TW202303148A - 體外定量b肝病毒大表面蛋白的套組，用於分析hbv感染階段及肝癌預後的生物指標組，以及用於預測、診斷或治療慢性肝病的單株抗體組 - Google Patents

體外定量b肝病毒大表面蛋白的套組，用於分析hbv感染階段及肝癌預後的生物指標組，以及用於預測、診斷或治療慢性肝病的單株抗體組 Download PDF

Info

Publication number
TW202303148A
TW202303148A TW111124608A TW111124608A TW202303148A TW 202303148 A TW202303148 A TW 202303148A TW 111124608 A TW111124608 A TW 111124608A TW 111124608 A TW111124608 A TW 111124608A TW 202303148 A TW202303148 A TW 202303148A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
monoclonal antibody
seq
antigen
lhbs
binding fragment
Prior art date
Application number
TW111124608A
Other languages
English (en)
Inventor
黃溫雅
顏家瑞
李芸萍
Original Assignee
國立成功大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 國立成功大學 filed Critical 國立成功大學
Publication of TW202303148A publication Critical patent/TW202303148A/zh

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • G01N33/5761—Hepatitis B
    • G01N33/5764—Hepatitis B surface antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本發明有關於一種體外定量B肝病毒大表面蛋白(LHBS)的套組。此套組包括多種單株抗體，針對LHBS特定區域具有各自的結合特異性，藉此提高檢測生物樣品中LHBS的靈敏度以及動態廣度。其次，本發明亦提供一種針對LHBS特定區域的生物指標組，而且單株抗體可專一性辨識此生物指標組，藉由非侵入式分析生物樣本中HBV的感染階段及肝癌預後。再者，本發明亦提供一種單株抗體組，藉由偵測有需要的受試者之生物指標，以預測、診斷或治療慢性肝病。

Description

體外定量B肝病毒大表面蛋白的套組，用於分析HBV感染階段及肝癌預後的生物指標組，以及用於預測、診斷或治療慢性肝病的單株抗體組
本發明係有關一種檢測B肝病毒(HBV)感染階段的套組及方法，特別是有關於一種體外定量B肝病毒大表面蛋白的套組，用於分析HBV感染階段及肝癌預後的生物指標組，以及用於預測、診斷或治療慢性肝病的單株抗體組。
慢性B型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB，以下簡稱B肝)病毒感染是全球肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的主因，也是亞洲肝癌最重要的主因。對於預防晚期肝病而言，早期診斷及有效治療B肝病毒(hepatitis B virus，HBV)是非常重要。儘管以抗病毒治療效果而言，病毒DNA力價是靈敏的早期生物指標，但這項檢測的實驗方法需抽取DNA並進行即時聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction)，比較耗時且成本較高。發展新的生物指標，藉此檢測病毒增殖的早期變化並預測病毒治療效果，是非常重要的。
近來，大HBV表面(LHBS)蛋白是HBV生命週期的非常重要的指標(marker)。LHBS包含表面蛋白的前S1 (pre-S1)、前S2 (pre-S2)及S結構域，且LHBS是病毒顆粒鞘膜的完整組成分。因為血清之LHBS與HBV DNA複製數的相關性很高，可合理假設血清 LHBS的含量有潛力做為病毒複製(例如HBV DNA)的生物指標。相較於檢測HBV DNA，檢測血清LHBS的時間及成本效益更高。有鑑於此，亟需開發LHBS相關的生物指標，以提高檢測LHBS的靈敏度、動態範圍及分析B肝病毒的感染階段。
因此，本發明之一態樣是提供了一種體外定量生物樣品中B肝病毒大表面蛋白(LHBS)之套組，其中包括一組對LHBS特定區域具有各自結合特異性的單株抗體，以提高檢測LHBS的靈敏度及動態廣度。
其次，本發明之另一態樣是提供一種用於分析生物樣品中HBV感染階段及肝癌預後之生物指標組，其中生物指標組包括分別具有LHBS特定區域的複數個生物指標。
再者，本發明之又一態樣是提供一種藉由有需要的受試者之生物指標預測、診斷或治療慢性肝病的單株抗體組。
根據本發明之上述態樣，提出一種體外定量生物樣品中B肝病毒大表面蛋白(LHBS)之套組。在一實施例中，此套組可包括阻斷溶液(blocking solution)；用於檢測生物樣品中生物指標的單株抗體組，其中單株抗體組包括第一單株抗體，其係固定在固體支持的多個個別位置上且浸於阻斷溶液中；第二單株抗體及第三單株抗體之至少一者，且第二單株抗體及第三單株抗體分別與標記物(label)連接；以及檢測試劑，其能與標記物反應形成可檢測的產物。
在上述實施例中，前述第一單株抗體對生物樣品中序列識別號(SEQ ID NO)：1所列之第一多肽具有結合特異性，第二單株抗體對生物樣品中SEQ ID NO：2所列之第二多肽具有結合特異性，且第三單株抗體對生物樣品中SEQ ID NO：3所列之第三多肽具有結合特異性。
根據本發明之另一態樣，提出一種用於分析生物樣品中HBV感染階段及肝癌預後之生物指標(biomarker)組，其可包括具有SEQ ID NO：1之第一多肽的第一生物指標、具有SEQ ID NO：2之第二多肽的第二生物指標及/或具有SEQ ID NO：3之第三多肽的第三生物指標。
根據本發明之又一態樣，提出一種單株抗體組，由有需要的受試者之生物指標以預測、診斷或治療慢性肝病。在一實施例中，前述單株抗體組可包括第一單株抗體或其第一抗原結合片段，以及第二單株抗體或其第二抗原結合片段與第三單株抗體或其第三單株抗體之至少一種。第一單株抗體可專一性檢測具有SEQ ID NO：1之第一多肽的第一生物指標，且第一單株抗體或其第一抗原結合片段包含由SEQ ID NOs：4至6組成的重鏈CDR1至CDR3序列以及由SEQ ID NOs：7至9組成的輕鏈CDR1至CDR3序列。第二單株抗體或其第二抗原結合片段可專一性檢測具有SEQ ID NO：2之第二多肽的第二生物指標，且第二抗體或其第二抗原結合片段包含由SEQ ID NOs：10至12組成的重鏈CDR1至CDR3序列以及由SEQ ID NOs：13至15組成的輕鏈CDR1至CDR3序列。第三單株抗體或第三抗原其結合片段可專一性檢測具有SEQ ID NO：3的第三多肽的第三生物指標，且第三單株抗體或其第三抗原結合片段包含由SEQ ID NOs：16至18組成的重鏈CDR1至CDR3序列以及由SEQ ID NOs：19至21組成的輕鏈CDR1至CDR3序列。
在上述實施例中，前述生物指標包括具有SEQ ID NO：1之第一多肽的第一生物指標、具有SEQ ID NO：2之第二多肽的第二生物指標以及具有SEQ ID NO：3之第三多肽的第三生物指標。
在上述實施例中，前述第一單株抗體或其第一抗原結合片段包含如SEQ ID NO：22所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：23所示之輕鏈序列。
在上述實施例中，前述第二單株抗體或其第二抗原結合片段包含如SEQ ID NO：24所示之重鏈序列以及如SEQ ID NO：25所示之輕鏈序列。
在上述實施例中，前述第三單株抗體或其第三抗原結合片段包含如SEQ ID NO：26所示之重鏈序列及如SEQ ID NO：27所示之輕鏈序列。
在上述實施例中，前述第一單株抗體包含由SEQ ID NO：28所列序列編碼之重鏈以及由SEQ ID NO：29所列序列編碼之輕鏈。
在上述實施例中，前述第二單株抗體包含由SEQ ID NO：30所列序列編碼之重鏈以及由SEQ ID NO：31所列序列編碼之輕鏈。
在上述實施例中，前述第三單株抗體包含由SEQ ID NO：32所列序列編碼之重鏈以及由SEQ ID NO：33所列序列編碼的輕鏈。
在上述實施例中，前述第一單株抗體或其第一抗原結合片段、第二單株抗體或其第二抗原結合片段、第三單株抗體或其第三抗原結合片段為工程化 T 細胞(engineered T cells)之嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors，CARs)。
在上述實施例中，前述第一單株抗體或其第一抗原結合片段、第二單株抗體或其第二抗原結合片段、第三單株抗體或其第三抗原結合片段為抗體-藥物複合物 (antibody-drug conjugates，ADCs)。
應用本發明的體外定量B肝病毒大表面蛋白的套組，用於分析HBV感染階段及肝癌預後的生物指標組，以及用於預測、診斷或治療慢性肝病的單株抗體組，其抗體針對LHBS特定區域具有各自的結合特異性，藉此提高檢測生物樣品中LHBS的靈敏度以及動態廣度，分析生物樣本中HBV的感染階段及肝癌預後，以及開發工程化T細胞之CARs的抗原結合結構域與抗體-藥物複合物(ADCs)。
可以理解的是，以上概述及以下詳述僅為例示，主要是針對所主張的發明提供進一步的闡釋。
藉由以下詳細說明，並參酌所附圖式，以下詳細說明本發明的實施例。圖式及說明書使用之相同圖號，盡可能是指相同或類似的部分。
如前所述，本發明提供一種體外定量B肝病毒大表面蛋白(LHBS)的套組以及免疫分析法，其中此套組及免疫分析法包括多種單株抗體，針對LHBS特定區域具有各自的結合特異性(亦稱結合專一性)，藉此提高檢測生物樣品中LHBS的靈敏度以及動態廣度。
目前已發現，即使這些患者持續接受抗病毒治療，患者血清中的LHBS仍持續陽性，可用於預測HBV DNA轉換(conversion)。利用即時PCR檢測HBV DNA既費時又耗成本，故定量檢測LHBS有潛力取代定量檢測HBV DNA。
大體而言，此處所述的「單株抗體」係指對LHBS的特定區域具有各自結合特異性，可包括但不限於對SEQ ID NO：1的第一多肽具有結合特異性的第一單株抗體，對SEQ ID NO：2的第二多肽具有結合特異性的第二單株抗體，以及對SEQ ID NO：3的第三多肽具有結合特異性的第三單株抗體。
一般而言，第一單株抗體或其抗原結合片段或捕獲抗體對SEQ ID NO：1第一多肽具有結合特異性，其對應的是LHBS的前S1區。在一實施例中，第一單株抗體可固定於一表面，用於專一性捕獲生物樣品中的LHBS蛋白之前S1區。在一些例示中，生物樣品可包括但不限於組織及/或液體樣品。在一些例示中，組織可以包括實體組織(solid tissue)及/或軟組織(soft tissue)。在一些具體例中，液體樣品可包括血清、血液、尿液、精液、腦脊髓液(CSF)及唾液。
在一些實施例中，第一單株抗體或其抗原結合片段可包含重鏈CDR序列及輕鏈CDR序列，重鏈CDR序列係選自SEQ ID NOs：4至6所列序列，輕鏈CDR序列係選自SEQ ID NOs：7至9所列序列。在其他實施例中，第一單株抗體或其抗原結合片段可包括如SEQ ID NO：22所列的重鏈序列以及如SEQ ID NO：23所列的輕鏈序列。在一些特定實施例中，第一單株抗體或其抗原結合片段可包括由SEQ ID NO：28所列序列編碼的重鏈序列以及由SEQ ID NO：29所列序列編碼的輕鏈序列。
一般而言，第二單株抗體或其抗原結合片段或檢測抗體是對SEQ ID NO：2的第二多肽具有結合特異性，其對應的是LHBS的前S2區。第二單株抗體或檢測抗體可被設計在反應混合物中用於捕獲LHBS蛋白或其免疫複合物的前S2區，以顯著擴大檢測LHBS的動態範圍。
在一些實施例中，第二單株抗體或其抗原結合片段可包括重鏈CDR序列及輕鏈CDR序列，其中重鏈CDR序列係選自於由SEQ ID NOs：10至12所列序列，輕鏈CDR序列係選自於由SEQ ID NOs：13至15所列序列。在其他實施例中，第一單株抗體或其抗原結合片段可包括如SEQ ID NO：24所示的重鏈序列以及如SEQ ID NO：25所示的輕鏈序列。在特定實施例中，第一單株抗體或其抗原結合片段可包括由SEQ ID NO：30所列序列編碼的重鏈序列以及由SEQ ID NO：31所列序列編碼的輕鏈序列。
一般而言，第三單株抗體或其抗原結合片段或另一種檢測抗體是對SEQ ID NO：3的第三多肽具有結合特異性，其對應的是LHBS的S區。第三單株抗體或其他檢測抗體可被設計在反應混合物中用於捕獲LHBS蛋白或其免疫複合物的S區，以顯著擴大檢測LHBS的動態範圍。
第二單株抗體及第三單株抗體二者皆可被設計用於檢測LHBS蛋白的前S2區及S區，以增加檢測LHBS的動態廣度。在一個實施例中，第二單株抗體及第三單株抗體可分別連接至標記物(label)，用於後續與報告受質(reporting substrate)反應。
需留意的是，單株抗體可針對不同應用而被嵌合(chimerized)或人源化(humanized)。此外，如果第一單株抗體不負責捕獲生物樣品中LHBS蛋白的前S1區，則檢測LHBS很難達到預設的靈敏度及動態廣度。
上述單株抗體可應用於體外定量LHBS的套組及免疫分析法。在一些實施例中，此套組可包括阻斷溶液(blocking solution)。第一單株抗體可固定在固體支持的多個個別位置上，且部分浸於阻斷溶液中。第二單株抗體與標記物連接，第三單株抗體與此標記物連接，以及檢測試劑，其能與標記物反應形成一可檢測產物。
在一些實施例中，體外定量LHBS的免疫分析法可如下進行。首先，將第一單株抗體固定在表面上並浸於阻斷溶液中。接下來，生物樣品溶液與第一單株抗體反應形成第一免疫複合物。然後，第二單株抗體及第三單株抗體與第一免疫複合物反應形成第二免疫複合物。隨後，檢測試劑與標記物反應，形成可檢測產物。之後，對此可檢測產物進行定量，其中LHBS的動態範圍可在1.7 ng/mL到108.5 ng/mL之間。
在一些實施例中，上述免疫分析法之LHBS的分析靈敏度為不大於0.1 ng/mL。
在一些實施例中，前述表面、阻斷溶液、檢測試劑、標記物及可檢測產物並無特別限制。
在一些例示中，上述表面可為固體表面，適用連接單株抗體。前述固體表面的具體例可包括但不限於顆粒(包括但不限於瓊脂糖或乳膠珠體或顆粒或磁性顆粒)、珠體、奈米顆粒、聚合物、基材、載玻片、 蓋玻片、平板、皿、孔、膜及/或接枝(grafting)。 固體表面可包括許多不同的材料，包括但不限於聚合物、塑膠、樹脂、多醣、矽或二氧化矽為主的材料、碳、金屬、無機玻璃及膜。
在一些實施例中，上述阻斷溶液及檢測試劑可為常用的緩衝液或市售的緩衝液，故不另贅述。
此處所述的「標記物(label)」係指利用光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電磁、放射化學或化學方式，例如螢光、化學螢光(chemifluoresence)或化學冷光(chemiluminescence)，或任何其他合適的方式偵測(例如：測量及/或判斷)一分子或官能基(moiety)存在或不存在。 這類標記物可包括例如光吸收染料、螢光染料或放射性標記。 前述標記物、檢測標記物的方法以及將標記物加入試劑(例如：抗體及核酸探針)中的方法為本技術領域所熟悉者。
用於本文所述方法的標記物可為一級標記物(primary label，其中此標記物包含可直接檢測的官能基，或產生可直接檢測的官能基)或二級標記物(secondary label，其中可檢測的標記與另一官能基結合以產生可檢測的訊號，例如，使用二級抗體及三級抗體之免疫標記反應為很常見)。標記物可藉由共價或非共價方式與試劑連接。另一種方式，標記物可例如利用直接標記一分子，此分子經由配體受體結合對(ligand receptor binding pair)排列或其他此類專一性辨識性分子，使此分子達成與試劑結合。標記物可包括但不限於放射性同位素、生物發光化合物、發色團(chromophores)、抗體、化學冷光化合物、螢光化合物、金屬螯合物及酶。
在一些實施例中，前述標記物可為酶，包括但不限於辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)及鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)。酵素型標記物可產生可檢測產物，例如化學冷光訊號、顏色訊號或螢光信號。考慮做為標記物的酶可包括但不限於蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-類固醇異構酶、酵母醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、磷酸三碳糖異構酶、辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、天冬醯胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、過氧化氫酶、葡萄糖六磷酸脫氫酶、葡萄糖澱粉酶及乙醯膽鹼酯酶。
在一些實施例中，亦可使用市售檢測系統，例如生物素-鏈黴親和素(biotin-streptavidin)系統。在此系統中，能與目標的生物指標發生免疫反應(即，具有專一性)的抗體是被生物素化(biotinylated)。使用鏈黴親和素-過氧化酶偶聯物及顯色受質可判斷與生物指標結合的生物素化抗體的量(quantity)。
一般而言，此處所述的「生物指標」可包括但不限於單個生物指標或包括多個生物指標的生物指標組。在一個例示中，生物指標可包括但不限於具有SEQ ID NO：1的第一多肽的第一生物指標、具有SEQ ID NO：2的第二多肽的第二生物指標及/或具有第三多肽的第三生物指標。在其他例示中，生物指標組可包括但不限於第一生物指標，以及第二生物指標及第三生物指標的至少一個。
在應用時，上述生物指標或生物指標組可用於非侵入式分析生物樣本中的HBV感染階段及肝癌預後，或用於預測或診斷生物樣本中的慢性肝病的嚴重程度。
在其他應用中，用於檢測上述生物指標的單株抗體或用於檢測上述生物指標組的單株抗體組，可藉由在有需要的受試者之上述生物指標，來預測、診斷或治療慢性肝病。在這些例示中，單株抗體或單株抗體組可包括第一、第二及/或第三單株抗體或其抗原結合片段。
過繼性(adoptive)嵌合抗原受體T細胞 (chimeric antigen receptor-T cell；CAR-T細胞)免疫療法與提高腫瘤靶向(tumor targeting)的功效有關。調製(modulated) T細胞表現基因工程CAR的構築體(construct)，其包含辨識腫瘤抗原的免疫球蛋白單鏈可變區(single-chain variable，ScFv)片段，可攻擊目標細胞而無需通過抗原呈遞來促發(priming)。利用表現靶向HCC相關抗原(例如HBV LHBS蛋白)的ScFv 的載體可改造T細胞。在一些實施例中，第一單株抗體或其第一抗原結合片段、第二單株抗體或其第二抗原結合片段、以及第三單株抗體或其第三抗原結合片段可為下述的抗原結合結構域：工程化T細胞的嵌合抗原受體(CARs)。在其他例示中，第一單株抗體或其第一抗原結合片段、第二單株抗體或其第二抗原結合片段、以及第三單株抗體或其第三抗原結合片段，可為抗體-藥物複合物(antibody-drug conjugate，ADCs)之抗原結合結構域。
以下可以理解的是，下文所述之特定配置、觀點、具體例、條款及實施例，旨在說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，以適用於不同用途及條件。 實施例1：單株抗體的特性 1.1 患者組
此實施例從2010年至2017年，在國立成功大學(NCKU)附設醫院(台灣台南)招募49位HBV帶原者，經告知同意後接受藥物治療及追蹤。這些患者的血清進行各種HBV生物指標的測試，包括HBsAg、DNA力價及LHBS。患者的HBV感染階段是根據歐洲肝臟研究協會(European Association for the Study of the Liver，EASL)於2017年公開的臨床診療指南(2017)( J. Hepatol.67(2):370-398, 2017 Aug.)判斷。 1.2 製備小鼠免疫用的抗原
在本實施例中，為了產生專一性辨識HBV LHBS前S區的小鼠抗體，將前S區基因選殖到pET21b質體載體中，並利用誘導化學品異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG，0.2 mM)誘導大腸桿菌BL21菌株進行表現。將純化的重組前S區蛋白注射到BALB/c小鼠體內，產生前S區抗體。為了產生辨識HBS的抗體，將購自偉喬生醫股份有限公司(Leadgene, Inc.，台灣台南)的HBS重組蛋白注射到小鼠體內，以產生HBS專一性抗體(圖1)。選出血清對HBS具有最高親和力的小鼠進行後續研究。 1.3 篩選及純化單株抗體
在此具體例中，注射前一節中所述之重組蛋白的小鼠被犧牲。取脾細胞製備融合瘤。利用ELISA檢測含有針對前S區及HBS蛋白之抗體的融合瘤培養液的抗體力價融合瘤。表現辨識目標蛋白的抗體的融合瘤細胞可進一步進行序列限制稀釋步驟(serial limiting dilution procedures)，以產生單株抗體融合瘤細胞株。單株抗體經測試可辨識LHBS、HBS及跨越第21個至第47個胺基酸的前S1胜肽的靈敏度/特異性，此區域之前曾報導具有高度抗原性。純化出對目標蛋白呈現令人滿意的靈敏度及特異性之融合瘤細胞株後，經由腹腔注射(intraperitoneally injected)至小鼠體內以產生腹水。之後，收集富含抗體的腹水，並使用IgG小珠純化出單株抗體。取這些抗體的部分試樣直接與生物素結合，在三明治ELISA系統中可做為檢測抗體。 1.4 單株抗體的抗原辨識區
此具體例分析所產生的單株抗體的抗原辨識區域。請參閱圖2A至圖2C，其說明根據本發明一實施例之前S1單株抗體(圖2A)、前S2單株抗體(圖2B)及HBS單株抗體(圖2C)對於實施例不同區域的LHBS之結合親和力。
如圖2A所示，對於前S1抗體而言，合成並檢測了跨越前S1之N端胺基酸21至47區的不同寡肽(相當於前S1胜肽之第1個至第7個胺基酸殘基)，此區域之前顯示具有高度抗原性，以前S1抗體檢測對此胜肽之相對親和力。結果顯示，相較於相鄰的蛋白質區域，前S1抗體可專一性辨識含有第25-38個胺基酸(序列為FPDHQLDPAFGANS；SEQ ID NO：31)的胜肽。
對於前S2抗體，293T細胞經LHBS基因轉染，其中LHBS基因具有不同前S區的部分缺失，其細胞裂解物利用ELISA藉由前S2抗體辨識。圖2B的結果顯示前S2抗體可辨識全長及各種截短的LHBS構築體，除了在前S2區第152-163個及第164-174個胺基酸殘基缺失的胜肽，指出前S2 單株抗體的抗原表位(epitope)很可能位於前S2區(SEQ ID NO：32)第152-174個胺基酸殘基的附近。
如圖2C所示之HBS抗體的例子中，此抗體可辨識所有LHBS截短蛋白，除了第251個至第288 個胺基酸殘基(SEQ ID NO：33)的缺失以外，故這段區域被認為是HBS抗體的辨識區。
請參閱圖2D，其說明本發明一實施例之抗LHBS的前S1單株抗體、前S2單株抗體及HBS單株抗體之辨識區的示意圖。 1.5 抗體可變基因的DNA定序
前S1、前S2及HBS抗體產生融合瘤細胞株中抗體可變(V)基因的DNA定序由偉喬生醫股份有限公司(Leadgene, Inc.，台灣台南)進行。每個細胞株確認其抗體為單株性(monoclonality)，並證實抗體V基因之骨架區(framework region，FR)及互補決定區(complementary determining region，CDR)的DNA序列。根據DNA序列確認這些區域對應的胺基酸殘基。
前S1抗體的重鏈及輕鏈之胺基酸序列分別如SEQ ID NO：1(重鏈)及SEQ ID NO：2(κ輕鏈)所列，其各自的CDR 1至CDR 3則如SEQ ID NO：7至9(重鏈)及SEQ ID NO：10至12(κ輕鏈)所列，而其各自的DNA序列則如SEQ ID NO：25(重鏈)及SEQ ID NO：26(κ輕鏈)所列。
前S2抗體的重鏈及輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3(重鏈)及SEQ ID NO：4(κ輕鏈)所列，其各自的CDR 1至CDR 3則如SEQ ID NO：13至15(重鏈)及SEQ ID NO：16至18(κ輕鏈)所列，而其各自的DNA序列則如SEQ ID NO：27(重鏈)及SEQ ID NO：28(κ輕鏈)所列。
HBS抗體重鏈及輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：5(重鏈)及SEQ ID NO：6(κ輕鏈)所列，其各自的CDR 1至CDR 3則如SEQ ID NO：5(重鏈)及SEQ ID NO：6(κ輕鏈) ID NO：19至21(重鏈)及SEQ ID NO：22至24(κ輕鏈)所列，而其各自的DNA序列則如SEQ ID NO：29(重鏈)及SEQ ID NO：30(κ輕鏈)所列。 實施例2：單株抗體的特性 2.1 抗體靈敏度的測定
為了確定抗體力價，將0.1 ng/μL的每種抗原蛋白或胜肽塗佈至96孔ELISA培養盤的每個孔上，然後在4°C 下反應至隔夜。隔天，將純化的單株抗體進行序列10倍稀釋，並添加至預先塗佈抗原的ELISA孔中，接著用含有tween® 20的磷酸鹽緩衝鹽水(PBST，pH7.4)進行標準的ELISA潤洗步驟。使用與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的抗小鼠IgG二級抗體檢測抗原-抗體複合物的訊號，然後使用化學冷光HRP受質四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)，並使用ELISA化學冷光讀取儀測量訊號。
再者，為了確定抗體的抗原檢測極限，將各種抗原蛋白以10 倍序列稀釋，接著塗佈到 ELISA 培養盤的孔上，然後加入抗體(在PBST中以 1：2000稀釋)，接下來進行標準化學冷光檢測步驟。繪製校正曲線，以確定各種抗體對其特定抗原蛋白的檢測極限(limit of detection，LOD)、定量極限(limit of quantification，LOQ)、線性範圍及線性極限(limit of linearity，LOL)(Armbruster & Pry, Clin. Biochem. Rev.Vol. 29, Suppl(i)., 2008)。
在此實施例中，測試前S1、前S2 及 HBS 抗體的小鼠單株抗體對重組目標蛋白的靈敏度。
請參閱圖3A至圖3C，其說明根據本發明數個實施例之前S1單株抗體(圖3A)、前S2單株抗體(圖3B)及HBS單株抗體(圖3C)對各自重組蛋白的檢測靈敏度及動態範圍的曲線圖。
圖3A及圖3B顯示前S1抗體及前S2抗體辨識大腸桿菌表現之前S重組蛋白結果佳。
如圖3A所示，對於前S1抗體，定量極限(limit of quantificatio ，LOQ)及線性極限(limit of linearity，LOL)值分別為0.09 ng/mL及12.5 ng/mL，代表檢測動態範圍為0.09 ng/mL至12.5 ng/mL。
如圖3B所示，前S2抗體對前S區蛋白也顯示出高靈敏度，LOQ及LOL值分別為0.04 ng/mL及1.56 ng/mL。
至於圖3C所示的HBS抗體，對HBS重組蛋白的LOQ及LOL分別為0.06 ng/mL及 50 ng/mL。由於上述單株抗體對其目標蛋白表現出令人滿意的靈敏度及專一性，可利用生產出的腹水進行大規模倍增，之後利用IgG管柱純化並與生物素偶聯以用於三明治分析法。 2.2 利用ELISA檢測血清中LHBS
此實施例產生的單株抗體可用於建立三明治ELISA系統，以檢測血清中的LHBS。將目標針對前S1區的LHBS特異性抗體塗佈到ELISA孔上，然後在4°C下培養過夜。第二天，在孔中加入標準正常血清或HBsAg (+)血清(5 μL 血清 + 98 μL 2% 牛血清白蛋白/孔)。在一系列潤洗步驟後，添加辨識前S2或HBS區的檢測抗體。最終利用化學冷光檢測，使LHBS訊號可視化。利用不同濃度之前S區重組蛋白，將產生的訊號值繪製成標準曲線，來定量血清中的LHBS含量。
請參閱圖4A至4B，其說明根據本發明數個實施例利用前S2單株抗體(圖4A)或HBS單株抗體(圖4B)做為檢測抗體，顯示血清中LHBS化學冷光三明治ELISA系統的檢測靈敏度及動態範圍的線圖。
在LHBS ELISA系統中，專一性辨識LHBS的前S1抗體做為塗佈抗體，而前S2或HBS抗體則做為檢測抗體。在ELISA分析中，由具有已知LHBS濃度之多個HBsAg(+)案例的混合血清進行測試。上述結果顯示，使用前S2檢測抗體的LHBS三明治ELISA分析法呈現的LOQ值為13.5 ng/mL，線性範圍為13.5 ng/mL至108.5 ng/mL(圖4A，平台1)。而HBS檢測抗體的ELISA呈現的LOQ值為1.7 ng/mL，線性範圍為1.7 至108.5 ng/mL(圖4B；平台2)。上述數據證實，使用前S2或HBS檢測抗體的LHBS三明治 ELISA系統能靈敏地檢測血清中的LHBS。 實施例3：利用三明治ELISA檢測不同HBV感染階段的LHBS
為了找出LHBS含量與 HBV感染階段的相關性，此實施例收集49例不同HBV感染階段的血清。
請參閱圖5，其係繪示根據本發明一實施例的LHBS化學冷光三明治ELISA系統檢測不同HBV感染階段的不同患者組的血清LHBS含量的長條圖。
圖5利用Kruskal Wallis檢定分析的結果指出，處於免疫耐受階段的組別，其特徵在於ALT正常但病毒力價高，可呈現出最高的LHBS含量。HBeAg(+)慢性HBV(CHB)帶原者則次之，呈現中等的病毒力價。而HBeAg(-) CHB、肝硬化及HCC組，通常呈現的病毒力價非常低，LHBS 的含量也顯著低於前兩組(p 值 0.002)(圖 5)。
此外，皮爾森(Pearson)相關性分析顯示，這些患者的LHBS含量與病毒DNA 力價相關(r = 0.36)。這些結果指出，血清LHBS含量是病毒感染階段的指標，可做為其有效的生物指標。
請參閱圖6A至圖6C，其說明根據本發明一實施例之HCC患者的腫瘤周圍與腫瘤區域中主要HBS及LHBS的表現量，其係利用IHC染色(圖6A及圖6B)及西方墨點法(圖6C)進行分析。圖6A顯示二個代表案例的IHC影像，其中圖6A的子圖a、子圖b、子圖e、子圖f、子圖i及子圖j顯示案例1的IHC結果，子圖c、子圖d、子圖g、子圖h、子圖k及子圖l顯示案例2的IHC結果。子圖a至子圖d顯示掃描視圖。子圖a及子圖c顯示，主要HBS表現在非腫瘤區中但不表現在腫瘤中，其中非腫瘤區域如毛玻璃狀肝細胞(ground-glass hepatocytes，GGH)叢聚所示。子圖b及子圖d顯示，大HBS(LHBS)在非腫瘤區及腫瘤區皆有表現中。子圖e至子圖h顯示非腫瘤肝臟中GGH的放大圖(對應於子圖a至子圖d的掃描視圖中的紅色箭頭所指的區域)。子圖i至子圖l顯示腫瘤的放大視圖(對應於子圖a至子圖d的黑色箭頭所指的區域)。圖6B顯示HCC案例(n = 12)中IHC結果的總結，分別顯示GGH第I型零星散布(scattered，Is)、第I型GGH叢聚(clustered，Ic)、第II型GGH (II)以及腫瘤區域(T)的陽性染色細胞的百分比(中位數 6 SEM)。對於主要HBS及LHBS而言，分別顯示辨識主要S區及前S1區的抗體之IHC結果。橫線表示每組數據的中位數。圖6C顯示HCC案例(n = 22)的腫瘤周圍及腫瘤區域中的LHBS西方墨點法。利用前S 基因晶片分析法分析及預先確定野生型(n = 10)及前S2突變體(n = 12)的案例。用野生型、前S1及前S2突變的HBS基因轉染人類293T細胞，以用於檢測單株抗體對HBS的專一性。圖6C的箭頭指的是p39/gp42 kDa的LHBS。β-肌動蛋白做為內部對照組。圖6A至圖6C的縮寫如下：C，控制組；Ic，第I型GGH叢聚；II，第II型GGH；Is，GGH 第I型零星散布；N，非腫瘤性的；T，腫瘤；WT，野生型。
請參閱圖7A及圖7B，其顯示根據本發明一實施例之HCC臨床同齡組中組織LHBs染色表現與無疾病存活期(DFS)及整體存活期(OS)相關的卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)分析結果。*P＜0.05。肝組織中高 LHBs表現與DFS惡化 (P=0.011) 及 OS (P=0.004)具有顯著相關。
請參閱圖8A及圖8B，其顯示根據本發明另一實施例之HCC臨床同齡組中利用ELISA檢測血清LHBS的表現與無疾病存活期(disease-free survival，DFS)及整體存活期(overall survival，OS)相關的卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)分析結果。*P＜0.05。血清中高LHBS表現也與DFS惡化(P=0.042)及OS(P=0.017)具有顯著相關。
臨床病理學指標、HBsAg表現及HBV血清圖譜對肝細胞癌患者之無疾病存活期的預後重要性係列於表1。單變量分析顯示，病毒負載量(P=0.043)、腫瘤大小(P=0.001)、血管侵襲(P=0.044)、AJCC分期(P=0.024)、血清LHBS（P=0.048）以及組織 LHBS 染色(P=0.014)是DFS惡化的顯著預測因子(表1)。多變量分析顯示，組織LHBS染色(P=0.022，HR=2.650，CI=1.154-6.087)及腫瘤大小(P=0.001，HR=3.979，CI=1.750-9.048)與DFS獨立相關(表1)。
表1、臨床病理學指標、HBsAg表現及HBV血清圖譜對肝細胞癌患者無疾病存活期的預後意義。
Figure 02_image001
表2、肝細胞癌患者之臨床病理指標、HBsAg表現及HBV血清圖譜但不包括LHBS染色對無疾病存活期的預後重要性。
Figure 02_image003
如表2所示，由於通過比較非侵入性的方法取得血清，因此在多變量分析中可利用血清LHBS檢測的效果進行評估，而不是組織LHBS染色。多變量分析顯示，血清LHBS (P=0.049，HR=2.267，CI=1.001-5.137)、腫瘤大小(P=0.001，HR=4.443，CI=1.907-10.353)以及血管侵入(P=0.021，HR=2.590，CI = 1.157-5.797)與DFS獨立相關(表2)。 實施例4：LHBS有潛力藉由CAR-T細胞或T細胞接合抗體進行標靶治療。
將此實施例產生的單株抗體的單鏈可變區片段(ScFv)基因選殖到CAR-T載體中，以構築表現前S1之ScFv的CAR-T質體。將前S1 ScFv之CAR-T構築體轉染至T細胞中。將LHBS(+)肝細胞與前S1之ScFv(+)T細胞混合後，利用流式細胞儀分析檢測，T細胞可辨識LHBS(+)肝細胞，結果如圖9所示。
請參閱圖9，其顯示根據本發明一實施例利用流式細胞分析技術以LHBS單株抗體辨識HBV(+)HepAD38活細胞之LHBS的分析結果。在圖9中，曲線901代表利用自體抗體(autologous antibodies)檢測的結果，曲線903代表利用二級抗體488 (Secondary ab 488，做為陰性對照組)檢測的結果，曲線905代表利用LHBS單株抗體(LHBS monoclonal antibody clone “7-21-5”)檢測的結果，曲線907代表利用LHBS單株抗體(LHBS monoclonal antibody clone “8-17-1”)檢測的結果，其中後二者均針對跨越胺基酸的LHBS前S1區第21至47個胺基酸的胜肽。FL1-H是指螢光強度。如圖9所示， LHBS抗體可與LHBS結合，代表LHBS突出於HBV(+)活肝細胞的外表面，T細胞可辨識LHBS(+)肝細胞。因此，LHBS有潛力作為CAR-T細胞治療方法的標的分子。
HCC是世界上致死率最高的癌症之一，及時抗病毒治療是預防HBV相關之HCC最重要的方法。至今，對於抗病毒治療效果而言，最常見的生物指標是病毒DNA力價，惟其檢測需要繁瑣的實驗過程，包括萃取DNA與即時PCR。在上述具體例中，可發現病毒LHBS與CHB帶原者的病毒複製活性為高度相關，在免疫耐受期的含量最高，在肝硬化及HCC中的含量最低。病毒LHBS更顯示出與 DNA 力價具有高度相關。上述開發一種靈敏且簡單的ELISA方法，藉由檢測LHBS做為血清中病毒力價的指標。此方法通過在ELISA系統搭配化學冷光受質，可以高靈敏度及定量測量LHBS。此方法測量的動態範圍達到約100倍，對於濃度範圍廣的樣品可提供可靠性的測量。
通過直接檢測血清中的蛋白質，上述體外定量LHBS的套組及免疫分析法比病毒DNA力價定量(titering)更具有時間及成本效益。因此，血清LHBS可做為抗病毒治療效果之早期有利的生物指標。例如，可提供用於非侵入性分析生物樣品中的HBV感染階段的生物指標組，其包括具有SEQ ID NO：1的第一多肽的第一生物指標、具有SEQ ID NO：2的第二多肽的第二生物指標及具有SEQ ID NO：3的第三多肽的第三生物指標。
綜上所述，以上僅以特定序列的核酸及胺基酸、特定的抗原、特定的患者群、特定的分析模型或特定評價方法為例，闡述體外定量LHBS及生物指標組的套組及免疫分析法，以非侵入性分析生物樣本中的HBV 感染階段。然而，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，體外定量LHBS的套組及免疫分析法中，亦可採用其他核酸及胺基酸序列、其他抗原、其他患者群、其他分析模式或其他評估方法，以用於非侵入式分析生物樣品中HBV感染階段的生物指標組，但不脫離本發明的精神及範圍，亦不受上述限制。例如，單株抗體可以針對不同的應用進行嵌合或人源化，藉此有益地提高檢測LHBS的靈敏度及動態廣度。在其他例示中，前述單株抗體組還可藉由偵測有需要的受試者之上述生物指標來預測、診斷或治療慢性肝病。
根據本發明的上述實施例，本發明的體外定量LHBS的套組及免疫分析法及生物指標組，包括分別對特定區域具有結合特異性的單株抗體，藉此以非侵入式分析生物樣品中HBV感染階段，從而提高檢測生物樣品中LHBS的靈敏度及動態範圍。本發明還提供了一種對應於LHBS特定區域的生物指標組，前述生物指標組可被單株抗體專一性辨識，以分析生物樣品中HBV的感染階段及肝癌預後。
雖然本發明已以數個特定實施例揭露如上，但可對前述揭露內容進行各種潤飾、各種更動及替換，而且應可理解的是，在不脫離本發明之精神範圍內，某些情況將採用本發明實施例之某些特徵但不對應使用其他特徵。贅言因此，本發明的精神和權利要求範圍不應限於以上例示實施例所述。
901,903,905,907:曲線
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下： [圖1]顯示根據本發明一實施例之大HBV表面(LHBS)、中HBV表面(MHBS)及HBV表面(HBS)蛋白的示意圖。 [圖2A]至[圖2C]說明根據本發明一實施例之抗LHBS不同區域的前S1單株抗體(圖2A)、前S2單株抗體(圖2B)及HBS單株抗體(圖2C)之結合親和力。 [圖2D]說明本發明一實施例之抗LHBS的前S1單株抗體、前S2單株抗體及HBS單株抗體之辨識區的示意圖。 [圖3A]至[圖3C]顯示根據本發明一實施例之抗個別重組蛋白的前S1單株抗體(圖3A)、前S2單株抗體(圖3B)及HBS單株抗體(圖3C)之偵測靈敏度及動態範圍的曲線圖。 [圖4A]至[圖4B]顯示根據本發明一實施例之利用前S2單株抗體(圖4A)或HBS單株抗體(圖4B)做為檢測抗體之LHBS化學螢光三明治ELISA系統在血清中的檢測靈敏度及動態範圍。 [圖5]顯示根據本發明一實施例之LHBS化學螢光三明治法ELISA系統檢測不同HBV感染階段的不同患者群之血清LHBS含量的柱狀圖。 [圖6A]至[圖6C]說明根據本發明一實施例之HCC患者的腫瘤周圍與腫瘤區域中主要HBS及LHBS的表現量，其係利用IHC染色(圖6A及圖6B)及西方墨點法(圖6C)進行分析。 [圖7A]及[圖7B]顯示根據本發明一實施例之HCC臨床同齡組(cohort)中組織LHBs染色表現與無疾病存活期(DFS)及整體存活期(OS)相關的卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)分析結果。 [圖8A]及[圖8B]顯示根據本發明另一實施例之HCC臨床同齡組中利用ELISA檢測血清LHBS的表現與無疾病存活期(disease-free survival，DFS)及整體存活期(overall survival，OS)相關的卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)分析結果。 [圖9]顯示根據本發明一實施例利用流式細胞分析技術以LHBS單株抗體辨識HBV(+)HepAD38活細胞之LHBS的分析結果。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011

Claims (13)

  1. 一種體外定量生物樣品之B型肝炎病毒大表面蛋白(LHBS)的套組，包含： 一阻斷溶液； 一單株抗體組，用於檢測該生物樣品中之一生物指標，其中該單株抗體組包括： 一第一單株抗體固定在一固體支持物上的複數個個別位置上並浸於該阻斷溶液中，其中該第一單株抗體對該生物樣品中如序列識別號(SEQ ID NO)：1所列之一第一多肽具有一結合特異性；以及 一第二單株抗體及一第三單株抗體之至少一者，其中該第二單株抗體及該第三單株抗體分別與一標記物連接，該第二單株抗體對該生物樣品中如SEQ ID NO：2所列的一第二多肽具有一結合特異性，該第三單株抗體對該生物樣品中如SEQ ID NO：3所列的一第三多肽具有一結合特異性；以及 一檢測試劑，其中該檢測試劑能與該標記物反應並形成一可檢測產物。
  2. 一種用於分析生物樣品中HBV感染階段及肝癌預後的生物指標組，包含： 具有SEQ ID NO：1之一第一多肽的一第一生物指標；以及 具有SEQ ID NO：2之一第二多肽的一第二生物指標及具有SEQ ID NO：3之一第三多肽的一第三生物指標的至少一者。
  3. 一種單株抗體組，藉由有需要的受試者之生物指標以預測、診斷或治療慢性肝病，包含： 一第一單株抗體或其第一抗原結合片段，用於專一性檢測一第一多肽，其中該第一單株抗體或其第一抗原結合片段包含由SEQ ID NOs：4至6組成的重鏈CDR1至CDR3序列以及由SEQ ID NOs：7至9組成的輕鏈CDR1至CDR3序列；以及 一第二單株抗體或其第二抗原結合片段以及一第三單株抗體或其第三抗原結合片段之至少一者，其中該第二單株抗體或其第二抗原結合片段用於專一性檢測一第二多肽，該第三單株抗體或其第三抗原結合片段用於專一性檢測一第三多肽， 其中該第二單株抗體或其第二抗原結合片段包含由SEQ ID NOs：10至12組成的重鏈CDR1至CDR3序列以及由SEQ ID NOs：13至15組成的輕鏈CDR1至CDR3序列；以及 其中該第三單株抗體或其第三抗原結合片段包含由SEQ ID NOs：16至18組成的重鏈CDR1至CDR3序列以及由SEQ ID NOs：19至21組成的輕鏈CDR1至CDR3序列。
  4. 如請求項3所述的單株抗體組，其中該慢性肝病係選自於由潛伏性HBV感染、肝硬化及肝細胞癌所組成之一族群。
  5. 如請求項3所述的單株抗體組，其中該生物指標包括具有SEQ ID NO：1的該第一多肽的一第一生物指標、具有SEQ ID NO：2的該第二多肽的一第二生物指標及具有SEQ ID NO：3的該第三多肽的一第三生物指標。
  6. 如請求項3所述的單株抗體組，其中該第一單株抗體或其第一抗原結合片段包含如SEQ ID NO：22所示的一重鏈序列以及如SEQ ID NO：23所示的一輕鏈序列。
  7. 如請求項3所述的單株抗體組，其中該第二單株抗體或其第二抗原結合片段包含如SEQ ID NO：24所示的一重鏈序列以及如SEQ ID NO：25所示的一輕鏈序列。
  8. 如請求項3所述的單株抗體組，其中該第三單株抗體或其第三抗原結合片段包含如SEQ ID NO：26所示的一重鏈序列以及如SEQ ID NO：27所示的一輕鏈序列。
  9. 如請求項6所述的單株抗體組，其中該第一單株抗體包含如SEQ ID NO：28所示序列編碼的一重鏈以及如SEQ ID NO：29所示序列編碼的一輕鏈。
  10. 如請求項7所述的單株抗體組，其中該第二單株抗體包含如SEQ ID NO：30所示序列編碼的一重鏈以及如SEQ ID NO：31所示序列編碼的一輕鏈。
  11. 如請求項8所述的單株抗體組，其中該第三單株抗體包含如SEQ ID NO：32所示序列編碼的一重鏈以及如SEQ ID NO：33所示序列編碼的一輕鏈。
  12. 如請求項3所述的單株抗體組，其中該第一單株抗體或其第一抗原結合片段、該第二單株抗體或其第二抗原結合片段、該第三單株抗體或其第三抗原結合片段是一工程化T細胞之一嵌合抗原受體(CAR)的一抗原結合結構域。
  13. 如請求項3所述的單株抗體組，其中該第一單株抗體或其第一抗原結合片段、該第二單株抗體或其第二抗原結合片段、該第三單株抗體或其第三抗原結合片段是HBS一抗體-藥物複合物(ADC)的一抗原結合結構域。
TW111124608A 2021-07-01 2022-06-30 體外定量b肝病毒大表面蛋白的套組，用於分析hbv感染階段及肝癌預後的生物指標組，以及用於預測、診斷或治療慢性肝病的單株抗體組 TW202303148A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163217300P 2021-07-01 2021-07-01
US63/217,300 2021-07-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202303148A true TW202303148A (zh) 2023-01-16

Family

ID=84739081

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW111124608A TW202303148A (zh) 2021-07-01 2022-06-30 體外定量b肝病毒大表面蛋白的套組，用於分析hbv感染階段及肝癌預後的生物指標組，以及用於預測、診斷或治療慢性肝病的單株抗體組

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230018242A1 (zh)
CN (1) CN115561456A (zh)
TW (1) TW202303148A (zh)

Also Published As

Publication number Publication date
US20230018242A1 (en) 2023-01-19
CN115561456A (zh) 2023-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11866785B2 (en) Tumor specific antibodies and T-cell receptors and methods of identifying the same
US6984494B2 (en) Analytical method
JP6713478B2 (ja) Ｐｉｖｋａ−ｉｉの測定方法、及びｐｉｖｋａ−ｉｉ免疫測定試薬又はキットの製造方法
EP3027652A1 (en) Anti-pla2r antibody and uses thereof
CN113248609B (zh) 针对再生胰岛衍生蛋白1α的抗体组合以及包含其的检测试剂盒
KR20180041467A (ko) 코어-푸코실화 알파-페토프로테인에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 면역 분석법
KR20110040624A (ko) 항-ｆａｓｎ 자가면역 항체를 포함하는 간암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 간암 진단용 조성물
CN111735946B (zh) 血清aldh1b1自身抗体定量检测试剂盒及其应用
WO2012165926A2 (ko) 항-ａｔｉｃ 자가면역항체를 포함하는 간암 진단 마커 및 이의 항원을 포함하는 간암 진단용 조성물
TW202303148A (zh) 體外定量b肝病毒大表面蛋白的套組，用於分析hbv感染階段及肝癌預後的生物指標組，以及用於預測、診斷或治療慢性肝病的單株抗體組
CN111303289B (zh) 抗人Tn型糖基化MUC1抗体及其用途
JP5856956B2 (ja) 血液検査方法
CN110818797A (zh) 一种抗人ca153蛋白的重组抗体
JP7315965B2 (ja) ウィルス性肝癌の検出方法
WO2012102126A1 (ja) 抗il28b抗体及びこれを用いたil28bの測定方法
EP4189396A1 (en) Improved epitope for detecting and/or quantifying autoantibodies against alpha-fetoprotein
JP5492158B2 (ja) ヒトｔｓｈ及び犬ｔｓｈに対する抗体
JP5782690B2 (ja) 抗ｎｐ−ｈ２８９抗体の作製方法
US20120009596A1 (en) Protein markers for detecting liver cancer and method for identifying the markers thereof
KR102131860B1 (ko) 아르기닌이 메틸화된 ggt1에 특이적으로 결합하는 대장암 진단용 바이오마커 조성물
CN117050174B (zh) 针对再生胰岛衍生蛋白3a的抗体组合以及包含其的检测试剂盒
KR102128251B1 (ko) 아르기닌이 메틸화된 drd2에 특이적으로 결합하는 대장암 진단용 바이오마커 조성물
JP4856381B2 (ja) ヒトオロト酸ホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の測定法
CN116008555A (zh) 一种检测单克隆抗体对rankl结合力的方法及其应用
JP2023509181A (ja) ＥＢウイルスＢＮＬＦ２ｂ遺伝子によりコードされるポリペプチド及び検出におけるその使用