JP2023515028A - 逆マイクロラテックスを含むワクチンアジュバント - Google Patents

Abstract

少なくとも１つの逆マイクロラテックスを含むワクチンアジュバントであって、逆マイクロラテックスが、少なくとも１つの油、少なくとも１つの界面活性剤、例えばアルカリ金属塩又はアンモニウム塩の形態で完全に又は部分的に中和されたポリアクリレートなどの少なくとも１つのポリマーを含み、ろ過によって、又はオートクレーブの熱を通過させることによって完全に滅菌可能であり、ワクチン抗原のみを含む水相と１ステップで乳化可能である、ワクチンアジュバント。【選択図】なし

Description

本発明は、特定のワクチンアジュバント、その調製物、及びそれを含むワクチンに関する。

ワクチン組成物は、一般的に、抗原、目的の疾患に対する防御を誘導する免疫原性化合物、及び抗原に対するワクチン接種動物の免疫応答の増幅を可能にするワクチンアジュバントから構成される。ワクチン組成物におけるアジュバントの使用は、特に、ワクチンの用量によって付与される体液性又は細胞性免疫応答の強度を増加させることを可能にし、より高いレベルの防御を確実にすること；１用量のワクチンによって付与される防御期間を延長すること；より低い抗原用量で、アジュバントなしで使用される１用量全量によって付与される効力と同等の効力を得ること；ワクチン防御を確実にするために必要な免疫化の回数を減らすことを可能にする。

過去に様々なタイプの免疫アジュバントが開発されてきた。免疫アジュバントを得るための既存の技術的解決策の中では、少なくとも１つの油相及び少なくとも１つの水相（例えば、フロイントアジュバントなど）、リポソーム、合成免疫刺激性ポリマー、生体由来のアジュバント（サポニン、キトサン、サイトカイン、オリゴヌクレオチドなど）、又は水不溶性無機塩（例えば、非常に一般的に使用される水酸化アルミニウムなど）を含むエマルジョンが挙げられ得る。

油性ワクチンアジュバントは、油及び界面活性剤で構成され、水相にワクチン抗原を含むエマルジョンの形態でワクチンを製剤化することを可能にする。使用される油の中では、植物由来の油、鉱油、合成油、及び動物由来の油が挙げられ得る。油性アジュバント中に存在する界面活性剤は乳化性界面活性剤であり、親水性親油性バランス（ＨＬＢ）値が８～１９、より具体的には８～１５であることを特徴とする親水性を有する。このような親水性界面活性剤は、例えば、アルキルポリグリコシド又はアルキルポリグリコシドの混合物；サポニン；レシチン；ポリオキシエチル化アルカノール；ポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレンブロックを含むポリマー；脂肪酸、有利には２０℃で液体である脂肪酸と、例えばソルビトール、マンニトール又はグリセロールなどの糖ポリオールとの縮合により得られるエステル；脂肪酸、有利には２０℃で液体である脂肪酸とエトキシル化糖との縮合によって得られるエステルから構成され得る。

油性アジュバント中に存在する界面活性剤は、「油中水」型の乳化性界面活性剤であり得、これは、油中水型エマルジョンを得るのに十分に低い、好ましくは１以上８．０未満のＨＬＢ値を有し、そのために水相が親油性脂肪相中に分散される界面活性剤を意味する。油中水型界面活性剤の中では、１２～２２個の炭素原子を含み、場合により１つ以上のヒドロキシル基で置換された、飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖脂肪族カルボン酸のアンヒドロヘキシトールエステル、又はこれらのエステルの混合物が挙げられ得る。

得られるワクチンエマルジョンは、特に使用される界面活性剤系の性質に応じて、油中水型、水中油型、又は水中油中水型であり得る。特に、油中水型エマルジョンタイプのアジュバントは、非アジュバントワクチンと比較して、又は水酸化アルミニウムなどの水性アジュバントでアジュバント化されたワクチンと比較して、長期間にわたってワクチン抗原に対する体液性及び細胞性応答を有意に増加させることを可能にする。このような長期的応答により、ワクチン注射の回数を減らすことを可能にすることができる。油中水型エマルジョン型のアジュバントは、ウシ、ヒツジ、ヤギ、魚及び鳥類の、ウイルス、細菌又は寄生病原体に対するワクチン接種を意図したワクチン組成物の調製に特に使用される。

一部の合成ポリマーは免疫刺激特性も備え、ワクチンアジュバントとして使用されている。

動物用ワクチンアジュバントとして使用される免疫刺激性ポリマーの中では、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（ＰＯＥ－ＰＯＰ）、ポリエチレンイミン、そのナトリウム型のアクリル酸ホモポリマー、アクリル酸とアクリル酸エステルのコポリマー（カルボマーとも呼ばれる）が挙げられ得る。アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸エステル又はメタクリル酸エステルから得られるポリマーは、適切な溶媒中の沈殿重合プロセスに従って、又は仏国特許出願公開第２９２２７６７Ａ１号明細書で公開された特許出願に記載されている逆乳化重合によって、合成することができる。アクリル酸のポリマーの中では、例えば、特に米国特許第５３７３０４４号明細書、米国特許第２７９８０５３号明細書、及び欧州特許出願公開第０３０１５３２Ａ２号明細書に記載されている、Ｌｕｂｒｉｚｏｌ社によってＣＡＲＢＯＰＯＬ（商標）の商品名で販売されているポリマーが挙げられる。

カルボマー（又はアクリル酸ポリマー）は、ワクチンアジュバントとして適用するために１パーセントのオーダーの重量含有率で使用され、その希釈物は、容易に注射可能な、流体の半透明ワクチンの形態である。

これらのポリマーアジュバントは、非常に優れた安全性を有し、関連抗原に対して強力な短期応答を誘発し、例えば国際公開第２００７０９４８９３号パンフレット）に記載されているように、ブタのワクチン接種に特に使用されている。

研究の有望な手段は、例えば米国特許第３９１９４１１号明細書に記載されているように、改善された性能を有するアジュバントを得るために、２つのタイプのアジュバントの免疫刺激特性を組み合わせることを目的として、これらのポリマーアジュバントをエマルジョンタイプの油性アジュバントと組み合わせて製剤化することにある。

しかし、ポリアクリレートを含み、安定で、使用者が直接乳化できる、すぐに使用できるポリマー油性免疫アジュバントを得るために、これら２つの技術（すなわち、油性アジュバントとポリアクリレートゲル）を組み合わせることは、特にアジュバントの安定性及び滅菌に関して、ガレヌスの課題である。

本発明の目的のために、「すぐに使用できるポリマー油性免疫アジュバント」は、少なくとも１つの界面活性剤と１つのポリマーとを含有する油相から構成される混合物を意味すると理解され、この混合物はすでに滅菌されており、乳化ステップで水性抗原媒体と混合することによって直ちに使用できる。前記混合物が水相（抗原及び／又は有効成分を含む）と接触すると、低剪断又は高剪断撹拌系の使用によりエマルジョンが形成される。このタイプのアジュバント（以下、「ポリマー油性アジュバント」と呼ぶ）は、経時的に安定な予防用又は治療用ワクチンエマルジョンを得る目的で使用される。

ポリマー油性アジュバントを調製するために、いくつかの戦略を検討し、特定することができるが、それぞれいくつかの技術的課題を提起する：
１）第１のアプローチは、カルボキシル基が塩化されていないポリマーであり、粉末の形態である、少なくとも１つのポリアクリル酸を油相に添加することにある。この場合、粉末は懸濁液の形態で、油中で安定化することが困難なままであり、時間の経過とともに沈降の問題を示し得る。さらに、このようにして得られたアジュバントは、ポリマーが中和されず、より具体的には乳化プロセス中に中和できないため、酸性のエマルジョンの生成をもたらす。これら全てのパラメーターは、この技術的解決策が不十分であることを意味する。
２）第２のアプローチは、少なくとも１つのポリアクリル酸を水に添加することによって予め形成された水性ゲルを、油性アジュバントに添加することにある。この場合、油相中の水性ゲルの分散は、このプロセスの最後に得られる混合物の均一性を保証しないという第１の制約を有する。さらに、このアプローチは、分散相の相分離を生じ、所望の製品が不均一になるという大きなリスクを有する。
３）第３のアプローチは、油性アジュバント中の逆ラテックス（又はその分散水相がポリアクリレートを含み、そのカルボキシル官能基がアルカリ金属塩又はアンモニウム塩の形態で予め中和されているＷ／Ｏエマルジョン）の形態である、ポリアクリレートなどのポリマー補助剤を分散させることである。しかし、時間の経過とともに相分離が観察され、これにより油性アジュバントの不均一性が生じる。

すぐに使用できるポリマー油性アジュバントを製剤化することの難しさは、ワクチンの組成物に組み込まれる各化合物を滅菌するステップにも関連している。具体的には、注射による投与用のワクチン組成物は、無菌条件下で抗原を製剤化する前に滅菌しなければならない。使用できる滅菌方法の中では、生成物をオートクレーブで加熱滅菌した後、孔径０．２マイクロメートルのフィルターでろ過滅菌するステップ又はガンマ線照射のステップを挙げることができる。

ワクチン組成物は滅菌できないエマルジョンの形態であるため、抗原媒体で乳化するステップの前に、ろ過又はオートクレーブを通過させることによる加熱によって、油性アジュバントを滅菌する必要がある。油性アジュバントに含まれる界面活性剤は、一般的に放射線滅菌に適合しないことにも留意されたい。

現在市販されているポリマーワクチンアジュバントに関しては、その架橋構造及びその増粘特性により、孔径０．２マイクロメートルの滅菌フィルターでのろ過操作及び放射線滅菌操作の両方が不可能である。したがって、オートクレーブを通過することによる熱への曝露は、ポリマーワクチンアジュバントに適した唯一の滅菌技術である。この技術は水中のポリマーアジュバントの希釈溶液の調製を要するため、前記ポリマーアジュバントは、油性アジュバントと組み合わされる場合、この経路によって滅菌することができない。

上記の要素から、ポリマーアジュバントと油性アジュバントの組み合わせを含有する無菌ワクチンを調製するには、
・一方で、オートクレーブ内で加熱することにより、又は滅菌ろ過することにより滅菌される油性アジュバント、及び
・他方で、オートクレーブ内で加熱することにより、溶液中で水和、希釈、滅菌されるポリマーアジュバント、及び
・水性抗原媒体と無菌的に混合されるポリマーアジュバント、及び
・滅菌油相で無菌的に乳化される、ポリマーアジュバントと抗原媒体の水性混合物
が必要であることがわかる。

したがって、この方法は、多くのステップを含み、エネルギーを消費し、ポリマーアジュバントと油性アジュバントの組み合わせの混合物の直接販売ができないため、当業者には高価であると考えられている。

したがって、少なくとも１つの油と、例えばポリアクリレートなどの少なくとも１つのポリマーとを含有するポリマー油性アジュバントを提供することにある解決策が必要であり、前記ポリマー油性アジュバントは、少なくとも１年以上、特に２０℃で少なくとも２年間経時的に安定であり（「安定」とは、相分離がなく、保存中にポリマーが凝固しないことを意味すると理解される）、容易に滅菌可能であり、これにより、経時的に＋４℃で１年間、＋３７℃で少なくとも１ヶ月間安定した（すなわち、沈降も相分離も示さない）エマルジョンを達成することが可能となる。本発明によるポリマー油性アジュバントは、免疫学的観点から有効なワクチン組成物を得ることを可能にしなければならない。

本発明の解決策は、少なくとも１つの逆マイクロラテックスを含むワクチンアジュバントである。

図１は、本発明によるＡＤＪ３アジュバントを含むワクチンについて、マウスにおけるＯＶＡ抗原に対するＩｇＧ１抗体の応答を表すグラフである。 図２は、本発明によるＡＤＪ３アジュバントを含むワクチンについて、マウスにおけるＯＶＡ抗原に対するＩｇＧ２ａ抗体の応答を表すグラフである。 図３は、Ｄ０～Ｄ２８のニューカッスル病ＬａＳｏｔａ株（ＮＤＶ）に対する抗体価の変化を表すグラフである。 図４は、Ｄ０～Ｄ２８のＨ９Ｎ２トリインフルエンザ（ＡＩＶ）に対する抗体価の変化を表すグラフである。 図５は、対照群と比較した、試験ワクチン群によって得られた防御度（防御された動物数／総数）を表すグラフである。

本発明の目的のために、逆マイクロラテックスは、少なくとも１つの高分子電解質型ポリマーを含む逆マイクロエマルジョンを意味する。

本発明の目的のために、「マイクロエマルジョン」は、少なくとも１つの乳化界面活性剤を含む界面活性剤系の存在によって安定化された、熱力学的に安定な２つの不混和性液体の混合物を意味する。マイクロエマルジョンは、分散相の液滴のサイズが２００ナノメートル以下、好ましくは１００ナノメートル以下の平均粒径によって特徴付けられるため、一般的に透明である。

本発明の目的のために、「逆マイクロエマルジョン」は、分散相が水相であり、連続相が油相である、上記で定義したマイクロエマルジョンを意味する。

本発明の目的のために、「高分子電解質型ポリマー」は、ポリマー中に存在するモノマー単位の全部又は一部がイオン化された化学官能基を有するポリマーを意味する。したがって、アニオン性高分子電解質型ポリマーは、アニオン性機能を有するモノマー単位を主に含み、カチオン性高分子電解質型ポリマーは、カチオン性機能を有するモノマー単位を主に含む。

本発明の目的のために、「アニオン性及び架橋高分子電解質型ポリマー」は、上記で定義され、その構成モノマー単位を介して、重合反応中に使用され得、それにより少なくとも２つのポリマー鎖を一緒に連結することが可能になる、少なくとも２つの反応性官能基を有する少なくとも１つのモノマー単位を含むアニオン性高分子電解質型ポリマーを意味する。

逆マイクロラテックスは、次のステップを含むプロセスを実行することによって調製される：
・モノマー及び任意選択による様々な添加剤（例えば、架橋モノマーなど）を含有する水性溶液を調製するステップａ）、
・ステップａ）で得られた水相に、少なくとも１つの油、少なくとも１つの界面活性剤を添加し、これらの様々な成分を混合するステップｂ）、
・断熱媒体中でラジカル重合反応を開始させるためにラジカル開始剤を添加するステップｃ）、及び
・ステップｃ）の間に得られた反応媒体を機械的に撹拌しながら均質化するステップｄ）。

逆マイクロラテックスを調製するためのそのようなプロセスは、参照により本特許出願に組み込まれる欧州特許出願公開第１３７１６９２Ａ１号明細書で公開された欧州特許出願に記載されている。

場合に応じて、本発明によるワクチンアジュバントは、以下の特徴の１つ以上を有し得る：
・逆マイクロラテックスは、油相、水相、少なくとも１つの油中水型（Ｗ／Ｏ）界面活性剤、少なくとも１つの水中油型（Ｏ／Ｗ）界面活性剤、及びアニオン性架橋高分子電解質を含み；前記アニオン性架橋高分子電解質は、少なくとも１つの架橋性モノマー及び少なくとも１つの親水性モノマー単位を含む；
・親水性モノマー単位は、アルカリ若しくはアルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩で完全に又は部分的に塩化されたアクリル酸に由来する；
・アクリル酸は、ナトリウム塩又はアンモニウム塩、好ましくはナトリウム塩で完全に又は部分的に塩化されている；
・アニオン性架橋高分子電解質は、式（１）：

のモノマー単位を含み、式中、Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＨ_３、－Ｃ_２Ｈ_５及び－Ｃ_３Ｈ_７から選択され、好ましくは－ＣＨ_３であり、ｎは、０～５０であり、ｍは、８～２２である；
・前記アジュバントは、油（Ｈ_１）、少なくとも１つの油中水型界面活性剤（Ｅ_１）及び少なくとも１つの水中油型界面活性剤（Ｅ_２）をさらに含む；
・アジュバントは、１重量％～１０重量％、好ましくは３重量％～８重量％の油中水型界面活性剤（Ｅ_１）を含む；
・アジュバントは、１重量％～１０重量％、好ましくは３重量％～８重量％の油中水型界面活性剤（Ｅ_２）を含む；
・アジュバントは、その重量の１００％あたり、
ａ）５０重量％～９７．５重量％、好ましくは６０重量％～９０重量％の前記油（Ｈ_１）；
ｂ）１重量％～１０重量％、好ましくは３重量％～８重量％の前記油中水型界面活性剤（Ｅ_１）；
ｃ）１重量％～１０重量％、好ましくは３重量％～８重量％の前記水中油型界面活性剤（Ｅ_２）；及び
ｄ）０．５重量％～３０重量％、好ましくは１重量％～１０重量％、より好ましくは１重量％～１０重量％の少なくとも１つの逆マイクロラテックス、
を含み、重量含有率ａ）＋ｂ）＋ｃ）＋ｄ）の合計が１００％に等しいことが理解される。
・油（Ｈ_１）が白色鉱油であることを特徴とする、本発明によるワクチンアジュバント。油（Ｈ_１）は、例えば液体パラフィン、液体ワセリン、又はイソパラフィンなどの鉱物油であってもよいことに留意されたい。

優先的に、本発明によるワクチンアジュバントに含まれる逆マイクロラテックスは、その重量の１００％あたり、
・ａ’）１０重量％～４０重量％、好ましくは１２重量％～３０重量％の水、
・ｂ’）３０重量％～５０重量％、好ましくは３８重量％～５０重量％の油（Ｈ_２）、
・ｃ’）５重量％～３０重量％、好ましくは１０重量％～２５重量％の少なくとも１つの油中水型界面活性剤（Ｅ’_１）と少なくとも１つの水中油型界面活性剤（Ｅ’_２）との混合物、
・ｄ’）５重量％～３５重量％、好ましくは１０重量％～３０重量％の前記アニオン性架橋高分子電解質
を含み、重量含有率ａ’）＋ｂ’）＋ｃ’）＋ｄ’）の合計が１００％に等しいことが理解される。

本発明の主題であるワクチンアジュバントに含まれる油（Ｈ_１）は、逆マイクロラテックスに含まれる油（Ｈ_２）と同一又は異なる。

１つの特定の態様によれば、本発明の主題であるワクチンアジュバントに含まれる油（Ｈ_１）は、逆マイクロラテックスに含まれる油（Ｈ_２）と同一である。

油（Ｈ_２）及び油（Ｈ_１）は、特に、以下から選択される：
・スイートアーモンド油、ココナッツ油、モノイ油、ヒマシ油、ホホバ油、オリーブ油、菜種油、ピーナッツ油、ヒマワリ油、小麦胚芽油、コーン胚芽油、大豆油、綿実油、アルファルファ油、ケシ油、ウチキクリ油、マツヨイグサ油、キビ油、大麦油、ライ麦油、ベニバナ油、キャンドルナッツ油、パッションフラワー油、ヘーゼルナッツ油、ヤシ油、シアバター、アプリコット核油、カロフィラム油、シシンブリウム油、アボカド油、カレンデュラ油などの植物由来の油；
・植物油及びそのエトキシル化メチルエステル；
・スクアレン又はスクアランなどの動物由来の油；
・合成油、特に、ミリスチン酸ブチル、ミリスチン酸プロピル、ミリスチン酸セチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ステアリン酸ヘキサデシル、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸イソセチル、オレイン酸ドデシル、ラウリン酸ヘキシル、ジカプリル酸プロピレングリコールなどの脂肪酸エステル、イソプロピルラノレート、イソセチルラノレートなどのラノール酸由来のエステル、トリヘプタン酸グリセロールなどの脂肪酸モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリド、安息香酸アルキル、ポリ（α－オレフィン）、ポリ（イソブテン）などのポリオレフィン、イソヘキサデカン、イソドデカンなどの合成イソアルカン、及び過フッ化素油。シリコーン油もまた、本発明の文脈において使用することができる。

後者の中では、より具体的に、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルフェニルシロキサン、アミンによって変性されたシリコーン、脂肪酸によって変性されたシリコーン、アルコールによって変性されたシリコーン、アルコール及び脂肪酸によって変性されたシリコーン、ポリエーテル基によって変性されたシリコーン、エポキシ変性されたシリコーン、フッ素化基によって変性されたシリコーン、環状シリコーン及びアルキル基によって変性されたシリコーンが挙げられ得る。しかし、実用上の理由から、脂肪相がシリコーン油を含まないことが望ましい場合がある；
・石油の蒸留と、その後の脱硫、脱アスファルト、芳香族化合物の抽出、ワックスの抽出、及びその他の仕上げ処理ステップなどの処理ステップの実行によって得られる、鉱油、流動パラフィン、液体ワセリン、白色鉱油、イソパラフィンなどの炭化水素。ホワイトオイルとは、米国薬局方、ＵＳ ＸＸＩＩＩ（１９９５）に記載されているＦＤＡ２１ ＣＦＲ１７２．８７８及びＣＦＲ１７８．３６２０（ａ）の規制に準拠する鉱油、及び欧州薬局方（２００８）の純度要件に準拠する鉱油を意味する。例えば、Ｍａｒｃｏｌ（商標）、Ｐｒｉｍｏｌ（商標）、Ｄｒａｋｅｏｌ（商標）、Ｅｏｌａｎｅ（商標）、Ｋｌｅａｒｏｌ（商標）、Ｐｕｒｅｔｏｌ（商標）の商品名で販売されている油が挙げられ得る。
・軽油。本発明の目的のために、「軽油」は、低沸点（大気圧で１００℃～２５０℃）を有する油（Ｈ_２）を意味し、逆マイクロラテックスの脂肪相に含まれ、より高い沸点を有する少なくとも１つの油からも構成され；前記軽油は、濃縮された逆マイクロラテックスを得るために、形成された逆マイクロラテックスの蒸留による濃縮のステップ中に蒸発することが意図されている。この定義に合致する軽油として、Ｉｓｏｐａｒ（商標）Ｃ、Ｉｓｏｐａｒ（商標）Ｅ、Ｉｓｏｐａｒ（商標）Ｇ、Ｉｓｏｐａｒ（商標）Ｈ、Ｉｓｏｐａｒ（商標）Ｌ及びＩｓｏｐａｒ（商標）Ｍの商品名で販売されている７～１４個の炭素原子を含むイソパラフィンが挙げられ得る。

本発明の主題であるワクチンアジュバントに含まれる油中水型界面活性剤（Ｅ_１）は、逆マイクロラテックスに含まれる油中水型界面活性剤（Ｅ’_１）と同一又は異なる。

１つの特定の態様によれば、本発明の主題であるワクチンアジュバントに含まれる油中水型界面活性剤（Ｅ_１）は、逆マイクロラテックスに含まれる油中水型界面活性剤（Ｅ’_１）と同一である。

本発明の目的のために、「界面活性剤」は、２つの表面間の表面張力を改変し、両親媒性分子である化合物、すなわち、その構造に親油性部分と別の親水性部分を有する化合物を意味する。したがって、界面活性剤は、ある極性の相を異なる極性の別の相に可溶化及び／又は分散させることを可能にする。

「油中水型界面活性剤」という用語は、油中水型エマルジョンを得るのに十分に低い、好ましくは１以上８．０未満のＨＬＢ値を有し、そのために水相が親油性脂肪相中に分散される界面活性剤を意味する。

油中水型界面活性剤（Ｅ_１）及び（Ｅ’_１）では、１２～２２個の炭素原子を含み、場合により１つ以上のヒドロキシル基で置換された、飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖脂肪族カルボン酸のアンヒドロヘキシトールエステル、又はこれらのエステルの混合物が挙げられ得る。

「ヘキシトール」という用語は、ソルビトール、マンニトール、ズルシトール（ガラクチトールとしても知られる）又はイジトールなどのヘキソースに由来するヘキソールを意味する。

「アンヒドロヘキシトール」という用語は、ヘキシトールの脱水から生じる生成物を意味する。アンヒドロヘキシトールの例としては、例えば、アンヒドロソルビトール、アンヒドロマンニトール、アンヒドロダルシトール又はアンヒドロイジトールが挙げられる。「アンヒドロヘキシトール」という用語は、場合により同じ脱水反応中に副生成物として得られるジアンヒドロヘキシトール（例えば、イソソルビド、イソマンニド、イソダルシド、イソイジドなど）との混合物としての、モノアンヒドロヘキシトール（例えば、ソルビタン、マンニタン、ズルシタン（ｄｕｌｃｉｔａｎ）、イジタンなど）を意味する。

「エステルの混合物」という用語は、単一の酸と単一のヘキシトールから、又は単一の酸といくつかのヘキシトールの混合物から、又はいくつかの酸の混合物と単一のヘキシトールから、又はいくつかの酸といくつかのヘキシトールの混合物から得られる。

「１２～２２個の炭素原子を含み、場合により１つ以上のヒドロキシル基で置換された、飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖脂肪族カルボン酸のアンヒドロヘキシトールエステル」は、例えば、ドデカン酸、ドデセン酸、テトラデカン酸、テトラデセン酸、ヘキサデカン酸、ヘキサデセン酸、オクタデカン酸、オクタデセン酸、オクタデカジエン酸、オクタデカトリエン酸、オクタデカテトラエン酸、エイコサン酸、エイコセン酸、エイコサジエン酸、ドコサン酸、ドコセン酸、ヒドロキシヘキサデカン酸、ヒドロキシオクタデカン酸、ジヒドロキシドコサン酸又はジヒドロキシオクタデカン酸から選択される酸のエステルを意味する。

「１２～２２個の炭素原子を含み、場合により１つ以上のヒドロキシル基で置換された、飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖脂肪族カルボン酸のアンヒドロヘキシトールエステル」は、例えば、ラウリン酸、イソラウリン酸、４－ドデセン酸、５－ドデセン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ヒポゲン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、イソオレイン酸、リノール酸、イソゲラン酸、リノレン酸、アラキン酸、１０，１３－エイコサジエン酸、ベヘン酸、エルシジン酸、セトレイン酸、ドコサジエン酸（ｂｒａｓｓｉｃ ａｃｉｄ）、３－ヒドロキシヘキサデカン酸、４－ヒドロキシヘキサデカン酸、１１－ヒドロキシヘキサデカン酸、１６－ヒドロキシヘキサデカン酸、１２－ヒドロキシステアリン酸、ブラジル酸（ｂｒａｓｉｌｅｉｃ ａｃｉｄ）又は８，９－ジヒドロキシステアリン酸から選択される酸のエステルを意味する。

これらのエステルは、対応する酸及びアンヒドロヘキシトールのエステル化によって得られる。エステル化反応は当業者に公知であり、多くの特許及び参考書に記載されている。

１２～２２個の炭素原子を含み、場合により１つ以上のヒドロキシル基で置換された、飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖脂肪族カルボン酸のアンヒドロヘキシトールエステルの中では、ラウリン酸ソルビタン（商品名Ｍｏｎｔａｎｅ（商標）２０で販売）、ラウリン酸マンニタン、ラウリン酸ズルシタン（ｄｕｌｃｉｔａｎ）、イソラウリン酸ソルビタン、イソラウリン酸マンニタン、イソラウリン酸デュシタン（ｄｕｃｉｔａｎ）、パルミチン酸ソルビタン、パルミチン酸マンニタン、パルミチン酸ズルシタン（ｄｕｌｃｉｔａｎ）、ステアリン酸ソルビタン（商品名Ｍｏｎｔａｎｅ（商標）６０で販売）、ステアリン酸マンニタン、ステアリン酸ズルシタン（ｄｕｌｃｉｔａｎ）、イソステアリン酸ソルビタン（商品名Ｍｏｎｔａｎｅ（商標）７０で販売）、イソステアリン酸マンニタン、イソステアリン酸ズルシタン（ｄｕｌｃｉｔａｎ）、オレイン酸ソルビタン（商品名Ｍｏｎｔａｎｅ（商標）８０で販売）、オレイン酸マンニタン（商品名Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）８０で販売）、オレイン酸ズルシタン（ｄｕｌｃｉｔａｎ）、セスキオレイン酸ソルビタン（商品名Ｍｏｎｔａｎｅ（商標）８３で販売）、セスキオレイン酸マンニタン、トリオレイン酸ソルビタン（商品名Ｍｏｎｔａｎｅ（商標）８５で販売）、トリオレイン酸マンニタン、ベヘン酸（ｂｅｎｅｎａｔｅ）ソルビタン、ベヘン酸マンニタン、アラキン酸ソルビタン、及びアラキン酸マンニタンが挙げられ得る。

油中水型界面活性剤（Ｅ_１）及び（Ｅ’_１）の中では、本出願人がＭｏｎｔａｎｏｘ（商標）８１の名前で販売している５ｍｏｌのエチレンオキシドでエトキシル化された（５ＥＯ）オレイン酸ソルビタン、Ｓｉｍｕｌｓｏｌ（商標）ＯＣ７２の名前で本出願人が販売しているジエトキシル化された（２ＥＯ）オレオセチルアルコールが挙げられ得る。

「水中油型界面活性剤」（Ｅ_２）及び（Ｅ’_２）という用語は、親油性脂肪相が水相中に分散した水中油型エマルジョンを得るために、十分に高いＨＬＢ値、好ましくは８．０以上２０以下、好ましくは８．０以上１５．０以下のＨＬＢ値を有する界面活性剤を意味する。

水中油型界面活性剤（Ｅ_２）及び（Ｅ’_２）では、１２～２２個の炭素原子を含み、場合により１つ以上のヒドロキシル基で置換された、飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖脂肪族カルボン酸のアンヒドロヘキシトールエステル、又はこれらのエステルの混合物が挙げられ得、その後、これらは、エチレンオキシドを、エチレンオキシドの２～３０モル当量の様々な程度まで添加するステップに供される。

１２～２２個の炭素原子を含み、場合により１つ以上のヒドロキシル基で置換され、エトキシル化された、飽和又は不飽和の直鎖又は分岐鎖脂肪族カルボン酸のアンヒドロヘキシトールエステルの中では、特に、エトキシル化ソルビタンエステル、より具体的には、Ｍｏｎｔａｎｏｘ（商標）８０の名前で出願人が販売している２０ｍｏｌのエチレンオキシド（２０ＥＯ）でエトキシル化されたオレイン酸ソルビタン、１５ｍｏｌのエチレンオキシド（１５ＥＯ）を含有するエトキシル化オレイン酸ソルビタン、１０ｍｏｌのエチレンオキシド（１０ＥＯ）でエトキシル化されたオレイン酸ソルビタン、５ｍｏｌのエチレンオキシド（５ＥＯ）でエトキシル化されたオレイン酸ソルビタン、２０ｍｏｌのエチレンオキシド（２０ＥＯ）でエトキシル化されたオレイン酸マンニタン、１５ｍｏｌのエチレンオキシド（１５ＥＯ）でエトキシル化されたオレイン酸マンニタン、１０ｍｏｌのエチレンオキシド（１０ＥＯ）でエトキシル化されたオレイン酸マンニタン、５ｍｏｌのエチレンオキシド（５ＥＯ）でエトキシル化されたオレイン酸マンニタン、２０ｍｏｌのエチレンオキシド（２０ＥＯ）でエトキシル化されたステアリン酸ソルビタン、１０ｍｏｌのエチレンオキシド（１０ＥＯ）でエトキシル化されたステアリン酸ソルビタン、５ｍｏｌのエチレンオキシド（５ＥＯ）でエトキシル化されたステアリン酸ソルビタン、２０ｍｏｌのエチレンオキシド（２０ＥＯ）でエトキシル化されたステアリン酸マンニタン、１０ｍｏｌのエチレンオキシド（１０ＥＯ）でエトキシル化されたステアリン酸マンニタン、５ｍｏｌのエチレンオキシド（５ＥＯ）でエトキシル化されたステアリン酸マンニタン、Ｍｏｎｔａｎｏｘ（商標）２０の名前で出願人が販売している２０ｍｏｌのエチレンオキシド（２０ＥＯ）でエトキシル化されたラウリン酸ソルビタン、１０ｍｏｌのエチレンオキシド（１０ＥＯ）でエトキシル化されたラウリン酸ソルビタン、５ｍｏｌのエチレンオキシド（５ＥＯ）でエトキシル化されたラウリン酸ソルビタン、２０ｍｏｌのエチレンオキシド（２０ＥＯ）でエトキシル化されたラウリン酸マンニタン、１０ｍｏｌのエチレンオキシド（１０ＥＯ）でエトキシル化されたラウリン酸マンニタン、５ｍｏｌのエチレンオキシド（５ＥＯ）でエトキシル化されたラウリン酸マンニタン、５ｍｏｌのエチレンオキシドでエトキシル化されたトリオレイン酸ソルビタン、１０ｍｏｌのエチレンオキシドでエトキシル化されたトリオレイン酸ソルビタン、２０ｍｏｌのエチレンオキシドでエトキシル化されたトリオレイン酸ソルビタン、Ｍｏｎｔａｎｏｘ（商標）８５の名前で出願人が販売している２５ｍｏｌのエチレンオキシドでエトキシル化されたトリオレイン酸ソルビタン、５ｍｏｌのエチレンオキシドでエトキシル化されたトリオレイン酸マンニタン、１０ｍｏｌのエチレンオキシドでエトキシル化されたトリオレイン酸マンニタン、２０ｍｏｌのエチレンオキシドでエトキシル化されたトリオレイン酸マンニタン、２５ｍｏｌのエチレンオキシドでエトキシル化されたトリオレイン酸マンニタンが挙げられ得る。

水中油型界面活性剤（Ｅ_２）及び（Ｅ’_２）の中では、例えば、Ｓｉｍｕｌｓｏｌ（商標）１２９２の名前で本出願人が販売している２５ＥＯでエトキシル化されたヒマシ油、Ｓｉｍｕｌｓｏｌ（商標）ＯＬ５０の名前で本出願人が販売している４０ＥＯでエトキシル化されたヒマシ油、３ｍｏｌのエチレンオキシド（３ＥＯ）でエトキシル化されたコーン油、８ｍｏｌのエチレンオキシド（８ＥＯ）でエトキシル化されたコーン油、１０ｍｏｌのエチレンオキシド（１０ＥＯ）でエトキシル化されたコーン油、２０ｍｏｌのエチレンオキシド（２０ＥＯ）でエトキシル化されたコーン油、３０ｍｏｌのエチレンオキシド（３０ＥＯ）でエトキシル化されたコーン油、４０ｍｏｌのエチレンオキシド（４０ＥＯ）でエトキシル化されたコーン油、３ｍｏｌのエチレンオキシド（３ＥＯ）でエトキシル化された菜種油、１０ｍｏｌのエチレンオキシド（１０ＥＯ）でエトキシル化された菜種油、２０ｍｏｌのエチレンオキシド（２０ＥＯ）でエトキシル化された菜種油、３０ｍｏｌのエチレンオキシド（３０ＥＯ）でエトキシル化された菜種油、４０ｍｏｌのエチレンオキシド（４０ＥＯ）でエトキシル化された菜種油、３ｍｏｌのエチレンオキシド（３ＥＯ）でエトキシル化されたヒマワリ油、１０ｍｏｌのエチレンオキシド（１０ＥＯ）でエトキシル化されたヒマワリ油、２０ｍｏｌのエチレンオキシド（２０ＥＯ）でエトキシル化されたヒマワリ油、３０ｍｏｌのエチレンオキシド（３０ＥＯ）でエトキシル化されたヒマワリ油、４０ｍｏｌのエチレンオキシド（４０ＥＯ）でエトキシル化されたヒマワリ油などのエトキシル化植物油が挙げられ得る。

水中油型界面活性剤（Ｅ_２）及び（Ｅ’_２）の中では、アルキルポリグリコシド、より具体的には、アルキルポリグルコシド及びアルキルポリキシロシド、又はアルキルグリコシドの混合物、レシチン、サポニン、ポリオキシエチル化アルカノール、ポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレンブロックを含むポリマー、Ｓｉｌｍｕｌｓｏｌ（商標）Ｐ７の名前で本出願人が販売している７ｍｏｌのエチレンオキシド（７ＥＯ）でエトキシル化されたラウリルアルコール、ペンタエトキシル化（５ＥＯ）オレオセチルアルコール、オクタエトキシル化（８ＥＯ）オレオセチルアルコール、Ｓｉｍｕｌｓｏｌ（商標）ＯＣ７１０の名前で本出願人が販売しているデカエトキシル化（１０ＥＯ）オレオセチルアルコール、又はＧ－１０８６（商標）及びＧ－１０９６（商標）の名前で販売されているポリエトキシル化ヘキサオレイン酸ソルビタンが挙げられ得る。

架橋モノマー単位は、伸長ポリマー鎖と前記架橋モノマーとの間に共有結合を確立することができる少なくとも２つの反応性官能基を有するモノマーから誘導される単位を意味する。例えば、架橋モノマー単位は、その構造内に少なくとも２つのエチレン官能基を含み得るモノマーから誘導してもよく、アクリルモノマーとのラジカル重合反応に関与する場合、前記架橋モノマーは、架橋ポリマーを得るために、伝播ステップ中に、アクリルポリマーの２つの鎖に共有結合することができる。

架橋ポリマーは、水に不溶であるが、水中で膨潤することができ、したがって化学ゲルが得られる、三次元ネットワークの形態にある非線形ポリマーを意味する。

架橋ポリマーは、少なくとも１つの架橋モノマー単位及び少なくとも１つの他のモノマー単位、より具体的には親水性モノマー単位から構成されるポリマーを意味する。本発明の目的のために、親水性モノマー単位は、水に可溶性であり、より具体的には５℃以上の温度で、より具体的には１０℃以上の温度で、より具体的には２０℃以上の温度で、水に可溶性であるモノマーから生じるモノマー単位を意味すると理解される。

架橋ポリマーは、遊離酸形態又は部分的若しくは完全に塩化された形態の２－メチル－２－［（１－オキソ－２－プロペニル）アミノ］－１－プロパンスルホン酸；遊離酸形態又は部分的若しくは完全に塩化された形態のアクリル酸、遊離酸形態又は部分的若しくは完全に塩化された形態のメタクリル酸、遊離酸形態又は部分的若しくは完全に塩化された形態のイタコン酸、遊離酸形態又は部分的若しくは完全に塩化された形態の２－カルボキシエチルアクリル酸、遊離酸形態又は部分的若しくは完全に塩化された形態のマレイン酸、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、アクリル酸２－ヒドロキシエチル、アクリル酸２，３－ジヒドロキシプロピル、メタクリル酸２－ヒドロキシエチル、メタクリル酸２，３－ジヒドロキシプロピル、ビニルピロリドンに由来する親水性モノマー単位を含み得る。

架橋モノマー単位は、特にエチレングリコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジアクリレート、ジアリル尿素、トリアリルアミン、トリメチロールプロパントリアクリレート、メチレンビス（アクリルアミド）又はこれらの化合物の混合物、ジアリルオキシ酢酸又はジアリルオキシ酢酸ナトリウムなどのその塩、又はこれらの化合物の混合物から選択される、ジエチレン性又はポリエチレン性モノマーから誘導されるモノマー単位を意味する。

本発明によるアジュバント中に存在する界面活性剤は、１以上８未満のＨＬＢ値によって特徴付けられる親油性を有する、上記で定義及び記載された油中水型界面活性剤（Ｅ_１）又は油中水型界面活性剤（Ｅ’_１）、及び８以上２０以下のＨＬＢ値によって特徴付けられる親水性を有する、上記で定義及び記載された水中油型界面活性剤（Ｅ_２）又は水中油型界面活性剤（Ｅ’_２）である。

本発明の別の主題は、ワクチンアジュバントの調製のための、先に定義した逆マイクロラテックスの使用である。

本発明によるワクチンアジュバントを調製するプロセスは、滅菌ろ過又はオートクレーブ処理によってワクチンアジュバントを滅菌するステップを含む。

ろ過は、好ましくは、平均直径が０．２２ミクロン以下の細孔を有するフィルターで実施される（規格ＩＳＯ １３４０８－２：２０１８（ｅｎ）を参照）。

ろ過する前に、アジュバントを前ろ過してもよい。例として、平均直径０．４５μｍの細孔を有する疎水性フィルターを使用して、アジュバントを前ろ過することができる。前ろ過及びろ過ステップは、第１の膜が平均直径０．４５μｍの細孔を有し、第２の膜が平均直径０．２μｍの細孔を有する二重膜疎水性フィルター、又は平均直径０．４５μｍの細孔を有する第１の疎水性フィルターと平均直径０．２μｍの細孔を有する第２の疎水性フィルターとの組み合わせの使用を含む単一のステップで実行できる。これは、第１の膜又は第１のフィルターが、第２の膜又は第２のフィルターよりも大きな細孔を有することを意味する。理想的には、第１の膜又は第１のフィルターは、直径が０．３μｍ以上の細孔、好ましくは直径が０．６μｍ以下、より具体的には０．４５μｍに等しい細孔を有する。第２の膜は、殺菌作用を得るために、直径が０．２２μｍ以下の細孔を有する。

アジュバントのろ過及び／又は前ろ過に使用されるフィルター及び膜は、ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）又はＰＰ（ポリプロピレン）タイプのポリマー支持体から構成され得る。

優先的に、本発明によるアジュバントを調製するための前記プロセスは、以下のステップを含む：
ａ）周囲温度で、機械的撹拌により、少なくとも１つの油と、少なくとも１つの油中水型界面活性剤（Ｅ_１）及び／又は水中油型界面活性剤（Ｅ_２）を含む乳化系とを含む、油相を調製するステップ；
ｂ）周囲温度で機械的に撹拌しながら、少なくとも１つの逆マイクロラテックスを添加するステップ；
ｃ）均一な混合物が得られるまで、周囲温度で機械的撹拌を維持するステップ。

本発明の目的のために、周囲温度は、１５℃以上３０℃以下の温度を意味すると理解される。

本発明の別の主題は、本発明によるアジュバントと、少なくとも１つの抗原、又はアミノ酸配列を含む化合物の少なくとも１つのインビボジェネレーターの、少なくとも１つの水溶液（Ｓ）とを含むワクチンである。

好ましくは、ワクチンは、
・１０重量％～８０重量％の本発明によるアジュバント、及び
・２０重量％～９０重量％の水溶液（Ｓ）
を含む。

好ましくは、前記ワクチンは、油中水型エマルジョン又は水中油型エマルジョンの形態である。

抗原、又はアミノ酸配列を含有する化合物の少なくとも一つのインビボジェネレーターは、ウイルス、細菌若しくは寄生生物などの死微生物、又はこれらの微生物の精製画分、又は生微生物を意味し、この病原性は低減されている。本発明の抗原を構成し得るウイルスの例には、インフルエンザウイルス等のオルソミクソウイルス、ニューカッスル病ウイルス等のパラミクソウイルス、伝染性気管支炎ウイルスなどのコロナウイルス、オーエスキー病ウイルス又はマレック病ウイルスなどのヘルペスウイルスが含まれる。本発明による抗原を構成することができる細菌型の微生物としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、並びにパスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、アビバクテリウム（Ａｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）及び連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のものが挙げられ得る。寄生生物の例としては、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、及びリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）属のものが挙げられる。また、組み換えウイルス、特にアデノウイルス、ワクシニアウイルス、カナリア痘ウイルス、ヘルペスウイルス、又はバキュロウイルスなどの非エンベロープウイルスも挙げられ得る。また、非エンベロープ組み換え生ウイルスベクターも意味し、このゲノムは、好ましくは、対応するエンベロープウイルスの複製に必須でない部分に挿入され、抗体の合成及び／又は上記のエンベロープウイルス若しくは病原性微生物に対する防御作用を誘導する抗原サブユニットをコードする配列を含み；これらの抗原サブユニットは、例えば、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、又はペプチド画分であり、及び／又はエンベロープウイルス、細菌又は寄生生物などの生微生物による感染に対して防御する画分であり得る。微生物に挿入される外因性遺伝子は、例えば、オーエスキーウイルスに由来し得る。特に、病原性微生物又はウイルスに由来する外因性ヌクレオチド配列が挿入されたヌクレオチド配列から構成される組換えプラスミドが挙げられ得る。後者のヌクレオチド配列の目的は、アミノ酸配列を含有する化合物の発現を可能にすることであり、この化合物自体の目的は、宿主生物における免疫反応を誘発することである。

上記で定義されるワクチンは、この抗原の性質及び処置される個体の性質に依存する抗原濃度を含む。しかし、本発明によるアジュバントが、必要とされる通常の抗原用量を有意に減少させることを可能にすることは、特に注目に値する。適切な抗原濃度は、当業者によって従来法で決定することができる。一般的に、この用量は、約０．１μｇ／ｃｍ^３～１ｇ／ｃｍ^３、より一般的には１μｇ／ｃｍ^３～１００ｍｇ／ｃｍ^３である。本発明による組成物中の前記インビボジェネレーターの濃度は、ここでもまた、特に前記ジェネレーターの性質及びそれが投与される宿主に依存する。この濃度は、通例の実験に基づき、当業者によって容易に決定され得る。指標として、インビボジェネレーターが組換え微生物である場合、本発明による組成物中の濃度は、一般的に、１０^２～１０^１５微生物／ｃｍ^３、好ましくは、１０^５～１０^１２微生物／ｃｍ^３である。当該インビボジェネレーターが組換えプラスミドである場合、本発明の主題であるプロセスに従って得られる組成物中のその濃度は、０．０１ｇ／ｄｍ^３～１００ｇ／ｄｍ^３であり得る。上記で定義される通り、ワクチンは、アジュバント相と抗原相を混合し、任意選択により水又は薬学的に許容される希釈媒体を添加することによって、調製される。

本発明によるワクチンを調製するためのプロセスは、以下のステップ：
ａ）本発明によるワクチンアジュバントを調製すること、
ｂ）ステップａ）で得られたワクチンアジュバントを抗原媒体と混合すること
を含む。

好ましくは、抗原媒体は、ワクチンを形成することを意図しており、ワクチン抗原媒体について言及される。

抗原媒体は、上記のように、少なくとも１つの抗原又はアミノ酸配列を含む化合物の少なくとも１つのインビボジェネレーターを含む水性媒体を意味する。

好ましくは、混合物は、ワクチンがその重量の１００％当たり、１０重量％～８０重量％のアジュバント及び２０重量％～９０重量％の抗原媒体、好ましくは５０重量％～８０重量％のアジュバント及び２０重量％～５０重量％の抗原媒体、さらにより好ましくは５０重量％～７０重量％のアジュバント及び３０重量％～５０重量％の抗原媒体を含むような混合物である。

ステップｂ）の間、サポニン、動物及び／又は植物及び／又は鉱物及び／又は合成油、界面活性剤、水酸化アルミニウム、レシチン及びレシチン誘導体から選択される免疫賦活剤を任意選択により混合物に添加してもよい。

好ましくは、ステップｂ）において、抗原媒体を高剪断撹拌しながらアジュバントに徐々に添加してエマルジョンを形成する。

乳化プロセスの最後に、好ましくは油中水型の、安定で均一なエマルジョンの形態のワクチンが得られる。

最終的なワクチンは、製造後すぐに投与することができ、＋４℃の温度で少なくとも１年間保存できる（ワクチン中に存在する抗原の性質及び経時的な物理化学的安定性による）。

ワクチンは、注射によるヒト又は動物の治療において、経口、非経口、粘膜又は卵内経路により投与されることを意図している。

本発明によるアジュバントの例を以下に示す。

実施例１：ポリアクリル酸ナトリウムに基づく逆マイクロラテックスの調製
１．１ 逆マイクロラテックス（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の調製
ポリマーとして架橋ポリアクリル酸ナトリウムを含む逆マイクロラテックスは、参照により本明細書に組み込まれる欧州特許第１３７１６９２Ｂ１号明細書で公開された欧州特許の教示に従って調製される。より具体的には、欧州特許第１３７１６９２Ｂ１号明細書の段落［００２１］、段落［００２５］及び［００２６］、段落［００３３］～［００４８］、さらにより具体的には段落［００３９］～［００４１］（実施例２）の教示が、逆マイクロラテックスの調製に使用される。調製したマイクロラテックスのそれぞれについて、Ｅｘｘｏｎ Ｍｏｂｉｌ社から販売されている流体白色鉱物油、Ｍａｒｃｏｌ（商標）５２を使用する。逆マイクロラテックスを調製するための同じプロセスは、様々な重量濃度の界面活性剤の存在下で実行され、
・界面活性剤の重量が１４％に等しい場合、逆マイクロラテックス（Ａ）、
・界面活性剤の重量が１８％に等しい場合、逆マイクロラテックス（Ｂ）、
・界面活性剤の重量が２２％に等しい場合、逆マイクロラテックス（Ｃ）、
・界面活性剤の重量が２５％に等しい場合、逆マイクロラテックス（Ｄ）
を得ることを可能にする。

ラジカル重合後に得られる逆マイクロラテックス（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）は、乳白色から半透明の油状組成物の形態である。これらの逆マイクロラテックスは、油相と界面活性剤との混合物６０重量％、架橋ポリアクリル酸ナトリウム１５重量％及び水２５重量％を含有する。

１．２ 逆マイクロラテックス（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）及び（Ｈ）の調製
逆マイクロラテックス（Ａ）の調製のためのプロセスは、逆マイクロラテックス（Ｅ）を得るために、オレイン酸ソルビタンの代わりにオレイン酸マンニタンを油中水型界面活性剤として使用して行われる。

逆マイクロラテックス（Ｂ）の調製のためのプロセスは、逆マイクロラテックス（Ｆ）を得るために、オレイン酸ソルビタンの代わりにオレイン酸マンニタンを油中水型界面活性剤として使用して行われる。

逆マイクロラテックス（Ｃ）の調製のためのプロセスは、逆マイクロラテックス（Ｇ）を得るために、オレイン酸ソルビタンの代わりにオレイン酸マンニタンを油中水型界面活性剤として使用して行われる。

逆マイクロラテックス（Ｄ）の調製のためのプロセスは、逆マイクロラテックス（Ｈ）を得るために、オレイン酸ソルビタンの代わりにオレイン酸マンニタンを油中水型界面活性剤として使用して行われる。

逆マイクロラテックス（Ｅ）、（Ｆ）、（Ｇ）及び（Ｈ）は、乳白色から半透明の油性組成物の形態であり、油相と界面活性剤との混合物６０重量％、架橋ポリアクリル酸ナトリウム１５重量％及び水２５重量％を含有する。

実施例２：１．１ 逆マイクロラテックス（Ａ’）、（Ｂ’）、（Ｃ’）、（Ｄ’）の調製
実施例１．１に記載の逆マイクロラテックス（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、及び（Ｄ）の調製のためのプロセスは、逆マイクロラテックス（Ａ’）、（Ｂ’）、（Ｃ’）、及び（Ｄ’）をそれぞれ得るために、アクリル酸とテトラエトキシル化ラウロイルメタクリレート（２ｍｏｌ％）の混合物の存在下で実施される。

逆マイクロラテックス（Ａ’）、（Ｂ’）、（Ｃ’）、及び（Ｄ’）は、乳白色から半透明の油性組成物の形態であり、油相と界面活性剤の混合物６０重量％、アクリル酸とテトラエトキシル化ラウロイルメタクリレートの架橋共重合体１５重量％及び水２５重量％を含有する。

実施例３：逆マイクロラテックス（Ｂ’’）及び（Ｃ’’）の調製
実施例１の逆マイクロラテックス（Ｂ）を調製するためのプロセスは、油相と界面活性剤との混合物４９重量％、架橋ポリアクリル酸ナトリウム１５重量％及び水３６重量％を含有する、乳白色から半透明の油性組成物の形態である逆マイクロラテックス（Ｂ’’）を得るために、より多量の水の存在下で実施される。

実施例１の逆マイクロラテックス（Ｃ）を調製するためのプロセスは、油相と界面活性剤との混合物４９重量％、架橋ポリアクリル酸ナトリウム１５重量％及び水３６重量％を含有する、乳白色から半透明の油性組成物の形態である逆マイクロラテックス（Ｃ’’）を得るために、より多量の水の存在下で実施される。

実施例４：本発明によるアジュバントの調製
ポリマー油性アジュバントは、以下のプロセスに従って調製される：
ａ）周囲温度で、機械的撹拌により、少なくとも１つの油と、少なくとも１つの油中水型界面活性剤（Ｅ_１）及び／又は水中油型界面活性剤（Ｅ_２）を含む乳化系とを含む、油相を調製するプロセス；
ｂ）周囲温度で中程度の機械的撹拌（５０～１５０ｒｐｍ）を行いながら、逆マイクロラテックス又は逆ラテックスを添加するプロセス；
ｃ）均一な混合物が得られるまで、周囲温度で中程度の機械的撹拌（５０～１５０ｒｐｍ）を維持するプロセス。

本発明の目的のために、周囲温度は、１５℃以上３０℃以下の温度を意味すると理解される。

このようにして、ＡＤＪ１、ＡＤＪ２、ＡＤＪ３、ＡＤＪ’１アジュバントが調製され、表１に記載の組成によって特徴づけられる。

実施例５：本発明によるアジュバント及び比較アジュバントの評価
５．１ ろ過性
本発明によるアジュバント及び比較アジュバントのろ過性は、以下のプロトコルに従って評価される：
・２ピース１２ｍｌシリンジに１０ｍｌのアジュバントを導入し、
・直径２５ｍｍの０．２２μｍ ＰＴＦＥシリンジフィルターを接続し、
・３３１０ｇの重量をかけ、
・時間の関数としてフィルタリングされた質量を測定する。

ろ過されたアジュバントの量を時間の関数として測定し、試験した各アジュバントについて得られた結果を以下の表に記録する。

表２～５に記録された結果は、本発明によるアジュバントＡＤＪ１、ＡＤＪ２、ＡＤＪ３のろ過が、疎水性フィルター、平均細孔径０．２マイクロメートルの、特にＰＴＦＥ製の疎水性フィルター上での比較アジュバントＡＤＪ’１のろ過よりも速いことを示す。

５．２ 本発明によるアジュバント及び比較アジュバントの安定性の研究
本発明によるアジュバントＡＤＪ１、ＡＤＪ２、ＡＤＪ３及び比較アジュバントＡＤＪ’１の安定性は、以下のプロトコルに従って評価される：
ｉ）１００ｍｌフラスコ中の９０ｍｌの量の試験する組成物を、２０℃に調節された気候室に１年間導入する。試験した化合物の外観は、安定性試験においてチャンバー内に入れる前及び１ヶ月（Ｍ１）、３ヶ月（Ｍ３）、６ヶ月（Ｍ６）、及び１年（Ｙ１）の期間後に評価される。
ｉｉ）１００ｍｌフラスコ中の９０ｍｌの量の試験する組成物を、３７℃に調節された気候室に１ヶ月間（Ｍ１）導入する。試験した組成物の外観は、安定性試験においてチャンバー内に入れる前及び１ヶ月後に評価される。

安定性とは、相分離及び／又は沈降の観察がないことを意味すると理解される。観察結果を以下の表６に記録する。

本発明によるアジュバントＡＤＪ１、ＡＤＪ２、ＡＤＪ３、ＡＤＪ’１は、以下に記載する保存条件下で均一な外観を有するが、比較アジュバントＡＤＪ’１については、経時的に及び様々な温度で不均一な外観（相分離及び沈降）が観察される。

５．３．本発明によるアジュバントを含有するワクチン組成物の安定性の特徴付け
本発明によるアジュバントＡＤＪ１、ＡＤＪ２、ＡＤＪ３を含有するプラセボワクチンエマルジョンの安定性特性は、標準エマルジョンスクリーンを備えた標準ヘッドを取り付けたＳｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｌ４又はＬ５ローターステーターミキサーを使用して、以下のプロトコルに従って、２００グラムの量（２５０ｍｌの低型ビーカーで調製）で評価した：
ｉ／Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｌ４又はＬ５ミキサーを使用して１０００ｒｐｍの回転速度で機械的に撹拌しながら、６０グラムの水相を１４０グラムのアジュバントに添加し（このステップ中、撹拌ヘッドはビーカーの底から０．５ｃｍの位置に配置する必要がある）；
ｉｉ／ステップｉ／で得られた混合物を、４０００ｒｐｍ（又は７ｍ／ｓ）の回転速度で３分間、高剪断（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ Ｌ４又はＬ５ミキサーを使用）に供することにより、エマルジョンを生成する。

ステップｉｉ／の終わりに得られるエマルジョンは、流体で、均質であり、注射可能である。「流体」という用語は、より具体的には、Ｍ６２スピンドルを備えたＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＬＶＤＶ１＋を用いて、回転速度６０ｒｐｍ、２０℃で測定した動的粘度が３０～４０ｍＰａ．ｓである液体エマルジョンを意味する。

得られたエマルジョンの安定性は、以下のように特徴付けられる：
ｉ）３０ｍｌフラスコ中の２５ｍｌの量の試験する組成物を、４℃に調節された気候室に１年間導入する。試験した化合物の外観は、安定性試験においてチャンバー内に入れる前及び１ヶ月（Ｍ１）、３ヶ月（Ｍ３）、６ヶ月（Ｍ６）、及び１年（Ｙ１）の期間後に評価される。
ｉｉ）３０ｍｌフラスコ中の２５ｍｌの量の試験する組成物を、２０℃に調節された気候室に１年間導入する。試験した化合物の外観は、安定性試験においてチャンバー内に入れる前及び１ヶ月（Ｍ１）、３ヶ月（Ｍ３）、６ヶ月（Ｍ６）、及び１年（Ｙ１）の期間後に評価される。
ｉｉｉ）３０ｍｌフラスコ中の２５ｍｌの量の試験する組成物を、３７℃に調節された気候室に１ヶ月間（Ｍ１）導入する。試験した組成物の外観は、安定性試験においてチャンバー内に入れる前及び１ヶ月後に評価される。

安定性とは、相分離及び／又は沈降の観察がないことを意味すると理解される。観察結果を以下の表７に記録する。

５．４ 本発明によるアジュバントを含有するワクチンの免疫学的特性の特徴付け
本発明による、また先の実施例に記載されている、ポリマー油性アジュバントＡＤＪ１、ＡＤＪ２及びＡＤＪ３のアジュバント特性は、いくつかのワクチンモデル及びいくつかの動物種で特徴付けられた。

第１の試験中に、本発明によるアジュバントＡＤＪ３をオボアルブミンの溶液とともに製剤化して、マウスに注射することを意図したワクチンを得た。

第２の試験では、本発明によるアジュバントＡＤＪ２を不活化パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）細菌から構成される細菌抗原媒体で製剤化して、鳥類への投与を意図したワクチンを得た。

第３の試験では、本発明によるアジュバントＡＤＪ１を、ニューカッスル病及びＨ９Ｎ２インフルエンザに対する鳥類用に意図されたウイルスワクチンの製剤化に使用した。これらの試験は、いくつかの種及びいくつかの抗原モデルにおける本発明によるアジュバントのワクチンアジュバント特性を実証する。

得られた結果を以下に示す。

５．４．１ 試験１：オボアルブミンを抗原としたマウスでの試験
この試験は、抗原モデルとしてオボアルブミン（ＯＶＡ）を使用した９０日間のワクチン接種プロトコルで、ＯＦ１マウスで実施される。ワクチンは、生理学的血清で１０ｍｇ／ｍｌに調製したＯＶＡの抗原溶液から調製し、０．２２μｍフィルターでのろ過により滅菌した。ＯＶＡ抗原及び本発明によるＡＤＪ３アジュバントを含むワクチンの製剤化は、本発明によるアジュバントＡＤＪ３／抗原媒体比７０／３０（体積／体積）中のｉ－コネクターを介した乳化によって行われる。

ワクチンの安全性は、注射部位での局所反応を観察することによって評価される。ワクチンの有効性は、ＥＬＩＳＡ法による血液中のＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体の検出によって評価される。この検出は、ワクチン接種の日（Ｄ０の「初回ワクチン接種」）、次いで１４日後（Ｄ１４）、２８日目（Ｄ２８）のブースターワクチン接種時、次いで４２日目（Ｄ４２）、次いで５６日目（Ｄ５６）、次いで９０日目（Ｄ９０）の安楽死時に行われる。

試験群のメンバー間で局所反応は観察されず、したがって、本発明によるＡＤＪ３アジュバントを含むワクチンが十分に許容されたことを示している。

図１及び２は、Ｄ１４、Ｄ２８、Ｄ４２、Ｄ５６、及びＤ９０におけるＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ抗体のアッセイを示す。

本発明によるＡＤＪ３アジュバントを含むワクチンでは、抗原を含む非アジュバントワクチンと比較して、２つのクラスの抗体について有意に高い抗体価が観察され、これにより、開発された製剤のワクチンアジュバント特性が確認される。

５．４．２ 試験２：ニワトリでのワクチン試験、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）細菌抗原
この試験は、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）細菌病原体に対する４２日間のワクチン接種プロトコルでニワトリに対して実施された。この実験で使用した動物は、ワクチン接種時（Ｄ０）で３６日齢の赤ニワトリ（ｒｅｄ ｃｈｉｃｋｅｎ）である。各ワクチン用量は、１用量（０．５ｍｌ）＝０．５×１０^８ＣＦＵ又は１×１０^８ＣＦＵ／ｍｌの不活化パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）菌を含有する。ワクチン群は、群間でランダムに分配された１１羽のオスとメスのニワトリで構成される。

本発明によるＡＤＪ２アジュバントを含有する製剤は、本発明によるＡＤＪ２アジュバント／抗原媒体比７０／３０（重量／重量）中で、無菌ＤＴ５０チューブ内のＴｕｂｅ Ｄｒｉｖｅ乳化剤（Ｉｋａ社により販売）を使用して調製される：プレエマルジョンは速度３で２分間（１１００ｒｐｍ）、次いで速度９で６分間（４０００ｒｐｍ）。

動物はＤ０にワクチン接種される。Ｄ４２の屠殺時に局所反応が観察される。血液サンプルは、Ｄ０、Ｄ１４、Ｄ４２に採取される。抗原特異的ＥＬＩＳＡアッセイは、市販の検出キット（ＩＤ－ＶＥｔが販売するＩＤ Ｓｃｒｅｅｎパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）ニワトリ及びシチメンチョウ間接キット）を使用して、血清中の抗体レベルを検出するために実施される。

本発明によるＡＤＪ２アジュバントを含むワクチンは、屠殺時に重大な局所反応が観察されないため、ニワトリにおいて十分に許容される。以下の表１０に示されるように、ニワトリにおいて、非アジュバントワクチンと比較して、ＡＤＪ２アジュバントでアジュバント化されたワクチンについても有意により高い抗体価が観察される。

５．４．３ 試験３：ニワトリでのワクチン試験、ニューカッスル病／トリインフルエンザウイルス抗原
この試験は、ニューカッスル病ＬａＳｏｔａ株（ＮＤＶ）及びＨ９Ｎ２トリインフルエンザ（ＡＩＶ）に対する二価不活化ウイルスワクチンによる２８日間のワクチン接種プロトコルでニワトリに対して実施された。この実験で使用される動物は、実験開始時（Ｄ０）に２８日齢のＳＰＦ（特定病原体除去）ニワトリである。ワクチン群は、表１１のように形成される。

試験ワクチンは、本発明によるポリマー油性アジュバントＡＤＪ１を用いて、２つのＡＩＶ及びＮＤＶ不活性化ウイルス価を含有する抗原媒体を含む、本発明によるＡＤＪ１アジュバント／抗原培地比７０／３０（重量／重量）中での乳化により製剤化される。対照群はワクチン接種を受けていない。

ワクチンは、Ｄ０に筋肉内注射される。ワクチン接種後のＤ０、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１及びＤ２８に血液サンプルを採取し、血球凝集阻害試験によって分析して、各原子価（ＡＩＶ及びＮＤＶ）に対する特異的抗体価を決定する。ＡＩＶ群では、ワクチン接種後のＤ２８に防御負荷を実施して、負荷後のウイルス量を測定する（ＸＺ株Ｈ９Ｎ２ ＡＩＶウイルスの静脈内０．２ｍｌ中２．１０^６ＥＩＤ_５０）。口咽頭及び排泄腔のスワブをウイルス負荷の５日後に採取し、ＳＰＦニワトリ胚に接種して、２世代の伝播後のウイルスの存在を測定する。

ワクチン接種群では、２つの価数のワクチン接種後に強い抗体価が観察される（図１及び図２）。病原性負荷の後、死亡は観察されず、ワクチン接種群では、スワブサンプルで観察されたウイルス量もなく、これは、ＡＩＶウイルス負荷に対する完全な防御を示す（図３）。

５．５ 実験の結論
本発明によるアジュバントは、
・特に、無菌アジュバントを得るのに適した、平均孔径が０．２マイクロメートルの疎水性フィルター（特にポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）製）でのろ過動力学、
・２０℃及び３７℃での経時安定性、すなわち、相分離及び／又は沈降現象を示すことなく、均一で透明な外観を保持すること、
・ワクチン水相の存在下で前記アジュバントを乳化することによって形成される安定なワクチンエマルジョンを得ること、
・様々な抗原媒体の存在下でのワクチン組成物中の様々な動物種における免疫のアジュバント効果
によって特徴付けられる。

Claims (17)

1. 逆マイクロラテックスとして、少なくとも１つの高分子電解質型ポリマーを含む逆マイクロエマルジョンを少なくとも含む、ワクチンアジュバント。
2. 前記逆マイクロラテックスが、油相、水相、少なくとも１つの油中水型（Ｗ／Ｏ）界面活性剤、少なくとも１つの水中油型（Ｏ／Ｗ）界面活性剤、及びアニオン性架橋高分子電解質を含み；前記アニオン性架橋高分子電解質は、少なくとも１つの架橋性モノマー及び少なくとも１つの親水性モノマー単位を含むことを特徴とする、請求項１に記載のワクチンアジュバント。
3. 前記モノマー単位が、アルカリ若しくはアルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩で完全に又は部分的に塩化されたアクリル酸に由来することを特徴とする、請求項２に記載のワクチンアジュバント。
4. 前記アクリル酸が、ナトリウム塩又はアンモニウム塩、好ましくはナトリウム塩で完全に又は部分的に塩化されていることを特徴とする、請求項３に記載のワクチンアジュバント。
5. 前記アニオン性架橋高分子電解質が、式（１）：
   

   

   （式中、
   ・Ｒ１は、－Ｈ、－ＣＨ_３、－Ｃ_２Ｈ_５及び－Ｃ_３Ｈ_７から選択され、好ましくは－ＣＨ_３であり、
   ・ｎは、０～５０であり、
   ・ｍは、８～２２である）
   のモノマー単位を含むことを特徴とする、請求項２～４のいずれか一項に記載のワクチンアジュバント。
6. 前記アジュバントが、油（Ｈ_１）、少なくとも１つの油中水型界面活性剤（Ｅ_１）及び少なくとも１つの水中油型界面活性剤（Ｅ_２）をさらに含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載のワクチンアジュバント。
7. １重量％～１０重量％、好ましくは３重量％～８重量％の油中水型界面活性剤（Ｅ_１）を含むことを特徴とする、請求項６に記載のワクチンアジュバント。
8. １重量％～１０重量％、好ましくは３重量％～８重量％の油中水型界面活性剤（Ｅ_２）を含むことを特徴とする、請求項６又は７に記載のワクチンアジュバント。
9. その重量の１００％あたり、
   ａ）５０重量％～９７．５重量％、好ましくは６０重量％～９０重量％の前記油（Ｈ_１）；
   ｂ）１重量％～１０重量％、好ましくは３重量％～８重量％の前記油中水型界面活性剤（Ｅ_１）；
   ｃ）１重量％～１０重量％、好ましくは３重量％～８重量％の前記水中油型界面活性剤（Ｅ_２）；及び
   ｄ）０．５重量％～３０重量％、好ましくは１重量％～１０重量％、より好ましくは１重量％～１０重量％の少なくとも１つの逆マイクロラテックス、
   を含み、重量含有率ａ）＋ｂ）＋ｃ）＋ｄ）の合計が１００％に等しいことが理解される、請求項６～８のいずれか一項に記載のワクチンアジュバント。
10. 前記油（Ｈ_１）が白色鉱油であることを特徴とする、請求項６～８のいずれか一項に記載のワクチンアジュバント。
11. ワクチンアジュバントの調製のための、請求項２～５のいずれか一項に記載の逆マイクロラテックスの使用。
12. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のアジュバントと、少なくとも１つの抗原、又はアミノ酸配列を含む化合物の少なくとも１つのインビボジェネレーターの、少なくとも１つの水溶液（Ｓ）とを含む、ワクチン。
13. ・１０重量％～８０重量％の請求項１～１０のいずれか一項に記載のアジュバント、及び
    ・２０重量％～９０重量％の前記水溶液（Ｓ）
    を含むことを特徴とする、請求項１２に記載のワクチン。
14. 前記ワクチンが、油中水型エマルジョン又は水中油型エマルジョンの形態であることを特徴とする、請求項１２又は１３に記載のワクチン。
15. ろ過又はオートクレーブ処理によって前記ワクチンアジュバントを滅菌するステップを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のワクチンアジュバントを調製するためのプロセス。
16. 前記プロセスが、以下のステップ：
    ａ）周囲温度で、機械的撹拌により、少なくとも１つの油と、少なくとも１つの油中水型界面活性剤（Ｅ_１）及び／又は水中油型界面活性剤（Ｅ_２）を含む乳化系とを含む、油相を調製するステップ；
    ｂ）周囲温度で機械的に撹拌しながら、前記少なくとも１つの逆マイクロラテックスを添加するステップ；
    ｃ）均一な混合物が得られるまで、周囲温度で前記機械的撹拌を維持するステップ
    を含むことを特徴とする、請求項１２に記載のプロセス。
17. 以下のステップ：
    ａ）請求項１５又は１６に記載のプロセスで本発明のワクチンアジュバントを調製するステップ、及び
    ｂ）ステップａ）で得られた前記ワクチンアジュバントを抗原媒体と混合するステップ
    を含む、ワクチンを調製するためのプロセス。
    
    

Images