KR20110000259A - 고분자 유화제를 함유하는 안정성이 우수한 면역증강제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안정화제로서 고분자 유화제를 함유하는 면역증강제 조성물 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 블록 공중합체 형태의 고분자 유화제, 오일성분, 계면활성제 및 수성성분을 함유하여 안정성이 우수한 면역증강제 조성물 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

면역증강제, 백신 조성물, 계면활성제

Description

고분자 유화제를 함유하는 안정성이 우수한 면역증강제 조성물{Highly stable adjuvants comprising polymeric emulsifier as stabilizer}

본 발명은 안정화제로서 고분자 유화제를 함유하는 면역증강제 조성물 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 블록 공중합체 형태의 고분자 유화제, 오일성분, 계면활성제 및 수성성분을 함유하여 안정성이 우수한 면역증강제 조성물 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

백신 조성물은 현재 미생물을 감쇄시키거나 사망시키는 효능을 가진 병원성 미생물, 약화된 미생물, 불활성화된 미생물, 이들 미생물로부터 정제된 분설 및 유전자 재조합에 의해 생성시킨 병원균의 단백질 서브유닛(subunit) 또는 그의 조합이 백신 제제에 적합하게 제조되어 사용될 수 있다. 불활성화된 미생물 또는 정제된 단백질 서브유닛을 백신 접종용 항원으로서 사용하는 경우, 이런 항원에 의한 면역성의 유발이 미흡하고, 따라서 면역반응을 향상시키기 위한 보조물질 즉, 면역증강제가 첨가되어야 한다.

면역증강제는 일반적으로 백신 항원과 조합되었을 때, 항원만에 의해 유도된 반응에 비해 백신 항원에 대한 면역반응을 증가시키는 임의의 화합물이다. 면역증강제는 체액성 면역반응 및 세포성 면역반응 또는 이들 두 가지의 수위를 증가시키는 기능을 하면서, 다른 한편으로는 이들 반응을 지속시키는 기능을 한다.

면역증강제는 그것의 물리적 성질에 따라 크게 입자성 면역증강제와 비-입자성 면역증강제로서 분류된다. 입자성 면역증강제는 주로 마이크로 또는 나노입자로서 존재하며 면역원은 입자에 혼입되거나 결합될 수 있다. 알루미늄 염, 유중수 유화액, 수중유 유화액, 면역 자극 복합체, 리포솜 및 나노 또는 마이크로 입자가 그 예이다. 비-입자성 면역증강제는 입자성 면역증강제와 함께 사용되며, 뮤라밀 디펩타이드, 비-이온성 블록 공중합체, 사포닌, 리피드 A(2개의 포스페이트 기와 C12 내지 C16 길이의 5 또는 6개의 지방산 쇄를 갖는 글루코사민의 디사카라이드), 사이토카인, 탄수화물 중합체, 폴리사카라이드 유도체 및 콜레라 독소 및 이콜라이(E. Coli) 불안정 독소 등의 박테리아 독소 등이 그 예이다.

가장 잘 알려진 면역증강제의 일부는 입자성 면역증강제와 비-입자성 면역조절 물질의 조합으로서, 예를 들면, 죽은 미코박테리아와 디무수만니톨 모노올리에이트로서 규정된 아라셀(Arlacel) A와 혼합된 광유를 함유하는 유중수 유화액인 프로인트 완전 보조제(Freund's Complete Adjuvant, FCA)으로서 오일 유화액의 저장효과와 미코박테리아의 면역조절 성질 성분의 조합이다. 그러나 FCA의 항체 반응 유도가 우수하지만, 주사 투여시 국소 반응이 매우 심하고 발열 및 육아종 염증 등의 부작용을 수반하여 사용이 제한되었다. 이런 부작용을 피하기 위해, 불완 전 프로인트 보조제(Incomplete Freund's Adjuvant)가 개발되었으며, 미코박테리아 성분이 없는 점을 제외하고 FCA와 조성이 유사하다. 그러나 프로인트 보조제로 제조된 유화액은 점도가 매우 높고, 안정도가 낮으며, 따라서 이들의 상업적 개발에 제한이 있다.

면역증강제의 상업적 유용성은 제형의 특성에 의해 결정되며, 알루미늄하이드록사이드나 카보폴을 함유한 백신이 물을 기반으로 하는 현탁액인 반면, 오일 면역증강제를 함유한 백신은 유제와 혼합한 유화액으로 제조된다. 일반적으로 오일 면역증강제는 그 형태별로 수중유적형(oil-in-water, O/W), 유중수적형(water-in-oil, W/O) 및 다중형(water-in-oil-in-water) 유화액 등이 있다. 일반적으로 백신 조성물에 사용되는 유화액은 오일, 수용액 및 계면활성제의 혼합물을 포함하며, 일부 에멀전은 친유성 계면활성제 및 친수성 계면활성제를 혼입하여 제조하거나, 이온성 계면활성제로서 알려진 레시틴(lecithin) 또는 사포닌(saponin)을 함유할 수 있다.

면역증강제로서 오일 유화액은 제형의 형태가 어떠한 것이라 할지라도 주로 주사에 의해 투여된다. 오일 유화액이 주사 가능하기 위해서는 제형은 충분한 유동성을 가져야하지만 오일 유화액 특히 유중수적형 유화액은 주사투여가 어려울 정도로 점성이 높다. 특히, 대사전환이 가능한 오일의 유중수적형 유화액의 경우 점도가 주사 투여시 문제가 될 수 있다.

유중수적형 유화액의 점도는 일반적으로 연속상인 오일의 점도에 의존한다. 미네랄 오일 및 대사가능한 비-미네랄 오일 등의 다양한 오일들이 면역증강제로서 이용될 수 있다. 일반적으로 오일을 기반으로 하는 면역증강제가 오일을 사용하지 않는 백신들에 비해 면역 활성을 증가시킬 수는 있지만, 특히 미네랄 오일을 사용한 백신의 경우 주사부위에서 국소반응을 일으킬 수 있다. 이러한 문제는 미네랄 오일이 대사되지 못하거나 투여부위에 접촉하여 머무르기 때문에 발생한다.

투여부위에서 국소반응을 일으키는 문제의 측면에서, 미네랄 오일을 비-미네랄 오일로 대체하는 것이 바람직한 것으로 간주되었으며, 미국특허 제5,422,109호는 대사가능한 식물성, 동물성 및 합성오일 또는 대사가능한 오일과 대사가능하지 않은 오일이 혼합된 오일을 연속상으로서 함유하는 유화액 면역증강제를 제시하였고, 한국등록특허 제328,009호는 대사가능한 오일로서 식물성 오일 또는 지방산, 폴리올 또는 알콜 에스테르 등을 오일상으로 사용하고 폴리글리세릴 리시놀레이트 또는 폴리글리세릴 폴리리시놀레이트와 같은 계면활성제로 사용하여 에멀젼의 제조가 가능함을 제시하였다.

그러나 대사가능 오일을 기반으로 하는 면역증강제가 국소적 관용의 문제가 없는 반면 미네랄 오일을 기반으로 하는 면역증강제만큼 면역 활성이 높게 유지되어야 한다. 더욱이, 비-미네랄 오일을 기반으로 하는 유중수적형 유화액을 이용한 면역증강제는 안정하고, 충분한 저장성을 가지고 있어야만 한다. 대사가능한 오일 특히 합성, 반합성 및 식물성 오일들은 실온에서 점도가 높고 유중수적형 유화액에 이용되었을 때 유화액은 오일 자체의 점도와 유사한 점도를 갖는다. 그리고, 오일 함량의 감소 즉 물 함량의 증가는 종종 주사투여가 불가능할 정도까지 유화액의 점도를 증가시키며, 상호계면의 면적을 증가시켜 유화액의 안정성에 영향을 미친다. 계면활성제의 양으로 상호계면 면적의 크기를 결정하는 것은 불충분하며 유화액은 붕괴된다.

또한 상호계면 면적의 크기는 분산상의 액적크기에 의존하며, 액적의 크기 감소는 상호계면의 면적을 증가시킨다. 기계적 수단들이 분산상의 액적크기를 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 일반적으로 고속 전단 처리 장비에 비해 저속 전단 처리 장비가 액적의 크기를 증가시키며 결과적으로 상호계면 면적을 감소시킨다.

한편, 상업적 유용성의 관점에서 저장 또는 수송 동안에 면역증강제로서 사용되는 유화액의 안정성은 매우 중요하게 고려되어야 하며, 또한 주사 투여가 가능할 정도의 충분한 유동성을 유지할 필요가 있다. 일반적으로 유화액의 불안정성은 유상과 수상의 상분리, 침강 또는 응집 등의 현상으로 나타난다. 이는 백신 조성물에서 유상과 수상의 비중이 다르거나 대부분 분산상의 액적의 크기가 크거나 불균일하기 때문에 발생한다.

이러한 불안정성은 조성물이 농축 면역원 특히 비-정제된 농축 면역원을 함유하고 있는 경우에 많이 발생하며, 사멸된 불활화 백신에 사용되는 면역증강제의 경우 그리고 면역원이 동일한 부피의 희석제 내에서 더욱 잘 농축되기 때문에 다가 백신 조성물의 경우 더욱 잘 발생한다. 이러한 불안정성을 극복하기 위해 또는 주사 부위에서의 부작용을 감소시키기 위해 유화액 내의 계면활성제 및 기타 성분을 감소시킬 수 있으나 이러한 감소는 백신 조성물의 안정성의 감소를 유발할 수 있다. 따라서 주사 투여가 가능한 충분한 유동성을 가지면서 장기간 안정성을 가진 신규 면역증강제 및 그러한 면역증강제를 함유하는 백신 조성물에 대한 연구가 계속되고 있다.

이에 본 발명자들은 항원의 면역 활성을 증대시키고 안정성이 우수한 면역증강제의 개발을 위해 연구, 노력한 결과, 특정 고분자 유화제를 함유하는 유중수(W/O)형 유화액이 면역증강제로 유용하며 제형 안정성을 장기간 유지시킬 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 안정화제로서 고분자 유화제를 이용하여 안정성이 우수하고 주사 투여가 가능한 면역증강제 조성물 및 이를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 오일 성분, 비이온성 유화제 및 A-B-A 형태의 블록공중합체인 고분자 유화제를 포함하는 면역증강제 조성물로서, 상기 A는 하기 화학식 1로 표시되고, B는 하기 화학식 2로 표시되는 면역증강제 조성물을 그 특징으로 한다.

상기 화학식 1에서,

R₁은 수소 또는 1가의 C₁ ~ C₂₄의 알킬기;

R₂는 2가의 C₁ ~ C₂₄의 알킬기;

n은 0 또는 1 이고, p는 1 ~ 200의 정수이다.

상기 화학식 2에서,

R₃는 수소, 히드록시기 또는 C₁ ~ C₃의 알킬기;

q는 10 ~ 500의 정수이다.

또한 본 발명은 상기 면역증강제 조성물 및 면역원성 물질을 포함하는 백신 조성물을 그 특징으로 한다.

본 발명에 의한 면역증강제 조성물은 안정화제로서 고분자 유화제를 함유하는 유중수(W/O)형 유화액으로서 강한 면역반응을 유도하고, 면역원성을 지속적으로 유지하고, 제조가 용이하다. 또한 상기 면역증강제 조성물은 액적의 크기가 균 일하고, 주사투여가 가능한 충분한 유동성을 유지하며, 침강이나 상분리 등의 문제를 일으키지 않음으로써 제형의 안정성이 크게 증가되어 조성물의 사용기간을 증가시켜 백신의 제형으로서 널리 상용될 수 있으리라 기대된다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 면역증강제에서 사용되는 안정화제는 A-B-A의 구조를 갖는 블록 공중합체 형태의 고분자 유화제로서 A는 오일에 용해되는 모노카르복시산 잔기를 가지며, B는 물에 용해되는 2가(divalent)의 폴리알킬렌 글리콜 또는 치환된 폴리알킬렌 글리콜 잔기를 가진다.

상기 A부분의 화합물은 하기 화학식 1과 같이 표시된다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

R₁은 수소 또는 1가의 C₁ ~ C₂₄의 알킬기;

R₂는 2가의 C₁ ~ C₂₄의 알킬기;

n은 0 또는 1이고, p는 1 ~ 200의 정수이다.

또한 상기 화학식 1에서 괄호 내의 반복단위는 그 구조가 모두 동일하거나 R₁, R₂ 및 n이 다른 반복단위일 수 있으며, p는 고분자성 물질에서 일반적으로 나타내는 것과 같이 통계적인 평균값이다. 한편, 상기 화학식 1에서 R₁ 및 R₂는 선형(linear) 또는 가지형(branched)의 탄화수소일 수 있다.

상기 화학식 1의 형태를 가지는 성분 A의 구체적인 예로 폴리라우르산, 폴리미리스틴산, 폴리팔미트산, 폴리스테아르산, 폴리이소스테아르산, 폴리아라키드산 등이 있으며, 바람직하게는 폴리스테아르산, 폴리이소스테아르산이 포함될 수 있다.

한편 상기 A-B-A형의 고분자 유화제에서 성분 B는 하기 화학식 2로 표시된다.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서,

R₃는 수소, 히드록시기 또는 C₁ ~ C₃의 알킬기;

q는 10 ~ 500의 정수이다.

또한 상기 화학식 2에서 괄호 내의 반복단위는 그 구조가 모두 동일하거나 R₃가 다른 반복단위일 수 있으며, q는 고분자성 물질에서 일반적으로 나타내는 것과 같이 통계적인 평균값이다.

상기 화학식 2의 형태를 가지는 성분 B의 구체적인 예로 폴리에틸렌글리콜, 폴리히드록시에틸렌글리콜, 폴리글리세롤, 폴리프로필렌글리콜, 폴리히드록시프로필렌글리콜, 폴리부틸렌글리콜, 폴리히드록시부틸렌글리콜 등이 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세롤이 포함될 수 있다. 또한 q는 20 ~ 60 범위의 값을 가지는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 23 ~ 50의 값을 가질 수 있다.

또한, 상기 블록공중합체에서 A 및 B 성분은 각각 분자량이 500 ~ 50,000, 바람직하게는 3,000 ~ 10,000 인 것을 사용한다.

상기 고분자 유화제는 다양한 오일 또는 유화액과 충분한 상용성을 가지며 고분자 유화제의 함량은 면역증강제 전체 중량에 대하여 0.1 ~ 5.0 중량%, 바람직하게는 0.5 ~ 3.0 중량%로 함유된다.

본 발명의 면역증강제는 오일과 비이온성 계면활성제를 포함하며, 면역증강제의 안정성을 위해 고분자 유화제를 혼합한 것이다. 상기 고분자 유화제가 유중수(W/O)형 유화액 내에서 항원을 함유한 분산상인 수상의 액적을 보호함으로써 면역원성과 안정성을 증진시킨다.

본 발명에서 사용한 오일은 투여되는 동물 및 동물 환자의 신체 내에서 대사 될 수 없는 오일로서, 무기 오일을 지칭하며 증류 기법을 통해 석유로부터 수득된 액체 탄화수소들의 혼합물이다. 이러한 오일은 무기 경유, 즉 석유의 증류에 의해 유사하게 수득되지만 비중이 유동 파라핀보다 약간 더 낮은 오일을 포함한다. 상기 오일에는 알케인, 알켄, 알카인, 및 이들의 상응하는 산 및 알콜, 이들의 에테르 및 에스테르, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 본 발명의 면역증강제 및 백 신 조성물에 사용하기에 바람직한 오일은 가벼운 탄화수소 화합물, 즉 탄소수가 15 내지 32인 선형 또는 분지형 탄소 사슬을 포함하고 방향족이 없는 오일로서 예를 들어 미네랄 오일, 파라핀 오일, 하이드로게네이티드 캐스트롤, 하이드로게네이티드 폴리데센 등이 있으며 상품화된 미네랄 오일(MARCOL 52®, MARCOL 82®(Esso사) 또는 DRAKEOL 6VR®(Penreco사)을 이용할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 면역증강제 조성물에서 오일 성분은 면역증강제 전체 중량에 대하여 40 ~ 80 중량%, 바람직하게는 50 ~ 70 중량% 함유된다.

본 발명의 면역증강제는 비이온성 계면활성제로서 친수성 계면활성제와 친유성 계면활성제를 각각 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 비이온성 친수성 계면활성제로는 소르비탄의 에톡실화된 지방산 모노에스테르(에톡실화된 소르비탄 모노올레에이트, Tween 81®), 소르비탄의 에톡실화된 지방산 디에스테르, 소르비탄의 에톡실화된 지방산 트리에스테르(에톡실화된 소르비탄 트리올레이트, Tween 85® ,또는 에톡실화된 소르비탄 트리스테아레이트, Tween 65®), 에톡실화된 지방 알코올 (Brij 76®, Brij 56®, Brij 96®), 에톡실화된 지방산(Simulsol 2599®, Myrj 45®) 및 에톡실화된 피마자 오일(Arlatone 650®, Arlatone G®) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합물이 사용될 수 있다.

본 발명의 면역증강제 조성물에서 상기 비이온성 친수성 계면활성제의 성분은 면역증강제 전체 중량에 대하여 0.1 ~ 10.0 중량%, 바람직하게는 1.0 ~ 5.0 중량% 함유된다.

본 발명의 면역증강제는 비이온성 친유성 계면활성제로 소르비탄의 지방산 에스테르(Span 20®(소르비탄 모노라우레이트), Span 40®(소르비탄 모노팔미테이트), Span 60®(소르비탄 모노스테아레이트), Span 65®(소르비탄 트리스테아레이트) Span 80®(소르비탄 모노올레에이트), Span 85®(소르비탄 트리올레이트), 소르비탄 이소스테아레이트 또는 Crill 6®), 만니드의 지방산 에스테르(Montanide 80®, 만니드 디올레이트, 만니드 트리올레이트 또는 만니드 테트라올레이트 ) 및 만니드의 에톡실화된 지방산 에스테르(Montanide 888®, Montanide 103®, 에톡실화된 만니드 모노올레이트, 에톡실화된 만니드 디올레이트, 에톡실화된 만니드 트리올레이트 또는 에톡실화된 만니드 테트라올레이트) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합물이 사용될 수 있다.

본 발명의 면역증강제 조성물에서 상기 비이온성 친유성 계면활성제의 성분은 면역증강제 전체 중량에 대하여 0.1 ~ 10.0 중량%, 바람직하게는 1.0 ~ 5.0 중량% 함유된다.

결국, 본 발명의 면역증강제 조성물에서 포함되는 총 계면활성제 함량은 면역증강제 전체 중량에 대하여 0.1 ~ 20.0 중량%, 바람직하게는 2.0 ~ 10.0 중량% 범위에서 존재한다.

또한 본 발명의 면역증강제 조성물에서 수성 성분은 물, 완충 염수 또는 임의의 다른 적합한 수용액으로서 면역증강제 전체 중량에 대하여 20 ~ 60 중량%의 양으로 존재하며, 상기 수성 성분은 백신 조성물로 사용되는 경우 면역원성 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 면역증강제 조성물은 상기 수상 성분에 오일 성분이 분산된 유중 수적(water in oil type, W/O)형 유화액의 형태를 가지며, 상기 블록공중합체의 고분자 유화제이 안정화제로서 작용하여 보관 안정성이 매우 우수하다. 유화액 제조 시 균일한 입자와 형태를 갖기 위해서는 적절한 물리적 힘을 가해야 하며, 아지테이터(agitator), 호모게나이저(homogeniser), 콜로이드밀(colloid mill), 제트믹서(jet mixer), 및 초음파시스템(ultrasonic system) 등을 사용하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 면역증강제 조성물에 생물학적으로 허용되는 양으로서 유효한 양의 면역원성 물질이 포함된 백신 조성물을 권리범위로 포함한다.

면역원성(免疫原性)은 동물에서 항원에 대한 면역 반응을 유발하는 능력을 지칭하고, 면역 반응은 주로 세포독성 T-세포를 통해 매개되는 세포면역반응이거나, 헬퍼 T-세포에 의해 매개되어 항체를 생산하는 B-세포를 활성화시키는 체액성 면역 반응일 수 있다. 또한, 본 발명에서 면역원성 물질은 백신 조성물에 존재하여 동물에 투여했을 때의 보호성 면역 반응을 이끌어 내는 임의의 물질을 지칭한다.

상기 면역원성 물질은 그 종류 및 형태가 제한되지 아니하나, 불활성화된 병원체 또는 약화된 병원체로서, 전체 또는 부분적 세포 제제의 형태이거나, 종래의 단백질 정제, 유전자 조작 기법 또는 화학적 합성에 의해 수득된 항원 분자의 형태로서, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae), 하에모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 보르데텔라 브론티셉티카(Bordetella bronchiseptica), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis), 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리카 세로바스(Salmonella enterica serovars), 캔디다(Candida), 크립토스포리듐 파르븀(Cryptosporidium parvum), 네오스포라 카니움(Neospora canium), 오스터타기아(Ostertagia) 및 쿠페리아(Cooperia)로부터 제조된 항원일 수 있다. 또한 불활성화된 전체 또는 부분적 바이러스 제제의 형태이거나, 또는 종래의 단백질 정제, 유전자 조작 기법 또는 화학적 합성에 의해 수득된 항원 분자의 형태인 소의 허피스 바이러스-1,3,6, 소의 바이러스성 설사 바이러스(BVDV) 제1형 및 제2형, 소의 파라인플루엔자 바이러스, 전염성 기관지염 바이러스 (IBV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 산란 저하 증후군 바이러스 (EDS) 또는 전염성 F 낭병 바이러스 (IBDV), 기타 조류 인플루엔자 바이러스 등의 병원성 바이러스를 포함하며, 핵산 서열이 재조합된 발현 벡터가 포함될 수 있다.

상기 백신 조성물은 또한 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 수의학적으로 허용 가능한 담체란 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 또는 흡착지연제 등을 포함하며, 보다 구체적으로 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 자일리톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유가 이에 해당한다.

상기 백신 조성물은 인간을 제외한 동물에 주입되어 항원에 대한 항체 생성률을 높일 수 있으며, 상기 주입은 피하주사, 근육내 주사, 피하내 주사, 복막내 주사, 비강투여, 구강투여, 경피투여 및 경구 투여로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 방법으로 수행될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술하겠으나, 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 : 유중수적(W/O)형 면역증강제 제조

하기 표 1에 나타난 바와 같은 조성으로 오일, 비이온성 계면활성제, 고분자 유화제 및 수성 성분로 이루어진 면역증강제 조성물(실시예 1 ~ 8)을 제조하였다.

구체적으로 계면활성제인 B상을 A상에 혼입하여 완전히 용해하고, 고분자 유화제인 C상을 혼입한 뒤 호모게나이저(Ultra-turrax T8, IKA-WERKE)를 사용하여 8000rpm으로 혼합물을 유화하였다. 유화된 혼합액에 수성 성분인 D상을 서서히 혼입하면서 상기와 동일한 호모게나이저를 사용하여 8000rpm으로 유화하여 면역증강제 조성물을 제조하였다. 이때, 수성 성분인 D상은 불활화된 뉴캐슬병 바이러스와 불활화된 조류 인플루엔자 바이러스 용액을 각각 인산완충용액(pH 7.2)에 면역증강제 전체 중량의 10 중량%로 용해한 뒤, 부피비 1 : 1의 비율로 혼합하여 사용하였다. 제조된 면역증강제 조성물의 모식도를 도 1에 나타내었다.

한편, 비교예로서 만나이드 올리에이트와 미네랄 오일로 구성된 ISA 70(Seppic사 제조)를 혼합한 비교예 1 및 2와 고분자 유화제를 혼합하지 않은 비교예 3 및 4의 조성물을 제조하였다.

실험예 1 : 면역증강제 조성물의 입자크기와 점도측정

상기 면역증강제 조성물에서 유화액의 평균 입자크기와 점도를 분석하기 위하여, 상기 실시예 및 비교예 조성물의 평균 입자크기와 점도를 측정하였다. 평균 입자크기는 이엘에스-제트(ELS-Z)장비를 이용하여 측정하였고, 점도는 스핀들 타입의 부룩필드 점도계를 사용하여 25℃에서 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었고, 실시예 1 및 비교예 1의 조성물의 입도분포를 도 2 및 3에 나타내었다.

	비교예				실시예
	1	2	3	4	1	2	3	4	5	6	7	8
평균 입자 크기 (㎛)	3	3	4	3	4	3	4	3	4	3	3	3
점도 ( cP )	36.4	48.8	39.9	31.6	50.6	53.6	66.5	78.8	50.2	53.6	71.9	89.1

상기 표 2에서와 같이 고분자 유화제를 함유한 실시예 1 ~ 8의 조성물은 비교예의 조성물과 유사한 평균 입자크기를 가지며, 점도는 약간 상승하였으나, 충분한 유동성을 가지면서 동물에 투여하기에 적절한 100 cP이하의 점도를 나타냄을 확인하였다.

실험예 2 : 면역증강제 조성물의 안정성 시험

상기 제조예에서 제조된 실시예 및 비교예의 조성물의 보관 안정성을 평가하였다. 보관 안정성 평가는 조성물의 오일유출, 침전, 물유출 및 층분리 발생 여부를 37℃에서 또는 24시간 주기로 4℃ ~ 37℃로 순환하는 온도순환의 조건에서 8주 동안 관찰하여 평가하였으며, 그 결과를 하기 표 3 및 도 4에 나타내었다.

	37℃				온도 변화 (4↔37℃)
	오일 유출	침전	물유출	층분리	오일 유출	침전	물유출	층분리
비교예 1	○	○	○	-	○	○	-	○
비교예 2	○	○	○	-	○	○	-	○
비교예 3	○	-	-	○	○	○	-	○
비교예 4	○	-	-	○	○	○	-	○
실시예 1	-	-	-	-	-	-	-	-
실시예 2	-	-	-	-	-	-	-	-
실시예 3	-	-	-	-	-	-	-	-
실시예 4	-	-	-	-	-	-	-	-
실시예 5	-	-	-	-	-	-	-	-
실시예 6	-	-	-	-	-	-	-	-
실시예 7	-	-	-	-	-	-	-	-
실시예 8	-	-	-	-	-	-	-	-

○: 발생, -: 미발생

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 고분자 유화제를 첨가하지 않은 비교예 1 ~ 4의 조성물은 오일유출, 침전, 물유출 및 층분리 현상이 나타나지만, 고분자 유화제를 함유한 본 발명의 면역증강제 조성물의 경우에는 오일유출, 침전, 물유출 및 층분리 현상 없이 안정하였다. 따라서 본 발명에 의한 조성물이 장기간 보관에 있어서 보관 안정성을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 3 : 면역증강제 조성물의 항체가 시험

본 발명의 면역증강제 조성물이 백신 조성물로서의 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 실시하였다.

6 ~ 8주령의 닭을 시험동물로 실시예 2, 실시예 6 및 비교예 1의 조성물을 개체당 0.3mL씩 근육에 접종하고 21일 후 채혈하여 2진 희석에 의한 혈구응집억제(HI) 반응시험법으로 뉴캐슬병 바이러스(NDV) 및 조류 인플루엔자 바이러스(AIV)의 항체가를 측정하였다.

또한 상기 실시예 및 비교예의 조성물을 접종하고 21 일 후, 뉴캐슬병 바이러스 균주를 접종하여 14일 동안 생존 개체수를 모니터링 하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

	시험 개체수	생존 개체수	HI Log2 항체가 (NDV)	HI Log2 항체가 (AIV)
실시예 2	10	9	6.8	6.5
실시예 6	10	8	6.2	5.9
비교예 1	10	9	6.5	5.6
대조군	10	0	<1	<1

상기 표 4에서 나타난 바와 같이, 실시예의 조성물은 비교예의 조성물에 비하여 항체 형성능력이 대등하며, 생존 개체수도 큰 차이가 없어 백신 조성물로서 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명에서 제조된 유중수적(W/O)형 면역증강제의 모식도를 나타낸 그림이다.

도 2는 실시예 1의 조성물의 입도분포를 나타낸 그래프이다.

도 3은 비교예 1의 조성물의 입도분포를 나타낸 그래프이다.

도 4는 비교예 3(A) 및 실시예 4(B)의 조성물을 37℃에서 8주 동안 보관하여 보관 안정성을 평가한 사진이다.

Claims (8)

1. 오일 성분, 비이온성 유화제, 수성 성분 및 A-B-A 형태의 블록공중합체인 고분자 유화제를 포함하는 면역증강제 조성물로서, 상기 A는 하기 화학식 1로 표시되고, B는 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 면역증강제 조성물

   [화학식 1]

   

   상기 화학식 1에서,

   R₁은 수소 또는 1가의 C₁ ~ C₂₄의 알킬기;

   R₂는 2가의 C₁ ~ C₂₄의 알킬기;

   n은 0 또는 1 이고, p는 1 ~ 200의 정수이다.

   [화학식 2]

   

   상기 화학식 2에서,

   R₃는 수소, 히드록시기 또는 C₁ ~ C₃의 알킬기;

   q는 10 ~ 500의 정수이다.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 블록공중합체에서 A 및 B 성분은 각각 분자량이 500 ~ 50,000 인 것을 특징으로 하는 면역증강제 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 에톡실화된 지방산 에스테르, 에톡실화된 지방 알코올, 에톡실화 지방산, 에톡실화된 피마자오일, 소르비탄의 지방산 에스테르, 만니드의 지방산 에스테르 및 만니드의 에톡실화 지방산 에스테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 면역증강제 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 오일 성분은 미네랄 오일, 파라핀 오일, 하이드로게네이티드 캐스트롤 및 하이드로게네이티드 폴리데센으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 면역증강제 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 고분자 유화제는 조성물 전체 중량에 대하여 0.1 ~ 5.0 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는 면역증강제 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 면역증강제 조성물은 유중수적(W/O)형 유화액 형태인 것을 특징으로 하는 면역증강제 조성물.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 선택된 어느 한 항의 면역증강제 조성물 및 생물학적으로 허용되는 양으로서 유효한 양의 면역원성 물질을 함유하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 면역원성 물질은 불활성화된 병원체, 약화된 병원체 및 재조합 발현 벡터로 이루어진 군에서 1종 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.

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