KR20230011947A - Gvhd 환자의 치료적 관리를 가이드하고 최적화하기 위한 fmt 성능 예측 시험 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 대상체의 미생물총 및/또는 숙주 파라미터를 분석함으로써, 살아 있는 미생물로의 보완을 필요로 하는 GVHD 대상체가 상기 보완으로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부를 평가하는 방법에 관한 것이다. 불량한 미생물요법 반응자로서 확인된 환자의 상태를 개선시키기 위한 치료, 뿐만 아니라 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 물질 및 키트가 또한 제공된다.
Description
본 발명은 GVHD 관리의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 GVHD에서의 장 미생물총의 역할에 관한 것이고, 환자가 이 미생물총, 예컨대 분변 미생물총 이식물 (FMT)을 조정하는 것을 목표로 하는 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있는지, 또는 FMT에 성공적으로 반응하는 환자의 기회를 증가시키기 위해 또 다른 치료가 FMT 전에 필요한지 결정하는 방법을 제공한다.
GVHD
이식편 대 숙주 질환 (GVHD)은 동종이형 조혈 줄기 세포 이식 (알로-HSCT)의 주요 합병증이며, 숙주 세포 상의 단백질, 구체적으로 인간 백혈구 항원 (HLA)에 대한 공여자 면역 T-세포의 면역학적으로 매개된 염증 반응으로 이루어진다. 알로-HSCT는 악성 질환으로부터 유전적 빈혈까지 다양한 다수의 혈액학적 장애에서 치료 의도를 위해 요구된다.
부조직적합성 항원의 미스매치, 또는 다른 이유가 공여자의 면역계가 수용자를 공격하는 것을 촉발시켜 고유한 염증성 질환을 유발하는 경우 거부가 발생한다. GVHD는 자가 HSCT (동일한 환자로부터 유래된 세포) 후에는 발생하지 않는다.
GVHD는 증상의 시기에 따라 2가지 주요 형태를 갖는다:
- 급성 GVHD (aGVHD): HSCT 후 100일 내에 발생하는 임상-병리학적 증후군 (중위 발병은 전형적으로 이식 후 21 내지 25일임); 대부분 3개의 기관과 관련됨: 피부 (GVHD를 갖는 환자의 >80%), 위장 (GI) 관 (50-55%) 및 간 (50%). 어느 하나의 기관 또는 이들 기관의 조합이 영향을 받을 수 있다.
- 만성 GVHD (cGVHD)는 섬유성 피부 질환, 세기관지염, 타액선 및 누선 질환, 및 호산성 근막염과 함께 나타나며, 전형적으로 HSCT 후 100일 초과에, 종종 급성 GVHD 후에 발생한다.
GVHD의 현재의 치료
GVHD의 관리는 과제가 되고 있다. 코르티코스테로이드로의 면역-억제는 급성 및 만성 GVHD 둘 다에서 제1-라인 요법의 기초를 형성하는데, 이는 초기 질환 중증도에 따라, aGVHD를 갖는 환자의 50% 미만 및 cGVHD를 갖는 환자의 40-50%에서 지속된 반응을 생성한다.
스테로이드에 잘 반응하지 않는 환자 (스테로이드-불응성 SR)에 대해 또는 스테로이드가 테이퍼링될 수 없는 환자 (스테로이드-의존성 SD)에서, 예후는 매우 불량하다.
최근의 연구는 1주의 전신 치료 후 종양형성의 억제제-2 (ST2) 및 재생-소도-유래 단백질 3-α (REG3α)의 수준을 포함하는 스테로이드-저항성 GVHD에서 장기 결과를 예측하는 바이오마커를 기재하였다 (Major-Monfried et al., 2018).
환자의 미생물총의 중요성
알로-HSCT를 겪는 환자는 세포독성 화학요법, 전신 조사, 면역억제제, 및 광범위-스펙트럼 항생제에 노출될 수 있다. 이들 치료는 장 미생물총의 극적인 변경 및 장 점막에 대한 다양한 정도의 손상을 유발하여, 숙주 방어에서 결함을 초래한다.
알로-HSCT의 과정에 걸쳐, 환자는 전체 미생물 다양성 및 풍부성의 감소, 숙주 방어를 지지하는 유익한 박테리아 (예를 들어, 피르미쿠테스(Firmicutes))의 파괴, 및 후속 박테리아혈증 및 감염성 합병증 (Taur et al., 2012)과 연관되는 일부 병원체 및 유해균 (예를 들어, 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 일부 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae)) 및 다중약물-저항성 (MDR) 박테리아 (Malard et al., 2018)를 포함하는 통상적으로 준우세적인 박테리아 종의 우세의 증가에 의해 표시되는 미생물 군집의 현저한 이동을 나타낸다.
종양학에서 현재의 치료의 표준은 그의 기준선 상태를 포함하는 미생물총 관리를 고려하지 않는다. 그러나, 몇몇 최근의 연구는 장 미생물총이 이종대사, 면역 상호작용, 및 변경된 군집 구조를 포함하는 다수의 메커니즘을 통해 화학요법 효능 및 독성에 연루됨을 보고한다. 기능적 마이크로바이옴 없이, 이들 치료는 차선일 수 있다 (Iida et al., 2013; Alexander et al., 2017; Ma et al., 2019).
알로-HSCT 환자에서, 장 미생물총의 다양성은 알로-HSCT 후의 전체 생존에서 (Malard et al., 2018), 및 GVHD 환자 결과에서 (Taur et al., 2014, Peled et al., 2020) 핵심적 역할을 한다. 사실, 미생물총 다양성의 소실은 보다 현저한 위장 GVHD와 연관되는 것으로 관찰되었다 (Holler et al., 2014). 몇몇 연구는 파괴된 미생물총 (예를 들어 다양성의 소실, 단일 분류군에 의한 우세)이 GVHD-관련 사망으로서 불량한 환자 결과와 관련됨을 보고하였으며, 미생물총 및 그의 숙주 사이의 상호작용, 및 장 미생물총의 완전성을 복원하는 기회의 중요성을 주장하였다 (Malard et al., 2018; Taur et al., 2012; Taur et al., 2014; Peled et al., 2020; Holler et al., 2014; Golob et al., 2017; Jenq et al., 2015).
알로-HSCT 환자에서 장 미생물총을 복원하기 위한 FMT
따라서, 치료의 표준 의료품에 추가로, 알로-HSCT 환자에서 치료-관련 합병증을 억제하거나 감소시키기 위해 장 미생물총을 조작하는 전략이 최근 제안되었다. 몇몇 사례 연구는 위장 aGVHD의 치료에서 분변 미생물총 전달 (FMT, 일명 분변 미생물요법, 장 미생물총 항상성을 복원하는 것을 목표로 하는 상부 또는 하부 위장 경로를 통한 건강한 공여자로부터의 처리된 대변의 투여로 정의됨)의 사용의 유망한 결과를 보고하였다 (Kakihana et al., 2016; Spindelboeck et al., 2017; Qi et al., 2018 ; van Lier et al., 2019; Shouval et al., 2018).
그러나, 환자의 이 불량한 예후 집단에서 지금까지 보고된 소수의 사례를 고려하면, 환자가 이러한 FMT로부터 실제적으로 이익을 얻을 것 및 이익을 얻을 수 있을 것을 확인하는 것은 곤란하다.
표적화된 집단의 정의의 부재 하에서, 환자는 FMT를 얻을 수 있지만, 그의/그녀의 임상적 상태는 임상적 반응의 달성을 허용하지 않을 것이거나, 또는 그의/그녀의 미생물 장은 분변 이식물 생성물로부터 이익을 얻도록 준비되지 않는다.
GVHD 환자 집단은 효과적인 치료가 적시에 매우 빠르게 취해지지 않는 경우 매우 취약하며 높은 사망률을 갖는다. 따라서, FMT 치료로부터 이익을 얻도록 준비되지 않은 환자를 치료하는 것은 중요한 질병 및 생명을 위협하는 응급사태의 맥락 내에서, 치료될 시간 및 기회의 상실을 초래할 수 있다.
본 발명은 GVHD 환자의 치료적 관리를 가이드하고 최적화하기 위한 FMT 성능 예측 시험에 대한 충족되지 않은 필요를 성취시키는 것을 목표로 한다.
발명의 요약
본 발명은 살아 있는 박테리아로의 그의/그녀의 위장 미생물총의 보완 (예를 들어, FMT)을 필요로 하는 대상체가 상기 보완으로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부, 즉, 투여된 살아 있는 박테리아가 생착하고, 따라서 대상체의 위장 미생물총의 조성의 유의한 변화를 초래할 수 있을 것인지 여부를 평가하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 이러한 보완을 성공적으로 받을 수 있는 환자를 이 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 별로 없고 이들 박테리아가 그들의 장에서 생착할 가능성을 개선시키기 위해 살아 있는 박테리아를 받기 전에 컨디셔닝 치료를 필요로 하는 환자로부터 구별함으로써, GVHD 환자의 치료적 관리를 최적화하기 위해 특히 유리하다.
본 방법은
a. 상기 대상체로부터의 위장 생물학적 샘플에서, 양호한 예후와 연관된 박테리아의 풍부도를 측정하는 단계이며, 여기서 상기 박테리아는
- 피르미쿠테스 문;
- 바실루스(Bacillus) 및 악티노박테리아(Actinobacteria) 강;
- 바실랄레스(Bacillales), 락토바실랄레스(Lactobacillales) 및 미크로코칼레스(Micrococcales) 목;
- 스타필로코카세아에(Staphylococcaceae), 락토바실라세아에(Lactobacillaceae), 및 미크로코카세아에(Micrococcaceae) 과; 및
- 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 멜리소코쿠스(Melissococcus) 및 아르트로박터(Arthrobacter) 속
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 카테고리에 속하는 것인 단계; 및/또는
b. 상기 대상체로부터의 위장 생물학적 샘플에서, 불량한 예후와 연관된 박테리아의 풍부도를 측정하는 단계이며, 여기서 상기 박테리아는
- 박테로이데테스(Bacteroidetes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문;
- 박테로이디아(Bacteroidia) 강;
- 박테로이달레스(Bacteroidales) 및 엔테로박테리알레스(Enterobacteriales) 목;
- 박테로이다세아에(Bacteroidaceae), 포르피로모나다세아에(Porphyromonadaceae), 악시드아미노코카세아에(Acidaminococcaceae), 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae), 루미노코카세아에(Ruminococcaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 프레보텔라세아에(Prevotellaceae) 및 에리시펠로트리카세아에(Erysipelotrichaceae) 과; 및
- 박테로이데스(Bacteroides), 에스케리키아(Escherichia), 시겔라(Shigella), 루미노코쿠스(Ruminococcus), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 도레아(Dorea), 코프로코쿠스(Coprococcus), 블라우티아(Blautia), 알리스티페스(Alistipes), 서브돌리그라눌룸(Subdoligranulum), 로세부리아(Roseburia), 파라박테로이데스(Parabacteroides) 및 라크노스피라(Lachnospira) 속
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 카테고리에 속하는 것인 단계; 및
c. 단계 a에서 및/또는 단계 b에서 얻어진 결과 및 계산 식을 사용하여, 대상체의 미생물총이 상기 보완에 의해 유의하게 개선될 가능성을 반영하는 적어도 하나의 점수 (#R)를 계산하는 단계; 및
d. 단계 c에서 얻어진 각각의 점수를 하나 또는 여러 참조 값과 비교하고, 대상체가 살아 있는 박테리아로의 그의/그녀의 위장 미생물총의 보완을 성공적으로 받을 수 있는지 여부 또는 대상체가 상기 보완 전에 준비 치료를 필요로 하는지 여부를 추론하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 숙주 파라미터는 FMT 또는 살아 있는 박테리아로의 다른 보완 치료의 성공 또는 실패를 예측하기 위해 상기 미생물총 파라미터와 조합될 수 있다.
본 발명은 또한 시험이 양성인 대상체에서 GvHD를 치료하기 위한 FMT 생성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 환자가 FMT 또는 살아 있는 박테리아로의 또 다른 보완 치료로부터 이익을 얻을 수 있도록 환자를 준비시키기 위한, 컨디셔닝 치료, 예컨대 불리한 박테리아를 표적화하는 비-흡수성 항생제 및/또는 삼투 완하제 치료의 용도이다.
본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 물질 및 키트가 또한 제공된다.
도 1: 본 발명에 따른 임상적 경로
도 2: 헤라클레스(HERACLES) 연구 디자인
도 3: 헤라클레스 연구, SR-aGvHD 환자, 브레이쿠티스(BrayCurtis) 유사성 vs IMP, OTU 수준
도 4: 헤라클레스 연구, SR-aGvHD 환자, V1에 비해 생성물과의 유사성의 진화
도 5: 헤라클레스 연구, SR-aGvHD 환자, MaaT 인덱스. 상부 패널: 부티코어(Butycore); 중간 패널: 코어 미생물총; 하부 패널: 건강 MaaT 인덱스.
도 6: EAP 환자, 브레이쿠티스 유사성 vs IMP, OTU 수준
도 7: EAP 환자, 부티코어 MaaT 인덱스
도 8: EAP 환자, 건강 MaaT 인덱스
도 9: 혈액 시트룰린
도 10: 인독실술페이트
도 11: 분변 조눌린
도 12: 프리-알부민 (혈액)
도 13: 총 콜레스테롤
도 14: 기준선에서의 위장 반응의 미생물총 바이오마커
도 15: 판별 분석 결과. A: 유의한 계층화 효과를 갖는 각각의 미리 선택된 분류군에 대한 효과 크기. B: 분류학적 수준 (P: 문, C: 강, O: 목, F: 과, G: 속)에 의해 그룹핑된 분류군. 예후적 특징에 대한 유의한 효과를 갖지 않는 분류군은 백색으로 나타낸다.
도 16: 역치와 함께, 기준선에서의 위장 반응의 추가의 미생물총 바이오마커 (16S 시퀀싱에 의해 측정된 풍부도).
도 17: 전체 예측적 분석 결과. 내부 교차-확인 평균 AUC를 갖는 리지(Ridge) 로지스틱 회귀는 각각의 시점에 대한 신뢰 구간 (밝은 회색 리본)에 의해 둘러싸인 회색 선으로서 예시된다. 각각의 방문에서 포함된 환자의 수가 또한 언급된다.
도 18: 주요 마커 예측적 결과. 각각의 마커 (열)는 적어도 하나의 시점에 대한 예측적 모델에서 중요한 유도인자 (가중치로서 정량화됨)로서 간주된다. 막대는 신뢰 구간을 갖는 마커 상응 가중치를 나타낸다. 음의 가중치 (좌측으로 지향된 막대)는 비-반응자에 대한 보다 중요한 측정 값을 나타내고, 양의 가중치 (우측으로 지향된 막대)는 반응자에 대한 보다 중요한 측정 값을 나타낸다.
도 2: 헤라클레스(HERACLES) 연구 디자인
도 3: 헤라클레스 연구, SR-aGvHD 환자, 브레이쿠티스(BrayCurtis) 유사성 vs IMP, OTU 수준
도 4: 헤라클레스 연구, SR-aGvHD 환자, V1에 비해 생성물과의 유사성의 진화
도 5: 헤라클레스 연구, SR-aGvHD 환자, MaaT 인덱스. 상부 패널: 부티코어(Butycore); 중간 패널: 코어 미생물총; 하부 패널: 건강 MaaT 인덱스.
도 6: EAP 환자, 브레이쿠티스 유사성 vs IMP, OTU 수준
도 7: EAP 환자, 부티코어 MaaT 인덱스
도 8: EAP 환자, 건강 MaaT 인덱스
도 9: 혈액 시트룰린
도 10: 인독실술페이트
도 11: 분변 조눌린
도 12: 프리-알부민 (혈액)
도 13: 총 콜레스테롤
도 14: 기준선에서의 위장 반응의 미생물총 바이오마커
도 15: 판별 분석 결과. A: 유의한 계층화 효과를 갖는 각각의 미리 선택된 분류군에 대한 효과 크기. B: 분류학적 수준 (P: 문, C: 강, O: 목, F: 과, G: 속)에 의해 그룹핑된 분류군. 예후적 특징에 대한 유의한 효과를 갖지 않는 분류군은 백색으로 나타낸다.
도 16: 역치와 함께, 기준선에서의 위장 반응의 추가의 미생물총 바이오마커 (16S 시퀀싱에 의해 측정된 풍부도).
도 17: 전체 예측적 분석 결과. 내부 교차-확인 평균 AUC를 갖는 리지(Ridge) 로지스틱 회귀는 각각의 시점에 대한 신뢰 구간 (밝은 회색 리본)에 의해 둘러싸인 회색 선으로서 예시된다. 각각의 방문에서 포함된 환자의 수가 또한 언급된다.
도 18: 주요 마커 예측적 결과. 각각의 마커 (열)는 적어도 하나의 시점에 대한 예측적 모델에서 중요한 유도인자 (가중치로서 정량화됨)로서 간주된다. 막대는 신뢰 구간을 갖는 마커 상응 가중치를 나타낸다. 음의 가중치 (좌측으로 지향된 막대)는 비-반응자에 대한 보다 중요한 측정 값을 나타내고, 양의 가중치 (우측으로 지향된 막대)는 반응자에 대한 보다 중요한 측정 값을 나타낸다.
본 발명은 특히 GVHD의 임상적 맥락에, 특히 스테로이드-불응성 GVHD (SR-aGvHD)의 맥락에 관련된다. 이는 FMT 치료의 최적화이다. 임상의는 하기를 알고 있다:
- 한편으로, 환자를 불량하게 콜로니화할 FMT로 환자를 치료하는 것이 원하는 만큼 효율적이지 않을 가능성이 있다. 이는 이 환자 집단에 대해 특히 중요한 시간이 걸리고, 비용이 들 수 있지만, 치료 이익의 가능성은 낮다. 사실, 일부 환자는 FMT가 그들의 미생물총을 효율적으로 조정하고 임상적 이익을 가질 가능성을 증가시키기 위해, FMT를 받기 전에 추가의 치료를 필요로 할 수 있다.
- 다른 한편으로, 모든 환자에게 이러한 "준비 치료"를 제공하는 것은 이러한 치료를 필요로 하지 않는 환자를 치료하는 것을 초래할 것이다. 이는 잘해야 시간의 소실을 초래할 것이고, 최악의 경우 이들 환자가 반응할 가능성을 감소시킬 것이다.
따라서, 본 발명은 그에 반응하는 그들의 기회를 증가시키기 위해 FMT 전에 치료를 필요로 하는 환자를, 임의의 이러한 준비 치료를 필요로 하지 않고 높은 성공의 기회로 FMT를 직접적으로 받을 수 있는 환자로부터 구별하기 위한 FMT 성능 예측 시험을 제공하는 것을 목표로 한다.
이 맥락에서, GVHD 집단에서 FMT의 잠재적 이익을 조사하기 위해 2가지 프로그램이 본 출원인에 의해 설정되었다. 이어지는 실험 부분에 기재된 이들 프로그램의 결과는 FMT에 적격인 환자를 확인하는 계층화 도구를 초래하였다.
따라서, 본 발명은 살아 있는 미생물로의 그의/그녀의 위장 미생물총의 보완을 필요로 하는 대상체가 상기 보완으로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부를 평가하는 방법으로서,
a. 상기 대상체로부터의 위장 생물학적 샘플에서, 양호한 예후와 연관된 박테리아의 풍부도를 측정하는 단계이며, 여기서 상기 박테리아는
- 피르미쿠테스 문;
- 바실루스 및 악티노박테리아 강;
- 바실랄레스, 락토바실랄레스 및 미크로코칼레스 목;
- 스타필로코카세아에, 락토바실라세아에, 및 미크로코카세아에 과; 및
- 스타필로코쿠스, 락토바실루스, 멜리소코쿠스 및 아르트로박터 속
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 카테고리에 속하는 것인 단계; 및/또는
b. 상기 대상체로부터의 위장 생물학적 샘플에서, 불량한 예후와 연관된 박테리아의 풍부도를 측정하는 단계이며, 여기서 상기 박테리아는
- 박테로이데테스 및 프로테오박테리아 문;
- 박테로이디아 강;
- 박테로이달레스 및 엔테로박테리알레스 목;
- 박테로이다세아에, 포르피로모나다세아에, 악시드아미노코카세아에, 라크노스피라세아에, 루미노코카세아에, 클로스트리디아세아에, 프레보텔라세아에 및 에리시펠로트리카세아에 과; 및
- 박테로이데스, 에스케리키아, 시겔라, 루미노코쿠스, 파에칼리박테리움, 도레아, 코프로코쿠스, 블라우티아, 알리스티페스, 서브돌리그라눌룸, 로세부리아, 파라박테로이데스 및 라크노스피라 속
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 카테고리에 속하는 것인 단계; 및
c. 단계 a에서 및/또는 단계 b에서 얻어진 결과 및 계산 식을 사용하여, 대상체의 미생물총이 상기 보완에 의해 유의하게 개선될 가능성을 반영하는 적어도 하나의 점수 (#R)를 계산하는 단계; 및
d. 단계 c에서 얻어진 각각의 점수를 하나 또는 여러 참조 값과 비교하고, 대상체가 살아 있는 미생물로의 그의/그녀의 위장 미생물총의 보완을 성공적으로 받을 수 있는지 여부 또는 대상체가 상기 보완 전에 준비 치료를 필요로 하는지 여부를 추론하는 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본원에 사용된 용어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(include)"는 조성물 및 방법이 다른 요소를 배제하지 않으면서, 나열된 요소로부터 선택되는 요소를 포함함을 의미하는 것으로 의도된다.
단수 형태는 맥락이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수 언급대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "계산 식"에 대한 언급은 복수의 계산 식을 포함한다.
본 명세서에서, 살아 있는 미생물로의 위장 미생물총의 보완 (예를 들어, FMT)은, 그것이 이 보완을 받은 대상체의 미생물총 조성물의 유의한 변화를 발생시키는 경우, "성공적인" 것으로 간주된다. 하기 실험 부분에서 설명되는 바와 같이, 보완의 성공은 다양한 인덱스, 예컨대 투여되는 미생물 조성물 (예를 들어, FMT 생성물)과의 OTU 브레이쿠티스 유사성, 부티코어, 코어 마이크로바이옴 및 건강 인덱스 (실험 부분에서 정의됨), 뿐만 아니라 파라미터, 예컨대 혈액 시트룰린 및 혈액 인독실-3-술페이트 농도를 사용하여 평가될 수 있다. 특히, 살아 있는 미생물로의 위장 미생물총의 보완은, 대상체의 위장 미생물총 및 이러한 보완을 위해 투여된 생성물 사이의 OTU 브레이쿠티스 유사성이 (대상체의 위장 미생물총 및 생성물의 제1 투여 전에 관찰된 생성물 사이의 유사성에 비해) 1, 2, 또는 3회의 투여 후 수 일 (예를 들어, 5 내지 12일)에 적어도 5% 증가하는 경우, 성공적인 것으로 간주할 수 있다.
상기 방법에서, 보완 치료 (즉, 그의/그녀의 위장 미생물총을 보완하기 위한 살아 있는 미생물을 포함하는 생성물)를 "성공적으로 받을 수 있는" 대상체는 따라서 보완이 성공적일 가능성이 있을, 즉, 보완 조성물의 투여 전에 임의의 준비 또는 컨디셔닝 치료를 필요로 하지 않으면서, 그의/그녀의 위장 미생물총 조성의 유의한 변화를 발생시킬 사람이다.
마찬가지로, 보완 치료"로부터 이익을 얻을 수 있는" 또는 보완 치료"로부터 이익을 얻을 가능성이 있는" 대상체는 보완이 성공적일 가능성이 있을, 즉, 보완 조성물의 투여 전에 임의의 준비 또는 컨디셔닝 치료를 필요로 하지 않으면서, 그의/그녀의 위장 미생물총 조성의 유의한 변화를 발생시킬 사람이다.
바라건대, 성공적인 보완은 이러한 보완을 필요로 하는 대상체의 임상적 반응을 초래할 것이다. 그러나, 이는 단지 보완 생성물이 대상체의 상태를 개선시키도록 적당하게 선택된 경우이다. 그렇지 않다면, 보완은 대상체의 건강에 대한 효과 없이, 또는 보다 나쁜 경우, 유해한 효과를 갖고, 그와 같이 성공적일 수 있다 (즉, 투여된 미생물이 대상체의 장에서 생착함). 따라서, 본 명세서에서, "보완의 성공"은 이 치료에 대한 임상적 반응과 동의어가 아니다.
본원에 사용된 용어 "양호한 예후"는 보완이 투여된 살아 있는 박테리아의 적어도 일부의 생착을 발생시킬 예후를 의미하는 반면, "불량한 예후"는 보완이 미생물총 조성의 유의한 변화를 발생시키지 않을 예후를 의미한다.
청구된 방법을 수행하는 경우, 통상의 기술자는 임의의 적절한 참조물을 사용하여, 측정된 풍부도를 정규화할 수 있다. 적절한 참조물의 비-제한적 예는 박테리아의 총 수, 박테리아 박테리아 + 고균의 총 수, 및 특히 단계 c에서의 계산이 "양호한 예후" 및 "불량한 예후" 박테리아의 수준 사이의 비인 경우, 임의의 내부 참조물을 포함한다.
상기 방법의 특정 실시양태에 따르면, 하기 값이 결정된다:
- 제1 값 (#G)은 단계 a에서 결정되고/거나,
- 제2 값 (#B)은 단계 b에서 결정되고,
- 단계 c에서, #R1=#G, #R2=1:#B 및/또는 #R3=#G:#B, 그에 따라 참조 값(들) 초과의 #R1, #R2 및/또는 #R3은 양호한 예후를 나타내고, 참조 값(들) 하위의 #R1, #R2 및/또는 #R3은 불량한 예후를 나타낸다.
상기 실시양태에서, #G는 양호한 예후와 연관된 박테리아에 대해 선택된 분류군의 측정된 풍부도로 계산된다. 예를 들어, 이는 이들 분류군의 상대 풍부도의 합일 수 있다. 물론, 이 합은 예후에 있어서 각각의 분류군의 중요성을 반영하는 가중합일 수 있다. 예를 들어, 통상의 기술자는 보다 큰 가중치를, 많은 양으로 존재하지만 예후에 있어서 불량하게 관련된 분류군에 기인한 가중치보다는 통상적으로 매우 작은 양으로 존재하지만 예후에 대해 높게 관련된 분류군에 기인한다고 여길 수 있다.
동일한 추론이 #B의 계산에도 적용된다.
통상의 기술자는 또한 단계 c에서, 지시된 비보다 더 복잡한 식을 사용할 수 있다. 유일한 조건은 참조 값(들)이 그에 따라 적응된다는 것이다. 물론, 무효 또는 무한의 결과를 초래하는 계산 식은 불가능하게 될 것이다.
본원에 사용된 "살아 있는 미생물로의 대상체의 위장 미생물총의 보완"은 대상체의 미생물총을 개선시키는 것을 목표로 하는 살아 있는 미생물을 포함하는 임의의 조성물의 투여를 지칭한다. 이러한 조성물은 예를 들어, 하나 또는 여러 공여자로부터의 분변 물질로부터 기원한 하나의 단일 균주의 순수한 배양물, 몇몇 배양된 균주의 믹스 및/또는 미생물의 복잡한 군집을 포함할 수 있다. 분변 미생물총 이식 (FMT)은 본 발명에 따른 살아 있는 미생물로의 보완의 예이다.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 방법은 살아 있는 미생물로의, 예를 들어 분변 미생물총 이식물 (FMT)을 통해 그의/그녀의 위장 미생물총의 보완을 필요로 하는 대상체가 상기 이식물로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부를 평가하기 위해 수행된다.
또 다른 특정 실시양태에 따르면, 대상체는 동종이형 조혈 줄기 세포 이식 (알로-HSCT) 후 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)을 앓고 있다.
상기 방법은 동종이형 조혈 줄기 세포 이식 (알로-HSCT) 후 급성, 스테로이드-불응성 이식편 대 숙주 질환 (SR-aGvHD)을 앓고 있는 대상체가 살아 있는 미생물로의 보완 (예컨대 FMT)으로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부를 평가하는데, 및/또는 대상체가 위장 영향을 갖는 GvHD를 앓고 있는 상황에서 특히 유용하다.
상기 방법을 수행하는 경우, 통상의 기술자는 양호한 또는 불량한 예후와 연관된 바와 같은 상기 나타낸 상이한 분류군 중에서 분류군의 임의의 조합을 자유롭게 선택한다. 동일한 또는 상이한 분류학적 수준의 분류군은 조합될 수 있다. 통상의 기술자는 또한 이미 언급된 바와 같이 이들 분류군을 추가의 것들과 조합할 수 있고, 통상의 기술자는 임의의 관련된 식을 사용하여 각각 양호한 및 불량한 예후와 연관된 #G 및/또는 #B 값을 계산할 수 있다. 본 발명을 수행하기 위한 식의 비-제한적 예는 하기 나타낸다 (주의: 하기 나타낸 합은 나타낸 분류군의 가중합으로 이해되어야 한다 - 통상의 기술자는 결과의 예측적 값을 최적화하기 위해 각각의 분류군의 가중치를 정의할 수 있다):
(i) #G= 피르미쿠테스, #B= 박테로이데테스 및 #R=#G:#B; 및/또는
(ii) #G= 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스 문, #B= 박테로이데테스 및 #R=#G:#B; 및/또는
(iii) #G= 피르미쿠테스 + 악티노박테리아, #B= 박테로이데테스 및 #R=#G:#B; 및/또는
(iv) #G= 악티노박테리아 + 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스, #B= 박테로이데테스 및 #R=#G:#B; 및/또는
(v) #G= 피르미쿠테스, #B= 박테로이데테스 + 프로테오박테리아 및 #R=#G:#B; 및/또는
(vi) #G= 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스 문, #B= 박테로이데테스 + 프로테오박테리아 및 #R=#G:#B; 및/또는
(vii) #G= 피르미쿠테스 + 악티노박테리아, #B= 박테로이데테스 + 프로테오박테리아 및 #R=#G:#B; 및/또는
(viii) #G= 악티노박테리아 + 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스, #B= 박테로이데테스 + 프로테오박테리아 및 #R=#G:#B; 및/또는
(ix) #G= 피르미쿠테스 및 #R=#G; 및/또는
(x) #G= 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스 문, 및 #R=#G; 및/또는
(xi) #G= 피르미쿠테스 + 악티노박테리아 및 #R=#G; 및/또는
(xii) #G= 악티노박테리아 + 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스 및 #R=#G; 및/또는
(xiii) #B= 박테로이데테스 및 #R=1:#B; 및/또는
(xiv) #B= 박테로이데테스 + 프로테오박테리아 및 #R=1:#B; 및/또는
(xv) #G= 바실루스 + 임의로 악티노박테리아, #B= 박테로이디아 + 임의로 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria) + 임의로 네가비쿠테스(Negavicutes) + 임의로 클로스트리디아(Clostridia) 및 #R=#G:#B; 및/또는
(xvi) #G= 바실랄레스 + 락토바실랄레스 + 미크로코칼레스, #B= 박테로이달레스 + 엔테로박테리알레스 + 임의로 셀레노모나달레스(Selenomonadales) + 임의로 클로스트리디알레스(Clostridiales) 및 #R=#G:#B; 및/또는
(xvii) #G= 스타필로코카세아에 + 락토바실라세아에 + 미크로코카세아에 + 임의로 엔테로코카세아에(Enterococcaceae), #B= 박테로이다세아에 + 포르피로모나다세아에 + 악시드아미노코카세아에 + 라크노스피라세아에 + 임의로 엔테로박테리아세아에 및 #R=#G:#B; 및/또는
(xviii) #G= 스타필로코쿠스 + 락토바실루스 + 멜리소코쿠스 + 아르트로박터, #B= 박테로이데스 + 에스케리키아 + 시겔라 및 #R=#G:#B.
(xix) #G= 바실루스 + 미크로코칼레스, #B= 박테로이디아 + 엔테로박테리알레스 + 악시드아미노코카세아에 + 라크노스피라세아에 및 #R=#G:#B.
(xx) #B= 라크노스피라세아에 + 루미노코카세아에 + 클로스트리디아세아에, 프레보텔라세아에 + 에리시펠로트리카세아에 및 #R=1:#B.
(xxi) #B= 박테로이데스 + 루미노코쿠스 + 파에칼리박테리움 + 도레아 + 코프로코쿠스 + 블라우티아 + 알리스티페스 + 서브돌리그라눌룸 + 로세부리아 + 파라박테로이데스 + 라크노스피라 및 #R=1:#B.
본 발명의 방법을 수행하기 위해, 통상의 기술자는 박테리아를 정량화하는 임의의 적절한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법의 비-제한적 예는 정량적 PCR (qPCR), 16S 시퀀싱, 전체 메타게노믹스 시퀀싱, 마이크로어레이, 면역-검출 (예를 들어 ELISA 시험), 대사체학 (예를 들어 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피 또는 탠덤 질량 분광법과 결합된 기체 크로마토그래피) 뿐만 아니라 배양 및/또는 유동 세포계측법 방법을 포함한다.
본 발명의 특정 실시양태에 따르면, 관련된 분류군의 풍부도는 정량적 PCR에 의해 측정된다. PCR 기술은 널리 공지되어 있으며 용이하게 이용가능하고, 정확한 기재를 필요로 하지 않는다. PCR-기반 기술은 측정되는 표적에 대해 특이적이도록 디자인된 증폭 프라이머로 수행된다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 방법을 수행하는데 적합한 프라이머의 세트, 즉, 상기 방법의 단계 a 및/또는 b에서 검출되는 미생물 분류군의 각각에 대해 특이적인 서열을 증폭시키기 위한 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머의 세트에 관한 것이다. 이러한 프라이머의 세트는 최소 4개의 프라이머를 포함하지만, 이는 보다 많은 프라이머, 예를 들어 6, 8, 10, 16, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 200, 300, 500, 1000개 또는 그 초과의 프라이머를 포함할 수 있다. 샘플, 예컨대 직장 스왑 또는 대변 샘플로부터 박테리아 DNA를 추출하기 위한 이러한 프라이머의 세트 및 시약을 포함하는 부품의 키트는 또한 본 발명의 일부이다.
또 다른 특정 실시양태에서, 선택된 종의 상대 풍부도는 단계 a 및/또는 b에서 핵산 마이크로어레이의 사용에 의해 평가된다. "핵산 마이크로어레이"는 마이크로칩, 유리 슬라이드 또는 미소구-크기 비드일 수 있는 고체 지지체에 부착된 상이한 핵산 프로브로 이루어진다. 프로브는 핵산, 예컨대 cDNA ("cDNA 마이크로어레이") 또는 올리고뉴클레오티드 ("올리고뉴클레오티드 마이크로어레이")일 수 있고, 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 25 내지 약 60개 이하의 염기 쌍일 수 있다. 샘플에서 표적 핵산의 카피 수를 결정하기 위해, 이 샘플은 표지되고, 혼성화 조건에서 마이크로어레이와 접촉되고, 그에 따라 마이크로어레이 표면에 부착된 프로브 서열 및 그에 상보적인 표적 핵산 사이에 복합체가 형성된다. 이어서 표지된 혼성화된 복합체의 존재가 검출된다. 마이크로어레이 혼성화 기술의 많은 변형은 통상의 기술자에게 이용가능하다.
따라서, 본 발명에 따른 방법을 수행하도록 디자인된 핵산 마이크로어레이는 또한 본 발명의 일부이다. 이러한 핵산 마이크로어레이는 상기 방법의 단계 a 및/또는 b에서 검출되는 박테리아 분류군의 각각에 대해 특이적인 핵산 프로브를 포함한다. 본 발명에 따른 마이크로어레이는 적어도 하나의 대조군 박테리아 종 및/또는 임의의 스파이크-인 대조군 서열의 적어도 하나의 유전자를 검출하기 위한 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 50개의 염기이다. 적합한 마이크로어레이 올리고뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 마이크로어레이 올리고뉴클레오티드 디자인의 임의의 방법을 사용하여, 관련된 분류군에 대해 특이적인 게놈 서열에 기반하여 디자인될 수 있다. 특히, 마이크로어레이 올리고뉴클레오티드의 디자인을 위해 개발된 임의의 이용가능한 소프트웨어, 예컨대, 예를 들어, 올리고어레이(OligoArray) 소프트웨어, 고어레이스(GoArrays) 소프트웨어, 어레이 디자이너(Array Designer) 소프트웨어, 프라이머3(Primer3) 소프트웨어, mopo16s 소프트웨어 또는 프로미드(Promide) 소프트웨어가 사용될 수 있으며, 이들 모두는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
추가의 실시양태에 따르면, 대상체로부터 얻어진 샘플에서 관련된 분류군의 풍부도를 측정하는 것은 시퀀싱을 사용하여 수행된다. 임의로, DNA는 시퀀싱 전에 예를 들어 제한 뉴클레아제 또는 기계적 단편화에 의해 단편화된다. 시퀀싱은 라이게이션에 의한 시퀀싱, 피로시퀀싱, 합성에 의한 시퀀싱, 단일-분자 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱을 포함하는 관련 기술분야의 상태에서 공지된 임의의 기술을 사용하여 수행된다. 시퀀싱은 또한 PCR-기반 기술, 예컨대 예를 들어 에멀젼 PCR을 포함한다. 다수의 플랫폼은 차세대 시퀀싱 (NGS, 또한 "대량 평행 DNA 시퀀싱" 또는 "고 처리량 DNA 시퀀싱"으로 지칭됨), 예컨대 일루미나(Illumina) 게놈 애널라이저(Genome Analyzer) 플랫폼, 로슈(Roche) 454 플랫폼, ABI SOLiD 플랫폼, 헬리코스(Helicos) 단일 분자 시퀀싱 플랫폼, 단일 폴리머라제 분자를 사용한 실시간 시퀀싱 (Eid et al., 2009), 이온 토렌트(Ion Torrent) 시퀀싱 (WO 2010/008480), 파크바이오(PacBio) 시퀀싱 (Rhoads et al., 2015) 및 옥스포드(Oxford) 나노포어(Nanopore) 시퀀싱 (Clarke et al., 2009) (그러나 이에 제한되지는 않음)을 수행하기 위해 이용가능하다.
또 다른 실시양태에 따르면, 대상체로부터 얻어진 샘플에서의 관련된 분류군의 풍부도는 선택적 배지 상의 박테리아 배양을 통해 측정된다. 예를 들어, 분변 샘플을 희석하고, 이어서 혐기성 조건 하에서 피르미쿠테스에 대해 선택적인 배지를 갖는 페트리(Petri) 디쉬 상에서, 및 박테로이데테스에 대해 선택적인 배지를 갖는 또 다른 페트리 디쉬 상에서 배양하고; 박테리아를 성장시키고, 이어서 콜로니를 카운팅하여 2개의 문의 상대 양을 평가한다.
대상체로부터 얻어진 샘플에서의 관련된 분류군의 풍부도는 또한 유동 세포계측법에 의해 측정될 수 있다: 예를 들어, 샘플로부터의 피르미쿠테스는 형광단으로 표지될 수 있고, 박테로이데테스는 또 다른 형광단으로 표지될 수 있다. 이어서 피르미쿠테스 및 박테로이데테스에 속하는 세포의 수를 세포계측기를 사용하여 평가하여 방출된 형광을 측정한다.
본 발명의 프레임에서 "참조 값"으로서 사용될 수 있는 값의 예는 하기 실험 부분 (실시예 5 및 도 16)에 개시되어 있다. 이들 값은 16S 시퀀싱을 통해 측정된 박테리아 풍부도를 갖는 특이적 코호트로부터 얻어졌다. 참조 값의 다른 예는 하기와 같다:
- 상기 식 (xx), 즉, #B= 라크노스피라세아에 + 루미노코카세아에 + 클로스트리디아세아에 + 프레보텔라세아에 + 에리시펠로트리카세아에 및 #R=1:#B를 사용하여, 참조 값은 약 100이며, 이는 #R>100이 대상체가 FMT로부터 이익을 얻을 가능성이 있음을 나타냄을 의미한다.
- 상기 식 (xxi), 즉, #B= 박테로이데스 + 루미노코쿠스 + 파에칼리박테리움 + 도레아 + 코프로코쿠스 + 블라우티아 + 알리스티페스 + 서브돌리그라눌룸 + 로세부리아 + 파라박테로이데스 + 라크노스피라 및 #R=1:#B를 사용하여, 참조 값은 약 50이며, 이는 #R>50이 대상체가 FMT로부터 이익을 얻을 가능성이 있음을 나타냄을 의미한다.
물론, 통상의 기술자는 미생물의 상대 풍부도를 측정하는데 사용되는 기술 (예를 들어, 정량적 PCR, 마이크로어레이 상의 혼성화 또는 시퀀싱), 환자의 특이적 상태, 투여되는 살아 있는 미생물로의 GI 미생물총 보완 (예를 들어, FMT)의 성질, 사용되는 샘플의 성질, 환자의 음식 습관 및 다른 가능한 인자에 따라, 이들 역치를 조정하거나 개량할 수 있다. 보다 일반적으로, 상기 방법을 수행하는 경우 고려되어야 할 참조 값은 주어진 조건을 갖는, 및 GI 미생물총 보완에 의한 주어진 치료에 대한 그의 반응이 공지된 개체의 대표적인 코호트에서의 나열된 박테리아 분류군의 상대 풍부도를 측정함으로써 미리 결정된다. 통상의 기술자는 또한 시험의 민감성 및/또는 특이성에 바람직하도록 참조 값(들)을 조정할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에 따르면, 단계 a 및/또는 b에서 사용되는 생물학적 샘플은 직장 스왑 또는 대변 샘플이다.
본 발명의 또 다른 측면은 살아 있는 미생물로의 그의/그녀의 위장 미생물총의 보완을 필요로 하는 대상체가 상기 보완으로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부를 평가하기 위한 특정 숙주 파라미터 (즉, 미생물총 조성과 별개의 파라미터)의 예후적 값에 관한 것이다. 이 측면은 분변 조눌린의 농도 및 시트룰린, 프리알부민, 콜레스테롤 및 인독실술페이트의 혈액 농도의 예후적 관련성을 나타내는, 하기 실시예 4에 개시된 결과에 의해 지지된다. 2개의 바이오마커, 즉, 종양형성의 억제제-2 (ST2) 및 재생-소도-유래 단백질 3-α (REG3α), 일명 MAGIC 바이오마커는 스테로이드-저항성 GVHD에서의 장기 결과 (비 재발성 사망 및 전체 생존)를 예측하는 것으로 이전에 기재되었다 (Major-Monfried et al., 2018). ST2로의 본 발명자들로부터의 예비 결과는 기준선에서의 이들 마커가 또한 FMT에 대한 환자의 반응의 예측제임을 제시한다 (데이터는 제시되지 않음).
따라서, 본 발명은 또한 살아 있는 미생물로의 그의/그녀의 위장 미생물총의 보완을 필요로 하는 대상체가 상기 보완으로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부를 평가하는 방법으로서,
A. 대상체로부터의 적어도 하나의 생물학적 샘플로부터, 콜레스테롤, 인독실술페이트, 조눌린, 시트룰린, 프리알부민, 종양형성의 억제제-2 (ST2) 및 재생-소도-유래 단백질 3-α (REG3α) (이들 마커는 도 1에서 "CIRCE 마커"로 지칭됨)의 농도로 이루어진 군으로부터 선택되는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 예후적 마커를 측정하는 단계;
B. 단계 a에서 얻어진 값을 참조 값과 비교하는 단계이며, 여기서
- 참조 값보다 상위의 분변 조눌린 농도;
- 참조 값보다 상위의 시트룰린 농도;
- 참조 값보다 상위의 프리알부민 농도;
- 참조 값보다 상위의 콜레스테롤 농도; 및/또는
- 참조 값보다 하위의 3-인독실술페이트 농도;
- 참조 값보다 하위의 ST2 농도; 및/또는
- 참조 값보다 하위의 REG3α 농도;
는 양호한 예후의 지표인 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
하기 실시예 7에 제시된 바와 같이, 본 발명자들은 또한 FMT의 성공과 상관된 추가의 바이오마커로서 IL-6, IL-1β, IFNγ, CCL28, IL-8, IL-2, CCL25 및 MCP_1을 확인하였다. 특히, FMT 전의 IL-6, IL-1β, IFNγ, CCL28 및 IL-2의 수준은 상기 FMT의 성공과 상관된다.
따라서, 본 발명은 또한 살아 있는 미생물로의 그의/그녀의 위장 미생물총의 보완을 필요로 하는 대상체가 상기 보완으로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부를 평가하는 방법으로서,
A. 대상체로부터의 적어도 하나의 생물학적 샘플로부터, 콜레스테롤, 3-인독실술페이트, 분변 조눌린, 시트룰린, 프리알부민, 종양형성의 억제제-2 (ST2), 재생-소도-유래 단백질 3-α (REG3α), IL-6, IL-1β, IFNγ, CCL28 및 IL-2의 농도로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 여러 예후적 마커를 측정하는 단계;
B. 단계 a에서 얻어진 값을 참조 값과 비교하는 단계이며, 여기서
- 참조 값보다 상위의 분변 조눌린 농도;
- 참조 값보다 상위의 시트룰린 농도;
- 참조 값보다 상위의 프리알부민 농도;
- 참조 값보다 상위의 콜레스테롤 농도;
- 참조 값보다 하위의 3-인독실술페이트 농도;
- 참조 값보다 하위의 ST2 농도;
- 참조 값보다 하위의 REG3α 농도;
- 참조 값보다 하위의 IL-6 농도;
- 참조 값보다 하위의 IL-1β 농도;
- 참조 값보다 하위의 IFNγ 농도;
- 참조 값보다 상위의 CCL28 농도; 및/또는
- 참조 값보다 하위의 IL-2 농도
는 양호한 예후의 지표인 단계
를 포함하는 방법에 관한 것이다.
조눌린의 농도는 임의의 적절한 샘플에서 측정될 수 있다. 본 방법의 특정 실시양태에 따르면, 분변 조눌린 농도는 직장 스왑 또는 대변 샘플에서 측정된다.
상기 방법에서, 시트룰린, 프리알부민, 콜레스테롤, 인독실술페이트, ST2, REG3α, IL-6, IL-2, IL-1β, IFNγ 및/또는 CCL28은 환자로부터의 임의의 적절한 생물학적 샘플로부터 측정될 수 있다. 적합한 생물학적 샘플의 비-제한적 예는 혈액, 혈청 및 혈장을 포함한다.
물론, 통상의 기술자는 유리하게는 시험의 성능을 증가시키기 위해, 대상체의 미생물총의 분석 및 특정 숙주 파라미터의 분석에 각각 기반하여, 상기 기재된 방법을 조합할 수 있다. 이들 측면 둘 다를 조합하는 방법은 물론 본 발명의 일부이다.
본 발명은 또한 임상적 환자 프로파일 및/또는 상기 기재된 바와 같은 예측 시험의 결과에 기반하여, FMT가 성공할 가능성이 있는 대상체에서 GvHD를 치료하기 위한, 살아 있는 미생물의 조성물, 바람직하게는 FMT 생성물의 용도에 관한 것이다.
예측 시험은 바람직하게는 적어도 SR-aGVHD 환자에 대해 사용된다. 또한, 이는 유리하게는 이미 적어도 하나의 FMT를 받았고, 임상적 증상 및 FMT 효능 바이오마커 (혈액 인독실 술페이트, 뿐만 아니라 하기 실험 부분에서 정의된 부티코어 코어 마이크로바이옴 및 건강 인덱스)의 평가에 기반하여 FMT 효능이 만족스럽지 않은 SD aGVHD, 중첩 증후군을 갖는 aGVHD 또는 만성 GVHD 환자에서 적용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 GvHD의 증상 (특히 GI 증상)의 진행, 중증도, 재발의 위험 및/또는 지속기간의 임의의 감소 또는 개선을 지칭한다.
"FMT 생성물"이란 본원에서 (i) 동종이형 조혈 줄기 세포 이식을 초래한 치료 전에 환자 자신, (ii) 건강한 개체(들), (iii) 환자의 상태를 개선시키는데 효율적일 가능성이 많은 미생물총 프로파일, 뿐만 아니라 하나 또는 여러 미생물 균주로 풍부화된 임의의 이러한 분변 미생물 조성물을 나타내는 개체(들)로부터의 대변 샘플로부터 (직접적으로 또는 간접적으로) 얻어진 임의의 분변 미생물 조성물을 의미한다. 분변 미생물 물질을 컨디셔닝하고 FMT를 수행하는 몇몇 방식은 기재되었으며, 현재 개발되어 있고, 통상의 기술자는 신선하게 제조된 액체, 동결-건조된 물질 또는 임의의 다른 컨디셔닝일 수 있는 본 발명에 따라 사용하기 위한 분변 미생물 조성물을 제조하기 위한 적절한 기술을 자유롭게 선택한다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 FMT 생성물의 비-제한적 예는 예를 들어 WO2016/170285 또는 WO2019/171012에 기재된 FMT 생성물, 또는 적어도 2개의 박테리아 종을 함유하는 전체 또는 부분적 생태계의 미생물 배양에 기반한 생성물을 포함한다. 이들은 관장제에 의해 또는 보다 용이한 소비를 위한 캡슐에 의해 (예를 들어 WO2019/097030에 기재된 바와 같음) 투여될 수 있으며, 여기서 생성물은 동결-건조되고 분말화되었다 (예를 들어 WO2017/103550에 기재된 바와 같음).
특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 FMT에 의해 치료되는 대상체는 SR-aGvHD를 앓고 있다.
또 다른 특정 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 FMT에 의해 치료되는 대상체는 위장 증상을 갖는다.
상기 기재된 FMT 예측 시험은 이러한 질환을 치료하는 FMT의 잠재성에 영향을 미치는, 도 1에 기재된 GVHD 환자에 대한 보다 폭넓은 임상적 경로에 포함될 수 있다. GVHD 서브카테고리에 따르면, 환자는 FMT 요법으로 직접적으로 지향되거나, 또는 FMT의 잠재적 효과가 시험된다. 이는 "FMT 성능 예측 시험"으로 수립된 "계층화" 블록이다. 환자가 상기 기재된 예측적 시험에 의해 FMT로부터 이익을 얻을 가능성이 적은 것으로 확인되는 경우, 그/그녀는 FMT 전에 그의/그녀의 미생물총 생태계를 준비할 목적으로 치료 (예를 들어, 항생물요법, PEG, …)로 지향될 것이다. 이 GVHD 임상적 경로 (도 1)는 또한 본 발명의 일부이다.
이 GVHD 임상적 경로는 또한 FMT에 대한 반응을 모니터링하는 추가의 단계를 포함할 수 있다. 사실, 하기 실험 부분 (도 4)에 제시된 바와 같이, 5 퍼센트 포인트 초과 증가하는 FMT 생성물과의 OTU 브레이쿠티스 유사성은 양호한 GI 반응을 갖는 환자의 블록을 정의한다. 증가하는 부티코어 또는 건강 인덱스 (도 5)는 또한 모니터링 목적을 위해 사용될 수 있다. FMT가 발생하자 마자 (방문 2) 양호한 GI 반응을 갖는 환자에 대해 증가하는 시트룰린 (도 9) 및 인독실-3-술페이트 (도 10) 농도로서 혈액에서 측정된 파라미터는 FMT에 대한 반응을 모니터링하는 2가지 대안적인 또는 추가의 수단을 나타낸다.
상기 기재된 예측적 시험에 의해 살아 있는 미생물로의 그들의 위장 미생물총의 보완에 반응하지 않을 가능성이 있는 것으로 확인된 사람의 상태는 컨디셔닝 사전-치료에 의해 유의하게 개선될 수 있다. 사실, 그들을 FMT에 대해 적격으로 만들기 위해 FMT에 대해 "적격이 아닌" 것으로 확인된 환자에서의 미생물총 또는 숙주 변형을 유도하는 것이 가능하다. 예를 들어, 특이적 박테리아 집단을 표적화하는 비-흡수성 ABT로의 FMT 사전-치료, 장에서의 유해균의 부담을 감소시키는 삼투 완하제의 사용, 장의 염증 상태를 감소시키는 면역억제제의 사용, 또는 미생물 군집에서 이동을 유도하는 프리바이오틱스의 사용 - 또는 생태학적 변형 필요를 다루는 임의의 다른 과정은 특정 환자 상태에 적응될 수 있다. 상기 기재된 마커에 기반하여, 통상의 기술자는 어느 생태학적 준비가 생성물 허용가능성을 개선시키기 위해 가장 좋을 것인지 확인하고, 이어서 반응 가능성을 증가시킬 수 있다. 이 준비는 바람직하게는 박테로이데테스 또는 프로테오박테리아 문에 속하는 박테리아를 적어도 제거하도록 디자인된다.
FMT 사전-치료의 비-제한적 예는 하기를 포함한다:
- 특이적 박테리아 집단을 표적화하는 비-흡수성 항생제 (예를 들어, 반코마이신, 겐타미신, 콜리마이신, 리팍시민, 메트로니다졸, 페니실린 G 및 이들의 혼합물),
- 장에서의 유해균의 부담을 감소시키는 삼투 완하제의 사용
- 미생물 군집에서 이동을 유도하는 프리바이오틱스의 사용
- 장의 염증 상태를 감소시키는 면역억제제의 사용, 및
- 생태학적 변형 필요를 다루는 임의의 다른 과정.
특정 실시양태에 따르면, 본 발명은 FMT에 반응하지 않을 가능성이 있는 것으로 확인된 GVHD 환자 (위장 증상을 갖는 또는 갖지 않는)를 치료하기 위한, 반코마이신, 리팍시민, 메트로니다졸, 페니실린 G 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 여러 비-흡수성 항생제(들)의 용도에 관한 것이다. 보다 특히, 환자는 SR-aGvHD를 앓고 있다. 본 발명의 이 측면에 따르면, 항생제는 FMT (또는 살아 있는 미생물로의 다른 치료) 전에 투여된다.
본 발명의 또 다른 특정 측면에 따르면, 환자는 특이적 박테리아 집단을 표적화하는 비-흡수성 항생제에 추가로 또는 그에 대체하여 삼투 완하제를 받는다. 삼투 완하제 및 항생제 둘 다가 투여되는 경우, 항생제는 바람직하게는 완하제 치료 전에 투여된다.
이미 언급된 바와 같이, 본 발명은 또한 상기 기재된 진단/예측 방법을 수행하도록 특이적으로 디자인된 물질, 예컨대 프라이머의 세트 및 핵산 마이크로어레이에 관한 것이다. 따라서, 이러한 물질을 포함하는 동반 진단 검정을 위한 키트는 또한 본 발명의 일부이다.
본 발명의 다른 특징은 또한 본 발명의 체제에서 수행된 생물학적 검정을 따르고, 그의 범위를 제한하지 않으면서 그에 필요한 실험적 지지를 제공하는 설명의 과정에서 명백해질 것이다.
실시예
본 발명은 GVHD 집단에서 FMT의 잠재적 이익을 조사하기 위해 설정된 2가지 프로그램의 결과에 의해 지지된다:
1) 풀링된 FMT 생물치료제, MaaT013 (WO2019/171012에 기재됨)의 효능을 조사하는 MaaT 파마(MaaT Pharma)에 의해 수행된 진행중인 2상 연구 (헤라클레스). 본 발명자들은 이제 MaaT013 생물치료제로의 전체 생태계 장 미생물총 복원이 위장 우세 SR-aGVHD의 유효한 치료일 수 있고, 그에 의해 동종이형 HSCT 후의 생명을 위협하는 합병증의 위험을 감소시킬 수 있다고 예상한다.
2) 임의의 GVHD 상황 (만성/ 급성, SD/SR)의 치료를 허용하는 초기 접근 프로그램(Early Access Program) (EAP).
이들 프로그램, 뿐만 아니라 본원에 기재된 결과를 얻는데 사용된 물질 및 방법이 하기에 추가로 기재된다.
헤라클레스 연구
연구의 집단은 18세 초과의 스테로이드로의 제1 라인 요법에 대해 저항성인, 다른 기관이 관여되는 경우 장 우세를 갖는 등급 III 또는 IV aGVHD (= 위장 단계 2 내지 4)의 제1 에피소드를 발달시킨 환자로 이루어진다.
이 연구의 1차 목적은 동종이형 분변 미생물총 전달 (FMT)로 치료된 스테로이드 불응성 (SR) 위-장 (GI) 급성 이식편-대-숙주 질환 (aGVHD) 환자의 완전 반응 (CR) 및 매우 양호한 부분 반응 (VGPR)을 통한 D28에서의 위장 반응을 평가하는 것이다.
이 연구 동안 사용된 FMT 생성물은 MaaT 파마에 의해 제조된 MaaT013 미생물총 생물치료제이다. 이 생성물은 WO2019/171012에 기재된 바와 같이 얻었다. 이는 도면에서 "임상시험용 의학적 생성물"에 대해 "IMP"로 지칭된다.
도 2는 연구의 디자인을 제시한다.
15명의 환자의 코호트
6명의 반응자 = R
8명의 비-반응자 = NR
1명의 환자는 V2 전에 사망하였다 (분석에서 고려되지 않음)
혈액 및 분변 샘플을 4개의 방문에서 수집하였다.
V1: FMT 전
V2: FMT 1 후
V3: FMT 2 후
V4: FMT 3 후 (D28)
FMT 치료에 반응하는데 실패한 일부 환자는 계획된 바와 같은 3개 대신 단지 1 또는 2개의 FMT를 받았다.
방문 1 (V1) 대변 수집은 기준선에서, 즉, FMT 치료를 받기 전의 환자의 미생물총 프로파일링을 허용하였다. 하기 분석에서, 환자는 FMT 후 28일 (D28)에 그들의 위-장 (GI) 반응에 따라 분리된다.
치료 반응의 평가는 V4 (제28일)에서 의사에 의해 수행된 GVHD 등급화 및 단계화에 기반하여, 하기 로직에 따라 자동적으로 계산되었다. 반응을 기준선 (V1)에서의 GVHD 평가에 비해 계산하였다.
GI 반응은 하기 사례에서 달성된 것으로 간주되었다:
- 완전 반응 (CR): GI aGVHD 징후의 완전한 해결, 즉, 임의의 단계로부터 0으로의 GI 단계화의 개선
- 매우 양호한 부분 반응 (VGPR): GI aGVHD의 중증도에 있어서 적어도 2개의 단계의 개선, 또는 2로부터 1로의 GI 단계화의 개선, 단계 0으로의 개선은 제외
- 부분 반응 (PR): GI aGvHD의 중증도에 있어서 1개의 단계의 개선, 단계 0으로의 개선 또는 2로부터 1로의 GI 단계화의 개선은 제외
환자는 하기 사례에서 비-반응자로 간주되었다:
- 안정 질환 (SD): GI aGvHD의 동일한 단계의 지속
- 진행성 질환 (PD): 적어도 1 단계의 GI aGvHD의 악화
- 환자가 D28 (V4) 전에 추가의 전신 GVHD 요법을 받는 경우
- 환자가 D28 (V4) 전에 사망한 경우
초기 접근 프로그램 (EAP)
EAP는 FMT로 GVHD 환자를 치료하는 의사로부터의 증가하는 요구에 답하기 위해 시작되었다.
전신 치료의 다른 라인과 연관된 스테로이드로 치료된 모든 유형의 GVHD (급성/ 만성/중첩 증후군; SR 또는 SD)는 의학적 요구에 관한 의사 판단에 기반하여 EAP 프로그램에 포함될 수 있다.
27명의 환자가 MaaT013으로 치료되었다.
- 19명의 환자는 SR-aGVHD를 가졌다
- 8명의 환자:
SR-cGVHD를 갖는 1명의 환자
SD-aGVHD를 갖는 4명의 환자
중첩 증후군을 갖는 SD-aGVHD를 갖는 2명의 환자
중첩 증후군을 갖는 SR-aGVHD를 갖는 1명의 환자
단지 이들 환자 모두에 대해 이용가능한 데이터는 임상적 GVHD 반응이다.
4명의 환자에 대해, 본 발명자들은 각각의 FMT 치료 전에 및 D28에서 대변 샘플을 얻었다 (1명의 SR-cGVHD, 2명의 SD-aGVHD 및 1명의 중첩 증후군을 갖는 SD-aGVHD).
GI 반응은 제1 MaaT013 투여 후 28일에 하기 사례에서 달성된 것으로 간주되었다:
- 완전 반응 (CR): GI aGVHD 징후의 완전한 해결, 즉, 임의의 단계로부터 0으로의 GI 단계화의 개선
- 매우 양호한 부분 반응 (VGPR): GI aGVHD의 중증도에 있어서 적어도 2개의 단계의 개선, 또는 2로부터 1로의 GI 단계화의 개선, 단계 0으로의 개선은 제외
- 부분 반응 (PR): GI aGvHD의 중증도에 있어서 1개의 단계의 개선, 단계 0으로의 개선 또는 2로부터 1로의 GI 단계화의 개선은 제외
환자는 하기 사례에서 비-반응자로 간주되었다:
- 안정 질환 (SD): GI aGvHD의 동일한 단계의 지속
- 진행성 질환 (PD): 적어도 1 단계의 GI aGvHD의 악화
- 환자가 D28 전에 추가의 전신 GVHD 요법을 받는 경우
- 환자가 D28 전에 사망한 경우
물질 및 방법
분변 미생물총의 16S rDNA 시퀀싱 및 생물정보학 분석
16S rDNA 시퀀싱을 유로핀스 게노믹스(Eurofins Genomics) (독일 에버스베르크)에 의해 수행하였다. 게놈 DNA를 뉴클레오스핀 소일(NucleoSpin Soil) 키트 (마케리 나겔(Machery Nagel))를 사용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 표적화하는 시퀀싱 라이브러리를 마이택(MyTaq) HS-Mix 2X, 바이오라인(Bioline)을 사용하여 제조업체의 지시서에 따라 각각의 샘플에 대해 구축하였다. 이어서 라이브러리를 등몰 혼합물에서 풀링하고, 쌍형성된-단부 (2x300 bp) 마이섹(MiSeq) V3 실행, 일루미나에서 시퀀싱하였다.
FLASH를 사용한 앰플리콘 합류 (Magoc et al., 2011) 및 트림모마틱(Trimmomatic)을 사용한 품질 필터링 (Bolger et al., 2014) 후, 숙주 서열 오염제거를 보타이2(Bowtie2)로 수행하였다 (Langmead, Ben and Salzberg, 2013). 작동적 분류학적 단위 (OTU) 서열 클러스터링을 VSEARCH를 사용하여 97%의 동일성 역치로 수행하고 (Rognes et al., 2016), 이어서 분류학적 프로파일링을 실바(Silva) SSU 데이터베이스 릴리즈 128로 수행하였다. 공정한 비교를 위해, 각각의 샘플의 서열 수를 동일한 시퀀싱 깊이, 즉, 샘플당 60000개의 앰플리콘으로 무작위로 정규화하였다. 분류학적 및 다양성 분석을 R 통계 소프트웨어 (버전 3.4.4)로 수행하였다.
숙주 파라미터 (혈액, 분변)
알부민, 프리-알부민, 총 콜레스테롤을 혈장에 대해 각각 로슈 디아그노스틱스(Roche Diagnostics)로부터의 코바스 인테그라(Cobas Integra) 400+ / 키트 ALBT2, PREA, CHOL2로 평가하였다.
인독실-3-술페이트 및 시트룰린을 혈장에 대해 액체-크로마토그래피 - 질량 분광법에 의해 평가하였다.
분변 조눌린을 대변 상청액에 대해 이뮨디아그노스틱 아게(Immundiagnostik AG)로부터의 ELISA 키트 (ELx800 판독기/ IDK 조눌린 ref K5600)를 사용하여 평가하였다.
실시예 1: 다양한 GVHD를 갖는 환자에 대한 FMT 효능 (EAP 프로그램)
SR-aGVHD를 갖는 19명의 환자 중에서:
- 10명의 환자는 MaaT013에 대한 비-반응자로 간주되었다.
- 9명의 환자는 MaaT013에 대한 반응자로 간주되었다.
SR-aGVHD를 제외한 다양한 GVHD를 갖는 8명의 환자 중에서, 모두는 MaaT013에 대한 GVHD 반응 (6명의 완전 반응, 2명의 매우 양호한 부분 반응)을 달성하였으며, 이는 MaaT013 FMT에 대한 이들 환자의 직접적 지향을 지지한다.
실시예 2: FMT 치료의 콜로니화 성능 및 GI 반응 사이의 관계 (헤라클레스 연구)
도 3은 IMP로 지칭되는 투여된 FMT 생성물의 조성과의 환자의 미생물총 유사성을 나타낸다. 브레이 쿠티스 값이 보다 높을 수록, 생성물과 보다 유사하다.
V1에서, 이 유사성은 FMT가 아직 투여되지 않았기 때문에 예상된 바와 같이 낮다. 본 발명자들은 또한 R 및 NR 미생물총 사이의 차이를 관찰한다. 이는 우연히 생성물과 공통적인 OTU를 가질 공산을 증가시키는 NR 환자의 미생물총의 보다 높은 다양성과 관련될 수 있다.
V2, V3 (각각 FMT 패스 1 및 FMT 패스 2 후)에서, 생성물 조성과의 유사성은 D28에서 단지 반응자로 간주된 환자에 대해 증가한다.
마지막 FMT 후, D28을 의미하는 V4에서, 이 차이는 가장 현저하다 (t-검정, p<0.05).
이들 데이터는 환자의 장 미생물총이 FMT에 동등하게 반응하지 않음을 제시한다. 이들 중 일부, 즉, 반응자는 FMT 후에 변형된 미생물총 조성을 가지며, 이들 변형은 투여된 조성물과 보다 가까운 조성을 초래하고; 일부 다른 것들, 대부분 비-반응자는 생성물과 보다 많은 유사성을 얻지 않는다.
도 4는 V2, V3, V4 방문의 각각 및 V1 방문 사이의 생성물과의 유사성 퍼센트 (도 3에 기재된 바와 같음)의 차이를 예시한다. 진화 값의 범위는 3개의 그룹으로 나누어질 수 있다: (1) 진화가 음성인 그룹, (2) 진화가 낮은 그룹 [0에 가까움, 5 미만], 및 (3) 차이가 10 초과인 그룹. V4에서, 모든 반응자는 이 제3 블록이며, 이는 또한 비-반응자 중 하나를 포함한다 (이 블록에서 가장 낮은 값).
이들 진화 결과에 따르면, 최소 5 퍼센트 포인트 증가하는 생성물과의 유사성은 환자의 미생물총에 영향을 미치는 생성물에 의한 콜로니화를 정의하는 양호한 후보이다.
결론: 장 미생물총 및 생성물 미생물총 사이의 유사성은 FMT 허용성 대용물이고, FMT의 허용성은 환자의 반응에 영향을 미치는 인자 중 적어도 하나이다.
MaaT 인덱스
공개 및 내부 데이터의 조합에 기반하여, MaaT 파마는 3개의 인덱스를 정의하였다:
- 코어 마이크로바이옴: 건강한 대상체에 대한 공개 데이터 및 MaaT 데이터 중에서, 이는 코어 마이크로바이옴으로 명명된 통상적인 마이크로바이옴으로 정의되었다. 선택된 속은 코호트에서 >80% 유병률, 및 코호트당 >0.1% 중위 풍부도를 갖는 것들이다. 속 목록은 루미노코쿠스, 파에칼리박테리움, 도레아, 코프로코쿠스, 블라우티아, 알리스티페스, 박테로이데스, 서브돌리그라눌룸, 로세부리아, 파라박테로이데스, 라크노스피라이다.
- 건강 인덱스: 건강한 마이크로바이옴 (종종 양호한 건강과 연관된 박테리아 과를 함유함)의 인덱스. 이 인덱스는 그들 박테리아 과로부터의 상대 풍부도를 합계함으로써 수립된다: 라크노스피라세아에, 루미노코카세아에, 클로스트리디아세아에, 프레보텔라세아에, 에리시펠로트리카세아에.
- 부티코어: 15개의 부티레이트 생산 속의 합 또는 상대 풍부도: 블라우티아, 파에칼리박테리움, 알리스티페스, 유박테리움(Eubacterium), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 루미노코쿠스, 클로스트리디움(Clostridium), 코프로코쿠스, 오도리박터(Odoribacter), 로세부리아, 홀데마넬라(Holdemanella), 아나에로스티페스(Anaerostipes), 오실리박터(Oscillibacter), 서브돌리그라눌룸 및 부티리비브리오(Butyrivibrio). 부티코어는 항-염증 잠재성 미생물총 마커로 해석될 수 있다.
도 5에 제시된 바와 같이, 3개의 MaaT 정의된 인덱스는 모든 반응자 환자에서 V1 및 V4 사이에 증가되었다. V1에서 0에 가까운 부티코어는 모든 반응자에 대해 V4에서 5% 초과인 반면, 이는 모든 비-반응자에 대해 5% 미만이다. 이 계량치는 콜로니화 성능의 품질을 평가하기 위한 또 다른 양호한 후보이다.
실시예 3: FMT 치료의 콜로니화 성능 및 GI 반응 사이의 관계 (EAP 프로그램)
대변 샘플을 갖는 EAP 환자 (1명의 SR-cGVHD, 2명의 SD-aGVHD 및 1명의 중첩 증후군을 갖는 SD-aGVHD - 모두 반응자였음)에 대해, EAP 프로그램 동안 얻어진 데이터에 따르면, 콜로니화 성능 계량치는 SR-aGvHD 데이터에 대해 개요된 패턴을 지지한다.
도 6은 V1 및 FMT3 후에서 투여된 IMP의 조성과의 환자의 미생물총의 유사성을 나타낸다. 브레이 쿠티스 값이 보다 높을 수록, 생성물과 보다 유사하다. 이는 IMP의 미생물총의 생착을 입증한다.
도 7은 V1 및 V3 후에서의 환자에 대한, IMP에 대해 측정된 부티코어를 나타낸다. 부티코어는 V1에서 V3 후까지 증가하는 패턴을 가지며, 이는 콜로니화 성능의 품질 및 미생물총 재구축에서의 FMT의 효능을 예시한다.
도 8은 V1 및 V3 후에서 환자에 대해 측정된 건강 인덱스를 예시한다. 건강 인덱스는 V1에서 V3 후까지 증가하는 패턴을 가지며, 이는 콜로니화 성능의 품질 및 미생물총 재구축에서의 FMT의 효능을 예시한다.
결론: 이들 데이터는 환자의 장 미생물총이 FMT에 대해 동등하게 반응하지 않음을 제시한다. 이들은 FMT 후에 변형된 미생물총 조성을 가지며, 변형은 모두 반응자인 환자에 대해 투여된 생성물과 보다 가까운 보다 다양한 조성을 초래한다.
실시예 4: 숙주 파라미터 마커에 대한 증거 (헤라클레스 연구)
시트룰린
시트룰린은 소장 장세포에서 전적으로 생산되는 아미노산이다.
시트룰린은 간에 의해 대사되지 않기 때문에, 그의 혈청 농도는 총 기능적 장세포 질량과 강하게 상관된다. 이는 또한 연령과 상관된다. 값은 신장 기능에 의해 영향을 받을 수 있다. 시트룰린의 정상 범위는 30-50 umol/L이다.
시트룰린혈증은 GI-aGVHD 환자에서 감소된다 (Vokurka et al., Med Sci Monit 2013).
도 9에 제시된 바와 같이, 시트룰린 수준은 MaaT013 투여 후 R 환자에서 더 높았다 (V2 및 V3에서 유의함).
시트룰린의 기준선 값은 또한 예측적 바이오마커이며, > 20 μmol/L의 시트룰린은 환자가 치료에 반응할 가능성이 있음을 나타낸다.
인독실 술페이트
인독실 술페이트는 l-트립토판의 대사물이다:
l-트립토판 → 인돌 → 인독실 → 인독실 술페이트 (IS)
인돌은 트립토파나제-발현 위장 박테리아를 통해 인간 장에서 l-트립토판으로부터 생산된다. 인독실은 간에서 효소-매개 히드록실화를 통해 인돌로부터 생산된다. 이어서, 인독실은 간에서 술포트랜스퍼라제 효소에 의해 인독실 술페이트로 전환된다.
소변 3-IS 수준은 HSCT 후의 결과를 예측하며, 항생제와 연관된다. HSCT 후 최초 10일 내의 낮은 3-IS 수준은 HSCT 후 1년에서 유의하게 더 높은 이식물-관련 사망 및 전체 더 낮은 생존과 연관된다. 마이크로바이옴의 다양성 뿐만 아니라 그의 특이적 조성은 소변 3-IS를 나타낸다. 높은 소변 3-IS 수준과 연관된 대다수의 OTU는 라크노스피라세아에 (유박테리움 렉탈레(Eubacterium rectale)) 및 루미노코카세아에의 과에 속한다. 낮은 3IS는 바실루스의 강의 구성원과 연관되었다 (Weber et al., Blood 2015).
3IS와 연관된 인자: 리팍시민을 받은 환자에 비해 시프로플록사신/메트로니다졸을 받은 환자에서의 더 낮은 IS 농도. 보다 초기의 전신 항생제 치료는 또한 낮은 3IS 수준과 연관되었다.
3-인독실 술페이트 (3-IS)의 감소된 소변 배설은 장 미생물총 파괴 및 위장 (GI) 이식편-대-숙주-질환을 발달시킬 증가된 위험의 마커이다 (Weber et al., 상기 문헌).
3-IS는 헤라클레스 환자의 소변에서 평가될 수 없었지만 (수집된 소변 없음), 본 발명자들은 혈액 샘플에서 이를 시험하기로 결정하였다. 혈액에서는 빈약한 데이터가 이용가능하다.
도 10에 제시된 바와 같이, IS 수준은 V2, V3 및 V4에서 R 환자에서 약간 더 높다. IS 수준은 MaaT013 투여 후 증가되는 것으로 보이며, 이는 MaaT013의 유익한 영향을 시사하고, 생착의 대용 마커일 수 있다.
분변 조눌린
인간 조눌린은 세포간 긴밀한 연접을 가역적으로 조정함으로써 소장의 상피층에서 침투성을 증가시키는 단백질이다.
조눌린 방출을 촉발시킬 수 있는 몇몇 잠재적인 장 자극 중에서, 박테리아에의 소장 노출 및 글루텐은 지금까지 확인된 2가지 촉발인자이다. 장 감염은 장 장벽의 손상을 유발함으로써 알레르기성, 자가면역, 및 염증성 질환을 포함하는 몇몇 병리학적 상태의 병인론에 연루되었다. 장 박테리아에 노출된 소장은 조눌린을 분비한다. 이 분비는 시험된 미생물의 병독성과 독립적이고, 박테리아-노출된 소장 점막의 관강 측면 상에서만 발생되며, 긴밀한 연접 복합체로부터의 단백질 폐쇄 소대 (ZO)-1의 이탈과 일치하는 장 침투성의 증가가 이어진다. 경세포 경로의 이 조눌린-유도된 개방은 미생물을 쫓아내는 방어 메커니즘을 나타내고, 그에 의해 소장의 박테리아 콜로니화에 대한 숙주의 선천 면역 반응에 기여할 수 있다 (Fasano, Clin Gastroenterol Hepatol 2012).
분변 조눌린은 크론병에서 상승된다. 정상 범위는 61±46 ng/ml이다 (Malickova et al., Pract Lab Med 2017).
도 11에 예시된 바와 같이, V2에서 측정된 3명/4명 반응자는 V1보다 약간 더 높은 조눌린 수준을 갖는다. 코호트 수준에서, 분변 조눌린은 모든 방문에 대해 비-반응자보다 반응자에서 더 높다.
프리알부민
도 12는 프리알부민 측정이 V2 및 V3에서 보다 유의하게, 비-반응자보다 반응자에서 더 높음을 예시한다.
총 콜레스테롤
도 13에 제시된 바와 같이, 콜레스테롤은 반응자에서 더 높다 (모든 방문). 모든 방문에 대해 가장 낮은 값을 갖는 대상체 250-012-002는 예외이다.
실시예 5: FMT 반응을 예측하는 미생물총 마커에 대한 증거
도 14 및 16은 반응하는 집단 (GI D28)을 반응하지 않는 집단으로부터 분리할 수 있는 일련의 미생물총 바이오마커를 제시한다. 피르미쿠테스 문에 속하는 박테리아의 상대 풍부도는 피르미쿠테스의 보다 높은 상대 풍부도 (80% 초과)를 갖는 반응자 (어두운 회색으로), 및 1명을 제외한 30% 미만의 피르미쿠테스의 상대 풍부도를 갖는 반면 FMT가 결코 투여되지 않은 (V1) 비-반응자 (밝은 회색으로) 사이의 계층화 계량치이다. 악티노박테리아는 또한 대부분의 반응자에 대해 보다 높은 경향이 있다 (비-반응자에 의해 도달된 가장 높은 값 7%를 제외하고). 박테로이데테스 (R에 대해 15% 미만, 대부분의 NR에 대해 25% 초과) 및 프로테오박테리아 문 (R에 대해 10% 미만, 대부분의 NR에 대해 25% 초과)은 반대 패턴을 갖는다: 반응자는 보다 낮은 값을 갖는다.
본 발명자들은 또한 불량한 예후 문에 비해 양호한 예후의 비를 평가하였다: (1) 박테로이데테스에 비한 피르미쿠테스의 비의 log10 변환인 F_over_B_ratio_log, 및 (2) (박테로이데테스 + 프로테오박테리아)에 비한 (피르미쿠테스 + 악티노박테리아)의 비의 log10 변환인 FA_over_BP_ratio_log. 이들 비 둘 다에 대해, 모든 R은 0 초과의 값을 갖고, 1명/8명을 제외한 모든 NR은 보다 낮은 값을 갖는다 (도 14).
또한, 높은 알파 다양성 인덱스 (여기서 OTU 수준에서의 심슨(Simpson) 인덱스에 의해 나타내어짐)는 불량한 예후 바이오마커일 가능성이 있다. 모든 R은 19% 미만의 심슨 인덱스를 가지며, 이는 6명/8명 NR에 대한 사례가 아니다 (도 14).
도 15는 몇몇 그룹 (여기서 2개의 그룹: 반응자 및 비-반응자)의 분리에 대한 정보를 제공하는 중요한 특색을 선택하고, 그들의 정량적 효과를 측정하는 분석의 결과를 나타낸다. 도 15A는 유의한 계층화 효과를 갖는 각각의 미리 선택된 분류군에 대한 크기 효과를 예시한다. 이들 분류군은 분류학적 수준 (P: 문, C: 강, O: 목, F: 과, G: 속)에 의해 그룹핑되어 도 15B에 제시된다. 색칠된 분류군은 환자 계층화에 유용한 것들인 반면, 다른 것들은 분류군이 계층화에 대한 효과를 갖지 않음을 나타내었다.
FMT 전에 주어진 환자에 대해 어두운 회색으로 강조된 분류군의 보다 높은 상대 풍부도는 환자 반응의 예측제이며, 밝은 회색으로 강조된 것들에 대한 보다 높은 수준, 또는 도 14에 예시된 바와 같이, 건강 인덱스, 또는 코어 미생물총 또는 다양성은 비-반응의 예측제이다.
도 16 및 하기 표 1은 본 발명을 수행하는 경우 사용될 수 있는 식의 비-제한적 예를 제시한다.
표 1: 16S 시퀀싱에 의해 측정된 나열된 분류군의 풍부도를 갖는, GI 증상을 갖는 SR-aGvHD 환자에서 FMT 성능 예측 시험을 수행하기 위한 식 및 연관된 역치 (#R 컷-오프)의 예.
실시예 6: qPCR을 사용한 상대 풍부도 평가
정량적 PCR (qPCR, 또는 실시간 PCR)은 유리하게는 예를 들어 하기 기재된 프로토콜 및 프라이머를 사용하여 본 발명에 따른 FMT 성능 예측 시험을 수행하기 위해 사용될 것이다.
a. qPCR 기술의 선택
정량적 PCR (qPCR, 또는 실시간 PCR)은 단지 소량의 주형 DNA가 요구되고, 높은 민감성, 고-처리량 프로세싱, 알맞은 비용을 가지며, 실험실에서 빈번히 발견되는 알맞은 장비를 요구하기 때문에 몇몇 이점을 갖는다 (Bacchetti De Gregoris et al., 2011).
b. 프로토콜 예
주: 이 프로토콜은 업데이트된 16S RNA 유전자 서열 데이터베이스를 갖는 새로운 프라이머 디자인에 따라 진화할 수 있다.
DNA는 분변 물질로부터의 DNA의 추출에 적합한 제조된 키트를 사용하여, 제조업체의 지시서에 따라 추출된다.
qPCR은 SYBR을 포함하는 믹스 및 다중웰 (예를 들어 96-웰 플레이트) 실시간 PCR 검출 시스템 상의 실행으로 이중으로 수행된다.
박테리아 분류군의 16S rRNA 영역에 특이적인 프라이머가 사용된다.
각각의 분류군-표적화된 qPCR (즉, 프라이머의 각각의 쌍)은 독립적으로 수행되어야 한다.
사용될 수 있는 프라이머의 예는 하기 표 2에 기재된다.
표 2: FMT 성능 예측 시험을 수행하는 경우 qPCR에 의해 나열된 분류군의 풍부도를 측정하는데 사용될 수 있는 프라이머의 예. 뉴클레오티드 기호: R = A 또는 G; Y = C 또는 T; W = A 또는 T; 및 S = C 또는 G.
PCR 사이클 파라미터는 이 특이적 검정, 뿐만 아니라 각각의 프라이머 쌍 효율에 대해 최적화될 것이다. 예 (Yang et al., 2015)는 이들 값을 제공한다:
물질: 2x패스트스타트(2xFastStart) SYBR 그린 믹스 (바자임(Vazyme), 중국 난징)을 갖는 PCR 시스템 서열 검출기. qPCR 혼합물은 염료1을 갖는 10μl의 2x패스트-스타트 SYBR 그린, 0.5 μl의 각각의 정방향 및 역방향 프라이머 (최종 농도, 0.4μM), 및 9μl의 DNA 주형 (10 ng으로 평형화됨)을 함유하였다.
박테리아 프라이머의 어닐링 온도: 60℃.
변성의 사이클링 조건: 10분 동안 95℃, 이어서 15초 동안 95℃ 및 1분 동안 60℃의 40 사이클.
양성 및 음성 대조군이 사용될 것이다.
c. 박테리아 분류군에 대한 상대 풍부도 값
박테리아 분류군에 대한 상대 풍부도 값은 하기와 같이 총 박테리아에 대해 계산될 수 있다 (Yang et al., 2015):
여기서 Eff.Bact (1 내지 2의 값)는 박테리아 프라이머의 계산된 효율 (2 = 100% 및 1 = 0%)이고, Eff.Spec는 분류군-특이적 프라이머 (피르미쿠테스, 박테로이데테스)의 효율을 지칭한다. CTbact 및 CTspec는 써모사이클러에 의해 등록된 CT 값이다. "X"는 샘플에 존재하는 16S 분류군-특이적 (예를 들어 피르미쿠테스) 카피 수의 퍼센트를 나타낸다.
실시예 7: FMT 반응을 예측하는 추가의 마커의 확인
물질 및 방법
실험은 총 24명의 환자에 대해 초래되었다. 최종 헤라클레스 코호트는 이전의 실시예에서 제시되지 않은 9명의 추가의 환자를 포함한다.
루미넥스(Luminex) 검정을 사용하여, 하기 분자의 농도를 V1, V2, V3 및 V4에서 헤라클레스 연구에 포함된 환자로부터의 혈장 샘플에서 측정하였다:
- CCL25 - C-C 모티프 케모카인 리간드 25
- CCL28 - C-C 모티프 케모카인 리간드 28
- CD14 - 분화의 클러스터 14
- CD30 - 분화의 클러스터 30
- IFN_감마 - 인터페론 감마
- IL_10 - 인터류킨 10
- IL_17A - 인터류킨 17A
- IL_18 - 인터류킨 18
- IL_1베타 - 인터류킨 1 베타
- IL_2 - 인터류킨-2
- IL_2RA - 인터류킨-2 수용체 알파 쇄
- IL_6 - 인터류킨 6
- IL_8 - 인터류킨-8
- IP_10 - 인터페론 감마-유도된 단백질 10
- MCP_1 - 단핵구 화학유인물질 단백질 1
- REG3a - 재생 소도-유래 단백질 3 알파
- TGFb_1 - 형질전환 성장 인자 베타 1
- TGFb_2 - 형질전환 성장 인자 베타 2
- TGFb_3 - 형질전환 성장 인자 베타 3
- TNF알파 - 종양 괴사 인자
루미넥스 검정을 마그픽스(MAGPIX)® 시스템, 및 하기 루미넥스 키트로 수행하였다: 머크 밀리포어(Merck Millipore)로부터의 TGFb1.2.3 및 sCD14, 및 IL-1b, IL-2, sIL-2ra, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17A, IL-18, IFNg, TNFa, MCP1, CCL25, CCL28, sCD30, CXCL10 및 RegIIIa에 대해 바이오테크네(Biotechne)로부터의 16 플렉스 루미넥스.
하기 파라미터의 농도를 연관된 방법으로 V1, V2, V3 및 V4에서 헤라클레스 연구에 포함된 환자로부터의 혈청 샘플에서 측정하였다:
- Zonu - ELx800 판독기 / 키트 IDK 조눌린 ELISA ref. K 5601 / 이뮨디아그노스틱 아게 (서비바이오(Servibio))로 ELISA에 의해 혈청 조눌린
- TAS - 히타치(Hitachi) 912 / 키트 총 항산화 상태 (TAS) - Ref NX2332 / 란독스(Randox)로 효소적 방법에 의해 총 항산화 상태
- ALAT - 로슈 디아그노스틱스로부터의 코바스 인테그라 400+ / 키트 ALTL 상에서 37℃에서 피리독살 포스페이트로 IFCC (국제 임상 화학 연합(International Federation of Clinical Chemistry))에 의해 SGPT
- CHOG - 로슈 디아그노스틱스로부터의 코바스 인테그라 400+/ 키트 CHOL2 상에서 효소적 비색측정법에 의해 총 콜레스테롤
- LDH - 로슈 디아그노스틱스로부터의 코바스 인테그라 400+ / 키트 LDHI2 상에서 UV 시험에 의해 락테이트 데히드로게나제
- Prealb - 로슈 디아그노스틱스로부터의 코바스 인테그라 400§ / 키트 PREA 상에서 면역검정에 의해 프리알부민
- NMO - 유동 세포계측법에 의해 단핵구 (유미젠(YUMIZEN) H500 OT)
- NPBA - 유동 세포계측법에 의해 다핵 호염기구 (유미젠 H500 OT)
PN - 유동 세포계측법에 의해 다핵 호중구 (%) (유미젠 H500 OT)
하기 파라미터를 연관된 방법으로 V1, V2, V3 및 V4에서 헤라클레스 연구에 포함된 환자로부터의 혈장 샘플에서 측정하였다:
- Neopt - ELx800 판독기 / 키트 네오프테린 Elisa Ref RE9321 / 아이비엘 인터내셔날 게엠베하(IBL international GmbH)로 ELISA에 의해 혈액 네오프테린
- Citru - 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피에 의해 시트룰린
- Indox - 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피에 의해 3-인독실술페이트
- ST2 - : ELx800 판독기 / 키트 인간 ST2/IL-33R 면역검정 콴티킨(Quantikine) ELISA ref DST200 / 알앤디 시스템스(R&D Systems)로 ELISA에 의해 종양형성의 억제 2
하기 파라미터를 연관된 방법으로 V1, V2, V3 및 V4에서 헤라클레스 연구에 포함된 환자로부터의 분변 샘플에서 측정하였다:
ㆍ 기체 크로마토그래피-질량 분광법에 의해 단쇄 지방산
- ACETA_s - 아세테이트BUTYR_s - 부티레이트
- ISOBUT_s - 이소부티레이트
- PROP_s - 프로피오네이트
- VALERA_s - 발레레이트
ㆍ 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피에 의해 담즙산
- CA - 콜산
- CDCA - 케노데스옥시콜산
- DCA - 데스옥시콜산
- LCA - 리토콜산
ㆍ CALturbo - 코바스 인테그라 400§ / 키트 fCal 터보 칼프로테신 Ref B KCAL-REST/ 뷜만(BUHLMANN)으로 면역탁도측정법에 의해 칼프로텍틴
ㆍ Zonu_s - ELx800 판독기 / IDK 조눌린 ELISA ref K5600 / 이뉴노디아그노스틱 아게로 ELISA 검정에 의해 대변 조눌린
ㆍ Neopt_s - ELx800 판독기 / 키트 네오프테린 ELISA Ref RE59321 / 아이비엘 인터내셔날 게엠베하로 ELISA 검정에 의해 대변 네오프테린
숙주 파라미터의 완결된 목록을 사용하여, 본 발명자들은 이들 특색, 각각의 시점에서 환자 R vs NR 계층화에서 가장 많은 가중치를 주는 것들로부터 추출하는 기계 학습 접근법을 채용하였다. R vs NR 계층화는 상기 나타낸 바와 같이 수행되었다 (헤라클레스 연구).
기계 학습 모델링
훈련 동안 사용된 알고리즘은 규칙화의 강도를 결정하는데 사용된 내부 교차-확인을 갖는 리지 로지스틱 회귀였다. 본 발명자들은 용이하게 해석될 수 있는 모델로서 로지스틱 회귀를 선택한다: 이는 각각의 특색의 가중치를 특색이 반응 상태와 상관되는 경우 양성으로, 반대-상관되는 경우 음성으로 복귀시킨다.
결과
전체 결과는 도 17에서 관찰될 수 있는 AUC (ROC 곡선하 면적)의 관점에서 표현된다.
이 도면은 평균 AUC (회색 선)가 각각의 시점에 대한 신뢰 구간 (밝은 회색 리본)으로 둘러싸였음을 나타낸다. 각각의 방문에서 포함된 환자의 수가 또한 언급된다. 전체 예측은 이 도면에 따르면 특히 V1 (기준선) 및 V3 (제2 생성물 투여 후)에서 계층화되며, 여기서 최소 신뢰 구간은 유의한 것으로 해석될 수 있는 0.5 AUC (점선)를 교차하지 않는다.
도 18은 가장 예측 결과를 유도하는 측정된 파라미터를 제시한다.
각각의 점에 대해, 막대는 상응하는 파라미터의 값이 NR 환자에서 더 큰 경우 좌측으로 지향되고, 값이 R 환자에 대해 더 큰 경우 우측으로 지향된다.
이들 결과는 몇몇 파라미터를 그들 환자에 대해 영향이 강한 것으로 이전에 언급된 것들에 추가하는 것을 허용한다. 이는 V1에서 하기를 포함한다:
- NR 환자에서 더 많음: IL-6, IL-1베타, IFN_감마, 혈액 조눌린
- R 환자에서 더 많음: CCL28
V2에서, 본 발명자들은 하기를 갖는다:
- NR 환자에서 더 많음: IL-6, IL-8, IL-1베타, 혈액 조눌린
- R 환자에서 더 많음: CCL25
V3에서:
- NR 환자에서 더 많음: IL-6, IL-8, IL-2, IL-1베타, IFN_감마
- R 환자에서 더 많음: CCL25
V4에서:
- NR 환자에서 더 많음: IL-6, IL-8, IL-2, IL-1베타, MCP_1
- R 환자에서 더 많음: CCL25
따라서, FMT 생성물을 투여하기 전에 FMT 성능을 예측하기 위한 마커에 추가로, 이들 결과는 하기 마커가 또한 상기 FMT가 성공적이었는지 여부를 평가하기 위해 FMT 후에 사용될 수 있음을 제시한다:
- 인독실 술페이트 농도의 증가
- 특정 역치 미만의 IL8
- 특정 역치 초과의 CCL25, 및/또는
- 특정 역치 미만의 MCP_1.
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aaggaggtgw tccarcc 17
Claims (14)
- 살아 있는 미생물로의 그의/그녀의 위장 미생물총의 보완을 필요로 하는 대상체가 상기 보완으로부터 이익을 얻을 수 있는지 여부를 평가하는 방법으로서,
a1. 상기 대상체로부터의 위장 생물학적 샘플에서, 양호한 예후와 연관된 박테리아의 풍부도를 측정하는 단계이며, 여기서 상기 박테리아는
- 피르미쿠테스(Firmicutes) 문;
- 바실루스(Bacillus) 및 악티노박테리아(Actinobacteria) 강;
- 바실랄레스(Bacillales), 락토바실랄레스(Lactobacillales) 및 미크로코칼레스(Micrococcales) 목;
- 스타필로코카세아에(Staphylococcaceae), 락토바실라세아에(Lactobacillaceae), 및 미크로코카세아에(Micrococcaceae) 과; 및
- 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 락토바실루스(Lactobacillus), 멜리소코쿠스(Melissococcus) 및 아르트로박터(Arthrobacter) 속
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 카테고리에 속하는 것인 단계; 및
a2. 단계 a1에서 측정된 풍부도의 가중합에 상응하는 제1 값 (#G)을 결정하는 단계; 및/또는
b1. 상기 대상체로부터의 위장 생물학적 샘플에서, 불량한 예후와 연관된 박테리아의 풍부도를 측정하는 단계이며, 여기서 상기 박테리아는
- 박테로이데테스(Bacteroidetes) 및 프로테오박테리아(Proteobacteria) 문;
- 박테로이디아(Bacteroidia) 강;
- 박테로이달레스(Bacteroidales) 및 엔테로박테리알레스(Enterobacteriales) 목;
- 박테로이다세아에(Bacteroidaceae), 포르피로모나다세아에(Porphyromonadaceae), 악시드아미노코카세아에(Acidaminococcaceae), 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae), 루미노코카세아에(Ruminococcaceae), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae), 프레보텔라세아에(Prevotellaceae) 및 에리시펠로트리카세아에(Erysipelotrichaceae) 과; 및
- 박테로이데스(Bacteroides), 에스케리키아(Escherichia), 시겔라(Shigella), 루미노코쿠스(Ruminococcus), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 도레아(Dorea), 코프로코쿠스(Coprococcus), 블라우티아(Blautia), 알리스티페스(Alistipes), 서브돌리그라눌룸(Subdoligranulum), 로세부리아(Roseburia), 파라박테로이데스(Parabacteroides) 및 라크노스피라(Lachnospira) 속
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 카테고리에 속하는 것인 단계; 및
b2. 단계 b1에서 측정된 풍부도의 가중합에 상응하는 제2 값 (#B)을 결정하는 단계; 및
c. 단계 a에서 및/또는 단계 b에서 얻어진 결과를 사용하여, #R1=#G, #R2=1:#B 및/또는 #R3=#G:#B로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 점수 (#R)를 계산하는 단계; 및
d. 단계 c에서 얻어진 각각의 점수를 하나 또는 여러 참조 값과 비교하는 단계이며, 여기서 #R1, #R2 및/또는 #R3이 참조 값(들)보다 상위인 경우, 대상체는 살아 있는 미생물로의 보완으로부터 이익을 얻을 가능성이 있고, #R1, #R2 및/또는 #R3이 참조 값(들)보다 하위인 경우, 대상체는 미생물이 대상체의 장에서 성공적으로 생착하기 위해 살아 있는 미생물로의 보완 전에 치료를 필요로 하는 것인 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 살아 있는 미생물로의 상기 보완이 분변 미생물총 이식물 (FMT)인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가 동종이형 조혈 줄기 세포 이식 (알로-HSCT) 후 이식편 대 숙주 질환 (GvHD)을 앓고 있는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 대상체가 동종이형 조혈 줄기 세포 이식 (알로-HSCT) 후 급성, 스테로이드-불응성 이식편 대 숙주 질환 (SR-aGvHD)을 앓고 있는 것인 방법.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 대상체가 위장 GvHD (GI GvHD)를 앓고 있는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) #G= 피르미쿠테스, #B= 박테로이데테스 및 #R=#G:#B; 및/또는
(ii) #G= 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스 문, #B= 박테로이데테스 및 #R=#G:#B; 및/또는
(iii) #G= 피르미쿠테스 + 악티노박테리아, #B= 박테로이데테스 및 #R=#G:#B; 및/또는
(iv) #G= 악티노박테리아 + 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스, #B= 박테로이데테스 및 #R=#G:#B; 및/또는
(v) #G= 피르미쿠테스, #B= 박테로이데테스 + 프로테오박테리아 및 #R=#G:#B; 및/또는
(vi) #G= 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스 문, #B= 박테로이데테스 + 프로테오박테리아 및 #R=#G:#B; 및/또는
(vii) #G= 피르미쿠테스 + 악티노박테리아, #B= 박테로이데테스 + 프로테오박테리아 및 #R=#G:#B; 및/또는
(viii) #G= 악티노박테리아 + 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스, #B= 박테로이데테스 + 프로테오박테리아 및 #R=#G:#B; 및/또는
(ix) #G= 피르미쿠테스 및 #R=#G; 및/또는
(x) #G= 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스 문, 및 #R=#G; 및/또는
(xi) #G= 피르미쿠테스 + 악티노박테리아 및 #R=#G; 및/또는
(xii) #G= 악티노박테리아 + 악시드아미노코카세아에 및 라크노스피라세아에 과를 제외한 피르미쿠테스 및 #R=#G; 및/또는
(xiii) #B= 박테로이데테스 및 #R=1:#B; 및/또는
(xiv) #B= 박테로이데테스 + 프로테오박테리아 및 #R=1:#B; 및/또는
(xv) #G= 바실루스 + 임의로 악티노박테리아, #B= 박테로이디아 + 임의로 감마프로테오박테리아(Gammaproteobacteria) + 임의로 네가비쿠테스(Negavicutes) + 임의로 클로스트리디아(Clostridia) 및 #R=#G:#B; 및/또는
(xvi) #G= 바실랄레스 + 락토바실랄레스 + 미크로코칼레스, #B= 박테로이달레스 + 엔테로박테리알레스 + 임의로 셀레노모나달레스(Selenomonadales) + 임의로 클로스트리디알레스(Clostridiales) 및 #R=#G:#B; 및/또는
(xvii) #G= 스타필로코카세아에 + 락토바실라세아에 + 미크로코카세아에 + 임의로 엔테로코카세아에(Enterococcaceae), #B= 박테로이다세아에 + 포르피로모나다세아에 + 악시드아미노코카세아에 + 라크노스피라세아에 + 임의로 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 및 #R=#G:#B; 및/또는
(xviii) #G= 스타필로코쿠스 + 락토바실루스 + 멜리소코쿠스 + 아르트로박터, #B= 박테로이데스 + 에스케리키아 + 시겔라 및 #R=#G:#B.
(xix) #G= 바실루스 + 미크로코칼레스, #B= 박테로이디아 + 엔테로박테리알레스 + 악시드아미노코카세아에 + 라크노스피라세아에 및 #R=#G:#B.
(xx) #B= 라크노스피라세아에 + 루미노코카세아에 + 클로스트리디아세아에, 프레보텔라세아에 + 에리시펠로트리카세아에 및 #R=1:#B.
(xxi) #B= 박테로이데스 + 루미노코쿠스 + 파에칼리박테리움 + 도레아 + 코프로코쿠스 + 블라우티아 + 알리스티페스 + 서브돌리그라눌룸 + 로세부리아 + 파라박테로이데스 + 라크노스피라 및 #R=1:#B
인 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 위장 생물학적 샘플이 직장 스왑 또는 대변 샘플인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 qPCR, 16S 시퀀싱, 전체 메타게노믹스 시퀀싱에 의해 또는 마이크로어레이에 의해 정량화되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, #B= 라크노스피라세아에 + 루미노코카세아에 + 클로스트리디아세아에 + 프레보텔라세아에 + 에리시펠로트리카세아에 및 #R=1:#B>100이 대상체가 살아 있는 미생물로의 보완으로부터 이익을 얻을 가능성이 있음을 나타내는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, #B= 박테로이데스 + 루미노코쿠스 + 파에칼리박테리움 + 도레아 + 코프로코쿠스 + 블라우티아, 알리스티페스 + 서브돌리그라눌룸 + 로세부리아 + 파라박테로이데스 + 라크노스피라 및 #R=1:#B>50이 대상체가 살아 있는 미생물로의 보완으로부터 이익을 얻을 가능성이 있음을 나타내는 것인 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 대상체로부터의 적어도 하나의 생물학적 샘플로부터, 콜레스테롤, 인독실술페이트, 분변 조눌린, 시트룰린, 프리알부민, 종양형성의 억제제-2 (ST2), 재생-소도-유래 단백질 3-α (REG3α), IL-6, IL-1β, IFNγ, CCL28 및 IL-2의 농도로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 여러 예후적 마커를 측정하는 단계;
b. 단계 a에서 얻어진 값을 참조 값과 비교하는 단계이며, 여기서
- 참조 값보다 상위의 분변 조눌린 농도;
- 참조 값보다 상위의 시트룰린 농도;
- 참조 값보다 상위의 프리알부민 농도;
- 참조 값보다 상위의 콜레스테롤 농도;
- 참조 값보다 하위의 인독실술페이트 농도;
- 참조 값보다 하위의 ST2 농도;
- 참조 값보다 하위의 REG3α 농도;
- 참조 값보다 하위의 IL-6 농도;
- 참조 값보다 하위의 IL-2 농도;
- 참조 값보다 하위의 IL-1β 농도;
- 참조 값보다 하위의 IFNγ 농도; 및/또는
- 참조 값보다 상위의 CCL28 농도
가 양호한 예후의 추가의 지표인 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제11항에 있어서,
- 분변 조눌린 농도가 직장 스왑 또는 대변 샘플에서 측정되고;
- 다른 예후적 마커가 혈액, 혈장 또는 혈청에서 측정되는 것인 방법. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의한 시험이 대상체가 살아 있는 미생물로의 보완으로부터 이익을 얻을 가능성이 있음을 나타낸 대상체에서 GvHD의 치료에 사용하기 위한 FMT 생성물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트로서, 풍부도가 측정되는 박테리아 분류군에 대해 특이적인 프라이머를 포함하는 키트.
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