FR3107454A1

FR3107454A1 - Adjuvant de vaccin comprenant un microlatex inverse

Info

Publication number: FR3107454A1
Application number: FR2001698A
Authority: FR
Inventors: Dorothee PLISZCZAK; Juliette BEN AROUS; Stéphane MONTEILLET; David PUJOL
Original assignee: Societe dExploitation de Produits pour les Industries Chimiques SEPPIC SA
Current assignee: Societe dExploitation de Produits pour les Industries Chimiques SEPPIC SA
Priority date: 2020-02-20
Filing date: 2020-02-20
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2040-02-20
Also published as: US20230052315A1; CN115151246A; JP2023515028A; BR112022016519A2; FR3107454B1; EP4106723A1; WO2021165312A1; KR20220143706A; MX2022010233A

Abstract

Adjuvant de vaccin comprenant au moins un microlatex inverse, ledit microlatex inverse comprenant au moins une huile, au moins un agent tensio-actif, au moins un polymère comme par exemple un polyacrylate totalement ou partiellement neutralisé sous forme de sels de métaux alcalins ou de sel d’ammonium, ledit adjuvant de vaccin étant stérilisable dans son ensemble par filtration ou par passage à la chaleur d’un autoclave, et émulsionnable en une étape avec la phase aqueuse comprenant uniquement un antigène vaccinal.

Description

Adjuvant de vaccin comprenantun microlatex inverse

La présente invention est relative à un adjuvant de vaccin particulier, sa préparation et le vaccin le comprenant.

Une composition vaccinale est généralement constituée d’un antigène, un composé immunogène qui induit une protection contre une maladie d’intérêt, et d’un adjuvant de vaccin, qui permet l’amplification de la réponse immunitaire de l’animal vacciné contre l’antigène. L'utilisation d'adjuvants dans les compositions vaccinales permet notamment d'augmenter l'intensité de la réponse immunitaire humorale ou cellulaire conférée par une dose de vaccin, permettant d'assurer un meilleur niveau de protection; de prolonger la durée de la protection conférée par une dose de vaccin; d'obtenir, avec une dose antigénique moindre, une efficacité équivalente à celle conférée par une dose complète utilisée sans adjuvant; de diminuer le nombre d’immunisations nécessaires pour assurer une protection vaccinale.

Des adjuvants d’immunité de natures diverses ont été développés par le passé. Parmi les solutions technologiques existantes pour l’obtention d’adjuvants d’immunité, on peut citer les émulsions comprenant au moins une phase huileuse et au moins une phase aqueuse (comme par exemple les adjuvants dits de Freund), les liposomes, les polymères synthétiques immunostimulants, les adjuvants d’origine biologique (saponine, chitosan, cytokines, oligonucléotides…) ou les sels minéraux insolubles dans l'eau (par exemple l'hydroxyde d'aluminium, qui est très couramment utilisé).

Les adjuvants de vaccins huileux sont composés d’huile et de tensioactifs et permettent de formuler des vaccins sous forme d’émulsions, dont la phase aqueuse contient l’antigène vaccinal. Parmi les huiles utilisées on peut citer les huiles d’origine végétale, les huiles minérales, les huiles synthétiques et les huiles d’origine animale. Les tensioactifs présents dans les adjuvants huileux sont des tensioactifs émulsionnants, présentant un caractère hydrophile caractérisé par une valeur de la Balance Hydrophile-Lipophile (HLB) comprise entre 8 et 19, plus particulièrement comprise entre 8 et 15. Un tel tensioactif hydrophile peut consister par exemple en un alkylpolyglycoside ou un mélange d'alkylpolyglycosides; en des saponines; en des lecithines; en des alcanols polyoxyethylés; en des polymères comprenant des blocs polyoxyethylenes et polyoxypropylenes; en des esters obtenus par condensation d'un acide gras, avantageusement un acide gras liquide à 20°C avec un polyol-sucre, comme par exemple du sorbitol, du mannitol ou du glycérol; en des esters obtenu par condensation d'un acide gras, avantageusement un acide gras liquide à 20°C avec un sucre éthoxylé.

Les tensioactifs présents dans les adjuvants huileux peuvent aussi être des tensioactifs émulsionnants du type «eau-dans-huile», désignant des agents tensioactifs possédant une valeur de HLB suffisamment faible, de préférence supérieure ou égale à 1 et inférieure à 8,0 permettant d’obtenir des émulsions eau dans huile, pour lesquelles la phase aqueuse est dispersée dans la phase grasse lipophile. Parmi les agents tensioactifs du type eau-dans-huile, on peut citer les esters d'anhydro hexitol et d'acide carboxylique aliphatique linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comportant de 12 à 22 atomes de carbone éventuellement substitués avec un ou plusieurs groupes hydroxyles, ou d'un mélange de ces esters.

Les émulsions vaccinales obtenues peuvent être de type eau-dans-huile, huile-dans-eau ou eau-dans-huile-dans-eau, en fonction notamment de la nature du système tensioactif utilisé. En particulier, les adjuvants de type émulsions eau-dans-huile permettent d’augmenter significativement la réponse humorale et cellulaire contre l’antigène vaccinal sur une durée prolongée par rapport au vaccin non adjuvé ou par rapport au vaccin adjuvé avec un adjuvant aqueux tel que l’hydroxyde d’aluminium. Une telle réponse long terme peut permettre de diminuer le nombre d’injections de vaccin. Les adjuvants de type émulsion eau-dans-huile sont notamment utilisés pour la préparation de compositions vaccinales destinées à la vaccination des bovins, des ovins, des caprins, des poissons et des espèces aviaires contre des pathogènes viraux, bactériens ou parasitaires.

Certains polymères synthétiques possèdent également des propriétés immunostimulantes et ont été utilisés comme adjuvants de vaccins.

Parmi les polymères immunostimulants utilisés comme adjuvants de vaccins vétérinaires, on peut citer notamment les co-polymères blocs de polyoxyéthylène et polyoxypropylène (POE-POP), les polyéthylèneimines, les homopolymères de l'acide acrylique sous leurs formes sodiques, les copolymères de l'acide acrylique et d’esters de l’acide acrylique (appelés aussi carbomères). Les polymères obtenus à partir d'acide acrylique, d'acide méthacrylique, d’esters de l'acide acrylique ou d’esters de l'acide methacrylique peuvent être synthétisés selon un procédé de polymérisation précipitante dans un solvant adapté ou par polymérisation en émulsion inverse, comme décrit dans la demande de brevet publiée sous le numéro FR2922767A1. Parmi les polymères de l’acide acrylique, on citera par exemple, les polymères commercialisés par la société Lubrizol sous le nom de marque CARBOPOL™ décrits notamment dans les brevets américains publiés sous le numéros US 5373044, US 2798053 et dans la demande de brevet européen EP 0301532A2.

Les carbomères (ou polymères d’acide acrylique) sont utilisés à des teneurs massiques de l'ordre du pour cent pour les applications comme adjuvant de vaccin, et leur dilution se présente sous la forme d'un vaccin fluide et translucide facilement injectable.

Ces adjuvants polymériques ont une très bonne innocuité et induisent une forte réponse court terme contre l’antigène associé, et sont notamment utilisés pour la vaccination des porcs, comme décrit par exemple dans la demande de brevet publiée sous le numéro WO2007094893).

Une voie de recherche prometteuse consiste à formuler ces adjuvants polymériques en combinaison avec des adjuvants huileux de type émulsion, dans le but de combiner les propriétés immunostimulantes des deux types d’adjuvants pour obtenir un adjuvant de performance améliorée, comme décrit par exemple dans le brevet américain publié sous le numéro US3919411.

Toutefois, l’association de ces deux technologies (c’est à dire adjuvants huileux et gels de polyacrylates) afin d’obtenir un adjuvant d’immunité huileux polymérique prêt à l’emploi, contenant un polyacrylate, stable et directement émulsionnable par l'utilisateur est un challenge galénique notamment en ce qui concerne la stabilité et la stérilisation de l’adjuvant.

Par “adjuvant d’immunité huileux polymérique prêt à l’emploi”, on entend au sens de la présente invention, un mélange consistant à en une phase huileuse contenant au moins un agent tensioactif et un polymère, déjà stérilisé et pouvant immédiatement être mis en œuvre par mélange avec le milieu antigénique aqueux dans une étape d’émulsification. Lorsque ledit mélange entre en contact avec une phase aqueuse (contenant un antigène et/ou un principe actif) il se forme une émulsion grâce à l’utilisation d’un système d’agitation à bas ou fort taux de cisaillement. Ce type d’adjuvant (appelé par la suite “adjuvant huileux polymérique”) est utilisé dans le but d’obtenir des émulsions vaccinales, prophylactiques ou thérapeutiques, stables dans le temps.

Plusieurs stratégies peuvent être envisagées et sont identifiées pour préparer un adjuvant huileux polymérique, mais chacune pose quelques problèmes techniques :

La première manière de procéder consiste à rajouter dans une phase huileuse au moins un acide polyacrylique, polymère dont les groupements carboxyliques ne sont pas salifiés, et qui se présente sous forme d’une poudre. Dans ce cas, la poudre demeure difficilement stabilisable dans l’huile sous forme de suspension et peut présenter des problèmes de sédimentation dans le temps. Par ailleurs, l’adjuvant obtenu de telle sorte, conduit à l’obtention d’émulsions à caractère acide, car le polymère n’est pas neutralisé et plus particulièrement non neutralisable lors du procédé d’émulsification. Tous ces paramètres font que cette solution technique est non satisfaisante.
La deuxième façon de procéder consiste à ajouter un gel aqueux, préalablement formé par l’ajout d’au moins un acide polyacrylique dans de l’eau, dans un adjuvant huileux. Dans ce cas, la dispersion d’un gel aqueux dans une phase huileuse présente comme première contrainte de ne pas garantir l’homogénéité du mélange obtenu à l’issue de ce procédé. De plus, cette voie comporte comme risque majeur de conduire à un déphasage de la phase dispersée conduisant alors à la non homogénéité du produit désiré.
La troisième façon de procéder est de disperser un adjuvant polymérique comme un polyacrylate, se présentant sous la forme d’un latex inverse (ou émulsion de type E/H, dont la phase aqueuse dispersée comprend un polyacrylate dont les fonctions carboxyliques ont été préalablement neutralisées sous la forme d’un sel de métal alcalin ou d’un sel d’ammonium) dans l’adjuvant huileux. Toutefois, un déphasage est observé dans le temps, conduisant à une hétérogénéité de l’adjuvant huileux.

Les difficultés de formulation d’un adjuvant huileux polymérique prêt à l’emploi sont aussi liées aux étapes de stérilisation de chaque composé qui entre dans la constitution du vaccin. En effet, les compositions vaccinales dédiées à l’administration par voie injectable doivent être stérilisées avant la formulation avec l’antigène en conditions aseptiques. Parmi les méthodes de stérilisation utilisables, on peut noter la stérilisation par la chaleur du produit dans un autoclave, suivie d’une étape de filtration stérilisation sur un filtre de diamètre de pore de 0,2 micromètre ou d’une étape d’irradiation aux rayons gamma.

Les compositions vaccinales se présentant sous la forme d’une émulsion ne pouvant pas être stérilisées, il est donc nécessaire de stériliser les adjuvants huileux, par filtration ou par la chaleur par passage dans un autoclave, avant l’étape d’émulsification avec le milieu antigénique. Il faut également noter que les agents tensioactifs contenus dans les adjuvants huileux ne sont généralement pas compatible avec une stérilisation par irradiation.

En ce qui concerne les adjuvants de vaccins polymériques présents sur le marché, leurs structures réticulées et leurs propriétés épaississantes rendent les opérations de filtration impossibles sur des filtres stérilisants de diamètre de pores de 0,2 micromètres, ainsi que les opérations de stérilisation par irradiation. Par conséquent, l’exposition à la chaleur par le passage dans un autoclave est la seule technique de stérilisation adaptées à adjuvants de vaccins polymériques. Cette technique nécessitant la préparation d’une solution diluée d’adjuvant polymérique dans l’eau, lesdits adjuvants polymériques ne peuvent pas être stérilisés par cette voie lorsqu’ils sont combinés avec des adjuvants huileux.

Il résulte des éléments indiqués précédemment que pour préparer un vaccin stérile, contenant une combinaison d’un adjuvant polymérique et d’un adjuvant huileux, il est nécessaire que:

L’adjuvant huileux soit stérilisé par passage à la chaleur d’un autoclave ou par filtration stérilisante d’une part, et
L’adjuvant polymérique soit hydraté, dilué et stérilisé en solution par passage à la chaleur d’un autoclave, d’autre part, et
L’adjuvant polymérique soit mélangé de façon aseptique avec le milieu antigénique aqueux, et
Le mélange aqueux de l’adjuvant polymérique et du milieu antigénique soit émulsionné de façon aseptique avec la phase huileuse stérile.

Ce procédé est donc considéré par l’homme du métier comme coûteux car comprenant de nombreuses étapes, consommant de l’énergie, et ne permettant pas une commercialisation directe du mélange de la combinaison de l’adjuvant polymérique et de l’adjuvant huileux.

Ainsi il existe un besoin d’une solution qui consiste à disposer d’un adjuvant huileux polymérique contenant au moins une huile et au moins un polymère comme par exemple un polyacrylate , ledit adjuvant huileux polymérique étant stable dans le temps au moins 1 an et plus particulièrement au moins 2 ans à 20°C (par «stable», on entend l’absence de déphasage, de prise en masse du polymère lors du stockage), facilement stérilisable et qui permet d’atteindre des émulsions stables dans le temps à +4°C pendant 1 an et pendant au moins 1 mois à +37°C (autrement dit ne présentant pas de sédimentation ni de déphasage). L’adjuvant huileux polymérique selon l’invention doit permettre d’obtenir des compositions vaccinales performantes d’un point de vue immunologique.

Une solution de la présente invention est un adjuvant de vaccin comprenantau moins un microlatex inverse.

Par micro-latex inverse, on désigne au sens de la présente invention une micro-émulsion inverse comprenant au moins un polymère de type polyélectrolyte.

Par «micro-émulsion», on désigne au sens de la présente invention un mélange de deux liquides immiscibles, thermodynamiquement stable, stabilisé par la présence d’un système tensioactifs comprenant au moins un agent tensioactif émulsionnant. Une micro-émulsion est généralement transparente car la taille de gouttelettes de la phase dispersée se caractérise par un diamètre moyen de particule inférieur ou égal à 200 nanomètres, et de préférence inférieur ou égal à 100 nanomètres.

Par «micro-émulsioninverse », on désigne au sens de la présente invention une micro-émulsion telle que définie précédemment, pour laquelle la phase dispersée est une phase aqueuse et la phase continue est une phase huileuse.

Par «polymère de type polyélectrolyte», on désigne au sens de la présente invention un polymère dont toute ou partie des unités monomériques présentes dans le polymère porte une fonction chimique ionisée. Ainsi, un polymère de type polyélectrolyte anionique comporte majoritairement des unités monomériques possédant une fonction anionique et un polymère de type polyélectrolyte cationique comporte majoritairement des unités monomériques possédant une fonction cationique.

Par «polymère de type polyélectrolyteanionique et réticulé», on désigne au sens de la présente invention un polymère de type polyélectrolyteanionique tel que défini précédemment et qui comprend par ses unités monomériques constitutives au moins une unité monomérique possédant au moins deux fonctions réactives pouvant être mises en jeu lors de la réaction de polymérisation et permettant ainsi de lier entre-elles au moins deux chaînes polymériques.

Les micro-latex inverses sont préparés par la mise en œuvre d’un procédé qui comprend les étapes suivantes:

Une étape a) de préparation d’une solution aqueuse contenant les monomères et les éventuels différents additifs (comme par exemple un monomère de réticulation)
Une étape b) d’ajout à la phase aqueuse obtenue à l’étape a) d’au moins une huile, d’au moins un agent tensioactif et de mélange de ces différents composants
Une étape c) d’ajout d’un initiateur de type radicalaire pour amorcer une réaction de polymérisation radicalaire en milieu adiabatique, et
Une étape d) d’homogénéisation sous agitation mécanique du milieu réactionnel obtenu lors de l’étape c).

Un tel procédé de préparation d’un micro-latex inverse est décrit dans la demande de brevet européen publié sous le numéro EP 1 371 692 A1, qui est incorporé par référence dans la présente demande de brevet.

Selon le cas, l’adjuvant de vaccin selon l’invention peut présenter une ou plusieurs des caractéristiques suivantes:

le microlatex inverse comprend une phase huileuse, une phase aqueuse, au moins un agent tensioactif de type eau-dans-huile (E/H), au moins un agent tensioactif de type huile-dans-eau (H/E) et un polyélectrolyte anionique et réticulé; avec ledit polyélectrolyte anionique et réticulé comprenant au moins un monomère de réticulation et au moins une unité monomérique hydrophile.
l’unité monomérique hydrophile provient de l’acide acrylique totalement ou partiellement salifié par un sel de métal alcalin ou alcalino-terreux ou un sel d’ammonium.
l’acide acrylique est totalement ou partiellement salifié par un sel de sodium ou un sel d’ammonium, de préférence par un sel de sodium.
le polyélectrolyte anionique et réticulé comprend une unité monomèrique de formule (1):

(1)

Avec: R1 choisi entre -H, -CH₃, -C₂H₅et -C₃H₇, de préférence -CH_3,n compris entre 0 et 50, et m compris entre 8 et 22.

ledit adjuvant comprend en outre une huile (H₁), au moins un tensioactif du type eau-dans-huile (E₁) et au moins un tensioactif du type huile-dans-eau (E₂).
L’adjuvant comprend entre 1% et 10% massique de tensioactif du type eau-dans-huile (E₁), de préférence de 3 % à 8% massique.
L’adjuvant comprend entre 1% et 10% massique de tensioactif du type eau-dans-huile (E₂), de préférence de 3 % à 8%.
l’adjuvant comprend pour 100% de sa masse:

de 50% à 97,5% massique de ladite huile (H₁), de préférence de 60% à 90%
de1% à 10% massique dudit tensioactif du type eau-dans-huile (E₁), de préférence de 3% à 8%
de 1% à 10% massique dudit tensioactif du type huile-dans-eau (E₂), de préférence de 3% à 8%; et
de 0,5% à 30% massique d’au moins un microlatex inverse, de préférence de 1 à 10%, plus préférentiellement entre 1% et 10%,

étant entendu que la somme des teneurs massiques a) + b) + c) +d) est égale à 100%.

Adjuvant de vaccin selon l’invention, caractérisé en ce que l’huile (H₁) est une huile minérale blanche. Notons que l’huile (H1) eut également être une huile minérale, comme par exemple l’huile de paraffine, l’huile de vaseline, une isoparaffine.

De manière préférentielle, le microlatex inverse compris dans l’adjuvant de vaccin selon l’invention comprendra pour 100% de sa masse :

- a’) de 10% à 40% massique d’eau, de préférence de 12% à 30% massique,

- b’) de 30% à 50% massique d’huile (H₂), de préférence de 38% à 50% massique,

- c’) de 5% à 30% massique, de préférence de 10% à 25% massique d’un mélange d’au moins un tensioactif du type eau-dans-huile (E’₁) et d’au moins un tensioactif du type huile-dans-eau (E’₂),

- d’) de 5% à 35% massique, de préférence de 10 à 30% massique dudit polyélectrolyte anionique et réticulé,

étant entendu que la somme des teneurs massiques a’) + b’) + c’ + d’) est égale à 100%.

L’huile (H₁) comprise dans l’adjuvant de vaccin objet de la présente invention est identique ou différente de l’huile (H₂) comprise dans le micro-latex inverse.

Selon un aspect particulier, l’huile (H₁) comprise dans l’adjuvant de vaccin objet de la présente invention est identique à l’huile (H₂) comprise dans le micro-latex inverse.

Les huiles (H₂) et les huiles (H₁) sont choisies notamment parmi :

les huiles d’origines végétale, telles que l’huile d’amande douces, l’huile de coprah, l’huile de monoï, l’huile de ricin, l’huile de jojoba, l’huile d’olive, l’huile de colza, l’huile d’arachide, l’huile de tournesol, l’huile de germes de blé, l’huile de germes de maïs, l’huile de soja, l’huile de coton, l’huile de luzerne, l’huile de pavot, l’huile de potiron, l’huile d’onagre, l’huile de millet, l’huile d’orge, l’huile de seigle, l’huile de carthame, l’huile de bancoulier, l’huile de passiflore, l’huile de noisette, l’huile de palme, le beurre de karité, l’huile de noyau d’abricot, l’huile de calophyllum, l’huile de sysybrium, l’huile d’avocat, l’huile de calendula ;
les huiles végétales et leurs esters méthyliques éthoxylés;
les huiles d’origine animale, telles que le squalène, le squalane ;
les huiles synthétiques, notamment les esters d’acides gras tels que le myristate de butyle, le myristate de propyle, le myristate de cétyle, le palmitate d’isopropyle, le stéarate de butyle, le stéarate d’hexadécyle, le stéarate d’isopropyle, le stéarate d’isocétyle, l’oléate dodécyle, le laurate d’hexyle, le dicaprylate de propylèneglycol, les esters dérivés d’acide lanolique, tels que le lanolate d’isopropyle, le lanolate d’isocétyle, les monoglycérides, diglycérides et triglycérides d’acides gras comme le triheptanoate de glycérol, les alkylbenzoates, les polyalphaoléfines, les polyoléfines comme le polyisobutène, les isoalcanes de synthèse comme l’isohexadecane, l’isododécane et les huiles perfluorées. Les huiles de silicone sont également susceptibles d’être utilisées dans le cadre de la présente invention.

Parmi ces dernières, on peut plus particulièrement citer les diméthylpolysiloxanes, les méthylphénylpolysiloxanes, les silicones modifiés par des amines, les silicones mofifiés par des acides gras, les silicones modifiés par des alcools, les silicones modifiés par des alcools et des acides gras, des silicones modifiés par des groupements polyéther, des silicones époxy modifiés, des silicones modifiés par des groupements fluorés, des silicones cycliques et des silicones modifiés par des groupements alkyles. Toutefois, pour des raisons pratiques, il peut être souhaitable que la phase grasse ne comprenne pas d’huile de silicone;

les huiles minérales, hydrocarbures, telles que l’huile de paraffine, l’huile de vaseline, les huiles minérales blanches et les isoparaffines, obtenues par distillation du pétrole et par la mise en oeuvre d’étapes de traitement subséquentes comme par exemple les étapes de désulfurisation, de désasphaltage, d’extraction des composés aromatiques, d’extraction de cires et autres étapes de traitement de finition. Par huile blanche on désigne les huiles minérales conformes aux réglementations FDA 21 CFR 172.878 et CFR 178.3620 (a), inscrites à la Pharmacopée des USA, US XXIII (1995) et conformes aux exigences de pureté de la Pharmacopée Européenne (2008). On peut citer par exemple les huiles commercialisées sous les noms de marque Marcol^TM, Primol^TM, Drakeol^TM, Eolane^TM, Klearol^TM, Puretol^TM;
les huiles légères. Par «huile légère» on entend au sens de la présente invention une huile (H₂), de faible point d’ébullition (de 100°C à 250°C à pression atmosphérique), comprise dans la phase grasse du micro-latex inverse, constituée également d’au moins une huile de point d’ébullition plus élevée; ladite huile légère étant destinée à être évaporée lors d’une étape de concentration par distillation du micro-latex inverse formé pour obtenir un micro-latex inverse concentré. Comme huile légère répondant à cette définition, on peut citer les isoparaffines comportant de 7 à 14 atomes de carbone commercialisées sous les noms de marque Isopar™C, Isopar™E, Isopar™G, Isopar™H, Isopar™L et Isopar™M.

L’agent tensioactif du type eau-dans-huile (E₁) compris dans l’adjuvant de vaccin objet de la présente invention est identique ou différent de l’agent tensioactif du type eau-dans-huile (E’₁) compris dans le micro-latex inverse.

Selon un aspect particulier, l’agent tensioactif du type eau-dans-huile (E₁) comprise dans l’adjuvant de vaccin objet de la présente invention est identique à l’agent tensioactif du type eau-dans-huile (E’₁) compris dans le micro-latex inverse.

Par “agent tensioactif», on désigne au sens de la présente invention un composé qui modifie la tension superficielle entre deux surfaces et qui est une molécule amphiphile, c’est-à-dire qu’elle présente dans sa structure une partie lipophile et une autre partie hydrophile. Ainsi, un agent tensioactif permet de solubiliser et/ou de disperser une phase d’une certaine polarité dans une autre phase de polarité différente.

Par “agent tensioactif du type eau-dans-huile”, on désigne des agents tensioactifs possédant une valeur de HLB suffisamment faible, de préférence supérieur ou égale à 1 et inférieur à 8,0 permettant d’obtenir des émulsions eau dans huile, pour lesquelles la phase aqueuse est dispersée dans la phase grasse lipophile.

Parmi les agents tensioactifs du type eau-dans-huile (E₁) et (E’₁), on peut citer les esters d'anhydro hexitol et d'acide carboxylique aliphatique linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comportant de 12 à 22 atomes de carbone éventuellement substitués avec un ou plusieurs groupes hydroxyles, ou d'un mélange de ces esters.

Par hexitol on désigne les hexols dérivés des hexoses comme le sorbitol, le mannitol, le dulcitol (dénommé aussi galactitol) ou l'iditol.

Par anhydro hexitol, on désigne les produits résultant de la déshydratation des hexitols. Comme anhydro hexitols, il y a par exemple les anhydro sorbitols, les anhydro mannitols, les anhydro dulcitols ou les anhydro iditols. Par anhydro hexitols, on désigne les mono anhydro hexitols (comme par exemple le sorbitan, le mannitan, le dulcitan, l’iditan), éventuellement en mélange avec les dianhydro hexitols (comme par exemple l’isosorbide, l’isomannide, l’isodulcide, l’isoidide) obtenus en tant que produits secondaires lors de la même réaction de déshydratation.

Par mélange d'esters, on désigne les esters obtenus, soit à partir d'un seul acide et d'un seul hexitol, soit à partir d'un seul acide et d'un mélange de plusieurs hexitols, soit à partir d'un mélange de plusieurs acides d'un seul hexitol, soit à partir d'un mélange de plusieurs acides avec plusieurs hexitols.

Par ester d'anhydro hexitol et d'acide carboxylique aliphatique linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comportant de 12 à 22 atomes de carbone éventuellement substitué avec un plusieurs groupe hydroxyles, on désigne par exemple les esters d'acides choisis parmi les acides dodécanoïques, dodécènoïques, tétradécanoïques, tétradécènoïques, hexadécanoïques, hexadécènoïques, octadécanoïques, octadécènoïques, octadécadiènoïques, octadécatriènoïques, octadécatétraènoiques, eicosanoïques, eicosènoïques, eicosadiènoïques, docosanoïques, docosènoïques, hydroxy hexadécanoïques, hydroxyoctadécanoïques, dihydroxydocosanoïques ou dihydroxyoctadécanoïques.

Par ester d'anhydro hexitol et d'acide carboxylique aliphatique linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comportant de 12 à 22 atomes de carbone éventuellement substitué avec un plusieurs groupe hydroxyles, on désigne par exemple les esters des acides choisis parmi l'acide laurique, l'acide isolaurique, l'acide 4-dodécènoïque, l'acide 5-dodécènoïque, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide hypogéique, l'acide stéarique, l'acide isostéarique, l'acide oléique, l'acide iso-oléique, l'acide linoléique, l'acide isogéranique, l'acide linolénique, l'acide arachidique, l'acide 10,13-écosadiènoïque, l'acide béhènique, l'acide érucidique, l'acide cétoléique, l'acide brassique, l'acide 3-hydroxy hexadécanoïque, l'acide 4-hydroxy hexadécanoïque, l'acide 11-hydroxy hexadécanoïque, l'acide 16-hydroxy hexadécanoïque, l'acide 12-hydroxy stéarique, l'acide brasiléique ou l'acide 8,9-dihydroxy stéarique.

Ces esters sont obtenus par estérification des acides et des anhydro hexitols correspondants. La réaction d'estérification est connue de l'homme du métier ; elle est décrite dans de nombreux brevets et livres de référence.

Parmi les esters d'anhydro hexitol, et d'acide carboxylique aliphatique linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comportant de 12 à 22 atomes de carbone éventuellement substitués avec un ou plusieurs groupes hydroxyles, on peut citer le laurate de sorbitan (commercialisé sous le nom de marque Montane™20), le laurate de mannitan, le laurate de dulcitan, l’isolaurate de sorbitan, l’isolaurate de mannitan, l’isolaurate de ducitan, le palmitate de sorbitan, le palmitate de mannitan, le palmitate de dulcitan, le stéarate de sorbitan (commercialisé sous le nom de marque Montane™60), le stéarate de mannitan, le stéarate de dulcitan, I'isostéarate de sorbitan (commercialisé sous le nom de marque Montane™70), I'isostéarate de mannitan, I'isostéarate de dulcitan, I'oléate de sorbitan (commercialisé sous le nom de marque Montane™80), I'oléate de mannitan (commercialisé sous le nom de marque Montanide™80), l’oléate de dulcitan, le sesquioléate de sorbitan (commercialisé sous le nom de marque Montane™83), le sesquioléate de mannitan, le trioléate de sorbitan (commercialisé sous le nom de marque Montane™85), le trioléate de mannitan, le bénénate de sorbitan, le béhénate de mannitan, l’arachinate de sorbitan, l’arachinate de mannitan.

Parmi les agents tensioactifs du type eau-dans-huile (E₁) et (E’₁), on peut aussi citer l’oléate de sorbitan éthoxylé avec 5 moles d’oxyde d’éthylène (5 OE) commercialisé par la demanderesse sous le nom de Montanox^TM81, l’alcool oléocétylique diéthoxylé (2 OE) commercialisé par la demanderesse sous le nom de Simulsol^TMOC72.

Par “agent tensioactif du type huile-dans-eau” (E₂) et (E’₂), on désigne des agents tensioactifs possédant une valeur de HLB suffisamment élevée de préférence supérieure ou égale à 8,0 et inférieure ou égale à 20, de préférence supérieure ou égale à 8,0 et inférieure ou égale à 15,0, permettant d’obtenir des émulsions huile dans eau pour lesquelles la phase grasse lipophile est dispersée dans la phase aqueuse.

Parmi les agents tensioactifs du type huile-dans-eau (E₂) et (E’₂), on peut citer les esters d'anhydro hexitol et d'acide carboxylique aliphatique linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comportant de 12 à 22 atomes de carbone éventuellement substitués avec un ou plusieurs groupes hydroxyles, ou d'un mélange de ces esters, qui subissent ultérieurement une étape d’addition d’oxyde d’éthylène à un degré variable entre 2 et 30 équivalents molaires d’oxyde d’éthylène.

Parmi les esters d'anhydro hexitol et d'acide carboxylique aliphatique linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé, comportant de 12 à 22 atomes de carbone éventuellement substitués avec un ou plusieurs groupes hydroxyles, et éthoxylés, on peut citer notamment les esters de sorbitan éthoxylés, et plus particulièrement l’oléate de sorbitan éthoxylé à 20 moles d’oxyde d’éthylène (20 OE), commercialisé par la demanderesse sous le nom de Montanox^TM80, l’oléate de sorbitan éthoxylé à 15 moles d’oxyde d’éthylène (15 OE), l’oléate de sorbitan éthoxylé à 10 moles d’oxyde d’éthylène (10 OE), l’oléate de sorbitan éthoxylé à 5 moles d’oxyde d’éthylène (5 OE), l’oléate de mannitan éthoxylé à 20 moles d’oxyde d’éthylène (20 OE), l’oléate de mannitan éthoxylé à 15 moles d’oxyde d’éthylène (15 OE), l’oléate de mannitan éthoxylé à 10 moles d’oxyde d’éthylène (10 OE), l’oléate de mannitan éthoxylé à 5 moles d’oxyde d’éthylène (5 OE), le stéarate de sorbitan éthoxylé à 20 moles d’oxyde d’éthylène (20 OE), le stéarate de sorbitan éthoxylé à 10 moles d’oxyde d’éthylène (10 OE), le stéarate de sorbitan éthoxylé à 5 moles d’oxyde d’éthylène (5 OE), le stéarate de mannitan éthoxylé à 20 moles d’oxyde d’éthylène (20 OE), le stéarate de mannitan éthoxylé à 10 moles d’oxyde d’éthylène (10 OE), le stéarate de mannitan éthoxylé à 5 moles d’oxyde d’éthylène (5 OE), le laurate de sorbitan éthoxylé à 20 moles d’oxyde d’éthylène (20 OE) commercialisé par la demanderesse sous le nom de Montanox^TM20, le laurate de sorbitan éthoxylé à 10 moles d’oxyde d’éthylène (10 OE), le laurate de sorbitan éthoxylé à 5 moles d’oxyde d’éthylène (5 OE), le laurate de mannitan éthoxylé à 20 moles d’oxyde d’éthylène (20 OE), le laurate de mannitan éthoxylé à 10 moles d’oxyde d’éthylène (10 OE), le laurate de mannitan éthoxylé à 5 moles d’oxyde d’éthylène (5 OE), le trioléate de sorbitan éthoxylé à 5 moles d’oxyde d’éthylène, le trioléate de sorbitan éthoxylé à 10 moles d’oxyde d’éthylène, le trioléate de sorbitan éthoxylé à 20 moles d’oxyde d’éthylène, le trioléate de sorbitan éthoxylé à 25 moles d’oxyde d’éthylène commercialisé par la demanderesse sous le nom de Montanox^TM85, le trioléate de mannitan éthoxylé à 5 moles d’oxyde d’éthylène, le trioléate de mannitan éthoxylé à 10 moles d’oxyde d’éthylène, le trioléate de mannitan éthoxylé à 20 moles d’oxyde d’éthylène, le trioléate de mannitan éthoxylé à 25 moles d’oxyde d’éthylène.

Parmi les tensioactifs du type huile-dans-eau (E₂) et (E’₂), on peut citer les huiles végétales éthoxylées comme par exemple l’huile de ricin éthoxylée à 25 OE commercialisé par la demanderesse sous le nom de Simulsol^TM1292, l’huile de ricin éthoxylée à 40 OE commercialisé par la demanderesse sous le nom de Simulsol^TMOL 50, l’huile de maïs éthoxylée à 3 moles d’oxyde d’éthylène (3 OE), l’huile de maïs éthoxylée à 8 moles d’oxyde d’éthylène (8 OE), l’huile de maïs éthoxylée à 10 moles d’oxyde d’éthylène (10 OE), l’huile de maïs éthoxylée à 20 moles d’oxyde d’éthylène (20 OE), l’huile de maïs éthoxylée à 30 moles d’oxyde d’éthylène (30 OE), l’huile de maïs éthoxylée à 40 moles d’oxyde d’éthylène (40 OE), l’huile de colza éthoxylée à 3 moles d’oxyde d’éthylène (3 OE), l’huile de colza éthoxylée à 10 moles d’oxyde d’éthylène (10 OE), l’huile de colza éthoxylée à 20 moles d’oxyde d’éthylène (20 OE), l’huile de colza éthoxylée à 30 moles d’oxyde d’éthylène (30 OE), l’huile de colza éthoxylée à 40 moles d’oxyde d’éthylène (40 OE), l’huile de tournesol éthoxylée à 3 moles d’oxyde d’éthylène (3 OE), l’huile de tournesol éthoxylée à 10 moles d’oxyde d’éthylène (10 OE), l’huile de tournesol éthoxylée à 20 moles d’oxyde d’éthylène (20 OE), l’huile de tournesol éthoxylée à 30 moles d’oxyde d’éthylène (30 OE), l’huile de tournesol éthoxylée à 40 moles d’oxyde d’éthylène (40 OE),

Parmi les tensioactifs du type huile-dans-eau (E₂) et (E’₂), on peut citer les alkylpolyglycoside, plus particulièrement les alkylpolyglucosides et les polyalkylxylosides, ou un mélange d’alkylglycosides, les lécithines, les saponines, les alcanols polyoxyéthylés, les polymères comprenant des blocs polyoxyéthylènes et polyoxypropylènes, , l’alcool laurique éthoxylé à 7 moles d’oxyde d’éthylène (7 OE) commercialisé par la demanderesse sous le nom de Silmulsol^TMP7, l’alcool oléocétylique pentaéthoxylé (5 OE), l’alcool oléocétylique octaéthoxylé (8 OE), l’alcool oléocétylique décaéthoxylé (10 OE) commercialisé par la demanderesse sous le nom de Simulsol^TMOC 710, ou les hexaoléates de sorbitan polyéthoxylés commercialisés sous les noms G-1086^TMet G-1096^TM.

Par unité monomèrique de réticulation, on désigne une unité issue d’un monomère possédant au moins deux fonctions réactives par lesquelles peuvent s’établir des liaisons covalentes entre les chaînes polymériques en extension et ledit monomère de réticulation. Par exemple, une unité monomèrique de réticulation peut être issue d’un monomère qui peut comprendre au moins deux fonctions éthyléniques dans sa structure et, lorsqu’engagé dans une réaction de polymérisation radicalaire avec des monomères acryliques, ledit monomère de réticulation peut se lier de façon covalente à deux chaînes de polymère acrylique en cours d’étape de propagation, pour obtenir un polymère réticulé.

Par polymère réticulé, on désigne un polymère non linéaire se présentant à l’état de réseau tridimensionnel insoluble dans l’eau, mais gonflable à l’eau et conduisant donc à l’obtention d’un gel chimique.

Par polymère réticulé, on désigne un polymère composé d’au moins une unité monomérique de réticulation et d’au moins une autre unité monomérique, et plus particulièrement d’une unité monomérique hydrophile. Par unité monomérique hydrophile, on entend au sens de la présente invention, une unité monomérique issue d’un monomère soluble dans l’eau et plus particulièrement soluble dans l’eau à une température supérieure ou égale à 5°C, plus particulièrement à une température supérieure ou égale à 10°C, plus particulièrement à une température supérieure ou égale à 20°C.

Le polymère réticulé peut comprendre des unités monomériques hydrophiles issues de :

l’acide 2-methy 2-[(1-oxo 2-propènyl) amino] 1-propanesulfonique sous forme acide libre ou partiellement ou totalement salifiée ; l’acide acrylique sous forme acide libre ou partiellement ou totalement salifiée, l’acide méthacrylique sous forme acide libre ou partiellement ou totalement salifiée, l’acide itaconique sous forme acide libre ou partiellement ou totalement salifiée, l’acide 2-carboxyéthyl acrylique sous forme acide libre ou partiellement ou totalement salifiée, l’acide maléique sous forme acide libre ou partiellement ou totalement salifiée, l’acrylamide, le N,N-diméthyl acrylamide, le méthacrylamide, le N-isopropyl acrylamide, l’acrylate de (2-hydroxy éthyle), l’acrylate de (2,3-dihydroxy propyle), le méthacrylate de (2-hydroxy éthyle), le méthacrylate de (2,3-dihydroxypropyle), le vinyl pyrrolidone.

Par unité monomérique de réticulation, on désigne une unité monomérique issue d’un monomère diéthylénique ou polyéthylénique, notamment choisi parmi le diméthacrylate d’éthylèneglycol, le diacrylate de diéthylèneglycol, le diacrylate d’éthylèneglycol, le diallyl urée, le triallylamine, le triméthylol propanetriacrylate, le méthylène-bis(acrylamide) ou un mélange de ces composés, l’acide diallyoxyacétique ou un de ses sels comme le diallyloxyacétate de sodium, ou un mélange de ces composés.

Les tensioactifs présents dans l’adjuvant selon l’invention sont des agents tensioactifs du type eau-dans-huile (E₁) ou du type eau-dans-huile (E’₁), tels que définis et décrits précédemment, présentant un caractère lipophile caractérisé par une valeur de HLB supérieure ou égale à 1 et inférieure à 8 et des agents tensioactifs du type huile-dans-eau (E₂) ou du type huile-dans-eau (E’₂), tels que définis et décrits précédemment, présentant un caractère hydrophile caractérisé par une valeur de HLB supérieure ou égale à 8 et inférieure ou égale à 20.

La présente invention a également pour objet l’utilisation d’un microlatex inverse tel que défini précédemment, pour la préparation d’un adjuvant de vaccin.

Le procédé de préparation d’un adjuvant de vaccin selon l’invention, comprend une étape de stérilisation de l’adjuvant de vaccin par filtration stérilisante ou autoclavage.

La filtration sera de préférence effectuée sur un filtre présentant des pores de diamètre moyen inférieur ou égal à 0,22 microns (voir norme ISO 13408-2:2018(fr)).

Avant d’être filtré l’adjuvant pourra être préfiltré. A titre d’exemple l’adjuvant peut être préfiltré à l’aide de filtres hydrophobes présentant des pores de diamètre moyen de 0,45µm. Les étapes de préfiltration et filtration peuvent être réalisées en une seule étape ce qui implique l’utilisation de filtres hydrophobes à doubles membranes, dont une première membrane présente des pores de diamètre moyen de 0,45 µm et la deuxième membrane présente des pores de diamètre moyen de 0,2 µm ou la combinaison d’un premier filtre hydrophobe présentant des pores de diamètre moyen de 0,45 µm et d’un deuxième filtre hydrophobe présentant des pores de diamètre moyen de 0,2µm. Cela signifie que la première membrane ou le premier filtre possède des pores plus larges que la deuxième membrane ou le deuxième filtre. Idéalement la première membrane ou le premier filtre ont présentent des pores de diamètre supérieur ou égal à 0,3 µm, de préférence des pores de diamètre inférieur ou égal à 0,6µm et plus particulièrement égal à 0,45µm. La deuxième membrane présente des pores de diamètre inférieur ou égal à 0,22 µm afin d’obtenir une action stérilisante.

Les filtres et les membranes utilisés pour la filtration et/ou la pré-filtration de l’adjuvant peuvent consister en des supports polymériques de type PTFE (Poly-Tetra-Fluoro-Ethylene), PP (Polypropylene).

De manière préférentielle, ledit procédé de préparation d’un adjuvant selon l’invention comprend les étapes suivantes:

a) Préparation sous agitation mécanique et à température ambiante d’une phase huileuse comprenant au moins une huile et un système émulsionnant comprenant au moins un tensioactifdu type eau-dans-huile (E₁) et/ou du type huile-dans-eau (E₂);

b) Ajout du au moins un microlatex inverse sous agitation mécanique à température ambiante;

c) Maintien de l’agitation mécanique, à température ambiante, jusqu’à l’obtention d’un mélange homogène.

Par température ambiante, on entend au sens de la présente invention, une température supérieure ou égale à 15°C et inférieure ou égale à 30°C.

La présente invention a également pour objet un vaccin comprenant l’adjuvant selon l’invention ainsi qu’au moins une solution aqueuse (S) d’au moins un antigène ou d’au moins un générateur in vivo d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés.

De préférence le vaccin comprendra:

De 10 à 80 % massique de l’adjuvant selon l’invention, et,
De 20 à 90% massique de la solution aqueuse (S).

De préférence ledit vaccin se présente sous la forme d’une émulsion de type eau-dans-huile ou de type huile-dans-eau.

Par antigène ou au moins un générateurin vivod'un composé comprenant une séquence d'acides aminés, on désigne soit des micro-organismes tués, tels que les virus, les bactéries ou les parasites, soit des fractions purifiées de ces micro-organismes, soit des micro-organismes vivants dont le pouvoir pathogène a été atténué. A titre d'exemples de virus pouvant constituer un antigène selon la présente invention, il y a les orthomyxovirus tels que le virus de la grippe, les paramyxovirus tels que le virus de la maladie de Newcastle, les coronavirus tels que le virus de la bronchite infectieuse, les herpès virus tels que le virus de la maladie d'Aujeszky ou le virus de la maladie de Marek. A titre de micro-organisme du type bactérien pouvant constituer un antigène selon la présente invention, on peut citerE. coIi, et ceux des genresPasteurella,Avibacterium,StaphylococcusetStreptococcus. A titre d'exemples de parasites, il y a ceux des genresEimeria,Trypanosoma,etLeishmania.On peut aussi citer les virus recombinants notamment les virus non enveloppés, tels que les adénovirus, le virus de la vaccine, le virus Canarypox, les herpès virus ou les baculovirus. On désigne aussi un vecteur recombinant viral non enveloppé vivant, dont le génome contient, insérée de préférence dans une partie non essentielle pour la réplication du virus enveloppé correspondant, une séquence codant pour une sous-unité antigénique induisant une synthèse d'anticorps et/ou un effet protecteur contre le susdit virus enveloppé ou micro-organisme pathogène ; ces sous-unités antigéniques peuvent être par exemple, une protéine, une glycoprotéine, un peptide ou une fraction peptidique et/ou protectrice contre une infection par un micro-organisme vivant tel un virus enveloppé, une bactérie ou un parasite. Le gène exogène inséré dans le microorganisme peut être, par exemple, issu d'un virus Aujeszky. On peut citer notamment un plasmide recombinant constitué d'une séquence de nucléotides, dans laquelle est insérée une séquence nucléotidique exogène, provenant d'un micro-organisme ou d'un virus pathogène. Cette dernière séquence nucléotidique a pour but de permettre l'expression d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés, ce composé ayant lui-même pour but de déclencher une réaction immune dans un organisme hôte.

Le vaccin tel que défini ci-dessus, comprend une concentration en antigène qui dépend de la nature de cet antigène et de la nature du sujet traité. Il est toutefois particulièrement remarquable qu'un adjuvant selon l'invention, permette de diminuer notablement la dose habituelle d'antigène requise. La concentration adéquate d'antigène peut être déterminée de manière classique par l'homme du métier. Généralement, cette dose est de l'ordre de 0,1 μg / cm³à 1 g / cm³plus généralement comprise entre 1 μg / cm³et 100 mg / cm³. La concentration dudit générateurin vivodans la composition selon l'invention dépend, là encore, notamment de la nature dudit générateur et de l'hôte dans lequel il est administré. Cette concentration peut être aisément déterminée par l'homme du métier, sur la base d'expérience de routine. A titre indicatif, lorsque le générateurin vivoest un micro-organisme recombinant, sa concentration dans la composition selon l'invention en général comprise entre 10²et 10¹⁵microorganismes / cm³et de préférence entre 10⁵et 10¹²microorganismes / cm³. Lorsque le générateurin vivoest un plasmide recombinant, sa concentration dans la composition obtenue selon le procédé objet de l'invention peut être comprise entre 0,01 g / dm³et 100 g / dm³. Le vaccin, tel que défini précédemment, est préparé en mélangeant la phase adjuvante et la phase antigénique, en ajoutant éventuellement de l'eau ou un milieu diluant pharmaceutiquement acceptable.

Le procédé de préparation du vaccin selon l’invention comprend les étapes suivantes:

a) Préparation de l’adjuvant de vaccin selon l’invention,

b) Mélange de l’adjuvant de vaccin obtenu à l’étape a) avec un milieu antigénique.

De préférence le milieu antigénique est destiné à former un vaccin, on parlera de milieu antigénique vaccinal.

Par milieu antigénique on désigne un milieu aqueux comprenantau moins un antigène ou au moins un générateur in vivo d’un composé comprenant une séquence d’acides aminés, tel que décrits ci-dessus.

De préférence le mélange sera tel que le vaccin comprendra pour 100% de sa masse entre 10 % et 80 % massique d’adjuvant et entre 20 % et 90% massique de milieu antigénique, de préférence entre 50% et 80 % massique d’adjuvant et entre 20% et 50% massique de milieu antigénique, et encore plus de préférence entre 50% et 70% massique d’adjuvant et entre 30% et 50% massique de milieu antigénique.

Lors de l’étape b) on pourra optionnellement ajouter dans le mélange un immunostimulant choisi parmi les saponines, les huiles animales et/ou végétales et/ou minérales et/ou de synthèse, les tensioactifs, l’hydroxyde d’aluminium, les lécithines et les dérivés de lécithine.

De manière préférentielle, à l’étape b) le milieu antigénique sera ajouté à l’adjuvant progressivement sous agitation à haut cisaillement pour former une émulsion.

A la fin du procédé d’émulsification, un vaccin sous la forme d’une émulsion préférentiellement de type eau-dans-huile, stable et homogène, est obtenu.

Le vaccin final peut être administré dès fabrication et peut être stocké pendant au moins 1 an, à une température de +4°C (selon la nature de ou des antigènes présents dans le vaccin et de leur stabilité physicochimique dans le temps).

Le vaccin est destiné à être administré en thérapie humaine ou vétérinaire par voie injectable, orale, parentérale, mucosale, in-ovo.

Des exemples d’adjuvants selon l’invention sont présentés ci-après.

Exemple 1 : Préparation de microlatex inverses à base de polyacrylate de sodium

1.1 Préparation des microlatex inverses (A), (B), (C) et (D)

Des microlatex inverses comprenant comme polymère un polyacrylate de sodium réticulé, sont préparés selon les enseignements du brevet européen publié sous le numéro 1371692 B1, qui est incorporé ici par référence. Plus particulièrement les enseignements du paragraphe [0021], des paragraphes [0025] et [0026], des paragraphes [0033] à [0048], et encore plus particulièrement des paragraphes [0039] à [0041] (exemple 2) du brevet européen publié sous le numéro 1371692 B1, sont utilisés pour préparer les microlatex inverses. Pour chacun des microlatex préparés, on utilise une huile minérale blanche fluide, Marcol™52 commercialisé par la société Exxon Mobil. Le même procédé de préparation de microlatex inverses est mis en œuvre en présence de différentes concentrations massiques de tensioactifs, et permet d’obtenir :

le microlatex inverse (A) lorsque la quantité massique de tensioactifs est égale à 14%,
le microlatex inverse (B) lorsque la quantité massique de tensioactifs est égale à 18%,
le microlatex inverse (C) lorsque la quantité massique de tensioactifs est égale à 22%,
le microlatex inverse (D) lorsque la quantité massique de tensioactifs est égale à 25%.

Les microlatex inverses (A), (B), (C) et (D), obtenus après polymérisation radicalaire, se présentent sous la forme de compositions huileuses opalescentes à translucides. Ces microlatex inverses contiennent 60% massique d’un mélange de phase huileuse et de tensioactifs, 15% massique de polyacrylate de sodium réticulé et 25% massique d'eau.

1.2 Préparation des microlatex inverses (E), (F), (G) et (H)

Le procédé de préparation du microlatex inverse (A), est mis en œuvre en utilisant comme tensioactif de type eau dans huile l'oléate de mannitan à la place de l’oléate de sorbitan, pour obtenir le microlatex inverse (E).

Le procédé de préparation du microlatex inverse (B) est mis en œuvre en utilisant comme tensioactif de type eau dans huile l'oléate de mannitan à la place de l’oléate de sorbitan, pour obtenir le microlatex inverse (F).

Le procédé de préparation du microlatex inverse (C) est mis en œuvre en utilisant comme tensioactif de type eau dans huile l'oléate de mannitan à la place de l’oléate de sorbitan, pour obtenir le microlatex inverse (G).

Le procédé de préparation du microlatex inverse (D) est mis en œuvre en utilisant comme tensioactif de type eau dans huile l'oléate de mannitan à la place de l’oléate de sorbitan, pour obtenir le microlatex inverse (H).

Les microlatex inverses (E), (F), (G) et (H) se présentent sous la forme d'une composition huileuse opalescente à translucide, contenant 60% massique d’un mélange de phase huileuse et de tensioactifs, 15% massique de polyacrylate de sodium réticulé et 25% massique d'eau.

Exemple 2 : Préparation de microlatex inverses (A’), (B’), (C’), et (D’)

Le procédé de préparation des microlatex inverses (A), (B), (C), et (D), décrit dans l’exemple 1.1, est mis en œuvre en présence d’un mélange d’acide acrylique et de méthacrylate de lauroyle tétraéthoxylé (2% molaire), pour obtenir respectivement les microlatex inverses (A’), (B’), (C’), et (D’).

Les microlatex inverses (A’), (B’), (C’), et (D’) se présentent sous la forme de compositions huileuses opalescentes à translucides, contenant 60% massique d’un mélange de phase huileuse et de tensioactifs, 15% massique du copolymère réticulé de l’acide acrylique et de méthacrylate de lauroyle tétraéthoxylé et 25% massique d’eau.

Exemple 3 : Préparation des microlatex inverses (B’’) et (C’’)

Le procédé de préparation du microlatex inverse (B) de l’exemple 1 est mis en œuvre en présence d’une quantité d’eau plus importante, de façon à obtenir un microlatex inverse (B’’) se présentant sous la forme de compositions huileuses opalescentes à translucides, contenant 49% massique d’un mélange de phase huileuse et de tensioactifs, 15% massique de polyacrylate de sodium réticulé et 36% massique d’eau.

Le procédé de préparation du microlatex inverse (C) de l’exemple 1 est mis en œuvre en présence d’une quantité d’eau plus importante, de façon à obtenir un microlatex inverse (C’’) se présentant sous la forme de compositions huileuses opalescentes à translucides, contenant 49% massique d’un mélange de phase huileuse et de tensioactifs, 15% massique de polyacrylate de sodium réticulé et 36% massique d’eau.

Exemple 4 : Préparation d’adjuvants selon l’invention

Les adjuvant huileux polymériques sont préparés selon le procédé suivant:

b) Ajout du microlatex inverse ou du latex inverse, sous agitation mécanique modérée (50 à 150 tours.min^-1) à température ambiante;

c) Maintien de l’agitation mécanique modérée (50 à 150 tours.min^-1), à température ambiante, jusqu’à l’obtention d’un mélange homogène.

De la sorte, les adjuvants ADJ1, ADJ2, ADJ3, ADJ’1 sont préparés et se caractérisent par les constitutions décrites dans le tableau 1:

(1): Polyacrylate de sodium se présentant sous la forme d’un latex inverse, dont la préparation est décrite dans le brevet FR2922767 B1.

Exemple 5 : Evaluation des adjuvants selon l’invention et des adjuvants comparatifs

5.1 Filtrabilité

La filtrabilité des adjuvants selon l’invention et des adjuvants comparatifs, est évaluée selon le protocole suivant:

Introduire 10 mL d’adjuvant dans une seringue 2 pièces de 12 mL
connecter un filtre seringue PTFE 0,22µm de 25 mm de diamètre
appliquer un poids de 3310 g
mesurer la masse filtrée en fonction du temps

On mesurela quantité d’adjuvant filtré en fonction du temps et les résultats obtenus pour chaque adjuvant testé sont consignés dans les tableaux ci-dessous:

Les résultats consignés dans les tableaux 2 à 5 montrent que la filtration des adjuvants selon l’invention ADJ1, ADJ2, ADJ3 est plus rapide que celle de l’adjuvant comparatif ADJ’1 sur un filtre de type hydrophobe, notamment en PTFE, de diamètre moyen de pores de 0,2 micromètres.

5.2 Etude de la stabilité des adjuvants selon l’invention et des adjuvants comparatifs

La stabilité des adjuvants selon l’invention ADJ1, ADJ2, ADJ3 et de l’adjuvant comparatif ADJ’1, est évaluée selon le protocole suivant:

i) On introduit dans une enceinte climatique régulée à 20°C une quantité de 90 mL de la composition à tester et contenue dans un flacon de 100mL, pendant une durée d’un an. On évalue avant la mise en stabilité dans l’enceinte et après une durée d’un mois (M1), de trois mois (M3), de six mois (M6) et d’un an (A1) l’aspect visuel de la composition testée.

ii) On introduit dans une enceinte climatique régulée à 37°C une quantité de 90 mL de la composition à tester et contenue dans un flacon de 100mL, pendant une durée d’un mois (M1). On évalue avant la mise en stabilité dans l’enceinte et après une durée d’un mois, l’aspect visuel de la composition testée.

Par stabilité on entend l’absence de déphasage et/ou de sédimentation observée. Les résultats des observations sont consignés dans le tableau 6 ci-dessous.

(Limpide): homogène et limpide, une seule phase

(Hétérogène): hétérogène, deux ou trois phases observées, présence de dépôt.

Les adjuvants ADJ1, ADJ2, ADJ3, ADJ’1 selon l’invention présentent des aspects homogènes dans les conditions de stockage décrites ci-dessous, alors qu’on observe pour l’adjuvant comparatif ADJ’1 des aspects hétérogènes (déphasage et sédimentation) au cours du temps et à différentes températures.

5.3. Caractérisation des propriétés de stabilité des compositions vaccinales contenant des adjuvants selon l’invention

Les propriétés de stabilité des émulsions vaccinales placebo contenant les adjuvants selon l’invention ADJ1, ADJ2, ADJ3, sont évaluées sur une quantité de 200 grammes (préparée dans un bécher de 250 mL de forme basse) selon le protocole suivant, en utilisant un mélangeur rotor-stator Silverson de type L4 ou L5équipé de sa tête standard munie d’une grille à émulsion standard :

i/ 60 grammes de phase aqueuse sont ajoutés dans 140 grammes d’adjuvant sous une agitation mécanique à l’aide d’un agitateur Silverson de type L4 ou L5 à une vitesse de rotation de 1000 tours/minute (durant cette étape la tête d’agitation doit être placée à 0,5 cm du fond du bécher).

ii/ l’émulsion est réalisée en soumettant le mélange obtenu à l’étape i/ à un haut cisaillement (avec l’agitateur Silverson L4 ou L5) pendant une durée de 3 minutes à une vitesse de rotation de 4 000 tours/minute (ou 7 m/s).

Les émulsions obtenues à l’issue de l’étape ii/ sont fluides, homogènes et injectables. Par fluide, on entend plus particulièrement une émulsion liquide dont la viscosité dynamique, mesurée à l’aide d’un Brookfield de type LVDV1+ muni d’un mobile M62 à une vitesse de rotation de 60 tours/minute, à 20°C, est comprise entre 30 et 40 mPa.s.

La stabilité des émulsions obtenues est caractérisée comme suit:

i) On introduit dans une enceinte climatique régulée à 4°C une quantité de 25 mL de la composition à tester et contenue dans un flacon de 30 mL, pendant une durée d’un an. On évalue avant la mise en stabilité dans l’enceinte et après une durée d’un mois (M1), de trois mois (M3), de six mois (M6) et d’un an (A1), l’aspect visuel de la composition testée.

ii) On introduit dans une enceinte climatique régulée à 20°C une quantité de 25 mL de la composition à tester et contenue dans un flacon de 30mL, pendant une durée d’un an. On évalue avant la mise en stabilité dans l’enceinte et après une durée d’un mois (M1), de trois mois (M3), de six mois (M6) et d’un an (A1), l’aspect visuel de la composition testée.

iii) On introduit dans une enceinte climatique régulée à 37°C une quantité de 25 mL de la composition à tester et contenue dans un flacon de 30mL, pendant une durée d’un mois (M1). On évalue avant la mise en stabilité dans l’enceinte et après une durée d’un mois, l’aspect visuel de la composition testée.

Par stabilité on entend l’absence de déphasage et/ou de sédimentation observée. Les résultats des observations sont consignés dans le tableau 7 ci-dessous.

(H): homogène, une seule phase observée

5.4 Caractérisation des propriétés immunologiques des vaccins contenant des adjuvants selon l’invention

Les propriétés adjuvantes des adjuvants huileux polymériques ADJ1, ADJ2 et ADJ3 selon l’invention et tels que décrits aux exemples précédents ont été caractérisées sur plusieurs modèles vaccinaux et plusieurs espèces animales.

Lors d’un premier essai, l’adjuvant selon l’invention ADJ3 a été formulé avec une solution d’ovalbumine pour obtenir un vaccin destiné à être injecté chez la souris.

Dans un second essai, l’adjuvant selon l’invention ADJ2 a été formulé avec un milieu antigénique bactérien constitué de bactéries inactivées dePasteurella Multocidapour obtenir un vaccin destiné à être administré à des espèces aviaires.

Dans un troisième essai, l’adjuvant selon l’invention ADJ1 a été utilisé pour la formulation d’un vaccin viral destiné aux espèces aviaires contre la maladie de Newcastle et la grippe de type H9N2. Ces essais démontrent les propriétés adjuvantes de vaccin des Adjuvants selon l’invention chez plusieurs espèces et plusieurs modèles antigéniques.

Les résultats obtenus sont présentés ci-dessous.

5.4.1 Essai 1 : Essai chez la souris, avec l’ovalbumine comme antigène

L’essai est réalisé sur souris OF1 dans un protocole de vaccination de 90 jours avec l’ovalbumine (OVA) comme modèle antigénique. Les vaccins ont été préparés à partir d’une solution antigénique d’OVA préparée en sérum physiologique à 10 mg/ml, et stérilisée par filtration sur filtre 0,22 µm. La formulation du vaccin comprenant l’antigène OVA et l’adjuvant ADJ3 selon l’invention est effectuée par émulsification à travers un i-connecteur dans un ratio adjuvant selon l’invention ADJ3 / milieu antigénique 70/30 (volume/volume).

L’innocuité des vaccins est appréciée par l’observation des réactions locales aux sites d’injection. L’efficacité vaccinale est évaluée par la détection par méthode ELISA des anticorps de type IgG1 et IgG2a dans le sang. Cette détection se réalise au jour de la vaccination («primo-vaccination» à J0), puis après 14 jours (J14), au moment du rappel de vaccination au vingt-huitième jour (J28), puis au quarante-deuxième jour (J42), puis au cinquante-sixième jour (J56), puis au quatre-vingt-dixième jour (J90) au moment de l’euthanasie.

Aucune réaction locale n’a été observé parmi les éléments du groupe test, signifiant ainsi que le vaccin comprenant l’adjuvant ADJ3 selon l’invention a été bien toléré.

Les figures 1 et 2 présentent le dosage des anti-corps IgG1 et IgG2a à J14, J28, J42, J56 et J90.

La figure 1 est un graphe représentant la réponse de l’anticorps IgG1 contre l’antigène OVA chez la souris pour un vaccin comprenant l’adjuvant ADJ3 selon l’invention.

La figure 2 est un graphe représentant la réponse de l’anticorps IgG2a contre l’antigène OVA chez la souris pour un vaccin comprenant l’adjuvant ADJ3 selon l’invention.

On observe des titres en anticorps significativement plus élevés pour le vaccin comprenant l’adjuvant ADJ3 selon l’invention comparé au vaccin comprenant l’antigène non adjuvé, pour les deux classes d’anticorps, ce qui confirme les propriétés d’adjuvant de vaccin de la formule développée.

5.4.2 Essai 2 : Essai vaccinal chez le poulet, antigène bactérien Pasteurella multocida

Cet essai a été réalisé sur des poulets dans un protocole de vaccination de 42 jours contre le pathogène bactérienPasteurella multocida. Les animaux utilisés dans cette expérimentation sont des poulets roux âgés de 36 jours lors de la vaccination (J0). Chaque dose vaccinale contient 1 dose (0,5 ml) = 0,5.10⁸ UFC soit 1.10⁸ UFC/ml de bactériesPasteurella multocidainactivées. Les groupes vaccinaux sont constitués de 11 poulets mâles et femelles répartis aléatoirement entre les groupes.

La formulation contenant l’adjuvant ADJ2 selon l’invention, est effectuée à l’aide d’un émulsificateur de type Tube Drive (commercialisé par la société Ika) dans des tubes DT50 stériles en ratio adjuvant ADJ2 selon l’invention/milieu antigénique de 70/30 (poids/poids) : vitesse 3 pendant 2 minutes (1100 tours/minute) pour la pré-émulsion puis vitesse 9 pendant 6 minutes (4000 tours/minute).

Les animaux sont vaccinés à J0. Les réactions locales sont observées à l’abattage à J42. Des prélèvements sanguins seront réalisés à J0, J14, J42. Des dosages ELISA spécifiques de l’antigène seront réalisés pour la détection du taux d’anticorps dans les sérums à l’aide d’un kit de détection commercial (kit ID Screen Pasteurella multocida chicken and turkey indirect commercialisé par ID-VEt).

Le vaccin comprenant l’adjuvant ADJ2 selon l’invention est bien toléré chez le poulet, car aucune réaction locale critique n’est observée à l’abattage. On observe également des titres anticorps significativement plus élevés pour le vaccin adjuvé par l’adjuvant ADJ2 par rapport au vaccin non adjuvé chez le poulet, comme montré dans le tableau 10 ci-après.

5.4.3 Essai 3 : Essai vaccinal chez le poulet, antigène viral Newcastle Disease / Avian Influenza

Cet essai a été réalisé sur poulets dans un protocole de vaccination de 28 jours par un vaccin viral inactivé bivalent contre la maladie de Newcastle souche LaSota (NDV) et la grippe aviaire de type H9N2 (AIV). Les animaux utilisés dans cette expérimentation sont des poulets SPF (specific pathogen free) âgés de 28 jours au début de l’expérimentation (J0). Les groupes vaccinaux sont constitués comme suit dans le tableau 11:

Le vaccin test est formulé à l’aide de l’adjuvant huileux polymérique ADJ1 selon l’invention par émulsification dans un ratio adjuvant ADJ1 selon l’invention/milieu antigénique de 70/30 (poids/poids) avec le milieu antigénique contenant les deux valences virales inactivées AIV et NDV. Le groupe contrôle n’est pas vacciné.

Les vaccins sont injectés à J0 par voie intramusculaire. Des prélèvements de sang sont réalisés à J0, J7, J14, J21 et J28 après vaccination et analysés par test d’inhibition de l’hémagglutination pour déterminer les titres anticorps spécifiques contre chaque valence (AIV et NDV). Dans le groupe AIV, une épreuve de protection est réalisée à J28 après vaccination pour mesurer la charge virale après épreuve ( 2.10⁶ EID₅₀dans 0.2ml par voie intraveineuse de virus AIV H9N2 souche XZ). Des écouvillonnages oropharyngeaux et du cloaque sont collectés 5 jours après l’épreuve virale et inoculés à des embryons de poulets SPF pour mesurer la présence virale après deux générations de transmission.

On observe de forts titres anticorps dans le groupe vacciné après vaccination pour les deux valences (figure 1 et figure 2). Après épreuve virulente, aucune mortalité n’est observée, et dans le groupe vacciné on n’observe également aucune charge virale dans les échantillons d’écouvillonnage, ce qui démontre une protection complète contre l’épreuve virale AIV (figure 3).

La figure 3 est un graphe représentant l’évolution du titre en anticorps contre la maladie de Newcastle souche LaSota (NDV) de J0 (ou D0) à J28(D28).

La figure 4 est un graphe représentant l’évolution du titre en anticorps contre la grippe aviaire de type H9N2 (AIV) de J0 (ou D0) à J28(D28).

La figure 5 est un graphe représentant le taux de protection (nombre d’animaux protégés/nombre total) procuré par le groupe Vaccin test en comparaison avec le groupe contrôle.

5.5 Conclusion expérimentale

Les adjuvants selon l’invention se caractérisent par:

une cinétique de filtration, notamment sur des filtres de type hydrophobe (notamment en PolyTétraFluoro Ethylène ou PTFE) de diamètre moyen de pores de 0,2 micromètres, adaptée à l’obtention d’un adjuvant stérile
une stabilité dans le temps à 20°C et à 37°C, à savoir restant d’un aspect homogène et limpide, sans laisser apparaître de phénomènes de déphasage et/ou de sédimentation
l’obtention d’émulsions vaccinales stables, formées par émulsification desdits adjuvants en présence de phase aqueuse vaccinale.
un effet adjuvant de l’immunité chez différentes espèces animales dans des compositions vaccinales en présence de différents milieux antigéniques.

Claims

Adjuvant de vaccin comprenantau moins un microlatex inverse.
Adjuvant de vaccin selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microlatex inverse comprend une phase huileuse, une phase aqueuse, au moins un agent tensioactif de type eau-dans-huile (E/H), au moins un agent tensioactif de type huile-dans-eau (H/E) et un polyélectrolyte anionique et réticulé; avec ledit polyélectrolyte anionique et réticulé comprenant au moins un monomère de réticulation et au moins une unité monomérique hydrophile.
Adjuvant de vaccin selon la revendication 2, caractérisée en ce que l’unité monomérique provient de l’acide acrylique totalement ou partiellement salifié par un sel de métal alcalin ou alcalino-terreux ou un sel d’ammonium.
Adjuvant de vaccin selon la revendication 3, caractérisé en ce que l’acide acrylique est totalement ou partiellement salifié par un sel de sodium ou un sel d’ammonium, de préférence par un sel de sodium.
Adjuvant de vaccin selon l’une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que le polyélectrolyte anionique et réticulé comprend une unité monomèrique de formule (1):

(1)
Avec:
R1 choisi entre -H, -CH₃, -C₂H₅et -C₃H₇, de préférence -CH₃

n compris entre 0 et 50, et

m compris entre 8 et 22.
Adjuvant de vaccin selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit adjuvant comprend en outre une huile (H₁), au moins un tensioactif du type eau-dans-huile (E₁) et au moins un tensioactif du type huile-dans-eau (E₂).
Adjuvant de vaccin selon la revendication 6, caractérisé en ce qu’il comprend entre 1% et 10% massique de tensioactif du type eau-dans-huile (E₁), de préférence de 3 % à 8% massique.
Adjuvant de vaccin selon l’une des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce qu’il comprend entre 1% et 10% massique de tensioactif du type eau-dans-huile (E₂), de préférence de 3 % à 8%.
Adjuvant de vaccin selon l’une des revendications 6 à 8, comprenantpour 100% de sa masse:
a) de 50% à 97,5% massique de ladite huile (H₁), de préférence de 60% à 90%
b) de1% à 10% massique dudit tensioactif du type eau-dans-huile (E₁), de préférence de 3% à 8%
c) de 1% à 10% massique dudit tensioactif du type huile-dans-eau (E₂), de préférence de 3% à 8%; et
d) de 0,5% à 30% massique d’au moins un microlatex inverse, de préférence de 1 à 10%, plus préférentiellement entre 1% et 10%,
étant entendu que la somme des teneurs massiques a) + b) + c) +d) est égale à 100%.
Adjuvant de vaccin selon l’une des revendications 6 à 8, caractérisé en ce que l’huile (H₁) est une huile minérale blanche.
Utilisation d’un microlatex inverse tel que défini dans l’une des revendications 2 à 5 pour la préparation d’un adjuvant de vaccin.
Vaccin comprenant l’adjuvant tel que défini à l’une des revendications 1 à 10 ainsi qu’au moins une solution aqueuse (S) d’au moins un antigène ou d’au moins un générateur in vivo d'un composé comprenant une séquence d'acides aminés.
Vaccin selon la revendication 12, caractérisé en ce qu’il comprend:
De 10 à 80 % massique de l’adjuvant tel que défini à l’une des revendications 1 à 10, et,

De 20 à 90% massique de la solution aqueuse (S).
Vaccin selon l’une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que ledit vaccin se présente sous la forme d’une émulsion de type eau-dans-huile ou de type huile-dans-eau.
Procédé de préparation d’un adjuvant de vaccin tel que défini à l’une des revendications 1 à 10, comprenant une étape de stérilisation de l’adjuvant de vaccin par filtration ou par autoclavage.
Procédé selon la revendication 12 , caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes:
a) Préparation sous agitation mécanique et à température ambiante d’une phase huileuse comprenant au moins une huile et un système émulsionnant comprenant au moins un tensioactifdu type eau-dans-huile (E₁) et/ou du type huile-dans-eau (E₂);
b) Ajout du au moins un microlatex inverse sous agitation mécanique à température ambiante;
c) Maintien de l’agitation mécanique, à température ambiante, jusqu’à l’obtention d’un mélange homogène.
Procédé de préparation d’un vaccin comprenant les étapes suivantes:
a) Préparation de l’adjuvant de vaccin selon le procédé tel que défini à l’une des revendications 15 et 16, et
b) Mélange de l’adjuvant de vaccin obtenu à l’étape a) avec un milieu antigénique.