JP2023510005A - ジルチアゼムとウイルスポリメラーゼ阻害薬との組合せ - Google Patents
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Abstract
本発明は、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せに関する。特に、本発明は、ウイルス感染症、特にヒト又は動物の身体の呼吸器及び/又は腸管のウイルス感染症の予防及び/又は治療における前記組合せの治療的使用に特に関する。
Description
本発明の分野
本発明は、少なくとも2種の抗ウイルス化合物の新規組合せに関する。
本発明は、少なくとも2種の抗ウイルス化合物の新規組合せに関する。
特に、本発明は、ウイルス感染症の予防及び/又は治療における使用のためのこの組合せに関する。
特に、本発明は、ウイルス感染症、特に呼吸器及び/又は腸管の上皮細胞に影響を及ぼすウイルス感染症の予防及び/又は治療における治療的使用のためのこの組合せに関する。
技術の状況
ヒトの急性呼吸器感染症(ARI)は、世界における受診、入院及び死亡の主な原因の1つであり、とりわけ、低年齢小児では死亡原因の第1位であって、年間200万人超が死亡する。
ヒトの急性呼吸器感染症(ARI)は、世界における受診、入院及び死亡の主な原因の1つであり、とりわけ、低年齢小児では死亡原因の第1位であって、年間200万人超が死亡する。
急性呼吸器感染症の原因となる病原体のうち、ウイルスが主たる位置を占める。実際、それらは、小児肺炎症例の大部分で認められ、成人の細菌性肺炎の病因である。
発生頻度(季節性流行)及び罹患率の観点で最も代表的なウイルスのうち、A型及びB型インフルエンザウイルスは流行性であり、また、頻発するパンデミックのリスク因子を構成する。インフルエンザウイルスはまた、呼吸器重複感染の場合に共罹患率及び共死亡率の増加の一因となる病原体を構成し、また、抗生物質耐性細菌株の出現の一因となり、これはヒト及び動物における抗生物質治療の有効性を根本的に脅かすものである。
ウイルス、とりわけインフルエンザウイルスの予防的又は治療的処置の観点では、現在の兵器はかなり限定されている。
現在は、ワクチン接種が、インフルエンザを予防するための主な戦略である。しかし、ワクチンの使用には欠点がある。例えば、新しい季節性ウイルス株の出現時には、新しいワクチンを開発及び処方するのに6～9カ月の期間が必要である。更に、循環株が変異すると、ワクチンは効力を失う。最後に、有胚鶏卵に基づく従来のワクチン製造方法では、鳥由来のある特定のパンデミック株、例えば、H5N1又はH7N9に対するワクチンを製造することは困難であり又は不可能ですらある。
学術誌(Pizzornoら、2019b)は、インフルエンザ治療との関連で使用される主な治療用化合物及びそれらの作用機序を提示している。
治療作用が必要な場合、現在使用されている主な抗ウイルス化合物は以下の通りである:オセルタミビル/Tamiflu(登録商標)(ROCHE社);ザナミビル/Relenza(登録商標)(グラクソスミスクライン社);及び米国及び日本を含む数カ国で入手可能なバロキサビルマルボキシル/Xofluza(登録商標)(ROCHE社)。
ザナミビル及びオセルタミビルは、ノイラミニダーゼ阻害薬である。
バロキサビルマルボキシルは、インフルエンザウイルスのポリメラーゼ複合体の阻害薬である;最近、これはまた、他のマイナス鎖RNAゲノムウイルスのポリメラーゼの阻害薬と特徴付けられた(Wangら,2020)。
これらの抗ウイルス治療薬は比較的有効であるが、これらにはまた、第一に、前記抗ウイルス化合物に耐性を有するウイルスの出現の増加、及び第二に、これらの化合物の広域スペクトル抗ウイルス活性の欠如という、重大な欠点がある。
実際に、これらの抗ウイルス化合物は、ウイルス決定因子を標的とし、宿主細胞を標的としない。インフルエンザウイルスの変異(複製の観点であまり忠実でないそれらのポリメラーゼ、及び異なるウイルス間の遺伝子再集合の源であるそれらのセグメント化ゲノムに固有である)の頻度が高いため、従来の抗ウイルス薬は頻発するウイルス耐性を誘発する。
バロキサビルマルボキシルの場合、いくつかの最近の研究が、耐性を発現するリスクが非常に高いことを示している。1つの第3相臨床研究において、耐性株の発生率は、主にA型ウイルス(H3N2)で約10%であった。より重要なのは、耐性率が、1つの小児科研究で約20%に達したことである(Omotoら、2018)。更に、バロキサビルマルボキシルに耐性を有する変異体に関する1つの更なる最近の研究により、主な耐性変異の1つ(PA I38T)が症状軽減開始の遅延及びウイルス排出の延長につながることが示された(Ueharaら、2019)。
最後に、バロキサビルマルボキシルで治療されていない一部の感染患者は耐性菌を排出しており、これは、バロキサビルに耐性を有するウイルスの、個体間伝播性が良好であることを実証しており、これらの変異ウイルスの大規模な蔓延が起こり得るという懸念をもたらす(Takashitaら、2019)。しかも、耐性の臨床的影響は、中でも、入院患者及び免疫不全の個体において特に問題となる。
したがって、これらの耐性の出現を制限するために、新しい抗ウイルス化合物が積極的に探し求められている。特に、少なくとも2種の抗ウイルス化合物の組合せに基づく併用療法が、特に有望と思われる。とりわけ、組み合わされる2種の抗ウイルス化合物が相乗活性を有する場合、これにより、使用する活性化合物の用量を低減すること、したがって、著しい抗ウイルス治療効果を確実にしながら、耐性の出現リスクを制限することが可能になる。
過去数年に同定された新しい抗ウイルス化合物のうち、ジルチアゼムを特に挙げることができ、これは、ウイルスではなく宿主細胞に作用することによって種々のウイルス感染症の治療を可能にする活性化合物である。
国際特許出願WO 87/07508は、サイトメガロウイルス又はヘルペスに関連したウイルス感染症の治療のためのジルチアゼムの使用を記載している。
国際特許出願WO 2011/066657は、ウイルス感染症、例えば、口腔ヘルペス、性器ヘルペス及び帯状疱疹の治療又は予防のためのジルチアゼムの使用を記載している。
国際出願WO 2016/146836及び論文(Pizzornoら、2019a)は、インフルエンザウイルスによる感染症を治療するための、場合により他の抗ウイルス薬と組み合わせた、ジルチアゼムの使用を記載している。ジルチアゼムとオセルタミビルとの組合せが、ウイルス性インフルエンザ感染症を治療するために提示されている。
国際出願WO 2019/224489は、III型インターフェロンをコードする遺伝子の発現を呼吸器上皮細胞において誘導するジルチアゼムのある特定の生物学的効果を詳細に開示している。したがって、ジルチアゼムは、種々の治療的用途で、とりわけ、呼吸器及び腸管上皮におけるウイルス性及び細菌性呼吸器感染症の治療に使用することができる。
したがって、ジルチアゼムは、ウイルス感染症の治療のための非常に有望な新しい治療選択肢である。
しかし、この化合物の治療的使用の多くの利点はまだ確認されていない。特に、他の抗ウイルス薬と組み合わせたその使用には、予想できなかった驚くべき利点があり得る。
本発明の開示
本発明は、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せに関する。
本発明は、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せに関する。
本発明はまた、医薬としての使用のためのこの組合せ、とりわけ、ウイルス感染症、とりわけヒト又は動物の身体の呼吸器及び/又は腸管感染症、特にインフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のためのこの組合せに関する。
本発明はまた、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せを医薬ビヒクル中に含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、ウイルス感染症、特にインフルエンザウイルスによるウイルス感染症の予防及び/又は治療における治療的使用のためのこの医薬組成物に関する。
最後に、本発明は、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物とを含む組合せ製品であって、ウイルス感染症、特にインフルエンザウイルスによるウイルス感染症の予防及び/又は治療における同時の、別々の又は逐次的な使用のための、組合せ製品に関する。
図の説明
図及びそれらの説明において、簡略化のために、以下の名称及び略語を使用するものとする:
- Dil又はDILは、ジルチアゼムを示し;
- FAVは、ファビピラビルを示し;
- BLX、Bal又はバロキサビルは、活性型のバロキサビル(バロキサビル酸)を示す。
図及びそれらの説明において、簡略化のために、以下の名称及び略語を使用するものとする:
- Dil又はDILは、ジルチアゼムを示し;
- FAVは、ファビピラビルを示し;
- BLX、Bal又はバロキサビルは、活性型のバロキサビル(バロキサビル酸)を示す。
本発明の詳細な説明
本発明は、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せに関する。
本発明は、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せに関する。
本発明の意味の範囲内において、「組合せ」とは、少なくとも2種の別個の活性化合物を含む組成物であって、両化合物が抗ウイルス作用を有する、組成物を意味する。
この組合せは、質量で同じ量の各抗ウイルス化合物、すなわち、ジルチアゼム50質量%とウイルスポリメラーゼ阻害薬50質量%との組合せ、又は等しくない用量の各化合物、例えば、ジルチアゼム90質量%とウイルスポリメラーゼ阻害薬10質量%、ジルチアゼム80質量%とウイルスポリメラーゼ阻害薬20質量%、ジルチアゼム70質量%とウイルスポリメラーゼ阻害薬30質量%、ジルチアゼム60質量%とウイルスポリメラーゼ阻害薬40質量%、ジルチアゼム40質量%とウイルスポリメラーゼ阻害薬60質量%、ジルチアゼム30質量%とウイルスポリメラーゼ阻害薬70質量%、ジルチアゼム20質量%とウイルスポリメラーゼ阻害薬80質量%、若しくは更にはジルチアゼム10質量%とウイルスポリメラーゼ阻害薬90質量%のいずれかを含み、百分率は組合せの総質量に対する化合物の質量によって表される。
本発明の第1の実施形態によれば、組合せは、ジルチアゼム及びバロキサビルマルボキルを含む。特に、組合せは、ジルチアゼム及びバロキサビルマルボキルからなる。本発明の一変形形態において、組合せは、ジルチアゼム及び活性型のバロキサビル(バロキサビル酸)を含む。
本発明の第2の実施形態によれば、組合せは、ジルチアゼム及びピモジビルを含む。特に、組合せは、ジルチアゼム及びピモジビルからなる。
本発明の第3の実施形態によれば、組合せは、ジルチアゼム及びRO-7を含む。特に、組合せは、ジルチアゼム及びRO-7からなる。
本発明の第4の実施形態によれば、組合せは、ジルチアゼム及びCC-42344を含む。特に、組合せは、ジルチアゼム及びCC-42344からなる。
他の実施形態によれば、組合せは、
- ジルチアゼム、バロキサビルマルボキシル及びCC-42344、
- ジルチアゼム、バロキサビルマルボキシル及びピモジビル、
- ジルチアゼム、バロキサビルマルボキシル及びRO-7、又は更には
- ジルチアゼム並びにバロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の全ての可能な組合せ
を含む。
- ジルチアゼム、バロキサビルマルボキシル及びCC-42344、
- ジルチアゼム、バロキサビルマルボキシル及びピモジビル、
- ジルチアゼム、バロキサビルマルボキシル及びRO-7、又は更には
- ジルチアゼム並びにバロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の全ての可能な組合せ
を含む。
したがって、本発明による組合せは、抗ウイルス活性を有する少なくとも2種の活性化合物を含み、これらについては以下に詳述する。
この組合せは相乗的抗ウイルス効果を有し、その利点の1つは、各抗ウイルス化合物の使用用量を、単剤療法において従来使用されている用量と比較して低減できることである。これにより、一方では、治療される生物に対して負の副作用の出現を制限することができ、他方では、前記抗ウイルス化合物に対するウイルスの耐性の出現を制限することができる。
この特許出願はまた、ジルチアゼムと少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物、例えば、以下に記載するものの組合せを記載する。
ジルチアゼム
ジルチアゼムは、CAS番号42399-41-7で参照される、ベンゾチアゼピンファミリーのメンバーである分子である。この分子は、L-cisとD-cisの2つのエナンチオマーの形態又はラセミ混合物であることができる。
ジルチアゼムは、CAS番号42399-41-7で参照される、ベンゾチアゼピンファミリーのメンバーである分子である。この分子は、L-cisとD-cisの2つのエナンチオマーの形態又はラセミ混合物であることができる。
ジルチアゼム塩酸塩の構造化学式を、以下に式(I)に示す。
ジルチアゼムは30年より前から知られており、ヨーロッパ及び米国において医薬品規制当局によって認可されている。これは、ジルチアゼム塩酸塩の形で投与できる。Cardizem(登録商標)、Cartia(登録商標)、Taztia(登録商標)及びDilacor(登録商標)が最も一般的な商標名である。
多くの製剤、特に徐放性製剤が入手可能である。ジルチアゼムは、種々の剤形で、例えば、局所適用のためのクリーム剤の形態で、経口投与のための錠剤若しくはカプセル剤の形態で、注射用溶液を調製するための粉末剤の形態で又は吸入のための医薬製剤の形態で入手可能である(WO 02/094238, US 4,605,552)。
ヒトにおいて使用される標準的な投与計画は、カルシウムチャネル阻害薬としての治療的使用のためには、カプセル剤又は錠剤で投与される180～360mg/日である。
この化合物について最初に確認された生理学的性質はカルシウムチャネル阻害、したがって、細胞内カルシウムの流れの阻害である。ジルチアゼムはとりわけ、心筋の筋繊維及び血管の平滑筋線維において膜貫通型カルシウムの侵入を阻害する。これにより、収縮タンパク質に到達する細胞内カルシウム濃度を低下させることが可能となる。
ヒトにおいて、ジルチアゼム投与は、心仕事量を低減する目的で、その血管拡張作用のために適応される。これはまた、心臓及び循環障害、例えば、狭心症、動脈性高血圧症、心筋虚血及び頻脈の治療に使用される。
ジルチアゼムはまた、腎臓及び末梢の観点からは、アンジオテンシンIIの効果を元に戻すことによって作用する。
局所適用においては、ジルチアゼムは慢性裂肛の場合に適応となり得る。
特許EP 1117408は、網膜光受容体の変性に関連する病態を治療するためのカルシウムチャネル阻害薬としてのジルチアゼムの使用を記載している。
前に論じたようなウイルス感染症を治療するためのジルチアゼムの使用に関しては、これはすでにいくつかの特許出願に記載されている。更に、この新しい抗ウイルス治療適応症に関する販売承認を得る目的で、臨床試験が現在進行中である(FLUNEXT PHRC #15-0442 ClinicalTrials.gov Identifier:NCT03212716)。
ウイルスポリメラーゼ複合体阻害薬
インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体は、3つのサブユニット、塩基性タンパク質1(PB1)、塩基性タンパク質2(PB2)及び酸性タンパク質(PA)から構成される。この複合体は、ウイルスゲノムの転写及び複製を可能にする。
インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体は、3つのサブユニット、塩基性タンパク質1(PB1)、塩基性タンパク質2(PB2)及び酸性タンパク質(PA)から構成される。この複合体は、ウイルスゲノムの転写及び複製を可能にする。
開発中の及び/又は最近の製造承認を得ている抗ウイルス治療薬は、このポリメラーセ複合体の異なるサブユニットを標的とし、異なる作用機序に従って作用する:
- バロキサビルマルボキシルは、PAサブユニットによって媒介されるエンドヌクレアーゼ阻害薬であり、
- ピモジビルは、PB2サブユニットの阻害薬であり、
- ファビピラビルは、ポリメラーゼ複合体によるRNA伸長を阻害するヌクレオシド類似体である。
- バロキサビルマルボキシルは、PAサブユニットによって媒介されるエンドヌクレアーゼ阻害薬であり、
- ピモジビルは、PB2サブユニットの阻害薬であり、
- ファビピラビルは、ポリメラーゼ複合体によるRNA伸長を阻害するヌクレオシド類似体である。
規制当局によって承認され、販売されたこのポリメラーゼ複合体の最初の阻害薬化合物は、バロキサビルマルボキシルであった。現在、他のPB2阻害薬(ピモジビル)及びPB1阻害薬(ファビピラビル)はそれぞれ、第3相臨床試験で試験されているか、又は認可が制限されている。
バロキサビルマルボキシル
本出願において(とりわけ図中で)バロキサビルとも称するバロキサビルマルボキシル(S-033188)は、インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体のPAサブユニットのキャップ依存性エンドヌクレアーゼ活性を阻害する分子である。この分子は、生体への投与後に活性型「バロキサビル酸」に代謝されるプロドラッグであり、活性型「バロキサビル酸」は、ウイルスポリメラーゼ複合体のPAサブユニットの活性部位において2つのマンガンイオンと安定な結合を形成することによってウイルスmRNA合成の開始を阻害する。活性代謝物へのプロドラッグの代謝は速いが、バロキサビル酸の肝臓排出は長時間に及び(半減期:50～90時間)、単回経口投与が可能となる(Hayden & Shindo、2019)。本出願において、「バロキサビル」という用語は、CAS番号1985606-14-1のプロドラッグ、バロキサビルマルボキシルの代謝後に得られる、CAS番号1985605-59-1の活性型の「バロキサビル酸」を示す。
本出願において(とりわけ図中で)バロキサビルとも称するバロキサビルマルボキシル(S-033188)は、インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体のPAサブユニットのキャップ依存性エンドヌクレアーゼ活性を阻害する分子である。この分子は、生体への投与後に活性型「バロキサビル酸」に代謝されるプロドラッグであり、活性型「バロキサビル酸」は、ウイルスポリメラーゼ複合体のPAサブユニットの活性部位において2つのマンガンイオンと安定な結合を形成することによってウイルスmRNA合成の開始を阻害する。活性代謝物へのプロドラッグの代謝は速いが、バロキサビル酸の肝臓排出は長時間に及び(半減期:50～90時間)、単回経口投与が可能となる(Hayden & Shindo、2019)。本出願において、「バロキサビル」という用語は、CAS番号1985606-14-1のプロドラッグ、バロキサビルマルボキシルの代謝後に得られる、CAS番号1985605-59-1の活性型の「バロキサビル酸」を示す。
この活性型が、全てのin vitro実験に使用される。最初のin vitro研究は、インフルエンザA型ウイルス(平均EC50:1.4～3.1nM)及びインフルエンザB型ウイルス(平均EC50:4.5～8.9nM)を阻害する非常に良好な効力を示した。バロキサビルはまた、アダマンタン及びノイラミニダーゼ阻害薬(H274Y)に耐性を有するウイルスに対して、並びに鳥類の保有宿主に起因するインフルエンザA型ウイルスの異なる亜型に対して有効であることが判明している。バロキサビルとノイラミニダーゼ阻害薬(オセルタミビル)の組合せは、インフルエンザA型ウイルス(H1N1)による致死感染からのマウスの保護を可能にする相乗効果を示している。この組合せはまた、治療開始から24時間後に肺におけるウイルス力価の大幅な減少を可能にする(Fukaoら、2019)。
バロキサビルマルボキシルは、その長い半減期を所与としてインフルエンザ感染症の治療に革命を起こす可能性があり、単回投与(オセルタミビルの5日間の治療とは対照的に)からなる治療計画及びノイラミニダーゼ阻害薬と比較して増加した抗ウイルス活性が可能となる。
最近の第3相臨床研究においては、入院していないインフルエンザ感染成人のウイルス排出停止までの時間の中央値は、オセルタミビルで治療した群での72時間及びプラセボ群での96時間と比較して、バロキサビルマルボキシルで治療した群では48時間であったが、2種類の治療間で症状の持続期間に有意差はなかった(Haydenら、2018)。
バロキサビルマルボキシルは、この化合物が投与された患者の4～5%で、主に消化器の副作用(嘔気、下痢等)に関して忍容性が非常に良好である。
これに対して、この分子の主要な欠点の1つは、インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体のPAサブユニットの耐性変異の急速な出現である。最初のin vitro試験から、PAのアミノ酸138(I38T/M/又はフェニルアラニンF)に、主置換を有するウイルスバリアントが単離されており、これは、バロキサビルに対するウイルスの感受性を10～100倍低下させている(Noshiら、2018)。臨床的には、現在非常にまれであるが、これらの置換は抗ウイルス性治療薬の非存在下で認めることができる(Takashitaら、2019)。臨床試験中に、PAにおけるI38T/M置換は、バロキサビルマルボキシルで治療された患者の2～24%で認められた。更に、バロキサビルマルボキシルで治療され且つ変異ウイルスを有する患者においては、臨床徴候の持続期間はそれほど短縮されなかった。
最近、バロキサビルマルボキシルの抗ウイルス効果が、マイナス鎖セグメント化RNAゲノムを有する他の種類のウイルス、例えば、重症熱性血小板減少症候群ウイルス(SFTSV)及びハートランドウイルス(HRTV)、ダニ媒介性病原体で観察された。(Wangら、2020)
ピモジビル
ピモジビル(JNJ63623872若しくはJNJ-872又はVX-787)は、キャップ結合部位に結合することによりインフルエンザA型ウイルスポリメラーゼ複合体のPB2サブユニットを阻害し、天然リガンド7-メチルGTPの結合及びウイルスmRNA合成を妨げる複合体である(Clarkら、2014)。
ピモジビル(JNJ63623872若しくはJNJ-872又はVX-787)は、キャップ結合部位に結合することによりインフルエンザA型ウイルスポリメラーゼ複合体のPB2サブユニットを阻害し、天然リガンド7-メチルGTPの結合及びウイルスmRNA合成を妨げる複合体である(Clarkら、2014)。
ピモジビルは、用量に応じて、主に消化器の副作用(嘔気、下痢等)に関して忍容性が良好である。
2つの第3相臨床試験が、2017年～2018年のシーズンに行われた。
いずれの抗感染症治療薬に関しても、PB2の耐性変異が、in vitro及びin vivoで確認された。PB2のM431I置換はおそらく、約60倍の感受性の低下の原因であり、ピモジビルで単剤療法で治療された患者の10%で認められた(Trevejoら、2018)。
RO-7
RO-7は、インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体の酸性タンパク質PAのエンドヌクレアーゼ活性の阻害薬であり、2016年に発見された。この化合物は、ヒトで循環する又は鳥類の保有宿主に存在する、様々な種類のインフルエンザウイルスにおいて良好なin vitro活性(EC50:1.1～21.6nM)を有する。RO-7の使用は、インフルエンザウイルスによる致死感染からマウスを保護すると同時に、それらの肺におけるウイルス負荷を大幅に減少させた。RO-7はバロキサビルマルボキシルと構造的に非常に類似しているので、PAのアミノ酸I38置換はまた、この分子に対するインフルエンザウイルス感受性の低下をもたらす。
RO-7は、インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体の酸性タンパク質PAのエンドヌクレアーゼ活性の阻害薬であり、2016年に発見された。この化合物は、ヒトで循環する又は鳥類の保有宿主に存在する、様々な種類のインフルエンザウイルスにおいて良好なin vitro活性(EC50:1.1～21.6nM)を有する。RO-7の使用は、インフルエンザウイルスによる致死感染からマウスを保護すると同時に、それらの肺におけるウイルス負荷を大幅に減少させた。RO-7はバロキサビルマルボキシルと構造的に非常に類似しているので、PAのアミノ酸I38置換はまた、この分子に対するインフルエンザウイルス感受性の低下をもたらす。
CC-42344
CC-42344は、ごく最近確認された化合物の1つである。これは、インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体のPB2サブユニットの活性を阻害することによって作用する。前臨床データはまだ公表されていないが、この分子は良好な抗ウイルス活性を有し、経口的に、IVにより又は吸入により投与できる。
CC-42344は、ごく最近確認された化合物の1つである。これは、インフルエンザウイルスポリメラーゼ複合体のPB2サブユニットの活性を阻害することによって作用する。前臨床データはまだ公表されていないが、この分子は良好な抗ウイルス活性を有し、経口的に、IVにより又は吸入により投与できる。
リバビリン
リバビリン(Virazole)は、多くのDNA及びRNAウイルスに対して活性がある広域スペクトルの抗ウイルス分子である。これはグアノシン類似体であり、その一リン酸エステルの形態でイノシン5'-一リン酸脱水素酵素(IMPDH)を阻害して、利用可能なGTPレベルを低下させる。三リン酸エステルの形態では、リバビリンは、転写されるウイルスRNAに組み込まれ、したがって、RNA伸長を阻止し、変異原性作用を有する。したがって、リバビリンはウイルスゲノム複製阻害薬であると考えられる。
リバビリン(Virazole)は、多くのDNA及びRNAウイルスに対して活性がある広域スペクトルの抗ウイルス分子である。これはグアノシン類似体であり、その一リン酸エステルの形態でイノシン5'-一リン酸脱水素酵素(IMPDH)を阻害して、利用可能なGTPレベルを低下させる。三リン酸エステルの形態では、リバビリンは、転写されるウイルスRNAに組み込まれ、したがって、RNA伸長を阻止し、変異原性作用を有する。したがって、リバビリンはウイルスゲノム複製阻害薬であると考えられる。
in vitroの研究において、リバビリンはあらゆる型のインフルエンザウイルスに対して効果的であることが判明している。これに対して、臨床研究は、経口投与されるリバビリンはインフルエンザウイルスに対して有効ではないと結論付けた。更に、観察された多くの副作用がその使用を制限する。しかし、リバビリンと他の抗ウイルス化合物との組合せに基づくいくつかの臨床試験が、ヒトにおいて進行中である。
ファビピラビル
ファビピラビル又はT-705は、RNAウイルス、とりわけ、とりわけ種々のインフルエンザウイルスを含むオルソミクソウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、口蹄疫ウイルス、並びに他のフラビウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス及びアルファウイルスに対する抗ウイルス薬として使用される化合物である。
ファビピラビル又はT-705は、RNAウイルス、とりわけ、とりわけ種々のインフルエンザウイルスを含むオルソミクソウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、口蹄疫ウイルス、並びに他のフラビウイルス、アレナウイルス、ブニヤウイルス及びアルファウイルスに対する抗ウイルス薬として使用される化合物である。
この分子は、これらのウイルスのポリメラーゼの選択的阻害によって作用する(Yousukeら、2009)。
インフルエンザウイルスに対するその効果に関しては、ファビピラビルは、MDCK細胞培養において、ノイラミニダーゼ阻害薬に耐性を有するウイルスを含むインフルエンザA型、B型及びC型ウイルスに対して、並びにA/PutoRico/8/34株に感染したマウスモデルにおいて、効力を示している。ファビピラビルは、低い細胞傷害性を示し且つインフルエンザウイルスポリメラーゼを特異的に阻害することができるヌクレオシド類似体として作用する。
in vivoにおいて、ファビピラビルは、オセルタミビルに対して感受性又は耐性を有する高病原性のウイルスA/H5N1に感染したマウスを保護するのに有効であることが判明している。
オセルタミビルとファビピラビルの組合せは、A型インフルエンザウイルスに感染したマウスにおいてある特定の濃度で相乗的であることが判明した。
ファビピラビル耐性変異が、インフルエンザウイルスポリメラーゼにおいて確認されている(Goldhillら、2018)。
ヒトにおけるこの化合物の治療的使用は、2014年から日本で製造承認を得ている。
前記組合せの治療的使用。
本発明の態様の1つによれば、本発明は、医薬としての使用するための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せに関する。
本発明の態様の1つによれば、本発明は、医薬としての使用するための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せに関する。
本発明はとりわけ、ウイルス感染症、とりわけ、ヒト又は動物の生命体の呼吸器及び/又は腸管のウイルス感染症の予防及び/又は治療における治療的使用のための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せに関する。
「予防」という用語は、ヒト又は動物の身体におけるウイルス感染症の出現の可能性を予防する又は少なくとも低減する事実を意味する。
「治療」という用語は、ヒト又は動物の身体においてウイルス感染症に抗するという事実を意味する。これは、体内のウイルス負荷を減少させる目的で治療を施すことを意味する。「治療」という用語はまた、ウイルス感染症に付随する症状(熱、疲労)を減弱するという事実を意味する。
前記治療は、ヒト並びに動物、特に家畜、例えば、ブタ、ウマ及び家禽に等しく適用可能である。
本発明の第1の実施形態によれば、本発明は、ウイルス感染症の予防における治療的使用のための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せに関する。本発明の第2の実施形態によれば、本発明は、ウイルス感染症の治療における治療的使用のための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せに関する。
本発明の第3の実施形態によれば、本発明は、ウイルス感染症の予防及び治療における治療的使用のための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せに関する。
本発明の好ましい一実施形態によれば、前記組合せは、ジルチアゼム及びバロキサビルマルボキルを含む。
本発明はまた、ウイルス感染症、とりわけ呼吸器及び/又は腸管のウイルス感染症を有する患者を治療する方法であって、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せを前記患者に投与する工程を含む、方法に関する。
本発明はまた、ウイルス感染症、とりわけ、呼吸器及び/又は腸管のウイルス感染症の出現を、ウイルスに感染しやすい個体において予防する方法であって、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せを前記個体に投与する工程を含む、方法に関する。
本発明はまた、ウイルス感染症、とりわけ、呼吸器及び/又は腸管のウイルス感染症を、感染動物又は感染しやすい動物において予防及び/又は治療する方法であって、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せを前記動物に投与する工程を含む、方法に関する。
ウイルス感染症及び関連ウイルス
本発明の意味の範囲内において、「ウイルス感染症」とは、生物に侵入したウイルスによって、「標的細胞」又は「宿主細胞」と称される、前記生物のある特定の細胞に感染することによって誘発される疾患を意味する。ウイルス感染症は一般に、医療専門家によって、感染患者又は動物の症状を観察することに基づいて診断される。診断の確定には、追加の検査室試験(血液及び/又は痰及び/又は気管支肺胞洗浄液及び/又は腸管からの生体試料の試験)が必要な場合がある。
本発明の意味の範囲内において、「ウイルス感染症」とは、生物に侵入したウイルスによって、「標的細胞」又は「宿主細胞」と称される、前記生物のある特定の細胞に感染することによって誘発される疾患を意味する。ウイルス感染症は一般に、医療専門家によって、感染患者又は動物の症状を観察することに基づいて診断される。診断の確定には、追加の検査室試験(血液及び/又は痰及び/又は気管支肺胞洗浄液及び/又は腸管からの生体試料の試験)が必要な場合がある。
本発明による組合せは、ウイルス感染症、とりわけヒト又は動物の身体の呼吸器及び/又は腸管のウイルス感染症、すなわち、呼吸器表皮細胞を冒す感染症の予防及び/又は治療を意図するものである。
「呼吸器感染症」とは、肺及び気道、すなわち、呼吸するために空気が通過する通路を冒すウイルス感染症を意味する。これらはとりわけ、風邪、インフルエンザ及び細気管支炎を含む。
ウイルス性呼吸器感染症に関与するウイルスとしては、特に、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、インフルエンザウイルス(flu)、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス及びライノウイルスが挙げられる。
小児において、ウイルス性呼吸器感染症の主因は、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、エンテロウイルス、コロナウイルス及び一部のアデノウイルス株である。
本発明との関連では、これは、特に、急性呼吸器感染症(ARI)である。
「腸管感染症」とは、とりわけ上部消化管及び下部消化管を含む消化管:口、咽頭(消化管と気道が交差する部分の)、食道、胃及び腸を冒すウイルス感染症を意味する。
胃腸炎の最も一般的な原因は、ノロウイルス又はロタウイルスによるウイルス感染症と関連付けられる。
特定の一実施形態によれば、治療的組合せは、インフルエンザウイルスによる感染症の治療及び/又は予防を対象とするものである。
インフルエンザの原因となるインフルエンザウイルスは、:A型、B型、C型及びD型の4つの型に分類される。ウイルスの表面には、感染生物の細胞の感染において重要は役割を果たす2種の糖タンパク質:血球凝集素HA及びノイラミニダー(NA)が認められる。それらの表面のHA及びNA糖タンパク質の性質に応じて、インフルエンザA型ウイルスの異なる亜型が存在し、16つの型のHA及び9つの型のNAが、動物界で、とりわけ移動性の海鳥の間で循環しているウイルスにおいて確認されている。したがって、インフルエンザウイルスは、それらがその表面に有する糖タンパク質の型に応じて定義できる。
ヒトにおいては、数十年にわたって循環している亜型Aのウイルスは亜型H1N1、H2N2及びH3N2であり、トリウイルスH5N1、H7N7、H7N9、H5N2及びH9N2の種間感染、とりわけ動物からヒトの種間感染が時折ある。ブタ、トリ及びヒト由来の新しいパンデミックインフルエンザウイルスH1N1(ブタ、トリ及びヒトの再集合を伴うウイルス)の最近の出現によって強調されるように、A型インフルエンザウイルスは深刻な公衆衛生上の脅威を示す。インフルエンザのパンデミックはとりわけ、ヒト集団における、新しい表面糖タンパク質(HA及びNA)が与えられたウイルスの出現に対応する抗原シフトの結果である。これらのシフトは、動物のウイルス、とりわけ、トリウイルスのヒトへの直接伝播を可能にする:アジアにおける2003年以降の病原性の高いトリH5N1の場合又は2003年のオランダにおけるH7N7インフルエンザ及び2013年の東南アジアにおけるH7N9の流行の場合が、これである。更に、とりわけ遺伝的浮動(表面糖タンパク質に変異が出現すること)の結果である季節性インフルエンザの流行は、ヒト集団、とりわけ、非常に低年齢の個体、高齢で免疫不全の個体及び心肺疾患を有する個体における罹患率及び死亡率の増加の主要な原因である。
本発明の意味の範囲内において、「インフルエンザウイルス」とは、A型、B型、C型又はD型インフルエンザ病原体、とりわけヒト又は動物を宿主とするA型及びB型インフルエンザを意味する。「fluウイルス」と「インフルエンザウイルス」は、本出願において互換的に使用し、同じウイルスを示す。
本発明はとりわけ、インフルインザウイルス感染症の予防及び/又は治療におけるその治療的使用のための、ジルチアゼムとバロキサビルマルボキシルの組合せに関する。本発明の一変形形態において、本発明はとりわけ、インフルインザウイルス感染症の予防及び/又は治療におけるその治療的使用のための、ジルチアゼムとバロキサビル酸の組合せに関する。
本発明の第1の態様によれば、本発明の組合せは、少なくとも1種のA型インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療に使用される。有利には、本発明の組合せは、A型インフルエンザウイルスの種々の亜型に対する広域スペクトルの作用を有する。
特定の一態様によれば、インフルエンザウイルスは、亜型H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H7N9、H5N2及びH9N2から選択されるA型ウイルスである。
本発明の別の態様によれば、本発明の組合せは、少なくとも1種のB型インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療のために使用される。
ウイルス耐性
本発明はとりわけ、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における治療的使用のための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬との組合せであって、前記インフルエンザウイルスが少なくとも1種の抗ウイルス化合物、とりわけ抗インフルエンザ化合物、特にウイルスポリメラーゼ阻害薬の阻害作用に対して耐性を有する、組合せに関する。
本発明はとりわけ、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における治療的使用のための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬との組合せであって、前記インフルエンザウイルスが少なくとも1種の抗ウイルス化合物、とりわけ抗インフルエンザ化合物、特にウイルスポリメラーゼ阻害薬の阻害作用に対して耐性を有する、組合せに関する。
実際、本発明による組合せは特に、ウイルス感染症を引き起こすウイルスが、従来使用されているウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物、特にジルチアゼム並びにバロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択されるウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物の作用に対して感受性がない又は感受性がわずかしかない場合に特に興味深い。
上に示したように、ウイルスポリメラーゼをターゲットとするこのファミリーの化合物の治療的使用の主要な欠点は、それらの作用に対して耐性を有して、これらの化合物の阻害作用に対して非感受性になるウイルス株の発生である。
ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との併用の利点は以下の通りである:
1)少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物に対して耐性を有するウイルス株の出現が明らかに制限される、又はジルチアゼムとの併用投与中には完全に阻害されることさえある(実施例6を参照のこと);
2)ジルチアゼム単独でも、ウイルスポリメラーゼ阻害薬に対して耐性を有するウイルス株に対する有効な抗ウイルス活性を有する(バロキサビル耐性ウイルス株に基づく、実施例4を参照のこと);
3)ジルチアゼム+バロキサビルマルボキシルの組合せが、ジルチアゼムと高濃度のバロキサビルの存在によって、バロキサビル耐性ウイルス株に対して有効な抗ウイルス活性を有する(実施例5を参照のこと)。
1)少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物に対して耐性を有するウイルス株の出現が明らかに制限される、又はジルチアゼムとの併用投与中には完全に阻害されることさえある(実施例6を参照のこと);
2)ジルチアゼム単独でも、ウイルスポリメラーゼ阻害薬に対して耐性を有するウイルス株に対する有効な抗ウイルス活性を有する(バロキサビル耐性ウイルス株に基づく、実施例4を参照のこと);
3)ジルチアゼム+バロキサビルマルボキシルの組合せが、ジルチアゼムと高濃度のバロキサビルの存在によって、バロキサビル耐性ウイルス株に対して有効な抗ウイルス活性を有する(実施例5を参照のこと)。
特に、本発明による組合せは、ジルチアゼム及びバロキサビルマルボキシルを含み、ウイルスポリメラーゼ阻害薬の阻害作用に対して耐性を有するインフルエンザウイルス、例えば、ポリメラーゼPB2サブユニットに耐性変異を示すウイルスによる感染症の治療及び/又は予防に使用される。
本発明の別の実施形態によれば、この組合せは、ジルチアゼム及びバロキサビルマルボキシルを含み、バロキサビルマルボキシルの阻害作用に対して耐性を有するインフルエンザウイルスによる感染症の治療及び/又は予防に使用されるものである。特に、これは、ポリメラーゼPAサブユニットに変異を有するインフルエンザA/H1N1ウイルス株である。より正確には、これは、ポリメラーゼPAサブユニットにI38T点変異を有するインフルエンザA/H1N1ウイルス株である。
本発明の別の実施形態によれば、インフルエンザウイルスは、少なくとも1種の抗インフルエンザ化合物、特にノイラミニダーゼ阻害薬、例えば、オセルタミビル(Tamiflu(登録商標))の阻害作用に対して耐性を有する。
本発明の一変形形態は、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における治療的使用のためのジルチアゼムであって、前記インフルエンザウイルスが少なくとも1種の抗ウイルス化合物、特に抗インフルエンザ化合物、特にウイルスポリメラーゼ阻害薬の阻害作用に耐性を有する、ジルチアゼムに関する。特に、このインフルエンザウイルスは、以下の化合物の1つ:バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7、CC-42344及びノイラミニダーゼ阻害薬、特にオセルタミビルに対して耐性を有する。
組合せ中に存在する他の活性薬
本発明はまた、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せであって、別の活性薬、特に抗ウイルス薬及び/又は抗生物質薬を更に含む、組合せに関する。
本発明はまた、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せであって、別の活性薬、特に抗ウイルス薬及び/又は抗生物質薬を更に含む、組合せに関する。
好ましい一態様によれば、抗ウイルス薬は、当業者に周知であり、インフルエンザの予防又は治療に従来使用されている抗ウイルス薬の中から選択される。少なくとも1種のインフルエンザウイルスに対して活性がある抗ウイルス薬は市販されており、参考文献、例えば、Le Dictionnaire Vidalに記載されている。オセルタミビルを特に挙げることができる。したがって、本発明はまた、ジルチアゼム、バロキサビルマルボキシル及びオセルタミビルの組合せに関する。
抗生物質は、当業者に周知の抗生物質、とりわけ、二次細菌感染症を予防するためにウイルス感染症に使用される抗生物質、とりわけ、マクロライドファミリーの抗生物質から選択され、特にロキシスロマイシンである。
本発明はまた、治療的使用のための、とりわけウイルス感染症の予防及び/又は治療における治療的使用のための、特に、インフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療のための、上に名前を挙げた組合せの1つに関する。
医薬組成物又は獣医学的組成物
本発明はまた、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せを適当な医薬ビヒクル中に含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せを適当な医薬ビヒクル中に含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せを適当な医薬ビヒクル中に含む獣医学的組成物に関する。
本発明の好ましい一態様によれば、この医薬組成物又は獣医学的組成物中に存在するウイルスポリメラーゼ阻害薬は、バロキサビルマルボキシルである。
この医薬組成物又は獣医学的組成物は、効果的な量のジルチアゼム及び効果的な量のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物、特にバロキサビルマルボキシルを含む。
本発明の意味の範囲内において、「効果的な量」とは、ウイルスの増殖及び/若しくは複製並びに/又は生物内におけるウイルス感染症の発生を阻害するのに十分な抗ウイルス化合物の量を意味する。この阻害は、例えば、本出願の実施例中に示されるようにウイルス産生を測定することによって定量化できる。
例えば、in vitroの、いわゆる「効果的な」量は以下の通りである:
- ジルチアゼムについては、5～200μMの濃度が好ましく、
- ウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物、とりわけバロキサビル(活性型)については、5～200nMの濃度が好ましい。
- ジルチアゼムについては、5～200μMの濃度が好ましく、
- ウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物、とりわけバロキサビル(活性型)については、5～200nMの濃度が好ましい。
本発明によれば、「医薬ビヒクル」という用語は、本発明による1種又は複数の許容される医薬ビヒクル又は賦形剤、すなわち、個体又は動物への投与に重大な有害作用を伴わない、当業者に周知のビヒクル又は賦形剤を示す。
本発明による医薬組成物又は獣医学的組成物は、経口、舌下、吸入、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、眼内又は直腸投与に好適である。
本発明の好ましい一態様によれば、医薬組成物は、吸入による投与に適当な剤形であることを特徴とする。
吸入とは、呼吸器による吸収を意味する。これは特に、治療目的の化合物、気体、微小液滴又は懸濁している粉末剤の形態のある特定の物質のための吸収方法である。
吸入による、すなわち、経鼻及び/又は経口経路による医薬組成物又は獣医学的組成物の投与は、当業者に周知である。
吸入による投与は2種類に分類される:
- 組成物が粉末剤の形態である場合の、ガス注入による投与、並びに
- 組成物がエアロゾル剤(懸濁剤)の形態又は圧力下に置かれた、溶液剤、例えば、水溶液剤の形態である場合の、噴霧による投与。その場合、医薬組成物又は獣医学的組成物の投与には、ネブライザー又はスプレーヤーの使用が推奨される。
- 組成物が粉末剤の形態である場合の、ガス注入による投与、並びに
- 組成物がエアロゾル剤(懸濁剤)の形態又は圧力下に置かれた、溶液剤、例えば、水溶液剤の形態である場合の、噴霧による投与。その場合、医薬組成物又は獣医学的組成物の投与には、ネブライザー又はスプレーヤーの使用が推奨される。
したがって、ここで考えられる剤形は、粉末剤、液滴の水性懸濁剤又は加圧溶液剤の中から選択される。
本発明はまた、医薬として使用するための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せを適当な医薬ビヒクル中に含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、ウイルス感染症、とりわけ、ヒト又は動物の身体の呼吸器及び/又は腸管のウイルス感染症、特にインフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における治療的使用のための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せを薬学的に適当なビヒクル中に含む、医薬組成物に関する。
組合せ製品
本発明はまた、ウイルス感染症、とりわけ、ヒト又は動物の呼吸器及び/又は腸管のウイルス感染症、特にインフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における治療的使用のための同時の、別々の又は逐次的な使用のための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物とを含む組合せ製品に関する。
本発明はまた、ウイルス感染症、とりわけ、ヒト又は動物の呼吸器及び/又は腸管のウイルス感染症、特にインフルエンザウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における治療的使用のための同時の、別々の又は逐次的な使用のための、ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物とを含む組合せ製品に関する。
この組合せ製品は、ヒト又は動物に使用できる。
これは特に、ジルチアゼム及びバロキサビルマルボキから構成される。
これは、他の活性化合物、特にオセルタミビルを含み得る。
以下の実施例において、バロキサビルという用語は、バロキサビル酸、すなわち、この化合物の活性化された形態を示すために使用するものであって、プロドラッグである患者に投与される形態を示すために使用するものではない。
(実施例1)
ジルチアゼム+バロキサビルの組合せは、細胞系における組換えH1N1nLucウイルスに対して相乗的な抗ウイルス効果を有する。
A/H1N1nLucを感染させたA549細胞(感染多重度(MOI)0.01)を、感染後1時間に漸増濃度のジルチアゼム(6nM～100μM)及びバロキサビル酸(0.0625nM～1nM)(Med Chem Tronicaによって販売されている、ref.HY-109025A)単独で、及びそれらの組合せで処理した。
ジルチアゼム+バロキサビルの組合せは、細胞系における組換えH1N1nLucウイルスに対して相乗的な抗ウイルス効果を有する。
A/H1N1nLucを感染させたA549細胞(感染多重度(MOI)0.01)を、感染後1時間に漸増濃度のジルチアゼム(6nM～100μM)及びバロキサビル酸(0.0625nM～1nM)(Med Chem Tronicaによって販売されている、ref.HY-109025A)単独で、及びそれらの組合せで処理した。
感染細胞上清(感染後48時間にサンプリング)で測定した発光は、ウイルス複製のレベルを反映している(実験クロノグラムを図1aに示す)。これら2種の分子のそれぞれのEC50を決定した(ジルチアゼムのEC50=50102nM;バロキサビルのEC50=0.144nM、図1bを参照のこと)。
分子の組合せの効果を、測定した発光データからCombenefitソフトウェアを用いた分析によって特徴付けた(クロマチックスケールを用いて表の形態で示す、図1cを参照のこと)。
組合せの相乗効果又は拮抗効果を、結果の理解を容易にするためにクロマチックスケールを用いて相乗作用スコアによって示す(Loeweモデルに従って分析)。5以上の係数(灰色～濃い灰色)は、分子の組合せの相乗効果を示し、一方、-5以下の係数(白色)は、分子の組合せの拮抗効果を示す。-5～5の係数は、組合せにおける分子の非干渉、又は更には、異なる処理間の相加効果を示す。実験数=3。
図1cに示されるように、ジルチアゼムとバロキサビル酸の組合せは相乗効果を示す。
2つの特定の条件が、特に相乗的である:
(i)高濃度のジルチアゼム(1562nm)をIC50(0.1nM)に近いバロキサビル酸濃度と結び付ける条件、
ii)より低濃度のジルチアゼム(25nM未満)を非常に小用量のバロキサビル(0.1nM未満)と結び付ける条件。
(i)高濃度のジルチアゼム(1562nm)をIC50(0.1nM)に近いバロキサビル酸濃度と結び付ける条件、
ii)より低濃度のジルチアゼム(25nM未満)を非常に小用量のバロキサビル(0.1nM未満)と結び付ける条件。
組み合わせた濃度の、試験した全ての条件下で、拮抗効果は観察されなかった。
結果は、ジルチアゼムと活性型のバロキサビルの組合せが、同じ濃度でこれら2種の分子のそれぞれ単独での単剤療法処理と比較して、A549細胞におけるウイルス複製の非常に大幅な、相乗的な減少を可能にする(とりわけ、バロキサビル耐性変異の出現のリスクを低下させる点で有利である低用量のバロキサビルを使用する条件下で)ことを示している。
(実施例2)
ジルチアゼム+ファビピラビルの組合せは、細胞系における組換えH1N1nLucウイルスにおいて、これら2種の分子のそれぞれの濃度に応じて、相乗的又は拮抗的である。
A/H1N1nLucを感染させたA549細胞(MOI 0.01)を、感染後1時間に漸増濃度のジルチアゼム(6nM～100μM)及びファビピラビル(6nM～100μM)単独で、及びそれらの組合せで処理した。
ジルチアゼム+ファビピラビルの組合せは、細胞系における組換えH1N1nLucウイルスにおいて、これら2種の分子のそれぞれの濃度に応じて、相乗的又は拮抗的である。
A/H1N1nLucを感染させたA549細胞(MOI 0.01)を、感染後1時間に漸増濃度のジルチアゼム(6nM～100μM)及びファビピラビル(6nM～100μM)単独で、及びそれらの組合せで処理した。
感染細胞上清(感染後48時間にサンプリング)で測定した発光は、ウイルス複製のレベルを反映している(実験クロノグラムを図2aに示す)。
これらの分子のそれぞれのEC50を決定した(ジルチアゼムのEC50=53791nM;ファビピラビルのEC50=2494nM、図2bを参照のこと)。
分子の組合せの効果を、測定した発光データからCombenefitソフトウェアを用いた分析によって特徴付けた(クロマチックスケールを用いて表の形態で示す、図2cを参照のこと)。
組合せの相乗効果又は拮抗効果を、結果の理解を容易にするためにクロマチックスケールを用いて相乗作用スコアによって示す。5以上の係数(灰色～濃い灰色)は、分子の組合せの相乗効果を示し、一方、-5以下の係数(白色)は、分子の組合せの拮抗効果を示す。-5～5の係数は、組合せにおける分子の非干渉、又は更には、異なる処理間の相加効果を示す。実験数=3。
得られた結果は、これら2種の分子の組合せ(ジルチアゼム+ファビピラビル)は抗ウイルス効果を改善できるが、一般に、処理用量を大幅には低減できないことを示している。
異なるジルチアゼム及びファビピラビル分子の濃度によっては、これらの組合せは非常に不均一な効果と関連している。相乗効果を得るためには、大用量のファビピラビル(1580nM超、これは、ファビピラビル耐性の発現リスクの増加に有利に働くので不利である)を種々の用量のジルチアゼム(6nm～100μM)と併用することが必要である。
更に、ある特定の条件下では、これら2種の分子の組合せの効果は拮抗的な場合がある。これらの拮抗効果は、使用するジルチアゼムの用量が高い(6250nM)場合に観察される
ジルチアゼム+バロキサビルの組合せでは、使用する濃度を変化させた場合でも均一な結果を得ることができ、したがって、好ましくないジルチアゼム+ファビピラビルの組合せとは異なる。
(実施例3)
ヒト呼吸器上皮モデルにおけるジルチアゼム+バロキサビルの組合せの相乗効果
A/H1N1ウイルス及びA/H3N2ウイルスの複製の低下は、ジルチアゼム+バロキサビル(活性型)の組合せによる処理では、ジルチアゼム又はバロキサビル単独による単剤療法処理と比較して著しく大きい。
ヒト呼吸器上皮モデルにおけるジルチアゼム+バロキサビルの組合せの相乗効果
A/H1N1ウイルス及びA/H3N2ウイルスの複製の低下は、ジルチアゼム+バロキサビル(活性型)の組合せによる処理では、ジルチアゼム又はバロキサビル単独による単剤療法処理と比較して著しく大きい。
気液界面で培養された(供給業者の取扱説明書に従って)再構成されたヒト呼吸器上皮(鼻由来)(MucilAir(登録商標)HAE、Epithelix社)に、A/H1N1 pdm09(A/Lyon/969/2009 H1N1)型(MOI 0.1)又はA/H3N2(A/Texas/50/2012 H3N2)型(MOI 0.01)の原型(非組換え)インフルエンザウイルスを感染させ、次いで、感染後5、24及び48時間(hpi)にそれぞれ送達される、ジルチアゼム(90μM)、バロキサビル(10nM)又はジルチアゼム(90μM)とバロキサビル(10nM)の組合せで処理した又は処理しなかった(未処理)(実験クロノグラムを図3aに示す)。
処理した又は処理しなかった感染上皮の頂極からの試料を、24、48及び72hpiに採取して、MDCK細胞において感染滴定によってTCID50/mLでウイルス複製を測定した。
頂極における各サンプリングの前に、EVOM2デバイス及びSTX2プローブ(World Precision Instruments社)を使用して、経上皮抵抗(上皮完全性の生理学的マーカー)も測定した(図3c及び3e)。
図3bに示されるように、処理しない(未処理)場合には、ウイルス感染により、感染後48時間から108 TCID50/mL超の力価を有するA/H1N1感染粒子の産生が誘発される。
ジルチアゼム処理(90μM)では、A/H1N1感染粒子の産生を、感染後48時間で2log10まで及び感染後72時間で少なくとも1log10まで減少させることができる。
バロキサビル処理は、かなりのin vitro抗ウイルス活性を有し、感染後48時間においてA/H1N1感染粒子の産生を4log10まで減少させるが、その溶媒単独(DMSO)では感染に影響を及ぼさない。
ジルチアゼム分子とバロキサビル分子の組合せは、単剤療法処理と比較して抗ウイルス効果を大幅に改善し、感染後48時間及び72時間におけるA/H1N1ウイルス産生の減少は6log10に近い。
図3cは、図3aに記載したA/H1N1による上皮の感染中における経上皮抵抗(TEER)測定のトラッキングを示す。これは、感染後48時間及び72時間において、未処理の上皮又は対照溶媒DMSOによって処理された上皮の完全性のかなりの低下を示しており、これは、図3bに示したような非常に効率的な感染と相関している。
これに対して、ジルチアゼムによる処理では、TEER値が依然として安定しており、感染上皮の完全性を維持することができ、これは、感染滴定によって実証される抗ウイルス効果と相関している(図3b)。
バロキサビルによる処理もまた、TEER値の測定値がジルチアゼム処理によって得られたものと類似しており、感染上皮の完全性の維持を可能にする。
同様に、感染上皮の完全性は、両分子の組合せによる処理によっても維持され、これはその抗ウイルス効力と相関している(図3b)。
これらのTEER測定値はまた、ジルチアゼム及びバロキサビルを組み合わせて処理しても細胞毒性効果がないことを裏付けている。
図3dに示されるように、処理しない(未処理)場合には、上皮のA/H3N2ウイルス感染は、感染後48時間から力価が109 TCID50/mL超の力価を有する感染粒子の産生を誘発する。
ジルチアゼム処理(90μM)は、A/H3N2感染粒子の産生を感染後48時間で2log10まで及び感染後72時間で少なくとも1log10まで減少させる。
バロキサビル処理は、かなりのin vitro抗ウイルス活性を有し、感染後48時間においてA/H3N2感染粒子の産生を3log10まで減少させるが、その溶媒単独(DMSO)では感染に影響を及ぼさない。
ジルチアゼム分子とバロキサビル分子の組合せは、単剤療法処理と比較して抗ウイルス効果を大幅に改善し、感染後48時間及び72時間におけるA/H3N2ウイルス産生の減少は5log10に近い。
図3eに示される、図3aに記載したA/H3N2による上皮の感染中における経上皮抵抗(TEER)測定のトラッキングは、感染後48時間及び72時間において未処理の上皮又は対照溶媒DMSOで処理した上皮の完全性の大幅な低下を示しており、これは、測定して図3dに示した非常に効率的な感染と相関している。
これに対して、ジルチアゼムでの処理では、感染後48時間までTEER値が依然として安定しており、A/H3N2に感染した上皮の完全性を維持することができ、これは、感染滴定によって実証される抗ウイルス効果と相関している(図3d)。
バロキサビルでの処理もまた、TEER値の測定値が感染後48時間においてジルチアゼム処理によって得られたものと類似しており、感染上皮の完全性の維持を可能にする。
同様に、感染上皮の完全性は、両分子の組合せによる処理によっても維持され、これはその抗ウイルス効力と相関している(図3d)。
これらのTEER測定値はまた、ジルチアゼム及びバロキサビルを組み合わせて処理しても、上皮に対する細胞毒性効果がないことを裏付けている。
結論として、図3b及び3dは、処理しなかった場合の感染の状態と比較して、ジルチアゼム又はバロキサビルによる処理の著しい抗ウイルス効果を実証している。これらの結果はまた、ジルチアゼム+バロキサビル処理の有益な効果/相乗的な効果を、これら2種の分子のそれぞれを同じ濃度で単独で用いた単剤療法処理と比較して示している:この組合せは実際に、ヒト呼吸器上皮モデルにおける単剤療法処理と比較して、ウイルス複製の著しく大きい減少を可能にする。
(実施例4)
ジルチアゼムは、再構成されたヒト呼吸器上皮モデルにおいて、同じ上皮モデルにおける野生型(WT)組換えA/H1N1ウイルスに対するその抗ウイルス活性に匹敵する、バロキサビルに対して耐性を有するI38T組換えA/H1N1ウイルスに対する効果的な抗ウイルス活性を有する。
耐性A/H1N1ウイルスは、リバースジェネティクスによって作製した。これは、そのポリメラーゼのPAサブユニットにI38T耐性変異を有する。
ジルチアゼムは、再構成されたヒト呼吸器上皮モデルにおいて、同じ上皮モデルにおける野生型(WT)組換えA/H1N1ウイルスに対するその抗ウイルス活性に匹敵する、バロキサビルに対して耐性を有するI38T組換えA/H1N1ウイルスに対する効果的な抗ウイルス活性を有する。
耐性A/H1N1ウイルスは、リバースジェネティクスによって作製した。これは、そのポリメラーゼのPAサブユニットにI38T耐性変異を有する。
供給業者、Epithelix社の取扱説明書に従って気液界面において培養を維持された、再構成された鼻由来のヒト呼吸器上皮(MucilAir(登録商標)HAE、Epithelix社)に、野生型のA/H1N1 pdm09型の組換えインフルエンザウイルス(WT、MOI 0.1)、又はバロキサビルに耐性を有するA/H1N1 pdm09型の組換えインフルエンザウイルス(ウイルスポリメラーゼのPAサブユニットにI38T変異)(I38T、MOI 0.1)を感染させた。
次に、感染後5、24及び48時間(hpi)にそれぞれ送達される、ジルチアゼム(90μM)単独、10nM若しくは100nMの濃度のバロキサビル単独、又は両分子の組合せ(ジルチアゼム90μM及びバロキサビル10nM又は100nM)の3回の連続投薬により、これらの上皮を処理し、又は処理しなかった(未処理)(実験クロモグラムを図4aに示す)。
処理した又は処理しなかった感染上皮の頂極からの試料を、24、48及び72hpiに採取して、MDCK細胞において感染滴定によってTCID50/mLでウイルス複製を測定した。
頂極における各サンプリングの前に、EVOM2デバイス及びSTX2プローブ(World Precision Instruments社)を使用して、経上皮抵抗(上皮完全性の生理学的マーカー)も測定した。
各実験条件を、二重反復で行った(n=2)。グラフは、GraphPadソフトウェアによって生成された平均値及び標準偏差値を示している。
図4bは、処理しない(未処理)場合には、ウイルス感染により、感染後48時間から力価が108 TCID50/mL超のA/H1N1 WT感染粒子の産生が誘発されるという事実を示している。
ジルチアゼム処理(90μM)では、A/H1N1感染粒子の産生を、感染後48時間で2log10まで及び感染後72時間で0.5log10まで減少させることができる。
バロキサビル処理は、かなりのin vitro抗ウイルス活性を有し、感染後48時間においてA/H1N1感染粒子の産生を3log10まで減少させるが、その溶媒単独(DMSO)では感染に影響を及ぼさない。
図4cに示される、感染中における経上皮抵抗(TEER)測定のトラッキングは、感染後48時間及び72時間において未処理の上皮又は対照溶媒DMSOで処理した上皮の完全性の大幅な低下を示しており、これは、図4bに示した非常に効率的な感染と相関している。
これに対して、ジルチアゼムによる処理では、感染後48時間までTEER値が依然として安定しており、A/H1N1に感染した上皮の完全性を維持することができ、これは、感染滴定によって実証される抗ウイルス効果と相関している(図4b)。
バロキサビルによる処理もまた、感染後48時間及び42時間においてTEER値の測定値が安定しており、A/H1N1に感染した上皮の完全性の維持を可能にする。
図4dは、処理しない(未処理)場合には、バロキサビル耐性A/H1N1 I38Tウイルスによる上皮感染により、感染後48時間で108 TCID50/mLに近い力価を有する感染粒子の産生が誘発されるという事実を示している(図4d参照)。
10nMのバロキサビルによる処理には、感染上皮モデルにおけるこの耐性A/H1N1 I38Tウイルスに対して抗ウイルス効果がない。依然として制限されている抗ウイルス活性を、しかし、この耐性A/H1N1 I38Tウイルスに対して得るためには、バロキサビルでの処理用量を大幅に増加させる(100nM)必要がある(感染粒子の産生が感染後48時間で1log10減少及び感染後72時間で1.5log10減少)。
これに対して、ジルチアゼム(90μM)単独での処理により、A/H1N1 I38T感染粒子の産生は、感染後48時間で約2log10まで及び感染後72時間で約2log10まで、大幅に減少させることができる。
図4eに示される、A/H1N1 I38Tによる感染中における経上皮抵抗(TEER)測定のトラッキングは、感染後48時間及び72時間において未処理の上皮の完全性の大幅な低下を示しており、これは、図4dに示した非常に効率的な感染と相関している。
これに対して、ジルチアゼムによる処理では、感染後48時間及び72時間においてTEER値が依然として安定しており、A/H1N1 I38Tウイルスに感染した上皮の完全性を維持することができ、これは、感染滴定によって実証される抗ウイルス効果と相関している(図4d)。
これに対して、10nMのバロキサビルによる処理では、感染後48時間及び72時間においてA/H1N1 I38Tに感染した上皮の完全性を維持できず、これは、(図4d)に報告した抗ウイルス活性の欠如と一致している。感染後48時間及び72時間におけるTEERの安定した値の測定値によって報告されるように、耐性A/H1N1 I38Tウイルスに対する著しい抗ウイルス活性が図4dにおいて報告されている、高用量のバロキサビル(100nM)での処理のみが、上皮の完全性を維持できる。
(実施例5)
ジルチアゼム+バロキサビルの組合せは、バロキサビルを高用量で使用する場合のみ、単剤療法処理と比較して著しく大きい、バロキサビル耐性A/H1N1 I38Tウイルス複製の減少を誘発する。
供給業者、Epithelix社の取扱説明書に従って気液界面において培養を維持された、再構成された鼻由来のヒト呼吸器上皮(MucilAir(登録商標)HAE、Epithelix社)に、バロキサビルに耐性を有するA H1N1 pdm09型の組換えインフルエンザウイルス(ウイルスポリメラーゼのPAサブユニットにI38T変異)(I38T、MOI 0.1)を感染させた。
ジルチアゼム+バロキサビルの組合せは、バロキサビルを高用量で使用する場合のみ、単剤療法処理と比較して著しく大きい、バロキサビル耐性A/H1N1 I38Tウイルス複製の減少を誘発する。
供給業者、Epithelix社の取扱説明書に従って気液界面において培養を維持された、再構成された鼻由来のヒト呼吸器上皮(MucilAir(登録商標)HAE、Epithelix社)に、バロキサビルに耐性を有するA H1N1 pdm09型の組換えインフルエンザウイルス(ウイルスポリメラーゼのPAサブユニットにI38T変異)(I38T、MOI 0.1)を感染させた。
次に、感染後5、24及び48時間(hpi)にそれぞれ送達される、ジルチアゼム(90μM)単独、10nM若しくは100nMの濃度のバロキサビル単独、又は両分子の組合せ(ジルチアゼム90μM及びバロキサビル10nM又は100nM)の3回の連続投薬により、これらの上皮を処理し、又は処理しなかった(未処理)(実験クロモグラムを図5aに示す)。
処理した又は処理しなかった感染上皮の頂極からの試料を、24、48及び72hpiに採取して、MDCK細胞において感染滴定によってTCID50/mLでウイルス複製を測定した。
頂極における各サンプリングの前に、EVOM2デバイス及びSTX2プローブ(World Precision Instruments社)を使用して、経上皮抵抗(上皮完全性の生理学的マーカー)も測定した。
図5bは、処理しない(未処理)場合には、バロキサビル耐性A/H1N1 I38Tウイルスによる上皮の感染により、感染後72時間で108 TCID50/mLに近い力価を有する感染粒子の産生が誘発されるという事実を示している。ジルチアゼム処理(90μM)では、A/H1N1 I38T感染粒子の産生を、感染後48時間で2log10まで及び感染後72時間で少なくとも2log10まで減少させることができる。
これに対して、バロキサビル処理(10nM)は、感染に影響を及ぼさないその溶媒単独(DMSO)と同様に有効でない。
これら2種の分子、ジルチアゼム及びバロキサビルの組合せでは、それらの各濃度でA/H1N1 I38T 感染粒子の産生を減少させることが可能であるが、感染後48時間及び72時間においてジルチアゼム単独による処理と比較して、付加的な又は相乗的な効果がない。
この結果は、A/H1N1 WTウイルス(バロキサビルに対して耐性を有しない、図3bを参照のこと)について得られた結果とは異なる。A/H1N1 WTウイルスに対しては、同じ濃度のこれら2種の分子、ジルチアゼム及びバロキサビルの組合せは、とりわけ感染後48時間及び72時間に約6log10のウイルス産生の減少を誘発することによって、単剤療法処理と比較して相乗的な抗ウイルス効果を有する。
図5cに示される、感染中における経上皮抵抗(TEER)測定のトラッキングは、感染後48時間及び72時間において未処理の上皮又は対照溶媒DMSOで処理した上皮の完全性の大幅な低下を示しており、これは、図5bに示した非常に効率的な感染と相関している。
これに対して、ジルチアゼムによる処理では、感染後48時間及び72時間においてTEER値が依然として安定しており、A/H1N1 I38Tに感染した上皮の完全性を維持でき、これは、感染滴定によって実証される抗ウイルス効果と相関している(図5b)。
バロキサビル(10nM)による処理では、A/H1N1 I38Tに感染した上皮の完全性を維持できず、これは、(図5b)に報告されるその抗ウイルス効力がないことと一致している。
また、その著しい抗ウイルス効力と一致して、ジルチアゼム+バロキサビルの組合せは、感染後48時間及び72時間における安定なTEER測定値と関連している。
図5dは、処理しない(未処理)場合には、バロキサビル耐性A/H1N1 I38Tウイルスによる上皮感染により、感染後48時間で108 TCID50/mLに近い力価を有する感染粒子の産生が誘発されるという事実を示している。
ジルチアゼム処理(90μM)では、A/H1N1 I38T感染粒子の産生を、感染後48時間で2log10 を超えて減少させることができる。
高濃度(100nM)で使用すると、バロキサビルの処理は、A/H1N1 I38T感染粒子の産生を、感染後48時間に約1log10減少させたが、10nMの濃度での処理は、耐性ウイルスI38Tに対して効果がなかった(図5bを参照のこと)。
同じ濃度でのこれら2種の分子、ジルチアゼム及びバロキサビルの組合せは、単剤療法処理と比較して、感染後48時間、とりわけ72時間におけるA/H1N1 I38T感染粒子の産生を更に減少させる(A/H1N1 I38T感染粒子を最大3log10減少させる)。したがって、ヒト呼吸器上皮モデルにおいて、耐性A/H1N1 I38Tウイルスに対するジルチアゼムをバロキサビル(高濃度=100nM)と組み合わせたときの得は、顕著である。
この組合せは、バロキサビル用量を大幅に増加させる必要があるバロキサビル耐性ウイルス株に対して特に適切である。
図5eに示される、感染中における経上皮抵抗(TEER)測定のトラッキングは、感染後48時間及び72時間において未処理の上皮の完全性の大幅な低下を示しており、これは、図5dに示した非常に効率的な感染と相関している。
これに対して、ジルチアゼム又は高用量(100nM)のバロキサビルによる処理では、感染後48時間及び72時間においてTEER値が依然として安定であり、A/H1N1 I38Tに感染した上皮の完全性を維持でき、これは、感染滴定によって実証される抗ウイルス効果と相関している(図5d)。
また、その著しい抗ウイルス効力(図5dを参照のこと)と一致して、ジルチアゼム+バロキサビルの組合せは、感染後48時間及び72時間における安定なTEER測定値と関連している。
結論として、実施例4及び5において得られ、示される結果から以下のことが言える:
(i)これらの結果は、バロキサビル耐性表現型の組換えA/H1N1 I38Tウイルス(ポリメラーゼのPAサブユニットにI38T変異)に対して、10nMのバロキサビルによる参照処理が効力を有さないことを裏付けている（図4d）。
(ii)図4dはまた、依然として制限されている抗ウイルス活性を、しかし、この耐性A/H1N1 I38Tウイルスに対して得るためには、バロキサビル処理用量を大幅に増加させる(100nM)必要があることを実証している。
(iii)重要なことに、これらの結果はまた、ジルチアゼムが、同じ上皮モデルにおける野生型(WT)組換えA/H1N1ウイルスに対するその抗ウイルス活性と比較して、再構成されたヒト呼吸器上皮モデルにおいて、バロキサビルに対して耐性を有するI38T組換えA/H1N1ウイルスに対する著しく効果的な抗ウイルス活性を有することを示している(図4bと4dを比較のこと)。
(iv)図5bに示される結果もまた、ジルチアゼム(90μM)とバロキサビル(10nM)による併用処理では、A/H1N1の野生型株に感染した上気道の呼吸器上皮においてウイルス複製の著しい減少が可能であることを裏付けている。
(v)これに対して、ジルチアゼム(90μM)+バロキサビル(10nM)のこの組み合わせは、耐性A/H1N1 I38Tウイルスに対する単剤療法におけるジルチアゼムによる処理と比較して、付加的な得をもたらさない(図5b)。
(vi)ジルチアゼム(90μM)が、同じヒト呼吸器上皮モデルにおける同じ濃度の2種の分子のそれぞれでの単剤療法処理と比較して、耐性A/H1N1 I38Tウイルスに対する抗ウイルス活性に関して著しい得をもたらすのは、100nMのバロキサビルと組み合わせた場合である。
(i)これらの結果は、バロキサビル耐性表現型の組換えA/H1N1 I38Tウイルス(ポリメラーゼのPAサブユニットにI38T変異)に対して、10nMのバロキサビルによる参照処理が効力を有さないことを裏付けている（図4d）。
(ii)図4dはまた、依然として制限されている抗ウイルス活性を、しかし、この耐性A/H1N1 I38Tウイルスに対して得るためには、バロキサビル処理用量を大幅に増加させる(100nM)必要があることを実証している。
(iii)重要なことに、これらの結果はまた、ジルチアゼムが、同じ上皮モデルにおける野生型(WT)組換えA/H1N1ウイルスに対するその抗ウイルス活性と比較して、再構成されたヒト呼吸器上皮モデルにおいて、バロキサビルに対して耐性を有するI38T組換えA/H1N1ウイルスに対する著しく効果的な抗ウイルス活性を有することを示している(図4bと4dを比較のこと)。
(iv)図5bに示される結果もまた、ジルチアゼム(90μM)とバロキサビル(10nM)による併用処理では、A/H1N1の野生型株に感染した上気道の呼吸器上皮においてウイルス複製の著しい減少が可能であることを裏付けている。
(v)これに対して、ジルチアゼム(90μM)+バロキサビル(10nM)のこの組み合わせは、耐性A/H1N1 I38Tウイルスに対する単剤療法におけるジルチアゼムによる処理と比較して、付加的な得をもたらさない(図5b)。
(vi)ジルチアゼム(90μM)が、同じヒト呼吸器上皮モデルにおける同じ濃度の2種の分子のそれぞれでの単剤療法処理と比較して、耐性A/H1N1 I38Tウイルスに対する抗ウイルス活性に関して著しい得をもたらすのは、100nMのバロキサビルと組み合わせた場合である。
(実施例6)
バロキサビルと組み合わせたジルチアゼムの使用は、抗ウイルス選択圧下でのウイルスの連続細胞継代の標準試験においてバロキサビル耐性ウイルスの出現を防止することを可能にする。
24ウェルプレート中のMDCK細胞に原型A/H1N1 WTウイルス(それに対するバロキサビル及びジルチアゼムの半数阻害濃度(IC50)はそれぞれ、0.2nM及び5μMである)を0.001のMOIで感染させ、それによってウイルスの第１の細胞継代(P0)を構成した。
バロキサビルと組み合わせたジルチアゼムの使用は、抗ウイルス選択圧下でのウイルスの連続細胞継代の標準試験においてバロキサビル耐性ウイルスの出現を防止することを可能にする。
24ウェルプレート中のMDCK細胞に原型A/H1N1 WTウイルス(それに対するバロキサビル及びジルチアゼムの半数阻害濃度(IC50)はそれぞれ、0.2nM及び5μMである)を0.001のMOIで感染させ、それによってウイルスの第１の細胞継代(P0)を構成した。
このウイルスの連続細胞継代の4つの異なるアームを、以下に定義するような、選択圧を含む又は含まない条件下で行った:
(i)処理なし(NT)、
(ii)25μMの一定濃度のジルチアゼム(Dil)による処理、
(iii)1nMから128nMまでの漸増濃度のバロキサビルによる処理、及び
(iv)前記(iii)において前述したような1nMから128nMまでの同じ漸増濃度のバロキサビルと組み合わせた濃度を25μMと一定にしたのジルチアゼム(Dil)による処理。
(i)処理なし(NT)、
(ii)25μMの一定濃度のジルチアゼム(Dil)による処理、
(iii)1nMから128nMまでの漸増濃度のバロキサビルによる処理、及び
(iv)前記(iii)において前述したような1nMから128nMまでの同じ漸増濃度のバロキサビルと組み合わせた濃度を25μMと一定にしたのジルチアゼム(Dil)による処理。
継代P0から、細胞を感染後1時間に前述の異なる条件に従って処理し又は処理せず(NT)、感染上清を感染後48時間(D +2)にサンプリングした これらの感染試料を連続希釈し(10-1～10-6)、各希釈液を24ウェルプレート中のMDCK細胞上に載せ、それによって細胞継代P0に続く細胞継代(P1)を構成した。
この感染の1時間後、細胞は、前述の異なる条件に従って処理し、又は処理しなかった(NT)。この細胞継代P1の終わり(感染後48時間、D +4)に、処理アーム(I、ii、iii及びiv)のそれぞれについて、感染ウェルの上清を、いわゆる「限界」希釈で採取し、すなわち、著しい細胞変性効果(CPE)が観察される、P0から得られる10-1～10-6の希釈液の最後の希釈液を観察した。
これらの感染上清を連続希釈し(10-1～10-6)、各希釈液を24ウェルプレート中のMDCK細胞上に載せ、それによって細胞継代P1に続く細胞継代(P2)を構成した。
各連続細胞継代について、このように手順を行った。ジルチアゼムの濃度は、実験全体にわたって一定のままであった。バロキサビルの濃度は、最初の2つの継代(P0及びP1)の間は1nMに固定し、次いで次の2つの継代(P3及びP4)の間は2倍にし、その後、第10継代における128nMまで継代ごとに2倍にした。(実験のクロノグラム、図6aを参照のこと)。
この実験の終わりに、著しいCPEを示す、各処理アームの最後の細胞継代から得られた感染上清を、MDCK細胞においてTCID50/mLで滴定した。使用した最初の野生型ウイルスと比較してバロキサビル耐性表現型の出現を特徴付けるために、これらの上清のウイルスに対するバロキサビルの半数阻害濃度もまた、MDCK細胞においてTCID50/mLの限界希釈の滴定法によって算出した。
未処理及びジルチアゼム処理実験アームについては、第10継代から得られた感染上清を使用した。バロキサビル処理アームについては、第8細胞継代から得られた感染上清を使用した。ジルチアゼム+バロキサビル組合せ処理アームについては、第6細胞継代から得られた感染上清を使用した(第7細胞継代及び第9細胞継代においてはこれらの実験アームでそれぞれ、ウイルスが消滅していたため;図6a及び6bを参照のこと)。
MDCK細胞をこのように当該感染上清で感染させ、次いで、感染の1時間後に種々の漸増濃度のバロキサビル(0.04nM～160nM)で別々に処理した。同時に、MDCK細胞はまた、細胞継代P0に最初に使用したA/H1N1 WTウイルスに0.001のMOIで感染させ(図6a及び6bを参照のこと)、次いで、感染の1時間後に種々の漸増濃度のバロキサビル(0.04nM～160nM)で別々に処理し又は処理しなかった。
感染上清を48hpiにサンプリングし、次いで、ウイルス負荷を、MDCK細胞中において限界希釈法によってTCID50で滴定した。結果を、A/H1N1ウイルスに感染させ且つ処理しなかった対照細胞と比較した相対値で表した(図6c～6g)。これらの感染ウイルス滴定から、バロキサビルの半数阻害濃度をこのようにして算出し、以下のTable 1(表1)に報告する。
結果の詳細な説明
図6bのグラフは、図6aに前述した、各細胞継代に関して異なる実験アーム(未処理、バロキサビルで処理、ジルチアゼムで処理及びジルチアゼム+バロキサビルの組合せで処理)において使用したバロキサビル及びジルチアゼムの濃度を示す。表は、各細胞継代(著しい細胞変性効果が観察された)に由来する感染上清の限界希釈であって、4つの実験アーム(未処理、バロキサビルで処理、ジルチアゼムで処理及びジルチアゼム+バロキサビルの組合せで処理)のそれぞれにおいて各後続細胞継代に由来するMDCK細胞に感染させるために使用したものを示す。
図6bのグラフは、図6aに前述した、各細胞継代に関して異なる実験アーム(未処理、バロキサビルで処理、ジルチアゼムで処理及びジルチアゼム+バロキサビルの組合せで処理)において使用したバロキサビル及びジルチアゼムの濃度を示す。表は、各細胞継代(著しい細胞変性効果が観察された)に由来する感染上清の限界希釈であって、4つの実験アーム(未処理、バロキサビルで処理、ジルチアゼムで処理及びジルチアゼム+バロキサビルの組合せで処理)のそれぞれにおいて各後続細胞継代に由来するMDCK細胞に感染させるために使用したものを示す。
未処理及びジルチアゼム処理実験アームを、10代以上の細胞継代にわたって維持した。処理なしのアームでは、各細胞継代に使用した限界希釈は常に10-6であった。ジルチアゼム処理アームでは、使用した限界希釈は、グラフ及び表に示されるように、10-5から10-6まで変動した。
バロキサビル処理アームに関しては、各細胞継代に使用した限界希釈は、使用するバロキサビルの濃度が8nMである第6細胞継代までは10-5で安定なままであった。この細胞継代から、後続細胞継代に使用する限界希釈は、使用するバロキサビルの濃度が64nMである第9細胞継代において複製ウイルスが消滅するまで、漸増濃度のバロキサビルを使用するにつれて(8nMから32nMまで)徐々に減少した(10-4から10-1まで)。
ジルチアゼム+バロキサビル組合せ処理アームにおいては、使用した限界希釈(著しい細胞変性効果が観察された)は、第１の細胞継代(10-3)よりも低く、第6細胞継代まで10-3～10-2で安定なままであった。バロキサビル及びジルチアゼムの使用濃度がそれぞれ16nM及び25μMである第7細胞継代の間に、複製ウイルスの消滅が観察された。
これらの結果は、バロキサビル処理アームにおいて、バロキサビルの初期半数阻害濃度(IC50)が0.2nMであるA/H1N1ウイルスは、32nMのバロキサビル濃度条件までは、第8細胞継代まで複製したことを示す。これらの結果は、これらの実験条件下でバロキサビルによって発揮される選択圧が耐性ウイルス表現型を誘発することを示唆している。これに対して、ジルチアゼム処理アームではこのウイルス耐性表現型が観察されなかった。これは、未処理アームの場合とまさしく同様に、各細胞継代に使用した限界希釈が、第10細胞継代までウイルスが消滅することなく10-5～10-6で安定なままであったためである。
これらの結果は、組合せ処理アーム(ジルチアゼム25μM+1nM～8nMの漸増濃度のバロキサビル)におけるバロキサビルへのジルチアゼムの追加により、同じ濃度のジルチアゼム又はバロキサビル単独による処理と比較してウイルス阻害の相乗効果が得られたことを示している。これは、(i)各細胞継代において使用した限界希釈がこの実験アームにおいては第１の細胞継代から常に低かった(10-3)、及び(ii)複製ウイルスがより急速に消滅した(第7細胞継代から)ためである。
図6cは、最初の細胞継代P0から得られたA/H1N1ウイルスに対するバロキサビルの半数阻害濃度の決定を報告する。実験に使用したA/H1N1ウイルスについて最初に決定されたIC50は、0.2nMと確認される。
図6dは、未処理実験アームの細胞継代P10から得られたウイルスに対するバロキサビルの半数阻害濃度の決定を報告する。処理なし(未処理)の第10細胞継代に由来するA/H1N1ウイルスに対するバロキサビルの算出IC50は0.9nMである。このわずかな増加は、この実験アームにおけるMDCK細胞の連続的な細胞増殖に適応したA/H1N1ウイルスのウイルス複製に帰することができる。
図6eは、ジルチアゼムで処理された実験アームの細胞継代P10から得られたウイルスに対するバロキサビルの半数阻害濃度の決定を報告する。ジルチアゼム処理を行った第10細胞継代に由来するA/H1N1ウイルスに対するバロキサビルの算出IC50は0.3nMである。このIC50は、この実験に使用したA/H1N1ウイルスに関して最初に決定されたIC50と本質的に類似している。この結果は、10代の連続細胞継代にわたる25μMの一定濃度のジルチアゼムによる処理は、A/H1N1ウイルスのバロキサビルに対する感受性を変更しないこと(及びバロキサビル耐性表現型の出現を誘発しないこと)を裏付けている。
図6fは、バロキサビルで処理された実験アームの細胞継代P8から得られたウイルスに対するバロキサビルの半数阻害濃度の決定を報告する。
バロキサビル処理(漸増濃度で)を行った第8細胞継代に由来するA/H1N1ウイルスに対するバロキサビルの算出IC50は7nMである。このIC50は、この実験に使用したA/H1N1ウイルスに関して最初に決定したIC50(IC50=0.2nM)よりはるかに高い。
初期IC50の35倍に相当するこの増加は、バロキサビル耐性表現型を有するウイルスの出現を裏付けており、これは、図6bに記載した観察と一致している(この実験アームにおいて第１の細胞継代から使用されたより低い希釈限界、第8細胞継代における32nMのバロキサビル濃度条件まで有効なウイルス複製)。
図6gは、ジルチアゼム+バロキサビルの組合せで処理された実験アームの細胞継代P6から得られたウイルスに対するバロキサビルの半数阻害濃度の決定を報告する。
ジルチアゼム+バロキサビル組合せ処理(漸増濃度での)を行った第6細胞継代に由来するA/H1N1ウイルスに対するバロキサビルの算出IC50は0.8nMである。このIC50は、未処理の実験アームにおける第10細胞継代に由来するA/H1N1ウイルスにおいてバロキサビルに関して算出されたIC50(0.9nM、図6dを参照のこと)と非常に類似しており、実験に要した、細胞継代P0から得られたA/H1N1において最初に算出されたIC50(IC50=0.2nM、図6cを参照のこと)よりわずかに高い。このわずかな増加が、この実験アームにおけるMDCK細胞の連続的な細胞増殖に適応したA/H1N1ウイルスのウイルス複製に帰することができるという事実は別として、このIC50は、バロキサビル処理実験アームの細胞継代P8からのA/H1N1ウイルスについて算出したIC50(IC50=7nM、図6fを参照のこと)より非常に明らかに低いことが明白に確認され、これは、この実験アームにおいてバロキサビル耐性表現型を有するウイルスが出現していないことを示している。これらの結果は、バロキサビルと組み合わせたジルチアゼムの使用が、抗ウイルス選択圧(漸増濃度のバロキサビル)下でのウイルスの連続細胞継代の標準試験においてバロキサビル耐性ウイルスの出現を防止することが可能であることを示している
異なる実験アームの最後の細胞継代から得られたA/H1N1ウイルスに関するバロキサビルの半数阻害濃度定を以下のTable 1(表1)に示す。
結論として、選択圧条件下におけるA/H1N1ウイルスのMDCK細胞中での連続継代培養のこの実験の結果は、予想通り、漸増濃度のバロキサビルの使用ではバロキサビル耐性表現型を有するA/H1N1ウイルスの出現が誘発されたが、漸増濃度のバロキサビルの同じ条件下で、25μMの一定濃度のジルチアゼムを組み合わせて追加すると、バロキサビル耐性表現型を有するA/H1N1ウイルスの出現を防止することが可能になることを示している。
同様に、予想通り、未処理実験条件では、バロキサビル耐性表現型を有するA/H1N1ウイルスの出現が誘発されなかった。
同様に、ジルチアゼム単独処理の実験条件もまた、バロキサビル耐性表現型を有するA/H1N1ウイルスの出現を誘発しなかった。
明細書中における引用順での参考文献
（参考文献）
（参考文献）
Claims (10)
- ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物との組合せ。
- 医薬としてのその使用のための、請求項1に記載の組合せ。
- 特にヒト又は動物の身体の呼吸器及び/又は腸管の、ウイルス感染症の予防及び/又は治療におけるその使用のための組合せ。
- 前記ウイルス感染症が、インフルエンザウイルス感染症であることを特徴とする、請求項3に記載のその使用のための組合せ。
- 前記インフルエンザウイルスが、少なくとも1種の抗ウイルス化合物、特に抗インフルエンザ化合物、特にウイルスポリメラーゼ阻害薬の阻害作用に耐性を有することを特徴とする、請求項4に記載のその使用のための組合せ。
- 前記組合せが、少なくとも1種の他の活性薬、とりわけ抗ウイルス薬及び/又は抗生物質を含むことを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載のその使用のための組合せ。
- ジルチアゼムと、例えば請求項1から6に記載の、少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬との組合せを、医薬ビヒクル中に含む医薬組成物。
- 前記組成物が、吸入による投与に適当な剤形であることを特徴とする、請求項7に記載の医薬組成物。
- 特にインフルエンザウイルスによる、ウイルス感染症の予防及び/又は治療におけるその治療的使用のための、請求項7又は8に記載の医薬組成物。
- ジルチアゼムと、バロキサビルマルボキシル、ピモジビル、RO-7及びCC-42344の中から選択される少なくとも1種のウイルスポリメラーゼ阻害薬化合物とを含む組合せ製品であって、特にインフルエンザウイルスによる、ウイルス感染症の予防及び/又は治療におけるその同時の、別々の又は逐次的な使用のための、組合せ製品。
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