KR20230007389A - 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome) 치료를 위한 기질 결합 소포체 (matrix bound vesicles, mbv) - Google Patents

급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome) 치료를 위한 기질 결합 소포체 (matrix bound vesicles, mbv) Download PDF

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스티븐 프랜시스 바딜락
조지 에스. 핫세
라파엘 크럼
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유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
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Abstract

급성 호흡 곤란 증후군 (ACUTE RESPIRATORY DISTRESS SYNDROME)의 치료를 위한 기질 결합 소포체 (MATRIX BOUND VESICLES, MBV)
이를 필요로 하는 개체에서 SARS-CoV2 (COVID-19)와 같은, 바이러스성 감염과 관련된 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome)과 같은, 급성 호흡 곤란 증후군을 치료하는 방법을 공개한다. 이 방법은 세포 외 기질로부터 유래된 분리된 기질 결합 소포체를 포함하는 약학적 제제를 개체에게 투여하는 것을 포함한다.

Description

급성 호흡 곤란 증후군 (ACUTE RESPIRATORY DISTRESS SYNDROME) 치료를 위한 기질 결합 소포체 (MATRIX BOUND VESICLES, MBV)
관련된 출원에 대한 교차 문헌
이 출원은, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합된, 2020년 4월 16일에 신청된, 미국 가 출원 번호 (U.S. Provisional Application No.) 63/011,177의 유리한 점을 청구한다.
본 출원은, SARS-CoV2 (COVID-19) 에 의해 원인이 되는 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS) 과 같은, ARDS의 치료를 위한 세포 외 기질 (extracellular matrix) 로부터 유래 된 기질 결합 소포체 (matrix bound vesicles, MBV)의 투여와 관련된다.
또한 이 분야 기술에서 2019-신규 코로나바이러스 또는 2019-nCoV로도 알려진, 중증 급성 호흡기 증후군-코로나바이러스-2 ((severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2 (SARS-CoV-2))의 감염으로부터 야기되는, 코로나바이러스 질환 2019 (Coronavirus Disease 2019, COVID-19) 세계적 유행병(pandemic)은 현재 전 세계적으로 공중 보건의 우려의 원천이다. 치료는 임상적으로 많은 환자에서 도전적인 것으로 되었다 (Mehta et al. (2020) COVID-19: Consider Cytokine Storm Syndromes and Immunosuppression. Lancet. 395 (10229): 1033-1034). 비록 항 바이러스성, 항-염증성, 면역 억제 성 약물 및 백신을 개발하기 위하여 막대한 재원이 동원되었음에도 불구하고, 증가하는 증거는, 사이토카인 방출 증후군 (cytokine release syndrome) 또는 사이토카인 폭풍 증후군 (cytokine storm syndrome)으로도 알려진, 사이토카인과분비(hypercytokinemia) 가 흔한 특징이고 및 가장 심각한 질병을 앓은 COVID-19 환자의 치사율의 주 원인 임을 제시한다 (Tian, S. et al. (2020) Pulmonary Pathology of Early-Phase 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Pneumonia in Two Patients With Lung Cancer. J. Thorac. Oncol. S1556-0864(20)30132-5). 더욱이, 사이토카인과분비(hypercytokinemia)는 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS)에 의해 전형적으로 원인이 되는 환자 치사율의 강한 지표이다. 사이토카인과분비 및 ARDS 둘 다는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의해 촉발되는 면역 체계의 병리학적 조절 장애를 반영한다. 현재의 치료법은 면역 억제 또는 특정한 염증 매개체의 억제에 의하여, 이차 감염에 대한 감수성을 증가하게 하는, 비정상적인 염증을 대상으로 한다.
따라서, 예를 들어, SARS-CoV-2에 의해 원인이 되는 ARDS와 같은, 바이러스 감염의 결과로부터와 같은 그러한 면역 시스템 장애의 경우 면역 체계 조절을 위한 새롭고 및 효과적인 치료에 대한 절박한 필요성이 남아 있다.
여기서 제공되는 것은 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS)을 치료 또는 예방하는 방법이다.
한 실시 예에서, 본 발명은 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS) 을 전개할 위험이 있는 개체에서 ARDS를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 그 방법에는 개체에게 세포 외 기질 (extracellular matrix)로부터 유래 된 분리 된 기질 결합 소포체 (matrix bound vesicles, MBV) 를 치료학적 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 투여하고, 이로써 개체에서 ARDS 를 치료 또는 예방하는 것이 관여된다. 이 공개되는 방법은 ARDS를 가지고 있거나, 또는 가질 위험성이 있는 개체를 선택하는 것을 포함할 수 있다.
환자에서 ARDS는 어느 수의 원천적인 컨디션에 의해 원인이 될 수 있다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 개체는 바이러스성, 박테리아성, 또는 곰팡이성 기원인 폐 감염을 가진다. 예를 들어, 개체는 SARS-CoV2, SARS-CoV, MERS-CoV, 에볼라바이러스 (ebolavirus), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 또는 헤르페스 바이러스(herpes virus)로부터 선택된 바이러스에 의한 폐 감염을 가질 수 있다. 선행 실시 예 어느 것에서, 개체는 폐렴을 가질 수 있다. 한 실시 예에서, 개체는 SARS-CoV-2 또는 COVID-19로 감염된다. 다른 실시 예에서, 개체는 인플루엔자를 가진다. 다른 실시 예에서, 개체는 SARS 또는 MERS를 가진다. 또 다른 실시 예에서, 개체는 연기, 화학물질 가스, 또는 베이핑(vaping) 증기 ((예를 들어, 전자-담배 (e-cigarette)로부터))와 같은 독성 물질을 흡입하였다. 또 다른 예에서, 개체는 폐에 흡입된 물, 구토물, 또는 음식물을 가진다. 다른 실시 예에서, 개체는 폐 또는 호흡을 조절하는 뇌의 일부분에 손상을 주는 머리 또는 흉부 상처를 가진다. 다른 실시 예에서, 개체는 패혈증 (sepsis)을 갖는다. 또 다른 실시 예에서, 개체는 췌장염 (pancreatitis)을 가진다. 다른 실시 예에서, 개체는 심각한 화상 (severe burn) 갖는다. 다른 실시 예에서, 개체는 수혈을 받았다.
본 발명에 따라, 어떤 실시 예에서, 본 발명의 방법은 사이토카인과분비 (hypercytokinemia)를 경험하는 개체에서 사용된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 MBV의 투여는 개체에서 사이토카인과분비 효과를 역전 시킨다. 어떤 실시 예에서, MBV는 ARDS의 발병을 예방하기 위하여 ARDS 발병 전에 개체에 투여된다. 또 다른 실시 예에서, MBV는 ARDS 발병 후에 ARDS를 치료하고 및 ARDS의 진행을 예방하기 위하여 개체에게 투여된다.
본 발명의 방법의 한 실시 예에서, 개체는 인간 개체이다.
본 발명의 한 실시 예에 따라, MBV를 포함하는 약학적 조성물은 전신적인 정맥 (IV) 주사로 투여된다. 예를 들어, 전신적 정맥 주사는 표준 IV 라인 (standard IV line) 또는 중앙 라인 (central line)을 통한다. 어떤 실시 예에서, 중앙 라인은 말초 삽입 중앙 카테터 (peripherally inserted central catheter, PICC), 터널 형 카테터 (tunneled catheter), 또는 이식된 포트 (implanted port)이다. 어떤 실시 예에서, 표준 IV 라인은 손목, 팔 또는 손에 있는 정맥이다. 또한 다른 실시 예에서, 정맥 주사는 일 회 주사(bolus injection), 또는 연속적인 점적 또는 펌프 주사 (continuous drip or pump injection) 이다.
다른 실시 예에 따라, 약학적 조성물은 개체의 폐에 투여된다. 예를 들어, 약학적 조성물은 분무기를 통해 에어로졸 (aerosol)로서 투여된다. 또 다른 실시 예에서, 약학적 조성물은 기관 내 점적 주입(endotracheal instillation)에 의해 투여된다. 예를 들어, 투여는 개체에 장치된 기관 내 튜브를 통한다. 또 다른 실시 예에서, 약학적 조성물은 폐에 량정의 흡입기를 통해 투여된다.
다른 실시 예에 따라, MBV는(i) CD63, CD81, 및/또는 CD9 중 하나 이상의 발현하지 않거나, 또는 거의 검출되지 않는 수준의 CD63, CD81, 및/또는 CD9을 갖고, 및/또는 (ii) MBV는 (a) 적어도 55% 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI) 의 조합을 포함하는 인지질 (phospholipid) 함량; (b) 10% 이하의 스핑고마이엘린 (sphingomyelin, SM)을 포함하는 인지질 함량; (c) 20% 이하의 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine, PE)을 포함하는 인지질 함량; 및/또는 (d) 15% 이상의 포스파티딜 이노시톨(phosphatidylinositol, PI)을 포함하는 인지질 함량을 포함한다.
또 다른 실시 예에서, MBV는 방광 (urinary bladder), 소장(small intestine), 심장, 피부(dermis), 간, 신장, 자궁, 뇌, 혈관, 폐, 뼈, 근육, 췌장, 태반, 위, 지라(spleen), 결장(colon), 지방 조직(adipose tissue), 또는 식도(esophagus)의 세포 외 기질로부터 유래한다. 한 실시 예에서, MBV는 방광 (urinary bladder), 소장(small intestine), 심장, 피부(dermis), 간, 신장, 자궁, 뇌, 혈관, 폐, 근육, 췌장, 태반, 위, 지라(spleen), 결장(colon), 지방 조직(adipose tissue), 또는 식도(esophagus)의 세포 외 기질로부터 유래한다. 한 실시 예에서, MBV는 뼈 세포 외 기질로부터 유래하지 않는다.
또 다른 실시 예에서, MBV는 방광 기질 (urinary bladder matrix, UBM), 소장 점막 하 (small intestinal submucosa, SIS), 또는 방광 점막 하 ( urinary bladder submucosa, UBS)로부터 유래한다. 한 실시 예에서, MBV는 방광 기질 (urinary bladder matrix, UBM)로부터 유래한다. 한 실시 예에서, MBV는 소장 점막 하 (small intestinal submucosa, SIS)로부터 유래한다. 한 실시 예에서, MBV는 방광 점막 하 ( urinary bladder submucosa, UBS)로부터 유래한다.
또 다른 실시 예에서, MBV는 인간, 원숭이, 돼지, 소, 또는 양에서 선택된 포유류 척추 동물의 세포 외 기질로부터 유래한다.
다른 실시 예에서, MBV는 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x1012 MBV의 양으로 투여된다.
어떤 실시 예에서, 개체는 항생제, 항 바이러스제, 또는 항염증제 약물을 투여받고 있다. 예를 들어, 개체는 렘데시비르 (remdesivir), 파비피라비르 (favipiravir), 아지트로마이신(azithromycin), 또는 하이드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine)을 받고 있다. 예를 들어, 개체는 렘데시비르 (remdesivir), 파비피라비르(favipiravir), 아지트로마이신(azithromycin), 또는 하이드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine) 을 받고 있고 및 개체는 COVID-19를 가지고 있다. 예를 들어, 어떤 실시 예에서, 개체는 토실리주맙 (tocilizumab), 아나킨라 (anakinra), 또는 야너스 키나제 (Janus kinase, JAK) 억제제를 투여받고 있다. 예를 들어, 개체는 토실리주맙 (tocilizumab), 아나킨라 (anakinra), 또는 야너스 키나제 (Janus kinase, JAK) 억제제를 투여받고 있고 및 개체는 COVID-19를 가지고 있다.
다른 실시 예에서, 개체는 면역억제제로 치료된 개체와 비교하여 MBV 치료의 결과로서 2차 감염의 위험이 감소 된다. 예를 들어, 2차 감염은 폐 감염이다. 예를 들어, 2차 감염은 혈액 내 감염이다. 예를 들어, 2차 감염은 심장, 신장, 또는 간에 있다. 예를 들어, 2차 감염은 박테리아성 감염이다. 예를 들어, 2차 감염은 바이러스성 감염이다.
추가의 실시 예에서, 개체는 약학적 조성물 투여 후에 개체의 산소 포화도 (oxygen saturation)가 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초과하여 증가하는 경험을 한다. 다른 실시 예에서, 개체는 약학적 조합물의 투여 후에 개체의 산소 포화도 지수 (oxygen saturation index)에서 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초과하여 증가하는 경험을 한다. 다른 실시 예에서, 개체는 약학적 화합물의 투여 후에 개체의 산소 지수 (oxygen index)가 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초과하여 증가하는 경험을 한다. 이 증가는 약학적 조성물의 투여 후 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 또는 24시간 내에 일어날 수 있다.
다른 실시 예에서, 개체는 MBV 투여 후에 전-염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine) 생성의 감소를 경험한다. 예를 들어, 전-염증성 사이토카인은 TNF-α, IFN-γ, IL-8, IL-6, IL-1β, 또는 IL-12 중 하나 또는 그 이상이다. 다른 실시 예에서, 개체는 MBV 투여 후에 항-염증성 사이토카인 생성의 증가를 경험한다. 예를 들어, 항-염증성 사이토카인은 TGF-β, IL-4, 또는 IL-10이다. 한 실시 예에서, 증가 또는 감소는 MBV 투여 전 및 후에 개체의 폐로부터 기관지 폐포 세척액을 샘플링하여 측정된다. 또 다른 실시 예에서, 증가 또는 감소는 MBV 투여 전 및 후에 개체의 혈액을 샘플링하여 측정된다. 다른 실시 예에서, 치료의 효력은 ARDS 및/또는 사이토카인과분비와 관련된 증상의 감소로 측정된다
본 발명의 앞선 및 다른 목표, 특징, 및 장점은 수반하는 도면을 참조하여 진행되는 하기의 상세한 서술로부터 좀 더 분명할 것이다.
도 1A-1G는 액체-상 세포 외 소포체 (extracellular vesicles, EV) 및 기질 결합 소포체 (matrix bound vesicles, MBV)의 형태적 특징을 보여준다. 도 1A는 방광 기질 (urinary bladder matrix, UBM)로부터 유래 된 ECM 스케폴드의 스캐닝 전자 현미경을 보여주며, 여기서는 지름 약 100nm의 뚜렷한 구체 (spherical bodies) 가 기질 전체에 걸쳐 퍼져있다. 스케일 바= 1μm. 도 1B는 액-상 (EV) 또는 고체-상 세포 외 분획 (MBV)으로부터 선택적으로 소포체를 수확하기 위하여 사용된 3T3 섬유아세포(3T3 fibroblast cell) 배양 모델의 실례를 보여준다. 도 1C는 탈세포화 후에 세포 부재 및 온전한 핵의 부재를 보여주는 상 대조 현미경 (phase contrast microscopy), 헤마톡실린 및 에오신 (hematoxylin and eosin, H&E) 염색, 및 4', 6-디아미디노-2-페닐인돌 (4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) 염색을 보여준다. 도 1D는 3T3 섬유아세포 (3T3 fibroblast cell) 배양 모델로부터 단리된 액체-상 EV 및 MBV의 투과 전자 현미경 이미지를 보여준다. 스케일 바= 100nm. 도 1E는 3T3 섬유아세포 배양으로부터 단리된 액체-상 EV 및 MBV의 나노입자 추적 분석 (nanoparticle tracking analysis, NTA)으로부터의 크기 분포 플럿을 보여준다. 도 1F는 액체-상 EV 및 MBV에서 CD9, CD63, CD81 및 Hsp70의 발현 수준을 비교하는 면역블럿 분석 (immunoblot analysis) 을 보여준다. 도 1G는 액체-상 EV 및 MBV에서 전기영동적으로 단리된 단백질의 은 염색 분석 (silver stain analysis)을 보여준다.
도 2A-2E는 EV 및 MBV 사이의 miRNA 화물(cargo)의 차이를 보여준다. 도 2A는 3T3 모 세포 (parent cell), 이들의 분비된 액체-상 EV, 및 이들의 MBV로부터 단리된 총 RNA의 생물분석기 분석 (bioanalyzer analysis)을 보여준다. 도 2B는 액체-상 EV (초록), MBV (파란색) 및 세포 (빨강색)의 RNA-seq 데이터 세트를 비교하는 주성분 분석 (principal-component analysis, PCA)을 보여준다. 도 2C는 액체-상 EV, MBV 및 모 세포에서 miRNA의 차별화된 발현을 보여주는 화산 플럿 (volcano plots)을 보여준다. 포함 기준은 각 방향에서 log2의 차이 (배수-변화) 2-배로, P-값 <0.05이다. 각각의 점은 특정한 miRNA 전사체를 대표한다; 수직 점선의 오른쪽 (및 수평 점선 라인 위)의 초록색 점은 발현 수준의 상대적인 증가에 해당하고, 및 왼쪽 (및 수평 점선 라인 위)의 빨강색 점은 발현 수준의 상대적인 감소에 해당한다. 파란색 점 (수평 점선 아래에 나타나는)은 발현 수준에서 의미 있는 차이가 없는 miRNA를 표시한다. 도 2D는 miRNA 서열 분석 결과의 RT-qPCR 평가를 보여주고, *p<0.05, n=4이다. 도 2E는 독창성 경로 분석 (Ingenuity Pathway Analysis) (IPA 기능 분석)을 보여준다. IPA 기능 분석에 의해 동정 된 의미 있게 강화된 분자 기능은 MBV (빨강 색-아래 바 ) 및 액체-상 EV (파란색-위 바)에서 차별되게 발현되는 miRNA를 고려하여 결정되었다. 세포 성장 및 증식, 세포 모양, 세포에서-세포로의 신호 전달, 및 조직 발달에서는 빨강 색 바는 없다; 소화관 시스템 발달 및 기능, 간 시스템 발달 및 기능 및 기관 발달 및 기능에서는 파란색 바가 없다.
도 3A-3H는 MBV 의 세포 기원에 기반을 둔 MBV의 miRNA 화물(cargo)에서의 차이를 나타낸다. 도 3A는 세포가 없음을 보여주는 탈세포화된 BMSC 세포 배양 플레이트의 상 대비 현미경 이미지를 보여준다. 도 3B는 탈세포화된 BMSC 세포 배양 플레이트로부터 단리된 MBV의 투과 전자 현미경 이미지를 보여준다. 스케일 바 = 100nm. 도 3C-3E는 BMSC (도 3C), ASC (도 3D), 및 UCSC (도 3E) 탈세포화된 배양 플레이트로부터 단리된 MBV의 나노입자 추적 분석 (nanoparticle tracking analysis, NTA)으로부터의 크기 분포 플럿을 보여준다. 도 3F는 BMSC, ASC, 및 UCSC-유래한 MBV로부터 단리된 총 RNA의 생물 분석기 분석을 보여준다. 도 3G는 BMSC MBV (초록색; 중앙 왼쪽), UCSC MBV (파란색; 위 오른쪽) 및 ASC MBV (빨강색; 아래 오른쪽) RNA-seq 데이터세트를 비교하는 주성분 분석 (principal-component analysis, PCA)을 보여준다. 도 3H는 BMSC, ASC, 및 UCSC-유래한 MBV에서 차별화된 발현을 나타내는 화산 플럿을 보여준다. 포함 기준은 각 방향에서 log2의 차이 (배수-변화) 2-배로, P-값 <0.05이다. 각각의 점은 특정한 miRNA 전사체를 대표한다; 수직 점선의 오른쪽 (및 수평 점선 라인 위)의 초록색 점은 발현 수준의 상대적인 증가에 해당하고, 및 왼쪽 (및 수평 점선 라인 위)의 빨강색 점은 발현 수준의 상대적인 감소에 해당한다. 파란색 점 (수평 점선 아래에 나타나는)은 발현 수준에서 의미 있는 차이가 없는 miRNA를 표시한다.
도 4A-4E는 MBV, 액체-상 EV, 및 모 세포 사이의 인지질의 LC/MS 특징을 보여준다. 도 4A는 MBV로부터 얻어진 인지질의 총이온 크로마토그램을 보여준다. 도 4B는 MBV에 있는 주 인지질 클래스 (major phospholipid classes)의 질량 스펙트라 (mass spectra)를 보여준다. 평가에는 인지질의 포화 (이중결합 수 =0), 단일 불포화 (이중결합 수 =1) 및 다가불포화 (이중 결합 수 =2-10) 종의 정량화를 포함한다. 도 4C는 주 인질의 총 함량을 보여주는 파이 플럿 (pie plots)을 보여준다. 데이터는 인지질의 %로써 표시된다. 도 4D 및 도 4E는 다른 인지질 분자 종의 함량을 보여준다. 데이터는 Z-스코어로 자동계량 되고 및 파란색 (낮은 값)에서 빨강색 (높은 값)으로 코드 되는 열지도 (heat maps)로서 표시된다. 약어는: EV, 엑소좀 소포체 (exosomal vesicles); MBV, 기질-결합 소포체 (matrix-bound vesicles); PC, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine); PCd, PC 디아실 종 (PC diacyl species); PCp, PC 플라스말로겐 (PC plasmalogens); PE, 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine), PEd, PE 디아실 종(PE diacyl species); PEp, PE 플라스말로겐 (PE plasmalogens); PI, 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidylinositol); PS, 포스파티딜세린 (phosphatidylserine); BMP, 비스-모노아실글리세로 포스페이트 (bis- monoacylglycerophosphate); PA, 포스파티딕에시드 (phosphatidic acid); PG, 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol); 및 SM, 스핑고마이엘린 (sphingomyelin)이다.
도 5A-5D는 MBV, 액체-상 EV, 및 모 세포 사이에서 LPE, LPA 및 LPG의 차이를 조사하는 LC/MS 성질 규명 및 후속 분석을 보여준다. 도 5A는 MBV로부터 얻은 주 라이소-인지질 (major lyso-phospholipids)의 전형적인 질량 스펙트라를 보여준다. 도 5B는 주 라이소-인지질 총 함량을 보여주는 파이 플럿을 보여준다. 데이터는 총 라이소-인지질의 %로서 제시된다. 도 5C 및 도 5D는 라이소-인지질 분자 종의 함량을 보여준다. 데이터는 Z-스코어로 자동계량 되고 및 파란색 (낮은 값)에서 빨강 색 (높은 값)으로 코드 되는 열지도 (heat maps)로서 표시되고, n=3이다. 약어는: EV, 엑소좀 소포체 (exosomal vesicles); MBV, 기질-결합 소포체 (matrix-bound vesicles); LPC, 라이소 포스파티딜콜린 (lyso-phosphatidylcholine); LPE, 라이소-포스파티딜에탄올아민 (lyso-phosphatidylethanolamine); LPI, 라이소-포스파티딜 이노시톨 (lyso-phosphatidylinositol); LPS, 라이소-포스파티딜세린 (lyso-phosphatidylserine); LPA, 라이소-포스파티딕에시드 (lyso-phosphatidic acid); LPG, 라이소-포스파티딜글리세롤(lyso-phosphatidylglycerol); 및 mCL, 모노-라이소-카디오리핀 (mono-lyso-cardiolipin) 이다.
도 6A-6C는 MBV 에서의 PUFA-함유하는 인지질 및 이들의 산화적으로 수정된 분자 종의 수준이 액체-상 EV에 있는 이들의 수준에 비교하여 더 높은 것을 보여준다. 모 세포 (parent cell), 액체-상 EV 및 MBV에서의 자유 PUFA (도 6A) 및 이들의 산소화된 대사체 (도 6B)의 함량이 평가되었다. 데이터는 평균± s.d., *p<0.05로서 표시되었으며 및 세포 또는 MBV에 비교되었으며, n=3이다. 도 6C는 모 세포, 액체-상 EV, 및 MBV에서 단일하게-, 이중으로-, 및 삼중으로-산소화된 인지질 종의 함량을 보여준다. 데이터는 Z-스코어로 자동계량 되고 및 파란색 (낮은 값)에서 빨강색 (높은 값)으로 코드 되는 열지도 (heat maps)로서 표시된다. 약어는: EV, 엑소좀 소포체 (exosomal vesicles); MBV, 기질-결합 소포체 (matrix-bound vesicles); PL, 인지질 (phospholipids); PC, 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine); PE, 포스파티틸에탄올아민 (phosphatidylethanolamine); PI, 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidylinositol); PS, 포스파티딜세린 (phosphatidylserine); BMP, 비스-모노아실글리세로 포스페이트 (bis- monoacylglycerophosphate); PA, 포스파티딕에시드 (phosphatidic acid); PG, 포스파티딜글리세롤(phosphatidylglycerol); 및 CL, 카디오리핀(cardiolipin) 이다.
도 7은 쥐 동물 모델에서 류머티스성 관절염 치료를 위한 MBV의 투여 경로를 묘사한다.
도 8A-8E는 대조군 및 프리스탄-만으로 (pristane-only), 복강 내 (intraperitoneal, IP) 메토트렉세이트 (methotrexate, MTX), 관절주위 (periarticular, PA) MBV, 또는 정맥 주사 (intravenous, IV) MBV로 처치된 관절염 쥐 모델의 개별적인 관절염 스코어를 보여준다. 도 8A는 처치된 그룹에서 7일째 날에 관절염 스코어를 보여주고, 도 8B는 처치된 그룹에서 10일째 날에 관절염 스코어를 보여주고, 도 8C는 처치된 그룹에서 13일째 날에 관절염 스코어를 보여주고, 도 8D는 처치된 그룹에서 17일째 날에 관절염 스코어를 보여주고, 및 도 8E는 처치된 그룹에서 21일째 날에 관절염 스코어를 보여준다.
도 9A는 프리스탄 (pristane)을 통해 임상적 관절염 표현형 모사를 유도한 스프라그-다우레이 쥐 및 프리스탄-만으로, IP 메토트렉세이트 (IP methotrexate), PA MBV, 또는 IV MBV로 처치된 스프라그-다우레이 쥐의 다각도에서 찍은 사진을 보여준다. 도 9B는 질환 대조군 및 관절주위 MBV로 처치된 쥐 발의 근접 사진을 보여준다.
도 10은 대조군 및 프리스탄-만으로, IP 메토트렉세이트 (IP methotrexate), PA MBV, 또는 IV MBV로 처치된 관절염 쥐 모델에서 처치 첫 번 21 째 날에 평균 관절염 스코어를 보여준다.
도 11A는 대조군 및 IP 메토트렉세이트, PA MBV, 및 IV MBV로 처치된 관절염 쥐 모델의 발을 찍은 사진을 보여준다. 도 11B는 IP 메토트렉세이트, PA MBV, 및 IV MBV로 처치된 관절염-쥐 모델에서 치료 첫 번 77일째 날에 평균 관절염 스코어를 보여준다.
도 12A-12B는 IP 메토트렉세이트, PA MBV, 및IV MBV로 처치된 관절염 쥐 모델에서 TNFα (도 12A) 및 IL1β (도 12B)의 혈청 수준을 보여준다.
도 13은 매개체 대조군 또는 MBV로 처치된 건선의 생쥐 이미퀴모드 (imiquimod ) 모델의 조직학적 이미지를 보여준다.
도 14는 매개체 대조군 또는 MBV로 처치된 건선의 생쥐 이미퀴모드 (imiquimod ) 모델에서 TREG 세포의 마커로서 FOXP3 RNA 수준을 보여준다.
도 15는 생리 식염수(음성 대조군), MBV, 또는 사이클로포스파미드 (cyclophosphamide) (양성 대조군)로 처치된 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole limpet hemocyanin, KLH) 쥐 모델에서 ELISA로 측정된 대로 항-KLH IgG를 보여준다.
도 16A는 형광 활성화 세포 분리 (fluorescence activated cell sorting, FACS) CD45+CD3-B220-CD11b+Ly6G- 세포로 측정된 대로, IL-33을 함유하는 MBV로 처치된 후에 카디오톡신 (cardiotoxin) 손상 부위로 침투하는 염증성 대식세포 (inflammatory macrophages)에 대한 점 플럿 (dot plots) 을 보여준다. 도 16B는 염증성 대식세포 빈도를 보여준다. 도 16C는 CD45+CD3+B220-CD4+ 세포에 대해 형광 활성화 세포 분리로 측정된 대로, IL-33을 함유하는 MBV로 처치된 후에 카디오톡신 (cardiotoxin) 손상 부위로 침투하는 ST2+ TREG 에 대한 점 플럿 (dot plots)을 보여준다. 도 16D는 ST2+ TREG 의 빈도를 보여준다.
도 17은 ELISA로 측정한 대로 전 염증성 반응 (proinflammatory response)을 촉진하기 위하여 Th1 활성제로, 항-염증성 반응을 촉진하기 위하여 Th2 활성제로, 전 염증성 반응 (proinflammatory response)을 촉진하기 위하여 Th17 활성제로, 또는 MBV로 자극된 T 세포에 대한 IL4 생산을 보여준다.
도 18은 형광으로-라벨 된 MBV (초록색)를 에어로졸을 통해 109 입자/mL 용량으로 투여 후 포르말린 고정된, 파라핀에-박힌 쥐 폐 조직의 면역 형광 현미경 이미지를 보여준다. 대표적인 이미지는 (왼쪽 및 중앙 팬널) MBV가 처치된 폐 조직의 큰 및 작은 기도 (airway), 특히, 유조직(parenchyma)이 아닌, 상피 (epithelia)에서 쉽게 검출될 수 (화살 머리) 있음을 보여준다. 처치되지 않은 대조군 조직 (오른쪽 팬널)은 MBV-처치된 조직과는 같지 않은 확산 된 패턴을 가진 비-특이적인, 낮은 수준의 자동 형광 (autofluorescence)을 보인다.
도 19A-19C는 기질-결합 나노소포체의 전신적인 투여는 감염 -후 7일째 날에 바이러스-매개하는 폐 병리 및 단핵 호중구 (mononuclear neutrophil) 세포 침투를 완화하는 것을 보여준다. 도 19A: 전체 폐 병리의 20x 헤모톡실린 (hematoxylin) 및 에오신(eosin) 이미지의 모자이크 편집은 감염-후 7일째 날에 간질성 폐렴 (interstitial pneumonia)이 폐의 간질 공간에 확산 된 단핵 세포 침투와 관련된다는 것을 보여주었다. MBV로의 전신적인 투여는 폐 간질 (lung interstitium)로의 전반적인 세포 침투를 감소시켰으며 및 감염 후 7일에 급성 폐 염증의 해결 (resolution)을 보였다. H + E 이미지 인접한 세포 밀도 열지도 (cellular density heat maps)는 인플루엔자 (influenza) + i.v. PBS 그룹에서 높은 밀도의 세포 침투를 보였으며 인플루엔자 (influenza) + i.v. MBV 그룹에서는 전반적인 세포 밀도의 감소를 보였다. 도 19B: 전신적인 MBV는 세척액 (lavage) (BAL), 폐 간질 (lung interstitium), 및 지라(spleen) 에서 CD45+ 호중구 (CD45+ neutrophils)의 전반적인 빈도를 의미 있게 감소시켰다. 도 19C: 전신적인 MBV는 전-염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines) 및 케모카인 (chemokines) GCSF, IL-6, Il-1b, TNFα, 및 IFN-γ의 농도를 의미 있게 감소시켰다.
도 20A-20D는 MBV의 전신적 투여는 폐 및 지라 (spleen)의 CD4+ t-세포 집단을 감소시키고 및 활성화된, 항-바이러스성 CD8+ T-세포의 존재를 증가시킴을 보여준다. 도 20A: 전신적 MBV는 폐 조직에서 CD4+ t-세포의 빈도를 의미 있게 감소시키고 및 CD8+ T-세포의 빈도를 증가시켰다. 도 20 B: 전신적 MBV는 지라에서 CD4 T-세포의 빈도를 의미 있게 감소시키고 및 지라에서 CD8+ T-세포의 빈도를 증가시켰다. 도 20C: 전신적 MBV는 지라 및 림프 결절 (lymph nodes)에서 각각 말초적으로 위치하여 있는 CD69+ 및 Tbet+ CD4+ T-세포의 빈도를 증가시킴으로써 항-바이러스성 CD4 반응의 활성화를 유도하였다. 도 20D: CD69+ 및 Tbet+ CD8+ T-세포의 증가 된 빈도가 제시하는 대로 전신적 MBV는 항-바이러스성 CD8+T-세포 반응의 말초적 활성화를 유도하였다.
도 21A-21D는 MBV의 전신적 투여는 감소된 세포 침투를 통해 만성 바이러스-후 (post-viral) 폐 염증을 감소시키고 및 전-염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine) 생성을 감소시킴을 보여준다. 도 21A: 전체 폐 병리의 20x 헤마톡실린 및 에오진 이미지의 모자이크 편집 (mosaic compilation) 은 감염-후 21 째 날에 기관지 폐렴이 기관지 및 큰 기도 (large airways) 주위에 집중적인 단핵 세포 (mononuclear cell) 침투와 관련되었음을 보여주었다. MBV로의 전신적 처치는 폐 간질 (lung interstitium)로의 전반적인 세포 침투를 감소시켰으며 및 감염-후 7일에 급성 폐 염증의 해결을 보였다. H + E 이미지 인접한 세포 밀도 열 지도는 인플루엔자 (influenza) + i.v. PBS 그룹에서 높은 밀도의 세포 침투를 보였으며 인플루엔자 (influenza) + i.v. MBV 그룹에서는 전반적인 세포 밀도의 감소를 보였다. 도 21B: 전신적 MBV는 폐 간질 및 지라에서 CD45+ 중핵구의 전반적인 빈도를 의미 있게 감소시켰다. 도 21C: 전신적 MBV는 폐에서 CD11b 수지상 세포 (dendritic cells)의 비율을 증가시켰다. 도 21D: 전신적 MBV는 전-염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines) 및 케모카인 (chemokines) Il-12, Il-1b, MCP-1, 및 KC의 농도를 의미 있게 감소시켰다.
도 22는 전신적 MBV 투여는 CD62L+CD44+ 기억 CD4 및 CD8 T-세포의 비율을 의미 있게 증가시킴을 보여 주는 바 그래프 (bar graphs) 세트로 장기간 항-바이러스 저항을 지지한다.
도 23은 MBV의 전신적 투여는 감염 후 21 째 날에 H1N1-관련된 강화 (consolidation) 및 간질 섬유화 (interstitial fibrosis)를 의미 있게 감소시킴을 보여주는 디지털 이미지 및 그래프 세트이다. 위 이미지는 트리크롬 염색 (trichrome staining) 및 큐패스 제공하는 이미지 (quPath rendered images)를 나타낸다. 큐패스 소프트웨어 (QuPath software)를 사용하여 조직병리학적 분석이 수행되었다. 간략하게, 마손의 트리크롬 염색된 세포 (Mason's trichrome stained cells)는 광학적 밀도 (optical density) 데이터를 사용하여 세어 졌으며 및 랜덤-트리스 기계-학습 아키텍처 (Random Trees machine-learning architecture)에 의한 표현형에 기반을 두어 분류되었다. ML 분류자 (ML classifier)는 여섯 개의 대표적인 이미지에 대하여 훈련되었으며, 네 가지 가능한 클래스: 결합 조직 (connective tissue), 혈관(blood vessel), 폐 기질 조직 (lung stromal tissue), 질환 조직 (diseased tissue)으로 표시된 다수의 (n > 10) 훈련 부위를 가진다. 아랫부분에서, 폐 표면 면적당 총 조직 섬유화/강화 퍼센트가 계산되었으며 및 MBV 처치된 동물에서 총 질환 조직이 H1N1을 지닌 처치 되지 않은 동물에서의 질환조직에 비교하여 의미있게 감소 됨을 보였다.
도 24는 쥐 엑소좀 (murine exosomes), 쥐 뼈 기질 소포체 (murine bone matrix vesicles) (뼈 MV), 및 쥐 기질 결합 나노소포체 (murine matrix bound nanovesicles) (MBV)에서 주목된 여러 가지 마커들의 수준을 비교하는 Exo-CheckTM 엑소좀 항체 어레이 (Exosome Antibody Arrays, System Biosciences)의 결과를 보여준다. 상위 팬널은 어레이의 디지털 이미지를 제공하고 및 하위 팬널은 엑소좀 대비 뼈 MV 대비 MBV에서의 주목된 마커들 각각의 상대적 발현을 보여주는 그래프이다.
도 25는 뼈 MV 마커 아넥신 V (Annexin V) 및 조직 비-특이적인 알카라인 포스파타제 (Tissue Non-specific Alkaline Phosphatase, TNAP)의 발현을 검출하기 위한 혈장 엑소좀 및 근육 MBV의 웨스턴 블럿 분석 결과를 보여준다.
도 26은 여러 가지 세포 타입- 처치되지 않은 (M0) 또는 IFN+LPS (M1) 또는 IL-4 (M2)로 처치된 골수 유래된 대식세포 또는 혈장 (plasma)으로부터 유래된 엑소좀, 17A 세포로부터 유래된 뼈 MV (Bone MV), 또는 근육으로부터 단리된 MBV에 있는, 여러 가지 유전자들의 발현 변화 배수를 보여 주는 바그래프이다.
서열 목록
37 C.F.R. 1.822에 정의된 대로 뉴클레오타이드 베이스 (nucleotide bases) 를 위한 표준 글자 약어, 및 아미노산을 위한 세 글자 코드를 사용하여, 서열 목록에 목록화되어 있는 핵산 및 아미노산 서열을 보여준다. 각 핵산 서열의 단지 한 가닥만 보여주나, 그러나 제시된 가닥에 어느 참조하여 이의 보완 줄기도 포함되는 것으로 이해된다. 서열 목록은 ASCII 텍스트 파일 (text file) [Sequence_Listing, April 15, 2021, 1.07 KB]로서 제출되고, 이는 여기 참고 문헌으로 병합되었다. 수반되는 서열 목록에서:
서열 번호:1-3는 miRNA 서열이다.
본 공개는, 예를 들어 바이러스성 감염과 관련된 사이토카인과분비인, 사이토카인과분비와 관련된 ARDS와 같은, 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS)의 치료에 기질 결합 나노 소포체 (matrix bound nanovesicles, MBV)를 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 관점이 하기의 부분에 제시되어 있다; 그러나 한 특별한 부분에서 서술된 본 발명의 관점은 어느 특정한 부분에 제한하려는 것은 아니다.
여기서 데이터가 제시된 대로, MBV는 대식세포 (macrophages)의 항-염증성 특성을 유도하는, 대식세포 활성의 강력한 조절자이다. 대식세포들이 염증성 자극에 노출되었을 때, 이들은 TNF, IL-1, IL-6, I-8, 및 IL-12와 같은 사이토카인을 분비한다. 그러한 사이토카인들은 맥관 투과성 및 염증성 세포의 영입을 증가시키고 이는 ARDS와 같은 컨디션에 기여한다. 그러나 여기서 예시를 든 대로, MBV와 접촉한 대식세포는 전-염증성 사이토카인의 생성을 하향조절하는 능력을 갖추고 있음은 물론 염증의 음성적 조절자를 상향조절하는 능력을 갖추고 있어, MBV가 사이토카인과분비의 "사이토카인 폭풍 (cytokine storm)"을 약화시키는 능력이 있음을 제시한다. 이러한 MBV의 유일한 성질 때문에, MBV는 여기서 서술한 대로 바이러스성 감염에서부터 상해까지의 여러 인자에 의해 원인이 될 수 있는 사이토카인과분비 때문에 폐에 다양한 염증의 결과로부터 오는 ARDS를 치료하는데 유용하다. 바이러스에 대한 면역 반응이 사이토카인 폭풍의 원인이 되고 및 ARDS의 결과가 되는, COVID-19와 같은 질환에서, MBV는 ARDS와 같은, 사이토카인 폭풍의 파괴적인 효과를 예방하거나 또는 뒤바꾸는 능력을 갖는다.
요약
여기서 공개된 대로, 본 공개의 기질 결합 나노소포체 (matrix bound nanovesicles, MBV)가, 예를 들어, 감염과 관련된 사이토카인과분비 (hypercytokinemia)인, 사이토카인 과분비와 관련된 ARDS와 같은, 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS)을 치료하는 방법에 사용된다. 어떤 실시 예에서, 사이토카인과분비는, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 또는 원생동물 (예를 들어, 아메바)과 같은 병원균에 의한 감염의 결과이다. 어떤 실시 예에서, 세포 내 병원균에 의해 매개 되는 질환 또는 장애는 급성 감염이다. 어떤 실시 예에서, ARDS는 MERS, SARS-CoV, 또는 SARS-CoV2와 같은 바이러스성 감염의 결과이다. 한 실시 예에서, ARDS는 SARS-CoV2의 결과이다. 한 실시 예에서, ARDS는 인플루엔자의 결과이다.
치료적 적용 (Therapeutic Applications)
전 세계 인구집단에서 미리-존재하는 면역 없이, COVID-19는 세계적 유행병 (팬데믹, pandemic)이 되어, 첫 번째 케이스가 보고된 이래 4개월 미만에 전 세계 경제를 파괴하였다. 이 짧은 기간에, COVED-19는 계절 인플루엔자의 치사율의 300% 내지 400%로, 매우 치명적인 감염으로서 부각되었다. ((WHO (2020) Coronavirus disease 2019 (COVID-19): Situation Report, 67)). 현재 COVID-19의 치료는 주로 자연적으로 지원되고, 및 ARDS로부터의 호흡 기능 장애는 치사율의 주된 원인이다. ((Ruan Q, et al. (2020) Clinical predictors of mortality due to COVID-19 based on an analysis of data of 150 patients from Wuhan, China. Intensive Care Medicine: 1-3.)). 바이러스 감염 및 이에 따른 조직 손상은 ARDS에서 최고조가 될 수 있는 사이토카인 폭풍 (cytokine storm) 을 시작하는 것으로 알려졌다. ((Ware LB & Matthay MA (2000) The acute respiratory distress syndrome. NEJM. 342(18):1334-1349; Matthay MA, et al. (2012) The acute respiratory distress syndrome. Journal of Clin Inves. 122(8):2731-2740; Wheeler AP & Bernard GR (2007) Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome: a clinical review. Lancet 369(9572):1553-1564)). ARDS의 특징의 정의에는 확산한 폐포 손상, 폐부종, 및 저산소혈증을 포함하는 것으로, 이는 혈장 또는 기관지 폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF)에 증가된 염증성 사이토카인으로서 나타나는 조절이 안 되는 국소 및 전신 감염 때문이고, 이는 혈관 밖 호중구의 축적을 초래한다. ((Matthay MA et al. (2012) The acute respiratory distress syndrome. Journal Clin Inves. 122(8):2731-2740)). 전 염증성 대식세포 (Pro-inflammatory macrophages) 및 단핵세포 (monocyte)는 또한 ARDS에서 원인적인 역할을 하고, 국소 염증의 증가를 통해 폐 조직의 손상을 전파한다; 이 염증은, 그 후 증가된 상피 및 내피 조직의 투과성에 기여한다. ((Aggarwal NR et al. (2014) Diverse macrophage populations mediate acute lung inflammation and resolution. Amer Journal of Phys Lung Cell and Mol Phys. 306(8):L709-L725; Zemans RL & Matthay MA (2017) What drives neutrophils to the alveoli in ARDS? (BMJ Publishing Group Ltd); Thompson BT et al. (2017) Acute respiratory distress syndrome. New England Journal of Med. 377(6):562-572)).
개체에 대한 심도있는 기초 연구 및 임상적 연구에도 불구하고, ARDS를 예방하거나 또는 해결하기 위한 효과적인 치료의 부족함이 아직 남아 있으며, 및 조기 염증을 감소시키는 보조적 과정 (supportive procedures)이 환자결과에서 지속적인 개선을 제공하기 위한 오직 하나의 수단이다. ((Bellani G, et al. (2016) Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries. Jama 315(8):788-800)).
호흡기 바이러스 감염 (예를 들어, SARS-CoV2)에 초기 반응에는 심각한 ARDS를 유도하는 전-염증성 사이토카인을 방출하는 대식세포, 좀 더 많은 면역 세포 영입, 및 바이러스-감염된 세포 식균이 포함된다 ((Conti P, et al. (2020) Induction of pro-inflammatory cytokines (IL-1 and IL-6) and lung inflammation by Coronavirus-19 (COVID-19 or SARS-CoV-2): anti-inflammatory strategies. J Biol Regul Homeost Agents. 34(2)). 중국 우완 (Wuhan)에 있는 환자를 역추적한 코호트 연구에서는 COVID-19로부터의 사망의 93%는 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS) 및 폐에 초 염증 (hyperinflammation)이 관여된다는 것을 보여준다 ((Zhou F, et al. (2020) Clinical course and risk factors for mortality of adult inpatients with COVID-19 in Wuhan, China: a retrospective cohort study. Lancet. 395(10229):1054-1062)). 영입된 단핵세포는 바이러스에 대항하는 숙주 방어에서 뚜렷한 역할을 하는 대식세포로 분화한다, 그러나 이 같은 세포는 또한 염증의 해결 및 폐 수선을 동시에 촉진한다. 초기 항 바이러스성 면역 반응에서, M1-유사 대식세포는 전-염증성 사이토카인을 방출하여 더 많은 면역 세포를 영입하고 및 바이러스-감염된 세포를 식균하고, 및 어떤 경우에는, ARDS를 유도한다 ((Conti P, et al. (2020) Induction of pro-inflammatory cytokines (IL-1 and IL-6) and lung inflammation by Coronavirus-19 (COVID-19 or SARS-CoV-2): anti-inflammatory strategies. J Biol Regul Homeost Agents. 34(2)). M1-유사 (전-염증성) 대식세포 활성화 상태가 M2-유사, 항-염증성, 전-리모델링 (pro-remodeling) 표현형으로의 전환하는 것은 호흡 장애를 완화할 수 있고, 상피 장벽 기능을 회복하고, 및 14일 이내에 바이러스에 대항하는 후천성 면역성 (acquired immunity)의 전개를 촉진할 수 있다 ((He W, et al. (2017) Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nat Commun. 8(1):846)). 대식세포 표현형의 전환 없이는, 그러나, 상피 장벽 기능은 파괴되고 및 세포 죽음 및 부종이 ADRS를 초래하게 할 수 있다. 하이드록시클로로퀸 (hydroxycholorquine, HCQ)과 같은 약물이 임상 예비 조사에서 COVID-19의 치료로서 조사되고 있다; 중요하게도, 그러나 HCQ는, 면역 억제에 의해, ARDS 케이스에서 보인 초 염증 (hyperinflammation) 과 같은, 초 염증을 나타낸다 ((Liang N, et al. (2018) Immunosuppressive effects of hydroxychloroquine and artemisinin combination therapy via the nuclear factor-kappaB signaling pathway in lupus nephritis mice. Exp Ther Med 15(3):2436-2442)). 그러므로, HCQ 및 이와 비슷한 면역 억제 약물은 환자를 제2차 감염, 예를 들어, 2차 폐렴, 의 고도 위험에 놓이게 하고, 및 항-바이러스성 면역의 전개를 억제한다 ((Liang N, et al. (2018) Immunosuppressive effects of hydroxychloroquine and artemisinin combination therapy via the nuclear factor-kappa B signaling pathway in lupus nephritis mice. Exp Ther Med 15(3):2436-2442)). COVID-19의 만족스러운 치료는 그러므로 사이토카인 폭풍 및 예방적인, 항체-매개하는 면역성 전개의 동시 해결을 요구한다. ECM 내의 인자들이 대식세포 및 T-도우미 세포 (T-helper cells)의 전-염증성 (pro-inflammatory)으로부터 전-리모델링 (pro-remodeling) 상태로의 표현형 전환을 조절하므로, 본 발명은- 면역 능력의 타협 없이-세포 외 기질 (extracellular matrix, ECM) 내에 박혀 있는 분자 인자들에 의해 촉진되는 숙주-면역 시스템의 조절/재프로그램을 향하고 있다. ((Hussey GS, et al. (2018) Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Rev Mater; Allman AJ, et al. (2002) The Th2-restricted immune response to xenogeneic small intestinal submucosa does not influence systemic protective immunity to viral and bacterial pathogens. Tissue Eng Part A. 8(1):53-62)). ECM 스케폴드의 분해 생산물은 골격근 수선, 궤양성 대장염의 설치류 모델, 시신경, 및 상기도 (upper respiratory tract) 에 강력하고 및 임상적으로 관련 있는 항-염증성 및 전-치유 성 (pro-healing) 효과를 가지고 있다. ((예를 들어, 국제 특허 출원 발행 번호 (International Patent Application Publication Nos) WO 2017/151862 및 WO　2018/204848 참조)).
그러므로, COVID-19의 만족스럽고 및 바람직한 치료는 면역력의 타협 없이 사이토카인과분비의 해결을 요구한다. 여기서 공개된 대로, 본 공개의 MBV는 사이토카인과분비와 관련된 초 염증 (hyperinflammation) (예를 들어, 바이러스 감염과 관련된 사이토카인 과분비) 과 같은, 초 염증을 치료하는 방법에 사용된다.
본 공개의 MBV 치료의 선행 및 다른 목적, 특징, 및 장점은 병원 및 비-병원 환경 둘 다에서 투여할 수 있는 것이다. 어떤 실시 예에서, 본 공개의 MBV 치료는 사이토카인 폭풍 증후군과 관련된 COVID-19를 가진 환자를 치료하기 위하여 투여된다. 디폴트 된 염증성 치유 반응(default inflammatory healing response)을 염증을 제한하고 및 기능적인 조직 리모델링을 촉진하는 그러한 방향으로 돌리도록 하기 위하여 환자에게 안전하고 및 쉽게 투여될 수 있는 그러한 치료적인 플랫폼은 현재 존재하지 않으며 및 그러므로 오랫동안 충족되지 않았던 요구이다.
MBV는 ECM의 필수 구성 요소이고, 엑소좀과는 다르고, 및 전 임상 모델에서 초 염증을 효과적으로 재전향 (redirect) 한다 (Hussey GS, et al. (2020) Lipidomics and RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials. Sci Adv 6(12):eaay4361; van der Merwe Y, et al. (2019) Matrix-bound nanovesicles prevent ischemia-induced retinal ganglion cell axon degeneration and death and preserve visual function. Sci Rep 9(1):3482)). MBV는 또한, 뼈 생성 및 미네랄화 (mineralization)에 관련된 뼈 기질 소포체 (bone matrix vesicles) 와 다르다. 예를 들어, 뼈 기질 소포체는 MBV는 발현하지 않는 알카라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase)를 발현한다. 어떤 실시 예에서, MBV는 면역 조절성 miRNA, 단백질, 및 지질을 함유하고, 및 대식세포에 의해 빠르게 흡수되어, 신호전달 캐스케이드를 촉발하고 및 ECM-기반을 둔 생체물질의 맥락에서 잘-연구된 현상인, 표현형 전환에 필수적인 유전자 발현을 조절한다 ((Hussey GS, et al. (2019) Matrix bound nanovesicle-associated IL-33 activates a pro-remodeling macrophage phenotype via a non-canonical, ST2-independent pathway. J Immunol Regen Med 3:26-35; Huleihel L, et al. (2017) Macrophage phenotype in response to ECM bioscaffolds. Semin Immunol 29:2-13)). 더욱이, 어떤 실시 예에서, MBV 투여는 조절 T-세포 (TREG)의 상향 조절의 결과가 되며, 이는 ECM-기반을 둔 생체물질의 맥락에서 이전에 성질 규명된 현상이다. MBV는 류머티스성 관절염 (rheumatoid arthritis), 외상성 근육 손상 (traumatic muscle injury), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis), 및 식도암 (esophageal cancer)을 포함하는 가혹한 환경에서 회복 면역 반응 (reparative immune response) 을 빠르고 및 효과적으로 유도한다. ((Huleihel L, et al. (2017) Matrix-Bound Nanovesicles Recapitulate Extracellular Matrix Effects on Macrophage Phenotype. Tissue Eng Part A 23(21-22):1283-1294; Dziki JL, et al. (2016) Immunomodulation and Mobilization of Progenitor Cells by Extracellular Matrix Bioscaffolds for Volumetric Muscle Loss Treatment. Tissue Eng Part A 22(19-20):1129-1139; Keane TJ, et al. (2017) Restoring Mucosal Barrier Function and Modifying Macrophage Phenotype with an Extracellular Matrix Hydrogel: Potential Therapy for Ulcerative Colitis. J Crohns Colitis 11(3):360-368; Saldin LT, et al. (2019) Extracellular Matrix Degradation Products Downregulate Neoplastic Esophageal Cell Phenotype. Tissue Eng Part A 25(5-6):487-498.)).
MBV 내에 저장된 사이토카인 화물 (cargo)은 회복 적이고 및 조절적인 M2 대식세포를 지지하고 및 급성 폐 손상 후에 박테리아성 감염 및 염증을 조절한다 ((Liu Q, et al. (2019) IL-33-mediated IL-13 secretion by ST2+ TREG controls inflammation after lung injury. JCI Insight 4(6)). ECM 스케폴드는 근골격, 위장관, 비뇨 생식기 및 CNS 조직이 관여되는 다양한 임상적 적용에 유용하다 ((Badylak SF (2007) The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28(25):3587-3593)). ECM은 조직 정체성을 정의하는 각 조직에 주재하는 세포의 분비되는 구조적 및 기능적 분자로 구성된다. 그러한 외인성 스케폴드 (xenogeneic scaffolds)는 부정적인 선천적 또는 적응성 면역 반응을 끌어내지 않으며, 및 대신 항-염증성 및 회복적인 선천적 및 적응성 면역 반응을 지지한다 (Brown BN, et al. (2009) Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30(8):1482-1491)). 이 자연적으로 존재하는 생체물질의 사용은; 건설적인 리모델링 (constructive remodeling)" 이라고 불리는 과정인, 기능적, 부위-적절한 조직의 부분적인 회복과 (적어도), 전형적으로 관련된다 ((Badylak SF (2007) The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28(25):3587-3593)). ECM 바이오스케폴드, 또는 ECM 바이오스케폴드의 분해 산물은, 항-염증성 M2-유사 대식세포 및 T-도우미 타입 2 (T helper Type 2, Th2) 세포 반응의 영입을 통해 조직 수선을 지시하는 것으로 나타났으며, 그러한 반응은 자주 감소된 국소 염증 및 전구 세포와의 건설적인 크로스 토크 (crosstalk) 와 관련된다.
기질 결합 소포체 (Matrix Bound Nanovesicles, MBV) 는 M2-유사 회복적 및 항-염증성 대식세포 표현형을 활성화한다. MBV는 체액에서 발견되는 엑소좀과는 별도로 뚜렷한 클래스의 세포 외 소포체라는 것이 연구에서 나타났다 ((Hussey GS, et al. (2020) Lipidomics and RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials. Sci Advances. 6(12):eaay4361)). MBV는 혹독한 조직 탈세포화 과정에서도 살아남으므로, 이들은 손상에 대한 조직 반응에서 조절적인 역할을 함은 물론이고, 조직 및 기관 발달 및 종 간의 항상성에서 기본적인 역할을 할 수 있다. MBV는 다수의, 다양한 조직 소스로부터 유래할 수 있다. MBV는 풍부하고, 동결건조 될 수 있고, 매우 안정적이고, 및 기관 점적 주입 (tracheal instillation) 또는 분무화 (nebulization) 통해 쉽게 투여될 수 있다.
MBV는 ECM의 대식세포 표현형의 전-리모델링 (pro-remodeling) 을 촉진하는 효과를 요약할 수 있다. 대식세포 유전자 및 단백질 발현, 세포 표면 마커, 및 식균 활성, 산화질소 (nitric oxide, NO) 생산, 및 관찰된 항-미생물 능력으로 결정되는 기능적 능력은 MBV로 치료 후에 조절적/항-염증 표현형을 가장 나타내었으며, 이는 ECM-기반을 둔 바이오스케폴드의 대식세포 표현형 및 기능의 효과를 서술한 이전의 보고와 일치한다 (예를 들어, PCT Publication No. WO 2017/151862A1 참조). MBV는 miRNA, 단백질, 및 인지질 화물(cargo)의 조합을 통해 면역조절 효과를 발휘하는 것으로 보였다. 예를 들어, 체액에 존재하는 엑소좀에 비교하여, MBV는 세포 외 환경의 맥락에서 전-/항-염증에 따라 다른 포스포리파아제 (phospholipases)에 의해 활성화되는 지질을 지지하는 매개체 (pro-resolving lipid mediators)가 매우 강화되어 있다 (Hussey GS, et al. (2020) Lipidomics and RNA sequencing reveal a novel subpopulation of nanovesicle within extracellular matrix biomaterials. Sci Adv 6(12):eaay4361). 더욱이, MBV는 면역 세포가 회복적인 M2-유사 표현형을 향하도록 지시하는 신호를 주고, 또한 손상된 폐에서 Treg에 의한 수선 및 조절적인 기능을 자극하는, IL-33의 풍부하고 및 안정적인 소스이다 ((Liu Q, et al. (2019) IL-33-mediated IL-13 secretion by ST2+ TREG controls inflammation after lung injury. JCI Insight 4(6)). IL-33 전달은 박테리아의 제거를 개선함으로써 H1N1 감염 후에 박테리아 슈퍼-감염을 감소시킨다 (Robinson KM, et al. (2018) Novel protective mechanism for interleukin-33 at the mucosal barrier during influenza-associated bacterial superinfection. Mucosal immunology. 11(1):199-208). 추가로, MBV는 miRNA 125b-5p, 143-3p, 및 145-5p가 강화되어 있다. 대식세포 내에 이들 miRNA의 억제는 항-염증성/조절성 표현형보다는 전-염증성 표현형과 좀 더 일치하는 유전자 및 단백질 발현 프로파일과 연관되어 있다 ((Huleihel L, et al. (2017) Matrix bound nanovesicles recapitulate extracellular matrix effects on macrophage phenotype. Tissue Eng Part A)).
실시 예시 2에서 서술된 대로, MBV가 관절염 스코어를 완화할 수 있을지를 평가하기 위하여 프리스탄-유도된 관절염 (pristane-induced arthritis, PIA) 모델 설치류가 사용되었다. 8-주령 된, 스프라구-다우레이 (Sprague-Dawley) 쥐는 연구 0일째 날에 300 μL 프리스탄 (pristine) ((2,6,10,14-테트라메티펜타데칸 (2,6,10,14-tetramethypentadecane))을 피부 내 주사로 투여받았다. 두 번째 용량의 300 μL 프리스탄은, 4일째 날에, 피부-내로 투여되었다. 프리스탄을 투여받은 동물은 그 후 하기의 실험 그룹으로 무작위로 나뉘었다: 프리스탄-만 (Pristane-only), 메토트렉세이트 (Methotrexate) 복강 주사 (IP MTX), MBV 의 관절 주위 주사 (PA MBV)), 및 MBV의 정맥 주사 (IV MBV). 치료제는 7, 10, 14, 17, 및 21 째 날에 투여되었다. 7 째 날에 시작하여, 관절염 스코어(arthritis score) 7, 10, 14, 17, 21, 28 째 날 및 그 후 매주 100일 동안 각 동물에서 측정되었다. 이 연구로부터의 결과는 PA 및 MBV의 IV 투여 둘 다는 프리스탄-만 투여한 대조군 동물에 비교하여 관절염 스코어를 의미 있게 감소시킴을 보였다. 21일째 날 이후에, 동물은 추가의 치료를 받지 않았으나, 그러나 2차 갑작스런 재발을 (flare-up) 평가하기 위하여 종적으로 추적되었다. 100일째 날로부터의 결과는 MBV 처치한 동물은 추가의 처치가 주어지지 않았음에도 불구하고 대조군 (처치-안 한)과 비교하여 관절염 스코어의 지속적인 감소를 나타냄을 보였다. 더욱이, 발의 전체적인 모양 검사에서 MBV 처치한 그룹에서는 감소된 홍조 및 부종을 보였다. 추가로, 실시 예시 4에서 보여준 대로, 설치류 KLH ((키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin)) 면역 에세이에서 면역억제에 의한 비정상적인 감염을 다루는 현재의 치료제와는 반대로, MBV 치료는 면역 능력의 타협 없이 숙주 면역 시스템의 조절/재프로그래밍을 겨냥함을 보여준다. 실시 예시 10-13은 MBV의 전신적인 투여는 인플루엔자 감염의 동물 모델에서 급성 바이러스-매개하는 폐 병리 및 장-기간의 염증을 완화하는 추가의 증거를 제공한다. 이들 데이터들이 보여주는 대로, MBV 치료는 ARDS와 같은, 비정상적인 염증 반응이 관련되는 많은 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 잠재력이 있다.
블레오마이신-유도된 (bleomycin-induced) 폐 섬유증의 쥐 모델에서 탈세포화한 방광 기질 (urinary bladder matrix, UBM) 분말의 기관 점적 주입 (tracheal instillation) 은 폐 상피 세포 케모탁시스 (chemotaxis), 이동 및 수선을 촉진한다(Manni ML, et al. (2011) Extracellular matrix powder protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Tissue Eng Part A. 17(21-22):2795-2804). 추가로, 탈세포화된 ECM 분말의 기관 점적 주입은 박테리아 부담을 상당히 감소시키고 및 박테리아-유도된 사이토카인/케모카인 분비를 약화시켜 접종된 생쥐를 심각한 박테리아-유도된 폐 감염으로부터 보호하며, 그러므로 ECM 스케폴드는, 박테리아-유도된 감염과 같은, 급성 호흡 곤란 증후군으로부터 야기되는 2차 합병증의 예방을 제공할 수 있음을 제시한다 ((Chen C, et al. (2019) Urinary bladder matrix protects host in a murine model of bacterial-induced lung infection. Tissue Eng Part A. 25(3-4):257-270)). 그 외에, 기관 점적 주입 또는 분무에 의한 쥐 폐로의 탈세포화된 ECM의 전달은, 고산소 컨디션 동안에 약화된 폐포 격벽 비대 (alveolar septal thickening), 세포 사멸, 및 지속적인 산화적 손상을 포함하는 지속적인 고산소 노출 (hyperoxia exposure)에 의해 유도되는 급성 폐 손상에 대한 개선 효과를 보인다. 그러나, IPF의 치료를 위한 ECM 분말의 임상적 잠재력 (translational potential )은 분무 될 수 있는 그러한 ECM 현탁액의 최대 농도 및 부피 때문에 제한된다 (Wu J, et al. (2017) Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PloS One 12(2):e01711650). 이들의 나노미터 크기를 감안하면, MBV는 ECM 분말의 폐와 관련된 문제를 극복하고 및 MBV는 폐에 기관 점적 주입 또는 분무를 통해 직접적으로 투여될 수 있음을 제시한다.
체액 또는 세포 배양 상등액으로부터의 엑소좀 분리와는 반대로, ECM 구조 분자의 복잡한 초미세구조 (ultrastructure)는 ECM-스케폴드 물질로부터 MBV 분리에 대한 특유의 도전을 제시한다.
어떤 실시 예에서, MBV는 분무화 되고 및 흡입 또는 정맥 주사를 통해 전달되어, 빠르게 타겟적으로 또는 전신적으로 전달이 되도록 한다. MBV는 상처 후에 초기 면역 반응의 강력한 자연적인 조절자이고 및 국소적 및 전신적 평형을 회복시킨다. 그러므로, MBV는 자연 면역의 타협 없이 ARDS를 완화할 수 있다. MBV는 면역억제 없이 염증 해결을 촉진한다. 사이토카인 스크린에서는 MBV 내에 저장된 풍부한 항-염증성 사이토카인을 보여주며, 이는 MBV는 평형을 회복하고 및 자연 면역과 타협함이 없는 장점이 있고, ARDS에 대항하는 회복력을 주는 면역 표현형을 촉진함을 제시한다. 그러므로, MBV는 면역억제 없이 염증의 해결을 촉진한다. 더욱이, 탈세포화된 돼지 조직 및 기관으로부터 유래된 MBV 및 ECM은 쉽게 얻을 수 있으며, 안전하고, 좋지 않은 면역 반응을 생산하지 않으며, 및 따라서, 이 기술은 임상적 전이 (clinical translation) 에 준비되어 있다.
세포 외 기질 (extracellular matrix, ECM)로 구성된 생물학적 스케폴드가 외과적 매쉬 (surgical mesh) 재료로서 개발되었으며 및 다른 것들 중 (Badylak et al., Acta Biomater. 2009; 5(1):1-13), 배 벽 탈장 (ventral hernia) 수선 (Alicuban et al., Hernia. 2014;18(5):705-712), 근골격 재건설 (musculoskeletal reconstruction) (Mase et al., Orthopedics. 2010;33(7):511), 식도 재건설(esophageal reconstruction) (Badylak et al., Tissue Eng Part A. 2011; 17(11-12):1643-50), 경막 대체 (dura mater replacement) (Bejjani et al., J Neurosurg. 2007;106(6):1028-1033), 힘줄 수선 (tendon repair) (Longo et al., Stem Cells Int. 2012;2012:517165), 유방 재건설(breast reconstruction (Salzber, Ann Plast Surg. 2006;57(1):1-5)을 포함한 임상적 적용에 사용된다.
기질 결합 나노소포체 (Matrix bound nanovesicles, MBV)는 ECM의 미소섬유 네트워크 내에 박혀 있다. 이 나노입자들은 ECM 스케폴드 제조과정 동안에 이들의 화물 (cargo)이 분해 및 변성되는 것으로부터 보호한다.
반대로, 엑소좀 (exosomes) ((또는 세포 외 소포체(extracellular vesicle), "EV"))은 이전에 거의 전적으로 체액 및 세포 배양 상등액에서 동정 된 미세소포체 (microvesicles) 이다. MBV 및 엑소좀은 뚜렷이 다르다는 것이 알려졌다. MBV는 다른 소포체와는 다르다, 예를 들어, 이들은 세제 및/또는 효소 소화에 저항적이고, 특유한 지질 프로파일을 가지고 있고, 및 다른 마이크로 RNA (microRNAs) 클러스터를 함유한다. MBV는 엑소좀과 같은, 다른 소포체에서 발견되는 같은 특징적인 표면 단백질을 가지고 있지 않다.
여기서 공개된 대로, MBV는 예를 들어, 생물학적 기능을 유지 또는 회복하기 위하여, 전신적 면역 반응 (전신적 투여를 통한 것과 같은) 을 조절한다. 예를 들어, MBV의 투여는, 바이러스 감염과 관련된 ARDS와 같은, 예를 들어, 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS)인, 초 염증성 면역 반응을 조절하는 것과 같은, 면역 반응을 보전 또는 회복할 수 있다.
바이러스 감염과 관련된 ARDS 치료 (Treatment of ARDS Associated with Viral Infections)
어떤 실시 예에서, ARDS는 바이러스 감염과 관련된다. 어떤 실시 예에서, 바이러스는 레트로바이러스 (retrovirus) ((예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 (human immunodeficiency virus, HIV), 유인원 면역결핍 바이러스(simian immunodeficiency virus, SIV), 인간 T-세포 림프친화성 바이러스 (human T-cell lymphotropic virus, (HTLV)-1, HTLV-2, HTLV-3, HTLV-4)), 에볼라 바이러스 (Ebola virus), 간염 A 바이러스 (hepatitis A virus), 간염 B 바이러스(hepatitis B virus), 간염 C 바이러스 (hepatitis C virus)), 헤르페스 심플렉스 바이러스, (herpes simplex virus, HSV) ((예를 들어, HSV-1, HSV-2, 바리셀라 조스타 바이러스 (varicella zoster virus), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus)), 아데노바이러스 (adenovirus), 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus) ((예를 들어, 인플루엔자 바이러스 A (influenza virus A), 인플루엔자 바이러스 B (influenza virus B), 인플루엔자 바이러스 C (influenza virus C), 인플루엔자 바이러스 D (influenza virus D), 토고토바이러스 (thogotovirus)), 플라비바이러스 (flavivirus) ((예를 들어, 뎅기 바이러스(dengue virus), 지카 바이러스 (Zika virus)), 웨스트 나일 바이러스 (West Nile virus), 리프트 벨리 열 바이러스 (Rift Valley fever virus), 아레나바이러스 (arenavirus), 크리맨-콩고 출혈 열 바이러스 (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 에코바이러스 (echovirus), 리노바이러스 (rhinovirus), 콕사키 바이러스 (coxsackie virus), 코로나바이러스(coronavirus) ((예를 들어, 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2), MERS, 또는 SARS-Cove)), 호흡기 세포 융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 멈프스 바이러스(mumps virus), 로타바이러스 (rotavirus), 홍역 바이러스(measles virus), 루벨라 바이러스 (rubella virus), 파보바이러스 (parvovirus) ((예를 들어, 아데노-관련된 바이러스, (adeno-associated virus)), 박시니아 바이러스 (vaccinia virus), 바리올라 바이러스 (variola virus), 몰러스컴 바이러스 (molluscum virus), 소 백혈병 바이러스 (bovine leukemia virus), 폴리오바이러스 (poliovirus), 래비스 바이러스 (rabies virus), 폴리오마 바이러스 (polyomavirus) ((예를 들어, JC 바이러스 (JC virus), BK 바이러스 (BK virus)), 알파바이러스 (alphavirus), 및 루비바이러스 (rubivirus) ((예를 들어, 루벨라 바이러스 (rubella virus))로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 바이러스는 코로나바이러스다. 어떤 실시 예에서, 바이러스 감염과 관련된 ARDS는 사이토카인과분비와 관련 있다. 한 실시 예에서, ARDS는 SARS-CoV-2에 기인한다. 다른 실시 예에서, ARDS 는 인플루엔자 바이러스에 기인한다. 어떤 실시 예에서, ARDS는 박테리아 감염에 기인한 패혈증과 관련된다.
어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 MBV는 바이러스 감염과 관련된 ARDS, 예를 들어, 후천성 면역결핍 증후군 (acquired immune deficiency syndrome, AIDS), HTLV-1 관련된 골수증 (myelopathy)/열대성 경련성 하반신 마비 (tropical spastic paraparesis), 에볼라 바이러스 질환 (Ebola virus disease), 간염 A (hepatitis A), 간염 B (hepatitis B), 간염 C (hepatitis C), 헤르페스(herpes), 헤르페스 조스터 (herpes zoster), 급성 베리셀라 (acute varicella), 단핵세포증 (mononucleosis), 호흡기 감염 (respiratory infections), 폐렴 (pneumonia), 인플루엔자 (influenza), 뎅기 열 (dengue fever), 뇌염 (encephalitis) ((예를 들어, 일본 뇌염(Japanese encephalitis)), 웨스트 나일 열 (West Nile fever), 리프트 벨리 열 (Rift Valley fever), 크리만-콩고 출혈성 열 (Crimean-Congo hemorrhagic fever), 카야사누어 숲 질환 (Kyasanur Forest disease), 황열 (Yellow fever), 지카 열 (Zika fever), 무균 뇌척수막염 (aseptic meningitis), SARS, 심근염 (myocarditis), 보통 감기 (common cold), 폐 감염 (lung infections), 전염성 연속정 (molloscum contagiosum), 지방성 소 백혈증 (enzootic bovine leucosis), 코로나바이러스 질환 2019 (coronavirus disease 2019, COVID-19), 볼거리 (mumps), 위장염 (gastroenteritis), 홍역 (measles), 루벨라 (rubella), 뺨을 때리는 병 (slapped-cheek disease), 천연두 (smallpox), 무사마귀 (warts) ((예를 들어, 생식기 무사마귀( genital warts)), 전염성 연속종(molluscum contagiosum), 소아미비(polio), 광견병 (rabies), 및 장미색 비강진 (pictorialism rosea)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 바이러스 감염과 관련된 ARDS, 를 치료하는데 사용된다. 어떤 실시 예에서, 바이러스 감염과 관련된 ARDS는 사이토카인과분비와 관련된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 MBV는 에볼라바이러스(ebolavirus)와 관련된 ARDS를 치료를 위하여 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 MBV는 인플루엔자 (influenza)와 관련된 ARDS를 치료를 위하여 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 MBV는 SARS 와 관련된 ARDS를 치료를 위하여 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 MB는 COVID-19와 관련된 ARDS를 치료를 위하여 사용된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 서술된 MBV는 바이러스 감염에 기인한 패열증과 관련된 ARDS를 치료를 위하여 사용된다.
어떤 실시 예에서, 감염과 관련된 바이러스는 RNA 바이러스다 (RNA로 구성된 유전체를 가진다). RNA 바이러스는 단일-가닥 RNA (ssRNA) 또는 이중-가닥 RNA(dsRNA) 일 수 있다. RNA 바이러스는, RNA 중합효소 (RNA polymerase) 가 교정하는 능력이 부족하기 때문에, DNA 바이러스에 비교하여 높은 돌연변이 비율을 가지고 있다 (Steinhauer DA, Holland JJ (1987). "Rapid evolution of RNA viruses". Annu. Rev. Microbiol. 41: 409-33 참조). 예시적인 RNA 바이러스에는, 제한 없이, 번야바이러스(bunyaviruses) ((예를 들어, 한타바이러스 (hantavirus)), 코로나바이러스 (coronaviruses) (예를 들어, MERS-CoV, SARS-CoV, SARS-CoV-2), 플라비바이러스(flaviviruses) ((예를 들어, 황열 바이러스 (yellow fever virus), 웨스트 나일 바이러스 (west nile virus), 뎅기 바이러스 (dengue virus), 간염 바이러스 (hepatitis viruses) ((예를 들어, 간염 A 바이러스 (hepatitis A virus), 간염 C 바이러스 (hepatitis C virus), 간염 E 바이러스 (hepatitis E virus)), 인플루엔자 바이러스 (influenza viruses) (예를 들어, 인플루엔자 바이러스 타입 A (influenza virus type A), 인플루엔자 바이러스 타입 B (influenza virus type B), 인플루엔자 바이러스 타입 C (influenza virus type C)), 홍역 바이러스(measles virus), 볼거리 바이러스 (mumps virus), 노로바이러스(noroviruses) ((예를 들어, 노르워크 바이러스 (Norwalk virus)), 폴리오바이러스 (poliovirus), 호흡기 세포 융합 바이러스 (respiratory syncytial virus) (RSV), 레트로바이러스(retroviruses) ((예를 들어, 인간면역결핍 바이러스-1 (human immunodeficiency virus-1, HIV-1)) 및 토로바이러스 (toroviruses) 가 포함된다. 어떤 실시 예에서, RNA 바이러스는 인플루엔자 바이러스 (influenza viruses), 예를 들어, 인플루엔자 A이다. 어떤 실시 예에서, RNA 바이러스는 RSV이다. 어떤 실시 예에서, RNA 바이러스는 MERS-CoV 이다. 어떤 실시 예에서, RNA 바이러스는 SARS-CoV 이다. 어떤 실시 예에서, RNA 바이러스는 SARS-CoV-2이다. 어떤 실시 예에서, RNA 바이러스는 SARS-CoV2 이다. 어떤 실시 예에서, RNA 바이러스는 지카(ZIKA)다.
RNA 바이러스는 유전체 타입에 따라 분류된다 (이중-가닥, 음성(-), 또는 양성(+) 단일-가닥). 이중-가닥 RNA 바이러스는, 각 하나 이상의 바이러스 단백질을 암호화하는, 많은 수의 RNA 분자를 함유한다. 양성-센스 ssRNA (positive-sense ssRNA) 바이러스는 이들의 유전체를 mRNA로서 직접 이용한다; 숙주 세포 내에 있는 리보좀은 mRNA를 단일 단백질로 번역하고 이는 그 후 수정되어 바이러스 복제에 필요한 다양한 단백질을 형성한다. 그러한 단백질의 하나는 RNA-의존 RNA 중합효소 (RNA-dependent RNA polymerase) ((RNA 복제 효소(RNA replicase)) 이고, 이는 이중-가닥, 복제 형태를 형성하기 위하여 바이러스 RNA를 복사한다. 음성-센스 ssRNA (negative-sense ssRNA) 바이러스는 RNA 복제 (RNA replicase) 효소가 이들의 유전체를 복사하도록 하여 복제를 위한 양성-센스 RNA를 생성한다. 그러므로 바이러스는 RNA 복제 (RNA replicase) 효소를 포함한다. 결과로 얻어진 양성-센스 RNA는 그 후 바이러스 mRNA로서 작용하고 및 숙주 리보좀에 의해 번역된다. 어떤 실시 예에서, 바이러스는 dsRNA이다. 어떤 실시 예에서, 바이러스는 음성 RNA 바이러스다. 어떤 실시 예에서, 바이러스는 양성 ssRNA 바이러스다. 어떤 실시 예에서, 양성ssRNA 바이러스는 코로나바이러스다.
SARS-CoV2는, 때로는 또한 2019 또는 2019-nCoV의 신규 코로나바이러스로도 불리는, 양성-센스 단일-가닥 RNA 바이러스다. SARS-CoV2는 S ((스파이크(spike)), E ((외피(envelope)), M ((막(membrane)), 및 N ((뉴클레오캡시드(nucleocapsid))으로 알려진, 네 가지 구조 단백질을 가지고 있다. N 단백질은 RNA 유전체를 붙잡고 있고; S, E, 및 M 단백질은 함께 바이러스 외피를 형성한다. 스파이크는 바이러스가, 인간 세포에 있는 ACE2 수용체와 같은, 숙주 세포의 막에 부착하도록 한다 ((Kruse R.L. (2020), Therapeutic strategies in an outbreak scenario to treat the novel coronavirus originating in Wuhan, China (version 2). F1000Research, 9:72)). SARS-CoV2는 매우 전염성이 높고, 코로나바이러스 질환 2019 (COVID-19)의 원인 바이러스 제제이고, 전 세계적인 대 유행병이다. 어떤 실시 예에서, 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome) 이 SARS-CoV2 (COVID-19)와 관련되어 있다. 어떤 실시 예에서, 치료되고 있는 ARDS는 SARS-CoV2 (COVID-19)와 관련되어 있다. 어떤 실시 예에서, 치료되고 있는 ARDS는 SARS-CoV2 (COVID-19)와 관련된 사이토카인과분비와 관련되어 있다.
어떤 실시 예에서, 감염과 관련된 바이러스는 DNA 바이러스이다 (DNA로 구성된 유전체를 가진다). 예시적인 DNA 바이러스에는, 제한 없이, 파보바이러스(parvoviruses) ((예를 들어, 아데노-관련된 바이러스 (adeno-associated viruses)), 아데노바이러스(adenoviruses), 아스파바이러스(asfarviruses), 헤르페스 바이러스(herpesviruses) ((예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스 1 및 2 (herpes simplex virus 1 and 2) (HSV-1 및 HSV-2), 엡스타인-바 바이러스(epstein-barr virus, EBV), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV)), 파필로마 바이러스 (papillomaviruses) (예를 들어, HPV), 폴리오마바이러스(polyomaviruses) (예를 들어, 유인원 액포형성 바이러스(simian vacuolating virus 40, SV40)), 및 폭스바이러스 (poxviruses) ((예를 들어, 박시니아 바이러스(vaccinia virus), 우두 바이러스(cowpox virus), 두창 바이러스(smallpox virus), 계두 바이러스(fowlpox virus), 양두 바이러스(sheeppox virus), 믹소마 바이러스(myxoma virus))가 포함된다. 어떤 특정 실시 예에서, DNA 바이러스는 아데노바이러스, 예를 들어, AdV5이다. 어떤 특정 실시 예에서, DNA 바이러스는 장내 바이러스 (enterovirus), 예를 들어, EV71이다. 어떤 특정 실시 예에서, DNA 바이러스는 헤르페스바이러스(herpesvirus), 예를 들어, HSV-1이다.
어떤 실시 예에서, 감염은 전신적이다. 어떤 실시 예에서, 감염은, 예를 들어, 기관에, 또는 예를 들어, 조직에 국소적이다. 어떤 실시 예에서, 감염은, 이것에만 국한하지 않으나, 눈, 귀, 내 귀(inner ear), 폐, 기도(trachea), 기관지 (bronchus), 소기관지(bronchioli), 간, 담낭(gall bladder), 담관 (bile duct), 신장, 방광, 고환, 자궁경관 (cervix), 난소 (ovary), 자궁(uterus), 피부, 또는 뇌를 포함하는 기관에 국소적이다. 어떤 특정 실시 예에서, 감염은 폐에 국소적이다.
다른 병리적 감염과 관련된 ARDS의 치료 (Treatment of ARDS Associated with Other Pathogenic Infections)
어떤 특정 실시 예에서, ARDS는 박테리아 감염과 관련된다. 어떤 특정 실시 예에서, ARDS는 클라미디아 (Chlamydia) (예를 들어, C. trachomatis), 대장균 (Escherichia coli) ((예를 들어, 장병원성 대장균 (enteropathogenic E. coli), 장출혈성 대장균 (enterohemmorhagic E. coli), 요로병원성 대장균 (uropathogenic E. coli), 장침입성 대장균(enteroinvasive E. coli)), 헬리코박터 피롤리 (Helicobacter pylori), 마이코박테리움 (Mycobacterium (예를 들어, M. tuberculosis, M. leprae, M. lepromatosis), 리스테리아 (Listeria) (예를 들어, L. monocytogenes), 쉬겔라 (Shigella) (예를 들어, S. flexneri), 포도상구균 (Staphylococcus) (예를 들어, S. aureus), 연쇄상구균 (Streptococcus) (예를 들어, S. pyogenes), 스트랩토마이세스 (Streptomyces), 뉴모코쿠스 (Pneumococcus), 메닌지오코쿠스 (Meningococcu)s, 고노코쿠스 (Gonococcus), 크랩시엘라 (Klebsiella) (예를 들어, K. pneumoniae), 프로테우스 (Proteus), 세라티아(Serratia), 슈도모나스 (Pseudomonas) (예를 들어, P. aeruginosa), 레지오넬라 (Legionella), 아시네토박터 (Acinetobacter) (예를 들어, A. baumannii), 코리네박테리움 (Corynebacterium) (예를 들어, C. diphtheria), 콕시엘라(Coxiella) (예를 들어, C. burnetii), 바실러스(Bacillus) (예를 들어, B. anthricis), 박테로이데스 (Bacteroides), 보르데텔라 (Bordetella), 엔테로코쿠스 (Enterococcus) (예를 들어, E. faecalis), 푸란시셀라 (Francisella) (예를 들어, F. tularensis), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza), 나이세리아 (Neisseria) (예를 들어, N. meningitides, N. gonorrhoeae), 리켓치아 (Rickettsia), 살모넬라(Salmonella) (예를 들어, S. typhimurium), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholera), 클로스트리디움 (Clostridium) (예를 들어, C. tetan, C. botulinum), 예르시니아(Yersinia) (예를 들어, Y. pestis), 보리엘리아 (Borrielia) (예를 들어, B. burgdorferi), 브루셀라 (Brucella), 버크홀데리아(Burkholderia), 캠피로바터 (Campylobacter), 및 마이코플라즈마 (Mycoplasma)로 구성하는 그룹으로부터 선택된 한 박테리아와 관련된다. 어떤 실시 예에서, 박테리아 감염과 관련된 ARDS는 사이토카인과분비와 관련된다. 어떤 실시 예에서, ARDS는 박테리아 감염이 원인이 되는 패혈증과 관련이 있다.
어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 MBV는 박테리아 감염과 관련된 ARDS, 예를 들어, 세포 내 박테리아 감염과 관련된 ARDS, 를 치료하는데 사용된다. 여기서 서술된 방법은, 예를 들어, 클라미디아 (chlamydia), 폐결핵 (tuberculosis), 위궤양 (peptic ulcers), 나병 (leprosy), 리스테리아병 (listeriosis), 타액선염 (sialadenitis), 박테리아-원인성 설사 (bacteria-caused diarrhea) 또는 음식물 중독(food poisoning), 패혈성 인두염 (strep throat), 성홍열(scarlet fever), 농가진 (impetigo), 세포 염 (cellulitis), 폐렴(pneumonia), 뇌막염(meningitis), 박테리아성 심장 내막염(bacterial endocarditis), 게실염(diverticulitis), 파종성 임균 혈증(disseminated gonococcemia), 화농성 관절염(septic arthritis), 임균성 신생아 안염 (gonococcal ophthalmia neonatorum), 요로감염증 (urinary tract infections), 연한 조직 감염 (soft tissue infections), 척추관절병 (spondyloarthropathies) ((예를 들어, 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis)), 레지오넬라증 (legionellosis) ((예를 들어, 재향군인병(Legionnaires' disease), 폰티악 열 (Pontiac fever)), 디프테리아 (diphtheria), 살모넬라증 (salmonellosis), 탄저병 (anthrax), 콜레라(cholera), 파상풍 (tetanus), 보툴리눔 식중독(botulism), 근막염 (fasciitis), 가스 괴저(gas gangrene), 플라크(plaque), 라임 병 (Lyme disease), 브루셀라병 (brucellosis), 멜리오이도시스 (melioidosis), 큐 열병 (Q fever), 야토병 (tularemia), 임질 (gonorrhea), 발진티푸스 (typhus), 마이코플라즈마 폐렴 (mycoplasma pneumonia), 위장염 (gastroenteritis), 및 워킹 폐렴 (walking pneumonia)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 박테리아성 질환 또는 장애와 관련된 ARDS를 치료하는데 사용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 박테리아 감염과 관련된 ARDS는 사이토카인과분비와 관련된다. 어떤 실시 예에서, MBV는 박테리아 감염이 원인이 되는 패혈증과 관련이 있는 ARDS를 치료하는데 사용된다.
어떤 실시 예에서, ARDS는 곰팡이 감염과 관련된다. 어떤 특정 실시 예에서, ARDS는 곰팡이 감염과 관련되고 여기서 곰팡이는 캔디다 (Candida) (예를 들어, C. albicans, C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis), 크립토코쿠스(Cryptococcus) (예를 들어, C. neoformans, C. gattii), 아스페르길루스(Aspergillus) (예를 들어, A. fumigatus, A. niger), 무코랄레스 (Mucorales) (예를 들어, M. mucor, M. absidia, M. rhizopus), 스포로트릭스 (Sporothrix) (예를 들어, S. schenkii), 블라스토마이세스 (Blastomyces) (예를 들어, B. dermatitidis), 파라콕시디오이데스 (Paracoccidioides) (예를 들어, P. brasiliensis), 콕시디오이데스(Coccidioides) (예를 들어, C. immitis), 히스토플라스마 (Histoplasma) (예를 들어, H. capsulatum), 아크레모니움 (Acremonium), 바시디오볼러스(Basidiobolus) (예를 들어, B. ranarum), 클라도피알로포라 (Cladophialophora) (예를 들어, C. bantiana), 커닝하멜라 (Cunninghamella) (예를 들어, C. bertholletiae), 에피데르모파이톤(Epidermophyton), 엑소피알라 (Exophiala), 엑세로힐룸 (Exserohilum), 폰세카에아 (Fonsecaea) (예를 들어, F. pedrosoi), 호르타에아 (Hortaea) (예를 들어, H. werneckii), 라카지아 (Lacazia) (예를 들어, L. loboi), 렙토스파에리아 (Leptosphaeria) (예를 들어, L. maculans), 마두렐라(Madurella) (예를 들어, M. mycetomatis), 말라세지아 (Malassezia), 마이크로스포룸 (Microsporum), 무코아 (Mucor), 네오테스투디나 (Neotestudina), 오니초콜라(Onychocola), 피알로포라 (Phialophora), 피드라이아 (Piedraia), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) (예를 들어, P. jirovecii), 슈달레쉐리아 (Pseudallescheria) (예를들어, P. boydii), 피레노카에타 (Pyrenochaeta), 리쪼무코아 (Rhizomucor), 세도스포리움 (Scedosporium), 시틸리디움 (Scytalidium), 스포로트릭스 (Sporothrix), 트리초파이톤 (Trichophyton), 트리초스포론 (Trichosporon), 및 지고마이세테 (Zygomycete)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 곰팡이 감염과 관련된 ARDS는 사이토카인고분비와 관련된다.
어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 MBV는 세포 내 곰팡이 감염과 관련된 ARDS를 치료하는데 사용된다, 예를 들어, 칸디다증 (candidiasis), 효모균증 (cryptococcosis), 아스페르길루스증 (aspergillosis), 털곰팡이증 (mucormycosis), 스포로트리쿰증 (sporotrichosis), 분아진균증 (blastomycosis), 파라콕시디오이데스진균증 (paracoccidioidomycosis), 콕시디외데스진균증 (coccidioidomycosis), 히스토플라즈마증 (histoplasmosis), 진균종 (eumycetoma), 손발톱진균병(onychomycosis), 하이알로하이포진균증(hyalohyphomycosis), 피하 접합균증 (subcutaneous zygomycosis), 뇌 농양 (cerebral abscesses), 식균증(phaeohyphomycosis), 채모균증 (chromoblastomycosis), 균종(mycetoma), 폐 털곰팡이증 (pulmonary mucormycosis), 몸 백선증 (tinea corporis), 두부 백선 (tinea capitis), 고부 백선 (tinea cruris), 발 백선증 (tinea pedis), 손톱 백선(tinea unguium), 흑색 백선증 (tinea nigra), 로보 병 (Lobo's disease), 흑각병 (blackleg disease), 균종(mycetoma), 전풍 (pityriasis versicolor), 말라세지아 모낭염 (malassezia folliculitis), 스테로이드 여드름(steroid acne), 지루성 피부염 (seborrhoeic dermatitis), 신생아 두부 농포증 (neonatal cephalic pustulosis), 털곰팡이증 (mucormycosis), 마두라진균증(maduromycosis), 흑색털결절진균증 (black piedra), 뉴모시스티스 폐렴 (pneumocystis pneumonia), 슈달레세리아증 (pseudallescheriasis), 시도스포리오시스 (scedosporiosis), 스포로트리쿰증 (sporotrichosis), 및 접합근종증 (zygomycosis)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포 내 곰팡이 감염과 관련된 ARDS. 어떤 실시 예에서, 곰팡이 감염과 관련된 ARDS는 사이토카인과분비와 관련된다. 어떤 실시 예에서, ARDS는 곰팡이 감염이 원인이 되는 패혈증과 관련이 있다.
어떤 특정 실시 예에서, ARDS는 세포 내 원생동물 감염과 관련이 있다. 어떤 실시 예에서, 원생동물은 아메바 (amoeba)이다. 어떤 특정 실시 예에서, 아메바는 아피코플렉산즈 (Apicomplexans) 플라스모디움 (Plasmodium) (예를 들어, P. vivax, P. falciparum, P. ovale, P. malariae, Toxoplasma gondii, Cryptosporidium parvum, Babesia microti, Cyclospora cayetanensis, Cystoisospora belli)), 트리파노조마 (Trypanosoma) (예를 들어, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi), 및 레쉬마니아(Leishmania) (예를 들어, Leishmania donovani) 로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 어떤 실시 예에서, 원생동물 감염과 관련된 ARDS는 사이토카인과분비와 연관이 있다.
어떤 특정 실시 예에서, 여기서 서술된 MBV는 세포 내 아메바 감염에 의해 원인이 되는 질환 또는 장애를, 예를 들어, 바베스아증(babesiosis), 말라리아(malaria), 크립토스포리듐증 (cryptosporidiosis), 원포자충증 (cyclosporiasis), 시스토이소스포리아증 (cystoisosporiasis), 톡소플라즈마증 (toxoplasmosis), 트리파노소마증 (trypanosomiasis), 사가스 병(Chagas disease), 및 레쉬마니아증 (leishmaniasis)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아메바 감염과 관련된 ARDS를 치료하는데 사용된다. 어떤 실시 예에서, 아메바 감염과 관련된 ARDS는 사이토카인과분비와 관련이 있다.
사이토카인 방출 에세이 Assays for Cytokine Release
케모카인 (chemokine) 과 같은, 사이토카인의 발현은 여기서 공개된 방법에서 평가될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 이 분야 기술에서 케모카인으로써 알려진 전-염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines)이 연구 된다. 케모카인의 예에는, 제한 없이, CXCL8, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, 및 CXCL10을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 사이토카인 방출은 시험관 내 (in vitro), 예를 들어, 세포 배양에서 연구된다. 어떤 특정 실시 예에서, 시험관 내 사이토카인 방출은 세포 배양 상등액으로부터 정량된다. 어떤 실시 예에서, 사이토카인 방출은 생체 내 (in vivo), 예를 들어, 동물 모델에서 연구된다. 어떤 특정 실시 예에서, 생체 내 사이토카인 방출은 체액, 예를 들어, 전 혈, 혈청, 혈장, 또는 림프액으로부터 정량 다. 어떤 특정 실시 예에서, 동물 모델은 쥐 모델이다. 어떤 특정 실시 예에서, 동물 모델은 비-인간 영장류이다. 어떤 특정 실시 예에서, 사이토카인 방출은 인간 환자에서 연구된다.
어떤 실시 예에서, 사이토카인 방출은 사이토카인 발현 수준의 정량을 통해 평가된다. 어떤 실시 예에서, 사이토카인 발현 수준은 효소-결합 면역 흡착 측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 사용하여 정량된다. 어떤 실시 예에서, 사이토카인 발현 수준은 다중 면역측정법(multiplex immunoassay), 예를 들어, 루미넥스 (Luminex), 를 사용하여 정량된다. 어떤 실시 예에서, 사이토카인 발현 수준은 사이토카인 어레이 (cytokine array)를 사용하여 정량된다. 어떤 실시 예에서, 사이토카인 발현 수준은 웨스턴 블럿 (Western Blot)을 사용하여 정량된다. 어떤 실시 예에서, 사이토카인 발현 수준은 질량 분석법 (mass spectrometry) 을 사용하여 정량된다.
어떤 실시 예에서, 사이토카인 방출은 면역 시스템에서의 변화를 모니터하여 에세이 된다. 면역 시스템을 연구하는 방법은 이 분야 기술에서 알려졌으며, 및 제한 없이: 형광 활성화된 세포 분류 (fluorescence activated cell sorting (FACS), 전사체 프로파일링 (transcriptomic profiling) ((예를 들어, RNA-서열분석 (RNA Seq)), 혈액 도말(blood smears), 완전 혈구 측정 (complete blood count), 및 헤마토크리트(hematocrit)를 포함한다.
어떤 특정 실시 예에서, 열, 폐렴, 숨가쁨 (shortness of breath), 및 낮은 혈액 산소 수준 (low blood oxygen levels)과 같은 질환 또는 장애의 증상은 면역 시스템의 변화를 제시한다. 어떤 특정 실시 예에서, 열, 폐렴, 숨가쁨, 및 낮은 혈액 산소 수준과 같은 질환 또는 장애 증상의 감소는, 즉 여기서 공개된 대로 MBV 치료법으로 치료 후에 증상의 감소는, 면역 시스템의 변화를 제시한다.
급성 호흡 곤란 증후군의 치료 (Treatment of Acute Respiratory Distress Syndrome)
본 발명은 또한 여기서 서술된 MBV로 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS)을 치료하는 방법을 제공한다.
급성 호흡 곤란 증후군은 불량한 혈액 산소화 (poor blood oxygenation), 폐로의 액체 침투 (fluid infiltration into the lungs), 및 발병의 예리함 (acuity of onset)의 특징이 있는 장애다 ((Diamond et al. (2020). Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS). StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing)). ARDS 발병은 보통 원인 사건 7일 이내에 일어난다. ARDS는 환자의 동맥혈에서의 산소 수준 (arterial blood, PaO2) 대비 불어 넣은 공기에 있는 산소 (inspired air, FiO2)의 비율로 임상적으로 정의한다. ARDS는 PaO2/FiO2 비율이 300 미만을 보이는 환자로 정의한다. ARDS는 높은 이병률 (morbidity)및 높은 치사율 (mortality)을 가진다. 임상적 ARDS는 추가로, 예를 들어, 팬 등 ((Fan et al. (2018). Acute Respiratory Distress Syndrome: Advances in Diagnosis and Treatment. JAMA. 319 (7): 698-710)) 에서 서술된다.
ARDS의 위험 인자에는, 제한 없이, 감염성 질환 또는 장애 (예를 들어, 바이러스 감염, 예를 들어, 박테리아 감염), 이식-대비- 숙주 질환 (graft-versus-host disease), 대량 수혈 (massive blood transfusion), 기관 외상 (organ trauma), 조직 외상 (tissue trauma) ((예를 들어, 심각한 화상(severe burn)), 만성 알코올중독(chronic alcoholism), 혈구탐식성림프조직구증식증 (hemophagocytic lymphohistiocytosis), 패혈증(sepsis), 전신적 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome), 물에 빠짐(drowning) ((예를 들어, 물 흡입( aspiration of water)), 약물 과량복용 (drug overdose) ((예를 들어, 구토물 흡입 (aspiration of vomit)), 음식물 흡입 (aspiration of food), 지방 색전증 (fat embolism), 유독 가스의 흡입 (inhalation of toxic fumes) (예를 들어, 연기 또는 화학물질 가스), 및 췌장염 (pancreatitis)이 포함 된다. "베이핑(vaping)"으로 알려진 전자-담배 (e-cigarettes)를 피우는 것 또한 ARDS를 전개하는 위험 인자로 결정되었다. 어떤 특정 실시 예에서, 개체는 호흡을 조절하는 뇌의 일부분에 손상을 주는 머리 상처가 있다. 어떤 특정 실시 예에서, 개체는 폐에 손상을 주는 흉부 상처가 있다. 어떤 실시 예에서, ARDS의 위험 인자는 감염성 질환 또는 장애, 예를 들어, 바이러스, 예를 들어, 코로나바이러스, 예를 들어, SARS-CoV2이다. 어떤 실시 예에서, ARDS의 위험 인자는 감염성 질환 또는 장애, 예를 들어, 바이러스, 예를 들어, 에볼라바이러스 (ebolavirus) 이다. 어떤 실시 예에서, ARDS의 위험 인자는 감염성 질환 또는 장애, 예를 들어, 박테리아, 예를 들어, 스트랩토콕커스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae)이다. 어떤 실시 예에서, ARDS는 사이토카인과분비와 관련된다. 특별한 실시 예에서, ARDS는 SARS-Cov2 (COVID-19)와 관련된 사이토카인과분비와 관련된다. 어떤 실시 예에서, ARDS는 SARS-Cov2 (COVID-19)와 관련된 치사율과 관련된다. 이들 개체 누구도 여기서 공개되는 방법으로 치료를 위하여 선택될 수 있다.
ARDS를 가진 환자의 기존 치료법에는, 제한 없이, 회로 부분 감소 (reducing shunt fraction), 산소 전달 증가, 산소 소비 감소, 및 조직 및 기관에 영향을 주는 추가의 상해를 피하는 것을 포함하는, 지원 적 및/또는 고통완화 적 치료를 포함한다. 어떤 실시 예에서, ARDS를 가진 환자는 기계적인 산소호흡기에 놓인다. 어떤 특정 실시 예에서, 기계적인 산소호흡기에 놓인 환자는 여기서 서술된 대로, MBV가 투여된다. 어떤 특정 실시 예에서, 기계적인 산소호흡기에 놓인 환자는 여기서 서술된 대로, MBV가 정맥주사로 투여된다. 어떤 특정 실시 예에서, 만약 환자가 ARDS 의 위험에 놓이면 ARDS 발병 전에 MBV 투여를 받는다.
본 발명은 바이러스 감염으로 촉발된 질환 또는 장애와 같은, 면역 시스템의 병리학적인 조절장애가 특징인 질환 또는 장애로부터 고통을 받는 환자에게 투여될 때 MBV는 면역 시스템을 조절하는 능력을 갖추고 있다는 발견에 기반을 둔다. 특히, 전신적으로 투여된 MBV는 영향을 받은 조직에 MBV의 국소적 투여로부터 달성된 치료적 효과와 부합하는 염증 장애의 증상을 치료하는데 치료적 효과를 갖는 것이 발견되었다. 더욱이, MBV가 면역 시스템을 억제하기보다는 면역 시스템을 조절하므로, MBV 투여의 치료적 효과는 면역 억제와 더불어 자주 관찰되는 2차 감염의 위험을 제시하지 않는다. 따라서, 이는 MBV를 염증성 질환, 예를 들어, 급성 호흡 곤란 증후군, 의 독특한 전신적 치료법으로서 위치하게 한다. 전통적인 항-염증 또는 면역 억제적 약물과는 반대로 MBV로 치료된 환자는, 본 발명의 방법이 자연 면역 시스템을 억제하지 않고, 질환과 싸워 없애는 기능을 하도록 놓아두고 및 2차 감염을 예방하기 때문에, 감염에 따른 2차 감염이 발병될 위험의 감소를 경험할 수 있다. 예를 들어, COVID-19 유도된 ARDS로부터 고통을 받는 환자는 ARDS를 치료하기 위하여 전통적인 항-염증 또는 면역 억제제 약물을 투여받는 비슷한 경우의 환자와 비교하여 ARDS를 치료하기 위하여 MBV가 투여되었을 때 2차 감염이 발병될 위험의 감소를 경험한다.
하기의 실시 예시 2에서 서술된 대로, 예시적인 염증 질환으로서 류머티스성 관절염 쥐 모델에서, MBV를 꼬리 정맥주사로 전신적으로 또는 관절주위로 국소적 주사로 투여된 쥐에서 관절염 스코어는 류머티스성 관절염 치료의 최적 표준인, 관절 주위 메토트렉세이트 (methotrexate)를 투여받은 쥐의 관절염 스코어에 비교될 만큼 개선되었다. 놀랍게도, 관절염 스코어 개선은 전신적 주사 또는 국소적 주사를 받은 쥐 사이에 비교될 만하였다. 실시 예시 10-13은 추가로 MBV의 전신적 투여는 인플루엔자 감염 동물 모델에서 급성 바이러스-중개하는 폐 병리 및 장-기간 염증의 완화를 증명한다.
따라서, MBV의 전신적 투여는, 신체의 한 부분에 국한하지 않거나 또는 국소적 치료로 처리할 수 없는 비정상적인 면역 반응, 예를 들어, ARDS, 의 결과로부터 오는 장애를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. ARDS 같은, 면역 과도활성의 경우, 기저 원인이 (예를 들어, 사이토카인 과분비) 순환에 존재하며, 및 그러므로, 전신적인 장애이다. 그러므로, 어떤 실시 예에서, 전신적 치료법은 신체 전체를 통한 면역 반응을 조절하는 효과적인 기전을 제공한다.
어떤 실시 예에서, 투여는 전신적일 수 있다. 전신적 투여는 정맥 내 투여, 경구 투여, 장 투여 (enteral administration), 비 경구 투여 (parenteral administration), 비강 내 투여(intranasal administration), 기관 내 투여 (intratracheal administration), 직장 내 투여 (rectal administration), 설하 투여 (sublingual administration), 구강 투여 (buccal administration), 입술 밑 투여 (sublabial administration), 복강 내 투여 (intraperitoneal administration), 또는 근육 내 투여 (intramuscular administration)가 될 수 있다. 특별한 비-제한적인 실시 예시에서, 전신적인 투여는 정맥 내 투여이다. 어떤 특정한 실시 예에서, 투여는, 폐로와 같은, 국소적이다. 예를 들어, 국소적 투여는 흡입 또는 기관 내이다. 예를 들어, 투여는 분무로 흡입 적이거나, 또는 비강 내 투여를 통한 흡입이다.
어떤 실시 예에서, MBV 투여는 개체의 폐에서 CD45+ 호중구 수의 감소의 결과가 된다. 다른 실시 예에서, MBV 투여는 개체의 폐에서 CD8+ T 세포 수의 증가 및 CD4+ T 세포 수의 감소의 결과가 된다. 다른 실시 예에서, MBV 투여는 개체의 지라에서 CD8+ T 세포 수의 증가 및 CD4+ T 세포 수의 감소의 결과가 된다. 추가의 실시 예에서, 투여는 개체의 지라에서 CD69+CD4+ T 세포 수의 증가의 결과가 된다. 또 다른 실시 예에서, 투여는 개체의 림프 결절에서 항-바이러스성 Tbet+ CD4+ T 세포 수의 증가의 결과가 된다. 또 다른 실시 예에서, 투여는 개체의 지라에서 항-바이러스성 Tbet+ CD8+ T 세포 수의 증가의 결과가 된다. 추가의 실시 예에서, 투여는 개체의 지라에서 항-바이러스성 CD69+ CD8+ T 세포 수의 증가의 결과가 된다. 좀 더의 실시 예에서, 투여는 개체의 폐에서 면역조절적인 CD11b+ 수지상 세포 (dendritic cells) 수의 증가의 결과가 된다. 어떤 실시 예에서, 투여는 개체의 폐에서 CD62L+/CD44+ 기억 CD4 및 CD8 T-세포 수의 증가의 결과가 된다. 투여는 개체에서 이들의 효과 하나 이상의 결과가 될 수 있다. 증가는 MBV 투여 전에 개체에서의 계수와 비교하거나 또는 표준 값에 비교하여 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초과하여 증가 될 수 있다. 감소는 MBV 투여 전에 개체에서의 계수와 비교하거나, 또는 표준 값과 비교하여 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초과하여 감소 될 수 있다.
좀 더의 실시 예에서, 투여는 개체에서 바이러스-관련된 조직 손상을 감소시킨다. 예를 들어, 투여는 개체에서 폐의 손상을 감소시키는 결과가 될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 바이러스-관련된 조직 손상은 MBV 투여 전의 개체의 조직과 비교하여 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초과하여 감소 된다.
세포 외 기질 (Extracellular Matrix, ECM)로부터 유래한 나노소포체
ECM으로부터 유래된 나노소포체 (nanovesicle) ((기질 결합 나노소포체 matrix bound nanovesicles), "MBV" 라고도 불린다))는 일반적으로, 여기 참고 문헌으로 병합된 PCT 발행서 번호 (Publication No.)WO 2017/151862, WO　2018/204848, 및 WO 2019/213482에 서술되어 있다. MBV는 세포 외 기질에 박혀 있다는 것이 공개된다. 이들 MBV는 분리될 수 있으며 및 생물학적으로 활성적이다. 어떤 실시 예에서, MBV는 알카라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase), 오스테오폰틴 (osteopontin), 오스테오프로게테린 (osteoprogeterin), 보완체 C5 (complement C5), 및/또는 c-반응성 단백질 (c-reactive protein)을 포함하지 않는다. 이들 MBV는 단독으로 또는 ECM과 함께, 치료적 목적으로 사용될 수 있다.
세포 외 기질 (extracellular matrix) 은, 이것에만 제한적이지 않으나, 구조적 단백질, 특화된 단백질, 프로테오글라이칸 (proteoglycans), 글리코사미노글라이칸 (glycosaminoglycans), 및 포유동물 조직 내에 세포를 둘러싸고 및 지지하는 성장 인자를 포함하는 구조적 및 기능적 생물분자 및/또는 생물 거대분자의 혼합물 복합체이고, 및 달리 제시되지 않는 한, 무세포적이다. 일반적으로, 공개되는 MBV는 어느 타입의 세포 외 기질 (ECM)에 박혀 있으며, 및 이 부위로부터 단리될 수 있다. 그러므로, MBV는 ECM 표면에서 검출될 만큼 존재하지 않으며, 및 엑소좀 (exosomes) ((또한 세포외 소포체 (extracellular vesicles) 또는 EV))은 아니다.
세포 외 기질 (extracellular matrices)은, 예를 들고 및 제한 없이, 미국 특허번호 4,902,508; 4,956,178; 5,281,422; 5,352,463; 5,372,821; 5,554,389; 5,573,784; 5,645,860; 5,771,969; 5,753,267; 5,762,966; 5,866,414; 6,099,567; 6,485,723; 6,576,265; 6,579,538; 6,696,270; 6,783,776; 6,793,939; 6,849,273; 6,852,339; 6,861,074; 6,887,495; 6,890,562; 6,890,563; 6,890,564; 및 6,893,666에 공개되어 있다; 각각은 그 전문이 여기에 참고 문헌으로 병합되어 있다. ECM은 어느 조직으로부터, 또는 ECM이 세포 배양에 의해 생산되는 시험관 내 어느 소스로부터 생산될 수 있으며 및 자연적인 ECM의 하나 이상의 중합체 성분 (구성 성분)을 포함한다. ECM 제제는 세포가 소스 조직 또는 배양으로부터 제거되었음을 의미하는, "탈세포화된 (decellularized)" 또는 "무세포화 (acellular)" 로 간주 될 수 있다.
어떤 실시 예에서, ECM은 척추동물, 예를 들어, 이것에만 국한하지 않으나, 인간, 원숭이, 돼지, 소, 양, 등을 포함하는 포유류 척추동물로부터, 단리 된다. ECM은 이것에만 국한하지 않으나 방광 (urinary bladder), 장 (intestine) (소장 및 대장과 같은), 심장, 피부 (dermis), 간, 신장, 자궁, 뇌, 혈관, 폐, 뼈, 근육, 췌장, 태반, 위, 지라, 결장(colon), 지방조직, 또는 식도(esophagus )를 포함하는 어느 기관 또는 조직으로부터 유래할 수 있다. 어떤 실시 예에서, 뼈를 제외한 어느 조직으로부터 유래할 수 있다. 특정한 비-제한적인 실시 예시에서, 세포 외 기질은 식도 조직(esophageal tissue), 방광 ((방광 기질 (urinary bladder matrix) 또는 방광 점막하 (urinary bladder submucosa)와 같은)), 소장 점막하 (small intestinal submucosa), 피부, 탯줄 (umbilical cord), 심낭 (pericardium), 심장 조직 (cardiac tissue), 또는 골격 근 (skeletal muscle)으로부터 단리 된다. ECM, 예를 들고 및 제한 없이, 점막하 (submucosa), 상피 기저 막 (epithelial basement membrane), 기저 막 (tunica propria), 등을 포함하는 기관으로부터의 어느 부분 또는 조직을 포함할 수 있다. 한 비-제한적인 실시 예에서, ECM은 방광으로부터 단리된 다. 어떤 실시 예에서, ECM은 인간 개체로부터 이다. 다른 실시 예에서, ECM은 돼지 개체로부터이다.
ECM은 기저 막을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 다른 비-제한적인 실시 예에서, ECM은 적어도 기적 막의 한 부분을 포함한다. ECM 재료는 모세관 내피세포 또는 섬유 세포와 같은 본래의 조직을 포함하는 세포 요소 일부분을 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 어떤 실시 예에서, ECM은 기저 막 표면 및 비-기저 막 표면 둘 다를 함유한다.
어떤 실시 예에서, ECM은 돼지 방광 ((또한 방광 기질 (urinary bladder matrix) 또는 UBM 이라고도 알려진))으로부터 수확된다. 간략하게, ECM은 돼지와 같은, 포유류로부터 방광 조직을 제거하고 및 지방 조직을 포함한, 잔여 외부 결합조직을 다듬어 제조한다. 모든 잔여 소변은 수돗물로 반복적으로 세척하여 제거한다. 조직은 탈-상피화 용액, 예를 들고 및 제한 없이, 고장 식염수 (hypertonic saline) (예를 들어, 1.0 N 생리 식염수)에, 조직을 먼저 10분에서 4시간 범위의 기간 동안 담가서 탈라미네이트(delaminate) 시킨다. 고장 식염수에의 노출은 밑에 있는 기저 막으로부터 상피 세포를 제거한다. 선택적으로, 칼슘 킬레이팅 제제가 생리 식염수 용액에 첨가될 수 있다. 초기 탈라미네이트 과정 후에 남은 조직에는 상피 기저 막 (epithelial basement membrane) 및 상피 기저 막에의 기저 옆쪽에 있는 조직층이 포함된다. 상대적으로 연약한 상피 기저 막은 언제나 손상되며 및 루미날 표면에 어느 기계적 마찰에 의해 제거된다. 이 조직은 그 다음에 대부분의 기저 옆쪽 조직은 제거되나 상피 기저 막 및 기저 막 (tunica propria)은 유지되는 추가의 처리가 되도록 한다. 외 측 장막 (outer serosal), 외막 (adventitial), 근육층 점막 (tunica muscularis mucosa), 점막 하층 (tunica submucosa) 및 대부분의 점막 근 층 (muscularis mucosa)은 기계적 마모에 의해 또는 효소 처리 ((예를 들어, 트립신 (trypsin) 또는 콜라게나아제 (collagenase)를 사용하여))에 이어서 수화 (hydration) 및 마모 (abrason)의 조합에 의해 남아있는 탈상피화된 조직으로부터 제거된다. 이들 조직의 기계적 제거는 장간막 조직 (mesenteric tissues)을, 예를 들고 및 제한 없이, 에디슨-브라운 겸자 (Adson-Brown forceps) 및 메트젠바움 가위 (Metzenbaum scissors)로 제거하고 및 수술용 칼 (scalpel)의 손잡이 또는 물기 있는 거즈 (moistened gauze)에 싼 다른 거친 물체로 세로로 닦는 동작을 사용하여 점막 근 층 (tunica muscularis) 및 점막 하층 (tunica submucosa)을 닦아내어 성취될 수 있다. 절단 칼날, 레이저, 및 다른 세포 분리 방법이 관련되는 자동화된 로봇 식 과정도 또한 고려된다. 이들 조직이 제거된 후에, 결과로 얻어진 ECM은 주로 상피 기저 막(epithelial basement membrane) 및 기저막 아래 (subjacent tunica propria) 로 구성된다.
다른 실시 예에서, ECM은 장막 (tunica serosa) 및 막 근 층 (tunica muscularis) 둘 다를 포함하는 외부 층을 제거하기 위하여 수술용 칼 손잡이 및 물기 있는 거즈로 세로로 닦는 동작을 사용하여 돼지 방광 조직을 마모하여 제조한다. 조직 단편을 밖으로 뒤집은 후에, 점막 층 (tunica mucosa)의 루미날 부분은 같은 닦는 동작을 사용하여 밑에 놓여 있는 조직으로부터 탈라미네이트 (delaminated) 된다. 점막 하층의 천공을 예방하기 위하여 조심한다. 이 조직이 제거된 후에, 결과로 얻어진 ECM은 주로 점막 하층 (tunica submucosa)으로 구성된다 (여기 참고 문헌으로 병합된, 도 2의 미국 특허 번호 9,277,999 참조).
ECM은 또한 분말로서 제조될 수 있다. 그러한 분말은, 여기 그 전문이 참고문헌으로 병합된, 길버트 등 ((Gilbert et al., Biomaterials 26 (2005) 1431-1435))의 방법에 따라 만들어질 수 있다. 예를 들어, UBM 시트 (UBM sheet)는 냉동 건조될 수 있으며 및 그 후 액체 질소에 담그기 위하여 작은 시트로 쪼개질 수 있다. 순간 얼린 재료는 곱게 빻아 질 수 있어 분자가 회전 칼 분쇄기 (rotary knife mill) 에 넣기에 충분히 작게 될 수 있으며, 여기서 ECM은 분말이 된다. 비슷하게, ECM 조직 내에 있는 NaCl을 침전시킴으로써 재료는 균질한 크기의 입자로 분열될 것이고, 이는 순간 동결시키고, 동결 건조, 및 분말화 될 수 있다.
한 비-제한적인 실시 예에서, ECM은 소장 점막하 또는 SIS로부터 유래한다. 상업적으로 구할 수 있는 제제에는, 이것에만 국한하지 않으나, SURGISISTM, SURGISIS-ESTM, STRATASISTM 및 STRATASIS-ESTM (Cook Urological Inc.; Indianapolis, Ind.) 및 GRAFTPATCHTM (Organogenesis Inc.; Canton Mass.)가 포함된다. 다른 비-제한적인 실시 예에서, ECM은 피부로부터 유래한다. 상업적으로 구 할 수 있는 제제에는, 이것에만 국한하지 않으나, PELVICOLTM (유럽에서는 PERMACOLTM로서 팔린다; Bard, Covington, Ga.), REPLIFORMTM (Microvasive; Boston, Mass.) 및 ALLODERMTM (LifeCell; Branchburg, N.J.)가 포함된다.
MBV는 하기에 공개된 방법을 사용하여 세포 외 기질 (extracellular matrix) 로부터 유래 (방출) 될 수 있다. 어떤 실시 예에서, ECM 은 펩신 (pepsin), 콜라게나아제 (collagenase), 엘라스타아제(elastase), 할우로니다아제 (hyaluronidase), 또는 프로테이나제 K (proteinase K), 와 같은 효소로 소화되고, 및 MBV는 단리된 다. 다른 실시 예에서, MBV는 글라이신 HCl (glycine HCL), 시트릭 에시드 (citric acid), 암모늄 하이드록사이드 (ammonium hydroxide)와 같은 용액으로 pH를 변경하고, 이것에만 국한하지 않으나, EDTA, EGTA와 같은 킬레이팅 제제의 사용으로, 이것에만 국한하지 않으나, 포타슘 클로라이드 (potassium chloride, KCl), 소듐 클로라이드(sodium chloride), 마그네슘 클로라이드(magnesium chloride), 소듐 아이오다이드(sodium iodide), 소듐 티오시아네이트 (sodium thiocyanate)와 같은 염의 사용으로 이온 강도 및/또는 카오트로픽 효과 (chaotropic effects)에 의해, 또는 ECM을 구아니딘 HCl (guanidine HCl) 또는 요소(Urea)와 같은 변성 컨디션에 노출시켜 ECM으로부터 방출 및 분리시킨다.
특별한 실시 예에서, MBV는 ECM을 펩신(pepsin), 엘라스타아제 (elastase), 할우로니다아제(hyaluronidase), 프로테이나제 K (proteinase K), 염 용액 (salt solutions), 또는 콜라게나아제 (collagenase)와 같은 효소로 소화시킨 후 제조된다. ECM은 냉동-해동되거나, 또는 기계적인 분해가 되도록 할 수 있다.
어떤 실시 예에서, CD63, CD81, 및/또는 CD9의 발현은 MBV에서는 검출될 수 없다. 그러므로, 어떤 실시 예에서, MBV는 CD63 및/또는 CD81 및/또는 CD9를 발현하지 않는다. 한 특정한 실시 예시에서, CD63, CD81, 및 CD9는 나노소포체에서 검출될 수 없다. 다른 실시 예에서, MBV는, 웨스턴 블럿 (Western blot)에 의해 검출될 만할 정도로, CD63, CD81, 및 CD9은 거의 검출되지 않는 수준을 가진다. 이들 MBV는 CD63loCD81loCD9lo이다. 다른 실시 예에서, MBV는 검출될 만한 수준의 CD63, CD81, 또는 CD9의 하나 또는 그 이상을 발현하지 않는다. 다른 실시 예에서, MBV는 거의 검출되지 않는 수준의 CD63, CD81, 또는 CD9 중 하나 또는 그 이상을 발현한다. 이 분야 기술의 전문가는, 예를 들어, CD63, CD81, 및 CD9에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여, CD63lo 및/또는 CD81lo 및/또는 CD9lo인 MBV를 쉽게 동정할 수 있다. CD63, CD81, 및 CD9의 낮은 및 높은 양의 기준치 (threshold)를 결정하기 위하여 형광 활성화된 세포 분류 (fluorescent activated cell sorting, FACS) 및 형광적으로 라벨 된 항체와 같은 공정을 사용하여 이들 마커들의 낮은 수준은 결정될 수 있다. 추가의 실시 예에서, MBV는 검출될 만한 수준의 알카라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase), 오스테오폰틴 (osteopontin), 오스테오프로게테린(osteoprogeterin), 보체 C5 (complement C5), 및/또는 c-반응성 단백질 (c-reactive protein)을 함유하지 않는다. 생체 내 MBV는 ECM에 결합 되어 있고 및 생체 액에서 발견되지 않기 때문에, 공개되는 MBV는, 생체 액에서 존재하기 때문에 ECM 표면에 일시적으로 붙어 있을 수 있는 엑소좀과 같은 나노소포체와는 다르다.
MBV는, 예를 들어, 엑소좀에 비교하여, 뚜렷한 인지질 함량을 가진다. 어떤 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 85%, 또는 90%이거나, 또는 약 50%-90%, 50%-65%, 50%-60%, 50%-70%, 60%-70%, 60%-90%, 또는 70%-90%의 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI) 의 조합이다. 특별한 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 적어도 55%의 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI)의 조합이다. 특별한 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 적어도 60%의 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI) 의 조합이다. 어떤 실시 예에서, MBV의 인질 함량은 포스파티딜콜린 (PC) 대 포스파티딜 이노시톨 (PI) 비율이 8:1 미만으로 포함한다 (예를 들어, 7:1 미만, 6:1 미만, 5:1 미만, 4:1 미만, 3:1 미만, 또는 2:1 미만). 어떤 실시 예에서, MBV의 인지질 함량은 포스파티딜콜린 (PC) 대 포스파티딜 이노시톨 (PI) 비율이 0.5-1:1의 범위, 또는 1:0.8-1의 범위, 0.5-1:2의 범위, 또는 2:0.5-1의 범위, 또는 0.8-1:1의 범위, 또는 1:0.8-1의 범위를 포함한다. 한 실시 예에서, MBV의 인지질 함량은 포스파티딜콜린 (PC) 대 포스파티딜 이노시톨 (PI) 비율이 약 1:1을 포함한다. 특정 실시 예에서, MBV의 인지질 함량은 포스파티딜콜린 (PC) 대 포스파티딜 이노시톨 (PI) 비율이 약 0.9: 1을 포함한다.
어떤 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4% 이하이다. 또는 약 5%-10%, 5%-15%, 10%-15%, 또는 8%-12%의 스핑고마이엘린 (sphingomyelin, SM)이다. 특정 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 10% 이하의 스핑고마이엘린 (sphingomyelin, SM)이다. 어떤 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 15% 이하의 스핑고마이엘린 (sphingomyelin, SM), 14% 이하의 스핑고마이엘린, 13% 이하의 스핑고마이엘린, 12% 이하의 스핑고마이엘린, 11% 이하의 스핑고마이엘린, 10% 이하의 스핑고마이엘린, 9% 이하의 스핑고마이엘린, 8% 이하의 스핑고마이엘린, 7% 이하의 스핑고마이엘린, 6% 이하의 스핑고마이엘린, 5% 이하의 스핑고마이엘린, 또는 4% 이하의 스핑고마이엘린이다.
어떤 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 또는 10% 이하, 또는 약 10%-20%, 15%-20%, 14%-18%, 또는 12%-16% 의 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine, PE)이다. 특별한 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 20% 이하의 포스파티딜에탄올아민 (PE)이다.
어떤 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 5%, 10%, 12%, 15%, 18%, 20%, 25%, 또는30% 또는 그 이상, 또는 약 5%-30%, 10%-20%, 10-25%, 15%-25%, 또는 12%-18%의 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidylinositol, PI)이다. 특별한 실시 예에서, MBV는 인지질 함량 15 % 이상의 포스파티딜 이노시톨(PI)를 함유한다.
특별한 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 15% 이상의 포스파티딜 이노시톨, 20% 이하의 포스파티딜에탄올아민, 및 10% 이하의 스핑고마이엘린을 포함한다. 특별한 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 15% 이상의 포스파티딜 이노시톨 및 20% 이하의 포스파티딜에탄올아민이다. 특별한 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 15% 이상의 포스파티딜 이노시톨 및 10% 이하의 스핑고마이엘린이다. 특별한 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 20% 이상의 포스파티딜에탄올아민 및 10% 이하의 스핑고마이엘린을 포함한다. 특별한 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 15% 이상의 포스파티딜 이노시톨, 20% 이하의 포스파티딜에탄올아민, 10% 이하의 스핑고마이엘린, 및 적어도 55%의 포스파티딜 이노시톨 및 포스파티딜콜린의 조합이다. 한 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 적어도 55% 포스파티딜콜린 (PC) 및 포스파티딜 이노시톨 (PI)의 조합 및 10% 이하의 스핑고마이엘린 (SM)이다. 특별한 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 적어도 55%의 포스파티딜 이노시톨 및 포스파티딜콜린의 조합 및 15% 이상의 포스파티딜 이노시톨이다. 특별한 실시 예에서, MBV의 총 인지질 함량은 55%의 포스파티딜 이노시톨 및 포스파티딜콜린의 조합 및 20% 이하의 포스파티딜에탄올아민이다.
MBV는 또한 라이실 옥시다아제 (lysyl oxidase, Lox)를 포함할 수 있다. 일반적으로, ECM으로부터 유래된 나노소포체는 엑소좀 보다 더 높은 Lox 함량을 가진다. Lox는 MBV의 표면에서 발현된다. Lox 단백질을 검출하기 위하여 나노-LC MS/MS 단백체 분석이 사용될 수 있다. Lox의 정량이 수행될 수 있다 (예를 들어, 여기 그 전문이 참고 문헌으로 병합된, Hill RC, et al., Mol Cell Proteomics. 2015;14(4):961-73, 참조).
어떤 실시 예에서, MBV는 하나 이상의 miRNA를 포함한다. 특별한 비-제한적인 실시 예시에서, MBV는 하나, 둘, 또는 세 개 모두의 miR-143, miR-145 및 miR-181을 포함한다. MiR-143, miR-145 및 miR-181은 이 분야 기술에서 알려졌다.
miR-145 핵산 서열은, 여기 참고 문헌으로 병합된, MiRbase 접근 번호 MI0000461에서 제공된다. miR-145 핵산 서열은 CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGCUAAGAUGGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU (서열 번호 1) 이다. miR-181 핵산 서열은, 여기 참고 문헌으로 병합된, miRbase 접근 번호 MI0000269에서 제공된다. miR-181 핵산 서열은: AGAAGGGCUAUCAGGCCAGCCUUCAGAGGACUCCAAGGAACAUUCAACGCUGUCGGUGAGUUUGGGAUUUGAAAAAACCACUGACCGUUGACUGUACCUUGGGGUCCUUA (서열 번호: 2) 이다. miR-143 핵산 서열은, 여기 참고 문헌으로 병합된, NCBI 접근 번호 NR_029684.1, March 30, 2018에서 제공된다. miR-143 핵산 서열을 암호화하는 DNA는:
GCGCAGCGCC CTGTCTCCCA GCCTGAGGTG CAGTGCTGCA TCTCTGGTCA GTTGGGGTC TGAGATGAAG CACTGTAGCT CAGGAAGAGA GAAGTTGTTC TGCAGC (서열 번호 3)이다.
투여 후, MBV는 개체에서 대식세포에서 F4/80 (대식세포 마커) 및 CD-11b의 발현을 유지한다. 나노소포체 처리된 대식세포는 우세하게 M2 표현형을 제시하는
F4/80　+　Fizz1　+　이다.
여기서 공개된 MBV는 약학적 전달을 위해 조성물로 제형화 될 수 있다. MBV는 추가로, 여기에 참고 문헌으로 병합된, PCT 발행 번호 WO 2017/151862에 공개되고 및 서술된다.
ECM으로부터 MBV의 분리 (Isolation of MBV from the ECM)
MBV를 생산하기 위하여, ECM은 관심 있는 어느 세포에 의해 생산될 수 있거나, 또는 수프라 (supr)에서 서술된 대로, 상업적 소스로부터 사용할 수 있다. 또한, 그 전문이 참고 문헌으로 병합된, 퀴자노 등 참조 (Quijano et al., Tissue Eng, Part C 2020; (10):528-540. DOI: 10.1089/ten.tec.2020.0243. PMID: 33012221). MBV는 치료되는 개체와 같은 종으로부터, 또는 다른 종으로부터 생산될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 이 방법들에는 소화된 ECM을 생산하기 위하여 효소로 ECM을 소화시키는 것을 포함한다. 특별한 실시 예에서, ECM은 하나 이상의 펩신 (pepsin), 엘라스타아제 (elastase), 할우로니다아제 (hyaluronidase), 콜라게나아제 (collagenase), 메탈로프로타나아제 (metalloproteinase), 및/또는 프로테이나제 K (proteinase K)로 소화된다. 특별한 비-제한적인 실시 예시에서, ECM은 단지 엘라스타아제 및/또는 메탈로프로테이나아제로만 소화된다. 다른 비-제한적인 실시 예시에서, ECM은 콜라게나아제 및/또는 트립신 및/또는 프로테이나제로 소화되지 않는다. 다른 실시 예에서, ECM은 세제로 처리된다. 추가의 실시 예에서, 이 방법은 효소의 사용을 포함하지 않는다. 특별한 비-제한적인 실시 예시에서, 이 방법은 MBV 를 분리하기 위하여 염 (salts)과 같은, 포타슘 클로라이드 (potassium chloride)와 같은 케오트로픽 제제 (chaotropic agents) 또는 이온 강화를 활용한다. 추가의 실시 예에서, ECM은 MBV 분리 전에 MBV 함량을 증가하기 위하여 조작될 수 있다. ECM으로부터 MBV를 분리하는 기술이, 예를 들어, 국제 특허 출원 (International Patent Application) WO 2017/151862에 서술되어 있다.
어떤 실시 예에서, ECM은 효소로 소화된다. ECM은 약 12시간에서 36시간 동안과 같은, 약 12시간에서 약 48시간 동안 효소로 소화될 수 있다. ECM은 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간 또는 48시간 동안 효소로 소화될 수 있다. 한 특별한 비-제한적인 실시 예시에서, ECM은 실온에서 효소로 소화된다. 그러나 소화는 약 4 ºC에서, 또는 약 4 º C에서 25 ºC 사이의 어느 온도에서 일어날 수 있다. 일반적으로, ECM은 콜라겐 섬유 (collagen fibril)를 제거하기에 충분한, 어느 길이의 시간 동안, 및 어느 온도에서 효소로 소화된다. 소화 과정은 조직 소스에 따라 변화될 수 있다. 선택적으로, ECM 은 효소로 소화되기 전 또는 후에, 냉동 및 해동에 의해 가공된다. ECM은 이온성 및/또는 비-이온성 세제를 포함하는, 세제(detergents)로 처리될 수 있다.
소화된 ECM은 그 후 섬유-없는 상등액을 분리하기 위하여, 원심 분리에 의한 것과 같이, 처리된다. 어떤 실시 예에서, 소화된 ECM은 예를 들어, 첫 번째 단계로 약 300 내지 약 1000g에서 원심분리 된다. 그러므로, 소화된 ECM은 약 400g, 약 450g, 약 500g 또는 약 600g에서와 같은, 약 400g 내지 약 750g에서 원심분리 될 수 있다. 이 원심분리는 약 10분 내지 약 12분 동안과 같은, 약 10분, 약 11분, 약 12분, 약 14분, 또는 약 15분 동안과 같은, 약 10분 내지 약 15분 동안 일어날 수 있다. 소화된 ECM을 포함하는 상등액이 수집된다.
어떤 실시 예에서, MBV는 Lox를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 그러한 MBV를 분리하는 방법에는 세포 외 기질을 엘라스타아제 및/또는 메탈로프로테이나아제를 소화시켜 소화된 세포 외 기질 (extracellular matrix)을 생성하고, 소화된 세포 외 기질을 원심분리시켜 콜라겐 섬유 잔여물을 제거하고 및 그러므로 섬유-없는 상등액을 생성하고, 섬유-없는 상등액을 원심 분리시켜 고체 물질을 분리시키고, 및 고체 물질을 담체 (carrier)에 현탁 시키는 것을 포함한다.
어떤 실시 예에서, 소화된 ECM은 또한 두 번째 단계로 약 2000g 내지 약3000g 에서 원심분리될 수 있다. 그러므로, 소화된 ECM은, 약 2000g, 2,500g, 2,750g, 또는 3,000g에서와 같은, 약 2500g 내지 약 3000g에서 원심분리될 수 있다. 이 원심분리는, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 또는 약 30분 동안과 같이, 약 20분 내지 약 30분 동안 일어날 수 있다. 소화된 ECM을 포함하는 상등액이 수집된다.
추가의 실시 예에서, 소화된 ECM은 세 번째 단계로 약 10,000g 내지 약 15,000g에서 원심분리될 수 있다. 그러므로, 소화된 ECM은 약 10,000g, 11,000g 또는 12,000g에서와 같이, 약 10,000g 내지 약 12,500g에서 원심분리될 수 있다. 이 원심분리는 약 25분 내지 30분 동안과 같이, 예를 들어, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39 또는 약 40분과 같이, 약 25분 내지 약 40분 동안 일어날 수 있다. 소화된 ECM을 포함하는 상등액이 수집된다. 이 원심분리 단계 하나, 둘 또는 세 개 모두가 독립적으로 사용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 이 세 개 모든 원심분리 단계가 사용된다. 이 원심분리 단계는, 2, 3, 4, 또는 5번과 같이, 반복될 수 있다. 한 실시 예에서, 이 세 가지 모든 원심분리 단계는 세 번 반복된다.
어떤 실시 예에서, 소화된 ECM은 약 500g에서 약 10분 동안 원심분리되고, 약 2,500g에서 약 20분 동안 원심분리되고, 및/또는 약 10,000g에서 약 30분 동안 원심분리된다. 세 단계 모두와 같은, 이 단계(들)는, 세 번과 같이, 2, 3, 4, 또는 5번 반복된다. 그러므로, 한 비-제한적인 실시 예시에서, 소화된 ECM은 약 500g에서 약 10분 동안 원심분리되고, 약 2,500g에서 약 20분 동안 원심분리되고, 및 약 10,000g에서 약 30분 동안 원심분리된다. 이들 세 단계는 세 번 반복된다. 그러므로, 섬유-없는 상등액이 생성된다. 섬유-없는 상등액은 그 후 원심분리되어 MBV가 분리된다. 어떤 실시 예에서, 섬유-없는 상등액은 약 100,000g 내지 약 150,000g에서 원심분리 된다. 그러므로, 섬유-없는 상등액은, 약 100,000g, 약 105,000g, 약 110,000g, 약 115,000g, 또는 약 120,000g에서와 같은, 약 100,000g 내지 약 125,000g에서 원심분리된다. 이 원심분리는, 약 70분 내지 80분, 예를 들어, 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85 또는 약 90분 동안과 같은, 약 60 내지 약 90분 동안 일어날 수 있다. 한 비-제한적인 실시 예시에서, 섬유-없는 상등액은 약 100,000g에서 약 70분 동안 원심분리된다. MBV 인 고체 물질이 수집된다. 이 MBV는 그 후, 이것에만 제한되지 않으나, 버퍼와 같은, 관심 있는 어느 운반체에 재 현탁될 수 있다.
추가의 실시 예에서 ECM은 효소로 소화되지 않는다. 이 방법들에서는, ECM은, 인산염 버퍼 된 생리 식염수 (phosphate buffered saline)와 같은 등장 생리 식염수에 현탁된다. 염이 그 후 현탁액에 첨가되어 염의 최종농도가 약 0.1M보다 더 크게 되도록 한다. 농도는, 예를 들어, 약 3M까지, 예를 들어, 약 0.1M 염 내지 약 3M, 또는 약 0.1M 내지 약 2M이 될 수 있다. 염은, 예를 들어, 0.1M, 0.15M, 0.2M, 0.3M, 0.4 M, 0.7 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8M., 0.9M, 1.0 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8M, 1.9 M, 또는 2M이 될 수 있다. 어떤 비-제한적인 실시 예시에서, 염은 포타슘 클로라이드 (potassium chloride), 소듐 클로라이드 (sodium chloride) 또는 마그네슘 클로라이드 (magnesium chloride)이다. 다른 실시 예에서, 염은 소듐 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 소듐 아이오다이드 (sodium iodide), 소듐 티오시아네이트 (sodium thiocyanate), 소듐 염 (sodium salt), 리티움 염 (lithium salt), 세슘 염(cesium salt) 또는 칼슘염 (calcium salt)이다.
어떤 실시 예에서, ECM은, 약 15분 내지 약 1시간, 약 30분 내지 약 1시간, 또는 약 45분 내지 약 1시간과 같은, 약 10분 내지 약 2시간 동안 염 용액에 현탁된다. ECM은 염 용액에 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120분 동안 현탁될 수 있다. ECM은 염 용액에, 이것에만 국한하지 않으나, 약 4°C 내지 약 25°C 또는 약 4°C 내지 약 37°C와 같은, 4°C 내지 약 50°C의 온도에서 현탁될 수 있다. 특별한 비-제한적인 실시 예시에서, ECM은 약 4 °C에서 염 용액에 현탁된다. 다른 특별한 비-제한적인 실시 예시에서, ECM은 약 22 ºC 또는 약 25°C (실온) 에서 염 용액에 현탁된다. 추가의 비-제한적인 실시 예시에서, ECM은 약 37°C에서 염 용액에 현탁된다.
어떤 실시 예에서, 이 방법은 세포 외 기질 (extracellular matrix)을 염 농도 약 0.4 M보다 큰 농도에서 배양하는 것; 콜라겐 섬유 잔류물을 제거하기 위하여 소화된 세포 외 기질을 원심분리하고, 및 상등액을 분리하는 것; 고체 물질을 분리하기 위하여 상등액을 원심분리하는 것; 및 고체 물질은 운반체에 현탁시키는 것, 이로써 세포 외 기질로부터 MBV를 분리하는 것을 포함한다.
염 용액에 배양한 후에, ECM은 원심분리시켜 콜라겐 섬유를 제거한다. 어떤 실시 예에서, 소화된 ECM은 또한 약 2000g 내지 약 5000g에서 원심분리시킬 수 있다. 그러므로, 소화된 ECM은 약 2,500g, 약 3,000g, 약 3,500g, 약 4,000g, 또는 약 4,500g 와 같이 약 2,500g 내지 약 4,500g에서 원심분리시킬 수 있다. 한 특별한 비-제한적인 실시 예시에서, 원심분리는 약 3,500g에서이다. 이 원심분리는 약 25분 내지 약 35분 동안과 같이, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30분, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34 또는 약 35분 동안과 같이, 약 20 내지 약 40분 동안 일어 날수 있다. 상등액은 그 후 수집된다.
추가의 실시 예에서, 상등액은 그 후 세 번째 단계에서 약 100,000g 내지 약 150,000g에서 원심분리될 수 있다. 그러므로, 소화된 ECM은 약 100,000g, 110,000g 또는 120,000g에서와 같은 약 100,000 내지 약 125,000g에서 원심분리될 수 있다. 이 원심분리는 약 1시간 내지 약 3시간 동안과 같이, 약 30분 내지 약 2.5시간 동안, 예를 들어, 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 90분, 또는 약 120분 (2시간) 동안 일어날 수 있다. 고체 재료는 수집되고 및, 버퍼 된 생리 식염수와 같은, 용액에 현탁되고, 이로써 MBV가 분리된다.
또 다른 실시 예에서, ECM은, 이것에만 제한하지 않으나, 인산염 버퍼 된 생리 식염수 (phosphate buffered saline)와 같은, 등장 버퍼 된 염 용액 (isotonic buffered salt solution) 에 현탁된다. 큰 입자들 (하기 참조)을 제거하기 위하여 원심분리 또는 다른 방법들이 사용될 수 있다. 그 후 ECM으로부터 MBV, 약 10 및 약 1,000nm 사이와 같은, 약 10nm 및 약 300nm 사이와 같은, 약 10nm 및 약 10,000nm사이의 입자를 분리하기 위하여 초 원심분리가 사용된다.
특별한 비-제한적인 실시 예시에서, 등장 버퍼 된 생리 식염수 용액 (isotonic buffered saline solution)은 총 염 농도 약 0.164mM, 및 pH 약 7.2 내지 약 7.4를 가진다. 어떤 실시 예에서, 등장 버퍼 된 생리 식염수 용액은, 약 0.0027M KCl (인산염 버퍼 된 생리 식염수에 KCL 농도)과 같은, 0.002M KCl 내지 약 0.164M KCL을 포함한다. 이 현탁액은 그 후 초 원심 분리 과정을 거친다.
등장 버퍼 된 염 용액에서 배양된 후, ECM을 원심분리시켜 콜라겐 섬유를 제거한다. 어떤 실시 예에서, 소화된 ECM은 또한 약 2000g 내지 약 5000g에서 원심분리될 수 있다. 그러므로, 소화된 ECM은, 약 2,500g, 약 3,000g, 3,500g, 약 4,000g, 또는 약 4,500g 와 같이 약 2,500g 내지 4,500g에서 원심분리될 수 있다. 한 특별한 비-제한적인 실시 예시에서, 원심분리는 약 3,500g에서이다. 이 원심분리는 약 25 내지 약 35분과 같이, 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30분, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34 또는 약 35분 동안과 같이, 약 20 내지 약 40 분 동안 일어날 수 있다.
큰 분자량의 물질을 현탁액으로부터 제거하기 위하여 미세 여과 및 원심분리가 사용되고 및 조합될 수 있다. 한 실시 예에서, 200nm보다 더 큰 것과 같은, 큰 크기의 분자 물질은 미세여과를 사용하여 제거된다. 다른 실시 예에서, 큰 크기의 물질은 원심분리를 사용하여 제거된다. 세 번째 실시 예에서 미세 여과 및 초 원심분리 둘 다 사용되어 큰 분자량의 물질이 제거된다. 약 10,000nm보다 큰 물질, 약 1,000nm보다 큰, 약 500nm보다 큰, 또는 약 300nm보다 큰 물질과 같은, 큰 분자량의 물질은 현탁된 ECM으로부터 제거된다.
미세 여과 배출액 또는 상등액은 그 후, 초 원심분리되게 된다. 그러므로, 약 10,000nm 미만, 약 1,000nm 미만, 약 500nm 미만, 또는 약 300nm 미만의 입자를 포함하는, 배출액이 수집되고 및 사용된다. 이 배출액은 그 후 분자량 컷 어프 (molecular weight cutoff, MWCO) 3,000 내지 100,000의 멤브레인으로 초 원심분리되도록 한다. 100,000MWCO가 실시 예시에서 사용되었다.
급성 호흡 곤란 증후군 (Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS)을 치료하는 방법
이를 필요로 하는 개체에서 ARDS를 치료하는 방법이 여기서 공개된다. 이 방법들에는 염증을 감소하기 위한 치료가 필요한 개체의 선택 및 개체에게 치료학적 유효량의 MBV의 투여 (치료학적 유효량의 MBV를 포함하는 약학적 제제를 투여하는 것과 같은)가 포함되며, 이로써 ARDS를 치료한다.
개체는 포유류가 될 수 있다. 개체는 인간일 수 있다. 개체는 수의학적 개체일 수 있다. 개체는 조류 또는, 고양이, 개 또는 토끼와 같은, 애완동물이 될 수 있다. 개체는 비-인간, 영장류 (유인원과 같은), 또는 돼지, 반추동물, 말 및 가금류를 포함하는 가축이 될 수 있다. 이 방법들에는 염증을 감소하기 위한 치료가 필요한 개체의 선택 및 개체에게 치료학적 유효량의 MBV의 투여 (치료학적 유효량의 MBV를 포함하는 약학적 제제를 투여하는 것과 같은)가 포함된다. 어떤 실시 예에서, MBV는 전신적으로 투여될 수 있다. 다른 실시 예에서, MBV는 국소적으로 투여될 수 있다. MBV는 감소된 염증이 필요한 개체와 같은 또는 다른 종으로부터 유래할 수 있다. MBV는 자기 것 일 수 있다.
여기서 공개된 방법들은 개체에서 염증의 감소의 결과가 될 수 있다. 한 실시 예에서, 사이토카인과분비 (hypercytokinemia)와 같은, 고 염증의 징후 또는 증상이 감소 또는 제거된다. 예를 들어, 여기의 방법은 개체에서 ARDS의 치료의 결과가 될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 여기의 방법은 개체에서 ARDS의 진전을 예방하거나, 또는 개체에서 ARDS의 역전에 사용될 수 있다.
한 실시 예에 따라, ARDS의 치료는 상응하는 임상적 징후에 따라 측정될 수 있다. 어떤 실시 예에서, ARDS는 심각할 수 있고, 및 예를 들어, 머레이 스코어 (Murray Score)를 사용하여 급성 폐 손상 (Acute Lung Injury), 저산소혈증 PaO2/FiO2 (Hypoxemia PaO2/FiO2), PEEP (cmH2O), 순응도 (Compliance, ml/cmH2O) 및 침투된 CXR 사분면 (CXR quadrants)에 대하여 스코어 할 수 있다. 어떤 실시 예에서, ARDS는, 예를 들어, 수정된 다우네즈 스코어링 시스템 (Modified Downe's Scoring System)을 사용하여, 호흡률, 시아노시스 (cyanosis), 수축 (retractions), 그렁거림 (grunting), 및 공기 유입 (air entry)을 측정하여 스코어 될 수 있다. 어떤 실시 예에서, ARDS는, 예를 들어, 이 분야 기술에서 알려진 다른 스코어링 시스템을 사용하여 스코어 될 수 있다. MBV 치료에 의한 ARDS의 개선은 ARDS 증상 개선과 관련된 스코어링의 변화에 의해 제시될 수 있다.
한 실시 예에서, ARDS의 치료는 상응하는 임상적 징후에 따라 측정될 수 있다. 예를 들어, ARDS의 치료는, 예를 들어, 산소 지수 (Oxygen Index, OI), 산소 포화도 지수 (Oxygen Saturation Index, OSI), 또는 산소 포화도 (Oxygen Saturation, OS) 의 개선으로 측정될 수 있다. ARDS 치료의 효과는 예를 들어 OI, OSI, 또는 OS의 증가로 측정될 수 있다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 개체에서 산소 포화도는 MBV 투여 후에 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초과하여 증가한다. 다른 실시 예에서, 개체에서 산소 포화도 지수는 MBV 투여 후에 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초가하여 증가한다. 또 다른 실시 예에서, 개체에서 산소 지수는 MBV 투여 후에 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초과하여 증가한다. 추가의 실시 예에서, ARDS의 치료는 개체에서 전-염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines) 수준의 측정으로 제시될 수 있다. 예를 들어, 전-염증성 사이토카인의 감소는 ARDS의 치료 효과를 가리킬 수 있다. 예를 들어, MBV 투여 후에 TNF-α, IFN-γ, IL-8, IL-12, IL-6 및/또는 IL-1β의 감소는 ARDS 치료의 효과를 표시할 수 있다. 다른 실시 예에서, IL-10, IL-4, 및/또는 TGF-β와 같은 항-염증성 사이토카인의 증가는 ARDS 치료 효과의 표시일 수 있다. 사이토카인 수준은 앞선 실시 예에서, 예를 들어, MBV 투여 전 및 후에 개체의 기관지 폐포 세척액으로부터 회수된 샘플에 의해 측정될 수 있다. 사이토카인 수준은 앞선 실시 예에서, 예를 들어, MBV 투여 전 및 후에 혈액으로부터 얻은 샘플로 측정될 수 있다. 체액 또는 세포 샘플에서 사이토카인의 수준은 이 분야 기술 전문가에게 알려진 전통적인 방법에 의해 결정된다. 예를 들어, 세포 배양 상등액 및 기관지 폐포 세척액에서 사이토카인의 농도는 ELISA 키트의 제조사 (R&D systems, Minneapolis, MN)가 추천하는 대로 측정될 수 있다.
MBV 치료의 효과는 이 분야 기술 전문가에게 알려진 방법에 의해 폐기능의 모니터링으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 다양한 측정 계수들이 치료 전, 치료 동안, 또는 치료 후에 연구될 수 있다. 폐기능은, 이것에만 국한하지 않으나, 흡기속도 (inspiratory flow rate), 호기속도 (expiratory flow rate), 및 폐 부피 (lung volume)를 포함하는 몇 가지의 물리적으로 측정 가능한 폐의 작동 중 어느 것을 검사하여 모니터링 할 수 있다. 이 분야 기술 전문가에게 잘 알려진 수학적 공식에 의해 결정된 대로, 이 계수들 중 하나 또는 그 이상에서 통계학적으로 의미 있게 증가하는 것은 MBV 치료의 효율을 제시한다.
임상 실습에서 가정 보편적으로 적용되는 폐기능 측정의 방법에는 특별한 계수를 측정하기 위하여 흡기 또는 호기 동작의 시간적 측정이 관여된다. 예를 들어, FVC는 환자가 깊은 초기 흡입으로부터 강력하게 내쉬는 총 부피를 리터 (liters)로 측정한다. 이 계수는, FEV1과 연관되어 평가될 때, 기관지 수축을 정량적으로 평가하도록 한다. 이 분야 기술 전문가에게 잘 알려진 수학적인 공식에 의해 결정된 대로, FVC 또는 FEV1에서 통계적으로 의미 있는 증가는 기관지 수축의 감소를 반영하고, 및 MBV 치료법이 효과적임을 제시한다.
강압적인 폐활량 (forced vital capacity ) 측정의 문제는 강압적 폐활량 동작 (forced vital capacity maneuver) (즉, 최대 흡기로부터 최대 호기의 강압적인 날숨)은 주로 기술 의존적이라는 것이다. 다른 말로, 주어진 개체는 일련의 연속적인 FVC 동작 동안에 다른 FVC 값을 생산할 수 있다. FEF 25-75 또는 강압적인 날숨 동작의 중간 부분에 대해 결정된 강압적 호기 흐름은 FVC 보다 덜 기술 의존인 경향이 있다. 비슷하게, FEV1은 FVC 보다 덜 기술-의존적인 경향이 있다. 그러므로, 이 분야 기술 전문가에게 잘 알려진 수학적인 공식에 의해 결정된 대로, FEF 25-75 또는 FEV1에서 통계적으로 의미 있는 증가는 기관지 수축의 감소를 반영하고, 및 MBV 치료법이 효과적임을 제시한다.
폐기능의 지수로서 날숨 공기의 부피를 측량하는 것 이외에, 날숨 사이클 (expiratory cycle)의 다른 부분에 대하여 측정된 분당 흐르는 리터 (liters)는 환자의 폐기능의 상태를 결정하는 데 유용할 수 있다. 특히, 강압적인 최대 날숨 동안에 분당 가장 높은 공기 흐름을 리터(liters)로서 택한, 날숨 흐름의 피크는, 천식 (asthma) 및 다른 호흡기 질환이 있는 환자에서 전반적인 폐기능과 잘 관련된다. 그러므로, 이 분야 기술 전문가에게 잘 알려진 수학적인 공식에 의해 결정된 대로, MBV 투여 후에 피크 날숨 흐름에서 통계적으로 의미 있는 증가는, 치료법이 효과적임을 제시한다.
개체는 치료 코스 (course of treatment)로 구성된 MBV 투여 1회 또는 그 이상 투여될 수 있다. 치료 코스는 MBV를 하루에 한 번 ARDS가 가라앉을 때까지 투여될 수 있다. 또는 치료 코스는 MBV를 하루에 두 번 ARDS가 가라앉을 때까지 투여될 수 있다. 치료 코스는 한 번에 또는 몇 시간에 걸쳐서 투여될 수 있다. 예를 들어, MBV는 일 회분에 IV 투여로 또는 일 회분의 기관지 점적으로 투여될 수 있거나, 또는 이는 연속적인 투여를 위해 몇 분 또는 몇 시간에 걸쳐서 산소 호흡기 또는 산소마스크의 공기 흐름으로 유입시킬 수 있다. 예를 들어, MBV는 연속적인 IV 점적기로 투여될 수 있다.
어떤 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x101 내지 약 1x1020 MBV가 투여된다. 개체는, 예를 들어, 흡입을 위해, 약 1x101 내지 약 1x102 MBV와 같은, 약 1x101 내지 약 1x103 MBV가 마이크로 리터 부피 (microliter volume)로 농축되어 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 부피는 50 μL - 500 μL 이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 부피는 100 μL - 300 μL 이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 부피는 200 μL - 400 μL 이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 부피는 300 μL - 400 μL 이다. 추가의 실시 예에서, 부피는 250 μL 이다. 추가의 실시 예에서, 부피는 300 μL 이다. 좀 더의 실시 예에서, 부피는 약 1 μL 내지 약 4μL, 약 1 μL 내지 약 3μL, 또는 약 1 μL 내지 약 2μL 같이 약 1 μL 내지 약 5μL가 될 수 있다. 한 실시 예에서, 약 1x101 내지 약 1x103 MBV가 약 50-500μL 부피로 흡입 투여를 위해 제공된다.
추가의 실시 예에 따라, 개체는, 투여 당 체중 kg 당 약 1x106 내지 약 1x1012 MBV와 같이, 약 1x106 내지 약 1x1020 MBV/체중 kg이 투여된다. 실시 예들에서, 개체는 약 1x106 내지 약 1x1019 MBV, 약 1x106 내지 약 1x1018 MBV, 약 1x106 내지 약 1x1017 MBV, 약 1x106 내지 약 1x1016 MBV, 약 1x106 내지 약 1x1015 MBV, 약 1x106 내지 약 1x1014 MBV, 약 1x106 내지 약 1x1013 MBV, 또는 약 1x106 내지 약 1x1012 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x107 내지 약 1x1011 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x107 내지 약 1x108 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x108 내지 약 1x1010 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x109 내지 약 1x1010 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x106 내지 약 1x108 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x107 내지 약 1x109 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x108 내지 약 1x1011 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x109 내지 약 1x1011 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x1010 내지 약 1x1011 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x1011 내지 약 1x1012 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x106 내지 약 1x1014 MBV가 투여된다. 다른 실시 예에서, 개체는 투여 당 체중 kg 당 약 1x1012 내지 약 1x1014 MBV가 투여된다. 한 실시 예에서, 상기 언급된 어느 양에 따른 MBV의 투여는 전신적 투여다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 투여는 정맥주사이다. 다른 실시 예에서, 투여는 흡입에 의한다. 한 실시 예에서, 흡입은 흡입기 (nebulizer) 또는 흡입기 펌프 (inhaler pump)에 의한다.
다른 실시 예에서, MBV는 용량당 한양이 정해진 부피의 액체로 비강 내 투여로 투여된다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 부피는 50 μL - 500 μL 이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 부피는 100 μL - 300 μL 이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 부피는 200 μL - 400 μL이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 부피는 300 μL - 400 μL이다. 추가의 실시 예에서, 부피는 250 μL이다. 추가의 실시 예에서, 부피는 300 μL이다. 좀 더의 실시 예에서, 부피는, 약 1 μL 내지 약 4 μL, 약 1 μL 내지 약 3 μL, 또는 약 1 μL 내지 약 2 μL와 같이, 약 1 μL 내지 약 5 μL가 될 수 있다. 한 실시 예에서, 약 1x101 내지 약 1x103 MBV가 약 50-500μL 부피로 비강 내 투여로 제공된다. 한 실시 예에서, 개체는 약 1x101 내지 약 1x103 MBV가 50-200 μL 의, 생리 식염수와 같은, 운반체 (carrier)에 농축되어, 코 스프레이 펌프 (nasal spray pump)에 의한 것과 같이, 비강 내 투여로 투여된다. 한 실시 예에서, 개체는 투여된 모두의 용량의 총량이 체중 kg 당 약 1x108 내지 약 1x1020 MBV의 양으로 MBV가 제공되도록 복수 용량의 MBV 농축 용액이 투여될 수 있다.
한 실시 예에서, 용량 (dose)에서의 MBV의 수는 1x108 내지 1x1010 MBV이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 용량 (dose)에서의 MBV의 수는 1x109 MBV이다. 한 실시 예에서, MBV는, 예를 들어, 생리적인 생리 식염수인, 생리적으로 수용할 만한 운반체로 분무 된다. 예를 들어, 분무 될 용량에서 MBV의 수는 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x1020 MBV이다. 예를 들어, 분무 될 용량에서 MBV의 수는 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x1012 MBV이다. 예를 들어, 용량은 투여 당 체중 kg 당 1x107 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x107 내지 1x108 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x108 내지 1x1010 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x109 내지 1x1010 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x108 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x107 내지 1x109 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x108 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x109 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg당 1x1010 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x1011 내지 1x1012 MBV이다.
다른 실시 예에서, MBV는 용량당 1x107 내지 1x1011 MBV의 양이 정해진 부피의 액체로 비강 내 투여로 투여된다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 부피는 0.5 mL 내지 5.0 mL이다. 다른 실시 예에서, 부피는 마이크로 리터 (microliter) 의 양이다. 다른 실시 예에서, 부피는 1mL 내지 3mL이다. 예를 들어, 부피는 2mL 내지 4mL이다. 또 다른 실시 예에서, 부피는 3mL이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 한 용량에서 MBV의 수는 1x108 내지 1x1010 MBV 이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 한 용량에서 MBV의 수는 1x109 MBV 이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 한 용량에서 MBV의 수는 투여 당 체중 kg 당 1x1010 내지 1x1011 MBV 이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 한 용량에서 MBV의 수는 투여 당 체중 kg 당 1x1011 내지 1x1012 MBV 이다.
다른 실시 예에서, MBV는 용량당 1x107 내지 1x1011 MBV의 양으로 정해진 부피의 액체로 정맥주사 투여에 의해 투여된다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 부피는 0.5mL 내지 10.0mL이다. 다른 실시 예에서, 부피는 1mL 내지 5mL이다. 다른 실시 예에서, 부피는 3mL 내지 8mL이다. 또 다른 실시 예에서, 부피는 3mL이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 한 용량에서 MBV의 수는, 1x108 내지 1x1010 MBV이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 한 용량에서 MBV의 수는, 1x109 MBV이다. 예를 들어, 정맥주사로 투여될 한 용량에서 MBV의 수는 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x1020 MBV이다. 예를 들어, 정맥주사로 투여될 한 용량에서 MBV의 수는 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x1012 MBV이다. 예를 들어, 용량은 투여 당 체중 kg 당 1x107 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x107 내지 1x108 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x108 내지 1x1010 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x109 내지 1x1010 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x108 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x107 내지 1x109 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x108 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x109 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x1010 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x1011 내지 1x1012 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x1012 내지 1x1014 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x1014 내지 1x1020 MBV이다.
다른 실시 예에서, MBV는 용량당 1x107 내지 1x1011 MBV의 양으로 정해진 부피의 액체로 복강 내 투여에 의해 투여된다, 예를 들어, 한 실시 예에서, 부피는 10mL 내지 200mL이다. 다른 실시 예에서, 부피는 50mL 내지 100mL이다. 다른 실시 예에서, 부피는 50mL 내지 125mL이다. 또 다른 실시 예에서, 부피는 50mL이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 한 용량에서 MBV의 수는, 1x108 내지 1x1010 MBV이다. 예를 들어, 한 실시 예에서, 한 용량에서 MBV의 수는, 1x109 MBV이다. 예를 들어, 복강주사로 투여될 한 용량에서 MBV의 수는 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x1020 MBV이다. 예를 들어, 용량은 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x1012 MBV이거나 투여 당 체중 kg 당 1x107 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x107 내지 1x108 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x108 내지 1x1010 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x109 내지 1x1010 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x108 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x107 내지 1x109 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x108 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x109 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x1010 내지 1x1011 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x1011 내지 1x1012 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x1012 내지 1x1014 MBV이거나 또는 투여 당 체중 kg 당 1x1014 내지 1x1020 MBV이다.
어떤 실시 예에서, 투여는 전신적이다. 전신적 투여의 예시적인 경로는, 이것에만 국한하지 않으나, 정맥 내 투여, 경구 투여, 장관 투여 (enteral administration), 비 경구적 투여(parenteral administration), 비강 내 투여 (intranasal administration), 흡입 투여 (inhalational administration), 기관 내 투여 (intratracheal administration), 직장 내 투여 (rectal administration), 설하 투여 (sublingual administration), 구강 투여(buccal administration), 질투여 (vaginal administration), 복강 내 투여(intraperitoneal administration), 피부 경유 (transdermal), 점막 경유 (transmucosal), 또는 근육 내 투여 (intramuscular administration)를 포함한다.
어떤 실시 예에서, 전신적 투여는 정맥 내 투여를 포함한다. 어떤 실시 예에서, 정맥 내 투여는 전신적인 정맥 내 (intravenous, IV) 주사를 포함한다. 어떤 특정한 실시 예에서, IV는 한 몫에 주사 (bolus injection), 연속적인 점적 (continuous drip), 또는 펌프 주사 (pump injection)가 포함된다. 어떤 실시 예에서, 전신적 정맥 내 주사는 표준 IV 라인 (standard IV line) 또는 중앙 라인 (central line)의 사용이 포함된다. 어떤 특정한 실시 예에서, 표준 IV 라인은 손목, 팔, 또는 손에 있는 정맥에 놓인다. 어떤 특정한 실시 예에서, 중앙 라인은 말초 삽입 중앙 카테터 (peripherally inserted central catheter, PICC), 쇄골 하선 (subclavian line), 내 경정맥 선 (internal jugular line), 대퇴 선 (femoral line), 터널 카테터 (tunneled catheter), 또는 이식된 포트 (implanted port) 로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 특별한 실시 예에서, 장기 치료가 예상되는 환자, 즉, 장기 입원, 예를 들어, COVID-19 환자, 는 전신적 정맥 내 주사를 위하여 중앙 라인에 놓이게 한다.
어떤 실시 예에서, 투여는 국소적, 예를 들어, 폐로이다. 예를 들어, 투여는 코 및/또는 입을 경유하는 흡입 적이다. 예를 들어, 투여는 기관 내적이다. COVID-19가 있는 환자에서, 코 및/또는 입에 의한 기관 내 투여 또는 흡입 투여가 사용된다.
흡입 투여는 구강 및/또는 비강을 통해 매개 될 수 있다. 어떤 특정 실시 예에서, 흡입은 MBV를 포함하는 약학적 조성물의 에어로졸 투여를 통해 촉진된다. 어떤 실시 예에서, 흡입은 분무기 (nebulizer) 또는 흡입기 (inhaler) (예를 들어, 측정된 용량의 흡입기 또는 건조분말 흡입기)의 보조가 포함한다, 어떤 실시 예에서, 투여는 액체 연무의 흡입을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 투여는 고체 형태의 흡입을 통해서이다. 어떤 특정 실시 예에서, 고체는 나노 크기이고 및 나노입자 (nanoparticles), 나노 다이아몬드 (nanodiamonds), 또는 나노 카본 (nanocarbons) 과 함께 조합하여 제형화 되거나, 또는 리포좀 (liposomes) 또는 리포좀-기반을 둔 패키지 (liposome-based packages)에 포장된다. 어떤 실시 예에서, 전신적 투여는, 기관지 내 점적 주입(intratracheal instillation)으로도 또한 알려진, 기관 내 투여 (endotracheal administration)를 포함한다. 어떤 특정 실시 예에서, MBV의 전신적 투여는 이를 필요로 하는 개체, 예를 들어, 심각한 ARDS를 가진 개체, 예를 들어, COVID-19와 관련된 심각한 ARDS를 가진 개체, 의 폐로 빠른 투여를 위하여 기관 내 튜브를 통한 투여를 포함한다.
흡입으로의 투여를 위하여, MBV는, 가압 된 팩 또는 분무기로부터, 디클로로디플루오로메탄 (dichlorodifluoromethane), 트리클로로플루오로메탄 (trichlorofluoromethane), 디클로로테트라플루오로에탄 (dichlorotetrafluoroethane), 카본 디옥사이드 (carbon dioxide) 또는 다른 적절한 가스와 같은 추진제의 사용으로, 에어로졸 스프레이 제시 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 된 에어로졸의 경우에, 용량 단위는 정량을 전달하기 위한 밸브를 제공하여 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기 (insufflator) 에서 사용을 위한 캡슐 (capsules) 및 카트리지(cartridges) 는 화합물 및 락토즈 또는 전분과 같은 적절한 분말 베이스의 혼합 분말을 함유하도록 제형화 될 수 있다. 흡입 제제는 에어로졸 (aerosols), 미립자 (particulates) 또는 이와 유사한 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, 흡입을 위한 입자 크기의 목표는 약물이 흡수를 위해 폐의 폐포 부위에 도달되도록 하기 위하여 약 1 μm 이하이다. 그러나, 입자 크기는 폐에서 배치 부위를 조정하기 위하여 수정될 수 있다. 그러므로, 호흡 세기관지 (respiratory bronchioles) 및 공기층 (air spaces)에 침적을 달성하기 위하여 더 큰 입자들 (지름 약 1 내지 약 5 μm 와 같은)이 사용될 수 있다.
여기서 서술된 대로 MBV를 활성 성분으로 포함하는 약학적 조성물은 보통, 선택된 특정한 투여 방식에 따라, 적절한 고체 또는 액체 운반체와 제제화될 것이다. 예를 들어, 물, 생리적 생리 식염수, 다른 균형된 염 용액, 수용성 덱스트로즈, 글리세롤 또는 이와 유사한 것과 같은, 약학적으로 및 생리적으로 수용 가능한 액체 매개체가 주사 가능한 제형, 또는 분무화 또는 에어로졸화제형을 위하여 사용될 수 있다. 포함될 수 있는 부형제는, 예를 들어, 인간 혈청 알부민과 같은, 단백질 또는 혈장제제가 포함될 수 있다. 만약 필요하면, 투여될 약학적 조성물은 습윤 (wetting) 또는 유화제 (emulsifying agents), 방부제, 및 pH 버퍼 제 및 이와 유사한 것, 예를 들어, 소듐 아세테이트 (sodium acetate) 또는 소르비탄 모노라우레이트 (sorbitan monolaurate)와 같은, 소량의 비-독성 보조 물질을 또한 함유할 수 있다. 그러한 용량 형태를 제조하는 실제 방법들은 이 분야 기술 전문가에게 알려져 있거나, 또는 분명할 것이다.
MBV를 포함하는 약학적 조성물은, 어떤 실시 예에서, 정확한 용법의 개인적 투여에 적절할 수 있도록, 단위 용량 형태로 제형화 될 것이다. 투여되는 활성 화합물(들)의 양은 치료될 개체, 질환의 심각성 정도, 및 투여 방식에 의존될 것이며, 및 처방하는 임상가의 판단에 두는 것이 가장 좋다. 이러한 범위 내에서, 투여될 제형은 치료될 개체에서 바람직한 효과를 달성하기 위한 효과적인 양으로 일정량의 활성 화합물을 함유할 것이다.
실시 예시로서, 한 개인의 폐에 투여하는 한 방법은 분무기 또는 흡입기 사용을 통한 흡입에 의한 것이다. 예를 들어, MBV는 에어로졸 또는 미립자로 제형화 되고 및 이 분야 기술 전문가에게 잘 알려진 표준 분무기를 사용하여 폐로 들어간다.
용법 처치는 궁극적으로 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x1012 MBV (즉, 소포체의 절대 수)를 전달하기 위하여 단일 용량 스케줄 또는 다수 용량 스케줄이 될 수 있다. 투여는 주기적인 일 회분으로 단일 투여로서 또는, 지속적-방출 약물 (sustained-release drug) 또는 약물 전달 장치로부터 특별한 기간 동안 연속적인 방출에 의한 것과 같은, 연속적인 주입으로서 제공될 수 있다. 개체는 적절한 대로 여러 용량으로 투여될 수 있다. 만약 다수의 용량이 투여된다면, 투여는 간헐적일 수 있다. 예시적인 실시 예에서, 치료학적 유효량의 MBV 투여 (전신적 투여, 예를 들어, 정맥 내 투여, 또는 다른 경로의 투여와 같은)는 한번 수행될 수 있거나, 또는 반복적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회와 같이, 투여될 수 있다. 예시적인 실시 예에서, 투여는 하루 한 번, 하루 두 번, 하루걸러 한번 ARDS 증상이 가라앉을 때까지 수행될 수 있다. 다른 실시 예에서, 치료적 이점을 달성하기 위하여 단지 단일 투여만 요구된다.
개별 용량은 전형적으로 개체에서 측정할 만한 효과를 생산하는데 필요한 양보다 적지 않으며, 및 개체 조성물 또는 이의 부수물의 흡수, 분포, 대사 및 배출(absorption, distribution, metabolism, and excretion, "ADME") 의 약동학 및 약리학에 기반을 두고 및 그러므로, 개체 내에 조성물의 배치에 기반을 두어 측정될 수 있다. 여기에는 투여 경로는 물론 용법의 양의 고려가 포함되며, 이는 국소적 및 전신적 (예를 들어, 정맥 내) 적용을 위하여 조정될 수 있다. 효과적인 양의 용량 (dose) 및/또는 용법 (dose regimen)은 전 임상 에세이로부터, 안정성 및 악화 및 용량 범위 시도, 개별 임상가-환자 관계는 물론, 시험관 내 및 생체 내 에세이로부터, 경험적으로 쉽게 결정될 수 있다. 일반적으로, 이 에세이들은 염증성 장애 (뇌염 또는 아토피성 피부염과 같은) 를 평가할 것이다.
치료학적 유효량의 MBV는 약학적으로 허용할 만한 운반체 (약학적 제제에서와같이), 예를 들어, 등장 버퍼 용액 pH 약 3.0 내지 8.0에서, 바람직하게 pH 약 3.5 내지 약 7.4, 3.5 내지 6.0, 또는 3.5 내지 약 5.0 에서 현탁 시킬 수 있다. 유용한 버퍼에는 소듐 시트레이트-시트릭 에시드(sodium citrate-citric acid) 및 소듐 포스페이트-포스포릭 에시드 (sodium phosphate-phosphoric acid), 및 소듐 아세테이트/아세틱 에시드 (sodium acetate/acetic acid) 버퍼가 포함된다. 방부제 및 항-박테리아 제제와 같은, 다른 제제들도 조성물에 첨가될 수 있다. 이들 조성물은 국소적으로 또는, 정맥 내와 같은, 전신적으로 투여될 수 있다.
치료학적 유효량의 MBV를 포함하는 약학적 제제는 정확한 용법의 개인적 투여에 적절할 수 있도록, 단위 용량 형태로 제형화 될 수 있다. 투여되는 활성 화합물(들)의 양은 치료될 개체, 고통의 심각성 정도, 및 투여 방식에 의존될 것이며, 및 처방하는 임상가의 판단에 두는 것이 가장 좋다. 이러한 범위 내에서, 투여될 제형은 치료될 개체에서 바람직한 효과를 달성하기 위한 효과적인 양으로 일정량의 활성 화합물을 함유할 것이다. 어떤 실시 예에서, MBV로의 치료는 투여 시점에서 존재하는 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS) 의 징후 (sign)또는 증상 (symptom) 이 감소 (decrease) 또는 감축되는 (reduction) 결과가 된다.
어떤 실시 예시에서, MBV로의 치료는 MBV 투여 전에 염증 수준에 대비하여 개체에서 염증의 감소 (decrease) 또는 감축되는 (reduction) 결과가 될 수 있다. 어떤 실시 예시에서, MBV로의 치료는 ARDS, 예를 들어, 바이러스 감염, 예를 들어, COVID-19, 과 관련된 ARDS 징후 또는 증상의 감축 또는 제거의 결과가 될 수 있다.
병용 요법 (Combination Therapies)
본 발명의 MBV 치료 방법은 단일 요법으로 사용될 수 있거나 또는, 질환 또는 장애, 예를 들어, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 또는 ARDS와 관련된 감염, 을 치료하기 위하여 사용될 수 있는 하나 이상의 다른 치료요법 (예를 들어, 항-바이러스 제제와 같은, 항-감염제)과 조합으로 사용될 수 있다. 여기서 사용된 대로, "조합 (combination)" 이라는 용어는 장애로부터 개체가 고통받는 동안에 개체에게 두 개 이상의 다른 치료가 전달되고 이로써 환자에서 치료의 효과가 한 시점에서 겹치는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 어떤 특정 실시 예에서, 한 치료의 전달이 두 번째 전달이 시작될 때에도 아직 일어나고 있고, 그래서 투여 측면에서 겹친다. 이는 때때로 여기서 "동시에 (simultaneous)" 또는 "동시 전달 (concurrent delivery)" 을 의미한다. 다른 실시 예에서, 한 치료의 전달이 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 끝난다. 각 케이스의 어떤 특정 실시 예에서, 조합된 투여 때문에 치료는 좀 더 효과적이다. 예를 들어, 두 번째 치료는 좀 더 효과적이다, 예를 들어, 더 적은 두 번째 치료로 같은 효과가 보이거나, 또는 두 번째 치료는, 만약 첫 번째 치료 없이 두 번째 치료가 투여되었을 때 보이는 것보다, 증상을 좀 더 큰 정도로 감소하거나, 또는 비슷한 경우가 첫 번째 치료에서 보인다. 어떤 특정 실시 예에서, 전달은 증상, 또는 장애와 관련된 다른 계수들의 감소가 다른 것 없이 전달된 한 번의 치료로 관찰된 것보다 더 크도록 한다. 두 번 치료의 효과는 부분적으로 가산 적이거나 (partially additive), 전체로 가산적이거나 (wholly additive), 또는 가산적보다 더 크게 (greater than additive) 될 수 있다. 전달은 전달된 첫 번째 치료의 효과가 두 번째가 전달될 때 아직도 검출될 만하도록 할 수 있다.
개체는 같은 또는 다른 조성물 또는 약학적 제제로 추가 치료 제제들이 투여될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 개체는 ARDS를 가졌으며 및 개체는 추가의 치료제, 항-염증제와 같은, 비-스테로이드성 항-염증성 약물 (nonsteroidal anti-inflammatory drugs) ((NSAIDs, 예를 들어, 아스피린 (aspirin), 이브프로펜 (ibuprofen), 및 나프록센 (naproxen)), 항루코트리엔 (antileukotrienes), 면역 선택적 항-염증성 유도체 (immune selective anti-inflammatory derivatives, ImSAIDs), 생체 활성 화합물(bioactive compounds), 스테로이드 (steroids) ((코티고스테로이드 corticosteroids)와 같은)), 및 아편 (opioids)과 같은 추가의 치료 제제가 투여된다.
따라서, 어떤 특정 실시 예에서, 개체는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용을 위해 적절한 하나 이상의 다른 치료요법을 받았고, 받고 있고, 또는 받기로 스케줄 되어 있다. 어떤 특정 실시 예에서, 본 발명의 치료 방법은 추가로 개체에게 질환 또는 장애, 예를 들어, 감염을, 치료하는데 사용을 위한 적절한 하나 이상의 다른 치료요법을 투여하는 것을 포함한다. 어떤 특정 실시 예에서, 하나 이상의 다른 치료요법은 세포 내 병원균으로 감염된 하나 이상의 증상을 완화하는 제제를 포함한다. 어떤 특정 실시 예에서, 하나 이상의 다른 치료요법은 감염된 조직의 외과적 제거를 포함한다.
여기서 공개된 사용 방법은, 예를 들어, 세포 내 병원균과 관련된 질환 또는 장애의 하나 이상의 증상을 완화하는 항-감염성 제제와 조합으로 사용될 수 있다는 것이 이해된다. 예를 들어, 여기서 공개된 사용 방법은 항바이러스 제제와 조합으로 사용될 수 있다.
세포 내 병원균에 의한 감염을 치료하기에 적합한 치료요법은 일반적으로 이 분야 기술에서 알려져 있고 및 예를 들어, 카마루짜만 등 ((Kamaruzzaman et al. (2017) Br. J. Pharmacol. 174(14): 2225-36)) 및 데 클레르크 등 ((De Clercq et al. (2016) Clin. Microbiol. Rev. 29(3): 695-747))에 의해 리뷰 (review) 되었다. 어떤 특정 실시 예에서, 항-감염성 제제는 세포 내 병원균의 생존력, 증식, 감염력, 및/또는 병독성을 억제하거나 또는 감소시킨다. 세포 내 병원균은 면역 감시체계를 회피할 수 있고 및 잠복 상태로 살면서 도전할 수 있다. 따라서, 어떤 특정 실시 예에서, 항-감염성 제제는 세포 내 병원균의 잠복이 역전되게 하여 숙주의 면역 시스템에 의해 감염이 인식될 수 있도록 한다.
어떤 특정 실시 예에서, 세포 내 병원균은 바이러스이고, 및 항-감염성 제제는 항바이러스 제제이다. 조합으로 사용될 수 있는 예시적인 항바이러스 제제에는 이것에만 국한하지 않으나 아바카비르 (abacavir), 아사이클로비르 (acyclovir), 아데포비르 (adefovir), 앰프레나비르 (amprenavir), 아타자나비르 (atazanavir), 시도포비르 (cidofovir), 다루나비르 (darunavir), 델라비르딘 (delavirdine), 디다노신 (didanosine), 도코사놀 (docosanol), 에파비렌즈 (efavirenz), 엘비테그라비르 (elvitegravir), 엠트리시타빈 (emtricitabine), 엔푸비르티드(enfuvirtide), 엔테카비르 (entecavir), 에트라비린 (etravirine), 팜시클로비르 (famciclovir), 파비피라비르 (favipiravir), 포스카네트 (foscarnet), 포미비르젠 (fomivirsen), 갠시클로비르 (ganciclovir), 인디나비르 (indinavir), 이독스유리딘 (idoxuridine), 라미부딘 (latitudinal), 로피나비르 (lopinavir), 마라비록 (maraviroc), MK-2048, 넬피나비르 (nelfinavir), 네비라핀(nevirapine), 팬시클로비르 (penciclovir), 랄테그라비르 (raltegravir), 릴피비린(rilpivirine), 리토나비르 (ritonavir), 사퀴나비르 (saquinavir), 스타부딘 (stavudine), 테노포비르 (tenofovir) 트리플유리딘 (trifluridine), 발라시클로비르 (valaciclovir), 발간시클로비르(valganciclovir), 비다라빈 (vidarabine), 이바시타빈 (ibacitabine), 아만타딘 (amantadine), 오셀타미비르 (oseltamivir), 리만티딘 (rimantidine), 티프라나비르 (tipranavir), 잘시타빈 (zalcitabine), 자나미비르(zanamivir), 페라미비르 (peramivir), 다노프레비르 (danoprevir), 렘데시비르(remdesivir), 및 지도부딘 (zidovudine)이 포함 된다. 특히. 세포 내 병원균이 HIV인 곳에서, 조합으로 사용될 수 있는 예시적인 항- HIV 제제에는, 이것에만 국한하지 않으나, 뉴클레오사이드/뉴클레오타이드 역 전사효소억제제 (nucleoside/nucleotide reverse transcriptase inhibitors) ((예를 들어, 라미부딘(lamivudine), 아비카비르 (abacavir), 지도부딘 (zidovudine), 스타브딘 (stavudine), 디다노신 (didanosine), 엠트리시타빈(emtricitabine), 및 테노포비르 (tenofovir)), 비-뉴클레오사이드 역 전사효소억제제 (non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors) ((예를 들어, 델라비르딘 (delavirdine), 에파비렌즈 (efavirenz), 에트라비리딘 (etravirine), 및 네비라핀 (nevirapine)), 프로테아제 억제제 (protease inhibitors) ((예를 들어, 엠프레나비르 (amprenavir), 포삼프레나비르 (fosamprenavir), 아타자나비르 (atazanavir), 다루나비르(darunavir), 인디나비르 (indinavir), 로피나비르 (lopinavir), 리토나비르(ritonavir), 넬피나비르 (nelfinavir), 사퀴나비르(saquinavir), 및 티프라나비르 (tipranavir)), 융합 또는 유입 억제제 (fusion or entry inhibitors) ((예를 들어, 엔푸비르티드 (enfuvirtide) 및 마라비록 (maraviroc)), 인테그라제 억제제 (integrase inhibitors) ((예를 들어, 랄테그라비르(raltegravir) 및 카보테그라비르 (cabotegravir)), 및 잠복기-역전 제제 (latency-reversing agents) ((예를 들어, HDAC 억제제 (예를 들어, 보리노스테트 (vorinostat) 및 TLR7 친화제 (agonists) (예를 들어, GS-9620, 예를 들어, 미국 특허 발행 번호 US20160008374 A1에 서술된 대로))가 포함된다. 어떤 특정 실시 예에서, 바이러스는 SARS-CoV2 이고, 및 병용 치료요법 (combination therapy)은 하이드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine)이 포함 된다. 어떤 특정 실시 예에서, 바이러스는 SARS-CoV2 이고, 및 병용 치료요법은 항바이러스 제제를 포함한다. 어떤 특정 실시 예에서, 바이러스는 SARS-CoV2 이고, 및 병용 치료요법은 2차 감염에 대항하는 예방적 치료로서 항-박테리아제를 포함 한다.
어떤 특정 실시 예에서, 세포 내 병원균은 박테리아이며, 및 항-감염성 제제는 항-박테리아 제제이다. 조합으로 사용될 수 있는 예시적인 항-박테리아 제제에는 이것에만 국한하지 않으나, 아지트로마이신 (azithromycin), 반코마이신 (vancomycin), 메트로니다졸 (metronidazole), 겐타미이신(gentamicin), 콜리스틴 (colistin), 피닥소마이신 (fidaxomicin), 테라반신 (telavancin), 오리타반신 (oritavancin), 달바반신 (dalbavancin), 답토마이신 (daptomycin), 세팔랙신 (cephalexin), 세프록심(cefuroxime), 세파드록실(cefadroxil), 세파졸린 (cefazolin), 세팔로틴(cephalothin), 세팍로어(cefaclor), 세파만돌 (cefamandole), 세폭시틴 (cefoxitin), 세프프로질 (cefprozil), 세프토비프롤(ceftobiprole), 시프로(cipro), 레바퀸 (Levaquin), 플루옥신 (floxin), 테퀸 (tequin), 아베록스 (avelox), 노르프록스(norflox), 테트라사이클린 (tetracycline), 미노사이클린(minocycline), 옥시테트라사이클린(oxytetracycline), 독시사이클린 (doxycycline), 아목시실린(amoxicillin), 앰피실린 (ampicillin), 페니실린 V (penicillin V), 디클록사실린 (dicloxacillin), 카베니실린 (carbenicillin), 메티실린 (methicillin), 에르타패냄 (ertapenem), 도리패냄 (doripenem), 이미패냄/시라스타틴 (imipenem/cilastatin), 메로패냄 (meropenem), 아미카신 (amikacin), 카나마이신 (kanamycin), 네오마이신 (neomycin), 네틸마이신 (netilmicin), 토브라마이신 (tobramycin), 파로모마이신 (paromomycin), 세픽심 (cefixime), 세프디니어 (cefdinir), 세프디토렌 (cefditoren), 세포페라존 (cefoperazone), 세포탁심 (cefotaxime), 세프타지딤 (ceftazidime), 세프티부텐 (ceftibuten), 세프티족심 (ceftizoxime), 세프트리악손 (ceftriaxone), 세폭소틴 (cefoxotin), 및 스트랩토마이신 (streptomycin) 이 포함 된다.
어떤 특정 실시 예에서, 세포 내 병원균은 곰팡이이며, 및 항-감염성 제제는 항-곰팡이 제제이다. 조합으로 사용될 수 있는 예시적인 항-곰팡이 제제에는 이것에만 국한하지 않으나, 나타마이신 (natamycin), 리모시딘 (rimocidin), 필리핀 (filipin), 니스타틴 (nystatin), 암포테리신 B (amphotericin B), 캔디신 (candicin), 및 하마이신 (hamycin), 미코나졸 (miconazole), 케토코나졸 (ketoconazole), 클로트리마졸 (clotrimazole), 에코나졸 (econazole), 오모코나졸 (omoconazole), 비포나졸 (bifonazole), 부토코나졸 (butoconazole), 팬티코나졸(fenticonazole), 이소코나졸 (isoconazole), 옥시코나졸 (oxiconazole), 세르타코나졸 (sertaconazole), 설코나졸 (sulconazole), 티오코나졸 (tioconazole), 플루코나졸 (fluconazole), 이트라코나졸 (itraconazole), 이사부코나졸 (isavuconazole), 라부코나졸 (ravuconazole), 포사코나졸 (posaconazole), 보리코나졸 (voriconazole), 테르코나졸(terconazole), 및 알바코나졸 (albaconazole), 아바펀진 (abafungin), 테르비나핀 (terbinafine), 나프티핀 (naftifine), 부테나핀 (butenafine), 아니두라펀진 (anidulafungin), 카스포펀진 (caspofungin), 미카펀진 (micafungin), 폴리고디알 (polygodial), 벤조익 에시드 (benzoic acid), 시클로피록스 (ciclopirox), 톨나프테이트 (tolnaftate), 운데시레닉 에시드 (undecylenic acid), 플루사이토신 (flucytosine) 또는 5-풀루오로사이토신 (5-fluorocytosine), 그리세오풀빈 (griseofulvin), 및 할로프로진 (haloprogin)이 포함 된다.
어떤 특정 실시 예에서, 세포 내 병원균은 원생동물이며, 및 항-감염성 제제는 항-원생동물 제제이다. 조합으로 사용될 수 있는 예시적인 항- 원생동물 제제에는 이것에만 국한하지 않으나, 퀴닌 (quinine) ((선택적으로 클린다마이신 (clindamycin)과 조합으로)), 클로로퀸 (chloroquine), 아모디아퀸 (amodiaquine), 아르테미시닌 (artemisinin) 및 이의 유도체 ((예를 들어, 아르템에테르(artemether), 아르테수네이트 (artesunate), 디하드로아르테미시닌 (dihydroartemisinin), 아르테에테르(arteether)), 독시사이클린 (doxycycline), 피리메타민 (pyrimethamine), 메플로퀸 (mefloquine), 할로판트린 (halofantrine), 하이드록시클로로퀸 (hydroxychloroquine), 에풀로니틴 (eflornithine), 니타족사나이드 (nitazoxanide), 오르니다졸 (ornidazole), 파로모마이신 (paromomycin), 팬타미딘 (pentamidine), 프리마퀸 (primaquine), 피리메타민 (pyrimethamine), 프로구아닐 (proguanil) ((선택적으로 아토바퀴논 (atovaquone)과 조합으로)), 설폰아마이드 (sulfonamides) ((예를 들어, 설파독신 (sulfadoxine), 설파메톡시피리다진 (sulfamethoxypyridazine)), 다페노퀸 (tafenoquine), 및 티니다졸 (tinidazole) 이 포함 된다. 특별한 실시 예에서, 세포 내 병원균은 플라스모디움 (Plasmodium) (예를 들어, P. vivax, P. falciparum, P. ovale, P. malariae)이고, 및 항-감염성 제제는 항-말라리아 제제이다. 조합으로 사용될 수 있는 예시적인 항- 말라리아 제제에는 이것에만 국한하지 않으나 퀴닌 (quinine) ((선택적으로 클린다마이신 (clindamycin)과 조합으로)), 클로로퀸 (chloroquine), 아모디아퀸 (amodiaquine), 아르테미시닌 (artemisinin) 및 이의 유도체 ((예를 들어, 아르템에테르(artemether), 아르테수네이트 (artesunate), 디하드로아르테미시닌 (dihydroartemisinin), 아르테에테르(arteether)), 독시사이클린 (doxycycline), 할로판트린 (halofantrine), 메플로퀸 (mefloquine), 프리마퀸 (primaquine), 프로구아닐 (proguanil) ((선택적으로 아토바퀴논 (atovaquone)과 조합으로)), 설폰아마이드 (sulfonamides) ((예를 들어, 설파독신 (sulfadoxine), 설파메톡시피리다진 (sulfamethoxypyridazine)), 타패노퀸 (tafenoquine)이 포함 된다. 이들 항-말라리아 제제들은 ARDS 를 치료하기 위하여 MBV와 조합으로 사용될 수 있다.
ARDS 또는 ARDS와 관련된 사이토카인 과분비를 치료하는데 병용 치료요법의 한 부분으로서 사용될 수 있는 추가 부류의 제제는 항-염증성 (anti-inflammatory) 및/또는 면역 억제 (immunosuppressive) 제제들, 예를 들어, 사이토카인 억제제 (cytokine inhibitors), 칼시누린 억제제 (calcineurin inhibitors), mTOR 억제제, 또는 스테로이드(steroids) 이다: 어떤 실시 예에서, 항-염증성 제제에는 칼시누린 억제제 (calcineurin inhibitors), 예를 들어, 타크로리머스 (tacrolimus) 및 사이클로스포린 (cyclosporine) 이 포함 된다. 어떤 실시 예에서, 항-염증성 제제에는 mTOR 억제제, 예를 들어, 시로리머스 (sirolimus)가 포함된다. 어떤 실시 예에서, 항-염증성 제제에는 스테로이드, 예를 들어, 프레드니손 (prednisone)이 포함 된다. 어떤 실시 예에서, 항-염증성 제제에는 사이토카인 억제제, 예를 들어, IL-6 길항제 (antagonist), IL-1 길항제, 용해성 종양 괴사 인자 수용체 (soluble tumor necrosis factor receptor), IL-1 수용체 친화제 (agonistic), 및 TGF-β1 잠복기-관련된 펩티드 (TGF-β1 latency-associated peptide)가 포함된다. 어떤 특정 실시 예에서, 사이토카인 억제제에는 토실리주맙 (tocilizumab), 사리루맙 (sarilumab), 아나킨라 (anakinra), 또는 실툭시맙 (siltuximab) 이 포함 된다. 어떤 특정 실시 예에서, 항-염증성 제제에는 자누스 키나아제 (Janus kinase, JAK) 억제제, 예를 들어, 토파시티닙 (tofacitinib), 룩소리티닙 (ruxolitinib), 또는 바리시티닙 (baricitinib)이 포함 된다.
적절한 치료요법은 특정한 감염의 진단에 따라 선택될 수 있다. 개체가 다수의 병원균 (예를 들어, 다수의 세포 내 병원균, 예를 들어, 다수의 바이러스 감염, 예를 들어 SARS-CoV2 및 2차 감염)으로 감염되었을 때, 이들 감염을 치료하기 위하여 두 개 이상의 적절한 치료요법이 여기서 공개된 MBV 치료요법과 조합으로 사용될 수 있다.
한 실시 예에서, 본 발명의 조성물은 SARS-CoV2에 대항하여 항체 치료 요법, 예를 들어, 밤라니비맙 (bamlanivimab), 에테세비맙 (etesevimab), 카시리비맙 (casirivimab), 또는 임데비맙 (imdevimab), 또는 이들이 조합과 함께 병용 치료요법의 한 부분으로서 사용될 수 있다.
어떤 실시 예에서, 이 방법에는 치료적 이점이 달성되었다는 것을 검출하는 단계가 포함된다. 치료적 효율의 측정은 수정된 특정한 질환에 적용될 것이며, 이 분야 기술 전문가는 치료적 효율을 측정하기 위하여 사용되는 적절한 검출 방법을 인식할 것이다. 개체는 이 분야 기술에서 알려진 어느 방법을 사용하여 반응에 대하여 평가될 수 있다. 예시적 실시 예에서, 개체는 염증성 질환 (뇌염 또는 아토피성 피부염과 같은)이 있고, 및 개체에서 치료적 반응은, 백혈구 수, 다형핵 호중구(polymorphonuclear neutrophils, PMN)의 수, PMN 활성화 정도 ((루미놀 강화된-화학 발광 (luminol enhanced-chemiluminescence)과 같은)), 사이토카인의 양, C-활성 단백질 (C-reactive protein), 및 이 분야 기술에서 알려진 다른 측정에 의해 측정될 수 있다.
용어
용어 및 방법의 하기의 설명은 본 발명을 좀 더 잘 서술하고 및 이 분야 기술 통상 전문가가 본 발명을 실행할 때 안내하기 위하여 제공된다. 단일형 'a" "an, "및 "the" 는 맥락이 달리 분명하게 지시하지 않는 한 하나 또는 그 이상을 의미한다. 예를 들어, "세포를 포함하는 (comprising a cell)" 이라는 용어는 단일 또는 복수의 세포를 포함하고 및 "적어도 하나의 세포를 포함하는 (comprising at least one cell)" 의 구절과 동등하다고 간주 된다. "또는 (or)" 은 맥락이 달리 분명하게 지시하지 않는 한, 언급된 대체 요소의 단일 요소 또는 두 개 이상의 요소의 조합을 의미한다. 여기서 사용된 대로, "포함한다 (comprises)"는 "포함한다 (includes)"를 의미한다. 그러므로 "A 또는 B를 포함하는 (comprising A or B), 은 추가 요소의 배제 없이 "A, B, 또는 A 및 B를 포함하는 (including A, B, or A and B)"을 의미한다. 여기서 언급된 유전자은행 접근번호 (GenBank　 Accession Nos.)의 날짜는 적어도 빠르게는 2015년 9월 16일에 얻을 수 있는 서열이다. 여기서 인용된 모든 참고 문헌, 특허 출원 및 발행, 및 유전자은행 접근번호는 참고 문헌으로 병합되어 있다. 달리 제시되지 않는 한, "약 (about)" 은 5퍼센트 내를 제시한다. 본 공개의 다양한 실시 예의 리뷰를 촉진하기 위하여, 특별한 용어의 하기의 설명이 제공된다:
급성 호흡 곤란 증후군 (Acute Respiratory Distress Syndrome): 급성 호흡 곤란 증후군, 또는 "ARDS", 는 심각한 저산소혈증이 증상의 특징이면서, 폐에 널리 퍼지는 염증이 빠르게 시작되는 호흡 부전의 한 타입을 의미한다. 징후 및 증상은 보통 시작된 후 몇 시간 내이나, 그러나 며칠 내 또는 일주일까지 일어날 수 있다. ARDS에서, 체액이 폐의 가장 작은 혈관으로부터 폐의 폐포로 누출된다. 정상적인 생리에서, 폐포-모세관 막 (alveolar-capillary membrane)은 폐를 그러한 체액으로부터 보호한다. 그러나, 폐포-모세관 막에 심각한 폐 및/또는 전신적 손상이 있을 경우, 막은 위태롭게 될 수 있어, ARDS를 초래할 수 있다. 어떤 특정 실시 예에서, ARDS 는 폐 감염과 관련된다.
ARDS의 증상에는, 제한 없이, 숨가쁨, 빠른 호흡, 감소 된 혈액 산소화, 두통, 낮은 혈압, 열, 기침, 혼동, 극도의 피로감, 및 저산소혈증으로 인한 피부 및/또는 손발톱 탈색이 포함될 수 있다. ARDS는 폐의 산소 및 이산화탄소의 교환 능력을 손상시킨다. ARDS를 지닌 환자의 흉부 방사선촬영은, 예를 들어, 양쪽 폐에 불투명하게 나타나는 널리 퍼진 "젖빛-유리(ground-glass)"를 가진 양자 간 침윤물을 폐에서 보여준다. 진단의 관점으로부터, 베를린 기준 (Berlin criteria)에 따라 양성 말단-호기 압력 (positive end-expiratory pressure, PEEP) 이 5cm H2O 이상임에도 불구하고 PaO2/FiO2 ((동맥 산소의 부분 압력 (partial pressure of arterial oxygen) 및 흡기 산소 분율 (fraction of inspired oxygen) 의 비율))가 300mm 미만일 때 ARDS는 진단된다. 경증일 경우 (mild case), PaO2/FiO2 는 200mg Hg 보다 크고 및 300mg 미만이다. 보통의 경우 (moderate case), PaO2/FiO2 는 100mg Hg 보다 크고 및 200mg 미만이다. 심각한 경우 (severe case), PaO2/FiO2 는 100mm Hg 미만이다. 일차 치료는 산소의 투여 및/또는 기계적인 환기가 관여된다.
투여 (Administration): 선택된 경로로 개체에게 조성물 (MBV 또는 MBV를 포함하는 약학적 제제)을 도입하는 것. 경로는 국소적 또는 전신적일 수 있다. 예를 들어, 만약 선택된 경로가 정맥 내이면, 조성물은 개체의 정맥으로 조성물을 도입하여 투여된다. 만약 선택된 경로가 국소적이면, 조성물은 개체의 조직에 직접 조성물을 도입하여 투여될 수 있다
동물 (Animal): 살아있는 다-세포 척추 개체로, 예를 들어, 포유류 및 조류를 포함하는 카테고리. "포유류 (mammal)" 라는 용어는 인간 및 비-인간 포유류 둘 다를 포함한다. 비슷하게, "개체 (subject)" 라는 용어는 인간 및 수의과적 개체 둘 다를 포함한다.
관절염 (Arthritis): 관절염은 신체의 하나 이상의 관절의 윤활 막에 영향을 주는 염증성 질환이다. 이는 관절 질환의 가장 흔한 타입이며 및 관절에의 염증이 특징이다. 이 질환은 보통 소수관절 (몇 개 관절에 영향을 줌) 이나, 그러나 전반적일 수 있다. 보통 관여되는 관절에는 고관절 (hips), 무릎(knees), 하부 요추 경추 (lower lumbar and cervical vertebrae), 손의 근위 및 원위 측두골 관절 (proximal and distal interphalangeal joints of the fingers), 제1 수근중수관절(first carpometacarpal joints), 및 발의 제1 족근중족관절 (first tarsometatarsal joints of the feet)이 포함된다. 증상에는 관절 통증 및 뻣뻣함, 홍조 (redness), 온기 (warmth), 부기 (swelling), 및 영향을 받은 관절 동작 범위의 감소가 포함된다. 어떤 실시 예에서, 여기서 공개되는 조성물 및 방법은 관절염을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 관절염의 타입에는, 제한 없이, 류머티스성 관절염 및 건선성 관절염이 포함된다.
생체 적합성 (Biocompatible): 포유류 개체에 이식되었을 때, 그 개체에서 부작용 반응을 유발하지 않는, 어느 물질. 생체 적합한 재료는, 개인에게 도입되었을 때, 이의 의도된 기능을 수행할 수 있으며, 및 그 개인에게 독성적이거나 또는 해롭지 않으며, 또한 개체에서 그 재료에 대한 면역학적 거부를 유도하지 않는다.
강화된 (Enriched): 혼합물에 있는, 나노소포체와 같은, 관심 있는 성분이 강화 공정 전에 비교하여 강화 공정 후에 그 혼합물에서 다른 바람직하지 않은 성분의 양에 대하여 그 성분의 양이 증가된 비율을 가지는 공정.
세포 외 기질 (Extracellular matrix (ECM): 구조적 및 기능적 바이오분자 및/또는 바이오 거대분자의 복합 혼합물로서, 이것에만 국한하지 않으나, 구조적 단백질, 특화된 단백질, 프로테오글라이칸 (proteoglycans), 글리코사미노글라이칸 (glycosaminoglycans), 및 조직 내에 있는 세포 주변 및 세포를 지지하는 성장인자들을 포함하고 및, 달리 제시되지 않는 한, 무세포적이다. ECM 제제는 "탈세포화 (decellularized)" 또는 "무세포화 (acellular)"로 간주 될 수 있으며, 여기서 서술된 공정 및 이 분야 기술에서 알려진 공정을 통해 세포가 소스 조직으로부터 제거되었음을 의미한다. "ECM-유래된 나노소포체 (ECM-derived nanovesicle)", "기질 결합 나노소포체 (Matrix bound nanovesicle)", "MBV" 또는 "ECM으로부터 유래된 나노소포체 (nanovesicle derived from an ECM)"와 같은 "ECM-유래된 재료 (ECM-derived material)"는, 자연적인 ECM 또는 ECM이 배양된 세포에 의해 생산되는 시험관 내 소스로부터 제조된 나노소포체이다. ECM-유래된 나노소포체는 하기에 정의된다.
사이토카인과분비 (Hypercytokinemia) 또는 "사이토카인 방출 증후군 (cytokine release syndrome)". "사이토카인 폭풍 (cytokine storm)" 또는 "사이토카인 폭풍 증후군 (cytokine storm syndrome)"으로서 이 분야 기술에서 또한 알려진 면역 시스템의 급성 과반응; 그러한 면역 반응은 감염성 질환 또는 장애의 결과로부터 올 수 있는 전신적인 염증성 반응 증후군이다. 사이토카인과분비는 많은 수의 백혈구 세포가 활성화되고 및 염증성 사이토카인을 방출할 때 일어나고, 이는 이어서 또한 병원성 염증의 양성적인 피드백 회로 (positive feedback loop)로 좀 더 많은 백혈구 세포를 활성화한다. 추가로, 면역 세포에 있는 사이토카인 본래의 수용체에 결합하는 전-염증성 사이토카인들은 추가로 사이토카인 생성을 활성화하고 및 자극하는 결과가 된다. 사이토카인과분비 병원성은 국소 부위에서 시작되고 및, 예를 들어, 전신적 순환을 통해 신체 전체로 퍼지며, 및 다-기관 부전을 초래할 수 있다. 바이러스 감염으로부터 생기는 사이토카인과분비 병원성은 급성 폐 손상 및 급성 호흡 곤란 증후군과 관련된다. 사이토카인과분비 병원성은, 예를 들어, 티소니크 등 ((Tisonick et al., (2012) "Into the Eye of the Cytokine Storm," Microbiol. Mol. Biol. Rev., 76(1):16-32))에서 서술된다. 과량으로 방출된 사이토카인은, 이것에만 국한하지 않으나, 예를 들어, IL-6, IFN-γ, IL-8 (CXCL8), IL-10, GM-CSF, MIP-1α/β, MCP-1 (CCL2), CXCL9, 및 CXCL10가 포함될 수 있다.
감염 (Infection): 병원균, 예를 들어, 숙주, 예를 들어, 환자, 내에 정상적으로 존재하지 않거나, 또는 정상적으로 숙주의 특정한 장소에 존재하지 않고 숙주의 다른 위치에 침투하는 (예를 들어, 정상적으로 소화관에 존재하는 병원균이 요로에 들어가거나, 또는 정상적으로 피부에 존재하는 병원균이 혈액 흐름으로 들어갈 때), 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 또는 원생동물의 침입 및 증식을 의미한다. 감염은 증상을 야기하지 않을 수 있으며 및 무증상일 수 있거나, 또는 증상을 일으킬 수 있고 및 임상적으로 분명할 수 있다. 감염은 국소적으로 남아 있거나, 또는, 예를 들어, 혈액 또는 림프관을 통해, 퍼질 수 있어 전신적이 될 수 있다.
염증 (Inflammation): 염증은 염증성 제제를 격리하는 역할을 하는 조직에 상처에 의해 유발되는 국소적 보호적인 반응이다. 염증은 맥관 조직이, 병원균, 손상된 세포, 또는 자극제와 같은, 유해한 자극에 대한 복잡한 생물학적 반응에 의해 조직화된다. 이는 개체가 해로운 자극을 제거하는 것은 물론 조직을 위해 회복 과정을 시작하는 보호적 시도이다. 염증성 반응은, 전신적으로나 또는 염증 부위에 국소적으로, 백혈구의 축적이 특징이다. 염증성 반응은, 이것에만 국한하지 않으나, 백혈구 수 측정, 다형 핵 호중성 백혈구 (polymorphonuclear neutrophils, PMN) 수의 측정, 루미놀 강화된-화학 발광 (luminol enhanced-chemiluminescence) 과 같은, PMN 활성화 정도 측정, 또는 존재하는 사이토카인의 양 측정을 포함하는, 많은 방법에 의해 측정될 수 있다. C-반응성 단백질은 전신적 염증성 반응의 마커이다.
염증성 장애는 염증이 정상적인 또는 정규적인 생리적 기능을 방해하는 장애 종류이다. 염증성 장애에는, 자가면역 장애 (autoimmune disorders) (내부 항원에 대한 부적절한 염증성 반응), 및 외상성 손상 또는 외부 항원으로 인한 염증에 의해 원인이 되는 장애와 같은, 다양한 컨디션을 포함할 수 있다. 일차 염증성 장애는 염증 그 자체에 의해 원인이 되는 장애 또는 질환이다. 2차 염증성 장애는 다른 장애의 결과인 염증이다. 염증은 염증성 장애를, 예를 들어, 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS)을, 초래할 수 있다.
어떤 실시 예에서, 항-염증제가 염증성 질환 또는 장애, 예를 들어, ARDS를 치료하기 위하여 투여된다. 항-염증제에는, 제한 없이, 비스테로이드성 항-염증성 약물 (nonsteroidal anti-inflammatory drugs) ((NSAIDs, 예를 들어, 아스피린(aspirin), 이브프로팬 (ibuprofen), 및 나프록센 (naproxen)), 항뉴코트리엔 (antileukotrienes), 면역 선택적 항-염증성 유도체 (immune selective anti-inflammatory derivatives, ImSAIDs), 바이오활성 화합물 (bioactive compounds), 스테로이드 (steroids) ((코티코스테로이드 (corticosteroids)와 같은)), 및 오피오이드 (opioids)가 포함된다.
인플루엔자 (Influenza): 인플루엔자 (("플루(Flu)"로도 또한 알려진))는 인플루엔자 바이러스에 의해 원인이 되는 감염성 질환이다. 세 타입의 인플루엔자 바이러스가 인간을 감염시킬 수 있다: 타입 A, 타입 B, 및 타입 C; 타입 D는 인간을 감염시키는 것으로 보이지 않았다. 인플루엔자 바이러스는 매우 전염성이 높다; 비-제한적인 실시 예시에서, 인플루엔자 바이러스는 감염된 개인의 기침 또는 재채기로부터의 방울이 공기를 통해 퍼진다. 인플루엔자는 매년 발생하여 전 세계적으로 퍼지며, 약 3 내지 5백만 케이스의 심각한 병 및 약 290,000 내지 650,000 사망의 결과가 된다 (("Influenza (Seasonal)"　World Health Organization　(WHO). 6 November 2018)). 고위험인 사람을 위하여 세계보건 기구 (World Health Organization, WHO)에 의해 인플루엔자에 대항하여 매년 예방접종이 추천된다. 맹독성 인플루엔자 균주의 더 크고, 전 세계적인 발생이 일어날 수 있다, 예를 들어, 1918년에 스페인 인플루엔자 (Spanish influenza in 1918) (17-100 백만 사망의 결과), 1957년에 아시아 인플루엔자 (Asian influenza　in 1957) (2 백만 사망의 결과), 및 1968년 홍콩 인플루엔자(Hong Kong influenza　in 1968) (1 백만 사망의 결과). 2009년 6월에, WHO는 인플루엔자 A의 새로운 타입인, H1N1 ((또한 "돼지 플루 (swine flu)"로도 알려짐))의 발생이 팬데믹이 될 것임을 선언했다 ((Chan M. (2009). " 세계는 2009 인플루엔자 팬데믹의 시작에 있다 (World now at the start of 2009 influenza pandemic)". 세계보건기구 (World Health Organization , WHO). 2009년 6월 12일에 원본으로부터 기록보관)). 인플루엔자 감염의 증상에는, 제한 없이, 열, 콧물 흐름, 목 아픔, 근육 및 관절 고통, 두통, 및 피곤함이 포함된다. 어떤 특정 실시 예에서, 인플루엔자는 바이러스성 폐렴과 관련된다. 어떤 특정 실시 예에서, 인플루엔자는 2차 박테리아성 폐렴과 관련된다.
단리된 (Isolated): "단리된 (isolated)" 생물학적 화합물 (핵산, 단백질 세포, 또는 나노소포체와 같은)은, 성분이 자연적으로 존재하는, 개체의 세포 또는 ECM에 있는 다른 생물학적 성분으로부터 상당히 분리되었거나 또는 정제된 것이다. "단리된 (isolated)" 핵산 및 단백질에는 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질이 포함된다. 분리되었던 MBV는 ECM의 섬유로 된 재료로부터 제거된다. 이 용어는 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질은 물론 화학적으로 합성된 핵산도 포함한다.
라이실 옥시다아제 (Lysyl oxidase, Lox): 콜라겐 (collagen) 및 엘라스틴 (elastin) 전구체에 라이신 (lysine) 잔기로부터 알데하이드 (aldehydes) 형성을 촉진하는 구리-의존성 (copper-dependen) 효소. 이 알데하이드들은 매우 반응성이 있고, 및 다른 라이실 옥시다아제-유래된 알데하이드 잔기 (lysyl oxidase-derived aldehyde residues), 또는 미수정된 라이신 잔기와 자동적인 화학 반응을 거친다. 생체 내에서, 이는 콜라겐 및 엘라스틴의 교차-연결 (cross-linking) 의 결과가 되며, 이는 콜라겐 섬유소의 안정화 역할을 하며 및 성숙된 엘라스틴의 온전성 및 탄력성에 역할을 한다. 복잡한 교차-링크가 구조가 다른 콜라겐 ((세 개의 라이신 잔기들로부터 유래된 피리디놀린(pyridinolines)) 및 엘라스틴 ((네 개의 라이신 잔기들로부터 유래된 데스모신 (desmosines))에서 형성된다. Lox 효소를 암호화하는 유전자들은 다양한 개체로부터 클론 되었다 (Hamalainen et al., Genomics 11:508, 1991; Trackman et al., Biochemistry 29:4863, 1990; incorporated herein by reference). 인간 라이실 옥시다아제 (human lysyl oxidase) 서열의 잔기 153-417 및 잔기 201-417은 촉매적 기능을 위해 중요한 것으로 보인다. LoxL1, LoxL2, LoxL3 및 LoxL4로 불리는 네 개의 Lox-유사 동형 단백질이 있다.
대식세포 (Macrophage): 세포 찌꺼기, 외래 물질, 미생물, 및 암세포를 식균하고 및 분해하는 백혈구 세포의 한 타입. 식균 작용에서의 이들의 역할에 추가하여, 이들 세포들은 발생, 조직 유지 및 수선에서 중요한 역할을 하고 및 림프구와 같은 면역 세포를 포함하는 다른 세포를 영입하고 및 영향을 주는 선천성 및 적응성 면역 둘 다에서 중요한 역할을 한다. 대식세포는 M1 및 M2로서 언급되어온 표현형을 포함하는 많은 타입으로 존재할 수 있다. 전-염증성 기능(pro-inflammatory functions)을 주로 수행하는 대식세포는 M1 대식세포 (CD86+/CD68+)로 불리고, 반면에 염증을 감소하고 및 조직 수선을 북돋우고 및 조절하는 대식세포는 M2 대식세포 (CD206+/CD68+) 로 불린다. 대식세포의 다양한 표현형을 동정하는 마커들은 종 사이에 다양하다. 대식세포 표현형은 극단의 M1 및 M2 사이에의 범위의 스펙트럼으로 나타낸다는 것이 주목되어야 한다. F4/80은 ((어드헤신 G 단백질 커플 된 수용체 E1(adhesion G protein coupled receptor E1, ADGRE1) 유전자에 의해 암호화되는)) 대식세포 마커이고 여기 참고 문헌으로 병합된 유전자은행 접근 번호 (GENBANK　 Accession No.) NP_001243181.1, 2018년 4월6일 및 NP_001965, 2018년 3월5일 참조. 이론에 ◎매이기를 바라지 않으며, MBV는 대식세포의 표현형을 조절하는 능력을 갖추며, M2-유사, 조절적인, 또는 전-리모델링 대식세포 (pro-remodeling macrophages)의 증가를 초래한다는 것이 믿어진다. 대식세포에 대한 MBV의 효과는 추가로, 그 전문이 여기 참고 문헌으로 병합된, WO 2017/151862A1에서 특징지어진다. 어떤 실시 예에서, 본 발명의 MBV는 개체에서 대식세포에서 M2 표현형을 유도하고 및 M1 대식세포를 억제하기 위하여 사용될 수 있다.
마이크로 RNA (MicroRNA): 길이가 약 17 내지 25 뉴클레오타이드 베이스의 작은 비-코딩 RNA로, 전형적으로 타겟 mRNA의 번역을 억제하여 전사-후 적으로 (post-transcriptionally) 유전자 발현을 조절한다. miRNA는 음성적 조절자로서 기능 할 수 있어, 더 많은 양의 특정한 miRNA는 더 낮은 수준의 타겟 유전자 발현과 관계 있을 것이다. 세 가지 형태의 miRNA, 일차 miRNAs (primary miRNAs, pri-miRNAs), 미성숙 miRNA (premature miRNAs, pre-miRNAs), 및 성숙 miRNA (mature miRNAs)가 있다. 일차 miRNA (pri-miRNAs) 는 약 몇백에서 1 kb 이상의 스템-루프 (stem-loop) 구조의 전사체로 발현된다. pri-miRNA 전사체는 핵에서 스템-루프의 바닥 근처의 스템 (stem)의 두 선을 자르는 도로사 (Drosha)라고 불리는 RNase II 엔도뉴클레이즈 (endonuclease)에 의해 쪼개진다. 도로사는 이중 RNA (RNA duplex) 를 엇갈리게 잘라, 5' 인산염 및 3' 말단에 2 뉴클레오타이드 돌출 (overhang)을 남긴다. 분해 산물인, 미성숙 miRNA (pre-miRNA)는 약 60 내지 약 100 뉴클레오타이드 길이의 뒤로 접힌 방식 (fold-back manner)으로 형성된 헤어핀 구조이다. Pre-miRNA는 랜-GTP (Ran-GTP) 및 엑스포틴-5 (Exportin-5)에 의해 핵으로부터 세포질로 운반된다. Pre-miRNA는 다이서 (Dicer) 라고 불리는 다른 RNAse II 엔도뉴클레이즈에 의해 세포질에서 추가로 가공된다. 다이서는 5' 인산염 및 3' 돌출기를 인식하고, 및 스템-루프 접합점에서 루프를 잘라버리고 이중 miRNA (miRNA duplex) 를 형성시킨다. 이중 RNA는 RNA-유도 소음 복합체 (RNA-induced silencing complex, RISC)에 결합하고, 여기서 안티센스 가닥 (antisense strand)은 우선적으로 분해되고 및 센스 가닥 (sense strand) 성숙된 miRNA는 RISC가 이의 타겟 부위로 가도록 한다. 생물학적으로 활성인 형태의 miRNA가 성숙된 miRNA이고 및 이는 약 17 내지 약 25 뉴클레오타이드 길이이다.
나노소포체 (Nanovesicle): 지름 약 10 내지 약 1,000 nm의 나노입자인 세포 외 소포체. 나노소포체는 다른 분자들 중에서 생물학적으로 활성 신호 분자(예를 들어, 마이크로RNAs, 단백질)를 지닌 지질 막 결합 된 입자이다. 일반적으로, 나노소포체는 지질 이중 층에 의해 제한되며, 및 생물학적 분자들이 동봉되며 및/또는 이중 층에 박혀 있을 수 있다. 그러므로, 나노소포체는 원형질막에 의해 둘러싸인 루맨 (lumen)을 포함한다. 다른 타입의 소포체는 지름 (diameter), 세포 하부 기원 (subcellular origin), 밀도 (density), 모양 (shape), 침강 속도 (sedimentation rate). 지질 조성 (lipid composition), 단백질 마커 (protein markers), 핵산 함량 (nucleic acid content), 및, 세포 외 기질 또는 분비된 것과 같은, 이의 기원에 기반을 두어 구별될 수 있다. 나노소포체는, ECM으로부터의 기질 결합 나노소포체와 같은 (상기 참조), 이의 기원, 단백질 함량 및/또는 miR 함량에 의해 동정될 수 있다.
"엑소좀 (exosome)" 또는 "액체 상 세포 외 소포 (liquid phase extracellular vesicle) (EV)" 는 세포에 의해 분비되는 막 소포이고, 및 지름이 10 내지 150nm의 범위이다. 일반적으로, 후기 엔도좀 (late endosomes) 또는 다 소포체 (multivesicular bodies)는 안으로 출아 (budding) 및 제한적인 엔도좀 막으로부터 소포를 잘라 이들 동봉된 소포에 형성된 루맨 내 소포 (intralumenal vesicles) 를 함유한다. 이들 루맨 내 소포 (intralumenal vesicles)는 그 후, 원형질막과 융합시 세포 외 유출 (exocytosis) 동안에 다소포체 루맨 (multivesicular body lumen) 으로부터 세포 외 환경, 전형적으로 혈액, 뇌척수액 또는 침과 같은, 체액으로 방출된다. 엑소좀은 막의 한 부분이 함몰될 때 세포 내로 생성되며 및 세포 내로 이입된다 (endocytosed). 더 작은 소포로 잘리고 및 궁극적으로 세포로부터 축출된 내부화된 부분은 단백질 및 mRNA 및 miRNA와 같은 RNA 분자를 함유한다. 원형질-유래한 엑소좀은 주로 리보조말 RNA가 결핍되어 있다. 세포-외 기질 유래한 엑소좀은 특정한 miRNA 및 단백질 성분을 포함하고, 및 혈액, 소변, 타액, 및 척수액과 같은 거의 모든 체액에 존재하는 것으로 보였다. 엑소좀은 CD11c, CD63, CD81, 및/또는 CD9를 발현하며, 및 그러므로 CD11c+ 및/또는 CD63+ 및/또는 C81+ 및/또는 CD9+ 가 될 수 있다. 엑소좀은 그 표면에 높은 수준의 라이실 옥시다아제 (lysyl oxidase) 를 가지고 있지 않다.
"ECM으로부터 유래한 나노소포체 (nanovesicle derived from an ECM)", "기질 결합 나노소포체 (matrix bound nanovesicle)," "MBV" 또는 "ECM-유래한 나노소포체 (ECM-derived nanovesicle)" 모두 같은 막 결합 입자를 의미하며, 10nm-1000 nm의 크기 범위이고, 세포 외 기질에 존재하고, 단백질, 지질, 핵산, 성장 인자 및 세포 행동에 영향을 주는 사이토카인과 같은 생물학적으로 활성인 신호전달 분자를 함유한다. 이 용어는 서로 교환가능하고, 및 같은 소포를 의미한다. 이 나노소포체는 ECM 내에 박혀 있으며, 및 ECM에 결합 되어 있고 및 표면에 단순히 접촉되어 있거나 또는 체액에 자유롭게 순환하는 것은 아니다. 이들 나노소포체는, 냉동-해동 및 펩신 (pepsin), 엘라스타아제 (elastase), 할우로니다아제 (hyaluronidase), 프로테이나제 K (proteinase K), 및 콜라게나아제 (collagenase)와 같은 프로테아제로 소화, 및 세제로 소화와 같은 거친 분리 컨디션에 저항적이다. MBV는 엑소좀을 포함하는 다른 세포 외 소포와 뚜렷이 다르며 및 엑소좀과 다른 인지질 조성 (phospholipid composition)을 가지고 있다. 어떤 경우에, MBV는 또한 보통 엑소좀에 기인되는 특정 마커의 부재에 기반을 둔 엑소좀과 뚜렷이 다를 수 있다. 이는 또한 알카라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase)를 발현하는 뼈의 생성 및 광물질화 (mineralization)에 관여하는 뼈 기질 소포 (bone matrix vesicles)와는 다르다.
어떤 실시 예에서, MBV는 단백질 발현 또는 지질 함량의 하기의 특징 하나 또는 그 이상에 의해 특징지어진다:
(i) MBV는 CD63 및/또는 CD81 및/또는 CD9 중 하나 또는 그 이상을 발현하지 않을 수 있으며 또는 엑소좀과 같은 다른 소포에 비교하여 낮거나 또는 거의 검출되지 않는 수준의 CD63 및/또는 CD81 및/또는 CD9 (CD63lo 및/또는 CD81lo 및/또는 및/또는 CD9lo) (예를 들어, 실시 예시 1 참조)를 갖는다. (또한 실시 예시 17 및 도 24 참조). 예를 들어, 웨스턴 블럿팅 (western blotting) 또는 유동 세포분석 ( flow cytometry)과 같은, 항체-기반을 둔 방법의, 다양한 방법들이 MBV에서 낮은, 거의 검출되지 않는 발현의, 또는 발현이 없는 CD63 및/또는 CD81 및/또는 CD9를 구별하는 데 사용될 수 있다 (예를 들어, Bashashati and Brinkman, Adv Bioinformatics, 2009: 584603 참조). 어떤 실시 예에서, CD63 및/또는 CD81 및/또는 CD9의 MBV 발현은 다른 소포와 비교하여 낮거나 또는 거의 검출되지 않는 것으로 간주 되며 상기 MBV 에서 CD63 및/또는 CD81 및/또는 CD9의 발현은, 엑소좀과 같은, 다른 소포의 평균 발현의 적어도 한 표준 편차 또는 적어도 두 표준 편차 낮다;
(ii) MBV는 총 인지질의 적어도 55%가 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI) 의 조합을 포함하는 인지질 함량을 갖는다;
(iii) MBV는 총 인지질의 10% 이하가 스핑고마이엘린 (sphingomyelin, SM)을 포함하는 인지질 함량을 갖는다;
(iv) MBV는 총 인지질의 20% 이하가 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine, PE)을 포함하는 인지질 함량을 갖는다;
(v) MBV는 총 인지질 함량의 15% 이상이 포스파티딜 이노시톨(phosphatidylinositol, PI)을 포함하는 인지질 함량을 가지고 퍼센트는 지질의 농도의 퍼센트를 나타낸다.
어떤 실시 예에서, MBV는 하기의 특징 모두에 의해 특징지어진다;
(i) CD63 및/또는 CD81 및/또는 CD9 하나 또는 그 이상을 발현하지 않거나 또는 낮거나 또는 거의 검출되지 않는 수준의 CD63 및/또는 CD81 및/또는 CD9 (CD63lo 및/또는 CD81lo 및/또는 CD9lo) (추가로 상기 서술된 대로)를 갖는다;
(ii) 총 인지질의 적어도 55%가 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI)의 조합을 포함하는 인지질 함량;
(iii) 총 인지질의 10% 이하가 스핑고마이엘린 (sphingomyelin, SM)을 포함하는 인지질 함량;
(iv) 총 인지질의 20% 이하가 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine, PE) 을 포함하는 인지질 함량; 및
(v) 총 인지질 함량의 15% 이상이 포스파티딜 이노시톨(phosphatidylinositol, PI)을 포함하는 인지질 함량.
어떤 실시 예에서, MBV는 하기의 특징 모두에 의해 특징지어진다;
(i) 총 인지질의 적어도 55%가 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI)의 조합을 포함하는 인지질 함량;
(ii) 총 인지질의 10% 이하가 스핑고마이엘린 (sphingomyelin, SM)을 포함하는 인지질 함량;
(iii) 총 인지질의 20% 이하가 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine, PE)을 포함하는 인지질 함량; 및
(iv) 총 인지질 함량의 15% 이상이 포스파티딜 이노시톨(phosphatidylinositol, PI)을 포함하는 인지질 함량.
어떤 실시 예에서, MBV는 하기의 특징 하나 또는 그 이상에 의해 특징지어진다:
(i) 총 인지질의 적어도 55%가 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI)의 조합을 포함하는 인지질 함량;
(ii) 총 인지질의 10% 이하가 스핑고마이엘린 (sphingomyelin, SM)을 포함하는 인지질 함량;
(iii) 총 인지질의 20% 이하가 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine, PE)을 포함하는 인지질 함량; 및
(iv) 총 인지질 함량의 15% 이상이 포스파티딜 이노시톨(phosphatidylinositol, PI)을 포함하는 인지질 함량.
MBV가 분리되는 ECM은 조직으로부터의 ECM 일 수 있으며, 배양된 세포로부터 생산될 수 있으며, 또는 상업적 소스로부터 구입될 수 있다.
어떤 실시 예에서, MBV는 하기의 특징 하나 또는 그 이상에 의해 특징지어진다:
(i) 검출될 만한 수준의 알카라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase) 를 함유하지 않는다;
(ii) 검출될 만한 수준의 오스테오폰틴 (osteopontin)을 함유하지 않는다;
(iii) 검출될 만한 수준의 오스테오프로게테린 (osteoprogeterin)을 함유하지 않는다;
(iv) 검출될 만한 수준의 보체 C5 (complement C5)를 함유하지 않는다; 및/또는
(v) 검출될 만한 수준의 C-반응성 단백질 (c-reactive protein)을 함유하지 않는다.
어떤 실시 예에서, MBV는 하기의 특징 하나 또는 그 이상에 의해 특징지어진다:
(i) 낮은 수준의 검출될 만한 EpCAM을 함유하거나 또는 함유하지 않는다,
(ii) 낮은 수준의 검출될 만한 ANXA5를 함유하거나 또는 함유하지 않는다,
(iii) 낮은 수준의 검출될 만한 TSG101을 함유하거나 또는 함유하지 않는다,
(iv) 낮은 수준의 검출될 만한 FLOT1을 함유하거나 또는 함유하지 않는다,
(v) 낮은 수준의 검출될 만한 ICAM1을 함유하거나 또는 함유하지 않는다,
(vi) 낮은 수준의 검출될 만한 GM130을 함유하거나 또는 함유하지 않는다; 및/또는
(vii) 낮은 수준의 검출될 만한 ALIX을 함유하거나 또는 함유하지 않는다.
어떤 실시 예에서, MBV는 낮은 수준 또는 검출되지 않는 수준의 ANXA5, TSG101, 및 ICAM1으로 특징지어진다.
어떤 실시 예에서, MBV는 낮은 수준 또는 검출되지 않는 수준의 CD81, CD63, ANXA5, TSG101, 및ICAM1 으로 특징지어진다.
산소 포화도 지수 (Oxygen Saturation Index, OSI): 산소 포화도 지수는 특정한 산소 수준 (specific oxygen levels, SpO2)을 사용하여 계산된 산소 지수 (Oxygen Index, OI)를 위한 비-침습적 대용품 (non-invasive surrogate)이다. OSI =((FiO2 x 평균 기도 압력(mean airway pressure) x 100)/SpO2. SpO2 (산소 포화)는, 예를 들어, 맥박 산소측정법에 의해, 비-침습적으로 측정될 수 있으며 및 혈액에 있는 총 헤모글로빈 (불포화된 및 포화된)에 대비한 산소-포화된 헤모글로빈 부분의 측정이다.
산소 지수 (Oxygen Index, OI): 산소 지수 =(FiO2 x 평균 기도 압력(mean airway pressure) x 100)/PaO2 이며, 및 OSI와는 달리, 침습적인, 동맥 혈액가스 측정을 필요로한다
약학적으로 허용할 만한 운반체 (Pharmaceutically acceptable carriers) : 청구하는 약학적 제제에서 유용한 약학적으로 허용할 만한 운반체는 전통적인 것이다. 레밍톤의 약학 과학 ((Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)), 에서는 여기서 공개하는 융합 단백질의 약학적 전달에 적절한 조성 및 제형을 서술하고 있다.
일반적으로, 운반체의 성질은 적용될 투여의 특정 방식에 의존할 것이다. 예를 들어, 비 경구 제형은 보통 물, 생리적 생리 식염수, 균형된 염 용액, 수용성 덱스트로즈, 글리세롤, 또는 매체로서 이와 유사한 것과 같은 약학적으로 및 생리적으로 허용 가능한 액체를 포함하는 주사 가능한 액체를 포함한다. 고체 조성물 (예를 들어, 분말, 정제, 타블렛, 또는 캡슐 형태)을 위해, 전통적인 비-독성 고체 운반체는, 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨(mannitol), 락토즈 (lactose), 전분 (starch) 또는 마그네슘 스테아레이트 (magnesium stearate)를 포함할 수 있다. 생물학적으로-중성인 운반체에 추가하여, 투여될 약학적 제제는, 습윤 또는 유화제, 방부제, 및 pH 버퍼링 제제 및, 예를 들어, 소듐 이세테이트 (sodium acetate) 또는 소르비탄 모노라우레이트 (sorbitan monolaurate)와 유사한 것과 같은, 미량의 비-독성 보조 물질을 함유할 수 있다.
약학적 제제 (Pharmaceutical agent): 개체 또는 세포에 적절히 투여되었을 때 바람직한 치료적 또는 예방적 효과를 유도할 수 있는 화학적 화합물 또는 조성물.
인지질 (Phospholipid): 두 개의 소수성 지방산 꼬리 및 인산염 그룹으로 구성되는 하나의 친수성 머리로 구성된 구조를 가진 지질 클래스. 인지질의 주요 클래스에는 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC), 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine, PE), 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidylinositol, PI), 포스파티딜세린 (phosphatidylserine, PS), 포스파티딜글리세롤 (phosphatidylglycerol, PG), 스핑고마이엘린 (sphingomyelin, SM), 카디오리핀(cardiolipin, CL), 포스파티딕 에시드(phosphatidic acid, PA), 및 비스-모노아실글리세로포스페이트 (bis-monoacylglycerophosphate, BMP) 가 포함된다. 인지질은 다양한 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들어, LC-MS 기반을 둔 글로벌 지질체학 (global lipidomics) 및 산화화원 지질체학 (redox lipidomics)이 사용될 수 있다. 어떤 실시 예에서, 특정한 인지질 함량은 총 인지질 (MBV 에 있는 총 인지질과 같은) 의 퍼센트 농도로서 제시되며, 여기서 퍼센트 농도는 무게/무게 이다.
폐렴 (Pneumonia): 한쪽 또는 양쪽 폐에 있는 폐포 (공기주머니)에 염증을 일으키는 감염. 어떤 실시 예에서, 폐는 액체 또는 고름으로 채워진다. 어떤 실시 예에서, 폐렴은 바이러스성 감염, 예를 들어, 코로나바이러스 (coronavirus) (예를 들어, SARS-CoV2, SARS-CoV, MERS-CoV), 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 (influenza virus) ((예를 들어, 인플루엔자 A (influenza A)), 예를 들어, 에볼라바이러스 (ebolavirus), 와 관련된다. 어떤 실시 예에서, 폐렴은 박테리아성 감염, 예를 들어, Streptococcus pneumonia, 과 관련된다. 어떤 실시 예에서, 폐렴은 곰팡이 감염, 예를 들어, Pneumocystis jirovecii, 과 관련된다. 어떤 실시 예에서, 폐렴은 2차 감염이다, 즉, 기존에 존재하는 감염 (예를 들어, COVID-19)을 가진 환자가 폐렴을 발병한다. 어떤 실시 예에서, 폐렴은 병원 내 획득 (hospital-acquired) 이다. 어떤 실시 예에서, 폐렴은 지역사회-획득이다. 폐렴의 증상은, 제한 없이, 기침, 열, 빠른 호흡, 숨가쁨, 흉부 통증, 및 피로감을 포함한다. 어떤 특정 실시 예에서, 폐렴은 ARDS와 관련된다.
폴리뉴클레오타이드 (Polynucleotide): 어떤 길이의 핵산 서열 (선상 서열과 같은). 그러므로, 폴리뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드, 및 또한 크로모좀에서 발견되는 유전자 서열도 포함한다. "올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)" 는 고유 포스포다이에스테르 결합 (phosphodiester bonds)에 의해 연결된 뉴클레오타이드의 복수이다. 올리고뉴클레오타이드는 길이 6 에서 300 뉴클레오타이드 사이의 폴리뉴클레오타이드이다. 올리고뉴클레오타이드 유사체는 올리고뉴클레오타이드와 비슷하게 기능 하나 그러나 비-자연적으로 일어나는 부분을 가진 잔기를 의미한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 유사체는, 변화된 당 잔기 (altered sugar moieties) 또는, 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오타이드(phosphorothioate oligodeoxynucleotide)와 같은, 당-내 연결 (inter-sugar linkages)과 같은, 비-자연적으로 일어나는 부분을 함유할 수 있다. 자연적으로 일어나는 폴리뉴클레오타이드의 기능적 유사체는 RNA 또는 DNA에 결합할 수 있으며, 및 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid, PNA) 분자를 포함한다.
예방약 (Prophylactic): 여기서 사용된 대로 질환 또는 장애가 일어나는 것으로부터 예방하기 위하여 디자인되고 및 사용되는 약물 또는 치료를 의미한다. 여기서 사용된 대로 "예방약 (prophylactic)" 및 "예방 (prevention)"은 서로 교환되게 사용된다.
정제된 (Purified): "정제된 (purified)" 이라는 용어는 절대적 순도를 요구하지 않는다; 오히려, 상대적인 용어로서의 의도가 있다. 그러므로, 예를 들어, 정제된 핵산 분자 제제는 언급된 핵산이 이의 세포 내 자연적인 환경에 있는 핵산보다 좀 더 순수한 그런 것이다. 예를 들어, 핵산 제제는 핵산이 총 단백질 함량의 적어도 50%를 대표하도록 정제된다. 비슷하게, 정제된 MBV 제제는 엑소좀이, 미세소포 (microvesicles) 및 엑소좀이 있는, 세포를 포함하는 환경에서보다 좀 더 순수한 그런 것이다. 정제된 핵산 집단 또는 MBV는 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%보다 더 크거나 또는 100% 순수하거나, 또는 다른 핵산 또는 세포 성분이 각각 없다.
질병을 예방하는 또는 치료하는 (Preventing or treating a disease): 질환을 "예방하는 (Preventing)"은, 예를 들어, 질환에 소인을 가진 것으로 알려진 사람에서, 질환의 발병을 억제하는 것을 의미한다. 질환에 소인을 가진 것으로 알려진 사람의 예시에는 가족 내에 그 질환의 역사를 가진 어떤 사람이거나, 혹은 개체를 그러한 컨디션에 있도록 하는 인자에 노출되었던 사람이다. "치료 (treatment)" 는 질환 또는 병리적 컨디션의 징후 또는 증상이 전개가 시작된 후에 이를 완화하는 치료적 중재를 의미한다.
SARS-CoV-2 또는, 또한 이 분야 기술에서 2019-신규 코로나바이러스 (2019-novel coronavirus) 또는 2019-nCoV로 알려진, 심각한 급성 호흡 증후군-코로나바이러스-2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2, SARS-CoV-2)는 2019년 후반기에 중국 우한 (Wuhan)에서 기원한, 새로운 코로나바이러스이고 및 2020 년 전 세계적인 팬데믹 (global pandemic)의 원인이다. SARS-CoV-2에 의해 원인이되는 질환은 코로나바이러스 질환 2019 (Coronavirus Disease 2019) 또는 COVID-19로 불린다. COVID-19는 기침, 열, 피로감, 몸살, 및 숨가쁨을 포함하는 다양한 증상의 원인이다. 심각한 질환을 앓은 COVID-19 환자는 급성 호흡 곤란 증후군을 경험하며 및 인공 호흡기 (mechanical ventilation)를 필요로 한다.
패혈증 (Sepsis): 패혈증은 혈류에 방출된 사이토카인 및 케모카인 (예를 들어, 감염과, 예를 들어, 세포 내 병원균 또는 바이러스와 싸우기 위하여)이 신체 전체에 전신적 염증을 일으킬 때 일어날 수 있는 장애이다. 패혈증은 광범위한 기관 손상, 기관 부전, 및 사망을 초래할 수 있다. 패혈증의 증상은, 제한 없이, 상승된 심장 박동수, 혼돈 또는 혼미 (confusion or disorientation), 극도의 고통 또는 불편함, 열, 및 숨가쁨을 포함한다. 어떤 실시 예에서, 패혈증은 ARDS와 관련된다. 어떤 실시 예에서, 패혈증은 사이토카인과분비와 관련된다.
개체 (Subject): 인간 및 비-인간 동물로, 생쥐, 토끼, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류 및 파충류와 같은, 포유류 및 비-포유류와 같은, 모든 척추동물을 포함한다. 서술된 방법의 많은 실시 예에서, 개체는 인간이다. '개체 (Subject)"는 "환자 (patient)"라는 용어와 교환될 수 있게 사용된다. 개체는, 질환 또는 장애, 예를 들어, 감염성 질환 또는 장애, 를 전개할 고 위험도를 가진 것으로 진단된 개인 (예를 들어, 면역 시스템이 약화된 개인, 의료 서비스 전문가), 질환 또는 장애, 예를 들어, 감염성 질환 또는 장애를 가진 것으로 진단된 어떤 사람, 질환 또는 장애, 예를 들어, 감염성 질환 또는 장애로부터 이전에 고통을 받은 어떤 사람, 또는 질환 또는 장애, 예를 들어, 감염성 질환 또는 장애의 증상 또는 조짐에 대해 평가받은 개인이 될 수 있다.
치료학적 유효량 (Therapeutically effective amount): 처치될 개체에서 바람직한 효과를 달성하기에 충분한, MBV와 같은, 특정한 물질의 양. 개체에게 투여되었을 때, 바람직한 시험관 내 효과를 달성한 것으로 보이는 타겟 조직 농도 (예를 들어, 폐에서)를 달성할 한 용량이 일반적으로 사용될 것이다.
총 인지질 함량 (Total phospholipid content); "총 인지질 (total phospholipids)" 또는 "총 인지질 함량 (total phospholipid content)" 은, 여기서 사용된 대로, MBV 에 관한 한, 주어진 양의 단리된 MBV, 즉 ECM으로부터 단리된 MBV, 에 존재하는 모든 인지질의 합을 의미한다. MBV는, 예를 들어, 탈세포화된 ECM의 효소적 소화 및 분획 원심분리 (differential centrifugation) 에 의해 분리될 수 있다. 총 인지질 함량은 LC-MS 기반을 둔 글로벌 지질체학 (global lipidomics) 및 산화환원 지질체학 (redox lipidomics)과 같은 방법에 의해 측정될 수 있다. 총 인지질 함량은 무게로 측정된다. 총 인지질 함량의 퍼센트는 무게/무게 기반에서 퍼센트 농도를 의미한다.
이식 (Transplanting): MBV와 같은 생체 적합성 물질을 이를 필요로 하는 개체에 배치하는 것.
치료하는, 치료, 및 치료요법 (Treating, Treatment, and Therapy); 상처, 병리 또는 컨디션의 약화 또는 개선에 있어서 어떤 성공 또는 성공의 표시이고, 증상의 경감 (abatement), 감퇴 (remission), 약화 (diminishing)와 같은 어느 객관적 및 주관적 계수 또는 컨디션을 환자가 좀 더 견딜만하게 하거나, 퇴화 및 쇠약의 속도를 느리게 하고, 퇴화의 마지막 지점이 덜 쇠약하게 하거나, 또는 개체의 신체적 및 정신적 웰-빙의 개선을 포함한다. 치료는 객관적 또는 주관적 계수에 의해 평가될 수 있다; 신체검사 (physical examination), 신경 검사 (neurological examination), 또는 정신 검사 (psychiatric evaluations)를 포함한다.
달리 주목되지 않는 한, 기술적 용어는 전통적인 사용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 공통의 용어는 벤자민 레윈 (Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); 캔드류 등 ((Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)); 및 로버트 메이여 ((Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8))에서 찾아 볼 수 있다;
상기 서술은 본 발명의 여러 관점 및 실시 예를 서술한다. 본 특허 출원은 이 관점들 및 실시 예들의 모든 조합 (combinations) 및 순열 (permutations)을 특별히 고려한다.
실시 예 (EXAMPLES)
지금 일반적으로 서술되는 본 공개는, 하기의 실시 예시의 참조로 좀 더 쉽게 이해될 것이며, 이는 본 공개의 어떤 특정 관점 및 실시 예를 단지 보여주기 위할 목적으로 포함되며, 및 어느 방식으로든지 본 공개의 범위를 제한하려는 의도는 아니다.
실시 예 1: 지질체학 및 RNA 서열 분석을 통한 기질 결합 소포체 (Matrix Bound Vesicles, MBV) 및 세포 외 소포체 (Extracellular Vesicles, EV) 분별하기 (Differentiating Matrix Bound Vesicles (MBV) and Extracellular Vesicles (EV) through lipidomics and RNA sequencing)
기질-결합 나노소포체 (Matrix-bound nanovesicles, MBV)는 ECM 바이오스케폴드의 내재 된 성분으로 보고되었다. 액체-상 세포 외 소포체 (extracellular vesicles, EV)가 심도있는 조사의 주제이었음에도 불구하고, 이들의 MBV와의 유사성은 크기 및 모양에 국한되었다. 이 실시 예는 액체-상 EV 및 MBV 인지질의 상세한 비교를 수행하기 위하여 LC-MS-기반을 둔 지질체학 (LC-MS-based lipidomics) 및 산화환원 지질체학 (redox lipidomics)을 이용하였다. 맥관 내에 있는 화물 (cargo)의 포괄적인 RNA 서열분석 및 생물정보학 분석을 조합하였을 때, 이 실시 예는 MBV는 EV의 뚜렷하고 및 유일한 부분모집단임을 보여주고, 및 ECM-기반을 둔 생체물질의 뚜렷한 특징을 보인다.
이 실시 예는 액체-상 (즉, 엑소좀) 및 기질 결합 형태 (즉, MBV)의 EV 사이의 유사점 및 차이점을 동정한다. 그러나, EV는 생체 액에 존재하고 MBV는 원래 조직 (native tissue) ECM에 존재하고 및 ECM-기반을 둔 생체물질은 다수의 세포 소스로부터 분비되는 이질적인 집단을 대표함을 감안하면, 이들 추정적인 EV 집단 사이의 직접적인 비교적인 생체 내 분석은 문제가 있다. 체액 또는 조직-유래 매체 사용의 대안으로서, ECM 및 배양된 세포에 의해 시험관 내에서 생산된 컨디션화된 배지가 분리될 수 있다 (Fitzpatrick et al., Biomater Sci., 3, 12-24 (2015). 이 접근 방법은 단일 세포 타입의 사용으로 이로써 소포체의 기원에 관한 어떤 의심도 배제; 액체 또는 고체상 분획으로부터 소포체를 선택적으로 수확할 수 있는 능력; 및 세포 배양 환경을 조절하고 및 그러므로 또한 소포체 조성 및 화물 (cargo)을 조절할 수 있는 능력과 같은 몇가지 장점을 제공한다.
재료 및 방법 (Materials and Methods)
시험관 내 세포-유래 ECM 제조: 인간 골수 줄기세포 (bone marrow stem cells, BMSC), 인간 지방 줄기세포 (adipose stem cells, ASC) 및 인간 탯줄 줄기세포 (umbilical cord stem cells, UCSC) ECM 플레이트들은 스탬바이오 시스 (StemBioSys) (San Antonio, Texas)로부터 제공되었으며 및 발행된 프로토콜에 따라 제조되었다 (Lai et al., Stem cells and development 19, 1095-1107 (2010)). 간략하게, 인간 BMSC, 인간 ASC, 또는 인간 UCSC는 인간 피브로넥틴 (fibronectin)으로 코팅된 (37 °C에서 1시간) 75cm2-세포 배양 플라스크에 세포 밀도 3,500 세포/cm2 로 접종시키고 및 20% 태아 소 혈청 (fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린-스트랩토마이신 (penicillin-streptomycin)으로 보충된 α-MEM 배지에서 14일 동안 배양시켰다. 배지는 초기 접종 후 일일 및 그 후 매 3일 마다 다시 채웠다. 7일째 날에, 아스코르빅 에시드 2-포스페이트 (acorbic acid 2-phosphate) (Sigma Aldrich)가 최종 농도 50 μM 로 배지에 첨가되었다. 14일째 날에, 플레이트는 20 mM 암모늄 하이드록사이드 (ammonium hydroxide)에 있는 0.5% 트리톤 (Triton) 을 사용하여 5분 동안 탈세포화하고, 칼슘(calcium) 및 마그네슘 (magnesium) 둘 다를 함유하고 있는 행크의 균형된 염 용액 (Hank's Balanced Salt Solution) (HBSS +/+)으로 2번, 및 초-순수 (ultra-pure) H2O로 한 번 헹구었다. 뮤린 NIH 3T3 섬유아세포 (Murine NIH 3T3 fibroblast cells)를 75cm2-세포 배양 플라스크에 세포 밀도 3,500 세포/cm2 로 접종시키고 및 엑소좀-고갈시킨 FBS (exosome-depleted FBS) (G. V. Shelke, et al, Journal of extracellular vesicles 3, 24783 (2014)), 1% 페니실린-스트랩토마이신(penicillin-streptomycin) 및 아스코르빅 에시드 2-포스페이트 (acorbic acid 2-phosphate) (Sigma Aldrich) 최종 농도 50 μM 로 보충된 DMEM 배지에서 7일 동안 배양시켰다. 7일째 날에, 배양된 3T3 섬유아세포로부터의 상등액이 수집되고, 및 플레이트 된 배양은 PBS로 3번 세척시키고, 20mM 암모늄 하이드록사이드 (ammonium hydroxide)에 있는 0.5% 트리톤 (Triton)을 사용하여 5분 동안 탈세포화하고, 초-순수 (ultra-pure) H2O로 3번 헹구었다.
MBV 및 액체-상 EV 분리: MBV가 분리되었다 (L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)). 간략하게, 탈세포화 된 ECM은 버퍼 (50mM Tris pH 7.5, 5mM CaCl2, 150mM NaCl)에 있는 100ng/ml 리베라아제 DL (Liberase DL) (Roche)로 37 °C에서 1시간 동안 효소적으로 소화시켰다. 액체-상 EV를 함유하는 세포 배양 상등액 및 MBV를 함유하는 소화된 ECM은, 500g (10분), 2500g (20분), 및 10,000g (30분)의 차별화된 원심분리가 되게 하고, 및 이 상등액은 0.22 μm 필터 ((Millipore)를 통과시켰다. 방출된-MBV 또는 액체-상 EV를 함유하는 깨끗해진 상등액은 그 후 100,000 x g ((Beckman Coulter Optima L-90K 초 원심분리기 (Ultracentrifuge))로 4°C에서 70분 동안 원심분리시켜 소포체를 펠렛화 (pellet)하였다. 소포체 펠렛은 그 후 세척시키고 및 1X PBS에 재 현탁 시키고, 및 추후 사용할 때까지 -20 °C에 저장되었다.
방광 기질 (urinary bladder matrix, UBM)의 제조: UBM은 시장에서 파는 돼지 (market-weight pigs)로부터 제조되었다 (조직 소스; LLC, Lafayette, IN) (L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)). 간략하게, 장막 (tunica serosa), 외근육층 (muscularis externa), 점막하조직(submucosa), 및 점막근판(muscularis mucosa)은 기계적인 탈라민화 (mechanical delamination)에 의해 제거되었고, 및 소장 점막 (tunica mucosa)의 요로 상피 세포 (urothelial cells)는 탈이온화 된 물로 세척하여 기저 막 (basement membrane)으로부터 분리되었다, 나머지 기저 막 및 고유판 (lamina propria) (일괄하여 UBM으로 불림)은 4% 에탄올 (ethanol) 을 포함하는 0.1% 퍼아세틱 에시드(peracetic acid)로 2시간 동안 300 rpm에서 교반하고 이어서 인산염-버퍼 된 생리 식염수 (phosphate-buffered saline, PBS) 및 타입 1 물 (type 1 water) 세척으로 탈세포화 시켰다. UBM은 그 후 동결 건조시키고 및 #60 메쉬 스크린 (mesh screen)을 가진 윌리 밀 (Wiley Mill) 을 사용하여 빻았다.
스캐닝 전자 현미경 (Scanning Electron Microscopy, SEM): UBM은 차가운 2.5% 글루타르알데히드 (glutaraldehyde) 에 24시간 동안 고정시키고 이어서 1x PBS에서 30분 동안 3번 세척시켰다. 샘플은 그 후 등급 된 알코올 시리즈(30%, 50%, 70%, 90%, 100% 에탄올)로 매 세척당 30분 동안 탈수시켰으며, 그 후 100% 에탄올에 4°C에서 하룻밤 동안 놓아두었다. 샘플은 추가로 3번 100% 에탄올에서 각각 30분 동안 세척시키고 및 라이카 EM CPD 0303 한계점 건조기 (Leica EM CPD030 Critical Point Dryer) (Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA)를 사용하여 이산화탄소를 전이 배지 (transitional medium)로 사용하여 한계점 건조되었다. 샘플은 그 후 4.5nm 두께의 금/팔라듐 합금 코딩 (gold/palladium alloy coating)으로 스퍼터 코터 108 자동 (Sputter Coater 108 Auto) (Cressington Scientific Instruments, UK)을 사용하여 스퍼터-코트 되었으며 및 JEOL JSM6330f 스캐닝 전자 현미경으로 이미지화되었다.
투과 전자 현미경 (Transmission Electron Microscopy, TEM): 탄소-코팅된 그리드 (carbon-coated grids)에 놓이고 및 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 고정시킨 MBV 또는 액체-상 EV에 대하여 TEM 이미징이 수행되었다 (L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)). 그리드는 JEOL 1210 TEM으로 80kV에서 고-해상도 고도 현미경 기술 디지털 카메라 (Advanced Microscopy Techniques digital camera)로 이미지 되었다. MBV의 크기는 JEOL TEM 소프트웨어를 사용하여 대표적인 이미지로부터 결정되었다.
나노입자 추적 분석 (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA): 액체-상 EV 및 MBV의 입자 크기 및 농도는 빠른 비디오 캡처 (fast video capture) 및 입자 추적 소프트웨어 (particle-tracking software)로 장치되어 있는 나노사이트 (Nanosight) (NS300) 기기를 사용하여 계산되었다. 샘플은 입자-없는 물 (particle-free water)로 최종 부피 1000 μ l에 1:500으로 희석시켰다. 시스템으로 샘플을 배포하기 위하여 주사기 펌프가 사용되었다. 측정은 각 샘플에서 45초 캡처 3번으로부터 수행되었다. 비디오 처리 및 입자 계산을 위하여, 검출 한계점 (detection threshold) 은 4로 조정되었다. 데이터는 평가된 각 샘플에 대하여 농도 대비 입자 크기로 나타낸다.
RNA 분리 (RNA isolation): 총 RNA는 제조사의 안내에 따라 알엔이지 미니 키트 (RNeasy mini kit) (Qiagen)를 사용하여 3T3 세포, 액체-상 EV 및 MBV로부터 분리되었다. RNA 분리 전에, 액체-상 EV 및 MBV 샘플은 어떤 오염된 RNA를 분해하기 위하여 RNase A (10 μg/ml)로 37 °C에서 30분 동안 처리되었다. RNA 양은 나노 드롭 스펙트로포토메터 (NanoDrop spectrophotometer)를 사용하여 결정되었으며, 및 이의 질은 애질런트 바이오분석기 2100 (agilent Bioanalyzer 2100)을 사용하여 결정되었다.
RNA 서열분석 및 생물 정보학적 분석 (RNA sequencing and bioinformatic analysis): miRNA 라이브러리 제조는 각 샘플 100ng, 및 QIASEQTM miRNA 라이브러리 키트 (QIASEQTM miRNA Library Kit) (Qiagen) 로 제조사의 안내에 따라 시작되었다. 간략하게, 성숙된 miRNA는 어댑터 3' 및 5' 끝에 라이게이트 (ligated) 되었다. 라이게이트된 miRNA는 고유의 분자 색인 (unique molecular indices, UMI)을 가진 역 전사 프라이머 ((reverse transcription (RT) primer))를 사용하여 그 후 cDNA로 역 전사되었다. cDNA는 그 후 깨끗이 하여 어댑터를 제거하고, 이어서 보편적인 전진 프라이머 (universal forward primer) 및 샘플 색인을 부여하는 48개 역 프라이머 (reverse primers) 중의 하나의 역 프라이머로 라이브러리를 증폭시켰다. 전-서열 분석 질 조절 (pre-sequencing quality control)이 애질런트 RNA 스크린 테이프 시스템 (Agilent RNA ScreenTape System)을 사용하여 수행되었다. 차세대 서열 분석 (Next Generation Sequencing)이 로딩 농도 (loading concentration) 2.5 pM로 NextSeq 500 기기에서 수행되었다. 생물정보학 분석은 제네비아 기술 (Genevia Technologies) (Tampere, Finland)에 의해 수행되었다. 서열분석 리드 (sequencing reads)의 질은 FastQC 소프트웨어를 사용하여 검토되었다. 어댑터 서열을 제거하기 위하여, 모든 샘플에, 디폴트 세팅으로, TrimGalore! [Version 0.4.5;]가 사용되었다. 모든 리드 (read)는, fastx_트리머 소프트웨어 (fastx_trimmer software) (Hannon Lab에 의한 FASTX Toolkit; Version 0.0.14) 를 사용하여, 마이크로-RNA의 전형적인 크기인, 21 베이스로 줄였다.
각 샘플의 리드(read)는 그 후 해당하는 참조 유전체 (hg38, GRCm38)에 대항하여 정렬되었다. 샘플들에 대한 miRNA 수 (miRNA counts)의 테이블이 소프트웨어 보우타이 (bowtie) [Version 1.2.2] 및 miRDeep2 [Version 0.0.8]를 사용하여 생성되었다. 이 과정에서, 이 연구에 관련된 각종의 전구체-miRNA 및 성숙-miRNA 서열은 miRbase에서 가져왔다. 성숙된 miRNA의 수는 이들과 관련된 모든 전구체 miRNA의 중앙값을 취하여 얻어졌다. 모든 샘플의 성숙된 miRNA의 수는 DESeq2를 사용하여 정상화되었다. 추가의 분석 전에 데이터의 질을 확신하기 위하여, 주성분 요소분석 (principal component analysis, PCA)이 수행 되었으며 및 결과는 ggplot2를 사용하여, 쥐와 인간 샘플에서 별도로, 가시화되었다.
성숙된 miRNA 데이터의 정상화 (normalization) 및 샘플 그룹 사이의 통계학적 테스트는 DESeq2를 사용하여 수행되었다. P 값은 벤자미니-호흐버그 (Benjamini-Hochberg) 방법을 사용하여 다수 테스팅에 대하여 보정되었다. 조정된 p 값 < 0,05 및 절대 log2 배수 변화 (absolute log2 fold change) > 1을 가진 miRNA는 의미 있게 차이 나게 발현된다고 간주 된다. 차이 나게 발현되는 miRNA의 표는 실험적으로 테스트 된 miRNA-타겟 상호작용의 mirTARbase 데이터 베이스를 사용하여 이들의 타겟 및 이들의 신뢰도와 함께 해석되었다. 차이 나게 발현되는 miRNA는 또한 R 패키지 miRNAtap (R package miRNAtap)을 사용하여 예측되는 타겟과 또한 주석 (annotated) 되었다. miRNAtap은 5개의 다른 데이터 베이스(PicTar, DIANA, TargetScan, miRanda, miRDB)로부터 예측된 miRNA 타겟을 종합하고 및 전반적인 miRNA 타겟 소스를 계산한다. 주석에 포함될 잠재적인 miRNA 타겟 상호작용에 요구되는 최소 양의 데이터 베이스 소소는 3이었다.
독창성 경로 분석 (Ingenuity pathway analysis, IPA): 차이 나게 발현되는 (differentially expressed, DE) miRNA의 기능적 분석을 위해 독창성 경로 분석 소프트웨어 (Ingenuity Pathway Analysis software) (Version 01-14) 가 사용되었다. miRNA 타겟은 IPA 핵심 분석 (IPA Core Analysis)을 사용하여 동정 되었다. 필터는 IRNA에 의하여 영향을 받는 의미 있게 강화된 분자적 및 세포 적 기능 및 생리적 시스템 발달 기능에 대한 정보를 얻기 위하여 실험적으로 관찰된 (Experimentally Observed) 발견에 대하여 세트 되었다.
qPCR 평가 (qPCR validation): 역 전사 (Reverse transcription, RT) 및 정량적 폴리머라아제 중합 반응 (quantitative polymerase chain reaction)은 택만 고도 miRNA 에세이 프로토콜 (TAQMAN　 Advanced miRNA Assays Protocol)(Applied Biosystems)을 사용하여 수행되었다. 간략하게, 10ng의 총 RNA가 택만 고도 miRNA cDNA 합성 키트 (The TAQMAN　 Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit) (Applied Biosystems, Cat No. A28007)로 합성하고 및 3'-폴리(A) 꼬리 ((3'- poly(A) tail))를 miRNA에 붙이기 위하여 사용되었다. 폴리 (A) 꼬리를 인식하는 만능 RT 프라이머가 RT 반응에서 cDNA를 합성하기 위하여 사용되었으며, 이어서 cDNA 분자의 수를 증가하기 위하여 miRNA-AMP 전진 (forward) 및 역 (reverse) 만능 프라이머 (universal primers)를 사용하여 miR-AMP 단계가 이어졌다. qPCR이 택맨 훼스트 어드벤스 마스터 믹스 (TA1MAN　 Fast Advanced Master Mix) (Applied Biosystems, Cat No. 4444556) 및 mmu-miR-163-5p, mmu-miR-27a-5p, mmu-miR-92a-1-5p, mmu-miR-451a, mmu-miR-93-5p, 및 mmu-miR-99b-5p를 인식하는 특정한 택맨 고도 miRNA 에세이 (TAQMAN　 Advanced miRNA Assays) (Applied Biosystems, Cat No. A25576) 를 사용하여 퀀트스튜디오 시스템 기기 (QUANTSTUDIOTM system machine)에서 이루어졌다. 액체-상 EV를 참조로 사용하여 각 특정한 타겟에 대한 MBV 샘플에서의 발현 배수 변화가 계산되었다.
면역블럿 및 은 염색 에세이 (Immunoblot and silver stain assays): 세 개의 별도의 3T3 섬유아세포 배양으로부터 유래한 액체-상 EV 및 MBV는 각각 합쳐지고 및 나노추적 입자 분석 (nanotracking particle analysis)으로 정량화되었다. 면역블럿 (immunoblot) 및 은 염색 분석 (silver stain analysis)을 위해, 액체-상 EV 및 MBV 샘플 둘 다에서 같은 수의 소포체가 젤에 로드되었다. 21x 1011 MBV 또는 액체-상 EV가 5% β 머르캅토에탄올 (β mercaptoethanol) (Sigma-Aldrich)을 함유하는 2X 라에밀리 버퍼 (Laemmli buffer) (R&D Systems)와 혼합되고, 4 내지 20% 구 배 SDS-PAGE (Bio-Rad)에서 분리되고, 및 그 후 PVDF 멤브레인에 이전되었다. 멤브레인은 다음의 일차 항체로 하룻밤 동안 배양되었다: 토끼 항-CD63, 토끼 항-CD81, 토끼 항-CD9, 및 토끼 항-Hsp70, 1:1000 희석 (System Biosciences). 멤브레인은 염소-항-토끼 2차 항체로 1:5,000 희석 (System Biosciences)으로 배양되기 전 및 후에 각각 15분 동안 세 번 세척되었다. 세척된 멤브레인은 화학발광 기질에 (chemiluminescent substrate) (Bio-Rad) 노출되었고 및 그 후 캐미독 터치 기기 (ChemiDoc Touch instrument) (Bio-Rad)를 사용하여 가시화되었다. 젤의 은 염색 (Silver staining)은 제조사의 안내에 따라 실버 스테인 플러스 키트(Silver Stain Plus Kit) (Bio-Rad)를 사용하여 수행되었으며 및 캐미독 터치 기기 (ChemiDoc Touch instrument) (Bio-Rad)를 사용하여 가시화되었다.
인지질의 LC/MS 분석 (LC/MS analysis of phospholipids): 지질은 3T3 세포, 엑소좀 및 MBV로부터 폴취 공정 (Folch procedure)에 의해 추출되었다(J. Folch, et al, J biol Chem 226, 497-509 (1957)). 인지질 및 이들의 산화된 산물의 MS 분석은 OrbitrapTM FusionTM LumosTM 질량 스펙트로메터 (mass spectrometer) (ThermoFisher)에서 수행되었다 (Y. Y. Tyurina et al., ACS nano 5, 7342-7353 (2011)). 간략하게, 인지질은 정상 상 컬럼 (normal phase column) ((Luna 3μm Silica (2) 100Å, 150x 2.0 mm, (Phenomenex))에서 유속 0.2 ml/분으로 DIONEX ULTIMATE 3000 HPLC 시스템에서 분리되었다. 컬럼은 35 °C에서 유지되었다. 분석은 10 mM 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)를 함유하는 구 배 용매 (A 및 B) 를 사용하여 행 되었다. 용매 A는 프로판올: 헥산: 물 (propanol: hexane: water) (285:215:5, v/v/v) 를 함유하고 및 용매 B는 프로판올: 헥산: 물 (285:215:40, v/v/v)를 함유한다. 모든 용매는 LC/MS 등급이다. 컬럼은 0-23분 동안은 10% 내지 32% B로부터 선상 구 배 (linear gradient)로 용출시켰으며; 23-32 분 동안은 32-65% B 선상 구 배를 사용하였고; 32-35분은 65-100 % B 선상 구 배로: 35-62분은 100% B로 유지하였고; 62-64분은 100% 내지 10%의 선상 구 배로 용출하였으며 이어서 및 64 내지 80분 동안 10% B에서 평형 시켰다. 스펙트럼은 음성 이온 모드에서 얻어졌다. 중수소화된 인지질 (deuterated phospholipids)이 내부 표준 (internal standards) (Avanti Polar Lipids)으로 사용되었다. 재생산성을 평가하기 위하여 각 샘플에 대하여 세 번의 기술적인 반복이 수행되었다. LC/MS 데이터 분석은 소프트웨어 패키지 Compound DISCOVERERTM (ThermoFisher)를 사용하여 자체 생성된 분석 작업 순서 (in-house generated analysis workflow) 및 비-산화된/산화된 인지질 데이터 베이스와 함께 수행되었다. 지질은 잔류 시간 (retention time)에 의해 추가로 필터 되었으며 및 분절 질량 스펙트럼 (fragmentation mass spectrum)으로 확인되었다.
유리 지방산 및 이의 산화물의 LC/MS 분석 (LC/MS Analysis of free fatty acids and their oxidation products): 유리 지방산 (Free fatty acids)은 온-라인으로 Q-이그젝티브 하이브리드 쿼드루폴-오비트랩 질량 스펙트로메터 (Q-Exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer) (ThermoFisher Scientific, San Jose, CA) 와 커플된 DIONEX ULTIMATETM 3000 HPLC 시스템을 사용하여 LC/MS로 분석되었다 (Y. Y. Tyurina et al., Nature chemistry 6, 542 (2014)). 간략하게, 지방산 및 이의 산화 유도체는 구 배 용매 ((둘 다 5% 암모늄 아세테이트(ammonium acetate)를 포함하는 A:메탄올(20%)/물(80%)(v/v) 및 B: 메탄올(90%)/물(20%)(v/v))를 사용하여 C18 컬럼 (Accliam PepMap RSLC, 300μm 15 cm, Thermo Scientific)에 의해 분리되었다. 컬럼은 흐름속도 12 μL/분으로 선상 구 배를 사용하여 30% 용매 B 내지 95% 용매 B로 70분에 걸치고, 95% B로 70분 내지 80분 동안 유지시키고 이어서 초기 컨디션으로 83분까지 돌아오고 및 추가 7분 동안 재-평형시켜 용출시켰다. 스펙트럼은 음성 이온 모드에서 얻어졌다. 분석 데이터가 얻어졌으며 및 엑스칼리버 소프트웨어(Xcalibur software)를 사용하여 분석되었다. 재생산성을 증가하기 위하여 각 샘플에 대하여 최소 세 번의 기술적인 반복이 수행되었다.
결과 (Results)
액체-상 EV 및 기질 결합 나노소포체의 분리 (Isolation of liquid-phase EV and matrix bound nanovesicles): 돼지 방광 기질 (urinary bladder matrix, UBM) 로부터 유래된 ECM 바이오스케폴드 내에 박혀 있는 MBV의 고-해상도, 고-배율 이미지를 제공하기 위하여 스캐닝 전지 현미경 (Scanning electron microscopy, SEM) 이 수행 되었다. SEM 이미지는 대략 100nm 지름의 뚜렷한 구 (spheres)가 콜라겐 섬유 (collagen fibers) 전체에 퍼져 있음을 보여주었다 (도 1A). 고체 ECM 기질에 침착되어 있는 MBV가 액체-상으로 분비된 EV로부터 단리된 유일한 클래스의 세포 외 소포체 아닌지 조사하기 위하여, 소포체를 액체-상 (liquid-phase) 또는 고체-상 (solid-phase) 세포 외 분획으로부터 선택적 수확을 하도록 하는 시험관 내 3T3 섬유아세포 세포 배양 모델이 사용되었다 (도 1B). 상 비교 현미경 (phase contrast microscopy)으로부터의 대표적인 이미지, H&E 및 DAPI 염색된 부분에서 세포 배양 플레이트의 탈세포화 후에는 잔여 세포 또는 완전한 핵이 보이지 않음을 보여주었다 (도 1C). 세포 배양 상등액으로부터 수확된 액체-상 EV 및 탈세포화된 ECM으로부터 단리된 MBV (도 1D)의 TEM 이미지는 이들 두 소포체 집단은 비슷한 모양을 공유하고 있음을 보여준다. 더욱이, 나노입자 추적 분석 (nanoparticle tracking analysis, NTA) 분포 플럿은 대부분의 소포체가 지름 <200nm를 가지면서 액체-상 EV 및 MBV 둘 다 비슷한 소포체 크기를 보여 주었다 (도 1E).
MBV가 보통 엑소좀의 특성이라고 하는 마커들을 함유하는지 아닌지를 결정하기 위하여, 면역 블럿 분석이 CD63, CD81, CD9, 및 Hsp70에 대하여 수행되었다 (J. Lotvall et al. (Taylor & Francis, 2014)). 결과는 액체-상 EV와는 대조적으로, MBV는 CD63, CD81, CD9에서 현저한 감소를 보였음 보여준다. MBV는 면역 블럿 에세이에서 겨우 검출될 만하고 및 EV 에서의 발현수준에 비해 현저히 감소된 CD9 및 CD81의 수준을 발현하였다. MBV는 또한 EV 에서 관찰된 것보다 의미 있게 낮은 CD63 발현을 보였다 (도 1F). 다른 말로, 액체 상 EV (즉, 엑소좀)는 MBV에 비하여 CD63, CD81, CD9의 발현 수준이 강화되어 있다. 더욱이, 전기영동적으로-분리된 단백질의 은 염색 (silver staining)은 MBV는 액체-상 EV보다는 뚜렷이 다른 단백질 화물 (cargo)을 함유하고 있음을 보여주었으며 (도 1G) , 이는 MBV는 나노소포체의 독특한 부분모집단일 수 있음을 제시한다.
miRNA는 3T3 섬유아세포로부터 유래된 액체-상 EV 및 MBV로 선택적으로 패키징 된다: 이들 소포체들이 유래된 3T3 섬유아세포 모 세포에 대비하여 MBV 및 액체-상 EV에서 차이 나게 발현되는 miRNA를 목록화(catalog) 하기 위하여 포괄적인 차세대 RNA-서열 분석 (RNA-seq)이 적용 되었다. 생체분석기 분석 (Bioanalyzer analysis)은 액체-상 EV 및 MBV로부터 분리된 총 RNA에 18S 및 28S 리보조말 RNA (ribosomal RNA)는 없고, 및 작은 RNA 분자 (small RNA molecules) (<200 nt)는 강화되어 있음을 보여주었다. 그러나, 액체-상 EV에서 100-200 nt사의의 작은 RNA 분자가 현저하게 강화되어 있으면서 액체-상 EV로부터의 작은 RNA 크기 분포는 MBV 보다 훨씬 넓다 (도 2A). 분석은 모 세포 RNA, 액체-상 EV, 및 MBV 분리 물(그룹당 n=3)로부터 생성된 miRNA 라이브러리에 대하여 차세대 서열분석을 수행하여 차별된 miRNA 특징에 초점을 두었다. 주성분 분석 (Principal component analysis, PCA)은 각 그룹 내에서, 복제된 miRNA 프로파일은 서로 가깝게 클러스터 되어 있음을 보여주었다 (도 2B).
모 세포 및 액체-상 EV 및 MBV 분리 물 사이에 miRNA 함량에 있어서 상당한 차이가 관찰되었다. 전반적으로, 28 (50.91%) miRNAs가 액체-상 EV에 비교하여 적어도 2배 차이 나게 MBV 에서 발현되는 것이 발견되었다 (도 2C). 추가로, 각 액체-상 EV 또는 MBV 및 모 세포 miRNA 프로파일은 분명하게 달랐다 (도 2B, 도 2C). miRNA 서열분석의 결과를 평가하기 위하여, RT-qPCR이 수행되었으며 3T3 섬유아세포로부터 분리된 액체-상 EV와 비교하여 MBV 에서 상향조절된 3개의 miRNA (miR-163-5p, miR-27a-5p, miR-92a-1-5p) 및 하향조절된 3개의 miRNAs (miR-451a, miR-93b-5p, miR-99b-5p)가 검출되었다 (도 2D). 이 결과는 액체-상 EV에 비교하여 MBV에서 miR-163-5p, miR-27a-5p and miR-92a-1-5p의 수준이 상향조절되고, 및 miR-451a, miR-93b-5p and miR-99b-5p 수준은 하향조절됨을 보여주었고, 이로써 miRNA 서열분석 데이터로부터의 결과를 입증하였다. 액체-상 EV에 비교하여 MBV에서 차이 나게 강화된 miRNA의 독창성 경로 분석 (Ingenuity Pathway Analysis, IPA)은 기관 및 시스템 발달 및 기능과 강하게 연관되어 있음을 보여주었다. 반면에, MBV 에 비교하여 액체-상 EV에서 차이 나게 강화된 miRNA는 세포 성장, 발달, 증식 및 모양에 관여된 경로와 연결되었다 (도 2E).
MBV miRNA 함량은 세포 기원에 따라 고유하다: 3T3 섬유아세포 모델의 결과는 세포 배양 상등액으로 분비되는 액체-상 EV 에 비교하여 ECM에 침착된 MBV 내에 miRNA가 선택적으로 패키징 됨을 보여주었다. MBV miRNA 화물 (cargo)이 세포 기원에 고유한 것인지 아닌지를 결정하기 위하여, 다른 인간 공여자 (donors)로부터 단리된 골수-유래 줄기세포 (bone marrow-derived stem cells, BMSC), 지방 줄기세포 (adipose stem cells, ASC) 및 탯줄 줄기세포(umbilical cord stem cells UCSC)에 의해 시험관 내에서 생산된 ECM으로부터 분리된 MBV의 miRNA 조성이 규명되었고 및 차세대 서열분석 방법으로 비교되었다. 탈세포화된 BMSC 세포 배양 플레이트의 대표적인 상 비교 현미경 이미지는 세포가 없음을 보여 주고 및 가지형 미소섬유 구조 (branched fibrillar structures) 를 보여준다 (도 3A). 탈세포화된 BMSC 세포 배양 플레이트로부터 분리된 MBV의 TEM 이미징은 세포 외 소포체의 특성인 특징적인 모양을 보여주었다 (도 3B). 더욱이, 나노입자 추적 분석은 대부분의 소포체가 지름 <200nm를 가지며, BMSC, ASC, 및 UCSC-유래한 MBV 사이에 비슷한 분포 플럿을 보였다 (도 3C-3E). 이들 샘플들로부터 총 RNA 분리 후에, 생체분석기 분석은 리보조말 RNA의 부재 및 작은 RNA 분자 (<200 nt)의 강화를 보여주었다 (도 3F). miRNA 라이브러리가 샘플들로부터 (BMSC, n = 3 인간 공여자; ASC, n = 3 인간 공여자; UCSC, n = 3 인간 공여자) 생성되었으며 및 miRNA 서열 분석이 되게 하였다. 주성분 분석은 샘플은 주로 이들이 유래된 세포 타입에 의해 클러스터 됨을 보여주었다 (도 3G). MBV 샘플을 생성하기 위하여 사용된 각 세포 타입을 위해 세 명의 별도의 인간 공여자의 사용에도 불구하고, 주성분 분석은 각각의 그룹 내에 miRNA 프로파일에서 높은 정도의 균질성을 보여주었다 (도 3G). 추가로, 화산 플럿 (volcano plots)은 BMSC-ASC 및 UCSC-ASC 사이에서 보다 BMSC 및 UCSC-유래된 MBV 사이에서 더 적은 miRNA가 차이 나게 발현됨을 보였다.
액체-상 EV, MBV, 및 모 세포의 인지질 프로파일 (Phospholipid profiles of liquid-phase EV, MBV, and parent cells): 몇몇 연구에서 EV의 지질 조성이 규명되었다 (T. Skotland, et al, Journal of lipid research 60, 9-18 (2019)). 그러나, MBV의 인지질 조성에 대한 데이터는 없다. 이들의 3T3 섬유아세포 모 세포에 비교하여 MBV 및 액체-상 EV의 인지질 조성을 비교적으로 평가하기 위하여 LC-MS 기반을 둔 글로벌 지질체학 (global lipidomics) 및 산화환원 지질체학 (redox lipidomics) 분석이 그러므로 수행되었다 (도 4A, 도 4D). 세 가지 타입의 샘플에 걸쳐서 아홉 개의 주요 인지질 클래스가 검출되었으며, 검출된 총 분자 종의 수는 536으로 다음의 주요 클래스 사이에 분포되었다: bis-모노아실글리세로포스페이트 (bis-monoacylglycerophosphate, BMP) - 59종, 포스파티딜글리세롤 (phosphatidylglycerol, PG) - 37종, 카디오리핀 (cardiolipin, CL) - 117종, 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidylinositol, PI) - 33종, 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine, PE) - 102종, 포스파티틸세린 (phosphatidylserine, PS) - 45종, 포스파티딕 에시드 (phosphatidic acid, PA) - 26종, 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) - 107종, 및 스핑고마이엘린 (sphingomyelin, SM) - 10종 (도 4D). 이들의 폴리불포화 지방산 (polyunsaturated fatty acid, PUFA) 잔기의 함량에 있어서, PE, PI, PC 및 PS는 4-7 이중 결합을 함유하는 이들 폴리불포화 PL 종의 주요 저장소를 대표한다 (도 4B). 이들 PUFA 인지질은 신호전달 지질 매개체의 유사 전구체를 대표한다. 매개체의 형성은 5-리포옥시게나아제 (5-lipoxygenase) 또는 15- 리포옥시게나아제 (15-lipoxygenase)에 의하여 PUFA 인지질의 촉매적 산소화 (catalytic oxygenation)를 통해 일어나 산소화 된 인지질을 생산하고 이는 이어서 특정화된 포스포리파제 A2 (specialized phospholipases A2) 중 하나에 의하여 가수분해되어 산소화된 지방산 (지질 매개체)을 방출한다 (Z. Zhao et al., Endocrinology 151, 3038-3048 (2010); Y. Y. Tyurina et al., Journal of leukocyte biology, (2019)). 추가로, 산소화 된 PUFA 인지질은, 사멸 (apoptosis), 페롭토시스(ferroptosis) 및 염증 (inflammation)을 포함하는, 많은 세포 내 공정 및 세포 반응을 조정하는 신호전달 분자로서 작용한다((Y. Y. Tyurina et al., Antioxidants & redox signaling 29, 1333-1358 (2018)). 이들 인지질 및 이들의 상대적인 함량의 분자적 종 분화에서 의미 있는 차이가 액체-상 EV 및 MBV 사이에서 관찰되었다 (도 4E). 주목할만하게 SM을 제외하고, 아라키도닉 에시드 (arachidonic acid, AA)- 및 도코사헥사에노익 에시드 (docosahexaenoic acid, DHA)-잔기는 모든 인지질에서 검출되었다 (도 4E). 많은 인지질에서, 양은 액체-상 EV 및 모 세포 대비 MBV 에서 의미 있게 더 높았으며 (도 4E), 이는 MBV를PUFA-인지질의 풍부한 저장소로서 동정한다. PUFA-인지질은 PLA2에 의하여 가수분해될 수 있어, 유리 PUFA 및 LPL의 방출의 결과가 된다 (V. D. Mouchlis, et al, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1864, 766-771 (2019)). 전자는 두 개의 주요 옥시게나아제 (oxygenases), COX 및 LOX에 의해 추가로 이용될 수 있어 전 (pro-) 또는 항-염증성 능력을 갖춘 지질 매개체를 생산한다(Y. Y. Tyurina et al., Redox (phospho) lipidomics of signaling in inflammation and programmed cell death. Journal of leukocyte biology, (2019); C. A. Rouzer, et al., Chemical reviews 103, 2239-2304 (2003).; H. Kuhn, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1851, 308-330 (2015)). 이 발견은 세포/조직의 맥락에 의존적으로 MBV가 이들 지질 매개체 합성의 잠재적인 전구체로서 자격이 있게 한다(Y. Y. Tyurina et al., Journal of leukocyte biology, (2019).). 정량적으로, MBV는 PI, PS, PG 및 BMP에서 강화되었다 (도 4C 및 표 2). 도 4C에서 보여준 인지질 함량이 표 1에 또한 제공된다.
[표 1] 총 인지질의 퍼센트로서의 인지질 함량
Figure pct00001
반대로, PE, PA 및 SM의 함량은 액체-상 EV에서 더 높았다. PC는 세포 및 액체-상 EV에서 우세한 인지질이었다. 유일한 마이토콘드리아 인지질인, 카디오리핀 (cardiolipin, CL), 은 MBV 및 모 세포에 비교하여 액체-상 EV 에서 의미 있게 더 낮았다 (도 4F). CL은 마이토콘드리아 내막에 우세하게 위치 해있는 유일한 마이토콘드리아-특이적인 인지질이기 때문에 (M. Schlame, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1862, 3-7 (2017)), 이 발견은 MBV의 생체생성이 세포의 마이토콘드리아 분획과의 연결 가능성을 나타낸다. 플라스마로겐 인지질 (plasmalogen phospholipids) ((또는 에테르 인지질 (ether phospholipids))은 구조적으로 디아실-인지질 (diacyl-phospholipids) ((또는 에스테르-인지질 (ester-phospholipids))과 다르다 (M. Schlame, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids 1862, 3-7 (2017)). 플라스마로겐에서, 비닐 에테르 결합 (vinyl ether bond)은 sn-1 포화 된 또는 모노불포화 된 체인을 인지질의 글리세롤 뼈대 (glycerol backbone)에 연결하고 있다 (N. E. Braverman, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease 1822, 1442-1452 (2012)). 에테르 지질 (ether lipids), PE 및 PC 플라스마로겐 (plasmalogens),은 막 융합을 촉진할 수 있고 (P. E. Glaser, et al., Biochemistry 33, 5805-5812 (1994)) 및 세포 외 소포체의 막 두께를 증가할 수 있으며 (X. Han, et al., Biochemistry 29 , 4992-4996 (1990); T. Rog, et al., Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 1858, 97-103 (2016)), 및 그러므로 세포에 의한 나노소포체 흡수에서 한 역할을 할 수 있음이 나타났다. 상세한 MS/MS 분석은 액체-상 EV 및 MBV 둘 다에서 높은 수준의 에테르 PE (ether PE) 및 PC 종 (플라스마로겐) 을 보였다. 이들 종은 각각 PE-16:0p/20:4, PE-16:1p/20:4, PE-18:1p/20:4, PE-18:1p/22:6 및 PC-16:0p/20:4, PC-18:0p/20:4, PC-20:0p/20:4, PC-18:0p/22:6, 로서 동정되었다 (도 4E).
표 2. MBV, 엑소좀 및 3T3 모세포에서 카디오리핀 (cardiolipin), 포스파티딕 에시드 (phosphatidic acid), 포스파티딜글리세롤 (phosphatidylglycerol) 및 비스-모노글리세로포스페이트 (bis-monoglycerophosphate)의 함량. 데이터는 인지질의 pmol/nmol, means±s.d., *p<0.05 대비 세포, #p<0.05 대비 액체-상 EV로서 제시된다.
[표 2]
Figure pct00002
액체-상 EV, MBV, 및 모 세포의 라이소인지질 프로파일 (Lysophospholipid profiles of liquid-phase EV, MBV, and parent cells): 포스포리파아제 A (phospholipases A)에 의하여 만들어지는 인지질의 가수분해 대사물인, 라이소인지질 (Lysophospholipids, LPL)은, 다른 것들 중에서, 대식세포 활성화 (R. Ray, et al., Blood 129, 1177-1183 (2017)) 염증 및 섬유화 (A. M. Tager et al., Nature medicine 14, 45 (2008)), 조직 수선 및 리모델링 (K. Masuda, et al., The FEBS journal 280, 6600-6612 (2013)), 및 상처 치유 (wound healing) (K. M. Hines et al., Analytical chemistry 85, 3651-3659 (2013))를 포함하는, 다양한 생리적 반응을 조절하는 생체 활성 신호조절 분자이다. LC-MS 분석은 LPL이 모 세포에 비교하여 MBV 및 액체-상 EV에서의 이의 총 함량이 1.7-1.8 배 더 클지라도 세 가지 타입의 샘플에서 다 존재함을 보였다. 좀 더 구체적으로, 일곱 클래스의 LPL이 동정 되었다: 라이소포스파티딜 에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine, LPE), 라이소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine, LPC), 라이소포스파티딜세린 (lysophosphatidylserine, LPS) 라이소포스포이노시톨 (lysophosphoinositol, LPI), 라이소포스파티딕 에시드(lysophosphatidic acid, LPA), 라이소포스파티딜글리세롤(lysophosphatidylglycerol, LPG) 및 모노라이소카디오리핀 (monolysocardiolipin, mCL) (도 5A). MBV는 모 세포에 비교하여 LPE, LPA 및 LPG가 강화되었다 (도 5B). LPI 및 mCL의 함량은 세포에 대비하여 MBV 및 액체-상 EV에서 의미 있게 더 낮았다. LPA 및 LPG의 함량은 EV에 비교하여 MBV 에서 의미 있게 더 높았다. MBV 에서 mLCL 및 LPI의 수준은 EV에서보다 3- 및 6.3 배 더 높았으나 세포에 비교하여 3.3- 및 1.9배 더 낮았다 (도 5C, 도 5D). MBV 및 EV 사이에서는 LPE, LPC 및 LP의 함량의 의미 있는 변화는 발견되지 않았다. 16:0, 16:1, 18:0 및 18:1을 함유하는 비-산화 가능한 분자 종이 검출된 모든 LPL 종에서 발견된 주요 타입이었다 (도 5C). 이 발견들은, 대식세포 분화, 조직 수선, 리모델링 및 상처 치유에 중요한 생체 활성 분자인, 라이소포스포리피드 (lysophospholipids)의 높은 수준은 MBV의 특징적 특성임을 제시한다.
MBV 및 액체-상 EV의 유리 및 산소화 된 지방산의 분석 (Analysis of free and oxygenated fatty acids of MBV and liquid-phase EV): 쥐 골수 유래한 대식세포의 MBV에의 노출이, 구조상의 대식세포 표현형과 연관되는 M2-유사 마커인, Fizz1 및 Arg1, 의 발현의 결과가 되므로 (L. Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)), PUFA 및 이들의 산소화 된 산물의 LC/MS 분석이 MBV 대비 액체 상 EV 및 모 세포에서 수행되었다. MBV는 아라키도닉 (arachidonic) (20:4, AA), 도코사헥사에노익(docosahexaenoic) (22:6, DHA) 및 도코사펜타에노익 (docosapentaenoic)(22:5, DPA) 지방산이 강하게 강화되었다 (도 6A). 다른 말로, MBV는 신호전달 지질 매개체의 해당하는 효소적 기전- COXs 및 LOXs 에 의한 생합성을 위한 기질의 저장소를 대표한다. 액체 상 EV에서, 주요 PUFA는 리놀레익 (linoleic) (18:2) 및 리놀레닉(linolenic) (18:3) 에시드 이었다 (도 6A).
세포 외 소포체가 AA-유래된 지질 매개체의 생합성을 위한 효소적 기기 (enzymatic machinery)를 함유하므로 (E. Boilard, Journal of lipid research 59, 2037-2046 (2018)), 산화된 지방산의 산화환원 지질체학 분석 (redox lipidomics analysis)이 수행 되었다. 12-HETE, 15-HETE, 리폭신 A4 (lipoxin A4 ) 와 같은 AA 대사물의 높은 수준이 액체-상 EV 대비 MBV에서 발견되었다 (도 6B). 조직 수선의 맥락에서, 아라키도닉 (arachidonic) (20:4, AA) 및 도코사헥사에노익(docosahexaenoic) (22:6, DHA) 에시드에 의해 생산된, 리폭신 A4 (lipoxin A4, LXA4) 및 D-시리즈 레졸빈 D1 (D-series resolvin D1, RvD1)은 M2-유사 표현형으로 대식세포 활성화를 자극한다(C. N. Serhan, The American journal of pathology 177, 1576-1591 (2010)). 최종으로, MBV 및 액체-상 EV에 있는 산화된 AA 및 DHA를 함유하는 산화된 인지질이 규명되었다. 산화된 종의 수준은 액체-상 EV에서 보다 MBV에서 더 높았으며, 여기서 PS, PI 및 PC는 모노-산화된 종 (mono-oxygenated species)으로 대표된다. BMP, PG 및 CL은 단일- 및 이중으로- 산소화 된 AA- 및 DHA- 잔기를 함유하였다; 삼중으로-산소화 된 PUFA는 단지 PE 에서만 발견되었다 (도 6C). 전반적으로, 지질체학 (lipidomics) 및 산화적 지질체학 (oxidative lipidomics) 결과는 유리 AA, DHA 및 DPA 및 PUFA-함유하는 인지질의 수준은 물론 이들의 산화적으로 수정된 분자 종들의 수준이 액체-상 EV에 있는 이들에 비교하여 MBV에서 더 높은 것을 보여준다. 액체-상 EV가 아닌, MBV 가 PUFA 비-산소화된 및 산소화된 인지질에서 강화되었으며 및 그러므로 산화된 및 산화 가능한 에스테르화된 PL 종의 잠재적 저장소를 대표하며, 이는 세포 외 환경의 전-/항-염증의 맥락 (pro-/anti-inflammatory contexts)에 따라 다른 포스포리파아제 (different phospholipases)에 의해 활성화된 지질 매개체의 잠재적 소스를 나타낸다.
상기-언급된 LC-MS-기반을 둔 지질체학 및 산화환원 지질체학 연구는 액체-상 EV 및 MBV 인지질의 상세한 비교를 수행하기 위하여 진행되었다. 혈관 내 화물(cargo)의 포괄적인 RNA 서열 분석 및 생물정보학 분석을 조합하였을 때, 이들 데이터는 MBV는, 액체-상 EV (즉, 엑소좀)와는 뚜렷이 다른, EV의 뚜렷하고 및 유일한 부분 모집단이고 및 유사점은 소포체의 크기 및 모양에 국한하면서, ECM-기반을 둔 생체 물질의 특색있는 특징을 반영한다.
여기서, 소포체 집단은 액체-상 세포 배양 배지 또는 고체-상 ECM 기질로의 이들의 구획화에 기반을 두어 분별 된다. 조성에 관한 한, 3T3 섬유아세포의 ECM으로부터 분리된 MBV는 액체-상 EV 및 모 세포에 비교하여 차이 나는 miRNA 및 지질 특징을 함유하였다. 이들 데이터는 소포체 생체생성 동안에 miRNA 및 지질을 다른 세포 외 장소로 가도록 되어 있는 소포체로 특별하게 배포하기 위하여 분자 분류가 일어나는 시나리오를 제시한다. 더욱이, 액체 경계면 및 고체 기질 사이를 구별하는 세포의 능력, 및 뚜렷한 지질 특징을 가진 소포체의 맞춤형 부분모집단 (tailored subpopulations of vesicles)을 본질적으로 다른 구획에 선택적으로 침착시키는 세포의 능력은 액체-상으로 분비되는 EV의 생체생성과는 다르고 및 독립적인 MBV의 막 생체생성의 증거를 제공한다. MBV가 세포 외 기질의 빽빽한 소섬유 네트워크 내에 통합되어 있는 것으로 보인 것을 고려하면, MBV는 조직 발달 및 항상성 (homeostasis) 동안에 기질 침착 동안에, 및 상처 후에 다이나믹한 기질 리모델링 동안에 ECM 성분과 조화되어 세포에 의해 분비되어야 한다. 더욱이, ECM이 조직-특이적인 3D 구조물(architecture)로 배열된 프로테오글라이칸 (proteoglycans) 및 글라이코사미노글라이칸 (glycosaminoglycans) 단백질의 복잡한 혼합물인 것을 감안하면 ((Hussey et al., Nature Review Materials, 3(7):159-173, 2018)), MBV 화물 (cargo) 및 지질 함량은 조직 및 세포 기원에 또한 고유해야만 한다. 해부학적으로 구별되는 소스 조직으로부터 유래된 ECM 바이오스케폴드로부터 분리된 MBV는 차이 나는 miRNA 특징을 가지고 있다 (Huleihel et al., Science Advances, 2, e1600502, 2016). 본 연구로부터의 결과는 다른 인간 공여자로부터 유래된 골수-유래된 줄기세포, 지방 줄기세포 및 탯줄 줄기세포에 의해서 시험관 내에서 생산된 ECM으로부터 분리된 MBV는 세포 소스에 특이적인 뚜렷한 miRNA 특징을 함유하였다는 것을 추가로 보여준다. 그 외에 추가로, 더 적은 miRNAs가 BMSC-ASC 및 UCSC-ASC 사이에서 보다 BMSC 및 UCSC-유래된 MBV 사이에서 차이 나게 발현되는 것이 발견되었으며, 이 발견은 지방 줄기세포의 조직-특이적인 분화 잠재력에 기인할 수 있다 (L. Xu et al., Stem cell research & therapy 8, 275 (2017)). 이 발견들은 MBV IRNA 프로파일의 세포-특이적인 특징을 추가로 강조하며, 이는 공여자의 본질적인 다양성에 의해 의미 있게 영향을 받지는 않았다. 그러나, 세 인간 공연자가 모두 남자라는 것을 감안하면, 줄기세포 샘플로부터 MBV의 miRNA 화물(cargo)에서 성-관련된 다양성을 결정하기 위한 추가의 연구가 보장된다 (warranted). 중요하게, 주성분 분석은 다른 인간 공여자로부터 분리된 특정한 세포 타입에 의해 침착된 MBV로부터의 miRNA 화물 (cargo)의 높은 정도의 배치-배치 간 (batch-to-batch) 균일성을 보여주었으며, 이는 MBV 및 ECM 생체물질 제조를 연구 도구 또는 임상적 치료제로서 지원한다. 본 연구는 기질에 통합된 MBV는 EV의 고유한 부분모집단임을 확립했다. 추가로, MBV 는 보통 엑소좀에 특징인 단백질 (예를 들어, CD63, CD81, CD9) 이 현저히 감소됨이 보였다.
체액으로 분비되고 및 세포-세포 신호전달이 쉽게 가능한 EV와는 반대로, 조직 ECM 내에 박혀 있는 MBV는 기질과 안정적으로 연관되어 있으며 및 ECM 재료의 분해 후에만 단지 분리될 수 있다 (Huleihel et al., Science advances 2, e1600502 (2016)). MBV를 방출하기 위한 기질 분해의 요구사항은, 전-분해하는 지질 매개체 (pro-resolving lipid mediators)를 생성하는 이들의 능력과 관련되는 그런 것을 포함하는, 이들의 반응 기전을 부분적으로 정의할 수 있다. MBV는 탈세포화 후에도 온전히 남아 있고 및 ECM에 부착되어 있기 때문에, 이들의 구성 성분 인지질의 분자적 종 분화는 그러한 MBV-ECM 상호작용을 촉진하는 경향이 있다. LC-MS-기반을 둔 지질체학 및 산화환원 지질체학 접근 방법을 사용하여, MBV 인지질, 라이소인지질 (lysophospholipids) 및 산소화 된 및 비-산소화 된 PUFA의 분자 종 분화의 상세한 성질규명이 수행되었다. 높은 수준의 라이소인지질, 대식세포 분화, 조직 수선, 리모델링 및 상처 치유에 중요한 생체 활성 분자들이, MBV의 특징적인 특성이다. 추가로, 융해성 지질로서, 라이소인지질은 소포 함유물을 세포 내 타겟으로의 수송을 촉진시킬 수 있다. 액체-상 EV 가 아닌, MBV는 PUFA 비-산소화 된 및 산소화 된 인지질이 강화되어 있으며 및 그러므로 산화된 및 산화 가능한 에스테르화 된 PL 종의 잠재적인 저장소를 대표한다. 주목할만하게, PUFA-강화된 MBV는 세포 외 환경의 전-/항-염증성 맥락에 따라 다른 포스포리파아제 (phospholipases)에 의해 활성화되는 지질 매개체의 중요한 소스이다.
실시 예 2: 프리스탄-유도된 관절염의 치료를 위한 MBV의 용도 (Use of MBV for Treatment of Pristane-Induced Arthritis)
방광 기질 (Urinary bladder matrix)은 실시 예 1에서 서술된 대로의 방법론을 사용하여 제조되었다.
MBV는 실험실에서 생산된 돼지 UBM으로부터 리베라아제 TL (Liberase TL) ((매우 정제된 콜라게나아제 I (Collagenase I) 및 콜라게나아제 II (Collagenase II))로 버퍼 (50mM Tris p H7.5, 5mM CaCl2, 150mM NaCl)에서 24시간 동안 실온에서 궤도 로커 (orbital rocker) 위에서 효소적으로 소화시켜 분리되었다. 소화된 ECM은 그 후 10,000 xg 에서 30분 동안 원심분리 되게 하여 ECM 잔해를 제거시켰다. 유리된 MBV를 함유하는 깨끗해진 상등액은 그 후 100,000 xg (Beckman Coulter Optima L-90K 초 원심분리기) 4 ºC에서 2시간 동안 원심분리시켜 MBV를 펠렛화 하였다.
이 실시 예에서, 염증성 제제, 프리스탄 (pristine)으로 처치된 쥐 모델에서 MBV의 전신적 및 국소적 투여 후에 항-염증성 효과가 평가되었다. 쥐에서 프리스탄-유도된 (pristane-induced) 관절염 모델은 류머티스성 관절염의 연구에 임상적으로-상응하는 동물 모델로서 확립되었다 (Tuncel et al. PLoS One. 2016; 11(5):e0155936). 프리스탄-유도된 관절염은 8-주령 암컷, 스프라그-다우레이 (Sprague-Dawley) 쥐에서 300 μL 프리스탄 (pristine) ((2,6,10,14-테트라메티팬타데칸 (2,6,10,14-tetramethypentadecane))을, 밑 (base)에서 1cm 떨어진 꼬리의 등 쪽에 피부 내 주사로 연구 0일에 주사하여 유도되었다. 대조군 동물은 0일에 프리스탄의 피부 내 주사를 받지 못했다. 두 번째 용량의 300 μL 프레스탄이, 등 쪽 꼬리 밑에서 약 1cm 떨어져 4일째에 피부 내로 투여되었다. 프리스탄을 받은 동물은 케이지에 함께 두었다. 프리스탄을 받은 동물은 무작위로 다음의 실험 그룹으로 나뉘었다: 프리스탄-만 (pristane-only), 메토트랙세이트 (methotrexate), 관절 주위 MBV (periarticular MBV), 및 정맥 내 MBV (intravenous MBV). 관절 주위 및 정맥 내 MBV 투여 경로의 묘사가 도 7에 보여진다.
관절염 스코어가 7, 10, 14, 17, 21, 28일째 그 후 매주 끝 지점 100일째 동안까지 각 동물에 대하여 측정되었다. 각 앞발 및 뒷발의 사진을 손바닥 및 발바닥 각도로부터 보아 각각 찍었다. 관절염은 60-점 관절염 스코어링 기준을 사용하여 평가되었다: 염증이 있는 각 손가락관절 및 발가락에 1점이 주어졌고 및 영향을 받은 발목에 5점까지 할당되었다 (한 발 당 15점, 각 쥐 당 60점). 프리스탄-만 (Pristane-only)으로서 디자인된 동물은 7, 10, 14, 17, 및 21일에 어느 처치도 받지 않았다. 메토트랙세이트 (methotrexate) 동물은 1X 멸균 PBS에 있는 0.1 mg/kg 메토트랙세이트를 7, 10, 14, 17, 및 21일째에 복강 내로 전달받았다. 관절 주위 MBV 동물은 뒷발 및 앞발의 발바닥 (plantar)및 손바닥 (volar)의 표면에 전달된 25 μL 의 500 μg/mL 돼지-유래한 UBM MBV를 각각 받았다. 정맥 내 MBV 그룹은 동물의 측면 꼬리 정맥으로 정맥 내로 전달된 100 μL 의 500 μg/mL UBM MBV를 받았다. 각 그룹에 4 동물이 28일의 단기-연구에 할당되었으며 및 4 동물이 100일 연구에 할당되었다. 샘플 크기는 미리 결정된 알파 0.05 및 베타 0.80으로 이전에 발행된 메토트랙세이트의 효과 크기를 사용하여 결정되었다. 관절염 스코어는 평균 +/- 평균의 표준 오차로서 표시된다. 7-21 일은 각 그룹에 n 이 8을 대표하며 및 그 후 28일 및 그 후부터는 각 그룹에 n 이 4를 대표한다. 그룹에서의 차이는 터기의 포스-혹 교정 (Tukey's post-hoc correction)과 함께 두-방향 분산 분석 (two-way analysis of variance)을 사용하여 분석되었다. 알파 0.05로 연구하기 전에 중요성이 결정되었다.
타겟된 PA ((관절 주위 (periarticular)) 및 전신적 IV 투여 둘 다를 통한, MBV의 투여는 쥐에서 관절염의 심각 도를 의미 있게 감소시켰으며, 케어 (care)의 최적 표준인, 메토트랙세이트와 비슷한 효력을 보였다. 모든 쥐들이 7일째 날에 관절염 스코어 0을 보인 반면 (도 8A), 빠르면 10일째와 같이, 높은 관절염 스코어가 프리스틴-만인 쥐에서 관찰되었으며, 및 치료를 받은 모든 쥐는 더 낮은 관절염 스코어를 보였다 (도 8B). 놀랍게도, 13일째를 시작으로, MBV 치료는, 최적 표준의 관절염 치료인, 메토트랙세이트처럼 효율적이었다 (도 8C 및 8D). 21일째에, MBV 처치된 쥐는 (IV 및 PA 처치된) 메토트랙세이트 처치된 쥐보다 더 낮은 관절염 스코어를 보였다 (도 8E). 쥐의 발을 찍은 사진은 프리스탄-만 (pristane-only) 및 메토트렉세이트 (methotrexate) 및 MBV 처치된 쥐에서 홍반(erythema) 및 부종(edema)에서 차이를 보였다 (도 9-도 9B). 첫 번째 21일 실험에서 처치된 그룹들 간에서 평균 관절염 스코어가 도 10에 보여준다. MBV의 PA 투여가 프리스탄-만의 쥐에 비교하여 관절염 스코어에서 비교될 만한 감소, 및 메토트렉세이트 처치에 비교될 만한 감소된 관절염 스코어를 보이는 반면, 정맥 주사 투여가 관절염 스코어를 감소하는데 PA 및 메토트렉세이트와 똑같은 효력을 가진 것이 놀랍게도 발견되었다. IV 투여가 MBV의 역가를 희석하는 결과가 있고 및 그러므로, 만약 있다면, 염증이 있는 관절에 제한된 효과를 가질 것으로 기대되었지만, 이는 관찰되지 않았다. 놀랍게도, MBV 투여의 PA 및 IV 경로 둘 다 프리스탄-만의 쥐에 비교하여 관절염 스코어에서 비교될 만한 감소를 보였고, 및 둘 다 메토트렉세이트 처치와 비교될 만한 감소된 관절염 스코어를 보였다. 염증이 있는 부위에 관절-주위 주사는 고통스럽고 및 한 개인의 많은 관절이 염증이 있을 수 있기 때문에, MBV의 정맥 내 투여가 PA 투여처럼 효과적이라는 이 기대하지 않았던 발견은 전신적 전달 경로가 덜 침습적이지만 그래도 동등하게 효과적인 치료 효과를 위하여 사용될 수 있고, 한 투여 당 단지 일 회 주사만 필요로 하고 (관절마다 다수의 주사보다는) 및 그러므로 환자에게는 좀 더 편안하다는 것을 제시한다.
기대하지 않게, MBV를 IV 및 PA 투여 둘 다로 투여받은 쥐에서 염증성 재발 또한 감소 되었다. 실험 77일을 통해 수집된 데이터는 MBV 처치를 만성 및 재발 단계의 염증에 있는 관절염의 효과적인 치료로서 지지한다. 도 11A의 사진에서 보여준 대로, 표현형적으로, PA 또는 IV MBV로 처치된 쥐발은 메토트렉세이트로 처치된 쥐발과 같은 홍반 및 부종을 보였다. PA 및 IV MBV는 염증의 만성 및 재발 단계에 있는 프리스탄-유도된 관절염 임상적 스코어링을, 류머티스성 관절염 (Rheumatoid Arthritis) 관리에 최적 표준인, 메토트렉세이트와 동등한 효력으로 감소시킨다 (도 11B). 류머티스성 관절염 쥐 모델로부터의 조직 분석은 조직 염증 및 조직 간의 감소된 공간의 결과를 보였다. MBV-처치된 샘플에서는, 메토트렉세이트 처치에서 관찰된 것과 견줄만한 공간의 회복 및 감소된 염증이 있었으며, 이는 기관 및 조직-수준 둘 다에서 MBV의 효력을 나타낸다.
24일째 날에 생쥐로부터 수집된 혈청을 사용하여, 효소-연결된 면역흡착 에세이 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)로 전-염증성 사이토카인의 분석이 평가되었다. 도 12 에서 보여준 대로, 프리스탄-만으로의 동물에 비교하여, 관절 주위로 또는 정맥 내로 투여된 MBV는 IL-1-베타의 혈청 수준을 의미 있게 감소시켰다 (도 12B). 추가로, 국소적으로 투여된 MBV (즉 PA MBV)는 TNF 알파 혈청 수준의 감소의 결과를 보였다 (도 12A). 이들 데이터는 MBV 가 면역 시스템의 조절제라는 것을 강하게 제시한다.
종합하면, 이들 실험으로부터의 데이터는 MBV의 초기 치료코스는, 전신적이거나 또는 국소적이거나, MBV 목표의 초기 처치 코스 후에 몇 주 또는 몇 달 동안 관절염 증상을 완화하는 치료적 효과를 가질 수 있고, 그러므로 이어지는 류머티스성 관절염 증상의 갑작스런 재발 (flare)의 심각성 또는 빈도를 감소시키거나 또는 이들을 제거하기까지 하여, 감퇴시키는 (remission) 결과가 될 수 있다는 것을 제시한다.
이 데이터는 일반적으로, 염증성 면역 반응을 조절하는 데 MBV의 유용성을 또한 제시하며 및 MBV가 전-염증성 사이토카인의 생산을 하향조절 할 수 있음을 보여준다. 이는 사이토카인 폭풍과 같은 고도염증성 사건 (hyperinflammatory events)을 완화하는데 MBV의 유효성을 제시하고, 그러므로 MBV를 폐에의 고도염증의 결과로부터 오는 ARDS와 같은 컨디션을 치료하는데 유용하게 만든다.
실시 예 3: 이미퀴모드-유도된 건선의 치료를 위한 MBV의 용도 (Use of MBV for Treatment of Imiquimod-induced Psoriasis)
UBM 및 UBM으로부터 유래한 MBV가 위의 실시 예 2 에서 서술된 대로의 방법론을 사용하여 제조된다.
국소적으로 적용되었을 때 생쥐에서 건선-유사 컨디션을 유도하는 것으로 알려진 화합물인, 이미퀴모드(imiquimod, IMQ)를 8-주령, 암컷, C57/bl6 쥐에 매일, 국소적 적용으로 62.5mg의 5% 이미퀴모드 크림(imiquimod cream)으로 생쥐의 면도 된 등 및 오른쪽 귓바퀴에 15일 동안 투여하였다. 대조군 동물은 연구 내내 국소적 이미퀴모드를 받지 않았으며, 및 대신 페트롤리움 젤리 (petroleum jelly)를 면도 된 등 및 오른쪽 귓바퀴에 국소적 투여로 받았다. 처치 그룹 및 치료적 범례 (paradigms)는 건선 급발진의 예방 및 이미 존재하는 급발진의 관리로 나뉘었다. 예방적인 치료요법을 받는 동물은 연구 0-16일 사이에 처치를 받았으며 및 관리 치료요법을 받는 동물은 연구 7-16일 사이에 처치를 받았다. 처치 그룹은 복강 내 MBV 및 매개체-만의 대조군으로 구성되었다. 복강 내 MBV를 받는 동물은 처치 타임 라인 (treatment timeline)에 의해 지정된 대로 연구의 각 날짜에 109 돼지-유래한, UBM MBV를 받았다.
7일째 날에, 조직 샘플이 수집되고 및 조직학적으로 평가되었다. MBV가 복강 내 주사로 투여될 때 (109 MBV 매일 용량으로 처치 기간 7일에 걸쳐), 도 13 에서 보여준 대로, 건선 병변 부위가 해결되었다.
Foxp3를 발현하는 세포가 직접적으로 TREG 세포에 의해 조절되므로, 처치가 TREG 활성에 영향을 주는지 아닌지를 결정하기 위하여, Foxp3 RNA가 정량되었다. RNA가 검사 부위의 조직 생체검사로부터 제조사의 안내에 따라 Trizol을 사용하여 분리되었다. RNA 정량 및 A260/280가 나노 드롭 분광 광계도 (NanoDrop spectrophotometer) (NanoDrop)를 사용하여 결정되었다. cDNA가 슈퍼스크립트 III 역 전사 효소 (SuperScript III reverse transcriptase enzyme)를 사용하여 첫 번째-가닥 역 전사로 합성되었다. foxp3의 qPCR이 파워 사이버 그린 PCR 마스터 믹스 (Power SYBER Green PCR Master Mix) (Applied Biosystems)를 사용하여 수행되었다. 모든 qPCR은 사이버 그린 (SYBR Green)을 사용하여 수행된 모든 APC은 50 C에서 2분 동안, 95 C에서 10분 동안, 및 95 C에서 15초 동안 40 사이클 및 60 C에서 1분 동안 수행되었다. qPCR은 델타델타CT (DeltaDeltaCT) 방법으로 분석되었으며 및 Log (배수 변화)는 음성 대조군 (이미퀴모드 없이 + PBS 매개체)에 상대적인 foxp3 발현이다. Foxp3 프라이머 (전방향: 5'-TCTCCAGGTTGCTCAAAGTC-3' 및 역방향: 5'-GCAGAAGTTGCTGCTTTAGG-3') 및 Gapdh 프라이머 (전방향: 5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTA-3' 및 역방향: 5'-TGTTGCTGTAGCCGTATTCA-3'). 도 14 에서 보여준 대로, MBV로의 처치는 Foxp3 RNA 수준을 의미 있게 증가시켰으며, 이는 MBV 가 TREG 세포를 자극함을 제시한다. 종합하면, 이들 데이터는 MBV 처치는, 전신적으로 투여될 때라도, 같은 조직에서 항-염증성 세포 표현형의 수의 증가의 결과가 됨을 제시한다. 그러므로, 국소 및 전신적 투여 둘 다 ARDS의 치료를 위하여 사용될 수 있다.
실시 예 4: 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 생쥐 모델에서 MBV의 용도 (Use of MBV in a Keyhole limpet hemocyanin (KLH) mouse model)
UBM 및 UBM으로부터 유래한 MBV가 위의 실시 예 2 에서 서술된 대로의 방법론을 사용하여 제조된다.
이 실험에서, 면역억제 및 면역독성의 키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole limpet hemocyanin) (KLH) 쥐 모델이 전신적으로 전달된 MBV의 면역독성을 평가하기 위하여 사용되었다. 8-주령 스프라구-다우레이 쥐 (Sprague-Dawley rats)가 4개의 별개의 그룹으로 분리되었다: KLH로 면역화시킨 후 정상 항-KLH 반응을 보여주기 위하여 사용된 KLH 대조군, 처치 또는 KLH 면역화와 관련되지 않은 어느 잠재적인 효과를 조절하기 위하여 매개체 대조군이 사용되었고, 강력한 면역 억제제로서 사이클로포스파마이드 (cyclophosphamide) 양성 대조군이 사용되었으며, 및 전신적 면역력에 대한 MBV 투여 효과를 평가하기 위하여 MBV 처치 그룹이 사용되었다. -7일째 날에, 사이클로포스파마이드 처치한 동물은 200mg/kg을 복강으로 투여받았다. MBV 처치된 동물은 1 x 109 입자 MBV를 정맥 내로-7, -4, 및 -1 째 날에 투여받았다. 0일째 날에, 매개체 대조군을 제외한 모든 그룹은 후라운드 불완전 아주번트 (Freund's incomplete adjuvant)에 있는 0.4 mL의 1000 μg/ml의 재구성된 KLH로 면역화시켰다. 면역화-후 7, 14, 및 21일째 날에, 전 혈 (whole blood)이 꼬리 측면 정맥으로부터 수집되었고, 및 혈청이 항-KLH IgG의 분석하기 위하여 분리되었다. 도 15에 보여진 대로, 항-KLH IgG는 효소-연결된 면역흡착 에세이(ELISA)를 사용하여 모든 동물의 혈청에서 평가되었다. 종합하면, 이들 데이터는 MBV로 처치된 동물은 아직도 면역 능력이 있으며 및 면역글로불린-기반을 둔 반응을 증가시킬 수 있음을 제시한다.
이 발견은 MBV의 항-염증성 치료로서의 유용성에 대해 광범위한 영향을 지닌다. 예를 들어, 사이토카인과분비 결과로부터 오는 고도염증을 포함하는 염증을 감소시키는 많은 표준 치료는, 면역 억제적이고 및 개체를 2차 감염의 위험에 놓이게 하고 및 면역 반응의 원인이 되는 제제에 대항하는 면역반응을 시작하는 능력을 감소시키면서, 면역력의 회복 및 전개를 방해한다. 그러나, MBV는 개체의 면역 반응을 시작하는 능력을 방해하지 않는 것으로 보이므로, MBV는, 예를 들어, SARS-CoV-2와 같은 바이러스성 감염에 의해 원인이 되는, 예를 들어, ARDS에서 항-염증성 치료로서 유용하다, 왜냐하면, MBV는 바이러스에 대해 면역반응을 시작하는 개체의 능력을 방해하지 않고 그러면서도 아직도 염증성 사이토카인의 생산을 감소시키고 및 면역반응을 수선 및 치유 쪽으로 조절하기 때문이다.
실시 예 5: MBV의 투여는 생체 내 T REG 를 증가시킨다 (Administration of MBV increases T REG in vivo)
UBM 및 UBM으로부터 유래한 MBV가 위의 실시 예 2 에서 서술된 대로의 방법론을 사용하여 제조된다.
심장독 (Cardiotoxin) 근육 상처 수술이 넉 아웃 (knockout) 또는 야생형 (wild-type) C57/bl6 생쥐에서 수행되었다; 생쥐는 야생형 IL-33 발현하는 Arg-1GFP ("WT B6")이거나 또는 넉 아웃 IL-33 없는 Arg-1GFP B6 ("KO B6")이었다. 이들 생쥐의 세포에서 아르기나아제 (Arginase) 발현이 GFP 발현으로 검출될 수 있어, M2-유사 표현형의 동정이 되도록 하였다. IL-33을 자연적으로 함유하는 MBV (국제 특허 출원 발행 번호 WO 2019/213482 참조)가 근육 상처 부위로 1x 109 MBV의 양을 투여되었다. 수술-후 날짜 (post-operative day, POD) POD3 및 POD7에, 상처 난 횡단 배 (transverse abdominal) (TA) 근육이 생쥐로부터 수술적으로 수확되었으며, 조직 표본은 갈리고, 디스파아제 (dispase)로 처치되고 및 생리 식염수로 헹구어졌으며, 이 공정은 반복되어 비-세포 잔해는 제거되었다. 침윤 백혈구는 유동 세포 분석 (flow cytometric analysis, FACS)에 의해 평가되었다.
도 16A 및 도 16B는 대표적인 점 플럿 (dot plots) 및 CD45+CD3-B220-CD11b+Ly6G- 게이트 (gate)에서 염증성 대식세포의 빈도를 보여준다. IL-33 없이 대식세포 수의 증가가 있으며 및 이들은 M1 전-염증성 표현형이다. IL-33을 함유하는 MBV는 염증성 반응을 의미 있게 감소시킨다.
도 16C 및 도 16D는 대표적인 점 플럿 (dot plots) 및 CD45+CD3+B220-CD4+ 게이트 (gate)에서 ST2+ TREG 의 빈도를 보여준다. 이 결과들은 IL-33은 Foxp3 양성인 TREG 세포의 수를 증가하기 위하여 필요하다는 것을 보여준다. 모든 p-값은 일원 분산분석 (one-way ANOVA)을 사용하여 계산되었다. (*P<0.05, **P<0.01).
실시 예 6: MBV의 투여는 IL-4 생산을 유도한다 (Administration of MBV Induces IL-4 Production)
UBM 및 UBM으로부터 유래한 MBV가 위의 실시 예 2 에서 서술된 대로의 방법론을 사용하여 제조된다.
이 실험에서, 순진한 T-림프구 (naive T-lymphocytes)가 정상 생쥐의 지라로부터 분리되었다. T-림프구는 T 세포 반응을 유도하기 위하여 자극된다. 일차 쥐 CD4+ T-세포 (Primary murine CD4+ T-cells)가 8-주령 C57/Bl6J 생쥐의 지라로부터 CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD45R, CD49b, CD105에 대한 바이오틴-접합 된 항체의 칵테일, 항-MHC-클래스 II (Anti-MHC-class II), Ter-119, 및 일차 라벨링 시약으로서 TCR을 사용하여 비-CD4+ T-세포를 고갈시켜 분리되었다. 세포는 항-바이오틴 마이크로비드 (anti-biotin microbeads)로 자석적으로 라벨 되었고 및 비-라벨 된 CD4+ T-세포는 자석 보조 세포 분류 (magnet assisted cell sorting)를 사용하여 분리되었다. 분리된 CD4+ 세포는 항-생쥐 CD3 엡실론 (CD3epsilon) (3 μg/mL)으로 미리 코트 된 12-웰 플레이트에 각 웰 당 10% 태아 소 혈청(fetal bovine serum), 완전 RPMI 1640배지 (complete RPMI 1640 media)에서 최종 농도 1.0 x 106 세포/mL로 배양시켰다.
각 해당하는 Th (T-도우미) 서브세트 ((Th (T-helper) subset))는 하기의 배양 컨디션에서 5일 배양으로 유도되었다. Th1: 항-생쥐 CD28 (3 μg/ml), 항-생쥐 IL-4, 클론 (10 μg/mL), 재조합 생쥐 Il-2 (5ng/mL), 및 재조합 생쥐 Il-12 (10ng/mL). Th2: 항-생쥐 CD28 (3 μg/ml), 항-생쥐 IFN-감마(gamma) (10 μg/mL), 재조합 생쥐 Il-2 (5ng/mL), 및 재조합 생쥐 Il-4 (10ng/ml). Th17: 항-생쥐 CD28 (3 μg/ml), 재조합 생쥐 TGFb (2.5ng/ml), IL6 (20ng/ml), 항-IFNg (10 μg/ml), 항-IL4 (10 μg/ml), 및 항-IL2 (10 μg/ml). ThMBV: 항-생쥐 CD28 (3 μg/ml), 재조합 생쥐 Il-2 (5ng/mL), 및 1 x 109 입자 MBV. T-세포는 이들 컨디션에서 5일 동안 배양되었다. 5일째 날에, 세포는 세척되고 및 혈청 없는 완전 RPMI 1640으로 대체되고 및 50ng/mL의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(Phorbol 12-myristate 13-acetate)로 24시간 동안 자극되었다. 24시간 후에, 세포 배양 상등액이 수집되고 및 IL-4 에 대한 ELISA가 수행되었다.
도 17에서 보여준 대로, Th1 ((전-염증성 반응(proinflammatory response)) 의 알려진 활성제로 자극되었을 때, 최소 IL-4 (강력한 항-염증성 신호전달 분자) 가 이들 세포에 의해 생성되었다. Th2 ((항-염증성 반응(anti-inflammatory response))의 활성제가 주어졌을 때, 충분한 IL-4가 예상한 대로 이들 세포에 의해 생성되었다. 세포가 전-염증성 Th17 표현형 쪽으로 활성 되었을 때, IL-4는 생성되지 않았다. 세포가 MBV (109 MBV/웰)에 노출되었을 때, IL-4 생산에서 현저한 증가가 일어났다. 종합하면, 이들 데이터는 MBV로의 처치는 T-도우미 세포의 강한 항-염증성 표현형을 유도함을 제시한다.
실시 예 7: MBV는 사이토카인 폭풍의 매개체를 하향조절하고 및 대식세포에서 사이토카인 폭풍의 음성적 조절자의 발현을 증가시킨다 (MBV downregulate mediators of the cytokine storm and increase expression of negative regulators of cytokine storm in macrophages)
UBM 및 UBM으로부터 유래한 MBV가 위의 실시 예 2 에서 서술된 대로의 방법론을 사용하여 제조된다.
쥐 골수는 6-내지 8-주령 B6 생쥐로부터 수확되었다. 골수로부터 수확된 세포는 세척시키고 및 2 x 106 세포/mL로 플레이트 되었으며 및 대식세포 콜로니-자극 인자 (macrophage colony-stimulating factor, MCSF)의 존재하에서 매 48시간 마다 완전 배지 교환으로 7일 동안 대식세포로 분화되도록 하였다. 대식세포는 그 후 1 x 109 MBV/ml (그룹당 n=3)와 함께 또는 없이 처치되었다. 37 °C 에서 24시간 배양 기간 후에, 세포는 멸균 PBS로 세척되었으며 및 총 RNA가 수확되고 및 RNA 서열분석을 사용하여 분석되었다. 생물정보학적 분석은 제네비아 테크놀로지 (Genevia Technologies) (Tampere, Finland)에 의해 수행되었다. 차별 발현 (DE) 분석 (Differential expression analysis)은 R 패키지 DESeq2, 버전 1.24.0 (R package DESeq2, version 1.24.0) (Love et al., 2014. Genome Biology 15:550)을 사용하여 수행되었다. 통계학적 테스트를 위하여 p 는 0.05 세트를 독립적 필터링을 최적화하는데 사용된 의미 있는 컷 어프로 하고, 및 영 가설 (null hypothesis)은 대비 그룹 사이의 log2 배 변화 (log2 fold changes)는 0과 동등하게 하고, 발드 테스트 (Wald test)가 사용되었다. P-값은 벤자미니-호흐버그 과정 (Benjamini-Hochberg procedure) (Benjamini et al. 1995. Journal of the Royal Statistical Society B 57: 289-300)을 사용하여 다수 테스팅을 위하여 조정되었다. 얻어진 결과는 그 후 0.05를 조정된 p 값을 위한 한계점으로서 사용하고 및 1을 절대 log2 배 변화 (absolute log2 fold change)를 위한 한계점으로 사용하여 포스트-혹 필터 (post-hoc filtered) 되었다. 유전자들은 biomaRt, version 2.40.5 (Durinck et al. 2009. Nature Protocols, 4:1184-1191)를 사용하여 MGI 심볼 (MGI symbols), 유전자 서술 (gene descriptions) 및 유전자 바이오타입 (gene biotypes)으로 또한 주석 되었다. 서열분석 결과는 MBV 처치는 표 3에서 보여준 대로, CD163, Igf1, Nlrp 인프라마좀 (Nlrp inflammasome), C5ar2, Hrh1, Hdac9, Igfbp4, 및 Pparg 를 포함하는 사이토카인 폭풍의 결정적인 매개체로 알려진 유전자들의 발현을 의미 있게 감소시킨다는 것을 보였다. 더욱이, MBV는 표 4에서 보여준 대로, IL-10, 및 Socs1-3을 포함하는 사이토카인 폭풍의 음성적 조절자의 발현을 증가시키는 것으로 보였다.
표 3: MBV는 사이토카인 폭풍과 관련된 유전자들의 발현을 감소시킨다.
Figure pct00003
표 4: MBV는 사이토카인 폭풍의 음성적 조절자로서 작용하는 유전자들의 발현을 증가시킨다.
Figure pct00004
이 데이터가 보여준 대로, MBV는 전염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokine) 생산, 및 특히 사이토카인 과분비 (hypercytokinemia) (("사이토카인 폭풍(cytokine storm"))에 기여하는 전-염증성 사이토카인의 강력한 조절자인 것으로 보여진다. MBV의 이 특징은 사이토카인 폭풍 및 폐에 고도염증의 결과인 ARDS의 치료 또는 경감을 위한 후보로서 유용함을 제시한다.
실시 예 8: 쥐 인플루엔자 모델에서 바이러스-유도된 면역 반응의 치료를 위한 MBV의 용도 (Use of MBV for Treatment of Viral-Induced Immune Response in a Murine Influenza Model)
UBM 및 UBM으로부터 유래한 MBV가 위의 실시 예 2 에서 서술된 대로의 방법론을 사용하여 제조된다.
MBV가 폐로 국소화하는 능력을 결정하기 위하여, PKH67 형광적으로-라벨 된 MBV 250 μl가 에어로졸 형태로 비강으로 C57BL/6 생쥐에 109 입자/mL 용량으로 투여되었다. 놀랍게도, 생쥐 조직의 면역 형광 현미경은 폐기도 및 폐포에 MBV가 의미 있게 강화됨을 보였다. 도 18에서 보여진 대로, MBV는 처치된 폐 조직의 큰 및 작은 기도, 특히 상피 (epithelia)에서 분명하게 검출될 만 (화살 머리로 표시) 하였으나, 유 세포 (parenchyma)에서는 관찰되지 않았다. 처치되지 않은 대조군 폐 조직 (오른쪽 패널)은 비-특이적인, 확산 된 낮은 수준의 자동 형광, MBV-처치된 조직과는 비슷하지 않은 패턴을 보이고, 왼쪽 및 중앙 팬넬에서 형광은 정말로 MBV 국소화를 표시함을 보여준다.
COVID-19와 관련된 ARDS와 같은, 바이러스-유도된 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS)에 대항하는 MBV의 치료적 효능을 평가하기 위하여, HIN1 쥐 모델이 사용된다. 인플루엔자 H1N1은 COVID-19 환자에서 관찰된 비슷한 폐 병리를 유도하며, 및 증상-없는 날, 빠른 ARDS-유사 폐 상처, 및 몇 주 또는 몇 달 동안 지속 되는 지속적인 폐포염을 포함하는, 비슷한 병원성 타임 코스를 따른다. 2009 H1N1 팬데믹 바이러스는 추가로 높은 전파성 및 세계적인 확산 측면에서 SARS-CoV2와 닮았다.
수컷 및 암컷 C57BL/6 생쥐는 A/CA/07/2009 (H1N1 팬데믹 인플루엔자)를 구 강 인두 아스피레이션 (oropharyngeal aspiration)으로 생존 연구를 위해 106 pfu의 치사 용량 또는 면역학적 연구를 위해 104 pfu의 아치사 용량 (sublethal dose) 으로 감염시켰다. 감염-후 3일째 또는 5일째 날에, 생쥐는 비강 내 또는 정맥 내 전달로 MBV로 처치되었다.
생쥐는 무작위로 하기의 여섯 실험 그룹 (그룹당 8 생쥐, 4 생쥐/그룹의 두 코호트로 실행, 수컷 및 암컷 생쥐 둘 다)으로 지정된다: 1) 인플루엔자 A/CA/07/2009만; 2) 인플루엔자 A/CA/07/2009 + 대조군 ((매체만(vehicle only)); 3) 인플루엔자 A/CA/07/2009 + 비강 내 MBV 처치 용량 250 μL 의 1 x 106 MBV/ml; 4) 인플루엔자 A/CA/07/2009 + 비강 내 MBV 처치 용량 250 μL 의 1 x 109 MBV/ml; 5) 인플루엔자 A/CA/07/2009 + 정맥 내 MBV 처치 용량 250 μL 의 1 x 106 MBV/ml; 6) 인플루엔자 A/CA/07/2009 + 정맥 내 MBV 처치 용량 250 μL 의 1 x 109 MBV/ml. 건강한 그룹의 생쥐가 기본 라인 대조군 (baseline controls)으로 사용된다. 생쥐는 이어서 이병률의 대리 (surrogate for morbidity)서로 매일 체중이 추적되며 및 25%의 체중 손실이 관찰되었을 때 생쥐는 희생된다. 이 생존 연구는 바이러스 유도된 치사율에 대항하는 MBV의 효력을 보여주고 및 추가로 용량 및 전달 경로에 기반을 둔 MBV의 효능을 보여준다.
면역학적 연구가 위의 세 실험 그룹: 1) 인플루엔자 A/CA/07/2009; 2) 인플루엔자 A/CA/07/2009 +대조군; 3) 인플루엔자 A/CA/07/2009 + MBV에서 결정된 대로 가장 효력이 있는 용량 전략을 사용하여 수행된다. 생쥐 조직 샘플 (이것에만 국한하지 않으나, 폐 및 림프 절 (lymph nodes, LN), 기관지 폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid., BALF), 및 혈청을 포함하는)은 감염-후 7일째 및 21일째 날에 수집된다. 폐기능은 염증 및 부종의 측정으로서 준 정적 폐 탄성 (quasi-static lung compliance)을 측정하기 위하여 각 타임 포인트 (time point) 에서 Flexivent　 (SCIREQ, Quebec, CA)로 측정된다. 폐기능 측정은 제조사의 안내에 따라 얻는다.
폐 상처 및 감염은 폐 단백질 균질액 (homogenate)을 사용하여 국소 사이토카인 수준을 측정하기 위하여 바이오-플렉스 사이토카인 에세이 (Bio-PlexTM Cytokine Assays) (Bio-Rad)로 제조사의 안내에 따라 평가되었다. 폐 엽의, 헤마톡실린 (hematoxylin) 및 에오신 (eosin) 염색과 같은, 조직학적 분석이 병리학적 평가를 위해 수행되었다. 백혈구 세포 수 세기, 효소-연결된 면역흡착 에세이 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 의한 항체 아이소타입 및 수준의 정량, 항-햄아글루티닌 (anti-hemagglutinin) 항체 수준, 및 혈청 사이토카인의 바이오-플렉스 사이토카인 에세이 (Bio-PlexTM Cytokine Assays)를 포함하는, 혈액 평가가 수행된다. 추가로, 바이오-플렉스 사이토카인 에세이에 의한 공간 (airspace) 사이토카인 수준의 측정 및 차별적인 염증성 세포 수 세기 (differential inflammatory cell counting)를 위한 샘플 수집을 위하여 기관지 폐포 세척이 수행된다.
폐 소화 (lung digests)로부터의 단일 세포, LN 현탁액, 및 BALF는 형광적으로 라벨된 항체로 염색되고 및 Cytek　 Aurora를 사용하여 제조사의 안내에 따라 다 계수 스펙트라 유동 세포 분석 (multiparameter spectral flow cytometry)이 완성 되었다. 유동 세포 분석 평가는 골수 구획 (myeloid compartment) (즉 전-염증성 사이토카인 분비하는 M1 대식세포 및/또는 회복 및 조절 M2 대식세포) 및 림프구 구획 (lymphoid compartment) (즉, 조절 T 세포는 물론, 바이러스 특이적인 T 효능 세포) 둘 다에서 변화를 정량하기 위하여 사용된다. 바이러스 감염 및 MBV 치료요법이 함께 또는 독립적으로 어떻게 조직 및 면역 세포 집단을 분자적 수준에서 형성하는지를 동정하기 위하여 LN 및 폐 조직의 단일 세포 RNA 서열 분석도 수행된다.
결과는 MBV로 처치된 동물은 처치되지 않은 대조군 동물에 비교하여 의미 있게 감소된 바이러스 이환율을 보인다는 것을 보여준다. 더 놀라운 것은, MBV로 처치된 감염된 동물은 백혈구 세포 수 및 사이토카인 수준에서 보여준 것과 같이 감소된 폐 상처 및 감염을 보인다. 이 데이터는 MBV의 투여가 급성 호흡 곤란을 초래하는 질환 및 장애의 면역조절을 위한 효과적인 치료제이고 및 MBV는 바이러스 감염에 의해 유도되는 ARDS의 심각성 또는 발병률을 감소시킬 수 있다는 것을 보여준다. 이는, 다른 조짐들 중에, 팬데믹 H1N1 또는 SARS-CoV2 및 다른 인플루엔자 및 코로나바이러스 유도된 호흡질환과 같은, 치료제가 존재하지 않은 바이러스성 질환을 위한 효력적인 치료요법을 제공한다.
실시 예 9: 임상에서 COVID-19 관련된 급성 호흡 곤란 증후군의 치료를 위한 MBV의 용도(Use of MBV for Treatment of COVID-19 Associated Acute Respiratory Distress Syndrome in the Clinic)
UBM 및 UBM으로부터 유래한 MBV가 위의 실시 예 2 에서 서술된 대로의 방법론을 사용하여 제조된다.
SARS-CoV2 -유도된 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)으로 진단된 환자, COVID-19 양성 환자들이 MBV로 처치된다. 스스로 숨을 쉴 수 있는 환자는 3mL의 분무 된 생리적 생리 식염수에 있는 약 1 x 109 MBV 용량을 투여받고 및 분무기를 통해 코 및/또는 입을 통하여 폐로 흡입된다. 호흡관이 삽입된 환자는 기관 내로 전달되는 3mL의 생리적 생리 식염수에 있는 1 x 109 MBV 용량을 투여받는다. 복강 내 주사가 바람직한 투여의 방식이라고 결정된 어떤 환자는 약 50mL의 생리적 생리 식염수에 있는 1 x 109 MBV를 복강 내 투여로 투여받는다.
치료의 치료적 효능을 결정하기 위하여 혈액 산소화 수준이 각 환자에서 MBV 치료요법의 용량을 받기 전 및 후에 측정된다. 추가로, 세척으로 폐로부터 체액 샘플이 얻어지며, 및 위의 표 3 및 4에서 제공된 사이토카인과 같은, 사이토카인 발현 수준이 ELISA에 의해 측정된다. 환자가 연속적인 환기 또는 산소 지지 없이 산소 수준을 유지하는 능력 또는, 폐로부터 체액의 제거 및/또는 세척액 테스트로부터 결정된 대로 전-염증성 사이토카인의 감소를 표시하는 흉부 X-레이의 개선을 포함하는 개선의 징후가 보일 때까지 환자는 매 6-24 시간마다 용량을 계속 투여받는다.
실시 예 10: 실시 예11-15를 위한 재료 및 방법 (Materials and Methods for Examples 11-15)
COVID-19과 관련된 ARDS와 같은, 바이러스-유도된 급성호흡 장애 증후군 (ARDS)에 대항하는 MBV의 치료적 효능을 평가하기 위하여, H1 N1 쥐 모델이 사용되었다. 인플루엔자 H1N1은 COVID-19 환자에서 관찰된 것과 비슷한 폐 병리를 유도하며, 및 증상-없는 날, 빠른 ARDS-유사 폐 상처, 및 몇 주 또는 몇 달 동안 지속되는 지속적인 폐포염을 포함하는, 비슷한 병원성 타임 코스를 따른다. 2009 H1N1 팬데믹 바이러스는 추가로 높은 전파성 및 세계적인 확산 측면에서 SARS-CoV2와 닮았다.
수컷 및 암컷 C57BL/6 생쥐는 A/CA/07/2009 (H1N1 팬데믹 인플루엔자)를 구강 인두 아스피레이션 (oropharyngeal aspiration)으로 생존 연구를 위해 106 pfu의 치사 용량 또는 면역학적 연구를 위해 104 pfu의 아치사 용량 (sublethal dose)으로 감염시켰다. 감염-후 3일째 또는 5일째 날에, 생쥐는 정맥 내 전달에 의해 MBV로 처치되었다.
생쥐는 무작위로 하기의 여섯 실험 그룹 (그룹당 8 생쥐, 4 생쥐/그룹의 두 코호트로 실행, 수컷 및 암컷 생쥐 둘 다)으로 지정되었다: 1) 인플루엔자 A/CA/07/2009만; 2) 인플루엔자 A/CA/07/2009 + 대조군 ((매체만(vehicle only)); 3) 인플루엔자 A/CA/07/2009 + 정맥 내 MBV 처치 용량 250 μL 의 1 x 106 MBV/ml; 4) 인플루엔자 A/CA/07/2009 + 정맥 내 MBV 처치 용량 250 μL 의 1 x 109 MBV/ml. 건강한 그룹의 생쥐가 기본 라인 대조군 (baseline controls)으로 사용되었다. 생쥐는 이어서 이병률의 대리 (surrogate for morbidity)로 매일 체중이 추적되었으며 및 25%의 체중 손실이 관찰되었을 때 생쥐는 희생된다. 이 생존 연구는 바이러스 유도된 치사율에 대항하는 MBV의 효력을 보여주고 및 추가로 용량 및 전달 경로에 기반을 둔 MBV의 효능을 보여준다.
면역학적 연구가 위의 세 실험 그룹: 1) 인플루엔자 A/CA/07/2009; 2) 인플루엔자 A/CA/07/2009 +대조군; 3) 인플루엔자 A/CA/07/2009 + MBV에서 결정된 대로 가장 효력이 있는 용량 전략을 사용하여 수행되었다. 생쥐 조직 샘플 ((이것에만 국한하지 않으나, 폐 및 림프 절 (lymph nodes, LN), 기관지 폐포 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid., BALF), 및 혈청을 포함하는))은 감염-후 7일째 및 21일째 날에 수집되었다.
폐 상처 및 감염은 폐 단백질 균질액 (homogenate)을 사용하여 국소 사이토카인 수준을 측정하기 위하여 바이오-플렉스 사이토카인 에세이 (Bio-PlexTM Cytokine Assays) (Bio-Rad)로 제조사의 안내에 따라 평가되었다. 폐 엽의, 헤마톡실린 (hematoxylin) 및 에오신 (eosin) 염색 및 트리크롬 (trichrome) 염색과 같은, 조직학적 분석이 병리학적 평가를 위해 수행되었다. 백혈구 세포 수 세기, 효소-연결된 면역흡착 에세이 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 의한 항체 아이소타입 및 수준의 정량, 항-햄아글루티닌 (anti-hemagglutinin) 항체 수준, 및 혈청 사이토카인의 바이오-플렉스 사이토카인 에세이 (Bio-PlexTM Cytokine Assays)를 포함하는, 혈액 평가가 수행되었다. 추가로, 바이오-플렉스 사이토카인 에세이에 의한 공간 (airspace) 사이토카인 수준의 측정 및 차별적인 염증성 세포 수 세기 (differential inflammatory cell counting)를 위한 샘플 수집을 위하여 기관지 폐포 세척이 수행되었다.
폐 소화 (lung digests)로부터의 단일 세포, LN 현탁액, 및 BALF는 형광적으로 라벨 된 항체로 염색되었고 및 사이텍 오로라(CYTEK　 Aurora)를 사용하여 제조사의 안내에 따라 다 계수 스펙트라 유동 세포 분석 (multiparameter spectral flow cytometry)이 완성 된다. 유동 세포 분석 평가는 골수 구획 (myeloid compartment) (즉 전-염증성 사이토카인 분비하는 M1 대식세포 및/또는 회복 및 조절 M2 대식세포) 및 림프구 구획 (lymphoid compartment) (즉, 조절 T 세포는 물론, 바이러스 특이적인 T 효능 세포) 둘 다에서 변화를 정량하기 위하여 사용되었다. 바이러스 감염 및 MBV 치료요법이 함께 또는 독립적으로 어떻게 조직 및 면역 세포 집단을 분자적 수준에서 형성하는지를 동정하기 위하여 LN 및 폐 조직의 단일 세포 RNA 서열 분석도 수행된다.
실시 예 11: MBV의 전신적 투여는 급성 바이러스-매개하는 폐 병독성을 완화한다 (Systemic Administration of MBV Mitigates Acute Viral-Mediated Pulmonary Pathology.
H1N1으로 기관 내 (intra-tracheal) 접종 후 7일 후에, 기질-결합 나노소포체 (matrix-bound nanovesicles)의 전신적 투여는 폐 조직의 H+E 염색에서 증명된 대로 급성 바이러스-관련된 폐 병독성을 상당히 완화 시켰다. 7일째 날에, 인플루엔자 + i.v. PBS 매개체 대조군 그룹은 폐 간극 공간에 세포 밀도 및 통합 (consolidation)에서 증가를 보였으며 반면에 Influenza + i.v. MBV 그룹은 세포 밀도를 감소시키는 것은 물론 간극 염증성 침투 (interstitial inflammatory infiltrate)에서 감소를 보인다 (도 19A). 세포 밀도를 열지도 (heat map)의 형태로 가시화하기 위하여 quPath 인공 지능 (quPath artificial intelligence)을 사용하였을 때, 인플루엔자+ i.v. MBV 그룹은 인플루엔자+ PBS 그룹에 비교하여 세포 밀도에서 감소를 보였다 (도 19A). 인플루엔자 감염 후에 폐의 세포 침투액 조성의 추가 조사는 기관지 세척 액체 (bronchiolar lavage fluid, BALF), 폐 간극 공간 (lung interstitial space), 및 지라에서 CD45+ 호중구의 증가를 보였다 (도 19B, p<.05). 정맥 내 MBV는 BALF, 폐 간극 공간, 및 지라에서 CD45+ 호중구의 빈도를 의미 있게 감소시켰다 (도 19B, p<.05). 전신적 MBV 투여로 세포 침투 및 호중구 존재의 감소는 전-염증성 사이 토-(CTO-) 및 케모카인 (chemokines)의 감소와 연관이 있었다 (도 19C). 특히, 전신적 MBV 는 감염에서 호중구 및 골수 세포의 조직으로의 영입에 관련된 폐 생산된 G-CSF를 감소시켰다 (도 19C, p<.05). MBV의 전신적 투여는 인플루엔자 + i.v. PBS에 비교하여 Il-6, Il-1b, TNF-알파, 및 IFN-감마를 포함하는 전-염증성 사이토카인의 폐 농도를 감소시켰다 (도 19C, p<.05).
실시 예 12: H1N1 접종 후 MBV는 항-바이러스성 CD4 및 CD8 표현형을 촉진한다 (MBV Promote an Anti-viral CD4 and CD8 Phenotype following H1N1 inoculation.)
H1N1으로 기관 내 (intra-tracheal) 접종 후 7일 후에, MBV의 전신적 투여는 PBS-만의 대조군에서 기준치 (baseline) 비율에 비교하여 폐에서 CD4: CD8 T-세포의 비율을 의미 있게 변화시킨다 (도 20A, p<.05). MBV 투여로 증가된 CD8: CD4 T-세포 비율의 이 촉진은 폐에서 국소적으로 감염 부위에 및 또한 지라에서 전신적으로 둘 다에서 보였다 (도 20A 및 20B, p<.05). CD4 및 CD8 T-세포를 추가 조사하였을 때, MBV는 PBS-만의 대조군에 비교하여 증가 된 비율의 CD8: CD4 T-세포를 선호하는 쪽으로 옮기는 것을 촉진하였을 뿐만 아니라 또한 활성화된 (CD69+) 및 항 바이러스성 (Tbet+) CD4 및 CD8 T-세포 둘 다에서 증가를 촉진하였다 (도 20C 및 20D, p<.05). 특별히, 지라의 수준에서, MBV는 PBS-만 및 인플루엔자 + i.v. PBS그룹에 비교하여 CD69+ CD4 T-세포의 빈도를 증가시켰다 (도 20C, p<.05). 전신적 MBV는 또한 PBS-만 및 인플루엔자 + i.v. PBS그룹에 비교하여 림프 절 (lymph nodes)에서 항-바이러스성 Tbet+ CD4 T-세포의 빈도를 증가시켰다 (도 20C, p<.05). MBV는 또한 PBS-만 및 인플루엔자 + i.v. PBS그룹 둘 다에 비교하여 지라에서 CD69+ 활성화된 CD8 T-세포의 빈도를 증가시켰다 (도 20D, p<.05). 의미 있게 중요하지는 않으나, 인플루엔자 + i.v. PBS 그룹에 비교하여 전신적 MBV 그룹에서 지라에서 Tbet+ 항-바이러스성 CD8 t-세포의 증가된 빈도의 경향이 있다 (도 2 D, p>.05).
실시 예 13: MBV는 장-기간 바이러스-매개하는 폐 염증을 완화한다 (MBV Mitigate Long-Term Viral-Mediated Pulmonary Inflammation)
H1N1으로 기관 내 (intra-tracheal) 접종 후 21일 후에, MBV의 전신적 투여는 인플루엔자 + i.v. PBS 그룹에 비교하여 폐 조직에서 전반적인 세포 밀도를 상당히 감소시킨다 (도 21A). 감염 후 7일째와 비슷하게, MBV의 전신적 투여는 전반적인 CD45+ 호중구의 빈도를 폐에서의 국소적 수준에서는 물론 지라에서 전신적으로 둘 다 의미 있게 감소시켰다 (도 21B). 전-염증성 호중구의 감소와 조합으로, 폐에서 면역 조절적 CD11+ 수지상 세포 (dendritic cells)의 빈도의 동시 증가가 있다 (도 21C). 추가로, 장-기간 바이러스성 염증에서 상승된 이들과 비교하여 MBV의 전신적 투여는 전-염증성 케모카인 및 사이토카인을 감소시킨다 (도. 3. D, p<.05). 특히, MBV는 IL12, Il1-베타, MCP1, 및 KC의 폐 농도를 감소시킨다 (도 3. D, p<.05).
실시 예 14: MBV의 전신적 투여는 CD4 및 CD8 T-세포 둘 다에서 전-기억 면역 반응 (Pro-Memory Immune Response)를 유도한다 (Administration of MBV Induces a Pro-Memory Immune Response in Both CD4 and CD8 T-cells)
인플루엔자 + i.v. PBS 그룹에 비교하여, MBV i.v.의 투여는 바이러스-매개하는 폐 병독성에서 염증 및 세포 침투의 해결을 촉진하였을 뿐만 아니라 또한 기억 면역 반응 (memory immune response)을 촉진하였다. 특별히, MBV의 전신적 투여는 인플루엔자 + i.v. PBS그룹에 비교하여 CD62l+/CD44+ 기억 CD4 및 CD8 T-세포의 빈도를 증가시켰다 (더 22A 및 22B, p<.05).
실시 예 15: MBV의 전신적 투여로 바이러스-관련된 조직 손상 및 세포 외 기질 침착은 감소된다 (Viral-Associated Tissue Damage and Extracellular Matrix Deposition is Decreased with Systemic Administration of MBV)
H1N1으로 접종 후 21일 후에, MBV의 전신적 투여는 인플루엔자 + i.v. PBS 그룹에 비교하여 quPath 인공 지능 (quPath artificial intelligence)으로 정량화한 트리크롬 이미지 (trichrome images)에 시각화한 대로, 바이러스-관련된 조직 손상 및 새로운 세포 외 기질 침착을 의미 있게 감소시켰다 (도 23A 및 23 B, p<.05).
이 결과는 MBV로 처치된 동물은 처치되지 않은 대조군 동물에 비교하여 의미 있게 감소된 바이러스성 이환율을 보인다. 좀 더 놀랍게, MBV로 처치된 감염된 동물은 백혈구 세포 수 및 사이토카인 수준에서 보여준 대로 감소된 폐 손상 및 염증을 보인다. 이들 데이터는 MBV의 투여는 급성 호흡 곤란을 초래하는 질환 및 장애의 면역 조절을 위한 효과적인 치료제이고 및 MBV는 바이러스성 감염에 의해 유도되는 ARDS의 심각성 및 발생을 감소시킬 수 있음을 보여 주었다. 이는, 다른 조짐 중에서, H1N1, 또는 SARS-CoV2에 의해 원인이 되는 질병과 같은, 치료제가 존재하지 않은 ARDS, 바이러스성 질환을 위한 효능적인 치료요법을 제공한다. 이 데이터는 또한 다른 인플루엔자 및 코로나바이러스-유도된 호흡기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
실시 예 16: 실시 예 17-19를 위한 재료 및 방법 (Materials and Methods for Examples 17-19)
사두근 (Quadriceps) 근육은 먼저 0.02% 트립신(trypsin) 및 0.05% EDTA로 탈세포화시키고 및 0.01% 퍼아세틱 에시드 (peracetic acid)로 소독하고 버퍼 (50mM Tris pH 7.5, 5mM CaCl2, 150mM NaCl)에서 리베라아제 TH (Liberase TH)로 실온에서 하룻밤 동안 효소적 소화시켜 ECM 으로부터 MBV를 방출시켰다.
엑소좀은 이노바티브 리서치 (Innovative Research)로부터 얻은 C57Bl6 생쥐 혈장 (plasma)으로부터 분리되었다.
cMV는 차우드하리 등 (Chaudhary et al. Matrix Biol. 52-54:284-300, 2016) 에서 이미 서술된 대로 17IIA 예비-조치세포 (pre-odontoblast)로부터 분리되었다. 간략하게, 17ILA 세포의 골 분화는 버퍼에서 1mg/ml 콜라게나아제 LA (collagenase IA)로 2시간 동안 37 oC에서 효소적 소화시키기에 앞서 10 mM Na-Pi 버퍼 (pH 7.4) 및 50 μg/ml 아스코리빅 에시드(ascorbic acid)로 24시간 동안 유도시켰다.
소포체 분리: 상기 서술된 대로 적절한 제조 후에, 샘플은 그 후 500xg 에서 10분 동안, 2,500xg 20분 동안, 10,000Хg 30분 동안 원심분리 되게 하여 세포 및 ECM 잔해를 제거시키고, 및 이 상등액은 0.22 μm 필터를 통과하게 하였다. 소포체를 함유하는 정화된 상등액은 그 후 100,000 xg (Beckman Coulter Optima L-90K 초 원심분리기) 4°C 에서 70분 동안 원심분리시켜 소포체를 펠렛화시켰다. 소포체 펠렛은 1X PBS에 재현탁 되었고, 분액되었고 (aliquoted), 및 추가로 사용될 때까지 -20 oC에 저장되었다.
소포체 단백질 마커의 성질 규명: 소포체 서브타입은 엑소좀과 흔히 관련된 단백질 마커의 발현 수준을 결정하기 위하여 분석되었다. 단백질 마커는 엑소-첵 엑소좀 항체 어레이 (Exo-CheckTM Exosome Antibody Array) (System Biosciences)를 사용하여 50 μg 소포체 단백질로 분석되었다. 이미지J (ImageJ)가 분석된 각 단백질의 상대적인 발현을 정량하기 위하여 사용되었다.
쥐 골수-유래된 대식세포 분리 및 처치: 골수-유래된 대식세포는 이전에 시카리 등 (Sicari et al., Biomaterials 35:8605-8612, 2014)에 의해서 서술된 대로 C57Bl6 생쥐의 경골 (tibia) 및 대퇴골 (femur)로부터 분리되었다. 수확된 단핵세포 (mononuclear cells)는 2x106 세포/mL 비율로 접종되었으며 및 단핵구 (monocyte)는 37°C 및 5% CO2에서 7일 동안 대식세포-콜로니-자극-인자 (macrophage-colony-stimulating-factor, MCSF)-함유하는 배지에서 배양하여 대식세포로 분화시켰다. 결과로 얻어진 세포는 순수 대식세포 (naive macrophages)로 지정되었다. 순수 대식세포는 다음의 처치 중 하나에 24시간 동안 노출시켰다: 1) M1 대식세포를 유도하기 위하여 LPS/IFNγ, 2) M1 대식세포를 유도하기 위하여 IL-4, 3) 1x109 입자/mL 플라즈마 엑소좀, 4) 1x109 입자/mL 17IIA cMV, 또는 5) 1x109 입자/mL 근육 MBV.
유전자 발현: 24시간 후에, RNA는 트리졸 (Trizol)로 수집되었다. 1000 ng RNA가 고능력 cDNA 역전사 키트 (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit) (ThermoFisher Scientific)에서 제조사의 안내에 따라 cDNA로 전환되었다. 실시간 qPCR은 파워엎 사이브르 그린 마스터 믹스(PowerUpTM SYBR　 Green Master Mix)를 사용하여 수행되었다. 상대적인 유전자 발현은 2 -△△Ct 방법으로 처치되지 않은 (M0) 대조군과 비교하여 결정되었다.
통계학적 분석: 이원분산분석 (two-way analysis of variance, ANOVA) 및 터키 수정과 함께 (Tukey correction) 포스트-혹 분석 (post-hoc analysis)은 그룹 사이에 의미 있는 비교를 결정하였다. 모든 통계적 분석은 그래프패드프리즘 (GraphPad Prism)으로 완성되었다. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < .001.
실시 예 17: MBV는 흔한 엑소좀 마커 CD63 또는 CD81를 발현하지 않는다 (MBV do not express the common exosomal markers CD63 or CD81).
쥐 엑소좀, 쥐 골수 뼈 기질 소포체 (bone matrix vesicles, Bone MV), 및 쥐 기질 결합 소포체 (matrix bound nanovesicles, MBV)에 흔한 엑소좀 마커의 존재 유무를 비교하기 위하여 엑소-첵 엑소좀 항체 어레이 (Exo-CheckTM Exosome Antibody Array) (System Biosciences)가 사용되었다. 이 결과는 도 24의 위 팬널에서 보여주고 및 MBV는 CD63 및 CD81와 같은 기본적인(canonical) 및 잘 받아들여진 엑소좀 마커들이 사실상 없음을 분명히 보여준다. 추가로, 도 24의 위 팬널에서 동정 된 다른 신호 전달 분자들은 MBV에는 없으나, 반면에, 이들은 뼈 미세소포체 (bone microvesicles) 및 엑소좀에는 중간 정도 또는 높은 정도로 존재한다. 발현 값의 밀도측정 플럿이 도 24의 아래 팬널에 보여진다.
이 데이터는 엑소좀 및 뼈 MV (Bone MV)는 이들 마커들의 중간 내지 높은 발현을 가진 비슷한 발현 프로파일 공유하는 반면에, MBV는 이들 EV 마커들의 발현에 의미 있는 차이가 있음을 보여준다. 예를 들어, 엑소좀 웰에 같은 위치에 어두운 링 (dark rings) 또는 고체 어두운 점 (solid dark spots)의 존재 및 아래 팬널의 그래프에서 보여준 대로 이들 마커들의 상대적 발현 수준과 비교하여, MBV는 빈 웰 (blank well)로 제시된 대로 EpCAM, ANXA5, TSG101, FLOT1, ICAM1, 및 ALIX의 하나 이상의 수준이 사실상 없다, 즉 "낮거나 (low)" 또는 "검출 가능하지 않은 (undetectable)"수준이다. 뼈 MV (Bone MV)는 MBV에 비교하여, 웰에 어두운 점 및 아래 팬널에 그래프에서 보여준 대로 이들 마커들의 상대적 발현 수준으로 보여준 대로 이들 마커 모두의 발현 수준이 또한 더 높다.
한 실시 예에서, 엑소-첵 엑소좀 항체 어레이(Exo-CheckTM Exosome Antibody Array)의 양성 대조군에 비교하여 MBV는 CD63, CD81, EpCAM, ANXA5, TSG101, FLOT1, ICAM1, 및 ALIX 중의 하나 또는 그 이상이 낮거나 또는 검출되지 않을 만한 수준을 갖는다. 한 실시 예에서 MBV는 엑소좀, 예를 들어, 플라즈마 엑소좀 (plasma exosome)에 비교하여, CD63, CD81, EpCAM, ANXA5, TSG101, FLOT1, ICAM1, 및 ALIX 중의 하나 또는 그 이상이 낮거나 또는 검출되지 않을 만한 수준을 갖는다. 한 실시 예에서, MBV는 bone MV에 비교하여 Cd63, CD81, EpCAM, ANXA5, TSG101, FLOT1, ICAM1, 및 ALIX 중 하나 또는 그 이상이 낮거나 또는 검출되지 않을 만한 수준을 갖는다. 한 실시 예에서, MBV는 엑소좀 또는 뼈 MV (bone MV)에 비교하여 낮거나 또는 검출되지 않을 만한 수준 ANXA5, TSG101, 및 ICAM1으로 특징지어진다. 한 실시 예에서, MBV는 뼈 MV 또는 플라즈마 엑소좀 (plasma exosome)에 비교하여 CD81, CD63, ANXA5, TSG101, 및 ICAM1이 낮거나 또는 검출되지 않을 만한 수준으로 특징지어진다.
실시 예 18: MBV는 bone MV 마커의 발현이 낮거나 또는 없다 (MBV have low or no expression of bone MV markers).
뼈 MV (Bone MV) 마커 Annexin V, 및 조직 비-특이적인 알카라인 포스파타아제 (Tissue Non-specific Alkaline Phosphatase, TNAP)의 발현이 웨스턴 블럿 (Western blot) 분석으로 평가되었다. 그 결과는 도 25에 보인다. 1711A 세포로부터 제조된 용해물(lysate)이 양성 대조군으로 사용되었다. 이 실험의 결과는 기질 결합 나노소포체 ( matrix bound nanovesicles, MBV)는 뼈 미세 소포체 (bone microvesicles)의 두 마커, TNAP 및 Annexin V의 어느 발현이 없다는 것을 보여준다. 플라즈마 엑소좀 (plasma exosome)은 Annexin V는 발현하나, TNAP은 발현하지 않는다. 이 결과들은 MBV를 엑소좀 및 뼈 미세 소포체 (bone microvesicles) 둘 다로부터 분명히 구별한다.
실시 예 19: MBV는 엑소좀 또는 뼈 MV에 비교하여 차이 나는 면역조절 효과를 가진다 (MBV have a differential immunomodulatory effect compared to exosomes or bone MV).
쥐로부터 수확한 골수-유래 대식세포 (Bone Marrow-Derived Macrophages, BMDM)는 다음의 테스트 물질로 처치하지 않거나 (M0) 또는 24시간 동안 처치하였다: M1 표현형을 유도하기 위하여 IFN+LPS (M1), M2-유사 표현형을 유도하기 위하여 IL-4 (M2), 플라즈마로부터 유래된 엑소좀, 17A 세포로부터 유래된 뼈 MV (Bone MV), 또는 근육으로부터 분리된 MBV. 처치 후, 표시된 유전자 발현의 배수 변화 (fold change)는 qPCR로 평가되었다. 도 26에서 보여준, 이 결과는 MBV에 의한 전-염증성 마커 IL-6 및 TNF-α의 하향조절은 엑소좀 및 뼈 미세소포체에 의한 이 같은 두 개의 염증 매개체의 하향 조절과는 분명히 구별됨을 보여준다. MBV는 강력한 항-염증성 효과를 가졌다; 반면에 엑소좀 및 뼈 미세소포체는 가지지 않았다.
참고 문헌의 병합
반대로 달리 언급되지 않는 한, 여기서 언급된 각 특허 증명서 및 과학 논문의 전체 공개가 모든 목적에서 참고 문헌으로 병합된다.
동등 (EQUIVALENTS)
본 발명은 이의 정신 및 필수 특징으로부터 이탈됨이 없이 다른 특정한 형태로 구현될 수 있다. 앞선 실시 예들은 그러므로 모든 관점에서 여기서 서술된 발명을 제한하기보다는 예시적인 것으로 간주 된다. 본 발명의 범위는 그러므로 앞선 서술에 의한 것보다는 첨부되는 청구항에 의해 제시되고, 및 청구항과 동등한 의미 및 범위 내에 들어오는 모든 변화는 거기에서 포괄되려는 의도가 있다.

Claims (60)

  1. 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 발병 위험이 있는 개체에서 ARDS를 치료 또는 예방하는 방법으로, 세포 외 기질로부터 유래된 단리된 기질 결합 소포체 (matrix bound vesicles, MBV)의 치료학적 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 이로써 개체에서 ARDS를 치료 또는 예방하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 개체는 바이러스성, 박테리아성, 또는 곰파이성 기원인 폐 감염을 가진 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 개체는 SARS-CoV2, SARS-CoV, MERS-CoV, 에볼라바이러스 (ebolavirus), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 또는 헤르페스 바이러스 (herpes virus) 로 구성된 그룹으로부터 선택된 바이러스에 인한 폐 감염을 가진 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 폐렴을 가진 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 SARS-CoV-2 또는 COVID-19에 감염된 것을 특징으로 하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 인플루엔자를 가진 것을 특징으로 하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 SARS 또는 MERS를 가진 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 독성 물질을 흡입한 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제8항의 방법에 있어서, 상기 독성 물질은 연기 (smoke), 화학 연기(chemical fumes), 베이핑 (vaping) 증기인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 폐로 흡입된 물, 구토물, 또는 음식물이 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 폐 또는 호흡을 조절하는 뇌의 일부분을 손상시키는 머리 또는 흉부 상처가 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 패혈증 (sepsis) 을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 췌장염 (pancreatitis)을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 심각한 화상 (severe burn)을 갖는 것을 특징으로 하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 다량의 수혈 (blood transfusion)을 받은 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 사이토카인과분비 (hypercytokinemia)를 경험하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 MBV의 투여는 상기 개체에서 사이토카인과분비를 역전시키는 것을 특징으로 하는, 방법,
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBV는 ARDS 의 발병을 예방하기 위하여 ARDS 의 발병 전에 상기 개체에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBV는 ARDS를 치료하고 ARDS의 진행을 예방하기 위하여 ARDS 발병 후에 상기 개체에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 인간 개체인 것을 특징으로 하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 전신 정맥 내 (systemic intravenous, IV) 주사로 투여되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 전신 정맥 내 주사는 표준 IV 라인 (line) 또는 중앙 라인 (central line) 을 통하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 중앙 라인은 말초 삽입 중앙 카테터 (peripherally inserted central catheter, PICC), 터널형 카테터 (tunneled catheter), 또는 임플란트된 포트 (implanted port)인 것을 특징으로 하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 표준 IV 라인은 손목, 팔, 또는 손의 정맥에 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정맥 내 주사는 일 회 주사 (bolus injection) 또는 연속적인 점적 (continuous drip) 또는 펌프 주사 (pump injection) 인 것을 특징으로 하는, 방법.
  26. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 상기 개체의 폐에 분무기 (nebulizer)를 통하여 에어로졸로서 투여하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  27. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 상기 개체에게 장치된 기관지 내 관 (endotracheal tube)을 통해 기관지 내 점적 주입 (endotracheal instillation)으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 비강 내 투여를 통해 정량 흡입기 (metered dose inhaler)로 폐에 투여되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서;
    (i) 상기 MBV는 CD63, CD81, 및/또는 CD9 중 하나 또는 그 이상을 발현하지 않거나, 또는 거의 검출되지 않는 수준의 CD63, CD81, 및/또는 CD9을 갖고; 및/또는
    (ii) 상기 MBV는:
    (a) 적어도 55%의 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine, PC) 및 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidyl inositol, PI)의 조합을 포함하는 인지질 함량;
    (b) 10% 이하의 스핑고마이엘린(sphingomyelin, SM) 을 포함하는 인지질 함량;
    (c) 20% 이하의 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine, PE)을 포함하는 인지질 함량; 및/또는
    (d) 15% 이상의 포스파티딜 이노시톨 (phosphatidylinositol, PI)을 포함하는 인지질 함량을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBV는 방광 (urinary bladder), 소장(small intestine), 심장, 피부(dermis), 간, 신장, 자궁, 뇌, 혈관, 폐, 뼈, 근육, 췌장 (pancreas), 태반, 위, 지라(spleen), 결장(colon), 지방 조직(adipose tissue), 또는 식도(esophagus)의 세포 외 기질로부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBV는 방광 기질 (urinary bladder matrix, UBM), 소장 점막 하(small intestine submucosa, SIS), 또는 방광 점막하 (urinary bladder submucosa, UBS)로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBV는 인간, 원숭이, 돼지, 소, 또는 양에서 선택된 포유류 척추동물의 세포 외 기질로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBV는 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x1020 MBV의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBV는 투여 당 체중 kg 당 1x106 내지 1x1012 MBV의 양으로 투여 되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBV는 투여 당 체중 kg 당 1x109 내지 1x1014 MBV의 양으로 투여 되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 항생제, 항바이러스제, 또는 항-염증 약물을 투여받은 것을 특징으로 하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 렘데시비르 (remdesivir), 파비피라비르 (favipiravir), 아지트로마이신(azithromycin), 또는 하이드록시클로로퀸을 투여받는 것을 특징으로 하는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 토실리주맙 (tocilizumab), 아나킨라 (anakinra), 또는 야너스 키나제 (Janus kinase, JAK) 억제제를 투여받는 것을 특징으로 하는, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 면역억제제 (immunosuppressive agent) 로 치료된 개체와 비교하여 MBV 치료의 결과로서 2차 감염의 위험이 감소된 것을 특징으로 하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 2차 감염은 폐 감염인 것을 특징으로 하는, 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 2차 감염은 혈액 내 감염인 것을 특징으로 하는, 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 2차 감염은 심장, 신장, 또는 간에 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 감염은 박테리아성 감염인 것을 특징으로 하는, 방법.
  44. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 2차 감염은 바이러스성 감염인 것을 특징으로 하는, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물 투여 후에 개체에서 산소 포화도 (oxygen saturation)가 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초과하여 증가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  46. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물 투여 후에 개체에서 산소 포화도 지수 (oxygen saturation index)가 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초과하여 증가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  47. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 화합물 투여 후에 개체에서 산소 지수 (oxygen index)가 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 100% 초과하여 증가하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증가는 약학적 조성물의 투여 후 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 또는 24시간 내에 일어나는 것을 특징으로 하는, 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 MBV 투여 후에 전-염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine) 생성의 감소를 경험하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 전-염증성 사이토카인은 TNF-α, IFN-γ, IL-8, IL-6, IL-1β, 또는 IL-12 중 하나 또는 그 이상인 것을 특징으로 하는, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 MBV 투여 후에 항-염증성 사이토카인 생성의 증가를 경험하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 항-염증성 사이토카인은 TGF-β, IL-4, 또는 IL-10인 것을 특징으로 하는, 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증가 또는 감소는 MBV 투여 전 및 후에 개체의 폐로부터 기관지 폐포 세척액을 샘플링하여 측정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증가 또는 감소는 MBV 투여 전 및 후에 개체의 혈액을 샘플링하여 측정되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에 약학적 조성물의 투여는 하기 중 하나 이상의 결과를 가져오는 것을 특징으로 하는, 방법:
    (a) 개체의 폐에서 CD45+ 호중구 (neutrophils) 수의 감소;
    (b) 개체의 폐 또는 지라 (spleen)에서 CD8+ 세포 수의 증가 및 CD4+ T 세포 수의 감소;
    (c) 개체의 지라에서 CD69+CD4+ T 세포 수의 증가;
    (d) 개체의 림프절 (lymph node)에서 항-바이러스성 tbet+CD4+ T 세포 수 증가;
    (d)개체의 지라에서 항-바이러스성 tbet+CD8+ T 세포 수 증가;
    (e) 개체의 지라에서 CD69+ CD8+ t-세포 수 증가;
    (f) 폐에서 면역조절 CD11b+ 수지상 세포 (immunoregulatory CD11b+ dendritic cells) 수의 증가; 및
    (g) 폐에서 CD62L+/CD44+ 기억 CD4 및 CD8 T-세포 수 증가.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체에 대한 약학적 조성물의 투여는 개체에서 바이러스-관련된 조직 손상을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBV는 하기의 마커: EpCAM, ANXA5, TSG101, FLOT1, ICAM1, GM130, 또는 ALIX 중 하나 또는 그 이상을 낮게 또는 검출 불가능한 수준으로 발현하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  58. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBV는 하기의 마커: ANXA5, TSG101, 또는 ICAM1 중 하나 또는 그 이상을 낮게 또는 검출 불가능한 수준으로 발현하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  59. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MBV는 CD81, CD63, ANXA5, TSG101, 및 ICAM1을 낮게 또는 검출 불가능한 수준으로 발현하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  60. 세포 외 기질로부터 유래된 분리된 기질 결합 소포체 (matrix bound vesicles, MBV)를 급성 호흡 곤란 증후군 (acute respiratory distress syndrome, ARDS)의 치료를 위하여 사용하는 것을 특징으로 하는, 용도.
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