JP2023503347A - 抗黄熱病ウイルス抗体、ならびにそれらの生成および使用の方法 - Google Patents

抗黄熱病ウイルス抗体、ならびにそれらの生成および使用の方法 Download PDF

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Abstract

ＹＦＶ Ｅタンパク質に特異的であり、ＹＦＶに対して中和能力を有する抗体およびその抗原結合断片が提供される。これらの抗体および抗原結合断片は、ＹＦＶを治療することに有用である。【選択図】図１ａ

Description

関連出願の相互参照
この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１１月２５日に出願された米国仮出願第６２／９４０，０４９号の優先権を主張する。
ＡＮ ＡＳＣＩＩファイルとして提出された「配列表」、表、またはコンピュータプログラムリスト付属書類の参照
２０２０年１１月２４日に作成された、４９３，２４１バイト、マシンフォーマットＩＢＭ－ＰＣ、ＭＳ ＷｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムのファイルＭＡＢ－５０１００１ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記載された配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、抗黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）抗体およびその抗原結合断片、ならびにそのような抗体およびその抗原結合断片を含有する組成物、ならびに抗体、抗原結合断片、および組成物のための治療的および診断的使用に関する。
黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）は、アフリカおよび南アメリカの熱帯および亜熱帯地域で見出される蚊媒介性フラビウイルスである。それは、主に、感染したＡｅｄｅｓまたはＨａｅｍａｇｏｇｕｓ蚊種の刺咬を通して人間に伝染し、３つの明確に異なる伝染サイクル、すなわち、１）ジャングルまたは森林サイクル、２）アフリカのサバンナ（中間）サイクル、および３）都市サイクルを有する。（ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｙｅｌｌｏｗｆｅｖｅｒ／ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）。ＹＦＶに感染した多くの人々は無症候であるが、他の人々は、３～６日間のインキュベーション期間に続いて、発熱、悪寒、頭痛、腰痛、筋肉痛、食欲不振、吐き気、嘔吐、および／または倦怠感などの症状を発症する。（ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｎｅｗｓ－ｒｏｏｍ／ｆａｃｔ－ｓｈｅｅｔｓ／ｄｅｔａｉｌ／ｙｅｌｌｏｗ－ｆｅｖｅｒ）。感染者の約１５％が、高熱、出血性素因、腹痛、腎不全、心臓血管の不安定性、および肝不全を含む、重症型のＹＦＶを発症し、重症型のＹＦＶがある患者の最大５０％が、死亡するであろう。（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｈｏｓｐｉｔａｌｉｓｔ ２０１７，７（４）；１５７－１５８）。
ＹＦＶは、３つの構造タンパク質および７つの非構造タンパク質をコードする、１０，８６２個のヌクレオチドのＲＮＡゲノムを有する。５’末端から、コードされたタンパク質の順序は、Ｃ、ｐｒＭ／Ｍ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５である。３つの構造タンパク質には、Ｃ（キャプシド）タンパク質、膜タンパク質Ｍ、およびエンベロープタンパク質Ｅが含まれる。エンベロープタンパク質は、細胞指向性、病原性、および免疫において重要な役割を果たす。
弱毒生１７Ｄワクチンは、これまでに開発された中で最も安全かつ最も効果的なワクチンの１つと見なされている。しかしながら、ワクチンの可用性にもかかわらず、黄熱病は、深刻な公衆衛生問題のままである。保護的であるが、免疫が特定の集団では経時的に減弱し得ることを示唆する、あるデータが存在する。加えて、風土病のない国でのＹＦＶの発生（２０１６年の中国での１１件の輸入症例など）および１７Ｄの備蓄を使い果たす同時発生が、治療を開発することの重要性を強調している。
実際、今日まで、現在、承認されたＹＦＶ治療はなく（唯一の過程は支持療法である）、何十年もの研究にもかかわらず、ＹＦＶに対する安全かつ効果的な治療用抗体の開発は、達成困難なままとなっている。ＹＦＶ Ｅ特異的血清抗体応答は、Ｅタンパク質のドメインＩ（ＤＩ）および／またはドメインＩＩ（ＤＩＩ）を標的とする抗体によって圧倒的に媒介されることが示されている一方で、ドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）を標的とする抗体は、存在しないか、または非常に低い力価において存在する（ＤＶｒａｔｓｋｉｋｈ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ９，ｅ１００３４５８（２０１３））。対応して、今日まで記載された６つのＹＦＶ Ｅ特異的ヒトモノクローナル抗体はすべて、Ｅタンパク質のＤＩＩ内の重複するエピトープを標的とする（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２６，４３８－４４６ ｅ４３５（２０１９）、Ｄａｆｆｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３７，２６２－２７２（２００５））。近年、可溶性ＹＦＶ Ｅ二量体と複合したこれらのｍＡｂ（５Ａ）のうちの１つの結晶構造が決定され、このｍＡｂが１つのＥモノマーのＤＩＩ内の保存された中和エピトープに結合することを示した（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２６，４３８－４４６ ｅ４３５（２０１９））。したがって、非常に特異的で高親和性の非常に強力な中和抗ＹＦＶ抗体およびその抗原結合断片の必要性が残っている。
本開示は、ＹＦＶタンパク質に結合し、中和能力を示す抗体およびその抗原結合断片、特に、高い中和能力を示すＥタンパク質のドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）に結合する抗体の発見に関する。本開示の抗体はまた、他のフラビウイルスと交差反応し、例えば、ＤＥＮＶ－２、ＤＥＮＶ－４、ＷＮＶ、および／またはＺＩＫＶ Ｅタンパク質に対する結合反応性を示し得る。ＹＦＶ特異的モノクローナル抗体の広範なパネルが記載される。結合研究は、ＹＦＶ－１７Ｄに対する中和抗体応答が、主にＹＦＶ Ｅタンパク質のＤＩＩ内のＦＬ近位エピトープを認識する抗体によって媒介されることを実証した。強力な中和活性を有するＤＩＩＩ標的抗体のわずかなセットも同定された。加えて、結合アッセイは、ＹＦＶ－１７Ｄワクチン接種が広いフラビウイルス結合活性を示す抗体のサブセットを誘導するように思われ、その大部分が高度に保存されたＦＬを標的とし、交差中和活性をほとんどまたは全く示さないことを明らかにした。中和研究は、ある割合の抗体が非常に強力な中和活性を示すことを示した。全体として、本明細書に記載の抗体のパネルは、有望な治療候補およびＹＦＶワクチンの合理的設計のための枠組みを提供する。
そのような抗体は、ＹＦＶによる一次感染の重症度もしくは持続期間を軽減するか、または感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を改善するために、予防的に（ウイルスへの曝露およびウイルスによる感染の前に）投与されたときに有用であり得る。抗体は、単独で、またはＹＦＶ感染症を治療するために有用な第２の薬剤と併せて使用され得る。特定の実施形態では、抗体は、一次感染の重症度もしくは持続期間を軽減するために、または感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を改善するために、単独で、または第２の薬剤と併せてのいずれかで、治療的に（ウイルスへの曝露および感染後に）与えられ得る。特定の実施形態では、抗体は、上記に記載される患者などのＹＦＶによる感染症にかかるリスクがある患者を保護するために、独立型治療として予防的に使用され得る。これらの患者集団のうちのいずれも、単独で、または例えば、抗ウイルス療法、もしくは他の抗ウイルスワクチンを含む、第２の薬剤と併せて与えられたときに、本開示の抗体を用いた治療から利益を享受し得る。
特定の実施形態では、ＹＦＶに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片が提供され、そのような抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つは、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２から選択された抗体の表３に開示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／またはＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、ならびに／もしくはその間のすべての同一性率である。
抗体またはその抗原結合断片はまた、以下の特性：ａ）抗体またはその抗原結合断片は、クリーンまたは低多反応性プロファイルを示す、ｂ）抗体またはその抗原結合断片は、約０．５マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）～約５μｇ／ｍｌ、約０．０５μｇ／ｍｌ～約０．５μｇ／ｍｌ、または約０．０５ｍｇ／ｍｌ未満のインビトロ中和能力（ＩＣ５０）を示す、ｃ）抗体またはその抗原結合断片は、ＹＦＶ－１７Ｄ粒子に結合す、もしくはｄ）抗体またはその抗原結合断片は、ＹＦＶのエンベロープタンパク質に結合する、のうちの１つ以上も有し得る。特定の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、上記の特性ａ）～ｄ）のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つを含む。
特定の他の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、ａ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ｂ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ２アミノ酸配列、ｃ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ３アミノ酸配列、ｄ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ｅ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ２アミノ酸配列、ｆ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ３アミノ酸配列、および／またはｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ならびにｆ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせを含む。
特定の他の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちの少なくとも１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、および／またはその間のすべての同一性率である抗体からなる群から選択される。
特定の他の実施形態では、単離された抗体またはその抗原結合断片は、ａ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つの重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、および／またはｂ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つの軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む。
本開示はまた、記載された抗ＹＦＶ抗体をコードする核酸および該核酸を含む発現ベクター、ならびに核酸および／または発現ベクターを介してそのような抗体を発現する宿主細胞も企図する。
一実施形態では、本明細書に開示される抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離された核酸配列が提供される。
他の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片をコードする、単離された核酸配列を含む、発現ベクターが提供される。
他の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片をコードする核酸配列、もしくは本明細書に開示される抗体または抗原結合断片をコードする単離された核酸配列を含む発現ベクターでトランスフェクト、形質転換、または形質導入された宿主細胞が提供される。
他の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体またはその抗原結合断片のうちの１つ以上と、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。
他の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片をコードする１つ以上の核酸配列、もしくは本明細書に開示される抗体または抗原結合断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の発現ベクターと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。
他の実施形態では、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片をコードする核酸配列を含む発現ベクター、もしくは本明細書に開示される抗体または抗原結合断片をコードする核酸配列を含む宿主細胞が提供される。
本開示はさらに、記載された抗ＹＦＶ抗体（またはコードする核酸もしくはそのような核酸を含む発現ベクター）を使用する予防および／または治療の方法を企図する。
一実施形態では、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症が治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状が治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減されるように、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に、ａ）本明細書に開示される他の実施形態による、１つ以上の抗体またはその抗原結合断片、ｂ）本明細書に開示される１つ以上の抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上の核酸配列、本明細書に開示される抗体または抗原結合断片をコードする核酸配列を含む、発現ベクター、もしくは本明細書に開示される抗体または抗原結合断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む、宿主細胞、またはｃ）本明細書に開示される他の実施形態による、医薬組成物を投与することを含む、ＹＦＶ感染症またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する方法が提供される。
他の実施形態では、方法は、患者に第２の治療薬を投与することをさらに含む。
実施形態では、第２の治療薬は、抗ウイルス薬、ＹＦＶに特異的なワクチン、フラビウイルスに特異的なワクチン、ＹＦＶ抗原に特異的なｓｉＲＮＡ、およびＹＦＶ抗原に特異的な二次抗体から選択される。
特定の実施形態では、予防を必要とするか、もしくは予防を必要とする疑いのある患者においてＹＦＶ感染症を予防する際に使用するため、またはＹＦＶ感染症に罹患している患者を治療するため、または感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症を改善するための医薬組成物が提供され、そのような使用の結果として、感染症が予防されるか、または感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症が、予防されるか、改善されるか、もしくは重症度および／もしくは持続期間を軽減されるかのいずれかである。特定の実施形態では、予防を必要とするか、または予防を必要とする疑いのある患者においてＹＦＶ感染症を予防する際に使用するための医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、ＹＦＶ感染症に罹患している患者を治療する際に使用するための医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状または合併症を改善する際に使用するための医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、感染症は、予防される。特定の実施形態では、感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状または合併症は、そのような使用の結果として、予防されるか、改善されるか、または重症度および／もしくは持続期間を軽減される。
特定の実施形態では、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者においてＹＦＶ感染症、または該ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する際に使用するための医薬組成物が提供され、そのような使用の結果として、感染症が予防されるか、または感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症が、予防されるか、改善されるか、もしくは重症度および／もしくは持続期間を軽減されるかのいずれかである。
特定の他の実施形態では、予防を必要とする患者においてＹＦＶ感染症を予防するため、またはＹＦＶ感染症に罹患している患者を治療するため、または感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症を改善するための薬剤の製造における医薬組成物の使用が提供され、感染症が予防されるか、または感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症が、予防されるか、改善されるか、もしくは重症度および／もしくは持続期間を軽減されるかのいずれかである。
特定の他の実施形態では、予防を必要とするか、または予防を必要とする疑いのある患者においてＹＦＶ感染症、または該ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を予防するための薬剤の製造における医薬組成物の使用が提供され、そのような使用の結果として、感染症が予防されるか、または感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症が、予防されるか、改善されるか、もしくは重症度および／もしくは持続期間を軽減されるかのいずれかである。
特定の他の実施形態では、ＹＦＶ Ｅタンパク質に結合する抗体が提供される。この抗体は、ＹＦＶ Ｅタンパク質のドメインＩＩのＦＬ内のエピトープ、ＹＦＶ Ｅタンパク質のドメインＩＩのＦＬの近位、およびＹＦＶのドメインＩＩＩ内のタンパク質のうちの少なくとも１つに結合することができる。この抗体はまた、以下の特性：ａ）抗体またはその抗原結合断片は、クリーンまたは低多反応性プロファイルを示す、ｂ）抗体またはその抗原結合断片は、約０．５マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）～約５μｇ／ｍｌ、約０．０５μｇ／ｍｌ～約０．５μｇ／ｍｌ、または約０．０５ｍｇ／ｍｌ未満のインビトロ中和能力（ＩＣ５０）を示す、ｃ）抗体またはその抗原結合断片は、ＹＦＶ－１７Ｄ粒子に結合する、およびｄ）抗体またはその抗原結合断片は、ＹＦＶのエンベロープタンパク質に結合する、のうちの１つ以上を有することもできる。
ＹＶＦ－１４Ｄワクチン接種に続くドナー血清分析を図示する。図１ａ：－５日目（ワクチン接種前）、ワクチン接種後１０、１４、２８、９０、１８０、２７０、および３６０日目におけるＹＦＶ－１７Ｄに対する血清中和活性。２つの独立した実験からの平均±ＳＤ（ｎ＝６）が示される。図１ｂ：相互血清希釈として表される、ワクチン接種後の各時点における血清サンプルの中和ＩＣ５０。 １０日目および１４日目におけるＹＦＶ－１７Ｄワクチン接種誘導型形質芽細胞応答の特性評価を示す。図２ａ：ワクチン接種後０、１０、および１４日目における末梢血中のＣＤ１９＋ＣＤ２０－／ｌｏ Ｂ細胞間の形質芽細胞の頻度。形質芽細胞は、本明細書では、ＣＤ１９＋ＣＤ３－ＣＤ８－ＣＤ１４－ＣＤ１６－ＣＤ２０－／ｌｏＣＤ３８ｈｉＣＤ２７ｈｉ細胞として定義される。図２ｂ：１００ｎＭにおけるＹＦＶ－１７Ｄ粒子全体に対するＥＬＩＳＡ結合反応性を示したＰＢ由来ｍＡｂの割合。図２ｃ：１００ｎＭおよび１０ｎＭ濃度におけるＹＦＶ－１７Ｄに対するＰＢ由来ｍＡｂの中和活性。緑色のドットは、ＶＨ＋ＶＬにおけるヌクレオチド置換の数を示す。図２ｄ：示された中和能力（ＩＣ５０）を伴うＹＦＶ－１７Ｄ反応性ＰＢ由来ｍＡｂの割合。 生殖細胞系列に戻された形質芽細胞モノクローナル抗体の結合活性を図示する。Ｂｉａｃｏｒｅによって決定されるような３つの体細胞変異したＰＢ由来ｍＡｂ（ＡＤＩ－４６１８４、ＡＤＩ－４６１８５、およびＡＤＩ－４２１６８）ならびにそれらの対応するＵＣＡの結合トレースおよび親和性。ＵＣＡは、未変異共通祖先である。 ＰＢ由来ｍＡｂの中和スクリーニングを示す。マイクロタイター中和アッセイによってスクリーニングされたＰＢ ｍＡｂの代表的なＹＦＶ－１７Ｄ中和滴定曲線。２つの独立した実験からの平均±ＳＤ（ｎ＝６）が示される。 ＹＦＶ－１７Ｄに対する反応性を示すｓｗＩｇ＋Ｂ細胞の存在を示す。図５ａ：各サンプリング時点におけるｓｗＩｇ＋Ｂ細胞のＹＦＶ Ｅ反応性。示される蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）プロットは、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＩｇＤ－ＩｇＭ－ Ｂ細胞上でゲートされる。ＹＦＶ Ｅは、背景の結合を低減するために２つの異なる色で標識された。図５ｂ：ＹＦＶ Ｅ反応性を示す各サンプリング時点におけるｓｗＩｇ＋Ｂ細胞の割合。 ＹＦＶ Ｅ特異的抗体がＶＨ３－７２生殖細胞系列遺伝子の優先的な使用を示すことを図示する。図６ａ：各サンプリング時点から単離されたＹＦＶ Ｅ特異的ｍＡｂのＶＨ生殖細胞系列遺伝子の使用。未選択ヒトＭＢＣレパートリー（「未選択」）のＶＨ生殖細胞系列遺伝子頻度もまた、比較のために含まれる。未選択ヒトＭＢＣのための配列決定データが、複数の高スループット配列決定研究から取得された。図６ｂ：ＶＨ３－７２生殖細胞系列遺伝子を利用するｍＡｂのＶＬ生殖細胞系列遺伝子の使用。すべてのサンプリング時点からのＭＡｂが、この分析のためにプールされた。円グラフの中央にある数字は、ＶＨ３－７２ ｍＡｂの総数を表す。図６ｃ：ＶＨ３－７２生殖細胞系列遺伝子を利用するＹＦＶ Ｅ特異的ｍＡｂ、すべての他のＶＨ生殖細胞系列遺伝子を利用するｍＡｂ、またはＭＢＣからの未選択ＡｂにおけるＣＤＲ Ｈ３の長さ分布。図６ｄ：ＶＨ３－７２生殖細胞系列遺伝子またはすべての他のＶＨ生殖細胞系列遺伝子を利用するＹＦＶ Ｅ特異的ｍＡｂのＳＨＭ負荷（ＶＨにおけるヌクレオチド置換の数として表される）。図６ｅ：ＢＬＩによって決定されるようなＶＨ３－７２生殖細胞系列遺伝子またはすべての他のＶＨ生殖細胞系列遺伝子を利用するｍＡｂのＹＦＶ Ｅタンパク質への見かけの結合親和性。黒色のバーは、中央値を示す。親和ＫＤＡｐｐは、これらのｍＡｂのごく一部のみが一価の配向でＹＦＶ Ｅへの検出可能な結合を示したため、１４日目のＭＢＣから単離されたｍＡｂについてプロットされる。統計的比較が、マンホイットニー検定を使用して行われた（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）。 ＦＬ内またはＦＬの近位のエピトープを標的とする抗体が、ＹＦＶ－１７Ｄワクチン接種に対するメモリーＢ細胞応答を支配することを図示する。図７ａ：各サンプリング時点における主要な競合群のそれぞれの中のｍＡｂの割合。図７ｂ：ｍＡｂを利用するＶＨ３－７２が、競合群に従って陰影を付けられ、自然に対になった軽鎖生殖細胞系列遺伝子が示される。図７ｃ：４Ｇ２と競合し、ＶＨ３－７２生殖細胞系列遺伝子を使用するｍＡｂの割合。図７ｄ：ＶＨ３－７２生殖細胞系列遺伝子またはすべての他の生殖細胞系列遺伝子のいずれかを使用する４Ｇ２競合ｍＡｂの見かけの親和性。統計的比較が、マンホイットニー検定を使用して行われた（＊＊Ｐ＜０．０１）。 非常に強力な中和抗体の大部分がＦＬ近位エピトープを認識することを図示する。図８ａ：各エピトープビン非中和－非結合におけるＹＦＶ－１７Ｄに対する中和ＩＣ５０（１未満、１～１０、１０～１００を超える、１００ｎＭを超える）を伴うｍＡｂの割合。図８ｂ：示されたエピトープビン全体にわたるＹＦＶ－１７Ｄに対する個々のｍＡｂの中和ＩＣ５０。黒いバーは、中央値を示す。図８ｃ：ＹＦＶ Ｅ上の示された抗原部位を標的とする非常に強力な中和抗体（ＩＣ５０＜１ｎＭ）の割合。円グラフの中央にある数字は、非常に強力な中和抗体の数を示す。図８ｄ：５Ａのみまたは５Ａ／ＡＤＩ－４５１０７競合中和抗体のＶＨおよびＶＬ生殖細胞系列遺伝子の使用。両方のドナーからのＭＡｂが、示されるすべての分析のために組み合わせられた。 モノクローナル抗体のサブセットが広いフラビウイルス交差反応性を示すことを示す。図９ａ：検査されたフラビウイルスＥタンパク質（ＹＦＶ、ＤＥＮＶ－１、ＤＥＮＶ－２、ＺＩＫＶ、およびＷＮＶ）のうちの１つ以上と反応するｍＡｂの割合。組換えＥタンパク質結合が、ＢＬＩによって親和指向で測定された。円グラフの中央にある数字は、分析されたｍＡｂの数を示す。図９ｂ：示された抗原部位を認識する交差反応性ｍＡｂの割合。両方のドナーからの交差反応性ｍＡｂが、この分析のために組み合わせられた。図９ｃ：ＹＦＶ Ｅ以外の少なくとも１つのフラビウイルスＥタンパク質への結合を示した５０個のｍＡｂの交差反応性プロファイルを示すヒートマップ。見かけの親和性（ＫＤＡｐｐ）が、ＢＬＩを使用して親和指向で決定された。ＹＦＶ－１７ＤおよびＺＩＫＶに対するウイルス中和活性を示すヒートマップが、結合ヒートマップの下方に示される。個々のｍＡｂのための競合群の割り当てが、ヒートマップの上部に示される。Ｎ．Ｂ．は、非結合であり、ｎ．ｎ．は、非中和であり、ｎｅｕｔ．は、中和である。
ＹＦＶ感染症に対するヒト抗体応答の深い理解は、ＹＦＶ感染症の治療および／または予防のためのＹＦＶワクチンならびに治療的および／または予防的抗体の開発および評価を支援するであろう。高スループット抗体分離プラットフォームが、２人のワクチン接種を受けた成人ドナーにおけるＹＦＶに対するヒトメモリーＢ細胞応答を詳細に分析するために使用され、非常に強力で選択的なＹＦＶ中和抗体が、単離および特性評価された。
高スループットエピトープマッピング研究は、ＹＦＶ Ｅタンパク質のＤＩＩ上のＦＬ内またはＦＬの近位のエピトープが免疫優勢であることを明らかにした。ＦＬ特異的エピトープに結合したｍＡｂの多くは非中和性であったが、５Ａエピトープと重複するＦＬ近位エピトープを標的としたｍＡｂのほとんどは、中和活性を示した。さらに、強力なｎＡｂの大部分は、この抗原部位を認識し、ＹＦＶ－１７Ｄワクチン接種によって誘導されたｎＡｂ応答が、主にこのクラスのＡｂによって媒介されることを示唆した。これらのｍＡｂのサブセットは、前述のＹＦＶ ｍＡｂよりも約１０倍低いＩＣ５０を伴って、並外れて強力な中和活性を示した。ＹＦＶ－１７Ｄワクチンの供給不足およびＹＦＶ疾患のための効果的な治療の欠如と相まって、ブラジルおよびコンゴ民主共和国での最近のＹＦＶの発生を考慮すると、これらのｍＡｂは、予防および／または治療法のための有望な候補を表す。
したがって、本明細書に開示されるものは、ＹＦＶ感染症の治療および／または予防のための高度に選択的かつ強力な抗ＹＦＶ抗体、ならびに可能性のあるワクチン候補である。加えて、ここで開示される試薬は、臨床試験の評価のための有用なツールのセットを提供し、これは、現在調査中のものから最適なＹＦＶワクチン接種または抗体ベースの治療方略を選択するために重要であろう。
別様に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書および以下の特許請求の範囲では、以下の意味を有するように定義されるべきである多くの用語が参照される。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。
「任意の」または「任意に」とは、その次に記載される事象または状況が発生する可能性があるか、または発生しない可能性があり、この記載が、その事象または状況が発生する場合および発生しない場合を含むことを意味する。
「約」という用語は、数値表示、例えば、範囲を含む温度、時間、量、濃度、およびそのような他のもの前に使用される場合、（＋）または（－）１０％、５％、１％、またはそれらの間の任意の部分範囲もしくは部分値だけ変動し得る近似値を示す。好ましくは、「約」という用語は、量に関して使用される場合、その量が＋／－１０％変動し得ることを意味する。
「含むこと」または「含む」とは、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図している。「から本質的になる」とは、組成物および方法を定義するために使用される場合、述べられた目的のために、組み合わせにとっていかなる本質的に重要な他の要素も除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、請求された発明の基本的および新規の特性に実質的に影響を及ぼさない他の材料またはステップを除外しないであろう。「からなる」とは、他の成分の微量以上の要素および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
「ＹＦＶ」とも呼ばれる、「黄熱病ウイルス」は、典型的には、感染したＡｅｄｅｓまたはＨａｅｍａｇｏｇｕｓ種の蚊の刺咬によって広がるＲＮＡウイルスである。
「ＹＦＶ－１７Ｄ」という用語は、ニワトリおよびマウス組織内の野生型Ａｓｉｂｉ株を継代することによって開発された弱毒化ＹＦＶワクチン株を指す。現在生産されている３つの１７Ｄ亜株、すなわち、ブラジルで製造された１７ＤＤ、ロシアで製造された１７Ｄ－２１３、ならびに中国、フランス、セネガル、および米国で製造された１７Ｄ－２０４がある。弱毒化の機構はほとんど理解されていないが、１７Ｄワクチンウイルスの限定された遺伝的多様性は、ワクチンの弱毒化および安全性に起因すると仮定されている。１７Ｄの複製は、野生型ＲＮＡウイルスほどエラーを起こしやすくないという証拠がある。Ｐｕｇａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７８（２）：１０３２－８（２００４）を参照されたい。
「エンベロープタンパク質」または「Ｅタンパク質」という用語は、受容体結合および膜融合において中心的な役割を果たす一次免疫原である、構造ＹＦＶタンパク質を指す。Ｅタンパク質細胞外ドメイン（３９５個の残基からなる可溶性Ｎ末端部分）の構造は、ドメインＩ、ＩＩ、およびＩＩＩと称される３つの明確に異なる構造ドメインを含む。（Ｖｏｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００９，３９４（１）：１２－１８）。ドメインＩＩは、高度に保存された融合ループ（ＦＬ）として機能するＳ－Ｓブリッジ安定化ループをその遠位端に含有する。ウイルスが標的宿主細胞に侵入すると、ドメインＩＩのＦＬが露出され、宿主細胞膜の中に挿入される。（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１７，９（１１）：３３８）。いくつかの実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、ドメインＩＩ ＹＦＶ Ｅタンパク質のＦＬに結合する。他の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、ＹＦＶ Ｅタンパク質のドメインＩＩＩに結合する。
効果的なＹＦＶ治療法の開発は、いくつかの独自の課題を提示してきた。ここで実施されるＹＦＶワクチンに対するヒト抗体応答の詳細な分析は、そのような療法的治療の開発のための洞察を提供する。本明細書に開示される抗体レパートリー分析は、中和ＹＦＶ特異的抗体の大部分が、５Ａエピトープと重複するＦＬ近位エピトープを標的とする一方で、少数の強力な中和抗体が、これまで任意の効果的な抗ＹＦＶ抗体のためのエピトープではなかったＥタンパク質の領域である、ＤＩＩＩドメインを標的としたことを明らかにする。
「エピトープ」という用語は、パラトープとして公知である抗体分子の可変領域内の具体的な抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。単一の抗原は、１つより多くのエピトープを有し得る。したがって、異なる抗体は、抗原上の異なる領域に結合し得、異なる生物学的効果を有し得る。「エピトープ」という用語はまた、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位も指す。それはまた、抗体によって結合される抗原の領域も指す。エピトープは、構造的または機能的として定義され得る。機能的エピトープは、一般に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、立体配座であり、すなわち、非線形アミノ酸から構成され得る。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的活性表面群である決定基を含み得、特定の実施形態では、具体的な三次元構造特性および／または具体的な電荷特性を有し得る。本明細書で使用される場合の「抗体」（または「Ａｂ」）という用語は、４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖から構成される免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を指すことを意図している。
本明細書で使用される場合の「抗原結合部分」、「抗原結合断片」という用語、および同等物は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在する、酵素的に取得可能な、合成、もしくは遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。特定の実施形態では、本明細書で使用される場合の「抗原結合部分」または「抗体断片」という用語は、ＹＦＶに結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。
抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ｄＡｂ断片、ＣＤＲを含有する断片、または単離されたＣＤＲを含み得る。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質分解、または抗体可変および（任意に）定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現を伴う組換え遺伝子工学技法などの任意の好適な標準技法を使用して、完全抗体分子に由来し得る。そのようなＤＮＡは、公知であり、および／または、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、もしくは合成されることができる。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変および／または定常ドメインを好適な構成に配列するために、またはコドンを導入する、システイン残基を作成する、アミノ酸を修飾、添加、もしくは削除するなどのために、化学的に、または分子生物学技法を使用することによって、配列決定および操作され得る。
抗原結合断片の非限定的な例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）Ｆｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片、（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（ｖｉ）ｄＡｂ断片、および（ｖｉｉ）抗体の超可変領域（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））または拘束されたＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドを模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位が含まれる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小型モジュール式分子免疫薬（ＳＭＩＰ）、およびサメ可変ＩｇＮＡＲドメインなどの他の遺伝子操作された分子もまた、本明細書で使用される場合の「抗原結合断片」という表現内に包含される。
抗体の抗原結合断片は、典型的には、少なくとも１つの可変ドメインを含むであろう。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であり得、一般に、１つ以上のフレームワーク配列に隣接するか、またはそれとともにフレーム内にある、少なくとも１つのＣＤＲを含むであろう。ＶＬドメインと関連付けられたＶＨドメインを有する抗原結合断片では、ＶＨおよびＶＬドメインは、任意の適切な配列で相互に対して配置され得る。例えば、可変領域は、二量体であり、ＶＨ－ＶＨ、ＶＨ－ＶＬ、またはＶＬ－ＶＬ二量体を含有し得る。代替として、抗体の抗原結合断片は、単量体ＶＨまたはＶＬドメインを含有し得る。
特定の実施形態では、抗体の抗原結合断片は、少なくとも１つの定常ドメインに共有結合された少なくとも１つの可変ドメインを含有し得る。本開示の抗体の抗原結合断片内で見出され得る可変および定常ドメインの非限定的で例示的な構成には、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１、（ｉｉ）ＶＨ－ＣＨ２、（ｉｉｉ）ＶＨ－ＣＨ３、（ｉｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２、（Ｖ）ＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉ）ＶＨ－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｖｉｉ）ＶＨ－ＣＬ、（ｖｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１、（ｉｘ）ＶＬ－ＣＨ２、（ｘ）ＶＬ－ＣＨ３、（ｘｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２、（ｘｉｉ）ＶＬ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３、（ｘｉｉｉ）ＶＬ－ＣＨ２－ＣＨ３、および（ｘｉｖ）ＶＬ－ＣＬが含まれる。上記に列挙される例示的な構成のうちのいずれかを含む、可変および定常ドメインの任意の構成では、可変および定常ドメインは、相互に直接連結され得るか、または完全もしくは部分的ヒンジまたはリンカー領域によって連結され得るかのいずれかである。ヒンジ領域は、少なくとも２つ（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０個以上）のアミノ酸からなり得、これは、単一のポリペプチド分子内の隣接する可変ドメインおよび／または定常ドメイン間の柔軟または半柔軟結合をもたらす。さらに、本開示の抗体の抗原結合断片は、（例えば、ジスルフィド結合によって）相互と、および／または１つ以上の単量体ＶＨもしくはＶＬドメインと共有結合している、上記に列挙される可変および定常ドメイン構成のうちのいずれかのホモ二量体またはヘテロ二量体（もしくは他の多量体）を含み得る。
完全抗体分子と同様に、抗原結合断片は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）であり得る。抗体の多重特異性抗原結合断片は、典型的には、少なくとも２つの異なる可変ドメインを含み、各可変ドメインは、別個の抗原に、または同じ抗原上の異なるエピトープに特異的に結合することが可能である。本明細書に開示される例示的な二重特異性抗体形式を含む、任意の多重特異性抗体形式は、当技術分野で利用可能である日常的な技法を使用して、本開示の抗体の抗原結合断片との関連で使用するために適合され得る。
各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「ＶＨ」）および重鎖定常領域（ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」または「ＶＬ」）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化されることができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端まで配列される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される。本開示の特定の実施形態では、抗体（またはその抗原結合断片）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、または自然もしくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。したがって、重鎖内のＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、および「ＣＤＲＨ３」と指定され、軽鎖内のＣＤＲは、「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、および「ＣＤＲＬ３」と指定される。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｔを有するコンセンサスモチーフを含む、ＣＤＲＬ３結合ドメインを含有する。Ｘ１は、Ｙ、Ｆ、またはＡであり、Ｘ２は、Ｎ、Ｈ、またはＹであり、Ｘ３は、Ｒ、Ｓ、Ｔ、またはＤであり、Ｘ４は、Ｄ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、またはＰであり、Ｘ５は、ＰまたはＳであり、Ｘ６は、Ｙ、Ｆ、Ｋ、またはＷである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－５０２１１、ＡＤＩ－４８８９９、ＡＤＩ－４５１３６、ＡＤＩ－４５０７８、ＡＤＩ－４９１６２、ＡＤＩ－４９１４１、ＡＤＩ－４２８４４、ＡＤＩ－４８９１０、ＡＤＩ－４５０７４、ＡＤＩ－４９０４１、ＡＤＩ－５０２２０、ＡＤＩ－４２１７２、ＡＤＩ－４２１７８、ＡＤＩ－５０２１８、およびＡＤＩ－４９１９４は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＬ３を含む抗体を提供し、ＣＤＲＬ３結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列ＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＴＸ５Ｘ６Ｔを含み、Ｘ１は、ＱまたはＨであり、Ｘ２は、ＡまたはＳであり、Ｘ３は、ＳまたはＹであり、Ｘ４は、ＴまたはＳであり、Ｘ５は、ＲまたはＰであり、Ｘ６は、Ｙ、Ｌ、Ｗ、またはＲである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４２２０１、ＡＤＩ－４５１６４、ＡＤＩ－４６７２９、ＡＤＩ－４２２２３、ＡＤＩ－４６７１８、ＡＤＩ－４５０７６、ＡＤＩ－４８９６８、ＡＤＩ－４５１５６、ＡＤＩ－５０５３６、およびＡＤＩ－５０５３７は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＬ３を含む抗体を提供し、ＣＤＲＬ３結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列ＧＴＷＤＸ１ＳＸ２Ｘ３ＳＡＧＸ４Ｖを含み、Ｘ１は、ＳまたはＴであり、Ｘ２は、Ｓであるか、またはアミノ酸ではなく、Ｘ３は、ＬまたはＰであり、Ｘ４は、Ｋ、Ｇ、またはＲである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４５０８３、ＡＤＩ－４２２２５、ＡＤＩ－４２２１０、ＡＤＩ－４２１９８、ＡＤＩ－４２８０９、ＡＤＩ－４２８３０、ＡＤＩ－４２８１８、ＡＤＩ－４２１５１、およびＡＤＩ－５０５３３は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＨ３を含む抗体を提供し、ＣＤＲＨ３結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列ＡＸ１Ｘ２ＹＤＳＸ３Ｘ４ＹＹＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８を含み、Ｘ１は、ＫまたはＲであり、Ｘ２は、Ｙ、Ｆ、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｙ、またはＨであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｎ、またはＲであり、Ｘ４は、ＡまたはＧであり、Ｘ５は、ＷまたはＹであり、Ｘ６は、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ａ、またはＥであり、Ｘ７は、Ｄ、Ｅ、またはＨであり、Ｘ８は、Ｙ、Ｈ、またはＳである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４５０８５、ＡＤＩ－５０２１１、ＡＤＩ－４５０７８、ＡＤＩ－４９１６２、ＡＤＩ－４５１３６、ＡＤＩ－４２１７２、ＡＤＩ－４９１９４、ＡＤＩ－５０２０３、ＡＤＩ－４２１７８、ＡＤＩ－４８９０８、ＡＤＩ－４２８４４、ＡＤＩ－４８９１０、およびＡＤＩ－４９１６８は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＬ２を含む抗体を提供し、ＣＤＲＬ２結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＰＳを含み、Ｘ１は、ＤまたはＥであり、Ｘ２は、Ｎ、Ｖ、またはＤであり、Ｘ３は、Ｋ、Ｎ、Ｄ、またはＳであり、Ｘ４は、Ｋ、Ｅ、またはＲである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４９０３９、ＡＤＩ－４２２２９、ＡＤＩ－４５０９７、ＡＤＩ－４５０８３、ＡＤＩ－４２２２５、ＡＤＩ－４９１３９、ＡＤＩ－４８９６９、ＡＤＩ－４８９００、ＡＤＩ－４２７８６、ＡＤＩ－４２２１０、ＡＤＩ－４２１９８、ＡＤＩ－４９１５４、ＡＤＩ－４９１８８、ＡＤＩ－４２１８８、ＡＤＩ－４２８０９、ＡＤＩ－４６５９６、ＡＤＩ－４２８３０、ＡＤＩ－４６５９１、ＡＤＩ－４８９５５、ＡＤＩ－４２８１８、ＡＤＩ－４６５８６、ＡＤＩ－４２１５１、ＡＤＩ－４５１４０、ＡＤＩ－４６７２２、ＡＤＩ－４５１２８、ＡＤＩ－４５１２７、ＡＤＩ－４６７３９、ＡＤＩ－４６７２４、ＡＤＩ－５０５３９、ＡＤＩ－４２１１４、ＡＤＩ－５０５３３、およびＡＤＩ－４９２０５は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＬ２を含む抗体を提供し、ここで、ＣＤＲＬ２結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＬＸ５Ｘ６を含み、Ｘ１は、Ａ、Ｇ、またはＲであり、Ｘ２は、ＡまたはＴであり、Ｘ３は、ＳまたはＴであり、Ｘ４は、Ｔ、Ｇ、Ｓ、またはＩであり、Ｘ５は、ＱまたはＲであり、Ｘ６は、ＳまたはＲである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４９１３３、ＡＤＩ－４９０３３、ＡＤＩ－４８８９５、ＡＤＩ－４２２０１、ＡＤＩ－４２２３０、ＡＤＩ－４８９１６、ＡＤＩ－４２２１１、ＡＤＩ－５１６４、ＡＤＩ－４２１９１、ＡＤＩ－４９１４５、ＡＤＩ－４６７２９、ＡＤＩ－４２１８９、ＡＤＩ－４６７１８、ＡＤＩ－４５０７６、ＡＤＩ－４８９６８、ＡＤＩ－５０２０３、ＡＤＩ－４２２２７、ＡＤＩ－４８８９４、ＡＤＩ－５０２１８、ＡＤＩ－４５１５６、ＡＤＩ－５０５３６、ＡＤＩ－５０５３７、ＡＤＩ－４６７３７、ＡＤＩ－４５１２３、およびＡＤＩ－５０２００は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＬ２を含む抗体を提供し、ＣＤＲＬ２結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列Ｘ１Ｘ２ＳＸ３ＲＡＸ４を含み、Ｘ１は、Ｇ、Ｄ、Ｒ、またはＡであり、Ｘ２は、ＡまたはＳであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、またはＮであり、Ｘ４は、ＴまたはＡである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４９１４７、ＡＤＩ－５０２０１、ＡＤＩ－４５１１３、ＡＤＩ－５０２１９、ＡＤＩ－４８８９７、ＡＤＩ－４２１９４、ＡＤＩ－４２８４７、ＡＤＩ－４８９０８、ＡＤＩ－４２２３１、ＡＤＩ－４２２３３、ＡＤＩ－４５１４８、ＡＤＩ－４２１８７、ＡＤＩ－４２７８７、ＡＤＩ－４９１４１、ＡＤＩ－４２２１３、ＡＤＩ－４２１９２、ＡＤＩ－４９５９０、ＡＤＩ－４８４６２、ＡＤＩ－４２２００、ＡＤＩ－４２１８１、ＡＤＩ－４９０３７、ＡＤＩ－４９１３７、およびＡＤＩ－４２８１７は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＬ２を含む抗体を提供し、ＣＤＲＬ２結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列Ｘ１ＶＸ２Ｘ３ＲＰＳを含み、Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、またはＲであり、Ｘ２は、Ｓ、Ｔ、Ｎ、またはＡであり、Ｘ３は、Ｎ、Ｋ、またはＱである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４２２２８、ＡＤＩ－４２１９０、ＡＤＩ－４９１８３、ＡＤＩ－４９１８９、ＡＤＩ－５０２０５、ＡＤＩ－５０５３１、ＡＤＩ－４９１３８、ＡＤＩ－４５１５４、ＡＤＩ－４９１６１、ＡＤＩ－４９５６１、ＡＤＩ－４２２１９、ＡＤＩ－４８４３５、ＡＤＩ－４５１６１、ＡＤＩ－４２１９３、ＡＤＩ－４２１４９、ＡＤＩ－４２２１６、ＡＤＩ－４２８１０、ＡＤＩ－４８８９０、ＡＤＩ－４２２０６、ＡＤＩ－４８９５０、およびＡＤＩ－４２１２４は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＬ２を含む抗体を提供し、ＣＤＲＬ２結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列Ｘ１ＡＳＸ２ＬＥＸ３を含み、Ｘ１は、Ｒ、Ｑ、またはＫであり、Ｘ２は、Ｔ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、またはＩであり、Ｘ３は、ＴまたはＳである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４２８２１、ＡＤＩ－４５０８５、ＡＤＩ－５０２１１、ＡＤＩ－４８８９９、ＡＤＩ－４９１６８、ＡＤＩ－４５１３６、ＡＤＩ－４５０７８、ＡＤＩ－４２８４４、ＡＤＩ－４８９１０、ＡＤＩ－４９０４１、ＡＤＩ－４２１７２、ＡＤＩ－４２１７８、ＡＤＩ－４９０３２、およびＡＤＩ－４９１９４は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＨ２を含む抗体を提供し、ＣＤＲＨ２結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＨＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＹＸ９ＰＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｓを含み、Ｘ１は、Ｄ、Ｅ、またはＳであり、Ｘ２は、ＩまたはＶであり、Ｘ３は、ＦまたはＹであり、Ｘ４は、ＸまたはＴであり、Ｘ５は、ＧまたはＥであり、Ｘ６は、Ｓ、Ｇ、またはＴであり、Ｘ７は、ＴまたはＡであり、Ｘ８は、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、またはＴであり、Ｘ９は、ＮまたはＳであり、Ｘ１０は、ＳまたはＦであり、Ｘ１１は、ＬまたはＶであり、Ｘ１２は、ＫまたはＥである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４５０８３、ＡＤＩ－４２２２５、ＡＤＩ－４９１３９、ＡＤＩ－４８９００、ＡＤＩ－４２２３２、ＡＤＩ－４２７８６、ＡＤＩ－４２２１０、ＡＤＩ－４２１９８、ＡＤＩ－４９１５４、ＡＤＩ－４２１８８、ＡＤＩ－４２８０９、ＡＤＩ－４２８１８、ＡＤＩ－４２１５１、ＡＤＩ－４６７２２、ＡＤＩ－４６７４２、ＡＤＩ－４９１４１、ＡＤＩ－４６７３９、ＡＤＩ－４６７２４、ＡＤＩ－５０５３９、ＡＤＩ－４８９５１、ＡＤＩ－５０５３８、およびＡＤＩ－５０５３３は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＨ２を含む抗体を提供し、ＣＤＲＨ２結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＤＸ５Ｘ６Ｘ７ＫＸ８Ｘ９ＡＤＳＸ１０Ｘ１１Ｇを含み、Ｘ１は、ＶまたはＬであり、Ｘ２は、ＩまたはＭであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｗ、またはＬであり、Ｘ４は、ＦまたはＹであり、Ｘ５は、ＥまたはＧであり、Ｘ６は、ＳまたはＴであり、Ｘ７は、Ｋ、Ｎ、またはＹであり、Ｘ８は、Ｆ、Ｗ、またはＹであり、Ｘ９は、ＹまたはＦであり、Ｘ１０は、ＶまたはＬであり、Ｘ１１は、ＫまたはＲである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４５０９７、ＡＤＩ－４２１４４、ＡＤＩ－４９１３８、ＡＤＩ－４５１５４、ＡＤＩ－４９５６１、ＡＤＩ－４２１８９、ＡＤＩ－４２８４４、ＡＤＩ－４５１６１、ＡＤＩ－４８４６２、ＡＤＩ－４２１７２、ＡＤＩ－４２１７８、ＡＤＩ－４２２１７、ＡＤＩ－４６７３７、ＡＤＩ－４９２０５、ＡＤＩ－４５１５１、およびＡＤＩ－４６７２８は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＬ１を含む抗体を提供し、ＣＤＲＬ１結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列ＲＸ１ＳＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９を含み、Ｘ１は、ＡまたはＴであり、Ｘ２は、ＱまたはＲであり、Ｘ３は、ＳまたはＴであり、Ｘ４は、ＩまたはＶであり、Ｘ５は、ＳまたはＴであり、Ｘ６は、Ｓ、Ｎ、Ｔ、Ｆ、Ｄ、またはＧであり、Ｘ７は、Ｎ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、またはＫであり、Ｘ８は、ＬまたはＶであり、Ｘ９は、ＡまたはＮである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４９１４７、ＡＤＩ－５０２０１、ＡＤＩ－４５１１３、ＡＤＩ－４２２０１、ＡＤＩ－４２１９４、ＡＤＩ－４２８４７、ＡＤＩ－４５０８５、ＡＤＩ－４８９０８、ＡＤＩ－５０２１１、ＡＤＩ－４２２３１、ＡＤＩ－４５１６４、ＡＤＩ－４８８９９、ＡＤＩ－４６７２９、ＡＤＩ－４９１６８、ＡＤＩ－４９０４０、ＡＤＩ－４５１３６、ＡＤＩ－４５０７８、ＡＤＩ－４６７１８、ＡＤＩ－４９１４１、ＡＤＩ－４２８４４、ＡＤＩ－４２１９２、ＡＤＩ－４８９１０、ＡＤＩ－４２２００、ＡＤＩ－５０２０３、ＡＤＩ－４２１８１、ＡＤＩ－４９０４１、ＡＤＩ－５０２２０、ＡＤＩ－４２１７２、ＡＤＩ－４２１７８、ＡＤＩ－４９０３２、ＡＤＩ－４９１３７、ＡＤＩ－４２８１７、ＡＤＩ－４５１５６、ＡＤＩ－５０５３６、ＡＤＩ－５０５３７、およびＡＤＩ－４９１９４は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＬ１を含む抗体を提供し、ＣＤＲＬ１結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列ＳＧＳＸ１ＳＮＸ２ＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＶＸ６を含み、Ｘ１は、ＮまたはＳであり、Ｘ２は、ＩまたはＦであり、Ｘ３は、ＳまたはＮであり、Ｘ４は、Ｎ、Ｙ、Ｓ、またはＤであり、Ｘ５は、Ｙ、Ｆ、またはＤであり、Ｘ６は、ＳまたはＡである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４９０３９、ＡＤＩ－４２２２９、ＡＤＩ－４５０９７、ＡＤＩ－４５０８３、ＡＤＩ－４２２２５、ＡＤＩ－４８９００、ＡＤＩ－４２７８６、ＡＤＩ－４２２１０、ＡＤＩ－４２１９８、ＡＤＩ－４９１５４、ＡＤＩ－４２１８８、ＡＤＩ－４２８０９、ＡＤＩ－４６５９６、ＡＤＩ－４２８３０、ＡＤＩ－４６５９１、ＡＤＩ－４８９５５、ＡＤＩ－４２８１８、ＡＤＩ－４６５８６、ＡＤＩ－４２１５１、ＡＤＩ－４５１４０、ＡＤＩ－４６７２２、ＡＤＩ－４５１２８、ＡＤＩ－４６７３９、ＡＤＩ－４６７２４、ＡＤＩ－５０５３９、ＡＤＩ－４２１１４、およびＡＤＩ－５０５３３は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＬ１を含む抗体を提供し、ＣＤＲＬ１結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列Ｘ１ＧＴＸ２Ｘ３ＤＸ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＶＳを含み、ここで、Ｘ１は、ＡまたはＴであり、Ｘ２は、Ｓ、Ｇ、またはＲであり、Ｘ３は、ＳまたはＴであり、Ｘ４は、Ｖ、Ｆ、またはＩであり、Ｘ５は、ＧまたはＡであり、Ｘ６は、Ｙ、Ｄ、またはＦであり、Ｘ７は、ＫまたはＮであり、Ｘ８は、ＹまたはＦである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４８９６９、ＡＤＩ－４２２２８、ＡＤＩ－４２１９０、ＡＤＩ－４９１８３、ＡＤＩ－４９１８９、ＡＤＩ－５０２０５、ＡＤＩ－５０５３１、ＡＤＩ－４９１３８、ＡＤＩ－４５１５４、ＡＤＩ－４９１６１、ＡＤＩ－４９５６１、ＡＤＩ－４２２１９、ＡＤＩ－４８４３５、ＡＤＩ－４５１６１、ＡＤＩ－４５１２７、ＡＤＩ－４２１４９、ＡＤＩ－４２２１６、ＡＤＩ－４２８１０、ＡＤＩ－４８８９０、ＡＤＩ－４２２０６、ＡＤＩ－４８９５０、ＡＤＩ－４２１２４、およびＡＤＩ－４９２０５は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＨ１を含む抗体を提供し、ＣＤＲＨ１結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列Ｘ１Ｘ２ＦＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８を含み、Ｘ１は、Ｆ、Ｙ、またはＬであり、Ｘ２は、Ｔ、Ａ、Ｓ、またはＮであり、Ｘ３は、ＳまたはＴであり、Ｘ４は、Ｓ、Ｔ、またはＲであり、Ｘ５は、ＹまたはＬであり、Ｘ６は、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｗ、Ｓ、またはＤであり、Ｘ７は、Ｍ、Ｉ、またはＬであり、Ｘ８は、Ｈ、Ｓ、Ｎ、またはＴである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４５０９０、ＡＤＩ－４９０４４、ＡＤＩ－４５１１３、ＡＤＩ－４２１４４、ＡＤＩ－５００２６、ＡＤＩ－４５０７５、ＡＤＩ－４２２３０、ＡＤＩ－４２１５４、ＡＤＩ－４５０８５、ＡＤＩ－４２２１１、ＡＤＩ－５０２１１、ＡＤＩ－４２２３１、ＡＤＩ－４２２３３、ＡＤＩ－４９１６８、ＡＤＩ－４２１８７、ＡＤＩ－４９５６１、ＡＤＩ－４２２１９、ＡＤＩ－５０５３５、ＡＤＩ－４５１３６、ＡＤＩ－４２１８９、ＡＤＩ－４８４３５、ＡＤＩ－４６７１８、ＡＤＩ－４２８４４、ＡＤＩ－４５１６１、ＡＤＩ－４８９１０、ＡＤＩ－４８４６２、ＡＤＩ－４２２００、ＡＤＩ－５０２０３、ＡＤＩ－４２１４９、ＡＤＩ－４２１７２、ＡＤＩ－４２１７８、ＡＤＩ－５０１９７、ＡＤＩ－４２８１０、ＡＤＩ－５０２１８、ＡＤＩ－４５１５６、ＡＤＩ－５０５３６、ＡＤＩ－５０５３７、ＡＤＩ－４６７３７、ＡＤＩ－４２１１４、ＡＤＩ－４９１９４、ＡＤＩ－４２１２４、およびＡＤＩ－４６７２８は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＨ１を含む抗体を提供し、ＣＤＲＨ１結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列Ｘ１ＳＩＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＷＸ７を含み、Ｘ１は、ＧまたはＩであり、Ｘ２は、ＳまたはＴであり、Ｘ３は、Ｓ、Ｔ、Ｇであるか、またはアミノ酸ではなく、Ｘ４は、Ｄ、Ｓ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ５は、Ｙ、Ｎ、またはＤであり、Ｘ６は、ＷまたはＹであり、Ｘ７は、ＳまたはＴである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４５０８３、ＡＤＩ－４２２２５、ＡＤＩ－４８９００、ＡＤＩ－４２７８６、ＡＤＩ－４２２１０、ＡＤＩ－４９１８８、ＡＤＩ－４２１８８、ＡＤＩ－４２８１８、ＡＤＩ－４２１５１、ＡＤＩ－４８９１３、ＡＤＩ－４６７２２、ＡＤＩ－４９１４１、ＡＤＩ－４６７４１、ＡＤＩ－４６７３９、ＡＤＩ－５０５３９、ＡＤＩ－５０５３８、およびＡＤＩ－５０５３３は、このコンセンサスモチーフを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＨ１を含む抗体を提供し、ＣＤＲＨ１結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、コンセンサスモチーフは、配列ＦＸ１ＦＳＤＸ２ＹＭＸ３を含み、Ｘ１は、ＩまたはＴでありＸ２は、ＨまたはＹであり、Ｘ３は、ＡまたはＤである。以下のクローン、すなわち、ＡＤＩ－４２１９１、ＡＤＩ－４９０４０、ＡＤＩ－４２２２３、ＡＤＩ－４２１９３、ＡＤＩ－４８９６８、ＡＤＩ－４２２１２、ＡＤＩ－４５１２６、ＡＤＩ－４２１４１、ＡＤＩ－４９１４０、ＡＤＩ－４８８９４、ＡＤＩ－４２２２６、ＡＤＩ－４９１３７、ＡＤＩ－４８８９０、ＡＤＩ－４２２０６、およびＡＤＩ－４９０３０は、このコンセンサスモチーフを含む。
１つ以上のＣＤＲ残基の置換または１つ以上のＣＤＲの省略も、可能である。抗体は、１つまたは２つのＣＤＲが結合のために省かれ得る、科学文献に記載されている。Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５ ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９）は、公開されている結晶構造に基づいて抗体とそれらの抗原との間の接触領域を分析し、ＣＤＲ残基の約５分の１～３分の１のみが実際に抗原に接触すると結論付けた。Ｐａｄｌａｎはまた、１つまたは２つのＣＤＲが抗原と接触しているアミノ酸を有していない、多くの抗体も見出した（Ｖａｊｄｏｓ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３２０：４１５－４２８も参照）。
抗原と接触しないＣＤＲ残基は、分子モデリングによって、および／または経験的に、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの外側にあるＫａｂａｔ ＣＤＲの領域から、以前の研究に基づいて同定されることができる（例えば、ＣＤＲＨ２内の残基Ｈ６０－Ｈ６５は、しばしば要求されない）。ＣＤＲまたはその残基が省略される場合、それは通常、別のヒト抗体配列またはそのような配列のコンセンサスにおいて対応する位置を占めるアミノ酸で置換される。置換するＣＤＲおよびアミノ酸内の置換のための位置もまた、経験的に選択されることができる。
本明細書に開示される完全ヒトモノクローナル抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内に１つ以上のアミノ酸置換、挿入、ならびに／もしくは欠失を含み得る。そのような変異は、本明細書に開示されるアミノ酸配列を、例えば、公的な抗体配列データベースから入手可能な生殖細胞系列配列と比較することによって、容易に確認されることができる。本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに由来する抗体およびその抗原結合断片を含み、１つ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸は、抗体が由来した生殖系列配列の対応する残基に、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、もしくは対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異させられる（そのような配列変化は、本明細書では集合的に「生殖細胞変異」と称される）。当業者は、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から開始して、１つ以上の個々の生殖細胞変異またはそれらの組み合わせを含む、多数の抗体および抗原結合断片を容易に産生することができる。特定の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン内のフレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のすべては、抗体が由来した元の生殖系列配列で見出される残基に戻るように変異させられる。他の実施形態では、特定の残基のみ、例えば、ＦＲ１の最初の８つのアミノ酸内もしくはＦＲ４の最後の８つのアミノ酸内で見出される変異残基のみ、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３内で見出される変異残基のみが、元の生殖細胞系列配列に戻るように変異させられる。他の実施形態では、フレームワークおよび／またはＣＤＲ残基のうちの１つ以上は、異なる生殖細胞系列配列（すなわち、抗体が最初に由来した生殖細胞系列配列とは異なる生殖細胞系列配列）の対応する残基に変異させられる。さらに、本開示の抗体は、フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の２つ以上の生殖細胞変異の任意の組み合わせを含有し得、例えば、特定の個々の残基が、特定の生殖細胞配列の対応する残基に変異させられる一方で、元の生殖細胞系列配列とは異なる特定の他の残基は、維持されるか、または異なる生殖細胞系列配列の対応する残基に変異させられる。取得されると、１つ以上の生殖細胞変異を含有する抗体および抗原結合断片は、結合特異性の改善、結合親和性の増加、（場合によっては）拮抗的または反発的な生物学的特性の改善または向上、免疫原性の低減などの１つ以上の所望の特性について容易に検査されることができる。この一般的な様式で取得された抗体および抗原結合断片は、本開示内に包含される。
本開示はまた、１つ以上の保存的置換を有する、本明細書に開示されるＣＤＲアミノ酸配列のうちのいずれかの変異体を含む、完全モノクローナル抗体も含む。例えば、本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のうちのいずれかに対して、例えば、１０個以下、８個以下、６個以下、４個以下などの保存的アミノ酸置換を伴うＣＤＲアミノ酸配列を有する抗体を含む。いくつかの実施形態では、開示される抗ＹＦＶ抗体および抗原結合断片は、ヒト抗体である。本明細書で使用される場合の「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことを意図している。本開示のヒト抗体は、例えば、ＣＤＲ内に、特に、ＣＤＲ３内に、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボで体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。
いくつかの実施形態では、開示される抗ＹＦＶ抗体および抗原結合断片は、組換え抗体である。「組換え」という用語は、一般に、遺伝子工学方法によって産生される目的の遺伝子を発現する任意のタンパク質、ポリペプチド、または細胞を指す。タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合の「組換え」という用語は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。本開示の免疫原性組成物で使用されるタンパク質は、天然源から単離されるか、または遺伝子工学方法によって産生され得る。
本開示の抗体は、いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体であり得る。本明細書で使用される場合の「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体（以下にさらに記載される）、組換え型の組み合わせヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（以下にさらに記載される）、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５を参照）、または他のＤＮＡ配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作成、もしくは単離された抗体などの任意の組換え手段によって調製、発現、作成、または単離されるヒトまたはヒト化抗体を含む、すべての抗体を含むことを意図している。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する。しかしながら、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（または、ヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用されるときはインビボ体細胞変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連するが、インビボでヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に自然に存在しない場合がある、配列である。
いくつかの実施形態では、抗ＹＦＶ抗体およびその抗原結合断片は、単離された抗体である。本明細書で使用される場合の「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ＹＦＶに特異的に結合する単離された抗体またはその断片は、ＹＦＶ以外の抗原に特異的に結合するＡｂｓを実質的に含まない）。いくつかの実施形態では、抗ＹＦＶ抗体および抗原結合断片は、ＹＦＶ Ｅタンパク質、例えば、ＤＩＩドメインまたはＤＩＩＩのＦＬに特異的に結合する。「特異的に結合する」または「に特異的に結合する」という用語、もしくは同等物は、抗体またはその抗原結合断片が、生理学的条件下で比較的安定している抗原と複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約１×１０－６Ｍ以下の平衡解離定数によって特徴付けられることができる（例えば、より小さいＫＤは、より緊密な結合を表す）。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴、および同等物を含む。本明細書に記載されるように、抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、例えば、ＹＦＶに特異的に結合するＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ機器（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する生体層干渉測定機器によって、同定されている。さらに、ＹＦＶタンパク質および１つ以上の追加の抗原に結合する多重特異性抗体、またはＹＦＶの２つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、それでもなお、本明細書で使用される場合に「特異的に結合する」抗体と見なされる。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、約１×１０－６Ｍ、約１×１０－７Ｍ、約１×１０－８Ｍ、約１×１０－９Ｍ、約１×１０－１０Ｍ、約１×１０－６Ｍ～約１×１０－７Ｍ、約１×１０－７Ｍ～約１×１０－８Ｍ、約１×１０－８Ｍ～約１×１０－９Ｍ、約１×１０－９Ｍ～約１×１０－１０Ｍ、または約１×１０－９Ｍ～約１×１０－１０Ｍの平衡解離定数（したがって特異性）を示す。
いくつかの実施形態では、抗ＹＦＶ抗体および抗原結合断片は、高親和性結合剤である。「高親和性」という用語は、ＫＤとして表される、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ機器（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）または溶液親和性ＥＬＩＳＡを使用する生体層干渉測定機器によって測定されると、少なくとも１０－９Ｍ、より好ましくは１０－１０Ｍ、より好ましくは１０－１１Ｍ、より好ましくは１０－１２ＭのＹＦＶへの結合親和性を有するｍＡｂを指す。
「減速速度」という用語により、「Ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」は、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）またはＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ機器（Ｐａｌｌ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定されると、１×１０－３ｓ－１以下、好ましくは、１×１０－４ｓ－１以下の速度定数でＹＦＶから解離する抗体を意味する。
具体的な実施形態、本開示の抗体または抗体断片は、抗生物質、第２の抗ＹＦＶ抗体、ワクチン、またはトキソイドなどの治療部分（「免疫複合体」）、もしくはＹＦＶを治療するために有用な任意の他の治療部分にコンジュゲートされ得る。
また、本明細書で提供される抗体と実質的に同一の抗体および抗原結合断片も企図される。核酸またはその断片を指すときの「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、別の核酸（またはその相補鎖）を伴う適切なヌクレオチド挿入または欠失と最適に整合されたとき、以下に論じられるように、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧＡＰなどの任意の周知の配列同一性のアルゴリズムによって測定されると、ヌクレオチド塩基の少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％にヌクレオチド配列同一性があることを示す。したがって、特定の「同一性」率を示す核酸配列は、その同一性率を共有し、および／またはその率が相互と「同一」である。参照核酸分子と実質的な同一性を有する核酸分子は、特定の事例では、参照核酸分子によってコードされるポリペプチドと同じまたは実質的に同様のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。
いくつかの実施形態では、抗体またはその抗体結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２から選択された抗体の表３に開示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／またはＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、ならびに／もしくはその間のすべての同一性率である、そのような抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ２アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ１アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ２アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ１アミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、抗ＹＦＶ抗体およびその抗原結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちの少なくとも１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、および／またはその間のすべての同一性率である。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つの重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つの軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つの重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列および軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片はそれぞれ、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体からなる群から選択される。
また、本明細書に記載の抗体をコードする核酸も提供される。特定の実施形態では、ＹＦＶおよびその抗原結合断片に特異的に結合する抗体をコードする、単離された核酸配列が提供され、抗体またはその抗原結合断片のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つは、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２から選択された抗体の表３に開示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／またはＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、ならびに／もしくはその間のすべての同一性率である。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸配列が提供され、そのような核酸配列は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ３アミノ酸配列をコードする配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸配列が提供され、そのような核酸配列は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ２アミノ酸配列をコードする配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸配列が提供され、そのような核酸配列は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ１アミノ酸配列をコードする配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸配列が提供され、そのような核酸配列は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ３アミノ酸配列をコードする配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸配列が提供され、そのような核酸配列は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ２アミノ酸配列をコードする配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸配列が提供され、そのような核酸配列は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ１アミノ酸配列をコードする配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸配列が提供され、そのような核酸配列は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つの重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列をコードする配列を含む。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片をコードする単離された核酸配列が提供され、そのような核酸配列は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つの軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列をコードする配列を含む。ポリペプチドに適用される場合、「実質的な同一性」または「実質的に同一」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整合されたときに、少なくとも９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９８％、または９９％の配列同一性を共有することを意味する。したがって、特定の「同一性」率を示すアミノ酸配列は、その同一性率を共有し、および／またはその率が相互と「同一」である。したがって、特定の「同一性」率を示すアミノ酸配列は、その同一性率を共有し、および／またはその率が相互と「同一」である。
特定の実施形態では、開示される抗体アミノ酸配列は、例えば、他の配列と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、および／またはその間のすべての同一性率であり、ならびに／もしくは相互と（または本明細書に開示される抗体配列の特定のサブセットと）そのような同一性率を共有する。
好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を伴う側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させないであろう。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって相互と異なる場合、類似性の割合または程度は、置換の保存的性質を補正するように上方に調整され得る。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３３１を参照）。類似化学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸の群の例には、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、２）脂肪族－ヒドロキシル側鎖：セリンおよびスレオニン、３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン、４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン、６）酸性側鎖：アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩、ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが含まれる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、グルタミン酸塩－アスパラギン酸塩、およびアスパラギン－グルタミンである。代替として、保存的置換は、Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３ ４５に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列に正の値を有する、任意の変化である。「適度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列に負ではない値を有する任意の変化である。
ポリペプチドの配列類似性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、および他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を使用して、類似配列を照合する。例えば、ＧＣＧソフトウェアは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチドの間、または野生型タンパク質とそのムテインとの間の配列相同性または配列同一性を決定するために、デフォルトパラメーターとともに使用され得る、ＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、デフォルトまたは推奨パラメーターとともにＦＡＳＴＡを使用して比較されることもできる（ＧＣＧバージョン６．１におけるプログラム）。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間の最良の重複の領域の整合および配列同一性率を提供する（上記のＰｅａｒｓｏｎ（２０００））。本開示の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較するときの別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用する、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ、特に、ＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３ ４１０ ａｎｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９ ４０２を参照）。
特定の実施形態では、本開示の方法で使用するための抗体または抗体断片は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または１つより多くの標的ポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。
本明細書に開示される、抗ＹＦＶ抗体は、当業者に利用可能な技法を使用して、例えば、以下の実施例に記載されるように、ヒトＢ細胞から取得され得る。マウスなどのトランスジェニック動物においてヒト抗体を生成するための方法もまた、当技術分野で公知であり、本開示に従って抗体を導出するために採用され得る。任意のそのような方法が、ＹＦＶに特異的に結合するヒト抗体を作製するために本開示の文脈で使用されることができる（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１を参照）。
特定の実施形態では、本開示の抗体は、固相上または溶液相内のいずれかで固定化された抗原に結合することによって測定されたときに、約１．０×１０－７Ｍ～約１．０×１０－１２Ｍに及ぶ親和性（ＫＤ）を保有する。特定の実施形態では、本開示の抗体は、固相上または溶液相内のいずれかで固定化された抗原に結合することによって測定されたときに、約１×１０－７Ｍ～約６×１０－１０Ｍに及ぶ親和性（ＫＤ）を有する。特定の実施形態では、本開示の抗体は、固相上または溶液相内のいずれかで固定化された抗原に結合することによって測定されたときに、約１×１０－７Ｍ～約９×１０－１０Ｍに及ぶ親和性（ＫＤ）を有する。
本明細書に開示される具体的な抗ＹＦＶ抗体および抗体断片に加えて、本開示はまた、生物学的同等性を維持するこれらの抗体および抗体断片の変異体も企図する。そのような変異抗体および抗体断片は、親配列と比較すると、アミノ酸の１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載された抗体のものと本質的に同等である生物学的活性を示す。同様に、本開示の抗体をコードするＤＮＡ配列は、開示された配列と比較すると、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本開示の抗体または抗体断片と本質的に生物学的に同等である抗体または抗体断片をコードする配列を包含する。
２つの抗原結合タンパク質または抗体は、例えば、単回用量または複数回用量のいずれかで、類似実験条件下で同じモル用量において投与されたときに、その吸収の速度および程度が有意差を示さない、医薬品同等物または医薬品代替物である場合、生物学的に同等と見なされる。いくつかの抗体は、それらの吸収の程度において同等であるが、それらの吸収速度において同等ではない場合に同等物または医薬品代替物と見なされ、その上、吸収速度のそのような差異が意図的であり、標識に反映されるため、生物学的に同等と見なされ得、例えば、慢性的使用における有効体内薬物濃度の達成に必須ではなく、研究される特定の医薬品にとって医学的に重要でないと見なされる。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、それらの安全性、純度、および効力に臨床的に有意義な差異がない場合、生物学的に同等である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、患者が参照製品と生物学的製品との間で１回以上切り替えられることができ、そのような切替を伴わない継続的治療法と比較して、免疫原性の臨床的に有意な変化または有効性の減少を含む、有害作用のリスクの予期される増加がない場合、生物学的に同等である。
一実施形態では、２つの抗原結合タンパク質は、両方とも１つまたは複数の使用条件のための１つまたは複数の作用機序によって、そのような機序が公知である程度に作用する場合、生物学的に同等である。
生物学的同等性は、インビボおよび／またはインビトロ方法によって実証され得る。生物学的同等性の測定には、例えば、（ａ）抗体またはその代謝産物の濃度が時間の関数として血液、血漿、血清、または他の生体液中で測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、（ｂ）ヒトのインビボバイオアベイラビリティデータと相関性があり、それを合理的に予測するインビトロ検査、（ｃ）抗体（またはその標的）の適切な急性薬理効果が時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳動物におけるインビボ検査、および（ｄ）抗体の安全性、有効性、またはバイオアベイラビリティ、もしくは生物学的同等性を確立する、十分に制御された臨床試験が含まれる。
本開示の抗体の生物学的に同等な変異体は、例えば、残基もしくは配列の様々な置換を行うことによって、または生物学的活性のために必要とされない末端または内部残基もしくは配列を削除することによって、構築され得る。例えば、生物学的活性のために必須ではないシステイン残基は、再生時に不要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止するように、削除されるか、または他のアミノ酸と置き換えられることができる。他の文脈において、生物学的に同等な抗体は、抗体のグリコシル化特性を修飾し得る、アミノ酸変化を含む抗体変異体、例えば、グリコシル化を排除または除去する変異を含み得る。
抗体の生物学的および生物物理学的特性
特定の実施形態では、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、ＹＦＶに特異的に結合し、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／またはＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つは、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２から選択された抗体の表３に開示される対応するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／またはＣＤＲＬ３アミノ酸配列と少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、ならびに／もしくはその間のすべての同一性率である。
いくつかの実施形態では、抗ＹＦＶ抗体およびその抗原結合断片は、中和抗体であり、すなわち、中和能力を示す。本明細書で使用される場合の「中和抗体」（または「ＹＦＶ活性を中和する抗体」もしくは「中和活性を伴う抗体」）は、本明細書に開示されるように、抗原、例えば、場合によってはＹＦＶ Ｅタンパク質へのその結合が、少なくとも１つの生物学的活性の阻害をもたらす、抗体を指す。例えば、本開示の抗体は、ＹＦＶの宿主細胞への融合を阻止することを補助し、またはシンシチウム形成を防止し、もしくはＹＦＶによって引き起こされる原発性疾患を予防し得る。代替として、本開示の抗体は、ＹＦＶ感染症の少なくとも１つの症状を改善する能力を実証し得る。ＹＦＶの生物学的活性のこの阻害は、いくつかの標準的インビトロアッセイ（本明細書に記載されるような中和アッセイなど）または当技術分野で公知のインビボアッセイ（例えば、本明細書に記載の抗体のうちの１つ以上の投与に続く、ＹＦＶによる攻撃からの保護を調べるための動物モデル）のうちの１つ以上によって、ＹＦＶ生物学的活性の１つ以上の指標を測定することによって評価されることができる。
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、約０．５マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）～約５μｇ／ｍｌ、約０．０５μｇ／ｍｌ～約０．５μｇ／ｍｌ、または約０．０５ｍｇ／ｍｌ未満のインビトロ中和能力（ＩＣ５０）を示す。
「ＩＣ５０」という用語は、「最大阻害濃度の半分」を指し、その値は、生物学的または生化学的有用性に向けた化合物（例えば、抗ＹＦＶ抗体）阻害の有効性を測定する。この定量的測定値は、特定の阻害剤が所与の生物学的プロセスを半分に阻害するために要求される量を示す。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＹＦＶ中和抗体のＹＦＶ中和能力は、中和ＩＣ５０値として表される。本明細書に記載の抗体のうち、一般に、ＹＦＶ Ｅタンパク質のＤＩＩＩに結合する抗体は、最高中和能力を有する。
いくつかの実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、ＤＥＮＶ－２、ＤＥＮＶ－４、ＷＮＶ、またはＺＩＫＶ Ｅタンパク質と交差反応し、すなわち、ＹＦＶ Ｅタンパク質および他のフラビウイルスのうちの１つ以上に由来するＥタンパク質に結合する。特定の実施形態では、そのような抗体およびその抗原結合断片は、高い見かけの強い親和性（ＫＤＡｐｐｓ＜１０ｎＭ）で、ＤＥＮＶ－２、ＤＥＮＶ－４、ＷＮＶ、ＹＦＶ、およびＺＩＫＶ Ｅタンパク質に結合する。特定の実施形態では、交差反応性抗体またはその抗原結合断片は、ＹＦＶ－１７Ｄおよび別のフラビウイルスに対して中和活性を有する。特定の実施形態では、交差反応性抗体およびその抗原結合断片は、ＦＬエピトープに結合する。特定の実施形態では、交差反応性抗体およびその抗原結合断片は、ＤＩＩＩに結合する。特定の実施形態では、交差反応性抗体は、ＡＤＩ－４８９０５である。
エピトープビニングおよび関連技術
上記に記載されるように、かつ実施例に実証されるように、出願人は、本発明の抗体およびその抗原結合断片のエピトープビニングを特性評価している。そのような特性評価を行うための方法に加えて、そのような特性評価を実行するために、または抗体がポリペプチドもしくはタンパク質内の「１つ以上のアミノ酸と相互作用する」かどうかを別様に確認するために使用され得る様々な他の技法が、当業者に利用可能である。例示的技法には、例えば、実施され得る、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．，ＮＹ）に記載されるものなどの日常的な交差ブロックアッセイを含む。他の方法には、アラニンスキャニング変異分析、ペプチドブロット分析（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－６３）、ペプチド切断分析結晶学的研究、およびＮＭＲ分析が含まれる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、および抗原の化学修飾などの方法が採用されることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために使用され得る別の方法は、質量分析によって検出される水素／重水素交換である。一般論として、水素／重水素交換法は、目的のタンパク質を重水素標識し、それに続いて、抗体を重水素標識タンパク質に結合させることを伴う。次に、タンパク質／抗体複合体は、水に移され、抗体複合体によって保護されているアミノ酸内の交換可能なプロトンは、界面の一部ではないアミノ酸内の交換可能なプロトンよりも遅い速度で重水素から水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質／抗体界面の一部を形成するアミノ酸は、重水素を保持し、したがって、界面に含まれないアミノ酸と比較して比較的高い質量を示し得る。抗体の解離後、標的タンパク質は、プロテアーゼ切断および質量分析を受け、それによって、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応する重水素標識残基を明らかにする。例えば、Ｅｈｒｉｎｇ（１９９９）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（２）：２５２－２５９、Ｅｎｇｅｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（２００１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７３：２５６Ａ－２６５Ａを参照されたい。
当業者が理解するように、エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって並置された隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸の両方から形成されることができる。隣接アミノ酸から形成されたエピトープが、典型的には、変性溶媒への曝露時に保持される一方で、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒を用いた処理時に失われる。エピトープは、典型的には、独自の空間的立体配座に少なくとも３つ、より一般的には、少なくとも５つまたは８～１０個のアミノ酸を含む。
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）としても公知である修飾支援型プロファイリング（ＭＡＰ）は、化学的または酵素的に修飾された抗原表面への各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に対する多数のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分類する方法である（ＵＳ ２００４／０１０１９２０）。各カテゴリーは、別のカテゴリーによって表されるエピトープとは明確に異なるか、または部分的に重複するかのいずれかである、独自のエピトープを反映し得る。このテクノロジーは、特性評価が遺伝的に明確に異なる抗体に焦点を合わせ得るように、遺伝的に同一の抗体の迅速なフィルタリングを可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用されると、ＭＡＰは、所望の特性を有するｍＡｂを産生する希少ハイブリドーマクローンの同定を促進し得る。ＭＡＰは、本開示の抗体を、異なるエピトープに結合する抗体の群に選別するために使用され得る。
当業者が理解するように、当技術分野で利用可能な日常的方法を使用することによって、抗体が参照抗ＹＦＶ抗体と同じエピトープに結合するか、または参照抗ＹＦＶ抗体と結合について競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本開示の参照ＹＦＶ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体は、飽和条件下でＹＦＶタンパク質またはペプチドに結合することを許容される。次に、ＹＦＶ分子に結合する試験抗体の能力が評価される。試験抗体が参照抗ＹＦＶ抗体との飽和結合に続いてＹＦＶに結合することができる場合、試験抗体は参照抗ＹＦＶ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方で、試験抗体が参照抗ＹＦＶ抗体との飽和結合に続いてＹＦＶ分子に結合することができない場合、試験抗体は本開示の参照抗ＹＦＶ抗体によって結合されたエピトープと同じエピトープに結合し得る。
抗体が参照抗ＹＦＶ抗体と結合について競合するかどうかを決定するために、上記に記載される結合方法論は、２つの指向で実施される。第１の指向では、参照抗体は、飽和条件下でＹＦＶ分子に結合することを許容され、その後に、ＹＦＶ分子への試験抗体の結合の評価が続く。第２の指向では、試験抗体は、飽和条件下でＹＦＶ分子に結合することを許容され、その後に、ＹＦＶ分子への参照抗体の結合の評価が続く。両方の指向で、第１の（飽和）抗体のみがＹＦＶ分子に結合することが可能である場合、試験抗体および参照抗体は、ＹＦＶへの結合について競合すると結論付けられる。当業者によって理解されるように、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合しない場合があるが、重複または隣接するエピトープに結合することによって、参照抗体の結合を立体的に阻止し得る。
２つの抗体は、それぞれが抗原への他方の抗体の結合を競合的に阻害（阻止）する場合、同じまたは重複するエピトープに結合する。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍過剰な一方の抗体は、競合結合アッセイにおいて測定されると、他方の抗体の結合を少なくとも５０％であるが、好ましくは、７５％、９０％、またはさらに９９％阻害する（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９０）５０：１４９５－１５０２を参照）。代替として、２つの抗原は、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を低減または排除する場合、同じエピトープを有する。２つの抗体は、一方の抗体の結合を減少または排除するいくつかのアミノ酸変異が他方の抗体の結合を減少または排除する場合、重複するエピトープを有する。
追加の日常的な実験（例えば、ペプチド変異および結合分析）が、次いで、試験抗体の結合の観察された欠如が実際に参照抗体と同じエピトープへの結合に起因するかどうか、または立体的ブロッキング（または別の現象）が観察された結合の欠如に関与するかどうかを確認するために実行されることができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当技術分野で利用可能な他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを使用して、実施されることができる。
免疫複合体
本開示は、ＹＦＶによる一次感染の重症度を軽減することが可能である、または発熱、筋肉痛、頭痛、嘔吐、下痢、出血を含む、ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状、もしくはその重症度を改善するための薬剤などの治療部分にコンジュゲートされたヒトＹＦＶモノクローナル抗体（「免疫複合体」）を包含する。そのような薬剤は、ＹＦＶに対する第２の異なる抗体またはワクチンであり得る。抗ＹＦＶ抗体にコンジュゲートされ得る治療部分のタイプは、治療されるべき状態および達成されるべき所望の治療効果を考慮に入れるであろう。代替として、所望の治療効果が、ＹＦＶ感染症と関連付けられた後遺症もしくは症状、または播種性血管内凝固症、急性腎不全、および急性呼吸窮迫症候群などであるが、これらに限定されない、そのような感染症に起因する任意の他の状態を治療することである場合、状態の後遺症もしくは症状を治療するために、または本開示の抗体の任意の副作用を軽減するために適切な薬剤をコンジュゲートすることが有利であり得る。免疫複合体を形成するための好適な薬剤の例は、当技術分野で公知であり、例えば、ＷＯ０５／１０３０８１を参照されたい。
多重特異性抗体
本開示の抗体は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または１つより多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有し得る。例えば、Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０－６９、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８－２４４を参照されたい。本開示の抗体は、別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質に連結されるか、またはそれと共発現されることができる。例えば、抗体またはその断片は、第２の結合特異性を伴う二重特異性または多重特異性抗体を産生するように、（例えば、化学結合、遺伝子融合、非共有結合性会合、または他の方法によって）別の抗体または抗体断片などの１つ以上の他の分子実体に機能的に連結されることができる。
治療的投与および製剤
本開示は、本発明の抗ＹＦＶ抗体またはその抗原結合断片を含む、治療用組成物を提供する。本開示による治療用組成物の投与は、改善された移送、送達、耐性、および同等物を提供するために製剤に組み込まれる、適切な担体、賦形剤、および他の薬剤とともに投与されるであろう。多数の適切な製剤が、すべての薬剤師に公知である処方集、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡで見出されることができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性またはアニオン性）含有ベシクル（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルション、エマルションカーボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカーボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。また、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ｆｏｒ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ”ＰＤＡ（１９９８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５２：２３８－３１１も参照されたい。
本開示の抗体のそれぞれの用量は、投与される対象の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路、ならびに同等物に応じて変化し得る。本開示の抗体が、ＹＦＶ感染症を治療するために、または患者におけるＹＦＶ感染症と関連付けられた発熱、吐き気、もしくは筋肉痛などのＹＦＶ感染症と関連付けられた１つ以上の症状を治療するために、または疾患の重症度を軽減するために使用されるとき、本開示の抗体のそれぞれを静脈内または皮下に投与することが有利である。通常、抗体のそれぞれは、約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、約０．１～約２０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１～約１５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０２～約７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０３～約５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０５～約３ｍｇ／ｋｇ体重、もしくは約１ｍｇ／ｋｇ体重、または約３．０ｍｇ／ｋｇ体重、または約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約２０ｍｇ／ｋｇ体重の単回投与において投与されるであろう。複数回用量が、必要に応じて投与され得る。状態の重症度に応じて、治療の頻度および持続期間は、調整されることができる。特定の実施形態では、本開示の抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約６００ｍｇ、約５～約３００ｍｇ、または約１０～約１５０ｍｇ、～約１００ｍｇ、もしくは～約５０ｍｇの初回用量として投与されることができる。特定の実施形態では、初回用量の後に、初回用量とほぼ同じであるか、それよりも少なくあり得る量で、抗体またはその抗原結合断片の第２または複数の後続の用量の投与が続き得、後続の用量は、少なくとも１日～３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、または少なくとも１４週間で隔てられる。
様々な送達システムが公知であり、本開示の医薬組成物を投与するために使用されることができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル内のカプセル化、変異ウイルスを発現することが可能な組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照）。導入の方法には、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、任意の便宜的な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜内層（例えば、口腔粘膜、鼻粘膜、直腸および腸粘膜など）を通した吸収によって、投与され得、他の生物学的活性剤とともに投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。それは、エアロゾル化製剤として送達され得る（ＵＳ２０１１／０３１１５１５およびＵＳ２０１２／０１２８６６９を参照）。吸入によって呼吸器疾患を治療するために有用な薬剤の送達は、より広く受け入れられるようになっている（Ａ．Ｊ．Ｂｉｔｏｎｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｄｕｍｏｎｔ，（２００６），Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ，５８：１ １０６－１ １ １８を参照）。局所肺疾患を治療することに効果的であることに加えて、そのような送達機構は、抗体の全身送達のためにも有用であり得る（Ｍａｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．６，２００８を参照）。
医薬組成物はまた、小胞、特に、リポソーム内で送達されることもできる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３を参照）。
特定の状況では、医薬組成物は、制御放出システム内で送達されることができる。一実施形態では、ポンプが使用されてもよい。別の実施形態では、高分子材料が使用されることができる。さらに別の実施形態では、制御放出システムが、組成物の標的に近接して配置されることができ、したがって、全身用量のほんの一部のみを要求する。
注射可能な調合物は、静脈内、皮下、皮内、および筋肉内注射、点滴注入などのための剤形を含み得る。これらの注射可能な調合物は、公に知られている方法によって調製され得る。例えば、注射可能な調合物は、例えば、注射に従来使用される無菌水性媒体または油性媒体に、上記に記載される抗体またはその塩を溶解させ、懸濁させ、または乳化することによって調製され得る。注射用の水性媒体として、例えば、生理食塩水、グルコースおよび他の補助剤を含有する等張液などがあり、これは、アルコール（例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（水素化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０モル）付加物）］などの適切な可溶化剤と組み合わせて使用され得る。油性媒体として、例えば、ゴマ油、大豆油などが採用され、これは、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどの可溶化剤と組み合わせて使用され得る。こうして調製された注射剤は、好ましくは、適切なアンプルに充填される。
本開示の医薬組成物は、標準的な針および注射器を用いて皮下または静脈内に送達されることができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスは、本開示の医薬組成物を送達する際の用途を容易に有する。そのようなペン送達装置は、再利用可能または使い捨てであり得る。再利用可能なペン送達装置は、一般に、医薬組成物を含有する交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の医薬組成物のすべてが投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジは、容易に廃棄され、医薬組成物を含有する新しいカートリッジと交換されることができる。ペン送達デバイスは、次いで、再利用されることができる。使い捨てペン送達デバイスには、交換可能なカートリッジがない。むしろ、使い捨てペン送達デバイスは、デバイス内のリザーバー内に保持された医薬組成物で事前に充填された状態になる。リザーバーが医薬組成物を含まない状態になると、デバイス全体が廃棄される。
多数の再利用可能なペンおよび自動注入器送達デバイスは、本開示の医薬組成物の皮下送達における用途を有する。例としては、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ，ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧ ＭＩＸ ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮ ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ，Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、ならびにＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれるが、確実にこれらに限定されない。本開示の医薬組成物の皮下送達に用途を有する使い捨てペン送達デバイスの例には、ほんの数例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）、およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）自動注入器（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、ならびにＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ，Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ）が含まれるが、確実にこれらに限定されない。
有利には、上記に記載される経口または非経口使用のための医薬組成物は、有効成分の用量に適合するために適した単位用量で剤形に調製される。単位用量におけるそのような剤形には、例えば、錠剤、丸薬、カプセル、注射剤（アンプル）、坐剤などが含まれる。含有される前述の抗体の量は、一般に、単位用量における剤形あたり約５～約５００ｍｇであり、特に、注射の形態では、前述の抗体は、約５～約１００ｍｇで、他の剤形については約１０～約２５０ｍｇで含有されることが好ましい。
管理計画
いくつかの実施形態では、治療的有効量の抗ＹＦＶ抗体またはその抗原結合断片は、例えば、ＹＦＶに感染しているか、またはＹＦＶに感染するリスクがある、それを必要とする対象に提供される。「治療的有効量」という語句は、それが投与される所望の効果を生じる量を意味する。正確な量は、治療の目的に依存し、既知の技法を使用して当業者によって確認可能であろう（例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）Ｔｈｅ Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい）。
特定の実施形態によると、ＹＦＶに対する抗体の複数回用量が、定義された時間経過にわたって対象に投与され得る。本開示のこの態様による方法は、ＹＦＶに対する抗体の複数回用量を対象に連続的に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「連続的に投与すること」とは、ＹＦＶに対する抗体の各用量が、異なる時点で、例えば、所定の間隔（例えば、時間、日、週、または月）で隔てられた異なる日に、対象に投与されることを意味する。本開示は、患者にＹＦＶに対する抗体の単一の初回用量を連続的に投与することを含み、その後に、ＹＦＶに対する抗体の１回以上の二次用量、および任意に、ＹＦＶに対する抗体の１回以上の三次用量が続く、方法を含む。
「初期用量」、「二次用量」、および「三次用量」という用語は、ＹＦＶに対する抗体の投与の時間的順序を指す。したがって、「初回用量」は、治療計画の開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも称される）であり、「二次用量」は、初回用量の後に投与される用量であり、「三次用量」は、二次用量の後に投与される用量である。初回、二次、および三次用量はすべて、ＹＦＶに対する同量の抗体を含有し得るが、一般に、投与の頻度の観点から相互と異なり得る。しかしながら、特定の実施形態では、初回、二次、および／または三次用量に含有されるＹＦＶに対する抗体の量は、治療の過程の間に相互に変化する（例えば、適宜、上下に調整される）。特定の実施形態では、２回以上（例えば、２、３、４、または５回）の用量は、「負荷用量」として治療計画の開始時に投与され、その後に、より少ない頻度で投与される後続の用量（例えば、「維持用量」）が続く。
本開示の１つの例示的実施形態では、各二次および／または三次用量は、直前の投与から１～２６週間（例えば、１週間、１週間半、２週間、２週間半、３週間、３週間半、４週間、４週間半、５週間、５週間半、６週間、６週間半、７週間、７週間半、８週間、８週間半、９週間、９週間半、１０週間、１０週間半、１１週間、１１週間半、１２週間、１２週間半、１３週間、１３週間半、１４週間、１４週間半、１５週間、１５週間半、１６週間、１６週間半、１７週間、１７週間半、１８週間、１８週間半、１９週間、１９週間半、２０週間、２０週間半、２１週間、２１週間半、２２週間、２２週間半、２３週間、２３週間半、２４週間、２４週間半、２５週間、２５週間半、２６週間、２６週間半、またはそれ以上）後に投与される。本明細書で使用される場合の「直前の用量」という語句は、複数回の投与の順序で、介在する用量を伴わずにその順序で次の用量の投与の前に患者に投与される、ＹＦＶに対する抗体の用量を意味する。
本開示のこの態様による方法は、ＹＦＶに対する抗体の任意の数の二次および／または三次用量を患者に投与することを含み得る。例えば、特定の実施形態では、単一の二次用量のみが、患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、またはそれ以上）の二次用量が、患者に投与される。同様に、特定の実施形態では、単一の三次用量のみが、患者に投与される。他の実施形態では、２回以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８回、またはそれ以上）の三次用量が、患者に投与される。
複数の二次用量を伴う実施形態では、各二次用量は、他の二次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各二次用量は、直前の用量から１～２週間後に患者に投与され得る。同様に、複数の三次用量を伴う実施形態では、各三次用量は、他の三次用量と同じ頻度で投与され得る。例えば、各三次用量は、直前の用量から２～４週間後に患者に投与され得る。代替として、二次および／または三次用量が患者に投与される頻度は、治療計画の過程にわたって変化し得る。投与の頻度はまた、臨床検査に続く個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療の過程の間に調整され得る。
したがって、特定の実施形態では、本明細書および全体を通して開示される本発明の抗体またはその抗原結合断片のうちの１つ以上と、薬学的に許容される担体および／または１つ以上の賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。特定の他の実施形態では、１つ以上の本発明の抗体またはその抗原結合断片をコードする１つ以上の核酸、またはそのような核酸を含む１つ以上の発現ベクターと、薬学的に許容される担体および／または１つ以上の賦形剤とを含む、医薬組成物が提供される。
抗体の治療的使用
本明細書に開示される抗ＹＦＶ抗体は、ＹＦＶがある対象を治療し、および／またはＹＦＶ感染症を予防するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、および「治療すること」という用語は、１つ以上の治療法の投与（１つ以上の予防または治療薬の投与を含むが、これに限定されない）に起因する、ＹＦＶ感染症、またはそれに関連する症状もしくは状態（発熱、悪寒、頭痛、腰痛、筋肉痛、食欲不振、吐き気、嘔吐、倦怠感、またはそれらの組み合わせ）の進行、重症度、および／または持続時間の低減または改善を指す。特定の実施形態では、そのような用語は、ＹＦＶの複製の低減もしくは阻害、他の対象へのＹＦＶの蔓延の阻害もしくは低減、ＹＦＶによる細胞の感染の阻害もしくは低減、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた１つ以上の症状の改善を指す。
本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防すること」、および「予防」という用語は、対象におけるＹＦＶ感染症またはそれに関連する状態の発症または発病の予防もしくは阻害、治療法（例えば、予防または治療薬）の投与に起因するＹＦＶ感染症またはそれに関連する状態の進行の予防もしくは阻害、ＹＦＶ感染症またはそれに関連する状態の症状の予防、または治療の組み合わせ（例えば、予防または治療薬の組み合わせ）の投与を指す。本明細書で使用される場合、「改善する」および「軽減する」という用語は、状態またはその任意の症状の重症度の低減または減少を指す。
ＹＦＶへのそれらの結合およびそれとの相互作用のために、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、いずれの理論にも拘束されることを所望することなく、宿主細胞膜とのウイルスの融合を防止するため、細胞間ウイルス蔓延を防止するため、およびシンシチウム形成の阻害のために有用であると考えられる。代替として、本開示の抗体は、発熱、下痢、および出血などの感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を改善するために、または感染症の重症度、持続期間、および／または頻度を軽減するために有用であり得る。本開示の抗体はまた、ＹＦＶ感染症を発症または獲得するリスクのある患者における予防的使用のために企図される。本開示の抗体は、ＹＦＶ感染症を治療するため、またはそのような感染症と関連付けられるか、もしくはそれに起因する、発熱、吐き気、または筋肉痛などのＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症を軽減するために、単独で、または第２の薬剤もしくは第３の薬剤と併せて使用され得ると企図される。第２または第３の薬剤は、本開示の抗体と同時に送達され得るか、またはそれらは、本開示の抗体の前もしくは後のいずれかで別個に投与され得る。第２または第３の薬剤は、抗ウイルス剤、発熱または痛みを軽減するためのＮＳＡＩＤまたは他の薬剤、ＹＦＶに特異的に結合する別の第２であるが異なる抗体、別のＹＦＶ抗原に結合する薬剤（例えば、抗体）、ＹＦＶに対するワクチン、およびＹＦＶ抗原に特異的なｓｉＲＮＡであり得る。
本開示のその上さらなる実施形態では、本抗体は、ＹＦＶ感染症に罹患している患者を治療するための医薬組成物の調製に使用される。本開示のさらに別の実施形態では、本抗体は、ＹＦＶによる一次感染の重症度を低減するため、または感染症の持続期間を短縮するため、もしくはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を低減するための医薬組成物の調製に使用される。本開示のさらなる実施形態では、本抗体は、抗ウイルス剤、トキソイド、ワクチン、第２のＹＦＶ抗体、もしくはＹＦＶ抗原に特異的な任意の他の抗体を含む、ＹＦＶ感染症を治療するために有用な任意の他の薬剤を用いた補助療法、または当業者に公知である任意の他の緩和療法として使用される。
したがって、特定の実施形態では、ＹＦＶ感染症が治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状が治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減されるように、例えば、表３に開示される抗ＹＦＶ抗体のうちの１つ以上などの本明細書および全体を通して開示される本発明の抗体またはその抗原結合断片のうちの１つ以上を、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に投与することを含む、ＹＦＶ感染症、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する方法が提供される。
特定の他の実施形態では、ＹＦＶ感染症が治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状が治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減されるように、表３に開示されるアミノ酸配列およびその補体をコードする核酸配列などの本発明の抗体またはその抗原結合断片のうちの１つ以上をコードする核酸を、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に投与することを含む、ＹＦＶ感染症、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する方法が提供される。
追加の実施形態では、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に、核酸配列を含む宿主細胞またはそのような核酸配列を含む発現ベクターを投与することを含む、ＹＦＶ感染症、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する方法が提供され、そのような核酸配列は、ＹＦＶ感染症が治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状が治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減されるように、表３に開示される配列から選択されるアミノ酸配列をコードする。
追加の実施形態では、ＹＦＶ感染症が治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状が治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減されるように、表３に開示される本発明の抗体またはその抗原結合断片、そのような核酸配列が表３に開示される配列から選択されるアミノ酸配列およびその補体をコードする、１つ以上の核酸配列またはそのような核酸配列を含む発現ベクター、そのような核酸配列が表３に開示される配列から選択されるアミノ酸配列およびその補体をコードする、１つ以上の核酸配列を含む１つ以上の宿主細胞、またはそのような１つ以上の核酸配列を含む発現ベクター、ならびに薬学的に許容される担体および／または１つ以上の賦形剤のいずれかを含む、医薬組成物を、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に投与することを含む、ＹＦＶ感染症、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する方法が提供される。
特定の実施形態では、ＹＦＶ感染症が治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状が治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減されるように、例えば、表３に開示される抗ＹＦＶ抗体のうちの１つ以上などの本明細書および全体を通して開示される本発明の抗体またはその抗原結合断片のうちの１つ以上を、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に投与することを含む、ＹＦＶ感染症、または該ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する方法が提供される。
特定の他の実施形態では、ＹＦＶ感染症が治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状が治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減されるように、表３に開示されるアミノ酸配列およびその補体をコードする核酸配列などの本発明の抗体またはその抗原結合断片のうちの１つ以上をコードする核酸を、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に投与することを含む、ＹＦＶ感染症、または該ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する方法が提供される。
追加の実施形態では、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に、核酸配列を含む宿主細胞またはそのような核酸配列を含む発現ベクターを投与することを含む、ＹＦＶ感染症、または該ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する方法が提供され、そのような核酸配列は、ＹＦＶ感染症が治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状が治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減されるように、表３に開示される配列から選択されるアミノ酸配列およびその補体をコードする。
追加の実施形態では、ＹＦＶ感染症が治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状が治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減されるように、表３に開示される本発明の抗体またはその抗原結合断片、そのような核酸配列が表３に開示される配列から選択されるアミノ酸配列およびその補体をコードする、１つ以上の核酸配列またはそのような核酸配列を含む発現ベクター、そのような核酸配列が表３に開示される配列から選択されるアミノ酸配列およびその補体をコードする、１つ以上の核酸配列を含む１つ以上の宿主細胞、またはそのような１つ以上の核酸配列を含む発現ベクター、ならびに薬学的に許容される担体および／または１つ以上の賦形剤のいずれかを含む、医薬組成物を、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に投与することを含む、ＹＦＶ感染症、または該ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する方法が提供される。
併用療法
上記のように、特定の実施形態によると、開示される方法は、ＹＦＶに対する抗体と組み合わせて１つ以上の追加の治療薬を対象に投与することを含む。本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」という表現は、追加の治療薬が、抗ＹＦＶ抗体を含む医薬組成物の前、後、または同時に投与されることを意味する。「と組み合わせて」という用語はまた、抗ＹＦＶ抗体および第２の治療薬の連続または同時投与を含む。
例えば、抗ＹＦＶ抗体を含む医薬組成物の「前」に投与されるとき、追加の治療薬は、抗ＹＦＶ抗体を含む医薬組成物の投与の約７２時間、約６０時間、約４８時間、約３６時間、約２４時間、約１２時間、約１０時間、約８時間、約６時間、約４時間、約２時間、約１時間、約３０分、約１５分、または約１０分前に投与され得る。抗ＹＦＶ抗体を含む医薬組成物の「後に」投与されるとき、追加の治療薬は、抗ＹＦＶ抗体を含む医薬組成物の投与から約１０分、約１５分、約３０分、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間、または約７２時間後に投与され得る。「同時」投与または抗ＹＦＶ抗体を含む医薬組成物との投与は、追加の治療薬が、抗ＹＦＶ抗体を含む医薬組成物の投与の５分以内に（投与の前、後、または同時に）別個の剤形で対象に投与されるか、または追加の治療薬および抗ＹＦＶ抗体の両方を含む単一の複合剤形として対象に投与されることを意味する。
併用療法は、本開示の抗ＹＦＶ抗体と、本開示の抗体または本開示の抗体の生物学的活性断片と有利に組み合わせられ得る任意の追加の治療薬とを含み得る。
例えば、抗ウイルス剤などの第２または第３の治療薬が、肝臓内のウイルス量を低減することを支援するために採用され得る。抗体はまた、トキソイド、ＹＦＶに特異的なワクチン、ＹＦＶに特異的な二次抗体、または別のＹＦＶ抗原に特異的な抗体を含む、上記のような他の治療法と併せて使用され得る。
抗体の診断的使用
本発明の抗ＹＦＶ抗体およびその抗原結合断片はまた、例えば、診断目的のために、サンプル中のＹＦＶを検出および／または測定するために使用され得る。ＹＦＶによって引き起こされると考えられる感染症の確認は、本開示の抗体のうちのいずれか１つ以上の使用を通してウイルスの存在を測定することによって行われ得ると想定される。ＹＦＶのための例示的診断アッセイは、例えば、患者から取得されたサンプルを本開示の抗ＹＦＶ抗体と接触させることを含み得、ＹＦＶ抗体は、検出可能な標識もしくはレポーター分子で標識されるか、または患者サンプルからタンパク質を含有するウイルスを選択的に単離するために捕捉リガンドとして使用される。代替として、非標識ＹＦＶ抗体が、それ自体が検出可能に標識される二次抗体と組み合わせて診断用途で使用されることができる。検出可能な標識またはレポーター分子は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉなどの放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネートもしくはローダミンなどの蛍光もしくは化学発光部分、またはアルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、もしくはルシフェラーゼなどの酵素であり得る。サンプル中のＹＦＶを検出または測定するために使用され得る具体的な例示的アッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）が含まれる。
本開示によるＹＦＶ診断アッセイで使用され得るサンプルには、正常または病理学的条件下で検出可能な量のＹＦＶタンパク質またはその断片を含有する、患者から取得された任意の組織または流体サンプルが含まれる。一般に、健康な患者（例えば、ＹＦＶの存在と関連付けられた疾患または状態に罹患していない患者）から取得された特定のサンプル中のＹＦＶのレベルが、ＹＦＶタンパク質のベースラインまたは標準レベルを最初に確立するために測定されるであろう。このベースラインレベルのＹＦＶは、次いで、ＹＦＶ感染症またはそのような感染症と関連付けられた症状を有すると疑われる個人から取得されたサンプルにおいて測定されたＹＦＶのレベルに対して比較されることができる。
ＹＦＶに対するヒト抗体応答は、ＹＦＶ－１７Ｄによる免疫化に続いて、２人のフラビウイルス未感染ドナーのメモリーＢ細胞から１５２個のＹＦＶ特異的モノクローナル抗体を単離および特性評価することによって、包括的にプロファイリングされ、これらの抗体は、次いで、ＹＦＶの抗原トポロジーをマッピングするために使用された。取得された抗ＹＦＶ抗体は、いくつかの抗原部位に結合し、最も一般的には、ＹＦＶ Ｅタンパク質のドメインＩＩのＦＬ内またはＦＬの近位のエピトープを標的とし、したがって、ドメインＩＩを標的とするＹＦＶ抗体の開発のための支援を提供することが見出された。しかしながら、非常に強力な中和活性を伴う２番目にあまり一般的ではないクラスの抗体が、ウイルスのＤＩＩＩを標的とすることが見出された。そのようなＤＩＩＩ指向型抗体は、このエピトープが自然免疫応答において準優占であるため、モノクローナル抗体またはカクテルの治療的用途との関連で特に重要であり得る。まとめると、これらの結果は、ＹＦＶワクチンおよび抗体ベースの治療候補の設計および評価に影響を及ぼし、受動的予防のための新しいオプションを提供する。
研究設計：２人のフラビウイルス未感染の健康な成人ドナー（「ドナー８」および「ドナー９」）が、ＹＦＶ－１７Ｄワクチン（Ｓｔａｍａｒｉｌ、Ｓａｎｏｆｉ）で免疫化され、血液サンプルが、ワクチン接種後１０、１４、２８、９０、１８０、２７０および３６０日に収集された。ＹＦＶ－１７Ｄに対する血清中和活性は、ワクチン接種後１４日目までに両方のドナーに現れ、研究の過程を通して持続した（図１ａ）。両方のドナーからのワクチン接種前の血清は、ＹＦＶ－１７Ｄとの反応性を欠き、ＹＦＶ－１７Ｄに対して検出可能な中和活性を示さず（データは示されていない）、また、他の一般的に循環するフラビウイルス、すなわち、デングウイルス血清型１－４（ＤＥＮＶ１－４）、ＪＥＶ、ＴＢＥＶ、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、およびジカウイルス（ＺＩＫＶ）からのＥおよびＮＳ１タンパク質との反応性も欠き、両方のドナーがワクチン接種時にフラビウイルス未感染である可能性が高いことを確認した（データは示されていない）。
ＹＦＶ－１７Ｄ誘導型形質芽細胞応答の分子的および機能的特性評価
両方のドナーにおける形質芽細胞応答が、ワクチン接種後１０日と１４日に監視された。両方のドナーでは、ワクチン接種前のレベルよりも約１０倍大きい拡張した形質芽細胞集団が、１０日および１４日時点の両方で観察された（図２ａ）。各ドナーからの約３００個の形質芽細胞が選別され、単一細胞ＰＣＲによって対応するＶＨおよびＶＬ領域を増幅した。１６１および２１０個の自然に対になった抗体が、それぞれ、ドナー８およびドナー９からクローン化され、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子操作された株で完全長ＩｇＧとして発現された。配列分析は、形質芽細胞応答が両方のドナーで非常に多様であり、クローンの約１５％のみが拡張クローン系統に属することを示した（データは示されていない）。両方のドナーからの形質芽細胞由来抗体の大部分は、高レベルの体細胞超変異（ＳＨＭ）を含有し、ＰＢ応答へのＭＢＣの効率的な動員を示唆した（データは示されていない）。ＰＢ由来ｍＡｂ中のＳＨＭの中央値は、１４日目よりも１０日目で有意に高かった。対応して、１４日目のＰＢからクローン化されたｍＡｂの大部分は、ＳＨＭを欠き、この時点でナイーブＢ細胞コンパートメントからの細胞の動員の増加を示唆した（データは示されていない）。
ＰＢ由来ｍＡｂにおける体細胞変異が結合活性に寄与するかどうかを分析するために、推定される未変異共通祖先（ＵＣＡ）ｍＡｂが、３つの体細胞変異ＰＢクローンから生成され、組換えＹＦＶ Ｅタンパク質へのそれらの結合親和性が測定された。３つすべての場合において、ＵＣＡ ｍＡｂは、成熟ｍＡｂと比較して実質的に低減した結合親和性を示し、ＰＢ ｍＡｂにおける体細胞変異がＹＦＶ Ｅの認識のために重要であることを示唆した（図３）。
ＰＢ由来ｍＡｂが、次いで、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＹＦＶ－１７Ｄ粒子への結合反応性について検査された（図２ｂ）。１０日目および１４日目のＰＢから単離されたＹＦＶ－１７Ｄ結合ｍＡｂの頻度は、８～４１％に及んだ。４５および４６個のＹＦＶ－１７Ｄ結合ｍＡｂが、それぞれ、ドナー８および９の拡張ＰＢ集団から回収され、次いで、１００および１０ｎＭ濃度においてマイクロタイター中和アッセイでｍＡｂの中和活性を分析した。中和活性は、１０ｎＭでの完全中和から１００ｎＭでの検出可能な中和なしにまで及んだ（図２ｃ）。１４日目のＰＢから単離されたｍＡｂのより高い割合が、１０日目のＰＢから単離されたものと比較して中和活性を示し、これは、両方のドナーにおける１０日目と対比した１４日目の血清中和活性の増加と一致する（データは示されていない）。１００ｎＭで少なくとも５０％感染阻害を示すｍＡｂへの中和滴定実験は、１４日目のＰＢから単離されたＹＦＶ－１７Ｄ結合ｍＡｂの９～１２％が中程度から高い中和活性（ＩＣ５０≦１０ｎＭ）を示すことを明らかにした（図２ｄおよび図４）。配列分析は、ＰＢ由来ｎＡｂの１２．５～３３％がＶＨ４－４／ＶＬ１－５１生殖細胞系列遺伝子対合を利用することを示し、共通の抗原部位の認識を示唆した（データは示されていない）。
それぞれ、ドナー８および９から単離された中和抗体の約５０％および２２％は、体細胞変異を欠き、ＹＦＶ－１７Ｄ中和抗体がナイーブＢ細胞レパートリーに存在することを示し、ＹＦＶ－１７Ｄワクチン接種がナイーブおよびＭＢＣの両方から生じるＰＢ応答を誘導し、これらのＢ細胞のごく一部のみが中和活性を示すＡｂをコードすることを示唆する。図１ａおよび１ｂを参照されたい。
ＹＦＶ－１７Ｄ誘導型ＭＢＣ応答の分子的および機能的特性評価
両方のドナーにおけるＭＢＣ応答が、ワクチン接種後１４、２８、９０、１８０、２７０、および３６０日目にＰＢＭＣを収集することによって監視され、精製Ｂ細胞が、前述のＢ細胞表面マーカー（ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ２１、およびＣＤ７１）ならびに蛍光標識された組換えＹＦＶ Ｅタンパク質のパネルで染色された（図５ａ）。ＹＦＶ Ｅ特異的ｓｗＩｇ＋ ＭＢＣは、１４～２８日目までに両方のドナーで出現し、９０～１８０日目にピークに達し、１８０～３６０日目にゆっくりと減少した（図５ｂ）。
１００～４００個のＹＦＶ Ｅ反応性Ｂ細胞が、各サンプリング時点で両方のドナーから選別された。ナイーブＢ細胞由来の非結合ｍＡｂが、採用された選別方略を介して捕捉されたが、後続の分析から除外された。単一細胞選別されたＹＦＶ Ｅ反応性Ｂ細胞上で発現されたＢ細胞表面マーカーの分析は、ＹＦＶ Ｅに対するＭＢＣ応答がすべての時点で非常に不均一であることを明らかにした（データは示されていない）。最も早いサンプリング時点（１４日目）で、活性化されたナイーブＢ細胞およびＩｇＭ＋ＣＤ２７＋ＭＢＣが両方のドナーにおける応答を支配したが、これらのＢ細胞集団は、経時的に急速に減弱した。９０日目までに、ＹＦＶ Ｅ特異的応答の１５％未満が、ＩｇＭ＋ＣＤ２７＋ＭＢＣで構成され、３６０日目までに、ＹＦＶ Ｅ特異的Ｂ細胞の約５％のみが、このＭＢＣ集団に属した（図８ｂ）。対照的に、ＣＤ２７＋細胞およびＣＤ２７－Ｂ細胞の両方で構成されたｓｗＩｇ＋ＭＢＣ集団は、１４日目～９０日目に拡張し、次いで、研究の過程の全体を通して安定したままであった。ＹＦＶ－１７Ｄワクチン接種に続いて観察されたＭＢＣ応答はまた、ＰＵＵＶによる自然感染に続いても観察された（データは示されていない）。
ＹＦＶ Ｅ特異的ｍＡｂのＳＨＭ負荷、見かけの結合親和性（ＫＤＡｐｐｓ）、および中和能力が、各サンプリング時点で追跡された。両方のドナーでは、ＳＨＭの中央値レベルは、１４日目で低く、Ａｂの５０％超が体細胞変異を欠き、６～９か月の期間にわたって徐々に増加し、それぞれ、ドナー８および９のＶＨにおける９および７個のヌクレオチド置換の中央値を伴って、ワクチン接種後９か月までに両方のドナーで横ばい状態になった（データは示されていない）。組換えＹＦＶ Ｅタンパク質を用いた結合研究は、ＭＢＣ由来ｍＡｂのＫＤＡｐｐｓが早い時点では非常に弱く、ワクチン接種に続いて６～９か月間に次第に改善することを示した（データは示されていない）。ワクチン接種後１４日目および２８日目に、ＹＦＶ Ｅ特異的ｍＡｂの大部分が、ＫＤＡｐｐｓ＞５０ｎＭを示した一方で、１８０日目までに、ＹＦＶ Ｅ特異的ｍＡｂの５０％は、ＫＤＡｐｐｓ＜５ｎＭを示した。親和性の増加と並行して、９０日目から始まって、非常に強力な中和抗体（ＩＣ５０＜１ｎＭ）の出現が観察された（データは示されていない）。これらの中和抗体は、非定型ＩｇＭ＋および／またはＩｇＤ＋ＭＢＣを含む複数のＭＢＣサブセットに由来した（データは示されていない）。表２は、単離および特性評価された中和ｍＡｂの親和性および中和データを要約する。
進行中のＢ細胞活性化が、ＹＦＶ Ｅ特異的ＭＢＣ上のＣＤ７１およびＣＤ２１の発現を分析することによって評価された。ＣＤ７１は、１４日目に７５～８５％のＹＦＶ Ｅ特異的Ｂ細胞上で発現され、両方のドナーで約６か月間上昇したままであった（データは示されていない）。両方のドナーでは、ＹＦＶ Ｅ特異的ＣＤ２１ｌｏ細胞は、ＹＦＶ Ｅ特異的応答の約４０～８０％を含み、ワクチン接種後１４日目および２８日目に高頻度で存在し、次いで、９０日目までに急速に減少した。ＣＤ７１＋集団とＣＤ２１ｌｏの集団との間に高度な重複があり、ＹＦＶ Ｅ特異的活性化Ｂ細胞（ＣＤ７１＋および／またはＣＤ２１ｌｏとして定義される）の５０～８０％が１４日目にＣＤ７１＋ＣＤ２１ｌｏ表現型を示したが、２８～９０日目までに、ＣＤ７１＋ＣＤ２１ｌｏ集団は、両方のドナーで活性化Ｂ細胞応答の＜５０％まで減弱し、ＹＦＶ Ｅ特異的活性化Ｂ細胞の大部分は、ＣＤ７１＋ＣＤ２１＋またはＣＤ７１─ＣＤ２１ｌｏ表現型のいずれかを示し、アイソタイプおよびＣＤ２７発現に関して不均一であった（データは示されていない）。
抗ＹＦＶ抗体の単離および特性評価
約１５２個の中和モノクローナル抗体が、単離および特性評価された。抗体可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）鎖遺伝子が、単一細胞ＰＣＲによって救出された。Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３２９，１１２－１２４．同族重鎖および軽鎖対が、続いて、クローン化され、さらなる特性評価のためにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子操作された株で完全長ＩｇＧとして発現された。Ｂｏｒｎｈｏｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，１０７８－１０８３．
単離されたｍＡｂの生殖細胞系列遺伝子の使用が、分析された。両方のドナーでは、ＶＨ３－７２生殖細胞系列遺伝子を利用するｍＡｂが、すべての時点で応答を支配した（図６ａ）。これらのｍＡｂの大部分はまた、５つの優勢な軽鎖（ＬＣ）生殖細胞系列遺伝子のうちの１つも利用し、平均より短い重鎖（ＨＣ）相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）の長さを示し、抗原認識の共有モードを示唆した（図６ｂ－ｃ）。ＶＨ３－７２を利用するｍＡｂの結合親和性は、類似レベルのＳＨＭを含有するにもかかわらず、他のＶＨ生殖細胞系列を利用するｍＡｂについて観察されたものよりも有意に高かった（図６ｄ－ｅ）。表１は、単離されたｍＡｂについて生殖細胞系列の使用およびヌクレオチド置換の数を要約する。
単離されたｍＡｂのエピトープ対象範囲を調査するために、一対競合実験が、新たに単離されたｍＡｂ、およびＹＦＶ ＥモノマーのＤＩＩ内の近位であるが重複しないエピトープを認識する、２つの十分に特性評価された対照ｍＡｂである４Ｇ２および５Ａを使用して実施された。４Ｇ２が、ＦＬを標的とする汎フラビウイルスｍＡｂである一方で、５Ａは、提案されたｐｒＭ会合領域と重複するＦＬ近位エピトープに結合するＹＦＶ Ｅ特異的ｍＡｂである。競合実験は、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ機器上で高スループット表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して実施された。ＢＬＩによる組換えＹＦＶ－１７Ｄ ＤＩＩＩタンパク質とのｍＡｂの反応性もまた、評価された。ｍＡｂの大部分は、ＤＩＩＩとの反応性、ならびに４Ｇ２、５Ａ、および新たに単離されたｍＡｂのうちの３つ（ＡＤＩ－４９１４７、ＡＤＩ－４４１１２、およびＡＤＩ－４５１０７）との競合に基づいて定義された、８つの明確に異なる抗原部位のうちの１つを認識した（図７ａ）。ｍＡｂのサブセットは、５ＡおよびＡＤＩ－４５１０７の両方と競合し、これら２つの抗原部位が近接していることを示唆した。ｍＡｂのわずかなサブセット（７７２個のうち６つ）が、ＤＩＩＩ内のエピトープを認識した。ＤＩＩＩ指向型ｍＡｂのうちの５つが、交差競合した一方で、第６のＡＤＩ－４８９４５は、独自のエピトープを認識し得る。両方のドナーからのｍＡｂの半分以上が、４Ｇ２および／または５Ａと競合し、ＹＦＶ Ｅ特異的応答の大部分が、ＤＩＩ上のＦＬ内またはＦＬの近位のエピトープを標的とするＡｂによって媒介されることを示唆した（図７ａ）。ＶＨ３－７２生殖細胞系列遺伝子を利用したほぼすべてのｍＡｂが、４Ｇ２と競合した（図７ｂ）。したがって、競合群によってクラスター化されたｍＡｂの配列特徴の分析は、４Ｇ２と競合したｍＡｂの半分以上がＶＨ３－７２生殖細胞系列遺伝子を利用することを明らかにした（図７ｃ）。ＶＨ３－７２を利用する４Ｇ２競合ｍＡｂは、他のＶＨ生殖細胞系列遺伝子を利用するものと比較して有意に高い親和性を示した（図７ｄ）。各抗原部位を標的とするｍＡｂの割合は、経時的に劇的に変化しなかったが、４Ｇ２／５Ａ競合ｍＡｂの抑制が、ドナー８において以降の時点（２７０日目および３６０日目）で観察された。さらに、両方のドナーで、５ＡおよびＡＤＩ－４５１０７の両方と競合するｍＡｂは、２８～９０日目まで出現しなかった。結果は、ＹＦＶ Ｅ特異的応答の大部分が、ドメインＩＩ上のＦＬ内またはＦＬの近位のエピトープに対して指向され、ＹＦＶ－１７Ｄに対するＢ細胞応答の成熟中にＡｂ免疫優勢階層にわずかな偏移のみがあることを示唆する。
非常に強力な中和抗体は、ＦＬ近位エピトープを認識する。
抗原部位と中和能力との関係が、調査された。５Ａのみ、または５ＡおよびＡＤＩ－４５１０７の両方のいずれかと競合したｍＡｂの９０％超が、中和活性を示した（図８ａ）。パネル内の非常に強力な中和抗体（ＩＣ５０＜１ｎＭ）の大部分（７８％）は、これら２つの競合群に属した（図８ｂ－８ｃ）。表２は、これらの抗体のビンデータを示す。これらの５Ａのみまたは５Ａ／ＡＤＩ－４５１０７競合中和抗体の配列特徴の分析は、ほぼ４０％がＶＨ４－４／ＶＬ１－５１生殖細胞系列遺伝子対合を利用し、収束ＣＤＲＨ３配列の証拠を示さなかったことを明らかにし、生殖細胞系列でコードされた抗原認識の共通モードを示唆した（図８ｄ）。以前の研究と一致して、ほとんどのＤＩＩＩ指向型ｍＡｂもまた、非常に強力な中和活性を示した。５Ａ競合物質およびＤＩＩＩ指向型ｍＡｂとは対照的に、他の競合群に属する少数のｍＡｂのみが、中和活性を示した。例えば、それぞれ、４Ｇ２のみ、または４Ｇ２および５Ａの両方と競合する、ｍＡｂの１２％および２０％のみが、中和ＩＣ５０＜１００ｎＭを示した。結果は、ＹＦＶ－１７Ｄに対するｎＡｂ応答が、主に、ＹＦＶ Ｅタンパク質のＤＩＩ内のＦＬ近位エピトープを認識するＡｂによって媒介されることを実証する。
ｍＡｂのサブセットは、他のフラビウイルス由来のＥタンパク質との交差反応性を示す。
単離されたｍＡｂは、組換えＤＥＮＶ－２、ＤＥＮＶ－４、ＷＮＶ、またはＺＩＫＶ Ｅタンパク質への結合反応性について評価された。両方のドナーでは、ＹＦＶ Ｅ反応性ｍＡｂの約６％は、少なくとも１つの異種フラビウイルスＥタンパク質に対する交差反応性を示した（図９ａ）。これらの交差反応性ｍＡｂの大部分は、高度に保存されたＦＬエピトープを標的とし、高い見かけの強い親和性（ＫＤＡｐｐｓ＜１０ｎＭ）で５つすべてのフラビウイルスＥタンパク質に結合した（図９ｂ－９ｃ）。対応して、ＦＬの外側のエピトープに結合したｍＡｂのわずかなサブセットは、一般に、より限定された交差反応性プロファイルおよびより低いＫＤＡｐｐｓを示した（図９ｃ）。５０個の交差反応性ｍＡｂのうちの６つのみが、ＹＦＶ－１７Ｄに対して中和活性を示し、単一のｍＡｂであるＤＩＩＩ結合剤ＡＤＩ－４８９０５のみが、ＺＩＫＶに対して検出可能であるが弱い中和活性（約１００ｎＭのＩＣ５０）を示した。ｍＡｂのうちのいずれも、ウエストナイルウイルスまたは日本脳炎ウイルスレポーターウイルス粒子に対して測定可能な中和活性を有していなかった。ＹＦＶ－１７Ｄワクチン接種は、したがって、広範なフラビウイルス結合活性を示すＡｂのサブセットを誘導すると思われ、その大部分は、高度に保存されたＦＬを標的とし、交差中和活性をほとんどまたはまったく示さない。
以下の表１は、本明細書に記載されるような１５２個の抗ＹＦＶ抗体の生殖細胞系列の使用およびアミノ酸配列情報を提供する。表１に提供される配列は、各列挙された抗体について、ＣＤＲＨ３配列（配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２７、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、および３０２）、ならびにＣＤＲＬ３配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９ ２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、および３０３）を含む。
以下の表２は、表１に記載される１５２個の抗ＹＦＶ抗体の親和性および中和データを示す。
以下の表３は、表１に記載される１５２個の抗ＹＦＶ抗体のそれぞれの重鎖および軽鎖のＣＤＲについて部分アミノ酸配列を提供する。ＣＤＲは、太字／下線付きで示される。各ＣＤＲアミノ酸配列はまた、配列リストに別個に列挙される（ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２は、配列番号６０７～８４０に対応し、ＣＤＲＬ１およびＣＤＲＬ２は、配列番号８４１～１００５に対応する）。
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材料および方法
研究設計
３０歳および３１歳の研究対象が、ＹＦＶ－１７Ｄ Ｓｔａｍａｒｉｌワクチンを接種された。ヘパリン添加血液（５０～１００ｃｃ）が、ワクチン接種前、ならびにワクチン接種に続いて１０、１４、２８、９０、１８０、２７０、および３６０日目に対象から取得された。サンプルが、血漿を取得するため、および末梢血由来のＢ細胞を単離するために、Ｇｅｉｓｅｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ Ｄａｒｔｍｏｕｔｈの免疫監視およびフローサイトメトリー中核研究室で処理された。単離された細胞および血漿は、－８０℃においてアリコートで凍結保存された。
細胞：Ｈｕｈ ７．５．１細胞（Ｄｒ．Ｊａｎ Ｃａｒｅｔｔｅから受領、元々はＤｒ．Ｆｒａｎｋ Ｃｈｉｓａｒｉから受領）が、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して３～４日毎に継代され、１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｇｉｂｃｏ）、１％Ｇｌｕｔａ－ＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、および２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｇｉｂｃｏ）内で維持された。ベロアフリカグリベットモンキー腎臓細胞（ＡＴＣＣから入手）が、０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ）を使用して３～４日毎に継代され、２％熱不活化胎児ウシ血清（ＦＢＳ、Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｇｉｂｃｏ）、１％Ｇｌｕｔａ－ＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、および２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）を補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ高グルコース、Ｇｉｂｃｏ）内で維持された。
黄熱病ウイルス１７Ｄ生成：ＹＦＶ－１７Ｄは、ＢＥＩ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（カタログ番号ＮＲ－１１５）から入手された。８０％の密集度においてＨｕｈ ７．５．１を伴う１５ｃｍプレートが、３７℃および５％ＣＯ２において１時間、３ｍＬの感染培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、７％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、１％Ｇｌｕｔａ－ＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ））中のＹＦＶ－１７Ｄ上清の９０μＬの２代継代原液を感染させられた。３日後、上清は、回収され、細胞残屑を除去するために４℃において１５分間、４，０００ｒｐｍで２回遠心分離された。中和アッセイのためのＹＦＶ－１７Ｄウイルス原液は、２ｍＬの３０％（ｖ／ｖ）Ｄ－スクロース／ＰＢＳ緩衝を通した４時間のＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ ＬＥ－８０Ｋ超遠心分離機内のＳＷ２８ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用した２８，０００ｒｐｍにおける事前に取り除かれた上清の超遠心分離によって、生成された。ペレットは、３００μｌのＰＢＳ中の氷上で一晩再懸濁させられ、その後、等分され、－８０℃で凍結された。
ジカウイルス生成：ジカウイルス株ＭＲ ７６６は、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ－８４（商標））から入手された。中和アッセイのために、８０％の密集度においてベロ細胞を伴う１５ｃｍプレートが、３７℃および５％ＣＯ２において１時間、３ｍＬの感染培地（ＤＭＥＭ低グルコース（Ｇｉｂｃｏ）、２％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、１％Ｇｌｕｔａ－ＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ））中のジカ上清の９０μＬの１代継代原液を感染させられた。３日後、上清は、回収され、細胞残屑を除去するために４℃において１５分間、４，０００ｒｐｍで２回遠心分離された。
抗原および抗体
組換えＹＦＶ抗原の産生：ＹＦＶ Ａｓｉｂｉ株（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ６ＤＶ８８、ゲノムポリタンパク質の残基１２２～６７８）のｐｒＭおよび可溶性Ｅ（ｓＥ）領域全体のためのコード領域は、Ｃ末端二重ストレップタグをコードする昆虫発現であるｐＭＴ－ｐｕｒｏにクローン化された。発現構築物設計は、フラビウイルス抗原６１、６２、６３の以前に発表された構造に基づいた。ＹＦＶ ｐｒＭ／Ｅ構築物は、誘導性の安定したショウジョウバエＳ２系統を生成するために使用された。タンパク質発現が、硫酸銅の添加により誘導され、５～７日間進行させられた。組換えタンパク質が、ＳｔｒｅｐＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて培養上清から親和性精製された。追加の精製ステップが、Ｓ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィーステップを使用して、実行された。最終的なタンパク質調合物は、追加の１５０ｍＭのＮａＣｌを補充されたｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水中で保存された。少量のアリコートが、使用まで－７０℃で保存された。この研究で使用された追加のフラビウイルス抗原、すなわち、ＤＥＮＶ－２ Ｅ、ＤＥＮＶ－４ Ｅ、ＷＮＶ Ｅ、およびＺＩＫＶ Ｅは、本質的にＹＦＶ ｓＥについて記載されるように発現および精製された。
フラビウイルスＮＳ１タンパク質抗原：デングウイルス（血清型１～４）、ＪＥＶ、ＴＢＥＶ、ＷＮＶ、ＹＦＶ由来のＮＳ１タンパク質は、Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ（カタログ番号ＦＬＡＶＸ４－ＮＳ１－１００およびＤＥＮＶＸ４－ＮＳ１－１００）から購入され、ＺＩＫＶ ＮＳ１は、Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ（カタログ番号Ｒ０１６３６）から購入された。上記のＮＳ１タンパク質に反応する陽性対照抗体、すなわち、抗ＤＥＮＶ ＮＳ１（カタログ番号ＡｂＤＥＮＶＮＳ１－ＤＡ０３４）、抗ＺＩＫＶ ＮＳ１抗体（カタログ番号ＡｂＺＩＫＶＮＳ１－Ｂ４－１００）は、Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙから入手された。抗ＹＦＶ ＮＳ１タンパク質抗体は、Ｍｅｒｉｄａｉｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（カタログ番号Ｃ０１９０６Ｍ）から購入された。抗ＷＮＶ ＮＳ１抗体（カタログ番号ＨＭ４８４－Ｘ０６３２）および抗ＴＢＥＶ ＮＳ１抗体（カタログ番号ＨＭ４７７－Ｘ１４６２）は、Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｂｉｏから購入された。フラビウイルス交差反応性血清が、ＪＥＶ ＮＳ１タンパク質を検出するために使用された。
ＹＦＶ－１７Ｄ ＤＩＩＩタンパク質：ＹＦＶ－１７Ｄ Ｅタンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０３３１４）のＤＩＩＩ領域（ａａ ２９３－３９７）は、修飾ｐＴ３５０ベクター（Ｆｅｌｉｘ Ｒｅｙ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用してショウジョウバエＳ２細胞内で産生された。タンパク質発現は、ＣｄＣｌ２によって誘導され、上清は、誘導後５～７日に回収された。組換えタンパク質は、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎカラム（ＩＢＡ）、ならびにＳ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）／１５０ｍのＭＮａＣｌ緩衝液を使用したサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、精製された。
単一Ｂ細胞選別
形質芽細胞選別のために、ＰＢＭＣが、抗ヒトＣＤ３８（ＰＥ）、ＣＤ２７（ＢＶ４２１）、ＣＤ２０（ＰＥ－Ｃｙ７）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＣＤ８（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＣＤ１４（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、およびＣＤ１６（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）を使用して染色された。形質芽細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ３－ＣＤ２０－／ｌｏＣＤ２７ｈｉｇｈＣＤ３８ｈｉｇｈ細胞として定義された。ＭＢＣ選別のために、Ｂ細胞が、ＭＡＣＳ Ｂ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９１－１５１）を使用して精製され、続いて、抗ヒトＣＤ１９（ＰＥ－Ｃｙ７）、ＣＤ２０（ＰＥ－Ｃｙ７）、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＣＤ８（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＣＤ１４（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＣＤ１６（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）、ＩｇＤ（ＢＶ４２１）、ＩｇＭ（ＡＦ－４８８）、ＣＤ２７（ＢＶ５１０）、ＣＤ２１（ＢＶ６０５）、ＣＤ７１（ＡＰＣ－Ｃｙ７ならびに二重標識（ＡＰＣおよびＰＥ）ＹＦＶ Ｅ四量体の混合物（それぞれ２５ｎＭ）を使用して染色された。四量体は、各実験のために新たに調製され、ＹＦＶ Ｅ四量体に対する反応性を示したＢ細胞は、単一細胞選別された。単一細胞は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、２０μＬ／ウェルの溶解緩衝液［５μＬの５Ｘ第１鎖ｃＤＮＡ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．６２５μＬのＮＰ－４０（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．２５μＬのＲＮａｓｅＯＵＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１．２５μＬのジチオスレイトール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および１２．６μＬのｄＨ２Ｏ］を含有する、９６ウェルＰＣＲプレート（ＢｉｏＲＡＤ）の中に選別された。プレートは、即時に－８０℃で保存された。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析された。
抗体可変遺伝子の増幅およびクローニング
抗体可変遺伝子（ＩｇＨ、ＩｇＫ、およびＩｇＬ）は、前述のように（Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００８）、逆転写ＰＣＲならびにＩｇＧおよびＩｇＭ特異的プライマーのカクテルを使用したネステッドＰＣＲによって増幅された。２回目のＰＣＲで使用されたプライマーは、消化された発現ベクターに対する５’および３’相同性の４０個の塩基対を含有し、これは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへの相同組換えによるクローニングを可能にした。化学変換のための酢酸リチウム法が、ＰＣＲ産物をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにクローン化するために使用された（Ｇｉｅｔｚ ａｎｄ Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００７）。形質転換反応当たり１０μＬの未精製重鎖および軽鎖ＰＣＲ産物ならびに２００ｎｇの消化された発現ベクターが、使用された。形質転換に続いて、個々の酵母コロニーが、配列決定および特性評価のために選ばれた。
ＩｇＧおよびＦａｂ断片の発現および精製
ＩｇＧは、前述のように（Ｂｏｒｎｈｏｌｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６ｂ）、２４ウェルプレート内で成長させられたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ培養物内で発現された。６日後、培養物は、遠心分離によって回収され、ＩｇＧは、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーによって精製された。結合した抗体は、２００ｍＭの酢酸／５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ３．５）を用いて１／８容量の２ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）の中に溶出され、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に緩衝液交換された。
２つのＹＦＶ Ｅ反応性対照ｍＡｂ、５Ａおよび４Ｇ２は、ヒトＩｇＧ１定常領域内で産生された。２つの対照抗体４Ｇ２および５Ａの公的に利用可能な可変領域配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅへの組換えクローニングのための相同オーバーハングを伴うｇＢｌｏｃｋ断片（ＩＤＴ）として合成された。後続の産生は、上記のように実行された。
Ｆａｂ断片は、パパインを用いて３０℃で２時間ＩｇＧを消化することによって生成された。消化は、ヨードアセトアミドの添加によって終了され、ＦａｂおよびＦｃ混合物は、Ｆｃ断片および未消化ＩｇＧを除去するようにタンパク質Ａアガロース上を通過させられた。タンパク質Ａ樹脂のフロースルーが、次いで、ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＩｇＧ－ＣＨ１親和性樹脂（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上を通過させられ、２００ｍＭの酢酸／５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ３．５）を用いて１／８容量の２ＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）の中に溶出された。Ｆａｂ断片が、次いで、ｐＨ７．０のＰＢＳに緩衝液交換された。
結合反応速度の測定
ＩｇＧ結合の表面プラズモン共鳴反応速度測定（ＳＰＲ）：ＣＡＰセンサーチップとドッキングされたＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋシステム、サンプルコンパートメントが１０℃に設定され、フローセル温度が２５℃に設定され、データ収集速度が１０Ｈｚに設定された。ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）が、流動緩衝液として使用された。各サイクルでは、流動緩衝液中で１：２０に希釈されたビオチンＣＡＰｔｕｒｅ試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が、フローセル１および２上で５μＬ／分の流速において６００秒間注入され、その後、フローセル２上のビオチン化ＹＦＶ Ｅ抗原（ＨＢＳ－ＥＰ＋中の２５ｎＭ）の９００秒間の捕捉（１μＬ／分）が続き、４００ＲＵの最小捕捉レベルに達した。抗体（ＨＢＳ－ＥＰ＋中の３６～２８８ｎＭ）は、次いで、フローセル１および２上で３００秒間（３０μＬ／分）注入され、解離が、３００秒間（３０μＬ／分）監視され、表面が、オリゴヌクレオチドレベルにおいて１２０秒間（１０μＬ／分）０．２５ＭのＮａＯＨ中の６Ｍのグアニジン－ＨＣｌを用いて再生された。最低２回のブランク（ＨＢＳ－ＥＰ＋）注入もまた、上記に記載されるような同一条件下で実行され、システムアーチファクトを評価および減算するために使用された。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価ソフトウェアのバージョン１．０を使用して、整合され、二重参照され、２価分析物結合モデルに適合された。
Ｆａｂ結合の表面プラズモン共鳴反応速度測定（ＳＰＲ）：ＣＡＰセンサーチップとドッキングされたＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋシステム、サンプルコンパートメントが１０℃に設定され、フローセル温度が２５℃に設定され、データ収集速度が１０Ｈｚに設定された。ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０）が、流動緩衝液として使用された。各サイクルでは、流動緩衝液中で１：２０に希釈されたビオチンＣＡＰｔｕｒｅ試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）が、フローセル１および２上で１μＬ／分の流速において６００秒間注入され、その後、フローセル２上のビオチン化ＹＦＶ Ｅ抗原（ＨＢＳ－ＥＰ＋中の１５ｎＭ）の９００秒間の捕捉（１μＬ／分）が続き、２７５ＲＵの最小捕捉レベルに達した。Ｆａｂ（Ａ５：ＨＢＳ－ＥＰ＋中の２７～１ｎＭ、４Ｇ２：ＨＢＳ－ＥＰ＋中の４～０．１２５ｎＭ）は、次いで、フローセル１および２上で３００秒間（３０μＬ／分）注入され、解離が、１２００秒間（３０μＬ／分）監視され、表面が、オリゴヌクレオチドレベルにおいて１８５秒間（１０μＬ／分）０．２５ＭのＮａＯＨ中の６Ｍのグアニジン－ＨＣｌを用いて再生された。最低２回のブランク（ＨＢＳ－ＥＰ＋）注入もまた、上記に記載されるような同一条件下で実行され、システムアーチファクトを評価および減算するために使用された。データは、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価ソフトウェアのバージョン１．０を使用して、整合され、二重参照され、１：１結合モデルに適合された。
生体層干渉法反応速度測定（ＢＬＩ）：一価の見かけのＫＤ決定のために、組換えＹＦＶ Ｅ抗原へのＩｇＧ結合が、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した生体層干渉法（ＢＬＩ）によって測定された。ＩｇＧは、抗ヒトＩｇＧ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）に捕捉され（１．５ｎｍ）、ＰＢＳＦ（０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡを伴うＰＢＳ）中で最低３０分間放置された。ＰＢＳＦ中の短い（６０秒）ベースラインステップの後、ＩｇＧ装填バイオセンサーチップは、ＹＦＶ Ｅ抗原（ＰＢＳＦ中の１００ｎＭ）に曝露され（１８０秒、１０００ｒｐｍの軌道振とう）、次いで、バイオセンサーチップ表面からの抗原の任意の解離を測定するようにＰＢＳＦの中に浸漬された（１８０秒、１０００ｒｐｍの軌道振とう）。結合応答が＞０．１ｎｍであったデータは、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアのバージョン１１．１を使用して、（関連ステップに対して）ステップ間で補正され、１：１結合モデルに適合された。
二価の見かけのＫＤの決定のために、組換えビオチン化ＹＦＶ Ｅ抗原へのＩｇＧ結合が、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用した生体層干渉法（ＢＬＩ）によって測定された。組換えビオチン化ＹＦＶ Ｅが、ストレプトアビジンバイオセンサー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で固定化され、ＰＢＳＦ（０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡを伴うＰＢＳ）中で最低３０分間放置された。ＰＢＳＦ中の短い（６０秒）ベースラインステップの後、抗原装填バイオセンサーチップは、ＩｇＧ（ＰＢＳＦ中の１００ｎＭ）に曝露され（１８０秒、１０００ｒｐｍの軌道振とう）、次いで、バイオセンサーチップ表面からのＩｇＧの任意の解離を測定するようにＰＢＳＦの中に浸漬された（１８０秒、１０００ｒｐｍの軌道振とう）。結合応答が＞０．１ｎｍであったデータは、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアのバージョン１１．１を使用して、（関連ステップに対して）ステップ間で補正され、１：１結合モデルに適合された。
高スループット抗体エピトープ割り当て
生体層干渉法（ＢＬＩ）エピトープビニング：エピトープビニングのために、対照抗体Ａ５および４Ｇ２（ヒトＩｇＧ１キメラとして産生された）が、抗ヒトＩｇＧ捕捉バイオセンサー（０．９ｎｍ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上で捕捉され、バイオセンサーは、次いで、それらをアダリムマブに曝露することによって遮断された（０．５ｍｇ／ｍＬ、２０分、３５０ｒｐｍの軌道振とう）。ＰＢＳＦ中の短い（６０秒）ベースラインステップの後、サンプルＩｇＧと装填されたバイオセンサーとの間で交差相互作用チェックが実施された（１８０秒、１０００ｒｐｍの軌道振とう）。交差相互作用は、このＩｇＧのパネルについては観察されなかった。装填されたバイオセンサーは、次いで、ＰＢＳＦ中の第２の短い（６０秒）ベースラインステップを受け、その後に、１００ｎＭの組換えＹＦＶ Ｅ単量体中の会合ステップ（１８０秒、１０００ｒｐｍの軌道振とう）が続いた。最後に、ビニングステップは、０．１％ＢＳＡ（ＰＢＳＦ）を伴うＰＢＳ中の１００ｎＭのサンプルＩｇＧにおいて実施された（１８０秒、１０００ｒｐｍの軌道振とう）。データは、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアのバージョン１１．１を使用して分析された。ビニング応答が０．１ｎｍ未満のサンプルＩｇＧは、対照抗体と競合することが決定された。ビニング応答が０．１ｎｍを超えるサンプルＩｇＧは、対照抗体に対する非競合物質であることが決定された。
Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ（ＳＰＲ）を使用した高スループットエピトープビニング
結合反応速度および親和性。７７０＋ＡＤＩ ｍＡｂ（精製ヒトＩｇＧとして供給された）のライブラリーに結合する黄熱病抗原（精製組換えモノマーとしてＡｄｉｍａｂによって供給された、４５ｋＤａの分子量）の反応速度および親和性定数は、ＨＣ－３０Ｍチップタイプを装備したＣａｒｔｅｒｒａの高スループット表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサープラットフォームを使用した「反応速度を捕捉する」アッセイ形式で、２５℃の温度において決定された。この実験用の表面を準備するために、チップは、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＨＢＳＥＴ）の流動緩衝液中の標準アミン結合を使用して、捕捉試薬、すなわち、複数の他の種由来の血清タンパク質に交差吸着されたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃポリクローナル（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０１４－０１）で「芝生状」としてコーティングされた。簡潔には、これは、ＨＢＳＥＴ流動緩衝液で単一フローセル（ＳＦＣ）をプライミングすることと、１：１：１ ｖ／ｖ／ｖ ０．１ＭのＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ、Ｐｉｅｒｃｅ）＋０．４Ｍの１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）（ＥＤＣ、Ｐｉｅｒｃｅ）＋０．１ＭのＭＥＳ（ｐＨ５．５）（Ｃａｒｔｅｒｒａ）の新たに調製された活性化溶液を１０分間注入することと、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．３）に希釈された５０μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃを１５分間結合することと、過剰な反応性エステルを１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）で７分間急冷することとを伴った。これは、（３８４個の反応スポットによって判断されると）６２５６ＲＵ±４％分散の平均最終結合レベルをもたらした。９６チャンネルプリントヘッド（９６ＰＨ）が、次いで、流動緩衝液中でプライミングされ、ＡＤＩ ｍＡｂをリガンドとして捕捉するために使用され、これは、流動緩衝液中で２μｇ／ｍｌに希釈され、個別のスポット上に一度に９６回バッチプリントされた。９６ＰＨの４つのシリアルドックが、４つすべてのプリントブロック場所に対処するために使用され、したがって、３８４リガンドアレイを生成した。９６ＰＨは、洗浄のために水に戻され、ＳＦＣは、プリントされたアレイ上にドッキングされ、ＨＢＳＥＴ＋０．５ｇ／ｌのＢＳＡのアッセイ流動緩衝液でプライミングされた。黄熱病モノマー抗原の分析物サンプルが、０．０２～３６７ｎＭの公称濃度に及ぶ８員４倍希釈系列として調製され、数回の緩衝液（ブランク）注入後に上昇濃度でＳＦＣに注入された。会合および解離時間は、それぞれ、５分および２０分であった。データは、Ｃａｒｔｅｒｒａの速度論ソフトウェアにおいて以下のように分析された。反応スポット上の結合データは、局所参照スポット（裸の捕捉試薬を表す）から応答を差し引き、次いで、緩衝液ブランク分析物６６から応答を差し引くことによって、二重参照された。二重参照されたデータは、各スポットにその独自の会合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、およびＲｍａｘ値を許容する、単純なラングミュアモデルに大域的に適合された。平衡解離（親和性）定数（ＫＤ）は、反応速度定数の比から計算された、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）。
エピトープビニング実験：ＣａｒｔｅｒｒａのＬＳＡが、６つのベンチマークｍＡｂ（ＡＤＩ－４９５８２、ＡＤＩ－４４１１２、ＡＤＩ－４５１０７、ＡＤＩ－４９１４７、４Ｇ２、および５Ａ）を分析物として使用して、古典的サンドイッチアッセイ形式６７でエピトープビニングアッセイを実施し、リガンドとしての７７０＋ＡＤＩライブラリーのエピトープ多様性を精査するために使用された。ＨＣＸ－３０Ｍ（事前に活性化された）チップタイプが、使用され、実験が、２５℃で実施された。ＳＦＣおよび９６ＰＨは、２５ｍＭのＭｅｓ（ｐＨ５．５）＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０の流動緩衝液中でプライミングされた。ＡＤＩ ｍＡｂは、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）（結合緩衝液）中で２μｇ／ｍｌに希釈され、各プリントブロック場所において７分の接触時間を使用して９６ＰＨを介して結合された。３８４リガンドアレイを構築するための９６ＰＨの４回の連続ドッキングの後、ＳＦＣは、ｐＨ８．５のエタノールアミンを７分間注入することによって、過剰な反応性エステルを急冷するように、表面全体の上にドッキングされた。各ｍＡｂの最終結合レベルは、スポット当たり１０００～４０００ＲＵに及んだ。９６ＰＨは、洗浄のために水に戻され、ＳＦＣは、ＨＢＳＥＴ＋０．５ｇ／ｌのＢＳＡのアッセイ流動緩衝液中でプライミングされた。各ビニングサイクルは、同時注入型のサンプル送達を伴い、それにより、抗原（５０ｎＭの黄熱病単量体）および抗体分析物（２０μｇ／ｍｌのｍＡｂまたは緩衝液）サンプルが、３８４リガンドアレイ上でそれらの間の最小限の解離時間を伴って連続して注入された。典型的な会合時間は、３分または５分であり、表面は、各ビニングサイクル後に７５ｍＭのリン酸を用いて再生された。結合データは、Ｃａｒｔｅｒｒａのエピトープソフトウェアにおいて分析された。
マイクロタイター中和アッセイ
モノクローナル抗体が、１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％Ｇｌｕｔａ－ＭＡＸ Ｇｉｂｃｏ）、１％Ｐ／Ｓ（Ｇｉｂｃｏ）、および２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する、ＤＭＥＭ高グルコース培地（Ｇｉｂｃｏ）中で連続的に希釈され、室温においてＹＦＶ－１７ＤまたはＺＩＫＶとともに１時間インキュベートされた。ＹＦＶ－１７ＤまたはＺＩＫＶは、６０％エンドポイント感染を達成するように希釈された。抗体・ウイルス混合物が、前日に播種された５ｘ１０＾３個のＨｕｈ ７．５．１細胞単層を含有する９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３５９５）に３回添加された。細胞は、３７℃および５％ＣＯ２において２日間インキュベートされた。細胞は、次いで、４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を用いて１０分間固定され、その後、ｐＨ７．６のＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（すべてＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３回洗浄された。固定された細胞は、３％脱脂粉乳（ＢｉｏＲａｄ）、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、および０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する、Ｔｒｉｓ緩衝液中で２μｇ／ｍｌにおいて汎フラビウイルスマウスｍＡｂ ４Ｇ２（ＡＴＣＣ）とともに室温（ＲＴ）で１時間インキュベートされた。その後、細胞は、３回洗浄され、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にコンジュゲートされた二次抗体とともに、１：５００希釈においてＲＴで１時間インキュベートされた。細胞は、再度洗浄され、核は、ＰＢＳ中で１：２，０００希釈したＨｏｅｃｈｓｔ－３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色された。ウイルス感染性は、Ｃｙｔａｔｉｏｎ－５自動蛍光顕微鏡（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して、捕捉された画像からのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８陽性細胞の自動列挙によって測定され、Ｇｅｎ５データ分析ソフトウェア（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して分析された。ｍＡｂの最大阻害濃度の半分（ＩＣ５０）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた非線形回帰分析を使用して計算された。ウイルス中和データは、最大阻害濃度の半分（ＩＣ５０）の値を抽出するために非線形回帰分析を受けた（４パラメーター、可変勾配シグモイド用量反応方程式、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）。
ドナー血漿サンプルの中和が、精製ＩｇＧについて上記に記載されるように正確に実行された。血漿の連続希釈液が、細胞単層に添加する前に１時間、ＹＦＶ－１７Ｄ感染性原液とともに事前にインキュベートされた。
非免疫化ドナーからの精製総ヒトＩｇＧが、ＹＦＶ－１７ＤおよびＺＩＫＶに対する精製ＩｇＧ中和アッセイにおける陰性対照として使用された（カタログ番号ＡＢ＿２３３７０４２、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
ＦＲＮＴアッセイ
ウイルス特異的ｍＡｂが、前述のようにスクリーニングされた。簡潔には、すべての精製ｍＡｂが、５％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１９９培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で連続希釈され、ＹＦＶ－１７ＤＤとともに３７℃でインキュベートされた。１時間のインキュベーション後、Ａｂウイルス混合物は、ベロＥ６細胞の８０％密集単層を含有する９６ウェルプレートに２回添加された。プレートは、３７℃で１．５時間インキュベートされた。ウェルは、次いで、５％熱不活化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１％アンホテリシンＢを伴う補足ＯｐｔｉＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の１％メチルセルロースで覆われ、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートされた。細胞は、次いで、固定され、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて３０分間透過処理された。透過処理後、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中の抗フラビウイルス抗体（ＭＡＢ１０２１６、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の１：２０００希釈液とともに２時間インキュベートされた。インキュベーション後、細胞は、ＰＢＳで洗浄され、抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体（１１５０３５１４６、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに２時間インキュベートされた。プレートは、洗浄され、ペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）とともに発展された。ｍＡｂの最大阻害濃度の半分（ＩＣ５０）は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いた非線形回帰分析を使用して計算された。
血清および精製ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ
ＮＳ１およびＥ結合ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３６９０）が、ＰＢＳ中で希釈された５μｇ／ｍｌのＮＳ１またはＥタンパク質でコーティングされ、４℃で一晩インキュベートされた。ウェルは、洗浄され、次いで、ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）で３７℃において１時間ブロックされた。ウェルは、ＰＢＳで３回洗浄され、５％ＮＦＤＭ－ＰＢＳ中のヒト血漿の連続希釈液が、添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。プレートが、次いで、ＰＢＳで３回洗浄され、二次交差吸着抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１４１３）または抗ヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＡＰ１１４Ｐ）検出抗体が、５％ＮＦＤＭ－ＰＢＳ中の１：８０００希釈において３７℃で１時間希釈された。ＰＢＳで３回洗浄した後、検出試薬が、製造業者の推奨（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３４０２９）に従って添加され、吸光度が、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎＭ波長において測定された。
ウイルス結合ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートが、ＰＢＳ中で希釈された５μｇ／ｍｌの４Ｇ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＭＡＢ１０２１６）でコーティングされ、３７℃で２時間インキュベートされた。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＹＦＶ－１７Ｄウイルス粒子全体が、ｐＨ７．４のＰＢＳ中で希釈され、４℃で一晩インキュベートされた。プレートが、次いで、ＰＢＳで３回洗浄され、５％ＮＦＤＭ－ＰＢＳで３７℃において１時間ブロックされた。ブロッキング溶液の除去後、５％ＮＦＤＭ－ＰＢＳ中で希釈された試験抗体は、３７℃で１時間結合させられた。プレートが、次いで、ＰＢＳで３回洗浄され、二次交差吸着抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３１４１３）または抗ヒトＩｇＭ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＡＰ１１４Ｐ）検出抗体が、５％ＮＦＤＭ－ＰＢＳ中の１：８０００希釈において３７℃で１時間希釈された。ＰＢＳで３回洗浄した後、検出試薬が、製造業者の推奨（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号３４０２９）に従って添加され、吸光度が、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎＭ波長において測定された。
精製ＩｇＧのウイルス粒子への結合が、上記に記載されるように実施された。ＩｇＧは、５％ＮＦＤＭ－ＰＢＳ中で希釈され、形質芽細胞およびＭＢＣ由来の１４日目の抗体の単一点反応性検査のために、１００ｎＭ濃度において検査された。
本明細書で引用されるすべての参考文献、特許、および特許公開は、本明細書で教示されるすべてについて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (54)

  1. 黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）タンパク質に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその前記抗原結合断片のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つは、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２から選択された抗体の表３に開示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／またはＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも７０％同一であり、前記抗体またはその前記抗原結合断片はまた、以下の特性：
    ａ）前記抗体またはその抗原結合断片は、ＹＦＶへの結合について前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する、
    ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片は、インビトロでＹＦＶに向けた中和活性を示す、
    ｃ）前記抗体またはその抗原結合断片は、約０．５マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）～約５μｇ／ｍｌ、約０．０５μｇ／ｍｌ～約０．５μｇ／ｍｌ、または約０．０５ｍｇ／ｍｌ未満のインビトロ中和能力（ＩＣ５０）を示す、および
    ｄ）前記抗体またはその抗原結合断片は、ＹＦＶのエンベロープタンパク質に結合する、のうちの１つ以上を有する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
  2. 前記抗体またはその抗原結合断片は、特性ａ）～ｄ）のうちの少なくとも２つを含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  3. 前記抗体またはその抗原結合断片は、
    ａ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ３アミノ酸配列、
    ｂ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ２アミノ酸配列、
    ｃ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ１アミノ酸配列、
    ｄ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ３アミノ酸配列、
    ｅ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ２アミノ酸配列、
    ｆ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ１アミノ酸配列、または
    ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、およびｆ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  4. 前記抗体またはその抗原結合断片は、
    ａ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つの重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、および
    ｂ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つの軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  5. 前記抗体は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つと少なくとも７０％同一である抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  6. 前記抗体は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  7. 請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離された核酸配列。
  8. 請求項７に記載の単離された核酸配列を含む、発現ベクター。
  9. 請求項７に記載の核酸配列でトランスフェクト、形質転換、または形質導入された宿主細胞。
  10. 医薬組成物であって、
    請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片のうちの１つ以上と、
    薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
  11. 医薬組成物であって、
    請求項７に記載の１つ以上の核酸配列と、
    薬学的に許容される担体および／または賦形剤と、を含む、医薬組成物。
  12. 請求項７に記載の核酸配列を含む、宿主細胞。
  13. 黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する方法であって、前記ＹＦＶ感染症が治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた前記少なくとも１つの症状が治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減されるように、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に、請求項１に記載の１つ以上の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
  14. 黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症、または前記ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状のいずれかを治療または予防する方法であって、
    前記ＹＦＶ感染症が治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた前記少なくとも１つの症状が治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減されるように、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に、請求項１に記載の１つ以上の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
  15. 前記方法は、前記患者に第２の治療薬を投与することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記第２の治療薬は、抗ウイルス薬、ＹＦＶに特異的なワクチン、ＹＦＶ抗原に特異的なｓｉＲＮＡ、およびＹＦＶ抗原に特異的な二次抗体からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 予防を必要とするか、もしくは予防を必要とする疑いのある患者において黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症を予防する際に使用するため、またはＹＦＶ感染症に罹患している患者を治療するため、または前記感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症を改善するための医薬組成物であって、そのような使用の結果として、前記感染症が予防されるか、または前記感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症が、予防されるか、改善されるか、もしくは重症度および／もしくは持続期間を軽減されるかのいずれかであり、前記使用は、前記医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
  18. 治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者において黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症または前記ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状のいずれかを治療または予防する際に使用するための医薬組成物であって、そのような使用の結果として、前記感染症が予防されるか、または前記感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症が、予防されるか、改善されるか、もしくは重症度および／もしくは持続期間を軽減されるかのいずれかであり、前記使用は、前記医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
  19. 予防を必要とする患者において黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症を予防するため、またはＹＦＶ感染症に罹患した患者を治療するため、または前記感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症を改善するための薬剤の製造における請求項１０に記載の医薬組成物の使用であって、前記感染症が予防されるか、または前記感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症が、予防されるか、改善されるか、もしくは重症度および／もしくは持続期間を軽減されるかのいずれかであり、前記使用は、前記医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、使用。
  20. 予防を必要とするか、または予防を必要とする疑いのある患者において黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症または前記ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状のいずれかを予防するための薬剤の製造における請求項１０に記載の医薬組成物の使用であって、そのような使用の結果として、前記感染症が予防されるか、または前記感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症が、予防されるか、改善されるか、もしくは重症度および／もしくは持続期間を軽減されるかのいずれかであり、前記使用は、前記医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む、使用。
  21. 黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）抗体またはその抗原結合断片であって、配列：
    ａ）Ｘ１が、Ｙ、Ｆ、もしくはＡであり、Ｘ２が、Ｎ、Ｈ、もしくはＹであり、Ｘ３が、Ｒ、Ｓ、Ｔ、もしくはＤであり、Ｘ４が、Ｄ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、もしくはＰであり、Ｘ５が、ＰもしくはＳであり、Ｘ６が、Ｙ、Ｆ、Ｋ、もしくはＷである、ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｔ、
    ｂ）Ｘ１が、ＱもしくはＨであり、Ｘ２が、ＡもしくはＳであり、Ｘ３が、ＳもしくはＹであり、Ｘ４が、ＴもしくはＳであり、Ｘ５が、ＲもしくはＰであり、Ｘ６が、Ｙ、Ｌ、Ｗ、もしくはＲである、ＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＴＸ５Ｘ６Ｔ、または
    ｃ）Ｘ１が、ＳもしくはＴであり、Ｘ２が、Ｓであるか、もしくはアミノ酸ではなく、Ｘ３が、ＬもしくはＰであり、Ｘ４が、Ｋ、Ｇ、もしくはＲである、ＧＴＷＤＸ１ＳＸ２Ｘ３ＳＡＧＸ４Ｖを有する、コンセンサスモチーフを含むＣＤＲＬ３を含む、ＹＦＶ抗体またはその抗原結合断片。
  22. Ｘ１が、ＫまたはＲであり、Ｘ２が、Ｙ、Ｆ、Ｔ、Ａ、Ｇ、Ｙ、またはＨであり、Ｘ３が、Ｓ、Ｎ、またはＲであり、Ｘ４が、ＡまたはＧであり、Ｘ５が、ＷまたはＹであり、Ｘ６が、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ａ、またはＥであり、Ｘ７が、Ｄ、Ｅ、またはＨであり、Ｘ８が、Ｙ、Ｈ、またはＳである、配列ＡＸ１Ｘ２ＹＤＳＸ３Ｘ４ＹＹＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８を有する、コンセンサスモチーフを含むＣＤＲＨ３を含む、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）抗体またはその抗原結合断片。
  23. ＹＦＶ結合ドメインＣＤＲＬ２を含む、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）抗体またはその抗原結合断片であって、前記ＣＤＲＬ２結合ドメインは、コンセンサスモチーフを含み、前記コンセンサスモチーフは、配列：
    ａ）Ｘ１が、ＤもしくはＥであり、Ｘ２が、Ｎ、Ｖ、もしくはＤであり、Ｘ３が、Ｋ、Ｎ、Ｄ、もしくはＳであり、Ｘ４が、Ｋ、Ｅ、もしくはＲである、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＲＰＳ、
    ｂ）Ｘ１が、Ａ、Ｇ、もしくはＲであり、Ｘ２が、ＡもしくはＴであり、Ｘ３が、ＳもしくはＴであり、Ｘ４が、Ｔ、Ｇ、Ｓ、もしくはＩであり、Ｘ５が、ＱもしくはＲであり、Ｘ６が、ＳもしくはＲである、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＬＸ５Ｘ６、
    ｃ）Ｘ１が、Ｇ、Ｄ、Ｒ、もしくはＡであり、Ｘ２が、ＡもしくはＳであり、Ｘ３が、Ｓ、Ｔ、もしくはＮであり、Ｘ４が、ＴもしくはＡである、Ｘ１Ｘ２ＳＸ３ＲＡＸ４、
    ｄ）Ｘ１が、Ｄ、Ｅ、もしくはＲであり、Ｘ２が、Ｓ、Ｔ、Ｎ、またはＡであり、Ｘ３が、Ｎ、Ｋ、もしくはＱである、Ｘ１ＶＸ２Ｘ３ＲＰＳ、または
    ｅ）Ｘ１が、Ｒ、Ｑ、またはＫであり、Ｘ２が、Ｔ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、またはＩであり、Ｘ３が、ＴまたはＳである、Ｘ１ＡＳＸ２ＬＥＸ３を含む、ＹＦＶ抗体またはその抗原結合断片。
  24. 黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）抗体またはその抗原結合断片であって、配列：
    ａ）Ｘ１が、Ｄ、Ｅ、もしくはＳであり、Ｘ２が、ＩもしくはＶであり、Ｘ３が、ＦもしくはＹであり、Ｘ４が、ＸもしくはＴであり、Ｘ５が、ＧもしくはＥであり、Ｘ６が、Ｓ、Ｇ、もしくはＴであり、Ｘ７が、ＴもしくはＡであり、Ｘ８が、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｋ、もしくはＴであり、Ｘ９が、ＮもしくはＳであり、Ｘ１０が、ＳもしくはＦであり、Ｘ１１が、ＬもしくはＶであり、Ｘ１２が、ＫもしくはＥである、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＨＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＹＸ９ＰＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｓ、または
    ｂ）Ｘ１が、ＶもしくはＬであり、Ｘ２が、ＩもしくはＭであり、Ｘ３が、Ｓ、Ｗ、もしくはＬであり、Ｘ４が、ＦもしくはＹであり、Ｘ５が、ＥもしくはＧであり、Ｘ６が、ＳもしくはＴであり、Ｘ７が、Ｋ、Ｎ、もしくはＹであり、Ｘ８が、Ｆ、Ｗ、もしくはＹであり、Ｘ９が、ＹもしくはＦであり、Ｘ１０が、ＶもしくはＬであり、Ｘ１１が、ＫもしくはＲである、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＤＸ５Ｘ６Ｘ７ＫＸ８Ｘ９ＡＤＳＸ１０Ｘ１１Ｇを有する、コンセンサスモチーフを含むＣＤＲＨ２を含む、ＹＦＶ抗体またはその抗原結合断片。
  25. 黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）抗体またはその抗原結合断片であって、配列：
    ａ）Ｘ１が、ＡもしくはＴであり、Ｘ２が、ＱもしくはＲであり、Ｘ３が、ＳもしくはＴであり、Ｘ４が、ＩもしくはＶであり、Ｘ５が、ＳもしくはＴである、Ｘ６が、Ｓ、Ｎ、Ｔ、Ｆ、Ｄ、もしくはＧであり、Ｘ７が、Ｎ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、もしくはＫであり、Ｘ８が、ＬもしくはＶであり、Ｘ９が、ＡもしくはＮである、ＲＸ１ＳＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９、
    ｂ）Ｘ１が、ＮもしくはＳであり、Ｘ２が、ＩもしくはＦであり、Ｘ３が、ＳもしくはＮであり、Ｘ４が、Ｎ、Ｙ、Ｓ、もしくはＤであり、Ｘ５が、Ｙ、Ｆ、もしくはＤであり、Ｘ６が、ＳもしくはＡである、ＳＧＳＸ１ＳＮＸ２ＧＸ３Ｘ４Ｘ５ＶＸ６、
    ｃ）Ｘ１が、ＡもしくはＴであり、Ｘ２が、Ｓ、Ｇ、もしくはＲであり、Ｘ３が、ＳもしくはＴであり、Ｘ４が、Ｖ、Ｆ、もしくはＩであり、Ｘ５が、ＧもしくはＡであり、Ｘ６が、Ｙ、Ｄ、もしくはＦであり、Ｘ７が、ＫもしくはＮであり、Ｘ８が、ＹもしくはＦである、Ｘ１ＧＴＸ２Ｘ３ＤＸ４ＧＸ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８ＶＳを有する、コンセンサスモチーフを含むＣＤＲＬ１を含む、ＹＦＶ抗体またはその抗原結合断片。
  26. 黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）抗体またはその抗原結合断片であって、配列：
    ａ）Ｘ１が、Ｆ、Ｙ、もしくはＬであり、Ｘ２が、Ｔ、Ａ、Ｓ、もしくはＮであり、Ｘ３が、ＳもしくはＴであり、Ｘ４が、Ｓ、Ｔ、もしくはＲであり、Ｘ５が、ＹもしくはＬであり、Ｘ６が、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｗ、Ｓ、もしくはＤであり、Ｘ７が、Ｍ、Ｉ、もしくはＬであり、Ｘ８が、Ｈ、Ｓ、Ｎ、もしくはＴである、Ｘ１Ｘ２ＦＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８、
    ｂ）Ｘ１が、ＧもしくはＩであり、Ｘ２が、ＳもしくはＴであり、Ｘ３が、Ｓ、Ｔ、Ｇであるか、もしくはアミノ酸ではなく、Ｘ４が、Ｄ、Ｓ、Ｔ、もしくはＧであり、Ｘ５が、Ｙ、Ｎ、もしくはＤであり、Ｘ６が、ＷもしくはＹであり、Ｘ７が、ＳもしくはＴである、Ｘ１ＳＩＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＷＸ７、
    ｃ）Ｘ１が、ＩもしくはＴであり、Ｘ２が、ＨもしくはＹであり、Ｘ３が、ＡもしくはＤである、ＦＸ１ＦＳＤＸ２ＹＭＸ３を有する、コンセンサスモチーフを含むＣＤＲＨ１結合ドメインを含む、ＹＦＶ抗体またはその抗原結合断片。
  27. ＹＦＶのＥタンパク質に結合する、請求項２２～２７のいずれか一項に記載のＹＦＶ抗体またはその抗原結合断片。
  28. ＤＥＮＶ－２、ＤＥＮＶ－４、ＷＮＶ、および／またはＺＩＫＶのＥタンパク質にさらに結合する、請求項２２～２７のいずれか一項に記載のＹＦＶ抗体またはその抗原結合断片。
  29. ＹＦＶ Ｅタンパク質に結合する抗体。
  30. 前記抗体は、前記ＹＦＶ Ｅタンパク質のドメインＩＩのＦＬ内のエピトープ、前記ＹＦＶ Ｅタンパク質のドメインＩＩの前記ＦＬの近位、およびＹＦＶのドメインＩＩＩ内のタンパク質のうちの少なくとも１つに結合する、請求項２９に記載の抗体。
  31. 前記抗体は、以下の特性：ａ）前記抗体またはその抗原結合断片は、クリーンまたは低多反応性プロファイルを示す、ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片は、約０．５マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）～約５μｇ／ｍｌ、約０．０５μｇ／ｍｌ～約０．５μｇ／ｍｌ、または約０．０５ｍｇ／ｍｌ未満のインビトロ中和能力（ＩＣ５０）を示す、ｃ）前記抗体またはその抗原結合断片は、ＹＦＶ－１７Ｄ粒子に結合す、およびｄ）前記抗体またはその抗原結合断片は、ＹＦＶのエンベロープタンパク質に結合する、のうちの１つ以上を有する、請求項２９に記載の抗体。
  32. 前記抗体は、約１×１０－６Ｍ～約１×１０－１０Ｍの平衡解離定数を示す、請求項２９に記載の抗体。
  33. 前記抗体は、高親和性結合剤であり、少なくとも１０－９ＭのＹＦＶへの結合親和性を示す、請求項２９に記載の抗体。
  34. 前記抗体は、ＹＦＶに対して１×１０－３ｓ－１以下の解離速度定数を有する、請求項２９に記載の抗体。
  35. 黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）タンパク質に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体またはその前記抗原結合断片のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つは、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２から選択された抗体の表３に開示されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／またはＣＤＲＬ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、ならびに／もしくはその間のすべての同一性率であり、前記抗体またはその前記抗原結合断片はまた、以下の特性：
    ａ）前記抗体またはその抗原結合断片は、ＹＦＶへの結合について前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する、
    ｂ）前記抗体またはその抗原結合断片は、インビトロでＹＦＶに向けた中和活性を示す、
    ｃ）前記抗体またはその抗原結合断片は、約０．５マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）～約５μｇ／ｍｌ、約０．０５μｇ／ｍｌ～約０．５μｇ／ｍｌ、または約０．０５ｍｇ／ｍｌ未満のインビトロ中和能力（ＩＣ５０）を示す、または
    ｄ）前記抗体またはその抗原結合断片は、ＹＦＶのエンベロープタンパク質に結合する、のうちの１つ以上も有する、単離された抗体またはその抗原結合断片。
  36. 前記抗体またはその抗原結合断片は、特性ａ）～ｄ）のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つを含む、請求項１に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  37. 前記抗体またはその抗原結合断片は、
    ａ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ３アミノ酸配列、
    ｂ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ２アミノ酸配列、
    ｃ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＨ１アミノ酸配列、
    ｄ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ３アミノ酸配列、
    ｅ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ２アミノ酸配列、
    ｆ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つのＣＤＲＬ１アミノ酸配列、または
    ｇ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、およびｆ）のうちの２つ以上の任意の組み合わせを含む、請求項３５または３６に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  38. 前記抗体またはその抗原結合断片は、
    ａ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つの重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列、および／または
    ｂ）表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちのいずれか１つの軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列を含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  39. 前記抗体は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体のうちの少なくとも１つと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、および／またはその間のすべての同一性率である抗体からなる群から選択される、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  40. 前記抗体は、表３に開示される抗体番号１～抗体番号１５２と指定された抗体からなる群から選択される、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。
  41. 請求項３５～４０のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離された核酸配列。
  42. 請求項４１に記載の単離された核酸配列を含む、発現ベクター。
  43. 請求項４１に記載の核酸配列または請求項４２に記載の発現ベクターでトランスフェクト、形質転換、または形質導入された宿主細胞。
  44. 請求項３５～４０のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片のうちの１つ以上と、薬学的に許容される担体および／または賦形剤と含む、医薬組成物。
  45. 請求項４１に記載の１つ以上の核酸配列、または請求項４２に記載の１つ以上の発現ベクターと、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物。
  46. 請求項４１に記載の核酸配列、または請求項４２に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  47. 黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状を治療または予防する方法であって、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に、
    ａ）請求項３５～４０のいずれかに記載の１つ以上の抗体またはその抗原結合断片、
    ｂ）請求項４１に記載の核酸配列、
    ｃ）請求項４２に記載の発現ベクター、
    ｄ）請求項４３に記載の宿主細胞、または
    ｅ）請求項４４もしくは４５に記載の医薬組成物を投与することを含み、
    したがって、前記ＹＦＶ感染症が、治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状が、治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減される、方法。
  48. 黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症または前記ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状のいずれかを治療または予防する方法であって、治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者に、
    ａ）請求項３５～４０のいずれかに記載の１つ以上の抗体またはその抗原結合断片、
    ｂ）請求項４１に記載の核酸配列、
    ｃ）請求項４２に記載の発現ベクター、
    ｄ）請求項４３に記載の宿主細胞、または
    ｅ）請求項４４もしくは４５に記載の医薬組成物を投与することを含み、
    したがって、前記ＹＦＶ感染症が、治療もしくは予防されるか、またはＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状が、治療されるか、緩和されるか、もしくは重症度を低減される、方法。
  49. 前記方法は、前記患者に第２の治療薬を投与することをさらに含む、請求項４７～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記第２の治療薬は、抗ウイルス薬、ＹＦＶに特異的なワクチン、ＹＦＶ抗原に特異的なｓｉＲＮＡ、およびＹＦＶ抗原に特異的な二次抗体からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 請求項３５～４１のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片のうちのいずれか１つ以上と、薬学的に許容される担体および／または賦形剤とを含む、医薬組成物。
  52. 予防を必要とするか、もしくは予防を必要とする疑いのある患者において黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症を予防する際に使用するため、またはＹＦＶ感染症に罹患している患者を治療するため、または前記感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症を改善するための医薬組成物であって、そのような使用の結果として、前記感染症が予防されるか、または前記感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症が、予防されるか、改善されるか、もしくは重症度および／もしくは持続期間を軽減されるかのいずれかである、請求項５１に記載の医薬組成物。
  53. 治療もしくは予防を必要とするか、または治療もしくは予防を必要とする疑いのある患者において黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症または前記ＹＦＶ感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状のいずれかを治療または予防する際に使用するための医薬組成物であって、そのような使用の結果として、前記感染症が予防されるか、または前記感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症が、予防されるか、改善されるか、もしくは重症度および／もしくは持続期間を軽減されるかのいずれかである、請求項５１に記載の医薬組成物。
  54. 予防を必要とする患者において黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）感染症を予防するため、またはＹＦＶ感染症に罹患している患者を治療するため、または前記感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症を改善するための薬剤の製造における請求項５１に記載の医薬組成物の使用であって、前記感染症が予防されるか、または前記感染症と関連付けられた少なくとも１つの症状もしくは合併症が、予防されるか、改善されるか、もしくは重症度および／もしくは持続期間を軽減されるかのいずれかである、使用。
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