JP2023123506A - 障害の処置のための細菌 - Google Patents
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Abstract
Description
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能性がある。新生児で未処置の場合、PKUは不可逆的な脳損傷を引き起こす可能性がある。PKUの処置は現在、食事からフェニルアラニンを完全に排除することを含む。タンパク質のほとんどの天然源は、必須アミノ酸であり成長に必要なフェニルアラニンを含有する。これは、PKUの患者が、成長のためにちょうど十分なフェニルアラニンを供給するアミノ酸サプリメントとともに、医療食品とpheフリータンパク質サプリメントに依存していることを意味する。この食事療法は患者にとっては困難であり、生活の質に影響を与える。
を提供する。フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)酵素は、フェニルアラニンを無毒なレベルのアンモニアおよびトランス-ケイ皮酸(transcinnamic acid)に代謝することができる。PAHとは異なり、PALはフェニルアラニンを代謝するためにTHB補因子活性を必要としない。L-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)は、フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化を触媒して、フェニルピルビン酸、ならびに微量のアンモニアおよび過酸化水素を生成する。フェニルピルビン酸(PPA)は、医薬品、食品、および化学工業において広範に使用されており、PPAは、多くのキラル薬および食品添加物の製造における原料中間体であるD-フェニルアラニンを合成するための出発物質である。したがって、LAADは工業的PPA生産の観点から研究されている(Houら、2015年、Appl Microbiol Biotechnol.2015年10月;99(20):8391~402頁;「Production of phenylpyruvic acid from L-phenylalanine using an L-amino acid deaminase from Proteus mirabilis:comparison of enzymatic and whole-cell biotransformation approaches」)。フェニルピルビン酸は、血液脳関門を横切ることができず(Steele、Fed Proc.1986年6月;45(7):2060~4頁;「Blood-brain barrier transport of the alpha-keto acid
analogs of amino acids.」、この変換はPKUの神経学的表現型を制御する際に有用であることを示している。
vitroで安定に維持される。特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニンの取り込みを増加させるためのフェニルアラニントランスポーター遺伝子をさらに含む。本発明は、遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物、ならびに高フェニルアラニン血症に関連する障害をモジュレートおよび処置する方法も提供する。
る分子または代謝産物の存在下で、あるいは消化管または腫瘍微小環境に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、任意の1つ以上のエフェクター分子を発現することができる。いくつかの実施形態では、任意の1つ以上の回路が1つ以上のプラスミド(例えば、高コピーまたは低コピー)上に存在するか、または細菌染色体中の1つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、のうちの1つ以上をさらに含む:(1)当技術分野で公知であり、本明細書で提供される任意の栄養要求性(例えば、thyAまたはdapB栄養要求性)などの1つ以上の栄養要求性、(2)本明細書に記載されているか、または当技術分野で公知の死滅スイッチのいずれかなどの1つ以上の死滅スイッチ回路、(3)1つ以上の抗生物質耐性回路、(4)本明細書に記載されているか、または当技術分野で公知のトランスポーターのいずれかなどの生物学的分子または基質を取り込むための1つ以上のトランスポーター、(5)本明細書に記載されていて、そうでなければ当技術分野で公知の分泌回路のいずれかなどの1つ以上の分泌回路、および(6)そのような追加回路の1つ以上の組み合わせ。細菌の組成物、ならびに1つ以上の疾患もしくは障害の処置、予防または管理のための方法も提供される。
産生のための1つ以上の遺伝子を含むように、さらに遺伝子改変される。障害の処置のための新規な治療におけるこれらの遺伝子操作された細菌の生産および使用のための方法が提供される。
genomics: what have we learned so far?;
Mol Microbiol. 2003年7月;49(2):277-300頁;Osawaら, Genotypic variations of Shiga toxin-converting phages from enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 isolates; J Med Microbiol (2001年) 49: 565-574頁、およびSchicklmaierら, A comparative study on the frequency of prophages among natural isolates of Salmonella and Escherichia coli with emphasis on generalized transducers. Antonie Van Leeuwenhoek (1998年) 73:
49-54頁)。
complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res (2001年) 11: 731-753頁)。
はバクテリオシンを含む、宿主に有利な機能を提供することができる多くの遺伝子を含み、これらは、例えば他の隣接する細菌種の増殖抑制を通じて、栄養素の競争に役立つ可能性がある。
& Kudmar, R. λ Lysogens of E. coli reproduce more rapidly than non-lysogens. Nature 255, 735-737頁(1975年);Wang, X., Kim,
Y. & Wood, T. K. Control and benefits of CP4-57 prophage excision in Escherichia coli biofilms. ISME J. 3, 1164-1179頁(2009年))。別の研究では、λが大腸菌ゲノムに組み込まれると、貧弱な炭素源で増殖する細胞の能力が停止することが示された。この場合、代謝の制限は、細菌に生存利益を付与し得る。グルコースが乏しい環境で細菌の増殖を遅らせることは、細菌が免疫系による検出を逃れるのを助け、生存の可能性を高める可能性がある。
菌Nissleのすべての検体に存在する、大腸菌Nissle中のプロファージが同定された。驚くべきことに、細菌の適応度、滞留時間および活性の試験は、内因性ファージにおける突然変異または欠失を含む細菌が本質的に同じである(例えば、少なくとも同程度の大きさである)ことを示した。
、ECOLIN_09980、ECOLIN_09985、ECOLIN_09990、ECOLIN_09995、ECOLIN_10000、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10055、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全な欠失または部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
少なくとも6mg/dL、少なくとも8mg/dL、少なくとも10mg/dL、少なくとも12mg/dL、少なくとも14mg/dL、少なくとも16mg/dL、少なくとも18mg/dL、少なくとも20mg/dL、または少なくとも25mg/dLの血中フェニルアラニンレベルである。本明細書において使用される場合、高フェニルアラニン血症に関連する疾患には、限定されないが、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、および瀬川病が含まれる。罹患者は、進行性および不可逆性の神経学的欠損、精神遅滞、脳症、てんかん、湿疹、低成長(reduced growth)、小頭症、振戦、四肢痙攣、および/または低色素沈着を患う可能性がある(Leonard 2006年)。高フェニルアラニン血症はまた、他の状態、例えば肝疾患に続発する可能性がある。
ンモニア、および過酸化水素を生成するために、L-アミノ酸の立体特異的酸化的脱アミノ化を触媒する酵素を指すために使用される。例えば、LAADはフェニルアラニンのフェニルピルビン酸への変換を触媒する。多数のLAAD酵素が当該分野において公知であり、それらの多くは、プロテウス属(Proteus)、プロビデンシア属(Providencia)、およびモルガネラ属(Morganella)などの細菌、または毒液に由来する。LAADはフェニルアラニン分解の速い反応速度を特徴とする(Houら、Appl Microbiol Technol.2015年10月;99(20):8391~402頁;「Production of phenylpyruvic acid from L-phenylalanine using an L-amino
acid deaminase from Proteus mirabilis:comparison of enzymatic and whole-cell biotransformation approaches」)。大部分の真核生物および原核生物のL-アミノ酸デアミナーゼは細胞外であるが、プロテウス種LAADは、細胞膜(内膜)に局在し、酵素活性が存在するペリプラズム間隙の外側を向いている。この局在化の結果として、内膜を通る細胞質へのフェニルアラニン輸送は、プロテウス属LAADにより媒介されるフェニルアラニン分解に必要とされない。フェニルアラニンは、トランスポーターを必要とせずに外膜を通してペリプラズムに容易に取り込まれ、基質の利用可能性を改善するトランスポーターの必要性を取り除く。
、および/または栄養要求性に関連する1つ以上の遺伝子配列を含み得る。これらの遺伝子配列の発現は、種々のプロモーター系、例えば、本明細書中に開示されるプロモーター系のいずれかを使用して調節され得、該プロモーターは、1つ以上の異なる遺伝子を調節する同じプロモーターであり得るか、異なる遺伝子を調節する同じプロモーターの異なるコピーであり得るか、または異なる遺伝子の発現を調節するために組み合わせて使用される異なるプロモーターの使用を含み得る。遺伝子発現を制御するための異なる調節系またはプロモーター系の使用は柔軟性(例えば、異なる環境条件下で遺伝子発現を差次的に制御する能力、および/または遺伝子発現を時間的に差次的に制御する能力)を与え、かつ遺伝子発現を「微調整」する能力も与え、当該調節のいずれかまたは全ては、遺伝子発現および/または細菌の増殖を最適化するのに役立ち得る。遺伝子操作された細菌およびそれらの細菌を含む医薬組成物は、PKUを含む高フェニルアラニン血症に関連する状態を処置および/または予防するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用され得る。特定の態様では、遺伝子操作された細菌を含む組成物は、高フェニルアラニン血症に関連する障害を処置および/または予防するために、本開示の方法において使用され得る。
よびSKALPとも呼ばれる)、トレフォイル因子、メラトニン、トリプトファン、PGD2、およびキヌレン酸、インドール代謝産物、および他のトリプトファン代謝産物、ならびに本明細書中に開示される他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。このような分子には、炎症促進性分子を阻害する化合物、例えば、一本鎖可変抗体(scFv)、アンチセンスRNA、siRNA、またはTNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、および/もしくはケモカイン(例えば、CXCL-8およびCCL2)を中和するshRNAが含まれる。このような分子には、本明細書中に記載されるような、(例えば、IL-22産生をもたらす)AHRアゴニスト(例えば、インドール酢酸、インドール-3-アルデヒド、およびインドール)およびPXRアゴニスト(例えば、IPA)も含まれる。このような分子には、HDAC阻害剤(例えば、ブチラート)、GPR41および/またはGPR43の活性化因子(例えば、ブチラートおよび/またはプロピオネートおよび/またはアセテート)、GPR109Aの活性化因子(例えば、ブチラート)、NF-kappaBシグナル伝達の阻害剤(例えば、ブチラート)、PPARγのモジュレーター(例えば、ブチラート)、AMPKシグナル伝達の活性化因子(例えば、アセテート)、およびGLP-1分泌のモジュレーターも含まれる。このような分子には、ヒドロキシルラジカル捕捉剤および酸化防止剤(例えば、IPA)も含まれる。分子は、主に抗炎症性(例えば、IL-10)、または主に消化管バリア機能増強性(例えばGLP-2)であり得る。分子は、抗炎症性および消化管バリア機能増強性の両方であり得る。抗炎症性および/または消化管バリア機能エンハンサー分子は、単一の遺伝子によってコードされてもよく、例えば、エラフィンはPI3遺伝子によってコードされる。あるいは、抗炎症性および/または消化管バリア機能エンハンサー分子は、複数の遺伝子、を必要とする生合成経路によって合成されてもよい(例えば、ブチラート)。
/US2017/017552(出願日2017年2月10日)、PCT/US2016/044922(出願日2016年7月29日)、PCT/US2016/049781(出願日2016年8月31日)、PCT/US2016/37098(出願日2016年6月10日)、PCT/US2016/069052(出願日2016年12月28日)、PCT/US2016/32562(出願日2016年5月13日)、PCT/US2016/062369(出願日2016年11月16日)およびPCT/US2017/013072に記載されており、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
性は、LIV-I/LS系の活性まで追跡され、そのLIV-I/LS系は、2つのペリプラズム結合タンパク質である、LIV結合タンパク質(LIV-I系)およびLS結合タンパク質(LS系)、ならびに膜成分であるLivHMGFからなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターである。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、細菌種に由来するaroP遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、LIV結合タンパク質およびLS結合タンパク質ならびに細菌種に由来するLivHMGF遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、pheP、aroP、およびLIV-I/LS系から選択される1種より多いフェニルアラニントランスポーターを含む。
て内因性であるが、インタクト微生物細胞に対して外部または外因性である環境条件を指すために交換可能に使用され得る。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の上部胃腸管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の下部胃腸管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の小腸に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素、微好気性、または嫌気性条件である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件とは、健康または疾患状態における哺乳動物の消化管に特異的である分子または代謝産物、例えばプロピオネートの存在を指す。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、腫瘍微小環境に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、腫瘍微小環境に特異的である分子または代謝産物である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、組織特異的または疾患特異的な代謝産物または分子である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は低pH環境である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物はpH依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの態様では、細菌は酸素レベルを検知できる進化した転写因子を有する。異なるシグナル伝達経路が異なる酸素レベルによって誘発され得、異なる動態を伴って発生する。
それらの発現を活性化する。しかしながら、好気性条件下で、酸素はFNR二量体における鉄-硫黄クラスターと反応し、それらを不活性型に変換する。このように、PfnrS誘導性プロモーターはタンパク質またはRNAの発現をモジュレートするために採用される。PfnrSは、本出願において、FNRS、fnrS、FNR、P-FNRSプロモーターおよびプロモーターPfnrSを示す他のそのような関連した名称として交換可能に使用される。
い。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、本発明の医薬組成物と組合せて投与される分子または代謝産物、例えば、テトラサイクリン、アラビノース、または誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ任意の生物学的分子によって刺激される。いくつかの実施形態では、外因性環境条件および/またはシグナルは、本発明の組み換え細菌細胞を含む培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件は、哺乳動物の消化管内に自然に存在する(例えば、低酸素もしくは嫌気性条件、または炎症反応に関与する生物学的分子)。いくつかの実施形態では、外因性環境条件(例えば、in vivo)への曝露の喪失は、当該外因性環境条件がプロモーターを誘導するために存在しない(例えば、消化管の外部の好気性環境)ので、誘導性プロモーターの活性を阻害する。本明細書において使用される場合、「非天然」核酸配列とは、通常、細菌に存在しない核酸配列、例えば内因性配列の追加のコピー、または細菌の異なる種、株、もしくは亜株由来の配列などの異種配列、または同じ亜型の細菌由来の非改変配列と比較して改変および/もしくは突然変異されている配列を指す。いくつかの実施形態では、非天然核酸配列は合成の、天然に存在しない配列である(例えば、Purcellら、2013年を参照のこと)。非天然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットにおける1つもしくは複数の遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態では、「非天然」とは、天然において互いに同じ関係で見出されない2つ以上の核酸配列を指す。非天然核酸配列はプラスミドまたは染色体上に存在し得る。さらに、任意の調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットの複数のコピーが細菌に存在してもよく、当該調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットの1つまたは複数のコピーは、突然変異されていてもよく、または本明細書に記載されるように別様で変更されていてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、コピー数を高めるために、または複数の異なる機能を実行する遺伝子カセットの複数の異なる成分を含むために、同じ調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットの複数のコピーを含むように操作される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はエフェクター分子(例えば、PME)をコードする遺伝子を含み、当該遺伝子は、天然では当該遺伝子に関連していない直接的または間接的に誘導可能なプロモーター、例えばエフェクター分子をコードする遺伝子に作動可能に連結されているFNRプロモーター、または第2のエフェクター分子に作動可能に連結されているParaBADプロモーター、に作動可能に連結されている。
プロモーター43(BBa_K143013)、PliaG(BBa_K823000)、PlepA(BBa_K823002)、Pveg(BBa_K823003))、構成的バチルス・サブティリスσBプロモーター(例えば、プロモーターctc(BBa_K143010)、プロモーターgsiB(BBa_K143011))、サルモネラ(Salmonella)プロモーター(例えば、サルモネラ由来のPspv2(BBa_K112706)、サルモネラ由来のPspv(BBa_K112707))、バクテリオファージT7プロモーター(例えば、T7プロモーター(BBa_I712074;BBa_I719005;BBa_J34814;BBa_J64997;BBa_K113010;BBa_K113011;BBa_K113012;BBa_R0085;BBa_R0180;BBa_R0181;BBa_R0182;BBa_R0183;BBa_Z0251;BBa_Z0252;BBa_Z0253))、バクテリオファージSP6プロモーター(例えば、SP6プロモーター(BBa_J64998))、およびそれらの機能性断片が含まれる。
its use for depleting unwanted amino acids using oral enzyme-artificial cells, as in removing phenylalanine in phenylketonuria; Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol.1995年; 23巻(1):1-21頁))。血液由来のフェニルアラニンは小腸内に循環し(例えば、図15参照)、当該部位で活性な細菌によって除去され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は小腸を通過する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、消化管内の滞留時間が長くなっている。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は小腸または大腸にコロニーを形成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は結腸にコロニーを形成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、消化管内の滞留時間が長くなっている。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は消化管にコロニーを形成しない。
ば、<21%O2; <160torrO2))。したがって、用語「低酸素条件(複数可)」または「低酸素環境」は、大気中に存在する酸素よりも低い酸素レベルを含む条件または環境を指す。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、哺乳動物の消化管、例えば、内腔、胃、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、盲腸、結腸、遠位S状結腸、直腸および肛門管に見出される酸素(O2)のレベル、量、または濃度を指すこと意味する。いくつかの実施形態において、「低酸素」という用語は、0~60mmHgのO2(0~60torrのO2)(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、および60mmHgのO2)のレベル、量、または濃度を指すことを意味し、それらの任意およびすべての小数の増加を含む(例えば、0.2mmHg、0.5mmHgのO2、0.75mmHgのO2、1.25mmHgのO2、2.175mmHgのO2、3.45mmHgのO2、3.75mmHgのO2、4.5mmHgのO2、6.8mmHgのO2、11.35mmHgのO2、46.3mmHgのO2、58.75mmHgなどが含まれるが、これらの例示的な小数は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。)。いくつかの実施形態において、「低酸素」とは、約60mmHg以下のO2(例えば、0~約60mmHgのO2)を指す。「低酸素」という用語はまた、0~60mmHgの間(0mmHgと60mmHgを含めて)のO2のレベル、量、または濃度の範囲、例えば、0~5mmHg O2、<1.5mmHg O2、6~10mmHg、<8mmHg、47~60mmHgなどを指すことができるが、これらの例示的範囲は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。例えば、Albenbergら、Gastroenterology、147巻(5):1055-1063頁(2014年);Bergofskyら、J Clin. Invest.、41巻(11):1971-1980頁(1962年);Cromptonら、J Exp. Biol.、43巻:473-478頁(1965年);Heら、PNAS(USA)、96巻:4586-4591頁(1999年);McKeown、Br. J. Radiol.、87巻:20130676(2014年)(doi:10.1259/brj.20130676)を参照されたい。前記の各文献では、様々な種の哺乳動物の消化管内に見出される酸素レベルが議論されており、これらの文献はそれぞれ全体とし本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、哺乳動物の消化管以外の器官または組織、例えば尿生殖路、腫瘍組織などに見出される酸素(O2)のレベル、量または濃度を意味し、当該器官または組織では、酸素は低下したレベル、例えば、低酸素(hypoxic)または無酸素(anoxic)レベルで存在する。いくつかの実施形態では、「低酸素」とは、部分的に好気性、半好気性(semi aerobic)、微好気性(microaerobic)、超好気性(nanoaerobic)、微酸素性(microoxic)、低酸素性(hypoxic)、無酸素性(anoxic)および/または嫌気性条件に存在する酸素(O2)のレベル、量または濃度を意味する。例えば、表Aは、様々な器官および組織に存在する酸素量をまとめたものである。いくつかの実施形態では、酸素(O2)のレベル、量、または濃度は、液体中に存在する遊離の非化合物の酸素(O2)のレベルを指す溶存酸素(「DO」)の量として表され、典型的には、ミリグラムパーリッター(mg/L)、百万分率(ppm; 1mg/L=1ppm)またはマイクロモル(umole)(1μmol O2=0.022391mg/L O2)で報告されている。Fondriest Environmental、Inc.、 “Dissolved Oxygen”、環境測定の基礎、2013年11月19日、www.fondriest.com/environmental-measurements/parameters/water-quality/dissolved-oxygen/>。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、約6.0mg/L DO以下の酸素(O2)のレベル、量、または濃度を指
すことを意味し、例えば6.0mg/L、5.0mg/L、4.0mg/L、3.0mg/L、2.0mg/L、1.0mg/L、または0mg/L、ならびにそれらの小数、例えば、3.25mg/L、2.5mg/L、1.75mg/L、1.5mg/L、1.25mg/L、0.9mg/L、0.8mg/L、0.7mg/L、0.6mg/L、0.5mg/L、0.4mg/L、0.3mg/L、0.2mg/Lおよび0.1mg/L DOである。これらの例示的な小数は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。液体または溶液中の酸素レベルは、空気飽和のパーセンテージまたは酸素飽和のパーセンテージとして報告され得る(溶液中の溶存酸素(O2)濃度と、安定な平衡下で一定の温度、圧力、および塩濃度の溶液についての最大溶存酸素量との比)。酸素の産生物または消費物を含まず、十分に酸素を供給された溶液(例えば、混合および/または撹拌された溶液)は、100%空気飽和である。いくつかの実施形態において、「低酸素」という用語は、40%以下の空気飽和、例えば、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、および0%空気飽和を指すことを意味し、それらの任意およびすべての小数の増加(例えば、30.25%、22.70%、15.5%、7.7%、5.0%、2.8%、2.0%、1.65%、1.0%、0.9%、0.8%、0.75%、0.68% 0.5%、0.44%、0.3%、0.25%、0.2%、0.1%、0.08%、0.075%、0.058%、0.04%、0.032%、0.025%、0.01%など)ならびに0~40%の間(0%と40%を含めて)の酸素飽和レベルの任意の範囲(例えば、0~5%、0.05~0.1%、0.1~0.2%、0.1~0.5%、0.5~2.0%、0~10%、5~10%、10~15%、15~20%、20~25%、25~30%など)が含まれる。ここに列挙した例示的な小数および範囲は、説明のためのものであり、決して限定されることを意味するものではない。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、9%以下の酸素飽和、例えば、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0%のO2飽和を指すことを意味し、それらの任意およびすべての小数の増加(例えば、6.5%、5.0%、2.2%、1.7%、1.4%、0.9%、0.8%、0.75%、0.68%、0.5%、0.44%、0.3%、0.25%、0.2%、0.1%、0.08%、0.075%、0.058%、0.04%、0.032%、0.025%、0.01%など)ならびに0~9%の間(0%と9%を含めて)の酸素飽和レベルの任意の範囲(例えば、0~5%、0.05~0.1%、0.1~0.2%、0.1~0.5%、0.5~2.0%、0~8%、5~7%、0.3~4.2%のO2など)が含まれる。ここに列挙した例示的な少数および範囲は、説明のためのものであり、決して限定的であることを意味するものではない。
vivo投与前の株の培養中に提供されるこのような条件の非限定的な例としては、低酸素、嫌気性、微好気性、または好気性条件、他の定義された酸素レベル(例えば、以下に例示されるもの)、アラビノースの存在、IPTG、ラムノース、または本明細書中に記載されているかもしくは当該分野で公知の他の化学的および/または栄養性誘導物質の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、培養容器内の条件は、一定の酸素レベル、例えば、1%~10%の酸素、10%~20%の酸素、20%~30%の酸素、30%~40%の酸素、40%~50%の酸素、60%~70%の酸素、70%~80%の酸素、80%~90%の酸素、90%~100%の酸素、および本明細書に記載される他の酸素レベルに設定され、その設定点においてプロモーターが直接的または間接的に誘導される。
菌は、所望の生物学的特性、例えば生存率を向上または改善させるように遺伝子操作されてもよい。非病原性細菌は、プロバイオティクス特性を提供するように遺伝子操作されてもよい。プロバイオティクス細菌は、プロバイオティクス特性を向上または改善させるように遺伝子操作されてもよい。
vivo、例えば消化管内で生存および/または増殖できる。例えば、安定な細菌は、PAL遺伝子を保有するプラスミドまたは染色体が宿主細胞中で安定に維持される、エフェクター分子(例えば、PAL)をコードする遺伝子を含む遺伝子組換え細菌であってもよく、それによりエフェクターは宿主細胞中で発現され得、宿主細胞はin vitroおよび/またはin vivoで生存および/または増殖できる。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質、例えば、PAL遺伝子の発現の安定性に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質、例えば、PAL遺伝子またはPAH遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす。
語句に含まれる。
合タンパク質を指す。Fv断片は抗体の結合部位を保持する最小の断片であり、その結合部位は、いくつかの態様では、元の抗体の特異性を維持し得る。一本鎖抗体の製造のための技術は、米国特許第4,946,778号に記載されている。scFvのVhおよびVL配列は、VLのC末端に接続するVHのN末端を介して、またはVLのN末端に接続するVHのC末端を介して接続することができる。ScFv断片は、いずれかの末端で他のエピトープタグまたはタンパク質ドメインに区別なく融合され得る独立したフォールディングエンティティである。様々な長さのリンカーを使用して、VhおよびVL配列を連結することができ、該リンカーは、グリシンリッチ(柔軟性を提供する)およびセリンまたはスレオニンリッチ(溶解性を増加させる)であり得る。短いリンカーは、2つのドメインの会合を妨げ、多量体(ダイアボディ、トリボディなど)をもたらし得る。長いリンカーは、タンパク質分解または弱いドメイン会合を生じ得る(Voelkelら、2011年に記載される)。15~20アミノ酸または18~20アミノ酸の長さのリンカーが最も頻繁に使用される。他の柔軟なリンカーを含むリンカーのさらなる非限定的な例は、チェンら、2013年(Adv Drug Deliv Rev.2013年10月15日;65(10):1357-1369頁、Fusion Protein Linkers:Property, Design and Functionality)に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。柔軟なリンカーはまた、グリジンおよびセリンなどの小さなまたは極性のアミノ酸に富むが、柔軟性を維持するためにスレオニンおよびアラニンなどの追加のアミノ酸、ならびに溶解性を改善するためにリジンおよびグルタミン酸などの極性のアミノ酸を含み得る。例示的なリンカーとしては、(Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n、KESGSSEQLAQFRSLDおよびEGKSSGSESKST、(Gly)8、ならびにGlyおよびSerリッチなフレキシブルリンカー、GSAGSAAGSGEFが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「一本鎖抗体」には、ラクダ抗体および他の重鎖抗体を含む単一ドメイン抗体、ナノボディを含む軽鎖抗体、ならびにヒト、マウスまたは他の種に由来する単一ドメインVHまたはVLドメインも含まれる。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。単一ドメイン抗体には、ラクダ、ラマ、またはアルパカに由来するラクダ科動物スキャフォールドを有するドメイン抗原結合ユニットが含まれる。ラクダ科動物は、軽鎖を欠く機能的抗体を産生する。重鎖可変(VH)ドメインは、自律的に折り畳まれ、抗原結合ユニットとして独立して機能する。その結合表面は、古典的な抗原結合分子(Fab)または一本鎖可変断片(scFv)における6つのCDRと比較して、3つのCDRのみを含む。ラクダ科動物の抗体は、従来の抗体のものに匹敵する結合親和性を達成することができる。ラクダ科動物スキャフォールドをベースとする抗体は、当該分野で周知の方法を使用して産生され得る。軟骨魚にも重鎖抗体(IgNAR、「免疫グロブリン新規抗原受容体」)があり、それからVNAR断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。あるいは、ヒトまたはマウス由来のIgG由来の二量体可変ドメインがモノマーに分割され得る。ナノボディは、軽鎖に由来する一本鎖抗体である。用語「一本鎖抗体」はまた、抗体模倣物を指す。
リアント」という用語は、元のペプチドの配列または元のペプチドと十分に類似する配列を含む融合タンパク質を含む。本明細書において使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、2つ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を指す。典型的に、融合タンパク質は周知のin vitro組換え技術から生じる。融合タンパク質は、その融合タンパク質の成分である個々の元のタンパク質と類似した構造機能(しかし必ずしも同じ程度である必要はない)、および/または類似した調節機能(しかし必ずしも同じ程度である必要はない)、および/または類似した生化学機能(しかし必ずしも同じ程度である必要はない)および/または免疫学的活性(しかし必ずしも同じ程度である必要はない)を有してもよい。「誘導体」は、限定されないが、20個の標準的なアミノ酸の1つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドを含む。2つのペプチド間の「類似性」は、1つのペプチドのアミノ酸配列を第2のペプチドの配列と比較することによって決定される。1つのペプチドのアミノ酸は、それが同一または保存的アミノ酸置換である場合、第2のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。保存的置換には、Dayhoff,M.O.、ed.、The Atlas of Protein Sequence and Structure 5、National Biomedical Research Foundation、Washington,D.C.(1978年)、およびArgos、EMBO J.8(1989年)、779~785頁に記載されているものが含まれる。例えば、以下の群の1つに属するアミノ酸は保存的変化または保存的置換を表す:-Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr;-Cys、Ser、Tyr、Thr;-Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;-Lys、Arg、His;-Phe、Tyr、Trp、His;および-Asp、Glu。
るように設計された配列を指す。コドンの最適化には、限定されないが、発現宿主生物のコドンの選好性に適合するように、コード配列についてのコドンを選択することを含むプロセスが含まれる。「コドン最適化された」という用語は、核酸分子によってコードされるポリペプチドを変更することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映するために、当該核酸分子の遺伝子またはコード領域においてコドンを改変することを指す。このような最適化には、少なくとも1つ、または2つ以上、または相当な数のコドンを、宿主生物の遺伝子においてより頻繁に使用されている1つ以上のコドンで置換することが含まれる。「コドン最適化配列」とは、既存のコード配列から改変された、あるいは例えば、コード配列から転写された転写RNA分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するように、またはコード配列の転写を改善するように設計された配列を指す。いくつかの実施形態において、転写および/または翻訳の改善は、転写および/または翻訳のレベルを増加させることを含む。いくつかの実施形態では、転写および/または翻訳の改善は、転写および/または翻訳のレベルを低下させることを含む。いくつかの実施形態では、目的の構築物からの発現レベルを微調整するために、コドン最適化が用いられる。コドンの最適化には、発現宿主生物のコドン選好性に適合するように、コード配列のコドンを選択することを含むプロセスが含まれるが、これに限定されない。多くの生物は、伸長中のポリペプチド鎖への特定のアミノ酸の挿入をコードするために、特定のコドンを使用するためのバイアスまたは選好性を示す。コドンの選好性またはコドンバイアス、生物間でのコドン使用頻度の差異は、遺伝暗号の縮重によって許容され、多くの生物の間で文書により十分に立証されている。コドンバイアスは、多くの場合、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率と相関し、そのメッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーRNA(tRNA)分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたtRNAの優性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。
態では、細菌は、その自然または天然状態において、同じまたは異なるファージまたはプロファージの1つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、その天然または自然状態において1つ以上の同じまたは異なった型のファージまたはプロファージを含む細菌は、操作された株のための前駆株として機能する。その結果、同じ1つ以上の内因性ファージまたはプロファージは、例えば前駆株または親株がその天然状態においてそのような内因性ファージまたはプロファージを含む場合、遺伝子操作された細菌中にも存在し得る。したがって、遺伝子操作された細菌は、その自然状態においてプロファージも含む(ここで、ファージは、その自然状態にある定義された要素である)。
ジの切除を含んでも含まなくてもよい。
症候群;プラダー・ウィリー症候群;非アルコール性脂肪性肝疾患;結節性硬化症;オルブライト症候群;脳由来神経栄養因子(BDNF)欠損;single-minded 1(SIM1)欠損;レプチン欠損;レプチン受容体欠損;プロオピオメラノコルチン(POMC)欠陥;プロタンパク質転換酵素スブチリシン/ケキシン1型(PCSK1)欠損;Srcホモロジー2B1(SH2B1)欠損;プロホルモン転換酵素1/3欠損;メラノコルチン-4-受容体(MC4R)欠損;ウィルムス腫瘍、無虹彩症、泌尿生殖器奇形、および精神遅滞(WAGR)症候群;偽性副甲状腺機能低下症1A型;脆弱X症候群;Borjeson-Forsmann-Lehmann症候群;アルストレーム症候群;コーエン症候群;および尺骨・乳房症候群を含むが、これらに限定されない。
2016年11月16日)、およびPCT/US2017/013072に記載されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される細菌は、内因性ファージゲノムに対する1つ以上の突然変異または改変を含む。いくつかの実施形態では、細菌は、その自然状態または天然状態においてバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態では、ファージは、特定の細菌の全ての分離株に存在する。いくつかの実施形態では、ファージは、同じ種、株、または亜株の細菌に存在する。いくつかの実施形態では、ファージはインタクトプロファージである。いくつかの実施形態では、ファージは欠陥プロファージである。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ファージを溶菌サイクルに入ることができないようにする。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、溶菌サイクルを経るファージの能力に影響を及ぼし、例えば、溶菌段階を経ることができる所与の集団内の細菌の頻度または数を減少させる。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ファージが他の細菌に感染するのを防止する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は細菌の適応度を変化させる(例えば、増加または減少させる)。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異はエフェクター機能を変化させる(例えば、増加または減少させる)。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は細菌の適応度を変化させない。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異はエフェクター機能を変化させない。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、大規模製造を含む、細菌が製造または産生されるプロセスを改善する。これらの実施形態のいずれかにおいて、細菌は、さもなければその自然状態であり得る。あるいは、これらの実施形態のいずれかにおいて、細菌は1つ以上のエフェクター分子をコードする遺伝子配列を含むように、さらに遺伝子操作され得る。
ウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロングム、クロストリジウム・ブチリカム、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ラクティス、およびサッカロミセス・ブラウディが含まれる。特定の実施形態では、細菌は、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、バクテロイデス・サブティリス、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、クロストリジウム・ブチリカム、大腸菌Nissle、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、およびラクトコッカス・ラクティスからなる群から選択される。
遺伝子配列で置換される。いくつかの実施形態では、置換は、抗生物質カセットをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ遺伝子の配列全体が逆位している。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ遺伝子の部分配列が逆位している。
いくつかの実施形態では、本発明の細菌は、1つ以上の溶原性ファージ、休眠性ファージ、テンペレートファージ、インタクトファージ、欠陥ファージ、クリプティックファージもしくはサテライトファージ、またはバクテリオシン/ファージ尾部または遺伝子導入剤を、それらの自然状態で含む。いくつかの実施形態では、プロファージまたはバクテリオファージは、目的の特定の細菌の全ての分離株に存在する。いくつかの実施形態では、細菌はプロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は、このようなバクテリオファージの1つ以上を含む親株の遺伝子操作された誘導体である。従って、本発明のこのような細菌は、それらの自然状態であってもよく、または1つ以上のエフェクター分子の発現または産生のための回路を含むようにさらに遺伝的に改変されていてもよい。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、細菌は、バクテリオファージの特性または挙動を変化させる、プロファージまたはバクテリオファージゲノム内の1つ以
上の改変または突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、プロファージが溶菌プロセスに入ること、またはそれを完了することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージが同じまたは異なる型の他の細菌に感染することを妨げる。
Opin Virol. 2011年10月1日;1(4):298-303頁、およびその中の参考文献)。ファージゲノムは、10個未満の遺伝子から数百個までの遺伝子をコードし得る。細菌プラスミドに組み込まれるファージのいくつかの例も存在するが、テンペレートファージまたはプロファージは、通常、細菌宿主の染色体に組み込まれている(Waldor MK, Friedman DI, Adhya S編 Phages Their Role in Bacterial Pathogenesis and Biotechnology.ワシントンDC:ASM Press;2005年、37-54頁中のLittle, Loysogeny, Prophage Induction, and Lysogenic Conversion)。場合によっては、ファージは常に細菌宿主染色体内の同じ位置にあり、この位置は各ファージに特異的、すなわち、異なるファージは異なる位置にある。他のファージは、それらが多数の異なる場所で組み込まれ得るという点で、より許容性である。
を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約100kb~120kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約120kb~140kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約140kb~160kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約160kb~180kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約180kb~200kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約200kb~180kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約160kb~250kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約250kb~300kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約300kb~350kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約350kb~400kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約400kb~500kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約500kb~1000kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが1000kbを超えるバクテリオファージゲノムを含む。
された細菌は、少なくとも約95~100個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約100~115個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約115~120個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約120~125個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約125~130個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約130~135個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約135~140個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約140~145個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約145~150個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約150~160個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約160~170個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約170~180個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約180~190個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約190~200個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約200~300個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約300個を超える遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。
サイクルにわたる溶菌サイクルに必須の1つ以上の遺伝子の損失の結果として、多くの細菌において高レベルの存在量に達し得る(Bobayら、Pervasive domestication of defective prophages by bacteria、Proc Natl Acad Sci USA)。注目すべきことに、欠陥プロファージはまた、相同組換え機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、さらなる感染の防止のための機構、または(例えば他の隣接する細菌種の増殖阻害を通じて、栄養素のための競合において有用であり得る)バクテリオシンを含む、適応性のまたは有利な機能を宿主にもたらし得る多くの遺伝子をしばしば含む。例えば、いくつかの欠陥プロファージは、大腸菌K-12(例えば、Rac、e14、DLP12、およびQIN)およびバチルス・サブティリス(例えば、186およびSKIN)において特徴付けられている(Casjens、2001年、およびその中の参考文献)。これらのファージの各々は、いくつかの機能的遺伝子を保有する。例えば、Racは、RecE相同組換えシステムをコードする。
a satellite virus depending on a helper
such as prophage P2、Virology、第51巻、第2号、1973年2月、327~344頁)。従って、いくつかの実施形態では、細菌は、それ自身の構造遺伝子を持たないファージゲノムを含む。
。そこで、DNAは、相同組換えによって、常在の同族染色体領域(cognate chromosomal region)を置換することができる。しかしながら、粒子の大部分はGTAをコードする遺伝子を有していないので、これらの粒子はウイルスとして増殖することができない。
Res.(2011年)39(suppl 2):W347-W352)およびArndtら(Arndtら(2016年)PHASTER:a better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Res.,2016年5月3日)に詳細に記載されている。簡単に説明すると、3つの方法が異なる基準で適用され、与えられた細菌ゲノム配列中のプロファージ領域(インタクト、疑わしい、または不完全)をスコアリングする。第1の方法では、Phasterによって同定された特定のファージオルガニズムの数がその領域のCDSの総数の100%以上である場合、その領域に合計スコア150がマークされる。100%未満の場合、方法2および3が使用される。方法2では、与えられた細菌ゲノム配列中のPhasterによって同定された特定のファージオルガニズムの数が、その領域のCDSの総数の50%を超える場合、そのファージオルガニズムは、その領域についての主要な潜在的なファージとみなされる;その領域のタンパク質の総数におけるこの表中のそのファージオルガニズムの総数のパーセンテージが計算され、次いで100倍される;その領域の長さにおけるそのファージオルガニズムの長さのパーセンテージが計算され、次いで50倍される(ファージ頭部のカプセル化能力が考慮される)。方
法3では、特定のファージ関連キーワード(「カプシド」、「頭部」、「インテグラーゼ」、「基盤」、「尾部」、「繊維」、「コート」、「トランスポザーゼ」、「ポータル」、「ターミナーゼ」、「プロテアーゼ」または「リシン」など)のいずれかが存在する場合、見つかったキーワードごとにスコアを10だけ増加させる。領域のサイズが30Kbより大きい場合、スコアは10だけ増加される。その領域に少なくとも40のタンパク質が存在する場合、スコアは10だけ増加される。ファージ関連タンパク質および仮想タンパク質の全てが、領域内のタンパク質の総数の70%を超える場合、スコアは10だけ増加される。方法2の合計スコアを方法3の合計スコアと比較し、大きい方を領域の合計スコアとして選択する。領域の合計スコアが70未満である場合、不完全とマークされ、70~90の間である場合、疑わしいとマークされ、90を超える場合、インタクトとマークされる。
ば、減少または増大させない)。
いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約1~500塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約500~1000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突
然変異は、少なくとも約1000~2000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約1000~2000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約2000~3000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約3000~4000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約4000~5000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約5000~6000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約6000~7000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約7000~8000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約8000~9000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約9000~10000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約10000~15000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1以上の突然変異は、少なくとも約10000~15000塩基対のファージゲノム、少なくとも約15000~20000塩基対のファージゲノム、少なくとも約20000~25000塩基対のファージゲノム、少なくとも約25000~30000塩基対のファージゲノム、少なくとも約30000~35000塩基対のファージゲノム、少なくとも約35000~40000塩基対のファージゲノム、少なくとも約45000~50000塩基対のファージゲノム、少なくとも約50000~55000塩基対のファージゲノム、少なくとも約55000~60000塩基対のファージゲノム、少なくとも約60000~65000塩基対のファージゲノム、少なくとも約65000~70000塩基対のファージゲノム、少なくとも約70000~75000塩基対のファージゲノム、少なくとも約75000~80000塩基対のファージゲノム、少なくとも約85000~90000塩基対のファージゲノム、少なくとも約90000~95000塩基対のファージゲノム、少なくとも約95000~100000塩基対のファージゲノム、少なくとも約100000~110000塩基対のファージゲノム、少なくとも約110000~120000塩基対のファージゲノム、少なくとも約120000~130000塩基対のファージゲノム、少なくとも約130000~140000塩基対のファージゲノム、少なくとも約140000~150000塩基対のファージゲノム、少なくとも約150000~200000塩基対のファージゲノム、または少なくとも約200000塩基対超のファージゲノムを含む。特定の一実施形態では、9687塩基対のファージゲノムが突然変異している。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドは連続している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約0.1~1%、少なくとも約1~2%、少なくとも約2~3%、少なくとも約3~4%、少なくとも約4~5%、少なくとも約5~6%、少なくとも約6~7%、少なくとも約7~8%、少なくとも約8~9%、少なくとも約9~10%、少なくとも約10~11%、少なくとも約11~12%、少なくとも約12~13%、少なくとも約13~14%、少なくとも約14~15%、少なくとも約15~16%、少なくとも約16~17%、少なくとも約17~18%、少なくとも約18~19%、少なくとも約19~20%、少なくとも約20~21%、少なくとも約21~22%、少なくとも約22~23%、少なくとも約23~24%、少なくとも約24~25%、少なくとも約25~26%、少なくとも約26~27%、少なくとも約27~28%、少なくとも約28~29%、少なくとも約29~30%が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約30~40%が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約40~50%が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約50~60%が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約60~70%が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約70~80%が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの
少なくとも約80~90%が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約90~100%が突然変異している。
%~95%、少なくとも約95%~96%、少なくとも約96%~97%、少なくとも約97%~98%、少なくとも約98%~99%、少なくとも約99%~100%、または少なくとも約100%が完全にまたは部分的に突然変異している。
コードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、1つ以上のプライマーゼ(primase)をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、ファージ挿入に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、接着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、パッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。
するポリペプチドをコードする7個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、ファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。
いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約1~500塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約500~1000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約1000~2000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約1000~2000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約2000~3000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約3000~4000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約4000~5000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約5000~6000塩基対のファージゲノム
を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約6000~7000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約7000~8000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約8000~9000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約9000~10000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約10000~15000塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約10000~15000塩基対のファージゲノム、少なくとも約15000~20000塩基対のファージゲノム、少なくとも約20000~25000塩基対のファージゲノム、少なくとも約25000~30000塩基対のファージゲノム、少なくとも約30000~35000塩基対のファージゲノム、少なくとも約35000~40000塩基対のファージゲノム、少なくとも約40000~45000塩基対のファージゲノム、少なくとも約45000~50000塩基対のファージゲノム、少なくとも約50000~55000塩基対のファージゲノム、少なくとも約55000~60000塩基対のファージゲノム、少なくとも約60000~65000塩基対のファージゲノム、少なくとも約65000~70000塩基対のファージゲノム、少なくとも約70000~75000塩基対のファージゲノム、少なくとも約75000~80000塩基対のファージゲノム、少なくとも約80000~85000塩基対のファージゲノム、少なくとも約85000~90000塩基対のファージゲノム、少なくとも約90000~95000塩基対のファージゲノム、少なくとも約95000~100000塩基対のファージゲノム、少なくとも約100000~110000塩基対のファージゲノム、少なくとも約110000~120000塩基対のファージゲノム、少なくとも約120000~130000塩基対のファージゲノム、少なくとも約130000~140000塩基対のファージゲノム、少なくとも約140000~150000塩基対のファージゲノム、少なくとも約150000~200000塩基対のファージゲノム、または200000塩基対超のファージゲノムを含む。特定の一実施形態では、9687塩基対のファージゲノムが欠失している。いくつかの実施形態では、欠失したヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、欠失したヌクレオチドは連続している。
上の遺伝子が部分的に欠失している。一実施形態では、ファージゲノム内に1つの欠失があり、当該欠失の末端の1つまたは2つの遺伝子が部分的に欠失し、残りの遺伝子が完全に欠失している。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣接している。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣接していない。
~93%、少なくとも約93%~94%、少なくとも約94%~95%、少なくとも約95%~96%、少なくとも約96%~97%、少なくとも約97%~98%、少なくとも約98%~99%、少なくとも約99%~100%、または少なくとも約100%が完全にまたは部分的に欠失している。
se)をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、ファージ挿入に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、接着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、パッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。
失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、ファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。
いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、挿入はファージゲノムの調節領域に挿入される。いくつかの実施形態では、挿入は1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約1~500塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約500~1000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約1000~2000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約1000~2000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約2000~3000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約3000~4000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約4000~5000塩基対の長さを含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約5000~6000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約6000~7000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約7000~8000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約8000~9000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約9000~10000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約10000~15000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、少なくとも約10000~15000塩基対の長さ、少なくとも約15000~20000塩基対の長さ、少なくとも約20000~25000塩基対の長さ、少なくとも約25000~30000塩基対の長さ、少なくとも約30000~35000塩基対の長さ、少なくとも約35000~40000塩基対の長さ、少なくとも約40000~45000塩基対の長さ、少なくとも約45000~50000塩基対の長さ、少なくとも約50000~55000塩基対の長さ、少なくとも約55000~60000塩基対の長さ、少なくとも約60000~65000塩基対の長さ、少なくとも約65000~70000塩基対の長さ、少なくとも約70000~75000塩基対の長さ、少なくとも約75000~80000塩基対の長さ、少なくとも約80000~85000塩基対の長さ、少なくとも約85000~90000塩基対の長さ、少なくとも約90000~95000塩基対の長さ、少なくとも約95000~100000塩基対の長さ、少なくとも約100000~110000塩基対の長さ、少なくとも約110000~120000塩基対の長さ、少なくとも約120000~130000塩基対の長さ、少なくとも約130000~140000塩基対の長さ、少なくとも約140000~150000塩基対の長さ、少なくとも約150000~200000塩基対の長さ、または少なくとも約200000塩基対超の長さを含む。特定の一実施形態では、9687塩基対の長さが挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。
0塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約45000~50000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約50000~55000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約55000~60000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約60000~65000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約65000~70000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約70000~75000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約75000~80000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約80000~85000塩基対内、少なくとも約85000~90000塩基対内、ファージゲノム、ファージゲノムの少なくとも約90000~95000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約95000~100000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約100000~110000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約110000~120000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約120000~130000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約130000~140000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約140000~150000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約150000~200000塩基対内、またはファージゲノムの少なくとも約200000塩基対超内に位置する。特定の一実施形態では、ファージゲノムの9687塩基対が挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。
または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの調節領域に逆位(inverted)される。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約1~500塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約500~1000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約1000~2000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約1000~2000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約2000~3000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約3000~4000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約4000~5000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約5000~6000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約6000~7000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約7000~8000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約8000~9000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約9000~10000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約10000~15000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約10000~15000塩基対、少なくとも約15000~20000塩基対、少なくとも約20000~25000塩基対、少なくとも約25000~30000塩基対、少なくとも約30000~35000塩基対、少なくとも約35000~40000塩基対、少なくとも約40000~45000塩基対、少なくとも約45000~50000塩基対、少なくとも約50000~55000塩基対、少なくとも約55000~60000塩基対、少なくとも約60000~65000塩基対、少なくとも約65000~70000塩基対、少なくとも約70000~75000塩基対、少なくとも約75000~80000塩基対、少なくとも約80000~85000塩基対、少なくとも約85000~90000塩基対、少なくとも約90000~95000塩基対、少なくとも約95000~100000塩基対、少なくとも約100000~110000塩基対、少なくとも約110000~120000塩基対、少なくとも約120000~130000塩基対
、少なくとも約130000~140000塩基対、少なくとも約140000~150000塩基対、少なくとも約150000~200000塩基対、または少なくとも約200000塩基対超を含む。特定の一実施形態では、9687塩基対が逆位している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは連続している。
約8~9%、少なくとも約9~10%、少なくとも約10~11%、少なくとも約11~12%、少なくとも約12~13%、少なくとも約13~14%、少なくとも約14~15%、少なくとも約15~16%、少なくとも約16~17%、少なくとも約17~18%、少なくとも約18~19%、少なくとも約19~20%、少なくとも約20~21%、少なくとも約21~22%、少なくとも約22~23%、少なくとも約23~24%、少なくとも約24~25%、少なくとも約25~26%、少なくとも約26~27%、少なくとも約27~28%、少なくとも約28~29%、少なくとも約29~30%内に位置する。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約30~40%が逆位している。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約40~50%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約50~60%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約60~70%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約70~80%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約80~90%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約90~100%内に位置する。
造タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上の基盤タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、バクテリオファージの構築に必要な1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上のポータル(portal)タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、組換えに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上のインテグラーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上のインベルターゼ(invertase)をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上のトランスポザーゼ(transposase)をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上のプライマーゼ(primase)をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージ逆位(phage inversion)に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、接着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、パッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。
チドをコードする5個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノムの調節領域に置換される(substituted)。いくつかの実施形態では、置換は、1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約1~500塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少な
くとも約500~1000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約1000~2000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約1000~2000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約2000~3000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約3000~4000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約4000~5000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約5000~6000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約6000~7000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約7000~8000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約8000~9000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約9000~10000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約10000~15000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約10000~15000塩基対、少なくとも約15000~20000塩基対、少なくとも約20000~25000塩基対、少なくとも約25000~30000塩基対、少なくとも約30000~35000塩基対、少なくとも約35000~40000塩基対、少なくとも約40000~45000塩基対、少なくとも約45000~50000塩基対、少なくとも約50000~55000塩基対、少なくとも約55000~60000塩基対、少なくとも約60000~65000塩基対、少なくとも約65000~70000塩基対、少なくとも約70000~75000塩基対、少なくとも約75000~80000塩基対、少なくとも約80000~85000塩基対、少なくとも約85000~90000塩基対、少なくとも約90000~95000塩基対、少なくとも約95000~100000塩基対、少なくとも約100000~110000塩基対、少なくとも約110000~120000塩基対、少なくとも約120000~130000塩基対、少なくとも約130000~140000塩基対、少なくとも約140000~150000塩基対、少なくとも約150000~200000塩基対、または少なくとも約200000塩基対超を含む。特定の一実施形態では、9687塩基対が置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは連続している。
0~25000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約25000~30000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約30000~35000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約35000~40000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約40000~45000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約45000~50000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約50000~55000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約55000~60000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約60000~65000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約65000~70000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約70000~75000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約75000~80000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約80000~85000塩基対内、少なくとも約85000~90000塩基対内、ファージゲノム、ファージゲノムの少なくとも約90000~95000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約95000~100000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約100000~110000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約110000~120000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約120000~130000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約130000~140000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約140000~150000塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約150000~200000塩基対内、またはファージゲノムの少なくとも約200000塩基対超内に位置する。特定の一実施形態では、ファージゲノムの9687塩基対が置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは連続している。
15、116、117、118、119、または120個の遺伝子が置換を含む。いくつかの実施形態では、13個の遺伝子が置換を含む。一実施形態では、74個の遺伝子が置換を含む。
ァージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換(phage substitution)、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
する14個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
本明細書中に記載のいくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、操作された大腸菌(Escherichia coli)株Nissle 1917(大腸菌Nissle)である。本明細書の実施例においてより詳細に記載されるように、日常的な試験手順により、大腸菌Nissle 1917(大腸菌Nissle;E. coli Nissle)および関連する操作された誘導体からのバクテリオファージ産生が同定された。バクテリオファージのソースを特定するために、大腸菌Nissleおよび操作された誘導体のゲノムの共同バイオインフォマティクス評価が行われ、プロファージの証拠について菌株のゲノム配列を分析し、機能的ファージ産生の可能性について任意の同定されたプロファージ要素を評価し、任意の機能的ファージ要素を細菌ゲノム配列から同定された他の既知ファージと比較し、他の配列決定された大腸菌(E. coli)ゲノムにおいてプロファージ要素が見つかる頻度を評価した。評価ツールには、ファージ予測ソフトウェア(PHASTおよびPHASTER)、SPAdesゲノムアセンブラソフトウェア、より大きな参照ゲノムに対して低分岐配列をマッピングするためのソフトウェア(BWA MEM)、ゲノム配列アラインメントソフトウェア(MUMmer)、およびアメリカ国立生物工学情報センター(NCBI)非冗長データベースが含まれていた。評価結果は、分析された大腸菌Nissleおよび操作された誘導体が3つの候補プロファージ要素(図1)を含み、3つのうちの2つ(ファージ2およびファージ3)がインタクトファージゲノムに特徴的なほとんどの遺伝的特徴を含むことを示している(図2、図3および図4)。他の2つの可能なファージ要素(図5Aおよび図5B)も同定された。注目すべきことに、操作された株は、親の大腸菌Nissleにおいて同定されなかった追加のファージ要素を全く含まず、このことはこれらの株によって産生されるプラーク形成単位がこれらの内因性ファージの1つに由来することを示している。本明細書に記載されるさらなる分析は、ファージ3をプラーク形成ファージ(ファージ3)として同定した。興味深いことに、他の推定プロファージ要素との相同性の短い領域に限定された関連配列が少数のゲノム中で見つかるものの、ファージ3は、ほぼ6000の配列決定された大腸菌ゲノムのコレクションの中で大腸菌Nissleに固有である。実施例においてより詳細に記載されるように、他のファージのいずれも誘導性ではないが、ファージ3は誘導性であり、誘導時に細菌溶解を引き起こすことが見出された。
も約44~45、少なくとも約45~46、少なくとも約46~47、少なくとも約47~48、少なくとも約48~49、少なくとも約49~50、少なくとも約50~51、少なくとも約51~52、少なくとも約52~53、少なくとも約53~54、少なくとも約54~55、少なくとも約55~56、少なくとも約56~57、少なくとも約57~58、少なくとも約58~59、少なくとも約59~60、少なくとも約60~61、少なくとも約61~62、少なくとも約62~63、少なくとも約63~64、少なくとも約64~65、少なくとも約65~66、少なくとも約66~67、少なくとも約67~68、少なくとも約68~69、少なくとも約69~70、少なくとも約70~71、少なくとも約71~72、少なくとも約72~73、少なくとも約73~74、少なくとも約74~75、少なくとも約75~76、少なくとも約76~77、少なくとも約77~78、少なくとも約78~79、少なくとも約79~80、少なくとも約80~81、少なくとも約81~82、少なくとも約82~83、少なくとも約83~84、少なくとも約84~85、少なくとも約85~86、少なくとも約86~87、少なくとも約87~88、少なくとも約88~89、少なくとも約89~90、少なくとも約90~91、少なくとも約91~92、少なくとも約92~93、少なくとも約93~94、少なくとも約94~95、少なくとも約95~96、少なくとも約96~97、少なくとも約97~98、少なくとも約98~99、少なくとも約99~100、または少なくとも約100以上の改変または変異を含む。
比較して、少なくとも約1%~10%、少なくとも約10%~20%、少なくとも約20%~30%、少なくとも約30%~40%、少なくとも約40%~50%、少なくとも約50%~60%、少なくとも約60%~70%、少なくとも約70%~80%、少なくとも約80%~90%、または少なくとも約90%~100%、細菌宿主の適応度を変化、増大、または減少させる。
いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約1~500塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約500~1000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約1000~2000
塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約1000~2000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約2000~3000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約3000~4000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約4000~5000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約5000~6000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約6000~7000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約7000~8000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約8000~9000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約9000~10000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、少なくとも約10000~15000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の変異は、少なくとも約10000~15000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約15000~20000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約20000~25000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約25000~30000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約30000~35000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約35000~40000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約40000~45000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約45000~50000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約50000~55000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、または少なくとも約55000~60000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。特定の一実施形態では、9687塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムが突然変異している。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドは連続している。
0%が突然変異している。
97%、少なくとも約97%~98%、少なくとも約98%~99%、少なくとも約99%~100%、または少なくとも約100%が完全にまたは部分的に突然変異している。
与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。
するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、ファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。
_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。
0105を包含するか、またはECOLIN_10105内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10110を包含するか、またはECOLIN_10110内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10115を包含するか、またはECOLIN_10115内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10120を包含するか、またはECOLIN_10120内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10125を包含するか、またはECOLIN_10125内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10130を包含するか、またはECOLIN_10130内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10135を包含するか、またはECOLIN_10135内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10140を包含するか、またはECOLIN_10140内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10145を包含するか、またはECOLIN_10145内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10150を包含するか、またはECOLIN_10150内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10160を包含するか、またはECOLIN_10160内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10165を包含するか、またはECOLIN_10165内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10170を包含するか、またはECOLIN_10170内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10175を包含するか、またはECOLIN_10175内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10180を包含するか、またはECOLIN_10180内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10185を包含するか、またはECOLIN_10185内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10190を包含するか、またはECOLIN_10190内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10195を包含するか、またはECOLIN_10195内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10200を包含するか、またはECOLIN_10200内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10205を包含するか、またはECOLIN_10205内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10210を包含するか、またはECOLIN_10210内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10220を包含するか、またはECOLIN_10220内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10225を包含するか、またはECOLIN_10225内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10230を包含するか、またはECOLIN_10230内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10235を包含するか、またはECOLIN_10235内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10240を包含するか、またはECOLIN_10240内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10245を包含するか、またはECOLIN_10245内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10250を包含するか、またはECOLIN_10250内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10255を包含するか、またはECOLIN_10255内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10260を包含するか、またはECOLIN_10260内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10265を包含するか、またはECOLIN_10265内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10270を包含するか、またはEC
OLIN_10270内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10275を包含するか、またはECOLIN_10275内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10280を包含するか、またはECOLIN_10280内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10290を包含するか、またはECOLIN_10290内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10295を包含するか、またはECOLIN_10295内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10300を包含するか、またはECOLIN_10300内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10305を包含するか、またはECOLIN_10305内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10310を包含するか、またはECOLIN_10310内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10315を包含するか、またはECOLIN_10315内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10320を包含するか、またはECOLIN_10320内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10325を包含するか、またはECOLIN_10325内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10330を包含するか、またはECOLIN_10330内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10335を包含するか、またはECOLIN_10335内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10340を包含するか、またはECOLIN_10340内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異は、ECOLIN_10345を包含するか、またはECOLIN_10345内に位置する。
、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な突然変異である。特定の一実施形態では、突然変異は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全なまたは部分的な突然変異である。特定の一実施形態では、突然変異は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な突然変異、ならびにECOLIN_10175の部分的な突然変異である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから突然変異している。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから突然変異している。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含む改変されたファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変されたファージゲノム配列を含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約1~500塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約500~1000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約1000~2000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約1000~2000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約2000~3000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約3000~4000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約4000~5000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約5000~6000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約6000~7000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約7000~8000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約8000~9000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約9000~10000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約10000~15000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、少なくとも約10000~15000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約15000~20000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約20000~25000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約25000~30000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約30000~35000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約35000~40000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約40000~45000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約45000~50000塩基対の大腸菌Nissleファージ
3ゲノム、少なくとも約50000~55000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノム、または少なくとも約55000~60000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。特定の一実施形態では、9687塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムが欠失している。いくつかの実施形態では、欠失したヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、欠失したヌクレオチドは連続している。
も約1%~2%、少なくとも約2%~3%、少なくとも約3%~4%、少なくとも約4%~5%、少なくとも約5%~6%、少なくとも約6%~7%、少なくとも約7%~8%、少なくとも約8%~9%、少なくとも約9%~10%、少なくとも約10%~11%、少なくとも約11%~12%、少なくとも約12%~13%、少なくとも約13%~14%、少なくとも約14%~15%、少なくとも約15%~16%、少なくとも約16%~17%、少なくとも約17%~18%、少なくとも約18%~19%、少なくとも約19%~20%、少なくとも約20%~21%、少なくとも約21%~22%、少なくとも約22%~23%、少なくとも約23%~24%、少なくとも約24%~25%、少なくとも約25%~26%、少なくとも約26%~約27%、少なくとも約27%~28%、少なくとも約28%~29%、少なくとも約29%~30%、少なくとも約30%~31%、少なくとも約31%~32%、少なくとも約32%~33%、少なくとも約33%~34%、少なくとも約34%~35%、少なくとも約35%~36%、少なくとも約36%~37%、少なくとも約37%~38%、少なくとも約38%~39%、少なくとも約39%~40%、少なくとも約40%~41%、少なくとも約41%~42%、少なくとも約42%~43%、少なくとも約43%~44%、少なくとも約44%~45%、少なくとも約45%~46%、少なくとも約46%~47%、少なくとも約47%~48%、少なくとも約48%~49%、少なくとも約49%~50%、少なくとも約50%~51%、少なくとも約51%~52%、少なくとも約52%~53%、少なくとも約53%~54%、少なくとも約54%~55%、少なくとも約55%~56%、少なくとも約56%~57%、少なくとも約57%~58%、少なくとも約58%~59%、少なくとも約59%~60%、少なくとも約60%~61%、少なくとも約61%~62%、少なくとも約62%~63%、少なくとも約63%~64%、少なくとも約64%~65%、少なくとも約65%~66%、少なくとも約66%~67%、少なくとも約67%~68%、少なくとも約68%~69%、少なくとも約69%~70%、少なくとも約70%~71%、少なくとも約71%~72%、少なくとも約72%~73%、少なくとも約73%~74%、少なくとも約74%~75%、少なくとも約75%~76%、少なくとも約76%~77%、少なくとも約77%~78%、少なくとも約78%~79%、少なくとも約79%~80%、少なくとも約80%~81%、少なくとも約81%~82%、少なくとも約82%~83%、少なくとも約83%~84%、少なくとも約84%~85%、少なくとも約85%~86%、少なくとも約86%~87%、少なくとも約87%~88%、少なくとも約88%~89%、少なくとも約89%~90%、少なくとも約90%~91%、少なくとも約91%~92%、少なくとも約92%~93%、少なくとも約93%~94%、少なくとも約94%~95%、少なくとも約95%~96%、少なくとも約96%~97%、少なくとも約97%~98%、少なくとも約98%~99%、少なくとも約99%~100%、または少なくとも約100%が完全にまたは部分的に欠失している。
ァージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。
はそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、ファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。
欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09980を包含するか、またはECOLIN_09980内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09985を包含するか、またはECOLIN_09985内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09990を包含するか、またはECOLIN_09990内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09995を包含するか、またはECOLIN_09995内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10000を包含するか、またはECOLIN_10000内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10005を包含するか、またはECOLIN_10005内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10010を包含するか、またはECOLIN_10010内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10015を包含するか、またはECOLIN_10015内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10020を包含するか、またはECOLIN_10020内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10025を包含するか、またはECOLIN_10025内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10030を包含するか、またはECOLIN_10030内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10035を包含するか、またはECOLIN_10035内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10040を包含するか、またはECOLIN_10040内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10045を包含するか、またはECOLIN_10045内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10050を包含するか、またはECOLIN_10050内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10055を包含するか、またはECOLIN_10055内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10065を包含するか、またはECOLIN_10065内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10070を包含するか、またはECOLIN_10070内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10075を包含するか、またはECOLIN_10075内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10080を包含するか、またはECOLIN_10080内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10085を包含するか、またはECOLIN_10085内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10090を包含するか、またはECOLIN_10090内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10095を包含するか、またはECOLIN_10095内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10100を包含するか、またはECOLIN_10100内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10105を包含するか、またはECOLIN_10105内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10110を包含するか、またはECOLIN_10110内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10115を包含するか、またはECOLIN_10115内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失
は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10120を包含するか、またはECOLIN_10120内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10125を包含するか、またはECOLIN_10125内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10130を包含するか、またはECOLIN_10130内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10135を包含するか、またはECOLIN_10135内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10140を包含するか、またはECOLIN_10140内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10145を包含するか、またはECOLIN_10145内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10150を包含するか、またはECOLIN_10150内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10160を包含するか、またはECOLIN_10160内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10165を包含するか、またはECOLIN_10165内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10170を包含するか、またはECOLIN_10170内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10175を包含するか、またはECOLIN_10175内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10180を包含するか、またはECOLIN_10180内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10185を包含するか、またはECOLIN_10185内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10190を包含するか、またはECOLIN_10190内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10195を包含するか、またはECOLIN_10195内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10200を包含するか、またはECOLIN_10200内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10205を包含するか、またはECOLIN_10205内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10210を包含するか、またはECOLIN_10210内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10220を包含するか、またはECOLIN_10220内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10225を包含するか、またはECOLIN_10225内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10230を包含するか、またはECOLIN_10230内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10235を包含するか、またはECOLIN_10235内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10240を包含するか、またはECOLIN_10240内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10245を包含するか、またはECOLIN_10245内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10250を包含するか、またはECOLIN_10250内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10255を包含するか、またはECOLIN_10255内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10260を包含するか、またはECOLIN_10260内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、
(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10265を包含するか、またはECOLIN_10265内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10270を包含するか、またはECOLIN_10270内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10275を包含するか、またはECOLIN_10275内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10280を包含するか、またはECOLIN_10280内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10290を包含するか、またはECOLIN_10290内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10295を包含するか、またはECOLIN_10295内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10300を包含するか、またはECOLIN_10300内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10305を包含するか、またはECOLIN_10305内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10310を包含するか、またはECOLIN_10310内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10315を包含するか、またはECOLIN_10315内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10320を包含するか、またはECOLIN_10320内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10325を包含するか、またはECOLIN_10325内に位置する。
いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10330を包含するか、またはECOLIN_10330内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10335を包含するか、またはECOLIN_10335内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10340を包含するか、またはECOLIN_10340内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10345を包含するか、またはECOLIN_10345内に位置する。
オナーゼ、インテグラーゼ、およびtRNAメチルトランスフェラーゼから選択される1つ以上のポリペプチド内に位置するか、またはそれらを包含する。一実施形態では、マイナーテールタンパク質U、尾部タンパク質、DNA切断-再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、カプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼの1つ以上が欠失している。
いくつかの実施形態では、挿入は、大腸菌Nissleファージ3ゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、挿入は大腸菌Nissleファージ3ゲノムの調節領域に挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたポリヌクレオチドは、1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約1~500塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約500~1000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約1000~2000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約1000~2000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約2000~3000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約3000~4000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約4000~5000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約5000~6000塩基対の
長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約6000~7000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約7000~8000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約8000~9000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約9000~10000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約10000~15000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約10000~15000塩基対の長さ、少なくとも約15000~20000塩基対の長さ、少なくとも約20000~25000塩基対の長さ、少なくとも約25000~30000塩基対の長さ、少なくとも約30000~35000塩基対の長さ、少なくとも約35000~40000塩基対の長さ、少なくとも約40000~45000塩基対の長さ、少なくとも約45000~50000塩基対の長さ、少なくとも約50000~55000塩基対の長さ、少なくとも約55000~60000塩基対の長さ、少なくとも約60000~65000塩基対の長さ、少なくとも約65000~70000塩基対の長さ、少なくとも約70000~75000塩基対の長さ、少なくとも約75000~80000塩基対の長さ、少なくとも約80000~85000塩基対の長さ、少なくとも約85000~90000塩基対の長さ、少なくとも約90000~95000塩基対の長さ、少なくとも約95000~100000塩基対の長さ、少なくとも約100000~110000塩基対の長さ、少なくとも約110000~120000塩基対の長さ、少なくとも約120000~130000塩基対の長さ、少なくとも約130000~140000塩基対の長さ、少なくとも約140000~150000塩基対の長さ、少なくとも約150000~200000塩基対の長さ、または少なくとも約200000塩基対超の長さを含む。特定の一実施形態では、少なくとも約9687塩基対の長さが挿入される。
0~25000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約25000~30000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約30000~35000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約35000~40000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約40000~45000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約45000~50000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約50000~55000塩基対内、または大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約55000~6000塩基対内に位置する。特定の一実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの9687塩基対が挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。
位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、挿入は散在した位置の1つ以上に位置する。
およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
ジ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10010内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10015内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10020内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10025内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10030内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10035内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10040内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10045内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10050内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10055内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10065内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10070内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10075内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10080内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10085内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10090内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10095内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10100内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10105内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10110内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10115内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10120内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10125内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10130内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10135内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10140内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10145内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10150内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10160内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10165内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10170内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10175内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10180内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10185内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10190内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10195内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10200内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10205内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10210内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10220内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10225内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10230内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10235内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10240内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10245内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10250内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10255内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10260内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10265内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10270内に位置する
。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10275内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10280内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10290内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10295内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10300内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10305内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10310内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10315内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10320内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10325内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10330内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10335内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10340内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入は、ECOLIN_10345内に位置する。
いくつかの実施形態では、逆位は、大腸菌Nissleファージ3ゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、逆位は、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの調節領域に逆位(inverted)される。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、1~500塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約500~1000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約1000~2000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約1000~2000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約2000~3000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約3000~4000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約4000~5000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約5000~6000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約6000~7000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約7000~8000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約8000~9000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約9000~10000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約10000~15000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、少なくとも約10000~15000塩基対、少なくとも約15000~20000塩基対、少なくとも約20000~25000塩基対、少なくとも約25000~30000塩基対、少なくとも約30000~35000塩基対、少なくとも約35000~40000塩基対、少なくとも約40000~45000塩基対、少なくとも約45000~50000塩基対、少なくとも約50000~55000塩基対、または少なくとも約55000~60000塩基対を含む。特定の一実施形態では、9687塩基対が逆位している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは連続している。
、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約9000~10000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約10000~15000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約10000~15000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約15000~20000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約20000~25000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約25000~30000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約30000~35000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約35000~40000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約40000~45000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約45000~50000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約50000~55000塩基対内、または大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約55000~60000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは連続している。
に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。
ジング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
を包含するか、またはECOLIN_09970内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09975を包含するか、またはECOLIN_09975内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09980を包含するか、またはECOLIN_09980内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09985を包含するか、またはECOLIN_09985内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09990を包含するか、またはECOLIN_09990内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09995を包含するか、またはECOLIN_09995内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10000を包含するか、またはECOLIN_10000内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10005を包含するか、またはECOLIN_10005内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10010を包含するか、またはECOLIN_10010内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10015を包含するか、またはECOLIN_10015内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10020を包含するか、またはECOLIN_10020内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10025を包含するか、またはECOLIN_10025内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10030を包含するか、またはECOLIN_10030内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10035を包含するか、またはECOLIN_10035内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10040を包含するか、またはECOLIN_10040内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10045を包含するか、またはECOLIN_10045内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10050を包含するか、またはECOLIN_10050内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10055を包含するか、またはECOLIN_10055内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10065を包含するか、またはECOLIN_10065内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10070を包含するか、またはECOLIN_10070内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10075を包含するか、またはECOLIN_10075内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10080を包含するか、またはECOLIN_10080内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10085を包含するか、またはECOLIN_10085内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10090を包含するか、またはECOLIN_10090内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10095を包含するか、またはECOLIN_10095内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10100を包含するか、またはECOLIN_10100内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10105を包含するか、またはECOLIN_10105内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10110を包
含するか、またはECOLIN_10110内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10115を包含するか、またはECOLIN_10115内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10120を包含するか、またはECOLIN_10120内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10125を包含するか、またはECOLIN_10125内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10130を包含するか、またはECOLIN_10130内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10135を包含するか、またはECOLIN_10135内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10140を包含するか、またはECOLIN_10140内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10145を包含するか、またはECOLIN_10145内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10150を包含するか、またはECOLIN_10150内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10160を包含するか、またはECOLIN_10160内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10165を包含するか、またはECOLIN_10165内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10170を包含するか、またはECOLIN_10170内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10175を包含するか、またはECOLIN_10175内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10180を包含するか、またはECOLIN_10180内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10185を包含するか、またはECOLIN_10185内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10190を包含するか、またはECOLIN_10190内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10195を包含するか、またはECOLIN_10195内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10200を包含するか、またはECOLIN_10200内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10205を包含するか、またはECOLIN_10205内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10210を包含するか、またはECOLIN_10210内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10220を包含するか、またはECOLIN_10220内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10225を包含するか、またはECOLIN_10225内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10230を包含するか、またはECOLIN_10230内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10235を包含するか、またはECOLIN_10235内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10240を包含するか、またはECOLIN_10240内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10245を包含するか、またはECOLIN_10245内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10250を包含するか、またはECOLIN_10250内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10255を包含す
るか、またはECOLIN_10255内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10260を包含するか、またはECOLIN_10260内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10265を包含するか、またはECOLIN_10265内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10270を包含するか、またはECOLIN_10270内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10275を包含するか、またはECOLIN_10275内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10280を包含するか、またはECOLIN_10280内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10290を包含するか、またはECOLIN_10290内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10295を包含するか、またはECOLIN_10295内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10300を包含するか、またはECOLIN_10300内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10305を包含するか、またはECOLIN_10305内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10310を包含するか、またはECOLIN_10310内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10315を包含するか、またはECOLIN_10315内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10320を包含するか、またはECOLIN_10320内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10325を包含するか、またはECOLIN_10325内に位置する。
いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10330を包含するか、またはECOLIN_10330内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10335を包含するか、またはECOLIN_10335内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10340を包含するか、またはECOLIN_10340内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は、(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10345を包含するか、またはECOLIN_10345内に位置する。
5、cIリプレッサー、未知の機能のドメイン(DUF4222);DNAリコンビナーゼ、多数の抗生物質耐性調節因子(MarR)、P22における未知のead様タンパク質、機能不明のタンパク質(DUF550);3’-5’エキソヌクレアーゼ、エキシシオナーゼ、インテグラーゼ、およびtRNAメチルトランスフェラーゼから選択される1つ以上のポリペプチド内に位置するか、またはそれらを包含する。一実施形態では、マイナーテールタンパク質U、尾部タンパク質、DNA切断-再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、カプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼの1つ以上が逆位している。特定の一実施形態では、マイナーテールタンパク質U、尾部タンパク質、DNA切断-再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、カプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼが逆位している。
いくつかの実施形態では、置換は、大腸菌Nissleファージ3ゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、置換は、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの調節領域に置換される(substituted)。いくつかの実施形態では、置換は、1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約1~500塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約500~1000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約1000~2000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約1000~2000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約2000~3000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約3000~4000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約4000~5000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約5000~6000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少な
くとも約6000~7000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約7000~8000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約8000~9000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約9000~10000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約10000~15000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、少なくとも約10000~15000塩基対、少なくとも約15000~20000塩基対、少なくとも約20000~25000塩基対、少なくとも約25000~30000塩基対、少なくとも約30000~35000塩基対、少なくとも約35000~40000塩基対、少なくとも約40000~45000塩基対、少なくとも約45000~50000塩基対、少なくとも約50000~55000塩基対、少なくとも約55000~60000塩基対、少なくとも約60000~65000塩基対、少なくとも約65000~70000塩基対、少なくとも約70000~75000塩基対、少なくとも約75000~80000塩基対、少なくとも約80000~85000塩基対、少なくとも約85000~90000塩基対、少なくとも約90000~95000塩基対、少なくとも約95000~100000塩基対、少なくとも約100000~110000塩基対、少なくとも約110000~120000塩基対、少なくとも約120000~130000塩基対、少なくとも約130000~140000塩基対、少なくとも約140000~150000塩基対、少なくとも約150000~200000塩基対、または少なくとも約200000塩基対超を含む。特定の一実施形態では、9687塩基対が置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、置換ヌクレオチドは連続している。
大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約45000~50000塩基対内、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約50000~55000塩基対内、または大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約55000~60000塩基対内に位置する。特定の一実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの9687塩基対が置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは連続している。
めの領域は、他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定され得る。ファージ中の相同な保存領域は保存されており、1つ以上の必須遺伝子を含み得るので、置換に適している場合がある。いくつかの実施形態では、プロモーターなどの調節エレメントが置換される。いくつかの実施形態では、コード配列が置換される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換領域は、溶菌サイクルに必須の1つ以上の遺伝子を含む。
せに関与するポリペプチドをコードする1個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする3個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする4個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする5個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、
86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10065内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10070内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10075内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10080内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10085内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10090内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10095内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10100内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10105内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10110内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10115内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10120内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10125内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10130内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10135内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10140内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10145内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10150内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10160内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10165内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10170内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10175内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10180内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10185内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10190内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10195内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10200内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10205内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10210内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10220内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10225内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10230内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10235内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10240内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10245内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10250内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10255内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10260内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10265内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10270内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10275内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10280内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10290内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10295内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10300内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10305内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10310内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10315内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10320内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10325内に位置する
。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10330内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10335内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10340内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換は、ECOLIN_10345内に位置する。
ァージ3ゲノムから置換される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから置換される。
いくつかの実施形態では、突然変異した内因性ファージを含む細菌細胞は、ペイロードが宿主細胞において発現され得、かつ宿主細胞がin vitroで(例えば、培地中で)および/またはin vivoで(例えば、腫瘍微小環境で)生存および/または増殖することができるように、ペイロードをコードする遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体をさらに含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、2個以上の異なるペイロードまたはオペロン、例えば、2個以上のペイロード遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、3個以上の異なるトランスポーターまたはオペロン、例えば、3個以上のペイロード遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、少なくとも約4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上の異なるペイロードまたはオペロン、例えば、少なくとも約4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のペイロード遺伝子を含む。
rans-cinnamic,benzoic and hippuric acid metabolites in biological fluids in a single GC-MS analysis)。PAL酵素活性はTHB補因子活性を必要としない。
mirabilis:general properties」 Biochimie
54:1359~1374頁)。
のプロモーターなどの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチドをコードする遺伝子配列および1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は異なるプロモーターの制御下にあって、当該プロモーターは本明細書に記載のいずれかの環境条件および本明細書に記載のいずれかのプロモーターなどの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチドをコードする遺伝子配列および1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチドをコードする遺伝子配列および1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該PAL遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にあり、当該LAAD遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチドをコードする遺伝子配列および1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該LAAD遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にあり、当該PAL遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にある。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、1つ以上のPheトランスポーターポリペプチドをコードする遺伝子配列をさらに含み得、当該遺伝子配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得、Palおよび/またはLAAD遺伝子配列を制御するプロモーターと同じまたは異なるプロモーターであり得る。
S2017/016603(出願日2017年2月3日)、PCT/US2017/016609(出願日2016年2月4日)、PCT/US2017/017563(出願日2017年2月10日)、PCT/US2017/017552(出願日2017年2月10日)、PCT/US2016/044922(出願日2016年7月29日)、PCT/US2016/049781(出願日2016年8月31日)、PCT/US2016/37098(出願日2016年6月10日)、PCT/US2016/069052(出願日2016年12月28日)、PCT/US2016/32562(出願日2016年5月13日)、PCT/US2016/062369(出願日2016年11月16日)、およびPCT/US2017/013072に記載されており、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
ヌレニン産生酵素、セロトニンまたはメラトニン産生または分解酵素、(本明細書に記載の)インドール代謝産物産生または分解酵素、KP代謝産物産生または分解酵素を含む、1つ以上のエフェクター分子またはペイロードをコードする任意のまたは複数の遺伝子および/または遺伝子配列および/または遺伝子カセットを含む。目的の追加の遺伝子の非限定的な例は、係属中の共同所有の国際特許出願PCT/US2016/34200(出願日2016年5月25日)、PCT/US2017/013072(出願日2017年1月11日)、PCT/US2017/016603(出願日2017年2月3日)、PCT/US2017/016609(出願日2016年2月4日)、PCT/US2017/017563(出願日2017年2月10日)、PCT/US2017/017552(出願日2017年2月10日)、PCT/US2016/044922(出願日2016年7月29日)、PCT/US2016/049781(出願日2016年8月31日)、PCT/US2016/37098(出願日2016年6月10日)、PCT/US2016/069052(出願日2016年12月28日)、PCT/US2016/32562(出願日2016年5月13日)、PCT/US2016/062369(出願日2016年11月16日)、およびPCT/US2017/013072に記載されており、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
件(例えば、in vivoおよび/またはin vitroおよび/または産生/製造条件)によって間接的に誘導される。
本発明の遺伝子操作された細菌は、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含み、当該遺伝子または遺伝子カセットは、外因性環境条件によって制御される直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは酸素レベル依存性プロモーターであり、目的のポリぺプチドは低酸素、微好気性、または嫌気性条件において発現される。例えば、低酸素条件において、酸素レベル依存性プロモーターは、対応する酸素レベル感知転写因子によって活性化され、それによって、目的のポリぺプチドの産生を駆動する。
ターによって制御される。いくつかの実施形態では、ペイロードのための1つ以上の遺伝子配列は、CRP結合部位に融合されたFNRプロモーターによって制御される。これらの実施形態では、サイクリックAMPは、グルコースが環境中に存在しない場合にCRPに結合する。この結合により、CRPのコンホメーション変化が引き起こされ、CRPがその結合部位に強く結合することが可能になる。次いで、CRP結合は、直接的タンパク質間相互作用を介してFNRプロモーターにRNAポリメラーゼをリクルートすることにより、遺伝子または遺伝子カセットの転写を活性化する。グルコースの存在下では、サイクリックAMPはCRPに結合せず、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットの転写は抑制される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子対する結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーター(例えば、FNRプロモーター)は、(例えば、グルコースをin vitroで増殖培地に添加することによって)十分な量のグルコースが存在する場合に、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが嫌気性条件下で発現されないこと確実にするために使用される。
施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ペイロードをコードする遺伝子とは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ペイロードをコードする遺伝子とは、同じプラスミド上に存在する。
FNRS24Yを含むシステムなどの酸素レベル非依存性誘導性プロモーターシステムは、PCT/US2016/062369(出願日2016年11月16日、WO2017087580として公開)に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失を含む。ファージ3ゲノム。一実施形態では、配列番号130を含む配列が、ファージ3ゲノムから欠失している。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含む改変されたファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変されたファージゲノム配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝的に操作されたウイルスは、誘導性プロモーターの制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、炎症状態によって活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルス。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子は、炎症性環境において活性化される炎症依存性プロモーター、例えば、反応性窒素種またはRNSプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、少なくとも1つの反応性窒素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域を含む。(例えば、反応性窒素種によって誘導可能な)好適なRNS誘導性プロモーターは、国際特許出願PCT/US2016/062369(出願日2016年11月16日、WO2017087580として公開)に記載され、WO2017/123675として公開され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルスは、誘導性プロモーターの制御下で発現されるペイロードを産生するための遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞障害の条件によって活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルス。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子は、細胞または組織損傷が存在する環境、例えば、反応性酸素種またはROSプロモーターにおいて活性化される細胞損傷依存性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、少なくとも1つの反応性酸素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域を含む。例えば反応性酸素種によって誘導可能な、好適なROS誘導性プロモーターは、国際特許出願PCT/US2017/0130
72(出願日2017年1月11日、WO2017/123675として公開)、国際特許出願PCT/US2016/032562(出願日2016年5月13日、WO2016183531として公開)、およびPCT/US2016/062369(出願日2016年11月16日、WO2017087580として公開)に記載されており、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、環境(例えば、腫瘍微小環境、特定の組織、または哺乳動物の消化管)における特定の分子または代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される1つ以上のペイロード遺伝子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。例えば、短鎖脂肪酸プロピオネートは、消化管に局在する主要な微生物発酵代謝産物である(Hosseiniら、2011年)。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プロピオネート誘導性
プロモーターの制御下にある。より具体的な実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、哺乳動物の消化管内のプロピオネートの存在によって活性化されるプロピオネート誘導性プロモーターの制御下にある。健康状態および/または疾患状態の哺乳動物の消化管に見出される任意の分子または代謝産物が、ペイロード発現を誘導するために使用され得る。誘導物質の非限定的な例としては、プロピオネート(propionate)、ビリルビン(bilirubin)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子II、VII、IX、およびX、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファフェトプロテイン(alpha fetoprotein)、抗ミトコンドリア、平滑筋、および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン(ceruloplasmin)、アンモニア、およびマンガンが挙げられる。代替の実施形態では、治療用ポリペプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、糖アラビノースの存在下で活性化されるpAraBADプロモーターの制御下にある。
vivoで(例えば、消化管または腫瘍微小環境において)生存および/または増殖することができるように、目的のポリペプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、細菌は、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットの複数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、低コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、非誘導条件下で漏出発現(leaky expression)を減少させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを
産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、高コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、遺伝子または遺伝子カセットの発現を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体上で発現される。
いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする遺伝子はプラスミド上に存在し、1つ以上の栄養性および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする遺伝子は染色体中に存在し、1つ以上の栄養性および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、IPTGまたは他のLacI誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体上に存在し、IPTGまたは他のLacI誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。
る。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、PALをコードする遺伝子とは、同じ染色体上に存在する。
、プロモーターは細菌培養物に添加される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、化学的および/または栄養性誘導物質および/または代謝産物によって誘導される培養物は、好気的に増殖される。いくつかの実施形態では、化学的および/または栄養性誘導物質および/または代謝産物によって誘導される培養物は、嫌気的に増殖される。
に配置されて、その発現を駆動し、ここで、アラビノース誘導性プロモーターが第1セットの外因性条件下で発現を駆動し、第2のプロモーターが第2セットの外因性条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第1および第2の条件は、2つの連続した培養条件(すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器における培養物の調製中の条件、例えば、アラビノースおよびIPTG)であり得る。別の非限定的な例では、第1の誘導条件は、例えば、アラビノースの存在を含む培養条件であり得、第2の誘導条件はin
vivo条件であり得る。そのようなin vivo条件には、低酸素、微好気性、もしくは嫌気性条件、消化管代謝産物の存在、および/または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上のアラビノースプロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するFNRプロモーターと組み合わされて、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。
epression)の重要な調節因子であるCRP-cAMP複合体の結合を必要とする。あるいは、rhaBADからの誘導性発現は、本明細書に記載されるように、リボソーム結合部位(RBS)の最適化を通じて制御または微調整され得る。一実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質の発現は、1つ以上のラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。一実施形態では、ペイロードの発現は、ラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。
、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む。
件であり得る。そのようなin vivo条件には、低酸素、微好気性、もしくは嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および/または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上のIPTG誘導性プロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するFNRプロモーターと組み合わされて、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。
の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質および/または転写調節因子(例えば、FNRS24Y)の発現は、in vivoで1つ以上のテトラサイクリン誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される分子、例えば、テトラサイクリンによって直接的または間接的に誘導される。
7%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表18の配列番号34のイタリック体の配列(Tetリプレッサーはイタリック体である)のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子配列を含む。
的または誘導性プロモーター)と一緒に、目的の1つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、2つのプロモーターが構築物の近位に配置されて、その発現を駆動し、ここで、温度調節プロモーターが第1セットの外因性条件下で発現を駆動し、第2のプロモーターが第2セットの外因性条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第1および第2の条件は、2つの連続した培養条件(すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器における培養物の調製中の条件、例えば、温度調節およびアラビノース)であり得る。別の非限定的な例では、第1の誘導条件は培養条件、例えば許容温度であり得、第2の誘導条件はin vivo条件であり得る。そのようなin vivo条件には、低酸素、微好気性、もしくは嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および/または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上の温度調節プロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するFNRプロモーターと組み合わされて、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。
ターの制御下で発現されるリプレッサーによって間接的に調節される。
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子はプラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は染色体上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は染色体上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。
くつかの実施形態では、プロモーターは、in vitro条件(例えば、本明細書に記載されるような様々な細胞培養および/または細胞製造条件)下で活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、in vivo条件(例えば、本明細書に記載されるような消化管および/または腫瘍微小環境の条件)下、ならびにin vitro条件(例えば、本明細書に記載されるような様々な細胞培養および/または細胞産生および/または細胞製造条件)下で活性である。
vitroおよび/または産生/製造条件)において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的な、および/または腫瘍微小環境の条件に特異的な外因性環境条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の小腸に特異的な外因性環境条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の消化管の環境および/または腫瘍微小環境の条件などの低酸素または嫌気性条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の消化管および/または腫瘍微小環境の条件に特異的な分子または代謝産物の存在下で活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、細菌細胞と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、in vitro培養、細胞産生および/または製造条件の間に存在する分子または代謝産物または他の条件の存在下で活性である。
いくつかの実施形態では、リボソーム結合部位が追加、スイッチアウト(switched out)、または置換される。いくつかのリボソーム結合部位を試験することによって、発現レベルを所望のレベルに微調整することができる。RBSの非限定的な例は、標準生物学的パーツ・レジストリに列挙され、WO2017/123675として公開されたPCT/US2017/013072(出願日2017年1月11日)に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。
培養中のペイロードの誘導は、WO2017/123675として公開された国際特許出願PCT/US2017/013072(出願日2017年1月11日)、WO2016183531として公開された国際特許出願PCT/US2016/032562(出願日2016年5月13日)、およびWO2017087580として公開されたPCT/US2016/062369(出願日2016年11月16日)に記載されており、それらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
1つ以上のタンパク質を発現する。そのような培養条件は、例えば細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および/または製造の間に使用されるフラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器中において提供され得る。本明細書中で使用される場合、「細菌培養物」または「細菌細胞培養物」または「培養物」という用語は、細胞増殖、細胞増幅、回収、精製、発酵、および/または製造を含むいくつかの生産プロセス中にin vitroで維持または増殖される細菌細胞または微生物を指す。本明細書中で使用される場合、「発酵」という用語は、定義された条件下での細菌の増殖、増幅、および維持を指す。発酵は、嫌気性または低酸素または酸素化条件、誘導物質、栄養素の存在下、定義された温度などを含む多くの細胞培養条件下で起こり得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、培養中の嫌気性または低酸素条件下で誘導される。そのような場合、一定の密度(例えば、1×108~1×1011の範囲)を示す一定のOD(例えば、0.1~10の範囲内のOD)および指数関数的増殖に達するまで、(例えば、1.5~3時間)細胞を増殖させ、その後、嫌気性または低酸素条件に約3~5時間切り替える。いくつかの実施形態では、株は、例えばFNRプロモーター活性を誘導し、1つ以上のFNRプロモーターの制御下で1つ以上のペイロードおよび/またはトランスポーターの発現を駆動するために、嫌気性または低酸素条件下で誘導される。
型、および/または製造の間に誘導される。一実施形態では、目的のいくつかのタンパク質の発現は、1つ以上のFNRプロモーターの制御下にあり、嫌気性または低酸素条件下での細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および/または産生の間に誘導される。
vivoで、これらのプロモーターからのペイロードの発現を可能にし得る。
いくつかの実施形態では、好気性条件下で株を調製、プレロード、プレ誘導することが望ましい。これにより、より効率的な増殖および生存が可能になり、場合によっては、毒性代謝産物の蓄積が減少する。そのような場合、一定の密度(例えば、1×108~1×1011の範囲)を示す一定のOD(例えば、0.1~10の範囲内のOD)および指数関数的増殖に達するまで、(例えば、1.5~3時間)細胞を増殖させ、その後、誘導物質の添加または他の手段(例えば、許容温度へのシフト)により、約3~5時間誘導する。
いくつかの実施形態では、生存能力、増殖、および活性は、微好気性条件下で細菌株をプレ誘導することによって最適化される。いくつかの実施形態では、微好気性条件は、最適な増殖、活性および生存能力の条件と、誘導のための最適条件との間の「バランスをと
る」のに最適である;特に、1つ以上のペイロードの発現が、嫌気性および/または低酸素プロモーター(例えば、FNRプロモーター)によって駆動される場合。そのような場合、例えば、一定の密度(例えば、1×108~1×1011の範囲)を示す一定のOD(例えば、0.1~10の範囲内のOD)および指数関数的増殖に達するまで、(例えば、1.5~3時間)細胞を増殖させ、その後、誘導物質の添加または他の手段(例えば、許容温度へのシフト)により、約3~5時間誘導する。
微生物は、それらの培養の容易さ、短い世代時間、非常に高い集団密度および小さいゲノムのため、短縮されたタイムスケールで固有の表現型に進化され得る。適応実験室進化(ALE)は、好ましい表現型を有する株を進化させるために、選択圧下で微生物を継代するプロセスである。最も一般的には、これは、炭素/エネルギー源の利用を増大させるために、または環境ストレス(例えば、温度、pH)に株を適応させるために適用され、それにより、炭素基質上またはストレス下で増殖する能力がより高い突然変異株は、集団内の適応性がより低い菌株を打ち負かすことになり、最終的には集団を支配するようになる。
、栄養要求株を作製して、代謝産物の量を減少させながらそれを継代することによって、得られる優性株はこの必須代謝産物を獲得する能力および組み込む能力がより高いはずである。
異原の培地への添加により、加速させることができる。しかし、連続継代の結果、増殖速度の向上がほとんどまたは全くなくなると、集団は、ある適応度最大値に収束し、ALE実験を停止することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トランスポーターをコードする遺伝子をさらに含む。トランスポーターは、細胞内へのフェニルアラニン輸送を増強するために、本発明の遺伝子操作された細菌において発現または改変され得る。そのようなトランスポーターの非限定的な例は、係属中の国際特許出願PCT/US2016/032565に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。
非改変細菌と比較して、血中フェニルアラニンを少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍低減させるために、哺乳動物の消化管の低酸素環境などの外因性環境条件下でPALを産生する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、哺乳動物の消化管の低酸素環境などの外因性環境条件下でPALを産生し、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して、尿中の馬尿酸を少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍増加させる。特定の非改変細菌は、感知できるレベルのフェニルアラニンの馬尿酸へのプロセシングを有さないであろう。これらの細菌の遺伝子改変型を使用した実施形態では、フェニルアラニンのPAL媒介性プロセシングは外因性環境条件下で感知できる。
AL、PAH、および/またはLAADを産生し、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍、血中のフェニルアラニンを減少および/または培地中のトランス-ケイ皮酸を増加させる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、1つ以上のPheトランスポーターポリペプチドをコードする遺伝子配列をさらに含み得る。
を容易に横切ることができる。したがって、遺伝子操作された細菌がLAADを発現する実施形態では、トランスポーターは、フェニルアラニン代謝を必要としなくてもよいか、または改善しなくてもよい。
Tetプロモーター配列を含む例示的な構築物の配列(配列番号30B)を示し、pheP配列には下線が引いてあり、TetR配列は四角で囲い、FNRプロモーター配列は太字である。
菌の出発点、親株、または「シャシー(chassis)」として使用される。一実施形態では、改変されたバクテリオファージは、その自然状態で大腸菌Nissleに対して内因性であるファージである。
_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含む改変されたファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変されたファージゲノム配列を含む。
LAADの触媒活性は酸素に依存し、従って、腸(例えば、結腸)内の嫌気性および/または低酸素環境において活性でないかもしれない。酸素は、胃腸管のより近位の区画に存在する。
れ、第2の酵素(例えば、PAL)は、FNRプロモーターの制御下で、結腸において発現される。いくつかの実施形態では、PALは、例えばFNRプロモーター、構成的プロモーターまたは本明細書中に記載される別の誘導性プロモーターの制御下で、小腸において見出される条件下で発現される。いくつかの実施形態では、PALおよび/またはLAADは、in vivo投与前にプレ誘導され、腸の近位部分において発現されて活性である。いくつかの実施形態では、PALおよび/またはLAADは、in vivo投与前に(本明細書に記載されるように、好気的もしくは嫌気的に、または化学的および/もしくは栄養性誘導物質有りまたは無しで)プレ誘導され、腸の遠位部分において発現されて活性である。
細菌がPMEをコードする遺伝子を含むいくつかの実施形態では、細菌は、フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子をさらに含み得る。フェニルアラニントランスポーターは、細胞内へのフェニルアラニン輸送を増強するために、本発明の遺伝子操作された細菌において発現または改変され得る。
nRSプロモーターまたはP(Bla)プロモーター)、または構成的プロモーターによって制御されるpheP遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および/または転写調節因子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および/または転写調節因子の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子およびフェニルアラニン代謝酵素および/または転写調節因子は、プロモーター領域から分岐して転写される。いくつかの実施形態では、PheP、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子のそれぞれの発現は、異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、PheP、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の発現は、同じプロモーターによって制御される。
ター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上に存在する。代替の実施形態では、大腸菌Nissleにおける天然pheP遺伝子は改変されておらず、異なる細菌由来の非天然pheP遺伝子のコピーが、PALの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター(例えば、FNRプロモーター)、またはPALの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上に存在する。
(例えば、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるWO2017087580の図66を参照のこと)。挿入部位は、ゲノムのどこにあってもよく、例えば、(栄養要求株を作り出すため)thyAなどの生存および/もしくは増殖に必要とされる遺伝子内、ゲノム複製部位付近などのゲノムの活性領域内、ならびに/またはアラビノースオペロンのAraBとAraCとの間のなどの意図しない転写のリスクを低減させるための分岐プロモーターの間にあってよい。
れておらず、天然pheP遺伝子の1つ以上の追加コピーが、PALの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター(例えばFNRプロモーター)、またはPALの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム内に挿入される。代替の実施形態では、天然pheP遺伝子は改変されておらず、異なる細菌種由来の非天然pheP遺伝子のコピーが、PALの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター(例えば、FNRプロモーター)、またはPALの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム内に挿入される。
の異なる輸送系(AroP、Mtr、PheP、TnaB、およびTyrP)を有することが報告されている。aroP遺伝子によってコードされる一般的なアミノ酸パーミアーゼは、フェニルアラニンを含む3つの芳香族アミノ酸を高親和性で輸送し、PhePと一緒に、フェニルアラニン取り込みの最大の部分を担うと考えられている。さらに、低レベルのフェニルアラニンの蓄積が芳香族アミノ酸トランスポーター欠損大腸菌株(ΔaroPΔphePΔmtrΔtnaΔtyrP)において観察され、LIV-I/LS系の活性まで追跡され、そのLIV-I/LS系は、2つのペリプラズム結合タンパク質である、LIV結合タンパク質(LIV-I系)およびLS結合タンパク質(LS系)、ならびに膜成分であるLivHMGFからなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターである(Koyanagiら、およびその中の参考文献;Identification of the
LIV-I/LS System as the Third Phenylalanine Transporter in Escherichia coli K-12)。
本開示のいくつかの実施形態では、EcNのゲノムに対する改変は、ジアミノピメリン酸栄養要求性を介して生物学的封じ込めを増強しながら、消化管内に見出される低酸素条件下でのフェニルアラニン分解を増強するために行われた。これらの遺伝子操作された細菌は、内因性EcNファージ3に対する1つ以上の改変をさらに含む。
0の図66に示されるその他のものが挙げられるが、これらに限定されず、その全内容は参照により本明細書に援用される。例えば、遺伝子操作された細菌は4つの異なった挿入部位、例えば、malE/K、insB/I、araC/BAD、およびlacZに挿入されたペイロードの4つのコピーを含むことができる。遺伝子操作された細菌はまた、4つの異なる挿入部位(例えば、malE/K、yicS/nepI、agaI/rsmI、およびcea)に挿入された同一または異なるペイロードの4つのコピー、ならびに異なる挿入部位(例えば、lacZ)に挿入された第3の同一または異なる遺伝子の1つのコピーを含み得る(WO2017087580の図13Bを参照。その全内容は参照により本明細書に援用される)。あるいは、遺伝子操作された細菌が3つの異なった挿入部位(例えば、malE/K、insB/I、およびlacZ)に挿入されたペイロードの3つのコピーを含み得る。
leファージ3ゲノム内に、1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、以下から選択される1つ以上の遺伝子を(完全にまたは部分的に)包含するか、または以下から選択される1つ以上の遺伝子内に位置する:ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09975、ECOLIN_09980、ECOLIN_09985、ECOLIN_09990、ECOLIN_09995、ECOLIN_10000、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10055、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
本明細書中に記載されるPMEおよび/またはPheトランスポーターの誘導および前誘導のために、PCT/WO2017/087580A1に記載されるように、プロトコールおよび戦略が使用され、その全内容は参照により本明細書に明確に援用される。
指標として使用され得る。したがって、フェニルアラニンの減少および/またはTCAの産生の測定は、in vivo投与前の治療株の誘導を測定および監視し、微調整するために使用され得る。
09985、ECOLIN_09990、ECOLIN_09995、ECOLIN_10000、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10055、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。具体的な一実施形態において、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列はファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
700倍、少なくとも約800倍、少なくとも約900倍、少なくとも約1,000倍、または少なくとも約1,500倍高いレベルで行う。
Eおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする1つ以上の遺伝子が細菌細胞の染色体に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列は低コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列は高コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、少なくとも1つのPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)の発現を増加させるために有用であり得る。いくつかの実施形態では、上記の遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の内在性遺伝子における改変、突然変異、および/または欠失のうち1つ以上をさらに含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、1つ以上の内因性バクテリオファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の1つ以上の遺伝子において変異されている。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、1つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または1つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含し得る。
よびECOLIN_10345。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号73)、これは、内因性アラビノースプロモーターからバイシストロニックメッセージとして転写される。ゲノムは、dapA遺伝子が欠失しているdapA栄養要求性を含むようにさらに操作される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、SYN-PKU708である。
、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載される1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的または完全に欠失される。
プロモーターの制御下にある)PhePの2コピー、および(内因性ParaBADプロモーターの制御下にある)LAADの1コピー、ならびに抗生物質耐性および栄養要求性(例えば、ΔdapA)を含む。
的プロモーター2(P1)-Kis抗毒素)。この株は、bla遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の図65Bの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の図61Aに示されるプラスミドをさらに含む(LacI Fnrs-Ptac-PAL-PAL、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号97)。一実施形態では、株はSYN-PKU1001である。
参照により本明細書に援用されるWO2017087580の図65Bの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含む(LacI Fnrs-Ptac-PAL-PAL、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号97)。一実施形態では、株はSYN-PKU1005である。
97)。一実施形態では、株はSYN-PKU1009である。
O2017087580の図65Dの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含む(lacI-Ptac-PAL-PAL、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号98)。一実施形態では、株はSYN-PKU1014である。
PAL-PAL-PheP、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号96)。一実施形態では、株はSYN-PKU1018である。
れることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含む(LacI Fnrs-Ptac-PAL-PAL-PheP、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号96)。一実施形態では、株はSYN-PKU1022である。
、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号96)。一実施形態では、株は、SYN-PKU1026である。
O2017087580の図65Aの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含む(LacI Fnrs-Ptac-PAL-PAL-PheP、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号95)。一実施形態では、株はSYN-PKU1032である。
LIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
P、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)と、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)と、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含み、フェニルアラニントランスポーターの1つ以上のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)と、PAHの1つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下に)と、PAHの1つ以上のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの1つ以上のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAHの1つ以上のコピーと、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAHの1つ以上のコピーと、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含み、フェニルアラニントランスポーターの1つ以上のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。PMEおよびトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれ得る。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAHの1つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAHの1つ以上のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの1つ以上のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)を含み、フェニルアラニントランスポーターの1つ以上のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびPAHの1つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモー
ターの制御下)、PAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびPAHの1つ以上のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの1つ以上のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、PAHの1つ以上のコピー、およびPAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、PAHの1つ以上のコピー、およびPAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)を含み、フェニルアラニントランスポーターの1つ以上のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。PMEおよび/またはトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれ得る。あるいは、PMEおよび/またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。PMEおよび/またはトランスポーターは、低または高コピープラスミドに含まれるPMEおよび/またはトランスポーターと組み合わせて、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれ得る。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAHの1つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PAL1の1つ以上のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つ以上のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAHの1つ以上のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの1つ以上のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。PMEおよびトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれ得る。あるいは、PMEおよび/またはトランスポーターは、低または高コピープラスミドに含まれてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissle由来であり、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの1つのコピー(例えば、PA
L1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。
20、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの3つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの3つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissle由来であり、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの4つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの4つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの4つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの4つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。これらの
実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの5つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの5つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの5つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの5つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。
非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的にまたは完全に欠失されている。
100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
a)高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)フォトラブダス(Photorhabdus)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL‐アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする1つ以上の遺伝子;
d)栄養要求性を生成するための内因性遺伝子(例えば、dapAまたはThyA)の1つ以上の欠失;
e)抗生物質耐性;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
a)高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)フォトラブダス(Photorhabdus)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL‐アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする1つ以上の遺伝子;
d)栄養要求性を生成するための内因性遺伝子(例えば、dapAまたはThyA)の1つ以上の欠失;および
e)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
IN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
a)高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)フォトラブダス(Photorhabdus)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL‐アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする1つ以上の遺伝子;
d)栄養要求性を生成するための内因性遺伝子(例えば、dapAまたはThyA)の1つ以上の欠失;および
e)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
N_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
a)外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)化学的誘導物質または栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の1つ以上のコピー;
d)PALの発現を誘導する化学的誘導物質と同一または異なった化学的誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にある、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL-アミノ酸デミナーゼ(LAAD)をコードする1つ以上の遺伝子;
e)栄養要求性を生成するための内因性遺伝子(例えば、dapAまたはThyA)の1つ以上の欠失;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
N_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
a)外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)化学的誘導物質または栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の1つ以上のコピー;
d)PALの発現を誘導する化学的誘導物質と同一または異なった化学的誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にある、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL-アミノ酸デミナーゼ(LAAD)をコード化する1つ以上の遺伝子;
e)栄養要求性を生成するための内因性遺伝子(例えば、dapAまたはThyA)の
1つ以上の欠失;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
a)外因性環境条件で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の2つの追加コピー;
b)外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の3つのコピー;
c)化学的誘導物質または栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の2つのコピー;
d)PALの発現を誘導する化学的誘導物質と同一または異なった化学的誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にある、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL-アミノ酸デミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の1つのコピー;
e)栄養要求性を生成するための内因性dapAの1つ以上の欠失;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
N_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
a)嫌気性誘導性プロモーター(PfnrS)および嫌気性応答性転写活性化因子FNRの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)PfnrSおよびFNRの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)合成プロモーター(Ptac)およびラクトース応答性転写リプレッサーLacIの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の1つ以上のコピー;
d)アラビノース誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性化因子AraCの調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする1つ以上の遺伝子;
e)栄養要求性を生成するための内因性遺伝子(例えば、dapAまたはThyA)の1つ以上の欠失;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
N_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
a)嫌気性誘導性プロモーター(PfnrS)および嫌気性応答性転写活性化因子FNRの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)PfnrSおよびFNRの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)合成プロモーター(Ptac)およびラクトース応答性転写リプレッサーLacIの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の1つ以上のコピー;
d)アラビノース誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性化因子AraCの調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする1つ以上の遺伝子;
e)栄養要求性を生成するための内因性遺伝子(例えば、dapAまたはThyA)の1つ以上の欠失;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば
、欠失、挿入、置換または逆位)。
a)lacZおよびagal/rsml遺伝子座で染色体に挿入された、嫌気性誘導性プロモーター(PfnrS)および嫌気性応答性転写活性化因子FNRの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の2つの追加コピー;
b)malEK、malPT、およびyicS/nepI遺伝子座で染色体に挿入された、PfnrSおよびFNRの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の3つのコピー;
c)exo/ceaおよびrhtC/rhtB遺伝子座に挿入された、合成プロモーター(Plac)およびラクトース応答性転写リプレッサーLacIの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の2つの追加コピー;
d)
e)アラビノース誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性化因子(AraC)の調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の1つのコピー(LAADは天然アラビノースプロモーター下にある);
f)ジアミノピメリン酸栄養要求株を作製するための4-ヒドロキシ-テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするdapA遺伝子の欠失;および大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
IN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
a)lacZおよびagal/rsml遺伝子座で染色体に挿入された、嫌気性誘導性プロモーター(PfnrS)および嫌気性応答性転写活性化因子FNRの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の2つの追加コピー;
b)malEK、malPT、およびyicS/nepI遺伝子座で染色体に挿入された、PfnrSおよびFNRの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の3つのコピー;
c)exo/ceaおよびrhtC/rhtB遺伝子座に挿入された、合成プロモーター(Plac)およびラクトース応答性転写リプレッサーLacIの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の2つの追加コピー;
d)アラビノース誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性化因子(AraC)の調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の1つのコピー(LAADは天然アラビノースプロモーター下にある);
e)ジアミノピメリン酸栄養要求株を作製するための4-ヒドロキシ-テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするdapA遺伝子の欠失;および
f)欠失領域が、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、および部分的にECOLIN_10165を含む、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の領域の欠失。
a)lacZおよびagal/rsml遺伝子座で染色体に挿入された、嫌気性誘導性プロモーター(PfnrS)および嫌気性応答性転写活性化因子FNRの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の2つの追加コピー;
b)malEK、malPT、およびyicS/nepI遺伝子座で染色体に挿入され
た、PfnrSおよびFNRの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の3つのコピー;
c)exo/ceaおよびrhtC/rhtB遺伝子座に挿入された、合成プロモーター(Plac)およびラクトース応答性転写リプレッサーLacIの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の2つの追加コピー;
d)アラビノース誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性化因子(AraC)の調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の1つのコピー(LAADは天然アラビノースプロモーター下にある);
e)ジアミノピメリン酸栄養要求株を作製するための4-ヒドロキシ-テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするdapA遺伝子の欠失;および
g)欠失領域が配列番号130からなる、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の領域の欠失。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleである。いくつかの実施形態では、当該株はSYN-PKU-2002と同じ改変を含む。いくつかの実施形態では、当該株はSYN-PKU-2002である。
のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
遺伝子操作された微生物がタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または他の抗癌分子、免疫調節分子、DNA、RNA、小分子、または微生物から分泌されることを目的としたその他の分子を産生する本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、操作された微生物は、分泌機構、および分泌系をコードする対応する遺伝子配列を含み得る。
6年8月31日)、PCT/US2016/37098(出願日2016年6月10日)、PCT/US2016/069052(出願日2016年12月28日)、PCT/US2016/32562(出願日2016年5月13日)、PCT/US2016/062369(出願日2016年11月16日)、およびPCT/US2017/013072に記載されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌および/または微生物は、本明細書に記載される目的のポリぺプチドをコードする1つ以上の遺伝子および/または遺伝子カセットをコードし、当該目的のポリぺプチドは、細菌および/または微生物の表面上に固定またはディスプレイされる。細菌および/または微生物にディスプレイまたは固定されるペイロード分子の例は、本明細書に記載のペイロード分子または他のエフェクターのいずれかであり、限定されないが、酵素(例えば、PMEまたはキヌレニナーゼ)、抗体(例えば、scFv断片)、および腫瘍特異的抗原またはネオ抗原(neoantigen)を含む。
本明細書において使用される場合、「必須遺伝子」という用語は、細胞増殖および/または生存に必要とされる遺伝子を指す。細菌の必須遺伝子は当業者に周知であり、遺伝子の指向性欠失(directed deletion of genes)および/またはランダム突然変異誘発ならびにスクリーニングによって同定され得る(例えば、ZhangおよびLin、「DEG 5.0,a database of essential genes in both prokaryotes and eukaryotes」、Nucl Acids Res、2009年;37:D455-D458、およびGerdesら、「Essential genes on metabolic maps」、Curr Opin Biotechnol、2006年;17(5):448~456頁を参照。これらの各々の内容全体は参照により明示的に本明細書に援用される)。
限定されないが、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要な遺伝子が含まれる。
形態では、栄養要求性の改変は、細菌細胞が栄養要求性の遺伝子産物の非存在下(例えば、消化管の外部)で生存しないことを確実にするために使用される。
S、rplB、cdsA、yaeL、yaeT、lpxD、fabZ、lpxA、lpxB、dnaE、accA、tilS、proS、yafF、tsf、pyrH、olA、rlpB、leuS、lnt、glnS、fldA、cydA、infA、cydC、ftsK、lolA、serS、rpsA、msbA、lpxK、kdsB、mukF、mukE、mukB、asnS、fabA、mviN、rne、yceQ、fabD、fabG、acpP、tmk、holB、lolC、lolD、lolE、purB、ymfK、minE、mind、pth、rsA、ispE、lolB、hemA、prfA、prmC、kdsA、topA、ribA、fabI、racR、dicA、ydfB、tyrS、ribC、ydiL、pheT、pheS、yhhQ、bcsB、glyQ、yibJ、およびgpsAが含まれる。他の必須遺伝子は当業者に知られている。
Biol 2015年;4(12):1279~1286頁を参照。その全内容は参照により明示的に本明細書に援用される)。
4A、R186A、およびI188L)を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは2-アミノベンゾチアゾールによって補完される。tyrSにおける突然変異(L36V、C38A、およびF40G)を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは2-アミノベンゾチアゾールによって補完される。adkにおける突然変異(I4L、L5IおよびL6G)を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールによって補完される。
Modular Plasmid System Designed for Biosafety」、ACS Synth Biol、2015年;4(3):307~316頁に記載されており、その内容全体は参照により明示的に本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は栄養要求株であり、また、本明細書に記載される死滅スイッチ成分および系のいずれかなどの死滅スイッチ回路、ならびに条件付き複製起点などの別のバイオセキュリティー系も含む(Wrightら、2015年)。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、1つ以上のバイオセイフティープラスミドと組み合わせて、細菌染色体に組み込まれた1つ以上のAIPS構築物を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、プラスミド複製開始タンパク質がトランスで提供される(すなわち、染色体に組み込まれたバイオセイフティー構築物によってコードされる)条件付き複製起点(COR)を含む。いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれた構築物は、栄養要求性(例えば、dapAまたはthyA栄養要求性)が生じるように宿主にさらに導入され、当該栄養要求性は、バイオセイフティープラスミド構築物から発現される遺伝子産物によって補完される。いくつかの実施形態では、バイオセイフティープラスミドは広域スペクトル毒素(例えば、Kis)をさらにコードするが、組み込まれたバイオセイフティー構築物は抗毒素(例えば、抗Kis)をコードし、両方の構築物を含む細菌細胞ではプラスミド増殖が可能になる。理論に縛られることを望むものではないが、この機構は、プラスミドDNA自体を野生型細菌による維持に不利にすることによって、プラスミド拡散を防ぐように機能する。そのようなバイオセイフティーシステムの非限定的な例が、参照によりその内容全体が本明細書に援用されるWO2017087580
の図61A、図61B、図61C、および図61Dに示されている。
御下にある。いくつかの実施形態では、プロモーターはプレ誘導に有用である。いくつかの実施形態では、プロモーターはin vivo活性化に有用である。いくつかの実施形態では、プロモーターはプレ誘導およびin vivo活性に有用である。いくつかの実施形態では、構築物は2つ以上のプロモーターを含み、当該プロモーターの一部はプレ誘導に有用であり、一部はin vivo活性に有用である。
IN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10055、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つ以上の完全なまたは部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、1つ以上のエフェクター分子をコードする1つ以上の遺伝子を含む1つ以上の回路をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下、疾患もしくは組織特異的分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応または免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、肝臓障害、代謝疾患、またはアラビノースなどの消化管または腫瘍微小環境中に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、任意の1つ以上の回路を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載される回路のいずれか1つ以上が1つ以上のプラスミド(例えば、高コピーまたは低コピー)上に存在するか、または細菌染色体中の1つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はさらに、記載された回路のうちの任意の1つ以上を発現することができ、以下のうちの1つ以上をさらに含む:(1)当技術分野で公知であり本明細書で提供される任意の栄養要求性(例えば、thyA栄養要求性)など、1つ以上の栄養要求性、(2)本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の任意の死滅スイッチなど、1つ以上の死滅スイッチ回路、(3)1つ以上の抗生物質耐性回路、(4)本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の任意のトランスポータ
ーなど、生物学的分子または基質を取り込むための1つ以上のトランスポーター、(5)本明細書に記載されるか当技術分野で公知の任意の分泌回路など、1つ以上の分泌回路、および(6)そのような追加の回路のうちの1つ以上の組合せ。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の構築物を発現するための多層遺伝子調節回路を含む。適切な多層遺伝子調節回路は、国際公開第2016/210378号として公開された国際特許出願PCT/US2016/39434(出願日2016年6月24日)に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。遺伝子調節回路は、抗癌分子を産生するか栄養要求性をレスキューする変異細菌をスクリーニングするのに有用である。特定の実施形態において、本発明は、1つ以上の目的の遺伝子を産生する遺伝子操作された細菌を選択する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、宿主-プラスミド相互依存性を生じるように改変されたプラスミドも含む。特定の実施形態では、相互依存性宿主-プラスミドプラットフォームは、抗生物質非依存性プラスミドシステム(AIPS)である(Wrightら、2015年)。これらおよびその他のシステムならびにプラットフォームは、WO2017/123675として公開された国際特許出願PCT/US2017/013072(出願日2017年1月11日)に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、死滅スイッチも含む。死滅スイッチは、外部刺激に応答して遺伝子操作された細菌を積極的に死滅させることを目的とする。細菌が生存のための必須栄養素を欠いているために細菌が死滅する栄養要求性突然変異とは対照的に、死滅スイッチは、細胞死を引き起こす微生物内の毒性分子の産生を誘導する環境内の特定の要因によって誘発される。適切な死滅スイッチは、WO2016210373として公開された国際特許出願PCT/US2016/039427(出願日2016年6月24日)に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
本発明の遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患、例えばPKUを処置、管理、改善、および/または予防するために使用され得る。単独で、または予防剤、治療剤、および/もしくは薬学的に許容される担体と組み合わせて1つ以上の遺伝子操作された細菌を含む本発明の医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される遺伝子改変を含むように操作された細菌の1つの種、株、または亜型を含む。代替の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される遺伝子改変を含むように各々操作された細菌の2つ以上の種、株、および/または亜型を含む。
来の方式で製剤化され得る。医薬組成物を製剤化する方法は当該分野において公知である(例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、Easton、PAを参照のこと)。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、従来の混合、溶解、造粒、粉状化、乳化、カプセル化、封入、または噴霧乾燥に供されて、腸溶コーティングまたは非コーティングされ得る錠剤、粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット、または粉剤を形成する。適切な製剤は投与経路に依存する。
実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は衛生製品として製剤化されてもよい。例えば、衛生製品は、抗菌製剤、または発酵ブロスなどの発酵製品であってもよい。衛生用品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト、ローション、およびリップクリームであってもよい。
pH環境で分解される。いくつかの実施形態では、少なくとも2つのコーティングが使用される。いくつかの実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングは異なるpHレベルで分解される。
酢乳、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料)、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜-果物ジュース、果物ジュース、スポーツドリンク、菓子、キャンディー、乳児用食品(乳児用ケーキなど)、栄養食品、動物飼料、または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は発酵乳製品などの発酵食品である。一実施形態では、発酵乳製品はヨーグルトである。別の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクセーキ、またはケフィアである。別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、プロバイオティクスとして機能することが意図される他の生細菌細胞を含有する調製物中に組み合わされる。別の実施形態では、食品は飲料である。一実施形態では、飲料は、果物ジュースベースの飲料または植物もしくはハーブ抽出物を含有する飲料である。別の実施形態では、食品はゼリーまたはプディングである。本発明の組換え細菌の投与に適した他の食品は当該分野において周知である。例えば、それらの各々の全内容が参照により本明細書に明示的に援用される米国特許出願公開第2015/0359894号および米国特許出願公開第2015/0238545号を参照のこと。さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、パン、ヨーグルト、またはチーズなどの食品中に注入されるか、その上に噴霧されるか、またはその上に振りかけられる。
体形態、または腸溶コーティングされてもよいか、もしくはコーティングされていなくてもよい、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット、もしくは粉末などの単回投与固体形態に分けることによって調製されてもよい。固体形態の単回用量は、患者に投与する前に液体、典型的には滅菌水または生理食塩水を加えることによって復元されてもよい。
内に投与される。凍結乾燥剤形のために原則として0~10%のスクロース(最適には0.5~1.0%)の抗凍結剤が含まれ得る。他の適切な抗凍結剤には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。他の適切な増量剤には、グリシンおよびアルギニン(それらのいずれも0~0.05%の濃度で含まれ得る)、ならびにポリソルベート-80(最適には0.005~0.01%の濃度で含まれる)が含まれる。さらなる界面活性剤には、限定されないが、ポリソルベート20およびBRIJ界面活性剤が含まれる。医薬組成物は注射可能な溶液として調製され得、吸収または分散を増加させるために使用されるもの(例えばヒアルロニダーゼ)などのアジュバントとして有用な薬剤をさらに含み得る。
本開示の別の態様は、それを必要とする対象に、本明細書に開示される操作された細菌を含む組成物を投与することを含む疾患の処置方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象に、内因性または天然ファージゲノムにおける改変を含む操作された細菌を含有する組成物を投与することを含む疾患の処置方法を提供する。
つ以上の遺伝子が置換される。いくつかの実施形態では、置換は抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ遺伝子が逆位している。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ遺伝子の一部が逆位している。
ラニン血症に関連する疾患、例えば、PKUを処置するために、血液などの追加の供給源からフェニルアラニンを代謝することができるかもしれない。これらの実施形態では、遺伝子操作された細菌は食物タンパク質と同時に送達される必要はなく、例えば血液から消化管までフェニルアラニン勾配が生成され、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンを代謝し、高フェニルアラニン血症を軽減する。
は、本明細書中に記載される方法は、特定の代謝産物または他のタイプのバイオマーカー分子または障害に関連するもしくはその原因となる分子のレベルを低減させるために、本発明の組成物を投与することを含み得、遺伝子操作された細菌の投与の結果として蓄積する代謝産物または他のタイプの分子のレベルの増加をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、1つの代謝産物または他のタイプの分子を対象において検出不能なレベルまで低減させ、同時にかつ比例して別の代謝産物または他のタイプの分子のレベルを増大させるために、本発明の組成物を投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、本発明の組成物を投与することを含み得、代謝産物または他のタイプの分子の濃度を、処置前の代謝産物の対象レベルの約1%超、2%超、5%超、10%超、20%超、25%超、30%超、40%超、50%超、60%超、70%超、75%超、80%超、90%超、95%超、または99%まで、または100%まで増加させる。このような増加は、例えば、尿、血中、糞便中、または腫瘍中で測定され得る。
lyase in the management of phenylketonuria: the relationship between ingested cinnamate and urinary hippurate in humans.J Res Commun Chem Pathol Pharmacol.1982年2月;35巻(2):275-82頁)。フェニルアラニンは1:1の比で馬尿酸に変換される。すなわち1モルのPheが1モルの馬尿酸に変換される。したがって、尿中の馬尿酸レベルの変化は、このメカニズムを利用する療法の効果の非侵襲的尺度として使用され得る。
哺乳動物対象)にPALベースの薬物を投与し、PAL治療活性の尺度として対象において産生される馬尿酸量を測定することによって、PALベースの薬物の治療活性をモニターする方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象(例えば、哺乳動物対象)にPALベースの薬物を投与し、PAL活性を決定するために対象において産生される馬尿酸量を測定し、対象におけるPAL活性を増加または減少させるために薬物の投与量を調節(例えば、増加または減少)することによって、PALベースの薬物の投与量を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症を有する対象のタンパク質摂取および/または食事を調節する方法を提供し、当該方法は、PALベースの薬物を対象に投与すること、対象において産生される馬尿酸量を測定すること、対象におけるPAL活性を増加または減少させるために対象のタンパク質摂取を調節するか、対象の食事を調節することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症を有する対象のタンパク質摂取および/または食事レジメンに対する遵守を確認するための方法を提供し、当該方法は、PALベースの薬物を対象に投与すること、対象において産生される馬尿酸量を測定すること、および対象におけるPAL活性を測定することを含む。
AL(Peg-PAL)の活性を測定および/またはモニターするために使用される。いくつかの実施形態では、馬尿酸の尿レベルの測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、本明細書に記載の治療菌株と組み合わせて投与される組換えPALの活性を測定および/またはモニターするために使用される。
ユニバーサルPCRのための標的遺伝子として使用することができる;16S rRNA遺伝子は種に特異的な領域を含み、当該領域によって多数の細菌種を区別することができる。
017087580の図68に示す。代替の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、投与後の数時間以内または数日以内に破壊されず、消化管で増殖およびコロニー形成し得る。
された細菌は、約0.2~約2.67μmol/109CFU/時間の標的分解速度を達成する。
本発明の遺伝子操作された細菌は、in vivoにおいて(例えば、動物モデルにおいて)評価され得る。疾患または状態の任意の適切な動物モデルが使用され得る。いくつかの実施形態では、動物モデルはマウスモデルである。例えば、参照によりその全内容が援用されるWO2017/087580 A1を参照。
いくつかの実施形態では、フェニルアラニン取り込みが改善した遺伝子操作された細菌を同定するために、ALE法が使用され得る。
遺伝子選択を使用するスクリーニングは、遺伝子操作された細菌におけるフェニルアラニン消費を改善するために実施される。毒性のあるフェニルアラニン類似体は、細胞タンパク質に取り込まれることによって、その作用機構(MOA)を発揮し、細胞死をもたらす。パラログp-フルオロ-DL-フェニルアラニンおよびオルソログo-フルオロ-DL-フェニルアラニンなどのこれらの化合物は、活性が増加したPAL酵素を選択するための非標的アプローチに有用である。これらの毒性化合物は細胞タンパク質に取り込まれるよりも、PALによって非毒性代謝産物に代謝され得ると仮定すると、フェニルアラニン分解活性が改善した遺伝子操作された細菌は、これらの化合物のより高いレベルに耐えることができ、これに基づいてスクリーニングおよび選択され得る。
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以下の実施例は、本開示の実施形態の例である。当業者ならば、本開示の趣旨または範囲を変化させることなく実施することができる数々の改変および変更を認識するだろう。このような改変および変更は、本開示の範囲内に包含される。実施例は、決して本開示を限定しない。
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、サンプル中のフェニルアラニンレベルの定量を必要とする本明細書に記載のin vitroおよびin vivoアッセイのために、共同所有の係属中の国際特許出願PCT/US2016/032562(出願日2016年5月13日)、およびPCT/US2016/062369(それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される)に記載されているように、塩化ダンシル誘導体化プロトコールが用いられた。
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、サンプル中のトランス-ケイ皮酸レベルの定量を必要とする本明細書に記載のin vitroおよびin
vivoアッセイのために、共同所有の係属中のPCT/US2016/032562(出願日2016年5月13日)、およびPCT/US2016/062369(それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される)に記載されているように、トリフルオロエチルアミン誘導体化プロトコールが用いられた。
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、サンプル中のフェニルアラニン、トランス-ケイ皮酸、フェニル酢酸、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸、馬尿酸および安息香酸レベルの定量を必要とする本明細書に記載のin vitroおよびin vivoアッセイのために、共同所有の係属中の国際特許出願PCT/US2016/032562(出願日2016年5月13日)、およびPCT/US2016/062369(それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される)に記載されているように、2-ヒドラジノキノリン誘導体化プロトコールが用いられた。
LC-MS/MSによる血漿および尿中の馬尿酸、トランス-ケイ皮酸、フェニルアラニン、およびフェニルピルビン酸の定量は、共同所有の係属中の国際特許出願PCT/US2016/032562(出願日2016年5月13日)およびPCT/US2016/062369(これらの各々の全内容は参照により本明細書に援用される)に記載されているように測定された。
SYN-PKU-710は、フェニルアラニンを消費して非毒性代謝産物トランス-ケイ皮酸(TCA)およびフェニルピルビン酸(PP)に変換することによって高フェニルアラニン血症を処置するように設計された大腸菌Nissle1917(EcN)(参考文献)に由来する操作された細菌である。これは腸内に見出されるフェニルアラニンを遮断および分解することによって作用し、血液中へのフェニルアラニンの流入を減少させる。SYN-PKU-710は、ヒト消化管の微好気性(低酸素)環境におけるフェニルアラニンの分解を可能にする一連の遺伝子操作によって作製された。ジアミノピメリン酸栄養要求性を介して生物学的封じ込めを増強しながら、消化管中に見出される低酸素条件下でのフェニルアラニン分解を増強するために、EcNのゲノムに以下の改変を行った:
a)嫌気性誘導性プロモーター(PfnrS)および嫌気性応答性転写活性化因子FNRの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の2つの追加コピーの挿入
b)PfnrSおよびFNRの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の3つのコピーの挿入
c)合成プロモーター(Plac)およびラクトース応答性転写リプレッサーLacIの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の2つの追加コピーの挿入
d)アラビノース誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性
化因子AraCの調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の挿入
e)ジアミノピメリン酸栄養要求株を作製するための4-ヒドロキシ-テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするdapA遺伝子の欠失
30分から90分のフェニルアラニン分解速度(すなわち、アッセイ溶液からの消失)またはケイ皮酸の蓄積は1e9細胞に対して正規化された。表59は、全株についての正規化した速度を示し、操作されたプラスミド保有株および染色体挿入を含む操作された株の非限定的例の遺伝子型および活性について記載している。
A.概要
目的:日常的な試験手順により、大腸菌Nissle1917(大腸菌Nissle;E.coli Nissle)および関連する操作された派生物からのバクテリオファージ産生が確認された。バクテリオファージの供給源を決定するために、大腸菌Nissleおよび操作された派生物のゲノムの共同バイオインフォマティクス評価を実施して、プロファージのエビデンスについて株のゲノム配列を分析し、機能的ファージを産生する可能性について同定されたプロファージ要素を評価し、細菌ゲノム配列の中で同定された他の既知のファージと任意の機能的ファージ要素を比較し、およびプロファージ要素が他の
配列決定された大腸菌(E.coli)ゲノム中で見出される頻度を評価した。
1.バイオ分析方法
a.ファージ予測
ファージ予測ソフトウェア(PHAST)(Zhouら、「PHAST: A Fast Phage Search Tool」Nucl.Acids Res.(2011)39(suppl 2):W347-W352)を使用して、公開され公に入手可能な大腸菌Nissleゲノム内(GenbankアクセッションNZ_CP007799.1)(Reisterら、Complete genome sequence of the gram-negative probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917;J Biotechnol.2014年10月10日;187:106-7頁)、ならびにSYN001(DSM 6601、ロット番号Jul91(DSMZ、Braunschweig、ドイツ)に由来する大腸菌Nissleの単一増殖から作製された研究セルバンクである大腸菌Nissle1917)内でプロファージを検索した。
遺伝子操作された株のゲノム配列は、Illumina MiSeq DNAシーケンサーを用いて外部リソース(GENEWIZ、ボストン、マサチューセッツ州)によって生成された。ファージ配列を調べるために、まず、デフォルトパラメーターを用いたゲノムアセンブラソフトウェア(SPAdes)バージョン3.9.1を使用してゲノムシークエンシング読み取りをアセンブルする必要があった(Nurkら、Assembling single-cell genomes and mini-metagenomes from chimeric MDA products; J Comput Biol.2013年10月;20(10):714-37頁)。500ヌクレオチド未満の長さを有するスキャフォールドは廃棄された。
操作された株には存在する可能性があるが、元の大腸菌Nissle株には存在しない可能性がある配列を同定するために、生の読み取りデータは、大きなリファレンスゲノムに対して低発散配列をマッピングするためのソフトウェア(BWA MEM)を使用して、3つのリファレンスゲノムのそれぞれにアラインメントされた(LiおよびDurbin, Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform; Bioinformatics. 2009年7月15日;25(14):1754-60頁)。3つのリファレンスゲノムは、公開されている配列と公的に入手可能な大腸菌Nissleゲノム(GenbankアクセッションNZ_CP007799.1)(Reisterら、Complete genome sequence of gram-ne gram-negativeプロバイオティクス大腸菌株Nissle 1917; J Biotechnol.2014年10月10日;187:106-7頁)、Genewizによって配列決定された大腸菌NissleゲノムのSYN001(野生型大腸菌Nissle)バージョン、および遺伝子操作された株を作製するために使用された特定の操作ステップから生じる変化とともにSYN001の配列に基づいた操作された株のゲノムの予想される配列であった。操作された株の予想される配列に対応しなかった配列に焦点を当てるために、読み取りを各リファレンスにアラインし、ソフトウェアSamtools(Liら、The Sequence Alignment/Map format and SAMtools; Bioinformatics.2009年8月15日;25(16):2078-9頁)に従って各リファレンスに別々にアラインされたものを破棄し、各リファレンスゲノムにアラインされなかった残りの読み取りをさらに分析した。
同じプロセスを使用して、操作された株におけるユニーク配列を同定した。
and mini-metagenomes from chimeric MDA products; J Comput Biol.2013年10月;20(10):714-37頁)。これらのアセンブルされたスキャフォールドは、Blastツール(Altschulら、Basic local alignment search tool; J Mol Biol.1990年10月5日;215(3):403-10頁)を用いて、それらをアメリカ国立生物工学情報センター(NCBI)中の非冗長データベースに対して比較することによって、ファージ関連配列の存在についてチェックされた。
PHASTバイオインフォマティックツールによって同定されたファージ3配列のサイズをさらに精緻化するために、大腸菌Nissleにおけるファージ3の59キロ塩基(kb)領域を、ファージ3を含まない大腸菌BW25113の密接に関連するゲノムにアラインメントすることによって、ファージ3配列のコア領域を決定した。大腸菌Nissle由来の59kbファージ3配列の左側および右側末端の領域は、宿主の染色体(非ファージ)配列に対応する可能性が高い大腸菌BW25113における遺伝子のゲノム構成と一致した;しかしながら、大腸菌Nissle由来のファージ3配列の中央にある43kb領域は、大腸菌BW25113には存在せず、大腸菌BW25113に存在する2つの宿主染色体遺伝子間の挿入として現れた。したがって、このアラインメントにより、大腸菌Nissleに固有であり、ファージ3の真のリミットを含む可能性が高い43kbのコアファージ3領域が観察された。次いで、この43kbのコアファージ3配列を、MUMmerアラインメントソフトウェア(Delcher et al., Fast algorithms for large-scale genome alignment and comparison; Nucleic Acids Res.2002年6月1日;30(11):2478-83頁)を使用してNCBIからダウンロードした5691個の大腸菌および赤痢菌アセンブリの包括的なセットに対してアラインメントのために比較した。大腸菌外のファージ3のインスタンスを同定するために、Blastツール(Altschul et al., Basic local alignment search tool; J Mol Biol.1990年10月5日;215(3):403-10頁)を使用して、43kbのコアファージ3領域全体を非冗長NCBIデータベースと比較した。
るかどうかを決定するために、ファージ3への部分的マッチングを有するスキャフォールドを他のゲノムから抽出し、PHAST(Zhouら、「PHAST: A Fast phage Search Tool」、Nucl.Acids Res.(2011年)、39(suppl 2):W347-W352)を使用して、これらの領域内のプロファージの存在を予測した。
任意の型のプロファージが配列決定された大腸菌株の中で見出される頻度を評価するために、新たに公開されたより効率的なバージョンのPHAST(PHASTER)(Arndt Dら、PHASTER: a better, faster version
of the PHAST phage search tool.Nucleic Acids Res.44,W16-W21(2016年))を使用して、大腸菌ゲノムの大きなセット内の任意のプロファージ要素の存在を検索した。ファージ予測アルゴリズムの精度は、高品質ゲノムの使用に依存するので、この検索には287個の高品質リファレンス配列(Refseq)大腸菌ゲノムのセットを使用した。
1.大腸菌Nissleのファージ含有量
3つの高信頼性の予測されるプロファージ配列が、本明細書中でファージ1、ファージ2、およびファージ3と呼ばれる大腸菌Nissleゲノムの各バージョン内に見出された(図1)。これらの高スコアファージの3つすべては、PHASTによって「インタクト」ファージと指定されており、これらがファージの主要成分のすべてを含むことを示している(図1)。大腸菌Nissle(ファージ3)における最も長い予測ファージは全部で68個のタンパク質を含み、ファージ尾部、頭部、ポータル,ターミナーゼ、リシン、カプシド、およびインテグラーゼを含み、これらはすべてインタクトのようである。ファージ2は全部で69個のタンパク質を含み、ファージトランスポザーゼ、溶解、ターミナーゼ、頭部、ポータル、カプシド、および尾部タンパク質を含む。ファージ2の詳細な調査は、int/xis遺伝子対が可動性遺伝要素によって破壊されていること、およびcIリプレッサーが別々のDNA結合および感知ペプチドに断片化されていることを明らかにし、これはこのファージの誘導を妨げると予想される。大腸菌Nissleで予測された最も短いインタクトファージであるファージ1は全部で32個のタンパク質を含み、溶解およびトランスポザーゼ機能を含む。しかしながら、ファージ1と呼ばれる推定プロファージ要素内に多くの構造遺伝子が存在しないことから、生存可能なファージ粒子を放出するその可能性が疑問視される。ファージ1~3の特徴を表84に要約する。
操作された株のアセンブルされたゲノム内で、PHASTは、元の大腸菌Nissleゲノムにおいて予測されたのと同じファージ含有量を予測した。大腸菌Nissle内で「インタクト」ファージとして同定された3つのファージの全ては、操作された株のゲノム内でも同定された(ファージ1~3)。
操作された株の生の配列決定読み取りの大部分は、リファレンスゲノムにマッピングされ、操作された株ゲノムに固有の配列はほとんどなかった。少量のユニークな配列内にファージ配列の証拠はなかった。アセンブルされた場合、これらのユニーク配列は、それぞれ長さ2kb未満の3つのスキャフォールドのみをもたらし、既知のファージ配列との類似性はなかった。この結果は、完全な操作株アセンブリの大腸菌Nissleリファレンスゲノムへの全ゲノムアラインメントを実施し、リファレンスにマッピングされなかった操作された株内の領域を同定することによって確認された。この手順を用いて、同じ短い配列の2つが同定された。これらの短い配列のいずれも、任意の公知のファージ配列といかなる類似性も有さなかった。操作された株に特有のこれらの非常に短い配列は、ファージではなく、サンプル中の偽のDNA(spurious DNA)を表している可能性がある。
実験室研究により、大腸菌Nissleによって放出されたプラーク形成ファージ粒子、および操作された株は、ファージ3(SYN-17.002)のみに由来することが決定された。従って、他の大腸菌ゲノムにおけるファージ3(プロファージとして)の存在の評価を行った。NCBIからダウンロードした5691の大腸菌(E.coli)およ
びShigellaゲノムアセンブリの広範なデータセット内で、全長ファージ3は、大腸菌Nissleにおいてのみ見出された。ファージ3の全長を100%の同一性でカバーする2つの全長、43kbの一致のみが存在し、これらの両方は大腸菌Nissleゲノムの異なるバージョン(GCA_000333215.1およびGCA_000714595.1)に対応する。データセット内の他の大腸菌ゲノムにおいて、5つの追加の長い部分一致(14-20kb、97-99.6%の同一性を有する)、および4つの他のより短い部分一致(5-10kb、95-98%の同一性)が存在した(図10)。同じアセンブリの複数スキャフォールドの間で分割された、いくつかの他のより短い断片も同定された。部分的なマッチングはファージ3の異なる領域にマッピングされ、図10に示されている。
ファージは、大腸菌において非常に一般的である。Refseqデータベース中の大腸菌ゲノムのほとんど全ては、PHASTERファージ予測ソフトウェアツールを用いて評価されるように、少なくとも1つの「インタクト」高スコアファージを含み、いくつかは20までを有する(図12)。大腸菌ゲノム中の予測ファージの平均数は6.4であり、これは、PHASTERによって大腸菌Nissleについて予測された数よりも実質的に高い。このより新しいファージ予測ツールを使用して、2つのより長いファージのみが、大腸菌Nissleにおいて同定される(これらは本明細書中でファージ2およびファージ3と呼ばれる)。従って、大腸菌Nissleは、ほとんどの他の大腸菌よりも実質的に少ない予測ファージを有する。
バイオインフォマティクス分析の結論は以下の通りである:第1に、大腸菌Nissleおよび操作された派生物は3つの候補プロファージ要素を含み、3つのうちの2つ(ファージ2およびファージ3)は、インタクトファージゲノムに特徴的なほとんどの遺伝的特徴を含む。さらに、ファージ3は、ほぼ6000の配列決定された大腸菌ゲノムのコレクションの中で大腸菌Nissleに特有であるが、他の推定プロファージ要素との相同性の短い領域に限定された関連配列が少数のゲノムにおいて見出される。第4に、プロファージは大腸菌株の間で非常に一般的であり、大腸菌Nissleは、配列決定された大腸菌ゲノムの十分に特徴付けられたセットにおいて見出される平均と比較して、比較的少数を含有する。これらのデータは、大腸菌Nissleの操作株におけるプロファージの存在がこの種の自然状態の結果であり、分析されたこのような操作株のプロファージの特徴が前駆株である大腸菌Nissleと一致したという結論を支持する。
の試験は、検証されたバクテリオファージプラークアッセイにおいて、ファージ3の低レベルの存在について陽性であった。バクテリオファージプラークアッセイを行って、バクテリオファージの存在およびレベルを決定した。簡単に述べると、一晩増殖させた試験細菌の培養物からの上清をファージ感受性指標株と混合し、バクテリオファージの存在を示すプラークの形成を検出するために軟寒天にプレーティングした。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーは、バイオインフォマティクス分析において同定された3つの異なる内因性プロファージを検出するために設計され、ファージ特異的DNAの存在についてプラークを評価するために使用された。
1.ファージ試験プロトコール:マイトマイシンC誘導データ解析を使用した大腸菌からの細菌ウイルスのプラークアッセイ
マイトマイシンCファージ誘導手順(STM-V-708法、大腸菌(E.coli)からの細菌ウイルスのプラークアッセイ)を用いて、ファージの産生について細胞株を分析した。Sinsheimer RL. Purification and Properties of Bacteriophage X174. J. Mol. Biol. 1959年;1:37-42頁、およびClowes, RCおよびHayes, W. Experiments in microbial genetics. John Wiley & Sons, NY. 1968年(これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される)に記載されているように、マイトマイシンC誘導を使用する。簡単に述べると、サンプル(細胞増幅を支持するためにチミジンを補充した培地を適宜用いて)およびコントロール細胞を一晩増殖させた。サンプル、ポジティブコントロール(大腸菌、EMG 2:K(ラムダ)、ATCC23716、または均等物)およびネガティブコントロール(大腸菌、ATCC13706、または均等物)の一部を除去し、遠心分離し、それぞれの上清をプラークアッセイでバクテリオファージの存在について調べた。マイトマイシンCを、最終濃度2μg/mLで、残りのサンプル、ポジティブおよびネガティブ細菌培養物に添加した。次いで、培養物を37±2℃に置き、ポジティブコントロール中で溶解が起こるまで(~4.5時間)、300~400rpmで振盪した。それぞれの培養物をクロロホルムで処理し、遠心分離し、上清の0.1mlアリコートをバクテリオファージの存在について調べた。これを達成するために、上清をファージ感受性大腸菌株ATCC13706と混合し、0.7%アガロース溶液と混合し、溶原性ブロス(LB)寒天培地上にローンとして(as a lawn)プレーティングした。プラークがポジティブコントロール中に存在し、プラークがネガティブコントロール中に存在しない場合、試験は有効であるとみなされた。
a.ファージ特異的PCRプライマーの選択
オリゴヌクレオチドポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーは、大腸菌Nissleの3つの推定プロファージ領域のそれぞれに対して特異性を有するように設計され、Integrated DNA Technologies(IDT、Skokie、イリノイ州)に注文された。プライマーはNissleゲノムを注意深く調べた後に選択され、ファージ特異的タンパク質は、コードすると予想されるユニーク領域内に完全に結合するように設計された(表85)。
上記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、大腸菌NissleゲノムDNA(gDNA)に対してPCRを行い、ファージ1、2、および3ならびにrpoB宿主ゲノムコントロールについて予想されるPCR産物が産生されたかどうかを決定した。ファージ陰性株ATCC13706はPCR反応のネガティブコントロールとして機能した。PCR反応のためのgDNA鋳型を調製するために、大腸菌NissleをLB培地中で37±2℃で増殖させ、250回転/分(rpm)で一晩振盪した。100μLの静止期培養物を1.5mLのエッペンドルフチューブに添加し、微量遠心分離機中で>20,000×g(15,000rpm)にて30秒間遠心した。上清を除去し、細胞ペレットを100μLの滅菌水に再懸濁した。この100μLの懸濁液を0.2mlの薄壁チューブに移し、エッペンドルフマスターサイクラープロ(Eppendorf Mastercycler Pro)サーモサイクラーにおいて98℃で10分間加熱した。得られた溶液は、PCR反応に適したgDNAを含んでいた。DNA増幅を支持するためのDNAヌクレオチドおよびポリメラーゼの供給源としてMyTaq(商標)Red Mix(Biol
ine)を用い、DNA鋳型として大腸菌NissleのgDNAを用い、表86の条件に従って混合して、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ポリメラーゼ連鎖反応を、表87に記載されるように、Eppendorf Mastercycler Proサーモサイクラーにおいて行った。PCRの完了後、5μLの反応物またはDNAスタンダード(1kB+ラダー、Invitrogen)を、電気泳動による分離およびSyngene紫外線(UV)トランスイルミネーターを使用する可視化のために、0.8%アガロースゲル上にロードした。
バクテリオファージ力価アッセイは、検証済みの方法を用いて行われた。PCR分析は、大腸菌Nissleまたは操作された株に由来する計数可能な(enumerable)バクテリオファージプラーク(適用可能な場合)を含む、得られたファージ力価プレートの上清で行われた。プラークを生成したファージの同一性をPCRによって決定した。
個々のプラークの寒天プラグを、2μLのピペットチップを用いて培養プレートから除去した。各プラグを0.5mLの滅菌蒸留水に再懸濁した。プラグ再懸濁液を15秒間ボルテックスし、次いで1μLをDNA鋳型としてPCR反応に添加した。DNA増幅を支持するためのDNAヌクレオチドおよびポリメラーゼの供給源としてMyTaq(商標)Red Mix(Bioline)を用い、DNA鋳型としてプラグ再懸濁液を用い、表5の条件に従って混合して、ファージ特異的PCR反応を行った。上記の表85からのプライマーの各組を、大腸菌NissleおよびATCC13706のgDNAをポジティブおよびネガティブコントロールとして用いて、3つの推定ファージの各々を同定するために別々のPCR反応に使用した。PCR反応は表89の条件に従って行い、プラーク中に存在する任意の残留宿主染色体DNAの増幅を防止するために、限られたサイクル数(25サイクル)で行った。PCRの完了後、5μLの反応物またはDNAスタンダード(1kB+ラダー、Invitrogen)を、電気泳動による分離およびSyngene UVトランスイルミネーターを用いた可視化のために、0.8%アガロースゲル上にロードした。
4.ファージ試験データの要約
いくつかのサンプル中のファージの存在を検出するための独立した分析が行われた。分析により、微生物および細胞培養物のドイツコレクションからの大腸菌Nissleの細胞バンクサンプル(本明細書ではSYN001と呼ぶ)、および大腸菌Nissleを含有するMutaflorのカプセルが、非誘導および誘導(マイトマイシンC処置)条件下で低レベルのファージを可変的に発現することが示された(表90)。
PCR分析法がプラーク産生ファージを同定し得ることを検証するために、プロファージ1、2、3または宿主rpoB遺伝子のいずれかに特異的なプライマーを使用して、大腸菌Nissle gDNAに対してPCR分析を行った(表85)。ここでは示されていないが、指標株ATCC13706に対する同じプライマーを用いた同様の分析では、ファージプライマーについてのバンドはなく、rpoBについてのバンドはわずかであり、この株が3つの大腸菌Nissleプロファージを欠くが、大腸菌Nissle遺伝子といくらかの配列類似性を有するrpoB遺伝子を含むことと一致する。各プライマーセットは、図13に示されるアガロースゲル電気泳動によって判断されるように、正しいサイズの単一のDNA産物を産生した。この結果に基づいて、これらのプライマーペアを使用して、異なるファージの存在について、表90に要約される分析からの個々のプラーク由来のファージDNAを評価した。
プラークアッセイからの計数可能なプラークを有するプレートを、PCR分析によって分析した。ポリメラーゼ連鎖反応分析を、プロファージ1、2、3または宿主rpoB遺伝子のいずれかに特異的なプライマーを使用して、計数可能なプラークを有するプレートからの10個のプラークに対して行い、プラークを作ったファージの同一性を決定した。いくつかの場合において、明らかに計数可能なプラークを有するプレートは10個未満のプラークを含み、この場合、全てのプラークが使用された。しかしながら、少なくとも6個のプラークが全ての分析のために試験された。実行されたすべてのPCR反応において、プロファージ3に特異的なプライマーのみがPCR産物を産生し、これは、表90に列挙される各試験株およびバッチについてのすべての場合において真実であった。このデータの代表的なゲル分析を図14に示す;図14の左側のパネルは、大腸菌Nissle-Mutaflorのアッセイから得られた個々のプラークプラグについて可視化されたPCR反応の代表的なセットを示す。右側のパネルは、大腸菌NissleまたはATCC13706(CRLファージアッセイで使用されるファージ陰性指標株)のいずれか由来のgDNAを使用し、常在プロファージ3を含まないコントロール試験を示す。この後者
の発見は、ファージプラークPCR分析において観察された陽性結果が、ATCC13706プレーティング株中の配列との交差反応の結果ではないことを確認している。
結論として、これらのデータは、発現可能なプロファージ要素が評価された大腸菌NissleおよびMutaflor株に存在することを実証している。このことは、発現可能なプロファージが大腸菌Nissleに存在することを示す。非誘導状態では、大腸菌NissleおよびMutaflorは、検出可能なプラークを全く産生しないか、低レベルの検出可能なプラークを産生する。すべての場合において産生されたファージのレベルは、ポジティブコントロール株ATCC23716よりも5~6桁低かった。これらの細菌ゲノムのバイオインフォマティクス分析に基づいて、PCRアッセイを開発し、これらの株において同定された3つの内因性プロファージ要素のいずれかが活性ファージ粒子の供給源であるかどうかを決定した。結果は、大腸菌Nissleに由来するプラークが、本明細書でファージ3と呼ばれるバイオインフォマティクス的に同定された3つのプロファージ要素のうちの1つのみに起因することを示している(このプロファージゲノムは、(ファージ3配列を天然には含まない)ファージ感受性大腸菌株ATCC13706上に形成されたプラークからユニークに(uniquely)増幅されたため)。まとめると、これらのデータはファージ3が陽性ファージ試験結果の原因物質であり、これらの株の間でファージ産生に観察可能な違いはないらしいという結論を強く支持する。この情報はまた、これらの株によって産生されるファージが、市販のMutaflorカプセルを含む、大腸菌Nissleに天然のプロファージ要素の結果であることを確立する。
結論として、これらのデータは、発現可能なプロファージ要素が大腸菌Nissleに内因性であることを実証する。検証されたプラークアッセイによって決定された、試験された株によってファージ粒子が産生された頻度は、定量的に同様の低レベルであり、一般に発現可能なプロファージが大腸菌Nissleに存在することを示している。これらの細菌ゲノムのバイオインフォマティクス分析(実施例55)に基づいて、PCRアッセイを開発し、大腸菌Nissleで同定された3つの内因性プロファージ要素のいずれかがプラーク形成ファージ粒子の供給源であるかどうかを決定した。結果は、大腸菌Nissleから発現される場合、プラークがバイオインフォマティクス的に同定された3つのプロファージ要素のうちの1つのみ、すなわちプロファージ3に起因することを示す。このプロファージゲノムは、(プロファージ3配列を天然には含まない)ファージ感受性大腸菌(E.coli)株ATCC13706上に形成されたプラークからPCRによってユニークに(uniquely)増幅された。まとめると、これらのデータはプロファージ3が陽性ファージ試験結果の原因物質であり、これらの株の間でファージ産生に観察可能な違いはないらしいという結論を強く支持する。この情報はまた、これらの株によって産生されるファージが、市販のMutaflorカプセルを含む、大腸菌Nissleに天然のプロファージ要素の結果であることを確立する。
本研究では、大腸菌Nissle、ならびにフェニルアラニン消費回路を含む操作された株、SYN-PKU-710、SYN-PKU1033およびSYN-PKU1034についてのプラークアッセイを実施して、各株によって産生されるファージのレベルを決定した。表91は、本研究で使用した株の説明を提供する。
mLバッフル付きフラスコ(37℃、250rpm)内のLB中で増殖させた。これらの一晩培養物を使用して、125mLバッフル付きフラスコに1:100希釈(必要に応じてDAP100ug/mL)でLB中の10mL培養物を2回接種した。各株について、一方のフラスコは2μg/mLのマイトマイシンCを含み、他方の培養物を対数期非誘導コントロールとして使用した。全てのフラスコを振盪(250rpm)しながら37℃で4.5時間増殖させた。次に、培養物および静止した非誘導一晩培養物を、96ウェルプレート中のPBSで10倍希釈し、細胞数を決定するためにプレーティングした。10-3~10-8希釈に及ぶ10ulのスポット希釈物を、各株について2回ずつプレートごとにプレーティングした(LBプレート-必要に応じてDAP100μg/mL)。
バイオインフォマティックアプローチは、活性ファージを含むと推定されるゲノムの3つの領域を同定するのに役立った(実施例55を参照のこと)。自社開発のPCR法を用
いて、活性ファージは、大腸菌Nissleゲノムの塩基2,035,867塩基と2,079,177塩基の間のゲノム遺伝子座に由来することが示された。
ファージを不活性化するために、λレッド組換えを用いて、9,687塩基対の欠失を作製した。λレッド組み換えは、バクテリオファージλ由来の組換え酵素を用いて、隣接する相同性によって指示された大腸菌の染色体にカスタムDNA片を挿入する手順である。まず、プラスミドpKD3からフリッパーゼ認識部位(FRT)に隣接するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を増幅するために、プライマーを設計および合成した(表93)。Nissleに導入されると、このカセットは抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を提供する。さらに、これらのプライマーは、抗生物質カセットをファージ遺伝子座に導く、ゲノムに対して60塩基対の相同性を含む。Phage3 KO FWDおよびPhage3 KO REVプライマーを使用して、1178塩基対の線状DNA断片をPCR増幅し、これをPCR精製した。得られたDNA鋳型を組換えに使用した。
ファージ欠失のためのNissle株を調製するために、最初に、pKD46プラスミドを大腸菌Nissle宿主株に形質転換することによって、ラムダレッドシステムを導入した。大腸菌Nissle細胞をLB培地中で一晩増殖させた。一晩培養物を5mlのLB培地で1:100に希釈し、OD600=0.4~0.6に達するまで増殖させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを4℃に予備冷却した。大腸菌細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を1mlの4℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を0.5mlの4℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を0.1mlの4℃水中に再懸濁した。エレクトロポレーターを2.5kVに設定した。1ngのpKD46プラスミドDNAを大腸菌細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、滅菌済みの冷却キュベットにピペットで移した。乾燥させたキュベットをサンプルチャンバーに入れ、電気パルスを印加した。室温のSOC培地1mlを直ちに加え、混合物を培養チューブに移し、30℃で1時間インキュベートした。細胞を選択培地プレート上に広げ、30℃で一晩インキュベートした。
組み換え構築物を、pKD46を含む大腸菌Nissleに形質転換して、ファージ配
列を欠失させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを4℃に予備冷却した。一晩培養物をカルベニシリンを含有する5mLのLB培地で1:100に希釈し、OD600=0.1に達するまで増殖させた。次に、0.05mLの100×L-アラビノースストック溶液を添加して、pKD46λレッド発現を誘導した。培養物を、OD600=0.4~0.6に達するまで増殖させた。次いで、大腸菌細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を1mlの4℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を0.5mlの4℃水中に再懸濁した。大腸菌を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を0.1mlの4℃水中に再懸濁した。エレクトロポレーターを2.5kVに設定し、0.5μgの組み換え構築物を細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、滅菌済みの冷却キュベットにピペットで移した。乾燥させたキュベットをサンプルチャンバーに入れ、電気パルスを印加した。1mlの室温SOC培地を直ちに加え、混合物を培養チューブに移し、37℃で1時間インキュベートした。細胞を、35μg/mLのクロラムフェニコールを含有するLBプレート上に広げ、一晩インキュベートした。
突然変異の存在をコロニーPCRによって確認した。コロニーをピペットチップで拾い上げ、上下にピペッティングすることによって20μlの冷ddH2Oに再懸濁した。3μlの懸濁液を、後の使用のために適切な抗生物質を含むインデックスプレート上にピペットで移した。インデックスプレートを37℃で一晩増殖させた。PCRマスターミックスを、5μlの10×PCR緩衝液、0.6μlの10mM dNTP、0.4μlの50mM Mg2SO4、6.0μlの10×エンハンサー、および3.0μlのddH2O(PCR反応当たり15μlのマスターミックス)を使用して作製した。CAT遺伝子に対してユニークなプライマー(100μMストック)または挿入されたCAT遺伝子に隣接するゲノム配列に対してユニークなプライマー(100μMストック)2μLを16μLのddH2Oに混合することによって、10μMプライマーミックスを作製した。使用したプライマーの配列を表94に示す。各20μlの反応について、15μLのPCRマスターミックス、2.0μLのコロニー懸濁液(鋳型)、2.0μLのプライマーミックス、および1.0μLのPfx Platinum DNA PolをPCRチューブ中で混合した。PCRサーモサイクラーを以下のようにプログラムし、ステップ2~4を34回繰り返した:1)94℃で5:00分、2)94℃で0:15分、3)55℃で0:30分、4)68℃で2:00分、5)68℃で7:00分、その後4℃に冷却。PCR産物を、10μLの各アンプリコンおよび2.5μLの5×色素を使用するゲル電気泳動によって分析した。PCR産物は、CAT遺伝子がゲノムに挿入された(それによって、ファージを欠失および不活性化する)場合にのみ形成される。
抗生物質耐性遺伝子をプラスミドpCP20で除去した。プラスミドpCP20は、FRT部位を組み換えてCAT遺伝子を除去するフリッパーゼリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミドである。欠失ファージ配列を有する株を、OD600=0.4~0.6に達するまで、37℃で抗生物質を含有するLB培地中で増殖させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを4℃に予備冷却した。細胞を2,000rpmにて4℃で5分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を1mlの4℃水中に再懸濁した。細胞を2,000rpmにて4℃で5分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を0.5mlの4℃水中に再懸濁した。細胞を2,000rpmにて4℃で5分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を0.1mlの4℃水中に再懸濁した。エレクトロポレーターを2.5kVに設定し、1ngのpCP20プラスミドDNAを細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、滅菌済みの冷却キュベットにピペットで移した。乾燥させたキュベットをサンプルチャンバーに入れ、電気パルスを印加した。室温のSOC培地1mlを直ちに加え、混合物を培養チューブに移し、30℃で1~3時間インキュベートした。次に、200μLの細胞をカルベニシリンプレート上に広げ、200μLの細胞をクロラムフェニコールプレート上に広げ、両方を37℃で一晩増殖させた。カルベニシリンプレートは、pCP20を有する細胞を含む。細胞を一晩インキュベートし、十分なOD600まで一晩増殖しなかったコロニーをさらに24時間インキュベートした。クロラムフェニコールプレートは、いくつの細胞がエレクトロポレーションで生き残ったかの指標を提供する。カルベニシリンプレートからの形質転換体を43℃で非選択的に精製し、一晩増殖させた。
実施例59に記載されるように、40bpのオーバーハングおよびpKD3に対する相同性を有するプライマーを使用して、ファージゲノムの10kB領域を標的とするノックアウトを作製した(λレッド組換え、続いてクロラムフェニコール耐性についての選択)。得られた4つのクローンを選択した。ファージ3ゲノムにおけるクロラムフェニコールカセットの挿入の存在についてスクリーニングするためのプライマーを使用して、予想される200bpのバンドが、4つのクローンすべてについて見られ、ファージ3ゲノムに特異的なポジティブな挿入を示した。
この研究は、野生型NissleおよびSYN-PKU-1034におけるファージ3ノックアウトが、プラークアッセイにおいてネガティブ試験(negative test)をもたらすかどうかを試験するために実施された。表97に、この研究で使用した株について記載する。
のためにプレーティングした。10-3~10-8の希釈にまたがるスポット希釈物(10μl)を、各株について、1プレートあたり(LBプレート-必要に応じてDAP100ug/mL)2回ずつプレーティングした。
この研究は、抗生物質カセットがプラスミドバックグラウンドから除去された種々のフェニルアラニン株におけるファージ産生を評価し、このカセットの除去がファージ粒子の再形成を可能にしないことを確認するために行われた。
ファージ3がノックアウトされ、クロラムフェニコールカセットが治癒されたフェニルアラニン消費株SYN-PKU-710のバージョンが分析された。まず、プラーク形成をプラークアッセイで評価した。次に、この株がトランス-ケイ皮酸を産生する能力をSYN-PKU-710と比較して、ファージの除去がin vitroでのフェニルアラニン消費活性に変化を引き起こすかどうかを決定した。関連するPhe分解領域のサンガー配列決定を行って、フェニルアラニン消費回路を確認した。
濃い緑色に変わり、LAAD陽性の結果を示した。さらなる分析のために1つのクローンを維持し、SYN-PKU-2002と命名した。
も含まない。SYN-PKU-2002はまた、IPTGおよび嫌気性誘導の両方でフェニルアラニン分解活性を有する。フェニルアラニン分解に関与する全ての関連領域が配列決定された。従って、SYN-PKU-2002は、ファージを産生しないことを除いて、SYN2619に対して機能的に同等であるように見える。
SYN-PKU-2002の一晩培養物の1:100逆希釈物を、対数期初期まで1.5時間増殖させた後、本明細書に記載の誘導のために1mM IPTGおよび0.1%アラビノースの存在下で4時間嫌気性チャンバーに移した。活性アッセイを行うために、1e8の細胞を再懸濁し、アッセイ緩衝液(0.5%グルコース、50mM Phe、および50mM フェニルアラニンを含有する50mM MOPSを含むM9培地)中でインキュベートした。上清サンプルを経時的に採取し、TCA(PALの産物)を290nmでの吸光度によって測定して、TCA産生/PAL活性の速度を決定した。フェニルピルビン酸は、本明細書に記載のLCMS法を用いて測定した。結果を図16Aおよび図16Bに示す。
In vivoで馬尿酸を産生するSYN-PKU-2002の活性を評価する。本研究では、SYN-PKU-710およびSYN-PKU-2002をフラスコ中で増殖させ、嫌気的に誘導し、馬尿酸を産生し、血清Pheを減少させるSYN-PKU-2002の能力に対するファージ欠失の影響を、in vivoでSYN-PKU-710株を含む同質遺伝子ファージとの比較を通して評価する。
SYN-PKU-2002の活性をin vivoで評価した。研究のための細胞を調製するために、SYN-PKU901およびSYN-PKU-2002の一晩培養物をそれぞれ使用して、DAP100μg/mLを含有する500mLのLBを含む4つの2Lフラスコに接種した。これらの培養物を1時間45分間増殖させ、次いで、90%N2、5%CO2、および5%H2を供給する嫌気性チャンバーに4時間移した。次いで、細胞を4600×Gで12分間遠心分離し、10mLの製剤緩衝液(グリセロール:15%(v/v)、スクロース:10%(w/v)(100g/L)、MOPS:10mM(2.1g/L)、NaCl:25mM(1.46g/L))に再懸濁した。いくつかの40μlアリコートを取り出し、細胞カウントおよび活性測定のために使用した。セロメーター(cellometer)カウント(4回行った)によって決定された生存率は、6.94e10 cfu/ml(+/-5.78e9)であった。
この研究の目的は、経口SYN‐PKU‐2002投与後の尿中馬尿酸(HA)、トランス‐ケイ皮酸(TCA)およびフェニルアラニン(Phe)の産生により測定した、フェニルケトン尿症(PKU)のENU2マウスモデルにおけるフェニルアラニン(Phe)分解プロバイオティクスSYN‐PKU‐2002の用量依存的なin vivo活性を調べることであった。PKUに関連するSYN-PKU-2002の有効性は、経口投与されたSYN-PKU-2002が、血漿TCAおよびHAの出現とともに、食事によるPhe摂取とは無関係にPahenu2/enu2マウスにおいて血漿Pheレベルを低下させる能力によって測定され、また皮下(SQ)注射によるPhe投与後の血漿中のこれらの代謝産物を測定することによっても評価された。
ファージ含有フェニルアラニン株SYN-PKU-710とそのファージフリー対応物SYN-PKU-2002との間の生存率、輸送(transit)またはコロニー形成の潜在的な違いを特定するために、in vivo競合研究を実施し、SYN-PKU-710と同質遺伝子のファージレスSYN-PKU-2002株の競合指数が生成された。SYN-PKU-710もSYN-PKU-2002も抗生物質カセットを有していないため、この研究では抗生物質耐性が治癒されていない標識株が用いられた。SYN-PKU-710については、クロラムフェニコール/カナマイシン(cm/kan)標識株SYN-PKU-713を使用した。SYN-PKU-2002については、クロラムフェニコール(cm)標識株SYN-PKU-2001を使用した。表102は、この研究に関連する株を列挙している。
以下の手順は、EcNプロファージ/ファージ中に見出されるDNA配列を検出する。上記手順は、プライマーが欠失されたプロファージの領域の外側で増幅してSYN-PKU-2002の細菌株を生成するので、SYN-PKU-2002におけるEcNゲノム
内のファージおよびプロファージDNAを増幅する。
a lawn)プレーティングする。プラークがポジティブコントロール中に存在し、かつプラークがネガティブコントロール中に存在しない場合、試験は有効であると見なされる。
a.サンプル:計数可能なプレートから採取した最大10個の再懸濁プラーク1μL
b.ネガティブコントロール:計数可能なサンプルプレートの非プラーク領域から採取した1個のプラグ1μL
c.ネガティブコントロール:大腸菌、ATCC13706、または同等の株(プラーク指標株)の溶解した定常培養物(stationary cultures)1μL
d.ポジティブコントロール:目的の細胞株の溶解した定常培養物(stationary cultures)1μL
GLP毒性試験の投与期間は、BID投与の雄および雌のCD-1マウスで28日間である(1日2回)。投与量は、1×109、1×1010、および1×1011 CFUのおよその範囲をカバーする。最高濃度は、実現可能な最大用量である。マウスは、試験品に関連する死亡率、臨床観察、体重、血液学、臨床化学、ならびに肉眼的および顕微鏡的病理について評価される。投与を中止した後、マウスから糞便サンプルを数日間採取し、qPCR分析を用いてSYN-PKU-2002のDNAの存在をアッセイし、SYN-PKU-2002の経時的な減少を決定する。血液はまた、qPCRを使用して、SYN-PKU-2002のDNAの存在について評価される。28日間のマウスGLP毒性試験の設計の概要を表107に示す。
SYN-PKU-2002の投与前および投与後の様々な時点での2匹のブタ(十二指腸カニューレを有していた)における胃フェニルピルビン酸のレベル。
非ヒト霊長類モデルにおけるSYN-PKU-2002の有効性を評価した。
D. S.およびBuckeridge C. Simple, automatic, noncompartmental analysis: The PKNCA R
package. J Pharmk PharmD 42.1, 11-107頁、doi:10.1007/s10928-015-9432-2(2015年))を用いて線形台形法で計算され、AUCを説明するモデルはrstanarmパッケージで推定された。d5-PheについてのAUC0-lastは、リニアアップ/ログダウン法(linear-up/log-down method)で計算された。標識PheのAUCの平均および信頼区間と処置差は、処置(ビヒクルまたは細胞)に対する固定効果および動物ごとのランダム効果を有する階層ベイズモデルを用いて計算された。
し、細胞をさらに1時間増殖させた。4,500×G、4℃で30分間遠心分離することによって細胞を回収し、製剤緩衝液に再懸濁し、試験当日まで-80℃で保存した。
LAAD発現の有効性およびPheのPAL代謝に対する負の効果の決定が評価された。
活性をさらに特徴づけるために、経口トレーサ試験が実施された。T=0で、尿パンを空にし、NHPは11mL中の肉由来のペプトン5.5g、4mLのD5-フェニルアラニン(20mg/mL)、および10mLの細菌(5.2×1011CFUのSYN-PKU-2001)を強制経口投与された。同時に、NHP1~10は全て、5mLの0.36M重炭酸ナトリウムを投与された後、2mLの水でフラッシュされた。動物は、静脈穿刺によって0、0.5、1、2、4および6時間で採血された。投与後6時間で、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、5mlの体積を計測した。図25は、投与時の血中Pheレベルの大きなスパイクを示している。
4つの研究により、タンパク質が豊富な食事後のSYN-PKU-2002の単回投与後、非ヒト霊長類(NHP)におけるPheの用量依存的な変換の成功と、血漿バイオマーカーt-ケイ皮酸(TCA)および馬尿酸(HA)の産生が確認された。
を強制経口投与した。NHP6~10に、1mLのSYN-PKU-2002(9.0×1010CFU)を強制経口投与した後、7mLの製剤緩衝液を強制経口投与した。同時に、NHP1~10の全ては、5mLの0.36M重炭酸ナトリウムを投与された後、水でフラッシュされた。動物は、静脈穿刺によって0、0.5、1、2、4および6時間で採血された。投与後6時間で、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、5mlの体積を計測した。
Phe、TCA、およびHA消費を発現させるために、ペプトン(小ペプチドで構成される)をカゼイン(全タンパク質)で置換することの有効性が評価された。
非ヒト霊長類において開示された研究は、Phe代謝の関連性と、それがPKU患者の食事に及ぼし得る重大な影響を実証している。米国医学研究所(The Institute of Medicine)は、フェニルアラニンが80~90mg/g全タンパク
質であると想定される食事基準摂取量を確立した。ヒトに推奨されるタンパク質の摂取量は50gである(2000カロリーの食事の場合)。無制限のアメリカの食事は、平均して、約100gの全タンパク質(男性)と約70gの全タンパク質(女性)を提供する。従って、無制限の食事は、約6~9gのフェニルアラニンを提供する。
細菌の増殖および分裂に必要なDAPの最小量を決定するために、EcNのDAP栄養要求株であるSYN766の増殖を、ある範囲のDAP濃度でのインキュベーションによって特性評価した。
なDAP濃度のLB100μLを含む96ウェルプレートのウェルで1:100に希釈した。
EcNの様々な改変株を、DAPを含まない培地で増殖させ、DAP栄養要求株および原栄養株の増殖特性を確認した。実施例79に記載したものと同様の増殖条件を使用した。フェニルアラニンを消費するように改変されたEcNの様々な株を、DAPの非存在下および存在下で増殖するそれらの能力について分析した。結果を図33に示す。非栄養要求株SYN001、SYN‐PKU901およびSYN3282は、約400分間指数関数的に増殖した後、OD600が約1.2で静止期に入った。同様の条件下で、DAP栄養要求株SYN766、SYN-PKU-2001およびSYN-PKU-2002は、最初の90分間は接種OD600の約0.010以内にとどまり、その後減少を示し始め、OD600が約0.005で実験を終了した。これは、dapAを欠失させると、DAPの外部供給源の非存在下で増殖が停止することを示している。SYN3282におけるPhe分解に関与する遺伝子の存在は、野生型株と比較して増殖に影響を与えなかった。SYN‐PKU‐2001およびSYN‐PKU‐2002におけるDAP栄養要求性とPhe分解に関与する遺伝子との組合せは、DAP栄養要求性のみ(SYN766)で観察された増殖障害に影響を与えなかった。これらの結果は、DAP栄養要求性がこれらの操作された株の増殖および生存を調節する主な要因であることを示している。
901およびSYN3282と、栄養要求株SYN766、SYN‐PKU‐2001およびSYN‐PKU‐2002は、約400分間指数関数的に増殖した後、OD600が約1.4で静止期に入った。
に集めた。PBS/流出液サンプルを秤量し、選択培地上での連続希釈プレーティングによって処理するまで氷上で維持して、各腸セグメントの流出液における生存可能なCFUを決定した。100mM重炭酸ナトリウムを含む製剤では、処置群の動物に9×109CFUのSYN-PKU901(6群)またはSYN-PKU-2001(6群)を経口投与した。投与後0.25、0.5、1、4、24、および48時間で、SYN-PKU901-およびSYN-PKU-2001-処置群を犠牲にし、組織をコントロール群と同じ方法で処理した。
健康な雄のカニクイザルにおけるSYN-PKU-2002のフェニルアラニン代謝活性は、3.3×109~7.2×1011コロニー形成単位(CFU)の範囲の用量レベルでSYN-PKU-2002を投与した後、血漿および尿中のフェニルアラニン(Phe)およびその代謝産物のレベルを測定することによって特性評価された。
健康なカニクイザルの胃腸管の様々なセグメント内でのSYN-PKU-2001のフェニルアラニン代謝活性およびコロニー形成を特性評価するために、2つの試験を行った。第1の試験では、動物を、それぞれ3匹の雌からなる2つの群に分け、5.5グラムのペプトン、5mLの0.36M重炭酸ナトリウム、25mg/kgのD5-フェニルアラニン、およびSYN-PKU-2001またはブランクコントロールのいずれかを投与した。投与の2時間後、動物を安楽死させ、サンプルを収集した。第2の試験では、3匹の雄のサルからなる1つの群に、5.5グラムのペプトン、5mLの0.36M重炭酸ナトリウム、25mg/kgのD5-フェニルアラニン、およびSYN-PKU-2001を投与し、投与の0.5時間後に動物を安楽死させ、サンプルを収集した。
、マウスの尿中に測定可能なレベルのD5-馬尿酸が得られるためである。
ラベル付きの50mLコニカルチューブに収集し、体積を記録した。各セグメントからの約1mLの内容物は、収集時にプレーティングするために分析施設に移された。残りの内容物を3つの異なるアリコートに分離した:1mL、1.6mL(凍結前にそのスポンサーにグリセロールを添加した)、および残り。小腸組織切片(ラベル付きのジップロックバッグに収集したもの)は、内容物とともに同日宅配便(ドライアイスで凍結)によって分析施設に発送されるまでドライアイス上で凍結された。
Claims (73)
- 非天然フェニルアラニン代謝酵素(PME)をコードする1つ以上の遺伝子を含み、かつ1つ以上のファージゲノムを更に含む細菌であって、前記1つ以上のファージゲノム中の1つ以上のファージ遺伝子は、1つ以上の突然変異を含む、細菌。
- 1つ以上のファージゲノムを含む細菌であって、前記1つ以上のファージゲノム中の1つ以上のファージ遺伝子は、1つ以上の突然変異を含む、細菌。
- 非天然フェニルアラニントランスポーターをコードする1つ以上の遺伝子を更に含む、請求項1に記載の細菌。
- 非天然L-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする1つ以上の遺伝子を更に含む、請求項1または2に記載の細菌。
- 前記1つ以上のファージゲノムは、前記プロバイオティクス細菌の自然状態において存在する、請求項1~4の何れか1項に記載の細菌。
- 前記1つ以上のファージゲノムは、1つ以上の溶原性ファージをコードする、請求項1~5の何れか1項に記載の細菌。
- 前記1つ以上のファージゲノムは、1つ以上の欠陥ファージまたはクリプティックファージをコードする、請求項1~5の何れか1項に記載の細菌。
- 前記1つ以上のファージゲノムは、1つ以上のサテライトファージをコードする、請求項1~5の何れか1項に記載の細菌。
- 前記1つ以上のファージゲノムは、1つ以上のテリオオシン(tailiocin)または遺伝子導入剤をコードする、請求項1~5の何れか1項に記載の細菌。
- 前記1つ以上の突然変異が以下から選択される、請求項1~9の何れか1項に記載の細菌:
a.前記ファージゲノム中の1つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の1つ以上の欠失;
b.前記ファージゲノム中の1つ以上のファージ遺伝子への1つ以上のヌクレオチドの1つ以上の挿入;
c.前記ファージゲノム中の1つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の1つ以上の置換;
d.前記ファージゲノム中の1つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の1つ以上の逆位;および
e.a、b、c、およびdのうちの2つ以上の組み合わせ。 - 前記1つ以上のファージ遺伝子における前記1つ以上の突然変異は欠失である、請求項1~10の何れか1項に記載の細菌。
- 前記1つ以上のファージ遺伝子における前記1つ以上の突然変異は挿入である、請求項1~10の何れか1項に記載の細菌。
- 前記1つ以上のファージ遺伝子における前記1つ以上の突然変異は置換である、請求項1~10の何れか1項に記載の細菌。
- 前記1つ以上のファージ遺伝子における前記1つ以上の突然変異は逆位である、請求項1~10の何れか1項に記載の細菌。
- 前記1つ以上の突然変異は、1つ以上の欠失、1つ以上の挿入、1つ以上の置換、および1つ以上の逆位から選択される2つ以上の突然変異の組み合わせである、請求項1~10の何れか1項に記載の細菌。
- 請求項1~15の何れか1項に記載の細菌であって、前記1つ以上の突然変異は、前記細菌からのファージ粒子の放出を、前記1つ以上のファージゲノム中に前記1つ以上の標的化突然変異を有さない同じ細菌と比較して低減または防止する、細菌。
- プロバイオティクス細菌である、請求項1~16の何れか1項に記載の細菌。
- バクテロイデス属(Bacteroides)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、クロストリジウム属(Clostridium)、エシェリヒア属(Escherichia)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、およびラクトコッカス属(Lactococcus)からなる群から選択される、請求項1~17の何れか1項に記載の細菌。
- 大腸菌(Escherichia coli)株Nissleである、請求項1~18の何れか1項に記載の細菌。
- 前記1つ以上のファージゲノムは、大腸菌Nissleファージ1ゲノム、大腸菌Nissleファージ2ゲノムおよび大腸菌Nissleファージ3ゲノムのうちの1つ以上から選択される、請求項1~19の何れか1項に記載の細菌。
- 前記ファージゲノムは、前記大腸菌Nissleファージ1ゲノムである、請求項1~20の何れか1項に記載の細菌。
- 前記ファージゲノムは、前記大腸菌Nissleファージ2ゲノムである、請求項1~20の何れか1項に記載の細菌。
- 前記ファージゲノムは、前記大腸菌Nissleファージ3ゲノムである、請求項1~20の何れか1項に記載の細菌。
- 前記突然変異は、以下から選択される1つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される1つ以上の遺伝子を含む、請求項23に記載の細菌:
ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09975、ECOLIN_09980、ECOLIN_09985、ECOLIN_09990、ECOLIN_09995、ECOLIN_10000、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10055、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_1015
0、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。 - 前記突然変異は、以下から選択される1つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される1つ以上の遺伝子を含む、請求項23または24に記載の細菌:
ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175。 - 前記突然変異は、以下の完全な欠失または部分的な欠失を含む、請求項23~25の何れかに記載の細菌:
ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175。 - 前記欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である、請求項26に記載の細菌。
- 前記欠失は配列番号130を含む、請求項27に記載の細菌。
- 前記欠失は配列番号130からなる、請求項28に記載の細菌。
- 1つ以上の追加の遺伝子改変を含む、請求項1~29の何れかに記載の細菌。
- 前記1つ以上の追加の遺伝子改変は、1つ以上の内因性遺伝子における1つ以上の突然変異を含む、請求項1~30の何れかに記載の細菌。
- 前記1つ以上の内因性遺伝子における突然変異は点突然変異である、請求項31に記載の細菌。
- 前記1つ以上の内因性遺伝子における突然変異は欠失である、請求項31に記載の細菌。
- 前記1つ以上の追加の遺伝子改変は、1つ以上の非天然遺伝子の追加を含む、請求項1~33の何れかに記載の細菌。
- 前記1つ以上の非天然遺伝子は染色体上に存在する、請求項1~34の何れかに記載の細菌。
- 前記1つ以上の非天然遺伝子はプラスミド上に存在する、請求項1~34の何れかに記載の細菌。
- 前記1つ以上の非天然遺伝子は、1つ以上のエフェクター分子の産生のための1つ以上の生合成酵素をコードする、請求項1~36の何れかに記載の細菌。
- 前記1つ以上の非天然遺伝子は、1つ以上のエフェクター分子をコードする、請求項1~36の何れかに記載の細菌。
- 前記1つ以上の非天然遺伝子は、1つ以上の毒性代謝産物の消費のための1つ以上の酵素をコードする、請求項1~36の何れかに記載の細菌。
- 前記1つ以上の非天然遺伝子は、毒性代謝産物の取り込みのための1つ以上のトランスポーターをコードする、請求項1~36の何れかに記載の細菌。
- 前記1つ以上の非天然遺伝子は、代謝産物のエクスポートのための1つ以上のエクスポーターをコードする、請求項1~36の何れかに記載の細菌。
- 少なくとも1つの非天然遺伝子は、前記非天然遺伝子と自然では関連しない直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項1~41の何れかに記載の細菌。
- 少なくとも1つの非天然遺伝子は、化学的誘導物質および/または栄養性誘導物質により誘導される直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項42に記載の細菌。
- 前記化学的誘導物質および/または栄養性誘導物質は、アラビノース、IPTG、テトラサイクリン、およびラムノースから選択される、請求項43に記載の細菌。
- 少なくとも1つの非天然遺伝子は、哺乳動物の消化管において見出される外因性環境条件により誘導される直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項42に記載の細菌。
- 少なくとも1つの非天然遺伝子は、腫瘍において見出される外因性環境条件により誘導される直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項42に記載の細菌。
- 少なくとも1つの非天然遺伝子は、低酸素条件下または嫌気性条件下で誘導される直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項42に記載の細菌。
- 前記プロモーターはFNR応答性プロモーターである、請求項47に記載の細菌。
- 前記PMEはフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)である、請求項2に記載の細菌。
- 前記PALは、アナベナ・バリアビリス(Anabaena variabilis)に由来する(PAL1)か、またはフォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)に由来する(PAL3)、請求項49に記載の細菌。
- 前記フェニルアラニントランスポーターはPhePである、請求項3に記載の細菌。
- 請求項1~51の何れかに記載の細菌であって、前記細菌が哺乳動物の消化管内に存在する場合に補完される遺伝子の栄養要求株である、細菌。
- 哺乳動物の消化管はヒトの消化管である、請求項52に記載の細菌。
- ジアミノピメリン酸の栄養要求株、またはチミジン生合成経路中の酵素の栄養要求株である、請求項1~53の何れかに記載の細菌。
- 抗生物質耐性を更に含む、請求項1~54に記載の細菌。
- 請求項1~55の何れか1項に記載の細菌と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物。
- 経口投与用に製剤化された、請求項56に記載の組成物。
- a.フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の2つの非天然コピー;
b.フォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の3つのコピー;
c.前記PALをコードする遺伝子の2つの追加コピー;
d.L-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の1つのコピー;
e.栄養要求性を生成するためのThyAおよびDapAの1つ以上における突然変異;
を含む遺伝子操作された細菌であって、前記細菌は1つ以上のファージゲノムを含み、前記1つ以上のファージゲノム中の1つ以上のファージ遺伝子は1つ以上の突然変異を含む、遺伝子操作された細菌。 - 請求項58に記載の遺伝子操作された細菌であって、
a.前記高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする前記内因性Nissle遺伝子の前記2つの追加コピーは、前記哺乳動物の消化管において見出される外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターに作動可能に連結され;
b.フォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の前記3つのコピーは、前記哺乳動物の消化管において見出される外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターに作動可能に連結され;
c.PALをコードする前記遺伝子の前記2つの追加コピーは、化学的誘導物質または栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターに作動可能に連結され;
e.プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の前記1つのコピーは、化学的誘導物質または栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターに作動可能に連結され;
f.ThyAおよびDapAの1つ以上における前記突然変異は、前記DapA遺伝子における突然変異である、遺伝子操作された細菌。 - 請求項59に記載の遺伝子操作された細菌であって、
a.前記高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする前記内因性Nissle遺伝子の前記2つの追加コピーは、嫌気性誘導性プロモーターに作動可能に連結され;
b.フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の前記3つのコピーは、嫌気性誘導性プロモーターに作動可能に連結され;
c.前記PALをコードする遺伝子の前記2つの追加コピーは、IPTG誘導性プロモーターに作動可能に連結され;
d.プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)由来のL-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の前記1つのコピーは、アラビノース誘導性プロモーターに作動可能に連結され;および
e.ThyAおよびDapAの1つ以上における前記突然変異は、前記dapA遺伝子の欠失である、遺伝子操作された細菌。 - 請求項60に記載の遺伝子操作された細菌であって、
a.前記高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする前記内因性Nissle遺伝子の前記2つの追加コピーは、FNRプロモーターに作動可能に連結され;および
b.前記フォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の3つのコピーは、FNRプロモーターに作動可能に連結されている、遺伝子操作された細菌。 - プロバイオティクス細菌である、請求項58~61の何れかに記載の細菌。
- バクテロイデス属(Bacteroides)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、クロストリジウム属(Clostridium)、エシェリヒア属(Escherichia)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、およびラクトコッカス属(Lactococcus)からなる群から選択される、請求項58~61に記載の細菌。
- 大腸菌(Escherichia coli)株Nissleである、請求項58~63の何れかに記載の細菌。
- 請求項64に記載の細菌であって、
a.前記高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする前記内因性Nissle遺伝子の前記2つの追加コピーは、lacZおよびagal/rsml遺伝子座で前記染色体に挿入され;
b.フォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の前記3つのコピーは、malEK、malPT、およびyicS/nepI遺伝子座で前記染色体に挿入され;
c.PALをコードする前記遺伝子の前記2つの追加コピーは、exo/ceaおよびrhtC/rhtB遺伝子座で挿入され;および
d.L-アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の1つのコピーは、前記アラビノース遺伝子座に挿入され、LAADは前記天然アラビノースプロモーター下にある、細菌。 - 前記1つ以上のファージゲノムは、前記大腸菌Nissleファージ1ゲノム、前記大腸菌Nissleファージ2ゲノムおよび前記大腸菌Nissleファージ3ゲノムのうちの1つ以上から選択される、請求項65に記載の細菌。
- 前記ファージゲノムは、前記大腸菌Nissleファージ3ゲノムである、請求項66に記載の細菌。
- 前記突然変異は、以下から選択される1つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される1つ以上の遺伝子を含む、請求項67に記載の細菌:
ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09975、ECOLIN_09980、ECOLIN_09985、ECOLIN_09990、ECOLIN_09995、ECOLIN_10000、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10055、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。 - 前記突然変異は、以下から選択される1つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される1つ以上の遺伝子を含む、請求項68に記載の細菌:
ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175。 - 前記欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である、請求項69に記載の遺伝子操作された細菌。
- 前記欠失は配列番号130を含む、請求項70に記載の遺伝子操作された細菌。
- 前記欠失は配列番号130からなる、請求項71に記載の遺伝子操作された細菌。
- 請求項58~72の何れか1項に記載の細菌と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物。
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