JP2023500406A - 新規な製剤および方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、ホスホクレアチン、およびトリヨードチロニン（T3）を含有するナノ粒子を含む組成物、ならびに心臓状態、特に心停止および急性心不全、および一般に低酸素症に関連する状態、例えば虚血および脳卒中の処置における組成物の使用をを提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、2019年11月10日出願の米国仮出願第62/933,504号に基づく優先権および利益を主張し、その内容は、出典明示によりその全体として本明細書の一部とする。
（発明の分野）
分野は、ホスホクレアチンおよびトリヨードチロニン（T3）を含有するナノ粒子を含む組成物、ならびに心臓状態、特に心停止および急性心不全、および一般に低酸素症に関連する状態、例えば虚血および脳卒中、神経障害、および低細胞エネルギーを特徴とする障害（例えば、ミトコンドリア機能障害を特徴とする障害）の処置における組成物の使用に関する。
心停止は、患者の心臓が効果的な鼓動を停止し、全身に血液を送り出す機能がなくなった状態を指す。多くの場合、心筋梗塞が原因である。迅速に処置された場合、心停止は、心肺蘇生法（CPR）と除細動によって覆されることがある。心停止を処置する薬は、心筋を刺激し、冠状動脈の灌流を促進する大動脈の圧力を増強するエピネフリンを含む。しかしながら、エピネフリンは蘇生の可能性を高める一方で、不整脈および心臓への負担を引き起こし、蘇生後期の問題のリスクを高める可能性があるため、エピネフリンが全生存期間を著しく改善するかどうかは議論の余地がある。
急性心機能不全（cardiac insufficiency）の他の形態は、急性心不全（heart failure）および心原性ショックを含む。急性心不全は、慢性心疾患の患者によく見られる重大な状態である。急性心不全の間、肺循環から末梢循環に血液を送り出す心臓の能力が損なわれる。心原性ショックは、心臓の心室が一次的に効果的に機能しなるために、血液が十分に循環しないことに起因するショックの一形態である。
トリヨードチロニンは、T3としても知られ、甲状腺ホルモンである。甲状腺刺激ホルモン（TSH）は、チロキシン（T4）とT3の産生を活性化する。T4は、脱ヨウ素化によりT3に変換される。T3は、体温、成長および心拍数を含む様々な体のプロセスに影響を与える。T3は、心臓組織に重要な影響を及ぼす。甲状腺ホルモン、特にT3は、ゲノムおよび非ゲノムメカニズムによって心室機能を調節する。心臓のストレス事象（心停止、心筋梗塞など）は、血清T3レベルの急激な低下に関連している。蘇生後のT3レベルは、生存率と高い相関がある。T3は、さらに心臓刺激特性があり：心拍数と収縮力を増加させることにより、心拍出量を増加させる。全体として、早期のボーラスT3注射は、心停止者を蘇生する可能性を高め得て、T3血清濃度の上昇は、生存退院の見込みを高め得ると考える理由がある。
心臓保護は、梗塞サイズを縮小し、それ故に急性虚血および心停止事象後の心不全への進行を防ぐことを目的とした、心臓病学における治療的介入の重要な目的である。最近の研究では、特にミトコンドリア機能の維持、その抗線維化および血管新生促進効果、細胞膜の再分極、および細胞再生の誘導による、心臓保護における甲状腺系の役割が強調されている。トリヨードチロニン/チロキシン（T3）療法は、心筋スタンニングを逆転させるために用いられてきた。甲状腺機能亢進症は、ミトコンドリアのナトリウム-カルシウム交換体およびミトコンドリアのK+チャネルへの依存度が高く、スタンニングを防止する。
心臓はかなりの酸素を蓄えることができないため、その高代謝状態をサポートするために、血流の連続的送達に依存している。心停止後、心筋組織の酸素分圧は急速に低下し、ATPの好気的産生は停止する。一般に、虚血性心筋の再酸素化なしでは、心拍再開（ROSC）を達成できない。エピネフリンは現在、ROSCの回復を誘発するために使用されている。しかしながら、エピネフリンの使用は、高血圧および肺水腫などの様々な負の副作用を引き起こすため精査されている。また、回復後の長期生存または精神機能を改善することは示されていない。
したがって、エピネフリンの潜在的な副作用なしにROSCを得ることができる処置を創出することが望ましい。
ホスホクレアチン（以下、PCRとも称する）は、リン酸化クレアチン分子であり、骨格筋および脳において、細胞のエネルギー通貨であるアデノシン三リン酸を再利用するために高エネルギーリン酸の迅速に動員可能な予備として機能する。ホスホクレアチンは、嫌気的にリン酸基をADPに供与してATPを形成できる。激しい活動中にATPを迅速に再生するためにホスホクレアチンを使用すると、ATP濃度の空間的および時間的バッファーを提供できる。
本発明者らは、驚くべきことに、T3およびホスホクレアチンのナノ粒子が低酸素条件下で心筋細胞のATPレベルを回復することを見出した。この新しい組合せは、エピネフリンの潜在的な副作用なしにROSCを得ることができる処置法を提供できると考えられる。ナノ粒子形態のT3とホスホクレアチンのこの組合せは、心臓虚血および蘇生における組織損傷の制御のための潜在的に新しい処置法を表している。本発明者らはまた、驚くべきことに、本開示の組成物が血液脳関門を通過できることを見出し、これは、T3およびホスホクレアチンのナノ粒子が、脳の低酸素症に関連する様々な障害の処置にも使用できることを意味する。結果は、低酸素症に関連する状態を含む、低細胞エネルギーを特徴とする状態での更なる適用を強く示唆している。
一態様において、本発明は、T3およびPCRの両方を封入するナノ粒子であって、該ナノ粒子が、キトサンおよびPLGAを含み、キトサン対PLGAの相対比を変更して、活性成分、例えばT3および／またはPCRの放出を調整し得る、ナノ粒子を提供する。理論に拘束されるものではないが、キトサンは親水性であると考えられる。したがって、活性成分がおそらく疎水性であり得る場合（例えばT3およびPCR）、PLGAと比較してより多くのキトサン、例えば、キトサン対PLGAが80/20の相対比量（例えば、％w/w 80/20、キトサン対PLGA）、またはキトサン対PLGAが90/10の相対比量（例えば、％w/w 90/10、キトサン対PLGA）での添加は、適用または投与時に活性成分が速やかに放出されるナノ粒子を生じ得る。理論に拘束されるものではないが、活性成分がより疎水性である場合、キトサン量と比較してより多くのPLGA、例えば、キトサン対PLGAが20/80の相対比（例えば、％w/w 20/80、キトサン対PLGA）、またはキトサン対PLGAが10/90（例えば、％w/w 10/90、キトサン対PLGA）での添加は、活性成分がよりゆっくりと放出されるナノ粒子を生じ得る。
更なる態様において、本開示は、予防または処置を必要とする対象体に治療上有効量のトリヨードチロニン（T3）およびホスホクレアチン（PCR）を投与することを含む、アデノシン三リン酸（ATP）の欠乏を特徴とする疾患、障害または状態の予防または処置のための方法を提供する。様々な実施形態において、疾患、障害または状態が、心血管障害、低酸素症に関連する障害、または低細胞エネルギーを特徴とする障害（例えば、ミトコンドリア機能障害を特徴とする障害またはATPシンターゼの機能不全を特徴とする障害）、神経変性障害、呼吸器障害、肥満、代謝障害、または糖尿病より選択される。
一実施態様において、本開示は、T3およびホスホクレアチン（PCR）のナノ粒子の有効量を含む組成物を、処置を必要とする患者に投与することを含む、心臓状態、例えば、心停止、心不整脈、心機能不全、心筋梗塞、心筋虚血/再潅流傷害、心筋梗塞、心筋低酸素症、またはうっ血性心不全を処置するための方法であって、組成物が、例えば上記した、生体吸収性ポリマーを含む、方法を提供する。
別の実施態様において、本開示はまた、例えば前記組成物1または1.1～1.16のいずれかの特徴を有する、T3ナノ粒子およびホスホクレアチン（PCR）の有効量を含む組成物を、処置を必要とする対象体に投与することを含む、低酸素症、虚血または虚血再灌流傷害に関連する疾患または状態、例えば、心筋 低酸素症、脳卒中（例えば、虚血性脳卒中または出血性脳卒中）、外傷性脳損傷（例えば、脳震盪）、虚血（例えば、心筋虚血または網膜虚血）、出血性ショック、または浮腫（例えば、脳浮腫）を処置するための方法であって、組成物が、例えば上記した、生体吸収性ポリマーを含む、方法を提供する。
本明細書に開示する方法の特定の例において、投与されるナノ粒子は、T3およびPCRを封入するキトサン-PLGAナノ粒子を含む。
さらに別の例において、投与されるナノ粒子は、T3およびPCRの両方を固定するキトサン-PLGAナノ粒子を含む。あるいは、投与されるナノ粒子は、T3およびPCRを固定するキトサン-PLGAナノ粒子、ならびにT3およびPCRを封入するキトサン-PLGAナノ粒子を含む。
図1は、対照と比較した、T3ナノ粒子とPCRの組合せが新生仔心筋細胞のATPレベルに対して有する影響を示す。
図2は、PLGAナノ粒子の粒子径分布を示す。
図3は、ホスホクレアチンを封入したPLGA-PEGナノ粒子の粒子径分布を示す。
図4は、ホスホクレアチンを封入したT3-PLGAナノ粒子の粒子径分布を示す。
図5は、T3-PLGAナノ粒子の粒子径分布を示す。
図6は、新生仔心筋細胞におけるATPレベルについての、正常状態と低酸素状態でのNano-T3の心臓保護効果を示す（生物発光アッセイ）。
図7は、新生仔心筋細胞におけるトロポニンT放出レベルについての、正常状態と低酸素状態でのNano-T3の心臓保護効果を示す（生物発光アッセイ）。
図8は、ATPレベルについての、低酸素下のニューロン（PC12）細胞に対するT3、Nano-T3、およびNano-T3およびホスホクレアチンの効果を示す。
図9は、トロポニンT放出レベルについての、低酸素下のニューロン（PC12）細胞に対するT3、Nano-T3、およびNano-T3およびホスホクレアチンの効果を示す。
図10は、T3がPLGAナノ粒子の外面に結合し、PCRがナノ粒子内に封入された、本開示のPLGAナノ粒子の形態の実施態様を示す。
図11Aは、心停止後一定の間隔にて観察されたブタ対象のBPMでの心拍数を示す。対照と比較した、T3-ナノ粒子、ホスホクレアチンを含むT3-ナノ粒子、およびエピネフリンで処置したブタ対象についての結果を示す。
図11Bは、心停止後一定の間隔にて観察されたブタ対象の左心室dP/dtmaxを示す。対照と比較した、T3-ナノ粒子、ホスホクレアチンを含むT3-ナノ粒子、およびエピネフリンで処置したブタ対象についての結果を示す。
図11Cは、心停止後一定の間隔にて観察されたブタ対象の循環cTnlを示す。対照と比較した、T3-ナノ粒子、ホスホクレアチンを含むT3-ナノ粒子、およびエピネフリンで処置したブタ対象についての結果を示す。
図12Aは、心停止後一定の間隔にて観察されたブタ対象の冠状静脈洞pHを示す。対照と比較した、T3-ナノ粒子、ホスホクレアチンを含むT3-ナノ粒子、およびエピネフリンで処置したブタ対象についての結果を示す。
図12Bは、心停止後一定の間隔にて観察されたブタ対象の冠状静脈洞pCO2を示す。対照と比較した、T3-ナノ粒子、ホスホクレアチンを含むT3-ナノ粒子、およびエピネフリンで処置したブタ対象についての結果を示す。
図13Aは、遊離T3と比較したBALB/Cマウスの脳におけるNano-T3のバイオアベイラビリティを示す。
図13Bは、遊離T3と比較したBALB/Cマウスの心臓および肺におけるNano-T3のバイオアベイラビリティを示す。
図14は、ATPレベルについての、低酸素下のラット褐色細胞腫（PC12）細胞およびT3誘導細胞（HS5）に対するT3、Nano-T3、およびエピネフリンの効果を示す。
図15は、トロポニンT放出レベルについての、低酸素下でのラット褐色細胞腫（PC12）細胞およびT3誘導細胞（HS5）に対するT3、Nano-T3、およびエピネフリンの効果を示す。
図16は、エピネフリンと比較した、心停止および蘇生後のブタの脳組織に対するNano-T3およびNano-T3/PCRの神経保護効果を示す。
図17は、ニューロン特異的エノラーゼの放出に対するNano-T3、Nano-T3/PCR、およびエピネフリンの効果を示す。
詳細な説明に記載する例および図は単なる例であり、クレームの解釈（construction）または解釈（interpretation）において特許請求の範囲を制限するために用いられるべきではない。
（組成物および関連する方法）
したがって、一態様において、本開示は、生体吸収性ポリマーにより封入または固定したT3およびホスホクレアチン（PCR）のナノ粒子を含む組成物（組成物1）を提供する。
例えば、組成物1は、以下の特性のいずれかをさらに有し得る：
1.1 ナノ粒子が、生分解性ポリマーへの共有結合によりコンジュゲートしたT3（例えば、L-T3）、および生分解性ポリマー内に封入したホスホクレアチン（PCR）を含む、組成物1。
1.2 ポリマーが、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）またはポリ乳酸（PLA）、例えば、D,L-乳酸とグリコール酸の共重合が50/50であるPLGAを含む、先行する組成物のいずれか。
1.3 ポリマーが、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）またはポリ乳酸（PLA）、例えば、短鎖ポリエチレングリコール（PEG、分子量100～2,000ダルトン）とコンジュゲートしていてもよい、D,L-乳酸とグリコール酸の共重合が50/50であるPLGAを含む、先行する組成物のいずれか。
1.4 T3ナノ粒子の平均直径が、約50～1000nm、例えば50～500nmである、先行する組成物のいずれか。
1.5 T3ナノ粒子の平均直径が、約100～300nm、例えば200nmである、先行する組成物のいずれか。
1.6 T3ナノ粒子のゼータ電位が、0～-20mVである、先行する組成物のいずれか。
1.7 T3ナノ粒子のゼータ電位が、0～+20mVである、先行する組成物のいずれか。
1.8 T3が、生体吸収性ポリマーと共有結合している、先行する組成物のいずれか。
1.9 ナノ粒子が、第2の薬理学的活性成分を含む、先行する組成物のいずれか。
1.10 PLGAの分子量範囲が、約5,000～50,000ダルトン、好ましくは6,000～8,000ダルトンである、先行する組成物のいずれか。
1.11 PLGAが、分子量範囲が5,000～20,000ダルトン、好ましくは6,000～8,000ダルトンであるPEGとコンジュゲートしている、先行する組成物のいずれか。
1.12 PLGAが、分子量範囲が約6,000～8,000ダルトンであるPEGとコンジュゲートしている、先行する組成物のいずれか。
1.13 T3が、ナノ粒子の構築のためにPLGAまたはPLGA-PEGと化学的にコンジュゲートしている、先行する組成物のいずれか。
1.14 組成物が、生理学的無菌媒体に分散している、先行する組成物のいずれか。
1.15 組成物が、生理食塩水またはデキストロースに分散している、先行する組成物のいずれか。
1.16 生分解性ポリマーが、キトサンを含む、先行する組成物のいずれか。
更なる態様において、本開示は、予防または処置を必要とする対象体に治療上有効量のトリヨードチロニン（T3）およびホスホクレアチン（PCR）を投与することを含む、アデノシン三リン酸（ATP）の欠乏を特徴とする疾患、障害または状態の予防または処置のための方法（方法1）を提供する。
1.1 疾患、障害または状態が、心血管障害、低酸素症に関連する障害、または低細胞エネルギーを特徴とする障害（例えば、ミトコンドリア機能障害を特徴とする障害またはATPシンターゼの機能不全を特徴とする障害）、神経変性障害、呼吸器障害、肥満、代謝障害、または糖尿病より選択される、方法1。
1.2 疾患、障害または状態が、心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症（例えば、冠状動脈アテローム性動脈硬化症）、虚血再灌流（I/R）傷害、高血圧（例えば、本態性高血圧、肺高血圧、続発性高血圧、孤立性収縮期高血圧、糖尿病に関連する高血圧、アテローム性動脈硬化症に関連する高血圧、腎血管性高血圧）、糖尿病、心肥大、心筋虚血、心筋梗塞、心停止、心筋症（例えば、小児心筋症）、心機能不全、心原性ショック、左心室過肉柱形成症候群、および心不全（例えば、急性心不全））である、先行する方法のいずれか。
1.3 疾患、障害または状態が、低酸素症に関連する障害（例えば、出血性ショック、臓器不全（例えば、ARDS、敗血症、敗血症性ショックまたは出血性ショックによる臓器不全）、臓器移植による低酸素症、腎不全（例えば、慢性腎不全）、脳浮腫、乳頭腫、脊髄損傷、脳卒中（例えば、虚血性脳卒中または出血性脳卒中）、虚血または虚血再灌流傷害、外傷性脳損傷（例えば、脳震盪）、脳低酸素症、脊髄損傷、浮腫（例えば、脳浮腫）、および貧血）である、先行する方法のいずれか。
1.4 疾患、障害または状態が、低細胞エネルギーを特徴とする障害（例えば、ミトコンドリア機能障害を特徴とする障害（例えば、ミトコンドリアミオパチー、例えば、カーンズ・セイア症候群；リー症候群；ミトコンドリアDNA枯渇症候群；ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソード（MELAS）；糖尿病および難聴；母性遺伝性の難聴および糖尿病；ミトコンドリア神経胃腸脳筋症；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん；ニューロパシー、運動失調、および網膜色素変性症（NARP）；ピアソン症候群）、ATPシンターゼの機能不全を特徴とする障害（例えば、頂端肥大型心筋症およびニューロパシー、運動失調、自閉症、シャルコー・マリー・トゥース症候群、脳症、脳偽萎縮を伴うてんかん、一時的な脱力、遺伝性痙性傍麻痺、家族性両側線条体壊死、レーベル遺伝性視神経症、海馬硬化を伴う内側側頭葉てんかん（MTLE-HS）、運動ニューロン症候群、周期性四肢麻痺、統合失調症、脊髄小脳失調症、ファロー四徴症）である、先行する方法のいずれか。
1.5 疾患、障害または状態が、神経変性障害（例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病）または細胞膜の再分極を特徴とする障害である、先行する方法のいずれか。
1.6 疾患、障害または状態が、呼吸器障害（例えば、気腫、急性肺損傷（ALI）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、呼吸停止および喘息）である、先行する方法のいずれか。
1.7 疾患、障害または状態が、糖尿病または糖尿病による障害（例えば、糖尿病性潰瘍、壊疽および糖尿病性網膜症）である、先行する方法のいずれか。
1.8 疾患、障害または状態が、代謝障害（例えば、メタボリック症候群）である、先行する方法のいずれか。
1.9 疾患、障害または状態が、肥満である、先行する方法のいずれか。
1.10 T3およびPCRが、ナノ粒子の形態で存在し、T3およびホスホクレアチン（PCR）が、生体吸収性ポリマーにより封入または固定されている、先行する方法のいずれか。
1.11 ナノ粒子が、生分解性ポリマーへの共有結合によりコンジュゲートしたT3（例えば、L-T3）、および生分解性ポリマー内に封入したホスホクレアチン（PCR）を含む、方法1.10。
1.12 ポリマーが、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）またはポリ乳酸（PLA）、例えば、D,L-乳酸とグリコール酸の共重合が50/50であるPLGAを含む、方法1.10～1.11のいずれか。
1.13 ポリマーが、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）またはポリ乳酸（PLA）、例えば、短鎖ポリエチレングリコール（PEG、分子量100～2,000ダルトン）とコンジュゲートしていてもよい、D,L-乳酸とグリコール酸の共重合が50/50であるPLGAを含む、方法1.10～1.12のいずれか。
1.14 T3ナノ粒子の平均直径が、約50～1000nm、例えば50～500nmである、方法1.10～1.13のいずれか。
1.15 T3ナノ粒子の平均直径が、約100～300nm、例えば200nmである、方法1.10～1.14のいずれか。
1.16 T3ナノ粒子のゼータ電位が、0～-20mVである、方法1.10～1.15のいずれか。
1.17 T3ナノ粒子のゼータ電位が、0～+20mVである、方法1.10～1.16のいずれか。
1.18 T3が、生体吸収性ポリマーと共有結合している、方法1.10～1.17のいずれか。
1.19 ナノ粒子が、第2の薬理学的活性成分を含む、方法1.10～1.18のいずれか。
1.20 PLGAの分子量範囲が、約5,000～50,000ダルトン、好ましくは6,000～8,000ダルトンである、方法1.10～1.19のいずれか。
1.21 PLGAが、分子量範囲が5,000～20,000ダルトン、好ましくは6,000～8,000ダルトンであるPEGとコンジュゲートしている、方法1.10～1.20のいずれか。
1.22 PLGAが、分子量範囲が約6,000～8,000ダルトンであるPEGとコンジュゲートしている、方法1.10～1.21のいずれか。
1.23 T3が、ナノ粒子の構築のためにPLGAまたはPLGA-PEGと化学的にコンジュゲートしている、方法1.10～1.22のいずれか。
1.24 組成物が、生理学的無菌媒体に分散している、方法1.10～1.23のいずれか。
1.25 組成物が、生理食塩水またはデキストロースに分散している、方法1.10～1.24のいずれか。
1.26 生分解性ポリマーが、キトサンを含む、方法1.10～1.25のいずれか。
1.27 T3およびPCRが、注射により投与される、先行する方法のいずれか。
1.28 T3およびPCRが、ボーラス注射により投与される、先行する方法のいずれか。
1.29 T3およびPCRが、点滴により投与される、先行する方法のいずれか。
1.30 T3およびPCRが、ボーラス注射とそれに続く点滴により投与される、先行する方法のいずれか。
1.31 T3およびPCRが、経口で投与される、先行する方法のいずれか。
1.32 対象体にが、ヒトである、先行する方法のいずれか。
1.33 T3およびPCRが、心肺蘇生法（CPR）および／または除細動と共に投与される、先行する方法のいずれか。
更なる態様において、本開示は、アポトーシスを防止、逆行または中断を必要とする対象体に治療上有効量のトリヨードチロニン（T3）およびホスホクレアチン（PCR）を投与することを含む、アポトーシスを防止、逆行または中断するための方法（方法2）を提供する。方法2の更なる実施態様は、組成物1以降のいずれかと組み合わせて提供される。
本明細書で用いるT3は、以下に示す、天然に存在する形態のトリヨードチロニンを指す：
Figure 2023500406000001
 T3は、フェニル環の4位から生じるヒドロキシル基が修飾されたトリヨードチロニンを指すためにも本明細書で用いる。例えば、本明細書で用いるT3は、結合基（例えば、フェニル部分のヒドロキシにあるC1-10アミン結合基）を有するトリヨードチロニンを指す。
例えば前記組成物1または1.1～1.16のいずれかの特徴を有する、T3ナノおよびホスホクレアチン（PCR）の粒子の有効量を含む組成物を用いる方法は、急性心機能不全を処置するために用いられ得る。処置し得る心臓状態の例は、心停止、心原性ショックおよび急性心不全を含む。
例えば、理論に拘束されるものではないが、T3-ナノ粒子とPCRの同時送達は、心筋細胞内のATPの通常のレベルを維持しながら、自発循環を回復させるために迅速に作用し得ると考えられる。
一実施態様において、粒子は、T3が遺伝子発現に影響を与えることを可能にする持続放出を提供する。別の実施態様において、T3は、生体吸収性ポリマーに共有結合しており、これは、ゲノム効果を低減し、インテグリン受容体に対する効果を増強する。
例えば前記組成物1または1.1～1.16のいずれかの特徴を有する、本発明のT3ナノ粒子は、心停止、例えば、心肺蘇生法除細動およびエピネフリン、または低酸素症に関連する疾患または障害、例えば、心筋低酸素症、脳卒中（例えば、虚血性脳卒中または出血性脳卒中）、外傷性脳損傷（例えば、脳震盪）、虚血（例えば、心筋虚血または網膜虚血）、出血性ショックまたは浮腫（例えば、脳浮腫）のための通常の標準的治療と組み合わせて、または補助的に投与され得る。それらは、心臓および神経機能を維持するために、心停止の直後に、そして所望により、その後に、例えば1～24時間後に投与され得る。
T3-ナノ粒子を合成する様々な方法が提供されている。例えば、単一のエマルションプロセスは、T3を封入するキトサン-PLGAナノ粒子を生成し得る。さらに別の例において、予め形成された生分解性ポリマーのゲル化/コンジュゲーションを含むプロセスは、1)架橋剤としてグルタルアルデヒドを含むおよび含まない、T3を封入するキトサンナノ粒子；または2)T3を封入するキトサン-PLGAナノ粒子を生成する。他の架橋剤を用い得る。
さらに別の例において、PLGAまたはPLGA-PEGナノ粒子の表面にT3を化学的に結合させることを含むプロセスは、1)T3を固定するPLGAナノ粒子、または2)T3を固定化するPLGA-PEGナノ粒子であって、さらにホスホクレアチン（PCr）などの活性化合物をナノシェル内に含むナノ粒子を生成する。
（本開示の組成物の製造方法）
一実施態様において、T3は、例えばフェニル部分上のヒドロキシを介して、生分解性ポリマーに共有結合している。このような組成物は、適切なリンカーを用いてフェノール性ヒドロキシが活性化され、アミノ部分が保護されている活性化T3を用いて形成し得る。例えば、一実施態様において、アミノ保護されたT3は、以下のスキーム1に示す合成を用いて形成される。
Figure 2023500406000002
その後、アミノ保護されたT3を、例えば、活性化リンカー基、例えば生体吸収性ポリマー上のアミン基に結合できる部分、例えばキトサン上のアミノ部分を用いることにより、例えばフェノール性ヒドロキシを介して、ナノ粒子に結合させる。
したがって、一実施態様において、本発明は、フェノール性ヒドロキシ基が、式[CH2-O-CH]-[CH2]n-で示されるエポキシド部分で置換され、アミノ保護された、活性化T3を提供する。例えば、本発明は、式1：
Figure 2023500406000003
 式1
［式中、nは、1から5より選択される整数であり、Rは、アミノ保護基、例えばブトキシカルボニル（BOC）である］
で示される化合物を提供する。
したがって、T3は、例えば式[CH2-O-CH]-[CH2]n-X（式中、n＝1～5、Xはハロゲン、例えば臭素である）で示されるエポキシアルキルを用いて、例えば図10に示す合成に従って、活性化され得る。その後、得られた化合物を、必要に応じて、選択的に脱保護して、例えば
Figure 2023500406000004
 のように、カルボキシ部分を放出して、フェノール性ヒドロキシ（ここではプロピレンオキシドで）が活性化され、アミノ保護（ここではBOCで）されたT3を得る。
その後、活性化されたT3を、生体吸収性ポリマーに結合させ、例えば、エポキシリンカー部分を有するT3およびアミノ保護基を、アミノ基を有する生体吸収性ポリマーと反応させ、次いで脱保護して、例えば図11に示す、T3と共有結合したナノ粒子を得る。この反応は、安定化剤、例えばポリビニルアルコール、例えばPVA1％w/vの存在下で、適切な溶媒、例えばジメチルスルホキシド、例えばDMSO（0.1％v/v）および酢酸（0.1％v/v）（溶媒は後で透析により除去する）中で、実施し得る。ナノ粒子に結合するT3部分の数は、反応条件と使用する反応物の量に基づき変化し得るが、これらの条件を一定に保つと、変化の分布は低くなる。典型的には、ナノ粒子は、20～200個のT3部分、例えばナノ粒子あたり約50個を含む。バッチ中のT3の量は、例えば、以下に記載するように、ろ過または遠心分離によりナノ粒子を分離し、秤量し、強塩基中でT3ナノ粒子を分解し、そしてHPLCにより測定することによりアッセイし得る。
別の実施態様において、T3は、フェニル部分のヒドロキシにてC1-10アミン結合基を介して生体吸収性ポリマーと共有結合している。プロセスは、一般的にスキーム2に従って進行する：
Figure 2023500406000005
第1の工程において、T3を無水メタノールに溶解させる。その後、塩化チオニルを加え、反応物を24時間還流させる。反応物を室温まで冷却し、メチル保護されたT3を、沈殿した白色粉末の形態で得て、メタノールおよびエーテルで洗浄する。
第2の工程において、メチル保護されたT3を無水メタノールに溶解させる。等量のトリエチルアミン（TEA）を溶液に加え、30分間撹拌する。その後、等量のクロロギ酸ベンジル（CBZ）を加え、室温にて6時間撹拌する。メタノールを除去し、生成物をジクロロメタン（DCM）で抽出し、酸性水、重炭酸塩および食塩水で洗浄する。
第3の工程において、アセトン中のCBZ保護されたT3、tert-ブチルオキシカルボニル（BOC）で保護された3-ブロモプロピルアミンおよび炭酸カリウム（5当量）の混合物を24時間加熱還流した。反応物をろ過し、濃縮し、次いで、粗製物をn-ヘキサンおよび酢酸エチル（9:1から7:3）を使用するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、最終生成物を得た。
T3がCBZ基のみで保護されるまで、BOC保護基を除去し、続いてメチル保護基が除去する。T3を、TEAおよびジメチルスルホキシド（DMSO）中でN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）で官能化されたPLGAと混合する。得られた生成物は、PLGAと共有結合したT3であり、CBZ保護基を除去する。
ナノ粒子の製造は、概して、本出願人自身の刊行物、米国特許出願公開第20110142947号、国際公開第2011/159899号および米国特許第13/704,526号に記載されており、それぞれの内容は、出典明示によりその全体として本明細書の一部とする。本明細書に記載するナノ粒子は、同様の手段により生成し得る。
理論に拘束されるものではないが、T3およびホスホクレアチンを含むナノ粒子は図10に示す形態をとると考えられる。簡単に言えば、適切な結合基（例えば、C1-10アミン結合基）を有するT3分子は、PLGAナノ粒子の外面に共有結合している。また、ホスホクレアチンは、PLGAナノ粒子内に封入されている。
一例において、T3ナノ粒子は、T3と以下の成分から作られる：
Figure 2023500406000006
 一例において、ナノ粒子は、およそ以下の量でこれらの成分を有する：
Figure 2023500406000007
ナノ粒子の含有量は、例えばDLS、TEM、NMR、HPLCおよびLC/MSを用いて、確認される。ナノ粒子製剤は、従来の手段、例えばろ過、ガンマ線を用いて、滅菌し得る。
上記の測定（すなわち粘度）は、当技術分野で知られている任意の手段により実施し得る。例えば、キトサン溶液の粘度は、ブルックフィールド型デジタル粘度計、例えばDV-11 + Proを用いて室温にて測定され得ることが企図される。別の例において、粘度は、ウベローデ型粘度計を用いて測定され得ることが企図される。このような例において、粘度計を粘性時計（visco-clock）に接続して、通過する溶液の時間を記録し得ることが企図される。
実施例1：虚血性傷害に対するT3とホスホクレアチンのナノ粒子の心血管保護効果
この試験は、低酸素媒介性心臓細胞傷害におけるT3、T3ナノ粒子、およびT3とホスホクレアチン（PCR）のナノ粒子のプラスの保護的役割、ならびに低酸素状態下での血管新生および神経保護に対するその効果を調査することを目的とした。血管新生に対するT3およびT3ナノ粒子＋PCRの効果を、CAMモデルで試験した。低酸素下でのT3の心臓保護効果を、PBS（対照）、遊離T3（3μM）、遊離PCR（30μM）、およびT3ナノ粒子＋PCRで処理した単離新生仔心筋細胞を用いて試験した。ミトコンドリア機能とサルコメアの完全性を、ATP-生物発光アッセイを用いて試験し、心臓トロポニンTレベルを、フローサイトメトリーを用いて試験した。低酸素下で誘導した神経細胞に対するT3ナノ粒子の効果もまた、試験した。最後に、Cy7色素でタグ付けしたT3およびT3ナノ粒子をマウスの尾静脈に注入して、生体内分布をリアルタイムでモニターした。
試験の結果を図1に示す。T3およびT3ナノ粒子は、対照群と比較して、CAMモデルにおける血管新生を増大させた（約3倍）。低酸素下では、心臓ATPの改善は、正常なトロポニンTレベルを維持しながら、T3ナノ粒子とPCRの組合せでのみ達成された（p＜0.001）。T3ナノ粒子は、神経保護マーカーであるPAX6およびDLX2をそれぞれ約60％と約40％の著しい増加を生じさせた。インビボでは、シアミン7シグナル強度が、投与後数分以内に主にマウスの脳および心臓で検出され、これは、PCRを含むT3ナノ粒子を含む組成物も予期せず血液脳関門を通過できたことを示している。
T3ナノ粒子は、細胞表面受容体αvβ3の活性化に作用し、細胞質に分布するが、核には分布しない。したがって、T3ナノ粒子＋PCRの組成物は、心臓虚血および蘇生における組織損傷の制御するための潜在的に新しい処置法を提供する。
実施例2：異なるナノ粒子ベースの合成およびサイズの比較
ナノ粒子について、いくつかの異なる潜在的なポリマーベースを製造した。T3を含むPLGAベースのナノ粒子を、200mgのPLGAおよび20mgのT3を1mLのDMSOに溶解させることにより製造した。溶液を、超音波処理下で40mLの1％PVAに滴下した。エマルションを凍結乾燥し、DMSOを除去した。その後、生成物を20mLのPBS中で再構成した。
同様の方法を実施して、T3およびPCRを含むPLGAベースナノ粒子を製造した。T3を含むPLGAベースのナノ粒子を、250mgのPLGAおよび25mgのT3を1mLのDMSOに溶解させることにより製造した。溶液を、超音波処理下で45mgのPCRを含む20mLの1％PVAの溶液に滴下した。その後、得られたエマルションを30mLの1％PVAに滴下する。エマルションを凍結乾燥し、25mLのPBS中で再構成した。
PLGA-PEGベースのナノ粒子もまた製造した。PLGA-PEGとT3の混合物を、PVAの1％溶液に滴下した。内容物を超音波処理および凍結乾燥して、PLGA-PEG-T3ナノ粒子を得る。所望により、PCRを、PVAの1％溶液中で凍結乾燥する前に、得られたエマルションに加えて、PCRを封入したPLGA-PEG-T3ナノ粒子を製造する。
各ベースの粒子サイズを、動的光散乱により測定した。結果を下記表1に要約する。
Figure 2023500406000008
 上記表に示すとおり、すべての形態のナノ粒子は同様の平均直径を示す。T3またはPCRを含まないPLGAナノ粒子は、179nmの直径を示し、これは、L-T3-ホスホクレアチン-PLGA（181nm）およびL-T3-PLGAナノ粒子（185nm）と同様であった。PLGA-PEGベースは、157nmでやや小さいが、同等の直径を示した。図2～5は、製造した各ベースの粒度分布を示す。
PLGAおよびPLGA-PEGベースナノ粒子の放出動態もまた試験した。PLGAナノ粒子は、PLGA-PEGベースナノ粒子と比較して、活性剤について優れた放出速度を有することが観察された。
実施例3：虚血性傷害に対する本開示のナノ粒子の心血管保護効果
低酸素媒介性心臓細胞傷害におけるT3とPCR両方を含むナノ粒子のプラスの保護的役割、ならびに低酸素状態下での血管新生および神経保護に対するその効果を調査するための試験を実施した。
血管新生に対するT3およびNano-T3＋Pcrの効果を、鶏胚漿尿膜（CAM）モデルで試験した。T3およびNano-T3は、対照群と比較して、CAMモデルにおける血管新生を増強することが観察された（約3倍）。結果を下記表2に要約する。
Figure 2023500406000009
T3およびT3ナノ粒子のいずれも、塩基性線維芽細胞増殖因子で処理した試料と比較して、極めて増強された血管新生を示した。T3単独は、bFGFと比較して観察された分岐点で37％の改善を示し、PLGAナノ粒子に結合したT3は、bFGFで処理した試料と比較して61％の改善を示した。
その後、低酸素下でのT3の心臓保護効果を、PBS（対照）、T3（1～3μM）、T3およびPCR（5μM）、T3ナノ粒子（1～3μM）、T3およびPCRナノ粒子（5μM）、およびエピネフリン（0.5μM）で処理した単離新生仔心筋細胞を用いて試験した。細胞を、4％酸素、5％CO2を含む低酸素インキュベーター中で37℃にて24時間培養した。インキュベート後、細胞を採取し、正常な状態のものと比較した。ミトコンドリア機能とサルコメアの完全性を、ATP-生物発光アッセイを用いて試験し、心臓トロポニンTレベルを、FITCとコンジュゲートしたトロポニンT抗体を添加した後、フローサイトメトリーを用いて試験した。
低酸素下では、心臓ATPの改善は、正常なトロポニンTレベルを維持しながら、NT3＋Pcrで達成された（p＜0.001）。下記表3に示すとおり、エピネフリンは、低酸素状態の細胞と同様の心筋細胞の収縮レベルを示し、一方、T3およびNano-T3で処理した試料は、正常な条件下での細胞のものに近い収縮レベルを示した。
Figure 2023500406000010
これらの結果は、一般に、ナノ粒子の形態のT3およびPCRで処理した後に観察されたATPおよびトロポニンのレベルで構成されている。図6は、T3およびPCRの処理が筋細胞のATPレベルに対して有する影響を示し、図7は、T3およびPCRがトロポニンレベルに対して有する影響を示す。いずれの場合においても、エピネフリンでの処理は、未処理の低酸素心筋細胞に近いATPおよびトロポニン放出レベルを示したが、T3ナノ粒子およびT3とPCRナノ粒子の両方での処理は、通常の酸素条件下での対照心筋細胞に近い結果を示した。T3およびNano-T3は、ほぼ近い結果であるが、Nano-T3がより優れた送達を有する。
低酸素下で誘導した神経細胞に対するT3ナノ粒子の効果もまた、試験した。結果を図8および9に要約する。結果は、Nano-T3およびNano-T3とPCRで処理したPC12神経細胞における、通常の酸素条件下の細胞と同様のATPレベルおよび乳酸デヒドロゲナーゼ放出レベルを示している。さらに、Nano-T3は、神経保護マーカーであるPAX6およびDLX2をそれぞれ約60％と約40％の著しい増加を生じさせることが観察された。
実施例4：心停止におけるトリヨードチロニンの新規ナノ粒子製剤の盲検化された無作為化ビヒクル対照前臨床試験
別の試験において、本発明者らは、ブタの心停止モデルにおいて細胞膜を介したシグナル伝達を延長するように設計したT3の2つのナノ粒子製剤の有効性を評価した。この試験では、ブタを7分間心停止させ、続いて、必要に応じて2分ごとに除細動を行いながら最大20分間手動CPRを受けた。CPR開始の2分後、動物を、静脈内ビヒクル（空のPLGAナノ粒子）、Nano-T3（T3と共有結合したナノ粒子；0.125mg/kg）、Nano-T3およびPCR（封入したPCRを含むT3と共有結合したナノ粒子；0.125mg/kg）、またはエピネフリン（0.015mg/kg）に盲検下で無作為に割り付けた（n＝10/群）。ROSC（補助なしの収縮期血圧が80mmHg超を1分間）を達成した動物では、更なる薬理学的サポートは、低血圧のための選択薬物の1回の追加投与に制限された。血行動態、左心室（LV）機能、血漿心臓トロポニンI（cTnI）および他のパラメーターを、ベースライン時およびROSC後最大4時間評価した。
ビヒクルと比較して、ROSC率は、Nano-T3、Nano-T3およびPCR、またはエピネフリンを投与された動物で高かった。ROSCの直後、Nano-T3で処置した動物は、エピネフリンで処置した動物と比較して、低い心拍数およびLV dP/dtmaxを示したが、ROSCの30～60分後には違いは見られなくなった（図11Aおよび11B参照）。薬物投与直後に採取した冠状静脈洞血液試料の分析は、エピネフリンではなく、Pro-Al 616およびPro-Al 617が、ROSC後の最初の5分以内にビヒクルと比較して冠状静脈洞pHおよびPCO2の著しい改善を生じることを示した（図12および13参照）。
生存期間は群間で同等であったが（Nano-T3：122±30分、Nano-T3およびPCR：119±22分、エピネフリン：116±26分）、エピネフリンは、2倍高い濃度のcTnIであり、これはより重度の筋細胞傷害（C）を示している。結果は、試験したナノ粒子が、ビヒクルよりも優れ、エピネフリンに匹敵するROSC率およびROSC後の生存を達成したことを示した。しかしながら、エピネフリンと比較してROSC後のcTnIレベルの著しい低下は、T3およびPCRを含むナノ粒子による蘇生が心停止のより好ましい臨床アウトカム転帰を引き起こし得ることを示唆している。更なる電子顕微鏡分析は、遊離T3単独と比較した、Nano-T3またはNano-T3/PCRの両方で処置した後の改善を示した。
実施例5：脳におけるNano-T3およびホスホクレアチンの神経保護効果
脳傷害バイオマーカーの定量および脳組織の組織病理学的評価を、S100カルシウム結合タンパク質B（S100B）、リン酸化ニューロフィラメント-H（pNF-H）、ニューロン-特異的エノラーゼ（NSE）およびクレアチンキナーゼ脳バンド（CK-BB）を含むヒト脳傷害バイオマーカーの循環濃度を定量するように設計された市販のアッセイを用いて実施する。アッセイは、実施例4の心停止モデルで試験される動物から収集した試料で使用するために選択される。
脳組織試料を、光学顕微鏡および電子顕微鏡を用いて分析する。すべての動物対象の前頭皮質、運動皮質、頭頂皮質、海馬のホルマリン固定組織試料の光学顕微鏡検査およびグルタルアルデヒド保存組織試料の電子顕微鏡検査。成功した神経保護効果は、ミトコンドリア構造の改善および／または損傷の減少を示す対象により実証される。
実施例6：虚血性傷害に対するNano-T3の神経保護効果
T3ナノ粒子（Nano-T3）の投与後の低酸素細胞に対する神経保護効果を評価するための試験を実施した。HS5細胞をT3（0.5μM）で処理して、神経新生を誘導し、その後フローサイトメトリーを用いてモニターした。T3誘導細胞およびPC12神経細胞を、T3（1～3μM）、Nano-T3（1～3μM）またはエピネフリン（0.5μM）で処理した。その後、細胞を低酸素下で24時間培養した。ATP生物発光およびLDH放出アッセイを用いた結果。
Cy7色素でタグ付けしたT3ナノ粒子をマウスの尾静脈に注入して、生体内分布をリアルタイムでモニターした。シアミン7シグナルを、励起/発光が最大波長750/776nmにてIVISを用いて検出した。IVIS画像を、注射の直前、注射の直後、注射の1時間後、注射の2時間後、注射の3時間後、注射の4時間後、および注射の24時間後にシアミン7シグナルを直接検出するために取得した。図13Aおよび13Bに示すように、Nano-T3は、脳、心臓または肺のいずれにおいてもほとんど検出されなかったT3および対照より有意に高いレベルで検出された。
図14に示すように、低酸素下（4％酸素、5％CO2、37℃で24時間）で、ATPレベルはNano-T3で処理した試料で約1.5倍に増加し（P＜0.001）、一方、エピネフリンで処理した試料でわずかに増加し、対照ではATPレベルは減少した。これに対応して、LDHレベルは、Nano-T3で処理した試料で約6分の1に減少したが（P＜0.001）、エピネフリンで処理した試料は増加を示した（図15）。これらの結果は、上記の実施例3で報告した結果と一致している。
フローサイトメトリーを用いてニューロン保護マーカー（PAX6およびDLX2）を検出するための試験もまた実施した。結果は、ニューロン誘導の48時間後、PAX6とDLX2は、対照と比較して増加したことを示した（P≦0.001）。7日目に、PAX6は有意な減少（対照より45％少ない）（**P≦0.001）を示したが、DLX2は有意な増加（90％）を示した（+P≦0.001）。しかしながら、Nano-T3で処理した細胞試料は、7日間のニューロン誘導後にPAX6およびDLX2の発現が約50％増加し（PAX6およびDLX2の発現がそれぞれ60％と40％）、これは神経保護効果を示している。
したがって、Nano-T3は、様々な神経転写因子の誘導によって、神経新生および細胞保護にプラスの影響を及ぼした。これらの結果は、Nano-T3が、上記の心臓保護および血管新生効果に加えて、脳虚血における組織損傷を制御するための潜在的に新しい治療経路であることを示唆する。
実施例7：低酸素ブタ脳組織の組織病理学的分析
低酸素傷害後の脳組織損傷に対するNano-T3およびT3とホスホクレアチンのナノ粒子（Nano-T3/PCR）の効果をブタで評価した。動物を7分間心停止させた。この後、動物をNano-T3、Nano-T3/PCRまたはエピネフリンのいずれかで蘇生した。脳組織の分析を、蘇生されて4時間生存した動物で実施した。正常なブタを対照として用いた。脳組織試料を、各動物の前頭皮質、尾状核、被殻、頭頂皮質および海馬から切除した。その後、切片をホルマリンおよびパラフィン中でスライドにセットし、Aperioスライドスキャナーで分析した。神経損傷を、虚血により損傷した細胞の数として定量した。結果を図16に要約する。
示されているように、Nano-T3（すなわち、図16で「616」とラベル付けされている）およびNano-T3/PCR（すなわち、図16で「617」とラベル付けされている）で処置した試料は、脳の各領域からのエピネフリンで処置した組織試料より虚血によって損傷した細胞が少ないことを示した。
実施例8：ニューロン特異的エノラーゼの放出に対するNano-T3およびNano-T3/PCRの効果
アッセイで用いた抗体がブタNSEと交差反応するため、SimpleStepヒトニューロン特異的エノラーゼELISAキット（Abcam ab217778）を用いて、ブタ血漿中のニューロン特異的エノラーゼ（NSE）の発現に対するNano-T3処置の効果を分析するための更なる試験を行った。
血液試料を、実施例7に記載するように、心停止および蘇生に供したブタから採取した。心停止の7分後、動物を、Nano-T3、Nano-T3/PCRまたはエピネフリンで蘇生した。ROSC後2時間にて、血液試料を、末梢静脈からEDTAを含むチューブに採取し、15分間遠心分離した。その後、血漿試料を、製造元の説明書に基づいてNSEアッセイに用いた。
結果を図17に要約する。示されているように、Nano-T3（すなわち、図17で「616」とラベル付けされている）およびNano-T3/PCR（すなわち、図17で「617」とラベル付けされている）で処置した試料は、循環NSEの有意な減少を示した。具体的には、エピネフリンで処置した試料は、ベースラインに対して64％のNDEの増加を示したが、Nano-T3およびNano-T3/PCRで処置した試料は、それぞれ15％および5％のみの増加を示した。
提供した例の別の組合せおよび変形は、本開示に基づいて明らかになるであろう。
説明した実施態様の多くの可能な組合せおよび変形のすべてについて特定の例を提供することは不可能であるが、そのような組合せおよび変形は、最終的に発行される請求項であり得る。

Claims (30)

  1. 生体吸収性ポリマーに封入または固定されたT3およびホスホクレアチン（PCR）のナノ粒子を含む組成物。
  2. ナノ粒子が、生分解性ポリマーへの共有結合によりコンジュゲートしたT3（例えば、L-T3）、および生分解性ポリマー内に封入したホスホクレアチン（PCR）を含む、請求項1に記載の組成物。
  3. ポリマーが、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）またはポリ乳酸（PLA）、例えば、D,L-乳酸とグリコール酸の共重合が50/50であるPLGAを含む、請求項1～2のいずれか一項に記載の組成物。
  4. ポリマーが、乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA）またはポリ乳酸（PLA）、例えば、短鎖ポリエチレングリコール（PEG、分子量100～2,000ダルトン）とコンジュゲートしていてもよい、D,L-乳酸とグリコール酸の共重合が50/50であるPLGAを含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の組成物。
  5. T3ナノ粒子の平均直径が、約50～1000nm、例えば50～500nmである、請求項1～4のいずれか一項に記載の組成物。
  6. T3ナノ粒子の平均直径が、約100～300nm、例えば200nmである、請求項1～5のいずれか一項に記載の組成物。
  7. T3ナノ粒子のゼータ電位が、0～-20mVである、請求項1～6のいずれか一項に記載の組成物。
  8. T3ナノ粒子のゼータ電位が、0～+20mVである、請求項1～7のいずれか一項に記載の組成物。
  9. T3が、生体吸収性ポリマーと共有結合している、請求項1～8のいずれか一項に記載の組成物。
  10. ナノ粒子が、第2の薬理学的活性成分を含む、請求項1～9のいずれか一項に記載の組成物。
  11. PLGAの分子量範囲が、約5,000～50,000ダルトン、好ましくは6,000～8,000ダルトンである、請求項1～10のいずれか一項に記載の組成物。
  12. PLGAが、分子量範囲が5,000～20,000ダルトン、好ましくは6,000～8,000ダルトンであるPEGとコンジュゲートしている、請求項1～11のいずれか一項に記載の組成物。
  13. PLGAが、分子量範囲が約6,000～8,000ダルトンであるPEGとコンジュゲートしている、請求項1～12のいずれか一項に記載の組成物。
  14. T3が、ナノ粒子の構築のためにPLGAまたはPLGA-PEGと化学的にコンジュゲートしている、請求項1～13のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 組成物が、生理学的無菌媒体に分散している、請求項1～14のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 組成物が、生理食塩水またはデキストロースに分散している、請求項1～15のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 生分解性ポリマーが、キトサンを含む、請求項1～16のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 予防または処置を必要とする対象体に治療上有効量のトリヨードチロニン（T3）およびホスホクレアチン（PCR）を投与することを含む、アデノシン三リン酸（ATP）の欠乏を特徴とする疾患、障害または状態の予防または処置のための方法。
  19. 疾患、障害または状態が、心血管障害、低酸素症に関連する障害、または低細胞エネルギーを特徴とする障害（例えば、ミトコンドリア機能障害を特徴とする障害またはATPシンターゼの機能不全を特徴とする障害）、神経変性障害、呼吸器障害、肥満、代謝障害、または糖尿病より選択される、請求項18に記載の方法。
  20. 疾患、障害または状態が、心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症（例えば、冠状動脈アテローム性動脈硬化症）、虚血再灌流（I/R）傷害、高血圧（例えば、本態性高血圧、肺高血圧、続発性高血圧、孤立性収縮期高血圧、糖尿病に関連する高血圧、アテローム性動脈硬化症に関連する高血圧、腎血管性高血圧）、糖尿病、心肥大、心筋虚血、心筋梗塞、心停止、心筋症（例えば、小児心筋症）、心機能不全、心原性ショック、左心室過肉柱形成症候群、および心不全（例えば、急性心不全））である、請求項18または19に記載の方法。
  21. 疾患、障害または状態が、低酸素症に関連する障害（例えば、出血性ショック、臓器不全（例えば、ARDS敗血症、敗血症性ショックまたは出血性ショックによる臓器不全）、臓器移植による低酸素症、腎不全（例えば、慢性腎不全）、脳浮腫、乳頭腫、脊髄損傷、脳卒中（例えば、虚血性脳卒中または出血性脳卒中）、虚血または虚血再灌流傷害、外傷性脳損傷（例えば、脳震盪）、脳低酸素症、脊髄損傷、浮腫（例えば、脳浮腫）、および貧血）である、請求項22または23に記載の方法。
  22. 疾患、障害または状態が、低細胞エネルギーを特徴とする障害（例えば、ミトコンドリア機能障害を特徴とする障害（例えば、ミトコンドリアミオパチー、例えば、カーンズ・セイア症候群；リー症候群；ミトコンドリアDNA枯渇症候群；ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様エピソード（MELAS）；糖尿病および難聴；母性遺伝性の難聴および糖尿病；ミトコンドリア神経胃腸脳筋症；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん；ニューロパシー、運動失調、および網膜色素変性症（NARP）；ピアソン症候群）、ATPシンターゼの機能不全を特徴とする障害（例えば、頂端肥大型心筋症およびニューロパシー、運動失調、自閉症、シャルコー・マリー・トゥース症候群、脳症、脳偽萎縮を伴うてんかん、一時的な脱力、遺伝性痙性傍麻痺、家族性両側線条体壊死、レーベル遺伝性視神経症、海馬硬化を伴う内側側頭葉てんかん（MTLE-HS）、運動ニューロン症候群、周期性四肢麻痺、統合失調症、脊髄小脳失調症、ファロー四徴症）である、請求項18または19に記載の方法。
  23. 疾患、障害または状態が、神経変性障害（例えば、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病）または細胞膜の再分極を特徴とする障害である、請求項18または19に記載の方法。
  24. 疾患、障害または状態が、呼吸器障害（例えば、気腫、急性肺損傷（ALI）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、呼吸停止および喘息）である、請求項18または19に記載の方法。
  25. 疾患、障害または状態が、糖尿病または糖尿病による障害（例えば、糖尿病性潰瘍、壊疽および糖尿病性網膜症）である、請求項18または19に記載の方法。
  26. 疾患、障害または状態が、代謝障害（例えば、メタボリック症候群）である、請求項18または19に記載の方法。
  27. 疾患、障害または状態が、肥満である、請求項18または19に記載の方法。
  28. トリヨードチロニン（T3）およびホスホクレアチン（PCR）が、請求項1～17のいずれか一項に記載の組成物の形態である、請求項18～27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 防止、方向転換または中断を必要とする対象体に治療上有効量のトリヨードチロニン（T3）およびホスホクレアチン（PCR）を投与することを含む、アポトーシスを防止、方向転換または中断するための方法。
  30. トリヨードチロニン（T3）およびホスホクレアチン（PCR）が、請求項1～17のいずれか一項に記載の組成物の形態である、請求項29に記載の方法。
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