JP2023500800A

JP2023500800A - ヒトｌ１レトロトランスポゾンｒｎａを調節するための方法およびそれに使用するための組成物

Info

Publication number: JP2023500800A
Application number: JP2022522886A
Authority: JP
Inventors: オーランド，バレリオ; デラ・バレ，フランチェスコ; マンジャバッキ，アリアンナ; イズピスア－ベルモンテ，フアン・カルロス; レディ，プラディープ・ダバッカ・ベヌ
Original assignee: キング・アブドゥッラー・ユニバーシティ・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー; ソークインスティテュートフォーバイオロジカルスタディーズ
Priority date: 2019-10-16
Filing date: 2020-10-16
Publication date: 2023-01-11
Also published as: EP4045655A1; CA3154827A1; WO2021076977A1; AU2020365129A1; EP4045655A4; CN115397987A

Abstract

Ｌ１ＲＮＡ活性の上方制御を必要とする対象においてＬ１ＲＮＡ活性を上方制御するための組成物および方法が提供される。組成物は、Ｌ１ＲＮＡをコードする核酸、あるいはＬ１ＲＮＡを単独で、または発現ベクターに含有されて、かつ／もしくはＬ１ＲＮＡを発現するように遺伝子操作された骨形成前駆細胞、例えば、間葉系幹細胞にさらに含有されて、含む。この態様において、組成物は、骨量指数を増加させる必要がある対象におけるＬ１ＲＮＡレベル、例えば、Ｌ１ＲＮＡコピー数を増加させるために使用される。好ましい実施形態において、骨前駆細胞は、自己細胞である。Ｌ１ＲＮＡレベル／活性の下方制御を必要とする対象においてＬ１ＲＮＡレベル／活性を下方制御するための組成物および方法も提供される。組成物は、１つ以上の薬剤を、細胞におけるＬ１ＲＮＡをノックダウンするのに有効な量で含む。組成物を使用して、老化と関連する状態を治療することができる。好ましい薬剤は、Ｌ１ＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１６日に出願された米国特許出願第６２／９１６，０９６号、および２０１９年１２月９日に出願された米国特許出願第６２／９４５，５３５号の優先権を主張し、それらの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、概して、ヒトＬ１レトロトランスポゾンＲＮＡ活性の調節を必要としている対象においてそれを行うための方法、およびそれに使用するための組成物に関する。

長鎖散在反復配列（ＬＩＮＥ）は、多くの真核生物のゲノムに広くいきわたる非ＬＴＲ（長鎖末端反復）レトロトランスポゾンの群である。ＬＩＮＥは、各ＬＩＮＥが約７０００塩基対長であるトランスポゾンのファミリーを構成する。ＬＩＮＥは、ｍＲＮＡに転写され、逆転写酵素として機能するタンパク質に翻訳される。逆転写酵素は、新しい部位でゲノムに組み込むことができるＬＩＮＥＲＮＡのＤＮＡコピーを作製する。ヒトにおける唯一の豊富なＬＩＮＥは、ＬＩＮＥ－１である。Ｌ１は、ヒトゲノムの約２１％を占める（Ｌａｎｄｅｒ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００１），ｄｏｉ：１０．１０３８／３５０５７０６２）が、Ｌ１ＨＳ（Ｌ１ヒト特異的）Ｔａ（転写された、サブセットａ）サブファミリーに属する数十のみが、依然として、ＯＲＦ２依存性ＲＮＡ媒介性「コピーアンドペースト」メカニズムを介して（Ｆｅｎｔ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ（１９９６），ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００９２－８６７４（００）８１９９７－２、Ｌｕａｎ，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９３），ｄｏｉ：１０．１０１６／００９２－８６７４（９３）９００７８－５、Ｃｏｓｔ，ｅｔａｌ．ＥＭＢＯＪ．（２００２），ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｍｂｏｊ／ｃｄｆ５９２）、自律的にレトロトランスポーズする能力を保持している（Ｓａｓｓａｍａｎ，ｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９７），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ０５９７－３７、Ｂｒｏｕｈａ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３），ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８３１０４２１００）。細胞は、有害な制御されない転位を防ぐためにいくつかの防御メカニズムを進化させているが（Ｋａｚａｚｉａｎ，ｅｔａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２０１７），ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｒａ１５１００９２）、エビデンスは、発達中の脳において体細胞Ｌ１動員が生じ、個々の体細胞モザイク現象に寄与することを示すが（Ｃｏｕｆａｌ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００９），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８２４８、Ｍｕｏｔｒｉ，ｅｔａｌ．Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ（２００９），ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｉｐｏ．２０５６４、Ｂａｉｌｌｉｅ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０５３１、Ｅｖｒｏｎｙ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１２），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１２．０９．０３５）、その機能は未知のままである。興味深いことに、マウスにおいて、脳におけるＬ１再活性化は、若年期ストレス状態への曝露と相関する（Ｂｅｄｒｏｓｉａｎ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３５９（６３８２）：１３９５－１３９９（２０１８），ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｈ３３７８）。しかしながら、Ｌ１動員が他の組織によって支持されているか、かつＬ１拡張が組織恒常性に寄与し得るかは、ほとんど未探索である。

Ｌａｎｄｅｒ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００１），ｄｏｉ：１０．１０３８／３５０５７０６２Ｆｅｎｔ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ（１９９６），ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ００９２－８６７４（００）８１９９７－２Ｌｕａｎ，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９３），ｄｏｉ：１０．１０１６／００９２－８６７４（９３）９００７８－５Ｃｏｓｔ，ｅｔａｌ．ＥＭＢＯＪ．（２００２），ｄｏｉ：１０．１０９３／ｅｍｂｏｊ／ｃｄｆ５９２Ｓａｓｓａｍａｎ，ｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９７），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ０５９７－３７Ｂｒｏｕｈａ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３），ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０８３１０４２１００Ｋａｚａｚｉａｎ，ｅｔａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２０１７），ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｒａ１５１００９２Ｃｏｕｆａｌ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００９），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８２４８Ｍｕｏｔｒｉ，ｅｔａｌ．Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ（２００９），ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｉｐｏ．２０５６４Ｂａｉｌｌｉｅ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０５３１Ｅｖｒｏｎｙ，ｅｔａｌ．Ｃｅｌｌ（２０１２），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１２．０９．０３５Ｂｅｄｒｏｓｉａｎ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３５９（６３８２）：１３９５－１３９９（２０１８），ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｈ３３７８

Ｌ１の調節を必要とする対象におけるＬ１を調節するための組成物および方法を提供することが、本発明の目的である。

一実施形態は、Ｌ１ＲＮＡ活性の上方制御を必要とする対象において、Ｌ１ＲＮＡ活性を上方制御するための組成物および方法を提供する。Ｌ１は、好ましくは、Ｌ１ＨＳ－Ｔａ１ファミリーのものである。組成物は、Ｌ１ＲＮＡをコードする核酸もしくはＬ１ＲＮＡを、単独で、または発現ベクターに含有されて含む。ＮＡは、好ましくは、対象に対して薬学的に許容される担体中にあるか、または、それは骨髄由来の骨形成前駆細胞、例えば、間葉系幹細胞に、Ｌ１ＲＮＡを発現するように前駆細胞を遺伝子操作することによって組み込むことができ、Ｌ１ＲＮＡ発現性細胞を薬学的に許容される担体中に懸濁させる。この態様において、組成物は、骨量指数を増加する必要がある対象におけるＬ１ＲＮＡレベル、例えば、Ｌ１ＲＮＡコピー数を増加させるために使用される。例示的な対象には、閉経後の女性、骨粗しょう症を有すると診断されるか、または骨粗しょう症を発症するリスクがある対象、およびレトロウイルス療法、例えば、ＮＲＴ１を受けている対象が含まれる。本方法は、Ｌ１ＲＮＡをコードする核酸（ＮＡ）またはＬ１ＲＮＡを、それらを必要とする対象に投与することを含む。ＮＡは、薬学的に許容される担体中で対象に投与することができるか、またはそれは、薬学的に許容される担体中に、Ｌ１ＲＮＡを発現するように遺伝子操作された骨髄由来骨形成前駆細胞、例えば、間葉系幹細胞の形態で投与することができる。好ましい実施形態において、骨前駆細胞は、自己細胞である。

別の実施形態は、Ｌ１ＲＮＡレベル／活性の下方制御を必要とする対象におけるＬ１ＲＮＡレベル／活性を下方制御するための組成物および方法を提供する。好ましい薬剤は、Ｌ１ＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、特に好ましくは、フルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである。組成物は、Ｌ１ＲＮＡを枯渇させるための１つ以上の薬剤を含有する製剤を含む。好ましい実施形態において、本方法は、対象における細胞、例えば、線維芽細胞、好ましくは、皮膚線維芽細胞において、Ｌ１ＲＮＡレベル／活性を下方制御することを含む。好ましい実施形態における方法は、１つ以上の薬剤を、対象における細胞、例えば、皮膚線維芽細胞において、Ｌ１ＲＮＡをノックダウンする有効量で投与することを含む。組成物を使用して、早老症候群および皺を含むがこれらに限定されない、老化および促進老化と関連する状態を治療することができる。

骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータと相関するＣＴＲおよびＯＰ群の骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。（図１Ａ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびに骨粗しょう症（ＯＰ）および健常（ＣＴＲ）の閉経後女性の骨ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００３）およびＬ１ＯＲＦ２（右パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００２）配列のＣＮＶアッセイ。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。個々のＬ１５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図１Ｂ～Ｄ）、または関連しない臨床パラメータ（図１Ｅ～１Ｈ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータと相関するＣＴＲおよびＯＰ群の骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。（図１Ａ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびに骨粗しょう症（ＯＰ）および健常（ＣＴＲ）の閉経後女性の骨ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００３）およびＬ１ＯＲＦ２（右パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００２）配列のＣＮＶアッセイ。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。個々のＬ１５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図１Ｂ～Ｄ）、または関連しない臨床パラメータ（図１Ｅ～１Ｈ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータと相関するＣＴＲおよびＯＰ群の骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。（図１Ａ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびに骨粗しょう症（ＯＰ）および健常（ＣＴＲ）の閉経後女性の骨ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００３）およびＬ１ＯＲＦ２（右パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００２）配列のＣＮＶアッセイ。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。個々のＬ１５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図１Ｂ～Ｄ）、または関連しない臨床パラメータ（図１Ｅ～１Ｈ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータと相関するＣＴＲおよびＯＰ群の骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。（図１Ａ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびに骨粗しょう症（ＯＰ）および健常（ＣＴＲ）の閉経後女性の骨ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００３）およびＬ１ＯＲＦ２（右パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００２）配列のＣＮＶアッセイ。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。個々のＬ１５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図１Ｂ～Ｄ）、または関連しない臨床パラメータ（図１Ｅ～１Ｈ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータと相関するＣＴＲおよびＯＰ群の骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。（図１Ａ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびに骨粗しょう症（ＯＰ）および健常（ＣＴＲ）の閉経後女性の骨ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００３）およびＬ１ＯＲＦ２（右パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００２）配列のＣＮＶアッセイ。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。個々のＬ１５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図１Ｂ～Ｄ）、または関連しない臨床パラメータ（図１Ｅ～１Ｈ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータと相関するＣＴＲおよびＯＰ群の骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。（図１Ａ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびに骨粗しょう症（ＯＰ）および健常（ＣＴＲ）の閉経後女性の骨ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００３）およびＬ１ＯＲＦ２（右パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００２）配列のＣＮＶアッセイ。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。個々のＬ１５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図１Ｂ～Ｄ）、または関連しない臨床パラメータ（図１Ｅ～１Ｈ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータと相関するＣＴＲおよびＯＰ群の骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。（図１Ａ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびに骨粗しょう症（ＯＰ）および健常（ＣＴＲ）の閉経後女性の骨ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００３）およびＬ１ＯＲＦ２（右パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００２）配列のＣＮＶアッセイ。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。個々のＬ１５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図１Ｂ～Ｄ）、または関連しない臨床パラメータ（図１Ｅ～１Ｈ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータと相関するＣＴＲおよびＯＰ群の骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。（図１Ａ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびに骨粗しょう症（ＯＰ）および健常（ＣＴＲ）の閉経後女性の骨ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００３）およびＬ１ＯＲＦ２（右パネル、ＯＰ／ＣＴＲＰ＝０．０００２）配列のＣＮＶアッセイ。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。個々のＬ１５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図１Ｂ～Ｄ）、または関連しない臨床パラメータ（図１Ｅ～１Ｈ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。ＣＴＲ群およびＯＰ群における、Ｌ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータとの相関関係を示す。個々のＬ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図２Ａ～２Ｃ）、または関連しない臨床パラメータ（図２Ｄ～２Ｇ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。図２Ｈは、ＣＴＲおよびＯＰ群の血液および骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。ＰＣＲプライマーおよびプローブ位置決め、ならびに健常（ＣＴＲ、Ｎ＝１３）および骨粗しょう症（ＯＰ、Ｎ＝９）の閉経後女性の骨および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル）およびＯＲＦ２（右パネル）配列のＣＮＶアッセイ。結果は、健常骨に対して基準化した値として示す。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定され、ＣＴＲ骨を他と比較した。ＣＴＲ群およびＯＰ群における、Ｌ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータとの相関関係を示す。個々のＬ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図２Ａ～２Ｃ）、または関連しない臨床パラメータ（図２Ｄ～２Ｇ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。図２Ｈは、ＣＴＲおよびＯＰ群の血液および骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。ＰＣＲプライマーおよびプローブ位置決め、ならびに健常（ＣＴＲ、Ｎ＝１３）および骨粗しょう症（ＯＰ、Ｎ＝９）の閉経後女性の骨および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル）およびＯＲＦ２（右パネル）配列のＣＮＶアッセイ。結果は、健常骨に対して基準化した値として示す。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定され、ＣＴＲ骨を他と比較した。ＣＴＲ群およびＯＰ群における、Ｌ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータとの相関関係を示す。個々のＬ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図２Ａ～２Ｃ）、または関連しない臨床パラメータ（図２Ｄ～２Ｇ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。図２Ｈは、ＣＴＲおよびＯＰ群の血液および骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。ＰＣＲプライマーおよびプローブ位置決め、ならびに健常（ＣＴＲ、Ｎ＝１３）および骨粗しょう症（ＯＰ、Ｎ＝９）の閉経後女性の骨および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル）およびＯＲＦ２（右パネル）配列のＣＮＶアッセイ。結果は、健常骨に対して基準化した値として示す。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定され、ＣＴＲ骨を他と比較した。ＣＴＲ群およびＯＰ群における、Ｌ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータとの相関関係を示す。個々のＬ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図２Ａ～２Ｃ）、または関連しない臨床パラメータ（図２Ｄ～２Ｇ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。図２Ｈは、ＣＴＲおよびＯＰ群の血液および骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。ＰＣＲプライマーおよびプローブ位置決め、ならびに健常（ＣＴＲ、Ｎ＝１３）および骨粗しょう症（ＯＰ、Ｎ＝９）の閉経後女性の骨および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル）およびＯＲＦ２（右パネル）配列のＣＮＶアッセイ。結果は、健常骨に対して基準化した値として示す。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定され、ＣＴＲ骨を他と比較した。ＣＴＲ群およびＯＰ群における、Ｌ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータとの相関関係を示す。個々のＬ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図２Ａ～２Ｃ）、または関連しない臨床パラメータ（図２Ｄ～２Ｇ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。図２Ｈは、ＣＴＲおよびＯＰ群の血液および骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。ＰＣＲプライマーおよびプローブ位置決め、ならびに健常（ＣＴＲ、Ｎ＝１３）および骨粗しょう症（ＯＰ、Ｎ＝９）の閉経後女性の骨および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル）およびＯＲＦ２（右パネル）配列のＣＮＶアッセイ。結果は、健常骨に対して基準化した値として示す。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定され、ＣＴＲ骨を他と比較した。ＣＴＲ群およびＯＰ群における、Ｌ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータとの相関関係を示す。個々のＬ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図２Ａ～２Ｃ）、または関連しない臨床パラメータ（図２Ｄ～２Ｇ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。図２Ｈは、ＣＴＲおよびＯＰ群の血液および骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。ＰＣＲプライマーおよびプローブ位置決め、ならびに健常（ＣＴＲ、Ｎ＝１３）および骨粗しょう症（ＯＰ、Ｎ＝９）の閉経後女性の骨および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル）およびＯＲＦ２（右パネル）配列のＣＮＶアッセイ。結果は、健常骨に対して基準化した値として示す。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定され、ＣＴＲ骨を他と比較した。ＣＴＲ群およびＯＰ群における、Ｌ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータとの相関関係を示す。個々のＬ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図２Ａ～２Ｃ）、または関連しない臨床パラメータ（図２Ｄ～２Ｇ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。図２Ｈは、ＣＴＲおよびＯＰ群の血液および骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。ＰＣＲプライマーおよびプローブ位置決め、ならびに健常（ＣＴＲ、Ｎ＝１３）および骨粗しょう症（ＯＰ、Ｎ＝９）の閉経後女性の骨および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル）およびＯＲＦ２（右パネル）配列のＣＮＶアッセイ。結果は、健常骨に対して基準化した値として示す。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定され、ＣＴＲ骨を他と比較した。ＣＴＲ群およびＯＰ群における、Ｌ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝および他の臨床指標に関連する臨床パラメータとの相関関係を示す。個々のＬ１ＯＲＦ２コピー数と、骨格代謝に関連する臨床パラメータ（図２Ａ～２Ｃ）、または関連しない臨床パラメータ（図２Ｄ～２Ｇ）との間の相関分析。正方形および円は、それぞれ健常（ＣＴＲ）および骨粗しょう症（ＯＰ）の参加者を特定する。図２Ｈは、ＣＴＲおよびＯＰ群の血液および骨生検におけるＬ１ＤＮＡコピー数を示す。ＰＣＲプライマーおよびプローブ位置決め、ならびに健常（ＣＴＲ、Ｎ＝１３）および骨粗しょう症（ＯＰ、Ｎ＝９）の閉経後女性の骨および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ゲノムにおけるＬ１－５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左パネル）およびＯＲＦ２（右パネル）配列のＣＮＶアッセイ。結果は、健常骨に対して基準化した値として示す。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定され、ＣＴＲ骨を他と比較した。分化性骨芽細胞におけるＬ１のＲＮＡ発現およびゲノムＣＮＶを示す。図３Ａ）モデル系：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のエクスビボでの骨形成。図３Ｂ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびにエクスビボでの骨形成中のＬ１発現およびＬ１コピー数変動のタイムライン。結果は、３つの異なるドナー（Ｎ＝３）について行われた別個の実験から得られる。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。図３Ｃは、試験したすべてのドナーにおける定量的ミネラル化分析を示す。他と比較して、ミネラル化の早期発生を有するドナー（左パネル）は、試験に含めなかった（右パネル）。図３Ｄは、ＲＵＮＸ２（Ｒｕｎｔ関連転写因子２）、ＯＳＸ（オステリックス，ＳＰ７）、ＯＣＮ（オステオカルシン）、ＯＰＮ（オステオポンチン）、ＢＳＰ（骨シアロタンパク質）。図３Ｅは、Ｌ１３’ＵＴＲ中にレトロ転位能のあるヒトＬ１（ＲＣ－Ｌ１）と、Ｌ１と同じ転写方向でイントロンによって中断された逆転増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）からなる、レトロ転位ンインジケータカセットと、を含有するプラスミドでエレクトロポレーションされた細胞からの結果を示す。カセットの方向は、細胞ゲノムＤＮＡにおけるスプライシングされたＥＧＦＰ配列が、１回のレトロ転位後にのみ生じることを確実にする。＊１２４３ｎｔは、イントロン含有ＥＧＦＰＤＮＡ配列の予測ＰＣＲアンプリコン長（レトロ転位されてない）であり、＊３４２ｎｔは、スプライシングおよびレトロ転位後のＥＧＦＰＤＮＡ配列の予測ＰＣＲアンプリコン長である。分化性骨芽細胞におけるＬ１のＲＮＡ発現およびゲノムＣＮＶを示す。図３Ａ）モデル系：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のエクスビボでの骨形成。図３Ｂ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびにエクスビボでの骨形成中のＬ１発現およびＬ１コピー数変動のタイムライン。結果は、３つの異なるドナー（Ｎ＝３）について行われた別個の実験から得られる。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。図３Ｃは、試験したすべてのドナーにおける定量的ミネラル化分析を示す。他と比較して、ミネラル化の早期発生を有するドナー（左パネル）は、試験に含めなかった（右パネル）。図３Ｄは、ＲＵＮＸ２（Ｒｕｎｔ関連転写因子２）、ＯＳＸ（オステリックス，ＳＰ７）、ＯＣＮ（オステオカルシン）、ＯＰＮ（オステオポンチン）、ＢＳＰ（骨シアロタンパク質）。図３Ｅは、Ｌ１３’ＵＴＲ中にレトロ転位能のあるヒトＬ１（ＲＣ－Ｌ１）と、Ｌ１と同じ転写方向でイントロンによって中断された逆転増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）からなる、レトロ転位ンインジケータカセットと、を含有するプラスミドでエレクトロポレーションされた細胞からの結果を示す。カセットの方向は、細胞ゲノムＤＮＡにおけるスプライシングされたＥＧＦＰ配列が、１回のレトロ転位後にのみ生じることを確実にする。＊１２４３ｎｔは、イントロン含有ＥＧＦＰＤＮＡ配列の予測ＰＣＲアンプリコン長（レトロ転位されてない）であり、＊３４２ｎｔは、スプライシングおよびレトロ転位後のＥＧＦＰＤＮＡ配列の予測ＰＣＲアンプリコン長である。分化性骨芽細胞におけるＬ１のＲＮＡ発現およびゲノムＣＮＶを示す。図３Ａ）モデル系：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のエクスビボでの骨形成。図３Ｂ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびにエクスビボでの骨形成中のＬ１発現およびＬ１コピー数変動のタイムライン。結果は、３つの異なるドナー（Ｎ＝３）について行われた別個の実験から得られる。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。図３Ｃは、試験したすべてのドナーにおける定量的ミネラル化分析を示す。他と比較して、ミネラル化の早期発生を有するドナー（左パネル）は、試験に含めなかった（右パネル）。図３Ｄは、ＲＵＮＸ２（Ｒｕｎｔ関連転写因子２）、ＯＳＸ（オステリックス，ＳＰ７）、ＯＣＮ（オステオカルシン）、ＯＰＮ（オステオポンチン）、ＢＳＰ（骨シアロタンパク質）。図３Ｅは、Ｌ１３’ＵＴＲ中にレトロ転位能のあるヒトＬ１（ＲＣ－Ｌ１）と、Ｌ１と同じ転写方向でイントロンによって中断された逆転増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）からなる、レトロ転位ンインジケータカセットと、を含有するプラスミドでエレクトロポレーションされた細胞からの結果を示す。カセットの方向は、細胞ゲノムＤＮＡにおけるスプライシングされたＥＧＦＰ配列が、１回のレトロ転位後にのみ生じることを確実にする。＊１２４３ｎｔは、イントロン含有ＥＧＦＰＤＮＡ配列の予測ＰＣＲアンプリコン長（レトロ転位されてない）であり、＊３４２ｎｔは、スプライシングおよびレトロ転位後のＥＧＦＰＤＮＡ配列の予測ＰＣＲアンプリコン長である。分化性骨芽細胞におけるＬ１のＲＮＡ発現およびゲノムＣＮＶを示す。図３Ａ）モデル系：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のエクスビボでの骨形成。図３Ｂ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびにエクスビボでの骨形成中のＬ１発現およびＬ１コピー数変動のタイムライン。結果は、３つの異なるドナー（Ｎ＝３）について行われた別個の実験から得られる。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。図３Ｃは、試験したすべてのドナーにおける定量的ミネラル化分析を示す。他と比較して、ミネラル化の早期発生を有するドナー（左パネル）は、試験に含めなかった（右パネル）。図３Ｄは、ＲＵＮＸ２（Ｒｕｎｔ関連転写因子２）、ＯＳＸ（オステリックス，ＳＰ７）、ＯＣＮ（オステオカルシン）、ＯＰＮ（オステオポンチン）、ＢＳＰ（骨シアロタンパク質）。図３Ｅは、Ｌ１３’ＵＴＲ中にレトロ転位能のあるヒトＬ１（ＲＣ－Ｌ１）と、Ｌ１と同じ転写方向でイントロンによって中断された逆転増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）からなる、レトロ転位ンインジケータカセットと、を含有するプラスミドでエレクトロポレーションされた細胞からの結果を示す。カセットの方向は、細胞ゲノムＤＮＡにおけるスプライシングされたＥＧＦＰ配列が、１回のレトロ転位後にのみ生じることを確実にする。＊１２４３ｎｔは、イントロン含有ＥＧＦＰＤＮＡ配列の予測ＰＣＲアンプリコン長（レトロ転位されてない）であり、＊３４２ｎｔは、スプライシングおよびレトロ転位後のＥＧＦＰＤＮＡ配列の予測ＰＣＲアンプリコン長である。分化性骨芽細胞におけるＬ１のＲＮＡ発現およびゲノムＣＮＶを示す。図３Ａ）モデル系：ヒト骨髄由来間葉系幹細胞のエクスビボでの骨形成。図３Ｂ）ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびにエクスビボでの骨形成中のＬ１発現およびＬ１コピー数変動のタイムライン。結果は、３つの異なるドナー（Ｎ＝３）について行われた別個の実験から得られる。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。図３Ｃは、試験したすべてのドナーにおける定量的ミネラル化分析を示す。他と比較して、ミネラル化の早期発生を有するドナー（左パネル）は、試験に含めなかった（右パネル）。図３Ｄは、ＲＵＮＸ２（Ｒｕｎｔ関連転写因子２）、ＯＳＸ（オステリックス，ＳＰ７）、ＯＣＮ（オステオカルシン）、ＯＰＮ（オステオポンチン）、ＢＳＰ（骨シアロタンパク質）。図３Ｅは、Ｌ１３’ＵＴＲ中にレトロ転位能のあるヒトＬ１（ＲＣ－Ｌ１）と、Ｌ１と同じ転写方向でイントロンによって中断された逆転増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）からなる、レトロ転位ンインジケータカセットと、を含有するプラスミドでエレクトロポレーションされた細胞からの結果を示す。カセットの方向は、細胞ゲノムＤＮＡにおけるスプライシングされたＥＧＦＰ配列が、１回のレトロ転位後にのみ生じることを確実にする。＊１２４３ｎｔは、イントロン含有ＥＧＦＰＤＮＡ配列の予測ＰＣＲアンプリコン長（レトロ転位されてない）であり、＊３４２ｎｔは、スプライシングおよびレトロ転位後のＥＧＦＰＤＮＡ配列の予測ＰＣＲアンプリコン長である。Ｌ１ＲＮＡノックダウン戦略を示し、ＦＡＮＡ－ＡＳＯは、細胞に送達され、Ｌ１ＲＮＡ内の相補的配列に結合し、Ｌ１転写物のＲＮアーゼＨ媒介性分解を引き起こす。抗Ｌ１ＦＡＮＡ－ＡＳＯと陰性対照（ＳＣＲ）との間の骨形成遺伝子発現の比率。Ｌ１ノックダウンは、ＯＣＮ（－１０％、ｐ＝０．０４７）、ＲＵＮＸ２（－２３％、ｐ＜０．００１）、ＯＳＸ（－４３％、ｐ＝０．０６６）、ＢＳＰ（－４４％、ｐ＝０．０１８）、ＯＰＮ（－４０％、ｐ＝０．００５）の発現を低下させる。ラミブジン３ＴＣ処理した細胞（３ＴＣ）および対照細胞（ＤＭＳＯ）におけるＬ１５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１（左）およびＬ１ＯＲＦ２（右）のＣＮＶのタイムライン。結果は、３つの異なるドナー（Ｎ＝３）について行われた別個の実験から得られる。ラミブジン３ＴＣ処理した細胞（３ＴＣ）と対照細胞（ＤＭＳＯ）との間の骨形成遺伝子発現の比率を示す。１４日目：ＯＰＮ（－１８％、ｐ＝０．０１６）、ＯＳＸ（－６０％、ｐ＝０．００２）、ＢＳＰ（－３４％、ｐ＝０．０１５）。２１日目：ＲＵＮＸ２（＋３２％、ｐ＜０．００１）、ＯＰＮ（－２３％、ｐ＝０．０６９）、ＯＳＸ（－５０％、ｐ＝０．０５８）、ＢＳＰ（－６０％、ｐ＝０．００２）。右パネル：分化１４日後および２１日後のラミブジン処理細胞（３ＴＣ）および対照細胞（ＤＭＳＯ）。左パネル、ラミブジン３ＴＣ処理細胞（３ＴＣ）および対照細胞（ＤＭＳＯ）におけるミネラル沈着のタイムラインでの定量化。ミネラル化は、分化の２１日後、ラミブジン３ＴＣ処理した細胞で低下する（－６９％、ｐ＝０．００３）。細胞内脂質含有量の定量化を、陰性対照として使用する。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。図４Ｆは、ＡＳＯのノックダウン効率が、Ｌ１配列を含有する５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１では４５％（左、ｐ＜０．００１）であり、Ｌ１配列を含有するＯＲＦ２では３０％（右、ｐ＝０．００３）であることを示す。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。図４Ｆは、ＡＳＯのノックダウン効率が、Ｌ１配列を含有する５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１では４５％（左、ｐ＜０．００１）であり、Ｌ１配列を含有するＯＲＦ２では３０％（右、ｐ＝０．００３）であることを示す。平均値間の有意性は、片側スチューデントｔ検定によって決定された。分化性脂肪細胞におけるＬ１動態およびＬ１発現のラミブジン３ＴＣ媒介性阻害を示す。図５Ａ．モデル系：骨髄由来間葉系幹細胞のエクスビボでの脂肪生成。図５Ｂ．ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびにエクスビボでの脂肪生成期間中のＬ１発現およびＬ１コピー数変動のタイムライン。結果は、３つの異なるドナー（Ｎ＝３）について行われた別個の実験から得られる。図５Ｃ．ラミブジン３ＴＣ処理した細胞（３ＴＣ）と対照細胞（ＤＭＳＯ）との間の脂質生成遺伝子発現の比率。図５Ｄは、ラミブジン３ＴＣ処理した細胞（３ＴＣ）および対照細胞（ＤＭＳＯ）における細胞内脂質含有量のタイムラインでの定量化を示す。分化性脂肪細胞におけるＬ１動態およびＬ１発現のラミブジン３ＴＣ媒介性阻害を示す。図５Ａ．モデル系：骨髄由来間葉系幹細胞のエクスビボでの脂肪生成。図５Ｂ．ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびにエクスビボでの脂肪生成期間中のＬ１発現およびＬ１コピー数変動のタイムライン。結果は、３つの異なるドナー（Ｎ＝３）について行われた別個の実験から得られる。図５Ｃ．ラミブジン３ＴＣ処理した細胞（３ＴＣ）と対照細胞（ＤＭＳＯ）との間の脂質生成遺伝子発現の比率。図５Ｄは、ラミブジン３ＴＣ処理した細胞（３ＴＣ）および対照細胞（ＤＭＳＯ）における細胞内脂質含有量のタイムラインでの定量化を示す。分化性脂肪細胞におけるＬ１動態およびＬ１発現のラミブジン３ＴＣ媒介性阻害を示す。図５Ａ．モデル系：骨髄由来間葉系幹細胞のエクスビボでの脂肪生成。図５Ｂ．ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびにエクスビボでの脂肪生成期間中のＬ１発現およびＬ１コピー数変動のタイムライン。結果は、３つの異なるドナー（Ｎ＝３）について行われた別個の実験から得られる。図５Ｃ．ラミブジン３ＴＣ処理した細胞（３ＴＣ）と対照細胞（ＤＭＳＯ）との間の脂質生成遺伝子発現の比率。図５Ｄは、ラミブジン３ＴＣ処理した細胞（３ＴＣ）および対照細胞（ＤＭＳＯ）における細胞内脂質含有量のタイムラインでの定量化を示す。分化性脂肪細胞におけるＬ１動態およびＬ１発現のラミブジン３ＴＣ媒介性阻害を示す。図５Ａ．モデル系：骨髄由来間葉系幹細胞のエクスビボでの脂肪生成。図５Ｂ．ＰＣＲプライマーおよびプローブの位置決め、ならびにエクスビボでの脂肪生成期間中のＬ１発現およびＬ１コピー数変動のタイムライン。結果は、３つの異なるドナー（Ｎ＝３）について行われた別個の実験から得られる。図５Ｃ．ラミブジン３ＴＣ処理した細胞（３ＴＣ）と対照細胞（ＤＭＳＯ）との間の脂質生成遺伝子発現の比率。図５Ｄは、ラミブジン３ＴＣ処理した細胞（３ＴＣ）および対照細胞（ＤＭＳＯ）における細胞内脂質含有量のタイムラインでの定量化を示す。健常および骨粗しょう症の女性３０名のコホートにおけるＬ１コピー数と骨マーカー転写シグナルレベルとの間の相関を示す。正方形および円は、それぞれ健常および骨粗しょう症の参加者を特定する。ＳＡＴＡ＝ヒトセントロメアアルファサテライト反復ＤＮＡ。アフェメトリクスシグナルレベルに関する一次データは、ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ：ＩＤ：Ｅ－ＭＥＸＰ－１６１８）から入手可能である。健常および骨粗しょう症の女性３０名のコホートにおけるＬ１コピー数と骨マーカー転写シグナルレベルとの間の相関を示す。正方形および円は、それぞれ健常および骨粗しょう症の参加者を特定する。ＳＡＴＡ＝ヒトセントロメアアルファサテライト反復ＤＮＡ。アフェメトリクスシグナルレベルに関する一次データは、ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ：ＩＤ：Ｅ－ＭＥＸＰ－１６１８）から入手可能である。健常および骨粗しょう症の女性３０名のコホートにおけるＬ１コピー数と骨マーカー転写シグナルレベルとの間の相関を示す。正方形および円は、それぞれ健常および骨粗しょう症の参加者を特定する。ＳＡＴＡ＝ヒトセントロメアアルファサテライト反復ＤＮＡ。アフェメトリクスシグナルレベルに関する一次データは、ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ：ＩＤ：Ｅ－ＭＥＸＰ－１６１８）から入手可能である。健常および骨粗しょう症の女性３０名のコホートにおけるＬ１コピー数と骨マーカー転写シグナルレベルとの間の相関を示す。正方形および円は、それぞれ健常および骨粗しょう症の参加者を特定する。ＳＡＴＡ＝ヒトセントロメアアルファサテライト反復ＤＮＡ。アフェメトリクスシグナルレベルに関する一次データは、ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ：ＩＤ：Ｅ－ＭＥＸＰ－１６１８）から入手可能である。健常および骨粗しょう症の女性３０名のコホートにおけるＬ１コピー数と骨マーカー転写シグナルレベルとの間の相関を示す。正方形および円は、それぞれ健常および骨粗しょう症の参加者を特定する。ＳＡＴＡ＝ヒトセントロメアアルファサテライト反復ＤＮＡ。アフェメトリクスシグナルレベルに関する一次データは、ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ：ＩＤ：Ｅ－ＭＥＸＰ－１６１８）から入手可能である。健常および骨粗しょう症の女性３０名のコホートにおけるＬ１コピー数と骨マーカー転写シグナルレベルとの間の相関を示す。正方形および円は、それぞれ健常および骨粗しょう症の参加者を特定する。ＳＡＴＡ＝ヒトセントロメアアルファサテライト反復ＤＮＡ。アフェメトリクスシグナルレベルに関する一次データは、ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ：ＩＤ：Ｅ－ＭＥＸＰ－１６１８）から入手可能である。健常および骨粗しょう症の女性３０名のコホートにおけるＬ１コピー数と骨マーカー転写シグナルレベルとの間の相関を示す。正方形および円は、それぞれ健常および骨粗しょう症の参加者を特定する。ＳＡＴＡ＝ヒトセントロメアアルファサテライト反復ＤＮＡ。アフェメトリクスシグナルレベルに関する一次データは、ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＭＢＬ－ＥＢＩ：ＩＤ：Ｅ－ＭＥＸＰ－１６１８）から入手可能である。エクスビボでの分化後１４、１７、および２１日でのＭＳＣミネラル化の定量化を示す。ＭＳＣは、健常者４名（Ｄ１８８、Ｄ２３９、Ｄ２４７、Ｄ１７０）およびＯＰ患者４名（ＨＵＫ７、ＨＵＫ９、ＨＵＫ１２、ＨＵＫ１６）の大腿骨から得た。Ｎ＝９各ドナーおよび時点における技術的反復数。エクスビボでの骨形成の７日目におけるＬ１ＲＮＡ送達の６時間後の陽性細胞のパーセンテージを示す実験ワークフローおよびフローサイトメーター分析を示す。トランスフェクション３日後の合成Ｌ１（破線の左側のスポット）および骨マトリックス（破線の右側のスポット）産生の細胞内局在も、典型的な実験から示される（右）。ＯＰ患者４名に由来するＭＳＣ（ＨＵＫ７、ＨＵＫ９、ＨＵＫ１２、ＨＵＫ１６）におけるＬ１ＲＮＡ（ＯＳ＋Ｌ１）またはランダムＲＮＡ配列（ＯＳ）送達の３日後の骨マトリックス定量化（上部パネル）を示す。Ｎ＝１２各患者の各条件における技術的反復数。ＲＦＵ＝相対蛍光単位左パネル：６ウェルプレートで用量を増加させたＣｙ５－Ｌ１ＲＮＡの送達後６時間におけるＭＳＣのフローサイトメーター分析。右パネル：Ｃｙ５－Ｌ１ＲＮＡ送達の４８時間後の細胞の画像。最小限の毒性を有する最高用量（赤色の長方形）を実験のために選択した。左パネル：６ウェルプレートで用量を増加させたＣｙ５－Ｌ１ＲＮＡの送達後６時間におけるＭＳＣのフローサイトメーター分析。右パネル：Ｃｙ５－Ｌ１ＲＮＡ送達の４８時間後の細胞の画像。最小限の毒性を有する最高用量（赤色の長方形）を実験のために選択した。左パネル：６ウェルプレートで用量を増加させたＣｙ５－Ｌ１ＲＮＡの送達後６時間におけるＭＳＣのフローサイトメーター分析。右パネル：Ｃｙ５－Ｌ１ＲＮＡ送達の４８時間後の細胞の画像。最小限の毒性を有する最高用量（赤色の長方形）を実験のために選択した。左パネル：６ウェルプレートで用量を増加させたＣｙ５－Ｌ１ＲＮＡの送達後６時間におけるＭＳＣのフローサイトメーター分析。右パネル：Ｃｙ５－Ｌ１ＲＮＡ送達の４８時間後の細胞の画像。最小限の毒性を有する最高用量（赤色の長方形）を実験のために選択した。左パネル：６ウェルプレートで用量を増加させたＣｙ５－Ｌ１ＲＮＡの送達後６時間におけるＭＳＣのフローサイトメーター分析。右パネル：Ｃｙ５－Ｌ１ＲＮＡ送達の４８時間後の細胞の画像。最小限の毒性を有する最高用量（赤色の長方形）を実験のために選択した。左パネル：６ウェルプレートで用量を増加させたＣｙ５－Ｌ１ＲＮＡの送達後６時間におけるＭＳＣのフローサイトメーター分析。右パネル：Ｃｙ５－Ｌ１ＲＮＡ送達の４８時間後の細胞の画像。最小限の毒性を有する最高用量（赤色の長方形）を実験のために選択した。未分化細胞（ＭＳＣ＋Ｌ１）および分化した細胞（ＯＳ＋Ｌ１）におけるアポトーシス遺伝子ＢＡＸ（ＢＣＬ－２結合Ｘ）およびインターフェロン媒介性応答遺伝子ＩＦＮａ２（インターフェロンアルファ２）、ＩＦＮｂ１（インターフェロンベータ１）、ＩＦＩ４４（インターフェロン誘導タンパク質４４）のレベルを、トランスフェクションの７２時間後に非トランスフェクション細胞（ＭＳＣ）と比較して示す。相対蛍光（ＲＦＵ、４８５／５７２）によって定量化された細胞内脂質蓄積のタイムラインを示す。ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）、ＦＡＢＰ４（脂肪酸結合タンパク質４）、ＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）、ＦＡＳＮ（脂肪酸合成酵素）を示す。健常（ＣＴＲ）、骨粗しょう症（ＯＰ）、および中間的な表現型（中間型）の３群に分けられた閉経後女性９９名の拡張コホートにおける全身骨ミネラル密度（ＢＭＤ）に相関させた血清ＴＲＡＰ５Ｂを示す。野生型（ＷＴ、各バー対における左バー）およびＬＡＫＩマウスから単離した尾先端線維芽細胞（ＴＴＦ）で測定された３つの活性マウスＬ１サブファミリー（Ｌ１－Ｔｆ、Ｌ１－Ｇｆ、およびＬ１－Ａｆ）の発現を示す。ＲＮＡ蛍光インサイツハイブリダイゼーションアッセイ（ＦＩＳＨ）を使用して確認されたＬ１発現における蛍光強度を示す。ｑＰＣＲおよびＲＮＡＦＩＳＨによって確認されたＬ１ＲＮＡ枯渇を示す、Ｌ１－ＡＯＮ（各対の棒の右バー）。ｑＰＣＲおよびＲＮＡＦＩＳＨによって確認されたＬ１ＲＮＡ枯渇を示す、Ｌ１－ＡＯＮ（各対の棒の右バー）。ｐ５３腫瘍抑制因子経路におけるストレス応答遺伝子（ｐ１６、ｐ２１、Ａｔｆ３、およびＧａｄｄ４５ｂ）、老化関連メタロプロテアーゼＭｍｐ１３、および炎症促進性インターロイキンＩＬ１ａの発現に対するＬ１－ＡＯＮで処理されたＬＡＫＩＴＴＦにおける効果を示す。活性老化関連β－ガラクトシダーゼ酵素（ＳＡ－Ｂ－ｇａｌ）について陽性である細胞の数が、Ｌ１－ＡＯＮで処理されたＬＡＫＩＴＴＦにおいて低下することを示す。ｓｃｒｂｌＬ１ＡＯＮ（１２Ｂでは各対の左バー）およびＬ１－ＡＯＮ（１２Ｂでは各対の右バー）処理と比較したｗｔにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３のレベル、ならびにスクランブル処理した対照細胞およびｗｔ（図１２Ａ）と比較したＬＡＫＩ細胞におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン焦点の強度、ならびに異常な核構造を有する細胞の数（図１２Ｂ）におけるＬ１－ＡＯＮ処理の効果を示す。ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を実施し、結果は、Ｌ１ＲＮＡの５’末端および３’末端の両方が、ＬＡＫＩＴＴＦ中のＳＵＶ３９Ｈ１／２タンパク質に結合されることを示した（図１２Ｃ）。ｓｃｒｂｌＬ１ＡＯＮ（１２Ｂでは各対の左バー）およびＬ１－ＡＯＮ（１２Ｂでは各対の右バー）処理と比較したｗｔにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３のレベル、ならびにスクランブル処理した対照細胞およびｗｔ（図１２Ａ）と比較したＬＡＫＩ細胞におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン焦点の強度、ならびに異常な核構造を有する細胞の数（図１２Ｂ）におけるＬ１－ＡＯＮ処理の効果を示す。ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を実施し、結果は、Ｌ１ＲＮＡの５’末端および３’末端の両方が、ＬＡＫＩＴＴＦ中のＳＵＶ３９Ｈ１／２タンパク質に結合されることを示した（図１２Ｃ）。ｓｃｒｂｌＬ１ＡＯＮ（１２Ｂでは各対の左バー）およびＬ１－ＡＯＮ（１２Ｂでは各対の右バー）処理と比較したｗｔにおけるＨ３Ｋ９ｍｅ３のレベル、ならびにスクランブル処理した対照細胞およびｗｔ（図１２Ａ）と比較したＬＡＫＩ細胞におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン焦点の強度、ならびに異常な核構造を有する細胞の数（図１２Ｂ）におけるＬ１－ＡＯＮ処理の効果を示す。ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を実施し、結果は、Ｌ１ＲＮＡの５’末端および３’末端の両方が、ＬＡＫＩＴＴＦ中のＳＵＶ３９Ｈ１／２タンパク質に結合されることを示した（図１２Ｃ）。Ｌ１ＲＮＡが、ＬＡＫＩ細胞の核に蓄積されたＳＵＶ３９Ｈ１／２に阻害的な役割を果たすかを決定する試験を示す。ＡｎＨ３Ｋ９特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼアッセイを、Ｌ１センス方向転写物の存在下で、組換えＳＵＶ３９Ｈ１／２タンパク質を使用して行った。Ｌ１アンチセンス転写物を陰性対照として使用した。ｑＰＣＲによって確認される、皮膚、脛骨前骨格筋、肝臓、腎臓、脾臓、および胃を含むいくつかの組織におけるＬ１ＲＮＡのノックダウンを示す。ｑＰＣＲによって確認される、皮膚、脛骨前骨格筋、肝臓、腎臓、脾臓、および胃を含むいくつかの組織におけるＬ１ＲＮＡのノックダウンを示す。ｑＰＣＲによって確認される、皮膚、脛骨前骨格筋、肝臓、腎臓、脾臓、および胃を含むいくつかの組織におけるＬ１ＲＮＡのノックダウンを示す。分析した異なる組織におけるＳＡＳＰ遺伝子の発現に対するＬ１－ＡＯＮ処理の効果（各バー対の右バー）を示す。マウスにおける皮膚、脾臓、および腎臓の組織学的プロファイルに対するＬ１－ＡＯＮの効果（各バー対の右バー）を示す。処理されたマウスの体重（図１３Ｄ）および寿命（図１３Ｅ）に対するＬ１－ＡＯＮ処理の効果（各バー対の右バー）を示す。処理されたマウスの体重（図１３Ｄ）および寿命（図１３Ｅ）に対するＬ１－ＡＯＮ処理の効果（各バー対の右バー）を示す。ヒトｗｔ（左バー）、早老症候群（ＨＧＰＳ、中央バー）、およびＷＲＮ－／－細胞（右バー）におけるＬＩＮＥ－１Ｔａエレメントの発現を示すｑＰＣＲである。Ｎ＝３。Ｓ．Ｅ．Ｍおよびｔ検定がプロットで示される。Ｌ１－ＡＯＮで処理されたＨＧＰＳおよびＷＲＮ－／－細胞（バーの各対の右バー）、ならびに対照（バーの各対の左バー）における老化細胞の数を示すＳａ－Ｂ－Ｇａｌアッセイの結果を示す。プロットは、アッセイの定量化を示す。Ｎ＝６。Ｓ．Ｅ．Ｍ．がプロットで示される。Ｌ１－ＡＯＮ処理後のＨＧＰＳ細胞における老化関連遺伝子の発現を示すｑＰＣＲからの結果である（各バー対の右側のバー）。Ｎ＝６。Ｓ．Ｅ．Ｍおよびｔ検定がプロットで示される。Ｌ１－ＡＯＮ処理後のＷＲＮ－／－細胞における老化関連遺伝子の発現を示すｑＰＣＲからの結果である（各バー対の右側のバー）。Ｎ＝６。Ｓ．Ｅ．Ｍおよびｔ検定がプロットで示される。Ｌ１－ＡＯＮ処理したＨＧＰＳ細胞およびＬＡＫＩ対照細胞におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３強度を示すプロットである。一重測定、Ｓ．Ｅ．Ｍ、およびｔ検定がプロットで示される。Ｌ１－ＡＯＮで処理したＷＲＮ－／－細胞およびＬＡＫＩ対照細胞におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３強度を示すプロットである。一重測定、Ｓ．Ｅ．Ｍ、およびｔ検定がプロットで示される。

開示される組成物および方法は、Ｌ１動員が他の組織によって支持されるという発見に基づいており、Ｌ１拡張が組織恒常性に寄与し得るかは、ほとんど未探索である。典型的なＬ１エレメントは、約６，０００塩基対長であり、非翻訳領域（ＵＴＲ）および標的部位重複に隣接する２つの非オーバーラップオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる。Ｌ１は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）と、続いてオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）と、ＯＲＦ間領域と、オープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）と、ポリＡ部位および関連するポリＡタイルを伴う３’ＵＴＲと、を有する。ヒトにおいて、ＯＲＦ２は、非定型的終結／再開始メカニズムによって翻訳されると考えられる。Ｌ１エレメントの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、ある意味で強力な内部ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写プロモーターを含有する。Ｌ１転写は、ＯＲＦ１ｐおよびＯＲＦ２ｐという２つのタンパク質を産生する全長ｍＲＮＡを生成する。第１のＯＲＦは、既知の機能のいずれのタンパク質とも相同性を欠く５００個のアミノ酸－４０ｋＤａタンパク質をコードする。Ｌ１の第２のＯＲＦは、エンドヌクレアーゼおよび逆転写酵素活性を有するタンパク質をコードする。

開示される組成物および方法は、特定の実施形態においてＬ１ＨＳ（Ｌ１ヒト特異的）Ｔａ（転写された、サブセットａ）サブファミリーに属する、Ｌ１の細胞レベルを調節する。Ｌ１ＬＩＮＥ（長鎖散在エレメント）のＴａ（転写された、サブセットａ）サブファミリーは、３’非翻訳領域における３ｂｐのＡＣＡ配列を特徴とし、ヒトゲノム中に約５２０個のメンバーを含有する。

Ｉ．定義
本明細書で使用される「化粧品組成物」は、哺乳動物、特にヒトの皮膚または毛髪に局所適用するための組成物を指す。かかる組成物は、一般に、放置または洗い流しとして分類することができ、外観または一般的な美観を改善するために人体に適用される任意の製品を含む。

本明細書で使用される場合、「ベクター」は、挿入されたセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントが挿入され得るプラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコンである。本明細書に記載されるベクターは、発現ベクターであることができる。

本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、１つ以上の発現制御配列を含むベクターである。

本明細書で使用される場合、「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝化生理食塩水、水、および油／水または水／油エマルションなどのエマルション、ならびに様々なタイプの湿潤剤など、標準的な薬学的担体のうちのいずれかを包含する。

本明細書で使用される場合、「治療すること」という用語は、特定の障害もしくは状態と関連する症状を緩和すること、および／または症状を予防もしくは排除することを含む。

「操作可能に連結された」とは、構成要素がそれらの通常の機能を行うように構成される並列を指す。例えば、コード配列に操作可能に連結された制御配列またはプロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができ、タンパク質に操作可能に連結されたオルガネラ局在配列は、連結されたタンパク質を特定のオルガネラに局在化させる。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、組換えベクターを導入することができる細胞を指す。

本明細書で使用される場合、「形質転換された」および「トランスフェクトされた」は、当該技術分野で既知のいくつかの技法による細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を包含する。

本明細書に記載のナノ粒子、治療剤、および医薬組成物に適用される場合、「有効量」および「治療有効量」は、互換的に使用され、所望の治療結果をもたらすのに必要な量を意味する。例えば、有効量は、組成物および／もしくは治療剤、または医薬組成物が投与される疾患の症状を治療、治癒、あるいは緩和するのに有効なレベルである。

「阻害する」および「低下させる」という用語は、活性もしくは発現を低下または減少させることを意味する。これは、活性もしくは発現の完全な阻害もしくは低下、または部分的な阻害もしくは低下であることができる。阻害または低下は、対照もしくは標準レベルと比較することができる。阻害は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％であることができる。

ＩＩ．対象におけるＬ１ＲＮＡを増加させる組成物および方法
開示される組成物および方法は、骨細胞に分化するヒト骨髄間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）におけるＬ１ＲＮＡ発現の低下は、転位の低下をもたらし、ミネラル化骨マトリックスを生成する細胞の能力を強く損なうという発見に基づく。閉経後の女性などの対象の骨髄間葉系細胞におけるＬ１ＲＮＡ（好ましくはヒトにおける、Ｌ１ＨＳ－Ｔａ１）の量を増加させることは、骨喪失に対抗し、したがって骨粗しょう症と関連する症状を低下させる。Ｌ１駆動の構造的変動は、骨量と強く相関し、健常対骨粗しょう症の閉経後女性の骨ゲノムおよび骨量を特定的に区別する。インビトロ細胞培養実験は、１）Ｌ１ゲノム拡張が、ＭＳＣから発達した発達性骨芽細胞における骨形成に積極的に寄与し、２）発達性骨芽細胞における妨害されたＬ１レトロ転位が、骨形成プログラムの活性化の欠如およびミネラル化の低下をもたらし、３）Ｌ１の動員が、骨粗しょう症患者における蓄積細胞型であるＭＳＣからの脂肪細胞の分化中に起こらず、そのため骨形成に特異的である、というメカニズムを開示する。本試験はまた、分化性骨芽細胞におけるＬ１ＲＮＡの中度の枯渇でさえ、骨芽細胞関連転写因子の発現の著しい低下を誘導するのに十分であることを示す。

さらに、活性Ｌ１によってコードされ、Ｌ１転位に必要な酵素であるＯＲＦ２は、抗レトロウイルス療法に使用されるヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＴＲＩ）のオフターゲットである。骨粗しょう症につながる骨ミネラル密度の顕著な低下は、ＮＲＴＩで治療される患者の主な合併症である。いくつかの実施形態において開示される組成物および方法は、骨細胞に分化するＨＢＭＳＣのＮＲＴＩ処理が、Ｌ１レトロ転位を防止して、骨のミネラル化の低下をもたらすという発見に基づいている。

したがって、一実施形態は、骨前駆細胞におけるＬ１ＲＮＡの増加を必要とする対象において、骨前駆細胞におけるＬ１ＲＮＡを増加させるための方法を開示する。例示的な対象には、骨粗しょう症を有するか、または骨の再成長／骨量指数の増加を必要とする状態を有する患者が含まれる。第２の実施形態は、骨前駆細胞におけるＬ１ＲＮＡの増加を必要とする対象において、骨前駆細胞におけるＬ１ＲＮＡを増加させるための組成物を開示する。組成物は、Ｌ１ＲＮＡを囲む核酸、Ｌ１ＲＮＡ、および任意選択的に、Ｌ１レトロ転位を上方制御することが知られている小分子を含む。

Ａ．骨粗しょう症および骨量指数の増加を必要とする状態
原発性骨粗しょう症は骨密度を低下させ、その微小構造を破壊することによって、低衝撃骨折を起こしやすい骨格疾患である。骨格は、ＢＭＤの７０～８０％が遺伝性であるため、強い遺伝的素因を有する（１）（２）。原発性骨粗しょう症は、遺伝子および環境の両方が関与する多因子性起源を有する（３）。骨粗しょう症において、骨髄ニッチのＭＳＣプールは、骨を構築する骨芽細胞を犠牲にして脂肪細胞の発達を促進する。このメカニズムは、単独で、または骨吸収率の増加とともに、正味の骨喪失をもたらす（４）（５）。骨粗しょう症は、世界的に罹患率、死亡率、および生活の質の低下の主な原因であり（６）、年間８９０万を超える骨折につながっている（７）。ＢＭＤの顕著な低下、骨格の脆弱性の増加、および骨折のリスクもまた、ＮＲＴＩベースのＡＲＴ下で、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染者のすべての年齢の個人にとって重要な臨床問題である。

骨は常に変化している、－すなわち、古い骨は取り除かれ、新しい骨に置き換えられる。幼少期の間、除去される骨よりも多くの骨が生成され、そのため骨格はサイズおよび強度の両方で成長する。ほとんどの人にとって、骨量は２０代にピークになる。この年齢までに、男性は通常、女性よりも多くの骨量を蓄積している。この時点後、骨格内の骨の量は、通常、古い骨の除去が新しい骨の形成を上回るにつれて、ゆっくりと減少し始める。

５０代の男性は、女性が閉経後の数年でなされる骨量の急激な減少を経験しない。しかしながら、６５歳または７０歳までに、男性と女性は同じ速度で骨量を失い、生涯にわたって骨の健康に不可欠な栄養素であるカルシウムの吸収は、男女ともに減少する。過度な骨喪失は、骨を壊れやすくし、骨折する可能性がより高くなる。骨粗しょう症には主に原発性および続発性の２タイプがある。原発性骨粗しょう症の症例では、状態が年齢関連骨喪失（ときに老年性骨粗しょう症と呼ばれる）によって生じるか、または原因が不明（特発性骨粗しょう症）であるかのいずれかである。特発性骨粗しょう症という用語は、典型的には、７０歳未満の男性にのみ使用され、高齢の男性では、年齢関連骨喪失が原因であると想定される。骨粗しょう症を有する大部分の男性は、少なくとも１つの（ときに１つを超える）二次原因を有する。続発性骨粗しょう症の症例では、骨量の喪失は、特定の生活習慣行動、疾患、または薬物によって引き起こされる。男性における続発性骨粗しょう症の最も一般的な原因のいくつかには、グルココルチコイド薬への曝露、性腺機能低下症（低レベルのテストステロン）、アルコール乱用、喫煙、胃腸疾患、高カルシウム尿症、および不動化が含まれる。

骨量指数を増加させるための介入方法が有用であり得る他の状態には、脊椎固定療法が含まれ、その療法では、自己移植片または骨移植片が、単独でまたは細胞と組み合わせて、脊椎固定部位（典型的には、２つの椎骨間の部位）に送達されて、変性椎間板疾患、脊椎すべり症、脊椎管狭窄症、脊椎側弯症、骨折した椎骨、感染症、椎間板ヘルニア、および腫瘍などの状態を治療する。介入は、骨の成長、および脊椎固定療法が挿入される脊椎間の最終的な固定を促進することが目的である。本出願に開示される組成物は、標準的な脊椎固定療法と組み合わせて、部位の骨成長を改善することができる。開示される組成物はまた、特に高齢者において、骨折治癒のための補助療法として使用することができる。

Ｂ．Ｌ１ＲＮＡの増加を必要とする対象においてＬ１ＲＮＡを増加させるための方法
一実施形態において開示される方法は、Ｌ１ＲＮＡを上方制御するようにエクスビボで遺伝子操作された骨形成骨髄由来細胞などの骨前駆細胞、または細胞のＬ１量を増加させる遺伝子治療を、それを必要とする対象に提供することを含む。本方法は、他の実施形態において、Ｌ１ＲＮＡまたはＬ１ＲＮＡをコードする遺伝子を、それを必要とする対象に、単独で、または本明細書に開示される遺伝子操作された骨形成骨髄由来細胞を提供することと組み合わせて提供することを含む。

Ｌ１ＲＮＡをインビトロで合成し、次いでインビトロまたはインビボで関心対象の細胞に導入することができるか、または宿主細胞を操作して、特定の条件下でＬ１遺伝子からＬ１ＲＮＡの発現を誘導することができる。１つのアプローチは、培養中の初代細胞への核酸移行、続いて、エクスビボで形質転換された細胞を宿主に、全身的、または特定の器官もしくは組織へのいずれかで移植（好ましくは、自己）することを含む。例示的な対象には、閉経後の女性、骨粗しょう症を有すると診断された対象、抗レトロウイルス療法、例えば、ＮＲＴ１を受けている対象が含まれる。

一実施形態において、開示される組成物は、ヒトＬ１ＲＮＡ（Ｌ１－Ｔａサブファミリー）の配列を、単独で、またはベクター中で、初代細胞に移行させて含有する。

しかしながら、組成物は、Ｌ１ＲＮＡの断片、例えば、Ｌ１オープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）を、単独で、もしくは５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が先行して、またはオープンリーディングフレーム２（ＯＲＦ２）を含むことができる。ＯＲＦ２発現構築物は、例えば、Ｇａｓｉｏｒ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３５７（５）：１３８３－１３９３（２００６）に公開されている。

ｉ．エクスビボ法
エクスビボ法は、例えば、対象から細胞を収集するステップと、細胞を培養するステップと、それらにＬ１ＲＮＡをコードするＤＮＡまたはＬ１ＲＮＡを含む発現ベクターで形質導入するステップと、細胞をコードされたＲＮＡの発現に好適な条件下で維持するステップと、を含むことができる。これらの方法は、分子生物学の分野で既知である。好ましい実施形態において、細胞は、治療される対象に対して自己由来である。好ましい宿主細胞は、ｈＢＭＳＣである。ｈＢＭＳＣを単離するための方法は、当該技術分野で既知である（Ｂａｇｈａｅｖｉ，ｅｔａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，ＨｅｐａｔｏｌＢｅｄＢｅｎｃｈ，１０（３）：２０８－２０１３（２０１７）。

１．ベクター
Ｌ１ＲＮＡをコードするベクターも提供される。上記のものなどの核酸は、細胞における発現のためにベクターに挿入することができる。本明細書で使用される場合、「ベクター」は、挿入されたセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントが挿入され得るプラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、発現ベクターであることができる。「発現ベクター」は、１つ以上の発現制御配列を含むベクターであり、「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を制御および調節するＤＮＡ配列である。

ベクター中の核酸は、１つ以上の発現制御配列に操作可能に連結することができる。例えば、制御配列は、発現制御配列が関心対象のコード配列の発現を効果的に制御するように、遺伝子構築物に組み込むことができる。発現制御配列の例には、プロモーター、エンハンサー、および転写終結領域が含まれる。プロモーターは、ＤＮＡ分子の領域からなる発現制御配列であり、典型的には、転写が開始する地点（一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の近く）の１００ヌクレオチド以内上流にある。コード配列をプロモーターの制御下にするために、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位をプロモーターの下流の１ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドの間に配置することが必要である。Ｈａｍａｎｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｅｎｇ．，１３：７（２０１９）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動されるｈＢＭＳＣにおける遺伝子発現が、伸長因子１α（ＥＦ１α）またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターを含有するプラスミドによるトランスフェクションよりも１０倍高い導入遺伝子発現をもたらしたことを実証した。

エンハンサーは、時間、位置、およびレベルに関して発現特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、転写部位から様々な距離に位置するときに機能することができる。エンハンサーはまた、転写開始部位から下流に位置することができる。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写することができ、次いで、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳することができる場合、細胞内の発現制御配列に「操作可能に連結され」、かつそれの「制御下」である。

好適な発現ベクターには、プラスミドならびに例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスに由来するウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。多数のベクターおよび発現系が、Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの企業から市販されている。最近のトランスフェクション試験では、細菌配列を除去する組換えによってｐＤＮＡに由来する核酸であるミニサークルＤＮＡ（ｍｃＤＮＡ）が検討されている。Ｌ１ＲＮＡは、当該技術分野で既知の方法（Ｍｕｎｅｔａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１６、１０１：３１０－３２０）を使用するｍｃＤＮＡを使用して宿主細胞に導入することができる。

２．宿主細胞形質転換
発現される核酸を含有するベクターを宿主細胞に移行することができる。「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクターを導入することができる骨前駆細胞を含むことが意図される。本明細書で使用される場合、「形質転換された」および「トランスフェクトされた」は、いくつかの技術のうちの１つによる細胞への核酸分子（例えば、ベクター）の導入を包含する。特定の技法に限定されないが、これらの技法のいくつかは、当該技術分野内で十分に確立されている。核酸は、例えば、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションを含む技術によって、哺乳動物細胞にトランスフェクトすることができる。好ましい宿主細胞には、ＨＢＭＳＣまたは骨芽細胞などの骨前駆細胞が含まれる。

形質導入ステップは、例えば、リン酸カルシウム、リポフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染、および遺伝子銃導入を含む、エクスビボ遺伝子治療に使用される任意の標準的な手段によって達成することができる。代替的に、リポソームまたはポリマー微粒子を使用することができる。形質導入に成功している細胞は、次に、例えば、コード配列または薬剤耐性遺伝子の発現について選択することができる。次いで、細胞を（所望の場合に）致死的に照射し、対象に注入または埋め込むことができる。

エクスビボでのＭＳＣの非ウイルストランスフェクションにおける有効な戦略は、典型的には、細胞膜の破壊を用いて、核酸を細胞に移行するか（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、およびマイクロポレーション）、またはエンドサイトーシスを介して細胞内移行を促進するナノ担体材料による核酸のパッケージングを用いる。

エクスビボでＭＳＣに核酸移行するエレクトロポレーションの主な代替は、核酸を電荷相互作用または表面受容体結合を通じて細胞膜と有利に会合するナノ粒子または凝集複合体に静電的に凝縮またはカプセル化する材料であるナノ担体によるトランスフェクションであり、続いて、主にナノ粒径および電荷に応じて、マクロピノサイトーシス、クラスリン媒介性エンドサイトーシス、またはカベオラ媒介性エンドサイトーシスを介して内在化される。担体は、ポリマー、脂質、多糖類、ペプチド、および無機材料を含むが、これらに限定されず、ＭＳＣのトランスフェクションを容易にすることが実証されている。例には、ナノ－ヒドロキシアパタイト（ｎＨＡ）、好ましくはヒアルロン酸で官能化されたユビキタスカチオンポリマートランスフェクション試薬２５ｋＤａ分岐ポリエチレンイミン（ｂＰＥＩ）、および反復アルギニン－アラニン－ロイシン－アラニン（ＲＡＬＡ）両親媒性ペプチド、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（β－アミノ－エステル）（ＰＢＡＥ）、ＰＥＩコーティングＰＬＧＡナノ粒子などが含まれるが、これらに限定されず、Ｈａｍａｎｎ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｅｎｇ．，１３：７（２０１９）でレビューされている。

転写効率を改善するための細胞培養条件を使用して、細胞に導入されている核酸の効率的な取り込みを確実にすることができる。例えば、グルココルチコイド（Ｇｃ）は、ＭＳＣにおけるエクスビボでのトランスフェクションを劇的に増強することができる。トランスフェクションの０～３０分前に送達される１００ｎＭのＧｃデキサメタゾン（ＤＥＸ）は、ｈＢＭＳＣにおける導入遺伝子発現を増加させることが示された。

形質転換された骨前駆細胞は、好ましくは、分離し、ＧＭＰ条件下で培養し、確立された用量範囲を精製して得る。

ｉｉ．インビボ法
インビボ法は、本明細書に開示される操作された骨前駆細胞を、それを必要とする対象に導入すること、またはＬ１ＲＮＡもしくはＬ１ＲＮＡをコードするＤＮＡを、それを必要とする対象に直接移行することを含む。開示される方法はまた、Ｌ１ＲＮＡ転写およびレトロ転位を上方制御することが知られている小分子および化合物を対象に投与することも含むことができる。例えば、ベンゾ［ａ］ピレン、カンプトテシン、サイトカラシンＤ、メルバロン、およびビンブラスチンなどの薬剤、ＰＰＡＲαアゴニスト（ベザフィブレートおよびフェノフィブレート）、ならびに非ステロイド性抗炎症薬（ジフルニサル、フルフェナム酸、サリチルアミド、およびスリンダク）が、Ｌ１プロモーター活性を誘導することが示されている（Ｔｅｒａｓａｋｉ，ｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１３；８（９）：ｅ７４６２９）。

細胞（Ｌ１ＲＮＡを含有するベクターまたはＬ１ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むように遺伝子操作された）は、当該技術分野で既知の方法を使用して、例えば、静脈内によって、対象に導入することができる。自己の形質転換したＢＭＳＣは、細胞２００万個／Ｋｇ～５００万個／ｋｇの用量範囲の投与で静脈内に注入することができる。細胞が静脈内に送達される実施形態において、注入日に、形質転換された細胞を生理食塩水に１ｍＬ当たり細胞５００万個の濃度に再懸濁し、好ましくはフコシル化する。次いで、最終製品は、末梢静脈アクセスを介した患者への静脈内投与のためにシリンジ中にパッケージングすることができる。フコシルトランスフェラーゼを使用した骨髄へのｈＢＭＳＣのホーミングを改善する方法は、当該技術分野で既知である。基本的に、外因的に導入されたフコシルトランスフェラーゼを使用して、ＭＳＣによって発現されたＣＤ４４を、骨髄へのＨＳＣホーミングに不可欠な強力なＥ－セレクチンリガンドであるＨＣＥＬＬ（造血細胞Ｅ－／Ｌ－セレクチンリガンド）に変更する。基本的に、外因的に導入されたフコシルトランスフェラーゼを使用して、ＭＳＣによって発現されたＣＤ４４を、骨髄へのＨＳＣホーミングに不可欠な強力なＥ－セレクチンリガンドであるＨＣＥＬＬ（造血細胞Ｅ－／Ｌ－セレクチンリガンド）に変更する（Ｋｒｕｅｇｅｒ，ｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌＭｅｄ．，７：６５１－６６３（２０１８でレビューされている）。

インビボ遺伝子療法を用いることができ、それによって遺伝子材料が患者に直接的に移行される。これらの実施形態において、遺伝子材料は、ウイルス由来ベクターまたは非ウイルス技術によって患者に導入される。インビボ核酸療法は、機能的に活性なＤＮＡを哺乳動物の体細胞組織または器官にインビボで直接移行させることによって達成することができる。核酸は、ウイルス手段によってインビボで投与することができる。治療用遺伝子発現カセットは、典型的には、遺伝子転写を駆動するプロモーター、関心対象の導入遺伝子、および遺伝子転写を終了させる終結シグナルからなる。かかる発現カセットは、送達ビヒクルとしてプラスミド（環化した二本鎖ＤＮＡ分子）に埋め込むことができる。プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）は、種々の注射技術によってインビボで直接的に注射することができ、その中で、流体力学的注射は、大量のｐＤＮＡ溶液を迅速に注射し、細胞膜に孔を一時的に誘導することによって、主要器官における最大の遺伝子移入効率を達成する。負に荷電したｐＤＮＡ分子が疎水性細胞膜を貫通するのを助けるために、カチオン性脂質およびカチオン性ポリマーを含む化学材料が、ｐＤＮＡをそれぞれリポプレックスおよびポリプレックスに凝縮させるために使用されている。

Ｌ１ＲＮＡまたはＬ１ＲＮＡをコードする核酸分子は、当該技術分野において周知であるように、複製欠損レトロウイルスを生成するパッケージング細胞株を使用して、レトロウイルスベクターにパッケージングされ得る。組換えアデノウイルスおよびワクシニアウイルスを含む他のウイルスベクターも使用され得、これらは非複製にすることができる。核酸はまた、リポソーム、ポリマー微粒子およびナノ粒子、ならびにアシアロ糖タンパク質／ポリリジンなどのポリカチオンを含む、他の担体によって送達され得る。開示されるベクターおよび担体を使用するインビボでの遺伝子送達のための様々な技法および方法は、当該技術分野で既知である（Ｗａｎｇ，ｅｔａｌ．，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．，１８（９７）：６７－７７（２０１４）でレビューされている）。ＤＮＡベクター設計における大きな進歩は、ミニサークルＤＮＡ（ｍｃＤＮＡ）であり、細菌由来のＣｐＧ豊富な骨格配列の欠如において、ｐＤＮＡと異なる。インビボで投与される場合、ｍｃＤＮＡは、従来のｐＤＮＡよりも安全で、高い、持続可能な導入遺伝子発現を媒介する。

ＩＩＩ．対象におけるＬ１ＲＮＡを低下させる組成物および方法
開示される方法および適用は、Ｌ１ＲＮＡ、ＬＩＮＥ１ＲＮＡをコードする核酸、またはＬ１ＲＮＡコードタンパク質のレベルを低下させることを必要とする対象においてそれを行うことに依拠する。本方法および適用は、Ｌ１ＲＮＡレベルの低下が、線維芽細胞における細胞老化のマーカーおよび皮膚の健康、例えば、表皮層の厚さなどの老化マーカーを低下させるという発見に基づいている。

Ｌ１ＲＮＡ発現の下方制御を使用して、加齢と関連する状態、例えば、早老症候群を治療することができる。ハッチンソン・ギルフォード早老症候群（「早老症」または「ＨＧＰＳ」）は、小児における促進老化の外観を特徴とする稀で致命的な遺伝子疾患である。出生時に健康に見えるが、早老症を有する小児は、生後２年以内に促進老化の多くの特徴を示し始める。早老症の徴候には、成長不全、体脂肪および毛髪の喪失、老化してみえる皮膚、関節の硬直、股関節脱臼、全身性アテローム性動脈硬化症、心臓血管（心臓）疾患、および脳卒中が含まれる。他の早老性症候群にはウェルナー症候群が含まれ、１０代後半まで発症しない「成人早老症」としても知られている。早老症に治癒はないが、作業療法および理学療法は、関節が硬直している場合、子供が動き続けることに役立てることができる。開示される組成物および方法は、早老症候群と関連する促進老化症状を改善することができる。以下の実施例は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）を使用してＨＧＰＳマウスモデル（ＬＡＫＩ）から得られた細胞におけるＬ１ＲＮＡの枯渇が、エピジェネティックマークのレベルを回復し、老化関連遺伝子の発現を低下させ、寿命を増加したことを示す。

Ｌ１ＲＮＡ発現の下方制御はまた、化粧品組成物における適用も見出すことができる。いくつかの実施形態において、化粧品組成物は、老化の兆候を処理するために局所または皮下で使用することができる。これらの兆候には、小皺および皺の形成、不十分な皮膚のハリ、皮膚光沢の低下、皮膚の滑らかさの欠如、皮膚の弾力性の低下、加齢斑点の形成、シミ、血色の悪さ、不均一な色素沈着、およびそれらの組み合わせが含まれる。組成物は、いくつかの実施形態において、表皮層の厚さを改善するのに有効である。

Ａ．Ｌ１ＲＮＡ下方制御／阻害
Ｌ１ＲＮＡは、Ｌ１ＲＮＡレベルを下方制御するように細胞を処理することによって下方制御することができる。このステップは、細胞を、Ｌ１ＲＮＡを阻害する１つ以上の薬剤と接触させることを含む。本明細書で使用されるＬ１ＲＮＡを阻害する薬剤には、細胞におけるＬ１ＲＮＡのレトロ転位を低下させる薬剤、およびＬ１ＲＮＡによって発現されるタンパク質の活性のうちのいずれかを阻害する薬剤が含まれるが、これらに限定されない。Ｌ１ＲＮＡ阻害剤は、核酸、ペプチド（例えば、ペプチドアプタマー）、または小分子であることができる。

ＬＩＮＥ１レトロ転位を阻害することが認められている化合物には、カプサイシン（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔａｌ．ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ．２０１８Ｏｃｔ；１９（１０）：３２４３）、ならびに３つの選択的ＬＩＮＥ１逆転写酵素阻害剤であるＧＢＳ－１４９、エムトリシタビン、およびラミブジンが含まれるが、これらに限定されず、Ｂａｎｕｅｌｏｓ－Ｓａｎｃｈｅｚ，ｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２６（８）：Ｐ１０９５－１１０９（２０１９）に公開されている。

Ｌ１ＲＮＡは、Ｌ１ＯＲＦ１、Ｌ１－ＯＲＦ２、もしくはこれらの組み合わせの発現を下方制御する、機能性核酸（本明細書では、Ｌ１ＲＮＡ阻害性ＮＡ）、またはそれをコードするベクターを使用して阻害することができる。例には、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、リボザイム、およびアプタマー（核酸およびペプチドアプタマー）が含まれるが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態において、Ｌ１ＲＮＡは、それを下方制御することを必要とする対象において、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、Ｌ１－ＯＲＦ１ＲＮＡ配列に特異的なフルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）修飾アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を使用して下方制御され、Ｌ１ＲＮＡ阻害性ＡＳＯ（またはそれを発現するベクター）は、本明細書に記載されるように製剤化して、それを必要とする対象に投与することができる。

ｉ．ＲＮＡ干渉
いくつかの実施形態において、Ｌ１ＲＮＡ発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を通じて阻害される。このサイレンシングは、最初に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を添加して観察された（Ｆｉｒｅ，ｅｔａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ，３９１：８０６－１１、Ｎａｐｏｌｉ，ｅｔａｌ．（１９９０）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：２７９－８９、Ｈａｎｎｏｎ，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ，４１８：２４４－５１）。ｄｓＲＮＡが細胞内に入ると、それはＲＮアーゼＩＩＩ様酵素であるダイサーによって、３’末端に２つのヌクレオチドオーバーハングを含む長さが２１～２３ヌクレオチである二本鎖小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔａｌ．（２００１）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１５：１８８－２００、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３－６、Ｈａｍｍｏｎｄ，ｅｔａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，４０４：２９３－６）。ＡＴＰ依存性ステップにおいて、ｓｉＲＮＡは、一般にＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られる複数サブユニットタンパク質複合体に組み込まれるようになり、それがｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列に誘導する（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ，１０７：３０９－２１）。いくつかの地点で、ｓｉＲＮＡ二本鎖は巻き戻され、アンチセンス鎖はＲＩＳＣに結合したままであり、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの組み合わせによる相補的ｍＲＮＡ配列の分解を指示するように思われる（Ｍａｒｔｉｎｅｚ，ｅｔａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ，１１０：５６３－７４）。しかしながら、ＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡの効果またはそれらの使用は、いかなるタイプのメカニズムにも限定されない。

短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導することができる二本鎖ＲＮＡであり、それによって遺伝子発現を減少させるか、または阻害さえする。一例において、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡなどの相同性ＲＮＡ分子の特異的分解を、ｓｉＲＮＡおよび標的ＲＮＡの両方の間の配列同一性領域内で引き起こす。例えば、ＷＯ０２／４４３２１は、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解が、３’オーバーハング末端と塩基対形成した場合に可能であるｓｉＲＮＡを開示しており、これらのｓｉＲＮＡの作製方法について参照により本明細書に組み込まれる。

配列特異的遺伝子サイレンシングは、酵素ダイサーによって生成されるｓｉＲＮＡを模倣する合成の短二本鎖ＲＮＡを使用して哺乳類細胞において達成することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４４９８）（Ｕｉ－Ｔｅｉ，ｅｔａｌ．（２０００）ＦＥＢＳＬｅｔｔ４７９：７９－８２）。ｓｉＲＮＡは、化学的もしくはインビトロ合成することができるか、または細胞内でｓｉＲＮＡへと処理される短二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であることができる。合成ｓｉＲＮＡは、一般に、アルゴリズムおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを使用して設計される。供給業者には、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ＭＷＢＢｉｏｔｅｃｈ（Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、およびＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｔｏ，ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が含まれる。ｓｉＲＮＡはまた、ＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キットなどのキットを使用してインビトロで合成することができる。

ベクターからのｓｉＲＮＡの生成は、より一般的に、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の転写を通じて行われる。ｓｈＲＮＡを含むベクターの生成のためのキットは、例えば、ＩｍｇｅｎｅｘのＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（商標）構築キット、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢＬＯＣＫ－ＩＴ（商標）誘導性ＲＮＡｉプラスミドおよびレンチウイルスベクターが入手可能である。

ｉｉ．アンチセンス
ＬＩＲＮＡは、アンチセンス分子であり得るものを使用して阻害することができる。アンチセンス分子は、正準塩基対形成または非正準塩基対形成のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮアーゼＨ媒介性ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分解を介して標的分子の破壊を促進するように設計される。代替的に、アンチセンス分子は、転写または複製などの、標的分子で通常起こるプロセシング機能を中断するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセス可能な領域を見出すことによる、アンチセンス効率の最適化のための多数の方法がある。例示的な方法には、インビトロ選択実験ならびにＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用するＤＮＡ修飾試験が含まれる。アンチセンス分子は、１０^－６、１０^－８、１０^－１０、または１０^－１２以下の解離定数（Ｋ_ｄ）で標的分子に結合することが好ましい。

「アンチセンス」核酸配列（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である、例えば、ＬＩＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。アンチセンス核酸配列および送達方法は、当該技術分野で周知である（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６（２）：１２０－１２８（２００４）、Ｃｌａｗｓｏｎ，ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．，１１（１７）：１３３１－１３４１（２００４）。アンチセンス核酸は、標的配列の全コード鎖に、またはその一部のみに、相補的であることができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが例えば、約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、またはそれ超のヌクレオチドであることができる。

ＡＳＯは、全長Ｌ１ＲＮＡ、Ｌ１５’ＵＴＲ、Ｌ１ＲＮＡＯＲＦ１、Ｌ１ＲＮＡＯＲＦ２、および／またはＬ１３’ＵＴＲに相補的であることができる。例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを以下に提供する。

Ｌ１５’ＵＴＲに対するオリゴ
ＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧ（配列番号５７）
ＡＴＧＡＡＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧ（配列番号５８）
ＣＣＣＴＡＧＴＧＡＧＡＴＧＡＡＣＣＣＧＧＴ（配列番号５９）
ＧＴＣＴＧＧＣＡＣＴＣＣＣＴＡＧＴＧＡＧＡ（配列番号６０）
ＴＧＣＧＣＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＡＣＴＣ（配列番号６１）
ＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＣＴＧ（配列番号６２）
ＧＧＴＧＣＧＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴＧＧＣＣＴ（配列番号６３）
ＧＣＴＣＧＣＧＣＡＡＧＧＴＧＣＧＣＡＣＡＣ（配列番号６４）
ＣＣＣＴＧＣＴＴＣＧＧＣＴＣＧＣＧＣＡＡＧ（配列番号６５）
ＣＡＡＴＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧＣＴＴＣＧＧ（配列番号６６）
ＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＣＡＡＴＧＣＣＴＣＧＣ（配列番号６７）
ＣＴＴＧＣＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＣ（配列番号６８）
ＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣＴＴＧＣＧＣＴＴＣＣ（配列番号６９）
ＧＡＡＡＧＧＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＣＣＣＣ（配列番号７０）
ＣＴＴＴＧＡＣＴＣＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＣＴ（配列番号７１）
ＴＣＡＣＣＣＣＴＴＴＣＴＴＴＧＡＣＴＣＧＧ（配列番号７２）
ＧＧＴＧＣＧＴＣＣＧＴＣＡＣＣＣＣＴＴＴＣ（配列番号７３）
ＣＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＧＴＣＣＧＴ（配列番号７４）
ＧＧＧＡＧＴＧＡＣＣＣＧＡＴＴＴＴＣＣＡＧ（配列番号７５）
ＡＴＡＴＴＣＧＧＧＴＧＧＧＡＧＴＧＡＣＣＣ（配列番号７６）
Ｌ１ＯＲＦ１に対するオリゴ
ＣＴＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧ（配列番号７７）
ＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＴＧＴ（配列番号７８）
ＣＡＡＡＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＣ（配列番号７９）
ＣＴＣＡＧＣＴＣＧＴＣＡＡＡＡＴＣＡＴＴＣ（配列番号８０）
ＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＣＧＴＣ（配列番号８１）
ＡＴＣＧＴＣＴＧＡＡＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号８２）
ＧＡＧＴＡＡＴＴＴＧＡＴＣＧＴＣＴＧＡＡＧ（配列番号８３）
ＣＣＧＴＡＧＣＴＣＡＧＡＧＴＡＡＴＴＴＧＡ（配列番号８４）
ＧＡＡＴＧＴＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＣＴＣＡＧ（配列番号８５）
ＣＣＴＴＴＧＧＴＴＴＧＡＡＴＧＴＣＣＴＣＣ（配列番号８６）
ＡＡＣＴＴＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＧＴＴＴＧ（配列番号８７）
ＣＡＡＡＧＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＴＧＣ（配列番号８８）
ＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＴＴＴＴＧＡ（配列番号８９）
ＡＣＡＴＴＣＴＴＣＴＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣ（配列番号９０）
ＴＴＣＴＡＧＴＴＡＴＡＣＡＴＴＣＴＴＣＴＡ（配列番号９１）
ＧＴＡＴＴＧＧＴＴＡＴＴＣＴＡＧＴＴＡＴＡ（配列番号９２）
ＧＣＡＣＴＴＣＴＣＴＧＴＡＴＴＧＧＴＴＡＴ（配列番号９３）
ＧＣＴＣＣＴＴＴＡＡＧＣＡＣＴＴＣＴＣＴＧ（配列番号９４）
ＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＴＡＡＧ（配列番号９５）
ＣＴＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＡＧ（配列番号９６）
Ｌ１ＯＲＦ２に対するオリゴ
ＴＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＡＡＴＴＴＧＡＴＣＣ（配列番号９７）
ＡＡＧＴＴＡＡＴＡＴＴＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧ（配列番号９８）
ＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＴＴ（配列番号９９）
ＡＴＴＴＡＧＴＣＣＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＡ（配列番号１００）
ＴＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＡＧＴＣＣＡＴ（配列番号１０１）
ＣＴＧＴＧＴＣＴＴＴＴＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡ（配列番号１０２）
ＡＣＴＴＧＣＣＡＧＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＴＴ（配列番号１０３）
ＴＣＴＴＴＡＴＧＣＡＡＣＴＴＧＣＣＡＧＴＣ（配列番号１０４）
ＧＧＧＴＣＴＴＧＡＣＴＣＴＴＴＡＴＧＣＡＡ（配列番号１０５）
ＧＣＡＣＡＣＴＧＡＴＧＧＧＴＣＴＴＧＡＣＴ（配列番号１０６）
ＴＧＴＧＧＧＡＴＣＧＧＴＧＧＴＧＡＴＡＴＣ（配列番号１０７）
ＴＴＴＧＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＧＡＴＣＧＧ（配列番号１０８）
ＣＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＴＴＧＴＡＴＴＴＣＴ（配列番号１０９）
ＧＴＡＧＴＡＴＴＣＴＣＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴ（配列番号１１０）
ＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧＴＡＧＴＡＴＴＣＴＣ（配列番号１１１）
ＴＴＡＴＴＴＧＣＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧ（配列番号１１２）
ＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴＴＡＴＴＴＧＣＧＴＡ（配列番号１１３）
ＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴＴ（配列番号１１４）
ＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＡＧＡ（配列番号１１５）
ＴＧＴＧＴＣＧＡＧＧＡＡＴＧＴＡＴＣＣＡＴ（配列番号１１６）
Ｌ１３’ＵＴＲに対するオリゴ
ＴＡＧＣＡＴＴＡＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＣＡ（配列番号１１７）
ＡＴＧＴＧＴＣＡＴＣＴＡＧＣＡＴＴＡＧＧＴ（配列番号１１８）
ＧＣＡＣＣＣＡＣＴＡＡＴＧＴＧＴＣＡＴＣＴ（配列番号１１９）
ＣＴＧＧＴＧＣＧＣＴＧＣＡＣＣＣＡＣＴＡＡ（配列番号１２０）
ＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＣＧＣＴＧ（配列番号１２１）
ＡＴＡＴＧＴＡＴＡＣＡＴＧＴＧＣＣＡＴＧＣ（配列番号１２２）
ＧＧＴＴＡＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＴＡＣＡ（配列番号１２３）
ＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧＧＴＴＡＧＴＴＡＣＡ（配列番号１２４）
ＧＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧ（配列番号１２５）
ＡＡＧＴＴＴＴＡＧＧＧＴＡＣＡＴＧＴＧＣＡ（配列番号１２６）
ＡＴＴＡＴＡＣＴＣＴＡＡＧＴＴＴＴＡＧＧＧ（配列番号１２７）

ＯＳＡは、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ＡＳＯであることができる。ＬＮＡＡＳＯは、アンチセンスギャップマー、抗マイクロＲＮＡ（アンタゴｍｉＲ）、および抗遺伝子アプローチなどの多くの異なる設定で使用されている。ＬＮＡは、リボース部分が２’酸素と４’炭素とを接続させる余分な架橋で修飾される修飾ＲＮＡヌクレオチドである。架橋は、Ａ型二本鎖に多く見られる３’エンド（Ｎｏｒｔｈ）構造中のリボースを「ロック」する。ＬＮＡ設計は、ミックスマーおよびギャップマーの２つの主要な分類に分けることができる。ミックスマーでは、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの配列全体に散在するが、一方ギャップマーでは、オリゴヌクレオチドの両端の２つのＬＮＡセグメントは、ＤＮＡヌクレオシドの中央セグメントまたはギャップによって分離される。ギャップマーは、ＲＮＡ阻害のために好ましい。これは、７～８個のＤＮＡヌクレオチド（ｎｔ）よりも長い中央ＤＮＡ／ＰＳセグメントが、ギャップマーがｍＲＮＡにハイブリダイゼーションされるときにＲＮＡ切断酵素ＲＮアーゼＨを動員するためである。

アンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手順を使用する化学合成および酵素的連結反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、分子の生物学的安定性を増加させるか、またはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計された天然に存在するヌクレオチドまたは様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸はまた、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされている発現ベクターを使用して生物学的に作製することもできる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、関心対象の標的核酸に対するアンチセンス方向のものであり、以下のサブセクションでさらに説明される）。

有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ／ＡＳＯ）の他の例には、アルファ－アノマー核酸が含まれる。アルファ－アノマー核酸分子は、通常のベータ単位に反して、鎖が互いに平行に走る相補的ＲＮＡとともに特異的な二本鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５－６６４１（１９８７））。アンチセンス核酸分子はまた、２’－ｏ－メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５：６１３１－６１４８（１９８７））またはキメラＲＮＡ－ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅｅｔａｌ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２１５：３２７－３３０（１９８７））を含むことができる。

特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、Ｌ１－ＯＲＦ１ＲＮＡ配列に特異的なフルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）修飾ＡＳＯである。ＦＡＮＡＡＳＯは標的配列に結合し、ＲＮアーゼＨ媒介性切断のためのドッキングエレメントとして作用する。

１．アプタマー
いくつかの実施形態において、阻害性分子は、アプタマーである。アプタマーは、標的分子と、好ましくは特定の方法で相互作用する分子である。アプタマーは、標的分子に非常に高い特異性で結合することができる。例えば、標的分子と、その分子の単一位置のみで異なる別の分子との間の結合親和性に、１０，０００倍超の差を有するアプタマーが単離されている。それらの強い結合特性のため、およびアプタマー標的の表面特性は、タンパク質標的の機能的に関連する部分にしばしば対応するため、アプタマーは、強力な生物学的アンタゴニストであることができる。典型的には、アプタマーは、ステムループまたはＧ－カルテットなどの、定義された二次および三次構造に折り畳まれる、長さが１５～５０塩基の小さい核酸である。アプタマーは、ＡＴＰおよびテオフィリンなどの小分子、ならびに逆転写酵素およびトロンビンなどの大分子に結合することができる。アプタマーは、１０^－１２Ｍ未満の標的分子からのＫ_ｄで非常に強く結合することができる。アプタマーは標的分子に、１０^－６、１０^－８、１０^－１０、または１０^－１２未満のＫ_ｄで結合することが好ましい。アプタマーは、バックグラウンド結合分子とのＫ_ｄよりも少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００、または１００，０００倍低い標的分子とのＫ_ｄを有することが好ましい。ポリペプチドなどの分子で比較を行う場合、バックグラウンド分子が異なるポリペプチドであることが好ましい。

２．リボザイム
Ｌ１ＲＮＡ発現は、リボザイムを使用して阻害することができる。リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。ヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼ型反応を触媒するいくつかの異なるタイプのリボザイムが存在し、これらは、ハンマーヘッドリボザイムなどの天然系で見出されるリボザイムに基づいている。天然系には認められないが、新規特異的反応を触媒するように改変されているいくつかのリボザイムも存在する。好ましいリボザイムは、ＲＮＡまたはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは典型的には、切断が後に続く標的基質の認識および結合を通じて、核酸基質を切断する。この認識は、しばしば、正準または非正準塩基対相互作用にほとんど基づいている。この特性は、標的基質の認識が標的基質配列に基づくため、リボザイムを核酸の標的特異的切断における特に優れた候補にする。

３．三重鎖形成オリゴヌクレオチド
Ｌ１ＲＮＡ発現は、三重鎖形成分子を使用して阻害することができる。三重鎖形成機能性核酸分子は、二本鎖核酸または一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用すると、ワトソン－クリックおよびフーグスティーン塩基対形成の両方に依存して複合体を形成する３本鎖のＤＮＡが存在する三重鎖と呼ばれる構造が形成される。三重鎖分子は、標的領域に高い親和性および特異性で結合することができるため、好ましい。三重鎖形成分子は、１０^－６、１０^－８、１０^－１０、または１０^－１２未満のＫ_ｄで標的分子に結合することが好ましい。

４．外部ガイド配列
Ｌ１ＲＮＡ発現は、外部ガイド配列を使用して阻害することができる。外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子に結合する分子であり、標的分子を切断するＲＮアーゼＰによって認識される。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計することができる。ＲＮアーゼＰは、細胞内で転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をプロセシングするのを補助する。細菌性ＲＮアーゼＰを動員して、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然ｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することによって、事実上任意のＲＮＡ配列を切断することができる。同様に、ＲＮＡの真核生物ＥＧＳ／ＲＮアーゼＰ指向切断を利用して、真核生物細胞内の所望の標的を切断することができる。種々の異なる標的分子の切断を促進するためにＥＧＳ分子を作製および使用する方法の代表的な例は、当該技術分野で既知である。

５．ＳｈＲＮＡ
Ｌ１ＲＮＡ発現は、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびｓｈＲＮＡを発現するように操作された発現構築物を使用して阻害することができる。ｓｈＲＮＡの転写は、ポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）プロモーターで開始され、４－５－チミン転写終結部位の２位で終結されると考えられる。発現時に、ｓｈＲＮＡは、３’ＵＵ－オーバーハングを有するステムループ構造に折り畳まれると考えられ、その後、これらのｓｈＲＮＡの末端が処理され、ｓｈＲＮＡを約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ様分子に変換する（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２９６：５５０－５５３（２００２）、Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００－５０５（２００２）、ＭｉｙａｇｉｓｈｉａｎｄＴａｉｒａ，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７－５００（２００２）、Ｐａｄｄｉｓｏｎｅｔａｌ．，ＧｅｎｅｓＤｅｖ．１６：９４８－９５８（２００２）、Ｐａｕｌｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５－５０８（２００２）；Ｓｕｉ（２００２）ｓｕｐｒａ、Ｙｕｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９９（９）：６０４７－６０５２（２００２）。

Ｂ．製剤
Ｌ１ＲＮＡを阻害するための製剤が本明細書に提供される。本明細書に記載のＮＡ、小分子、およびペプチドは、非経口投与、皮膚への非経口投与または局所投与のために製剤化することができる。開示される核酸、小分子、およびペプチドは、皮膚内のＬ１ＲＮＡを阻害するのに有効な量で、治療剤および核酸を皮膚に送達するための剤形および方法を使用して皮膚に投与することができる。特定の実施形態において、製剤は、１つ以上の細胞浸透剤、例えば、トランスフェクション剤を含む。ＮＡ剤を、トランスフェクション剤（またはその混合物）と混合または混ぜて、得られる混合物を用いて細胞をトランスフェクトする。好ましいトランスフェクション剤は、カチオン性脂質組成物、特に一価および多価カチオン性脂質組成物、より具体的には、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（登録商標）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＡ、およびＤＯＳＰＥＲ、ならびにデンドリマー組成物、特にＧ５～Ｇ１０デンドリマーであり、高密度スターデンドリマー、ＰＡＭＡＭデンドリマー、グラフトデンドリマー、ならびにデンドリグラフトおよびＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）として知られるデンドリマーが含まれる。

ｉ．非経口製剤
本明細書に記載の化合物（すなわち、Ｌ１ＲＮＡ、Ｌ１ＲＮＡをコードするベクター、Ｌ１ＲＮＡ阻害性ＮＡ（またはそれをコードするベクター）、およびＬ１ＲＮＡ阻害剤）は、非経口投与のために製剤化することができる。

例えば、非経口投与は、注射、注入などによって、患者への静脈内、皮内、腹腔内、病巣内、筋肉内、皮下による投与を含み得る。

非経口製剤は、当該技術分野で知られている技術を使用して水性組成物として調製することができる。典型的には、かかる組成物は、注射用製剤、例えば、溶液または懸濁液、注射前の再構成媒体の添加時に溶液または懸濁液を調製するために使用するのに好適な固体形態、油中水（ｗ／ｏ）エマルション、水中油（ｏ／ｗ）エマルション、およびそのマイクロエマルション、リポソーム、またはエマルソームなどのエマルションとして調製することができる。

担体は、溶媒または分散媒体であることができ、例えば、水、エタノール、１つ以上のポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、植物油（例えば、ピーナッツ油、コーン油、ゴマ油など）などの油、およびそれらの組み合わせが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒径の維持によって、かつ／または界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。

活性化合物の遊離酸もしくは塩基、または薬理学的に許容されるそれらの塩としての溶液および分散液は、水もしくは別の溶媒、または界面活性剤、分散剤、乳化剤、ｐＨ調整剤、粘度改質剤、およびそれらの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と好適に混合された分散媒体中で調製することができる。

好適な界面活性剤は、アニオン性、カチオン性、両性、または非イオン性表面活性剤であり得る。好適なアニオン性界面活性剤には、カルボキシレート、スルホネート、および硫酸塩イオンを含有するものが含まれるが、これらに限定されない。アニオン性界面活性剤の例には、長鎖アルキルスルホン酸塩およびアルキルアリールスルホン酸のナトリウム、カリウム、アンモニウムの塩、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム；ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのジアルキルスルホコハク酸ナトリウム；ビス－（２－エチルチオキシル）－スルホコハク酸ナトリウムなどのジアルキルスルホコハク酸ナトリウム；ならびにラウリル硫酸ナトリウムなどのアルキル硫酸塩が含まれる。カチオン性界面活性剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、臭化セトリモニウム、ステアリルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ポリオキシエチレン、およびココナッツアミンなどの四級アンモニウム化合物が含まれるが、これらに限定されない。非イオン性界面活性剤の例には、エチレングリコールモノステアレート、プロピレングリコールミリステート、グリセリルモノステアレート、グリセリルステアレート、ポリグリセリル－４－オレアート、ソルビタンアシレート、スクロースアシレート、ＰＥＧ－１５０ラウレート、ＰＥＧ－４００モノラウレート、ポリオキシエチレンモノラウレート、ポリソルベート、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ＰＥＧ－１０００セチルエーテル、ポリオキシエチレントリデシルエーテル、ポリプロピレングリコールブチルエーテル、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ（登録商標）４０１、ステアロイルモノイソプロパノールアミド、およびポリオキシエチレン水素化タロアミドが含まれる。両性界面活性剤の例には、Ｎ－ドデシル－ベータ－アラニンナトリウム、Ｎ－ラウリル－．ベータ．－イミノジプロピオン酸ナトリウム、ミリストアンホアセテート、ラウリルベタイン、およびラウリルスルホベタインが含まれる。

製剤は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有することができる。好適な保存剤には、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、およびチメロサールが含まれるが、これらに限定されない。製剤はまた、活性剤の分解を防止する抗酸化剤を含有し得る。

製剤は、典型的には、再構成で非経口投与のために、３～８のｐＨに緩衝化される。好適な緩衝剤には、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、およびクエン酸緩衝剤が含まれるが、これらに限定されない。

水溶性ポリマーは、非経口投与のための製剤にしばしば使用される。好適な水溶性ポリマーには、ポリビニルピロリドン、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、およびポリエチレングリコールが含まれるが、これらに限定されない。

滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上に列挙される賦形剤のうちの１つ以上を加えた適切な溶媒または分散媒に、必要とされる量の活性化合物を組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒体、および上に列挙されるものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥技術であり、予め滅菌濾過したその溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を得る。粉末は、粒子が本質的に多孔質であり、粒子の溶解を増加させることができるような様式で調製することができる。多孔性粒子を作製するための方法は、当該技術分野で周知である。

１．制御放出製剤
本明細書に記載される非経口製剤は、即時放出、遅延放出、持続放出、パルス放出、およびそれらの組み合わせを含む制御放出のために製剤化することができる。

ａ．ナノ粒子および微粒子
非経口投与のために、１つ以上の化合物、および任意選択的な１つ以上の追加の活性剤は、化合物および／または１つ以上の追加の活性剤の制御放出を提供する微粒子、ナノ粒子、またはそれらの組み合わせに組み込むことができる。製剤が２つ以上の薬剤を含有する実施形態において、薬剤は、同じタイプの制御放出（例えば、遅延、持続、即時、またはパルス）のために製剤化することができるか、または薬剤は、異なるタイプの放出（例えば、即時および遅延、即時および持続、遅延および持続、遅延およびパルスなど）のために独立して製剤化することができる。

例えば、化合物および／または１つ以上の追加の活性剤は、薬物の制御放出を提供するポリマー微粒子に組み込むことができる。薬剤の放出は、微粒子からの薬剤の拡散ならびに／または加水分解および／もしくは酵素分解によるポリマー粒子の分解によって制御される。好適なポリマーには、エチルセルロースおよび他の天然または合成のセルロース誘導体が含まれる。ＤＮＡおよびｍＲＮＡと同様に、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、ナノ担体を介して送達され得る。例えば、Ｂｅｎｏｉｔｅｔａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１２；１３１１：３８４１－３８４９は、効率的なｓｉＲＮＡ送達のために、ｓｉＲＮＡ複合体形成ブロック（ｐＤＭＡＥＭＡ）およびエンドソーム脱出ブロック（ＰＡＡ、ＢＭＡ、およびＤＭＡＥＭＡのターコポリマー）からなるジブロックコポリマー（ｐＤＭＡＥＭＡ－ｂ－ｐ（ＤＭＡＥＭＡ－コ－ＰＡＡ－コ－ＢＭＡ））を開発した。

水性環境中でゆっくり溶解しゲルを形成する、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリエチレンオキシドなどのポリマーは、薬物含有微粒子の材料としても好適であることができる。他のポリマーには、ポリ無水物、ポリ（エステル無水物）、ポリヒドロキシ酸、例えば、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ－３－ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）およびそれらのコポリマー、ポリ－４－ヒドロキシブチレート（Ｐ４ＨＢ）およびそれらのコポリマー、ポリカプロラクトンおよびそれらのコポリマー、ならびにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

代替的に、薬剤は、水溶液に不溶性であるか、または水溶液にゆっくりと溶解するが、酵素分解、胆汁酸の界面活性作用、および／または機械的侵食を含む手段によってＧＩ管内で分解することができる材料から調製された微粒子に組み込むことができる。本明細書で使用される場合、「水にゆっくりと溶解する」という用語は、水に３０分以内で溶解しない材料を指す。好ましい例には、脂肪、脂肪性材料、ワックス、ワックス様材料、およびこれらの混合物が含まれる。好適な脂肪および脂肪性材料には、脂肪アルコール（ラウリル、ミリスチルステアリル、セチル、またはセトステアリルアルコールなど）、脂肪酸エステル、脂肪酸グリセリド（モノグリセリド、ジグリセリドおよびトリグリセリド）、および水素化脂肪を含むがこれらに限定されない脂肪酸および誘導体が含まれる。具体的な例には、水素化植物油、水素化綿実油、水素化ヒマシ油、商品名Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標）で入手可能な水素化油、ステアリン酸、ココアバター、およびステアリルアルコールが含まれるが、これらに限定されない。好適なワックスおよびワックス様材料には、天然または合成のワックス、炭化水素、および通常のワックスが含まれる。ワックスの具体的な例には、蜜蝋、グリコワックス、カスターワックス、カルナウバワックス、パラフィン、およびカンデラワックスが含まれる。本明細書で使用される場合、ワックス様材料は、室温で通常固体であり、約３０～３００℃の融点を有する任意の材料として定義される。

いくつかの例では、微粒子への水の浸透速度を変更することが望ましいものであり得る。この目的のために、速度制御（浸潤）剤を、上に列挙される脂肪またはワックスとともに製剤化することができる。速度制御材料の例には、特定のデンプン誘導体（例えば、ワックス様マルトデキストリンおよびドラム乾燥コーンスターチ）、セルロース誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロース）、アルギン酸、ラクトース、およびタルクが含まれる。さらに、薬学的に許容される界面活性剤（例えば、レシチン）が、かかる微粒子の分解を促進するために添加され得る。

ゼインなどの水に不溶性であるタンパク質も、薬剤含有微粒子の形成のための材料として使用することができる。さらに、水溶性であるタンパク質、多糖類、およびそれらの組み合わせを、薬剤とともに微粒子中に製剤化し、続いて架橋結合させて不溶性ネットワークを形成することができる。例えば、シクロデキストリンは、個々の薬剤分子と複合体化され、続いて架橋結合され得る。

２．ナノ粒子および微粒子を作製する方法
薬剤含有微粒子を生成するための薬剤の担体材料への封入または組み込みは、既知の医薬製剤技術を通じて達成することができる。脂肪、ワックス、またはワックス様材料における製剤の場合、担体材料は典型的にはその融解温度を超えて加熱され、薬剤を添加して、担体材料中に懸濁された薬剤粒子、担体材料中に溶解された薬剤、またはそれらの混合物を含む混合物を形成する。その後、微粒子は、凝固、押出、スプレー冷却、または水性分散のプロセスを含むがこれらに限定されない、いくつかの方法を通じて製剤化することができる。好ましいプロセスでは、ワックスをその融解温度を超えて加熱し、薬剤を添加し、融解したワックス－薬剤混合物は、一定した撹拌下で混合物が冷却するにつれて凝固される。代替的に、融解したワックス－薬剤混合物を押し出しして、球状化してペレットまたはビーズを形成させることができる。これらのプロセスは、当該技術分野で既知である。いくつかの担体材料について、溶媒蒸発技術を使用して、薬剤含有微粒子を生成することが望ましい場合がある。この場合、薬剤および担体材料は、相互溶媒中に共溶解され、その後、いくつかの技法によって微粒子を生成することができ、限定されないが、水または他の適切な媒体中にエマルションを形成すること、噴霧乾燥すること、またはバルク溶液から溶媒を蒸発させ、得られた材料を粉砕することが含まれる。

いくつかの実施形態において、粒子形態の薬剤は、水に不溶性またはゆっくりと水に溶解する材料中に均一に分散される。組成物内の薬剤粒子のサイズを最小限に抑えるために、薬剤粉末自体を粉にして、製剤化の前に微細粒子を作製し得る。医薬分野で知られているジェットミルのプロセスをこの目的のために使用することができる。いくつかの実施形態において、粒子形態の薬物は、ワックスまたはワックス様材料をその融点を超えて加熱し、混合物を撹拌しながら薬物粒子を添加することによって、ワックスまたはワックス様材料中に均質に分散される。この場合、薬学的に許容される界面活性剤を混合物に添加して薬物粒子の分散を促進し得る。

粒子はまた、１つ以上の修飾放出コーティングでコーティングすることができる。リパーゼによって加水分解される脂肪酸の固体エステルは、微粒子または薬物粒子にスプレーコーティングすることができる。ゼインは、天然の水不溶性タンパク質の一例である。スプレーコーティングまたは湿式造粒技術によって、薬物含有微粒子または薬物粒子にコーティングすることができる。天然の水不溶性材料に加えて、消化酵素のいくつかの基質を架橋結合手順によって処理して、不溶性ネットワークの形成を得ることができる。化学的および物理的手段の両方によって開始されるタンパク質を架橋結合する多くの方法が報告されている。架橋結合を得る最も一般的な方法のうちの１つは、化学架橋結合剤の使用である。化学架橋剤の例には、アルデヒド（グルタルアルデヒドおよびホルムアルデヒド）、エポキシ化合物、カルボジイミド、およびゲニピンが含まれる。これらの架橋結合剤に加えて、酸化された天然の糖が、ゼラチンを架橋結合するために使用されている。架橋結合はまた、酵素的手段を使用して達成することができ、例えば、トランスグルタミナーゼは、海産食品を架橋結合するためのＧＲＡＳ物質として承認されている。最後に、架橋結合は、熱処理、紫外線照射、およびガンマ線照射などの物理的手段によって開始することができる。

薬物含有微粒子または薬物粒子を取り囲む架橋結合したタンパク質のコーティング層を生成するために、水溶性タンパク質を微粒子上にスプレーコーティングし、続いて上記の方法のうちの１つによって架橋結合させることができる。代替的に、薬物含有微粒子は、コアセルベーション相分離によって（例えば、塩の添加によって）タンパク質内にマイクロカプセル化し、続いて架橋結合することができる。この目的に好適ないくつかのタンパク質には、ゼラチン、アルブミン、カゼイン、およびグルテンが含まれる。

多糖類を架橋結合させて水不溶性ネットワークを形成することもできる。多くの多糖類では、これは、主ポリマー鎖を架橋結合するカルシウム塩または多価カチオンとの反応によって達成することができる。ペクチン、アルギン酸塩、デキストラン、アミロース、およびグアーガムが、多価カチオンの存在下で架橋結合に供される。逆荷電多糖類間の複合体も形成することができ、例えば、ペクチンおよびキトサンは、静電相互作用を介して複合体化することができる。

３．注射可能／埋め込み可能な製剤
本明細書に記載の化合物は、注射可能／移植可能な固体もしくは半固体インプラント、例えばポリマーインプラントに組み込むことができる。一実施形態において、化合物は、室温で液体またはペーストであるが、生理学的流体などの水性媒体と接触すると、半固体または固体材料を形成する粘度の増加を示すポリマーに組み込まれる。例示的なポリマーには、ヒドロキシアルカン酸と共重合した少なくとも１つの不飽和ヒドロキシ脂肪酸の共重合に由来するヒドロキシアルカン酸ポリエステルが含まれるが、これに限定されない。ポリマーは、融解し、活性物質と混合し、デバイスに成形または注入成形することができる。かかる融解組み立ては、送達される材料およびポリマーが分解するか、または反応性になる温度より低い融点を有するポリマーを必要とする。デバイスはまた、ポリマーを溶媒に溶解し、薬物をポリマー溶液に溶解または分散させ、次いで溶媒を蒸発させるソルベントカスティングによって調製することができる。溶媒プロセスは、ポリマーが有機溶媒に可溶性であることを必要とする。別の方法は、ポリマーと薬剤との混合粉末、または活性剤を充填したポリマー粒子の圧縮成形である。

代替的に、化合物は、ポリマーマトリックスに組み込まれ、室温では固体であるデバイスに成形、圧縮、または押し出しすることができる。例えば、化合物は、ポリ無水物、ポリヒドロアルカン酸（ＰＨＡ）、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＬＧＡ、ポリカプロラクトン、ポリエステル、ポリアミド、ポリオルトエステル、ポリホスファゼン、タンパク質および多糖類（コラーゲン、ヒアルロン酸、アルブミンおよびゼラチンなど）、ならびにそれらの組み合わせなどの生分解性ポリマーに組み込まれ、ディスクなどの固体デバイスに圧縮するか、またはロッドなどのデバイスに押し出しすることができる。核酸送達のためのポリアミドは、米国特許第８，２３６，２８０号に記載されている。

インプラントからの１つ以上の化合物の放出は、ポリマーの選択、ポリマーの分子量、および／またはポリマーの修飾によって変化させて、細孔の形成および／または加水分解可能な結合の組み込みなど、分解を増加させることができる。インプラントからの化合物の放出プロファイルを変化させるために生体分解性ポリマーの特性を変更する方法は、当該技術分野において周知である。

ｉｉ．経腸製剤
好適な経口剤形には、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、シロップ、およびロゼンジが含まれる。錠剤は、当該技術分野で周知の圧縮または成形技術を使用して作製することができる。ゼラチンまたは非ゼラチンカプセルは、硬質または軟質のカプセルシェルとして調製することができ、液体、固体、および半固体充填材料を、当該技術分野で周知の技術を使用してカプセル化することができる。

製剤は、薬学的に許容される担体を使用して調製され得る。本明細書で一般的に使用される場合、「担体」には、限定されないが、希釈剤、保存剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、膨張剤、充填剤、安定剤、およびそれらの組み合わせが含まれる。

担体はまた、コーティング組成物のすべての構成要素を含み、可塑剤、色素、着色剤、安定化剤、および流動促進剤を含み得る。

好適なコーティング材料の例には、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、およびヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートコハク酸塩などのセルロースポリマー；ポリ酢酸ビニルフタレート、アクリル酸ポリマーおよびコポリマー、ならびに商品名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）（ＲｏｔｈＰｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で市販されているメタクリル樹脂、ゼイン、シェラック、および多糖類が含まれるが、これらに限定されない。

さらに、コーティング材料は、可塑剤、色素、着色剤、流動促進剤、安定化剤、細孔形成剤、および界面活性剤などの従来の担体を含有し得る。

「希釈剤」は、「充填剤」とも称され、典型的には、固体剤形のかさを増加させるために必要であり、それによって実用的なサイズが、錠剤の圧縮またはビーズおよび顆粒の形成のために提供される。好適な希釈剤には、リン酸二カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、加水分解デンプン、アルファ化デンプン、二酸化ケイ素、酸化チタン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、および粉末糖が含まれるが、これらに限定されない。

「結合剤」は、固体投与製剤に凝集特性を付与するために使用され、したがって、錠剤またはビーズまたは顆粒が、剤形の形成後に完全体であることを確実にする。好適な結合剤材料には、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、糖類（スクロース、グルコース、デキストロース、ラクトース、およびソルビトールを含む）、ポリエチレングリコール、ワックス、アカシア、トラガカント、アルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、およびビーグルを含むセルロース、ならびにアクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレートコポリマー、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリアクリル酸／ポリメタクリル酸、およびポリビニルピロリドンなどの合成ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。

「滑沢剤」は、錠剤製造を容易にするために使用される。好適な滑沢剤の例には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセロール、ポリエチレングリコール、タルク、およびミネラル油が含まれるが、これらに限定されない。

「崩壊剤」は、投与後の剤形崩壊または「分散」を促進するために使用され、一般に、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルデンプンナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、アルファ化デンプン、粘土、セルロース、アルギニン、ガム、または交差結合ＰＶＰ（ＧＡＦＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐのＰｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）ＸＬ）などの架橋結合ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。

「安定剤」は、例えば、酸化反応を含む薬物分解反応を阻害または妨害するために使用される。好適な安定剤には、抗酸化剤、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸、その塩およびエステル、ビタミンＥ、トコフェロールおよびその塩、メタ重亜硫酸ナトリウムなどの亜硫酸塩、システインおよびその誘導体、クエン酸、没食酸プロピル、およびブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）が含まれるが、これらに限定されない。

１．制御放出経腸製剤
カプセル、錠剤、溶液、懸濁液などの経口剤形は、制御放出のために製剤化することができる。例えば、１つ以上の化合物および任意選択的な１つ以上の追加の活性剤を、ナノ粒子、微粒子、およびそれらの組み合わせに製剤化し、軟質もしくは硬質のゼラチンまたは非ゼラチンカプセルにカプセル化するか、あるいは分散媒体に分散させて経口懸濁液またはシロップを形成することができる。粒子は、薬剤および制御放出ポリマーまたはマトリックスから形成することができる。代替的に、薬剤粒子は、最終剤形に組み込む前に１つ以上の制御放出コーティングでコーティングすることができる。

別の実施形態において、１つ以上の化合物および任意選択的な１つ以上の追加の活性剤は、マトリックス材料に分散され、生理学的流体などの水性媒体との接触でゲル化または乳化する。ゲルの場合、マトリックスは活性剤を捕捉しながら膨潤し、活性剤は、マトリックス材料の拡散および／または分解によって経時的にゆっくりと放出される。かかるマトリックスは、錠剤として、または硬質および軟質カプセルのための充填材料として製剤化することができる。

さらに別の実施形態において、１つ以上の化合物、および任意選択的な１つ以上の追加の活性剤は、錠剤またはカプセルなどの販売される経口剤形に製剤化され、固体剤形は、遅延放出コーティングまたは持続放出コーティングなどの１つ以上の制御放出コーティングでコーティングされる。コーティングはまた、化合物および／または追加の活性剤を含有し得る。

ａ．持続放出剤形
持続放出製剤は、一般に、拡散系または浸透系として調製され、当該技術分野で既知である。拡散系は、典型的には、２タイプのデバイスである、リザーバおよびマトリックスからなり、当該技術分野で周知であり、説明されている。マトリックスデバイスは、一般に、ゆっくりと溶解するポリマー担体で薬剤を錠剤形態に圧縮することによって調製される。マトリックスデバイスの調製に使用される３つの主要なタイプの材料は、不溶性プラスチック、親水性ポリマー、および脂肪族化合物である。プラスチックマトリックスには、メチルアクリレート－メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、およびポリエチレンが含まれるが、これらに限定されない。親水性ポリマーには、メチルおよびエチルセルロースなどのセルロース性ポリマー、ヒドロキシプロピルセルロースなどのヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）９３４、ポリエチレンオキシド、ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。脂肪化合物には、カルナウバワックスおよびトリステアリン酸グリセリルなどの様々なワックス、ならびに水素化ヒマシ油または水素化植物油を含むワックス型材料、あるいはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。

特定の好ましい実施形態において、プラスチック材料は、薬学的に許容されるアクリルポリマーであり、アクリル酸およびメタクリル酸コポリマー、メチルメタクリレート、メチルメタクリレートコポリマー、エトキシエチルメタクリレート、シアノエチルメタクリレート、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、メタクリル酸アルキルアミンコポリマーポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（メタクリル酸）（無水物）、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ（メタクリル酸無水物）、およびグリシジルメタクリレートコポリマーが含まれるが、これらに限定されない。

ある特定の好ましい実施形態において、アクリルポリマーは、１つ以上のアンモニオメタクリレートコポリマーからなる。アンモニオメタクリレートコポリマーは、当該技術分野で周知であり、低含有量の四級アンモニウム基を有するアクリル酸エステルとメタクリル酸エステルとの完全重合化コポリマーとして、ＮＦＸＶＩＩに記載されている。

好ましい一実施形態において、アクリルポリマーは、商品名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）でＲｏｈｍＰｈａｒｍａから市販されているものなどのアクリル樹脂ラッカーである。さらなる好ましい実施形態において、アクリルポリマーは、それぞれ商品名ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ３０ＤおよびＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ３０ＤでＲｏｈｍＰｈａｒｍａから市販されている２つのアクリル樹脂ラッカーの混合物を含む。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ３０ＤおよびＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ３０Ｄは、低含有量の四級アンモニウム基を有するアクリルエステルとメタクリルエステルとのコポリマーであり、残りの中性（メタ）アクリルエステルに対するアンモニウム基のモル比は、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ３０Ｄでは１：２０、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ３０Ｄでは１：４０である。平均分子量は、約１５０，０００である。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｓ－１００およびＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ－１００も好ましい。コード指定ＲＬ（高透過性）およびＲＳ（低透過性）は、これらの薬剤の透過特性を指す。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ／ＲＳ混合物は、水および消化液に不溶性である。しかしながら、同じものを含むように形成された多粒子系は、水溶液および消化液中で膨張性および透過性である。

ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ／ＲＳなどの上述のポリマーを任意の所望の比率で一緒に混合して、望ましい溶解プロファイルを有する持続放出製剤が得られ得る。望ましい持続放出多粒子系は、例えば、１００％ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬ、５０％ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬおよび５０％ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳ、ならびに１０％ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＬおよび９０％ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＲＳから得ることができる。当業者は、他のアクリルポリマー、例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌなども使用され得ることを認識するであろう。

代替的に、持続放出製剤は、浸透系を使用して、または半透過性コーティングを剤形に適用することによって調製することができる。後者の場合、低透過性および高透過性コーティング材料を好適な比率で組み合わせることによって、所望の薬剤放出プロファイルを達成することができる。

上述の異なる薬剤放出メカニズムを有するデバイスは、単一または複数のユニットを含む最終剤形で組み合わせることができる。複数ユニット例には、錠剤、ビーズ、または顆粒を含有する多層錠剤およびカプセルが含まれるが、これらに限定されない。即時放出部分は、コーティングもしくは圧縮プロセスを使用して即時放出層を持続放出コアの上部に適用するか、または持続および即時放出ビーズを含有するカプセルなどの複数のユニット系で適用するいずれかの手段によって、持続放出系に加えることができる。

親水性ポリマーを含有する持続放出錠剤は、直接圧縮、湿式造粒、または乾式造粒などの当該技術分野で一般的に知られている技術によって調製される。それらの製剤は、通常、ポリマー、希釈剤、結合剤、および滑沢剤、ならびに活性医薬成分を組み込む。通常の希釈剤には、デンプン、粉末セルロース、特に結晶性セルロースおよび微結晶性セルロースなどの不活性粉末材料、フルクトース、マンニトール、およびスクロースなどの糖類、穀粉、ならびに同様の食用粉末が含まれる。典型的な希釈剤には、例えば、様々なタイプのデンプン、ラクトース、マンニトール、カオリン、リン酸カルシウムまたは硫酸カルシウム、塩化ナトリウムなどの無機塩および粉末糖が含まれる。粉末セルロース誘導体も有用である。典型的な錠剤結合剤には、デンプンなどの材料、ゼラチン、ならびにラクトース、フルクトース、およびグルコースなどの糖類が含まれる。アカシアを含む天然および合成ガム、アルギン酸塩、メチルセルロース、ならびにポリビニルピロリドンも使用することができる。ポリエチレングリコール、親水性ポリマー、エチルセルロース、およびワックスも結合剤として機能することができる。滑沢剤は、錠剤とパンチがダイに付着することを防止するために錠剤製剤に必要である。滑沢剤は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、および水素化植物油などの滑りやすい固形物から選択される。

ワックス材料を含有する持続放出錠剤は、一般に、直接ブレンド法、凝固法、および水性分散法などの当該技術分野で既知の方法を使用して調製される。凝固法では、薬剤をワックス材料と混合し、スプレー凝固または凝固のいずれかを行い、ふるいにかけて処理する。

ｂ．遅延放出剤形
遅延放出製剤は、固体剤形をポリマーフィルムでコーティングすることによって作製することができ、胃の酸性環境で不溶性であり、小腸の中性環境で可溶性である。

遅延放出投与単位は、例えば、薬剤または薬剤含有組成物を選択したコーティング材料でコーティングすることによって調製することができる。薬剤含有組成物は、例えば、カプセルに組み込むための錠剤、「コーティングされたコア」剤形における内側コアとして使用するための錠剤、または錠剤もしくはカプセルのいずれかに組み込むための複数の薬剤含有ビーズ、粒子、もしくは顆粒であり得る。好ましいコーティング材料には、生体侵食性、漸進的な加水分解性、漸進的な水溶性、および／または酵素的に分解可能なポリマーが含まれ、従来の「腸溶性」ポリマーであり得る。当業者によって理解されるであろう腸溶性ポリマーは、下部胃腸管のより高いｐＨ環境で可溶性になるか、または剤形が胃腸管を通過するにつれてゆっくりと侵食され、一方、酵素的な分解可能なポリマーは、下部胃腸管、特に結腸に存在する細菌性酵素によって分解される。遅延放出を果たすために好適なコーティング材料には、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、セルロースアセテートフタレート、セルロースアセテートトリメリテート、およびカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース系ポリマー；好ましくはアクリル酸、メタクリル酸、メチルアクリレート、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、および／またはエチルメタクリレートから形成されるアクリル酸ポリマーおよびコポリマー、ならびに商標名Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）（ＲｏｈｍＰｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の下で市販されているＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ３０Ｄ－５５およびＬ１００－５５（ｐＨ５．５以上で可溶性）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｌ－１００（ｐＨ６．０以上で可溶性）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）Ｓ（より高い程度のエステル化の結果として、ｐＨ７．０以上で可溶性）、ならびにＥＵＤＲＡＧＩＴＳ（登録商標）ＮＥ、ＲＬ、およびＲＳ（異なる透過性および膨張性の程度を有する水不溶性ポリマー）を含む他のメタクリル樹脂；ポリビニルピロリドン、酢酸ビニル、ビニルアセテートフタレート、ビニルアセテートクロトン酸コポリマー、およびエチレン－ビニルアセテートコポリマーなどのビニルポリマーおよびコポリマー；アゾポリマー、ペクチン、キトサン、アミロース、およびグアーガムなどの酵素分解性ポリマー；ゼインおよびシェラックが含まれるが、これらに限定されない。異なるコーティング材料の組み合わせも使用し得る。異なるポリマーを使用する多層コーティングも適用され得る。

特定のコーティング材料における好ましいコーティング重量は、異なる量の様々なコーティング材料で調製された錠剤、ビーズ、および顆粒の個々の放出プロファイルを評価することによって、当業者によって容易に決定され得る。それは、所望の放出特性を生じる材料、方法、および適用形態の組み合わせであり、臨床試験からのみ決定することができる。

コーティング組成物は、可塑剤、色素、着色剤、安定化剤、流動促進剤などの従来の添加剤を含み得る。可塑剤は、コーティングの脆弱性を低下させるために通常存在し、一般に、ポリマーの乾燥重量に対して約１０重量％～５０重量％を示す。典型的な可塑剤の例には、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トリアセチン、フタル酸ジメチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、クエン酸トリエチル、クエン酸トリブチル、アセチルクエン酸トリエチル、ヒマシ油、およびアセチル化モノグリセリドが含まれる。安定化剤は、好ましくは分散体中の粒子を安定化するために使用される。典型的な安定化剤は、ソルビタンエステル、ポリソルベート、およびポリビニルピロリドンなどの非イオン性乳化剤である。流動促進剤は、フィルム形成および乾燥中に付着効果を低下させるために推奨され、一般に、コーティング溶液中のポリマー重量の約２５重量％～１０重量％を示す。１つの効果的な流動促進剤は、タルクである。ステアリン酸マグネシウムおよびモノステアリン酸グリセロールなどの他の流動促進剤も使用され得る。二酸化チタンなどの色素も使用され得る。シリコーン（例えば、シメチコン）などの少量の発泡防止剤もコーティング組成物に添加され得る。

ｉｉｉ．局所製剤
局所投与に好適な剤形には、クリーム、軟膏、軟薬、スプレー、ゲル、ローション、エマルション、および経皮パッチが含まれる。製剤は、経粘膜、経上皮、経内皮、または経皮の投与のために製剤化され得る。製剤は、局所製剤で使用される既知の賦形剤を含むことができ、日焼け止め剤、界面活性剤、保存剤、剥離剤、制汗剤、着色剤、増粘剤、スキンライトナー、ビタミン、および化粧品として許容される担体中の他の治療活性剤が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、１つ以上の化学的浸透促進剤、膜透過剤、膜輸送剤、軟化剤、界面活性剤、安定剤、緩衝剤、およびこれらの組み合わせをさらに含有し得る。

「浸透促進剤」は、当該技術分野において既知であり、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、脂肪酸、脂肪アルコールエーテル、アミノ酸、リン脂質、レシチン、コール酸塩、酵素、アミンおよびアミド、複合体形成剤（リポソーム、シクロデキストリン、修飾セルロース、およびジイミド）、大環状ラクトン、ケトンおよび無水物、および環状尿素などの大環状化合物、界面活性剤、Ｎ－メチルピロリドンおよびその誘導体、ＤＭＳＯおよび関連化合物、イオン性化合物、アゾンおよび関連化合物、ならびにアルコール、ケトン、アミド、ポリオール（例えば、グリコール）などの溶媒が含まれるが、これらに限定されない。これらのクラスの例は、当該技術分野で既知である。

「保存剤」は、真菌および微生物の増殖を防止するために使用することができる。好適な抗真菌剤および抗微生物剤には、安息香酸、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、フェノール、フェニルエチルアルコール、およびチメロサールが含まれるが、これらに限定されない。

「界面活性剤」は、表面張力を低下させ、それによって生成物の乳化、発泡、分散、拡散、および湿潤特性を増加させる表面活性剤である。好適な非イオン性界面活性剤には、乳化ワックス、グリセリルモノオレエート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンカスターオイル誘導体、ポリソルベート、ソルビタンエステル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、シクロデキストリン、グリセリンモノステアレート、ポロキサマー、ポビドン、およびこれらの組み合わせが含まれる。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、ステアリルアルコールである。

局所適用、例えば、ネイキッドＤＮＡ、ＤＮＡ／リポソームまたはエマルション複合体、リポソームクリームの局所適用、ならびに剥離、エレクトロポレーション、およびマイクロメカニカル破壊法などの物理的方法を使用する局所核酸送達

核酸（ＮＡ）を皮膚に送達する方法は、当該技術分野で既知である。物理的方法には、ポリマーナノ粒子、リポソーム、ペプチド、またはデンドリマーを使用するマイクロニードル注射、マイクロポレーション、エレクトロポレーション、イオンフォレーシス、ソノフォレーシス、または受動送達が含まれる。（Ｚａｋｒｅｗｓｋｙ，ｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ，２１９：４４５－４５６（２０１５）でレビューされている）。

皮内注射は、ＮＡを皮膚に送達するための最も単純で最も直接的な方法である。ここで、ＳＣのバリア特性は、ＮＡを皮膚の実行可能な組織層に直接注射することによって完全に克服される。有用な皮内針には、マイクロニードルアレイが含まれる。マイクロニードルアレイは、長さがわずか１００～７００μｍの針を含む。皮膚に配置されると、その鋭い先端は角質層への容易な挿入を可能にするが、一方、長さが短く、より深い皮膚組織における神経を破壊することなく、皮膚への十分な浸透を確実にする。マイクロニードルは、本明細書に開示される核酸、例えば、Ｌ１ＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡ、カチオン性脂質－ＤＮＡ複合体（直径約１００ｎｍ）、ｓｉＲＮＡなどの送達に使用することができる。

マイクロポレーションは、大型治療薬または治療担体の送達のためにＳＣ（角質層）の物理的破壊を用いる別の技術である。抵抗素子のアレイは、皮膚上に配置することができる。アレイを通してパルス化された電流は、アレイと接触する角質細胞の局所的なアブレーションをもたらす。代替的に、エルビウム：イットリウム－アルミニウム－ガーネット（Ｅｒ：ＹＡＧ）レーザーアレイを、ＳＣおよび表皮の局所的なアブレーションのために使用することができる。この技術は、プラミドＤＮＡ、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡなどを皮膚に成功裏に送達するために使用されている。

エレクトロポレーションは、皮膚を透過させ、薬剤の受動的拡散を増強するために使用することができる。エレクトロポレーションのメカニズムは、電気的に誘導されるマイクロポレーションとはまったく異なる。電気的に誘導されるマイクロポレーションは、電場を利用して、皮膚に孔を作り出すＳＣマイクロ構造の熱アブレーションを誘導する。他方、エレクトロポレーションは、皮膚への短い持続時間（＜０．５秒）および高い強度（＜１００Ｖ）の電気パルスの適用であり、皮膚内の脂質二重層の一過性の透過処理をもたらし、同時に表皮角質細胞の細胞膜を透過性にする。エレクトロポレーションはまた、皮膚を通して水性孔を作ることが予想される。マイクロニードルローラーおよびフレキシブルな相互組み合わせエレクトロポレーションアレイの併用による皮膚への核酸分子の効率的な送達は、Ｈｕａｎｇ，ｅｔａｌ．，Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ２０１８；８（９）：２３６１－２３７６に公開されている。

イオンフォレーシスは、ＮＡのような荷電した薬物の輸送を促進するために使用することができる。一定の電流で連続した低強度（＜１０Ｖ）電界を加える。

リポソームはまた、皮膚疾患の治療のために核酸送達で広範囲に試験されている。

核酸の高次球状複合体（球状核酸）は、それらの皮膚への増強された送達、皮膚細胞への内在化、および分解からのＮＡの保護により、皮膚疾患を治療する可能性を示している。具体的には、高次かつ共有結合したｓｉＲＮＡの高密度層でコーティングされた金ナノ粒子は、インタクトなマウスＳＣを介した受動輸送をもたらし、真皮および表皮に限定的に局在した。

製剤は、既知の皮膚浸透促進剤を含むことができる。いくつかのペプチドが、皮膚へのＮＡの輸送を増強し、治療応答を誘発する能力を有することが特定されている。ファージディスプレイスクリーニングを使用して発見されたこれらのペプチドの最初のものは、ＴＤ－１（ＡＣＳＳＳＰＳＫＨＣＧ）（配列番号５５）であった。ＨｓｕおよびＭｉｔｒａｇｏｔｒｉは、ファージディスプレイスクリーニンを使用して、皮膚全体にわたるｓｉＲＮＡの送達を増強するだけでなく、細胞内取り込みも増強する能力を有する別のペプチドであるＳＰＡＣＥペプチド（ＡＣＴＧＳＴＱＨＱＣＧ）（配列番号５６）を特定した（ＨｓｕＴ，ＭｉｔｒａｇｏｔｒｉＳＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１１１０８（３８）：１５８１６－２１）。

本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに理解されるであろう。

Ｉ．骨粗しょう症患者由来の間葉系幹細胞へのＬＩＮＥ－１レトロトランスポゾンＲＮＡ送達は、骨形成分化および骨マトリックス生成を刺激する
材料および方法
参加者
変動性の高いＢＭＤを有するノルウェー人女性１０３名（５０～８６歳）から、３０名を年齢、体重、および主要な血清パラメータに従って選択し、以下の２群に分けた。骨粗しょう症（Ｔスコア≦－２．５）および健常者（Ｔスコア＞－１）。患者登録、腸骨生検、血液サンプリングの手順は、既に報告した。（４７）（４８）参加者は、新聞の広告を通じて募集され、かつ／またはＬｏｖｉｓｅｎｂｅｒｇＤｉａｃｏｎａｌ病院外来を介して含まれた。試験は、ノルウェー地域倫理委員会（ＲＥＫ番号：２０１０／２５３９）によって承認され、ヘルシンキ宣言に従って実施された。

ヒトＭＳＣ分化
骨髄由来のＭＳＣ（＃Ｃ－１２９７４，ＰｒｏｍｏＣｅｌｌＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、４継代まで０．１％ゼラチン溶液（＃０７９０３，ＳｔｅｍＣｅｌｌ）コーティングプレートで増殖させた。増殖培地（＃ＰＴ－３００１、Ｌｏｎｚａ）は３日ごとに交換した。骨形成分化は、１：５０Ｍａｔｒｉｇｅｌ（＃３５６２３７、Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティングプレートに播種した７０％密集細胞で、成長培地を骨形成分化培地（＃ＰＴ－３００２、Ｌｏｎｚａ）で置き換えることによって誘導した。脂肪生成分化は、１：５０ＭａｔＭａｔｒｉｇｅｌ（＃３５６２３７、Ｃｏｒｎｉｎｇ）コーティングプレートに播種した密集後細胞で、脂肪生成分化培地（＃ＰＴ－３００４、Ｌｏｎｚａ）による誘導／維持の３サイクルによって誘導した。

ゲノムＤＮＡ抽出およびＴａｑＭａｎｑＰＣＲベースのＬ１ＣＮＶアッセイ
高分子量ゲノムＤＮＡ（ＨＭＷ－ｇＤＮＡ）を、ＭａｇＡｔｔｒａｃｔＨＭＷＤＮＡキット（＃６７５６３、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者の説明書に従って単離した。溶解中、サンプルをＲＮアーゼＨおよびプロテイナーゼＫ（いずれもキットで提供される）を用いて３７℃で少なくとも１時間処理し、それぞれＲＮＡ／ＤＮＡ基質およびタンパク質汚染を除去した。単離したＨＭＷ－ｇＤＮＡを、エキソヌクレアーゼＩ（＃Ｍ０５６８、ＮＥＢ）を用いて３７℃で３０分間最終的に処理し、次いで８０℃で１５分間不活性化して、遊離ｓｓＤＮＡを除去した。次いで、ＨＭＷ－ｇＤＮＡを、７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＬ１コピー数について分析した。Ｌ１におけるすべてのコピー数アッセイは、ＤＮＡ入力濃度の反復内因性対照としてヒトセントロメアアルファサテライト（ＳＡＴＡ）で基準化した。各サンプルを、三重測定で分析した。各反応について、ｇＤＮＡ（２５ｐｇ）、標的特異的プライマー（０．２μＭ）、標的特異的ＦＡＭ標識プローブ（０．４μＭ）、ＲＯＸ受動参照色素（０．４μｌ、＃１７２５８５８、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、およびＩＱＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰｏｗｅｒｍｉｘ（１０μｌ、＃１７２５８４９、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）の２０μｌ混合物を９５℃で３分間インキュベートし、続いて９５℃で４５秒間の変性、５９℃で４５秒間のプライマーアニーリング／伸長の４０サイクルでインキュベートした。ＣＮＶ試験に使用される活性なレトロ転位能のあるＬ１に対するＴａｑＭａｎプローブおよびプライマー配列が公開されており（Ｃｏｕｆａｌ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００９），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８２４８、Ｇｏｏｄｉｅｒ，ｅｔａｌ．ＤＮＡ（２０１４），ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５９－８７５３－５－１１）、以下に示し、この試験で使用したプライマーおよびプローブである。

Ｌ１５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１
フォワードプライマー：５’－ＧＡＡＴＧＡＴＴＴＴＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧＡＡ－３’（配列番号２）；
リバースプライマー：５’－ＧＴＣＣＴＣＣＣＧＴＡＧＣＴＣＡＧＡＧＴＡＡＴＴ－３’（配列番号３）；
プローブ配列：５’－ＡＡＧＧＣＴＴＣＡＧＡＣＧＡＴＣ－３’^{（３０，３７）}（配列番号４）；
Ｌ１ＯＲＦ２
フォワードプライマー：５’－ＴＧＣＧＧＡＧＡＡＡＴＡＧＧＡＡＣＡＣＴＴＴＴ－３’（配列番号５）；
リバースプライマー：５’－ＴＧＡＧＧＡＡＴＣＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴ－３’（配列番号６）；
プローブ配列：５’－ＣＴＧＴＡＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＡＣＣＡＴＴ－３’^{（３０，３７）}（配列番号７）。

ＳＡＴＡ
フォワードプライマー：５’－ＧＧＴＣＡＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴ－３’（配列番号８）；
リバースプライマー：５’－ＣＧＣＡＧＴＴＴＧＴＧＧＧＡＡＴＧＡＴＴＣ－３’（配列番号９）；
プローブ配列：５’－ＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＡＡＡＡＣＴＡＧ－３’^{（３０，３７）}（配列番号１０）；
ＲＰＬ１３Ａ
フォワードプライマー：５’－ＧＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＴＣＣＡＣＴＡＣＣ－３’（配列番号１１）；
リバースプライマー：５’－ＴＧＧＧＴＣＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＣＴＧＴ－３’（配列番号１２）；
ＲＵＮＸ２
フォワードプライマー：５’－ＴＣＡＡＣＧＡＴＣＴＧＡＧＡＴＴＴＧＴＧＧＧ－３’（配列番号１３）；
リバースプライマー：５’－ＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＴＧＴＧＡＡＧＡＣＧＧ－３’（配列番号１４）；
ＯＣＮ
フォワードプライマー：５’－ＧＧＣＧＣＴＡＣＣＴＧＴＡＴＣＡＡＴＧＧ－３’（配列番号１５）；
リバースプライマー：５’－ＧＴＧＧＴＣＡＧＣＣＡＡＣＴＣＧＴＣＡ－３’（配列番号１６）；
ＯＰＮ
フォワードプライマー：５’－ＧＡＡＧＴＴＴＣＧＣＡＧＡＣＣＴＧＡＣＡＴ－３’（配列番号１７）；
リバースプライマー：５’－ＧＴＡＴＧＣＡＣＣＡＴＴＣＡＡＣＴＣＣＴＣＧ－３’（配列番号１８）；
ＢＳＰ
フォワードプライマー：ＣＡＣＴＧＧＡＧＣＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡ（配列番号１９）；
リバースプライマー：５’－ＴＧＧＴＧＧＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＴＣＡＡＡ－３’（配列番号２０）；
ＯＳＸ
フォワードプライマー：５’－ＣＣＴＣＴＧＣＧＧＧＡＣＴＣＡＡＣＡＡＣ－３’（配列番号２１）；
リバースプライマー：５’－ＡＧＣＣＣＡＴＴＡＧＴＧＣＴＴＧＴＡＡＡＧＧ－３’（配列番号２２）；
ＴＢＰ
フォワードプライマー：５’－ＧＣＴＧＧＣＣＣＡＴＡＧＴＧＡＴＣＴＴＴ－３’（配列番号２３）；
リバースプライマー：５’－ＣＴＴＣＡＣＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴ－３’（配列番号２４）；
ＰＰＡＲγ
フォワードプライマー：５’－ＡＣＣＡＡＡＧＴＧＣＡＡＴＣＡＡＡＧＴＧＧＡ－３’（配列番号２５）；
リバースプライマー：５’－ＡＴＧＡＧＧＧＡＧＴＴＧＧＡＡＧＧＣＴＣＴ－３’（配列番号２６）；
ＦＡＢＰ４
フォワードプライマー：５’－ＡＣＴＧＧＧＣＣＡＧＧＡＡＴＴＴＧＡＣＧ－３’（配列番号２７）；
リバースプライマー：５’－ＣＴＣＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＣＧＣＣＴＴ－３’（配列番号２８）；
ＦＡＳＮ
フォワードプライマー：５’－ＡＡＧＧＡＣＣＴＧＴＣＴＡＧＧＴＴＴＧＡＴＧＣ－３’（配列番号２９）；
リバースプライマー：５’－ＴＧＧＣＴＴＣＡＴＡＧＧＴＧＡＣＴＴＣＣＡ－３’（配列番号３０）；
ＬＰＬ
フォワードプライマー：５’－ＡＧＧＡＴＧＴＧＧＣＣＣＧＧＴＴＴＡＴＣ－３’（配列番号３１）；
リバースプライマー：５’－ＣＣＡＡＧＧＣＴＧＴＡＴＣＣＣＡＡＧＡＧＡＴ－３’（配列番号３２）；
ＧＦＰ－９６８／１０１３
フォワードプライマー：５’－ＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣ－３’（配列番号３３）；
リバースプライマー：５’－ＴＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＧＧＣＧＧＡＣＴＧ－３’（配列番号３４）；

Ｌ１ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブ特異性分析を行った。Ｌ１－５’－ＯＲＦ１プライマーおよびプローブセットは、３０９個の配列（２４６個のＬ１ＨＳ－Ｔａ１、１個のＬ１ＨＳ－Ｔａ０、１個のＬ１ＨＳ－ｐｒｅＴａ、６１個のＬ１ＰＡ２）と一致し、Ｌ１－ＯＲＦ２プライマーおよびプローブセットは、１８１個の配列（１６１個のＬ１ＨＳ－Ｔａ１、３個のＬ１－ＨＳ－Ｔａ０、４個のＬ１ＨＳ－ｐｒｅＴａ、６個のＬ１ＰＡ２、１個のＬ１ＰＡ３、５個のＬ１ＰＡ４）と一致する。

ラミブジン３ＴＣ処理
ラミブジン３ＴＣ（＃Ｌ１２９５、Ｓｉｇｍａ）をＤＭＳＯ中に再懸濁させ、細胞培地に最終濃度１５０μＭで２４時間ごとに添加した。

ミネラル化アッセイ
細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定した。ミネラル化は、ＯｓｔｅｏＩｍａｇｅミネラル化アッセイ（＃ＬＯＰＡ５０３、Ｌｏｎｚａ）を製造業者の指示に従って使用することによって評価した。ミネラル化は、ＧｌｏＭａｘディスカバープレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて適切な励起（４９２）／放出（５２０）波長で定量的にアッセイした。

脂質含有量アッセイ
細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、ＡｄｉｐｏＲｅｄアッセイ試薬（＃ＬＯＰＴ７００９、Ｌｏｎｚａ）とともに１０分間インキュベートした。脂質含有量は、ＧｌｏＭａｘディスカバープレートリーダー（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて適切な励起（４８５）／放出（５７２）波長で定量的にアッセイした。

ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ調製
細胞を収集し、１ｍｌのＱＩＡｚｏｌ溶解試薬（＃７９３０６、Ｑｉａｇｅｎ）中に再懸濁させた。次いで全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙＰｌｕｓＭｉｎｉキット（＃７４１３４、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の説明書に最小限の修正を加えて精製した。ＤＮアーゼ処理（ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼセット、＃７９２５４、Ｑｉａｇｅｎ）を行って、いずれの残留ＤＮＡも除去した。ＲＮＡの品質および濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して確認した。ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ第１の鎖ｃＤＮＡ合成システム（＃１８０８００５１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、各ＲＮＡサンプルの２００ｎｇから合成した。

Ｌ１ＲＮＡトランスフェクション
全長Ｌ１配列を担持するベクターヒト－Ｌ１＿ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩｓｋ（＋）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＵＳＡによってカスタム調製した。大スケールヒトＬ１ｍＲＮＡをインビトロで転写し、改変し、ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡによって精製した（ＡＲＣＡキャッピングおよび２’オメチマルト化（ＣａｐＩ）、５－メチル－Ｃで完全に置換、シアニン－５－Ｕの２５％置換、および偽Ｕの７５％置換、酵素的にポリアデニル化、ＤＮアーゼおよびホスファターゼ処理、シリカ膜精製）。Ｌ１ＲＮＡは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、カタログＮｏ．ＬＭＲＮＡ００３）を、推奨されるよりも少ないＲＮＡ量（１０倍少ない）の修正プロトコルで使用して、分化性骨芽細胞の７日目にトランスフェクトした。ＲＦＰｍＲＮＡ（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ、カタログＮｏ．ＭＲ８００Ａ－１）を陰性対照として使用した。トランスフェクションの３日後、骨マトリックスをＯｓｔｅｏＩｍａｇｅミネラル化アッセイ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログＮｏ．ＬＯＰＡ５０３）によって定量化した。

アリザリンレッド染色
骨芽細胞を１×ＰＢＳ（Ｋａｎｔｏｎｓａｐｏｔｈｅｋｅ、Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログＮｏ．Ａ１７１０１２）で洗浄し、１×ＰＢＳの４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ、カタログＮｏ．Ｆ８７７５）で３０分間固定した。ｄｄＨ２Ｏで２回洗浄後、アリザリンレッド染色溶液（５０ｍＬのｄｄＨ２Ｏ、ｐＨ＝４．２に希釈した０・７ｇのアリザリンレッドＳ（Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ、カタログＮｏ．Ａ５５３３））を２０分間添加した。その後、細胞をｄｄＨ２Ｏで４回洗浄し、乾燥させ、画像取得まで暗所に保存した。吸光度測定のために、アリザリンレッドＳを、０．０１ＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４水溶液、ｐＨ＝７中の３００μｌの１０％（ｗ／ｖ）セチルピリジニウムクロリドで、染色した骨芽細胞から１時間溶離した。１５０マイクロリットルを９６ウェルプレートに移し、吸光度を５６０ｎｍで測定した。０．０１ＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４水溶液中の１０％（ｗ／ｖ）セチルピリジニウムクロリドをブランクとして使用した。画像を取得し、処理し、既に報告されている（Ｅｇｇｅｒｓｃｈｗｉｌｅｒｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓ．Ｔｈｅｒ．（２０１９）．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３２８７－０１９－１１７０－８）ように分析した。

分化性骨芽細胞および脂肪細胞における遺伝子発現解析
リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を、７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。各サンプルを三重測定で分析し、ｃＤＮＡ入力濃度について内因性対照、骨形成についてリボソームタンパク質Ｌ１３Ａ（ＲＰＬ１３Ａ）、および脂質形成についてＴａｔａ結合タンパク質（ＴＢＰ）で基準化した。鋳型なしおよびＲＴなしを陰性対照として含めた。各１５μｌ反応について、１０ｎｇ（Ｌ１では１ｎｇ）のｃＤＮＡを、１μＭの特異的プライマーｍｉｘおよび７．５μｌのＳｙｂｒＳｅｌｅｃｔＭａｓｔｅｒｍｉｘ（＃４４７２９０８、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合した。反応物を９５℃で１０分間インキュベートし、続いて９５℃で１５秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長の４０サイクルでインキュベーションした。Ｃｔ値を、７９００ＨＴ高速リアルタイムＰＣＲＲＱマネージャソフトウェア（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって計算し、次いで、関心対象の遺伝子と内因性キャリブレータとの間のＤＣｔとして基準化した。遺伝子発現分析のためにこの試験で使用したプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ－ｂｌａｓｔ／）を使用して設計した。すべてのプライマー対において、各プライマーは、異なるエクソンと一致する。アンプリコン長は、８０～１３０ヌクレオチドであった。プライマー配列は、表１に報告する。

インビトロでのレトロ転位アッセイ
１５０×１０^３個のＭＳＣを、３μｇのＬＲＥ３－ＥＧＦＰプラスミド（ＦｒｅｄＧａｇｅ教授によって厚意により提供された）とともにインキュベートし、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によってエレクトロポレーションした。細胞を４０ｍｓで９９０Ｖの１つのパルスに供し、４８時間回復させ、次いで成熟骨芽細胞に分化するように２週間誘導した。細胞を収集し、ＤＮＡを単離した。５０ｎｇのＤＮＡを鋳型として使用して、イントロン隣接オリゴでＥＧＦＰ配列を増幅し、プラスミドによって担持されるＲＣ－Ｌ１配列を含有するイントロン（１２４３ｂｐ、レトロ転位されていない）と、スプライシングされた新たに挿入されたもの（３４３ｂｐ、レトロ転位された）とを区別した。ＰＣＲ反応を、０．５μＭの各プライマーおよび１０μｌのＨｏｔｓｔａｒｔｐｒｅｍｉｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（＃Ｒ０２８Ａ、Ｔａｋａｒａ）を用いて最終体積２０μｌで行い、変性のために９４℃で３０秒間、プライマーアニーリングのために５８℃で３０秒間、およびプライマー伸長のために７２℃で１分間インキュベートした。サイクルを３０回繰り返した。ＧＦＰプライマー配列は公開されており（３８）、表１に報告する。

細胞周期分析
２×１０５個のＭＳＣを３７℃で５分間トリプシン処理し、ＰＢＳおよび２％ＢＳＡで洗浄し、７０μＭストレーナー（＃３５２３５０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に通し、次いで７０％エタノール中で－２０℃で３０分間固定した。ＰＢＳおよび４％ＢＳＡで洗浄後、細胞をＰＢＳ中に再懸濁させ、ＲＮアーゼとともに３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー染色緩衝液（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ、＃ＦＣ００１）の１００μｌに再懸濁させた。１ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色溶液（＃Ｐ３５６６）の１０μｌを、単一細胞溶液に加え、穏やかに混合し、暗所で５分間インキュベートした。細胞周期分析を、ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメトリーシステムでＢＤＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用して行った。

アンチセンスオリゴヌクレオチド送達
Ｌ１ノックダウン実験のために、ＦＡＮＡ（２－デオキシ－２－フルオロアラビノ核酸）修飾した、５つの異なるＬＩＮＥ－１ＯＲＦ１ＲＮＡ領域に特異的なＡＳＯ、および陰性対照として使用される１つのスクランブル（ＳＣＲ）を、ジムノシス（ｇｙｍｎｏｓｉｓ）（ＡＵＭｂｉｏｔｅｃｈ）によって製造業者の説明書に従って送達した。凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを、５００μＭの濃度のヌクレアーゼフリー水に再懸濁させ、次いで３日ごとに細胞培地で５μＭに希釈した。

統計分析
２つの平均値間の有意性を決定するために、比較は、信頼水準０．０５が統計学的有意性で受け入れられた場合、適切なスチューデントｔ検定によって行った。＊＝Ｐ値＜０．０５、＊＊＝Ｐ値＜０．００５、＊＊＊＝Ｐ値＜０．０００５、＊＊＊＊＝Ｐ値＜０．００００５。相関分析では、ｐ値および決定係数（Ｒ二乗、Ｒ２）をＧｒａｐｈＰａｄ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／ｑｕｉｃｋｃａｌｃｓ／）を使用して算出した。生物学的な反復数（Ｎ）は、プロットまたは図の凡例に示される。

結果
Ｌ１ＤＮＡコピー数は、健常骨のゲノムにおいて拡張される。
活性なレトロ転位能のあるＬ１のコピー数における変動を、健常（ＣＴＲ、ｎ＝１４、ＢＭＤｔスコア≧－１）または骨粗しょう症（ＯＰ、ｎ＝１６、ＢＭＤｔスコア＜－２．５）として分類された年齢の一致した閉経後女性からの３０例の腸骨生検ゲノムＤＮＡで分析した（データは示さず）。要約すると、すべてのドナーは標準的なノルウェーの食事をし、身体的な関与を含む同様の栄養補助食品および生活スタイル因子を有していた。彼女らは、正常な内分泌的、臨床的、生化学的、および栄養学的な状態であり、少なくとも２年間エストロゲンの投薬なく閉経後である。彼女らは、骨代謝回転に影響を及ぼすことが知られている薬物治療を受けておらず、他の骨格の原発性または続発性疾患は有さなかった。吸収マーカー（血清ＴＲＡＰ５Ｂ、１ＣＴＰ、尿ＮＴＸ、または尿ＤＰＤ）は、患者と健常者との間で差はなく、それらはすべて国際標準に従って正常な臨床検査範囲内であった。骨形成マーカーのうち、血清オステオカルシンは正常範囲であり、群間で差はなかったが、一方、骨特異的アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は正常な変動範囲であるものの、骨粗しょう症で著しく高かった（ｐ＜０．０１９）。

Ｌ１ゲノムコピー数における変動を推定するため、ＴａｑＭａｎｑＰＣＲを高分子量ゲノムＤＮＡの単離に結合させ、本方法において報告されているように、それぞれ、エキソヌクレアーゼＩおよびＲＮアーゼＨ処理によるｓｓＤＮＡ（例えば、逆転写されたが、組み込まれていないＬ１ｃＤＮＡ）およびＲＮＡ／ＤＮＡ基質の除去を使用した。この手順は、ゲノムに組み込まれていないＬ１配列の検出を除外し、したがって、以前に予想され（Ｇｏｏｄｉｅｒ，ｅｔａｌ．ＤＮＡ（２０１４），ｄｏｉ：１０．１１８６／１７５９－８７５３－５－１１、Ｇｏｏｄｉｅｒ，ｅｔａｌ．ＤＮＡ（２０１６），ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３１００－０１６－００７０－ｚ）、最近報告されている（３４）ように、それらのゲノムコピー数の過大評価を回避する最先端のものである。ＴａｑＭａｎｑＰＣＲを使用して、Ｌ１ＤＮＡ配列の２つの異なる領域（５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）を、コピー数多型（ＣＮＶ）アッセイで増幅させた。

２群間のＬ１コピー数の変動は、両方の配列について非常に著しく、患者における強い低下を示した（図１Ａ）。潜在的に活性なレトロ転位能のあるＬ１に特異的な検証されたＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブ（ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブ特異性分析の方法を参照）の２セットを使用した（Ｃｏｕｆａｌ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００９），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８２４８、Ｍｕｏｔｒｉ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１０），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０９５４４）。一貫して、健常者と患者との間のＬ１コピー数に観察された相対的変動は、潜在的に活性なＬ１ＨＳ－Ｔａ１ファミリーの小部分に限定された差を表す。データは、骨ゲノム中のＬ１５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１コピー数が、測定された頭部（Ｒ２＝０．２７５、ｐ＝０．００６）（図１Ｂ）、股関節（Ｒ２＝０．３５５、ｐ＝０．０００５）（図１Ｃ）、および脊椎（Ｒ２＝０．３４７、ｐ＝０．０００６）（図１Ｄ）のすべての部位でＢＭＤと正の相関があることを示す。対照的に、体重（Ｒ２＝０．０１２、ｐ＝０．５６５）（図１Ｅ）、肥満指数（Ｒ２＝０．０３１、ｐ＝０．３５６）（図１Ｆ）、血清中の副甲状腺ホルモンレベル（Ｒ２＝０．０４１、ｐ＝０．２８２）（図１Ｇ）、および年齢（Ｒ２＝０．０２８、ｐ＝０．３７５）（図１Ｈ）などの骨格代謝に厳密には関係しない個々のパラメータとの間に統計的に有意な相関は観察されなかった。一貫した結果が、定義されたプライマーおよびプローブを使用して、臨床パラメータをＬ１ＯＲＦ２コピー数と相関させたときに得られた（図２Ａ～Ｇ）。

ＣＴＲとＯＰの女性間のＬ１コピー数における変動が骨組織に特異的であるかを評価するために、コピー数多型（ＣＮＶ）アッセイを同じドナーから採取された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のゲノムについて行った。ＰＢＭＣゲノムでは、Ｌ１コピー数は健常骨よりも有意に低かったが、最も重要なことに、ＣＴＲ群とＯＰ群との間で変動は観察されなかった（図２Ｈ）。これらの結果は、骨粗しょう症患者を健常なドナーと比較した場合、Ｌ１ゲノムコピー数の定量的変動が骨で特異的に検出され、病理の影響を受けない他の中胚葉由来組織では検出されないことを示唆し、骨粗しょう症におけるＬ１動態変化の骨特異性を示す。

ＭＳＣの骨形成分化はＬ１ゲノム拡張を引き起こす。
骨粗しょう症の遺伝的原因は不明であるが、骨髄ニッチおける骨形成系統に向けたＭＳＣの不完全な分化と関連している。閉経後の骨粗しょう症骨のゲノムにおけるＬ１コピー数の観察された低下は、Ｌ１動員と骨発達との間の潜在的な関連性を示し、Ｌ１再活性化の不全が欠陥のある骨形成に関与し得ることを示した。したがって、追加の試験は、成人ＭＳＣの生理的骨形成中にＬ１レトロトランスポゾン活性化および拡張が生じるかを調査した。健常なドナーの腸骨から単離された骨髄由来ＭＳＣを、成熟した骨芽細胞に３週間分化させた（図３Ａ）。成熟骨芽細胞によって沈着された骨様結節が、光学顕微鏡で検出された（図３Ａ）。石灰化マトリックス沈着および骨形成遺伝子発現の増加は、骨分化が良好にエクスビボで生じたことを示した（データは示さず、図３Ｃ～Ｄ）。さらに、ミネラル化の開始はＭＳＣドナー間で異なり得、類似のミネラル化動態（図３Ｃ）ならびに類似のマーカー遺伝子発現（図３Ｄ）を示す年齢適合ドナーを選択し（試験したコホートとほぼ同じ年齢）、細胞系の一貫した挙動を確実にした。最初に、リアルタイムｑＰＣＲを使用して発達中の骨芽細胞におけるＬ１発現のタイムラインをモニタリングし、骨形成誘導後まもなく、Ｌ１ＲＮＡの細胞内レベルが徐々に増加し、次いで分化終了時に減少することを認めた（図３Ｂ）。ＨＭＷ－ｇＤＮＡにＴａｑＭａｎｑＰＣＲベースのＣＮＶアッセイを使用して、試験によって、分化誘導性Ｌ１発現がゲノム組み込みの初めからＬ１における変化を伴うかを調査した。図３Ｂに示されるように、Ｌ１コピー数は、未分化細胞（７日目）と比較して、成熟骨芽細胞（２１日目）で著しく増加した。操作されたＬ１レトロ転位ＧＦＰ－レポーターをベースとしたベースアッセイは、以前にいくつかの研究で使用されており（Ｃｏｕｆａｌ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００９），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８２４８、Ｏｓｔｅｒｔａｇ，ｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ（２０００），ｄｏｉ：ｇｋｄ２４８［ｐｉｉ］、ＭａｃＩａ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．（２０１７），ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．２０６８０５．１１６）、Ｌ１伝播が骨細胞の分化を伴うことが確認された（図３Ｅ）。

Ｌ１動態の障害は、骨芽細胞成熟に有害である
発達中の骨芽細胞におけるＬ１再活性化およびゲノム拡張が骨形成表現型に影響を及ぼすかを理解するために、Ｌ１ＲＮＡは、Ｌ１－ＯＲＦ１ＲＮＡ配列に特異的なフルオロアラビノ核酸（ＦＡＮＡ）修飾ＡＳＯを使用することによってノックダウンした。ＦＡＮＡＡＳＯは標的配列に結合し、ＲＮアーゼＨ媒介性切断のためのドッキングエレメントとして作用し（図４Ａ）、それによってＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）のいずれのオフターゲット効果も回避する。重要なことに、Ｌ１配列は、遺伝子のイントロンに、したがって、抗Ｌ１ＡＳＯの標的になり得る多くのＲＮＡの核前駆体に、頻繁に存在する。Ｌ１ＲＮＡのノックダウンに使用されたＡＳＯは、ほとんどが細胞核から除外される（データは示さず）。これによって、オフターゲットの可能性がさらに低下する。５つのＦＡＮＡＡＳＯの混合物を３日ごとに分化中の骨芽細胞に送達させ、リアルタイムｑＰＣＲによって骨関連遺伝子の発現を分析した。多少驚くべきことに、Ｌ１ＲＮＡの中度の枯渇（図４Ｆ）は、骨形成の誘導の１６日後に分析した骨芽細胞関連転写因子オステリックス（ＯＳＸ、－４３％）およびＲｕｎｔ関連転写因子２（ＲＵＮＸ２、－２３％）の発現の著しい低下を誘導するのに十分であった。さらに、同様の観察が、骨芽細胞特異的遺伝子オステオカルシン（ＯＣＮまたはＢＧＬＡＰ、－１０％）ならびに骨組織の２つの主要な非コラーゲン性成分であるオステオポンチン（ＯＰＮ、－４０％）および骨シアルプロテイン（ＢＳＰ、－４４％）についてもなされた（図４Ｂ）。結果は、体細胞Ｌ１ＲＮＡ枯渇が、骨形成プログラムを活性化してミネラル化骨を生じる細胞の能力を損なうことを示した。

Ｌ１ゲノム拡張のＮＲＴＩ媒介性阻害は、成熟を低下させ、発達中の骨芽細胞のミネラル化を損なう
さらに、初期試験では、発達中の骨芽細胞におけるＬ１コピー数の拡張を妨げるＮＲＴＩラミブジン３ＴＣ（３ＴＣ）によるＯＲＦ２媒介性Ｌ１レトロ転位の遮断が、骨細胞の成熟および機能に影響を及ぼしているかを調査した。分化中の骨芽細胞を３ＴＣの添加および無添加で３週間毎日処理し、Ｌ１コピー数を分化の異なる３時点で測定した。予想されるように、本薬剤は、骨芽細胞の成熟中にＬ１ＤＮＡの拡張を効率的に妨げた（図４Ｃ）。骨形成マーカーにおける３ＴＣの可能性のある表現型効果を評価するために、３ＴＣ処理の有り（３ＴＣ）および無し（ＤＭＳＯ）によるマーカー遺伝子の発現を、分化中の骨芽細胞において分析した。最後まで分化した細胞（２１日目）において、ＯＰＮ（－２３％）、ＯＳＸ（－５０％）、およびＢＳＰ（－６０％）の発現の非常に著しい低下が観察された（図４Ｄ）。一貫して、ミネラルマトリックス沈着は、著しく低下した（－６０％）（図４Ｅ）。細胞生存能における薬物の潜在的な有害作用は、ヨウ化プロピジウム染色、続いて３ＴＣ処理した骨芽細胞における細胞周期ＦＡＣＳ分析によって除外した。ラミブジン３ＴＣで処理したか（３ＴＣ）または処理しなかった（ＤＭＳＯ）ヒト間葉系幹細胞のＦＡＣＳ細胞周期分析の結果およびサブＧ１ピークにおけるアポトーシス細胞数の測定は、有意差を示さなかった（データは示さず）。これらの結果は、ＡＲＴ下にある患者におけるＮＲＴＩ治療とミネラル化喪失との間の緊密な関連を表すＬ１ゲノム拡張阻害の仮説を裏付ける。

脂肪細胞に分化するＭＳＣはＬ１動員を欠く
結果は、Ｌ１再活性化が阻害されると、ＭＳＣが機能的な骨芽細胞に効率的に分化することができないことを一様に示す。閉経後骨粗しょう症では、赤色骨髄が、脂肪含有量が増加するにつれて赤色から白色に変化する（Ｄｅｖｌｉｎ，ｅｔａｌ．ＬａｎｃｅｔＤｉａｂｅｔｅｓＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（２０１５），ｄｏｉ：１０．１０１６／Ｓ２２１３－８５８７（１４）７０００７－５、Ａｍｂｒｏｓｉ，ｅｔａｌ．ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌ（２０１７），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１７．０２．００９）。中胚葉前駆体をエクスビボで脂肪細胞に分化させた場合（図５Ａ）、脂肪細胞によって蓄積された脂質液滴が光学顕微鏡で容易に検出された（図５Ａ）。細胞内脂肪酸含量および脂肪生成遺伝子発現の増加は、脂肪生成が問題なくエクスビボで発生したことを示した（Ｆｇ．９Ａ～Ｂ）。

Ｌ１の発現およびコピー数（図５Ｂ）をモニタリングし、分化時に著しい変化は観察されなかった。これは、脂肪細胞に分化するＭＳＣがレトロ転位に適格でないことを示す以前の報告と一致する（ＭａｃＩａ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．（２０１７），ｄｏｉ：１０．１１０１／ｇｒ．２０６８０５．１１６）。最後に、異なる５ドナーで示されるように、ＭＳＣにおけるＬ１拡張の３ＴＣ媒介性阻害は、脂肪生成マーカー遺伝子発現に有意に影響を及ぼさず（図５Ｃ）、細胞内脂質の蓄積は変化しなかった（図５Ｄ）。これらの試験は、発達中のＭＳＣでは、体細胞Ｌ１再活性化が系統特異的であり、骨形成プログラムに必要であると思われるが、一方、それは骨粗しょう症患者の骨髄ニッチにおける一般的な細胞型である脂肪細胞の形成に関与していないという結論を導いた。

間葉系幹細胞へのＬＩＮＥ－１レトロトランスポゾンＲＮＡ送達は、骨形成分化および骨マトリックス産生を刺激する
骨Ｌ１コピー数は、成熟骨芽細胞および骨細胞活性と相関する。
図６Ａ～Ｆは、選択された参加者３０名の生検における、Ｌ１コピー数と、骨芽細胞、骨細胞、および破骨細胞に特異的な遺伝子の発現との間の相関を示す。骨芽細胞におけるＲＵＮＸ２転写レベルは、５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１領域においてわずかに有意であった（図６Ａおよび６Ｂ）。４つの骨細胞マーカーのうち、２つはＬ１コピー数と正の相関があった。ＳＯＳＴ（５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１についてｐ＝０．００５、ＯＲＦ２についてｐ＝０．０００２）（図６Ａ、ＣおよびＤ）、ならびにＭＥＰＥ（５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１についてｐ＝０．００７、ＯＲＦ２についてｐ＝０．０００６）（図６Ａ、ＥおよびＦ）。また、成熟骨芽細胞および骨細胞の両方で一般的に発現するＳＰＰ１と、５’ＵＴＲ－ＯＲＦ１領域コピー数（ｐ＝０．００９）との間に有意な相関が認められたが（図６ＡおよびＧ）、破骨細胞特異的マーカーＡＣＰ５およびＣＡＬＣＲについては認められなかった（図６Ａ）。これらのデータは、骨粗しょう症患者の骨のＬ１コピー数の低下を、同じ組織内の骨芽細胞／骨細胞の同化活性の障害と強く関連付ける。

骨粗しょう症患者からのＭＳＣへの合成Ｌ１ＲＮＡ送達は、培養でマトリックスミネラル化を引き起こす
骨粗しょう症骨は、インビボでのＬ１再活性化の明らかな欠損を示し、おそらく骨芽細胞骨形成に負の結果を伴う。したがって、追加の試験は、骨粗しょう症ドナーから得られたＭＳＣへのＬ１ＲＮＡの直接送達が骨芽細胞に分化させ、成熟および骨形成能力を向上させることができるかを試験することを試みた。ＭＳＣを健常なドナー４名および患者４名の大腿骨から単離し、骨形成分化を支持するそれらの能力について試験した（図７Ｂ）。低用量のＣｙ５コンジュゲート化合成全長Ｌ１ＲＮＡ（図８Ａ～Ｇ）を、これらの分化性骨芽細胞に高効率でトランスフェクトした（図７Ｂ）。予想されるように、外因性リポフェクタミン媒介性ＲＮＡ送達は、Ｌ１ＲＮＡが経時的にゆっくりと放出される細胞内小胞（図７Ｂ、赤焦点）の形成をもたらした（Ｋｉｒｓｃｈｍａｎ，Ｊ．Ｌ．ｅｔａｌＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２０１７；ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｘ２９０）。患者由来の細胞は、顕著に遅延して低下したミネラル化を示した（図７Ａ）が、Ｌ１ＲＮＡでトランスフェクトした細胞は、回復した骨マトリックス生成を示した（図７Ｃ）。注目すべきは、キャッピング、５’末端の２’－Ｏ－メチル化、ポリアデニル化（２００個のアデノシン）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）による全置換、および偽ウリジンによる７５％置換を使用して、ＲＮＡを安定化させ、細胞内の生来の免疫系を回避したことである（Ｋｏｓｋｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ２００４；ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１７２．７．３９８９、Ｐａｒｄｉｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１３）．ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－１－６２７０３－２６０－５＿２、Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．ｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１０）．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．１８６３、Ｋａｒｉｋｏｅｔａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００５）．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２００５．０６．００８、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｒ．ｅｔａｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１０）．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ３４７、Ｋｏｒｍａｎｎ，ｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１７３３）。

したがって、アポトーシスもインターフェロン応答遺伝子も、Ｌ１ＲＮＡトランスフェクション時に誘導されなかった（図８Ｇ）。結果は、試験したすべての患者において、インビボでの分化性ＭＳＣへのＬ１ＲＮＡの送達が、骨芽細胞成熟を大きく増強し、ミネラル化マトリックスの生成を完全に救済したことを示す。

考察
原発性骨粗しょう症は、社会的費用およびヒト無力化に関連して、世界的に最も一般的で費用のかかる疾患のうちの１つである（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ｅｔａｌ．Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．（２０１６），ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００１９８－０１６－３６２０－９）。他の疾患、薬物治療、および不十分な栄養に起因して頻繁に生じる続発性骨粗しょう症は、さらにより頻繁であり得るが、特にＮＲＴＩベースの抗レトロウイルス治療を受けている患者では、注目されることは少ない。これらの試験は、Ｌ１ゲノムの構造的変動が、閉経後女性３０名の骨密度と関連することを報告し、骨粗しょう症骨と比較して、健常骨においてＬ１ＤＮＡコピーの量がより多いことが観察された（図１Ａ）。とりわけ、ＣＴＲとＯＰの女性間のこの構造的なＬ１駆動ゲノム変動は、特に骨において観察されたが、間葉起源の細胞を同様に代表している、同じドナーから得られた末梢血においては観察されなかった（図２Ｈ）。明確に定義された閉経後の健常な女性対骨粗しょう症の女性のこのインビボでの観察は、Ｌ１エレメントの拡張が、正常な骨の発達および／または構造的維持のゲノム記録を表し得ることを示唆した。ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞前駆体を使用して、成人のエクスビボでの骨形成を再現させ、試験は、骨芽細胞のＬ１を伴う成熟の発達的に制御された再活性化および動員を実証した（図３Ａ～Ｂ）。Ｌ１ＲＮＡのＡＳＯ媒介性分解、ならびに骨形成中のＬ１レトロ転位のＮＲＴＩ媒介性阻害は、骨芽細胞の成熟に、ミネラル化への有害な影響を伴う重大な作用を及ぼした（図４Ａ～Ｅ）。劇的な表現型効果は、一般的な細胞毒性効果に起因するものではなく（図５Ａ～Ｂ）、脂肪生成に対するＬ１機能喪失が有意な効果を欠くことによっても示されるように、系統的かつ骨形成発達プログラムに特異的であるように思われる（図５Ａ～Ｄ）。注目すべきことに、Ｌ１ゲノム拡張のＮＲＴＩ媒介性阻害は、発達性脂肪細胞における主要な脂肪生成遺伝子の発現も脂質蓄積も変化させなかった。分化中のＭＳＣにおけるＬ１活性の低下は、骨形成の欠損および骨芽細胞依存性ミネラル化の低下にもたらすが、発達中の脂肪細胞における脂質蓄積を制限しないという我々の結果は、原発性骨粗しょう症障害を特徴とする骨喪失および骨髄脂肪組織の増加と一致する（Ｈａｗｋｅｓ，ｅｔａｌ．Ｂｏｎｅ（２０１８），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｏｎｅ．２０１８．０３．０１２）。さらに、インビボでのラミブジン処理が、マウスにおける骨髄脂肪組織を増加させることが最近実証されている（Ｃｅｃｃｏ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ５６６，７３－７８（２０１９））。我々のデータは、患者におけるＮＲＴＩベース療法と骨喪失との間の十分な文書化された関連性（Ｇｒｉｇｓｂｙ，ｅｔａｌ．Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ．Ｉｎｔ．（２００４），ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００１９８－００４－１６２７－０、Ｂｒｏｗｎ，ｅｔａｌ．ＡＩＤＳ（２００６），ｄｏｉ：１０．１０９７／ＱＡＤ．０ｂ０１３ｅ３２８０１０２２ｅｂ、Ｍａｄｅｄｄｕ，ｅｔａｌ，ＱＪＮｕｃｌＭｅｄＭｏｌＩｍａｇｉｎｇ（２００４））、およびＯＲＦ２がＮＲＴＩの確立され認識された標的であるという事実（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔａｌ．ＰＬｏＳＯｎｅ（２００８），ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００１５４７、Ｂａｃｈｉｌｌｅｒ，ｅｔａｌ．Ｂｒａｉｎ．Ｂｅｈａｖ．Ｉｍｍｕｎ．（２０１７），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂｉ．２０１６．１２．０１８）と一致する。破骨細胞による関与の可能性も考えられた。しかしながら、骨吸収および破骨細胞活性のすべての血清マーカーは、骨粗しょう症および健常な閉経後女性で類似していた（データは示さず）。破骨細胞関与の可能性は、様々なＢＭＤの閉経後女性９９名の拡張コホートの血清中酒石酸耐性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）を測定することによって特に検討された（図１０）。ＢＭＤと血清ＴＲＡＰ５ｂとの間には、小さいが有意ではない逆相関（ｐ＝０．１３、Ｒ２＝０．０２６）があった。また、健常者と患者との間に差は認められなかった（ｐ＝０．３１、データは示さず）。したがって、破骨細胞におけるＬ１媒介作用の気付かれていない効果が、本結果を変え得る可能性は低い。患者における血清ＡＬＰのレベルはより高い（ｐ＝０．０１９）が、値は正常範囲内であり、原発性骨粗しょう症プロセスに対抗する代償的であるが不十分な骨形成を示唆する。骨発生ならびに早期胚発生（Ｋａｎｏ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｓＤｅｖ．（２００９），ｄｏｉ：１０．１１０９／ＴＬＡ．２０１６．７４５９５８１、ｖａｎｄｅｎＨｕｒｋ，ｅｔａｌ．Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２００７），ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｍ１０８、Ｆａｄｌｏｕｎ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１３），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．２４９５、Ｊａｃｈｏｗｉｃｚ，ｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１７），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｇ．３９４５）および発達中の脳（Ｃｏｕｆａｌ，ｅｔａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２００９），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ０８２４８、Ｂｅｄｒｏｓｉａｎ，ｅｔａｌ．，ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｈ３３７８）のような非病理学的文脈におけるＬ１再活性の機能的重要性は、依然として理解されていない。実際、Ｌ１および他のトランスポゾン活性は、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）生成から、制御されたＤＮＡ損傷および修復、クロマチンリモデリング、ならびに組み込み部位におけるシス効果に特異的な遺伝子座までのいくつかのステップを伴う複雑な現象である。したがって、Ｌ１再活性化によって引き起こされる１つを超えるメカニズムが、組織特異的表現型発現に寄与することが考えられる。したがって、Ｌ１レトロトランスポゾン動態の阻害が、骨粗しょう症発症の原因事象、またはそれに伴う事象のいずれであり得るかを明らかにするために、今後の試験が必要とされる。しかしながら、Ｌ１動態が骨形成を支持し、Ｌ１関連ゲノムの構造的変動によって健常骨と骨粗しょう症骨とがインビボで区別されるという報告された事実は、閉経後女性および抗レトロウイルスレジメン下の患者の骨喪失を軽減する戦略の開発のために以前には予測されなかった研究の前線を示唆し得る。

ＩＩ．Ｌ１ＲＮＡ抑制は、マウス早老症モデルにおいて組織変性を防ぐＨ３Ｋ９Ｍ３ヘテロクロマチンを保存する
ＬＩＮＥ－１（Ｌ１）エレメントは、そのレトロ転位とは無関係に、細胞質内のＬ１ＲＮＡ／ｃＤＮＡの蓄積に起因する炎症促進反応を活性化することによって、細胞毒性を引き起こし得る。これらの試験は、ＬＡＫＩマウスにおけるＬ１発現を調査して、散在反復配列の転写と老化表現型の発症との間の相関を認めた。

材料および方法
動物およびインビボ処理：
すべての動物処理は、ＮＩＨガイドラインに従って実施され、ＳａｌｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅの動物愛護委員会によって承認された。ＬＭＮＡ変異Ｇ６０９Ｇ（ＬＡＫＩ）を担持するハッチンソン・ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）のマウスモデルは、Ｓｐａｉｎ，Ｏｖｉｅｄｏ大学でＣａｒｌｏｓＬｏｐｅｚ－Ｏｔｉｎによって作製され、ＢｕｃｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＢｒｉａｎＫｅｎｎｅｄｙによって厚意により寄贈された。

ＷＴおよびＬＡＫＩマウスを用いる実験は、８週齢の両性のマウスで実施した。寿命実験のために、同腹子から両性マウスを、対照群および実験群に無作為に割り当てた。実験開始前に不健康を示した動物は除外した。組み入れ基準は使用しなかった。マウスは、０６：００～１８：００の間の１２時間の明暗サイクルで、水および食餌への自由なアクセスを有する温度制御室（２２±１℃）で飼育した。

ＬＩＮＥ－１特異的かまたはスクランブルの２’－デオキシ－２’フルオロ－β－ｄ－アラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡＡＳＯ）を、２～１０ｍｇ／Ｋｇの用量で２週間に１回、腹腔内または皮下注射によって送達した。

尾先端線維芽細胞の単離および培養：
尾先端線維芽細胞（ＴＴＦ）を、ＷＴおよびＬＡＫＩマウスから単離し、Ｇｌｕｔａ－ＭＡＸ、非必須アミノ酸、および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３７℃で培養した。ＬＩＮＥ－１ノックダウンのため、ＴＴＦは、２日ごとに培地に溶解させた１μＭのＦＡＮＡＡＳＯとともにインキュベートし、１週間後に老化マーカー発現または免疫組織化学のために収集した。

組織学的解析：
組織学的解析のために、組織サンプルを、ＦＡＮＡ－ＡＳＯ注射の８週後に、１６週齢で収集した。マウスをＰＢＳおよび１０％緩衝化ホルマリン溶液で灌流した。続いて、組織を１０％緩衝化ホルマリン溶液で４℃で一晩固定し、ＰＢＳ中の３０％スクロースで一晩凍結保存し、ＯＣＴマトリックス（Ｋａｌｔｅｋ）で包理し、液体窒素でフラッシュ凍結した。７μｍの凍結切片を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）または免疫組織化学のために使用した。

免疫組織化学：
細胞をＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドで、室温（ＲＴ）で１０分間固定した。固定後、細胞をＰＢＳ中の０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で、ＲＴで５分間処理した。ＰＢＳ中の４％ＢＳＡで３０分間ブロッキングした後、細胞を１次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、続いてＰＢＳ中で洗浄し、対応する２次抗体とともにＲＴで１時間インキュベートした。細胞は、ＤＡＰＩ－Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ－Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）を使用してマウントした。共焦点画像の取得は、ＺｅｉｓｓＬＳＭ７８０レーザー走査顕微鏡（ＣａｒｌＺｅｉｓｓＪｅｎａ）を使用して行った。画像は、適切なレーザー（４８８－ｎｍ、５６８－ｎｍ、６３３－ｎｍ、および４０５－ｎｍ）を使用して、０．２５μｍ間隔のｚ切片で得た。レーザー強度は通常、最大強度の３％～５％透過に設定し、設定はいずれのレーザーの信号飽和も回避するように確立した。

組織切片は、ＨｉｓｔｏＶＴＯｎｅ（ＮａｃａｌａｉＴｅｓｑｕｅ）を使用して透過処理および抗原回復を行った。続いて、組織切片をＰＢＳ中の５％画分ＶＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および免疫グロブリンマスキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でブロッキングし、一次抗体とともに一晩インキュベートした。最後に、組織切片を、ブロッキング緩衝液中の二次抗体とともに、室温で６０分間インキュベートした（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。組織切片をＤＡＰＩＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔＧマウント培地（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ．）でマウントした。

蛍光インサイツハイブリダイゼーション：
ＴＴＦおよび組織切片におけるＲＮＡ－ＦＩＳＨまたは免疫ＲＮＡＦＩＳＨを、製造業者の標準プロトコル（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従って行った。固定は３％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間行い、続いて、ハイブリダイゼーションの前に、１％ｔｒｉｔｏｎＸ－１００を用いて室温で５分間透過させた。ハイブリダイゼーションを、転写されたＬＩＮＥ－１ＲＮＡの大部分を認識する活性マウスＬ１ｓｐａエレメントの長さにわたるように設計された４８個の単一分子プローブを使用して、３８度で一晩行った。プローブセットはＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって設計され、作製された。ＣａｌＦｌｕｏｒ６１０で標識されたＣｕｓｔｏｍＳｔｅｌｌａｒｉｓ（登録商標）ＦＩＳＨプローブは、ｗｗｗ．ｂｉｏｓｅａｒｃｈｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｓｔｅｌｌａｒｉｓｄｅｓｉｇｎｅｒでオンラインで入手可能なＳｔｅｌｌａｒｉｓ（登録商標）ＦＩＳＨＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎｅｒ（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｅｔａｌｕｍａ，ＣＡ）を利用して、Ｌ１ｓｐａに対して設計された。

ＬＩＮＥ－１ＲＮＡインビトロ転写およびＳＵＶ３９酵素活性アッセイ：
ＬＩＮＥ－１ＲＮＡは、Ｌ１ｓｐａエレメントを鋳型として含有するｐＴＮＣ７プラスミドを使用するＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してインビトロで転写した。反応前に、ｐＴＮＣ７は、全長センスＬＩＮＥ－１ＲＮＡを転写するＮｏｔＩ制限酵素、またはアンチセンスＬＩＮＥ－１ＲＮＡについてＸｈｏＩ制限酵素によって直線化されている。転写されたＲＮＡは、ＲＮＡクリーンアッププロトコルに従って、ＲＮＡｅａｓｙミニキット（ｑｉａｇｅｎ）で精製した。組換えＳｕｖ３９Ｈ１（Ａｃｔｉｖｅｍｏｔｉｆ）ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）活性を、製造業者の説明書に従ってＥｐｉＱｕｉｋ（商標）ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性／阻害アッセイキット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ）を使用してアッセイした。簡単に説明すると、１μｇの組換えＳＵＶ３９Ｈ１を、１０ｎｇまたは５０ｎｇのインビトロで転写されたセンスＬＩＮＥ－１ＲＮＡとともにインキュベートした。アンチセンスＬＩＮＥ－１ＲＮＡを、Ｃａｍａｃｈｏｅｔａｌ．ｅｌｉｆｅ２０１７と同様に陰性対照として使用した。１μｇのＳＵＶ３９Ｈ１は、単独またはＲＮＡと複合体化して、１μｌの陽性対照酵素と並行してアッセイに使用した。吸光度をマイクロプレートリーダーによって４５０ｎｍで読み取り、ＨＭＴ活性は、ＨＭＴ活性＝ＯＤ（サンプル－ブランク）／インキュベーション期間（時間）として計算した。

ＲＮＡ抽出およびリアルタイムｑＰＣＲ：
総ＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙＰｌｕｓｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞および組織から抽出し、続いてｃＤＮＡ合成を、ＲＴ－ＰＣＲ用のｉＳｃｒｉｐｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＳｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して行った。ｑＰＣＲは、ＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄＳＹＢＲＧｒｅｅｎＳｕｐｅｒｍｉｘまたはｉＱＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して行った。

ｍｐ１６－ＦｗｄＣＧＴＧＡＡＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣ（配列番号３５）、
ｍｐ１６－ＲｅｖＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＣＴＡＣＧＴＧＡ（配列番号３６）、
ｍｐ２１－ＦｗｄＣＧＧＴＧＴＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＧＧＧＡ（配列番号３７）、
ｍｐ２１－ＲｅｖＡＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＴＧＧＡＣＡＴＧＧ（配列番号３８）、
ｍＡｔｆ３－ＦｗｄＣＴＣＴＧＧＣＣＧＴＴＣＴＣＴＧＧＡ（配列番号３９）、
ｍＡｔｆ３－ＲｅｖＧＧＴＣＧＣＡＣＴＧＡＣＴＴＣＴＧＡＧＧ（配列番号４０）、
ｍＧａｄｄ４５ｂ－ＦｗｄＣＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＴ（配列番号４１）、
ｍＧａｄｄ４５ｂ－ＲｅｖＴＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＡＴＡＴＣＡＴＣＣ（配列番号４２）、
ｍＢｔｇ２－ＦｗｄＧＣＧＡＧＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＧＧＴＴ（配列番号４３）、
ｍＢｔｇ２－ＲｅｖＴＡＧＣＣＡＧＡＡＣＣＴＴＴＧＧＡＴＧＧ（配列番号４４）、
ｍＭＭＰ１３－ＦｗｄＴＧＡＴＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡ（配列番号４５）、
ｍＭＭＰ１３－ＲｅｖＧＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＴＧＡＴＣＣＡＧＡ（配列番号４６）、
ｍＩＬ６－ＦｗｄＴＧＡＴＧＣＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡ（配列番号４７）、
ｍＩＬ６－ＲｅｖＡＣＣＡＧＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＡＴＡＧＧＣ（配列番号４８）、
ｍＬａｐ２ａ－ＦｗｄＴＴＣＴＣＧＡＧＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧ（配列番号４９）、
ｍＬａｐ２ａ－ＲｅｖＡＧＣＣＴＧＧＧＣＴＴＡＴＣＡＧＴＴＴＴ（配列番号５０）、
ｍＧａｐｄｈ－ＦｗｄＧＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴ（配列番号５１）、
ｍＧａｐｄｈ－ＲｅｖＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧ（配列番号５２）、
ｍＬ１－ＦｗｄＧＣＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＡＡＡＡＴＴＧＧ（配列番号５３）、
ｍＬ１－ＲｅｖＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＧＴＡＴＴＧＣＴ（配列番号５４）。

老化関連ベータ－ガラクトシダーゼ酵素活性アッセイ：
老化関連ベータ－ガラクトシダーゼ（ＳＡ－βｇａｌ）アッセイを、本明細書に記載されるように、簡潔に行った。簡単に説明すると、最初に、細胞を４％パラホルムアルデヒドに室温で５分間固定した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４０ｍＭクエン酸／リン酸Ｎａ緩衝剤、５ｍＭのＫ_４［Ｆｅ（ＣＮ）_６］３Ｈ_２Ｏ、５ｍＭＫ_３［Ｆｅ（ＣＮ）_６］、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化マグネシウム、および１ｍｇ／ｍｌのＸ－ｇａｌを含有する染色溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳで２回、メタノールで１回洗浄した。プレートを乾燥させ、明視野顕微鏡を使用して細胞の写真を撮影した。

結果および考察
マルチプレックスＴａｑＭａｎアッセイを使用して、３つの活性マウスＬ１サブファミリー（Ｌ１－Ｔｆ、Ｌ１－Ｇｆ、およびＬ１－Ａｆ）の発現を、野生型（ＷＴ）およびＬＡＫＩマウスから単離した尾先端線維芽細胞（ＴＴＦ）で測定した。ＬＡＫＩＴＴＦにおいて、３～６倍高いＬ１エレメントの発現が観察された（図１１Ａ）。Ｌ１発現は、ＲＮＡ蛍光インサイツハイブリダイゼーションアッセイ（ＦＩＳＨ）を使用してさらに確認し、顕著には、核内にＬ１ＲＮＡの強い蓄積が認められた（図１１Ｂ）。細胞質および核コンパートメントの両方からのＬ１ＲＮＡをノックダウンするため、Ｌ１特異的２’Ｆ－ＡＮＡ修飾ＡＯＮ（Ｌ１－ＡＯＮ）を使用した。Ｌ１ＲＮＡ枯渇は、ｑＰＣＲおよびＲＮＡＦＩＳＨによって確証した（図１１Ｃ～Ｄ）。興味深いことに、Ｌ１－ＡＯＮで処理されたＬＡＫＩＴＴＦは、ｐ５３腫瘍抑制因子経路におけるストレス応答遺伝子（ｐ１６、ｐ２１、Ａｔｆ３、およびＧａｄｄ４５ｂ）、老化関連メタロプロテアーゼＭｍｐ１３、および炎症促進性インターロイキンＩＬ１ａの著しく低い発現を示した（図１１Ｅ）。一貫して、活性老化関連β－ガラクトシダーゼ酵素（ＳＡ－Ｂ－ｇａｌ）が陽性である細胞数は、Ｌ１－ＡＯＮで処理したＬＡＫＩＴＴＦで低下する（図１１Ｆ）。

ＬＡＫＩマウスは、著しく低いレベルのＨ３Ｋ９ｍｅ３および脱凝縮ヘテロクロマチンを特徴とする。Ｌ１－ＡＯＮ処理で、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン焦点の強度は、スクランブル処理した対照細胞と比較してＬＡＫＩ細胞で増加し、ＷＴ（野生型）細胞のレベルに近づいた（データは示さず、図１２Ａ）。結果として、異常な核構造を有する細胞の数も低下した（データは示さず、図１２Ｂ）。

Ｈ３Ｋ９のトリメチル化に関与するクロマチン修飾因子であるＳＵＶ３９Ｈ１／２酵素は、反復ＲＮＡ、具体的には「センス」ＤＮＡ鎖から転写されるＬ１ＲＮＡに結合することができる。ＲＮＡ免疫沈降（ＲＩＰ）を実施し、結果は、Ｌ１ＲＮＡの５’末端および３’末端の両方が、ＬＡＫＩＴＴＦにおけるＳＵＶ３９Ｈ１／２（バーの各対の右バー）タンパク質によって結合されることを示した（図１２Ｃ）。さらに、ＳＵＶ３９Ｈ１／２焦点は、ＬＡＫＩＴＴＦにおけるＬ１ＲＮＡスポットと共局在した（データは示さず）。Ｌ１－ＡＳＯ処理がヘテロクロマチンを回復させ、老化関連遺伝子の発現を低下させたことを考慮して、Ｌ１ＲＮＡがＬＡＫＩ細胞の核に蓄積されたＳＵＶ３９Ｈ１／２に阻害的な役割を果たすかを決定するために、さらなる試験を行った。ＡｎＨ３Ｋ９特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼアッセイを、Ｌ１センス方向転写物の存在下で、組換えＳＵＶ３９Ｈ１／２タンパク質を使用して行った。Ｌ１アンチセンス転写物を陰性対照として使用した。Ｌ１センスＲＮＡは、ＳＵＶ３９Ｈ１／２酵素活性に、タンパク質の単独またはＬ１アンチセンスＲＮＡとの活性と比較して、強い阻害効果を発揮した（図１２Ｄ）。

インビボでのＬ１ＲＮＡ枯渇が老化表現型の発症を予防する上でＬＡＫＩマウスに任意の有益な効果を有することができるかを試験するために、ＬＡＫＩマウスをスクランブルおよびＬ１－ＡＯＮの両方で、８週齢から開始して処理した。マウスにＡＯＮ（Ｔ．Ｂ．Ｄ．）の腹腔内注射を供した。Ｌ１－ＡＯＮ処理したＬＡＫＩマウスを、分子的および組織学的分析のために１６週齢で屠殺した。皮膚、脛骨前骨格筋、肝臓、腎臓、脾臓、および胃を含むいくつかの組織におけるＬ１ＲＮＡのノックダウンを、ｑＰＣＲによって確証した（図１３Ａ）。重要なことに、８週間のＬ１－ＡＯＮ処理は、スクランブルＡＯＮ注射マウスと比較して、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンマークのレベルを回復させた（データは示さず）。さらに、Ｌ１－ＡＯＮ処理は、分析した異なる組織におけるＳＡＳＰ遺伝子の発現を低下させた（図１３Ｂ）。

早老患者（ＨＧＰＳ）または繰り返すウェルナー症候群（ＷＲＮ－／－）由来のヒト細胞におけるＬ１ＦＡＮＡオリゴの有益な効果も調査した。マウスで得られたデータと一致して、早老症候群およびウェルナー症候群の両方のヒト細胞は、Ｌ１ＲＮＡのより高い発現を特徴とする（図１４Ａ）。ヒト特異的Ｌ１－ＡＯＮを使用し、細胞はＳＡ－Ｂ－Ｇａｌ活性の低下および老化関連遺伝子の発現の低下を示す（図１４Ｂ～Ｄ）。さらに、ヒト系においてさえ、Ｌ１ＲＮＡ枯渇は、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンの回復に関連付けられる（図１４Ｅ～Ｆ）。

早期老化と関連する病理学的変化から器官を保護する治療の有効性を評価するために、早老症候群で損なわれる組織の組織学的分析（Ｃｅｓｔａ，２００６、Ｋｈａｎｎａｅｔａｌ．１９８８、ＫｕｒｂａｎａｎｄＢｈａｗａｎ，１９９０、Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，２００８、Ｏｓｏｒｉｏｅｔａｌ．，２０１１）を行った。ヘマトキシリン－エオシン染色は、Ｌ１－ＡＯＮで注射されたマウスが、皮膚、脾臓、胃、および腎臓の改善された組織学的プロファイルを有することを明らかにした（データは示さず）。特に、皮膚は、より厚い表皮層を特徴とし、初期核は脾臓においてより広範であり、胃の上皮層の体積はより高く、腎糸球体の直径は増加する（図１３Ｃ）。まとめると、これらの結果によって、Ｌ１ＲＮＡの安定的な低下がＬＡＫＩマウスの複数の器官における年齢関連組織学的変化を改善したことが確証される。

最後に、処理マウスの体重および寿命をモニタリングした。組織学的分析と一致して、Ｌ１－ＡＯＮ処理は、対照および未処理マウスと比較して、ＬＡＫＩマウスに典型的な体重の漸進的な低下を防止し（図１３Ｄ）、寿命の中央値の増加（１５～２５％）が観察された（図１３Ｅ）。

内因性Ｌ１エレメントは、生理学的（上記）および病理学的（ＨＧＰＳ、図１１Ａ～１１Ｅ）に老化した細胞の両方で転写的に活性である。この試験は、早老症候群のような促進老化のモデルでは、核内におけるＬ１ＲＮＡの蓄積が、ヘテロクロマチンの喪失およびＳＡＳＰ関連遺伝子の発現の増加をもたらすことを示す。ここで、データは、ＡＯＮを使用したこの反復ＲＮＡのノックダウンが、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンの脱凝縮を防止し、年齢関連遺伝子の発現を低下させたことを示す。さらに、ＬＡＫＩマウスにおけるインビボでのＬ１ＲＮＡ枯渇は、異なる組織における早期老化表現型、体重の減少の発症を遅らせ、処理マウスの寿命を増加させた。さらに、ＳＵＶ３９Ｈ１／２の負の調節因子としてのＬ１ＲＮＡにおける新規機能が実証された。

要約すると、この試験において、反復ＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドをベースとした療法が、ＬＡＫＩマウスにおける加齢関連表現型を改善するのに十分であることが初めて示される。したがって、具体的にＡＯＮに基づく介入、またはインビボでＬ１ＲＮＡのレベルを低下させる他の介入は、早老症候群のような破壊的な疾患に対する魅力的な治療選択肢であり得る。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、開示される本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に引用される刊行物およびそれらが引用される材料は、参照により具体的に本明細書に組み込まれる。

当業者は、本明細書に記載される発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を、日常的な実験のみを使用して認識するか、または確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。

Claims

Ｌ１ＲＮＡコピー数を増加させるための組成物であって、Ｌ１ＲＮＡまたはその断片を薬学的に許容される担体中に含む、組成物。
前記Ｌ１ＲＮＡが、Ｌ１ＨＳ－Ｔａ１である、請求項１に記載の組成物。
前記Ｌ１ＲＮＡのＯＲＦ１またはＯＲＦ２を含む、請求項１または２に記載の組成物。
前記Ｌ１ＲＮＡまたはその断片が、発現ベクター中にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
前記発現ベクターが、プラスミド、ミニサークルＤＮＡ（ｍｃＤＮＡ）、およびウイルスベクターからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
前記ベクターが、バクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群から選択される、請求項５に記載の組成物。
前記発現ベクターが、骨前駆細胞中にある、請求項５または６に記載の組成物。
前記骨前駆細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項７に記載の組成物。
前記Ｌ１ＲＮＡが、配列番号１を含む、請求項７または８に記載の組成物。
Ｌ１－ＲＮＡ発現の増加を必要とする対象においてＬ１－ＲＮＡ発現を増加させる方法であって、前記対象に、請求項のいずれか一項に記載の組成物を有効量で投与して、前記対象における１つ以上の細胞でＬ１ＲＮＡ発現を増加させることを含む、方法。
Ｌ１ＲＮＡまたはその機能的断片を発現するように遺伝子操作された骨前駆細胞を、それを必要とする前記対象における部位に投与することを含む、請求項１０に記載の方法。
前記細胞が、自己細胞である、請求項１１に記載の方法。
前記細胞を、骨成長または修復を必要とする部位に投与することを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
前記部位が、脊椎固定部位または骨折部位である、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、変性椎間板疾患、脊椎すべり症、脊椎管狭窄症、脊椎側弯症、骨折した椎骨、感染症、椎間板ヘルニア、および腫瘍からなる群から選択される状態を有すると診断された対象における、骨折部位または脊椎固定部位における骨量指数を増加するのに有効である、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、配列番号１を含む、請求項１０～１５のいずれか一項に記載の方法。
Ｌ１ＲＮＡを低下させるための組成物であって、Ｌ１ＲＮＡ発現を阻害するための１つ以上の薬剤を、薬学的に許容される担体中に含む、組成物。
前記Ｌ１ＲＮＡを阻害するための薬剤が、薬学的に許容される担体中の小分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、外部ガイド配列、およびアプタマーからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
Ｌ１ＲＮＡＡＳＯ、Ｌ１ＲＮＡＯＲＦ１ＡＳＯ、および／またはＬ１ＲＮＡＯＲＦ２ＡＳＯを含む、請求項１７または１８に記載の組成物。
前記ＡＳＯが、Ｌ１ＲＮＡ、Ｌ１ＲＮＡＯＲＦ１、またはＬ１ＲＮＡＯＲＦ２の断片に相補的であり、任意選択的に、前記ＡＳＯが、２４ヌクレオチド以下の長さである、請求項１８または１９に記載の組成物。
Ｌ１ＲＮＡコピー数の低下を必要とする対象においてＬ１ＲＮＡコピー数を低下させる方法であって、請求項１７～２０のいずれか一項に記載の組成物を、前記対象に投与することを含む、方法。
前記組成物が、注射によって投与される、請求項２１に記載の方法。
前記組成物を前記対象に皮下投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
前記組成物が、対象の早老症候群の１つ以上の症状を緩和する、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。
前記組成物が、皮膚老化の１つ以上の症状を緩和する、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。