CH701350A1

CH701350A1 - Metodo per il trattamento dell'arterosclerosi.

Info

Publication number: CH701350A1
Application number: CH00984/09A
Authority: CH
Inventors: Giovanni Rodighiero
Original assignee: Artcell Invest Ltd
Priority date: 2009-06-24
Filing date: 2009-06-24
Publication date: 2010-12-31
Also published as: US20120093797A1; EP2445505B1; EP2445505A1; WO2010150079A1

Abstract

Viene descritto un metodo per ottenere un efflusso di trigliceridi, lipoproteine e colesterolo dalla placca aterosclerotica presente nell’endotelio di una qualsiasi arteria che prevede la somministrazione di creatina fosfato (CP) e creatinafosfochinasi (CPK) esogeni.

Description

CAMPO DELL’ INVENZIONE

[0001] La presente invenzione descrive un’innovativa tecnica per il trattamento dell’arterosclerosi e segnatamente, una nuova tecnica per la risoluzione della placca arteriosclerotica nelle arterie. Il trattamento oggetto della presente domanda di brevetto prevede la somministrazione di creatina fosfato (CP) e creatina fosfochinasi (CPK) in associazione tra loro, avendo questi due principi attivi effetto sinergico. Detti agenti terapeutici sono capaci di causare l’efflusso delle lipoproteine dalla placca stessa. La dimensione e lo spessore della placca sono quindi ridotti e/o persino eliminati.

STATO DELL’ARTE

[0002] L’esatta natura dell’aterosclerosi, è tutt’ora causa di numerosi dibattiti ed il sottostante meccanismo d’azione non è ancora ben noto. Malgrado sia una patologia estremamente diffusa, molteplici aspetti dell’aterosclerosi non sono ad oggi conosciuti dettagliatamente ed esistono solo delle ipotesi. È comunque assodato che la formazione dell’ateroma è una risposta all’infiammazione cronica dovuta all’accumulo di lipoproteine derivate dal plasma sui siti arteriosi selezionati, ovvero in prossimità della lesione della parete arteriosa, con la conseguente formazione di placche ateromatose e possibili complicanze circolatorie. I macrofagi, presenti nelle lesioni aterosclerotiche, fagocitano le lipoproteine plasma-derivate accumulandosi nella lesione, dando così vita ad un deposito schiumoso (cellule macrofagiche schiumose). Molte di queste cellule sono inoltre degenerate o morte. Le cellule schiumose si aggregano sulla lesione arteriosa iniziale e formano strie di grasso di colore giallo. Come risulta dall’accumulo di lipoproteine, la lesione della parete arteriosa evolve dall’iniziale stria grassa ad una più complessa e voluminosa placca fibrograssa o ateromatosa. Detta placca consiste di un nucleo centrale ateromatoso ricco di lipidi (ateroma) rivestito da un denso strato fibrocellulare con depositi di calcio. La placca aterosclerotica ostacola e talvolta arresta il flusso sanguigno arterioso. La placca causa un indurimento circoscritto della parete del vaso e una volta formatasi, tende ad accrescersi all’interno del vaso stesso, restringendone progressivamente il calibro. La placca è inoltre assai pericolosa poiché, qualora si rompesse, i suoi frammenti trasportati dal sangue embolizzano, rischiando di otturare i vasi di diametro minore.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

[0003] È noto che le lipoproteine ricche di trigliceridi sono associate all’insorgenza ed allo sviluppo dell’arteriosclerosi. La presente domanda di brevetto intende descrivere un’innovativa tecnica che grazie a determinate reazioni biochimiche, assicuri la possibilità di determinare l’efflusso di dette lipoproteine dalla placca arteriosa, giungendo alla risoluzione della lesione aterosclerotica stessa. Indipendentemente che questa si trovi allo stadio iniziale o finale della sua formazione. Il CP ed il CPK sono due molecole energetiche e possono fornire l’energia necessaria per l’attivazione degli enzimi della placca aterosclerotica mettendo in moto le attività biochimiche della placca stessa, con immediati e benefici effetti lipolitici sulle lipoproteine ricche di trigliceridi e rilasciare il colesterolo. Purtroppo, l’uomo non ha ancora una conoscenza completa della medicina e sia il meccanismo che la fisiopatologia di diverse malattie non sono ancora ben note ed in molti casi, si lavora sulla base di semplici ipotesi: L’aterosclerosi, pur essendo una patologia estremamente diffusa, è una di queste malattie. Cosa succeda nella placca aterosclerotica, da un punto di vista strettamente metabolico, non è ancora ben conosciuto.

Abbreviazioni utilizzate:

[0004] <tb>TC<sep>colesterolo totale <tb>HDL<sep>lipoproteine ad alta densità colesterolo <tb>LDL<sep>lipoproteine a bassa densità colesterolo <tb>VLDL<sep>lipoproteine a molto bassa densità colesterolo <tb>TG<sep>trigliceridi <tb>CP<sep>creatina fosfato <tb>CPK-MM<sep>creatinafosfatochinasi muscolare umana

[0005] 1 tassi ematici delle lipoproteine ricche di trigliceridi (VLDL e chilomicroni), sono associate alla progressione dell’aterosclerosi indipendentemente dai livelli di colesterolo HDL presenti nel sangue. Le lipoproteine ricche di trigliceridi in generale ed in particolare le VLDL, sono state identificate all’interno di placche provenienti dall’aterosclerosi della specie umana (1). Il meccanismo di sviluppo dell’aterosclerosi partendo da elevati livelli plasmatici di lipoproteine ricche di trigliceridi coinvolge certamente il trasferimento di queste lipoproteine dal distretto circolatorio, ovvero dal plasma, nell’intima dell’arteria (2-3). Le lipoproteine plasmatiche possono attraversare la barriera endoteliale ed entrare nella parete arteriosa. A questo punto possono essere fagocitate direttamente dai macrofagi per produrre cellule schiumose ricche di lipidi, il tipo di cellula chiave della placca aterosclerotica iniziale ed a causa del loro massiccio accumulo, promuovono la formazione dell’aterosclerosi (4). La presente domanda di brevetto intende descrive una nuova tecnica per intervenire sulla placca basandosi sull’addizione di CP e CPK. La somministrazione sinergica di queste due molecole causa l’efflusso di trigliceridi e lipoproteine dalla placca aterosclerotica stessa causandone la risoluzione ed evitando quindi l’insorgenza e l’aggravarsi dell’aterosclerosi.

TEST EFFETTUATI

Esempio 1

[0006] Per giungere all’inventiva tecnica di trattamento della placca aterosclerotica oggetto della presente invenzione, sono stati eseguiti numerosi test clinici ed effettuati accurati studi sperimentali.

[0007] Per effettuare queste ricerche sono state utilizzate placche aterosclerotiche rimosse dalle carotidi interne di pazienti sottoposti ad endoarterectomia causata da stenosi carotidea dovuta alla placca. Una singola placca è stata lavata e quindi incubata per dieci ore in una soluzione di Tirode (200 ml) a 37°C facendola gorgogliare con il 95% di 0 addizionato dal 5% di CO. Il CP è addizionato per un ora (200 mg inizialmente, quindi 100 mg ogni sei minuti per un totale di 1200 mg) Negli intervalli sono addizionati 40 Ul di CPK-MM. Vengono misurate le concentrazioni di TG, HDL, LDL, TC nel mezzo. Si manifesta un rapido e massiccio efflusso di TG dalla placca nel mezzo nella prima ora e quindi solo un lieve incremento con solo tracce di colesterolo.

Considerazioni

[0008] Detto efflusso dalla placca al mezzo è rapido e causato dall’effetto del CP e del CPK sulla placca stessa. L’efflusso spontaneo di TG e lipoproteine dalla placca richiede invece alcuni giorni e questo è a sua volta più veloce dell’efflusso di colesterolo. Nei tessuti ischemici è stato osservato un marcato decremento delPATP e del CP dovuto ad ischemia e ipossia: nell’aterosclerosi è dimostrata l’esistenza di ischemia ed ipossia intraplacca. Analogamente, sia il contenuto di ATP che di CP nella placca, risulta basso. L’utilizzo di CP e CPK esogeno può riawiare le attività biochimiche nella placca stessa. La somministrazione di detti agenti a pazienti aterosclerotici può determinare l’efflusso di lipoproteine dalla placca riducendo la dimensione e lo spessore di detta placca.

Esempio 2

[0009] Utilizziamo placche aterosclerotiche della carotide interna rimosse da 8 pazienti sottoposti ad endoerectomia causata da stenosi carotidea interna dovuta alla placca (stenosi 80-90%). La placca ottenuta immediatamente dopo l’intervento chirurgico viene posta in una soluzione di Tirode fredda quindi è trattata, da mezzora ad un ora, dopo la rimozione avvenuta con l’intervento chirurgico. Le placche sono lavate e poste in soluzione di Tirode (200ml) ed incubate per dieci ore a 37°C facendole gorgogliare con il 95% di Ossigeno con il 5% di CO. Il CP ed il CPK-MM proveniente dal muscolo scheletrico umano (acquistato da Calbiochem), sono addizionati alla soluzione. Il CP è addizionato iniziando con 200 mg e quindi aggiungendo 100 mg ogni 6 minuti per 1 ora (totale 1200 mg): negli intervalli sono aggiunti 40 Ul di CPK-MM. Le concentrazioni nel mezzo di TG, HDL, LDL, TC vengono misurate con l’utilizzo del metodo enzimatico Hitachi (Roche diagnostic, Mannheim) sia a zero ore che ad 1 ora, 2 ore, 4 ore, 6 ore, 8 ore, 10 ore, dopo l’addizione di CPK e CP. Il limite inferiore di sensibilità (sensibilità analitica) di detto metodo enzimatico è di 3 mg/dl: concentrazioni inferiori a 3 mg/dl non sono rilevabili. La semi vita del CPK-MM è di circa 12 ore, ma l’attività enzimatica è presente per più di 23 ore con valori decrescenti (5). CPK-BB, presente nel cervello, è instabile nel plasma umano perdendo rapidamente la sua attività che si riduce del 50% in approssimativamente 15 minuti. La semi vita del CP è di 4-7 minuti con susseguente decremento di valore fino a 250 minuti (6). Le lesioni aterosclerotiche sono di tipo avanzato (tipo V) (7).

Considerazioni

[0010] L’addizione di CPK e CP alla soluzione hanno determinato un notevole efflusso di trigliceridi dalla placca nel mezzo con solo tracce di colesterolo. I valori di HDL, LDL e TC sono irrilevabili poiché inferiori a 3 mg/ml. Per esaminare il tempo d’azione del CPK e del CP i livelli di lipoproteine vengono misurati per un periodo di 10 ore. Detto efflusso di TG avviene molto rapidamente nella prima ora; Dopo ciò, avviene solo un piccolo incremento (Tabella 1). Detto rapido e grande efflusso di TG è dovuto all’aggiunta di CPK e CP. Normalmente l’efflusso spontaneo di TG e lipoproteine dai macrofagi (cellule schiumose) richiede alcuni giorni ed è comunque molto più rapido dell’efflusso di colesterolo (8-9-10). L’esame istologico delle lesioni rileva un tessuto connettivo denso di ialina con estese calcificazioni ma solo rare deposizioni lipidiche. Tutti i dati rilevati sono stati schematicamente riassunti nella sottostante Tabella 1.

TABELLA 1 Rilevamenti clinici e lipoproteine

[0011] <tb>PAZIENTE<sep>SESSO<sep>ETÀ’<sep><sep><sep>TG<sep>mg/m<sep>I<sep><sep> <tb><sep><sep><sep>0°h<sep>1°h<sep>2°h<sep>4°h<sep>6°h<sep>8°h<sep>10°h <tb>1<sep>M<sep>74<sep>0<sep>216<sep>218<sep>220<sep>221<sep>223<sep>224 <tb>2<sep>M<sep>76<sep>0<sep>179<sep>182<sep>183<sep>185<sep>186<sep>188 <tb>3<sep>M<sep>70<sep>0<sep>176<sep>181<sep>183<sep>185<sep>185<sep>186 <tb>4<sep>F<sep>79<sep>0<sep>208<sep>210<sep>211<sep>212<sep>212<sep>213 <tb>5<sep>M<sep>79<sep>0<sep>198<sep>197<sep>200<sep>203<sep>204<sep>205 <tb>6<sep>F<sep>78<sep>0<sep>501<sep>503<sep>504<sep>505<sep>508<sep>509 <tb>7<sep>M<sep>78<sep>0<sep>510<sep>508<sep>507<sep>512<sep>517<sep>520 <tb>8<sep>M<sep>69<sep>0<sep>254<sep>235<sep>232<sep>238<sep>240<sep>242 <tb>8<sep><sep>75<sep>0<sep>280<sep>279<sep>280<sep>282<sep>284<sep>285

[0012] Come evidenziato dai dati esposti nella Tabella 1, gli effetti del CPK e CP sulla placca sono immediatamente visibili e determinano un notevole efflusso di trigliceridi dalla placca al mezzo. Il CP preferibile per raggiungere lo scopo della presente invenzione, è il fosfato esogeno ad alta energia utilizzato anziché l’ATP, che è un composto chimicamente instabile rapidamente idrolizzato dalle ATPasi extracellulari. In aggiunta, alte concentrazioni di CP possono essere assunte, senza causare un diretto effetto inotropo negativo, effetto che sfortunatamente, è caratteristico delle alte concentrazioni di ATP (11). Sia il CP che l’ATP possono attraversare la membrana cellulare (12-13). La funzione del CP nello stoccaggio dell’energia è fondamentale essendo capace di formare l’ATP attraverso l’azione del CPK: l’ATP può essere convertito in cAMP attraverso l’azione dell’ enzima adenilciclasi (14). L’ATP è presente ovunque nel citoplasma e nel nucleoplasma delle cellule e fondamentalmente tutti i meccanismi fisiologici del nostro organismo che richiedono energia, la ottengono dall’ATP, che può essere utilizzato come fonte energetica per quasi tutte le funzioni cellulari. L’cAMP ha una moltitudine di effetti dentro le cellule attivando una cascata di enzimi e innescando reazioni biochimiche (15). Come rilevato nei test eseguiti e sopra descritti, nei tessuti ischemici è stato osservato un marcato decremento dell’ATP, del CP e dell’attività enzimatica come risultato dell’ischemia e dell’ipossia (16-19). Numerosi autori hanno dimostrato l’esistenza nell’aterosclerosi di ischemia, ipossia e scarsa attività enzimatica intraplacchica (20-23). È per questo che nella placca il contenuto di ATP e CP è molto basso. L’utilizzo di CP e CPK esogeno può fornire l’energia necessaria per riattivare gli enzimi della placca e mettere in moto le attività biochimiche della placca stessa ed incrementare così i livelli di cAMP. I Macrofagi hanno una molteplicità di funzioni e di enzimi (24). Solo recentemente è emerso il ruolo dei macrofagi quali maggiori cellule dotate di attività secretice. Molti dei prodotti secreti dai macrofagi, inclusi gli enzimi, sono secreti in quantitativi significanti solo dopo un appropriata attivazione. I macrofagi hanno numerosi enzimi coinvolti nell’aterosclerosi: acil Coa: colesterolo aciltransferasi (ACAT) (10), colesterolo esterasi neutra (25), ossidasi (26), lipoprotein lipasi (27). Tutti questi enzimi sono attivati dall’ATP. I macrofagi possono secernere, inoltre, enzimi proteolitici, come la collagenasi e l’elastasi. Le placche aterosclerotiche contengono un nucleo ateromatoso molle che è instabile ed è soggetto a rompersi. Solitamente la rottura avviene dove la capsula fibrosa è sottile, alla giunzione tra la placca e la parete vasale meno malata adiacente e infiltrata dalle cellule schiumose (4, 10) La rottura della placca dipende da numerosi fattori. Uno di questi fattori, sono gli enzimi proteolitici secreti dai macrofagi. Questi possono infatti rapidamente degradare i componenti della matrice extracellulare e possono indebolire la capsula fibrosa predisponendola alla rottura. L’eccesso di colesterolo nei macrofagi viene esterificato e convertito in estere del colesterolo da ACAT (10). L’estere del colesterolo accumulatosi nel citoplasma dei macrofagi è soggetto ad idrolizzarsi per la colesterol esterasi neutra. Le cellule schiumose macrofagee contengono la colesterol esterasi neutra che idrolizza il colesterol estere con rilascio ed efflusso di colesterolo libero che può essere rimosso dalla cellula in presenza di un accettore nel mezzo (25). Il cAMP stimola la fosforilazione della colesterolo esterasi per azione di una protein chinasi cAMP dipendente: l’addizione del cAMP esogeno e dell’ATP ai macrofagi ha dato un grande incremento (60%) della colesterol esterasi neutra. La somministrazione di CPK e CP esogeno incrementa notevolmente il livello di cAMP. Le LDL possono essere ossidate dalle macrofago ossigenasi (26). Il ruolo delle LDL ossidate è controverso. La lipoproteina lipasi è l’enzima di maggiore importanza nel metabolismo delle lipoproteine ricche di trigliceridi. I macrofagi sintetizzano e secernono nel mezzo la lipoproteina lipasi (27) e sono capaci di agire sulle lipoproteine ricche di trigliceridi attraverso l’azione della lipoproteina lipasi, in maniera da mobilizzare molto rapidamente i trigliceridi accumulati con il loro conseguente eflusso: la mobilizzazione è pertanto massiva e rapida. Ciò permette ai macrofagi di essere relativamente ricchi di esteri del colesterolo: la lipoproteina lipasi non agisce infatti sugli esteri del colesterolo. Usando solo una dieta a basso tenore di grasso, si nota un primo rapido decremento dei trigliceridi dalle lipoproteine ricche di trigliceridi e quindi un rilascio del contenuto delle lipoproteine (alcuni giorni), ma tutto il processo di lipolisi richiede più tempo. I trigliceridi infatti sono rilasciati per primi e successivamente avviene il rilascio del contenuto lipoproteico (8-10). Nella tecnica descritta nella presente domanda di brevetto, c’è solo efflusso di trigliceridi perché reflusso avviene molto rapidamente grazie all’addizione di CPK e CP ed inoltre la placca è stata trattata una sola volta. Bisogna però ricordare che tutti i processi di lipolisi richiedono più tempo e ripetute somministrazioni di CPK e CP in vivo per dare i migliori risultati con una completa lipolisi.

Somministrazione

[0013] Il CPK ed il CP esogeno secondo la presente domanda di brevetto, possono essere somministrati a pazienti con aterosclerosi per ridurre efficacemente le placche aterosclerotiche e le stenosi arteriose. La somministrazione deve proseguire per alcuni giorni poiché i macrofagi possono mobilizzare i trigliceridi e le lipoproteine assai più rapidamente che il colesterolo libero ed esterificato. Il colesterolo escreto dovrebbe essere legato ad un accettare posto nel mezzo, come le HDL, per essere rimosso dalla placca. Una infusione intravenosa lenta e continua di una soluzione fisiologica con CP, 5 gr, sciolti in questa possono essere dati per 1 ora: durante l’infusione una singola iniezione intravenosa (bolus) di CPK (liquido), 200UI, deve essere somministrato. Preferibilmente potrebbe essere somministrato CPK ricombinante, per evitare la possibilità di reazioni allergiche. Il dosaggio di CPK e CP, naturalmente, dipendono dai risultati ottenuti e possono variare.

[0014] L’utilizzo del CPK e del CP esogeno può dare l’energia necessaria per attivare gli enzimi della placca e mettere in moto le attività biochimiche della placca stessa. Ribadiamo che inizialmente vi è unicamente efflusso di trigliceridi perché l’efflusso è avvenuto molto rapidamente a causa dell’addizione di CP e CPK. Infatti i macrofagi mobilizzano i trigliceridi rapidamente, molto più rapidamente che il colesterolo libero ed esterificato (8-9). L’efflusso di colesterolo dalla placca richiede un tempo molto più lungo (10). Il CP ed il CPK devono quindi essere somministrati ai pazienti con l’aterosclerosi per ridurre le placche aterosclerotiche e le stenosi delle artera e la somministrazione di questi princìpi attivi deve durare alcuni giorni, preferibilmente due volte al giorno. Il CP deve essere somministrato per infusione intravenosa e solo dopo aver iniziato la somministrazione di CP il CPK deve essere addizionato. Il colesterolo escreto, dovrebbe essere legato ad un accettare nel mezzo, come l’HDL, per essere rimosso più efficacemente dalla placca.

Claims

1. Metodo per ottenere un efflusso di trigliceridi, lipoproteine e colesterolo dalla placca aterosclerotica presente nell’endotelio di una qualsiasi arteria caratterizzato dal fatto di prevedere la somministrazione di creatina fosfato (CP) e creatinafosfochinasi (CPK) esogeni.

2. Metodo secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che la somministrazione di creatina fosfato (CP) è da 200 a 2000 mg, preferibilmente da 500 a 1500 mg, ancora più preferibilmente da 1000 a 1300 mg.

3. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui la somministrazione di creatinafosfatochinasi (CPK) è da 30 a 300 Ul.

4. Metodo secondo le precedenti rivendicazioni in cui la somministrazione di creatina fosfato (CP) e creatinafosfochinasi (CPK) è eseguita per via endovenosa.

5. Metodo secondo le precedenti rivendicazioni in cui la creatina fosfato (CP) è somministrata diluita in una comune soluzione fisiologica per fleboclisi.

6. Metodo secondo le precedenti rivendicazioni in cui la creatinafosfochinasi (CPK) somministrata è creatinafosfochinasi (CPK) ricombinante, preferibilmente.

7. Metodo secondo la rivendicazione 6 in cui l’accettore del colesterolo è una lipoproteina ematica HDL, preferibilmente.

8. Metodo secondo le precedenti rivendicazioni in cui la creatina fosfato (CP) è somministrata prima della somministrazione della creatinafosfochinasi (CPK).

9. Metodo secondo le precedenti rivendicazioni in cui la somministrazione di creatina fosfato (CP) e creatinafosfochinasi (CPK) è ripetuta per più giorni.

10. Metodo secondo le precedenti rivendicazioni in cui la somministrazione di creatina fosfato (CP) e creatinafosfochinasi (CPK) è ripetuta più volte nel tempo e più volte nello stesso giorno.