制备：人骨髓干细胞(BMSC)、人脂肪干细胞(ASC)和人脐带干细胞(UCSC)ECM板由StemBioSys(San Antonio,Texas)提供，并根据已公开的方案((Lai等人，Stem cells and development 19,1095-1107(2010))制备。简言之，将人BMSC、人ASC或人UCSC以3,500个细胞/cm2的细胞密度接种到包被涂有人纤连蛋白的75cm2细胞培养瓶中(37℃下1小时)，并在补充有20％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的α-MEM培养基中培养用14天。在最初接种后的第二天更换培养基，然后每3天换液一次。在第7天，将抗坏血酸2-磷酸(Sigma Aldrich)添加到培养基中，终浓度为50μM。在第14天，使用在20mM氢氧化铵中的0.5％ Triton对板进行脱细胞5分钟，用含有钙和镁(HBSS+/+)的Hank平衡盐溶液冲洗两次，并用超纯H2O冲洗一次。将鼠NIH 3T3成纤维细胞以3,500个细胞/cm2的细胞密度接种到75cm2细胞培养瓶中，并在补充有外泌体耗竭的FBS(G.V.Shelke等人，Journal ofextracellular vesicles 3,24783(2014))、1％青霉素-链霉素和抗坏血酸2-磷酸(SigmaAldrich)的DMEM培养基中培养，终浓度为50μM，持续7天。在第7天，收集培养的3T3成纤维细胞的上清液，将铺板培养物用PBS洗涤3次，用在20mM氢氧化铵中的0.5％ Triton脱细胞5分钟，然后用超纯H2O冲洗3次。
MBV和液相EV的分离：将MBV分离((L.Huleihel等人，Science advances 2,e1600502(2016))。简言之，用在缓冲液(50mM Tris pH 7.5,5mM CaCl2,150mM NaCl)中的100ng/ml Liberase DL(Roche)在37℃下酶解脱细胞ECM 1小时。将含有液相EV的细胞培养上清和含有MBV的消化ECM分别以500g(10min)、2500g(20min)和10,000g(30min)进行差速离心，上清液通过0.22μm过滤器(Millipore)。然后将含有释放的MBV或液相EV的澄清上清液在4℃下以100,000×g(Beckman Coulter Optima L-90K Ultracentrifuge)离心70分钟以沉淀囊泡。然后将囊泡颗粒洗涤并重悬于1X PBS中，并在-20℃下储存直至进一步使用。
膀胱基质(UBM)的制备：UBM由市场体重的猪制备(Tissue Source；LLC,Lafayette,IN)((L.Huleihel等人，Science advances 2,e1600502(2016))。而言之，通过机械分层去除浆膜、外肌层、粘膜下层和粘膜肌层，并通过用去离子水洗涤将粘膜的尿路上皮细胞从基底膜上解离。剩余的基底膜和固有层(统称为UBM)通过在0.1％过乙酸和4％乙醇中以300rpm的速度搅拌2h，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)和1型水洗涤，使之脱细胞。然后将UBM冻干并使用带有#60目筛的Wiley Mill进行研磨。
扫描电子显微镜(SEM)：UBM在冷2.5％戊二醛中固定24小时，然后在1×PBS中洗涤3次，每次30分钟。然后将样品在分级乙醇系列(30％、50％、70％、90％、100％乙醇)中每次洗涤脱水30分钟，然后在4℃下置于100％乙醇中过夜。将样品在100％乙醇中再洗涤3次，每次30分钟，并使用Leica EM CPD030临界点干燥器(Leica Microsystems，Buffalo Grove，IL，USA)用二氧化碳作为过渡介质对临界点进行干燥。然后使用Sputter Coater 108Auto(Cressington Scientific Instruments,UK)在样品上溅射4.5nm厚的金/钯合金涂层，并使用JEOL JSM6330f扫描电子显微镜(JEOL,Peabody,MA,USA)成像
透射电子显微镜(TEM)：TEM成像在负载在碳涂层网格上并在4％多聚甲醛中固定的MBV或液相EV上进行(L.Huleihel等人，Science advances 2,e1600502(2016))。网格在80kV下使用JEOL 1210 TEM和高分辨率Advanced Microscopy Techniques数码相机进行成像。MBV的尺寸使用JEOL TEM软件从代表性图像中确定。
纳米颗粒跟踪分析(NTA)：使用配备快速视频捕获和颗粒跟踪软件的Nanosight(NS300)仪器计算液相EV和MBV的颗粒尺寸和浓度。使用无颗粒水将样品按1:500稀释至终体积为1000μl。使用注射泵将样品分配到系统中。从每个样品45秒的三个捕获中进行测量。对于视频处理和颗粒计算，将检测阈值校正为4。数据以每个评估样品的浓度与颗粒尺寸的关系表示。
RNA分离：根据生产商的说明，使用RNeasy mini kit(Qiagen)从3T3细胞、液相EV和MBV中分离总RNA。在RNA分离之前，液相EV和MBV样品在37℃下用RNase A(10μg/ml)处理30分钟，以降解任何污染的RNA。RNA量使用NanoDrop分光光度计测定，其量由AgilentBioanalyzer 2100(Agilent Technologies)测定。
RNA测序和生物信息学分析：使用每个样品100ng开始miRNA文库制备，并按照生产商的说明使用QIAseqTMmiRNA Library Kit(Qiagen)。简言之，成熟miRNA在其3'和5'末端与衔接子连接。然后使用具有独特分子索引(UMI)的逆转录(RT)引物将连接的miRNA逆转录为cDNA。然后清理cDNA以去除接头引物，然后用通用正向引物和分配样品索引的48个反向引物中的一个扩增文库。使用Agilent RNA ScreenTape System进行测序前质量控制。二代测序在NextSeq 500仪器上进行，上样浓度为2.5pM。生物信息学分析由GeneviaTechnologies(Tampere,Finland)进行。使用FastQC软件检查测序读数的质量。TrimGalore！[版本0.4.5；]用于去除所有样品上的衔接子序列，默认设置。使用fastx_trimmer软件(Hannon Lab的FASTX Toolkit；版本0.0.14)将所有读数缩短至21个碱基，即micro-RNA的典型大小。
然后将每个样品的读数与相应的参考基因组(hg38、GRCm38)进行比对。使用软件bowtie[版本1.2.2]和miRDeep2[版本0.0.8]创建跨样品的miRNA计数表。在这个过程中，参与研究的每个物种的前体miRNA和成熟miRNA序列均取自miRbase。通过取与其相关的所有前体miRNA的中位值来获得成熟miRNA的计数。使用DESeq2对所有样品的成熟miRNA计数进行归一化。为了在进一步分析之前确保数据质量，进行主成分分析(PCA)，并使用ggplot2将结果可视化，分别针对鼠和人样品。
使用DESeq2进行成熟miRNA数据的归一化和样品组之间的统计学检验。使用Benjamini-Hochberg方法对P值进行多重检验的校正。校正的p值<0.05和绝对log2倍数变化>1的miRNA被认为是显著差异表达。使用实验检测的miRNA-靶标相互作用的mirTARbase数据库，用它们的靶标和置信度注释差异表达的miRNA表。差异表达的miRNA还使用R包miRNAtap用预测的靶标进行注释。miRNAtap聚合来自五个不同数据库(PicTar、DIANA、TargetScan、miRanda、miRDB)的miRNA靶标预测并计算总体miRNA靶标评分。注释中包含潜在miRNAtarget相互作用所需的最少数据库源数量为3。
Ingenuity通路分析(IPA)：Ingenuity通路分析软件(版本01-14)用于差异表达(DE)miRNA的功能分析。使用IPA核心分析识别miRNA靶标。过滤器设置为实验观察结果，以获得有关受miRNA影响的显著丰富的分子和细胞功能以及生理系统发育功能的信息。
qPCR验证：逆转录(RT)和定量聚合酶链反应(qPCR)使用
Figure GDA0003952947440000381
AdvancedmiRNA Assays Protocol(Applied Biosystems)进行。简言之，将10ng总RNA与
Figure GDA0003952947440000382
Advanced miRNA cDNA合成试剂盒(Applied Biosystems，货号A28007)一起用于合成3'-poly(A)尾并使其适应miRNA。在RT反应中使用识别poly(A)尾的通用RT引物合成cDNA，然后使用miR-AMP正向和反向通用引物进行miR-AMP步骤，以增加cDNA分子的数量。qPCR在QUANTSTUDIOTM系统机器上进行，使用
Figure GDA0003952947440000383
Fast Advanced Master Mix(AppliedBiosystems，货号4444556)和特异性
Figure GDA0003952947440000384
Advanced miRNA Assays(AppliedBiosystems，货号A25576)识别mmu-miR-163-5p、mmu-miR-27a-5p、mmu-miR-92a-1-5p、mmu-miR-451a、mmu-miR-93-5p和mmu-miR-99b-5p。使用液相EV作为参考，计算每个特定靶标的MBV样品上的倍数变化表达。
免疫印迹和银染检测：来自三种不同的3T3成纤维细胞培养物的液相EV和MBV分别通过纳米跟踪颗粒分析进行合并和定量。对于免疫印迹和银染色分析，将液相EV和MBV样品的相同数量的囊泡上样到凝胶上。将21×1011MBV或液相EV与含有5％β巯基乙醇(Sigma-Aldrich)的2X Laemmli缓冲液(R&D Systems)混合，在4至20％梯度SDS-PAGE(Bio-Rad)上分离，然后转移PVDF膜上。将膜与以下一抗孵育过夜：兔抗CD63、兔抗CD81、兔抗CD9和兔抗Hsp70，稀释度为1:1000(System Biosciences)。在与山羊抗兔二抗以1:5,000稀释度(System Biosciences)孵育之前和之后，将膜洗涤3次，每次15分钟。将洗涤过的膜暴露于化学发光底物(Bio-Rad)，然后使用ChemiDoc Touch仪器(Bio-Rad)进行可视化。根据生产商的说明，使用Silver Stain Plus Kit(Bio-Rad)对凝胶进行银染色，并使用ChemiDocTouch仪器(Bio-Rad)进行可视化。
磷脂的LC/MS分析：通过Folch程序(J.Folch等人，J biol Chem 226,497-509(1957)从3T3细胞、外泌体和MBV中提取脂质。在OrbitrapTM FusionTM LumosTM质谱仪(ThermoFisher)(Y.Y.Tyurina等人，ACS nano 5,7342-7353(2011))上对磷脂及其含氧产物进行MS分析。简言之，在Dionex Ultimate 3000HPLC系统上以0.2ml/min的流速在正相柱(Luna 3μm Silica(2)
Figure GDA0003952947440000391
150×2.0mm,(Phenomenex))上分离磷脂。柱保持在35℃下。使用含有10mM乙酸铵的梯度溶剂(A和B)进行分析。溶剂A含有丙醇:己烷:水(285:215:5,v/v/v)，溶剂B含有丙醇:己烷:水(285:215:40,v/v/v)。所有溶剂均为LC/MS级。用10％至32％ B的线性梯度洗脱柱0-23分钟；使用32-65％ B的线性梯度，23-32分钟；用65-100％B的线性梯度，32-35分钟；在100％ B下保持35-62分钟；用100％至10％ B的线性梯度，62-64分钟，然后在10％ B下平衡64至80分钟。以负离子模式采集光谱。氘代磷脂用作内标(AvantiPolar Lipids)。对每个样品进行三个技术重复以评价重现性。使用软件包COMPOUNDDISCOVERERTM(ThermoFisher)进行LC/MS数据分析，该软件包具有内部生成的分析工作流程和非氧化/氧化磷脂数据库。通过保留时间进一步过滤脂质并通过碎片质谱确认。
游离脂肪酸及其氧化产物的LC/MS分析：使用在线耦合到Q-Exactive混合四极杆-轨道阱质谱仪(ThermoFisher Scientific，San Jose，CA)的DIONEX ULTIMATETM3000HPLC系统通过LC/MS分析游离脂肪酸(Y.Y.Tyurina等人，Nature chemistry 6,542(2014))。简言之，使用溶剂梯度(A：甲醇(20％)/水(80％)(v/v)和B：甲醇(90％)/水(10％)(v/v)，均含有5mM乙酸铵，通过C18柱(Accliam PepMap RSLC，300μm 15cm，Thermo Scientific)分离脂肪酸及其氧化衍生物)。使用从30％溶剂B到95％溶剂B的线性梯度，在70分钟内以12μL/min的流速洗脱色谱柱，在70至80分钟内保持95％ B，然后恢复初始条件83分钟并再平衡7分钟。以负离子模式采集光谱。使用Xcalibur软件采集和分析分析数据。每个样品至少运行三个技术重复，以提高重现性。
结果
液相EV和基质结合纳米囊泡的分离：进行扫描电子显微镜(SEM)以提供嵌入源自猪膀胱基质(UBM)的ECM生物支架内的MBV的高分辨率、高放大率成像。SEM图像显示分散在整个胶原纤维中的直径约100nm的离散球体(图1A)。为了检查沉积到固体ECM底物中的MBV是否是独特类型的细胞外囊泡，与分泌到液相中的EV分离，使用实现从液相或固相细胞外区室中选择性收获囊泡的体外3T3成纤维细胞培养模型(图1B)。来自相差显微镜的代表性图像以及H&E和DAPI染色切片显示在细胞培养板脱细胞后没有可见残留细胞或完整细胞核(图1C)。从细胞培养上清液中收获的液相EV和从脱细胞ECM中分离的MBV的TEM成像(图1D)显示这两个囊泡群具有相似的形态。此外，纳米颗粒跟踪分析(NTA)分布图显示液相EV和MBV的囊泡大小相似，大多数囊泡的直径<200nm(图1E)。
为了确定MBV是否含有通常归因于外泌体的标志物，对CD63、CD81、CD9和Hsp70进行免疫印迹分析((J.
Figure GDA0003952947440000401
等人(Taylor&Francis,2014))。结果表明，与液相EV相比，MBV的CD63、CD81、CD9显著降低。MBV表达的CD9和CD81水平在免疫印迹分析中几乎检测不到，并且相对于EV中表达的水平显著降低。MBV还显示出比在EV中观察到的显著更低的CD63表达(图1F)。换言之，与MBV相比，液相EV(即外泌体)富含CD63、CD81、CD9的表达水平。此外，电泳分离的蛋白质的银染色表明MBV含有与液相EV明显不同的蛋白质运载物(图1G)，这表明MBV可能是纳米囊泡的独特亚群。
miRNA被选择性地包装至源自3T3成纤维细胞的液相EV和MBV中：采用全面二代RNA测序(RNA-seq)对MBV和液相EV中相对于3T3成纤维细胞亲代细胞(这些囊泡从其来源)的差异表达miRNA进行分类。生物分析仪分析显示不存在18S和28S核糖体RNA，并且从液相EV和MBV分离的总RNA富集小RNA分子(<200nt)。然而，来自液相EV的小RNA大小分布比MBV宽得多，在液相EV中小RNA分子在100-200nt之间显著富集(图2A)。通过对从亲代细胞RNA、液相EV和MBV分离物(每组n＝3)产生的miRNA文库进行二代测序，分析的重点是差异miRNA特征。主成分分析(PCA)显示在各个组内，复制的miRNA谱彼此靠近聚集(图2B)。
在亲代细胞与液相EV和MBV分离株之间观察到miRNA含量的广泛差异。总体上，发现28个(50.91％)miRNA在MBV中与液相EV相比差异表达至少两倍(图2C)。此外，各自的液相EV或MBV和亲代细胞miRNA谱明显不同(图2B，图2C)。为了验证miRNA测序的结果，进行RT-qPCR以检测与从3T3成纤维细胞分离的液相EV相比，MBV中的3个上调的miRNA(miR-163-5p、miR-27a-5p、miR-92a-1-5p)和3个下调的miRNA(miR-451a、miR-93b-5p、miR-99b-5p)(图2D)。结果显示，与液相EV相比，MBV中的miR-163-5p、miR-27a-5p和miR-92a-1-5p的水平上调，而miR-451a、miR-93b-5p和miR-99b-5p的水平下调，从而证实了miRNA测序数据的结果。与液相EV相比，MBV中差异富集的miRNA的Ingenuity通路分析(IPA)显示与器官和系统发育和功能密切相关。相反，与MBV相比，液相EV中差异富集的miRNA与涉及细胞生长、发育、增殖和形态的途径相关(图2E)。
MBV miRNA含量具有细胞来源特有性：3T3成纤维细胞模型的结果显示，与分泌到细胞培养上清液中的液相EV相比，miRNA选择性包装在沉积在ECM中的MBV中。为了确定MBVmiRNA运载物是否具有细胞来源特有性，从ECM分离的MBV的miRNA组成由骨髓干细胞(BMSC)、脂肪干细胞(ASC)和脐带干细胞(UCSC)体外产生从不同的人供体中分离出来，通过二代测序方法进行表征和比较。脱细胞BMSC细胞培养板的代表性相差显微镜图像显示不存在细胞并且存在分支的纤维状结构(图3A)。从脱细胞BMSC细胞培养板中分离的MBV的TEM成像显示了归因于细胞外囊泡的特征形态(图3B)。此外，纳米颗粒追踪分析显示了BMSC、ASC和UCSC来源的MBV之间的相似分布图，大多数囊泡的直径<200nm(图3C-3E)。从这些样品中分离出总RNA后，生物分析仪分析显示不存在核糖体RNA和小RNA分子(<200nt)的富集(图3F)。从样品中生成miRNA文库(BMSC，n＝3例人供体；ASC，n＝3例人供体；UCSC，n＝3例人供体)并进行miRNA测序。主成分分析显示样品主要按其来源的细胞类型聚类(图3G)。尽管对用于产生MBV样品的每种细胞类型使用三个单独的人供体，但主成分分析显示各组内的miRNA谱具有高度的同质性(图3G)。此外，火山图显示，与BMSC-ASC和UCSC-ASC相比，BMSC和UCSC衍生的MBV之间差异表达的miRNA更少。
液相EV、MBV和亲代细胞的磷脂谱：几项研究已表征EV的脂质组成(T.Skotland等人，Journal of lipid research 60,9-18(2019))。然而，没有关于MBV的磷脂组成的数据。因此，进行基于LC-MS的全局脂质组学和氧化还原脂质组学分析，以比较评价MBV和液相EV与其3T3成纤维细胞亲代细胞的磷脂组成(图4A，图4D)。在这三种样品中检测到9个主要的磷脂类别，检测到的分子种类总数为536种，分布在以下主要类别之间：双-单酰基甘油磷酸酯(BMP)-59种，磷脂酰甘油(PG)-37种，心磷脂(CL)-117种，磷脂酰肌醇(PI)-33种，磷脂酰乙醇胺(PE)-102种，磷脂酰丝氨酸(PS)-45种，磷脂酸(PA)-26种，磷脂酰胆碱(PC)-107种，和鞘磷脂(SM)-10种(图4D)。在它们的多不饱和脂肪酸(PUFA)残基含量方面，PE、PI、PC和PS代表了这些含有四-七双键的多不饱和PL种类的主要库(图4B)。这些PUFA磷脂代表了信号传导脂质介质的可能前体。介质的形成是通过5-脂氧合酶或15-脂氧合酶对PUFA磷脂的催化氧化产生氧化磷脂，随后被一种特殊的磷脂酶A2水解以释放氧化脂肪酸(脂质介质)(Z.Zhao等人，Endocrinology 151,3038-3048(2010)；Y.Y.Tyurina et al.,Journal ofleukocyte biology,(2019))。此外，氧化的PUFA磷脂充当信号传导分子，协调许多细胞内过程和细胞反应，包括细胞凋亡、铁死亡和炎症((Y.Y.Tyurina等人，Antioxidants&redoxsignaling 29,1333-1358(2018))。在液相EV和MBV之间观察到这些磷脂的分子形态及其相对含量的显著差异(图4E)。除了SM之外，在所有磷脂中都检测到花生四烯酸(AA)-和二十二碳六烯酸(DHA)-残基(图4E)。对于许多磷脂，MBV中的含量显著高于液相EV和亲代细胞(图4E)，这将MBV确定为富含PUFA-磷脂的库。PUFA磷脂可以被PLA2水解，导致释放游离PUFA和LPL(V.D.Mouchlis等人，Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular and CellBiology of Lipids 1864,766-771(2019))。前者可以被两种主要的加氧酶COX和LOX进一步利用以产生具有促炎或抗炎能力的脂质介质((Y.Y.Tyurina等人，Redox(phospho)lipidomics of signaling in inflammation and programmed cell death.Journal ofleukocyte biology,(2019)；C.A.Rouzer等人，Chemical reviews 103,2239-2304(2003)；H.Kuhn等人，Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular and Cell Biology ofLipids 1851,308-330(2015))。这一发现使MBV成为合成这些脂质介质的潜在前体，具体取决于细胞/组织环境((Y.Y.Tyurina等人，Journal of leukocyte biology,(2019))。定量地，MBV富含PI、PS、PG和BMP(图4C和表2)。图4C中所示的磷脂含量还在表1中提供。
表1.以总磷脂的百分比表示的磷脂含量
细胞 EV MBV
PC，磷脂酰胆碱 62.95 41.54 31.38
PE，磷脂酰乙醇胺 13.84 24.47 14.75
PI，磷脂酰肌醇 9.6 4.21 33.58
PS，磷脂酰丝氨酸 6.49 11.18 12.68
BMP，双-单酰基甘油磷酸酯 0.13 0.13 0.55
PA，磷脂酸 0.11 0.64 0.42
PG，磷脂酰甘油 0.04 0.02 0.11
SM，鞘磷脂 5.87 17.64 5.87
CL，心磷脂 0.97 0.17 0.66
相反，液相EV中PE、PA和SM的含量较高。PC是细胞和液相EV中的主要磷脂。与MBV和亲代细胞相比，液相EV中独特的线粒体磷脂心磷脂(CL)的含量显著降低(图4F)。因为CL是独特的线粒体特异性磷脂，主要定位于线粒体内膜(M.Schlame等人，Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1862,3-7(2017))，该发现代表了MBV生物发生与细胞线粒体区室的可能联系。缩醛磷脂(或醚磷脂)在结构上与二酰基磷脂(或酯磷脂)不同(M.Schlame等人，Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1862,3-7(2017))。在缩醛磷脂中，乙烯基醚键将sn-1饱和或单不饱和链与磷脂的甘油主链连接(N.E.Braverman等人，Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-Molecular Basis of Disease 1822,1442-1452(2012))。已经表明醚类脂、PE和PC缩醛磷脂可以促进膜融合(P.E.Glaser等人，Biochemistry 33,5805-5812(1994))并增加细胞外囊泡的膜厚度((X.Han等人，Biochemistry 29,4992-4996(1990)；T.Rog,et al.,Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes 1858,97-103(2016))，因此可能在细胞吸收纳米囊泡中起作用。详细的MS/MS分析表明，液相EV和MBV中均含有高水平的醚PE和PC种类(纤溶酶原)。这些种类分别被鉴定为PE-16:0p/20:4、PE-16:1p/20:4、PE-18:1p/20:4、PE-18:1p/22:6和PC-16:0p/20:4、PC-18:0p/20:4、PC-20:0p/20:4、PC-18:0p/22:6(图4E)。
表2.MBV、外泌体和亲代3T3细胞中心磷脂、磷脂酸、磷脂酰甘油和双甘油磷酸的含量。数据以pmol/nmol磷脂表示，平均值±s.d.，*p<0.05vs细胞，#p<0.05vs液相EV。
3T3细胞 液相EV MBV
心磷脂，CL 0.97±0.06 0.17±0.01* 0.66±0.20*
磷脂酸，PA 0.11±0.01 0.64±0.29* 0.42±0.21
磷脂酰甘油，PG 0.04±0.01 0.02±0.02* 0.11±0.02**
双-单酰基甘油磷酸酯，BMP 0.13±0.01 0.13±0.04 0.55±0.12#*
液相EV、MBV和亲代细胞的溶血磷脂谱：溶血磷脂(LPL)是由磷脂酶A产生的磷脂的水解代谢物，是调节多种生理反应，包括巨噬细胞激活(R.Ray等人，Blood 129,1177-1183(2017))、炎症和纤维化(A.M.Tager等人，Nature medicine 14,45(2008))、组织修复和重塑((K.Masuda等人，The FEBS journal 280,6600-6612(2013))以及伤口愈合((K.M.Hines等人，Analytical chemistry 85,3651-3659(2013))等的生物活性信号传导分子。LC-MS分析表明，LPL存在于所有三种类型的样品中，尽管它们在MBV和液相EV中的总含量是亲代细胞的1.7-1.8倍。更具体地，已识别七类LPL：溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、溶血磷酸肌醇(LPI)、溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰甘油(LPG)和单溶血心磷脂(mCL)(图5A)。与亲代细胞相比，MBV富含LPE、LPA和LPG(图5B)。与细胞相比，MBV和液相EV中LPI和mCL的含量显著降低。MBV中LPA和LPG的含量明显高于EV。MBV中的mLCL和LPI水平比EV高3倍和6.3倍，但比细胞低3.3倍和1.9倍(图5C，图5D)。MBV和EV之间LPE、LPC和LPS的含量没有显著变化。含有16:0、16:1、18:0和18:1的不可氧化分子种类是在所有检测到的LPL种类中发现的主要类型(图5C)。这些发现表明，高水平的溶血磷脂、对巨噬细胞分化、组织修复、重塑和伤口愈合很重要的生物活性分子是MBV的特征。
MBV和液相EV的游离和含氧脂肪酸的分析：由于小鼠骨髓来源的巨噬细胞暴露于MBV导致M2样标志物Fizz1和Arg1表达，它们与建设性巨噬细胞表型相关(L.Huleihel等人，Science advances 2,e1600502(2016))，对MBV中的PUFA及其含氧产物相对于液相EV和亲代细胞进行LC/MS分析。MBV富含花生四烯酸(20:4,AA)、二十二碳六烯酸(22:6,DHA)和二十二碳五烯酸(22:5,DPA)脂肪酸(图6A)。换言之，MBV代表用于通过各自的酶机制——COX和LOX进行信号传导脂质介质的生物合成的底物库。在液相EV中，主要的PUFA是亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)(图6A)。
由于细胞外囊泡含有用于生物合成AA来源的脂质介质的酶促机制(E.Boilard,Journal of lipid research 59,2037-2046(2018))，因此对含氧脂肪酸进行氧化还原脂质组学分析。在液相EV相对于MBV中发现了更高水平的AA代谢物，例如12-HETE、15-HETE、脂氧素A4(图6B)。在组织修复的情况下，脂氧素A4(LXA4)和D系列消退素D1(RvD1)-由花生四烯酸(20:4,AA)和二十二碳六烯酸(22:6,DHA)产生的12/15-LOX-刺激M2样表型的巨噬细胞激活((C.N.Serhan,The American journal of pathology 177,1576-1591(2010))。最后，表征了MBV和液相EV中含有氧化AA和DHA的氧化磷脂。MBV中含氧物质的水平高于液相EV，其中PS、PI和PC由单含氧物质代表。BMP、PG和CL含有单氧化和双氧化AA和DHA残基；仅在PE中发现了三氧化的PUFA(图6C)。总体上，脂质组学和氧化脂质组学结果表明，与液相EV相比，MBV中游离AA、DHA和DPA和含有PUFA的磷脂及其氧化修饰分子种类的水平更高。MBV，但不是液相EV，富含PUFA非氧化和氧化磷脂，因此代表了氧化和可氧化酯化PL种类的潜在库，代表了由不同磷脂酶激活的脂质介质的潜在来源，依赖于亲/细胞外环境的抗炎环境。
进行上述基于LC-MS的脂质组学和氧化还原脂质组学研究，以对液相EV和MBV磷脂进行详细比较。结合对囊内运载物的全面RNA测序和生物信息学分析，这些数据反映MBV是EV的不同且独特的亚群，与液相EV(即外泌体)不同，是基于ECM的生物材料的显著特征，具有相似性受限于囊泡的大小和形状。
在本文中，囊泡群体基于它们的区室划分为液相细胞培养基或固相ECM底物。在组成方面，与液相EV和亲代细胞相比，从3T3成纤维细胞的ECM中分离的MBV含有不同的miRNA和脂质特征。这些数据暗示了在囊泡生物发生过程中发生分子分选以将miRNA和脂质特异性分配到运往不同细胞外位置的囊泡的情况。此外，细胞区分液体界面和固体基质的能力，以及选择性地将具有不同脂质特征的定制囊泡亚群沉积到这些不同的区室中的能力，为MBV的不同和独立的膜生物发生与分泌到液相的EV的生物发生提供了证据。考虑到MBV被证明整合在细胞外基质的致密纤维状网络中，MBV应在组织发育和稳态期间的基质沉积期间以及损伤后的动态基质重塑期间由细胞与ECM成分协同分泌。此外，鉴于ECM是蛋白质、蛋白聚糖和糖胺聚糖的复杂混合物，以组织特异性3D结构排列(Hussey等人，Nature ReviewMaterials,3(7):159-173,2018)，MBV运载物和脂质内容物也应该是组织和细胞来源所特有的。从解剖学上不同的来源组织来源的ECM生物支架中分离出的MBV具有不同的miRNA特征(Huleihel等人，Science Advances,2,e1600502,2016)。本研究的结果进一步表明，从来自不同人供体的骨髓干细胞、脂肪干细胞和脐带干细胞体外产生的ECM中分离出的MBV含有特定于细胞来源的独特miRNA特征。此外，与BMSC-ASC和UCSC-ASC相比，BMSC和UCSC来源的MBV之间差异表达的miRNA更少，该发现可能归因于脂肪干细胞的组织特异性分化潜能(L.Xu等人，Stem cell research&therapy 8,275(2017))。这些发现进一步强调了MBVmiRNA谱的细胞特异性特征，其不受供体内在变异性的显著影响。然而，鉴于三例人供体均为男性，有必要进一步研究以确定干细胞样品中MBV的miRNA运载物中与性别相关的变异。重要的是，主成分分析显示来自不同人供体的特定细胞类型沉积的MBV miRNA运载物的批次间高度一致性，支持MBV和ECM生物材料生产作为研究工具或临床治疗。本研究确定整合到矩阵中的MBV是EV的独特亚群。此外，MBV显示通常归因于外泌体的蛋白质(例如CD63、CD81、CD9)显著减少。
与分泌到体液中并易于用于细胞间通讯的EV相比，嵌入组织ECM中的MBV与基质稳定结合，并且只能在ECM材料降解后才能分离(Huleihel等人，Science advances 2,e1600502(2016))。基质降解以释放MBV的要求可能部分限定了它们的作用机制，包括与它们产生促分解脂质介质的能力有关的那些。因为即使在脱细胞化后MBV仍保持完整并附着在ECM上，其组成磷脂的分子形态可能促进这种MBV-ECM相互作用。使用基于LC-MS的脂质组学和氧化还原脂质组学方法，对MBV磷脂、溶血磷脂以及氧化和非氧化PUFA的分子形态进行详细表征。高水平的溶血磷脂是对巨噬细胞分化、组织修复、重塑和伤口愈合很重要的生物活性分子，是MBV的特征。此外，作为融合脂质，溶血磷脂可以促进囊泡内容物向细胞内靶标的转移。MBV(而非液相EV)富含PUFA非氧化和氧化磷脂，因此代表氧化和可氧化酯化PL物质的潜在库。值得注意的是，富含PUFA的MBV是由依赖于细胞外环境的促/抗炎背景的不同磷脂酶激活的脂质介质的重要来源。
实施例2：使用MBV治疗姥鲛烷诱导的关节炎
使用如实施例1中所述的方法制备膀胱基质。
MBV通过在缓冲液(50mM Tris pH7.5,5mM CaCl2,150mM NaCl)中的Liberase TL(高度纯化的胶原酶I和胶原酶II)在轨道摇床上于室温下酶解24小时从实验室生产的猪UBM中分离。然后将消化的ECM以10,000×g离心30分钟以去除ECM碎片。然后将含有释放的MBV的澄清上清液在4℃下以100,000×g(Beckman Coulter Optima L-90KUltracentrifuge)离心2小时以沉淀MBV。
在本实施例中，在用炎症剂姥鲛烷处理的鼠模型中全身或局部施用MBV后评估抗炎作用。已建立大鼠姥鲛烷诱导的关节炎模型作为研究类风湿性关节炎的临床相关动物模型(Tuncel等人PLoS One.2016；11(5):e0155936)。在研究的第0天，在8周龄雌性Sprague-Dawley大鼠中，通过在距基部远端1cm处在尾部背侧皮内注射300μL姥鲛烷(2,6,10,14-四甲基十五烷)，诱导姥鲛烷诱导的关节炎。对照动物在第0天未接受皮内注射姥鲛烷。在第4天，在距尾基部远端约1cm处皮内注射第二剂300μL姥鲛烷。接受姥鲛烷的动物一起饲养在笼中。接受姥鲛烷的动物被随机分为以下实验组：仅使用姥鲛烷、甲氨蝶呤、关节周围MBV和静脉内MBV。图7显示了关节周围和静脉内MBV施用途径的描述。
在第7、10、14、17、21、28天以及此后每周直至100天终点，确定每只动物的关节炎评分。分别从掌侧和足底的角度拍摄每个前爪和后爪的照片。使用60分关节炎评分标准评估关节炎：对每个发炎的指关节或脚趾给予1分，对受影响的脚踝给予至多5分(每爪15分，每只大鼠60分)。指定为仅使用姥鲛烷的动物在第7、10、14、17和21天未接受任何治疗。甲氨蝶呤动物在第7、10、14、17和21天接受腹腔递送在1X无菌PBS中的0.1mg/kg甲氨蝶呤。关节周围MBV动物分别接受25μL的500μg/mL猪来源的UBM MBV，分别在后爪和前爪的足底和掌侧表面递送。静脉内MBV组接受100μL的500μg/mL UBM MBV静脉内递送至动物的侧尾静脉中。每组中的四只动物被分配到为期28天的短期研究中，并且四只动物被分配到100天的研究中。使用先前公布的甲氨蝶呤效应量确定样品量，预先确定α0.05和β0.80。关节炎评分表示为平均值+/-平均值的标准误差。第7-21天代表每组的n为8，然后第28天及以后代表每组的n为4。使用Tukey事后校正的双因素方差分析分析组间差异。在研究之前用0.05的α确定显著性。
通过靶向PA(关节周围)和全身IV施用MBV，显著降低了大鼠关节炎的严重程度，显示出与金标准护理甲氨蝶呤相似的疗效。虽然所有大鼠在第7天显示关节炎评分为0(图8A)，但早在第10天，在仅使用姥鲛烷的大鼠中观察到高关节炎评分，并且所有接受处理的大鼠显示较低的关节炎评分(图8B)。出乎意料的是，从第13天开始，MBV处理与关节炎治疗的金标准甲氨蝶呤同样有效(图8C和图8D)。至第21天，MBV处理的大鼠(IV和PA处理)显示出比甲氨蝶呤处理的大鼠更低的关节炎评分(图8E)。拍摄的大鼠爪照片显示仅使用姥鲛烷和甲氨蝶呤和MBV处理的大鼠在红斑和水肿方面的差异(图9A-图9B)。实验前21天处理组的平均关节炎评分如图10所示。虽然MBV施用的PA施用与仅使用姥鲛烷的大鼠相比显示出相当的关节炎评分降低，以及与甲氨蝶呤处理相当的关节炎评分降低，意外地发现，静脉内施用在降低关节炎评分方面与PA和甲氨蝶呤具有相同的疗效。虽然预期IV施用将导致MBV效力的稀释，因此对发炎的关节具有有限的影响(若有)，但未观察到这一点。出乎意料的是，MBV施用的PA和IV途径与仅使用姥鲛烷的大鼠相比均显示出相当的关节炎评分降低，以及与甲氨蝶呤处理相当的关节炎评分降低。由于在炎症部位的关节周围注射是痛苦的，并且个体的许多关节可能发炎，因此意外发现MBV的静脉内施用与PA施用同样有效，这表明可以使用全身递送途径，因为其侵入性较小但同样有效，每次施用仅需单次注射(而不是每个关节多次注射)，因此对于患者而言更舒适。
出乎意料的是，通过IV和PA施用同时接受MBV的大鼠的炎症复发也减少了。通过实验第77天收集的数据支持MBV治疗作为有效治疗慢性炎症和复发阶段关节炎的方法。如图11A中的照片所示，在表型上，用PA或IV MBV处理的大鼠爪表现出与用甲氨蝶呤处理的那些相同的红斑和水肿。PA和IV MBV以与甲氨蝶呤(类风湿性关节炎的金标准护理)相同的疗效降低炎症的慢性期和复发期中的姥鲛烷诱导的关节炎临床评分(图11B)。类风湿性关节炎大鼠模型的组织分析导致组织炎症和组织之间的空间减少。在MBV处理的样品中，与甲氨蝶呤处理相比，空间恢复和炎症减少，揭示了MBV在有生物体和组织水平上的疗效。
使用在第24天从小鼠收集的血清样品，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)评估促炎细胞因子的分析。如图12所示，与仅使用姥鲛烷的动物相比，关节周围或静脉内施用的MBV显著降低了IL-1-β血清水平(图12B)。此外，局部施用的MBV(即PA MBV)导致TNFα血清水平降低(图12A)。这些数据强烈表明MBV是免疫系统的调节剂。
总之，来自这些实验的数据表明，MBV的初始治疗过程，无论是全身性的还是局部的，均可以在MBV初始治疗过程结束后的数周至数月内具有缓解关节炎症状的治疗效果，从而降低类风湿性关节炎症状随后发作的严重程度或频率，甚至将其消除，从而导致缓解。
数据还表明MBV通常可用于调节炎症免疫应答，并表明MBV可以下调促炎细胞因子的产生。这表明MBV在减轻细胞因子风暴等过度炎症事件方面的有效性，从而使MBV可用于治疗由肺部过度炎症引起的病状(例如ARDS)。
实施例3：MBV用于治疗咪喹莫特诱导的银屑病的用途
UBM和源自UBM的MBV使用如上文实施例2中所述的方法进行制备。
咪喹莫特(IMQ)是已知外用时诱导小鼠银屑病样病状的化合物，每天将其施用于8周龄雌性C57/bl6小鼠施，将62.5mg的5％咪喹莫特乳膏外用于小鼠的剃毛的背部和右侧耳廓，持续15天。对照动物在整个研究过程中未接受外用咪喹莫特，而是在剃毛的背部和右侧耳廓接受凡士林外用施用。处理组和治疗范式分为银屑病发作的预防和现有发作的管理。接受预防性治疗的那些动物在研究的第0-16天之间接受处理，而接受管理治疗的那些动物在研究的第7-16天之间接受处理。处理组由腹腔MBV和仅溶媒对照组成。接受腹腔MBV的动物在研究的每一天接受109源自猪的UBM MBV，如治疗时间表所指定。
在第7天，收集组织样品并通过组织学进行评估。当通过腹腔注射施用MBV时(在7天的处理期内，每日剂量为109MBV)，银屑病损伤缓解，如图13所示。
由于Foxp3表达细胞直接受TREG细胞调节，为了确定处理是否影响TREG活性，对Foxp3 RNA进行定量。根据生产商的说明，使用Trizol从测试部位的组织活检中分离RNA。使用NanoDrop分光光度计(NanoDrop)测定RNA量和A260/280。使用SuperScript III逆转录酶通过第一链逆转录合成cDNA。使用Power SYBER Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems)对foxp3进行qPCR。使用SYBR Green进行的所有qPCR在50℃下持续2分钟，95℃持续10分钟，以及95℃持续15s和60℃持续1分钟的40个循环。通过DeltaDeltaCT方法分析qPCR，Log(倍数变化)相对于阴性对照(无咪喹莫特+PBS溶媒)中的foxp3表达。Foxp3引物(正向：5'-TCTCCAGGTTGCTCAAAGTC-3'和反向：5'-GCAGAAGTTGCTGCTTTAGG-3')和Gapdh引物(正向：5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTA-3'和反向：5'-TGTTGCTGTAGCCGTATTCA-3')。如图14所示，MBV处理显著增加Foxp3 RNA水平，表明MBV刺激TREG细胞。总之，这些数据表明MBV处理导致相同组织中抗炎细胞表型数量的增加，即使是全身施用也是如此。因此，局部和全身施用均可用于治疗ARDS。
实施例4：MBV在匙孔血蓝蛋白(KLH)小鼠模型中的用途
UBM和源自UBM的MBV使用如上实施例2中所述的方法进行制备。
在本实验中，使用免疫抑制和免疫毒性的匙孔血蓝蛋白(KLH)大鼠模型来评估全身递送的MBV的免疫毒性。将8周龄Sprague-Dawley大鼠分成四个不同的组：KLH对照用于证明用KLH免疫后的正常抗KLH反应，溶媒对照用于对照与处理或KLH免疫无关的任何潜在影响，环磷酰胺阳性对照用作有效的免疫抑制剂，和MBV处理组用于评估MBV施用对全身免疫的影响。在第-7天，环磷酰胺处理的动物腹腔接受200mg/kg。在第-7、-4和-1天，MBV处理的动物静脉内接受1×109颗粒MBV。在第0天，除溶媒对照外的所有组均用在0.4mL的1000μg/ml弗氏不完全佐剂中的KLH进行免疫。在免疫后第7、14和21天，从侧尾静脉收集全血，并分离血清用于分析抗KLH IgG。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)评估所有动物的血清中的抗KLH IgG，如图15所示。总之，这些数据表明用MBV处理的动物仍具有免疫能力，并且能够产生基于免疫球蛋白的应答。
该发现对MBV作为抗炎治疗的有用性具有广泛的意义。许多减轻炎症的标准治疗方法，包括由以下原因引起的过度炎症，例如，高细胞因子血症是免疫抑制的，使受试者具有继发感染的风险，并且对引起免疫应答的试剂产生足够的免疫应答的能力降低，干扰免疫的恢复和发展。然而，由于MBV被证明不干扰受试者产生免疫应答的能力，因此MBV可用作抗炎治疗，例如，在ARDS中，例如由病毒感染(例如SARS-CoV-2)引起，因为MBV应该不干扰受试者对病毒产生免疫应答的能力，同时仍能减少炎性细胞因子的产生并调节免疫应答以修复和愈合。
实施例5：MBV的施用增加体内TREG
UBM和源自UBM的MBV使用如上实施例2中所述的方法进行制备。
对敲除或野生型C57/bl6小鼠进行心脏毒素肌肉损伤手术；小鼠是表达Arg-1GFP的野生型IL-33(“WT B6”)或敲除IL-33缺陷型Arg-1GFPB6(“KO B6”)。这些小鼠细胞中的精氨酸酶表达可以通过GFP表达进行检测，从而可以识别M-2样表型。将天然含有IL-33的MBV(参见国际专利申请公开号WO 2019/213482)以1×109MBV的量施用于肌肉损伤部位。在术后日(OD)POD3和POD7，通过手术从小鼠收获受伤的横向腹部(TA)肌肉，将组织标本切碎，用分散酶处理并在盐水中冲洗，并重复该过程以去除非细胞碎片。通过流式细胞仪分析(FACS)评估浸润的白细胞。
图16A和图16B显示了CD45+CD3-B220-CD11b+Ly6G-门中炎症性巨噬细胞的代表性点图和频率。在没有IL-33的情况下，巨噬细胞的数量增加，它们属于M1促炎表型。含有IL-33的MBV显著降低炎症反应。
图16C和图16D显示CD45+CD3+B220-CD4+门中ST2+TREG的代表性点图和频率。这些结果表明需要IL-33来增加Foxp3阳性的TREG细胞数量。使用单因素ANOVA计算所有p值。(*P<0.05，**P<0.01)。
实施例6：MBV施用诱导IL-4产生
UBM和源自UBM的MBV使用如上实施例2中所述的方法进行制备。
在本实验中，从正常小鼠的脾脏中分离幼稚T淋巴细胞。刺激T淋巴细胞以诱导T细胞反应。通过使用抗CD8a、CD11b、CD11c、CD19、CD45R、CD49b、CD105、Anti-MHC-class II、Ter-119和TCR的生物素缀合的抗体混合物作为主要标记试剂耗竭非CD4+T细胞，从8周龄C57/Bl6J小鼠的脾脏中分离原代鼠CD4+T细胞。用抗生物素微珠对细胞进行磁性标记，并使用磁辅助细胞分选分离未标记的CD4+T细胞。分离的CD4+细胞在预包被抗小鼠CD3ε(3μg/mL)的12孔板上培养，在10％胎牛血清、完整RPMI 1640培养基中以每孔1.0×106个细胞/mL的终浓度。
每个相应的Th(T-辅助)子集在以下培养条件下通过5天的培养诱导。Th1：抗小鼠CD28(3μg/ml)、抗小鼠IL-4、克隆(10μg/mL)、重组小鼠IL-2(5ng/mL)和重组小鼠IL-12(10ng/mL)。Th2：抗小鼠CD28(3μg/ml)、抗小鼠IFN-γ(10μg/mL)、重组小鼠Il-2(5ng/mL)和重组小鼠Il-4(10ng/ml)。Th17：抗小鼠CD28(3μg/ml)、重组小鼠TGFb(2.5ng/ml)、IL6(20ng/ml)、抗-IFNg(10μg/ml)、抗-IL4(10μg/ml)和抗IL2(10μg/ml)。ThMBV：抗小鼠CD28(3μg/ml)、重组小鼠Il-2(5ng/mL)和1×109颗粒MBV。T细胞在这些条件下培养5天。在第5天，洗涤细胞并用无血清的完全RPMI 1640换液，并用50ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸盐刺激24小时。24小时后，收集细胞培养上清液并进行针对IL-4的ELISA。
如图17所示，当用已知的Th1激活剂(促炎反应)刺激时，这些细胞产生极少IL-4(有效的抗炎信号分子)。当给予Th2(抗炎反应)激活剂时，细胞如预期产生大量IL-4。当细胞被激活为促炎Th17表型时，未产生IL-4。当细胞暴露于MBV(109MBV/孔)时，IL-4产生显著增加。总之，这些数据表明用MBV治疗诱导T-辅助细胞的强抗炎表型。
实施例7：MBV下调细胞因子风暴的介质并增加巨噬细胞中细胞因子风暴的负调节物的表达
UBM和源自UBM的MBV使用如上实施例2中所述的方法进行制备。
从6至8周龄B6小鼠收获小鼠骨髓。从骨髓收获的细胞以2×106个细胞/mL洗涤并铺板，并在巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)存在下分化成巨噬细胞，持续7天，每48h更换完全培养基。然后用或不用1×109MBV/ml(每组n＝3)处理巨噬细胞。在37℃下孵育24小时后，用无菌PBS洗涤细胞，收集总RNA并使用RNA测序进行分析。生物信息学分析由GeneviaTechnologies(Tampere,Finland)进行。使用R包DESeq2，版本1.24.0(Love等人，2014.Genome Biology 15:550)进行差异表达(DE)分析。Wald检验用于统计检验，p设置为0.05作为用于优化独立过滤的显著性截止值，并且零假设是对比组之间的log2倍数变化，其等于零。使用Benjamini-Hochberg程序(Benjamini等人1995.Journal of the RoyalStatistical Society B 57:289-300)校正多重检验的P值。然后使用0.05作为校正的p值的阈值和1作为绝对log2倍数变化的阈值对获得的结果进行事后过滤。还使用biomaRt版本2.40.5(Durinck等人2009.Nature Protocols,4:1184-1191)用MGI符号、基因描述和基因生物型注释基因。测序结果表明，MBV治疗显著降低已知为细胞因子风暴关键介质的基因的表达，包括：CD163、Igf1、Nlrp炎性体、C5ar2、Hrh1、Hdac9、Igfbp4和Pparg，如表3所示。
此外，MBV显示增加细胞因子风暴的负调节因子的表达，包括IL-10和Socs1-3，如表4所示。
表3：MBV降低参与细胞因子风暴的基因的表达。
Figure GDA0003952947440000481
表4：MBV增加作为细胞因子风暴负调节因子的基因的表达。
Figure GDA0003952947440000482
如该数据所示，MBV被证明是促炎细胞因子产生的有效调节剂，尤其是导致高细胞因子血症(“细胞因子风暴”)的促炎细胞因子。MBV的这一特征表明其可用于治疗或缓解由肺部过度炎症引起的细胞因子风暴和ARDS。
实施例8：MBV用于治疗鼠流感模型中病毒诱导的免疫应答的用途
UBM和源自UBM的MBV使用如上实施例2中所述的方法进行制备。
为了确定MBV定位到肺的能力，将250μl PKH67荧光标记的MBV以气溶胶形式以109个颗粒/mL的剂量鼻内施用至C57BL/6小鼠。值得注意的是，小鼠组织的免疫荧光显微镜显示肺气道和肺泡中MBV显著富集。如图18所示，在处理的肺组织的大小气道中，特别是在上皮细胞中，可以清楚地检测到MBV(用箭头表示)，但在肺实质中没有观察到。未经处理的对照肺组织(右图)显示出非特异性、低水平的自发荧光，其具有与MBV处理的组织不同的漫射模式，证明左图和中图的荧光确实表明MBV定位。
为了评估MBV对病毒性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(例如与COVID 19相关的ARDS)的治疗效果，使用H1N1鼠模型。H1N1流感引起与COVID-19患者相似的肺部病理学，并遵循相似的致病时程，包括无症状天数、快速ARDS样肺损伤和持续数周或数月的持续性肺泡炎。2009H1N1大流行病毒在高传播性和全球传播方面与SARS-CoV2更相似。
雄性和雌性C57BL/6小鼠通过口咽吸入感染甲型流感/CA/07/2009流感(H1N1大流行性流感)，用于生存研究的致死剂量为106pfu，用于免疫学研究的亚致死剂量为104pfu。在感染后第3天或第5天，通过鼻内或静脉内递送MBV处理小鼠。
小鼠被随机分配到以下六个实验组(每组8只小鼠，在两队列中运行，4只小鼠/组，雄性和雌性小鼠)：1)仅甲型流感/CA/07/2009；2)甲型流感/CA/07/2009+对照(仅溶媒)；3)甲型流感/CA/07/2009+鼻内MBV，处理剂量为250μL，1×106MBV/ml；4)甲型流感/CA/07/2009+鼻内MBV，处理剂量为250μL，1×109MBV/ml；5)甲型流感/CA/07/2009+静脉内MBV，处理剂量为250μL，1×106MBV/ml；6)甲型流感/CA/07/2009+静脉内MBV，处理剂量为250μL，1×109MBV/ml。一组健康小鼠用于基线对照。对小鼠进行每日体重跟踪作为发病率的替代指标，当观察到25％的体重减轻时处死小鼠。这些生存研究证明MBV对病毒诱导的死亡率的有效性，并进一步证明基于剂量和递送途径的MBV的疗效。
使用如上确定的3个实验组中最有效的给药策略进行免疫学研究：1)甲型流感/CA/07/2009；2)甲型流感/CA/07/2009+对照；3)甲型流感/CA/07/2009+MBV。在感染后第7天和第21天收集小鼠组织样品(包括但不限于肺和淋巴结(LN)、支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清)。通过
Figure GDA0003952947440000491
(SCIREQ,Quebec,CA)在每个时间点测量肺功能，以确定准静态肺顺应性作为炎症和水肿的量度。根据生产商的说明进行肺功能测量。
根据生产商的说明，使用肺蛋白匀浆评估肺损伤和炎症，以通过Bio-PlexTM细胞因子检测(Bio-Rad)确定局部细胞因子水平。对用于病理学评估的肺叶进行组织学分析，例如苏木素和伊红染色。进行血液评估，包括白细胞计数、通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定量抗体同种型和水平、抗血凝素抗体水平和血清细胞因子的Bio-PlexTM细胞因子测定评估。此外，进行支气管肺泡灌洗以收集样品，以通过Bio-PlexTM细胞因子检测和差异炎症细胞计数来确定空气空间细胞因子水平。
根据生产商的说明，来自肺消化物、LN悬浮液和BALF的单细胞用荧光标记的抗体染色，并使用
Figure GDA0003952947440000492
Aurora完成多参数光谱流式细胞术。流式细胞术评估用于定量骨髓区室(即分泌M1巨噬细胞和/或修复和调节M2巨噬细胞的促炎细胞因子)和淋巴区室(即调节性T细胞以及病毒特异性T效应细胞)的变化。还对LN和肺组织进行单细胞RNA测序分析，以确定病毒感染和MBV治疗如何在分子水平上共同并独立地塑造组织和免疫细胞群。
结果表明，与未处理的对照动物相比，用MBV处理的动物的病毒发病率显著降低。更出乎意料的是，用MBV处理的感染动物表现出肺损伤和炎症减少，如白细胞计数和细胞因子水平所示。这些数据表明，MBV的施用对于免疫调节导致急性呼吸窘迫的疾病和障碍是有效的治疗方法，并且MBV可以降低由病毒感染引起的ARDS的严重程度或发病率。除其他适应症外，这为尚无治疗方法的病毒性疾病(例如大流行性H1N1或SARS-CoV2以及其他流感和冠状病毒引起的呼吸道疾病)提供了有效的治疗方法。
实施例9：MBV用于在诊所治疗COVID-19相关的急性呼吸窘迫综合征的用途
UBM和源自UBM的MBV使用如上实施例2中所述的方法进行制备。
诊断为SARS-CoV2诱发的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、COVID-19阳性患者接受MBV治疗。能够自行呼吸的患者接受在3mL生理盐水中约1×109MBV的剂量，其通过雾化器装置通过鼻和/或口吸入肺部。插管患者接受在3mL生理盐水中1×109MBV的剂量，气管内递送。一些确定腹腔注射是优选施用方式的患者通过腹腔施用接受在约50mL生理盐水中的1×109MBV。
在接受一定剂量的MBV治疗之前和之后测量每名患者的血氧水平以确定治疗的疗效。此外，通过灌洗获得来自肺的液体样品，并通过ELISA确定细胞因子表达水平，例如上文表3和4中提供的细胞因子。患者继续每6-24小时接受剂量，直至患者出现改善体征，这包括在没有持续通气或氧气支持的情况下维持氧气水平的能力以及表明肺部液体清除胸部X光片改善和/或由灌洗液检测确定的炎症细胞因子水平降低。
实施例10：实施例11-15的材料和方法
为了评估MBV对病毒性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)(例如与COVID 19相关的ARDS)的治疗效果，使用H1N1鼠模型。H1N1流感引起与COVID-19患者相似的肺部病理学，并遵循相似的致病时程，包括无症状天数、快速ARDS样肺损伤和持续数周或数月的持续性肺泡炎。2009H1N1大流行病毒在高传播性和全球传播方面与SARS-CoV2更相似。
雄性和雌性C57BL/6小鼠通过口咽吸入感染甲型流感/CA/07/2009流感(H1N1大流行性流感)，用于生存研究的致死剂量为106pfu，用于免疫学研究的亚致死剂量为104pfu。在感染后第3天或第5天，通过静脉内递送MBV处理小鼠。
小鼠被随机分配到以下六个实验组(每组8只小鼠，在两个队列中运行，4只小鼠/组，雄性和雌性小鼠)：1)仅甲型流感/CA/07/2009；2)甲型流感/CA/07/2009+对照(仅溶媒)；3)甲型流感/CA/07/2009+静脉内注射MBV，处理剂量为250μL，1×106MBV/ml；4)甲型流感/CA/07/2009+静脉内MBV，处理剂量为250μL，1×109MBV/ml。一组健康小鼠用于基线对照。对小鼠进行每日体重跟踪作为发病率的替代指标，当观察到体重减轻25％时处死小鼠。这些生存研究证明了MBV对病毒诱导的死亡率的有效性，并进一步证明了基于剂量和递送途径的MBV的疗效。
使用如上确定的对3个实验组中最有效的给药策略进行免疫学研究：1)甲型流感/CA/07/2009；2)甲型流感/CA/07/2009+对照；3)甲型流感/CA/07/2009+MBV。在感染后第7天和第21天收集小鼠组织样品(包括但不限于肺和淋巴结(LN)、支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清)。
根据生产商的说明，使用肺蛋白匀浆评估肺损伤和炎症，以通过Bio-PlexTM细胞因子检测(Bio-Rad)确定局部细胞因子水平。对用于病理学评估的肺叶进行组织学分析，例如苏木素和伊红染色和三色染色。进行血液评估，包括白细胞计数、通过酶联免疫吸附测定(ELISA)定量抗体同种型和水平、抗血凝素抗体水平和血清细胞因子的Bio-PlexTM细胞因子测定评估。此外，进行支气管肺泡灌洗以收集样品，以通过Bio-PlexTM细胞因子检测和差异炎症细胞计数来确定气腔细胞因子水平。
根据生产商的说明，来自肺消化物、LN悬浮液和BALF的单细胞用荧光标记的抗体染色，并使用
Figure GDA0003952947440000501
Aurora完成多参数光谱流式细胞术。流式细胞术评估用于定量骨髓区室(即分泌M1巨噬细胞和/或修复和调节M2巨噬细胞的促炎细胞因子)和淋巴区室(即调节性T细胞以及病毒特异性T效应细胞)的变化。还对LN和肺组织进行单细胞RNA测序分析，以确定病毒感染和MBV治疗如何在分子水平上共同并独立地塑造组织和免疫细胞群。
实施例11：MBV的全身施用减轻急性病毒介导的肺部病理学。
气管内接种H1N1后7天后，全身施用基质结合纳米囊泡显著减轻急性病毒相关的肺部病理学，这在肺组织的H+E染色中很明显。在第7天，流感+i.v.PBS溶媒对照组显示肺间质空间的细胞密度和实变增加，而流感+i.v.MBV组显示细胞密度降低以及间质炎性浸润降低(图19A)。使用quPath人工智能以热图的形式可视化细胞密度，与流感+i.v.PBS组相比，流感+i.v.MBV组的细胞密度降低(图19A)。对流感感染后肺细胞浸润组成的进一步研究表明，细支气管灌洗液(BALF)、肺间质空间和脾脏中CD45+中性粒细胞增加(图19B，p<0.05)。静脉内MBV显著降低BALF、肺间质空间和脾脏中CD45+中性粒细胞的频率(图19B，p<0.05)。全身MBV施用的细胞浸润和中性粒细胞存在的减少与促炎细胞因子和趋化因子的减少有关(图19C)。具体地，全身MBV减少肺产生的G-CSF，其参与感染组织的中性粒细胞和骨髓细胞募集(图19C，p<0.05)。与流感+i.v.PBS组相比，全身施用MBV降低肺内促炎细胞因子(包括Il-6、Il-1b、TNF-α和IFN-γ)的浓度(图19C，p<.05)。
实施例12：MBV在H1N1接种后促进抗病毒CD4和CD8表型。
在气管内接种H1N1后第7天，与仅PBS对照中的基线比率相比，全身施用MBV显著改变了肺中CD4:CD8 T细胞的比率(图20A，p<.05)。这种使用MBV对CD8:CD4 T细胞比率增加的促进作用既见于肺部感染部位的局部，也见于整体脾脏(图20A和20B，p<0.05)。在进一步研究CD4和CD8 T细胞后，与仅PBS对照相比，MBV不仅促进有利于CD8:CD4 T细胞比率增加的转变，而且还促进激活(CD69+)和抗病毒(Tbet+)CD4和CD8 T细胞的增加(图20C和20D，p<.05)。具体地，在脾脏水平，与仅PBS和流感+i.v.PBS组相比，MBV增加CD69+CD4 T细胞的频率(图20C，p<.05)。与仅PBS和流感+i.v.PBS组相比，全身MBV还增加了淋巴结中抗病毒Tbet+CD4 T细胞的频率(图20C，p<.05)。与仅PBS和流感+i.v.PBS组相比，MBV还增加了脾脏中CD69+激活的CD8 T细胞的频率(图20D，p<.05)。虽然不具有显著性，与流感+i.v.PBS组相比，全身MBV组脾脏中Tbet+抗病毒CD8 t细胞的频率呈增加趋势(图2.D，p>.05)。
实施例13：MBV减轻长期病毒介导的肺部炎症
在气管内接种H1N1 21天后，与流感+i.v.PBS组相比，全身施用MBV显著降低肺组织中的总细胞密度(图21A)。与感染后第7天相似，全身施用MBV显著降低了肺局部水平和脾脏中CD45+中性粒细胞的总体频率(图21B)。与促炎性中性粒细胞减少相结合，肺中免疫调节性CD11+树突细胞的频率同时增加(图21C)。此外，与长期病毒性炎症中升高的那些相比，全身施用MBV降低了促炎趋化因子和细胞因子(图3.D，p<0.05)。具体地，MBV降低了IL 12、IL 1-β、MCP1和KC的肺浓度(图3.D，p<.05)。
实施例14：MBV的全身施用在CD4和CD8 T细胞中诱导前记忆免疫应答
与流感+i.v.PBS相比，MBV i.v.施用不仅促进病毒介导的肺病理学中炎症和细胞浸润的消退，而且还促进记忆免疫应答。具体地，与流感+i.v.PBS组相比，MBV的全身施用增加了CD621+/CD44+记忆CD4和CD8 T细胞的频率(图22A和22B，p<.05)。
实施例15：病毒相关的组织损伤和细胞外基质沉积随MBV的全身施用而减少
在接种H1N1后21天，与流感+i.v.PBS相比，全身MBV显著减少病毒相关的组织损伤和新的细胞外基质沉积，这在用quPath人工智能定量的三色图像上可见(图23A和23B，p<.05)。
结果表明，与未处理的对照动物相比，用MBV处理的动物的病毒发病率显著降低。更出乎意料的是，用MBV处理的感染动物表现出肺损伤和炎症减少，如白细胞计数和细胞因子水平所示。这些数据表明，MBV是用于导致急性呼吸窘迫的疾病和病症免疫调节的有效疗法，并且MBV可以降低病毒感染引起的ARDS的严重程度或发病率。这提供了尤其用于ARDS，不存在疗法的病毒性疾病，例如由H1N1或SARS-CoV2引起的疾病的有效疗法。这些数据还提供了治疗其他流感和冠状病毒引起的呼吸道疾病的方法。
实施例16：实施例17-19的材料和方法
股四头肌首先用0.02％胰蛋白酶和0.05％ EDTA脱细胞化，并用0.01％过氧乙酸消毒，然后在室温下用Liberase TH在缓冲液(50mM Tris pH 7.5,5mM CaCl2,150mM NaCl)中酶消化过夜，以从ECM释放MBV。
从创新研究获得的C57Bl6小鼠血浆中分离外泌体。
从17IIA前成牙本质细胞中分离cMV，如先前在Chaudhary等人Matrix Biol.52–54:284–300,2016中所述。简言之，用10mM Na-Pi缓冲液(pH 7.4)和50μg/ml抗坏血酸诱导17IIA细胞的成骨分化24小时，然后在37℃下用缓冲液中的1mg/ml胶原酶IA酶消化2小时。
囊泡的分离：在如上所述进行适当的制备后，然后对样品进行500×g持续10min、2,500×g持续20分钟和10,000×g持续30分钟的离心，以去除细胞和ECM碎片，上清液通过0.22μm过滤器。然后将含有囊泡的澄清上清液在4℃下以100,000×g(Beckman CoulterOptima L-90K Ultracentrifuge)离心70分钟以沉淀囊泡。将囊泡颗粒重悬于1X PBS中，分装并在20℃下储存直至进一步使用。
囊泡蛋白标志物的表征：分析囊泡亚型以确定通常与外泌体相关的蛋白标志物的表达水平。使用含有50μg囊泡蛋白的Exo-CheckTM外泌体抗体阵列(System Biosciences)分析蛋白质标志物。ImageJ用于定量分析的每种蛋白质的相对表达。
小鼠骨髓来源的巨噬细胞的分离和处理：从C57Bl6小鼠的胫骨和股骨分离骨髓来源的巨噬细胞，如Sicari等人，Biomaterials 35:8605–8612,2014先前所述。收获的单核细胞以2×106个细胞/mL的比例接种，单核细胞通过在37℃和5％ CO2下用含巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的培养基培养7天分化成巨噬细胞。产生的细胞被指定为幼稚巨噬细胞。将幼稚巨噬细胞暴露于以下处理中的一种，持续24小时：1)LPS/IFNγ以衍生M1巨噬细胞，2)IL-4以衍生M2巨噬细胞，3)1×109颗粒/mL血浆外泌体，4)1×109颗粒/mL 17IIA cMV，或5)1×109颗粒/mL肌肉MBV。
基因表达：24小时后，用Trizol收集RNA。按照生产商的说明，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(ThermoFisher Scientific)将1000ng RNA转化成cDNA。使用PowerUpTM
Figure GDA0003952947440000521
Green Master Mix进行实时qPCR。与未处理(M0)对照相比，通过2-ΔΔCt方法确定相对基因表达。
统计分析：双因素方差分析(ANOVA)和事后分析结合Tukey校正确定组间显著性比较。所有统计分析均使用GraphPad Prism完成。*P<0.05，**P<0.01，***P<.001。
实施例17：MBV不表达常见的外泌体标志物CD63或CD81。
EXO-CHECKTM外泌体抗体阵列(System Biosciences)用于比较鼠外泌体、鼠骨髓骨基质囊泡(Bone MV)和鼠基质结合纳米囊泡(MBV)上是否存在常见外泌体标志物。结果显示在图24的上图中并清楚地表明MBV几乎没有外泌体的典型和公认的标志物，例如CD63和CD81。此外，在图24的上图中识别的其他信号传导分子在MBV中不存在，而它们在骨微泡和外泌体中中度或高度存在。表达值的光密度图显示在图24的下图中。
数据显示，虽然外泌体和骨MV具有相似的表达谱，这些标志物的中度至高度表达，但MBV在这些EV标志物的表达上存在显著差异。例如，MBV也几乎没有，即具有“低”或“检测不到”水平的EpCAM、ANXA5、TSG101、FLOT1、ICAM1和ALIX中的一种或更多种，如空白孔所示，与外泌体孔上相同位置存在暗环或实心暗点以及这些标记物的相对表达水平相比，如小图中的图表所示。与MBV相比，骨MV还具有所有这些标志物的更高水平的表达，如孔上的暗点和这些标志物的相对表达水平所示，如下图的图表所示。
在一个实施方案中，与Exo-CheckTM外泌体抗体阵列的阳性对照相比，MBV具有低水平或检测不到的水平的CD63、CD81、EpCAM、ANXA5、TSG101、FLOT1、ICAM1和ALIX中的一种或更多种。在一个实施方案中，与外泌体(例如血浆外泌体)相比，MBV具有低水平或检测不到水平的CD63、CD81、EpCAM、ANXA5、TSG101、FLOT1、ICAM1和ALIX中的一种或更多种。在一个实施方案中，与骨MV相比，MBV的特征在于具有低水平或检测不到水平的Cd63、CD81、EpCAM、ANXA5、TSG101、FLOT1、ICAM1和ALIX中的一种或更多种。在一个实施方案中，与外泌体或骨MV相比，MBV的特征在于具有低水平或检测不到水平的ANXA5、TSG101和ICAM1。在一个实施方案中，与骨MV或血浆外泌体相比，MBV的特征在于具有低水平或检测不到水平的CD81、CD63、ANXA5、TSG101和ICAM1。
实施例18：MBV的骨MV标志物的表达低或不表达。
通过Western印迹分析评价骨MV标志物膜联蛋白V和组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)的表达。结果如图25所示。从1711A细胞制备的裂解物用作阳性对照。该实验的结果表明，基质结合纳米囊泡(MBV)没有任何骨微泡标志物TNAP和膜联蛋白V的表达。血浆外泌体表达膜联蛋白V，但不表达TNAP。这些结果清楚地将MBV与外泌体和骨微泡区分
实施例19：与外泌体或骨MV相比，MBV具有不同的免疫调节作用。
从小鼠收获的骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)未经处理(M0)或用以下供试品处理24小时：IFNγ+LPS诱导M1表型(M1)、IL-4诱导M2样表型(M2)、源自血浆的外泌体、源自17A细胞的骨MV或从肌肉中分离的MBV。处理后，通过qPCR评价指定基因表达的倍数变化。图26所示的结果表明，MBV对促炎标志物IL-6和TNF-α的下调与外泌体和骨微泡对相同两种炎症介质的下调明显不同。MBV具有强大的抗炎作用；而外泌体和骨微泡没有。
通过引用并入
除非有相反的说明，否则本文提及的每个专利文件和科学文章的全部公开内容均通过引用并入本文以用于所有目的
等同方案
在不背离本发明的精神或本质特征的情况下，本发明可以以其他具体形式体现。因此，前述实施方案在所有方面均被认为是说明性的，而不是限制本文描述的本发明。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前述描述来指示，并且所有落入权利要求的等同意义和范围内的变化均旨在涵盖在其中。
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caccuugucc ucacggucca guuuucccag gaaucccuua gaugcuaaga uggggauucc 60
uggaaauacu guucuugagg ucaugguu 88
<210> 2
<211> 110
<212> RNA
<213> 智人
<400> 2
agaagggcua ucaggccagc cuucagagga cuccaaggaa cauucaacgc ugucggugag 60
uuugggauuu gaaaaaacca cugaccguug acuguaccuu gggguccuua 110
<210> 3
<211> 106
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
gcgcagcgcc ctgtctccca gcctgaggtg cagtgctgca tctctggtca gttgggagtc 60
tgagatgaag cactgtagct caggaagaga gaagttgttc tgcagc 106

Claims (60)

1.一种治疗或预防具有发展急性呼吸窘迫综合征(ARDS)风险的受试者的ARDS的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的源自细胞外基质的分离的基质结合囊泡(MBV)的药物组合物，从而治疗或预防所述受试者的ARDS。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有源自于病毒、细菌或真菌的肺部感染。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者患有肺部病毒感染，所述病毒选自由SARS-CoV2、SARS-CoV、MERS-CoV、埃博拉病毒、流感病毒、巨细胞病毒或疱疹病毒组成的组。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有肺炎。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述受试者感染SARS-CoV-2或COVID-19。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述受试者患有流感。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述受试者患有SARS或MERS。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述受试者已经吸入有毒物质。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述有毒物质是烟、化学烟雾或来自电子烟的蒸气。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述受试者已经将水、呕吐物或食物吸入肺中。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述受试者患有头部或胸部损伤，肺或控制呼吸的大脑部分受损。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述受试者患有败血症。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述受试者患有胰腺炎。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述受试者患有重度烧伤。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述受试者已经接受大量输血。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述受试者出现高细胞因子血症。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述MBV的施用逆转所述受试者的高细胞因子血症。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在ARDS发作之前向所述受试者施用MBV以预防ARDS的发作。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中在ARDS发作之后向所述受试者施用MBV以治疗ARDS并预防ARDS进展。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述药物组合物通过全身静脉内(IV)注射施用。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述全身静脉内注射经由标准IV管或中心管进行。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述中心管是经外周插入中心静脉导管(PICC)、隧道式导管或植入式输液港。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述标准IV管在腕部、手臂或手的静脉中。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的方法，其中所述静脉内注射是推注，或连续滴注或泵注。
26.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述药物组合物经由喷雾器作为气雾剂施用于所述受试者的肺。
27.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述药物组合物经由置入所述受试者的气管内导管通过气管内滴注进行施用。
28.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述药物组合物通过定量吸入器经由鼻内施用而施用于肺。
29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中：
(i)所述MBV不表达CD63、CD81和/或CD9中的一种或更多种，或几乎检测不到CD63、CD81和/或CD9水平；和/或
(ii)所述MBV包含：
(a)至少55％的包含磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰肌醇(PI)组合的磷脂含量；
(b)10％或更少的包含鞘磷脂(SM)的磷脂含量；
(c)20％或更少的包含磷脂酰乙醇胺(PE)的磷脂含量；和/或
(d)15％或更多的包含磷脂酰肌醇(PI)的磷脂含量。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述MBV源自以下各项的细胞外基质：膀胱、小肠、心脏、真皮、肝脏、肾脏、子宫、脑、血管、肺、骨、肌肉、胰腺、胎盘、胃、脾脏、结肠、脂肪组织或食道。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述MBV源自膀胱基质(UBM)、小肠粘膜下层(SIS)或膀胱粘膜下层(UBS)。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述MBV源自哺乳类脊椎动物的细胞外基质，所述哺乳类脊椎动物选自人、猴、猪、牛或羊。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述MBV以每次施用每kg体重1×106至1×1020MBV的量施用。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述MBV以每次施用每kg体重1×106至1×1012MBV的量施用。
35.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述MBV以每次施用每kg体重1×109至1×1014MBV的量施用。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述受试者接受抗生素、抗病毒药物或抗炎药物。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述受试者接受瑞德西韦、法维拉韦、阿奇霉素或羟氯喹。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述受试者接受托珠单抗、阿那白滞素或Janus激酶(JAK)抑制剂。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中与接受免疫抑制剂治疗的受试者相比，由于接受MBV治疗，所述受试者具有降低的继发感染风险。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述继发感染是肺部感染。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述继发感染是血液中的感染。
42.根据权利要求39所述的方法，其中所述继发感染在心脏、肾脏或肝脏中。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述继发感染是细菌感染。
44.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中所述继发感染是病毒感染。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物后，所述受试者的氧饱和度增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％。
46.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中在施用所述药物组合物后，所述受试者的氧饱和度指数增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％。
47.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中在施用药物化合物后，所述受试者的氧指数增加10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或超过100％。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的方法，其中所述增加在施用所述药物组合物后1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时或24小时内发生。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述受试者在施用MBV后出现促炎细胞因子的产生减少。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述促炎细胞因子是TNF-α、IFN-γ、IL-8、IL-6、IL-1β或IL-12中的一种或更多种。
51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述受试者在施用MBV后出现抗炎细胞因子的产生增加。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述抗炎细胞因子是TGF-β、IL-4或IL-10。
53.根据权利要求50-52所述的方法，其中所述增加或减少通过在施用所述MBV之前和之后从所述受试者的肺取样支气管肺泡灌洗液来测量。
54.根据权利要求50-53所述的方法，其中所述增加或减少通过在施用所述MBV之前和之后对所述受试者的血液进行取样来测量。
55.根据权利要求1-54中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用所述药物组合物导致以下各项中的一项或更多项：
a)所述受试者的肺中CD45+中性粒细胞数量减少；
b)所述受试者的肺或脾脏中CD8+细胞数量增加和CD4+T细胞数量减少；
c)所述受试者的脾脏中CD69+CD4+T细胞数量增加；
d)所述受试者的淋巴结中抗病毒tbet+CD4+T细胞数量增加；
d)所述受试者的脾脏中抗病毒tbet+CD8+T细胞数量增加；
e)所述受试者的脾脏中CD69+CD8+t细胞数量增加；
f)肺中免疫调节性CD11b+树突细胞数量增加；和
g)肺中CD62L+/CD44+记忆CD4和CD8 T细胞数量增加。
56.根据权利要求1-55中任一项所述的方法，其中向所述受试者施用所述药物组合物减少所述受试者中病毒相关的组织损伤。
57.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述MBV表达低水平或不可检测水平的以下标志物中的一种或更多种：EpCAM、ANXA5、TSG101、FLOT1、ICAM1、GM130或ALIX。
58.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述MBV表达低水平或不可检测水平的以下标志物中的一种或更多种：ANXA5、TSG101或ICAM1。
59.根据权利要求1-56中任一项所述的方法，其中所述MBV表达低水平或不可检测水平的CD81、CD63、ANXA5、TSG101和ICAM1。
60.源自细胞外基质的分离的基质结合囊泡(MBV)用于治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的用途。
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