JP2023517179A - 脱細胞化生体材料を製造する方法、脱細胞化生体材料、及びその使用 - Google Patents

Abstract

本特許出願は、組織工学の分野を指す。特に、生体組織から脱細胞化生体材料を製造する方法、及び生体細胞外マトリックスを含む、上述の方法によって製造される脱細胞化生体材料を指す。特に、上述の生体組織は、動物又はヒトの眼の結合組織に由来する。より具体的には、活性物質（又は活性物質と合わされたもの）の生物学的足場、補綴物、及び／又は担体を製造するための動物強膜から脱細胞化生体材料を製造する方法、並びに生体材料自体、及び全身放出若しくは局所放出のための物質の足場、補綴物、又は担体としてのその使用を指す。【選択図】図１

Description

本特許出願は、組織工学の分野を指す。具体的には、生体組織から脱細胞化生体材料を製造する方法、及び生体細胞外マトリックスを含む、上述の方法によって製造される脱細胞化生体材料を指す。特に、上述の生体組織は、動物又はヒトの眼の結合組織に由来する。より具体的には、生物学的足場、補綴物を製造するための動物強膜から脱細胞化生体材料を製造する方法、及び／又は全身放出若しくは局所放出のための活性物質の担体として、並びに生体材料自体、及びその使用を指す。

組織工学において、新規な生体材料の開発は、足場として、又は補綴物を製造し、生体系におけるこれらの生体材料の拒絶の可能性を低減するために使用される場合、これらの材料の有効性を向上させるのに必要な特徴をますます改善していくために不可欠である。したがって、生体材料は、生物の臓器、組織又は機能を評価し、治療し、増加させるか、又は置き換えるために、生体系と界面接続することを意図した材料として定義することができる。

再生医薬の開発は、新しい組織の再生若しくは構築を補助するための目的の細胞のための支持骨格として機能するマトリックス若しくは足場の使用、並びに特に栄養素、代謝産物、成長因子、シグナル伝達分子、他の調節分子、及び医薬の輸送を可能にすることに基づく。

足場は、合成であってもよく、又は生物学的であってもよい。合成足場の使用は、その化学特性及び物理特性が、提案された目的に従って、かつ使用される細胞型に従って容易に操作することができるため、有利である。しかしながら、生物学的足場は、合成足場とは異なり、腱、靭帯、小腸の粘膜下層、膀胱及び肝臓等の組織に由来する天然の細胞外マトリックスの化合物である（ＢＡＤＹＬＡＫ，２００８、ＭＥＮＧ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。したがって、生物学的足場は、天然の細胞外マトリックスを有するため、エラスチン、フィブロネクチン及びコラーゲン等の成長因子及び構造要素を保持することができ、付着、分化及び細胞増殖にとって望ましい環境を提供する（ＰＡＲＥＮＴＥＡＵ－ＢＡＲＥＩＬ ｅｔ ａｌ．２０１０）。

足場は、細胞の挙動及び組織の発達を指令し、調節することができる構造特性、生化学特性及び生体力学特性を与える（ＧＩＬＰＩＮ ＆ ＹＡＮＧ，２０１７）。組織工学で使用される細胞は、患者自身からのもの（自己由来）、別の個体からのもの（同種異系）、又は異なる種の個体からのもの（異種異系）であり得る（ＡＢＢＡＳ、ＬＩＣＨＴＭＡＮ、ＰＩＬＬＡＩ，２０１２）。

生物学的足場の免疫反応及び拒絶の機会を低減するために、脱細胞化は、考えられる抗原性粒子の存在を排除するため、広く使用される技術である（ＢＡＤＹＬＡＫ ｅｔ ａｌ．，２００２）。脱細胞化は、化学的手順、酵素的手順、物理的手順、及び組み合わせた手順によって行うことができる。この戦略は、課題である組織から細胞を除去することを目指し、そこに存在する遺伝物質を排除し、可能性のある免疫反応を予防し、足場の機能を維持するために必要な機械特性を保存する細胞外マトリックスの要素を維持する（ＧＩＬＰＩＮ ＆ ＹＡＮＧ，２０１７）。脱細胞化は、使用されるプロセスであるが、同じことを行うための異なる方法が存在する。各方法は、その特殊性、利点及び欠点を有しており、異なる起源からの異なる生体材料に適用される。

特許第ＣＮ１０７００７８８６号は、過酢酸及びエタノールを使用し、ウイルス不活性化後、トリプシン、ＰＢＳ、ＥＤＴＡ、及び脱細胞化のための粘膜下部の超音波処理を使用した、ウシ又はブタの腸粘膜下部の汚染除去を記載している。この特許は、洗剤もヌクレアーゼも使用せず、高価な装置（ウルトラソニケーターである）を使用し、眼の組織には何ら言及していない。

特許第ＣＮ１０５９４４１４２号は、洗剤及び酵素で処理する前及び後に、保護溶液（細胞培地、コンドロイチン、デキストラン、抗生物質及びヒアルロン酸、加圧状態）を使用する、腱又は靱帯の脱細胞化の３つの方法を記載している。そのヌクレアーゼインキュベーション温度は、２５℃又は３０℃である。しかしながら、キレート化剤（ＥＤＴＡ）も低張性緩衝液も使用せず、脱細胞化プロセスにＲＮａｓｅも使用せず、ＤＮＡｓｅ標準温度（３７℃である）でもなく、眼の組織にそれを使用する可能性にも言及していない。

特許第ＣＮ１０５８３３３５３号は、保護溶液（コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、グリセロール及びネオマイシン）並びに高静圧条件を使用し、その後、洗剤とのインキュベーションと同時に、又は別個に行うことができるヌクレアーゼとのインキュベーションを使用する、ブタの皮膚の脱細胞化のためのプロセスを提示する。キレート化剤（ＥＤＴＡ）の使用も、低張性緩衝液の使用も言及しておらず、眼の組織には何ら言及していない。

特許ＣＮ１０１９４７１４４号は、脱細胞化された角膜足場を記載している。脱細胞化プロセスのために、凍結解凍サイクルを行い、その後、低張性溶液中でインキュベーション、ヌクレアーゼによる消化、及び電気泳動、その後に足場の再水和を行う。この特許は、強膜を使用しておらず、他の角膜の置き換え（移植）のみのための使用を予測している。

特許第ＥＰ３４１２３２２号は、コラーゲンからなり、ヒト胎盤（羊水及び絨毛膜）からの脱水及び脱細胞化に供される膜を調製し、使用する方法を記載している。脱細胞化プロセスは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００若しくはＳＤＳ等の洗剤の使用、好ましくは高減圧下の洗浄、及び生体材料において細胞培養を促進する細胞接着因子及び胎児ウシ／ヒト血清による処理に基づく。ヌクレアーゼの使用も、ＥＤＴＡの使用も言及しておらず、又はいかなる眼の組織の使用も言及していない。

特許第ＲＵ２０１６１３５７０３号は、ラット及びウサギから腎臓マトリックスを得るための脱細胞化プロセスを提示している。脱細胞化は、高性能の灌流系及びバイオリアクター、並びに溶液（低張性、ＥＤＴＡ、浸透圧ショック及び洗剤のために、ＳＤＳ、ＳＤＣ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含有する）を使用した洗剤－酵素系である。このプロセスは、臓器全体の脱細胞化を伴い、眼の組織には何ら言及していない。

特許出願第ＣＮ１０６７３０００５号は、コラーゲン構造が損傷を受けないような、脱細胞化のための角膜実質を調製するための方法を提案している。この文書は、強膜を引用しているが、この発明は、角膜及び角膜周辺に連結した強膜を含む角膜実質と、わずか２～３ｍｍの幅を有する強膜組織をその製造物として得ることを提示する。脱細胞化自体、及び強膜の使用は、この発明の焦点ではない。

特許出願第ＵＳ２０１８２５６７８４号は、脱細胞化溶液（非イオン性界面活性剤及びプロテアーゼ阻害剤）による超音波処理、水及び７０％エタノール溶液による洗浄、４８時間にわたるヌクレアーゼ消化を使用する、ウシ椎間板の脱細胞化のいくつかの方法を提示している。残留ＤＮＡ及びグリコサミノグリカンの定量化としての脱細胞化の効率を評価する方法も示している。長期間にわたるヌクレアーゼとのインキュベーションを報告しており、ウルトラソニケーターを必要とし、眼の組織には言及していない。

特許出願第ＫＲ２０１８０１３３１７２号は、脱細胞化細胞外マトリックスから骨移植片を固定するための注射可能な接着剤を製造するための方法を提示している。試料組織は脛骨であり、事前の脱塩のためにインキュベートされ、その後、トリプシンによって脱細胞化され、撹拌によって脱気された。溶液の詳細も提供されておらず、眼起源の組織も何ら言及していない。

特許出願第ＵＳ２０１８１６１２１９６９号は、脂肪組織及び種々の他の種類の軟組織の脱細胞化及び脱脂を記載している。この文書は、脱細胞化組織が想定することができるいくつかの形式、材料の様々な種類の調製及び前処理、脱脂、脱細胞化及び消毒の段階を示唆している。しかしながら、強膜、ましてやエンドヌクレアーゼの使用について具体的に言及していない。

特許出願第ＫＲ２０１８０００３８７９号は、バイオリアクターを使用して脱気することによる、脱細胞化プロセスを記載している。その名称は、いくつかの臓器における使用を指すが、提示されている結果は、腎臓のみを指す。この文書に記載されている方法は、本特許出願によって提案されている方法とは異なる。

Ｓａｌｄｉｎら（２０１７）によって実施された研究は、組織の脱細胞化プロトコルを比較する、異なる起源を有する３１種類の組織に関する総説である。角膜を含む種々のブタ組織の処理を提示しているが、強膜の使用には言及していない。ＥＤＴＡ及びＳＤＳを使用する脱細胞化プロセスは、ヒトの腱に対してのみ引用されており、ヌクレアーゼは使用していない。他のプロトコルは、通常、トリプシン、ＳＤＣ（デオキシコール酸ナトリウム）及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用し、時にはヌクレアーゼ緩衝液と組み合わせられる。

Ｓｉｎｇｅｌｙｎら（２０１１）による研究は、マトリックスが白色になるまで、心筋組織の脱細胞化を１％ＳＤＳを用いて行ったことに言及している。この研究は、脱細胞化のためのヌクレアーゼ又はＥＤＴＡの使用には言及しておらず、眼の組織には言及していない。

Ｓｅｉｆ－Ｎａｒａｇｈｉら（２０１２）によって行われた研究は、ＳＤＳ、イオン性洗剤及び水洗浄により行われたブタ心膜の脱細胞化を報告している。脱細胞化の後、心膜を凍結乾燥させ、粉砕して粉末にした。この研究は、脱細胞化プロセスを詳細には示しておらず、眼の組織も引用していない。

Ｌｉｕら（２００９）によって行われた研究は、膀胱粘膜下層の三次元多孔性足場の製造、及びその後の足場の再細胞化を目的としている。ブタ膀胱を洗浄し、過酢酸（異なる濃度での）に４時間浸漬することによって、脱細胞化のために酸化した。次いで、これをＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で２日間処理し、蒸留水でさらに２日間洗浄した。脱細胞化プロセスは、洗剤又はヌクレアーゼの使用には言及しておらず、眼の組織について言及することなく、臓器全体で行われる。

Ｄａｈｌら（２００３）によって行われた研究は、足場として使用するためのブタ頸動脈の脱細胞化の３つの方法を記載している。第１の方法は、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．０２％のＥＤＴＡ及び０．２ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅを含む緩衝液を２４時間使用する。第２の方法は、ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）及びＢＨＡ（ブチル化ヒドロキシアニソール）を含む低張性緩衝液による１１時間のインキュベーション、その後、ＴＲＩＳ ＨＣｌ、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ及びＢＨＡを含む高張性緩衝液による１１時間のインキュベーションを記載している。第３の処理は、ＰＢＳ中のＮａＣｌ、ＥＤＴＡを含む双性イオン性洗剤溶液（ＣＨＡＰＳ）による１１時間のインキュベーション、その後のＰＢＳ中のＮａＣｌ及びＥＤＴＡを含む陰イオン性洗剤溶液（ＳＤＳ）によるインキュベーションを含む。すべての処理を、一定撹拌の下、１０％のＣＯ２及び３７℃で行い、脱細胞化の後に、ＰＢＳで５分間洗浄した。このプロセスは、ヌクレアーゼの使用について言及しておらず、眼の組織を引用していない。

Ｔｅｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）による研究は、心臓弁工学のための中程度の架橋（網状化）コラーゲン足場について報告している。足場を、脱細胞化心膜から調製し、ＰＧＧ（ペンタ－ガロイルグルコース）、コラーゲン結合ポリフェノールで処理した。脱細胞化のために、心膜を滅菌生理食塩液中で洗浄し、水中に４℃で一晩保存した。次いで、これを中程度に撹拌しつつ、ＴＲＩＳ ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）中のＳＤＣ及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＥＤＴＡ及びＮａＮ３を用い、２２℃で６日間処理し、３日後に溶液を交換した。水及び７０％エタノールで洗浄して（洗剤残渣を除去した）後、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ中、３７℃で２４時間インキュベートした。洗浄した後、エラスターゼとともに６日間インキュベートし、次いで、可溶性タンパク質レベルがＢＣＡアッセイで検出されなくなるまで、再び洗浄した。脱細胞化プロセスは、より多くの時間を消費し、ＳＤＳを使用せず、眼の組織にも言及していない。

Ｖｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５）によって行われた研究は、軟骨、半月板及び腱組織の脱細胞化プロセスが、１％のＴｒｉｓで２４時間、２時間の超音波処理、及びヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ）を使用した３７℃で７２時間の消化により行われたことを報告している。したがって、記載されるプロセスは、本願発明者らの研究で提案されているものよりも長く、ＳＤＳを使用せず、超音波処理を必要とし、この研究は、眼の組織について言及していない。

Ｐａｄｕａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２０１６）によって行われた研究は、骨細胞外マトリックスの脱細胞化が、トリプシン及びＥＤＴＡを用いて２４時間行われ、残留細胞材料を除去するために、ストレプトマイシン及びペニシリンによるその後の２４時間のインキュベーションが行われたことを記載している。したがって、検討中の脱細胞化プロセスは、ヌクレアーゼ及びＳＤＳを使用しておらず、眼の組織を伴わない。

Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）によって行われた研究は、脱細胞化されたブタ心筋を、心臓組織工学のための足場として使用することを目的としている。脱細胞化のために、バイオリアクター、ＳＤＳ、トリプシン、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ及び超音波処理を使用した。このプロトコルは、２週間半続き、本発明の研究で提案されているものと比較すると、非常に長く、眼の組織には言及していない。

Ｗａｎｇら（２０１５）によって行われた研究は、安定した臨床的に適用可能な特徴を有するマトリックスを得るための脱細胞化された肝臓及び腎臓の使用を評価する。臓器に、採血のために灌流を行い、蒸留水（１～３時間）、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ＰＡＡ（過酢酸）及びＮａ－ＤＯＣ（デオキシコール酸ナトリウム）（２～１８時間から２４時間まで）を含有する溶液で脱細胞化を行った。このプロトコルは、ヌクレアーゼを使用しておらず、提案されているものとは異なり、臓器全体で作製されているため、灌流を行うための機器が必要である。この研究は、眼の組織を引用していない。

Ｓａｗｋｉｎｓら（２０１３）によって行われた研究は、脱塩され、脱細胞化された骨マトリックスを使用し、異なる細胞外マトリックスの特徴を比較しようとするものであった。脱塩のために、ＨＣｌ溶液を用いた２４時間の撹拌を使用した。その後、試料を凍結乾燥させた。脱細胞化プロセスは、２４時間のトリプシン及びＥＤＴＡの使用、２４時間のストレプトマイシン及びペニシリンによるインキュベーションに基づいていた。この脱細胞化は、ヌクレアーゼもＳＤＳも使用しておらず、トリプシンの使用を含む。眼の組織には何ら言及していない。

Ｗｏｌｆら（２０１２）によって行われた研究は、ブタの真皮及び膀胱由来の細胞外マトリックスの脱細胞化を提示している。脱細胞化のために、組織を、トリプシン、エタノール、過酸化水素、ＴＲＩＳ－ＥＤＴＡ／Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び過酢酸の溶液で、およそ４６時間処理した。脱細胞化プロセスは、本出願で提案されているものよりも長く、ヌクレアーゼ及びＳＤＳを使用しておらず、眼の組織も使用していない。

Ｗｕら（２０１５）によって行われた研究は、１％のＳＤＳ／ＰＢＳ（７２時間、この培地を２４時間ごとに交換する）、０．１％のＥＤＴＡ／ＰＢＳ（２４時間）、脱イオン水（一晩）及び凍結乾燥を用いたブタ半月板の脱細胞化を提示している。脱細胞化プロセスは、ヌクレアーゼを使用しておらず、この研究は、眼の組織に言及していない。

Ｕｎｇｅｒｌｅｉｄｅｒら（２０１５）によって行われた研究は、１％のＳＤＳ及びストレプトマイシン／ペニシリンを用いた５日間の心筋及び骨格筋の細胞外マトリックスの脱細胞化を記載している。脱細胞化プロセスは、ＥＤＴＡ又はヌクレアーゼの使用に言及していない。この研究は、眼の組織には何ら言及していない。

Ｆｕら（２０１６）によって行われた研究は、ブタ骨格筋の細胞外マトリックスを記載している。ＳＤＳ、ペプシン、ＥＤＴＡ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及びデオキシコール酸ナトリウムを用い、５つの異なる方法で、これらの試薬の異なる混合物を用いて脱細胞化を行った。脱細胞化は、眼起源の組織を引用していない。

Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｏら（２０１２）によって行われた研究は、腱病変における死体組織の再細胞化された足場を提示している。脱細胞化プロトコルは、２時間のＴＲＩＳ－ＥＤＴＡ及びプロテアーゼ阻害剤、その後の５時間の０．１％のＳＤＳ、及び２時間のＤＮａｓｅによるインキュベーションを使用する。眼の組織の使用には言及していない。

Ｍｏｈａｍｍａｄｉｅら（２０１８）によって行われた研究は、ウシ関節軟骨の脱細胞化プロトコルを記載している。このプロトコルは、物理的プロセス（液体窒素での凍結及び解凍）並びに化学的プロセス（２．５％のＳＤＳによる処理及びリン酸緩衝液による洗浄）の使用に基づいている。残留ＳＤＳを排除するために、本著者らは、試料をブフナー滅菌フィルターに入れ、７５％のエタノール、蒸留水及びリン酸緩衝液による洗浄を行う。次いで、脱細胞化された足場を、軟骨工学で使用するために、カルボキシル化された単層カーボンナノチューブで官能基化した。ＥＤＴＡを使用しておらず、洗浄のための特殊な装置を必要とする。この研究は、眼の組織には言及していない。

Ｘｕら（２０１７）によって行われた研究は、ブタアキレス腱のための脱細胞化プロトコルの標準化について記載している。評価される化学的方法では、本著者らは、４８時間及び７２時間のインキュベーションのためのＳＤＳ及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の濃度の異なる組み合わせを試験している。次いで、物理的方法（凍結及び解凍、超音波、灌流、静水洗浄）を、第１の研究で特定された最適濃度の化学試薬と合わせて試験し、化学処理時間を４８時間に制限した。最後に、試料を洗浄し、ＤＮａｓｅで消化し、－２０℃で保存した。この研究は、アキレス腱を脱細胞化するために、２つの化学洗剤（０．５％のＳＤＳ及び１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）と物理的方法（２００ｍｍＨｇの静水圧下での洗浄）との組み合わせを最適なプロトコルとして確立した。このプロセスは、ＥＤＴＡの使用には言及しておらず、特殊な装置を必要とし、眼の組織には言及していない。

Ｓａｃｋｅｔｔら（２０１８）によって行われた研究は、デオキシコール酸ナトリウム／２．５ｍＭのＰＢＳ交換を伴う２回の４８時間のインキュベーションを使用して、膵臓組織を、最初に脱細胞化した。このインキュベーションの後、組織を水ですすぎ、抗生物質を補充した１倍のＰＢＳ中で７２時間洗浄し、２４時間ごとに水ですすぎ、自然状態の抗生物質の置き換えを毎日行った。得られた脱細胞化された膵臓マトリックスを凍結乾燥させ、将来の使用のために－８０℃で保存した。脱細胞化は、ＳＤＳ又はＥＤＴＡの使用には言及しておらず、眼の組織には言及していない。

脱細胞化細胞外マトリックス等の生体材料が、医薬において、他の生体材料又は合成材料と比較して、もたらすことができる利点が知られているが、特に再生医薬において、この種類の材料の使用については、依然として大きい懸念がある。抗原性である可能性、感染性薬剤を保有する可能性、調製された材料と関連した変動性、並びに上述の材料中の望ましくない生理活性成分を特定し、及び／又は特性決定する能力の欠如は、効果的な技術的解決策をますます必要とする重要な課題である。いくつかの組織処理方法が現時点で知られており、これらの方法のいくつかは、これらの組織の脱細胞化を含み、これらが一般的な最先端技術を定義するため、本出願で言及される文書に記載されている。

生物学的足場等の使用のための生体材料を得るために知られている方法は、時間のかかる処理を含み、適切な程度の脱細胞化を有しておらず、及び／又は大規模に適用されるときに再現性ではない。したがって、組織工学の分野は、足場又は補綴物として使用するための改善された生体材料を開発し、並びに最終製品のより大きい効率及びより低い変動性を確保することができる、これらの材料を製造するための方法を開発しようとするものである。

本発明の目的
上述の最先端技術に固有の課題を考慮して、本特許出願は、生体細胞外マトリックスを含み、より大きい規模で、より短い時間で、最終生成物の変動性のより低い程度及びより大きい再現性を有する、脱細胞化細胞外マトリックスを産生することができる、脱細胞化生体材料を製造するための方法を開発することを目的とする。

本出願の別の目的は、補綴物の製造において、足場として、又は物質の担体として使用される改善された特性を有する脱細胞化生体細胞外マトリックスを含む生体材料を提供することである。

本出願の別の目的は、改善された特性を有する生体脱細胞化細胞外マトリックスに加えて、全身放出又は局所放出のための少なくとも１つの追加の物質を含む生体材料を提供することである。

本出願の別の目的は、補綴物の製造における、又は全身放出若しくは局所放出のための活性物質の担体の、それを必要とする個体における、好ましくは、インプラント歯科学及び／又は口腔顎顔面外傷学において、骨組織のため、軟骨組織のため、関節のため、腱のため、皮膚のため、補綴目的のため等の組織の修復及び／又は再生のプロセスにおいて使用するための、特に、充填及び／又は解剖学的修復の外科手技のための、足場としての製造物の製造におけるこの生体材料の使用を提供することである。

本発明の別の目的は、特に、水若しくはアルコール可溶性物質、栄養素、代謝産物、成長因子、シグナル伝達分子、調節分子、ホルモン及び医薬、又は薬学的に活性な化合物の担体製造物の製造におけるこの生体材料の使用を、それを必要とする個体又は動物において提供することである。

本発明の簡単な説明
本特許出願は、生体脱細胞化細胞外マトリックスを含む脱細胞化生体材料を製造するための方法を記載しており、特に、生体組織は、眼の結合組織に由来し、より具体的には、ブタ、ウシ、ウサギ、又はヒト個体由来の強膜に由来する。この方法は、より良い費用便益比を提示し、処理時間の低減を可能にし、脱細胞化プロセスにおける効率性を伴い、最終製品間の変動性を低減し、本明細書で提案される方法の再現性を向上させる。

本出願の別の実施形態は、補綴物の製造において足場として、又は全身放出若しくは局所放出のための物質の担体として使用される、提案された方法によって製造されるような、改善された特性を有する生体脱細胞化細胞外マトリックスを含む生体材料を伴う。

本出願の別の実施形態は、改善された特性を有する生体起源の脱細胞化細胞外マトリックスに加え、全身放出又は局所放出のための少なくとも１つの追加の活性物質を含む、提案された方法によって製造されるような生体材料を含む。言及される物質は、水若しくはアルコール可溶性物質、栄養素、代謝産物、成長因子、シグナル伝達分子、調節分子、ホルモン及び医薬、又は薬学的に活性な化合物からなる群から選択することができる。

本出願の別の実施形態は、足場の製造、補綴物の製造、及び／又は全身放出若しくは局所放出のための活性物質の担体の製造を、それを必要とする個体において行うことにおける使用、好ましくは、インプラント歯科学及び／又は口腔顎顔面外傷学において、骨組織のため、軟骨組織のため、関節のため、皮膚のため、補綴目的のため等の組織の修復及び／又は再生のプロセスにおいて使用するための、特に、充填及び／又は解剖学的修復の外科手技のための、この生体材料の使用である。

本発明は、添付の図面とともに解釈され、以下の説明に基づいてより良く理解される。

Ａは、その天然組織を有する、受領した状態の自然状態でのブタの眼の画像を示し、Ｂは、材料を洗浄し、強膜組織のみを残すための組織切断の代表的な画像を示す。 Ａは、脱細胞化プロセスの直前のきれいな強膜の代表的な画像（外部の図）を示し、Ｂは、脱細胞化プロセスの直前のきれいな強膜の代表的な画像（内部の図）を示す。 脱細胞化のＦプロトコルで使用されるバイオリアクターの代表的な画像を示す。 ブタの対照強膜（自然状態）及び脱細胞化プロトコルＡ～Ｆまでの後に製造された生体材料の組織学的分析を示す（矢印は、核又は核残留物を指し示す）。 ヒドロキシプロリン定量化手順によって得られたコラボレーションを示す代表的な試験プレートを示す。 Ａは、ドットブロットによる、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン及びエラスチンの含有量分析のためのニトロセルロース膜において分析された溶液の配置に使用されるレイアウトを示し、Ｂ、Ｃ、及びＤは、それぞれ、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン及びエラスチンについて行われたドットブロットを示す。 自然状態の強膜試料の走査型電子顕微鏡の画像を示す。矢印は、細胞の存在を示す。 脱水された強膜試料の走査型電子顕微鏡の画像を示す。矢印は、細胞の存在を示す。 脱水され、再水和された強膜試料の走査型電子顕微鏡の画像を示す。矢印は、細胞の存在を示す。 製造された脱細胞化生体材料の試料の走査型電子顕微鏡の画像を示す。 Ａは、自然状態の強膜試料、脱細胞化生体材料の試料、脱水された脱細胞化生体材料の試料、及び脱水され、再水和された脱細胞化生体材料の試料のヤング弾性率（ＧＰａ）の散乱ドットプロットを示し、Ｂは、自然状態の強膜試料、脱細胞化生体材料の試料、脱水された脱細胞化生体材料の試料、及び脱水され、再水和された脱細胞化生体材料の試料の最大歪み（ＧＰａ）の散乱ドットプロットを示す。 動物の皮下組織における脱細胞化生体材料の移植手順ステップを示す。 動物における生体材料インプラントの組織学的切断の代表的な画像を提示する。 動物における生体材料インプラントの組織学的切断の代表的な画像を提示する。 動物における生体材料インプラントの組織学的切断の代表的な画像を提示する。 動物における生体材料インプラントの組織学的切断の代表的な画像を提示する。 動物における生体材料インプラントの組織学的切断の代表的な画像を提示する。 評価されたパラメータの統計分析を示す。Ａは、急性炎症、Ｂは、線維芽細胞の存在、Ｃは、血管の存在、Ｄは、巨細胞の存在を示す。 Ａ及びＢは、それぞれ、４９日間及び１１４日間の腱病変における脱細胞化生体材料のインプラントの組織学的切断の代表的な画像を提示する。 Ａは、腱病変における脱細胞化生体材料の移植領域の組織学的切断の代表的な画像を提示し、Ｂは、損傷を受けた天然の腱に隣接する組織の組織学的切断の代表的な画像を提示し、Ｃ及びＤは、脱細胞化生体材料を含むインプラントによる置き換えのために除去された健康な天然の腱の組織学的切断の代表的な画像を提示する。 第１の実験時間（４９日間）におけるインプラント相互作用の領域における血管及び充血の存在を示す、腱領域における脱細胞化生体材料の移植領域の組織学的切断の代表的な画像を提示する。 損傷を受けた腱の領域を覆う緩い結合組織を示す組織学的切片の代表的な画像を提示する。 第２の実験時間（１１４日間）における天然の腱と相互作用する脱細胞化生体材料インプラントの組織学的切断の代表的な画像を提示する。 第１の実験時間（４９日間）における生体材料インプラントに浸潤する天然の腱の主要細胞のプロファイルを示す組織学的切断の代表的な画像を提示する。 第２の実験時間（１１４日間）における生体材料インプラントに浸潤する天然の腱の主要細胞のプロファイルを示す組織学的切断の代表的な画像を提示する。 ４９日後の市販製品（Ｂｉｏ－ＯＳＳ（登録商標）として上市されている骨移植顆粒）（対照群）の骨組織内のインプラントを示す組織学的切断の代表的な画像を提示する。 １３０日後の市販製品（Ｂｉｏ－ＯＳＳ（登録商標）として上市されている骨移植顆粒）（対照群）の骨組織内のインプラントを示す組織学的切断の代表的な画像を示す。 ４９日後の脱細胞化生体材料と天然の骨組織との相互作用を示す組織学的切断の代表的な画像を提示する。 １３０日後の生体材料と天然の骨組織との統合を示す、骨組織内の脱細胞化生体材料インプラントを示す組織学的切断の代表的な画像を提示する。 ４９日後の骨組織において、シンバスタチンと組み合わされた脱細胞化生体材料インプラントを示す組織学的切断の代表的な画像を提示する。 ４９日後の骨組織において、シンバスタチンと組み合わされた脱細胞化生体材料のインプラント統合を示す組織学的切断の代表的な画像を提示する。 １３０日後の骨組織において、シンバスタチンと組み合わされた脱細胞化生体材料インプラントにおける細胞浸潤を示す組織学的切断の代表的な画像を提示する。 ３０日後のインプラントを受け入れた軟骨病変を示す組織学的切断の代表的な画像を提示する。 生体材料インプラント、関節軟骨、及び新たに形成された結合組織の間の良好な統合を示す組織学的切断の代表的な画像を提示する。 生体材料を使用して瞼保持の充填手術矯正及び解剖学的矯正の画像を提示する。

本出願は、生体組織から脱細胞化生体材料を製造するための方法であって、
－生体組織を集め、処理し、洗浄するステップと、
－生体組織を脱細胞化プロセスに供するステップと、
－脱細胞化生体材料を、汚染除去及び／又は滅菌プロセスに供するステップと、を含む、方法を記載する。

上述の方法は、脱水和ステップをさらに含み、脱水和ステップは、好ましくは脱細胞化生体材料の汚染除去ステップの後かつ滅菌ステップ及び再水和ステップの前に行うことができる。

この方法で使用される生体組織は、眼の結合組織に由来し、さらにより具体的には、ブタ、ウシ、ウサギ、又はヒト起源の強膜に由来する。

本出願はまた、上述の製造方法によって製造される脱細胞化生体材料も記載する。上述の生体材料は、改善された特性を有する生物学的起源の脱細胞化細胞外マトリックスを含み、上述のマトリックスは、Ｉ型及びＩＩＩ型のコラーゲン線維と、エラスチンと、を含む。

さらに、本出願は、活性物質の足場、補綴物、又は担体として、それを必要とする個体において製造される上述の脱細胞化生体材料の使用を記載する。

実施例１－動物起源の試料の収集及び処理。
動物の眼球試料を、冷温貯蔵庫に集めた。本明細書に示される実施例において、これらの試料は、ブタのみを処理する屠殺場で集められたブタの眼球試料である（図１Ａ）。集めた直後に、試料を生理食塩液（０．９％ＮａＣｌ）に浸漬し、実験室が受領するまで、サーマル容器内で冷蔵状態で保存した。実験室までの輸送時間は、可能な限り短くすべきであり、常に１０時間未満にすべきである。

手術器具（ピンサー、メス等）を活用して、強膜に対応しない眼の構成要素を除去するために、試料をすぐに処理した（図１Ｂ）。

その後の脱細胞化プロトコルに供するために、抽出した強膜を、ＴＢＳ溶液（緩衝化ＴＲＩＳ生理食塩液）及び流水で強く洗浄した（図２Ａ及び２Ｂ）。

実施例２－生体材料の脱細胞化プロトコル。
脱細胞化は、生物学的足場の使用に起因する有害な免疫原性反応の機会を低減しようとするか、又は排除しようとする戦略である。この技術は、検討中の組織からの細胞の除去、及びその中に存在する遺伝物質の除去に作用するが、細胞外マトリックスの要素を維持し、足場機能の維持に必要な機械特性を保持しようと試みる。

したがって、試料を処理し、洗浄した強膜を得るステップの後、最初に、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、０～２５℃の温度で１～２０分間、ＴＢＳ溶液中で１～５回洗浄した。洗浄後、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で１～１８時間、低張性緩衝液（５～２０ｍＭのＴＲＩＳ、０．０５～１％ｗ／ｖのＥＤＴＡ、ｐＨ６～８）を使用して、インキュベーションを行った。このステップの後、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で５～２４時間、試料を洗剤緩衝液（５～２０ｍＭのＴＲＩＳ、０．０５～１％ｗ／ｖのＥＤＴＡ及び０．０５％～２％のＳＤＳ）で処理した。次いで、試料を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で３０分間～４時間、脱イオン水で洗浄し、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で５～１５分間、等張性緩衝液（ＴＢＳ溶液）で洗浄した。このプロトコルに続いて、生体試料を、１００～２００ｒｐｍで撹拌しながら、３０～４０℃の温度で３０分間～３時間、ヌクレアーゼ緩衝液（１０～５０ｍＭのＴＲＩＳ、２～１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１～８０Ｕ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、及び／又は０．０５～８０Ｕ／ｍＬのＲＮＡｓｅ）でインキュベーションした。このステップの後、試料を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、２５～３７℃の温度で最大５分間、０．０５～１％ｗ／ｖのＥＤＴＡを含有する生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）における最終的な洗浄に供した。

上述の標準プロトコルは、脱細胞化の以前の研究に基づいており、検討中の材料の特殊性を満たすことを目的とした改変を伴い、この方法の再現性、時間短縮、及び費用対効果の改善を確保したものである。Ｋａｓｂｅｋａｒら（２０１８）の研究は、低張性洗剤及びヌクレアーゼを含む緩衝液の使用を伴う組織のための化学酵素脱細胞化プロセスを示し、このプロセスは、強膜脱細胞化の標準化のための初期プロトコルとして使用された（表１）。
表１：初期の脱細胞化プロトコル及び適切な改変が実施された試験プロトコルの説明。

表１によれば、プロトコルＡは、Ｋａｓｂｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．（２０１８）によって実施された研究の説明に厳密に従っていた。提案されたプロトコルＢの違いは、ヌクレアーゼ緩衝液に使用されるベンゾナーゼの濃度に関するものであり、１Ｕ／ｍＬ～５Ｕ／ｍＬまで上げている。一方、プロトコルＣは、この濃度を１０Ｕ／ｍＬまで上げている。次いで、プロトコルＤは、ベンゾナーゼをＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ（８０Ｕ／ｍＬ）で置き換えており、一方、プロトコルＥは、８Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅを使用し、このプロセス中のすべての回転を下げ、好ましくは８０ｒｐｍ～２００ｒｐｍ、より好ましくは９０～１８０ｒｐｍ、さらにより好ましくは１００ｒｐｍまで下げ、洗剤緩衝液によるインキュベーションの後に、好ましくは４時間、２５℃の温度、１００ｒｐｍの回転での脱イオン水による洗浄を含む段階を加えており、この間隔内に２回の交換を含む。最後に、Ｂｉｏｓｔａｔ Ｂバイオリアクター（Ｂ．Ｂｒａｕｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）において半自動的に処理を行うための体積及び好適な条件に適合させるために、回転、好ましくは８０ｒｐｍ～２００ｒｐｍ、より好ましくは９０～１９０ｒｐｍ、さらにより好ましくは１８０ｒｐｍ、温度、インキュベーション時間及びヌクレアーゼの濃度に関連して、プロトコルＦにおいて調整を行った（図３）。

Ｃｒａｐｏら（２０１１）によれば、脱細胞化効率基準は、５０ｎｇ未満のＤＮＡ数／細胞外マトリックスのｍｇ数（乾燥重量）、組織学的分析における無傷なＤＮＡ及び可視核材料の欠如を包含する。

表２に得られ、記載される結果によれば、プロトコルＡ、Ｂ、及びＣは、効率的な脱細胞化に必要なＤＮＡ／組織ｍｇ数の限界に達しなかった。これらのプロトコルは、ＤＮＡ及びＲＮＡのすべての形態に攻撃し、分解する無差別エンドヌクレアーゼであるベンゾナーゼ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓヌクレアーゼ）を使用する（Ｎｅｓｔｌｅ ａｎｄ Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９６９）。したがって、ヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ）の併用は、高濃度で、ベンゾナーゼの代わりに提案された（プロトコルＤ）。このプロトコルは、脱細胞化効率の基準を満たした最初のプロトコルであった。したがって、プロトコルＤの満足のいく結果が得られた後、１つの強膜のみを使用し、試験再現性の必要性を考慮して、全強膜及びより多くの数（２０の強膜）を使用して、新しいプロトコル（Ｅ）を試験した。このために、より大きいプロセスの節約及び回転の低減のためにＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅの理想的な濃度を調整し、インキュベーション溶液に対する材料の曝露と、残留ＳＤＳを除去するための脱イオン水による洗浄の追加を改善した。このプロトコルも、ＤＮＡ量の減少に関する基準を満たした。その後、大規模の半自動化された、費用対効果の高いプロセスを模倣するために、バイオリアクターを使用して１００の強膜で脱細胞化を実行するために新しい調整を行った（プロトコルＦ）。このプロトコルも、効率的であることが証明された（表２）。
表２．対照試料（自然状態）及びＡ～Ｆ試験プロトコルによって脱細胞化された試料のゲノムＤＮＡ（ｎｇ／μＬ）及び強膜のミリグラム数によるＤＮＡ濃度の定量化。

組織学的分析（ＨＥ染色）によって、対照試料（自然状態）が、無傷の核を有することが証明された（紫色の点－矢印は核を示す）。プロトコルＡ、Ｂ及びＣに関連する画像の評価において、特定の点での核の残余物が示され、これらのプロトコルが効率的ではなかったことを示している。一方、プロトコルＤ、Ｅ、及びＦにおいて、核の存在を観察することはできず、これらの試験からの材料の脱細胞化効率を示している（図４）。

Ｇｉｌｂｅｒｔら（２００６）によれば、脱細胞化プロトコルの有効性は、有能な化合物、酵素的方法及び物理的方法に依存するだけではなく、組織の起源及びその組成にも依存する。Ｋａｓｂｅｋａｒ（２０１８）によって記載された脱細胞化プロトコルは、ヒト眼球の結合組織について標準化されたが、本明細書で提案されたものは、プロトコルＡによって非効率的な脱細胞化を部分的に正当化することができる、動物の強膜組織を使用していた。さらに、Ｋａｓｂｅｋａｒ（２０１８）によって記載されるプロセスは、２０個の眼のｎ個の試料に達し、本研究は、行われた改変によって、１００個の強膜の効率的な脱細胞化を達成し、大規模製造のための適合、時間短縮及び資源の節約を示している。また、検証プロトコルによれば、ＤＮＡ検出の規定された限界及び組織学的分析における核の不在を考慮するため、この技術の再現性に注目することができる。

したがって、この試験（プロトコルＦ）における標準化された最終的な脱細胞化のプロセスは、より効率的であり（１００個の強膜）、より良い費用便益比を有し（ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅの濃縮）、強膜の数当たりの処理時間の低減を可能にし（バイオリアクターにおいて半自動化）、評価及び再現性の基準を満たしている。

実施例３ａ－脱細胞化生体材料の汚染除去プロトコル。
インビトロ／インビボ試験のために、脱細胞化生体材料を、滅菌ＰＢＳ中で初期洗浄を行うことによって汚染除去し、次いで、濃縮された抗生物質及び／又は抗真菌薬溶液を含有する１倍の滅菌ＰＢＳ（およそ３０ｍＬ）に浸漬した。好ましくは、抗生物質及び／又は抗真菌薬溶液の濃縮溶液は、抗生物質作用を有する少なくとも１つの化合物と、抗真菌作用を有する少なくとも１つの化合物と、を含むが、特に、ペニシリン、ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢを含む。試料を、この溶液中、約２℃～８℃、好ましくは４℃の温度で、約３６時間～６０時間、好ましくは約４８時間保存した。保存期間の後、生体材料の断片は、生体材料の各試料から採取され、急速洗浄を１倍の滅菌ＰＢＳ中で行った。これらの断片を、抗生物質及び殺菌剤を含まないＬｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）微生物培養培地に接種することによって、汚染除去試験に供した。これらの試料を、撹拌しながら、３７℃で７２時間インキュベートした。微生物による何らかの種類の汚染の存在を評価するために、７２時間後に、問題となる断片が浸漬された培養培地及び他の対照（１倍洗浄ＰＢＳ、任意の種類の接種を伴わない滅菌ＬＢ培地）の光学密度（ＯＤ）（分光光度測定による、波長：６００ｎｍ）を測定した。実施された実験の詳細は、以下に見出すことができる。

滅菌試験のためのＬＢ培地に浸漬された材料：
Ａ）脱細胞化生体材料の断片
Ｂ）自然状態の強膜の断片
Ｃ）脱水された強膜の断片
Ｄ）前回の洗浄液からの１倍ＰＢＳ
Ｅ）ＬＢ培地のみ

汚染除去試験（ＯＤの読み取り）の結果、以下の結果が示された。
Ａ）－０．０２２
Ｂ）－０．０１８
Ｃ）－０．０２１
Ｄ）－０．０２５
Ｅ）０

この読み取り結果は、微生物の成長を示しておらず、その結果、使用されたプロトコルは、脱細胞化生体材料を汚染除去することができた。

上述の方法は、脱細胞化生体材料の初期及び予備的な汚染除去ステップの両方として効果的であることが証明され、追加の滅菌ステップにさらに供することができる（エチレンオキシド、又は当業者によって知られている任意の他の方法、例えば、ガンマ線を使用して）。

実施例３ｂ－脱細胞化生体材料の滅菌プロトコル。
本出願の別の実施形態では、滅菌ステップは、エチレンオキシドを使用して実行された。本出願に記載される脱細胞化及び脱水ステップの後、次に、生体材料の試料を、試験を実施するために特定の寸法に切断し、室温で約３０分間～１時間乾燥させた。乾燥させた後、外科用グレードの紙に封入して密封し、後でエチレンオキシド滅菌を確認するための識別及び密封を確実にした。

次に、試料を、エチレンオキシド滅菌プロセスに供し、１日間通気させた。その後、チオグリコレートブロス培地（３０℃～３５℃）及びトリプトン大豆ブロス－ＴＳＢ（２０℃～２５℃）における１４日間の微生物成長を調査するための分析を行った。

滅菌プロセス前と比較して、生体材料試料に肉眼で見える変化はなかった。滅菌後に、１４日後の培地において、材料の滅菌を確認した。チオグリコレートブロス及びＴＳＢブロスの両方について、微生物成長はなく、その滅菌性に関して、陰性の結果及び満足のいく試料を提示するものであった。

上述の方法は、生体材料の汚染除去及び／又は滅菌方法として使用されるのに効果的であることが証明された。

実施例４－コラーゲンの定量化。
ヒドロキシプロリン（ＨＰ）の定量化は、製造された生体材料のコラーゲン含有量の間接的な決定を目的とする。したがって、５～５０ｍｇの試料を、１００～４００μＬの脱イオン水中で均質化した。その後、このプロトコルに従って、アミノ酸希釈曲線（ＨＰ）を実施した。

図５は、左側に、三連で、対照としての標準ヒドロキシプロリン曲線を示し、垂直方向に、この物質の希釈が減少している。色が濃いほど、コラーゲンの主要成分の１つであるヒドロキシプロリンの濃度が高い。右側に、個々の脱細胞化生体材料の３つの試料が、垂直方向に３つの減少する希釈において、ヒドロキシプロリン定量化を行った。

均質化された試料の各１００～４００μＬに、対応する数の純粋なＨＣｌを添加した（１：１）。その後、この溶液を１００～１２０℃で３～８時間インキュベートした。次いで、試料をボルテックスし、２～７分間遠心分離して、沈殿物を除去した。

反応物を９６ウェルプレート中で調製し、５～５０μＬの試料をこのウェルに添加し、５～５０μＬのヒドロキシプロリン希釈曲線の各溶液を添加し、試験を三連で行った。塩酸を除去するために、プレートを乾燥させた。乾燥させた後、５０～５００μＬのクロラミンＴ試薬（クエン酸酢酸緩衝液、５０％のｎ－プロパノール及びクロラミンＴ、ｐＨ６．５）を添加した。プレートを室温で２～１０分間インキュベートした。

最後に、１００～５００μＬのＥｈｒｌｉｃｈ Ｒｅａｇｅｎｔ（過塩素酸、ｎ－プロパノール及びｐ－ジメチルアミノベンズアルデヒド－ＤＭＡＢ）を添加し、これが試料中のヒドロキシプロリンと相互作用し、その結果、染色の強度が材料中のアミノ酸（ＨＰ）の数に比例する比色反応が起こる。色が濃いほど、試料中のヒドロキシプロリンの数が多い。したがって、試料を５０～８０℃で６０～１２０分間インキュベートし、吸光度を５６０ｎｍで読み取った。図５において、分光光度測定による読み取りの直前である、プロトコル終了時の反応を見ることができる。

３つの異なる脱細胞化生体材料試料の断片における定量化によれば、平均濃度は、生体材料１ミリグラム当たり１０３．７６μｇのヒドロキシプロリンであり、これは生体材料１ミリグラム当たりおよそ７６９μｇのコラーゲンに相当する。凍結乾燥させた強膜が平均３７０ｍｇの重量を有することを考慮すると、製造された脱細胞化生体材料のコラーゲン含有量は、その重量の７６．９％に相当する。

この結果は、脱細胞化生体材料が、高濃度のヒドロキシプロリンを有しており、したがって、大量のコラーゲンを有していることを示す。

実施例５－脱細胞化生体材料の脱水及び再水和試験。
この実験は、脱水された生体材料からの水溶液又はアルコール溶液の再吸収能力を知り、測定することを目的としていた。このために、脱細胞化生体材料の異なるサイズの断片（例えば、０．６×０．６ｃｍ、１．０×１．０ｃｍ、１．５×１．５ｃｍ）を最初に秤量し、次いで、増加する濃度のエタノール（４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％及び１００％体積／体積）中で脱水させ、これを各濃度で少なくとも３時間インキュベートした。次いで、全脱水の後、断片を再び秤量し、再水和させ、水、アルコール、水若しくはアルコール可溶性物質、栄養素、代謝産物、成長因子、シグナル伝達分子、調節分子、ホルモン、医薬、及び／又は薬学的に活性な化合物からなる群からの少なくとも１つの選択された物質とともに、約２０分間～４０分間インキュベートした。

本明細書に記載される実施例において、生体材料を、所定体積の水を添加することによって再水和に供し、室温で最大３０分間インキュベートした（１５分ごとに吸収された体積を定量化する）。再水和の後、断片を再び秤量し、再吸収された体積を測定した（表３及び４）。
表３：脱細胞化生体材料によって吸収された体積：

表４：再吸収後の重量測定：

この結果によれば、脱水され、再水和された脱細胞化生体材料は、適用された体積の約１／４、又はおよそ６５．４μＬ／ｃｍ２を再吸収する。

本発明のある実施形態では、脱水ステップは、生体材料の脱細胞化及び汚染除去ステップの後に行う。汚染除去ステップは、少なくとも１つの抗生物質及び／又は抗真菌薬を用いて行われる。

本発明の別の実施形態では、脱水ステップは、最初の汚染除去ステップが行われるか否かにかかわらず、生体材料の脱細胞化の後に、しかし滅菌ステップに供される前に行うことができる。エチレンオキシド、又は当業者によって知られている任意の他の方法、例えば、ガンマ線を用いて行われる滅菌プロセス。

次いで、上述のプロセスによって得られた生成物は、脱水され、汚染除去され、及び／又は滅菌された脱細胞化生体材料を含み、これを保存することができ、次いで、使用されるときにのみ、少なくとも１つの活性化合物による再水和及び／又は会合ステップを経ることができる。

実施例６－Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン及びエラスチン含有量の分析。
その目的は、製造された脱細胞化生体材料中のＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン及びエラスチンの存在を定性的に同定することであった。簡潔に述べると、３つのニトロセルロース膜を、自然状態の強膜、脱水され、再水和された強膜、及び製造された脱細胞化生体材料の小さい断片で感作させた。各タンパク質に対する一次抗体を、反応の陽性対照として使用した。ニトロセルロース膜内に存在する、タンパク質を含まない結合部位を、撹拌しながら、２０～４０℃で１～５時間、膜を完全に覆うまで、１～３％のＰＢＳ－乳緩衝液の添加によってブロックした。次いで、膜を１倍のＰＢＳ緩衝液で１～７回洗浄し、各膜を、特異的な一次抗体とともにインキュベートし、２０～４０℃で撹拌しながら、１～５時間、１倍ＰＢＳで希釈した。１倍ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ緩衝液ＰＢＳ－Ｔ）を用い、０．０５％～１％で１～７回洗浄した後、それぞれのＩｇＧ特異的二次抗体（ペルオキシダーゼでマーキングされ、ＰＢＳで希釈されたもの）を、２０～４０℃で撹拌しながら、１～５時間インキュベートした。最後に、膜を、０．０５％のＰＢＳ－Ｔ緩衝液を用いて１～７回再び洗浄し、ＤＡＢ（３，３’－ジアミノベンジジン）溶液を用い、反応を明らかにした。

図６は、分析されたタンパク質のドットブロットを示し、各種類のタンパク質の存在を示しており、図６Ａは、実験レイアウトを示す。図６Ｂ、６Ｃ及び６Ｄは、それぞれ、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン及びエラスチンのドットブロットの代表的な画像である。

ドットブロットの結果によれば、自然状態の強膜、脱水され、再水和された強膜、及び製造された脱細胞化生体材料は、試験した３つのタンパク質であるコラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ及びエラスチンが存在する。

実施例７－走査型電子顕微鏡での生体材料の形態分析。
製造された脱細胞化生体材料の形態分析は、分析される異なる材料におけるその三次元構造、コラーゲン線維の存在及び品質、細胞の存在／不在の確認を評価することを目的としていた。

自然状態の強膜、脱水された強膜、脱水され、再水和された強膜、及び製造された脱細胞化生体材料の試料を、緩衝液で洗浄し、電子顕微鏡に好適な固定溶液に固定した。次いで、固定剤を除去し、試料を、増加する濃度のエチルアルコールを含む溶液中での漸進的な脱水に供した。脱水後、試料を乾燥させて保存した。試料は、メタライザー内で３サイクルの金－パラジウム被覆を受け、Ｚｅｉｓｓ ＥＶＯ ＭＡ１０顕微鏡を使用して可視化した。すべての分析は、５～１５ｋＶの曝露を使用して、三連で、いくつかの倍率で行われた。

図７Ａ及び７Ｂは、それぞれ、８３３倍及び２９００倍の倍率での自然状態の強膜試料の走査型電子顕微鏡を示す。図７Ｂの矢印によって示されるように、細胞の存在を明確に可視化することができる。

図８Ａ及び８Ｂは、それぞれ、８３３倍及び７１００倍の倍率での脱水された強膜試料の走査型電子顕微鏡を示す。図７Ｂの矢印によって示されるように、細胞の存在を明確に可視化することができる。

図９Ａ及び９Ｂは、それぞれ、１２５０倍及び２６４０倍の倍率で脱水され、再水和された強膜試料の走査型電子顕微鏡を示す。図７Ｂの矢印によって示されるように、細胞の存在を明確に可視化することができる。

図１０Ａ及び１０Ｂは、それぞれ、９２３倍及び５５２０倍の倍率での製造された脱細胞化生体材料の試料の走査型電子顕微鏡を示す。細胞の存在は、特定されておらず、コラーゲン及びエラスチン線維は、明らかな変化又は関連する変化が無い状態で残っていた。

電子顕微鏡分析から、使用された脱細胞化方法が、生体材料からの細胞除去を引き起こし、一方で、生体材料が脱細胞化プロセスを経なかった他の群において、細胞の存在が明確に観察されたことを示した。これに加えて、線維は、脱細胞化生体材料において健康な状態を維持しており、生体材料が、自然状態、脱水、又は脱水／再水和された強膜と比較して、線維性マトリックスの形成及び品質に関連する変化を提示する細胞の除去を行うことなく、生体マトリックスの特徴を維持した脱細胞化線維性マトリックスを含むことを示している。

実施例８－生体力学的アッセイ（弾性及び最大歪み弾性率）。
この生体材料の物理特性を評価し、再生医薬の観点での可能性のある用途の適応を可能にするために、生体力学的アッセイを行い、異なる条件下での強膜及び製造された生体材料の耐性を評価した。このアッセイのために、強膜試料のおよそ１２個の断片（１２名の異なる個体由来）を、以下の条件下で使用した。自然状態の強膜、製造された脱細胞化生体材料、脱水された脱細胞化生体材料（増加する濃度のエタノール中）、及び脱水され、再水和された脱細胞化生体材料（増加する濃度のエタノール中で脱水され、水中で３０～５０分間かけて再水和される）。すべての断片は、自然状態の各強膜からの中央領域から入手し、おおよその寸法は、５×２０×１ｍｍ（幅×長さ×厚さ）であった。標本（断片）を、ＴＩＭＥ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．製のＷＤＷ ３８／５６－１０００Ｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｅｓｔ Ｍａｃｈｉｎｅを使用して引張アッセイに供した。加えられる力を達成するために、最大容量５０ｋｇｆのロードセルを使用し、機械の内部変位センサによって変形を登録した。標本を、５ｍｍ離れた２本のツメで固定した。力を加える速度は、２ｍｍ／分であった。

図１１Ａは、自然状態の強膜試料（自然状態）、脱細胞化生体材料の試料（脱細胞化）、脱水された脱細胞化生体材料の試料（脱水）、及び脱水され、再水和された脱細胞化生体材料の試料（再水和）のヤング弾性率（ＧＰａ）の散乱ドットプロットを示す。この試験で使用したヤング弾性率は、永久的な変形を受けずに材料が支持する最大歪みである、適用された負荷の方向での歪みと変形との間の比率を記述する。したがって、弾性パラメータ（Ｅ）によって、脱水された脱細胞化生体材料及び脱細胞化生体材料の試料が、自然状態の強膜試料と比較すると、有意に大きい剛性を示したことを注記することが可能であった。これに加えて、脱水された脱細胞化生体材料の試料も、脱水され、再水和された脱細胞化生体材料試料と比較して、有意に大きい剛性を示した。

図１１Ｂは、自然状態の強膜試料（自然状態）、脱細胞化生体材料の試料（脱細胞化）、脱水された脱細胞化生体材料の試料（脱水）、及び脱水され、再水和された脱細胞化生体材料の試料（再水和）の最大歪み（ＧＰａ）の散乱ドットプロットを示す。予想通り、材料が弾性変形レジームで依然として指示する最大歪みを記述する最大歪みパラメータ（ＭＰａ）についても同じ挙動が観察された。したがって、それらのより大きい剛性に起因して、脱水された脱細胞化生体材料の試料及び脱細胞化生体材料の試料は、自然状態の強膜と比較すると、有意に大きい歪みに耐えた。次いで、脱水された脱細胞化生体材料は、脱水され、再水和された脱細胞化生体材料と比較すると、依然として有意に大きい歪みに耐えた。

製造された生体材料の試料が、分析された処理の種類（脱細胞化、脱水、又は再水和）に関係なく、自然状態の試料と比較して、より高い耐性（より高いＭｐａ）を示したことを強調することが重要である。それらの領域に加えられた、より大きい力を支持しているにもかかわらず、それらの試料はまた、小さい相対的変形を示し、これは自然状態の試料によって示される値に近かった。このような特徴は、組織修復及び／又は再生プロセス、好ましくは、骨組織、軟骨組織、関節、腱、皮膚等において、インプラント学並びに／又は口腔及び顎顔面外傷学における補綴目的のために、外科的充填及び／又は解剖学的矯正のために、あるいは補綴物の製造において、製造される生体材料のための様々な用途の可能性を確認するものである。

実施例９－局所炎症を分析するための、製造された生体材料の皮下移植。
実験動物における生体材料の存在に起因する炎症応答を評価するために、ラットの背側領域に、生体材料を皮下移植した。

動物をイソフルオランで麻酔し、この領域でトリコトミー及び消毒を行い、その後すぐに、メスで長手方向の切開を行った。皮下領域を、先端が丸いハサミで露出させ、次いで、０．５ｃｍ×０．５ｃｍ×０．２ｃｍの脱細胞化生体材料の断片を、切開部の一方に導入し、別の切開部では、生体材料を導入することなく、組織の露出のみを行い、これを対照として使用した。切開部を縫合し、麻酔終了まで動物を観察下においた。動物の安楽死は、材料移植の５日後及び１５日後（それぞれ、急性炎症及び慢性炎症）に行った。移植領域を取り出し、組織学的分析のために１０％ホルムアルデヒドで固定し、ＨＥで染色した（この手順を表す画像を図１２に示す）。組織学的検査は、周囲組織の炎症反応の強度、血管、線維芽細胞、多核巨細胞及び組織統合の存在を評価することを目的としていた。

図１２Ａ～Ｄは、製造された生体材料をラットの皮下組織に移植するための手順を示す。図１２Ａは、イソフルオランマスクによる麻酔下の動物を示す。図１２Ｂは、生体材料の移植を示す。図１２Ｃは、切開部の縫合を示す。図１２Ｄは、手術から５日後又は１５日後の移植領域の除去を示す。

画像の分析を行うために、組織学的切断の６個の領域を選択し、以下の表に従って、急性及び／又は慢性の炎症、線維芽細胞、血管及び多核巨細胞の存在及び強度に従ったスコアで分類した。
表５：分析パラメータスコア

すべての選択された領域において、４名の独立した評価者によって分析が行われた。各評価者によって割り当てられた各動物のスコアの平均を計算し、５日間の結果と１５日間の結果との比較を行った。

図１３は、５日後の対照群からの組織学的切断の代表的な画像を示す。一方で、図１４は、移植から５日後の皮下生体材料インプラントの組織学的切断の代表的な画像を示す。挿入図は、生体材料との炎症性浸潤の接触領域を示す特定の領域を示す。

図１５は、移植から５日後の皮下生体材料のインプラントの組織学的領域の代表的な画像を示す。矢印は、生体材料に浸潤された線維芽細胞（右側に示される材料）を示し、点線の円形は、血管の一例である。

図１６は、移植から１５日後の皮下生体材料インプラントの組織学的切断の代表的な画像を示す。挿入図は、移植された生体材料との炎症性浸潤の接触領域を示す特定の領域を示す。

図１７は、移植から１５日後の生体材料の皮下インプラントの組織学的領域の代表的な画像を示す。矢印は、生体材料に浸潤された線維芽細胞（左側に示される材料）を示す。点線の円形は、血管を示す。点線の長方形は、多核巨細胞を示す。

研究グループによって事前に決定された視覚的スコアを使用して、組織学的分析は、重度の拒絶反応の徴候を示すことなく、移植された生体材料と隣接組織との相互作用を示唆している。図１８Ａ～Ｄは、評価されたパラメータの統計分析を示す（＊＊＊：ｐ＝０．０００６、＊＊：ｐ＝０．００１５、＊：ｐ＝０．０３８）。

それぞれの対照と比較した場合、急性炎症の強度の比較において有意差があり、移植から５日後の群の方が高い（図１８Ａ）。線維芽細胞の存在に関して、移植から５日後の群及び５日間の対照群の両方と比較して、移植から１５日後の群において、これらの細胞の数が有意に増加した（図１８Ｂ）。次いで、血管形成は、それぞれの対照群と比較して、移植５日後群において有意な増加を示し（図１８Ｃ）、一方、巨細胞の存在は、５日間の対照群と比較して、移植１５日後群において有意な増加を示した（図１８Ｄ）。血管の存在に関する分析において、統計的差異は存在しないが、移植から１５日後に、生体材料の内部の新血管形成を注記することが視覚的に可能であり、このことは、身体による統合を示唆している。さらに、移植から１５日後の生体材料内に移行する、より多くの数の線維芽細胞の存在は、生体材料の周辺領域においてリモデリング及び／又は組織分解が存在することを示唆している。

皮下生体材料の移植に関連する結果によれば、増悪した炎症応答の誘導はなく、線維芽細胞の存在が、１５日間及び５日間の群と比較すると増加しているため、検出された炎症プロセスは、徐々に起こる細胞リモデリングにとって重要であり、より深い移行を可能にし、可能ならば局所組織への生体材料移植の統合を特性決定する。実験時間後に材料を取り除いたときの組織学的分析及び肉眼的分析に従って、実験実施時間中に重度の拒絶の徴候は検出されず、このことは、生体材料が、組織工学及び再生医薬で使用するための有望な特徴を示すことを示唆している。

実施例１０－腱損傷における生体材料の移植。
組織修復及び／又は再生における脱細胞化生体材料の使用の可能性を示すために、上述の生体材料のインビボ移植実験を行った。

この実験は、子羊の腱損傷において、製造された脱水された脱細胞化生体材料を移植する効果を分析しようとしたものであった。

この試験のために、２～４歳の雄子羊を使用した。すべての動物に全身麻酔を行い、外科手技に必要なすべての無菌的ケア、倫理的ケア、及び技術的ケアを使用した。腱の断片を取り出した後、本出願に記載の方法によって製造された生体材料から作製されたインプラントを、配置し、チタンネジで骨に固定し、腱の末端で縫合した。

術後期間をモニタリングし、動物は、抗生物質、抗炎症薬及び鎮痛薬を受けた。フォローアップ中に、映像を作製し、手術から４８時間後、及び安楽死まで定期的に、跛行（歩行不全評価）を評価した。

動物を、各々５匹の動物を含む２つの群に無作為に分け、術後４９日間の第１の実験時間（Ｄ４９）及び１１４日間の第２の実験時間（Ｄ１１４）に安楽死させた。安楽死の当日に、動物を臨床的に評価し、正常な粘膜、バイタルサイン及び行動を示した。

切開の後、以前の手術と同じ領域で、外科標本を集め、１０％ホルムアルデヒドを含有する溶液中で保存し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色された組織学的スライドのために送った。

跛行評価及び組織学的分析を、両方の実験時間（Ｄ４９及びＤ１１４）で行った。すべての動物の評価に基づき、４９日群の１匹の動物のみが、跛行の悪化を示し、その他は、歩行において、望ましい正の性能を示した。それに加えて、組織及びインプラントの組織学的分析を、両方の実験時間で行い、宿主細胞とインプラントの周辺領域との相互作用を示した。

動物の跛行評価
跛行を評価するために、以下のパラメータを考慮した。無し：動物が跛行を伴わずに速足で駆ける場合、軽度：動物が、わずかにバランスを崩しながら歩く場合、中度：歩行の間に跛行が起こる場合、重度：動物が、歩行中に足を安定させることができない場合。

両方の実験時間（Ｄ４９及びＤ１１４）からの動物を考慮して、１回目の跛行評価を、外科手技の４８時間後に行った。この分析では、１匹の動物のみが、重度の跛行を呈さなかった。外科手技から１５日後に、すべての動物は、良好な歩行への変化を呈した。３０日後の評価では、２匹の動物が、跛行の悪化を示し、１匹はＤ４９から、もう１匹はＤ１１４から、よろめきを呈した。その他は、軽度の跛行を有していたか、又は以前のパターンを維持していた。４５日後、再び足を安定させることが困難になったＤ１１４群の１匹の動物を除き、すべての動物は、最後の分析と比較して、相対的な改善を呈していた。

第１群（Ｄ４９）の安楽死の当日に、１匹の動物のみが、跛行の悪化を伴って変化した。他の動物は、跛行なく歩くことができたか、又は重度にバランスを崩すことなく速足で駆けることができた。評価は、第２の実験期間からの動物を用い、安楽死の日（Ｄ１１４）まで継続し、速足で駆けるときに軽度の跛行／跛行無しのパラメータを維持した。

２つの実験時間で実施された評価に基づき、分析の積分的変化（手術日から安楽死の日まで）を比較すると、Ｄ４９群の１匹の動物のみにおいて、歩行の悪化が観察された。他のすべての動物は、回復した歩行機能を伴い、良好な転帰を有していた。

組織学的評価
Ｄ４９群の定性的組織学的評価の後、インプラントの周囲に、強度のびまん性の炎症プロセスの存在を観察することができた。脱細胞化生体材料のインプラントと宿主細胞との間の相互作用が明らかに存在し、移植した組織の周囲にあるコラーゲン線維との間を移動した（図１９Ａ）。

図１９（Ａ）は、Ｄ４９実験群における、びまん性の炎症浸潤物及び移植された脱細胞化生体材料を示し、図１９（Ｂ）は、第２の実験群Ｄ１１４における、移植された脱細胞化生体材料（＊によって示される）の周囲にある、びまん性が低く、より画定された炎症浸潤物（｛ ｝によって示される）を示す。

損傷を受けた腱とインプラントとの間の領域は、健康な天然の腱で観察されるものとは異なる、無秩序で多細胞化された線維を呈していた（図２０）。

図２０（Ａ）は、移植された生体材料の領域（＊によって示される）、損傷を受けた天然の腱

及び天然の腱及びインプラントの中間の領域（強調表示されている）を示す。図２０（Ｂ）は、無秩序で多細胞化された線維を伴う、損傷を受けた天然の腱に隣接する組織を示す。図（Ｃ）は、インプラントによる置き換えのために除去された健康な天然の腱を示す。図（Ｄ）は、より高倍率での健康な天然の腱の領域を示す。

移植された組織に近い領域では、分析のほとんどにおいて、新血管形成の存在と、さらに血管内の細胞数の増加を注記することができた（図２１）。また、腱の欠損部に近い、緩い結合組織に類似した特徴を有する新しく形成された組織のいくつかの領域も視覚化した。

図２１は、第１の実験時間Ｄ４９における、天然の組織と生体材料インプラントとの相互作用の領域における血管及び充血の存在を示す（矢印によって示される）。

いくつかの試料では、インプラント及び損傷を受けた腱の外側の領域で、病変のすべての伸長部分を覆う、新しく形成された組織を肉眼的に観察することもでき、この組織は、緩い結合組織の特徴を顕微鏡的に呈していた（図２２）。

図２２は、損傷を受けた腱領域（＃によって示される）の上にある緩い結合組織（］によって示される）の顕微鏡画像を示す。

第２の実験時間Ｄ１４４では、炎症性浸潤の存在を観察することができたが、インプラントの周囲はびまん性が低く、より画定されており、より少ない数の細胞を含む（図１９Ｂ）。これに加えて、いくつかのスライドでは、インプラントとともに新しく形成された組織及び／又はリモデリングされた組織のいくつかの領域の存在が見られ、細胞外マトリックスの明らかな堆積、及びインプラント及び天然組織の両方との連続性を欠く領域において、より圧縮され、平行な線維の数の増加を示しており、このことは、天然の腱の線維と同じ方向で、その線維を組織化するという別個の意図で、徐々に起こる組織リモデリングを示唆している（図２３Ａ及びＢ）。

図２３（Ａ）及び（Ｂ）は、第２の実験時間における、天然の腱との相互作用における脱細胞化生体材料インプラントを示す。インプラント（＊によって示される）は、宿主細胞によって浸潤されていることが観察され、線維芽細胞の特徴を有するものが主である（太い矢印によって示される）。インプラント－腱の相互作用領域内の線維（黒色の矢印によって示される）は、それらの間で圧縮状態が増加し、平行に配置した状態で、それら自体で組織化する傾向があり、インプラントのこの領域では、天然の腱と類似の組織の組織化の組織学的態様を有するようになる（＃によって示される）。

一般に、この第２の実験時間では、第１の実験時間で観察された細胞とは異なる、インプラント組織に浸潤する主要な線維芽細胞様細胞を観察することができた（図２４Ａ及び図２４Ｂ）。これは、初期に強い急性炎症の発生を示唆しており、第２の時間では炎症が低減し、細胞型の減少及び変化、並びに病変の修復傾向を示している。

図２４（Ａ）及び図２４（Ｂ）は、第１の実験時間Ｄ４９（Ａ）及び第２の実験時間Ｄ１１４（Ｂ）のインプラントに浸潤した主要細胞のプロファイルを示す。

組織学的所見及び２つの実験時間の間の比較評価に基づいて、本出願に記載される方法によって製造される脱細胞化生体材料インプラントが、細胞浸潤を可能にするように効率的に作用し、病変の修復及び／又はリモデリングを誘導する試みにおいて、これらの細胞をこの足場に使用するような望ましい環境も提供するが、実験時間は、インプラントの完全な統合又は病変の完全な修復を視覚化するのには十分なものではなかったと推測することができる。それに加えて、臨床的態様、肉眼的態様及び組織学的態様は、生体材料の感染及び／又は拒絶の徴候を示さず、評価された実験時間中のこのインプラントの良好な相互作用を示唆している。

脱細胞化生体材料インプラントは、組織リモデリングの可能性を示し、主にその周辺部での再細胞化を可能にし、その領域の血管形成を可能にし、細胞外マトリックスの堆積を有利にし、これらは、損傷を受けた組織のリモデリングにとって不可欠な因子である。

実施例１１－骨における生体材料の移植。
組織修復及び再生プロセスにおいて移植片として、また、活性物質の担体として、生体材料を使用する可能性を検証するために、インビボでのインプラント実験、より具体的には、イヌの上顎歯槽骨の頬側表面上のインプラントの実験を行った。

２～８歳の雄及び雌のイヌを使用した。すべての動物に全身麻酔を行い、外科手技に必要なすべての無菌的ケア、倫理的ケア、及び技術的ケアを使用した。

アッセイは、３つの実験群から構成されていた。対照と呼ばれる第１の群では、骨再生のための標準的な市販材料である０．２５ｇのＧｅｉｓｔｌｉｃｈ Ｂｉｏ－Ｏｓｓ（登録商標）を使用し、第２の群では、脱水された脱細胞化生体材料（生体材料群と呼ばれる）を使用し、第３の群では、２．５％のシンバスタチンを保有する脱水された脱細胞化強膜（活性化合物を含む生体材料群と呼ばれる）を使用した。

付着歯肉に、１５番のメスの刃で長手方向の切開部を作製し、その後、骨膜を切開し、露出される骨領域に沿って剥離し、それにより歯槽骨に対する直接的なアクセスを可能にした。レシピエントの骨表面に、骨部分の過熱を防ぐために、常に付随物を伴う外部灌流と連続した生理食塩液を伴い、７０１番の円錐形のカーバイド手術バーを用いて、平均サイズ０．５×０．７５ｃｍの溝を作製した。生体材料を溝の上に配置した後、長さ１．５ｃｍの半円形の非侵襲性針の上に取り付けたモノフィラメントナイロン糸（４－０）を使用して、隔離されたステッチを使用して、外科的合成のために骨膜及び歯肉を再配置した。外科手技の後、動物は、３日連続で、抗生物質、抗炎症薬及び鎮痛薬の投与を受けた。

４９日後（Ｄ４９）及び１３０日後（Ｄ１３０）に、手術部位から断片を取り出した。試料を、１０％ホルムアルデヒドを含有する溶液中で固定し、増加する濃度のエタノール中で脱水し、キシレン中で透明化し、浸潤させ、パラフィン中に包埋し、その後の光学顕微鏡での組織学的分析のためにヘマトキシリン及びエオシンで染色した。

組織学的評価
Ｄ４９対照群の代表的なスライドに対する定性的組織学的評価によれば、生体材料断片の周囲にある挿入された歯肉膜において、骨芽体の形成が観察された。骨芽体領域は、骨細胞、骨芽細胞、及び破骨細胞等の典型的な細胞の存在による、骨組織形成プロセスの開始と適合する。未成熟骨組織に共通する所見である、コラーゲン線維の無秩序な分布、並びにマトリックスに挿入された骨細胞及び骨芽細胞及び血管の存在の分析から、このプロセスの未成熟性を検証することが可能である（図２５）。

図２５は、移植された市販の骨移植片からの顆粒（＊によって示される）が存在する、口腔粘膜を示す。（Ａ）では、移植片が移植された密な結合組織（＃によって示される）及び上部の緩い結合組織（角括弧によって開始される）を観察することができる。（Ｂ）では、市販の移植片顆粒は、隣接する骨芽体の形成を伴い、強調表示されており（＊によって示される）、このプロセスは、対照群Ｄ４９において、（Ｃ）及び（Ｄ）で拡大され、詳細表示される。

市販の骨移植片の顆粒に近い血管の数、及び軽度の充血、組織の栄養に有利に働き、その結果、問題となる組織の発達に寄与し得る状態にもわずかな増加が存在した。したがって、顆粒の存在が、不規則な細胞外マトリックスを伴う、未成熟骨に典型的な骨形成を誘導したと推測される。

対照群の実験時間Ｄ１３０では、第１の実験時間に対する同様の応答が観察され、新しく形成されたマトリックス内に多数の骨細胞と、及びより組織化された領域とを含有する一次骨を有し、市販の移植片の顆粒近くにハバース系の形成に似た配置を有する。（図２６）

図２６は、Ｄ１３０対照群を示す。（Ａ）では、新たに形成された骨（＃によって示される）に含まれる強調表示された顆粒の存在に加え、歯槽骨の骨膜（［によって示される）に対して外側に、膜内の市販の骨移植片顆粒（＊によって示される）が存在する。（Ｂ）で強調表示された領域は、分析のために（Ｃ）で拡大され、成長線は、生体材料領域及びハバース系の形成（＊＊によって示される）に対して近くに視覚化される（矢印によって示される）。より高倍率では、より組織化され、配向されたコラーゲン線維の堆積が、粒子の周囲、並びに生体材料の周囲の骨形成細胞の周囲で見ることができる（Ｄ）。

生体材料Ｄ４９群では、脱細胞化生体材料と動物の歯槽骨との密な接触を観察することができ、多数の細胞が、強膜領域に散在しており、生体材料内の血管新生を伴い、この実験時間では顕著な特徴であった。顕著な炎症浸潤物を有する領域は、可視化されなかった（図２７）。

図２７は、生体材料群Ｄ４９を示す。（Ａ）では、実験動物の付着歯肉の膜領域、及び骨組織（［によって示される）、動物の歯槽骨［によって示される）に隣接する脱細胞化生体材料の移植（＊によって示される）。（Ｂ）では、（Ａ）の拡大によって、インプラント及び形成中の骨組織（＃によって示される）の詳細を観察することができ、生体材料と、生体材料に侵入する骨及びおそらく骨前駆細胞との相互作用、及び脱細胞化生体材料における細胞の存在、並びに血管（矢印によって示される）を検証することができる。

生体材料Ｄ１３０群では、多数の血管の存在が明らかであり、脱細胞化生体材料インプラント内部の中程度の血管新生と、個別の骨形成を示唆する領域と参照されるインプラントとの密な接触を提案している。骨形成は、無秩序であるか、又はわずかに組織化されたパターンを示し、初期の時間Ｄ４９とは異なっていなかった。生体材料では、内側及び実験動物の骨に隣接する領域にも、散在した細胞が観察された（図２８）。

図２８は、生体材料群Ｄ１３０を示す。（Ａ）では、生体材料インプラントと動物の骨との間（［によって示される）と、インプラントと緩い結合組織との間（｛によって示される）に、密な統合の領域が観察される。ここで、脱細胞化生体材料インプラント（＃によって示される）は、内部のおそらく骨前駆細胞と、その線維を散在させる小さい細胞浸潤物の存在とを有する。（Ｂ）では、おそらく脂肪細胞の存在が強調表示されており、おそらく骨髄由来である（矢印によって示される）。（Ｃ）及び（Ｄ）では、移植された生体材料の上に新たに形成された骨（＊によって示される）の堆積を見ることができる。

骨組織修復プロセスにおいて、血管新生及び細胞移行が重要であり、骨伝導性生体材料を使用して、骨修復において細胞をより迅速かつ適切に向かわせることがわかっているため、本特許出願によって記載される方法によって製造されるように、脱細胞化生体材料の骨伝導性の役割が示唆される。

活性化合物を含む生体材料群では、生体材料を活性物質と組み合わせて使用し、担体としても機能する能力を評価した場合（この場合にはシンバスタチンを使用する）、組織学的評価は、他の群と比較して、より大きい骨体積の存在を示しており（図２９）、歯槽骨及び新たな骨形成の隣接領域を観察することができる。

図２９は、活性化合物を含む生体材料Ｄ４９群を示す。画像が、歯肉粘膜上皮（矢印によって示される）の存在を示す顕微鏡写真である場合、粘膜の膜（［によって示される）及びシンバスタチンを含む生体材料が配置された領域（｛によって示される領域）が、動物の歯槽骨（＊によって示される）に隣接していた。骨の新形成の領域（＃）は、長方形で強調表示されている。

活性化合物を含む生体材料Ｄ４９群における骨形成の領域は、骨の熟成プロセスに特徴的である一体化した骨梁を示した。これに加えて、未成熟な骨領域では、多数の骨細胞、及び血管を含有する小さい髄腔の存在が観察される（図３０）。

図３０は、活性化合物を含む生体材料Ｄ４９群を示す。シンバスタチンを含む生体材料と、歯槽骨（Ａ）及び結合組織（［によって開始される）との間の相互作用の領域。歯槽骨（＃によって示される）に隣接し、これと統合した、より大きい体積の新たに形成された骨（＊によって示される）、新たに形成された骨梁（＊によって示される）内の細胞浸潤物及び血管が存在する。新たに形成された骨は、画像（Ｂ）に示すような無秩序なコラーゲン線維と、歯槽骨から区別される成長線（Ａ及びＢにおいて矢印によって示される）を有する。

活性化合物を含む生体材料群（Ｄ１３０）の第２の実験時間では、Ｄ４９時間に関連して、同様の挙動が観察され、歯槽骨の成長線に隣接し、これによって区切られる、より大きい新たに製造された骨体積の存在が観察された（図３１）。これに加えて、生体材料に近い領域におけるマスト細胞の存在も観察され、このことは、組織リモデリングプロセス、並びに生体材料インプラントと相互作用するより多くの血管及び細胞の存在に明らかに関連している。

図３１は、活性化合物を含む生体材料Ｄ１３０群を示す。（Ａ）及び（Ｂ）では、シンバスタチンを含む生体材料の内部に、肥満細胞

及び他の細胞型の存在を見ることができる。成長線（矢印によって示される）は、成熟した歯槽骨（［によって示される）を、新たに形成されたもの（＊によって示される）から分離する。動物自体からの結合組織（｛によって示される）。

本特許出願に記載される方法によって製造される脱細胞化生体材料は、細胞移行を容易にすることに加え、骨伝導及び骨誘導の役割を有していた。これに加えて、例えば、化合物をインプラント部位に直接的に送達することによって、活性化合物と併用される可能性を示した。シンバスタチンは、高脂血症の治療に使用される薬物であり、インビトロで既に試験された多面的な骨形成効果及び吸収抑制効果を有する（骨芽細胞の増殖及び分化を刺激する骨形成タンパク質－２（ＢＭＰ－２）の発現の増加と関連する、骨組織に対するシンバスタチンの効果から得られる細胞動態の変化を示している）。したがって、脱細胞化生体材料インプラントは、骨形成を有利にし、シンバスタチンと会合する場合、他の実験群と比較して、より良い性能を示した。

実施例１２－軟骨病変における生体材料の移植。
組織修復及び再生プロセスにおいて、移植片としての生体材料、生物学的足場の使用の可能性を検証するために、インビボで軟骨組織によって引き起こされる損傷における、本特許出願によって記載される方法によって製造される脱細胞化生体材料のインプラント、より具体的には、ヒツジの膝において引き起こされる病変における生体材料の移植。

およそ１８ヶ月齢であり、体重が４８～５６ｋｇの雄子羊を使用した。動物に、麻酔プロトコル、外科手技に必要なすべての無菌的ケア、倫理的ケア、及び技術的ケア、並びに膝内側大腿脛骨膝蓋骨切開プロトコルを行い、膝蓋骨を横方向に引っ込めさせ、大腿脛関節を屈曲させた。軟骨下骨が露出するまで、直径６ｍｍ、深さおよそ３ｍｍの関節摩耗のために、骨用バーを使用した。直径７ｍｍの膜断片を適合させ、病変部位に挿入した。ラフィア（ｒａｆｆｉａ）及び麻酔後の回復の後、動物を一頭用の仕切り内に送り、その後、毎日臨床検査を行ってフォローアップし、包帯で５日間固定した。

外科手技から３０日後、動物を、麻酔前医薬によって安楽死させ、手術部位を取り出した。外科標本を４％ホルマリン中で固定し、ギ酸溶液で脱塩した。組織学的スライドを実施するための手順に従い、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。

組織学的分析では、移植された生体材料の良好な相互作用を観察することができた（図３２）が、特に、生体材料インプラントのコラーゲン線維と、天然骨組織との良好な相互作用は観察することができなかった。

図３２は、術後３０日間の実験時間で、軟骨損傷を患い、インプラントを受け入れた群の組織学的切片を示す。点線は、病変部位にあるインプラントのおおよその境界画定を示す。角括弧（］）は、天然の関節軟骨の領域を示し、矢印は、骨組織（軟骨下領域）との相互作用を示す。

生体材料インプラントの末端で、動物由来の線維芽細胞の強い浸潤が観察され、新しい細胞外マトリックスの堆積を伴って、これにより縁部の正確な境界画定が存在しなくなり、隣接組織に対する生体材料インプラントの重要な統合を示している（図３３Ｃ）。

図３３は、術後３０日間の実験時間で、軟骨病変を患い、インプラントを受け入れた群の組織学的切片を示す。図（Ａ）は、（Ｂ）及び（Ｃ）におけるより良い分析のために拡大されている区切られた領域での組織学的切断の代表的な画像である。図（Ｂ）では、矢印は、関節軟骨と新たに形成された結合組織との間の統合領域を示し、インプラントとの重要な統合を示している。円形は、軟骨細胞の有糸分裂像を示す。図（Ｃ）は、組織との間の良好な統合に起因して、境界画定の消失を引き起こす、線維芽細胞の浸潤、新しい細胞外マトリックスの堆積を伴う生体材料インプラントの領域を示す（下側左）。

生体材料インプラントに隣接して、炎症細胞も見出され、修復プロセスの段階に対応する、リンパ球、マクロファージ及び形質細胞等の単核細胞が主であった。分析された動物のいずれにおいても、多核巨細胞（ランゲルハンス巨細胞）又はカプセル化プロセスの存在等の生体材料の拒絶の徴候はなかった。

インプラントの上側表面で、新たに形成された結合組織が観察され、軟骨組織との重要な統合を伴う。この領域では、軟骨細胞の有糸分裂像の存在が、病変の縁部で観察され、これは軟骨増殖を示しており、本特許出願によって記載される方法によって製造される生体材料インプラントの組織修復の可能性を構成する（図３３Ｂ）。

実施例１３－充填及び解剖学的矯正のための生体材料の移植。
充填及び解剖学的矯正プロセスにおける生体材料の使用の可能性を検証するために、片方の眼において瞼保持を行ったヒトにおける、製造された生体材料のインプラントを実施した（図３４Ａにおいて矢印によって示される）。

次いで、生体材料インプラントを、所望の瞼に外科的に移植されるのに適したサイズで調製した（図３４Ｂ～Ｄ）。

図３４（Ｅ）は、手技直後の手術結果を示す。図３４（Ｆ）は、上述の外科手技からおよそ１０ヶ月後に、本特許出願の脱細胞化生体材料を使用した充填手術及び解剖学的矯正の結果を示す。患者は、移植された生体材料を拒絶せず、充填及び解剖学的矯正は成功し、患者の眼の対称性を美的に回復させた。

したがって、本出願は、脱細胞化生体材料を製造する方法であって、
－好ましくは、生体組織が、眼の結合組織、好ましくは、ブタ、ウシ、ウサギ、又はヒト起源の強膜に由来する場合、生体組織を集め、処理し、洗浄するステップと、
－得られた脱細胞化生体材料を脱細胞化プロセスに供するステップであって、
ａ－生体組織を、等張性緩衝液を使用して、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、０～２５℃の温度で１～２０分間、１～５回洗浄すること、
ｂ－生体組織を、低張性緩衝液を使用して、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で１～１８時間、インキュベートすること、
ｃ－生体組織を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で５～２４時間、洗剤緩衝液で処理すること、
ｄ－生体組織を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で３０分間～４時間、脱イオン水で洗浄すること、
ｅ－生体組織を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で５～１５分間、等張性緩衝液で１～５回洗浄すること、
ｆ－生体組織を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、３０～４０℃の温度で３０分間～３時間、ヌクレアーゼ緩衝液とともにインキュベートすること、及び
ｇ－生体組織を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、２５～３７℃の温度で最大５分間、０．０５～１％ｗ／ｖのＥＤＴＡを含む生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１～２回洗浄することを含む、生体組織を脱細胞化プロセスに供するステップと、
－得られた脱細胞化生体材料を、汚染除去及び／又は滅菌プロセスに供するステップと、を含む、方法を記載する。

さらに、ステップ（ａ）～（ｇ）における撹拌は、９０～１９０ｒｐｍの範囲である。ステップ（ａ）及び（ｅ）の上述の等張性緩衝液は、１０～１００ｍＭのＴＲＩＳ及び１００～２００ｍＭのＮａＣｌで構成される緩衝化ＴＲＩＳ生理食塩液（ＴＢＳ）である。ステップ（ｂ）の低張性緩衝液は、５～２０ｍＭのＴＲＩＳ、０．０５～１％ｗ／ｖのＥＤＴＡを含み、ｐＨ６～８である。ステップ（ｃ）の洗剤緩衝液は、５～２０ｍＭのＴＲＩＳ、０．０５～１％ｗ／ｖのＥＤＴＡ及び０．０５％～２％ｗ／ｖのＳＤＳを含む。ステップ（ｆ）のヌクレアーゼ緩衝液は、１０～５０ｍＭのＴＲＩＳ、２～１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１～８０Ｕ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、及び／又は０．０５～８０Ｕ／ｍＬのＲＮＡｓｅを含む。ステップ（ｄ）は、全時間の半分で少なくとも１回の洗浄水交換を含む。この方法は、大規模製造のための半自動化された方法で実施することができ、好ましくは、ステップ（ａ）～（ｇ）をバイオリアクター内で実施することができる。

脱細胞化生体材料の汚染除去ステップは、１つの抗生物質及び／又は抗真菌薬の使用を少なくとも含む。

抗生物質及び／又は抗真菌薬を使用する脱細胞化生体材料の汚染除去ステップは、
ｉ－脱細胞化生体材料を滅菌生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で少なくとも１回洗浄することと、
ｉｉ－抗生物質及び／又は抗真菌薬の濃縮溶液を含有する滅菌生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に脱細胞化生体材料を浸漬することと、
ｉｉｉ－その溶液中に脱細胞化生体材料を浸漬したまま、２～８℃の温度で約３６～６０分間維持することと、
ｉｖ－脱細胞化滅菌生体材料を滅菌生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で少なくとも１回洗浄することと、を含む。

抗生物質及び／又は抗真菌薬の濃縮溶液は、抗生物質活性を有する少なくとも１つの化合物と、抗真菌活性を有する少なくとも１つの化合物と、を含む。

好ましくは、抗生物質及び／又は抗真菌薬の濃縮溶液は、ペニシリン、ストレプトマイシン及びアムホテリシンＢを含む。

脱細胞化生体材料の滅菌ステップは、エチレンオキシド、又は当業者によって知られている任意の他の方法、例えば、ガンマ線の使用を含む。

脱細胞化生体材料を製造する上述の方法は、汚染除去ステップ及び／又は滅菌ステップの前又は後に行ってもよい脱水ステップをさらに含む。

脱水ステップは、脱細胞化生体材料又は汚染除去された脱細胞化生体材料を脱水プロセスに供することを含み、脱水プロセスにおいて、上述の生体材料は、増加する濃度のアルコールとともにインキュベートされ、好ましくは、アルコール濃度は、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、最大１００％体積／体積まで増加し、上述の生体材料は、いわゆるアルコール濃度の各々において少なくとも３時間インキュベートされる。

本方法は、脱水された生体材料の再水和ステップをさらに含んでもよく、好ましくは滅菌ステップの後に行うことができ、上述の脱水された生体材料を、水、アルコール、水若しくはアルコール可溶性物質、栄養素、代謝産物、成長因子、シグナル伝達分子、調節分子、ホルモン、医薬、及び／又は薬学的に活性な化合物（例えば、シンバスタチン）からなる群から選択される少なくとも１つの物質とともに約２０～４０分間インキュベートすることを含む。

本出願はまた、この方法によって製造される脱細胞化生体材料であって、生体脱細胞化細胞外マトリックスを含み、上述のマトリックスは、主にＩ型及びＩＩＩ型のコラーゲン線維と、エラスチンと、を含む。生体材料は、少なくとも１つの活性物質と組み合わせて使用されてもよく、又は水若しくはアルコール可溶性物質、栄養素、代謝産物、成長因子、シグナル伝達分子、調節分子、ホルモン、医薬、及び／又は薬学的に活性な化合物（例えば、シンバスタチン）からなる群から選択される少なくとも１つの活性物質を含んでもよい。

生体材料は、足場製品として使用するため、あるいはそれを必要とする個体における全身放出若しくは局所放出のための活性物質の足場製品、補綴物又は担体の製造のためのものである。例えば、組織修復及び／又は再生プロセス、好ましくは、骨組織、軟骨組織、関節、腱、皮膚のプロセスおけるその使用のため、インプラント歯科学及び／又は口腔顎顔面外傷学における補綴目的のため、充填及び／又は解剖学的修復の外科手技のため、又は補綴物の製造において、制限はない。

本特許出願は、明瞭さ及び理解のための説明及び例によって、特定の詳細度で本発明の主題を記載したが、添付の特許請求の範囲の範囲において、特定の変更及び改変が実施され得ることが明らかであろう。

本明細書に記載される例は、限定するものではなく、本発明の範囲から離れることなく、当業者が本発明のいくつかの態様又は構成要素を変更することを可能にする。

参考文献
Ａｂｂａｓ，Ａ．Ｋ．，Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．Ｈ．，＆Ｐｉｌｌａｉ，Ｓ．（２００７）．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ ｅｄ．）．
Ｂａｄｙｌａｋ，Ｓ．Ｆ．（２００２）．Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ａｓ ａ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３（５），３７７－３８３．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１２３２４２２０から取得
Ｂａｄｙｌａｋ，Ｓ．Ｆ．，＆Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｗ．（２００８）．Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０（２），１０９－１１６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｍｉｍ．２００７．１１．００３
Ｂａｒｂａｎｔｉ，Ｓ．Ｈ．，Ｚａｖａｇｌｉａ，Ｃ．Ａ．Ｃ．，＆Ｄｕｅｋ，Ｅ．Ａ．Ｒ．（２００５）．Ｐｏｌｉｍｅｒｏｓ ｂｉｏｒｅａｂｓｏｒｖｉｖｅｉｓ ｎａ ｅｎｇｅｎｈａｒｉａ ｄｅ ｔｅｃｉｄｏｓ．Ｐｏｌｉｍｅｒｏｓ，１５（１），１３－２１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５９０／Ｓ０１０４－１４２８２００５０００１００００６
Ｄａｈｌ，Ｓ．Ｌ．Ｍ．，Ｋｏｈ，Ｊ．，Ｐｒａｂｈａｋａｒ，Ｖ．，＆Ｎｉｋｌａｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．（２００３）．Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ Ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｒｔｅｒｉａｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１２（９１９），６５９－６６６．
Ｆｕ，Ｙ．，Ｆａｎ，Ｘ．，Ｔｉａｎ，Ｃ．，Ｌｕｏ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｄｅｎｇ，Ｌ．，．．．Ｌｖ，Ｑ．（２０１６）．Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｔｒｉｘ ｈｙｄｒｏｇｅｌ：ａ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０（４），７４０－７４９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｊｃｍｍ．１２７７６
Ｇｉｌｐｉｎ，Ａ．，＆Ｙａｎｇ，Ｙ．（２０１７）．Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｆｒｏｍ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０１７，１－１３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１５５／２０１７／９８３１５３４
Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｂｈａｒａｄｗａｊ，Ｓ．，Ｌｅｅ，Ｓ．Ｊ．，Ａｔａｌａ，Ａ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｙ．（２００９）．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｔｏ ａｉｄ ｃｅｌｌ－ｍａｔｒｉｘ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｕｒｏｌｏｇｉｃ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３０（２３－２４），３８６５－３８７３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００９．０４．００８
Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｏ，Ｔ．，Ｂｒｏｎｚｉｎｉ，Ｉ．，Ｖｏｌｐｉｎ，Ａ．，Ｖｉｎｄｉｇｎｉ，Ｖ．，Ｍａｃｃａｔｒｏｚｚｏ，Ｌ．，Ｃａｐｏｒａｌｅ，Ｇ．，．．．Ｐａｔｒｕｎｏ，Ｍ．（２０１４）．Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｒｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｅｎｄｏｎ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｕｓｉｎｇ ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｇｅｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８（８），６１２－６１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｔｅｒｍ．１５５７
Ｍｅｎｇ，Ｆ．，Ｍｏｄｏ，Ｍ．，＆Ｂａｄｙｌａｋ，Ｓ．Ｆ．（２０１４）．Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ＣＮＳ ｒｅｐａｉｒ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，９（３），３６７－３８３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．２２１７／ｒｍｅ．１４．９
Ｍｏｈａｍｍａｄｉｅ，Ｚ．Ｍ．，Ｐａｒｉｖａｒ，Ｋ．，Ｓｈａｈｒｉ，Ｎ．Ｍ．，Ｆｅｒｅｉｄｏｎｉ，Ｍ．，＆Ｈａｙａｔｉ－Ｒｏｏｄｂａｒｉ，Ｎ．（２０１８）．Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ Ｂｏｖｉｎｅ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄ ｂｙ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅｄ－ＳＷＣＮＴ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｒａｚｉｌｉａｎ Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５９０／１６７８－４３２４－２０１７１６００８３
Ｐａｄｕａｎｏ，Ｆ．，Ｍａｒｒｅｌｌｉ，Ｍ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｌ．Ｊ．，Ｓｈａｋｅｓｈｅｆｆ，Ｋ．Ｍ．，＆Ｔａｔｕｌｌｏ，Ｍ．（２０１６）．Ｏｄｏｎｔｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｎｔａｌ Ｐｕｌｐ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ｏｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｌ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ Ｂｏｎｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ，１１（２），ｅ０１４８２２５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１４８２２５
Ｐａｒｅｎｔｅａｕ－Ｂａｒｅｉｌ，Ｒ．，Ｇａｕｖｉｎ，Ｒ．，＆Ｂｅｒｔｈｏｄ，Ｆ．（２０１０）．Ｃｏｌｌａｇｅｎ－Ｂａｓｅｄ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，３（３），１８６３－１８８７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｍａ３０３１８６３
Ｓａｃｋｅｔｔ，Ｓ．Ｄ．，Ｔｒｅｍｍｅｌ，Ｄ．Ｍ．，Ｍａ，Ｆ．，Ｆｅｅｎｅｙ，Ａ．Ｋ．，Ｍａｇｕｉｒｅ，Ｒ．Ｍ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｍ．Ｅ．，．．．Ｏｄｏｒｉｃｏ，Ｊ．Ｓ．（２０１８）．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ａｎｄ ｄｅｌｉｐｉｄｉｚｅｄ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，８（１），１０４５２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１８－２８８５７－
Ｓａｌｄｉｎ，Ｌ．Ｔ．，Ｃｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｃ．，Ｖｅｌａｎｋａｒ，Ｓ．Ｓ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｌ．Ｊ．，＆Ｂａｄｙｌａｋ，Ｓ．Ｆ．（２０１７）．Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｒｏｍ ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，４９，１－１５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２０１６．１１．０６８
Ｓａｗｋｉｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｏｗｅｎ，Ｗ．，Ｄｈａｄｄａ，Ｐ．，Ｍａｒｋｉｄｅｓ，Ｈ．，Ｓｉｄｎｅｙ，Ｌ．Ｅ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ａ．Ｊ．，．．．Ｗｈｉｔｅ，Ｌ．Ｊ．（２０１３）．Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ ａｎｄ ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ｂｏｎｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，９（８），７８６５－７８７３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２０１３．０４．０２９
Ｓｅｉｆ－ｎａｒａｇｈｉ，Ｓ．Ｂ．，Ｈｏｒｎ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｐ－ｍａｇｏｆｆｉｎ，Ｐ．Ｊ．，＆Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，Ｋ．Ｌ．（２０１２）．Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｈｅｐａｒｉｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，８（１０），３６９５－３７０３．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２０１２．０６．０３０
Ｓｉｎｇｅｌｙｎ，Ｊ．Ｍ．，＆Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，Ｋ．Ｌ．（ｎ．ｄ．）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃａｆｆｏｌｄ，７３１－７３８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｍａｂｉ．２０１０００４２３
Ｔｅｄｄｅｒ，Ｍ．Ｅ．，Ｌｉａｏ，Ｊ．，Ｐｈ，Ｄ．，Ｗｅｅｄ，Ｂ．，Ｓｔａｂｌｅｒ，Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，．．．Ｐｈ，Ｄ．（２００９）．Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ｆｏｒ Ｈｅａｒｔ Ｖａｌｖｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１５（６）．
Ｕｎｇｅｒｌｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｌ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｔ．Ｄ．，Ｒａｏ，Ｎ．，＆Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，Ｋ．Ｌ．（２０１５）．Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ｓｋｅｌｅｔａｌ ａｎｄ ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８４，５３－５９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｙｍｅｔｈ．２０１５．０３．０２４
Ｖｉｓｓｅｒ，Ｊ．（ｎ．ｄ．）．Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋａｂｌｅ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，Ｍｅｎｉｓｃｕｓ ａｎｄ Ｔｅｎｄｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ，１－３４．
Ｗａｎｇ，Ｂ．，Ｂｏｒａｚｊａｎｉ，Ａ．，Ｔａｈａｉ，Ｍ．，ｄｅ Ｊｏｎｇｈ Ｃｕｒｒｙ，Ａ．Ｌ．，Ｓｉｍｉｏｎｅｓｃｕ，Ｄ．Ｔ．，Ｇｕａｎ，Ｊ．，．．．Ｌｉａｏ，Ｊ．（２０１０）．Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ ｐａｔｃｈ ｗｉｔｈ ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｓｃａｆｆｏｌｄ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｔ Ａ，９９９９Ａ，ＮＡ－ＮＡ．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｊｂｍ．ａ．３２７８１
Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｂａｏ，Ｊ．，Ｗｕ，Ｑ．，Ｚｈｏｕ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｗｕ，Ｘ．，．．．Ｂｕ，Ｈ．（２０１５）．Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｗｈｏｌｅ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｋｉｄｎｅｙ ｆｏｒ ｕｓｅ ａｓ ａ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｓｃａｌｅ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｅｎｇｒａｆｔｓ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２２（１），４８－６１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／ｘｅｎ．１２１４１
Ｗｏｌｆ，Ｍ．Ｔ．，Ｄａｌｙ，Ｋ．Ａ．，Ｂｒｅｎｎａｎ－Ｐｉｅｒｃｅ，Ｅ．Ｐ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ａ．，Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｃ．Ａ．，Ｄ’Ａｍｏｒｅ，Ａ．，．．．Ｂａｄｙｌａｋ，Ｓ．Ｆ．（２０１２）．Ａ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ｄｅｒｍａｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３３（２９），７０２８－７０３８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１２．０６．０５１
Ｗｕ，Ｊ．，Ｄｉｎｇ，Ｑ．，Ｄｕｔｔａ，Ａ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．，Ｗｅｎｇ，Ｈ．，．．．Ｈｏｎｇ，Ｙ．（２０１５）．Ａｎ ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｄｅｒｉｖｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｆｏｒ ｍｅｎｉｓｃｕｓ ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ，１６，４９－５９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｃｔｂｉｏ．２０１５．０１．０２７
Ｘｕ，Ｋ．，Ｋｕｎｔｚ，Ｌ．Ａ．，Ｆｏｅｈｒ，Ｐ．，Ｋｕｅｍｐｅｌ，Ｋ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ａ．，Ｔｕｅｂｅｌ，Ｊ．，．．．Ｂｕｒｇｋａｒｔ，Ｒ．Ｈ．（２０１７）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｎｄｏｎ－ｂｏｎｅ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｗｉｔｈ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ，１２（２），ｅ０１７１５７７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１７１５７７

Claims (22)

1. 脱細胞化生体材料を製造する方法であって、
   －生体組織を集め、処理し、洗浄するステップと、
   －前記生体組織を脱細胞化プロセスに供するステップであって、
   ａ－前記生体組織を、等張性緩衝液を使用して、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、０～２５℃の温度で１～２０分間、１～５回洗浄すること、
   ｂ－前記生体組織を、低張性緩衝液を使用して、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で１～１８時間、インキュベートすること、
   ｃ－前記生体組織を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で５～２４時間、洗剤緩衝液で処理すること、
   ｄ－前記生体組織を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で３０分間～４時間、脱イオン水で洗浄すること、
   ｅ－前記生体組織を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、４～３７℃の温度で５～１５分間、等張性緩衝液で１～５回洗浄すること、
   ｆ－前記生体組織を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、３０～４０℃の温度で３０分間～３時間、ヌクレアーゼ緩衝液とともにインキュベートすること、及び
   ｇ－前記生体組織を、８０～２００ｒｐｍで撹拌しながら、２５～３７℃の温度で最大５分間、キレート化剤を含む生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１～２回洗浄することを含む、生体組織を脱細胞化プロセスに供するステップと、
   －前記脱細胞化生体材料を、汚染除去及び／又は滅菌プロセスに供するステップと、を含む、方法。
2. 前記生体組織が、眼の結合組織、好ましくは、ブタ、ウシ、ウサギ、又はヒト起源の強膜に由来する、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（ａ）～（ｇ）における前記撹拌が、９０～１９０ｒｐｍの範囲である、請求項１に記載の方法。
4. ステップ（ａ）～（ｅ）の前記等張性緩衝液が、１０～１００ｍＭのＴＲＩＳ及び１００～２００ｍＭのＮａＣｌで構成される緩衝化ＴＲＩＳ生理食塩液（ＴＢＳ）である、請求項１に記載の方法。
5. ステップ（ｂ）の前記低張性緩衝液が、５～２０ｍＭのＴＲＩＳ、０．０５～１％ｗ／ｖのＥＤＴＡを含み、ｐＨ６～８である、請求項１に記載の方法。
6. ステップ（ｃ）の前記洗剤緩衝液が、５～２０ｍＭのＴＲＩＳ、０．０５～１％ｗ／ｖのＥＤＴＡ及び０．０５％～２％ｗ／ｖのＳＤＳを含む、請求項１に記載の方法。
7. ステップ（ｆ）の前記ヌクレアーゼ緩衝液が、１０～５０ｍＭのＴＲＩＳ、２～１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１～８０Ｕ／ｍＬのＤＮＡｓｅ、及び／又は０．０５～８０Ｕ／ｍＬのＲＮＡｓｅを含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記ステップ（ｄ）が、全時間の半分で少なくとも１回の洗浄水交換を含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記方法が、大規模製造のための半自動化された方式で実施することができ、好ましくは、ステップ（ａ）～（ｇ）をバイオリアクター内で実施することができる、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記脱細胞化生体材料の前記汚染除去ステップが、少なくとも１つの抗生物質及び／又は抗真菌薬の使用を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 少なくとも１つの抗生物質及び／又は抗真菌薬を使用して前記脱細胞化生体材料を汚染除去する前記ステップが、
    ｉ－前記脱細胞化生体材料を滅菌生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で少なくとも１回洗浄することと、
    ｉｉ－抗生物質及び／又は抗真菌薬の濃縮溶液を含有する滅菌生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に前記脱細胞化生体材料を浸漬することと、
    ｉｉｉ－前記溶液中に前記脱細胞化生体材料を浸漬したまま、２～８℃の温度で約３６～６０時間維持することと、
    ｉｖ－前記脱細胞化滅菌生体材料を滅菌生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で少なくとも１回洗浄することと、を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記抗生物質及び／又は抗真菌薬の濃縮溶液が、抗生物質作用を有する少なくとも１つの化合物と、抗真菌作用を有する少なくとも１つの化合物と、を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 前記脱細胞化生体材料の前記滅菌ステップが、エチレンオキシド又はガンマ線の使用を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記方法が、好ましくは汚染除去ステップの後かつ前記滅菌ステップの前に行うことができる脱水ステップをさらに含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記脱水ステップが、前記脱細胞化生体材料又は前記脱細胞化され汚染除去された生体材料を脱水プロセスに供することを含み、前記脱水プロセスにおいて、前記生体材料が、増加する濃度のアルコールとともにインキュベートされ、好ましくは、前記アルコール濃度が、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、最大１００％体積／体積まで増加し、前記生体材料が、いわゆる前記アルコール濃度の各々において少なくとも３時間インキュベートされる、請求項１４に記載の方法。
16. 前記方法が、前記脱水された生体材料の再水和ステップをさらに含んでもよく、前記方法が、前記脱水された生体材料を、水、アルコール、水若しくはアルコール可溶性物質、栄養素、代謝産物、成長因子、シグナル伝達分子、調節分子、ホルモン、医薬、及び／又は薬学的に活性な化合物からなる群から選択される少なくとも１つの物質とともに約２０～４０分間インキュベートすることを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 請求項１～１６のいずれか一項に定義される方法によって製造され、生物起源の脱細胞化細胞外マトリックスを含み、前記マトリックスが、主にコラーゲンＩ型、ＩＩＩ型、及びエラスチン線維を含む、脱細胞化生体材料。
18. 水若しくはアルコール可溶性物質、栄養素、代謝産物、成長因子、シグナル伝達分子、調節分子、ホルモン、医薬、及び／又は薬学的に活性な化合物からなる群から選択される活性物質をさらに含む、請求項１７に記載の生体材料。
19. 活性物質の足場、補綴物、又は担体として、それを必要とする個体において使用するためのものである、請求項１７又は１８に記載の生体材料。
20. 組織修復及び／又は再生プロセス、好ましくは、骨組織、軟骨組織、関節、腱、皮膚に使用するためのものであるか、インプラント学並びに／又は口腔及び顎顔面外傷学における補綴目的のためのものであるか、外科的充填及び／又は解剖学的矯正のためのものであるか、あるいは補綴物の製造において使用するためのものである、請求項１９に記載の脱細胞化生体材料。
21. 足場の製造における、補綴物の製造における、及び／又は全身放出若しくは局所放出のための物質の担体の製造を、それを必要とする個体において行うことに使用のためのものである、請求項１又は１６に記載の方法によって製造される生体材料の使用。
22. 組織修復及び／又は再生プロセス、好ましくは、骨組織、軟骨組織、関節、腱、皮膚に使用するためのものであるか、インプラント学並びに／又は口腔及び顎顔面外傷学における補綴目的のためのものであるか、外科的充填及び／又は解剖学的矯正のためのものであるか、あるいは補綴物の製造において使用するためのものである、請求項２１に記載の使用。
    
    

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