JP2023509181A - EBウイルスBNLF2b遺伝子によりコードされるポリペプチド及び検出におけるその使用 - Google Patents
EBウイルスBNLF2b遺伝子によりコードされるポリペプチド及び検出におけるその使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、免疫学的検出、特に腫瘍の免疫学的診断の分野に関する。具体的には、本発明は、抗エプスタイン-バーウイルス(EBV)抗体のレベルに基づいて鼻咽頭がんを診断する方法、及び本方法で使用するためのキットを提供する。また、本発明は、上記診断に使用されるEBV BNLF2b遺伝子によりコードされるポリペプチド、及び鼻咽頭がんの診断におけるその使用を提供する。
鼻咽頭がんは、上咽頭腔の上壁及び外側壁に発生する悪性腫瘍であり、その発生率は耳、鼻及び咽頭の悪性腫瘍の中で第1位である。中国は鼻咽頭がんの高発生地域であり、広東及び広西で最も高い発生率を示す[1]。鼻咽頭がんの発生は、EBV感染、遺伝因子、環境因子などの多くの因子に関係する[2]。鼻咽頭がんの初期症状は明らかではなく、発生部位が比較的隠れているため、ほとんどの鼻咽頭がんは進行期まで発見できない[3]。しかしながら、早期鼻咽頭がんの5年生存率は90%以上に達するが、進行鼻咽頭がんの予後は有意に低い[3]。一方、早期鼻咽頭がんは局所放射線療法で治療可能であり、進行鼻咽頭がんは化学療法による治療を必要とする。したがって、早期診断は、鼻咽頭がん患者の生存率及び生活の質を改善するための鍵である。
広範な研究の後、本出願の発明者らは、鼻咽頭がん患者が、対象の血清中のEBV BNLF2b遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的な抗体レベルに基づいて、健常な対照と効率的に区別することができることを予期せず発見した(これは、例えば、コーティングのための抗原としてBNLF2b遺伝子によりコードされるタンパク質又はポリペプチド断片を用いる間接法又は二重抗原サンドイッチ法により検出することができる)。加えて、本発明者らは、かなりの創造的努力により、捕獲試薬(例えば、ELISAにおけるコーティングのための抗原)として特に適したBNLF2b遺伝子によりコードされるポリペプチド断片を得た。したがって、本発明者らは、EBV BNLF2b遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体レベルの検出に基づいて鼻咽頭がんを診断するための方法及びプラットフォームを確立することに成功し、鼻咽頭がんスクリーニングの特異性及び陽性予測値を有意に改善することができる。
第1の実施形態において、本発明は、BNLF2b遺伝子によってコードされる野生型タンパク質の少なくとも7つの連続するアミノ酸残基からなり、以下の配列:BNLF2b遺伝子によってコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基5-11、アミノ酸残基16-23、アミノ酸31-39、またはアミノ酸残基53-60(例えば、アミノ酸残基53-61)の少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ、少なくとも3つ、または4つすべて)を含む、単離されたポリペプチドまたはその変異体を提供し;
ここで、バリアントは、それが由来するポリペプチドと、1つまたはいくつか(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、または9個)のアミノ酸残基であり、それが由来するポリペプチドの生物学的機能(例えば、抗EBV抗体によって認識および結合される活性)を保持する。
本発明のポリペプチド又はそのバリアントは、その製造方法によって限定されず、例えば、遺伝子工学的方法(組換え技術)又は化学合成方法によって製造することができる。
第2の実施形態において、本発明は、捕捉試薬を含むキットを提供し、捕捉試薬は、第1の実施形態の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される。ある実施形態において、キットは、さらに、試料中のBNLF2b遺伝子によりコード化されたタンパク質に特異的な抗体を検出する捕捉試薬として単離されたポリペプチド又はその変異体を使用するための指示、又は、対象由来の試料中のBNLF2b遺伝子によりコード化されたタンパク質に特異的な抗体レベルを検出するための捕捉試薬として単離されたポリペプチド又はその変異体を使用するための指示、を含み、それによって、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかを決定する。
第3の実施形態において、本発明は、以下の工程を含む、試料中のBNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体を検出するための方法を提供する:
(1)試料を捕捉試薬と接触させて抗原-抗体免疫複合体を得;ここで、捕捉試薬は、第1の実施形態において記載された単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される;
(2)工程(1)で得られた抗原-抗体免疫複合体の量の決定。
第4の実施形態において、本発明は、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかを決定するための方法を提供し、以下を含む:
(1)対象由来の試料中のBNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定すること。
(2)参照値とレベルの比較。
(1a)対象由来の試料を捕捉試薬と接触させて抗原-抗体免疫複合体を得;ここで、捕捉試薬は、第1の実施形態において記載された単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される;
(1b)工程(1a)で得られた抗原-抗体免疫複合体の量を決定する工程。
(1)対象由来の試料中のBNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体レベルを検出すること。
(2)参照値とレベルの比較。
(1a)対象由来の試料を捕捉試薬と接触させて抗原-抗体免疫複合体を得;ここで、捕捉試薬は、第1の実施形態において記載された単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される;
(1b)工程(1a)で得られた抗原-抗体免疫複合体の量を決定する工程。
ある実施形態において、工程(1b)において、免疫複合体の量は、免疫学的アッセイによって決定される。ある実施形態において、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ(例えば、ELISA)、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ、又はラジオイムノアッセイから選択される。
本発明では、特に断らない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用されるウイルス学、生化学、及び免疫学の実験手順は、全て、対応する分野で広く使用されるルーチン手順である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連用語の定義及び説明を以下に提供する。
本発明は、EBV BNLF2b遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体のレベルが、鼻咽頭がんの診断又は鼻咽頭がんのリスクの評価に使用可能であり、その診断性能が、鼻咽頭がんスクリーニングの特異性及び陽性予測値を有意に改善することができる既存のマーカーよりも有意に優れていることを初めて発見する。また、本発明は、EBV BNLF2b遺伝子によってコードされるタンパク質又はポリペプチド断片に基づく鼻咽頭がんの血清学的スクリーニングキットを初めて提供する。
GenBank(GenBank ID:V01555.2)のEBV B95-8株の86オープンリーディングフレーム(ORF)によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列情報に基づき、各タンパク質のB細胞エピトープをバイオインフォマティクスツールによりオンラインで予測した;予測結果によれば、各タンパク質に対して1~2個の可能性のあるB細胞エピトープペプチドを選択し、合成のためにXiamen Jingju Biotechnology Co.,Ltd.に委託した。合成中、ビオチンをポリペプチドのN末端に結合させ、その後の実験を容易にした。最後に、87のEpstein-Barrウイルス遺伝子にコードされたポリペプチド(配列番号1~87)の合成に成功し、これらのポリペプチドは68のORFに由来し、その特異的情報を表1に示した。
実施例1で得られたビオチン標識ポリペプチド(1~87番)をそれぞれ500ng/mlに希釈し、ストレプトアビジン被覆96ウェルマイクロウェルプレートにウェル当たり100μLで添加し、37℃で2時間反応させた。反応後、PBSTで2回洗浄し、ブロッキング液200μLを各ウェルに加え、37℃で2時間ブロッキングした後、ブロッキング液を捨て、1:20希釈鼻咽頭がん患者血清又は陰性対照血清100μLを各ウェルに加え、37℃で30分間反応させた。反応後、PBSTで5回洗浄し、1:20,000希釈のHRP標識ヤギ抗ヒトIgA(KPL,Gaithersburg,MD)を加え、37℃で30分間反応を続け、PBSTで5回洗浄した後、各ウェルにTMB発色溶液100μLを加え、37℃で15分間インキュベートした後、各ウェルに50μLの停止溶液を加え、混合後、450及び630nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
実施例1で合成した87ポリペプチド(1~87)と血清IgGとの反応性を実施例2の方法に従って検出し、ここで、1:5000で希釈したHRP標識マウス抗ヒトIgG(Wanyu Meilan、北京)を用いてヤギ抗ヒトIgAを置換した。結果を図1に示した。これらのポリペプチドのうち、BZLF1及びBRLF1などの遺伝子によりコードされる5つのポリペプチドは、鼻咽頭がんのプール血清と0.1より高い反応性を有し(表3-1)、BNLF1(ZTA)、BRLF1(RTA)及びBILF2(gp78)が報告されていた。
さらに、DNASTARソフトウェアパッケージ中のProteanソフトウェアを介してBNLF2b(配列番号101)によりコードされるタンパク質の親水性、疎水性及び抗原性を分析し、間接的検出のためのコーティング抗原として使用された2つのポリペプチドaa14-52(配列番号88)及びaa1-74(配列番号89)を合成した。
ポリペプチドaa14-52を炭酸塩緩衝液(pH9.6)で125ng/mlに希釈し、100μL/ウェルでコーティングした。実施例3の方法によれば、鼻咽頭がん患者の86の血清試料及び健常なヒトの195の血清試料が検出に使用された。結果を図3Aに示し、aa14-52をコーティング抗原として用いた場合、鼻咽頭がん患者の86血清試料中57試料はOD値が0.1を超え、健常人の195血清試料中全てのOD値が0.025未満であった。同時に、EBNA1/IgA+VCA/IgA組み合わせスクリーニング(組み合わせ検出方法については実施例6を参照のこと)により高リスクであるが最終的に非鼻咽頭がんと診断された122人の対象の血清試料を検出するために同じ方法を使用し、その結果を図に示した。3AではOD値が0.1を超えたのは3例のみであった。MedCalc 16.2.1ソフトウェア(MedCalc Software,Ostend,Belgium)によるROC曲線解析を、ポリペプチドa14-52に基づく上述の間接検出のデータについて実施し、その結果を図に示した。曲線下面積AUCが0.942、カットオフ値が0.025、Youden指数が0.80、特異度が100%、感度が80.23%(69/86)であった3B。
コーティング抗原としてポリペプチドaa1-74を用いて、4.1と同じ方法で、健常人の63の血清試料及び鼻咽頭がんの221の血清試料を検出した。図4Aに示すように、鼻咽頭がん患者63例の血清試料のうち55例はOD値が0.1を超えていたが、健常な対照の221例の血清試料のうち、OD値が0.1を超えていたのは10例のみであった。ポリペプチドaa1-74に基づく上述の間接法のROC曲線分析をさらに実施し、その結果を図4Bに示した。この方法が鼻咽頭がん患者を健常人から効率的に識別できることを示し、AUCは0.950であった。カットオフ値を0.1に設定した場合、感度は87.30%(55/63)、特異度は95.48%(211/221)であった。
実施例4の結果は、3種類の抗体IgA、IgM及びIgGが全て鼻咽頭がんのリスク予測において良好な特異性を有することを示したため、BNLF2bに対する全抗体を検出することにより、鼻咽頭がんのリスクを予測することができた。これに基づき、本実施例では、抗BNLF2b抗体を検出するためのダブル抗原サンドイッチ法を確立し、鼻咽頭がんのスクリーニングにおけるその性能を評価した。
Zhongshan BioのEBNA1/IgA検出キット、EU(Cat番号:EI2791-9601A)のVCA/IgA検出キット、及び実施例5の二重抗原サンドイッチ法(aa1-74)を用いて、鼻咽頭がん患者の74の血清試料と健常人の250の血清試料の同時検出を行った。EBNA1/IgAの検出結果を図6Aに示し、及びVCA/IgAの検出結果を図6Bに示した。通常、スクリーニング指標としてEBNA1/IgAとVCA/IgAを組み合わせて使用し、2つの抗体を組み合わせて使用した場合、鼻咽頭がんの確率は、LogitP=-3.934+2.203×VCA/IgA+4.797×EBNA1/IgA(Liu, Z., et al. 2013, Am J Epidemiol)と算出され、カットオフ値は0.98であった。EBNA1/IgA+VCA/IgAの組み合わせ検出の結果を図6Cに示した。鼻咽頭がん患者74人中69人及び健常人250人中8人が0.98より高い確率を有し、感度及び特異度はそれぞれ93.64%及び96.80%であった。
集団スクリーニングは広東省中山市(府社と南朗鎮)の高発生率地域の2つの町で実施され、計1325人が登録され、府社で496人、南朗鎮で829人が登録された。実施例6の方法(以下、抗BNLF2b抗体検出と称する)に従い、これらの試料をEBNA1/IgA、VCA/IgA、及び抗BNLF2b抗体について並行して検出した;EBNA1/IgAとVCA/IgA(LogitP=-3.934+2.203×VCA/IgA+4.797×EBNA1/IgA)の組み合わせにより、鼻咽頭がんを発症する確率を算出した。その結果、1325名のうち、EBNA1/IgA、VCA/IgA、抗BNLF2b抗体陽性者はそれぞれ163名、218名、32名であった。0.98を超える確率指数を有する126人のうち、5人が最終的に鼻咽頭がんと診断されたが、0.98未満の確率を有する人のうち、腫瘍登録システムによると、鼻咽頭がんと事前に診断された者はいなかった。鼻咽頭がんと診断された5検体のうち、VCA/IgAは1検体のみ検出できたが、他の方法は100%検出できた。1320の非鼻咽頭がん検体において、抗BNLF2b抗体検出の特異性及び陽性予測値は、それぞれ97.95%及び15.63%であり、EBNA1/IgA、VCA/IgA及びそれらの組み合わせよりも高かった。
実施例6及び実施例7のデータを合わせると、鼻咽頭がん79例、非鼻咽頭がん1570例であった。鼻咽頭がん検体79検体の検出結果を表7-1に示すが、抗BNLF2b抗体検出陽性例はEBNA1/IgA、VCA/IgA、確率でそれぞれ70例、67例、72例であった。非鼻咽頭がん1570例の検出結果を表7-2に示したが、抗BNLF2b抗体検出陽性例はEBNA/IgA、VCA/IgA、確率ともに5例、5例、4例であった。EBNA/IgA、VCA/IgA、EBNA/IgA/VCA/IgAによる抗BNLF2b抗体検出のさらなる組み合わせ検出の結果を表7-3に示し、EBNA/IgAと組み合わせた検出後、陽性予測値は15.15%から50%に増加し、検出と組み合わせた後、陽性予測値は15.15%から55.56%に増加したことを示した。
鼻咽頭がんの臨床症状は、他の頭頸部疾患との鑑別には不十分である。臨床的に疑われる症例は、主に鼻咽頭内視鏡検査及び病理学的検査により診断される。鼻咽頭がんが疑われた63例を収集し、そのうち31例が最終的に鼻咽頭がんと診断された。これら63例の検体を実施例6の方法による二重抗原サンドイッチ法により検出した結果、鼻咽頭がん31例中0.1、30例のカットオフ値がBNLF2b抗体陽性であったのに対し、非鼻咽頭がん32例中2例のみがBNLF2b抗体陽性であった。BNLF2b抗体検出は96.78%(30/31)の感度、93.75%(30/32)の特異度、93.75%(30/32)の陽性予測値を示した。以上の結果から、外来症例では、BNLF2b抗体の検出により、不要な鼻咽頭内視鏡検査の数が有意に減少し、患者の経済的及び身体的負担が軽減されることが示された。
BNLF2b遺伝子は、全部で98個のアミノ酸(配列番号101)をコードする。BNLF2bによりコードされるタンパク質の免疫優性エピトープを分析するために、著者らは9つの重複ポリペプチドを設計した。各ポリペプチドは15個のアミノ酸を有し(最後のポリペプチドは18個のアミノ酸を有し)、2つの隣接するポリペプチドは5個のアミノ酸によって重なり合い、C末端はその後の検出のためにビオチンで標識された(配列番号92-100)。実施例3の方法によれば、上述のポリペプチド断片をコーティング抗原として用いることにより、鼻咽頭がん患者の1:300希釈血清試料中のIgGの検出を行った。結果を図9に示した。これは、BNLF2bコードタンパク質のエピトープが主に4つのセグメント:aa1-25、aa31-45、aa51-65及びaa81-98に位置することを示した。
(2)aa31-45セグメント(図10B):N末端切断を有するかC末端切断を有するかにかかわらず、ポリペプチドは37~39位のアミノ酸EDRなしで鼻咽頭がん血清中のIgGとの反応性を完全に失った。従って、KER(aa31-33)とEDR(aa37-39)はこのエピトープを構成する重要なアミノ酸であった。
(3)aa51-65セグメント(図10C):N末端がaa54-56を含まない場合、又はC末端がaa60を含まない場合、ポリペプチドは鼻咽頭がん血清との反応性を完全に失った。
(4)aa81-98セグメント(図10D):N末端がaa87-89を含まない場合、又はC末端がaa96-98を含まない場合、ポリペプチドは鼻咽頭がん血清との反応性を完全に失った。
(2)aa31-45(図12B):K31、R33、およびD38とR39がアラニンに変異された後、ポリペプチドの鼻咽頭がん血清との反応性は著しく低下し、これらのアミノ酸がエピトープを構成する重要なアミノ酸であることが示された;さらに、32、34、35、36、37、40、41、および42位のアミノ酸変異は、比較的ほとんど影響を示さなかった。
(3)aa51-65(図12C):R53とN54、およびaa56-59がアラニンに変異した場合、ポリペプチドの鼻咽頭がん血清との反応性は有意に低下したが、52、55、60および61位は比較的影響が少なかった。
(4)aa81-98(図12D):aa95-97の3つのアミノ酸がアラニンに変異した場合、ポリペプチドの鼻咽頭がん血清との反応性は最も顕著に低下した。さらに、89、91、93、および98位のアミノ酸変異は、比較的ほとんど影響を示さなかった。
上記a14-52、aa1-74、aa1-52及びaa1-25の合成ポリペプチドに基づき、別の2つのポリペプチドaa11-65(配列番号103)及びaa11-74(配列番号104)をさらに合成し、それらのC-末端でビオチン標識した。実施例3の方法によれば、これらのポリペプチドの、鼻咽頭がん患者の84の血清試料及び健常なヒトの168の血清試料との反応が、それぞれ検出された。鼻咽頭がんの血清試料との6つのポリペプチドの反応性は、健常対照との反応性よりも有意に高かった(図13)。MedcalソフトウェアによるROC曲線分析の結果は、6つのポリペプチドのすべてが0.95を超える曲線下面積、89%を超える感度及び96%を超える特異性を有することを示した(表9)。上記の結果は、1つ以上のコアセグメント(aa5-11、aa16-23、aa31-33、a37-39、a53-60)を含むBNLF2bコード化ポリペプチド断片が鼻咽頭がんの優れたスクリーニング性能を有することを示した。
Claims (39)
- ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも7つの連続したアミノ酸残基で構成され、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基5~11、アミノ酸残基16~23、アミノ酸残基31~39、又はアミノ酸残基53~60から選択される少なくとも1つ(例えば、少なくとも2つ、少なくとも3つ、又はすべて4つ)の配列を含む、単離されたポリペプチド又はそのバリアントであって、
ここで、バリアントは、1つまたはいくつか(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、または9)のアミノ酸残基の置換(例えば、例えば、保存的置換または非保存的置換)によってのみ誘導され、それが由来するポリペプチドの生物学的機能(例えば、抗EBV抗体によって認識および結合される活性)を保持し;
好ましくは、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質は、配列番号101に示される配列を有する、上記単離されたポリペプチド又はそのバリアント。 - 単離されたポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基53~60、アミノ酸残基5~23、アミノ酸残基16~39、アミノ酸残基31~60、アミノ酸残基5~39、アミノ酸残基16~60、又はアミノ酸残基5~60を含む、請求項1に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。
- 単離されたポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも8個の連続したアミノ酸残基からなり、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基53~60を含み;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基53~61を含み;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基51~65を含み;
好ましくは、アミノ酸残基51~65が配列番号97に示される配列を有し;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも15個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。 - 単離されたポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも19個の連続したアミノ酸残基からなり、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基5~23を含み;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基1~25を含み;
好ましくは、アミノ酸残基1~25が配列番号102に示される配列を有し;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも25個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。 - 単離されたポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも24個の連続したアミノ酸残基からなり、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基16~39を含み;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基14~52を含み:
好ましくは、アミノ酸残基14~52が配列番号88に示される配列を有し;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも39個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。 - 単離されたポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも30個の連続したアミノ酸残基からなり、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基31~60を含み、
好ましくは、単離されたポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基31~61を含む、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。 - 単離されたポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも35個の連続したアミノ酸残基からなり、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基5~39を含み;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基1~52を含み;
好ましくは、アミノ酸残基1~52が配列番号91に示される配列を有し;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも53個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。 - 単離されたポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも45個の連続したアミノ酸残基からなり、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基16~60を含み;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基16~61を含み;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基14~74、アミノ酸残基11~65、又はアミノ酸残基11~74を含み;
好ましくは、アミノ酸残基14~74が配列番号90に示される配列を有し;
好ましくは、アミノ酸残基11~65が配列番号103に示される配列を有し;
好ましくは、アミノ酸残基11~74が配列番号104に示される配列を有し;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも61個、少なくとも55個、又は少なくとも64個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。 - 単離されたポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも56個の連続したアミノ酸残基からなり、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基5~60を含み;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基5~61を含み;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸残基1~74を含み;
好ましくは、アミノ酸残基1~74が配列番号89に示される配列を有し;
好ましくは、ポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の少なくとも74個の連続したアミノ酸残基からなる、請求項1又は2に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。 - 単離されたポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質のアミノ酸51~56、アミノ酸残基1~25、アミノ酸残基14~52、アミノ酸残基1~52、アミノ酸残基14~74、アミノ酸残基11~65、アミノ酸残基11~74、又はアミノ酸残基1~74からなる群から選択される配列からなる、請求項1~9のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。
- バリアントが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質に示されるアミノ酸位置に対して、以下の位置:6、9、10、11、16、31、33、38、39、53、54、56、57、58、59、95、96、97位に対応するアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含まない、請求項1~10のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドまたはそのバリアント。
- バリアントが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質に示されるアミノ酸位置に対して、以下の位置:5、7、8、12、13、14、15、19、22、24、25、32、34、35、36、37、40、41、42、52、55、60、61、89、91、93または98位に対応する1つ以上(例えば、1、2、3又は4つ)のアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含み、
好ましくは、バリアントが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質に示されるアミノ酸位置に対して、以下の位置:5、7、8、12、13、14、22、32、34、35、36、40、41、42、52、55、60、61、89、91、93または98位に対応する1つ以上(例えば、1、2、3又は4つ)のアミノ酸位置においてアミノ酸置換を含む、請求項1~11のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドまたはそのバリアント。 - バリアントが、5位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、7位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、8位に対応する位置でのアミノ酸のGによる置換、12位に対応する位置でのアミノ酸のG、T、D又はSによる置換、13位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、14位に対応する位置でのアミノ酸のGによる置換、15位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、22位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、24位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、25位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、32位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、34位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、35位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、36位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、37位に対応する位置でのアミノ酸のA、N、Q、SまたはRによる置換、40位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、41位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、42位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、52位に対応する位置でのアミノ酸のK、H、A、SまたはDによる置換、55位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、60位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、61位に対応する位置でのアミノ酸のK、H、SまたはAによる置換、89位に対応する位置でのアミノ酸のA又はTによる置換、91位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、93位に対応する位置でのアミノ酸のQによる置換、98位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換からなる群から選択される1つ又はいくつか(例えば、1、2、3又は4つ)のアミノ酸置換を含み、
好ましくは、バリアントが、5位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、7位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、8位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、12位に対応する位置でのアミノ酸のG、T,DまたはSによる置換、13位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、14位に対応する位置でのアミノ酸のGによる置換、22位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、25位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、32位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、34位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、35位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、36位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、40位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、41位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、42位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、52位に対応する位置でのアミノ酸のK、H、A、SまたはDによる置換、55位に対応する位置でのアミノ酸のSによる置換、60位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、61位に対応する位置でのアミノ酸のK、H、S又はAによる置換、89位に対応する位置でのアミノ酸のA又はTによる置換、91位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換、93位に対応する位置でのアミノ酸のQによる置換、98位に対応する位置でのアミノ酸のAによる置換からなる群から選択される1つ又はいくつか(例えば、1、2、3又は4つ)のアミノ酸置換を含む、請求項1~11のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドまたはそのバリアント。 - 単離されたポリペプチドが、BNLF2b遺伝子によりコードされる野生型タンパク質の97以下(例えば、96以下、95以下、94以下、93以下、92以下、91以下、90以下、89以下、88以下、87以下、86以下、85以下、84以下、83以下、82以下、81以下、80以下、79以下、78以下、76以下、75以下、または74以下)の連続したアミノ酸残基からなる、請求項1~13のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチドまたはそのバリアント。
- 単離されたポリペプチド又はそのバリアントが、固体支持体の表面に結合しているか、又は固体支持体に結合することができる修飾基を有し;
好ましくは、修飾基がビオチン又はアビジンであり;
好ましくは、固体支持体が、磁性ビーズ又はマイクロタイタープレート(例えば、マイクロウェルプレート又はELISAプレート)からなる群から選択される、請求項1~14のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。 - 単離されたポリペプチド又はそのバリアントが検出可能な標識を有し;
好ましくは、検出可能な標識が、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)、化学発光試薬(例えば、アクリジンエステル化合物)、蛍光色素又はビオチンからなる群から選択される、請求項1~14のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアント。 - 請求項1~14のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
- 請求項17に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
- 請求項17に記載の単離された核酸分子又は請求項18に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 補足試薬を含むキットであって、捕獲試薬が、請求項1~14のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択され;
好ましくは、キットは、試料中のBNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを検出し、場合により対象が鼻咽頭がんを有するか又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定するための捕捉試薬として単離されたポリペプチド又はそのバリアントを使用するための指示書をさらに含み;
好ましくは、捕捉試薬は、請求項15に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択され;
好ましくは、対象は、哺乳動物、例えばヒトである、上記キット。 - 検出試薬をさらに含み、検出試薬が、請求項16に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、請求項20に記載のキット。
- 検出試薬をさらに含み、検出試薬が、検出可能な標識を有する二次抗体から選択され;
好ましくは、検出可能な標識は、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)、化学発光試薬(例えば、アクリジンエステル化合物)、蛍光色素又はビオチンからなる群から選択され;
好ましくは、二次抗体は、検出される抗体が由来する種(例えば、ヒト)の抗体に特異的であり;
好ましくは、二次抗体は抗免疫グロブリン抗体であり;
好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、抗IgG抗体、抗IgM抗体、及び抗IgA抗体からなる群から選択される。請求項20に記載のキット。 - キットが、(i)試料を収集又は保存するためのデバイス(例えば、採血デバイス);(ii)検出を行うために必要な追加の試薬(例えば、緩衝液、希釈液、ブロッキング溶液、及び/又は標準)からなる群から選択される1つ以上の試薬又はデバイスをさらに含む、請求項20~22のいずれか1項に記載のキット。
- 対象が鼻咽頭がんであるかどうか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定するための方法であって、
(1)対象由来の試料中のBNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定し;および
(2)該レベルを参照値と比較する
ことを含み、
好ましくは、該レベルが参照値を上回る場合、対象が鼻咽頭がんであるか、または鼻咽頭がんのリスクがあると考えられ;
好ましくは、試料中のBNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルは、免疫学的アッセイによって決定され;
好ましくは、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ(例えば、ELISA)、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ又はラジオイムノアッセイからなる群から選択される、上記方法。 - アッセイが、捕捉試薬として請求項1~14のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントを使用することを含み、
好ましくは、捕捉試薬は、請求項15に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、請求項24に記載の方法。 - 工程(1)が、
(1a)対象由来の試料を捕捉試薬と接触させて、抗原-抗体免疫複合体を得る工程であって、捕捉試薬が、請求項1~14のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される工程;
(1b)工程(1a)で得られた抗原-抗体免疫複合体の量を決定する工程
を含み、
好ましくは、工程(1b)において、免疫複合体の量は免疫学的アッセイによって決定され;
好ましくは、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ(例えば、ELISA)、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ又はラジオイムノアッセイからなる群から選択され;
好ましくは、捕捉試薬は、請求項15に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、請求項25に記載の方法。 - 工程(1b)において、検出試薬が免疫複合体の量を検出するために使用され、検出試薬が、請求項16に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、請求項26に記載の方法。
- 工程(1b)において、検出試薬が免疫複合体の量を検出するために使用され、検出試薬が検出可能な標識を有する二次抗体から選択され
好ましくは、検出可能な標識は、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)、化学発光試薬(例えば、アクリジンエステル化合物)、蛍光色素又はビオチンからなる群から選択され;
好ましくは、二次抗体は、検出される抗体が由来する種(例えば、ヒト)の抗体に特異的であり;
好ましくは、二次抗体は抗免疫グロブリン抗体であり;
好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、抗IgG抗体、抗IgM抗体又は抗IgA抗体からなる群から選択され、好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は抗IgG抗体である、請求項26に記載の方法。 - 試料が、血液試料、例えば、全血、血漿又は血清である、請求項24~28のいずれか1項に記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項24~29のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(1)の前に、対象からの試料を提供し;及び/又は
工程(2)の後に、鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあると考えられる対象に、鼻咽頭がんを治療することができる治療的に有効な量の抗腫瘍療法(例えば、化学療法、放射線療法、及び/又は免疫療法)を投与する
ことをさらに含む、請求項24~30のいずれか1項に記載の方法。 - キットの製造において、BNLF2b遺伝子によりコード化されたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定することができる試薬の使用であって、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定するために使用され;
好ましくは、試薬は、免疫学的アッセイによってBNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定することができ;好ましくは、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ(例えば、ELISA)、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ又はラジオイムノアッセイからなる群から選択され;
好ましくは、対象はヒトであり;
好ましくは、試料は、血液試料、例えば、全血、血漿又は血清であり;
好ましくは、キットは、請求項24に記載の方法によって、対象が鼻咽頭がんであるか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定する、上記使用。 - BNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定することができる試薬が、請求項1~14のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される捕獲試薬を含み、
好ましくは、捕捉試薬は、請求項15に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択され;
好ましくは、キットは、請求項25又は26に記載の方法によって、対象が鼻咽頭がんを有するか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定する、請求項32に記載の使用。 - BNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定することができる試薬がさらに検出試薬を含み、検出試薬が、請求項16に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択され、
好ましくは、キットは、請求項27に記載の方法によって、対象が鼻咽頭がんであるか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定する、請求項33に記載の使用。 - BNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体のレベルを決定することができる試薬が、さらに検出試薬を含み、検出試薬が、検出可能な標識を有する二次抗体から選択され、
好ましくは、検出可能な標識は、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)、化学発光試薬(例えば、アクリジンエステル化合物)、蛍光色素又はビオチンからなる群から選択され;
好ましくは、二次抗体は、検出される抗体が由来する種(例えば、ヒト)の抗体に特異的であり;
好ましくは、二次抗体は抗免疫グロブリン抗体であり;
好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、抗IgG抗体、抗IgM抗体又は抗IgA抗体からなる群から選択され、好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は抗IgG抗体であり;
好ましくは、キットは、請求項28に記載の方法によって、対象が鼻咽頭がんであるか、又は鼻咽頭がんのリスクがあるかどうかを決定する、請求項33に記載の使用。 - 試料中のBNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体を検出するための方法であって、
(1)試料を捕捉試薬と接触させて抗原-抗体免疫複合体を得る工程であって、ここで、捕捉試薬は、請求項1~14のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される工程;
(2)工程(1)で得られた抗原-抗体免疫複合体の量を決定する工程
を含み、
好ましくは、工程(2)において、免疫複合体の量は、免疫学的アッセイによって決定され;
好ましくは、免疫学的アッセイは、酵素免疫アッセイ(例えば、ELISA)、化学発光免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイ又はラジオイムノアッセイからなる群から選択され;
好ましくは、捕捉試薬は、請求項15に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、上記方法。 - 工程(2)において、検出試薬を用いて免疫複合体の量を決定し、検出試薬が請求項16に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントから選択される、請求項36に記載の方法。
- 工程(2)において、検出試薬を用いて免疫複合体の量を決定し、検出試薬が検出可能な標識を有する二次抗体から選択され;
好ましくは、検出可能な標識は、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)、化学発光試薬(例えば、アクリジンエステル化合物)、蛍光色素又はビオチンからなる群から選択され;
好ましくは、二次抗体は、検出される抗体が由来する種(例えば、ヒト)の抗体に特異的であり;
好ましくは、二次抗体は抗免疫グロブリン抗体であり;
好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は、抗IgG抗体、抗IgM抗体又は抗IgA抗体からなる群から選択され、好ましくは、抗免疫グロブリン抗体は抗IgG抗体である、請求項36に記載の方法。 - キットが試料中のBNLF2b遺伝子にコードされたタンパク質に特異的な抗体を検出するために使用される、キットの製造における請求項1~16のいずれか1項に記載の単離されたポリペプチド又はそのバリアントの使用。
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