JP2023516149A - コロナウイルスワクチン - Google Patents

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Abstract

本発明は、感染性弱毒化生フラビウイルスの配列を含むポリヌクレオチドに関し、ここで、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、キメラウイルスが発現されるように配置されている。

Description

本発明は、１つ以上の抗原を含むキメラフラビウイルスと、そのＤＮＡワクチンとに関する。
２０１９年１２月の発見以来、今では重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）として知られる新規のコロナウイルスが、あらゆる大陸で人々に感染している。一方で、新規のＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の配列はシーケンシングされている。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び他のコロナウイルスに対する防御免疫は、ウイルススパイク（Ｓ）タンパク質を標的とする中和抗体（ＮＡｂ）に依存すると考えられている。特に、Ｎ末端Ｓ１ドメインに特異的なＮＡｂ（アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体結合ドメインを含有する）は、いくつかの動物モデルにおいてウイルス感染を予防することが以前に示されている。
黄熱病１７Ｄ（ＹＦ１７Ｄ）は２つのヒトワクチンにおいてベクターとして使用される。Ｉｍｏｊｅｖワクチンとは、ＹＦ１７Ｄのエンベロープタンパク質をコードするｃＤＮＡを、弱毒化日本脳炎ウイルス（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ：ＪＥＶ）株ＳＡ１４－１４．２のもので置き換えることによって開発された、組換えキメラウイルスワクチンである。Ｄｅｎｇｖａｘｉａワクチンは、ＹＦ１７Ｄ株ワクチンの前膜（ｐｒｅ－ｍｅｍｂｒａｎｅ）及びエンベロープ構造遺伝子を、デングウイルス１、２、３及び４血清型由来のもので置き換えることによって作製された、生弱毒化四価キメラである。
特許文献１にはＹＦＶ－１７ＤワクチンのｃＤＮＡを含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）が記載されており、ここでは、異種タンパク質をコードするｃＤＮＡを、Ｅ遺伝子とＮＳ１遺伝子との間などのＢＡＣ内のｃＤＮＡ ＹＦＶ－１７Ｄへ、Ｃ遺伝子へ、又はＹＦＶ－１７Ｄ ｃＤＮＡの非翻訳領域へ挿入することができる。
特許文献２には、フラビウイルスカプシドタンパク質のＮ末端部分、免疫原性タンパク質、又は免疫原性ペプチド及び２Ａ開裂ペプチドを含むそれらの一部をコードする配列が先行する、フラビウイルスの配列を含むＢＡＣなどのポリヌクレオチドが記載されている。
国際公開第２０１４／１７４０７８号公報 国際公開第２０１９／０６８８７７号公報
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスに対する予防的又は治療的ワクチンの必要性が高まっている。
爆発的に拡大しているＣＯＶＩＤ－１９のパンデミックにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の無制限の拡散を止めるための、安全、効果的、かつ速効性のワクチンの開発が促される。近年開発されたいくつかの有望なワクチンプラットフォームは、ＣＯＶＩＤ－１９に対する迅速な緊急応答のために活用されている。
本発明者らは、大きな抗原が、ＹＦ１７Ｄなどの感染性弱毒化生フラビウイルスの配列を含むポリヌクレオチドの一部として有効な方法で発現され得ることと、そのようなキメラウイルスが、ワクチン接種目的で使用するには充分に安定していることとを初めて見出した。したがって本発明は、コロナウイルスのスパイクタンパク質などの、大きな抗原を含むＹＦ１７Ｄなどの感染性弱毒化生フラビウイルスに基づく有効なワクチンを提供する。
本発明者らは更に、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１ユニット及びＳ２ユニットの両方をコードするヌクレオチド配列が挿入されている（すなわち、配置されている）、ＹＦ１７Ｄなどの感染性弱毒化生フラビウイルスのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、該コロナウイルスに対する有効かつ安定なワクチンを確実にすることを見出した。そのようなワクチン、特に、コロナウイルススパイクタンパク質の開裂不可能な形態をコードするワクチンにより、単回投与のみで、インビボにて予想外に高い免疫原性及び有効性を得ることが可能となる。更に、そのようなワクチンはまた、優れた安全性プロファイルを有する。
例えば本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原の融合前（ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ）形態を発現させるために、弱毒化ＹＦ１７Ｄ生ワクチンをベクターとして採用した。マウスにおいて、Ｓ１／２開裂部位が本明細書において「ＹＦ－Ｓ０」又は「構築物２」とも称される、Ｓ１及びＳ２サブユニット中のＳタンパク質のタンパク質分解プロセシングを妨げるように変異している、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含むワクチン候補は、高レベルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体と、好ましいＴｈ１細胞媒介性免疫応答とを誘導する。ストリンジェントなハムスターＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジモデルにおいて、ワクチン候補であるＹＦ－Ｓ０は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を予防する。更に、単回投与は、ほとんどのワクチン接種動物において、１０日以内であっても肺疾患からの防御を与える。より詳細には、比較的低い皮下用量のＹＦ－Ｓ０によるマカクのワクチン接種は、高いＮａｂ力価への迅速な血清転換をもたらした。これらの結果は、少なくともＹＦ－Ｓ０は、強力なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン候補であることを示している。
第１の態様は、感染性弱毒化生フラビウイルスのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列が、該ポリヌクレオチドからのキメラウイルスの発現を可能にするように配置されている、ポリヌクレオチドを提供する。
特定の実施形態では、Ｓ１／Ｓ２開裂部位をコードするヌクレオチド配列が変異しており、それによって、Ｓ１及びＳ２サブユニットにおけるＳタンパク質のタンパク質分解プロセシングが妨げられている。
特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、フラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３´と、フラビウイルスのＮＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５´と、に配置されている。
特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイクタンパク質のシグナルペプチド又はシグナルペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列を含まず、好ましくは、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくともＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイクタンパク質のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の最初の３９ヌクレオチドを含まない。
特定の実施形態では、更なるフラビウイルスの膜貫通（ＴＭ）ドメインをコードするヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列の３´と、ＮＳ１～ＮＳ５領域のＮＳ１領域の５´と、に配置され、好ましくは、更なるフラビウイルスのＴＭドメインは、ウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ ２：ＷＮＶ－ＴＭ２）である。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５´からコロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列への、ＮＳ１シグナルペプチドをコードする配列を含む。
特定の実施形態では、Ｓ２´開裂部位をコードするヌクレオチド配列は変異しており、それによって、Ｓ２ユニットのタンパク質分解プロセシングが妨げられている。
特定の実施形態では、コロナウイルスは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。
特定の実施形態では、フラビウイルスは、黄熱病ウイルスである。
特定の実施形態では、フラビウイルスは、黄熱病１７Ｄ（ＹＦ１７Ｄ）ウイルスである。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択される配列を含み、好ましくは配列番号５によって定義される配列を含む。
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。
更なる態様は、本明細書で教示されたポリヌクレオチドによってコードされる、感染性弱毒化キメラ生フラビウイルスを提供する。
更なる態様は、本明細書で教示されたポリヌクレオチド又は本明細書で教示されたキメラウイルスと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物であって、好ましくは医薬組成物が、ワクチンである、医薬組成物を提供する。
更なる態様は、医薬品として使用するためであって、好ましくは医薬品がワクチンである、本明細書で教示されたポリヌクレオチド、本明細書で教示されたキメラウイルス、又は本明細書で教示された医薬組成物を提供する。
更なる態様は、コロナウイルス感染症、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防で使用するための、本明細書で教示されたポリヌクレオチド、本明細書で教示されたキメラウイルス、又は本明細書で教示された医薬組成物を提供する。
更なる態様は、コロナウイルス感染症に対するワクチンを調製するインビトロ方法であって、以下の工程：
（ａ）ＢＡＣを提供する工程であって、ＢＡＣが
細菌細胞当たり１０コピーを超える該ＢＡＣの増幅のための誘導可能な細菌複製起点配列と、
本明細書で教示されたポリヌクレオチドを含むキメラウイルスのｃＤＮＡを含み、並びに哺乳動物細胞における該ウイルスｃＤＮＡの転写のため、及び感染性ＲＮＡウイルスへの転写ＲＮＡのプロセシングのためのシス調節エレメントを含む、ウイルス発現カセットと、
を含む、工程、
（ｂ）哺乳動物細胞を工程（ａ）のＢＡＣでトランスフェクトし、感染細胞を継代培養する工程、
（ｃ）病原性と、抗体を産生し、コロナウイルス感染に対する防御を誘導する能力と、について、工程（ｂ）のトランスフェクト細胞の複製ウイルスを検証する工程、
（ｄ）ベクターへ工程（ｃ）で検証されたウイルスをクローニングし、ベクターをワクチン製剤へと製剤化する工程、
を含む、方法を提供する。
特定の実施形態では、ベクターはＢＡＣであって、ＢＡＣが細菌細胞当たり１０コピーを超える該ＢＡＣの増幅のための誘導可能な細菌複製起点配列を含む。
ワクチン設計及び抗原性。（Ａ）ＹＦ１７Ｄ系ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン候補（ＹＦ－Ｓ）の概略図。ＹＦ－Ｓ１／２はＳタンパク質の天然の開裂可能な後融合形態（Ｓ１／２）を発現し、ＹＦ－Ｓ０は開裂不可能な前融合立体配座（Ｓ０）を発現し、ＹＦ－Ｓ１はＳタンパク質のＳ１サブユニットを含有するＮ末端（受容体結合ドメイン）を発現する。ワクチン設計における分子の詳細については、方法の節を参照されたい。（Ｂ）ＹＦ１７Ｄと比較した、ＢＨＫ－２１細胞上の異なるＹＦ－Ｓワクチン構築物からのプラーク表現型の代表的な写真。（Ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原及びＹＦ１７Ｄを染色する異なるＹＦ－Ｓワクチン構築物による、感染３日後のＢＨＫ－２１細胞の共焦点免疫蛍光画像（白色スケールバー：２５μｍ）。（Ｄ）異なるＹＦ－Ｓワクチン候補による、ＢＨＫ－２１細胞の形質導入後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ１／２、Ｓ０、及びＳ１）抗原及びＳＡＲＳスパイク発現の免疫ブロット分析。分析の前に、細胞溶解物をペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）で処理して、それらのグリコシル化を除去するか、又は未処理のままにした（黒い矢印－Ｓのグリコシル化形態；白い矢印－脱グリコシル化形態）。 ＹＦ－Ｓワクチン候補の弱毒化。（Ａ）シャム（ｎ＝１０）又はＹＦ１７Ｄ（ｎ＝９）と比較して、ワクチン候補であるＹＦ－Ｓ１／２（ｎ＝８）、ＹＦ－Ｓ０（ｎ＝８）、ＹＦ－Ｓ１（ｎ＝８）の１００プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ－ｆｏｒｍｉｎｇ－ｕｎｉｔ：ＰＦＵ）による、頭蓋内（ｉ．ｃ．）接種後の乳飲みＢａｌｂ／ｃマウスの生存曲線（最大２１日間）。（Ｂ）ＹＦ１７Ｄ（１、１０、及び１０２ＰＦＵブラック及びグレー）と比較して、ＹＦ－Ｓ０（１０２、１０３、及び１０４ＰＦＵ）の用量範囲による腹腔内（ｉ．ｐ．）接種後のＡＧ１２９マウスの生存曲線（最大２１日間）。群間の統計学的有意性をログランク・コックス・マンテル検定によって計算した（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 ハムスターにおけるＹＦ－Ｓワクチン候補の免疫原性及び防御の有効性。（Ａ）ワクチン接種及びチャレンジスケジュールの概略図。シリアンハムスターを、ＹＦ－Ｓ１／２（ｎ＝１２）、ＹＦ－Ｓ０（ｎ＝１２）、ＹＦ－Ｓ１（ｎ＝１２）、シャム（白色、ｎ＝１２）、又はＹＦ１７Ｄ（灰色、ｎ＝１２）であるワクチン構築物の各１０３ＰＦＵで、０日目及び７日目に２回、腹腔内免疫化した（２回の独立した実験）。その後、動物に２×１０５組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内接種し、４日間追跡した。（Ｂ～Ｄ）体液性免疫応答。異なるワクチン候補でワクチン接種したハムスターにおける、中和抗体（ｎＡｂ）（Ｂ）及び総結合ＩｇＧ（ｂＡｂ）（Ｃ）（両実験においてワクチン接種後２１日目に収集した血清；各３匹の動物の血清のミニプールを、ｂＡｂの定量のために分析し、各３匹の動物の血清のミニプールを、ｂＡｂの定量のために分析した）。（Ｄ）ＹＦ－Ｓ１／２及びＹＦ－Ｓ０によるワクチン接種後の指定日における血清転換率（各時点で検出可能なｂＡｂを有する動物の数を参照する）。（Ｅ、Ｆ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症からの防御。鼻腔内感染から４日後のハムスターの肺におけるウイルス負荷を、ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｅ）及びウイルス力価測定（Ｆ）によって定量した。ウイルスＲＮＡレベルを肺で決定し、β－アクチンに対して正規化し、シャムワクチン接種ハムスターの中央値と比較して、２（－ΔΔＣｑ）法を用いて倍率変化を計算した。肺における感染性ウイルス負荷は、肺組織１００ｍｇ当たりの感染性ウイルス粒子の数として表される。（Ｇ）既往反応。チャレンジ前及びチャレンジ４日後のｎＡｂのレベルの比較。個々の動物における応答のペアワイズ比較については、図１１Ｃ及び図１１Ｄを参照されたい。点線は、示される通り、定量下限（ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＬＯＱ）又は検出下限（ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＬＬＯＤ）を示す。示されるデータは中央値±四分位範囲（ＩＱＲ）である。群間の統計的有意性は、ノンパラメトリック分散分析、未補正ダン検定によるクラスカル・ウォリス検定（Ｂ～Ｆ）、又はノンパラメトリック両側ウィルコクソンの符号順位検定（Ｇ）によって計算した（ｎｓ＝非有意、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 ＹＦ－Ｓワクチン接種ハムスターにおける肺疾患からの防御。（Ａ）罹患した（シャムワクチン接種及び感染）ハムスター、並びにＹＦ－Ｓ０ワクチン接種及びチャレンジを受けたハムスターの肺の、代表的なヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）画像。血管周囲浮腫（矢印Ｂ）；気管支周囲炎症（矢印Ｒ）；血管周囲炎症（矢印Ｇ）；気管支肺炎（円）、気管支壁におけるアポトーシス小体（矢印Ｒ）。（Ｂ）シャム（灰色）に対して正規化された肺損傷の徴候（血管周囲浮腫、気管支肺炎、血管周囲炎症、気管支周囲炎症、血管炎、肺胞内出血、及び気管支壁のアポトーシス小体）についての、病理組織学的スコアを示すクモのスパイダープロット。黒色スケールバー：肺疾患の１００μｍ（Ｃ～Ｄ）マイクロＣＴ由来分析。肺の異なる位置における５つの横断面を各動物について選択し、スコア化して、肺の硬化を定量化するか（Ｃ）、又は肺硬化を反映する機能的バイオマーカとして非通気肺容積（ｎｏｎ－ａｅｒａｔｅｄ ｌｕｎｇ ｖｏｌｕｍｅ：ＮＡＬＶ）を定量化するために使用した（Ｄ）。（Ｅ）非処置非感染対照（ｎ＝４）と比較した、４日間のｐ．ｉ．でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後のシャム又はＹＦ－Ｓ－ワクチン接種ハムスターの肺における、選択された抗ウイルス、炎症誘発性、及びサイトカイン遺伝子の差次的発現を示すヒートマップ（処置群当たりｎ＝１２）（スケールは対照に対する倍率変化を表す）。ＲＮＡレベルを肺抽出物に対するＲＴ－ｑＰＣＲによって決定し、β－アクチンｍＲＮＡレベルについて正規化し、２（－ΔΔＣｑ）法を用いて非感染対照の中央値に対する倍率変化を計算した。（Ｆ）データが非処置非感染対照の中央値に対する中央値±ＩＱＲとして提示されている、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、ＩＰ－１０、インターフェロンラムダ（ＩＦＮ－λ）、及びＭＸ２のｍＲＮＡレベルの個々の発現プロファイル。全ての対照動物が検出不能なＲＮＡレベルを有したＩＦＮ－λについて、検出可能な最低値（ｌｏｗｅｒ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＬＬＯＤ－検出下限；点線）にわたって倍率変化を計算した。条件間の統計的有意性は、ノンパラメトリック分散分析、未補正ダン検定によるクラスカル・ウォリス検定によって計算した（ｎｓ＝有意でない、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 マウスにおいてＹＦ－Ｓワクチン候補によって誘発された体液性免疫応答。（Ａ）免疫化及びチャレンジスケジュールの概略図。Ｉｆｎａｒ－／－マウスに、５つの群である構築物ＹＦ－Ｓ１／２（ｎ＝１１）、ＹＦ－Ｓ０（ｎ＝１１）、ＹＦ－Ｓ１（ｎ＝１３）、シャム（白色、ｎ＝９）又はＹＦ１７Ｄ（灰色、ｎ＝９）で、０日目及び７日目に各々４００ＰＦＵにより２回ｉ．ｐ．ワクチン接種した。（Ｂ、Ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体レベル。ワクチン接種後２１日目のｎＡｂ（Ｂ）及びｂＡｂ（Ｃ）の力価。３匹の動物の血清のミニプールを、各々ｂＡｂの定量のために分析した）。（Ｄ）血清転換率。ＹＦ－Ｓ１／２及びＹＦ－Ｓ０によるワクチン接種後の指定日における確率（各時点で検出可能なｂＡｂを有する動物の数を参照する）。ｂＡｂの定量のために、各２～３匹の動物の血清のミニプールを分析した。点線は定量下限（ＬＬＯＱ）又は検出下限（ＬＬＯＤ）を示す。（Ｅ）ＹＦ－Ｓ１／２及びＹＦ－Ｓ０に対するＩｇＧ。ＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ２ｃの比（各２～３匹の動物のミニプールについて決定）をプロットし、Ｔｈ１応答とＴｈ２応答との間の理論的限界と比較した（点線は、ＩｇＧ１比１に対するＩｇＧ２ｂ／ｃを示す）。示されるデータは、３つの独立したワクチン接種実験からの中央値±ＩＱＲである（各条件についてｎ＞９）。群間の統計的有意性は、ノンパラメトリック分散分析、未補正ダン検定によるクラスカル・ウォリス検定（Ｂ～Ｃ）、又はパラメトリック１標本ｔ検定（Ｄ）によって計算した（ｎｓ＝有意でない、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 マウスにおけるＹＦ－Ｓワクチン候補の細胞媒介性免疫（ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ：ＣＭＩ）応答。スパイク特異的Ｔ細胞応答を、シャム（白色）又はＹＦ１７Ｄ（灰色）と比較して、ＹＦ－Ｓ１／２、ＹＦ－Ｓ０、ＹＦ－Ｓ１による初回（すなわち、追加免疫の２週間後）免疫化から２１日後にｉｆｎａｒ－／－マウスから単離した脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔ及び細胞内サイトカイン染色（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ：ＩＣＳ）によって分析した。（Ａ）ＥＬＩＳｐｏｔによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＭＩ応答の定量的評価。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクペプチドプールで刺激した後の脾細胞１０６個当たりのＩＦＮ－γ分泌細胞のスポット数。（Ｂ）ＹＦ－Ｓワクチン接種によって誘導される転写プロファイル。スパイクペプチド刺激脾細胞のＲＴ－ｑＰＣＲ分析によって決定された転写因子（ＴＢＸ２１、ＧＡＴＡ３、ＲＡＲ関連オーファン受容体Ｃ（ＲＡＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃ：ＲＯＲＣ）、フォークヘッドボックスタンパク質Ｐ３（ｆｏｒｋｈｅａｄ ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ３：ＦＯＸＰ３））のｍＲＮＡ発現レベル（ｎ＝５～７／条件）。グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡレベルについてデータを正規化し、２（－ΔΔＣｑ）法を用いて非感染対照の中央値に対する倍率変化を計算した。（Ｃ～Ｆ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクペプチドプールで刺激した後の、ＣＤ８を発現するＩＦＮ－γ（Ｃ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）（Ｄ）並びにＣＤ４（Ｅ）及びγ／δ（Ｆ）Ｔ細胞を発現するＩＦＮ－γの割合。全ての値は、対応する非刺激対照試料中の陽性細胞のスポット／割合を減算することによって正規化された。示されるデータは中央値±ＩＱＲである。群間の統計的有意性は、ノンパラメトリック分散分析、未補正ダン検定によるクラスカル・ウォリス検定によって計算した（ｎｓ＝有意でない、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。（Ｇ、Ｈ）ｔ－ＳＮＥ分析による、ＹＦ－Ｓ１／２及びＹＦ－Ｓ０ワクチン接種マウスからのＣＤ８ Ｔ細胞のプロファイリング。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクペプチドプールで一晩刺激した後の、ＹＦ－Ｓ１／２又はＹＦ－Ｓ０（群当たりｎ＝６）で免疫化したｉｆｎａｒ－／－マウスの脾細胞からの少なくとも１つの細胞内マーカ（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４）についての陽性のスパイク特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）分析。点は、ＩＦＮ－γ発現Ｔ細胞、ＴＮＦ－α発現Ｔ細胞、又はＩＬ－４発現ＣＤ８ Ｔ細胞を示す。（Ｈ）ＹＦ－Ｓ１／２及びＹＦ－Ｓ０ワクチン接種マウス由来のスパイク特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ発現密度のヒートマップ。スケールバーはＩＦＮ－γ発現密度（低発現から高発現）を表す（完全な分析については図１５を参照のこと）。 ＹＦ－Ｓ０リードワクチン候補を用いたハムスターにおける単回注射ワクチン接種。（Ａ）実験の概略図。３群のハムスターに、２つの異なる用量である、チャレンジから２１日前のＹＦ－Ｓ０の１×１０３ＰＦＵ（低、円；ｎ＝８）及び１０４ＰＦＵ（高、三角；ｎ＝８）のシャム（白色；ｎ＝８）又はＹＦ－Ｓ０により、１回のみｉ．ｐ．ワクチン接種した。第４の群に、チャレンジの１０日前に高１０４ＰＦＵ用量のＹＦ－Ｓ０をワクチン接種した（四角；ｎ＝８）。（Ｂ～Ｃ）単回投与ワクチン接種後の体液性免疫応答。チャレンジの直前にワクチン接種されたハムスターから収集された血清中におけるｎＡｂ（Ｂ）及びｂＡｂ（Ｃ）の力価（ｂＡｂの定量かのために分析された、２～３匹の動物の血清のミニプール）。（Ｄ、Ｅ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症からの防御。２回用量ワクチン接種スケジュールについて記載されるように、シャムワクチン接種動物と比較した、ＹＦ－Ｓ０によるワクチン接種後のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるチャレンジからの防御（図３及び図１２）；それぞれＲＴ－ｑＰＣＲ及びウイルス滴定によって決定された、４日間のｐ．ｉ．でのワクチン接種ハムスターの肺におけるウイルスＲＮＡレベル（Ｄ）及び感染性ウイルス量（Ｅ）の、ワクチン接種したシャムと比較したｌｏｇ１０倍率変化。点線は、示される通り定量下限（ＬＬＯＱ）又は検出下限（ＬＬＯＤ）を示す。示されるデータは中央値±ＩＱＲである。群間の統計的有意性は、ノンパラメトリック分散分析、未補正ダン検定によるクラスカル・ウォリス検定によって計算した（ｎｓ＝有意でない、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 ＹＦ１７Ｄ系ワクチン候補（ＹＦ－Ｓ）の概略図。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク（Ｓ１／２、Ｓ０、又はＳ１）抗原を、ＥＲ（小胞体）に挿入されたＹＦ１７Ｄポリタンパク質（濃灰色）内の翻訳融合としてＥ／ＮＳ１遺伝子間領域に挿入した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原及びＹＦ１７Ｄベクターのポリタンパク質の両方のフォールドのトポロジー的制約に対処するために、１つの余分な膜貫通ドメイン（ウエストナイルウイルスＥタンパク質由来；薄灰色）を、完全長Ｓタンパク質（Ｓ１／２及びＳ０）のＣ末端細胞質ドメインに付加した。同様に、２つの膜貫通ドメインを、構築物ＹＦ－Ｓ１のＳ１サブユニットのＥＲ常在Ｃ末端に融合した。ハサミは、ＹＦ－Ｓ０において欠失されたＳ１／２フリン開裂部位を含む、提示された成熟開裂部位を示す。 ＹＦ－Ｓワクチン候補の弱毒化。（Ａ）シャム（ｎ＝１０、灰色、１）又はＹＦ１７Ｄ（ｎ＝９、黒色、２）と比較した、１００ＰＦＵのワクチン候補である、（ｎ＝８）ＹＦ－Ｓ１／２（３）、ＹＦ－Ｓ０（４）、ＹＦ－Ｓ１（５）のｉ．ｃ．接種後の、乳飲みＢａｌｂ／ｃマウスの体重変化（最大２１日間）。（Ｂ）シャム、ＹＦ－Ｓ０又はＹＦ１７Ｄのいずれかの１０２ＰＦＵによる頭蓋内接種から７日後のＢａｌｂ／ｃマウスの代表的な画像。（Ｃ）１０２、１０３、又は１０４ＰＦＵのＹＦ－Ｓ０（４；５；６）、及び１、１０、又は１０２ＰＦＵのＹＦ１７Ｄ（１；２；３；黒及び灰色の円）の用量による、腹腔内接種後のＡＧ１２９マウスの体重変化（最大２１日）。 プラーク減少中和試験（ｐｌａｑｕｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ：ＰＲＮＴ）及び血清中和試験（ｓｅｒｕｍ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ：ＳＮＴ）によって決定されたｎＡｂ力価の相関。（Ａ）７つの血清のパネルについてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＰＲＮＴ）及びｒＶＳＶ－ΔＧ－スパイク（ＳＮＴ）を用いたｎＡｂ力価の相関分析。ピアソン回帰係数が０．７７（Ｐ＝０．０４）である中和アッセイ間の相関を決定するために、ＳＮＴ５０及びＰＲＮＴ５０値をプロットした。（Ｂ）ＳＮＴによって決定した４人の回復期患者の血清中のＮＡｂ。示されるデータは中央値±ＩＱＲである。 ハムスターにおける免疫原性及び防御の有効性。（Ａ）器官におけるウイルスＲＮＡ負荷。ＹＦ－Ｓ１／２、ＹＦ－Ｓ０、又はシャムでワクチン接種し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染によってチャレンジしたハムスターの、脾臓、肝臓、腎臓、心臓、及び回腸におけるウイルスＲＮＡ。ウイルスＲＮＡレベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって決定し、β－アクチンｍＲＮＡレベルに対して正規化し、２（－ΔΔＣｑ）法を用いて計算したシャムワクチン接種動物の中央値に対する倍率変化を得た。（Ｂ～Ｄ）既往反応。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によるチャレンジのから４日後のシャム（白色）又はＹＦ１７Ｄ（黄色）と比較した、ＹＦ－Ｓ１／２、ＹＦ－Ｓ０、ＹＦ－Ｓ１で免疫化したハムスターにおけるＮＡｂ力価（Ｂ）及びｂＡｂ力価（Ｄ）。（Ｃ）免疫化後２１日目（円）及びチャレンジ後４日目（四角）における、収集した血清のｎＡｂ力価のペアワイズ比較。ｂＡｂの定量のために、各３匹の動物の血清のミニプールを分析した。群間の統計的有意性は、ノンパラメトリック分散分析、未補正ダン検定によるクラスカル・ウォリス検定（Ａ、Ｂ、及びＤ）、又はノンパラメトリックなウィルコクソンの符号順位検定（Ｃ）によって計算した（ｎｓ＝有意でない、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 ５×１０３ＰＦＵ２回投与レジメンを用いたワクチン候補ＹＦ－Ｓ０の免疫原性及び防御の有効性を示す。（Ａ）免疫化及びチャレンジスケジュールの概略図。シリアンハムスターを、ＹＦ－Ｓ０（ｎ＝７）、シャム（白色、ｎ＝３）であるワクチン構築物の各５×１０３ＰＦＵで、０日目及び７日目に２回、腹腔内免疫化した。ワクチン接種後２３日目に、動物に２×１０５ ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を鼻腔内接種し、４日間追跡調査した。（Ｂ）体液性免疫応答。ワクチン接種２１日後のＮＡｂ力価。（Ｃ、Ｄ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症からの防御。鼻腔内感染から４日後のハムスターの肺におけるウイルス負荷を、図３のように、ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｃ）及びウイルス力価測定（Ｄ）によって定量した。点線は、示される通り定量下限（ＬＬＯＱ）又は検出下限（ＬＬＯＤ）を示す。示されるデータは中央値±ＩＱＲである。群間の統計的有意性は、ノンパラメトリック両側マン・ホイットニー検定によって計算した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。 組織学及びマイクロＣＴ画像法による肺の病理。（Ａ）Ｈ＆Ｅ染色した肺切片における肺損傷の徴候（血管炎、気管支周囲炎症、血管周囲炎症、気管支肺炎、血管周囲浮腫、気管支壁のアポトーシス小体、及び肺胞内出血）についての累積病理組織学スコア（点線－シャムワクチン接種群における最大スコア）。（Ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の４日後にワクチン接種したシャム及びＹＦ－Ｓ０の代表的なマイクロＣＴ画像。矢印は肺実質の硬化として見られる肺浸潤物の例を示す（黒色及び白色）。 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後のＲＮＡ発現レベル。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染（図４Ｅのような）の４日後のワクチン接種ハムスター（群当たりｎ＝１２）の肺における１０個の遺伝子の個々の発現プロファイルは、非感染対照と比較し、ｌｏｇ１０倍率変化として示された（ｎ＝４）。個々のｍＲＮＡのレベルをＲＴ－ｑＰＣＲによって決定し、β－アクチンｍＲＮＡについて正規化した。変化は、２（－ΔΔＣｑ）法を用いて計算した非感染対照の中央値を超える値として報告する。全ての対照動物が検出不能なＲＮＡレベルを有したＩＦＮ－λについてのみ、検出可能な最低値にわたって倍率変化を計算した。データは中央値±ＩＱＲとして提示した。ＬＬＯＤ－検出下限（点線）。シャムワクチン接種動物と比較した統計的有意性を、ノンパラメトリック分散分析、未補正ダン検定によるクラスカル・ウォリス検定によって計算した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。 ｔ－ＳＮＥ分析によるＹＦ－Ｓ１／２、ＹＦ－Ｓ０、及びシャムワクチン接種マウス由来のＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞のプロファイリング。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクペプチドプール（ＩＦＮ－γ発現Ｔ細胞－ＴＮＦ－α発現Ｔ細胞－ＩＬ－４発現Ｔ細胞；黄色－ＩＬ１７Ａ発現Ｔ細胞）で一晩刺激した後の、ＹＦ－Ｓ１／２、ＹＦ－Ｓ０、及びシャムワクチン接種ｉｆｎａｒ－／－マウス（群当たりｎ＝６）の脾細胞からの少なくとも１つの細胞内マーカ（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、又はＩＬ１７Ａ）について陽性のスパイク特異的ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞のｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）分析の完全表示。ＦｌｏｗＪｏを用いて、全ての動物由来のスパイク特異的ＣＤ８（上のパネル）又はＣＤ４Ｔ細胞（下のパネル）を最初に連結することによって生成された、ｔ－ＳＮＥプロット。 細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）のための逐次ゲーティング戦略。最初に、Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（ＺＡ）陽性事象及び低順方向散乱（ＦＳＣ）事象をゲーティングアウトすることによって、生細胞を選択した。次いで、ＦＳＣ－Ｈ対ＦＳＣ－Ａプロットにおいてダブレットを除去した。Ｔ細胞（ＣＤ３陽性）を、γδＴ細胞（γδＴＣＲ＋）、ＣＤ４Ｔ細胞（γδＴＣＲ－／ＣＤ４＋）、及びＣＤ８Ｔ細胞（γδＴＣＲ－／ＣＤ８＋）に層別化した。細胞内マーカについて陽性集団及び陰性集団を定義する境界を、非刺激対照試料に基づいて設定した。 ハムスター及びマウスにおいてＹＦによって誘発された体液性免疫応答。（Ａ～Ｂ）異なるワクチン候補でワクチン接種したハムスター（Ａ）及びｉｆｎａｒ－／－マウス（Ｂ）における中和抗体（ｎＡｂ）（両方の実験において、ワクチン接種後２１日目に血清を収集した（２回用量ワクチン接種スケジュール）。（Ｃ）ＥＬＩＳｐｏｔによるＹＦ１７Ｄ特異的細胞媒介性免疫応答の定量的評価。ＮＳ４Ｂペプチドで刺激した後の１０６脾細胞当たりのＩＦＮγ分泌細胞のスポット数。点線は、示される通り定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。示されるデータは中央値±ＩＱＲである。群間の統計的有意性は、ノンパラメトリック分散分析、未補正ダン検定によるクラスカル・ウォリス検定によって計算した（ｎｓ＝有意でない、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 組織学による肺の病理。Ｈ＆Ｅ染色した肺切片における肺損傷の徴候（血管炎、気管支周囲炎症、血管周囲炎症、気管支肺炎、血管周囲浮腫、気管支壁のアポトーシス小体）についての累積病理組織学スコア（点線－シャムワクチン接種群における最大スコア）。 マウスにおいてＹＦ－Ｓワクチン候補によって誘発された体液性及び細胞性免疫応答。（Ａ）免疫化及びチャレンジスケジュールの概略図。Ｉｆｎａｒ－／－マウスに、４００ＰＦＵのＹＦ－Ｓ０（ｎ＝９）、シャム（白色、ｎ＝６）、又はＹＦ１７Ｄ（灰色、ｎ＝６）によりｉ．ｐ．で１回ワクチン接種した。（Ｂ、Ｃ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体レベル。ワクチン接種後２１日目のｎＡｂ（Ｂ）及びｂＡｂ（Ｃ）の力価；ｂＡｂの定量のために分析した、２～３匹の動物の血清のミニプール。（Ｄ）ＥＬＩＳｐｏｔによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＭＩ応答の定量的評価。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクペプチドプールで刺激した後の脾細胞１０６個当たりのＩＦＮ－γ分泌細胞のスポット数。データは中央値±ＩＱＲとして提示した。点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）又は検出下限（ＬＬＯＤ）を示す。シャムワクチン接種動物と比較した統計的有意性を、一元配置分散分析、未補正ダン検定によるクラスカル・ウォリス検定によって計算した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。 ハムスター及びマウスにおいてＹＦ－Ｓによって誘発されたＹＦ１７Ｄ特異的体液性免疫応答。（Ａ～Ｂ）異なるワクチン候補でワクチン接種したハムスター（Ａ）及びｉｆｎａｒ－／－マウス（Ｂ）における中和抗体（ｎＡｂ）（両方の実験において、ワクチン接種後２１日目に血清を収集した（２回用量ワクチン接種スケジュール））。（Ｃ）ＥＬＩＳｐｏｔによるＹＦ１７Ｄ特異的細胞媒介性免疫応答の定量的評価。ＹＦ１７Ｄ ＮＳ４Ｂペプチド混合物で刺激した後の１０６脾細胞当たりのＩＦＮγ分泌細胞のスポット数。点線は、示される通り定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。示されるデータは中央値±ＩＱＲである。群間の統計的有意性は、一元配置分散分析、未補正ダン検定によるクラスカル・ウォリス検定によって計算した（ｎｓ＝有意でない、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。 ハムスターにおける単回ワクチン接種後の体液性免疫応答の寿命。（Ａ）中和抗体（ｎＡｂ）力価。（Ｂ）結合抗体価（ｂＡｂ）。 構築物１～７の概略図。 カニクイザルにおける免疫原性及び防御の有効性。１２匹のカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、１０５ＰＦＵのＹＦ－Ｓ０（ｎ＝６）又は適合プラセボ（ｎ＝６）で２回（０日目及び７日目）皮下で免疫化した。ワクチン接種後２１日目に、全てのマカクに１．５×１０４ ＴＣＩＤ５０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をチャレンジさせた。ａ、最初のワクチン接種後の指示された日におけるＮＡｂ。データは中央値±ＩＱＲである。ｂ、ＲＴ－ｑＰＣＲによって定量された示された時点での咽頭スワブにおけるウイルスＲＮＡ負荷量。異なる記号（四角、三角、及び菱形）は、定量下限を超えるウイルスＲＮＡ負荷量で経時的に追跡した個々のマカクの値を示す。肺の組織学的検査（チャレンジ後２１日目）では、ＹＦ－Ｓ０又はプラセボのいずれかをワクチン接種したマカクにおけるいかなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２誘導病理の証拠も明らかにはされなかった。両側未補正クラスカル・ウォリス検定を適用した。 ＢＨＫ－２１細胞における継代培養中のＹＦ－Ｓ０の遺伝的安定性。ａ、ＢＨＫ－２１細胞におけるＹＦ－Ｓ０継代培養の概略図。トランスフェクトされたＢＨＫ－２１細胞から回収されたＹＦ－Ｓ０ワクチンウイルス（Ｐ０）を１回プラーク精製し（Ｐ１）（ｎ＝５プラーク単離株）、増幅し（Ｐ２）、ＢＨＫ－２１細胞上で連続して継代培養した（Ｐ３～Ｐ６）。並行して、１回目のプラーク精製からの各増幅プラーク分離株（Ｐ２）（ｎ＝５）を、２回目のプラーク精製（Ｐ３＊）（ｎ＝２５プラーク単離株）及び増幅（Ｐ４＊）に供した。ｂ、異なる継代培養の上清中に存在する挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＳウイルスＲＮＡ配列の検出に使用される、３つの異なるプライマ対からのタイル化ＲＴ－ＰＣＲアンプリコンの概略図。全てのデータは、単一の代表的な実験からのものである。ｃ、プラーク精製ＹＦ－Ｓ０．の連続継代培養３（Ｐ３）及び６（Ｐ６）から収集したウイルス上清に対して実施したＲＴ－ＰＣＲフィンガープリンティング。ｄ、ＹＦ－Ｓ０のＰ３及びＰ６によるＳ発現の免疫ブロット分析。ｅ、２回目のプラーク精製（Ｐ４＊）からの増幅されたプラーク分離株に対するＲＴ－ＰＣＲフィンガープリンティングであり、２０個の個々の増幅されたプラーク単離株をここに示す（１～２０）。ｃ、ｅ、対照、ＹＦ－Ｓ０ ｃＤＮＡ（０．５ｎｇ）；ラダー、１－ｋｂ ＤＮＡラダー。直接サンガーシーケンシングにより、２５個のプラークのうち２５個（１００％）について、完全長Ｓ挿入の維持が確認された。２回のプラーク精製及び増幅の後、３つの単離株においてのみ、単一の点変異が見出された（２つのサイレント変異及び１つのミスセンス変異がＳ１のＮ末端におけるＳ４７Ｐアミノ酸変化をもたらす）；低い＜１０－４変異頻度（すなわち、合計２５×４，１９６ｎｔ中で観察された３ｎｔの変化＝配列決定された１０４，９００ｎｔ；そのうち、２５×３，７８０ｎｔ＝９４，５００ｎｔはＳ導入遺伝子配列のものであった）。この変異率は、現在のワクチン製造条件１４、７８における親ＹＦ１７Ｄの変異率と同様である。 ＹＦ－Ｓワクチン候補の弱毒化。ａ、１０４ＰＦＵのＹＦ１７Ｄ又はＹＦ－Ｓ０を腹腔内で接種した野生型（ＷＴ）及びＳＴＡＴ２ノックアウト（ＳＴＡＴ２－／－）ハムスターの生存曲線。ＹＦ１７Ｄ（ｎ＝６）及びＹＦ－Ｓ０（ｎ＝６）を接種した野生型ハムスター；ＹＦ１７Ｄ（ｎ＝１４）及びＹＦ－Ｓ０（ｎ＝１３）を接種したＳＴＡＴ２－／－ハムスター。研究終了時点で生存しているハムスターの数を示す。ｂ、ｃ、１０４ＰＦＵ ＹＦ１７Ｄ（ｎ＝６）又はＹＦ－Ｓ０（ｎ＝６）の腹腔内での接種後の野生型ハムスターの、血清中のワクチンウイルスＲＮＡ（ウイルス血症）（ｂ）及び体重変化（ｃ）。接種後の各日にウイルス血症を示したハムスターの数を以下の（ｂ）に示す。ｄ、ＹＦ－Ｓ０、ＹＦ１７Ｄ、及びシャムの０日目及び７日目に各４００ＰＦＵを腹腔内接種した後のＩｆｎａｒ－／－マウスの体重変化。マウスにＹＦ１７Ｄ（ｎ＝５）、ＹＦ－Ｓ０（ｎ＝５）、又はシャム（ｎ＝５）を接種した。ａのデータは２つの独立した実験からのものであり、他のパネルのデータは単一の実験からのものである。 単回投与ワクチン接種後のハムスターにおける免疫原性及び防御の有効性。ａ、ｂ、ハムスター（単回実験から群当たりｎ＝６）に単回用量のＹＦ－Ｓ０（腹腔内に１０４ＰＦＵ）をワクチン接種し、血清をワクチン接種の３、１０、及び１２週間後に収集した。ワクチン接種後の指示された週におけるＮＡｂ（ａ）及び結合抗体（ｂ）。データは中央値±ＩＱＲである。両側未補正クラスカル・ウォリス検定を適用した。 ＹＦ－Ｓ０（ａ）又はプラセボ（ｂ）を用いたマカクにおけるワクチン接種後のＹＦ１７Ｄ特異的免疫応答Ｉマカクａ、ｂ、ＮＡｂ力価（単回実験からの群当たり６匹のマカク）；ワクチン接種後の指示された時間に収集された血清（２回用量ワクチン接種スケジュール；図７）。ｃ、単回投与ワクチン接種スケジュール（２つの独立した実験からのＹＦ－Ｓ０（ｎ＝８）、シャム（ｎ＝５）、及びＹＦ１７Ｄ（ｎ＝５））に従ってワクチン接種したＩｆｎａｒ－／－マウス。ＹＦ１７Ｄ ＮＳ４Ｂペプチド混合物で刺激した後の１０６脾細胞当たりのＩＦＮγ分泌細胞のスポット数。データは中央値±ＩＱＲである。両側未補正クラスカル・ウォリス検定を適用した。 致死性ＹＦ１７Ｄの防御。ａ、Ｉｆｎａｒ－／－マウスを、単回の４００ＰＦＵ腹腔内（ｉ．ｐ．）用量のＹＦ１７Ｄ（黒色）（ｎ＝７）若しくはＹＦ－Ｓ０（ｎ＝１０）、又はシャム（灰色、ｎ＝９）のいずれかによりワクチン接種した。２１日後、マウスを、均一な致死用量の３×１０３ＰＦＵのＹＦ１７Ｄで頭蓋内（ｉ．ｃ．）接種によりチャレンジさせ、体重変化（ｂ）及び生存（ｃ）について監視した。試験終了点（１５日目）における生存マウスの数を示す。データは２つの独立した実験からのものである。 実施例２の構築物の配列。
発明の詳細な説明
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、単数及び複数の指示対象の両方を含む。
本明細書で使用される「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」という用語は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、又は「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、かつ包括的又は拡張可能であり、追加の列挙されていないメンバー、要素、又は方法工程を排除しない。この用語はまた、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を包含し、これらは特許用語において充分に確立された意味を有する。
終点による数値範囲の列挙は、それぞれの範囲内に包摂される全ての数及び分数、並びに列挙された終点を含む。
パラメータ、量、及び持続時間などの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される、「約」又は「およそ」という用語は、開示された発明においてそのような変動が実行されるのに適切である限り、指定された値の＋／－１０％以下、好ましくは＋／－５％以下、より好ましくは＋／－１％以下、更により好ましくは＋／－０．１％以下の変動など、指定された値の変動及び指定された値からの変動を包含することを意味する。修飾語「約」が指す値自体もまた、具体的に、好ましくは開示されていることを理解されたい。
例えば１つ以上のメンバー又はメンバーの群の少なくとも１つのメンバーなどの「１つ以上」又は「少なくとも１つ」という用語は、更なる例示によってそれ自体明確であるが、この用語はとりわけ、当該メンバーのいずれか１つ、又は当該メンバーのいずれか２つ以上、例えば当該メンバーのいずれか３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、若しくは７つ以上など、及び全ての当該メンバーへの言及を包含する。別の例では、「１つ以上」又は「少なくとも１つ」とは、１、２、３、４、５、６、７、又はそれ以上を指し得る。
本明細書における本発明の背景の議論は、本発明の文脈を説明するために含まれる。これは、言及された資料のいずれかが、特許請求の範囲のいずれかの優先日にいずれかの国で、公開された、既知であった、又は共通の一般知識の一部であったことを認めるものと解釈されるべきではない。
本開示を通して、様々な刊行物、特許、及び公開された特許明細書は、特定の引用によって参照される。本明細書で引用される全ての文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書で具体的に言及されるそのような文書の教示又は節は、参照により組み込まれる。
別段の定義がない限り、技術用語及び科学用語を含む本発明の開示において使用される全ての用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。更なる指針によって、本発明の教示をよりよく理解するために、用語定義が含まれる。特定の用語が本発明の特定の態様又は本発明の特定の態様に関連して定義される場合、そのような意味合いは、特に定義されない限り、本明細書全体にわたって、すなわち本発明の他の態様又は実施形態の文脈においても適用されることを意味する。
以下の節では、本発明の異なる態様又は実施形態がより詳細に定義される。そのように定義された各態様又は実施形態は、そうでないことが明確に示されていない限り、任意の他の態様（複数可）又は実施形態（複数可）と組み合わせることができる。特に、好ましい又は有利であると示された任意の特徴は、好ましい又は有利であると示された任意の他の特徴（単数又は複数）と組み合わせることができる。
本明細書を通して「一実施形態」、「実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所における「一実施形態では」又は「実施形態では」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではないが、そうであってもよい。更に、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態では、本開示から当業者に明らかであるように、任意の適切な様式で組み合わせることができる。更に、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが他の特徴を含まず、異なる実施形態の特徴の組合せは、本発明の範囲内であり、当業者によって理解されるように、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲において、特許請求される実施形態のいずれもが、任意の組合せで使用することができる。
本発明者らは、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードし、好ましくはＳ１及びＳ２ユニットをコードするヌクレオチド配列（それらの天然の開裂可能なバージョン又は開裂不可能なバージョンなど）が、当該ポリヌクレオチドからのキメラウイルスの発現を可能にするように挿入されている、感染性弱毒化生フラビウイルスのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスなどのコロナウイルスに対するワクチンの調製で使用され得ることを見出した。Ｓ１及びＳ２ユニットの両方をコードするそのようなワクチンについて、驚くほど高い安全性プロファイル、免疫原性、及び有効性をインビボで得ることができた。
更に、本発明者らは、Ｓ１／２開裂部位を変異させてＳ１及びＳ２サブユニット中のＳタンパク質のタンパク質分解プロセシングを防止することにより、スパイクタンパク質を安定化された開裂不可能な形態に保つことが可能になり、これが、インビボでの強い免疫応答の誘導と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジなどのストリンジェントなコロナウイルスチャレンジに対する保護と、に寄与することを見出した。例えば、本発明者らは、弱毒化生黄熱病１７Ｄ（ＹＦ１７Ｄ）ワクチンをベクターとして使用して、（Ｓ１及びＳ２サブユニットの両方を含む）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原の開裂不可能な融合前形態を発現させた。このようなワクチンは優れた安全性プロファイルを有する。これにより、高齢者個人及び基礎疾患を有する人を含む、リスクのある地域に住む９ヶ月以上の全ての人など、ＣＯＶＩＤ－１９に対して最も脆弱な人にもまたワクチンが好適であることが保証される）。ワクチンはまた、例えば開裂可能な形態のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原を含むワクチンと比較して、優れた免疫原性及び優れた有効性を有する。更に、そのようなワクチンは、全身性ウイルス拡散を効率的に予防し、ＣＯＶＩＤ－１９における疾患増悪に関連したサイトカインの増加を予防し、及び／又は単回投与ワクチン接種によって誘導される免疫に長寿命を提供する。加えて、そのようなワクチンは、開裂可能な形態のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原を含むワクチンと比較した場合などに、著しく低下した神経毒性を有する。したがって、そのようなワクチンは、集団全体の免疫化プログラムに理想的に適している可能性があった。
より具体的には、本発明者らは、ハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、及びカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）で示されたように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原の開裂不可能な融合前形態を発現するそのようなワクチンがインビボで高レベルのＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を誘導し、同時に、黄熱病ウイルスに対する防御免疫を誘導することを示した。更に、そのようなワクチンを用いて、体液性免疫は、本発明者らがマウスにおいてプロファイリングしたように、好ましいＴヘルパー１極性化を有する細胞性免疫応答によって補完される。ハムスターモデル及びマカクでは、そのようなワクチンはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染を予防することが示されている。更に、単回投与は、わずか１０日以内にほとんどのワクチン接種ハムスターにおいて肺疾患からの防御をもたらした。
第１の態様は、感染性弱毒化生フラビウイルスの配列（すなわち、感染性弱毒化生フラビウイルスをコードするヌクレオチド配列）を含むポリヌクレオチドであって、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が、該ポリヌクレオチドからのキメラウイルスの発現を可能にするように挿入される（すなわち、配置される）、ポリヌクレオチドを提供する。したがって、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、キメラウイルスをコードし、感染性弱毒化生フラビウイルスの配列と、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチドと、を含む。
更なる態様は、感染性弱毒化生フラビウイルスの配列（すなわち、感染性弱毒化生フラビウイルスをコードするヌクレオチド配列）を含むポリヌクレオチドであって、少なくとも１０００アミノ酸、少なくとも１１００アミノ酸、少なくとも１２００アミノ酸、又は少なくとも１２５０アミノ酸の抗原をコードするヌクレオチド配列が、該ポリヌクレオチドからのキメラウイルスの発現を可能にするように挿入される（すなわち、配置される）、ポリヌクレオチドを提供する。
本明細書で使用される「挿入された」又は「挿入する」又は「挿入すること」（すなわち、配置される）という用語は、フラビウイルスの構成成分をコードするヌクレオチド配列内における、フラビウイルスの異なる成分を各々コードする２つのヌクレオチド配列の間における、又はフラビウイルスをコードする配列の前（上流）における、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の包含（位置）を指す。本明細書で使用される「間に挿入された」（すなわち、間に配置された）という用語は、好ましくはコロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列がフラビウイルスの構成成分をコードする５´及び３´ヌクレオチド配列を含むように、例えばフラビウイルスの異なる成分をコードする配列（例えば、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ又はＮＳ５）などの、ヌクレオチド配列をコードする他の２つの間に、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が含まれること（配置）を指す。例えば、「間に挿入された」（すなわち、間に配置された）という用語は、Ｅタンパク質とフラビウイルスのＮＳ１タンパク質との間（すなわち、フラビウイルスのＥ／ＮＳ１境界において）への、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチドの挿入（配置）を指すために使用され得る。特定の実施形態では、「挿入された」という用語は、他のヌクレオチド配列（複数可）による１つ以上のヌクレオチド配列の置換を包含しない。
本明細書を通して使用される「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、典型的には、本質的にヌクレオシド単位で構成される任意の長さのポリマー（好ましくは、直鎖ポリマー）を指す。ヌクレオシド単位は、一般に、複素環塩基及び糖基を含む。複素環塩基としては、とりわけ、天然に存在する核酸に広く存在するアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）などのプリン及びピリミジン塩基と、他の天然に存在する塩基（例えば、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン）と、化学的又は生化学的に修飾された（例えば、メチル化）、非天然又は誘導体化塩基と、を挙げることができる。少なくとも１つのリボヌクレオシド単位を含む核酸分子は、典型的には、リボ核酸又はＲＮＡと称され得る。そのようなリボヌクレオシド単位（複数可）は、２´－ＯＨ部分を含み、ここで、－Ｈは、リボヌクレオシド（例えば、メチル、エチル、アルキル、又はアルキルオキシアルキルによって）について当技術分野で公知のように置換されていてもよい。好ましくは、リボ核酸又はＲＮＡは、主にリボヌクレオシド単位から構成されてもよく、例えば、核酸分子を構成するヌクレオシド単位の８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は更には１００％（数順）が、リボヌクレオシド単位であり得る。少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシド単位を含む核酸分子は、典型的には、デオキシリボ核酸又はＤＮＡと称され得る。そのようなデオキシリボヌクレオシド単位（複数可）は、２´－Ｈを含む。好ましくは、デオキシリボ核酸又はＤＮＡは、主にデオキシリボヌクレオシド単位から構成されてもよく、例えば、核酸分子を構成するヌクレオシド単位の８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、又は更には１００％（数順）が、デオキシリボヌクレオシド単位であり得る。ヌクレオシド単位は、とりわけ、天然に存在する核酸に一般的なホスホジエステル結合と、更なる修飾されたリン酸又はホスホネート系結合とを含む、多数の既知のヌクレオシド間結合のいずれか１つによって互いに結合され得る。
用語「核酸」は、更に好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を包含し、具体的には、ｈｎＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、増幅産物、オリゴヌクレオチド、及び合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を包含する。ＲＮＡは、ＲＮＡｉ（阻害性ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（対応するアシル化アミノ酸で荷電又は排出されているかにかかわらず、転移ＲＮＡ）、及びｃＲＮＡ（相補的ＲＮＡ）を含む。核酸は、天然に存在していてもよく、例えば天然に存在又は自然から単離されてもよく、例えば細胞又は組織によって天然に又は内因的に産生されてもよく、場合によりそこから単離されていてもよい。核酸は、組換えであってもよく、すなわち、組換えＤＮＡ技術によって生成されてもよく、及び／又は部分的若しくは完全に、化学的、若しくは生化学的に合成されてもよい。限定されないが、核酸は、好適な宿主又は宿主細胞発現系によって組換え生成され、かつ場合によりそこから単離されてもよく（例えば、好適な細菌、酵母、真菌、植物、又は動物の宿主若しくは宿主細胞発現系）、又は無細胞転写若しくは非生物学的核酸合成によって組換え生成されてもよい。核酸は、二本鎖、部分的に二本鎖、又は一本鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸はセンス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。加えて、核酸は環状又は直鎖状であり得る。
フラビウイルスは、およそ１１，０００ヌクレオチド長の正の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ゲノムは、５´非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ：ＵＴＲ）、長いオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ－ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）、及び３´ＵＴＲを含有する。ＯＲＦは、３つの構造（カプシド［Ｃ］（又はコア）、前駆体膜［ｐｒＭ］、及びエンベロープ［Ｅ］）タンパク質、及び７つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５）をコードする。ゲノムＲＮＡと共に、構造タンパク質はウイルス粒子を形成する。非構造タンパク質は、ウイルスポリタンパク質のプロセシング、複製、ビリオンアセンブリ、及び宿主免疫応答の回避に関与する。Ｃタンパク質のＣ末端のシグナルペプチド（Ｃシグナルペプチド；Ｃアンカードメインとも呼ばれる）は、シグナルペプチド配列のＮ末端（細胞質中のウイルスＮＳ２Ｂ／ＮＳ３プロテアーゼによる）及びＣ末端（小胞体［ＥＲ］内腔のホストシグナルラーゼによる）での連続開裂の配位によってフラビウイルスパッケージングを調節する。
ポジティブセンス一本鎖ゲノムは、ウイルス及び宿主タンパク質によって、３つの構造タンパク質［カプシド（Ｃ）、プレメンブレン（ｐｒＭ）、エンベロープ（Ｅ）］、及び７つの非構造（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５）タンパク質へと同時及び翻訳後に開裂される単一ポリタンパク質に翻訳される。構造タンパク質は、ビリオンの（球状）構造を形成し、ビリオン接着、内在化、及びウイルスＲＮＡの細胞内への放出を開始し、それによってウイルスのライフサイクルを開始する役割を果たす。他方で非構造タンパク質は、ウイルス複製、感染細胞における免疫応答の調節及び回避、並びに蚊へのウイルスの伝達に関与する。構造タンパク質と非構造タンパク質との間の分子内及び分子間相互作用は、ウイルス感染及び発病において重要な役割を果たす。
Ｅタンパク質は、そのＣ末端に、ＴＭ１及びＴＭ２として示される２つの膜貫通配列を含む。
ＮＳ１は、Ｅの最後の２４アミノ酸に対応するシグナル配列を介してＥＲの内腔中に移動し、ＥＲ常在宿主シグナルペプチダーゼによる開裂を介してそのアミノ末端でＥから放出される（Ｎｏｗａｋら（１９８９年）「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、第１６９巻第３６５～３７６頁）。ＮＳ１は、そのＣ末端に、プロテアーゼの認識部位を含有する８～９アミノ酸のシグナル配列を含む（Ｍｕｌｌｅｒ及びＹｏｕｎｇ（２０１３年）、「Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．」、第９８巻第１９２～２０８頁）。
感染性弱毒化生フラビウイルスの配列は、例えば感染性弱毒化生ＹＦ１７Ｄウイルスなどの感染性弱毒化生フラビウイルスの形成に必要なフラビウイルスの全ての構成成分をコードする、ヌクレオチド配列を指し得る。完全長ＹＦ１７Ｄ配列は、例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０３７００．１の下において注釈が付けられている。
感染性ウイルスは、典型的には、宿主細胞に感染することができる。本発明の文脈における「減衰」とは、病原体の病原性の変化であって、それによって疾患を引き起こす生物の有害な性質が弱められる（又は弱化される）変化に関し、弱毒化病原体は、生ワクチンとして使用することができる。弱毒化ワクチンは、最適以下の条件下における培養（弱毒化とも呼ばれる）、又は疾患を引き起こす能力を低下させる効果を有する遺伝子修飾など、弱められている生物からいくつかの方法で誘導することができる。
特定の実施形態では、感染性弱毒化生フラビウイルスの配列は、フラビウイルスのカプシド（Ｃ）タンパク質又はその一部、プレメンブレン（ｐｒＭ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）、ＮＳ１非構造タンパク質、ＮＳ２Ａ非構造タンパク質、ＮＳ２Ｂ非構造タンパク質、ＮＳ３非構造タンパク質、ＮＳ４Ａ非構造タンパク質、ＮＳ４Ｂ非構造タンパク質、ＮＳ５非構造タンパク質をコードする配列を含む。本発明は、ＹＦＶ １７Ｄ骨格、Ｃｏｖｉｄ－１９のＳ抗原、及びウエストナイルウイルスのＴＭドメインのキメラ構築物を用いて例示される。
フラビウイルス間及びコロナウイルスのＳ抗原間の配列の類似性は、ＹＦＶ以外の骨格、ウエストナイルウイルス以外のＴＭドメイン、及びＣｏｖｉｄ－１９以外のＳ抗原を有するキメラ構築物の構築を可能にする。本発明は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）、ＨＣｏＶＮＬ６３、ＨＫＵ１、及びＭＥＲＳ－ＣｏＶなどのコロナウイルスに対するＤＮＡワクチンの産生を可能にする。
特定の実施形態では、コロナウイルスは、ＣＯＶＩＤ－１９（又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）である。
スパイクタンパク質がＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスの任意のバリアントのスパイクタンパク質であり得ることは、当業者には理解される。
特定の実施形態では、スパイクタンパク質は、ＧＩＳＡＩＤ（ＥＰＩ ＩＳＬ ４０７９７６｜２０２０－０２－０３）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｉｓａｉｄ．ｏｒｇ）から入手可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ＢｅｔａＣｏｖ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／ＧＨＢ－０３０２１／２０２０配列からのスパイクタンパク質、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７．３の下において注釈が付けられているＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２単離株Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１からのスパイクタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスの英国型バリアントからのスパイクタンパク質（例えば、ＶＯＣ ２０２０１２／０１、Ｂ．１．１．７）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスのブラジル－日本型バリアントからのスパイクタンパク質（例えば、Ｂ．１．１．２４８）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスの南アフリカ型バリアントのスパイクタンパク質（例えばＶＯＣ５０１Ｙ．Ｖ２、Ｂ．１．３５１）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスのカリフォルニア型バリアントのスパイクタンパク質、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２変異体のニューヨーク型バリアントのスパイクタンパク質である。
ＣＯＶＩＤ－１９（又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイク（Ｓ）の例示的な注釈付きヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を以下に示す。
ヌクレオチド配列：
シグナルペプチド（１５ａａ）、サブユニット－１、開裂Ｓ１／Ｓ２、ｓｕｂｕｎｉｔ－２／Ｓ２´（ＫＲ）／融合ペプチド
本明細書の他の箇所に記載されるように、本発明のワクチン構築物では、ＳＰの最初の１３ａａ（小文字で３９ヌクレオチド）が欠失していてもよく、好ましくは本発明のワクチン構築物では、ＳＰの最初の１３ａａ（小文字で３９ヌクレオチド）のみが欠失している。
配列番号１
Figure 2023516149000001
Figure 2023516149000002
アミノ酸配列
配列番号２
Figure 2023516149000003
例えば、配列番号２によって定義されるスパイク配列と比較した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２バリアント英国型（ＶＯＣ ２０２０１２／０１、Ｂ．１．１．７）、南アフリカ型（ＶＯＣ ５０１Ｙ．Ｖ２、Ｂ．１．３５１）、及びブラジル－日本型（Ｂ．１．１．２４８）における変異（アミノ酸）は、典型的には、以下の通りである：
－配列番号２と比較した英国型バリアント：アミノ酸６９～７０及び１４４の欠失、並びにアミノ酸置換：Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、及びＤ１１１８Ｈ；
－配列番号２と比較した南アフリカ（ＳＡ）型バリアント：アミノ酸２４２～２４４の欠失、並びにアミノ酸置換：Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、及びＡ７０１Ｖ；又は
－配列番号２と比較したブラジル－日本（ＢＲ）型バリアント：アミノ酸置換：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆ；
ここで、数字は、配列番号２のそれぞれのアミノ酸を示す（すなわち、シグナルペプチドを含む）。
特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部は、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくともＳ２サブユニットである。より特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部は、少なくともＣＯＶＩＤ－１９（又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイクタンパク質のＳ２サブユニット、好ましくは、配列番号１７、若しくは配列番号９８、配列番号１００、若しくは配列番号１０２の対応する部分を含み、本質的にそれらからなり、又はそれらからなる、少なくともＣＯＶＩＤ－１９（又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイクタンパク質のＳ２サブユニットである。
換言すれば、特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくともＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む。より特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、ＣＯＶＩＤ－１９（又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイクタンパク質の少なくともＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む。更により特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、配列番号１７によって定義されるヌクレオチド配列、又は配列番号９８、配列番号１００、若しくは配列番号１０２の対応する部分を含む。
コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部は、好ましくはタンパク質三量体を形成することができる。更に、本発明者らは、充分な体液性免疫応答を誘発するためには、Ｓ１ユニット及びＳ２ユニットの両方の存在が好ましいことを実証した。
したがって、特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部は、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットを含む、本質的にそれらからなる、又はそれらからなる。より特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部は、ＣＯＶＩＤ－１９（又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットを含む、本質的にそれらからなる、又はそれらからなる。
換言すれば、特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む。より特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、ＣＯＶＩＤ－１９（又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む。更により特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、配列番号１７によって定義されるヌクレオチド配列及び配列番号１８によって定義されるヌクレオチド、又は配列番号９８、配列番号１００、若しくは配列番号１０２の対応する部分を含む。
特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットを連続的にコードする。当業者は、Ｓ１サブユニットをコードする配列がＳ２サブユニットをコードする配列の５´に位置することをこれが意味するということを理解するであろう。Ｓ１及びＳ２サブユニットを連続してコードするヌクレオチド配列は、典型的には、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１サブユニットの３´末端及びＳ２サブユニットの５´末端によって形成される、Ｓ１／Ｓ２開裂部位を含む。したがって、特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、配列番号１９によって定義されるヌクレオチド配列を含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、このＳ１／Ｓ２開裂部位は、Ｓ１及びＳ２サブユニットにおけるＳタンパク質のタンパク質分解プロセシングを予防するように変異されてもよい。したがって、特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、配列番号９７によって定義されるヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイクタンパク質の前駆体形態（すなわち、完全長シグナルペプチド又はその一部を含む）の完全長配列を含む。
特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイクタンパク質のシグナルペプチド又はシグナルペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列を含まない。コロナウイルススパイクタンパク質のシグナルペプチドは、典型的には、４５ヌクレオチド（１５アミノ酸をコードする）を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。したがって、コロナウイルススパイクタンパク質のシグナルペプチド又はシグナルペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、又は４５ヌクレオチド、好ましくは６ヌクレオチドなどの、１～４５ヌクレオチドを含み得る。
特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、スパイクタンパク質のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の最後の（又は最も３´側の）６ヌクレオチドを含み、例えば配列５´－ＣＡＡＴＧＴ－３´を含む。
特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、スパイクタンパク質のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の最初の３９ヌクレオチドを含まない。
特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の配列番号２０ ５´（上流）によって定義される配列を含まない。
コロナウイルスは、細胞質膜融合又はエンドソーム膜融合のいずれかによって標的細胞に感染する。宿主細胞へのウイルス侵入の最終工程は、複製のための細胞質へのＲＮＡの放出を含む。したがって、コロナウイルススパイクタンパク質の融合能は、対応するウイルスの感染力の重要な指標である。コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットは、典型的には、Ｓ１／Ｓ２開裂部位によって分離されている。コロナウイルススパイクタンパク質は、膜融合を媒介するために、Ｓ１／Ｓ２部位及びＳ２´部位での開裂によってプライミングされる必要がある。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質では、Ｓ１及びＳ２サブユニットは、ユニークなフリン様開裂部位（ｆｕｒｉｎ－ｌｉｋｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ：ＦＣＳ）である、ヌクレオチド配列ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧ（配列番号２１）を含む、それから本質的になる、又はそれからなる開裂部位によって分離されている。
本発明者らは、スパイクタンパク質の開裂不可能な形態が、優れた安全性プロファイル、免疫原性、及び有効性を有するワクチンの調製に有利であることを見出した。
特定の実施形態では、例えば、本明細書で教示されたポリヌクレオチドが、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含み、Ｓ１／Ｓ２開裂部位をコードするヌクレオチド配列が変異しており、それによって、Ｓ１及びＳ２サブユニットにおけるＳタンパク質のタンパク質分解プロセシングが予防される。
特定の実施形態では、例えば、本明細書で教示されたポリヌクレオチドが、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含み、Ｓ１／２開裂部位をコードするヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧ（配列番号２１）からヌクレオチド配列ＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧ（配列番号２２）へと変異している。
特定の実施形態では、例えば、本明細書で教示されたポリヌクレオチドが、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含み、Ｓ１／２開裂部位が、アミノ酸配列ＲＲＡＲ（配列番号２３）からアミノ酸配列ＡＡＡＡ（配列番号２４）へと突然変異している。Ｓ１／Ｓ２開裂部位は、ＭｃＣａｌｌｕｍら、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｇｕｉｄｅｄ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｓｐｉｋｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｏｓｅｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、「Ｎａｔｕｒｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」、２０２０年に記載されているものなどのＳＧＡＧ（配列番号９１）へ、又はＧＳＡＳ（配列番号９２）へ、又はＸｉｏｎｇら、「Ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ，ｃｌｏｓｅｄ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒｉｍｅｒ」、「Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２０２０年に記載されているものなどの単一のＲへと変異していてもよい。
特定の実施形態では、例えば、本明細書で教示されたポリヌクレオチドが、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくともＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含み、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ２サブユニット中のＳ２´開裂部位をコードするヌクレオチド配列が変異しており、それによって、Ｓ２ユニットのタンパク質分解プロセシングが予防される。
特定の実施形態では、例えば、本明細書で教示されたポリヌクレオチドが、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくともＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含み、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ２サブユニット中のＳ２´開裂部位をコードするヌクレオチド配列が、５´－ＡＡＧＣＧＣ－３´から５´－ＧＣＧＡＡＣ－３´へと変異している。
特定の実施形態では、例えば、本明細書で教示されたポリヌクレオチドが、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくともＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列を含み、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ２サブユニット中のＳ２´開裂部位をコードするヌクレオチド配列は変異しない。したがって、特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ２サブユニットのＳ２´開裂部位をコードするヌクレオチド配列は、配列５´－ＡＡＧＣＧＣ－３´を含む。
特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイクタンパク質のスパイクタンパク質Ｓ２サブユニットをコードし、かつコロナウイルススパイクタンパク質のスパイクタンパク質Ｓ１サブユニットをコードしない。より特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスのスパイクタンパク質Ｓ２サブユニットをコードし、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスのスパイクタンパク質Ｓ１サブユニットをコードしない。特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１８によって定義されるヌクレオチド配列、又は配列番号９８、配列番号１００、若しくは配列番号１０２の対応する部分を含まない。
特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイクタンパク質のスパイクタンパク質Ｓ１サブユニットをコードし、かつコロナウイルススパイクタンパク質のスパイクタンパク質Ｓ２サブユニットをコードしない。より特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスのスパイクタンパク質Ｓ１サブユニットをコードし、かつＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスのスパイクタンパク質Ｓ２サブユニットをコードしない。特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１７によって定義されるヌクレオチド配列、又は配列番号９８、配列番号１００、若しくは配列番号１０２の対応する部分を含まない。
本発明は、黄熱病ウイルス、より具体的には黄熱病１７Ｄ（ＹＦ１７Ｄ）ウイルスを用いて例示されるが、他のフラビウイルス系構築物、例えば、日本脳炎、デング熱、マレー渓谷脳炎（Ｍｕｒｒａｙ Ｖａｌｌｅｙ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：ＭＶＥ）、セントルイス脳炎（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：ＳＬＥ）、ウェストナイル（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ：ＷＮ）、ダニ媒介脳症（Ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：ＴＢＥ）、ロシア春夏脳炎（Ｒｕｓｓｉａｎ Ｓｐｒｉｎｇ－Ｓｕｍｍｅｒ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ：ＲＳＳＥ）、クンジンウイルス、ポワッサンウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、ジカウイルス、ウスツウイルス、ヴェッセルスブロン及びオムスク出血熱ウイルスなどを、これらに限定されないが用いて、等しく実施することができる。感染性弱毒化生フラビウイルスの配列の前に、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第２０１４１７４０７８号に記載されているように、フラビウイルスカプシドタンパク質のＮ末端部分を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなるフラビウイルスカプシドタンパク質の一部をコードする配列が先行し得る。
特定の実施形態では、キメラウイルスをコードするポリヌクレオチド配列は、コアタンパク質をコードする配列の５´末端、スパイクタンパク質又はその一部をコードする配列、及びフラビウイルスのコアタンパク質をコードする配列を、５´末端に連続して含む。
特定の実施形態では、感染性弱毒化生フラビウイルスの配列の前に、フラビウイルスカプシドタンパク質のＮ末端部分を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなり、スパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列と、２Ａ開裂ペプチドをコードするヌクレオチドとを含む、フラビウイルスカプシドタンパク質の一部をコードする配列が先行する。当業者は、そのような実施形態では、感染性弱毒化生フラビウイルスの配列の開始コドン（すなわち、最初の３つのヌクレオチド）が欠失していることを理解するであろう。
特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチド配列は、フラビウイルスのカプシドタンパク質のＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列、２Ａ開裂ペプチドをコードするヌクレオチド、及び感染性弱毒化生フラビウイルスのヌクレオチド配列を連続的に含む。
特定の実施形態では、フラビウイルスのカプシドタンパク質のＮ末端部分は、フラビウイルスのカプシドタンパク質の最初の２１個のＮ末端アミノ酸を含む。例えば、フラビウイルスのカプシドタンパク質のＮ末端部分は、アミノ酸配列ＭＳＧＲＫＡＱＧＫＴＬＧＶＮＭＶＲＲＧＶＲ（配列番号２５）を含む、本質的にそれからなる、又はそれからなる。
特定の実施形態では、フラビウイルスのカプシドタンパク質のＮ末端部分は、ヌクレオチド配列５´－ＡＴＧＴＣＴＧＧＴＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＴＧＧＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＴＴＣＧＣ－３´（配列番号２６）によってコードされる。上記のように、コロナウイルススパイク抗原をコードするポリヌクレオチドがフラウイルス（ｆｌａｖｉｒｕｓ）のＣコアの前に挿入される実施形態では、開裂タンパク質をコードする配列を、スパイクタンパク質をコードする配列の３´側に挿入することができる。効率的な開裂ペプチドは、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）［Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１年）、「Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ」、第８２巻第１０２７～１０４１頁］であり、このペプチドの使用はまた、更なるユビキチン開裂配列を含む必要性を克服する。Ｔ２Ａペプチドは、アミノ酸配列ＥＧＲＧＳＬＬ ＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２７）を有し得る。
Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａとは別に、他のウイルス２Ａペプチドを本発明の化合物及び方法に使用することができる。本明細書の例は、例えば、Ｃｈｎｇら（２０１５年）、「ＭＡｂｓ」、第７巻第４０３～４１２頁、すなわち口蹄疫ウイルスのＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２８）、ブタテッショウウイルス－１のＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号２９）、及びウマ鼻炎Ａウイルス由来のＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号３０）に記載されている。これらのペプチドは、保存されたＬｘｘｘＧＤＶＥｘＮＰＧＰモチーフ（配列番号３１）を有し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。このコンセンサス配列を有するペプチドを本発明の化合物に使用することができる。コンセンサス配列ＤＸＥＸＮＰＧＰ（配列番号３２）によって表されるウイルス２Ａ開裂ペプチドの他の好適な例は、Ｓｏｕｚａ－Ｍｏｒｅｉｒａら（２０１８年）、「ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ．」、８月１日に開示されており、ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、トリパノソーマ、及び細菌（サーモトガ・マリティマ）のようにピコルナウイルス由来である２Ａ開裂ペプチドの更なる好適な例は、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ（２００１年）、「Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．」、第８２巻第１０２７～１０４１頁に開示されている。
上記のように、ウイルス融合構築物は、カプシドタンパク質のＮ末端部分の反復を更に含有し得る。カプシドタンパク質のＮ末端部分の反復は、スパイクタンパク質の少なくとも一部の前に存在し得る。本発明では、反復は同じアミノ酸配列を有し得るが、ＤＮＡ配列は同義コドンを含むように修飾されていてもよく、使用される２１個のコドン［本明細書では、コドン１は開始ＡＴＧである］に対して最大約７５％のヌクレオチド配列同一性をもたらす。Ｓａｍｓａら（２０１２年）、「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」、２０１２年、第８６巻第１０４６～１０５８頁に実証されるように、カプシドＮ末端部分は、２１ＡＡカプシドＮ末端部分に限定されなくてもよく、例えば、更なる５、１０、１５、２０、又は２５アミノ酸を含み得る。先行技術は反復からの変異したシス作用性ＲＮＡ構造要素のみであった［Ｓｔｏｙａｎｏｖ（２０１０年）、「ワクチン」、第２８巻第４６４４～４６５２頁］。したがって、そのようなアプローチはまた、相同組換えのいかなる可能性をも排除し、これは、極端に安定なウイルス融合構築物をもたらす。
典型的な実施形態では、エピトープ又は抗原（例えば、コロナウイルスのスパイクタンパク質の少なくとも一部）をコードする配列の５´に位置するカプシドタンパク質のＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列は、構築物の産生に使用されるウイルスの配列と同一である。組換えを回避するために典型的に導入される突然変異は、そのような実施形態では、エピトープ又は抗原（例えば、コロナウイルスのスパイクタンパク質の少なくとも一部）をコードする配列の３´に位置するカプシドタンパク質のＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列に導入される。
更に、カプシドをコードするＣ遺伝子の反復では、配列は第２のコドンからのみ始まり、Ｔ２Ａからの開裂に影響を及ぼす可能性がある；Ｔ２Ａ「開裂」部位（ＮＰＧ／Ｐ）［配列番号３３］のＣ末端のアミノ酸（ａａ）、すなわちセリン（ＮＰＧ／ＰＳ）［配列番号３４］、又はあるいは元のカプシドタンパク質の開始メチオニンの代わりにＧｌｙ、Ａｌａ、若しくはＴｈｒであるので、Ｔ２Ａ開裂は、本発明の構築物において有利である。
更に、コドン最適化ｃＤＮＡもまた、クローニングフラビウイルス構築物である抗原に使用され得る。したがって、特定の実施形態では、感染性弱毒化生フラビウイルスのヌクレオチド配列及び／又はコロナウイルスのスパイクタンパク質の少なくとも一部をコードする配列は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得る。
全体として、上記の修飾の１つ以上は、そうでなければＹＦＶ複製に対する適応性コストを不可避的にもたらしたベクターに余分な「積荷」を挿入する複製負荷を最小限に抑える。
特定の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードする配列は、フラビウイルスのＥ／ＮＳ１境界に挿入される。換言すれば、特定の実施形態では、スパイクタンパク質の少なくとも一部をコードする配列は、フラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列と、フラビウイルスのＮＳ１タンパク質をコードする配列との間に挿入されるか、又はそれらの間に位置する。換言すれば、特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドにおいて、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列は、フラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３´と、フラビウイルスのＮＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５´と、に配置されている。
特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドにおいて、スパイクタンパク質の少なくとも一部をコードする配列は、フラビウイルスのカプシドタンパク質、前駆体膜タンパク質、及びエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３´（下流）と、フラビウイルスのＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５´（上流）とに位置する。
スパイクタンパク質又はそのサブユニットがＥ／ＮＳ１境界に挿入されている実施形態では、本発明の構築物は、ＥＲ内腔へのコードされたインサートの適切な提示及びタンパク質分解プロセシングを可能にする。この目的のために、抗原のシグナルペプチドをコードする配列（例えば、コロナウイルスのスパイクタンパク質の少なくとも一部をコードする配列）は、部分的又は全体的に除去されてもよく、好ましくは、フラビウイルスタンパク質のＮＳ１タンパク質の９アミノ酸をコードする配列によって置き換えられてもよい。例えば、フラビウイルスのＮＳ１タンパク質の９アミノ酸は、ＤＱＧＣＡＩＮＦＧ（配列番号３５）であってもよく、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＧＣＧＡＴＡＡＡＴＴＴＣＧＧＴ（配列番号３６）によってコードされてもよい。抗原中の膜貫通配列の有無に応じて、抗原のＴＭ配列を欠失させ、フラビウイルスＴＭ配列で置き換えることができるか、又は１つ以上の追加のＴＭ膜コード配列を、抗原をコードする配列の３´に挿入する（又は配置する）。
特定の実施形態では、更なるフラビウイルスの膜貫通（ＴＭ）ドメインをコードする配列は、スパイクタンパク質の少なくとも一部をコードする配列の３´（下流）と、フラビウイルスのＮＳ１～ＮＳ５領域のＮＳ１領域の５´（上流）とに位置する。換言すれば、特定の実施形態では、更なるフラビウイルスの膜貫通（ＴＭ）ドメインをコードする配列は、スパイクタンパク質の少なくとも一部をコードする配列の３´（下流）と、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の５´（上流）とに位置する。
特定の実施形態では、更なるフラビウイルスのＴＭドメインは、ウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（ＷＮＶ－ＴＭ２）である。
特定の実施形態では、ＷＮＶ－ＴＭ２は、核酸配列ＡＧＧＴＣＡＡＴＴＧＣＴＡＴＧＡＣＧＴＴＴＣＴＴＧＣＧＧＴＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＣＧＧＴＣＡＡＣＧＴＣＣＡＴＧＣＴ（配列番号３７）を含む。
特定の実施形態では、更なるフラビウイルスの２つのＴＭドメインは、スパイクタンパク質Ｓ１サブユニットをコードする配列の３´と、ＮＳ－ＮＳ５領域の５´と、に配置されている。換言すれば、特定の実施形態では、更なるフラビウイルスのＴＭドメインをコードする２つの配列は、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードする配列の３´（下流）と、ＮＳ１タンパク質をコードする配列の５´（上流）とに位置する。
特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、スパイクタンパク質又はその一部をコードする配列の５´（上流）、好ましくは５´（上流）の直近に、ＮＳ１シグナルペプチドをコードする配列を含む。
特定の実施形態では、該ＮＳ１シグナルペプチドは、核酸配列ＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＧＣＧＡＴＡＡＡＴＴＴＣＧＧＴ（配列番号３８）を含む。
したがって、特定の実施形態では、コロナウイルスのスパイクタンパク質のシグナルペプチドの最初の３９ヌクレオチドが欠失している場合、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、スパイクタンパク質又はその一部をコードする配列に対して、５´（上流）、好ましくは５´直近、ヌクレオチド配列ＧＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＣＧＣＧＡＴＡＡＡＴＴＴＣＧＧＴＣＡＡＴＧＴ（配列番号３９）を含んでもよく、ここで、ＮＳ１シグナルペプチドのＮＳ１シグナルペプチドは太字で示され、２アミノ酸のシグナル配列に下線が引かれている。
本発明者らは更に、以下の点が特に有利であることを見出した：
－コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が、フラビウイルスのＥ／ＮＳ１境界に挿入される（位置する）；
－コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が、コロナウイルススパイクタンパク質のシグナルペプチド又はシグナルペプチドの一部をコードするヌクレオチド配列を含まず、好ましくはここで、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が、コロナウイルススパイクタンパク質のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の最初の３９ヌクレオチドを含まない；
－更なるフラビウイルスの膜貫通（ＴＭ）ドメインをコードするヌクレオチド配列が、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の３´と、ＮＳ１～ＮＳ５領域のＮＳ１領域の５´とに位置し、好ましくはここで、更なるフラビウイルスのＴＭドメインが、ウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（ＷＮＶ－ＴＭ２）である；及び／又は
－ポリヌクレオチドが、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の５´側に、ＮＳ１シグナルペプチドをコードする配列を含む。
これらの特定の有利な特徴は全て、本明細書の他の箇所に記載されているように、「ＹＦ－Ｓ０」ワクチンに存在する。
したがって、特定の実施形態では、
－コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチドは、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードし；好ましくは、Ｓ１／Ｓ２開裂部位をコードするヌクレオチド配列が変異され、それによって、Ｓ１及びＳ２サブユニットにおけるＳタンパク質のタンパク質分解プロセシングが予防される；
－コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、フラビウイルスのＥ／ＮＳ１境界に挿入される（位置する）；
－コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイクタンパク質のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の最初の３９ヌクレオチドを含まない；
－更なるフラビウイルスの膜貫通（ＴＭ）ドメインをコードするヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の３´と、ＮＳ１～ＮＳ５領域のＮＳ１領域の５´と、に位置し、ここで好ましくは、更なるフラビウイルスのＴＭドメインが、ウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（ＷＮＶ－ＴＭ２）である；並びに
－ポリヌクレオチドは、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列の５´側に、ＮＳ１シグナルペプチド、好ましくは配列番号３８によって定義されるＮＳ１シグナルペプチドをコードする配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチドは、配列番号９３若しくは９４、好ましくは配列番号９４によって定義される配列を含むか、又は配列番号９５若しくは９６、好ましくは配列番号９５によって定義されるアミノ酸配列をコードする配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチド（すなわち、キメラウイルスをコードするポリヌクレオチド）は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号１３によって定義される配列を含む、本質的にそれらからなる、又はそれらからなる。好ましい実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチド（すなわち、キメラウイルスをコードするポリヌクレオチド）は、配列番号３、配列番号５、又は配列番号７によって、好ましくは配列番号５によって定義される配列を含む、本質的にそれらからなる、又はそれらからなる。
更なる態様は、本明細書で教示されたポリヌクレオチド配列を含む、ウイルス発現カセットなどの発現カセットを提供する。
更なる態様は、本明細書で教示された発現カセット又はポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
弱毒化前のキメラ構築物、及び弱毒化後の構築物のｃＤＮＡの増殖は、構築物のエラープルーフ複製を必要とする。参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願第２０１４１７４０７８号において本発明者らによって開示される細菌人工染色体の使用、特に誘導性ＢＡＣＳの使用は、本発明のキメラ構築物などのＲＮＡウイルスのｃＤＮＡの高収率で高品質な増幅に特に好適である。
したがって、特定の実施形態では、本明細書で教示された発現カセット又はポリヌクレオチド配列を含むベクターは、ＢＡＣであり得る。
この公報に記載されているＢＡＣは、以下を含み得る：
－細菌細胞当たり１０コピーを超える該ＢＡＣの増幅のための誘導可能な細菌複製起点配列、並びに
－ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡを含み、かつ哺乳動物細胞における該ウイルスｃＤＮＡの転写、及び転写されたＲＮＡの感染性ＲＮＡウイルスへのプロセシングのためのシス調節エレメントを含む、ウイルス発現カセット。
本発明の場合のように、ＲＮＡウイルスゲノムは、２つのウイルスゲノムのキメラウイルスｃＤＮＡ構築物である。
これらのＢＡＣＳでは、ウイルス発現カセットは、プラス鎖ＲＮＡウイルスゲノムのｃＤＮＡ、典型的には、以下を含む：
－該ｃＤＮＡの転写を開始するための、該ｃＤＮＡの５´末端に先行するＲＮＡポリメラーゼ駆動プロモータ、及び
－該ウイルスｃＤＮＡのＲＮＡ転写物を設定位置で開裂するための、該ｃＤＮＡの３´末端に続くＲＮＡ自己開裂のためのエレメント。
ＢＡＣは、該細菌人工染色体を酵母にシャトリングし、酵母中で維持するための、酵母自律複製配列を更に含み得る。酵母複製起点配列の例は、２μプラスミド起源又はＡＲＳ１（自律複製配列１）又はその機能的に相同な誘導体である。
本発明のこの態様のＲＮＡポリメラーゼ駆動プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ、例えばサイトメガロウイルス最初期（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ：ＣＭＶ－ＩＥ）プロモータ、又はシミアンウイルス４０プロモータ、又はそれらの機能的に相同な誘導体であり得る。
ＲＮＡポリメラーゼ駆動プロモータは、同様に、ＲＮＡポリメラーゼＩ又はＩＩＩプロモータであり得る。
ＢＡＣはまた、ＲＮＡ自己開裂のためのエレメント、例えば肝炎δウイルスのゲノムリボザイムのｃＤＮＡ又は機能的に相同なＲＮＡエレメントなどを含み得る。
更なる態様は、本明細書で教示されたようなポリヌクレオチド配列によってコードされた、感染性弱毒化キメラ生フラビウイルスを提供する。
特定の実施形態では、感染性弱毒化キメラ生フラビウイルスは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号１４、好ましくは配列番号４、配列番号６、又は配列番号８、より好ましくは配列番号４によって定義されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれらからなる、又はそれらからなる。
更なる態様は、本明細書で教示されたポリヌクレオチド又は本明細書で教示されたキメラウイルス、薬学的に許容される担体、
本明細書で教示された発現ベクター、及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、当技術分野と一致しており、医薬組成物の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではないことを意味する。
特定の実施形態では、医薬組成物は、ワクチンである。
ワクチン調製物へのＤＮＡの製剤化は当技術分野で公知であり、例えば、「´´ＤＮＡ Ｖａｃｃｉｎｅｓ´´Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」の第６章～第１０章、第１２７巻（２００６年）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓａｌｔｚｍａｎ、Ｓｈｅｎ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｓｍａ（編）、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．、Ｔｏｔｏｍａ，Ｎ．Ｊ．、及び「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｍｅｔｈｏｄｓ」の第６１章、第１２００～１２３１頁、「Ｖａｃｃｉｎｅｓ」（第６版）（２０１３年）（Ｐｌｏｔｋｉｎら編）に詳述に記載されている。ＤＮＡワクチンの調製に好適な、許容される担体、希釈剤、賦形剤、及びアジュバントに関する詳細はまた、以下に示すように、国際公開第２００５０４２０１４号にも見出すことができる。
「許容される担体、希釈剤、又は賦形剤」は、特に免疫療法に関して、ヒト及び／又は獣医学における使用に許容される追加の物質を指す。
例として、許容される担体、希釈剤、又は賦形剤は、全身投与又は局所投与において安全に使用され得る固体若しくは液体の充填剤、希釈剤、又は封入物質であり得る。特定の投与経路に応じて、当技術分野で周知の様々な担体を使用することができる。これらの担体は、糖、デンプン、セルロース、及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム及び炭酸塩、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張食塩水及び塩（塩酸塩、臭化物、及び硫酸塩を含む鉱酸塩など）、有機酸（酢酸塩、プロピオン酸塩、及びマロン酸塩など）、並びにパイロジェンフリー水を含む群から選択され得る。
薬学的に許容される担体、希釈剤、及び賦形剤について記載する有用な参考文献は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．、米国、（１９９１年））であり、これは参照により本明細書に組み込まれる。
患者にＤＮＡワクチンを提供するために、任意の安全な投与経路を使用することができる。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、頬側、静脈内、関節内、筋肉内、皮膚内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、及び経皮などが採用され得る。筋肉内及び皮下注射は、例えば、免疫療法組成物、タンパク質性ワクチン、及び核酸ワクチンの投与に適切であり得る。微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）又はエレクトロポレーションは、核酸ワクチンの送達に特に有用であり得ることもまた企図される。
剤形としては、錠剤、分散液、懸濁液、注射剤、液剤、シロップ剤、トローチ剤、カプセル剤、坐剤、エアロゾル剤、及び経皮パッチなどが挙げられる。これらの剤形はまた、この目的のために特別に設計された制御放出装置、又はこの様式で更に作用するように改変された他の形態のインプラントを、注射又は移植することを含み得る。治療剤の制御放出は、例えば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸、及びポリグリコール酸、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの特定のセルロース誘導体を含む疎水性ポリマーにより、治療剤をコーティングすることによって達成され得る。加えて、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソーム、及び／又はミクロスフェアを用いることによって達成され得る。
経口又は非経口投与に好適なＤＮＡワクチンは、各々所定量のプラスミドＤＮＡを含有するカプセル、小袋、又は錠剤などの個別の単位として、粉末若しくは顆粒として、又は水性液体、非水性液体、水中油型エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョン中の溶液若しくは懸濁液として、提供され得る。そのような組成物は、薬学の方法のいずれかによって調製され得るが、全ての方法は、１つ以上の必要な成分を構成する担体と上記の１つ以上の薬剤を結合させる工程を含む。一般に、組成物は、ＤＮＡプラスミドを液体担体若しくは細かく分割された固体担体又はその両方と、均一かつ密接に混合し、次いで、必要に応じて、生成物を所望の生成物へと形成することによって調製される。
上記組成物は、投与製剤と適合する様式で、かつ有効な量で投与され得る。患者に投与される用量は、適切な期間にわたって患者に有益な応答をもたらすのに充分であるべきである。投与される薬剤（複数形）の分量は、年齢、性別、体重、及びその一般的な健康状態、施術者の判断に依存するであろう要因を含めて、処置される対象に依存し得る。
更に、ＤＮＡワクチンは、参照として示されるＤａｒｊｉら（２０００年）、「ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、第２７巻第３４１～３４９頁、及びＣｉｃｉｎ－Ｓａｉｎら（２００３年）「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」、第７７巻第８２４９～８２５５頁によって例示される通り、該ＤＮＡプラスミドで形質転換されたサルモネラの弱毒化株を用いるように細菌形質導入によって送達され得る。
典型的には、ＤＮＡワクチンは、ヒトの予防的又は治療的免疫化に使用されるが、ある特定のウイルスについてはまた、家畜及びコンパニオンアニマルなどの家畜を含む脊椎動物（典型的には、哺乳動物、鳥類、及び魚類）に適用することもできる。ワクチン接種は、サル、マウス、ラット、鳥類、及びコウモリなどのウイルスの生きた貯蔵体（人畜共通感染症）である動物を想定している。
ある特定の実施形態では、ワクチンは、アジュバント、すなわち、ワクチン組成物の免疫原性及び／又は有効性を増強する１つ以上の物質を含み得る。しかしながら、生ワクチンは、ウイルス複製とは無関係に自然免疫応答を刺激し得るアジュバントによって最終的に損なわれ得る。好適なアジュバントの非限定的な例としては、スクアラン及びスクアレン（又は動物由来の他の油）；ブロックコポリマー；Ｔｗｅｅｎ－８０などの洗剤；Ｑｕｉｌｌ Ａ、Ｄｒａｋｅｏｌ又はＭａｒｃｏｌなどの鉱油、ピーナッツ油などの植物油；コリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などのコリネバクテリウム由来アジュバント；プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅ）などのプロピオニバクテリウム由来アジュバント；マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ及びＧｕｅｒｉｎ又はＢＣＧ）；インターロイキン２及びインターロイキン１２などのインターロイキン；インターロイキン１などのモノカイン；腫瘍壊死因子；ガンマインターフェロンなどのインターフェロン；サポニン－水酸化アルミニウム又は水酸化アルミニウムＱｕｉｌ－Ａなどの組合せ；リポソーム；ＩＳＣＯＭｔ）及びＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（Ｂ）アジュバント；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ムラミルジペプチド又は他の誘導体などの合成糖ペプチド；アビリジン；脂質Ａ誘導体；硫酸デキストラン；ＤＥＡＥ－デキストラン又はリン酸アルミニウム；Ｃａｒｂｏｐｏｌ´ＥＭＡなどのカルボキシポリメチレン；Ｎｅｏｃｒｙｌ Ａ６４０などのアクリルコポリマーエマルジョン；ワクシニア又は動物ポックスウイルスタンパク質；コレラ毒素などのサブウイルス粒子アジュバント、又はそれらの混合物が挙げられる。
更なる態様は、本明細書で教示されたキメラウイルスを調製するインビトロ方法を提供する。
更なる態様は、本明細書で教示されたキメラウイルス又はポリヌクレオチドを含む、コロナウイルス感染に対するワクチンを調製するインビトロ方法を提供する。
更なる態様は、コロナウイルス感染症に対するワクチンを調製するインビトロ方法であって、以下の工程：
（ａ）ＢＡＣを提供する工程であって、ＢＡＣが
細菌細胞当たり１０コピーを超える該ＢＡＣの増幅のための誘導可能な細菌複製起点配列と、
本明細書で教示されたポリヌクレオチドを含むキメラウイルスのｃＤＮＡを含み、並びに哺乳動物細胞における該ウイルスｃＤＮＡの転写のため、及び感染性ＲＮＡウイルスへの転写ＲＮＡのプロセシングのためのシス調節エレメントを含む、ウイルス発現カセットと、
を含む、工程、
（ｂ）哺乳動物細胞を工程（ａ）のＢＡＣでトランスフェクトし、感染細胞を継代培養する工程、
（ｃ）病原性と、抗体を産生し、コロナウイルス感染に対する防御を誘導する能力と、について、工程（ｂ）のトランスフェクト細胞の複製ウイルスを検証する工程、
（ｄ）ベクターへ工程（ｃ）で検証されたウイルスをクローニングし、ベクターをワクチン製剤へと製剤化する工程、
を含む、方法を提供する。
特定の実施形態では、ベクターはＢＡＣであって、ＢＡＣが細菌細胞当たり１０コピーを超える該ＢＡＣの増幅のための誘導可能な細菌複製起点配列を含む。
更なる態様は、医薬品として使用するためであって、好ましくは医薬品がワクチンである、本明細書で教示されたポリヌクレオチド、本明細書で教示されたキメラウイルス、又は本明細書で教示された医薬組成物を提供する。
更なる態様は、コロナウイルス感染症、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防で使用するための、本明細書で教示されたポリヌクレオチド、本明細書で教示されたキメラウイルス、又は本明細書で教示された医薬組成物を提供する。換言すれば、本明細書では、対象におけるコロナウイルス感染症（例えば、コロナウイルスに対してワクチン接種する方法）、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２感染症を予防する方法であって、本明細書で教示された予防有効量のポリヌクレオチド、本明細書で教示されたキメラウイルス、又は本明細書で教示された医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。言及される場合を除いて、「対象」又は「患者」という用語は互換的に使用することができ、動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、更により好ましくは哺乳動物、更により好ましくは霊長類を指し、具体的にはヒト患者並びに非ヒト哺乳動物及び霊長類を含む。好ましい対象はヒト対象である。
本発明者らは、本明細書で教示されたポリヌクレオチド配列の単回投与が充分であることを示した。
特定の実施形態では、本明細書で教示されたポリヌクレオチド、本明細書で教示されたキメラウイルス、又は本明細書で教示された医薬組成物の単回投与が、対象に投与される。
特定の実施形態では、単回投与は、本明細書で教示されたキメラウイルスの１０４～１０６ＰＦＵ、例えば約１０５ＰＦＵを含む、本質的にそれらからなる、又はそれらからなる。
本出願はまた、以下のステイトメントに記載されている態様及び実施形態を提供する。
ステイトメント１．感染性弱毒化生フラビウイルスの配列を含むポリヌクレオチドであって、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列が、キメラウイルスが発現されるように挿入される、ポリヌクレオチド。
ステイトメント２．該フラビウイルスが、黄熱病ウイルスである、ステイトメント１に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント３．該フラビウイルスが、ＹＦ１７Ｄである、ステイトメント１又は２に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント４．該コロナウイルスが、Ｃｏｖｉｄ１９である、ステイトメント１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント５．該スパイクタンパク質のシグナルペプチド又はシグナルペプチドの一部（１～４２ヌクレオチド間）をコードする配列が、欠失している、ステイトメント１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント６．スパイクタンパク質の該Ｓ１及びＳ２サブユニットをコードする、ステイトメント１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント７．該Ｓ１／Ｓ２開裂部位をコードするヌクレオチド配列が変異しており、それによって、Ｓ１及びＳ２サブユニットにおけるＳタンパク質のタンパク質分解プロセシングが妨げられている、ステイトメント１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント８．該Ｓ２´開裂部位をコードするヌクレオチド配列が変異しており、それによって、タンパク質分解プロセシングが妨げられている、ステイトメント１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント９．該ヌクレオチド配列が、該スパイクタンパク質Ｓ２サブユニットをコードする（すなわち、該Ｓ１サブユニットをコードする配列が、欠失している）、ステイトメント１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント１０．該ヌクレオチド配列が、該スパイクＳ１サブユニットをコードする（すなわち、該Ｓ２サブユニットをコードする配列が、欠失している）、ステイトメント１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント１１．該スパイクタンパク質又はその別個をコードする配列が、該フラビウイルスのＥ／ＮＳ１境界へ挿入されている、ステイトメント１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント１２．更なるフラビウイルスの膜貫通（ＴＭ）ドメインをコードする配列が、該スパイクタンパク質又はその一部をコードする配列の３´と、該ＮＳ１～ＮＳ５領域のＮＳ１領域の５´と、に配置されている、ステイトメント１１に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント１３．５´から該スパイクタンパク質又はその一部をコードする配列への、ＮＳ１シグナルペプチドをコードする配列を含む、ステイトメント１１又は１２に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント１４．更なるフラビウイルスの２つのＴＭドメインが、該スパイクタンパク質Ｓ１サブユニットをコードする配列の３´と、該ＮＳ１～ＮＳ５領域の５´と、に配置されている、ステイトメント１１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント１５．該キメラウイルスをコードするヌクレオチド配列が、コアタンパク質をコードする配列の５´末端、該スパイクタンパク質又はその一部をコードする配列、及び該フラビウイルスのコアタンパク質を、該５´末端に連続して含む、ステイトメント１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント１６．該スパイクタンパク質の一部をコードする配列が、該Ｓ１ドメインである（すなわち、該Ｓ２ドメインが、欠失している）、ステイトメント１５に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント１７．配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、及び配列番号１３からなる群から選択される配列を含む、ステイトメント１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。ＹＦＶ以外の別骨格でクローニングされた場合、上記の配列番号の５´及び３´は、骨格の配列に修飾される。
ステイトメント１８．細菌人工染色体である、ステイトメント１～１７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント１９．医薬品として使用するための、ステイトメント１～１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
ステイトメント２０．該医薬品が、ワクチンである、ステイトメント１９に記載の医薬品として使用するためのポリヌクレオチド。
ステイトメント２１．コロナウイルスに対するワクチン接種で使用するための、ステイトメント１～１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列。
ステイトメント２２．ステイトメント１～１８のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列によってコードされる、感染性弱毒化キメラ生フラビウイルス。
ステイトメント２３．医薬品として使用するための、ステイトメント２２に記載のキメラウイルス。
ステイトメント２４．コロナウイルス感染症の予防で使用するための、ステイトメント２２に記載のキメラウイルス。
ステイトメント２５．
コロナウイルス感染症に対するワクチンを調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）ＢＡＣを提供する工程であって、ＢＡＣが
細菌細胞当たり１０コピーを超える該ＢＡＣの増幅のための誘導可能な細菌複製起点配列と、
ステイトメント１～１７のいずれか一項に記載のキメラウイルスのｃＤＮＡを含み、並びに哺乳動物細胞における該ウイルスｃＤＮＡの転写のため、及び感染性ＲＮＡウイルスへの転写ＲＮＡのプロセシングのためのシス調節エレメントを含む、ウイルス発現カセットと、
を含む、工程、
（ｂ）哺乳動物細胞を工程（ａ）のＢＡＣでトランスフェクトし、該感染細胞を継代培養する工程、
（ｃ）病原性と、抗体を産生し、コロナウイルス感染に対する防御を誘導する能力と、について、工程（ｂ）のトランスフェクト細胞の複製ウイルスを検証する工程、
（ｄ）ベクターへ工程（ｃ）で検証されたウイルスをクローニングし、該ベクターをワクチン製剤へと製剤化する工程、
を含む、方法。
ステイトメント２６．該ベクターがＢＡＣであって、ＢＡＣが細菌細胞当たり１０コピーを超える該ＢＡＣの増幅のための誘導可能な細菌複製起点配列を含む、ステイトメント２５に記載の方法。
本発明をその特定の実施形態と併せて説明してきたが、前述の説明に照らして、多くの代替形態、修正形態、及び変形形態が当業者には明らかであろうということは、明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲において、以下のような、全てのかかる代替形態、修正形態、及び変形形態を包含することが意図されている。
本明細書に開示された態様及び本発明の実施形態は、以下の非限定的な例によって更に支持される。
実施例１．ＹＦ－Ｅ／ＮＳ１の間に挿入されたスパイク遺伝子配列
構築物１－ｐＳＹＦ１７Ｄ－ｎＣｏＶ－Ｓ（開裂）：（シグナルペプチド［ＳＰ］由来の最初の１３ａａを欠失したＣＯＶＩＤ－１９スパイク、及びウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（ＷＮＶ－ＴＭ２）に融合したＣ末端）。（図２２）構築物１は、実施例８及び実施例９で参照される「ＹＦ－Ｓ１／Ｓ２」に対応する。
図２９に示す核酸（配列番号３）及びアミノ酸配列（配列番号４）の注釈：末端ＹＦ－Ｅ／最初の２７ヌクレオチドＹＦ－ＮＳ１（９アミノ酸）／２ａａＳＰ／ＣＯＶＩＤ１９－Ｓ１／Ｓ１～Ｓ２間の開裂／ｃｏｖｉｄ１９－Ｓ２／サブユニット－２／Ｓ２´（ＫＲ）／融合ペプチド／ＷＮＶ－ＴＭ２／初期ＹＦ－ＮＳ１
実施例２：ＹＦ－Ｅ／ＮＳ１の間に挿入されたスパイク遺伝子配列による構築物
構築物２－ｐＳＹＦ１７Ｄ－ｎＣｏＶ－Ｓ（非開裂）：（シグナルペプチド（ＳＰ）由来の最初の１３ａａを欠失したＣＯＶＩＤ－１９スパイク、ＲＲＡＲ（配列番号２３）からＡＡＡＡ（配列番号２４）へと変異した開裂部位Ｓ１／Ｓ２、及びウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（ＷＮＶ－ＴＭ２）に融合したＣ末端）。（図２２）構築物２は、実施例８及び実施例９で参照される「ＹＦ－Ｓ０」に対応する。
図２９に示される核酸（配列番号５）及びアミノ酸配列（配列番号６）の注釈：末端ＹＦ－Ｅ／最初の２７ヌクレオチドＹＦ－ＮＳ１（９アミノ酸）／２ａａＳＰ／ＣＯＶＩＤ１９－Ｓ１／ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧ（ＲＲＡＲ）（配列番号２３）からＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧ（ＡＡＡＡ（配列番号２４））へ変異したＳ１～Ｓ２間の開裂／ｃｏｖｉｄ１９－Ｓ２／Ｓ２´（ＫＲ）／融合ペプチド／ＷＮＶ－ＴＭ２／初期ＹＦ－ＮＳ１
－構築物英国型スパイクバリアント：ｐＳＹＦ１７Ｄ－Ｓ－ＵＫ（非開裂）：シグナルペプチド（ＳＰ）由来の最初の１３を欠失したＳＡＲＳ－ＣｏＶ２英国型バリアント（ＶＯＣ ２０２０１２／０１、Ｂ．１．１．７）からのスパイクタンパク質、ＲＲＡＲ（配列番号２３）からＡＡＡＡ（配列番号２４）へと変異した開裂部位Ｓ１／Ｓ２、及びウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（ＷＮＶ－ＴＭ２）に融合したスパイクタンパク質のＣ末端）。
図２９に示される核酸（配列番号９８）及びアミノ酸配列（配列番号９９）の注釈：末端ＹＦ－Ｅ／最初の２７ヌクレオチドＹＦ－ＮＳ１（９アミノ酸）／２ａａＳＰ／ＣＯＶＩＤ１９－Ｓ１／ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧ（ＲＲＡＲ）（配列番号２３）からＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧ（ＡＡＡＡ）（配列番号２４）／へ変異したＳ１～Ｓ２間の開裂／ｃｏｖｉｄ１９－Ｓ２／Ｓ２´（ＫＲ）／融合ペプチド／ＷＮＶ－ＴＭ２／初期ＹＦ－ＮＳ１
構築物－２（配列番号５及び配列番号６によって定義される「ＹＦ－Ｓ０」）のスパイク配列に対するスパイクタンパク質の変異は、図２９の配列番号９８において太字（ヌクレオチド変化）及び下線（アミノ酸のコドン）で示されている。英国型バリアント：欠失アミノ酸６９～７０（「－」として表される）、欠失アミノ酸１４４（「－」として表される）、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ（ここで、数字は、配列番号２（すなわち、本明細書の他の箇所に記載されているように、シグナルペプチドを含む）のそれぞれのアミノ酸を示す）。
－構築物南アフリカ型スパイクバリアント：ｐＳＹＦ１７Ｄ－Ｓ－ＳＡ（非開裂）：シグナルペプチド（ＳＰ）由来の最初の１３を欠失した南アフリカ型バリアント（ＶＯＣ ５０１Ｙ．Ｖ２、Ｂ．１．３５１）からのスパイクタンパク質、ＲＲＡＲ（配列番号２３）からＡＡＡＡ（配列番号２４）へと変異した開裂部位Ｓ１／Ｓ２、及びウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（ＷＮＶ－ＴＭ２）に融合したスパイクタンパク質のＣ末端）。
図２９に示される核酸（配列番号１００）及びアミノ酸配列（配列番号１０１）の注釈：末端ＹＦ－Ｅ／最初の２７ヌクレオチドＹＦ－ＮＳ１（９アミノ酸）／２ａａＳＰ／ＣＯＶＩＤ１９－Ｓ１／ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧ（ＲＲＡＲ）（配列番号２３）からＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧ（ＡＡＡＡ）（配列番号２４）／へ変異したＳ１～Ｓ２間の開裂／ｃｏｖｉｄ１９－Ｓ２／Ｓ２´（ＫＲ）／融合ペプチド／ＷＮＶ－ＴＭ２／初期ＹＦ－ＮＳ１
構築物－２（配列番号５及び配列番号６によって定義される、「ＹＦ－Ｓ０」）のスパイク配列に対するスパイクタンパク質の変異は、図２９の配列番号１００において太字（ヌクレオチド変化）及び下線（アミノ酸のコドン）で示されている。ＳＡバリアント：Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、欠失２４２～２４４（「－」として表される）、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ（ここで、数字は、配列番号２（すなわち、本明細書の他の箇所に記載されているように、シグナルペプチドを含む）のそれぞれのアミノ酸を示す）。
－構築物ブラジル－日本（ＢＲ）型スパイクバリアント：ｐＳＹＦ１７Ｄ－Ｓ－ＢＲ（非開裂）：シグナルペプチド（ＳＰ）由来の最初の１３を欠失したブラジル－日本型（Ｂ．１．１．２４８）バリアント）からのスパイクタンパク質、ＲＲＡＲ（配列番号２３）からＡＡＡＡ（配列番号２４）へと変異した開裂部位Ｓ１／Ｓ２、及びウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（ＷＮＶ－ＴＭ２）に融合したスパイクタンパク質のＣ末端）。
図２９に示される核酸（配列番号１０２）及びアミノ酸配列（配列番号１０３）の注釈：末端ＹＦ－Ｅ／最初の２７ヌクレオチドＹＦ－ＮＳ１（９アミノ酸）／２ａａＳＰ／ＣＯＶＩＤ１９－Ｓ１／ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧ（配列番号２１）（ＲＲＡＲ（配列番号２３）からＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧ（配列番号２２）（ＡＡＡＡ（配列番号２４））／へ変異したＳ１～Ｓ２間の開裂／ｃｏｖｉｄ１９－Ｓ２／Ｓ２´（ＫＲ）／融合ペプチド／ＷＮＶ－ＴＭ２／初期ＹＦ－ＮＳ１
構築物－２（ＹＦ－Ｓ０、配列番号５及び配列番号６）のスパイク配列に対するスパイクの変異は、図２９の配列番号１０２において太字（ヌクレオチド変化）及び下線（アミノ酸のコドン）で示されている。ブラジル－日本（ＢＲ）型バリアント変異：Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆ（ここで、数字は、配列番号２（すなわち、本明細書の他の箇所に記載されているように、シグナルペプチドを含む）のそれぞれのアミノ酸を示す）。
実施例３．ＹＦ－Ｅ／ＮＳ１の間に挿入されたスパイク遺伝子配列による構築物
構築物３－ｐＳＹＦ１７Ｄ－ｎＣｏＶ－Ｓ（非開裂Ｓ２、二重変異体）：（シグナルペプチド（ＳＰ）由来の最初の１３ａａを欠失したＣＯＶＩＤ－１９スパイク、ＲＲＡＲ（配列番号２３）からＡＡＡＡ（配列番号２４）へと変異した開裂部位Ｓ１／Ｓ２、ＫＲからＡＮへと変異した第２の開裂Ｓ２´、及びウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（ＷＮＶ－ＴＭ２）に融合したＣ末端）。（図２２）
図２９に示されるような核酸（配列番号７）及びアミノ酸配列（配列番号８）の注釈：末端ＹＦ－Ｅ／最初の２７ヌクレオチドＹＦ－ＮＳ１（９アミノ酸）／２ａａＳＰ／ＣＯＶＩＤ１９－Ｓ１／ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧ（配列番号２１）（ＲＲＡＲ（配列番号２３））からＧＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＧ（配列番号２２）（ＡＡＡＡ（配列番号２４））へと変異したＳ１～Ｓ２間の開裂／ｃｏｖｉｄ１９－Ｓ２／ＡＡＧＣＧＣ（ＫＲ）から（ＡＮ）へと変異したＳ２´／融合ペプチドＷＮＶ－ＴＭ２／初期ＹＦ－ＮＳ１
実施例４：ＹＦ－Ｅ／ＮＳ１の間に挿入されたスパイク遺伝子配列Ｓ２サブユニットによる構築物
－構築物４－ｐＳＹＦ１７Ｄ－ｎＣｏＶ－Ｓ２（Ｅ／ＮＳ１）（ＹＦ１７Ｄ－Ｅ／ＮＳ１の間に挿入されたＣＯＶＩＤ－１９スパイクサブユニット－２、ウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（ＷＮＶ－ＴＭ２）に融合されたＣ末端）。（図２２）
図２９に示す核酸（配列番号９）及びアミノ酸配列（配列番号１０）の注釈：末端ＹＦ－Ｅ／最初の２７ヌクレオチドＹＦ－ＮＳ１（９アミノ酸）／サブユニット－２／Ｓ２´（ＫＲ）／融合ペプチド／ＷＮＶ－ＴＭ２／初期ＹＦ－ＮＳ１
実施例５：ＹＦ－Ｅ／ＮＳ１の間に挿入されたスパイク遺伝子配列Ｓ１サブユニットによる構築物
構築物５－ｐＳＹＦ１７Ｄ－ｎＣｏＶ－Ｓ１（Ｅ／ＮＳ１）（シグナルペプチド由来の最初の１３ａａを欠失し、ＷＮＶ－ＴＭ１及びＴＭ２に融合した、ＹＦ１７Ｄ－Ｅ／ＮＳ１の間に挿入されたＣＯＶＩＤ－１９スパイクサブユニット－１）。（図２２）
構築物５は、実施例８及び実施例９で参照される「ＹＦ－Ｓ１」に対応する。
図２９に示す核酸（配列番号１１）及びアミノ酸配列（配列番号１２）の注釈：末端ＹＦ－Ｅ／最初の２７ヌクレオチドＹＦ－ＮＳ１（９アミノ酸）／２ａａＳＰ／ＣＯＶＩＤ１９－Ｓ１／Ｓ１～Ｓ２間の開裂／初期ＣＯＶＩＤ－Ｓ２／ＷＮＶ－ＴＭ１及びＴＭ２／初期ＹＦ－ＮＳ１
実施例６：ＹＦコアに挿入されたＳ１サブユニット遺伝子配列
－構築物６－ｐＳＹＦ１７Ｄ－ｎＣｏＶ－Ｓ１（コア）（ＣＯＶＩＤ－１９スパイクサブユニット１）（図２２）
図２９に示されるような核酸（配列番号１３）及びアミノ酸配列（配列番号１４）の注釈：ＹＦコア´１－２１／ＣＯＶＩＤ１９－サブユニット－１／Ｔ２Ａペプチド／ＹＦコア２－２１
実施例７Ｓ：ＹＦコアに挿入されたＳ１サブユニット遺伝子配列
－構築物７－ｐＳＹＦ１７Ｄ－ｎＣｏＶ－Ｓ１－ＤＳＰ（シグナルペプチド由来の最初の１３ａａを欠失したＣＯＶＩＤ－１９スパイクサブユニット１）（図２２）
図２９に示される核酸（配列番号１５）及びアミノ酸配列（配列番号１６）の注釈：ＹＦコア´１－２１／２ａａシグナルペプチド／シグナルペプチド由来の最初の１３ａａを欠失したＣＯＶＩＤ１９－ＳＵＢＵＮＩＴ－１／Ｔ２Ａペプチド／ＹＦコア２－２１
実施例８：いくつかの動物モデルにおける構築物１、構築物２、及び構築物５のワクチン安全性、免疫原性、及び有効性の評価
８．１ ワクチン設計及び理論的根拠
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び他のコロナウイルスに対する防御免疫は、ウイルススパイク（Ｓ）タンパク質３、４を標的とする中和抗体（ｎＡｂ）に依存すると考えられている。特に、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有するＮ末端Ｓ１ドメインに特異的なｎＡｂは、いくつかの動物モデル５、６においてウイルス感染を予防することが示されている。
弱毒化ＹＦ１７Ｄ生ワクチンは、ほぼ全てのワクチン７、８において、単回ワクチン投与後から生涯にわたる防御をもたらし得る、広範な多機能先天性、体液性、及び細胞媒介性免疫（ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ：ＣＭＩ）応答を迅速に誘導するその顕著な効力について知られている。ＹＦ１７Ｄワクチンのこれらの好ましい特徴はまた、ＹＦ１７Ｄ骨格９に基づくベクトル化ワクチンにも当てはまる。ＹＦ１７Ｄは、２つの認可されたヒトワクチン［日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）に対するＩｍｏｊｅｖ（登録商標）及びデングウイルス（ｄｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ：ＤＥＮＶ）に対するＤｅｎｇｖａｘｉａ（登録商標）］におけるウイルスベクターとして使用される。これらの２つのワクチンについて、ＹＦ１７Ｄ表面抗原ｐｒＭ／Ｅをコードする遺伝子を、それぞれＪＥＶ又はＤＥＮＶの遺伝子と交換した。このＣｈｉｍｅｒｉＶａｘアプローチに基づく強力なジカウイルスワクチンは、前臨床開発中である１０。
ＹＦ１７Ｄは、限られたベクター容量を有する小型（＋）－ｓｓＲＮＡ弱毒化ウイルスであるが、ウイルスポリタンパク質の２つの主要部位における外来抗原の挿入に耐えることが示されている１１。重要なことに、外来配列の挿入は、（ｉ）ＹＦ１７Ｄポリタンパク質の複雑なトポロジー及び翻訳後プロセシング、かつ（ｉｉ）強力な組換えワクチンを得るために、免疫原性の、おそらく天然の倍数で目的の抗原を発現する必要性と、によって制約される。
組換えフラビウイルス１２、１３の産生のための先進的逆遺伝学システムを用いて、ＹＦ１７Ｄ系ＣＯＶＩＤ－１９ワクチン候補（ＹＦ－Ｓ）のパネルを設計した。これらは、ＹＦ１７Ｄ－Ｅ／ＮＳ１遺伝子間領域（ＹＦ－Ｓ１／２、ＹＦ－Ｓ０、及びＹＦ－Ｓ１）内のインフレーム融合として、原型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１株（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７．３）のＳタンパク質［その天然の開裂可能なＳ１／２、又は開裂不可能なＳ０バージョン、又はそのＳ１サブドメインのいずれか］のコドン最適化バージョンを発現する（図１Ａ、図８）。以下に概説するように、バリアントＹＦ－Ｓ０は、その優れた免疫原性、有効性、及び好ましい安全性プロファイルに基づいて、最終的にリードワクチン候補として選択された。
感染性弱毒化生ＹＦ－Ｓウイルスは、生物学的薬剤の生成のための確立された基材であり、かつワクチンウイルスが安定であることが示された医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）のガイドラインに従う場合、工業規模でのワクチン生成に好適である、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ－２１）細胞へのプラスミドトランスフェクトによってレスキューされた（図１０）。ウイルス誘導細胞変性効果を示したトランスフェクト細胞；感染性ウイルスの子孫を上清から回収し、更に特徴付けた。各構築物は、挿入された外来配列によってもたらされるいくつかの複製トレードオフと一致して、親ＹＦ１７Ｄのプラーク表現型（図１Ｂ）よりも小さい独特なプラーク表現型をもたらす。Ｓ抗原又はＳ１抗原及びＹＦ１７Ｄ抗原は、ＹＦ－Ｓ感染細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク及びＹＦ１７Ｄ特異的抗体により二重染色することによって、容易に可視化された（図１Ｃ）。ＹＦ－ＳバリアントのパネルによるＳ又はＳ１の発現を、新たに感染した細胞の溶解物のイムノブロッティングによって確認した。ＰＮＧａｓｅ Ｆによる処理は、適切なグリコシル化パターンを提示することを可能にした（図１Ｄ）。Ｓの元のＳ２サブユニット（柄及び細胞質ドメイン）を含有する完全長Ｓ１／２及びＳ０抗原は、（１）自発的に三量体１０～１２を形成し、かつ（２）細胞内に保持される（小胞体保持シグナルとして機能することが知られている余分な膜貫通ドメインへのＣ末端融合によって強化）と予想され得る。
より小さなプラーク表現型と一致して、乳飲みマウスにおけるＹＦ１７Ｄ又はＹＦ－Ｓバリアントの頭蓋内（ｉ．ｃ．）接種により、空ベクターＹＦ１７Ｄと比較して、異なるＹＦ－Ｓの弱毒化を確認した（図２Ａ及び図２Ｂ並びに図９）。親ＹＦ１７Ｄの１００プラーク形成単位（ＰＦＵ）をｉ．ｃ．接種した仔マウスは成長を停止し（図９Ａ）、７日以内に感染したが（安楽死日数の中央値；ＭＤＥ）（図２Ａ）、一方でＹＦ－Ｓバリアント接種した仔は成長を続けた。ＹＦ－Ｓ０を接種した群から、半分のみを安楽死させる必要があった（ＭＤＥ１７、５日間）。ＹＦ－Ｓ１／２群及びＹＦ－Ｓ１群について、ＭＤＥは、それぞれ１２日及び１０日であった；したがって、特にＹＦ－Ｓ０は、著しく低下した神経毒性を有する。同様に、ＹＦ－Ｓ０はまた、（ニューロトロピック）ＹＦ１７Ｄ感染に対して非常に感受性であるＩ型及びＩＩ型インターフェロン受容体欠損ＡＧ１２９マウスにおいて非常に弱毒化される１３、１４。ＹＦ１７Ｄの１ＰＦＵは、全てのマウスの安楽死を必要とする神経浸潤をもたらした（ＭＤＥ１６日）（図２Ｂ）が、一方でＹＦ－Ｓ０の１０００倍高い接種材料はいかなる疾患ももたらさず（図９Ｃ）、１０，０００倍高い接材料を受けた１２匹の動物のうち、１匹のみを安楽死させる必要があった（図２Ｂ）。要約すると、異なる形態のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ抗原を発現し、かつＹＦ１７Ｄと比較して神経毒性及び神経向性に関してマウスでは高度に弱毒化されている、一組のトランスジェニック複製コンピテントＹＦ１７Ｄバリアント（ＹＦ－Ｓ）を産生した。
８．２ ストリンジェントなハムスターモデルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及びＣＯＶＩＤ－１９様疾患に対する免疫原性及び保護。
様々なワクチン構築物の効力を評価するために、ストリンジェントなハムスターチャレンジモデルを開発した２。動物を、０日目に異なる構築物又は陰性対照の１０３ＰＦＵ（腹腔内経路）でワクチン接種し、７日後に同じ用量で追加免疫した（図３Ａ）。ワクチン接種後２１日目に、ＹＦ－Ｓ１／２及びＹＦ－Ｓ０をワクチン接種した全てのハムスター（ｎ＝１２、２回の独立した実験から）は、高レベルのＳ特異的ＩｇＧ及びウイルスｎＡｂに血清転換した（図３Ｂ、図３Ｃ；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２血清中和試験、ＳＮＴのベンチマークについては図１０を参照のこと。）。ＹＦ－Ｓ１／２の場合、ＩｇＧ及びｎＡｂのｌｏｇ１０幾何平均力価（ＧＭＴ）は、それぞれ３．２（９５％ＣＩ、２．９～３．５）及び１．４（９５％ＣＩ、１．１～１．９）であったが、一方でＹＦ－Ｓ０の場合、ＩｇＧ及びｎＡｂのＧＭＴ値３．５（９５％ＣＩ、３．３～３．８）及び２．２（９５％ＣＩ、１．９～２．６）が測定され、急速な血清転換動態を示した（５０％血清転換率＜２週間；図３Ｄ）。対照的に、ＹＦ－Ｓ１を受けた１２匹のハムスターのうち１匹のみが血清転換し、これは低レベルのｎＡｂを有していた。これは、充分な体液性免疫応答を誘発するための完全長Ｓ抗原の必要性を示している。
次に、ワクチン接種したハムスターを、鼻腔内（ワクチン接種後２３日目又は２８日目のいずれかにおいて）で、２×１０５ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によりチャレンジさせた。感染後４日目に、シャムワクチン接種対照と、適合プラセボとしてＹＦ１７Ｄをワクチン接種した動物の肺とで、高いウイルス負荷が検出された（図４Ａ、図４Ｂ）。感染は、重度のＣＯＶＩＤ－１９気管支肺炎の患者における所見に類似する、多巣性壊死性細気管支炎、白血球浸潤、及び浮腫を伴う重度の肺病理を特徴とした（図４Ａ検体写真及び図４Ｂレーダプロット）。対照的に、ＹＦ－Ｓ０をワクチン接種したハムスターは、この攻撃的チャレンジから防御された（図３Ｅ～図３Ｆ）。シャムワクチン接種対照と比較して、ＹＦ－Ｓ０ワクチン接種動物は、ウイルスＲＮＡ負荷（ｐ＜０．０００１；図３Ｄ）が５ ｌｏｇ１０（ＩＱＲ、４．５～５．４）減少し、肺における感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ｐ＜０．０００１；図３Ｅ）が５．３ ｌｏｇ１０（ＩＱＲ、３．９～６．３）減少した中央値を有した。更に、感染性ウイルスは１２匹のハムスターのうち１０匹においてもはや検出できず（２つの独立した実験）、ウイルスＲＮＡはそれらの肺で定量不可能なレベルまで減少した。１２匹の動物のうち２匹で測定された残留ＲＮＡは、非ヒト霊長類モデルで観察されるように、高力価接種材料の残留物を同様に表し得る１５～１８。ＹＦ－Ｓ０（１０３ＰＦＵの２つの用量）によるワクチン接種もまた、全身性ウイルス拡散を効率的に予防した；ほとんどの動物では、感染の４日後に、脾臓、肝臓、腎臓、及び心臓でウイルスＲＮＡは検出されなかったか、又は非常に低いレベルしか検出されなかった（図１１Ａ）。同様に、全面支援を維持し、ワクチン接種に使用されるわずかに異なる用量及びスケジュール（それぞれ、０日目及び７日目に５×１０３ＰＦＵのＹＦ－Ｓ０）により、シャムと比較して、それぞれ６ ｌｏｇ１０（ＩＱＲ、４．６～６．６）及び５．７ ｌｏｇ１０（ＩＱＲ、５．７～６．６）のウイルスＲＮＡ及び感染ウイルス力価の減少で、全てのワクチン接種ハムスター（ｎ＝７）が得られた（図１２）。最後に、ＹＦ－Ｓ０ワクチン接種ハムスターの約半分ではチャレンジ後に既往性抗体応答が観察されなかったという事実によって実証されるように、ＹＦ－Ｓ０ワクチン接種は飽和レベルのｎＡｂを誘導し、それによって殺菌免疫を付与し得る（図３Ｇ及び図１１Ｂ～図１１Ｄ（対のｎＡｂ分析））。対照的に、次善のワクチン候補ＹＦ－Ｓ１／２によりワクチン接種したハムスターでは、（１２匹の動物のうち１１匹において）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後にｎＡｂレベルが更に増加し、これによってチャレンジ後にのみ安定水準に近づいた。
ＹＦ－Ｓ０ワクチン接種動物の肺は正常のままであったか、又は正常に近く、シャムワクチン接種動物とは著しく異なる気管支肺炎の徴候はもはやなかった（２つの独立した実験によるｎ＝１２；図４）。定量化された特定の疾患スコア及びバイオマーカ２には、（ｉ）組織学的検査によって観察される検出可能な肺病理の減少又は欠如（図４Ａ、図４Ｂ、図１３Ａ）と、（ｉｉ）胸部のマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）によって誘導される、ＹＦ－Ｓ０ワクチン接種動物における個々の肺スコア（ｐ＝０．００２）（図４Ｃ、図１３Ｂ）及び呼吸能力（すなわち、閉塞された肺容積が＊３２％少ない；ｐ＝０．０３２３；図４Ｄ）の有意な改善と、が含まれた。加えて、ＹＦ－Ｓ０による免疫化は、ＣＯＶＩＤ－１９の疾患増悪に関連した、肺におけるサイトカイン、例えばＩＬ－６、ＩＬ－１０、又はＩＦＮ－γの発現のほぼ完全な、ほとんどの場合完全な正常化をもたらした（図４Ｅ、図４Ｆ、及び図１４）１９～２１。抗ウイルスＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－λ）２２の誘導、又はＹＦ－Ｓ０ワクチン接種動物におけるＭＸ２及びＩＰ－１０などのＩＦＮ刺激遺伝子（ＩＳＧ）の発現など、ウイルス感染の最も感受性の高いマーカでさえ、未処置健常対照の肺におけるレベルと比較して上昇を示さなかった（図４Ｆ及び図１４）。
全体として、開裂不可能なＳバリアントを発現するＹＦ－Ｓ０は、Ｓの開裂可能なバージョンを発現する構築物ＹＦ－Ｓ１／２よりも優勢であった。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の関連保護抗原として働くＳの安定化された融合前形態を示す。更に、ｎＡｂを誘導できなかったこと（図３Ｂ）と一致して、ｈＡＣＥ２受容体結合Ｓ１ドメインのみを発現する構築物ＹＦ－Ｓ１（図１Ｄ）は、ハムスターにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対するいかなる防御も与えなかった（図３Ｅ、図３Ｆ、及び図４）。
８．３ マウスにおける免疫原性、特に細胞媒介性免疫の好ましいＴｈ１極性化
ハムスターにおいてＣＭＩを研究するために利用可能なツールは非常に少ないので、異なるＹＦ－Ｓ構築物によって誘発される体液性及びＣＭＩ応答をマウスにおいて並行して研究した。ＹＦ１７Ｄは野生型マウス２３、２４では容易に複製しないので、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達が欠損しており、したがってＹＦ１７Ｄによるワクチン接種を受けやすい、Ｉｆｎａｒ－／－マウスを採用した１０、２４、２５。
マウスへ４００ＰＦＵ（ＹＦ－Ｓ、ＹＦ１７Ｄ、又はシャムバリアントのいずれか）を０日目にワクチン接種し、７日後に同じ用量で追加免疫した（図５Ａ）。２１日目に、全てのＹＦ－Ｓ１／２及びＹＦ－Ｓ０ワクチン接種マウス（３回の独立した実験においてｎ＞９）は、ＩｇＧについて３．５（９５％ＣＩ、３．１～３．９）、及びＹＦ－Ｓ１／２の場合はｎＡｂについて２．２（９５％ＣＩ，１．７～２．７）、又はＹＦ－Ｓ０の場合はＩｇＧについて４．０（９５％ＣＩ、３．７～４．２）、及びｎＡｂについては３．０（９５％ＣＩ、２．８～３．１）のｌｏｇ１０ＧＭＴで、高レベルのＳ特異的ＩｇＧ及びｎＡｂに血清転換した（図５Ｂ、図５Ｃ）。重要なことに、Ｓ特異的ＩｇＧへの血清転換は、最初の免疫化後７日という早期に検出可能であった（図５Ｄ）。ＩｇＧのアイソタイピングにより、ＩｇＧ１に対するＩｇＧ２ｂ／ｃの過剰が明らかになり、免疫応答（図５Ｅ）の優勢な炎症誘発性、したがって抗ウイルス（Ｔｈ１）極性化が示された。これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン誘導性防御に重要であると考えられる２６～２８。ハムスターと同様に、ＹＦ－Ｓ１はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｎＡｂを誘導することができなかった（図５Ｂ、図５Ｃ）。しかしながら、高レベルのＹＦ ｎＡｂが全ての構築物によって共同的に誘導され、一貫した免疫化が確認された（図１５）。
ワクチン誘導性免疫の形成及び寿命、並びにＣＯＶＩＤ－１９２９、３０の病因において極めて重要な役割を果たすＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＭＩ応答を評価するために、ワクチン接種マウスの脾細胞を、リコール抗原としてＳタンパク質全体に及ぶタイル状ペプチドライブラリーと共にインキュベートした。一般に、ＹＦ－Ｓバリアントのいずれかによるワクチン接種は、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔ（図６Ａ）によって検出されるように、特にＹＦ－Ｓ０ワクチン接種マウスから単離された細胞においてＴ－ｂｅｔ（ＴＢＸ２１）の上方制御によって更に支持される、好ましいＴｈ１極性化を有する顕著なＳ特異的Ｔ細胞応答をもたらした（ｐ＝０．０１９８、ｎ＝５）。このＣＭＩプロファイルは、ＧＡＴＡ－３レベルの付随する上昇（ＧＡＴＡ３；Ｔｈ２駆動；ｐ＝０．０１６）によって均衡されたが、ＲＯＲγｔ（ＲＯＲＣ；Ｔｈ１７）又はＦｏｘＰ３（ＦＯＸＰ３；Ｔｒｅｇ）の顕著な過剰発現はなかった（図６Ｂ）。興味深いことに、マウスにおいてｎＡｂを誘導できないこと（図５Ａ、Ｃ）、又はハムスターにおいて防御できないこと（図２及び図３）とは対照的に、ＹＦ－Ｓ１をワクチン接種した動物は、ＹＦ－Ｓ１／２又はＹＦ－Ｓ０をワクチン接種した動物よりも数多くのＳ特異的脾細胞（ｐ＜０．０００１、ｎ＝７）を有していた（図６Ａ）。したがって、激しいＣＭＩであっても、ワクチンの有効性には充分ではない場合がある。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリーの手段によるＴ細胞区画のより詳細なプロファイリングにより、特にＹＦ－Ｓ０免疫動物において、Ｓ特異的ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α発現ＣＤ８＋Ｔリンパ球、並びにＩＦＮ－γ発現ＣＤ４＋（図６Ｅ）及びγ／δＴリンパ球（図６Ｆ）の存在が確認された。ＩＬ－４（Ｔｈ２極性化）、ＩＬ－１７Ａ（Ｔｈ１７）、又はＦｏｘＰ３（調節性Ｔ細胞）などの他のマーカの特異的かつ顕著な上昇は、ＹＦ－Ｓ１／２又はＹＦ－Ｓ０については観察されなかった。この表現型は、ＩＦＮ－γ発現細胞の割合の増加を示す、ＹＦ－Ｓ１／２及びＹＦ－Ｓ０ワクチン接種マウス（図６Ｇ及び１５ ｔＳＮＥ）におけるそれぞれのＴ細胞集団のｔ－ＳＮＥプロット分析によって支持される。第１に、ＹＦ－Ｓ０ワクチン接種動物の場合、Ｔｈ１（ＩＦＮ－γ＋及び／又はＴＮＦ－α＋）細胞と、Ｔｈ２（ＩＬ－４＋）細胞との等しくバランスのとれた混合物、及び場合によってはＴｈ１７細胞のわずかな増加を含む、いずれかのＣＤ４＋細胞セットのいずれかの同様の組成物が更に明らかになった。同様に、第２に、両方の構築物について、ＣＤ８＋Ｔリンパ球集団は、一致した転写プロファイルと一致して、ＩＦＮ－γ又はＴＮＦ－α発現細胞によって支配された（図６Ｂ）。注目すべきことに、数は類似していたが、両方のワクチンＹＦ－Ｓ０及びＹＦ－Ｓ１／２は、ＩＦＮ－γを発現するそれぞれのＣＤ８＋Ｔリンパ球集団に関して区別された（重複しない）プロファイルを示した。実際、ＹＦ－Ｓ０は、Ｓ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する傾向があり、ＩＦＮ－γのより強い発現を伴った（図６Ｇ及び図１５）。要約すると、ＹＦ－Ｓ０は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓ抗原に遭遇した場合に高レベルのＩＦＮ－γを発現するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が支配的である、良好なＴｈ１極性化を有するマウスにおいて活発でバランスのとれたＣＭＩ応答を誘導する。
８．４ 単回投与ワクチン接種後の防御及び短期間の利益
最後に、ＹＦ－Ｓ０の単回投与を用いたハムスターのワクチン接種は、用量及び時間依存的様式で、高レベルのｎＡｂ及びｂＡｂ（図７Ｂ及び図７Ｃ）を誘導した。更に、ＹＦ－Ｓ０の単一の１０４ＰＦＵ用量は、２用量の１０３ＰＦＵを用いたプライム・ブーストワクチン接種における抗体レベルと比較して、ワクチン接種後２１日でより高いレベルのｎＡｂ（ｌｏｇ１０ＧＭＴ２．８；９５％ＣＩ：２．５～３．２）をもたらした（ｌｏｇ１０ＧＭＴ２．２；９５％ＣＩ：１．９～２．６）（ｐ＝０．０３９、両側マン・ホイットニー検定）（図３Ｂ）。また、この単回投与レジメンは、８匹のうち８匹の動物において、肺に感染性ウイルスが存在しないことによって評価されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対する効率的かつ完全な防御をもたらした（図７Ｅ）。定量可能なレベルのウイルスＲＮＡは、８匹の動物のうち１匹のみに存在したことに留意すべきである（図７Ｄ）。加えて、防御免疫が迅速に実装された。ワクチン接種の１０日後に既に、１０４ＰＦＵのＹＦ－Ｓ０を受けた８匹の動物のうち５匹が、ストリンジェントな感染チャレンジから防御された（図７Ｄ及び図７Ｅ）。注目すべきことに、長期追跡中のＮａｂ及び結合抗体の持続性は、この単回投与ワクチン接種によって誘導される免疫のかなりの寿命を暗示する。
８．５ 考察
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンは安全である必要があり、短時間で、理想的には１回の単回投与後に、持続的な防御免疫が得られる。様々なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン候補が開発されており、いくつかはベクター系である。本発明者らは、ＹＦ１７Ｄベクター化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン候補の有望な結果を報告している。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の融合後（Ｓ１／２）、融合前（Ｓ０）、及びＲＢＤ Ｓ１ドメイン（Ｓ１）を、ＹＦ１７Ｄ骨格に挿入して、それぞれＹＦ－Ｓ１／２、ＹＦ－Ｓ０、及びＹＦ－Ｓ１を得た（図８）。特に、ＹＦ－Ｓ０ワクチン候補は、マウス及びシリアンハムスターの両方において堅牢な体液性免疫応答をもたらした。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は感染したシリアンハムスターの肺で大量に複製し、主要な肺病理をもたらす２、３１～３３ので、本発明者らは、これら３種のワクチン候補の効力を評価するためにこのモデルを選択した。ＹＦ－Ｓ０は、より激しいとは言わないまでも、非ヒト霊長類モデルにおける他のワクチン候補に匹敵する、ストリンジェントなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジに対する効率的な防御をもたらした１６、１７、３４。ＹＦ－Ｓ０ワクチン接種動物の約４０％では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後のｎＡｂレベルの増加（＞２倍）は観察されず、殺菌免疫が示唆された（既往反応なし）。１０４ＰＦＵ単回用量ワクチン接種の３週間後に動物をチャレンジした実験では、肺に感染性ウイルスは検出されなかった。モデルの重症度を考慮すると、ワクチン接種の１０日後に既にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２にチャレンジされたいくつかの動物では、感染性ウイルスを肺から回収できなかったということは、注目に値する。
ウイルス複製の減少は、感染及び疾患に関連するバイオマーカの正常化を伴う感染動物の肺病理を軽減した（図４及び図１３）。同様に、ワクチン接種し、続いてチャレンジしたハムスターの肺では、ＩＬ－６などのサイトカインの上昇は認められなかった（図４Ｆ）。比較的低い皮下用量のＹＦ－Ｓ０によるマカクのワクチン接種は、高いＮＡｂ力価への迅速な血清転換をもたらした。この有望な効力が、ヒトにおける臨床使用のための単純なワンショット投与レジメンにつながり得ると推測することは魅力的である。
更に、ＹＦ－Ｓ０は、２つのマウスモデルにおいて、親ＹＦ１７Ｄベクターと比較して好ましい安全性プロファイルを示し（図２Ａ及び図２Ｂ）、ハムスター及び非ヒト霊長類において充分に忍容される。ＹＦ１７Ｄワクチンは、高齢者及び基礎疾患を有する人に禁忌であるため、これは重要である。これらの予備的な心強いデータは、ＹＦ－Ｓ０がＣＯＶＩＤ－１９に対して最も脆弱な人々においてもまた安全であり得ることを示唆している。
更に、マウスにおいて研究された細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）は、ＹＦ－Ｓ０が、高力価のｎＡｂを効率的に誘導することに加えて、Ｔｈ１応答を促進することを明らかにした。そのようなＴｈ１極性化は、歪んだ（ｓｋｅｗｅｄ）Ｔｈ２免疫２９又は抗体依存性増強（ＡＤＥ）３５におそらく関連する疾患増強に照らして関連性があると考えられる。ＡＤＥは、不活化ＲＳＶ融合後ワクチン候補について示唆されるように、ウイルス特異的抗体が様々なＦｃγ受容体媒介機構を介してウイルス感染を促進する場合に起こり得る３６。Ｔｈ２極性化は、代替的に活性化された「創傷治癒」単球／マクロファージ２６～２８、３７の誘導及び調節不全を引き起こし、過剰な炎症応答（サイトカインストーム）をもたらし、したがって急性肺傷害（ＡＬＩ）をもたらし得る。本発明者らのモデルでは、このような疾患増強の徴候は観察されなかった。
結論として、ＹＦ－Ｓ０は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症に対する激しい防御免疫を付与する。注目すべきことに、この免疫は、単回投与ワクチン接種後１０日以内に達成することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が再感染のスパイクで流行し続けるという脅威を考慮すると、再発性の伝染病として、このプロファイルを有するワクチンは、集団全体の免疫化プログラムに理想的に適している可能性がある。
８．６ 方法
細胞及びウイルス
ＢＨＫ－２１Ｊ（ベビーハムスター腎臓線維芽細胞）細胞３７を最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）、Ｖｅｒｏ Ｅ６（アフリカミドリザル腎臓、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８６）中で維持し、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ヒト胎児腎臓細胞）細胞をダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）中で維持した。全ての培地に１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１％重炭酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を添加した。ＢＳＲ－Ｔ７／５（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現ＢＨＫ－２１）３８細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬジェネテシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ中に維持した。
ハムスターにおける全ての攻撃実験について、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ＢｅｔａＣｏｖ／Ｂｅｌｇｉｕｍ／ＧＨＢ－０３０２１／２０２０（ＥＰＩ ＩＳＬ４０７９７６｜２０２０－０２－０３）を、記載２のようにＶｅｒｏ Ｅ６細胞上で増殖させた継代Ｐ４から使用した。ＹＦ１７Ｄ（Ｓｔａｍａｒｉｌ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ－Ｐａｓｔｅｕｒ）を、使用前にＶｅｒｏ Ｅ６細胞において２回継代培養した。
ワクチンの設計及び構築
ＹＦ１７Ｄ（誘導性ＢＡＣ発現ベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＹＦ１７Ｄ、特許番号ＷＯ２０１４１７４０７８Ａ１）の感染性ｃＤＮＡクローンを用いて、異なるワクチン構築物を作製した１０、１２、３９。いくつかのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ワクチン候補のパネルを、ＹＦ－Ｅ／ＮＳ１遺伝子間領域１１、４０内の翻訳インフレーム融合として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（Ｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７．３）又はそのバリアントのいずれかのコドン最適化配列をＹＦ１７Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０３７００）の完全長ゲノムに挿入することによって操作した（図８）。生成されたバリアントは、（ｉ）融合後及び／又は融合配座でＳを発現するアミノ酸（ａａ）１４～１２７３由来のＳタンパク質配列（それぞれ、ＹＦ－Ｓ１／２及びＹＦ－Ｓ０）、又は（ｉｉ）そのサブユニット－Ｓ１（ａａ１４－７２２；ＹＦ－Ｓ１）のいずれかを含有した。ＹＦ骨格における適切なＹＦトポロジー及び異なるＳ抗原の正しい発現を確実にするために、ＷＮＶ由来の膜貫通ドメインを挿入した。
ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によるＳ ｃＤＮＡ（重複する合成ｃＤＮＡ断片についてＰＣＲ後に得た；ＩＤＴ）を、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＹＦ１７Ｄ骨格に組み合わせることによって、ＳＡＲＳ２－ＣｏＶ－２ワクチン候補をクローニングした。ＮＥＢ Ｂｕｉｌｄｅｒ反応混合物を大腸菌ＥＰＩ３００細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に形質転換し、Ｓタンパク質ｃＤＮＡのインテグレーションの成功をサンガーシーケンシングによって確認した。組換えプラスミドを、一晩増殖させた後、カラムクロマトグラフィ（Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ、Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇｅｌ）によって精製し、続いて１０に記載のように２ｍＭのＬ－アラビノースを添加することによって、６時間にわたりＢＡＣベクターを更に増幅した。
感染性ワクチンウイルスを、標準的なプロトコル（ＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ社）を用いたＢＨＫ－２１Ｊ細胞へのトランスフェクションによってプラスミド構築物から産生した。細胞のほとんどがＣＰＥの徴候を示したトランスフェクションの４日後に上清を回収した。感染性ウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ）を、以前１０、１４に記載されたように、ＢＨＫ－２１Ｊ細胞に対するプラークアッセイによって決定した。産生したワクチンウイルスストック中の挿入配列の存在を、ＲＮＡ抽出（Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡキット、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、続いてＲＴ－ＰＣＲ（ｑＳｃｒｉｐｔＸＬＴ、Ｑｕａｎｔａ）、及びサンガーシーケンシングによって、及び新たに感染した細胞の免疫ブロットによって確認した（下記参照）。
ＹＦ－Ｓ０ワクチンウイルスの遺伝子安定性の分析
ＹＦ－Ｓ０ワクチンウイルスの遺伝的安定性を試験するために、トランスフェクトされたＢＨＫ－２１細胞（Ｐ０）から回収されたウイルス上清を１回プラーク精製し（Ｐ１）、ＢＨＫ－２１細胞上で連続して継代培養した（Ｐ３～Ｐ６）。更に、増幅後に、２回目のプラーク精製からの２５種のプラーク単離株の遺伝的安定性を分析した（Ｐ４＊）。２つの異なる細胞基材の比較のために、トランスフェクトされたＶｅｒｏ又はＢＨＫ－２１細胞から回収されたＹＦ－Ｓ０ウイルス上清を、それぞれ、Ｖｅｒｏ又はＢＨＫ－２１細胞上で１回継代培養した。
全ての継代について、新鮮な細胞に、それぞれの以前の継代培養からのウイルス上清の１：２希釈物を１時間感染させた。感染後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。感染細胞の上清を、それぞれ、ＢＨＫ－２１及びＶｅｒｏの感染の７２又は９６時間後にルーチン的に採取した。産生した継代培養中の挿入配列の存在を、ＲＮＡ抽出（Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡキット、Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）及びＤＮａｓｅ Ｉ処置、続いてＲＴ－ＰＣＲ（ｑＳｃｒｉｐｔＸＬＴ、Ｑｕａｎｔａ）、及びサンガーシーケンシングによって、及び新たに感染した細胞の免疫ブロットによって確認した（下記参照）。
免疫蛍光染色
異なるワクチン候補のインビトロ抗原発現を、Ｋｕｍら（２０１８年）によって以前に記載されたように、免疫蛍光染色によって検証した。簡単に言えば、ＢＨＫ－２１Ｊ細胞を、異なるＹＦ－Ｓワクチン候補の１００ＰＦＵで感染させた。感染細胞を感染３日後（３ｄｐｉ）に染色した。ＹＦ抗原の検出のために、ポリクローナルマウス抗ＹＦ１７Ｄ抗血清を使用した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原の検出にはウサギＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイクＳ１抗体（４０１５０－ＲＰ０１、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）及びウサギＳＡＲＳ－ＣｏＶスパイク一次抗体（４０１５０－Ｔ６２－ＣＯＶ２、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いた。二次抗体は、ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－５９４、及びヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－５９４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。細胞をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ）で対比染色した。ＨＣＸ ＰＬ ＡＰＯ ６３ｘ（ＮＡ１．２）水浸対物レンズを採用して、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡で同じ設定を用いて、全ての共焦点蛍光画像を取得した。
免疫ブロット分析（シンプルウェスタン）
感染したＢＨＫ２１－Ｊ細胞を採取し、氷冷リン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄し、１×プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する放射免疫沈降アッセイ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解した。４℃にて１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、清澄化した溶解物中のタンパク質濃度を、ＢＣＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。免疫ブロット分析を、製造業者の説明書に従ってシンプルウェスタンのサイズに基づくタンパク質アッセイ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）によって行った。簡潔には、各キャピラリに４００ｎｇの総タンパク質を負荷した後、特異的一次抗体（ＮＢ１００－５６５７８、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、及び４０１５０－Ｔ６２－ＣｏＶ２、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）、及びＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いて特異的Ｓタンパク質レベルを同定した。Ｃｏｍｐａｓｓソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）を用いて化学発光シグナルを分析した。糖タンパク質からのＮ結合型オリゴ糖の除去を評価するために、タンパク質抽出物を、製造者の説明書（ＮＥＢ）に従ってＰＮＧａｓｅ Ｆで処理した。
動物
野生型シリアンハムスター（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａｔｕｓ）、並びにＢＡＬＢ／ｃマウス及び仔マウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＬｅＧｅｎｅｓｔ－Ｓａｉｎｔ－Ｉｓｌｅ（フランス）から購入した。Ｉｆｎａｒ１－／－４１及びＡＧ１２９４２を自家繁殖させた。６～１０週齢のＩｆｎａｒ－／－マウス、６～８週齢のＡＧ１２９マウス、及び６～８週齢のメス野生型ハムスターを、試験全体を通して使用した。
動物実験
動物をカップル（ハムスター）又は５匹ごとに（マウス）、個別に換気されたアイソレータケージ（ＩｓｏＣａｇｅ Ｎ－Ｂｉｏｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ）に収容し、食物及び水を自由に摂取させ、ケージをエンリッチメントした（マウスのための綿及び厚紙製遊戯用トンネル、ハムスターのための木材ブロック）。収容条件及び実験手順は、ヨーロッパ実験動物学会連合（ｔｈｅ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ：ＦＥＬＡＳＡ）によって承認された学会ガイドラインに従って、ルーヴェン・カトリック大学倫理委員会（ｔｈｅ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ）（ライセンスＰ０１５－２０２０）によって承認された。動物を、１００μＬ（マウス）又は５００μＬ（ハムスター）の腹腔内投与されたＤｏｌｅｔｈａｌ（２００ｍｇ／ｍＬのペントバルビタールナトリウム、ベトキノールＳＡ）によって安楽死させた。
ハムスターの免疫及び感染
ハムスターに、プライム・ブーストレジメンを用いて（０日目及び７日目）、示された量の異なるワクチン構築物のＰＦＵで腹腔内（ｉ．ｐ）ワクチン接種した。対照として、２つの群へ、１０３ＰＦＵのＹＦ１７Ｄ又は２％ＦＢＳ（シャム）を含有するＭＥＭ培地のいずれかを０日目及び７日目にワクチン接種した。２１日目に全ての動物から採血して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する結合抗体及び中和抗体について血清を分析した。ワクチン接種後及びチャレンジ前の指示された時間に、ハムスターを、キシラジン（１６ｍｇ／ｋｇ、ＸＹＬ－Ｍ（登録商標）、Ｖ．Ｍ．Ｄ．）、ケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ、Ｎｉｍａｔｅｋ（登録商標）、ＥｕｒｏＶｅｔ）、及びアトロピン（０．２ｍｇ／ｋｇ、Ｓｔｅｒｏｐ（登録商標））溶液の腹腔内注射によって麻酔した。２×１０５ ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有するウイルスストックの液滴５０μＬを両鼻孔に静かに添加することによって、各動物の鼻腔内に接種した。疾患の徴候（嗜眠、重い呼吸、又は乱れた毛）について、動物を毎日監視した。チャレンジの４日後、全ての動物を安楽死させて、それぞれ、遺伝子発現プロファイリング、ウイルス滴定、又は病理組織学的分析のために、後ほどＲＮＡ、ＭＥＭ、又はホルマリン中の最終血清及び肺組織を収集した。
マウスの免疫
Ｉｆｎａｒ１－／－マウスを、各４×１０２ＰＦＵのプライム・ブーストを用いることによって（０日目及び７日目）、異なるワクチン構築物で腹腔内投与によりワクチン接種した。対照として、２つの群に、ＹＦ１７Ｄ又はシャムのいずれかを（０日目及び７日目に）ワクチン接種した。全てのマウスから毎週採血し、間接免疫蛍光アッセイ（ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ：ＩＩＦＡ）及び血清中和試験（ｓｅｒｕｍ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ：ＳＮＴ）のために遠心分離によって血清を分離した。第１のワクチン接種の３週間後、マウスを安楽死させ、ＥＬＩＳｐｏｔ、ｑＰＣＲによる転写因子分析、及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）のために脾臓を採取した。
カニクイザルの免疫化及び感染チャレンジ
全ての収容及び動物手順は、動物実験中央委員会（ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）によって発行されたプロジェクトライセンスＡＶＤ５０２００２０２０９４０４の下において、独立した倫理委員会（ＤＥＣ－ＢＰＲＣ）による積極的な助言に基づいて、かつ施設内動物福祉機関による詳細な研究プロトコルの承認後に、ＢＰＲＣで行われた。全ての動物の取り扱いは、オランダの法律に従って動物科学省（ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）内で行われ、政権当局（オランダ食品及び消費者安全当局（Ｎｅｄｅｒｌａｎｄｓｅ Ｖｏｅｄｓｅｌ－ｅｎ Ｗａｒｅｎａｕｔｏｒｉｔｅｉｔ、ＮＶＷＡ））、及び動物福祉機関によって定期的に検査された。マカクを社会的に適合するケージへペアで収容し、２つの群に無作為に割り当てた。６匹（ｎ＝６）のカニクイザルを、０日目（プライム）及び７日目（ブースト）で、ＹＦ－Ｓ０の１０５ＰＦＵの用量を用いて内上肢の皮下にワクチン接種した。対照として、ｎ＝６匹のマカクに、同じ場所（Ｅ／ＮＳ１接合部）に挿入されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と配列相同性のない無関係の対照抗原を有する組換えＹＦ１７Ｄからなる、１０５ＰＦＵの適合プラセボワクチンを２回ワクチン接種した。体温及び活動の連続リアルタイム測定を提供する温度モニタを、研究開始の３週間前に各マカクの腹腔に埋め込んだ（Ａｎａｐｉｌｌ ＤＳＩ）。健康を毎日チェックし、マカクを、食欲、一般的行動、及び便の硬さについて監視した。全血数及び臨床化学の定期的な評価のために血液を採取したが、正常範囲外の変化は検出されなかった。ワクチン接種後２１日目に、全てのマカクに、名目上１．５×１０４ＴＣＩＤ５０のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｖｅｒｏ細胞に対する逆滴定によって決定）を合計体積５ｍＬで鼻腔内・気管内混合接種により、チャレンジさせた；気管（４ｍＬ）と鼻孔（各０．２５ｍＬ）に分けた。得られたウイルスＲＮＡ負荷量を、２００ＲＮＡコピー／ｍＬの検出下限で記載されるようにＲＴ－ｑＰＣＲを用いて喉スワブで定量した。２１日間の追跡後、肺の組織学的分析のためにマカクを安楽死させた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＴ－ｑＰＣＲ
肺ホモジネート中の感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子の存在をｑＰＣＲ２によって定量した。簡単に説明すると、チャレンジ後のウイルスＲＮＡレベル及び遺伝子発現の定量化のために、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｋｉｔ Ｐｌｕｓ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて、製造業者の指示に従い、均質化された器官からＲＮＡを抽出した。反応は、ｉＴａｑ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅｓ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ｑＰＣＲキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いて実施し、プライマ及びプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補足表Ｓ１に列挙した。相対的ＲＮＡ倍率変化を、正規化のためにハウスキーピング遺伝子β－アクチンを用いて２－ΔΔＣｑ法４３により計算した。
終点ウイルス力価測定
感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２粒子を定量するために、９６ウェルプレート中のコンフルエントなＶｅｒｏ Ｅ６細胞に対して終点滴定を行った。肺組織を、２５０μＬの最小必須培地中においてビーズ破壊（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標））を用いて均質化し、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分、４℃）して、細胞残屑をペレット化した。ウイルス力価を、リード・ミュンヒ法４４によって計算し、組織１ｍｇ当たりの５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）として表した。
組織学
組織学的検査のために、肺組織を４％ホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋した。組織切片（５μｍ）をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、専門病理医によって、肺損傷についてブラインドで分析した。
マイクロコンピュータ断層撮影（ＣＴ）及び画像解析
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２チャレンジ後の肺病理の発症を監視するために、ハムスターを、２の前に記載されるように、Ｘ－ｃｕｂｅマイクロコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｂｅｓ）を用いて画像化した。再構築されたマイクロＣＴデータの定量化を、ＤａｔａＶｉｅｗｅｒ及びＣＴａｎソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて行った。前述のように２、４５～４８、マイクロＣＴデータの半定量的スコアリングを一次転帰測定として行い、画像法由来バイオマーカ（非通気肺体積）を二次測定として行った。
乳飲みマウスにおける神経毒性及びＡＧ１２９マウスにおける神経向性
ＢＡＬＢ／ｃ仔マウス及びＡＧ１２９マウスは、それぞれ、示されたＰＦＵ量のＹＦ１７Ｄ及びＹＦ－Ｓワクチン構築物を、頭蓋内又は腹腔内で接種し、接種後２１日間にわたり罹患率及び死亡率について毎日監視した。
間接免疫蛍光アッセイ（ＩＩＦＡ）による総結合ＩｇＧ及びＩｇＧアイソタイピングの検出
ハムスター及びマウス血清におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体を検出するために、社内で開発された間接的ＩＦＡ（ＩＩＦＡ）を使用した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて、ＣＭＶ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓｐｉｋｅ－Ｆｌａｇ－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｐ２Ａ－ＢｌａｓｔｉＲカセットを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞４９のＲＯＳＡ２６セーフハーバ遺伝子座に安定的に組み込んだ。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク結合抗体最終力価を決定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ－スパイク安定細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ野生型細胞に対して並行して、９６ウェルプレートで１／２連続血清希釈を行った。ヤギ抗マウスＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ａ１１００１、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ２ｃ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（それぞれ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ製の１１５～５４５～２０５、１１５～５４５～２０７、及び１１５～５４５～２０８）を、二次抗体として使用した。ＤＡＰＩで対比染色した後、青色チャネル（３８６ｎｍで励起）及び緑色チャネル（４８５ｎｍで励起）における蛍光を、Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇプラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。特異的なＳＡＲＳ２－ＣｏＶ－２スパイク染色は、緑色チャネルにおける細胞質（ＥＲ）濃縮を特徴とする。この特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク染色を定量化するために、ＨＥＫ２９３Ｔ野生型条件についての細胞質シグナル対核シグナルの差を、ＨＥＫ２９３Ｔ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク条件についての細胞質シグナル対核シグナルの差から差し引いた。全ての陽性値を特異的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２染色とみなした。試料のＩＩＦＡ最終力価は、この方法で陽性とスコア付けされた最も高い希釈度として定義される。血清の体積が限られているため、２～３個の試料のミニプールで全条件のＩＩＦＡ最終力価を決定した。
シュードタイプウイルス血清中和試験（ＳＮＴ）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶシュードタイプは、以前５０～５２に記載されているように産生された。簡潔には、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、Ｃ末端１８アミノ酸欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質をコードするｐＣＡＧＧＳ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Δ１８－Ｆｌａｇ発現プラスミドでトランスフェクトした５３、５４。トランスフェクションの１日後、細胞を、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）レポータ遺伝子（ＭＯＩ２）を発現するＶＳＶΔＧで２時間感染させた。培地を抗ＶＳＶ－Ｇ抗体（Ｉ１、ＣＲＬ－２７００由来のマウスハイブリドーマ上清；ＡＴＣＣ）を含有する培地と交換して、任意の残留ＶＳＶ－Ｇウイルス投入を中和した５５。２４時間後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＶＳＶシュードタイプを含有する上清を回収した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｎＡｂを定量するために、血清試料の連続希釈液を、等体積のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプＶＳＶ粒子と共に３７℃で１時間インキュベートし、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に１８時間接種した。ＹＦＶの中和力価（ＳＮＴ５０）は、ＹＦ１７ＤウイルスのｍＣｈｅｒｒｙタグ付きバリアントを用いて、社内で開発された蛍光ベースのアッセイで決定した１０、３９。その目的のために、血清希釈物をＹＦ１７Ｄ－ｍＣｈｅｒｒｙウイルスと共に９６ウェルプレート中で３７℃にて１時間インキュベートし、その後、血清ウイルス複合体をＢＨＫ－２１Ｊ細胞に７２時間移した。ＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙ発現細胞の割合を、Ｃｅｌｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ＣＸ５／７ Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇプラットフォーム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量し、中和ＩＣ５０値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）においてウイルス（１００％）及び細胞対照（０％）に対して正規化した血清中和希釈曲線を当てはめることによって決定した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）
血清を等体積の７０ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で段階希釈した後、３７℃で１時間インキュベートした。血清ウイルス複合体を、２４ウェルプレート中のＶｅｒｏ Ｅ６細胞単層に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。３日後、オーバーレイを除去し、３．７％ＰＦＡで固定した後、０．５％クリスタルバイオレットで染色した。試験血清試料の中和力価（ＰＲＮＴ５０）を、少なくとも５０％のプラーク減少をもたらす最高試験血清希釈の逆数として定義した。
Ｔ細胞アッセイのための抗原
ＰｅｐＭｉｘ（商標）黄熱病（ＮＳ４Ｂ）（ＪＰＴ－ＰＭ－ＹＦ－ＮＳ４Ｂ）及びＰｅｐＭｉｘ（商標）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクのサブプール－１（１５８重複１５ｍｅｒ）（ＪＰＴ－ＰＭ－ＷＣＰＶ－Ｓ－２）を、ＥＬＩＳｐｏｔ及びＩＣＳのリコール抗原として使用した。希釈したＶｅｒｏ Ｅ６細胞溶解物（５０μｇ／ｍＬ）及びＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と、イオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）との組合せを、それぞれ、陰性対照及び陽性対照とした。
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリー
新鮮なマウス脾細胞を、１．６μｇ／ｍＬ黄熱病ＮＳ４Ｂペプチド；１．６μｇ／ｍＬスパイクペプチドサブプール－１；ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）／イオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍＬ）、又は５０μｇ／ｍＬのＶｅｒｏ Ｅ６細胞により、３７℃で１８時間インキュベートした。ブレフェルジンＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で４時間処理した後、脾細胞をＺｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で生存率について染色し、Ｆｃ受容体をマウスＦｃＲブロッキング試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）（０．５μＬ／ウェル）によって室温の暗所で１５分間ブロッキングした。次いで、細胞を、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ）中の細胞外マーカＢＵＶ３９５抗ＣＤ３（１７Ａ２）（ＢＤ）、ＢＶ７８５抗ＣＤ４（ＧＫ１．５）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＡＰＣ／Ｃｙａｎｉｎｅ７抗ＣＤ８（５３－６．７）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、及びＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５抗ＴＣＲγ／δ（ＧＬ３）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した後、氷上で２５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、製造業者のプロトコルに従って、ＦｏｘＰ３転写因子緩衝キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて３０分間固定／透過処理した。最後に、細胞を以下の抗体で細胞内染色した：ＰＥ抗ＩＬ－４（１１Ｂ１１）、ＡＰＣ抗ＩＦＮ－γ（ＸＭＧ１．２）、ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ（商標）５９４抗ＴＮＦ－α（ＭＰ６－ＸＴ２２）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８抗ＦＯＸＰ３（ＭＦ－１４）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１抗ＩＬ－１７Ａ（ＴＣ１１－１８Ｈ１０．１）（全てＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製）、及びＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ－２０（ＢＤ）で取得。全ての測定値は、対応する刺激試料からの非刺激試料（非感染Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞溶解物とインキュベート）から差し引くことによって計算した。ＩＣＳ分析に採用されるゲーティング戦略を図１６に示す。ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）分析によるワクチン誘導性Ｔ細胞集団の比較発現プロファイリングのために使用される戦略を、図Ｓ８に概説する。ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．６．２（ＬＬＣ）を用いて、全てのフローサイトメトリーデータを分析した。ゲーティングされた脾細胞試料に基づいてスパイク特異的ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を別々に連結した後、Ｆｌｏｗｊｏでｔ－ＳＮＥプロットを生成した。
ＥＬＩＳｐｏｔ
ＩＦＮ－γ分泌マウス脾細胞の検出のためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイを、マウスＩＦＮ－γキット（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）ＭＩＦＮＧ－１Ｍ／５、ＣＴＬ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）を用いて行った。ビオチン化検出抗体、ストレプトアビジン－酵素コンジュゲート、及び基質の段階的添加によって、ＩＦＮ－γスポットを可視化した。ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）Ｓ６ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＣＴＬ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）を用いてスポットを計数し、対応する刺激試料のスポット数から、対照試料（非感染ＶｅｒｏＥ６細胞溶解物と共にインキュベート）からのスポット数を差し引くことによって、正規化した。負の値を０に補正した。
転写因子プロファイルのためのｑＰＣＲ
スパイクペプチド刺激脾細胞の分割は、ｓＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｋｉｔ Ｐｌｕｓキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いてＲＮＡ抽出に使用した。大容量ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｃＤＮＡを生成した。リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ７５００高速プラットフォーム状でＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。ＴＢＸ２１、ＧＡＴＡ３、ＲＯＲＣ、ＦＯＸＰ３（全てＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）の発現レベルを、ＧＡＰＤＨ（ＩＤＴ）の発現に対して正規化した。相対遺伝子発現を、２－ΔΔＣｑ法を用いることによって評価した。
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を全ての統計的評価に使用した。実施した動物の数及び独立した実験を図の凡例に示す。統計的有意性は、特に明記しない限り、ノンパラメトリックマンホイットニーＵ検定及びクラスカル・ウォリス検定を用いて決定した。値は≦０．０５のＰ値で有意に異なるとみなした。
Figure 2023516149000004
Figure 2023516149000005

８．７ 資金提供
このプロジェクトは、助成金契約第１０１００３６２７号（ＳＣＯＲＥプロジェクト）及び第７３３１７６号（ＲＡＢＹＤ－ＶＡＸコンソーシアム）の下において欧州連合のホライズン２０２０（Ｈｏｒｉｚｏｎ２０２０）研究及びイノベーションプログラムから資金提供を受け、助成金契約ＩＮＶ－００６３６の下においてビル＆メリンダ・ゲイツ財団から資金提供を受け、かつエクセレンス・オブ・サイエンス（Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ：ＥＯＳ）プログラム（ＶｉｒＥＯＳプロジェクト３０９８１１１３）の下においてフランダース学術研究財団（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｆｌａｎｄｅｒｓ：ＦＷＯ）、ＦＷＯヘラクレス財団（ＦＷＯ Ｈｅｒｃｕｌｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）（Ｃａｐｓ－Ｉｔインフラストラクチャ）、及びＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ Ｒｅｇａ財団（ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ Ｒｅｇａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）によって支援された。このプロジェクトは、プロジェクト番号第Ｇ０Ｇ４８２０Ｎの下においてフランダース学術研究財団（ＦＷＯ）から資金提供を受け、ＣＯＶＡＸ－ＰＲＥＣプロジェクトの下においてＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ／ＵＺ Ｌｅｕｖｅｎ Ｃｏｖｉｄ－１９基金（ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ／ＵＺ Ｌｅｕｖｅｎ Ｃｏｖｉｄ－１９ Ｆｕｎｄ）から資金提供を受けた。Ｊ．Ｍ．及びＸ．Ｚ．は、国家建設高水平大学公派研究生項目（Ｃｈｉｎａ Ｓｃｈｏｌａｒｓｈｉｐ Ｃｏｕｎｃｉｌ：ＣＳＣ）からの助成金によって支援された。Ｃ．Ｃ．はＦＷＯ（ＦＷＯ １００１７１９Ｎ）によって支持された。Ｇ．Ｖ．Ｖ．は、ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ国際基金（ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｆｕｎｄｓ）（Ｃ２４／１７／０６１）からの支援助成金、及びＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ国際基金（Ｃ３／１９／０５７、ラボ・オブ・エクセレンス（Ｌａｂ ｏｆ Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ））からのＫ．Ｄ．支援助成金を承認する。Ｇ．Ｏ．は、ＫＵ Ｌｅｕｖｅｎ（Ｃ１６／１７／０１０）及びＦＷＯ－Ｖｌａａｎｄｅｒｅｎからの資金提供を受けている。我々は、ＵＣＢ Ｐｈａｒｍａ（ブリュッセル）の従来の貢献を評価する。
８．８ 参照

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実施例９：更なるデータ
更なる結果を、図１７、図１８、図１９、図２０、図２１、図２３、図２４、図２５、図２６、図２７、及び図２８に示す。
図１７は、ハムスター及びマウスにおいてＹＦによって誘発された体液性免疫応答を示す。図１７Ａ～図１７Ｂは、異なるワクチン候補でワクチン接種したハムスター（Ａ）及びｉｆｎａｒ－／－マウス（Ｂ）における中和抗体（ｎＡｂ）（両方の実験において、ワクチン接種後２１日目に血清を収集した（２回用量ワクチン接種スケジュール））を示す。図１７Ｃは、ＥＬＩＳｐｏｔによるＹＦ１７Ｄ特異的細胞媒介性免疫応答の定量的評価を示す。
図１８は、組織学による肺の病理を示す。肺損傷の徴候（血管炎、気管支周囲炎症、血管周囲炎症、気管支肺炎、血管周囲浮腫、気管支壁のアポトーシス小体）についての累積病理組織学スコアは、Ｈ＆Ｅ染色した肺切片において示される（点線－シャムワクチン接種群における最大スコア）。
図１９は、体液性及び細胞性免疫応答が、マウスにおいてＹＦ－Ｓワクチン候補によって誘発されることを示す。図１９Ａは、免疫化及びチャレンジスケジュールの概略図を示す。Ｉｆｎａｒ－／－マウスに、４００ＰＦＵのＹＦ－Ｓ０（ｎ＝９）、シャム（白色、ｎ＝６）、又はＹＦ１７Ｄ（灰色、ｎ＝６）によりｉ．ｐ．で１回ワクチン接種した。図１９Ｂ、図１９Ｃは、ワクチン接種後２１日目のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体レベルを示す。図１９Ｄは、ＥＬＩＳｐｏｔによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＣＭＩ応答の定量的評価を示す。
図２０は、ＹＦ１７Ｄ特異的体液性免疫応答が、ハムスター及びマウスにおいてＹＦ－Ｓによって誘発されることを示す。より特には、図２０Ａ～図２０Ｂは、異なるワクチン候補でワクチン接種したハムスター（Ａ）及びｉｆｎａｒ－／－マウス（Ｂ）における中和抗体（ｎＡｂ）（両方の実験において、ワクチン接種後２１日目に血清を収集した（２回用量ワクチン接種スケジュール））を示す。図２０Ｃは、ＥＬＩＳｐｏｔによるＹＦ１７Ｄ特異的細胞媒介性免疫応答の定量的評価を示す。
図２１は、ハムスターにおける単回ワクチン接種後の体液性免疫応答の寿命を示す。図２１Ａは中和抗体（ｎＡｂ）の力価を示し、図２１Ｂは結合抗体の力価（ｂＡｂ）を示す。
６匹のカニクイザルに、マウス及びハムスターと同じスケジュールを用いて、皮下経路を介して１０５ＰＦＵのＹＦ－Ｓ０（ＹＦ１７Ｄ又はＹＦ１７Ｄ系組換えワクチンのヒト用量に類似）をワクチン接種した。６匹のマカクは、適合プラセボとして、無関係な対照抗原を発現する組換えＹＦ１７Ｄを受けた。有害な徴候又は症状は観察されなかった。マカクを毎週採血し、ＮＡｂへの血清転換について評価した。１４日目及び２１日目に、ＹＦ－Ｓ０をワクチン接種した全てのマカクは、一貫して高レベルのウイルスＮａｂに血清転換し、それぞれ、幾何平均力価２．６（２．４～２．８の９５％信頼区間）及び２．５（２．３～２．７の９５％信頼区間）であった。これらのレベルは、超えない場合、他のワクチン候補について報告されているレベル（０．３～２．６ ｌｏｇ１０変換幾何平均力価の範囲）に達し、チャレンジ時のＹＦ－Ｓ０ワクチン接種マカクにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡレベルの低下によって確認される保護と相関する。血清転換が急速に起こった：７日目（単回投与後）に、ＹＦ－Ｓ０を受けた６匹のマカクのうちの２匹が既にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＮＡｂを有していた。加えて、ＹＦ－Ｓ０は、黄熱病ウイルスに対するＮＡｂの保護レベルを誘導した。
図２３は、カニクイザルにおける免疫原性及び防御の有効性を示す。１２匹のカニクイザル（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、１０５ＰＦＵのＹＦ－Ｓ０（ｎ＝６）又は適合プラセボ（ｎ＝６）で２回（０日目及び７日目）皮下で免疫化した。ワクチン接種後２１日目に、全てのマカクに１．５×１０４ ＴＣＩＤ５０ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２をチャレンジさせた。肺の組織学的検査（チャレンジ後２１日目）では、ＹＦ－Ｓ０又はプラセボのいずれかをワクチン接種したマカクにおけるいかなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２誘導病理の証拠も明らかにはされなかった。
図２４は、ＢＨＫ－２１細胞における継代培養中のＹＦ－Ｓ０の遺伝的安定性を示す。トランスフェクトされたＢＨＫ－２１細胞から回収されたＹＦ－Ｓ０ワクチンウイルス（Ｐ０）を１回プラーク精製し（Ｐ１）（ｎ＝５プラーク単離株）、増幅し（Ｐ２）、ＢＨＫ－２１細胞上で連続して継代培養した（Ｐ３～Ｐ６）。並行して、１回目のプラーク精製からの各増幅プラーク単離株（Ｐ２）（ｎ＝５）を、２回目のプラーク精製（Ｐ３＊）（ｎ＝２５プラーク単離株）及び増幅（Ｐ４＊）に供した。
図２５は、ＹＦ－Ｓワクチン候補の弱毒化を示す。図２５は、１０４ＰＦＵのＹＦ１７Ｄ又はＹＦ－Ｓ０を腹腔内で接種した野生型（ＷＴ）及びＳＴＡＴ２ノックアウト（ＳＴＡＴ２－／－）ハムスターの生存曲線を示す。ＹＦ１７Ｄ（ｎ＝６）及びＹＦ－Ｓ０（ｎ＝６）を接種した野生型ハムスター；ＹＦ１７Ｄ（ｎ＝１４）及びＹＦ－Ｓ０（ｎ＝１３）を接種したＳＴＡＴ２－／－ハムスター。図２５ｂ、図２５ｃは、１０４ＰＦＵ ＹＦ１７Ｄ（ｎ＝６）又はＹＦ－Ｓ０（ｎ＝６）の腹腔内での接種後の野生型ハムスターの、血清中のワクチンウイルスＲＮＡ（ウイルス血症）（ｂ）及び体重変化（ｃ）を示す。接種後の各日にウイルス血症を示したハムスターの数を示す（図２５ｂ）。図２５ｄは、ＹＦ－Ｓ０、ＹＦ１７Ｄ、及びシャムの０日目及び７日目の各々に４００ＰＦＵを腹腔内接種した後の、Ｉｆｎａｒ－／－マウスの体重変化を示す。マウスにＹＦ１７Ｄ（ｎ＝５）、ＹＦ－Ｓ０（ｎ＝５）、又はシャム（ｎ＝５）を接種した。
図２６は、単回投与ワクチン接種後のハムスターにおける免疫原性及び防御の有効性を示す。ハムスター（単回実験から群当たりｎ＝６）に単回用量のＹＦ－Ｓ０（腹腔内に１０４ＰＦＵ）をワクチン接種し、血清をワクチン接種の３、１０、及び１２週間後に収集した。ワクチン接種後の指示された週におけるＮＡｂ（図２６ａ）及び結合抗体（図２６ｂ）。
図２７は、ＹＦ１７Ｄ特異的免疫応答Ｉマカクを示す。図２７ａ、図２７ｂは、ＹＦ－Ｓ０（ａ）又はプラセボ（ｂ）を用いたマカク（単回実験からの群当たり６匹のマカク）におけるワクチン接種後のＮＡｂ力価を示す；ワクチン接種後の指示された時間に収集された血清（２回用量ワクチン接種スケジュール；図７）。図２７ｃは、単回投与ワクチン接種スケジュール（２つの独立した実験からのＹＦ－Ｓ０（ｎ＝８）、シャム（ｎ＝５）、及びＹＦ１７Ｄ（ｎ＝５））に従ってワクチン接種したＩｆｎａｒ－／－マウスを示す。ＹＦ１７Ｄ ＮＳ４Ｂペプチド混合物で刺激した後の１０６脾細胞当たりのＩＦＮγ分泌細胞のスポット数を決定した。
図２８は、致死性ＹＦ１７Ｄからの保護を示す。図２８は、単回の４００ＰＦＵ腹腔内（ｉ．ｐ．）用量のＹＦ１７Ｄ（黒色）（ｎ＝７）若しくはＹＦ－Ｓ０（ｎ＝１０）、又はシャム（灰色、ｎ＝９）のいずれかによりワクチン接種したＩｆｎａｒ－／－マウスに関係する。２１日後、マウスを、均一な致死用量の３×１０３ＰＦＵのＹＦ１７Ｄで頭蓋内（ｉ．ｃ．）接種によりチャレンジさせ、体重変化（ｂ）及び生存（ｃ）について監視した。

Claims (18)

  1. 感染性弱毒化生フラビウイルスのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであって、コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列が、前記ポリヌクレオチドからのキメラウイルスの発現を可能にするように配置されている、ポリヌクレオチド。
  2. 前記Ｓ１／Ｓ２開裂部位をコードするヌクレオチド配列が変異しており、それによって、前記Ｓ１及びＳ２サブユニットにおけるＳタンパク質のタンパク質分解プロセシングが妨げられている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列が、前記フラビウイルスのエンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列の３´と、前記フラビウイルスのＮＳ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５´と、に配置されている、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列が、前記コロナウイルススパイクタンパク質のシグナルペプチド又はシグナルペプチドの一部をコードする前記ヌクレオチド配列を含まず、好ましくは、コロナウイルススパイクタンパク質の少なくともＳ２サブユニットをコードする前記ヌクレオチド配列が、前記コロナウイルススパイクタンパク質のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列の最初の３９ヌクレオチドを含まない、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  5. 更なるフラビウイルスの膜貫通（ＴＭ）ドメインをコードするヌクレオチド配列が、前記コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列の３´と、前記ＮＳ１～ＮＳ５領域のＮＳ１領域の５´と、に配置され、好ましくは、更なるフラビウイルスの前記ＴＭドメインが、ウエストナイルウイルス膜貫通ドメイン２（ＷＮＶ－ＴＭ２）である、請求項３又は４に記載のポリヌクレオチド。
  6. ５´から前記コロナウイルススパイクタンパク質のＳ１及びＳ２サブユニットをコードするヌクレオチド配列への、ＮＳ１シグナルペプチドをコードする配列を含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
  7. Ｓ２´開裂部位をコードする前記ヌクレオチド配列が変異しており、それによって、前記Ｓ２ユニットのタンパク質分解プロセシングが妨げられている、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記コロナウイルスが、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記フラビウイルスが、黄熱病ウイルスである、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記フラビウイルスが、黄熱病１７Ｄ（ＹＦ１７Ｄ）ウイルスである、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  11. 配列番号３、配列番号５、及び配列番号７からなる群から選択される配列を含み、好ましくは配列番号５によって定義される配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  12. 細菌人工染色体（ＢＡＣ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、感染性弱毒化キメラ生フラビウイルス。
  14. 請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド又は請求項１３に記載のキメラウイルスと、薬学的に許容される担体と、を含む医薬組成物であって、好ましくは前記医薬組成物が、ワクチンである、医薬組成物。
  15. 医薬品として使用するためであって、好ましくは前記医薬品がワクチンである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載のキメラウイルス、又は請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. コロナウイルス感染症、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の予防で使用するための、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１３に記載のキメラウイルス、又は請求項１４に記載の医薬組成物。
  17. コロナウイルス感染症に対するワクチンを調製するインビトロ方法であって、
    （ａ）ＢＡＣを提供する工程であって、前記ＢＡＣが
    細菌細胞当たり１０コピーを超える前記ＢＡＣの増幅のための誘導可能な細菌複製起点配列と、
    請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むキメラウイルスのｃＤＮＡを含み、並びに哺乳動物細胞における前記ウイルスｃＤＮＡの転写のため、及び感染性ＲＮＡウイルスへの転写ＲＮＡのプロセシングのためのシス調節エレメントを含む、ウイルス発現カセットと、
    を含む、工程、
    （ｂ）哺乳動物細胞を工程（ａ）の前記ＢＡＣでトランスフェクトし、前記感染細胞を継代培養する工程、
    （ｃ）病原性と、抗体を産生し、コロナウイルス感染症に対する防御を誘導する能力と、について、工程（ｂ）のトランスフェクト細胞の複製ウイルスを検証する工程、
    （ｄ）ベクターへ工程（ｃ）で検証されたウイルスをクローニングし、前記ベクターをワクチン製剤へと製剤化する工程、
    を含む、方法。
  18. 前記ベクターがＢＡＣであって、前記ＢＡＣが細菌細胞当たり１０コピーを超える前記ＢＡＣの増幅のための誘導可能な細菌複製起点配列を含む、請求項１７に記載の方法。
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