JP2023521486A - Ｇｖｈｄ患者の治療管理を導き、最適化するためのｆｍｔ性能予測試験 - Google Patents

Ｇｖｈｄ患者の治療管理を導き、最適化するためのｆｍｔ性能予測試験 Download PDF

Info

Publication number
JP2023521486A
JP2023521486A JP2022562889A JP2022562889A JP2023521486A JP 2023521486 A JP2023521486 A JP 2023521486A JP 2022562889 A JP2022562889 A JP 2022562889A JP 2022562889 A JP2022562889 A JP 2022562889A JP 2023521486 A JP2023521486 A JP 2023521486A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
bacteroidetes
subject
fmt
firmicutes
patients
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022562889A
Other languages
English (en)
Inventor
アファガール エルベ
プランタムラ エミリー
プレスタ エマニュエル
ガスク シリエル
レバスト ブノワ
Original Assignee
マー ファルマ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by マー ファルマ filed Critical マー ファルマ
Publication of JP2023521486A publication Critical patent/JP2023521486A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/10—Enterobacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G01N2800/245—Transplantation related diseases, e.g. graft versus host disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
  • Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)

Abstract

本開示は、対象の微生物叢及び／又は宿主パラメータを分析することによって、生きた微生物との補完を必要とするGVHD対象が、前記補完から恩恵を受けることができるかどうかを評価する方法に関する。微生物学的治療の応答が乏しいと同定された患者の状態を改善するための治療、ならびに本発明による方法を実施するための材料及びキットもまた提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、GVHD管理の分野に関する。特に、本発明は、GVHDにおける腸内細菌叢の役割に関するものであり、糞便微生物叢移植(FMT)などのこの微生物叢を調節することを目的とする治療から、患者が恩恵を受ける可能性があるかどうか、又はFMTに完全に応答する成功可能性を高めるために、FMTの前に別の治療が必要であるかどうかを判断するための方法を提供する。
ＧＶＨＤ
移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、同種造血幹細胞移植（同種ＨＳＣＴ）の主要な合併症であり、宿主細胞上のタンパク質、特にヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対するドナー免疫Ｔ細胞の免疫媒介炎症反応からなる。同種ＨＳＣＴは、悪性疾患から遺伝性貧血まで、さまざまな複数の血液疾患の治療目的に必要である。
拒絶反応は、マイナーな組織適合抗原の不一致、またはその他の理由により、ドナーの免疫系がレシピエントを攻撃し、特有の炎症性疾患を引き起こす場合に発生する。ＧＶＨＤは、自己ＨＳＣＴ(同じ患者由来の細胞)の後には発生しない。
ＧＶＨＤは、症状のタイミングに応じて２つの主要な形態を有する：
―急性ＧＶＨＤ(ａＧＶＨＤ)：ＨＳＣＴ後１００日以内に発生する臨床病理学的症候群(発症の中央値は通常、移植後２１～２５日である)；主に３つの臓器を含む：皮膚(ＧＶＨＤ患者の＞８０％)、胃腸(ＧＩ)管(５０～５５％)及び肝臓(５０％)。これらの臓器のいずれか１つ又はそれらの臓器の組み合わせが影響を受け得る。
―慢性ＧＶＨＤ(ｃＧＶＨＤ)は、線維性皮膚疾患、細気管支炎、唾液及び涙腺疾患、並びに好酸球性筋膜炎を伴い、通常、ＨＳＣＴの１００日以上後に発生し、急性ＧＶＨＤに続くことが多い。
現在のＧＶＨＤ治療
ＧＶＨＤの管理は困難である。コルチコステロイドによる免疫抑制は、急性及び慢性ＧＶＨＤの両方で第一選択療法の基礎を形成し、初期の疾患の重症度に応じて、ａＧＶＨＤ患者の５０％未満およびｃＧＶＨＤ患者の４０～５０％で持続的な反応を引き起こす。
ステロイドに良好に反応しない患者(ステロイド難治性 ＳＲ)又はステロイドを漸減できない患者(ステロイド依存性 ＳＤ)の場合、予後は非常に不良である。
最近の研究では、全身治療の１週間後の、腫瘍原性抑制因子-２(ＳＴ２)及び再生膵島由来タンパク質３-α(REG3α)のレベルを含む、ステロイド耐性GVHDの長期転帰を予測するためのバイオマーカーが記載されている(Major-Monfried et al.,2018)。
患者の微生物叢の重要性
同種ＨＳＣＴを受けている患者は、細胞傷害性化学療法、全身照射、免疫抑制剤、及び広域の抗生物質にさらされ得る。これらの治療は、腸内細菌叢の劇的な変化及び腸粘膜へのさまざまな程度の損傷を引き起こし、宿主防御の侵害につながる。
同種ＨＳＣＴの過程で、患者は、全体的な微生物の多様性及び豊富さの減少、宿主防御をサポートする有益な細菌(ファーミキューテス門など)の破壊、及び一部の病原体や原性共生生物（例えば、Clostridium difficile、いくつかの腸内細菌科）、及び多剤耐性(ＭＤＲ)細菌(Malard et al.,2018)を含む、通常は準優勢な細菌種の優勢な増加を特徴とする微生物群の深刻な変化を示し(Malard et al.,2018)、その後の細菌血症および感染性合併症に関連する(Taur et al., 2012)。
腫瘍学における現在の標準治療は、そのベースライン状態を含む微生物叢管理を考慮していない。しかしながら、最近のいくつかの研究では、腸内細菌叢が、異種代謝、免疫相互作用、及びコミュニティ構造の変化を含む、多くのメカニズムを通じて化学療法の有効性及び毒性に関与していると報告されている。機能的な微生物叢がなければ、これらの治療法は最適ではない可能性がある（Iida et al., 2013; Alexander et al., 2017; Ma et al., 2019）。
同種ＨＳＣＴ患者において、腸内細菌叢の多様性が同種ＨＳＣＴ後の全生存期間(Malard et al., 2018)及びＧＶＨＤ患者の転帰(Taur et al., 2014, Peled et al., 2020)において重要な役割を果たす。実際、微生物叢の多様性の喪失は、より顕著に胃腸ＧＶＨＤと関連していることが観察された(Holler et al., 2014)。いくつかの研究において、微生物叢の破壊(多様性の喪失、単一分類群による支配など)は、ＧＶＨＤ関連の死亡率として、患者の転帰不良と関連していることが報告されており、微生物叢とその宿主との間の相互作用、および腸内細菌叢の完全性を回復する機会の重要性を主張した（Malard et al., 2018; Taur et al., 2012; Taur et al., 2014; Peled et al, 2020; Holler et al., 2014; Golob et al., 2017; Jenq et al., 2015）。
同種ＨＳＣＴ患者の腸内細菌叢を回復するためのＦＭＴ
標準的な治療器具に加えて、腸内細菌叢を操作して、同種ＨＳＣＴ患者の治療関連の合併症を抑制又は減少させる戦略が近年提案された。いくつかのケーススタディにより、胃腸ａＧＶＨＤの治療における糞便微生物叢移植(FMT、糞便微生物叢療法としても知られ、腸内細菌叢の恒常性を回復することを目的とした上部または下部の胃腸経路を介した、健康なドナーからの治療された糞便の投与として定義される)の使用の有望な結果が報告された（Kakihana et al., 2016; Spindelboeck et al., 2017; Qi et al., 2018 ; van Lier et al., 2019; Shouval et al., 2018）。
しかしながら、この予後不良の患者集団でこれまでに報告された症例数が少ないことを考えると、どの患者が前記ＦＭＴの恩恵を受けるべきであり、実際に恩恵を受けることができるかを特定することは困難である。
対象集団の定義がない場合、患者はＦＭＴを取得する可能性があるが、彼／彼女の臨床状態により臨床反応の達成が可能でない、又は彼／彼女の微生物腸は糞便移植製品の恩恵を受ける準備ができていない。
ＧＶＨＤ患者集団は非常に脆弱であり、効果的な治療が迅速に実施されない場合、死亡率が高くなる。したがって、ＦＭＴ治療の恩恵を受ける準備ができていない患者を治療することは、重篤な病気及び生命を脅かす緊急事態の状況の中で、治療を受ける時間と機会の損失につながる可能性がある。
本発明は、ＧＶＨＤ患者の治療管理を導き、最適化するためのＦＭＴ性能予測試験に関して、満たされていないニーズを満たすことを目的とする。
本発明は、生きた細菌(例えば、ＦＭＴ)による彼／彼女の胃腸微生物叢の補完を必要とする対象が、前記補完から恩恵を受けることができるかどうか、すなわち、投与された生細菌が生着することができ、対象の胃腸微生物叢の組成における有意な変化をもたらすかどうかを評価する方法に関する。この方法は、これらの細菌が腸に生着する可能性を高めるために、前記補完を首尾よく受けることができる患者を、本治療の恩恵を受けない可能性が最も高く、生きた細菌を投与する前にコンディショニング治療を必要とする患者と区別することにより、ＧＶＨＤ患者の治療管理を最適化するのに特に有利である。
本方法は、以下を含む：
ａ．前記対象由来の胃腸内生体試料において、良好な予後に関連する細菌の存在量を測定するステップであり、前記細菌が、以下からなる群より選択される少なくとも1つのカテゴリーに属する、前記ステップ；
― ファーミキューテス門；
― バチルス綱及び放線菌綱；
― バチルス目、ラクトバチルス目、及びマイクロコッカス目；
― ブドウ球菌科、ラクトバチルス科、及びマイクロコッカス科；並びに、
― ブドウ球菌属、ラクトバチルス属、メリソコッカス属、及びアルスロバクター属 ;
及び／又は、
ｂ．前記対象由来の胃腸内生体試料における、予後不良に関連する細菌の存在量を測定するステップであり、前記細菌が、以下からなる群より選択される少なくとも1つのカテゴリーに属する、前記ステップ；
― バクテロイデス門、及びプロテオバクテリア門；
― バクテロイデス綱；
― バクテロイデス目、及びエンテロバクター目
― バクテロイデス科、ポルフィロモナス科、アシダミノコッカス科、ラクノスピラ科、ルミノコッカス科、クロストリジウム科、プレボテラ科、及びエリシペロトリクス科；並びに、
― バクテロイデス属、エスケリキア属、赤痢菌属、ルミノコッカス属、フェカリバクテリウム属、ドレア属、コプロコッカス属、ブラウティア属、アリスティペス属、サブドリグラニュラム属、ローズブリア属、パラバクテロイデス属、及びラクノスピラ属；及び
ｃ．ステップａ及び／又はステップｂにおいて得られた結果並びに計算式を使用して、前記補完によって対象の微生物叢が有意に改善される可能性を反映する少なくとも1つのスコア（＃R）を計算するステップ；及び
ｄ．ステップcで得られた各スコアを１つ又は複数の基準値と比較し、対象が生きた細菌による胃腸微生物叢の補完を首尾よく受けることができるかどうか、または対象が前記補完の前に事前治療を必要とするかどうかを推測するステップ。
本発明の他の態様によれば、宿主パラメータを上記の微生物叢パラメータと組み合わせて、ＦＭＴ又は生きた細菌によるその他の補完治療の成功又は失敗を予測することができる。
本発明はまた、試験が陽性であった対象におけるＧｖＨＤを治療するためのＦＭＴ産物の使用に関する。
本発明の別の態様は、好ましくない細菌を標的とする非吸収性抗生物質及び／又は浸透圧性下剤治療などのコンディショニング治療を使用して、患者がその後、ＦＭＴ又は生きた細菌によるその他の補完治療の恩恵を受けることができるように患者を準備することである。
本発明に記載の方法を実施するための材料及びキットもまた、提供される。
本発明に記載のクリニカルパス。 HERACLES試験のデザイン。 HERACLES試験、SR-aGvHD患者、BrayCurtis類似度対IMP、OTUレベル。 HERACLES試験、SR-aGvHD患者、V1と比較した産物との類似度の進展。 HERACLES試験、SR-aGvHD患者、MaaT指数。上部パネル: Butycore;中央パネル:コア微生物叢;下部パネル:健康MaaT指数。 EAP患者、BrayCurtis類似度対IMP、OTUレベル。 EAP患者、Butycore MaaT指数。 EAP患者、健康MaaT指数。 血中シトルリン インドキシル硫酸 糞便ゾヌリン プレアルブミン(血液) 総コレステロール ベースライン時の胃腸応答の微生物叢バイオマーカー 判別分析結果。A:有意な層別化効果を有する、事前に選択された各分類群の効果サイズ。B:分類学的レベルでグループ化された分類群(P:門、C:綱、O:目、F:科、G:属)。予後のサインに有意な影響を及ぼさない分類群は白で示されている。 ベースライン時の胃腸反応の追加の微生物叢バイオマーカー、閾値(16Sシーケンシングによって測定された存在量)。 全体的な予測分析結果。内部交差検定平均AUCを使用したRidgeロジスティック回帰は、各時点の信頼区間(薄い灰色のリボン)で囲まれた灰色の線として示されている。各訪問に含まれる患者の数も言及されている。 予測結果の主要なマーカー。各マーカー(行)は、少なくとも１つの時点の予測モデルにおける重要なドライバー(重みとして定量化)と見なされる。バーは、信頼区間での重みに対応するマーカーを表す。負の重み(左向きのバー)は非応答者にとってより重要な測定値を示し、正の重み(右向きのバー)は応答者にとってより重要な測定値を示す。
本発明は、GVHDの臨床的状況、特にステロイド不応性GVHD(SR-aGvHD)の状況において特に関連している。それは、FMT処理の最適化である。臨床医は次のことを周知である：
― 一方では、患者のコロニー形成が不十分なFMTで患者を治療することは、望みどおりに効率的でない可能性がある。この患者集団にとって特に貴重な時間がかかり、治療効果の可能性は低いにもかかわらず費用がかかる可能性がある。実際、一部の患者は、FMTが微生物叢を効率的に調節し、臨床的恩恵をもたらす可能性を高めるために、FMTを受ける前に追加の治療が必要になる場合がある。
― 他方では、このような「事前治療」をすべての患者に提供することは、そのような治療を必要としない患者を治療することにつながる。これはせいぜい時間の損失につながり、最悪の場合、これらの患者が応答する可能性を減少させ得る。
したがって本発明は、FMTに応答する可能性を高めるために、FMTの前に治療を必要とする患者と、そのような事前治療を必要とせず、成功の可能性が高くFMTを直接受けることができる患者とを区別するための、FMT性能予測試験を提供することを目的とする。
これに関連して、GVHD集団における潜在的なFMTの恩恵を調査するために、出願人によって２つのプログラムが設定された。これらのプログラムの結果は、以下の実験部分で説明され、FMTの対象となる患者を特定するための層別化ツールをもたらした。
本発明は、生きた微生物による彼/彼女の胃腸微生物叢の補完を必要とする対象が、前記補完から恩恵を受けることができるかどうかを評価するための方法に関し、以下を含む：
ａ．前記対象由来の胃腸内生体試料において、良好な予後に関連する細菌の存在量を測定するステップであり、前記細菌が、以下からなる群より選択される少なくとも1つのカテゴリーに属する、前記ステップ；
― ファーミキューテス門；
― バチルス綱及び放線菌綱；
― バチルス目、ラクトバチルス目、及びマイクロコッカス目；
― ブドウ球菌科、ラクトバチルス科、及びマイクロコッカス科；並びに、
― ブドウ球菌属、ラクトバチルス属、メリソコッカス属、及びアルスロバクター属 ;
及び／又は、
ｂ．前記対象由来の胃腸内生体試料における、予後不良に関連する細菌の存在量を測定するステップであり、前記細菌が、以下からなる群より選択される少なくとも1つのカテゴリーに属する、前記ステップ；
― バクテロイデス門、及びプロテオバクテリア門；
― バクテロイデス綱；
― バクテロイデス目、及びエンテロバクター目
― バクテロイデス科、ポルフィロモナス科、アシダミノコッカス科、ラクノスピラ科、ルミノコッカス科、クロストリジウム科、プレボテラ科、及びエリシペロトリクス科；並びに、
― バクテロイデス属、エスケリキア属、赤痢菌属、ルミノコッカス属、フェカリバクテリウム属、ドレア属、コプロコッカス属、ブラウティア属、アリスティペス属、サブドリグラニュラム属、ローズブリア属、パラバクテロイデス属、及びラクノスピラ属；及び
ｃ．ステップａ及び／又はステップｂにおいて得られた結果並びに計算式を使用して、前記補完によって対象の微生物叢が有意に改善される可能性を反映する少なくとも1つのスコア（＃R）を計算するステップ；及び
ｄ．ステップcにおいて得られた各スコアを１つ又は複数の基準値と比較し、対象が生きた細菌による胃腸微生物叢の補完を首尾よく受けることができるかどうか、または対象が前記補完の前に事前治療を必要とするかどうかを推測するステップ。
本明細書で使用される用語「含む（comprise）」又は「含む（include）」は、組成物及び方法が、列挙されたリストから選択される要素を含み、その他の要素を除外しないことを意味することを意図する。
単数形の「a」及び「the」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数の言及が含まれる。したがって、例えば、「計算式(a calculation formula)」の言及は、複数の計算式を含む。
本文において、生きた微生物による胃腸微生物叢の補完(例えばＦＭＴ)は、この補完を受けた対象の微生物叢組成に有意な変化をもたらす場合、「成功」と見なされる。以下の実験部分で説明するように、補完の成功は、種々の指標、例えば投与された微生物組成物(ＦＭＴ産物など)とのOTU BrayCurtis類似度、Butycore、コアマイクロバイオーム及び健康指数（実験部分で定義)、並びに血中シトルリン及び血中インドキシル-３-硫酸塩濃度などのパラメータを用いて評価することができる。特に、対象の胃腸微生物叢と前記補完のために投与された産物との間のOTU BrayCurtis類似度が、1回目、2回目または3回目の投与後数日(例えば、５～１２日)に（産物の最初の投与前に観察された、対象の胃腸内細菌叢と産物との間の類似度と比較して）少なくとも５％増加する場合、生きた微生物による胃腸微生物叢の補完は成功とみなされ得る。
上記の方法において、補完治療(すなわち、彼/彼女の胃腸微生物叢を補完するための生きた微生物を含む産物)を「首尾よく受けることができる」対象は、補完が成功する可能性が高い、すなわち、補完組成物の投与前の準備またはコンディショニング処理を必要とせずに、彼/彼女の胃腸微生物叢組成に有意な変化をもたらす人である。
同様に、補完治療から「恩恵を受けることができる」または「恩恵を受ける可能性が高い」対象は、補完が成功する可能性が高い、すなわち、補完組成物の投与前にいかなる事前治療またはコンディショニング治療も必要とせずに、彼/彼女の胃腸微生物叢組成の有意な変化をもたらす人である。
うまくいけば、成功した補完は、前記補完を必要とする対象の臨床応答を導く。しかしながら、これは、対象の状態を改善するために補完産物が適切に選択された場合にのみ当てはまる。そうでなければ、補完は、対象の健康に影響を与えることなく、または最悪の場合には有害な影響を与えることなく、それ自体成功し得る(すなわち、投与された微生物が対象の腸に生着する)。したがって、本文では、「補完の成功」は、本治療に対する臨床応答と同義ではない。
本明細書で使用される場合、用語「良好な予後」は、補完により投与された生細菌の少なくとも一部の生着がもたらされる予後を意味し、一方、「予後不良」は、補完により微生物叢組成の有意な変化がもたらされない予後を意味する。
特許請求された方法を実行するとき、当業者は、任意の適切な基準を使用して、測定された存在量を正規化することができる。適切な基準の非限定的な例としては、細菌の総数、細菌＋古細菌の総数、及び特にステップcにおける計算が「予後良好」および「予後不良」細菌のレベルの間の比である場合、任意の内部基準が挙げられる。
上記の方法の特定の実施形態によれば、以下の値が決定される：
― 最初の値（＃Ｇ）が、ステップaにおいて決定され、および/または
― 第2の値（＃Ｂ）が、ステップｂにおいて決定され、
― ステップCにおいて、＃Ｒ１＝＃Ｇ、＃Ｒ２＝１：＃Ｂ及び／又は＃Ｒ３＝＃Ｇ：＃Ｂであるため、基準値を超える＃Ｒ１、＃Ｒ２、及び／又は＃Ｒ３は良好な予後を示し、基準値より劣っている＃Ｒ１、＃Ｒ２、及び／又は＃Ｒ３は予後不良を示す。
上記実施形態において、＃Ｇは、良好な予後に関連する細菌について選択された分類群の測定された存在量を用いて計算される。例えば、それはこれらの分類群の相対的な存在量の合計であり得る。当然この合計は、予後における各分類群の重要性を反映するために、加重合計にすることができる。例えば、当業者は、大量に存在するが予後との関連性が低い分類群に起因する重みよりも、通常は非常に少量存在するが予後に非常に関連性が高い分類群に大きな重みを帰することができる。
同様の理論が＃Ｂの計算にも当てはまる。
当業者は、ステップcにおいて、示された比率よりも複雑な式を使用することもできる。唯一の条件は、それに応じて基準値を調整することである。当然、null又は無限の結果を導く計算式は除外される。
本明細書において使用される場合、「生きた微生物による対象の胃腸微生物叢の補完」は、対象の微生物叢を改善することを目的として、生きた微生物を含む任意の組成物の投与を指す。このような組成物は、1つの単一株の純粋培養物、複数の培養株の混合物、及び／又は微生物の複雑な群集、例えば、1つ又は複数のドナーからの糞便材料に由来するものを含むことができる。糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）は、本発明に記載の、生きた微生物による補完の一例である。
特定の実施形態によれば、本発明に記載の方法は、例えば糞便微生物叢移植(FMT)を通じて、生きた微生物による彼/彼女の胃腸微生物叢の補完を必要とする対象が、前記移植から恩恵を受けることができるかどうかを評価するために実施される。
別の特定の実施形態によれば、対象は、同種造血幹細胞移植(ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ)後の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に罹患している。
上記の方法は、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）後の急性、ステロイド抵抗性移植片対宿主病（ＳＲ－ａＧｖＨＤ）に罹患している対象が、生きた微生物との補完（例えば、ＦＭＴ）から恩恵を受けることができるかどうかを評価すること、及び／又は対象が胃腸への影響を伴うＧｖＨＤに罹患している状況において、特に有用である。
上記の方法を実行する場合、当業者は、予後良好または不良に関連する上記に示した異なる分類群の中から、分類群の任意の組み合わせの選択が自由である。同じ又は異なる分類レベルの分類群を組み合わせてもよい。当業者は、これらの分類群を追加の分類群と組み合わせることもでき、すでに述べたように、当業者は任意の関連式を使用して、それぞれ予後良好及び不良に関連する＃Ｇ及び／又は＃Ｂの値を計算することができる。本発明を実施するための式の非限定的な例を以下に示す。(注：以下に示す合計は、示された分類群の加重合計として理解されるべきである ― 当業者は、結果の予測値を最適化するために各分類群の重みを定義できる)：
（ｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門、＃Ｂ＝バクテロイデス門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
（ｉｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、＃Ｂ＝バクテロイデス門、＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
（ｉｉｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門＋放線菌門、＃Ｂ＝バクテロイデス門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
（ｉｖ）＃Ｇ＝放線菌門＋ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、＃Ｂ＝バクテロイデス門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
（ｖ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門、＃Ｂ＝バクテロイデス門＋プロテオバクテリア門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
（ｖｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、＃Ｂ＝バクテロイデス門+プロテオバクテリア門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
（ｖｉｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門＋放線菌門、＃Ｂ＝バクテロイデス門＋プロテオバクテリア門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
（ｖｉｉｉ）＃Ｇ＝放線菌門＋ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、＃Ｂ＝バクテロイデス門＋プロテオバクテリア門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
（ｉｘ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ；及び／又は、
（ｘ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、及び＃Ｒ＝＃Ｇ；及び／又は、
（ｘｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門＋放線菌門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ；及び／又は、
（ｘｉｉ）＃Ｇ＝放線菌門＋ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、及び＃Ｒ＝＃Ｇ；及び／又は、
（ｘｉｉｉ）＃Ｂ=バクテロイデス門、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂ；及び／又は、
（ｘｉｖ）＃Ｂ=バクテロイデス門＋プロテオバクテリア門、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂ；及び／又は、
（ｘｖ）＃Ｇ＝バチルス綱＋任意選択で放線菌綱、＃Ｂ＝バクテロイデス綱＋任意選択でガンマプロテオバクテリア綱＋任意選択でネガヴィクテス綱＋任意選択でクロストリジウム綱、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
（ｘｖｉ）＃Ｇ＝バチルス目＋ラクトバチルス目＋マイクロコッカス目、＃Ｂ＝バクテロイデス目＋エンテロバクター目＋任意選択でセレノモナス目＋任意選択でクロストリジウム目、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
（ｘｖｉｉ）＃Ｇ＝ブドウ球菌科＋ラクトバチルス科＋マイクロコッカス科＋任意選択でエンテロコッカス科、＃Ｂ＝バクテロイデス科＋ポルフィロモナス科＋アシダアミノコッカス科＋ラクノスピラ科＋任意選択で腸内細菌科、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
（ｘｖｉｉｉ）＃Ｇ＝ブドウ球菌属＋ラクトバチルス属＋メリソコッカス属＋アルスロバクター属、＃Ｂ＝バクテロイデス属＋エスケリキア属＋赤痢菌属、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；
（ｘｉｘ）＃Ｇ＝バチルス綱＋マイクロコッカス目、＃Ｂ＝バクテロイデス綱＋エンテロバクター目＋アシダミノコッカス科＋ラクノスピラ科、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；
（ｘｘ）＃Ｂ＝ラクノスピラ科＋ルミノコッカス科＋クロストリジウム科、プレボテラ科＋エリシペロトリクス科、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂ；
（ｘｘｉ）＃Ｂ＝バクテロイデス属＋ルミノコッカス属＋フェカリバクテリウム属＋ドレア属＋コプロコッカス属＋ブラウティア属＋アリスティペス属＋サブドリグラニュラム属＋ローズブリア属＋パラバクテロイデス属＋ラクノスピラ属、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂ。
本発明の方法を実行するために、当業者は、細菌を定量するための任意の適切な方法を用いることができる。このような方法の非限定的な例には、定量的ＰＣＲ(ｑＰＣＲ)、１６Ｓシーケンシング、全メタゲノミクスシーケンシング、マイクロアレイ、免疫検出(例えば、ＥＬＩＳＡ試験)、メタボロミクス(例えば、タンデム質量分析に結合された液体クロマトグラフィー又はタンデム質量分析に結合された気体クロマトグラフィー)、並びに培養及び／又はフローサイトメトリー法が挙げられる。
本発明の特定の実施形態によれば、関連する分類群の存在量は、定量的ＰＣＲによって測定される。ＰＣＲ技術は周知であり、簡単に利用可能であり、詳細な説明は必要でない。ＰＣＲを基にした技術は、測定されるターゲットに特異的であるように設計された増幅プライマーを使用して実行される。したがって本発明は、上記の方法を実施するのに適したプライマーのセット、すなわち、前記方法のステップa及び／又はbで検出される微生物分類群のそれぞれに特異的な配列を増幅するためのプライマー対を含む、プライマーのセットにも関する。このようなプライマーのセットは、最低4つのプライマーを含むが、より多くのプライマー、例えば6、8、10、16、20、30、40、50、60、70、80、100、200、300、500、1000又はそれ以上のプライマーを含むことができる。直腸スワブ又は糞便サンプルなどのサンプルから細菌DNAを抽出するための、プライマー及び反応物のセットを含む部品のキットも本発明の一部である。
別の特定の実施形態において、選択された種の相対的存在量は、核酸マイクロアレイの使用によってステップa及び／又はbにおいて評価される。「核酸マイクロアレイ」は、マイクロチップ、スライドガラス又はマイクロスフェアサイズのビーズであり得る固体支持体に取り付けられる、異なる核酸プローブからなる。プローブは、cDNA(「cDNAマイクロアレイ」)又はオリゴヌクレオチド(「オリゴヌクレオチドマイクロアレイ」)などの核酸であり得、オリゴヌクレオチドは、長さが約25～約60塩基対以下であり得る。サンプル中の標的核酸のコピー数を決定するために、本サンプルは標識されて、ハイブリダイゼーション条件でマイクロアレイと接触させられ、それによりマイクロアレイ表面に結合したプローブ配列とそれに相補的な標的核酸との間に複合体が形成される。次いで、標識されたハイブリダイズ複合体の存在が検出される。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が当業者に利用可能である。
本発明に記載の方法を実行するように設計された核酸マイクロアレイも、本発明の一部である。前記核酸マイクロアレイは、前記方法の工程a及び／又はbにおいて検出される細菌分類群のそれぞれに特異的な核酸プローブを含む。本発明に記載のマイクロアレイは、少なくとも1つの対照細菌種及び／又は任意のスパイク-イン制御配列の少なくとも1つの遺伝子を検出するための、少なくとも1つのオリゴヌクレオチドをさらに含み得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドは約50塩基長である。好適なマイクロアレイオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において公知のマイクロアレイオリゴヌクレオチド設計の任意の方法を用いて、関連する分類群に特異的なゲノム配列に基づいて設計され得る。特に、マイクロアレイオリゴヌクレオチドの設計のために開発された任意の利用可能なソフトウェア、例えば、オリゴアレイソフトウェア、GoArraysソフトウェア、アレイデザイナーソフトウェア、Primer3ソフトウェア、mopo16sソフトウェアまたはPromideソフトウェアなど、すべて当業者により周知であるものが使用され得る。
さらなる実施形態によれば、対象から得られたサンプルにおける関連する分類群の存在量の決定は、シーケンシングを用いて行われる。場合によりＤＮＡは、例えばシーケンシング前に制限ヌクレアーゼ又は機械的断片化によって断片化される。シーケンシングは、ライゲーションによるシーケンシング、パイロシーケンシング、合成によるシーケンシング、単一分子シーケンシング又は次世代シーケンシングを含む、当技術分野で公知の任意の技術を用いて行われる。シーケンシングには、例えばエマルジョンＰＣＲなどのＰＣＲに基づく技術も含まれる。次世代シーケンシング(NGS、「大規模並列DNAシーケンシング」または「ハイスループットDNAシーケンシング」とも呼ばれる)を実行するための多数のプラットフォーム、例えば、限定されないが、イルミナゲノムアナライザープラットフォーム、ロシュ454プラットフォーム、ABI SOLiDプラットフォーム、ヘリコス単一分子シーケンシングプラットフォーム、単一ポリメラーゼ分子を用いたリアルタイムシーケンシング(Eid et al., 2009)、イオントレントシーケンシング(WO 2010/008480)、PacBioシーケンシング(Rhoads et al., 2015)及びオックスフォードナノポアシーケンシング(Clarke et al., 2009)などが利用可能である。
さらに別の実施形態によれば、対象から得られたサンプルにおける関連する分類群の存在量は、選択培地上での細菌培養を通じて測定される。例えば、糞便サンプルは希釈されて、ファーミキューテス門選択の培地を有するペトリ皿、及びバクテロイデス門選択の培地を有する別のペトリ皿上で、嫌気性条件下で培養される；細菌を増殖させ、コロニーを数えて2門の相対量を評価する。
対象から得られたサンプル中の関連する分類群の存在量は、フローサイトメトリーによっても測定することができる：例えば、サンプル由来のファーミキューテス門は蛍光物質で標識され、バクテロイデス門は別の蛍光物質で標識され得る。次に、ファーミキューテス門及びバクテロイデス門に属する細胞の数を、サイトメーターを使用して評価し、放出された蛍光を測定する。
本発明の枠組みにおいて「基準値」として用いることができる値の例は、後述の実験部分に開示されている(実施例５及び図１６)。これらの値は特定のコホートから取得され、細菌の存在量は16Sシーケンシングによって測定された。基準値のその他の例は次のとおりである。
― 上記の式(ｘｘ)、すなわち、＃Ｂ＝ラクノスピラ科＋ルミノコッカス科＋クロストリジウム科＋プレボテラ科＋エリシペロトリクス科、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂを使用すると、基準値は約100であり、＃Ｒ＞100は対象がＦＭＴの恩恵を受ける可能性が高いことを示す。
― -上記の式(ｘｘｉ)、すなわち、＃Ｂ＝バクテロイデス属＋ルミノコッカス属＋フェカリバクテリウム属＋ドレア属＋コプロコッカス属＋ブラウティア属＋アリスティペス属＋サブドリグラニュラム属＋ローズブリア属＋パラバクテロイデス属＋ラクノスピラ属、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂを使用すると、基準値は約50であり、＃Ｒ＞50は対象がＦＭＴの恩恵を受ける可能性が高いことを示す。
当然、当業者は、これらの閾値を適合または改良することができ、微生物の相対的存在量を測定するために使用される技術(例えば、定量的PCR、マイクロアレイ上のハイブリダイゼーション又はシーケンシング)、患者の特定の状態、投与される生微生物とのGI微生物叢の補完の性質(例えば、ＦＭＴ)、使用される試料の性質、患者の食習慣及びその他の考えられる要因に依存する。より一般的には、上記の方法を実行する際に考慮すべき基準値は、所与の状態を有する個体の代表的なコホートにおける列挙された細菌分類群の相対的存在量を測定することによって予め決定され、GI微生物叢の補完による所与の治療に対する固体の応答が知られる。熟練者は、検査の感度及び／又は特異性を優先するように基準値を調整することもできる。
本発明の特定の実施形態によれば、ステップa及び／又はbで使用される生物学的試料は、直腸スワブまたは糞便試料である。
本発明の別の態様は、生きた微生物による彼/彼女の胃腸微生物叢の補完を必要とする対象が前記補完から恩恵を受けることができるかどうかを評価するための、特定の宿主パラメータ(すなわち、微生物叢組成物とは異なるパラメータ)の予後の値に関する。この態様は、糞便ゾヌリンの濃度、及びシトルリン、プレアルブミン、コレステロール並びにインドキシル硫酸の血中濃度との予後関連性を示す、以下の実施例４に開示された結果によって裏付けられる。腫瘍原性抑制因子-２(ＳＴ２)及びＭＡＧＩＣバイオマーカーとしても知られる再生膵島由来タンパク質３-α(ＲＥＧ３α)の２つのバイオマーカーは、ステロイド耐性ＧＶＨＤの長期転帰を予測するために以前に説明されている(非再発死亡率および全生存期間) (Major-Monfried et al., 2018)。ＳＴ２を用いた本発明者らからの予備的な結果は、ベースラインにおけるこれらのマーカーがＦＭＴに対する患者の応答の予測でもあることを示している(示されていないデータ)。
本発明はまた、生きた微生物による彼/彼女の胃腸微生物叢の補完を必要とする対象が前記補完から恩恵を受けることができるかどうかを評価するための方法に関し、以下を含む：
Ａ．対象由来の少なくとも１つの生物学的試料から、コレステロール、インドキシル硫酸、ゾヌリン、シトルリン、プレアルブミン、腫瘍原性抑制因子-２(ＳＴ２)及び再生膵島由来タンパク質３-α(ＲＥＧ３α)からなる群から選択される、１、２、３、４、５、６又は７つの予後マーカーを測定するステップ。これらのマーカーは、図１では「ＣＩＲＣＥマーカー」と呼ばれている。
Ｂ．ステップａで得られた値を基準値と比較するステップであり、
―基準値よりも優れた糞便ゾヌリン濃度；
―基準値よりも優れたシトルリン濃度；
―基準値よりも優れたプレアルブミン濃度；
―基準値よりも優れたコレステロール濃度；及び／又は、
―基準値より劣る3-インドキシル硫酸濃度；
―基準値より劣るST2濃度；及び／又は、
―基準値より劣るREG3α濃度;
が、良好な予後の追加指標である。
以下の実施例７に示すように、本発明者らはまた、ＦＭＴの成功と相関する追加のバイオマーカーとしてIL-6、IL-1β、IFNγ、CCL28、IL-8、IL-2、CCL25及びMCP_1を同定した。特に、ＦＭＴ前のIL-6、IL-1β、IFNγ、CCL28、IL-8及びIL-2のレベルは、前記ＦＭＴの成功と相関している。
本発明はまた、生きた微生物による彼/彼女の胃腸微生物叢の補完を必要とする対象が前記補完から恩恵を受けることができるかどうかを評価するための方法に関し、前記方法は、以下のステップを含む:
ａ．対象由来の少なくとも1つの生体試料から、コレステロール、3-インドキシル硫酸、糞便ゾヌリン、シトルリン、プレアルブミン、腫瘍原性抑制因子-2(ST2)、再生膵島由来タンパク質3-α(REG3α)、IL-6、IL-1β、IFNγ、CCL28およびIL-2の濃度からなる群から選択される、1つまたは複数の予後マーカーを測定するステップ；
ｂ．ステップａで得られた値を基準値と比較するステップであり、
―基準値よりも優れた糞便ゾヌリン濃度；
―基準値よりも優れたシトルリン濃度；
―基準値よりも優れたプレアルブミン濃度；
―基準値よりも優れたコレステロール濃度；
―基準値より劣る3-インドキシル硫酸濃度；
―基準値より劣るST2濃度；
―基準値より劣るREG3α濃度；
―基準値より劣るIL-6濃度；
―基準値より劣るIL-1β濃度；
―基準値より劣るIFNγ濃度；
―基準値よりも優れたCCL28濃度；及び／又は、
―基準値より劣るIL-2濃度；
が、良好な予後の追加指標である、前記ステップ。
ゾヌリンの濃度は、任意の適切なサンプルにおいて測定され得る。本方法の特定の実施形態によれば、糞便ゾヌリン濃度は、直腸スワブ又は糞便試料において測定される。
上記の方法において、シトルリン、プレアルブミン、コレステロール、インドキシル硫酸、ST2、REG3α、IL-6、IL-2、IL-1β、IFNγ、及び／又はCCL28を、患者由来の任意の適切な生体サンプルから測定することができる。適切な生体試料の非限定的な例には、血液、血清及び血漿が含まれる。
当然、当業者は、対象の微生物叢の分析及び特定の宿主パラメータの分析にそれぞれ基づいて、上述の方法を有利に組み合わせて、試験の性能を高めることができる。これらの両方の態様を組み合わせた方法は、当然本発明の一部である。
本発明はまた、臨床患者プロファイル及び／又は上記のような予測試験の結果に基づいて、ＦＭＴが成功する可能性が高い対象においてＧｖＨＤを治療するための、生きた微生物の組成物、好ましくはＦＭＴ産物の使用に関する。
前記予測試験は、少なくともSR-aGVHD患者に対して好適に用いられる。加えて、前記予測試験は、臨床症状、及びＦＭＴ有効性バイオマーカー(血中インドキシル硫酸、並びに以下の実験部分で定義されたButycore Coreマイクロバイオーム及び健康指数)の評価に基づいて、少なくとも１つのＦＭＴをすでに受けており、ＦＭＴ有効性が満足でない、ＳＤ ａＧＶＨＤ、オーバーラップ症候群を伴うａＧＶＨＤ又は慢性ＧＶＨＤ患者に有利に適用することができる。
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、GvHDの症状(特にGI症状)の進行、重症度、再発のリスク及び／又は持続時間の任意の低下又は改善を指す。
本明細書において「ＦＭＴ産物」とは、(i)同種造血幹細胞移植に至った、治療前の患者自身、(ii)健康な個体（１つ又は複数）、(iii)患者の状態を改善するのに効率的である可能性が最も高い微生物叢プロファイルを示す個体（１つ又は複数）由来の糞便サンプルから(直接的または間接的に)得られた任意の糞便微生物組成物、並びに１つ又は複数の微生物株で濃縮された任意の前記糞便微生物組成物を意味する。糞便微生物材料をコンディショニングし、ＦＭＴを実施するいくつかの方法が記載されて、現在開発されており、当業者は、本発明による使用のための糞便微生物組成物を調製するための適切な技術の選択が自由であり、これは、新たに調製された液体、凍結乾燥材料、または任意の他のコンディショニングであり得る。本発明に従って使用することができるＦＭＴ産物の非限定的な例には、例えばWO2016/170285又はWO2019/171012に記載のＦＭＴ産物、または少なくとも２つの細菌種を含む完全もしくは部分的な生態系の微生物培養に基づいた産物が含まれる。それらは、浣腸によって、又はより容易な消費としてカプセルによって投与することができ(例えば、WO2019/097030に記載されるように)、生成物は凍結乾燥され、粉末化されている(例えば、WO2017/103550に記載される)。
特定の実施形態によれば、本発明に記載のＦＭＴによって治療された対象は、ＳＲ－ａＧｖＨＤに罹患している。
別の特定の実施形態によれば、本発明に記載のＦＭＴによって治療された対象は、胃腸の症状を有する。
上記のＦＭＴ予測試験は、ＧＶＨＤ患者のためのより広範な臨床経路に含めることができ、図１において記載され、そのような疾患を治療するためのＦＭＴの可能性に影響する。ＧＶＨＤサブカテゴリーによると、患者はＦＭＴ療法に直接適応される、又はＦＭＴの潜在的な効果がテストされる。これは、「ＦＭＴ性能予測試験」で構築された「層別化」ブロックである。上記の予測検査によって患者がＦＭＴの恩恵を受ける可能性が低いと特定された場合、彼/彼女は、ＦＭＴの前に彼/彼女の微生物叢生態系を用意する目的で、治療に向けられる(例えば、抗バイオセラピー、ＰＥＧ等)。このＧＶＨＤクリニカルパス(図１)も本発明の一部である。
このＧＶＨＤクリニカルパスは、ＦＭＴに対する応答をモニタリングする追加のステップを含むこともできる。実際、以下の実験部分(図４)に示すように、５パーセントポイント以上増加するＦＭＴ産物とのＯＴＵ ＢｒａｙＣｕｒｔｉｓ類似度は、良好なＧＩ反応を有する患者ブロックを定義する。増加するＢｕｔｙｃｏｒｅ又は健康指数(図５)は、モニタリング目的にも使用できる。血中のシトルリン(図９)及びインドキシル-３-硫酸塩(図１０)濃度として測定されたパラメータは、ＦＭＴが発生するとすぐに良好なＧＩ反応を示した患者に対して増加し(訪問２)、ＦＭＴに対する反応をモニターするための２つの代替または追加の手段を表す。
上記の予測試験により、生きた微生物による胃腸微生物叢の補完に応答しない可能性が高いと特定された人の状態は、コンディショニング事前処理によって有意に改善され得る。実際、ＦＭＴに「不適格」と特定された患者をＦＭＴに適格にするために、微生物叢又は宿主の改変を誘導することが可能である。例えば、特定の細菌集団を標的とする非吸収性ＡＢＴによるＦＭＴの前処理、腸内の病原性共生生物の負担を軽減するための浸透圧性下剤の使用、腸の炎症状態を軽減するための免疫抑制剤の使用、又は微生物集団の変化を誘導するためのプレバイオティクスの使用 ― もしくは生態学的改変のニーズに対処するその他の工程が、特定の患者の健康状態に適応され得る。上記のマーカーに基づいて、当業者は、産物の受容性を改善するためにどの生態学的調剤が最適であるかを特定し、その後、応答可能性を高めることができる。この調剤は、好ましくは、少なくともバクテロイデス門またはプロテオバクテリア門に属する細菌を排除して設計される。
ＦＭＴ事前処理の非限定的な例には、以下が含まれる：
― 特定の細菌集団を標的とする、非吸収性抗生物質(例えば、バンコマイシン、ゲンタマイシン、コリマイシン、リファキシミン、メトロニダゾール、ペニシリンＧ及びそれらの混合物)、
― 腸内の病態の負担を軽減するための、浸透圧性下剤の使用、
― 微生物群集の変化を誘導するための、プレバイオティクスの使用、
― 腸の炎症状態を軽減するための、免疫抑制剤の使用、及び
― 生態学的改変のニーズに取り組むための、その他の任意の工程。
特定の実施形態によれば、本発明は、ＦＭＴに応答しない可能性が高いと同定されたＧＶＨＤ患者(胃腸症状の有無にかかわらず)を治療するための、バンコマイシン、リファキシミン、メトロニダゾール、ペニシリンＧ及びそれらの混合物からなる群から選択される、１つ又は複数の非吸収性抗生物質の使用に関する。より詳細には、患者はＳＲ－ａＧｖＨＤに罹患している。本発明のこの態様によれば、抗生物質は、ＦＭＴ(又は生きた微生物による他の治療)の前に投与される。
本発明の別の特定の態様によれば、患者は、特定の細菌集団を標的とする非吸収性抗生物質に加えて、又はそれに代わって、浸透圧性下剤を受領する。浸透圧性下剤及び抗生物質の両方が投与される場合、抗生物質は好ましくは、下剤治療の前に投与される。
既に述べたように、本発明は、上述の診断／予後判定方法を実行するために特別に設計されたプライマー及び核酸マイクロアレイのセットなどの材料にも関する。このような材料を含むコンパニオン診断アッセイのためのキットもまた、本発明の一部である。
本発明のその他の特徴はまた、本発明の枠組みにおいて実施され、その範囲を制限することなく、必要な実験的サポートを提供する生物学的アッセイの以下の説明の過程で明らかになる。
本発明は、ＧＶＨＤ集団におけるＦＭＴの潜在的な恩恵を調査するために設定された２つのプログラムの結果によって裏付けられている。
１）プールされたＦＭＴ生物学的製剤であるMaaT013(WO2019/171012に記載)の有効性を調査する、ＭａａＴファーマが実施した進行中の第２相試験(ＨＥＲＡＣＬＥＳ)。現在、MaaT013生物学的製剤による完全な生態系腸内細菌叢の回復は、胃腸優勢ＳＲ－ａＧＶＨＤの効果的な治療法であり、同種異系ＨＳＣＴ後の重篤な合併症のリスクを減らすことができると期待されている。
２）任意のＧＶＨＤの状況(慢性／急性、ＳＤ／ＳＲ)での治療を可能にする早期アクセスプログラム(ＥＡＰ)。
これらのプログラムは、本明細書に記載の結果を得るために使用される材料および方法と同様に、以下でさらに説明される。
ＨＥＲＡＣＬＥＳ試験
試験集団は、他の臓器が関与する場合、腸優勢のグレードIII又はＩＶ ａＧＶＨＤ(＝胃腸ステージ２～４)の最初のエピソードを発症した患者で構成され、ステロイドによる一次治療に耐性があり、18歳以上である。
本試験の主な目的は、同種異系糞便微生物叢移植(ＦＭＴ)で治療された、ステロイド難治性(ＳＲ)胃腸(ＧＩ)急性移植片対宿主病(ａＧＶＨＤ)患者の完全応答(ＣＲ)及び非常に良好な部分応答(ＶＧＰＲ)によるＤ２８での胃腸反応を評価することである。
本試験で使用されたＦＭＴ産物は、MaaTファーマによって製造されたMaaT013微生物叢生物学的製剤である。本産物は、WO2019/171012に記載されているように入手した。図では「investigational medicinal product」の「ＩＭＰ」と表記している。
図２は、本試験のデザインを示す。
15人の患者コホート
６人の応答者 ＝ Ｒ
８人の非応答者 ＝ ＮＲ
１人の患者がＶ２の前に死亡した(分析では考慮されていない)。
血液と糞便のサンプルは４回の訪問で収集された。
Ｖ１：ＦＭＴの前
Ｖ２：ＦＭＴ１の後
Ｖ３：ＦＭＴ２の後
Ｖ４：ＦＭＴ３の後（Ｄ２８）
ＦＭＴ治療に反応しなかった一部の患者は、計画どおり、３回ではなく１回又は２回のＦＭＴのみ受けた。
訪問１（Ｖ１）便収集により、ベースライン時、つまりＦＭＴ治療を受ける前の患者の微生物叢プロファイリングが可能になった。以下の分析では、患者はＦＭＴの２８日後(Ｄ２８)の胃腸(ＧＩ)反応に従って分離される。
治療応答の評価は、Ｖ４(28日目)に医師が行ったＧＶＨＤグレーディング及びステージングに基づいて、以下の論理に従って自動的に計算された。応答は、ベースライン(Ｖ１)でのＧＶＨＤ評価と比較して計算された。
ＧＩ応答は、以下の場合に達成されたと見なされた。
― 完全応答(ＣＲ):ＧＩ ａＧＶＨＤ症状の完全な解決、つまり、任意のステージから０へのＧＩステージングの改善
― 非常に良好な部分応答(ＶＧＰＲ)：ＧＩ ａＧＶＨＤの重症度の少なくとも２ステージの改善、又はステージ０への改善を除くＧＩステージングの２から１への改善
― 部分応答(ＰＲ)：ステージ０への改善又はＧＩステージングの２から１への改善を除く、ＧＩ ａＧｖＨＤの重症度の１ステージの改善
以下の場合、患者は非応答者と見なされた。
― 安定した疾患(ＳＤ)：ＧＩ ａＧｖＨＤの同じステージの持続
― 進行性疾患(ＰＤ)：少なくとも１ステージのＧＩ ａＧｖＨＤの悪化
― 患者がＤ２８(Ｖ４)の前に追加の全身ＧＶＨＤ療法を受けている場合
― 患者がＤ２８(Ｖ４)より前に死亡した場合
早期アクセスプログラム (ＥＡＰ)
ＥＡＰは、ＦＭＴを伴うＧＶＨＤ患者を治療するための、医師からの高まる需要に応えるために開始された。
すべてのタイプのＧＶＨＤ(急性／慢性／オーバーラップ症候群；ＳＲ又はＳＤ)は、他の全身治療ラインに関連のステロイドによって治療され、医療ニーズに関する医師の判断に基づいてＥＡＰプログラムに含めることができる。
27人の患者がMaaT013で治療された。
― 19人の患者がSR-aGVHDを有していた。
― 8人の患者:
・ SR-cGVHDの患者１名
・ SD-aGVHDの患者４名
・ オーバーラップ症候群のSD-aGVHD患者２名
・ オーバーラップ症候群のSR-aGVHD患者１名
これらすべての患者について利用可能な唯一のデータは、臨床GVHD反応である。
４人の患者について、各FMT治療前及びD28で糞便サンプルを採取した(１人のＳＲ－ｃＧＶＨＤ、２人のＳＤ－ａＧＶＨＤ、１人のオーバーラップ症候群を伴うＳＤ－ａＧＶＨＤ)。
GI応答は、最初のMaaT013投与から28日後に、以下の場合に達成されたと見なされた。
― 完全応答(ＣＲ):ＧＩ ａＧＶＨＤ症状の完全な解決、つまり、任意のステージから０へのＧＩステージングの改善
― 非常に良好な部分応答(ＶＧＰＲ)：ＧＩ ａＧＶＨＤの重症度の少なくとも２ステージの改善、又はステージ０への改善を除くＧＩステージングの２から１への改善
― 部分応答(ＰＲ)：ステージ０への改善又はＧＩステージングの２から１への改善を除く、ＧＩ ａＧｖＨＤの重症度の１ステージの改善
以下の場合、患者は非応答者と見なされた。
― 安定した疾患(ＳＤ)：ＧＩ ａＧｖＨＤの同じステージの持続
― 進行性疾患(ＰＤ)：少なくとも１ステージのＧＩ ａＧｖＨＤの悪化
― 患者がＤ２８(Ｖ４)の前に追加の全身ＧＶＨＤ療法を受けている場合
― 患者がＤ２８(Ｖ４)より前に死亡した場合
材料及び方法
糞便微生物叢の16S rDNAシーケンシング及びバイオインフォマティクス解析
16S rDNAシーケンシングは、Eurofins Genomics(Ebersberg, Germany)によって実施された。ゲノムDNAは、NucleoSpin Soil kit(Machery Nagel)を用いて抽出した。16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を標的とするシーケンシングライブラリを、製造元の指示に従って、MyTaq HS-Mix 2X、Biolineを使用して各サンプルについて構築した。ライブラリを等モル混合物にプールし、Illuminaのpaired-end (2x300 bp) MiSeq V3 runsでシーケンスした。
ＦＬＡＳＨを用いた増幅産物の混合(Magoc et al., 2011)及びTrimmomaticを用いた品質フィルタリング(Bolger et al., 2014)の後、Bowtie2を用いて宿主配列の除染を行った(Langmead, Ben and Salzberg, 2013)。操作上の分類単位(ＯＴＵ)シーケンスクラスタリングは、VSEARCH(Rognes et al., 2016)を使用して97％の同一性しきい値で実行され、分類学的プロファイリングはSilva SSU database Release 128を使用して実行された。公平な比較のために、各シーケンス番号のサンプルは、同じシーケンシング深度、すなわちサンプルあたり60000の増幅産物に無作為に正規化された。分類学的および多様性分析は、R Statistical Software(バージョン3.4.4)で実施した。
宿主パラメータ(血液、糞便)
アルブミン、プレアルブミン、総コレステロールを、それぞれRoche Diagnostics社のCobas Integra 400+ / Kits ALBT2, PREA, CHOL2を用いて血漿で評価した。
インドキシル-3-硫酸塩およびシトルリンは、液体クロマトグラフィー ― 質量分析によって血漿で評価された。
糞便ゾヌリンは、Immundiagnostik AGのELISAキット(ELx800 reader/ IDK zonulin ref K5600)を使用して便の上清で評価された。
実施例1：種々のGVHD患者に対するFMTの有効性(EAPプログラム)
SR-aGVHDの19人の患者の中で：
― 10人の患者がMaaT013に対する非応答者と見なされた
― 9人の患者がMaaT013に対する応答者と見なされた。
SR-aGVHDを除く種々のGVHDを有する8人の患者のうち、全員がMaaT013に対するGVHD反応を達成し(６人が完全応答、２人が非常に良好な部分応答)、これらの患者のMaaT013 FMTへの直接的な方針をサポートする。
実施例２：FMT治療のコロニー形成性能とGI応答との関係(ＨＥＲＡＣＬＥＳ試験)
図３は、IMPとして表される、投与されたFMT産物の組成との患者の微生物叢の類似度を示す。Bray Curtis値が高いほど、産物に類似している。
V1では、FMTがまだ投与されていないため、この類似度は予想どおり低い。また、RとNRとの間の微生物叢の違いも観察される。これは、NR患者の微生物叢の多様性が高く、偶然に産物と共通のOTUを持つ可能性を高めることに関連している可能性がある。
V2、V3(それぞれFMTパス１及びFMTパス２の後)では、前記産物の組成との類似度は、D28で応答者と見なされる患者についてのみ増加する。
最後のFMTの後の、D28を意味するV4では、この差が最も顕著である(t検定、p＜0.05)。
これらのデータは、患者の腸内細菌叢がFMTに等しく反応しないことを示している。それらのいくつか、すなわち応答者は、FMTの後に改変される微生物叢組成物を有し、これらの改変は、投与された産物により近い組成物をもたらす。他のいくつか、主に非応答者は、産物との類似度を高めない。
図４は、V2、V3、V4各訪問とV1訪問との間の、産物との類似度割合の差(図３で説明)を示している。進展値の範囲は、(１)進展が負のグループ、(２)進展が少ないグループ[０に近い、５未満]、(３)差が１０より大きいグループの３つのグループに分けることができる。V4では、すべての応答者がこの３番目のブロックであり、非応答者の１人 (このブロックの最小値) も含まれる。
これらの進展の結果によると、少なくとも５パーセントポイント増加する産物との類似度は、患者の微生物叢に影響を与える産物によるコロニー形成を定義するための良好な候補である。
結論：腸内細菌叢と産物細菌叢との類似度はFMT受容のプロキシであって、FMT受容は、患者の応答に影響する少なくとも１つの要素である。
ＭａａＴ指数
公開データと内部データの組み合わせに基づいて、MaaT pharmaは3つの指数を定義した。
― コアマイクロバイオーム：健康な対象の公開データ及びMaaTデータの中で、コアマイクロバイオームと呼ばれる共通のマイクロバイオームが定義されている。選択された属は、コホートにおける有病率が＞80％、コホートあたりの存在量の中央値が＞0,1％の属である。属のリストは、ルミノコッカス属、フェカリバクテリウム属、ドレア属、コプロコッカス属、ブラウティア属、アリスティペス属、バクテロイデス属、サブドリグラニュラム属、ローズブリア属、パラバクテロイデス属、ラクノスピラ属である。
― 健康指数：健康なマイクロバイオームの指数(良好な健康に関連することが多い細菌科を含む)。この指数は、これらの細菌科(ラクノスピラ科、ルミノコッカス科、クロストリジウム科、プレボテラ科、エリシペロトリクス科)の相対的な存在量を合計することによって構築される。
― Butycore：15の酪酸産生属の合計または相対的な存在量：ブラウティア属、フェカリバクテリウム属、アリスティペス属、ユーバクテリウム属、ビフィドバクテリウム属、ルミノコッカス属、クロストリジウム属、コプロコッカス属、オドリバクター属、ローズブリア属、ホールデマネラ属、アネロスチペス属、オシリバクター属、サブドリグラニュラム属、ブチリビブリオ属。Butycoreは、抗炎症性の潜在的な微生物叢マーカーとして解釈することができる。
図５に示すように、３つのMaaT定義指標は、すべての応答患者において、V1とV4との間で増加している。V1で0に近いButycoreは、すべての応答者についてV4で５％を超えているが、すべての非応答者で５％未満である。この指標は、コロニー形成の性能の質を評価するための別の良い候補である。
実施例３：FMT処理のコロニー形成性能とGI応答との関係(EAPプログラム)
便サンプル(１人のSR-cGVHD、２人のSD-aGVHD、及び１人のオーバーラップ症候群を有するSD-aGVHD ― すべて応答者であった)を有するEAP患者の場合、EAPプログラム中に得られたデータによると、コロニー形成性能メトリクスはSR-aGvHDデータについて概説されたパターンをサポートする。
図６は、患者の微生物叢と、Ｖ１及びＦＭＴ３後での投与されたＩＭＰの組成との類似度を示している。Bray Curtis値が高いほど、前記産物に類似している。これは、ＩＭＰの微生物叢の生着を示している。
図７は、V1およびV3後の患者について、IMPについて測定されたButycoreを示す。ButycoreはV1からV3後までの増加パターンを有し、コロニー形成性能の質及び微生物叢の再構築におけるFMTの効率を示す。
図８は、V1およびV3後の患者について測定された健康指数を示す。健康指数はV1からV3後までの増加パターンを有し、コロニー形成性能の質及び微生物叢の再構築におけるFMTの効率を示す。
結論：これらのデータは、患者の腸内細菌叢がFMTに等しく反応しないことを示す。それらは、FMTの後に改変される微生物叢組成を有し、改変は、すべての応答者であるそれらの患者のために投与された産物に近接する、より多様性の高い組成物をもたらす。
実施例４：宿主パラメータマーカーの証拠(ＨＥＲＡＣＬＥＳ試験)
シトルリン
シトルリンは、小腸腸細胞でのみ産生されるアミノ酸である。
シトルリンは肝臓で代謝されないため、その血清濃度は総機能腸細胞量と強く相関する。また、年齢とも相関する。値は腎機能の影響を受ける可能性がある。シトルリンの正常範囲は30～50 umol/ Lである。
シトルリン血症はGI-aGVHD患者で減少する(Vokurka et al, Med Sci Monit 2013)。
図９に示すように、シトルリンレベルは、MaaT013投与後のR患者において高かった(V2およびV3で有意)。
シトルリンのベースライン値は、予測バイオマーカーでもあり、シトルリン＞20μmol/Lは、患者が治療に反応する可能性が高いことを示す。
インドキシル硫酸
インドキシル硫酸は、L-トリプトファンの代謝産物である。
L-トリプトファン → インドール → インドキシル → インドキシル硫酸(IS)
インドールは、トリプトファナーゼ発現胃腸細菌を介してヒト腸内のL-トリプトファンから産生される。インドキシルは、肝臓での酵素媒介ヒドロキシル化を介してインドールから産生される。続いて、インドキシルは肝臓の硫酸基転移酵素によってインドキシル硫酸に変換される。
尿中３-ISレベルは、ＨＳＣＴ後の転帰を予測し、抗生物質と関連する。HSCT後最初の10日以内の３-ISレベルが低いと、移植関連の死亡率が有意に高く、HSCT後１年間の全体的な生存期間が低くなる。微生物叢の多様性だけでなく、その特定の組成は尿中３-ISを示す。高い尿中３-ISレベルに関連するＯＴＵの大部分は、ラクノスピラ科(Eubacterium rectale)及びルミノコッカス科に属する。低３ISは、バチルス綱のメンバーと関連していた(Weber et al., Blood 2015)。
３ISに関連する要素：リファキシミンを投与されている患者と比較して、シプロフロキサシン／メトロニダゾールを投与されている患者のIS濃度は低い。以前の全身性抗生物質治療も低３ISレベルと関連していた。
３-インドキシル硫酸(３-IS)の尿中排泄量の減少は、腸内細菌叢の破壊と胃腸(GI)移植片対宿主病を発症するリスク増加のマーカーである(Weber et al., 上記)。
３-ISはHERACLES患者の尿(採尿なし)では評価できなかったが、血液検体で検査することにした。血液において利用可能なデータは乏しい。
図１０に示すように、ISレベルは、V2、V3、及びV4のR患者でわずかに高くなっている。ISレベルはMaaT013投与後に増加するようであり、MaaT013の有益な影響を示唆しており、生着の代理マーカーである可能性がある。
糞便ゾヌリン
ヒトゾヌリンは、細胞間密着結合を可逆的に調節することにより、小腸の上皮層における透過性を増加させるタンパク質である。
ゾヌリン放出を引き起こす可能性のあるいくつかの潜在的な腸刺激の中で、細菌及びグルテンの小腸曝露は、これまでに特定された２つのトリガーである。腸内感染症は、腸管バリアの障害を引き起こすことにより、アレルギー、自己免疫、炎症性疾患を含むいくつかの病理学的状態の病因に関与している。腸内細菌で曝露された小腸はゾヌリンを分泌する。この分泌は、試験された微生物の病原性とは無関係であり、細菌に曝露された小腸粘膜の管腔面でのみ発生し、その後、密着結合複合体からのタンパク質閉鎖帯(ＺＯ)-1の離脱と同時に腸透過性が増加する。この傍細胞経路のゾヌリン駆動の開口部は、防御メカニズムを表し得、微生物を流しだし、小腸の細菌コロニー形成に対する宿主の自然免疫応答に寄与する(Fasano、Clin Gastroenterol Hepatol 2012)。
糞便ゾヌリンはクローン病で上昇する。正常範囲は61±46 ng/mlである(Malickova et al, Pract Lab Med 2017)。
図１１に示すように、V2で測定された3/4の応答者は、V1よりもゾヌリンレベルがわずかに高くなっている。コホートレベルでは、糞便ゾヌリンはすべての訪問で非応答者よりも応答者で高くなっている。
プレアルブミン
図１２は、プレアルブミン測定値が非応答者よりも応答者で高く、V2及びV3でより有意であることを示している。
総コレステロール
図１３に示すように、コレステロールは応答者(全訪問)でより高い。全訪問で最も低い値を持つ対象250-012-002は例外である。
実施例５：ＦＭＴ反応を予測する微生物叢マーカーの証拠
図１４及び１６は、一連の微生物叢バイオマーカーを示しており、応答集団(GI D28)を非応答集団から分離することができる。ファーミキューテス門に属する細菌の相対的な存在量は、ファーミキューテス門の相対的な存在量が高い(80％以上)応答者(濃い灰色)と、ＦＭＴが投与されたことがない(Ｖ１)１人を除きファーミキューテスの相対的な存在量が30％未満の非応答者(薄い灰色)との間の層別化メトリックである。放線菌門も、ほとんどの応答者で高くなる傾向がある(非応答者が到達する最高値の７％を除く)。バクテロイデス門(Rで15％未満、NRのほとんどで25％以上)及びプロテオバクテリア門(Rで10％未満、NRのほとんどで25％以上)は反対のパターンを有し:応答者は、より低い値を有している。
また、予後不良門に対する良好な予後の比率：(１) バクテロイデス門に対するファーミキューテス門の比率のlog10変換であるF_over_B_ratio_log、及び(２)(バクテロイデス門+プロテオバクテリア門)に対する(ファーミキューテス門+放線菌門)の比率のlog10変換であるFA_over_BP_ratio_logを評価した。これらの比率の両方について、すべてのRは0より大きい値を持ち、1/8を除くすべてのNRはより低い値を有する(図１４)。
また、高いアルファ多様性指数(ここではＯＴＵレベルのシンプソン指数で表される)は、予後不良のバイオマーカーである可能性がある。すべてのRのシンプソン指数は19％未満であるが、6/8 NRには当てはまらない(図１４)。
図１５は、いくつかのグループ(ここでは応答者と非応答者の２つのグループ)の分離に役立つ重要な特徴を選択し、それらの定量的効果を測定する分析の結果を示す。図１５Ａは、有意な層別化効果を有する予め選択された各分類群のサイズ効果を示す。これらの分類群は、分類学的レベル(Ｐ：門、Ｃ：綱、Ｏ：目、Ｆ：科、Ｇ：属)によってグループ化された図１５Ｂに示される。色付きの分類群は患者の層別化に役立つものであるが、他の示された分類群は層別化に影響を与えない。
ＦＭＴの前の特定の患者に対して、濃い灰色でハイライトされた分類群のより高い相対的な存在量は、患者の応答を予測し、及び薄い灰色でハイライトされた分類群のより高いレベル、又は図１４に示されるように健康指数、もしくはコア微生物叢又は多様性は、無応答を予測する。
図１６及び以下の表１は、本発明を実施する際に使用することができる式の非限定的な例を示す。
Figure 2023521486000001
表１：ＧＩ症状を有するSR-aGvHD患者におけるＦＭＴ性能予測試験を実行するための式及び関連するしきい値(＃Rカットオフ)の例、および16Sシーケンシングによって測定された、引用分類群の存在量。
実施例６：ｑＰＣＲを用いた相対存在量評価
定量的ＰＣＲ(ｑＰＣＲ、又はリアルタイムＰＣＲ)は、例えば以下に記載されるプロトコール及びプライマーを用いて、本発明に記載のＦＭＴ性能予測試験を実施するために有利に使用される。
ａ．ｑＰＣＲ技術の選択
定量的ＰＣＲ(ｑＰＣＲ、又はリアルタイムＰＣＲ)は、少量のテンプレートＤＮＡしか必要とせず、高感度、ハイスループット処理、手頃な価格、及び実験室で頻繁に見られる手頃な価格の機器を必要とするため、いくつかの利点がある(Bacchetti De Gregoris et al., 2011)。
ｂ．プロトコールの例
注釈：本プロトコールは、更新された16S RNA遺伝子配列データベースを用いる新しいプライマー設計に従って進展し得る。
ＤＮＡは、製造元の指示に従って、糞便物質からのＤＮＡの抽出に適した製造キットを使用して抽出される。
ｑＰＣＲは、ＳＹＢＲを含むミックスで重複して実行され、マルチウェル(96ウェルプレートなど)リアルタイムＰＣＲ検出システムで実行される。
細菌分類群の１６Ｓ ｒＲＮＡ領域に特異的なプライマーが使用される。
各分類群を標的とするｑＰＣＲ(すなわち、プライマーの各ペア)は独立して実施されなければならない。
使用できるプライマーの例を以下の表２に記載する。
Figure 2023521486000002
表２：ＦＭＴ性能予測試験を行う際にｑＰＣＲにより列挙された分類群の存在量を測定するために使用できるプライマーの例。ヌクレオチド記号：Ｒ＝Ａ又はＧ；Ｙ＝Ｃ又はＴ；Ｗ＝Ａ又はＴ；及びＳ＝Ｃ又はＧである。
ＰＣＲサイクルのパラメータは、この特定のアッセイ、及び各プライマーペアの効率に合わせて最適化する必要がある。一実施例(Yang et al., 2015)では、これらの値を提供する。
材料：２x FastStart SYBR green mixを用いたＰＣＲシステム配列検出器(Vazyme, Nanjing, China)。ｑＰＣＲ混合物には、染料１を含む２x Fast-Start SYBR green 10μl、フォワードプライマー及びリバースプライマーそれぞれ0.5μl(最終濃度0.4μＭ)、及び９μlのＤＮＡテンプレート(10 ngに平衡化)が含まれていた。
細菌プライマーのアニーリング温度：60 ℃。
変性のサイクル条件：95 ℃で10分間、続いて95 ℃で15秒間及び60 ℃で1分間を40サイクル。
ポジティブ及びネガティブコントロールを使用する必要がある。
ｃ. 細菌分類群の相対的な存在量の値
細菌分類群の相対的な存在量の値は、以下のように総細菌に対して計算できる(Yang et al., 2015)：
Figure 2023521486000003
ここで、Eff.Bact(１～２の間の値)は細菌プライマーの計算された効率(２＝100％及び１＝０％)であり、Eff.Specは分類群特異的プライマー(ファーミキューテス門、バクテロイデス門)の効率を指す。CTbact及びCTspecは、サーモサイクラーによって登録されたCT値である。「X」は、サンプル中に存在する16S分類群特異的(例えばファーミキューテス門)コピー数の割合を表す。
実施例７：ＦＭＴ応答を予測する追加のマーカーの同定
材料と方法
実験は合計24人の患者で主導された。最終的なHERACLESコホートは、以前の実施例では提示されていない９人の追加の患者で構成されている。
Luminexアッセイを使用して、V1、V2、V3及びV4のHERACLES試験に含まれる患者の血漿サンプル中の以下の分子の濃度を測定した。
― CCL25 ― C-Cモチーフケモカインリガンド25
― CCL28 ― C-Cモチーフケモカインリガンド28
― CD14 ― 分化クラスター14
― CD30 ― 分化クラスター30
― IFN_γ ― インターフェロンガンマ
― IL_10 ― インターロイキン10
― IL_17A ― インターロイキン17A
― IL_18 ― インターロイキン18
― IL_1β ― インターロイキン1ベータ
― IL_2 ― インターロイキン2
― IL_2RA ― インターロイキン2受容体アルファ鎖
― IL_6 ― インターロイキン6
― IL_8 ― インターロイキン8
― IP_10 ― インターフェロンガンマ誘導タンパク質10
― MCP_1 ― 単球走化性タンパク質1
― REG3a ― 膵島由来タンパク質3αの再生
― TGFb_1 ― 形質転換増殖因子β1
― TGFb_2 ― 形質転換増殖因子β2
― TGFb_3 ― 形質転換増殖因子β3
― TNFα ― 腫瘍壊死因子
Luminexアッセイは、MAGPIX（登録商標）システム、および以下のLuminexキットを用いて実施した：Merck MilliporeのTGFb1.2.3及びsCD14、並びにIL-1b、IL-2、sIL-2ra、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、IL-18、IFNg、TNFa、MCP1、CCL25、CCL28、sCD30、CXCL10及びRegIIIaのためのBiotechneの16 plex Luminex。
以下のパラメータの濃度は、関連する方法でV1、V2、V3及びV4のHERACLES試験に含まれる患者の血清サンプルで測定された。
― Ｚｏｎｕ ― ELx800 reader / Kit IDK Zonulin ELISA ref. K 5601 / Immundiagnostik AG (Servibio)を有するELISAによる血清ゾヌリン
― ＴＡＳ ― Hitachi 912 / Kit TOTAL ANTIOXIDANT STATUS (TAS) - Ref NX2332 / Randoxを有する酵素法による総抗酸化状態
― ＡＬＡＴ ― Roche diagnosticsのCobas integra 400+ / Kit ALTLでの、37 ℃でピリドキサールリン酸を有するＩＦＣＣ(国際臨床化学連盟)によるＳＧＰＴ
― ＣＨＯＧ ―Roche diagnosticsのCobas Integra 400+ / Kit CHOL2での、酵素比色法による総コレステロール
― ＬＤＨ ―Roche diagnosticsのCobas Integra 400+ / Kit LDHI2での、UV試験による乳酸デヒドロゲナーゼ
― Ｐｒｅａｌｂ ―Roche diagnosticsのCobas Integra 400 § / Kit PREAでの、イムノアッセイによるプレアルブミン
― ＮＭＯ ―フローサイトメトリーによる単球(YUMIZEN H500 OT)
― ＮＰＢＡ ― フローサイトメトリーによる多核好塩基球(YUMIZEN H500 OT)
ＰＮ ― フローサイトメトリーによる多核好中性球(％) (YUMIZEN H500 OT)
以下のパラメータは、関連する方法でV1、V2、V3、及びV4のHERACLES試験に含まれる患者の血漿サンプルで測定された。
― Ｎｅｏｐｔ ― ELx800 reader / Kit Neopterin Elisa Ref RE9321 / IBL international GmbH を有する、ELISAによる血液ネオプテリン
― Ｃｉｔｒｕ ― タンデム質量分析に結合された液体クロマトグラフィーによるシトルリン
― Ｉｎｄｏｘ ― タンデム質量分析に結合された液体クロマトグラフィーによる３-インドキシル硫酸
― ＳＴ２ ― ： ELx800 reader / Kit human ST2/IL-33R immunoassay Quantikine ELISA ref DST200 / R&D Systemsを有するELISAによる造腫瘍性２の抑制
以下のパラメータは、関連する方法でV1、V2、V3及びV4のHERACLES試験に含まれる患者の糞便サンプルで測定された。
・ ガスクロマトグラフィー質量分析による短鎖脂肪酸
― ACETA_s ― AcetateBUTYR_s ― 酪酸
― ISOBUT_s ― イソ酪酸
― PROP_s ― プロピオン酸塩
― VALERA_s ― バレラーテ
・ タンデム質量分析に結合された液体クロマトグラフィーによる胆汁酸
― CA ― コール酸
― CDCA ― ケノデオキシコール酸
― DCA ― デスオキシコール酸
― LCA ― リトコール酸
・ CALturbo ― Cobas Integra 400 § / Kit fCal Turbo Calprotecin Ref B KCAL-REST/ BUHLMANNを有する、免疫比濁法によるカルプロテクチン
・ Zonu_s ― ELx800 reader / IDK Zonulin ELISA ref K5600 / Immunodiagnostik AGを有するELISAアッセイによる便ゾヌリン
・ Neopt_s ― ELx800 reader / Kit Neopterin ELISA Ref RE59321 / IBL International GmbH を有するELISAアッセイによる便ネオプテリン
宿主パラメータの完全なリストを使用して、機械学習アプローチを採用し、これらの特徴から、各時点で患者のR対NRの層別化で最も重み付けされる特徴を抽出した。R対NRの層別化は、上記のように行われた(HERACLES試験)。
機械学習モデリング
トレーニング中に使用されたアルゴリズムは、正則化の強さを決定するために使用される内部交差検証を使用したRidgeロジスティック回帰であった。ロジスティック回帰は、簡単に解釈できるモデルとして選択した：特徴が応答状態と相関する場合は正、反相関の場合は負の、各特徴での重みを返す。
結果
全体的な結果は、図１７において観察され得るAUC（ROC曲線の下の面積）によって表される。
この図は、各時点の信頼区間(薄い灰色のリボン)で囲まれた平均AUC(灰色の線)を示す。各訪問に含まれる患者の数も言及されている。この図による全体的な予測は、特にV1(ベースライン)及びV3(2回目の産物投与後)で、最小信頼区間が、有意と解釈され得る0.5 AUC(点線)を超えない場合に、満たされている。
図１８は、予測結果を最も大きく駆動する測定パラメータを示す。
各時点について、対応するパラメータの値がNR患者で大きい場合はバーが左に向けられ、R患者で値が大きい場合は右に向けられる。
これらの結果は、それらの患者にとって影響力があると以前に指摘されたものに、いくつかのパラメータを追加することができる。V1には、以下が含まれる。
― NR患者の詳細：IL-6、IL-1β、IFN_γ、血中ゾヌリン
― R患者の詳細：CCL28
V2の場合、以下を有する。
― NR患者の詳細：IL-6、IL-8、IL-1β、血中ゾヌリン
― R患者の詳細：CCL25
V3 の場合:
― NR患者の詳細:IL-6、IL-8、IL-2、IL-1ベータ、IFN_gamma
― R患者の詳細:CCL25
V4 の場合:
― NR患者の詳細:IL-6、IL-8、IL-2、IL-1ベータ、MCP_1
― R患者の詳細:CCL25。
したがって、FMT産物を投与する前にFMTの性能を予測するためのマーカーに加えて、これらの結果は、FMTが成功したかどうかを評価するために、FMTの後に以下のマーカーも使用できることを示す。
― インドキシル硫酸濃度の増加
― 特定のしきい値を下回るIL8
―特定のしきい値を超えているCCL25、及び／又は、
―特定のしきい値を下回るMCP_1。
参考文献
Alexander JL et al. Gut microbiota modulation of chemotherapy efficacy and toxicity. Nature Reviews - Gastroenterology and hepatology. 2017.
Bacchetti De Gregoris T et al. Improvement of phylum- and class-specific primers for real-time PCR quantification of bacterial taxa. J. Microbiol. Methods, vol. 86, no 3, p. 351-356, sept. 2011.
Bolger AM et al. Trimmomatic: A Flexible Trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics. 2014.
Clarke, J. et al. Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA sequencing. Nat. Nanotechnol. 2009: 4, 265-270.
Eid, J et al. Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science 2009: 323, 133-138.
Golob JL et al. Stool Microbiota at Neutrophil Recovery Is Predictive for Severe Acute Graft vs Host Disease After Hematopoietic Cell Transplantation. Clinical Infectious Diseases. 2017.
Guo X et al. Development of a real-time PCR method for Firmicutes and Bacteroidetes in faeces and its application to quantify intestinal population of obese and lean pigs. Lett. Appl. Microbiol., vol. 47, no 5, p. 367-373, 2008.
Holler E, et al. Metagenomic analysis of the stool microbiome in patients receiving allogeneic stem cell transplantation: loss of diversity is associated with use of systemic antibiotics and more pronounced in gastrointestinal graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant 2014.
Iida N et al. Commensal Bacteria Control Cancer Response to Therapy by Modulating the Tumor Microenvironment. Science 2013.
Jenq RR et al. Intestinal Blautia Is Associated with Reduced Death from Graft-versus-Host Disease. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 2015.
Kakihana K, et al. Fecal microbiota transplantation for patients with steroid-resistant/dependent acute graft-versus-host disease of the gut. Blood 2016.
Langmead B et al. Fast Gapped-Read Alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 2012.
Ma et al. Gut Microbiota Shapes the Efficiency of Cancer Therapy. Front Microbiol. 2019.
Magoc T et al. FLASH: Fast Length Adjustment of Short Reads to Improve Genome Assemblies. Bioinformatics. 2011.
Major-Monfried H et al. MAGIC biomarkers predict long-term outcomes for steroid-resistant acute GVHD. Blood. 2018 Jun 21;131(25):2846-2855.
Malard Florent, Gasc Cyrielle, Plantamura Emilie, Dore Joel. High gastrointestinal microbial diversity and clinical outcome in graft-versus-host disease patients. Bone Marrow Transplantation 2018.
Malickova et al. Fecal zonulin is elevated in Crohn's disease and in cigarette smokers. Pract Lab Med. 2017 Sep 23;9:39-44.
Peled JU et al. Microbiota as Predictor of Mortality in Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine 2020.
Qi X. et al. Treating Steroid Refractory Intestinal Acute Graft-vs.-Host Disease With Fecal Microbiota Transplantation: A Pilot Study. Front Immunol. 2018.
Rhoads A and Au KF. PacBio Sequencing and Its Applications. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2015 Oct;13(5):278-89.
Rognes T et al. VSEARCH: A Versatile Open Source Tool for Metagenomics. PeerJ. 2016.
Shouval R et al. Repeated Courses of Orally Administered Fecal Microbiota Transplantation for the Treatment of Steroid Resistant and Steroid Dependent Intestinal Acute Graft Vs. Host Disease: A Pilot Study (NCT 03214289). Blood 2018.
Spindelboeck W, et al. Repeated fecal microbiota transplantations attenuate diarrhea and lead to sustained changes in the fecal microbiota in acute, refractory gastrointestinal GVHD. Haematologica.2017.
Taur Y et al. Intestinal Domination and the Risk of Bacteremia in Patients Undergoing Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation”. Clin Infect Dis. 2012.
Taur Y et al. The effects of intestinal tract bacterial diversity on mortality following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation”. Blood 2014.
van Lier et al. Fecal Microbiota Transplantation Can Cure Steroid-Refractory Intestinal Graft-Versus-Host Disease. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 2019
Vokurka et al. Serum citrulline levels as a marker of enterocyte function in patients after allogeneic hematopoietic stem cells transplantation - a pilot study. Med Sci Monit 2013; 19:81-85.
Weber D et al. Low urinary indoxyl sulfate levels early after transplantation reflect a disrupted microbiome and are associated with poor outcome. Blood. 2015.
Yang Y-W et al. Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Mouse Feces, Appl. Environ. Microbiol., vol. 81, no 19, p. 6749-6756, oct. 2015.

Claims (14)

  1. 生きた微生物による胃腸内細菌叢の補完を必要とする対象が、当該補完から恩恵を受けることができるかどうかを評価する方法であって、
    ａ１．前記対象由来の胃腸内生体試料において、良好な予後に関連する細菌の存在量を測定するステップであり、前記細菌が、以下からなる群より選択される少なくとも1つのカテゴリーに属する、前記ステップ；
    ― ファーミキューテス門；
    ― バチルス綱及び放線菌綱；
    ― バチルス目、ラクトバチルス目、及びマイクロコッカス目；
    ― ブドウ球菌科、ラクトバチルス科、及びマイクロコッカス科；並びに、
    ― ブドウ球菌属、ラクトバチルス属、メリソコッカス属、及びアルスロバクター属 ;及び、
    ａ２．ステップａ１で測定された存在量の加重和に対応する、第1の値(＃Ｇ)を決定するステップ；及び／又は、
    ｂ１．前記対象由来の胃腸内生体試料における、予後不良に関連する細菌の存在量を測定するステップであり、前記細菌が、以下からなる群より選択される少なくとも1つのカテゴリーに属する、前記ステップ；
    ― バクテロイデス門、及びプロテオバクテリア門；
    ― バクテロイデス綱；
    ― バクテロイデス目、及びエンテロバクター目
    ― バクテロイデス科、ポルフィロモナス科、アシダミノコッカス科、ラクノスピラ科、ルミノコッカス科、クロストリジウム科、プレボテラ科、及びエリシペロトリクス科；並びに、
    ― バクテロイデス属、エスケリキア属、赤痢菌属、ルミノコッカス属、フェカリバクテリウム属、ドレア属、コプロコッカス属、ブラウティア属、アリスティペス属、サブドリグラニュラム属、ローズブリア属、パラバクテロイデス属、及びラクノスピラ属；及び
    ｂ２．ステップｂ１で測定された存在量の加重和に対応する第２の値（＃Ｂ）を決定するステップ；及び、
    ｃ．ステップａ及び／又はステップｂで得られた結果を使用して、＃Ｒ１＝＃Ｇ、＃Ｒ２＝１：＃Ｂ、及び／又は＃Ｒ３＝＃Ｇ：＃Ｂからなる群から選択される少なくとも1つのスコア（＃Ｒ）を計算するステップ；及び
    ｄ．ステップｃで得られた各スコアと、１つ又は複数の基準値を比較するステップであり、＃Ｒ１、＃Ｒ２、及び／又は＃Ｒ３が基準値よりも優れている場合、対象は生きた微生物との補完から恩恵を受ける可能性が高く、及び＃Ｒ１、＃Ｒ２、及び／又は＃Ｒ３が基準値より劣っている場合、対象は、微生物が対象の腸にうまく生着するために、生きた微生物との補完前に治療を必要とする、前記ステップ；
    を含む、前記方法。
  2. 生きた微生物による前記補完が糞便微生物叢移植（ＦＭＴ）である、請求項1に記載の方法。
  3. 前記対象が、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）に伴う移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に罹患している、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
  4. 前記対象が、同種造血幹細胞移植（ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ）後の急性ステロイド難治性移植片対宿主病（ＳＲ－ａＧｖＨＤ）に罹患している、請求項３に記載の方法。
  5. 前記対象が、胃腸ＧｖＨＤ（ＧＩ ＧｖＨＤ）に罹患している、請求項３又は請求項４に記載の方法。
  6. （ｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門、＃Ｂ＝バクテロイデス門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｉｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、＃Ｂ＝バクテロイデス門、＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｉｉｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門＋放線菌門、＃Ｂ＝バクテロイデス門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｉｖ）＃Ｇ＝放線菌門＋ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、＃Ｂ＝バクテロイデス門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｖ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門、＃Ｂ＝バクテロイデス門＋プロテオバクテリア門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｖｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、＃Ｂ＝バクテロイデス門+プロテオバクテリア門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｖｉｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門＋放線菌門、＃Ｂ＝バクテロイデス門＋プロテオバクテリア門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｖｉｉｉ）＃Ｇ＝放線菌門＋ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、＃Ｂ＝バクテロイデス門＋プロテオバクテリア門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｉｘ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ；及び／又は、
    （ｘ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、及び＃Ｒ＝＃Ｇ；及び／又は、
    （ｘｉ）＃Ｇ＝ファーミキューテス門＋放線菌門、及び＃Ｒ＝＃Ｇ；及び／又は、
    （ｘｉｉ）＃Ｇ＝放線菌門＋ファーミキューテス門（アシダミノコッカス科及びラクノスピラ科を除く）、及び＃Ｒ＝＃Ｇ；及び／又は、
    （ｘｉｉｉ）＃Ｂ=バクテロイデス門、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｘｉｖ）＃Ｂ=バクテロイデス門＋プロテオバクテリア門、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｘｖ）＃Ｇ＝バチルス綱＋任意選択で放線菌綱、＃Ｂ＝バクテロイデス綱＋任意選択でガンマプロテオバクテリア綱＋任意選択でネガヴィクテス綱＋任意選択でクロストリジウム綱、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｘｖｉ）＃Ｇ＝バチルス目＋ラクトバチルス目＋マイクロコッカス目、＃Ｂ＝バクテロイデス目＋エンテロバクター目＋任意選択でセレノモナス目＋任意選択でクロストリジウム目、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｘｖｉｉ）＃Ｇ＝ブドウ球菌科＋ラクトバチルス科＋マイクロコッカス科＋任意選択でエンテロコッカス科、＃Ｂ＝バクテロイデス科＋ポルフィロモナス科＋アシダアミノコッカス科＋ラクノスピラ科＋任意選択で腸内細菌科、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；及び／又は、
    （ｘｖｉｉｉ）＃Ｇ＝ブドウ球菌属＋ラクトバチルス属＋メリソコッカス属＋アルスロバクター属、＃Ｂ＝バクテロイデス属＋エスケリキア属＋赤痢菌属、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；
    （ｘｉｘ）＃Ｇ＝バチルス綱＋マイクロコッカス目、＃Ｂ＝バクテロイデス綱＋エンテロバクター目＋アシダミノコッカス科＋ラクノスピラ科、及び＃Ｒ＝＃Ｇ：＃Ｂ；
    （ｘｘ）＃Ｂ＝ラクノスピラ科＋ルミノコッカス科＋クロストリジウム科、プレボテラ科＋エリシペロトリクス科、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂ；
    （ｘｘｉ）＃Ｂ＝バクテロイデス属＋ルミノコッカス属＋フェカリバクテリウム属＋ドレア属＋コプロコッカス属＋ブラウティア属＋アリスティペス属＋サブドリグラニュラム属＋ローズブリア属＋パラバクテロイデス属＋ラクノスピラ属、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂ。
    である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記胃腸内生体試料が、直腸スワブ又は糞便試料である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 細菌がqPCR、16Sシーケンシング、全メタゲノミクスシーケンシング又はマイクロアレイによって定量される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ＃Ｂ＝ラクノスピラ科＋ルミノコッカス科＋クロストリジウム科、プレボテラ科＋エリシペロトリクス科、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂ＞100は、対象が生きた微生物との補完から恩恵を受ける可能性が高いことを示す、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. ＃Ｂ＝バクテロイデス属＋ルミノコッカス属＋フェカリバクテリウム属＋ドレア属＋コプロコッカス属＋ブラウティア属＋アリスティペス属＋サブドリグラニュラム属＋ローズブリア属＋パラバクテロイデス属＋ラクノスピラ属、及び＃Ｒ＝１：＃Ｂ＞50は、対象が生きた微生物との補完から恩恵を受ける可能性が高いことを示す、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  11. ａ．対象由来の少なくとも1つの生体試料から、コレステロール、インドキシル硫酸、糞便ゾヌリン、シトルリン、プレアルブミン、腫瘍原性抑制因子-2(ST2)、再生膵島由来タンパク質3-α(REG3α)、IL-6、IL-1β、IFNγ、CCL28およびIL-2の濃度からなる群から選択される、1つまたは複数の予後マーカーを測定するステップ；
    ｂ．ステップａで得られた値を基準値と比較するステップであり、
    ―基準値よりも優れた糞便ゾヌリン濃度；
    ―基準値よりも優れたシトルリン濃度；
    ―基準値よりも優れたプレアルブミン濃度；
    ―基準値よりも優れたコレステロール濃度；
    ―基準値より劣るインドキシル硫酸濃度；
    ―基準値より劣るST2濃度；
    ―基準値より劣るREG3α濃度；
    ―基準値より劣るIL-6濃度；
    ―基準値より劣るIL-2濃度；
    ―基準値より劣るIL-1β濃度；
    ―基準値より劣るIFNγ濃度；及び／又は、
    ―基準値よりも優れたCCL28濃度；
    が、良好な予後の追加指標である、前記ステップ：
    をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. ― 糞便ゾヌリン濃度は、直腸スワブまたは糞便サンプルで測定される；及び
    ― その他の予後マーカーは、血液、血漿または血清で測定される、
    請求項１１に記載の方法。
  13. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法による試験により、生きた微生物との補完から恩恵を受ける可能性が高いことを示された対象における、GvHDの治療に使用するためのFMT産物。
  14. 存在量が測定される細菌分類群に特異的なプライマーを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法を実行するためのキット。
JP2022562889A 2020-04-17 2021-04-16 Ｇｖｈｄ患者の治療管理を導き、最適化するためのｆｍｔ性能予測試験 Pending JP2023521486A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20170256.0 2020-04-17
EP20170256.0A EP3895716A1 (en) 2020-04-17 2020-04-17 Fmt performance prediction test to guide and optimize therapeutic management of gvhd patients
PCT/EP2021/059993 WO2021209631A1 (en) 2020-04-17 2021-04-16 Fmt performance prediction test to guide and optimize therapeutic management of gvhd patients

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023521486A true JP2023521486A (ja) 2023-05-24

Family

ID=70480068

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022562889A Pending JP2023521486A (ja) 2020-04-17 2021-04-16 Ｇｖｈｄ患者の治療管理を導き、最適化するためのｆｍｔ性能予測試験

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230243000A1 (ja)
EP (2) EP3895716A1 (ja)
JP (1) JP2023521486A (ja)
KR (1) KR20230011947A (ja)
CN (1) CN115427583A (ja)
AU (1) AU2021255918A1 (ja)
CA (1) CA3174814A1 (ja)
IL (1) IL297358A (ja)
WO (1) WO2021209631A1 (ja)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8470164B2 (en) 2008-06-25 2013-06-25 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
MA41020A (fr) * 2014-11-25 2017-10-03 Evelo Biosciences Inc Compositions probiotiques et prébiotiques, et leurs procédés d'utilisation pour la modulation du microbiome
FR3035328B1 (fr) 2015-04-24 2019-08-23 Maat Pharma Procede de preparation d'un echantillon de microbiote fecal
FR3045383B1 (fr) 2015-12-18 2019-06-14 Maat Pharma Procede de lyophilisation d'un echantillon de microbiote fecal
EP3485879A1 (en) 2017-11-17 2019-05-22 Maat Pharma Pharmaceutical oral formulation comrpsing bacteria
FR3078627B1 (fr) 2018-03-09 2020-11-13 Maat Pharma Procedure de collecte de selles et procede de preparation d'un echantillon pour transplantation de microbiote fecal

Also Published As

Publication number Publication date
CA3174814A1 (en) 2021-10-21
CN115427583A (zh) 2022-12-02
EP4135731A1 (en) 2023-02-22
EP3895716A1 (en) 2021-10-20
IL297358A (en) 2022-12-01
WO2021209631A1 (en) 2021-10-21
AU2021255918A1 (en) 2022-11-24
KR20230011947A (ko) 2023-01-25
US20230243000A1 (en) 2023-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xu et al. The differential immune responses to COVID-19 in peripheral and lung revealed by single-cell RNA sequencing
Yow et al. Characterisation of microbial communities within aggressive prostate cancer tissues
US20150211053A1 (en) Biomarkers for diabetes and usages thereof
JP2022065095A (ja) 敗血症の診断
AU2013353839A1 (en) Molecular diagnostic test for cancer
JP2008538007A (ja) 敗血症の診断
US10544462B2 (en) Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
MXPA05005071A (es) Diagnostico de la sepsis o sirs usando perfiles de biomarcadores.
Han et al. A gut microbiota score predicting acute graft-versus-host disease following myeloablative allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
WO2010076322A1 (en) Prediction of response to taxane/anthracycline-containing chemotherapy in breast cancer
Almousa et al. Elevation of serum pyruvate kinase M2 (PKM2) in IBD and its relationship to IBD indices
JP2016502400A (ja) ＴＮＦα阻害剤に対する応答性を予測する診断法
US20180251844A1 (en) Host dna as a biomarker of crohn's disease
AU2016361499B2 (en) Methods and compositions for identifying and treating subjects at risk for checkpoint blockade therapy associated colitis
Campbell et al. Next-generation sequencing analysis of semen microbiome taxonomy in men with nonobstructive azoospermia vs. fertile controls: A pilot study
JP2023521486A (ja) Ｇｖｈｄ患者の治療管理を導き、最適化するためのｆｍｔ性能予測試験
US10227651B2 (en) Gene expression based biomarker system for irritable bowel syndrome (IBS) diagnosis
WO2020064997A1 (en) Microbiota composition, as a marker of responsiveness to anti-pd1/pd-l1/pd-l2 antibodies in renal cell cancer
RU2771080C2 (ru) Способ определения ответа пациента с диагнозом меланома кожи на анти-PD1-терапию
Peña Cearra Deciphering the impact of the mitochondrial negative regulator MCJ on host-microbiota interactions in experimental ulcerative colitis
Genga et al. How Have Genomics Informed Our Understanding of Critical Illness?
WO2021100875A1 (ja) 関節リウマチの発症に関与する細菌の検出方法、該細菌の検出用試薬、関節リウマチの素因の有無を判定する方法及び該素因の有無を判定するための剤
US10233501B2 (en) Biomarkers predictive of predisposition to depression and response to treatment
Konigsberg Altered Epigenetic Regulation of Immune and Repair Processes in Interstitial Lung Disease
JP2024501133A (ja) 感染因子を識別するための方法

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240415