1つの態様では、本開示は内因性ファージを含み、そしてファージ配列に対する1つ以上の改変を含む細菌を提供する。いくつかの実施形態では、改変はプロファージ配列の特性を変化させる。このような突然変異は、1つ以上のファージ遺伝子の1つ以上の部分的または完全な欠失、1つ以上のファージ遺伝子への1つ以上のヌクレオチドの1つ以上の挿入、ファージゲノム中の1つ以上のファージ遺伝子の1つ以上の部分的または完全な置換;1つ以上のファージ遺伝子の1つ以上の逆位、またはそれらの組み合わせを含む。
本発明は、1つ以上のバクテリオファージまたはプロファージを天然に含む、障害の処置のための新規な細菌を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、細菌が1つ以上のファージのゲノムに対する1つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の改変がファージまたはプロファージを不活性にする。いくつかの実施形態では、これらの細菌が1つ以上のエフェクター分子の発現または産生のための1つ以上の遺伝子を含むように、さらに遺伝的に改変される。障害の処置のための新規な治療におけるこれらの遺伝子操作された細菌の製造および使用のための方法が提供される。
一実施形態では、大腸菌Nissleが遺伝子操作された細菌の出発点、親株、または「シャシー(chassis)」として使用される。一実施形態では、改変されたバクテリオファージがそのファージ中の大腸菌Nissleに内因性であるファージであり、その天然の状態で細菌中に存在する。
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が1つ以上のエフェクター(例えば、PME)をコードする1つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がPALをコードする1つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がLAADをコードする1つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がPALをコードする1つ以上の遺伝子およびLAADをコードする1つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がトランスポーター(例えば、PheP)をコードする1つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がトランスポーターをコードする1つ以上の遺伝子(例えば、PheP)およびPALをコードする1つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がトランスポーターをコードする1つ以上の遺伝子(例えば、PheP)およびLAADをコードする1つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がトランスポーターをコードする1つ以上の遺伝子(例えば、PheP)、LAADをコードする1つ以上の遺伝子、およびPALをコードする1つ以上の遺伝子を含む。前述の実施形態のいずれかにおいて、フェニルアラニンを摂取するための遺伝子操作された細菌物は、その元の状態に対して1つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、内因性バクテリオファージゲノム。いくつかの実施形態では、バクテリオファージがバクテリオファージゲノム内の1つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、1つ以上のバクテリオファージ遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。
バクテリオファージは世界で最も一般的な生物学的実体であり、グラム陽性およびグラム陰性の両方の大多数の細菌種が細菌染色体中にいわゆるプロファージとして組み込まれる1つ以上のDNAバクテリオファージを含むことが十分に実証されている(Clokieら、Phages in Nature、Bacteriophage.2011 Jan−Feb; 1(1):31−45)。例えば、大腸菌株の研究では、分析された27の大腸菌株から51の異なる機能株が放出され、107の大腸菌株のうち83の機能株(Casjens、プロファージ、および細菌ゲノム)が放出された:これまでに得られたもの; Mol Microbiol、2003 Jul 49(2):277−300; Osawaら、大沢ら、Shiga toxin−coli O157:H7株の流動性失調症エシェリヒア属からのShigaトキシン転換相の遺伝子変形;J Med Microbiol(2001)49:565−574、およびSchicklmaierら、一般化された振動端子に重点を置いた、サルモネラおよびエシェリヒア属coliの天然分離株間のプロファージの周波数に関する比較研究)。Antonie Van Leeuwenhoek (1998) 73: 49−54)。
図12に示すように、ほとんどすべての大腸菌ゲノムはインタクトプロファージを含み、公開された完成大腸菌ゲノムの大部分はEcNよりも多くのインタクトプロファージを含む。略語: Ecoli =エシェリヒア属coli; EcN =エシェリヒア属coli Nissle 1917; Refseq = 基準配列。
グラム陽性菌の中で、Bsubtilis、クロストリジウム属acetobutylicum、ラクトコッカス属lactis、および多くの他のものゲノムは主にインタクトプロファージを含むことが示されている(Kunstら、1997; Bolotinら、The complete genome sequence of gram−positive bacterium Bacillus subtilis.Nature(2001) 390: 249−256、Nollingら、Genome sequence and comparative analysis of。J Bacteriol (2001) 183: 4823−4838; Bolotin et al、The complete genome sequence of lactic acid bacteriumラクトコッカス属lactis ssp.ラクチスIL1403。Genome Res (2001)11: 731−753)。
DNAファージは、溶解性であっても、温和であってもよい。溶解ファージは細菌細胞に感染し、次いで、子孫ファージの合成をプログラムし、これは、次いで、溶解細胞から放出される。逆に、テンペレートDNAファージは組み込まれたファージDNA(すなわち、プロファージ)が宿主のゲノムと協調して複製され、任意の宿主損傷ファージ遺伝子が発現されない、それらの宿主細菌との安定な関係を確立する。しかし、バクテリオファージ粒子はインタクトプロファージを含む細胞から、誘導と呼ばれる処理によって放出され得、その処理の間に、溶解成長に必要なプロファージ遺伝子が作動し、子孫ファージ粒子が産生され、細胞の溶解を通して細胞から放出される(Casjens、Prophages、および細菌ゲノミクスにおいて概説されている:これまでに学んだこと?; Mol Microbiol.2003 Jul;49(2):277−300)。誘導はいくつかの場合において、プロファージを保有する細菌の小分率または大分率において自発的かつランダムに起こり得るか、または特異的な、しばしば定義されていない環境シグナルは多くの細胞において特定のプロファージの同時誘導を引き起こし得、細菌細胞の死を引き起こし得る。いくつかの場合において、プロファージ配列の存在はまた、いくつかの細菌がファージなしでは有さない特性(例えば、抗生物質耐性、種々の環境条件下で存在する能力、改善された密着性、病原性、または促進された水平遺伝子導入)を有することを可能にし得る(Casjensら、2001)。
全てのプロファージが溶解サイクルを受ける能力を有するわけではない。非機能的、すなわち、欠陥または潜在的プロファージは突然変異崩壊および/または何千もの細菌複製サイクルに必須の1つ以上の遺伝子の損失の試験結果として、多くの細菌において高いレベルの豊富さを生じることができる(Bobayら、Pervasive domestication of defective prophages by bacteria、Proc Natl Acad Sci U S A。2014 Aug 19; 111(33): 12127−12132、およびその中の参考文献)。注目すべきは欠損プロファージはまた、多くの場合、相同組換え機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、さらなる感染の予防、またはバクテリオシンを含む、宿主に好都合な機能性を提供し得る多くの遺伝子を含み、これは例えば、他の隣接する細菌種の増殖抑制を介する栄養素の競合において有用であり得る。
ファージは、多くの方法で大腸菌における遺伝子発現および適合性に正の影響を及ぼすことができる。暗号ファージ、溶原性ファージ、および溶解ファージは宿主に、有害な環境条件下での生存を促進する複数の利益を提供することが示されている。例えば、ファージによって細菌に導入された遺伝子配列は、異なる栄養素または異なるニッチへの適応、または競合株を排除する能力の増加に関連付けられている。休止状態のプロファージはまた、別の、例えば溶解性のファージとの重複感染を予防することが示されている。
いくつかの研究は、内因性ファージが特定の炭素源において細菌の増殖能に影響を及ぼすことを示している。ラムダに加えて、活性Mu、P1およびP2プロファージならびに潜在的プロファージCP4−57は、グルコース制限および他の成長条件下で成長を増大させる(Edlin、G.、Lin、L& Bitner、RReproductive fitness of P1、P2、and Mu Lysogens ofエシェリヒア属coli.JVirol.21、560−564 (1977); Edlin、G.、Lin、L& Kudmar、Rλ lysogens of Ecoli)。Nature 255、735−737 (1975); Wang、X.、Kim、Y& Wood、TKControl and benefits of CP4−57 prophage excision inエシェリヒア属coli biofilms.ISME J.3,1164−1179(2009)。別の研究では、λが大腸菌ゲノムに組み込まれると、不十分な炭素源での増殖能が停止することが示された。この場合、代謝の制限は、細菌に生存利益を付与し得る。グルコースが乏しい環境で細菌の増殖を遅らせることは、細菌が免疫系による検出を逃れるのを助け、生存の機会を増加させるかもしれない。
他の生存特性も同様に影響され得る。Wangらは、9つの潜在的プロファージのすべてを欠く単一のEcoli株を作製した。この研究において、これらのプロファージは浸透圧、酸化および酸ストレスに耐えるために、種々の条件下での増殖を増加させるために、リンおよび窒素利用を増強するために、およびバイオフィルム形成に影響を及ぼすために有益であることが示された(Wangら、Cryptic prophages help bacteria cop with inderse environments; DOI: 10.1038/ncoms1146)。病原性細菌プロファージにおいて、いくつかの研究は、獲得が病原体の毒性の変化と関連することを示唆している。
従って、当業者は改変(例えば、内因性プロファージの部分または全体の突然変異または欠失)が細菌適応度を変化させ得る(例えば、ネガティブに影響し得る)ことを予想し得る。さらに、内因性プロファージはこのエフェクターを産生し得る遺伝子操作された細菌において、エフェクター活性を変化させ得る(例えば、ネガティブに影響し得る)と仮定し得る。これは特に、内因性プロファージが特定の株亜型の全ての試験片に存在する場合に株−これはプロファージ配列を含む細菌がプロファージを欠く細菌の形成と進化的に競合することができたことを示す。
本開示でさらに記述されているように、大腸菌Nissleのプロファージが特定されたが、これは一定の条件下で分析が可能であり、大腸菌Nissleの全試験片に存在する。驚くべきことに、細菌の適応度、滞留時間、および活性の試験は内因性ファージ中の突然変異または欠失を含む細菌が本質的に同じ、例えば、少なくとも同程度の大きさであることを示した。
同様のアッセイ条件下では、菌株間でPhe分解活性(in vitroまたはin vivo)に識別可能な差異はなかった。例えば、類似のアッセイ条件下では、Phe消費が2つの株の間で同じ大きさ内である(例えば、図15および図17Aを参照のこと)。ファージを含む株とファージを含まない株との間のin vivo競合研究はNissleのファージを含まないPKU株の間の輸送またはコロニー形成に識別可能な差異がないことを示す(例えば、図19を参照のこと)。
従って、ファージゲノム中のいくつかの実施形態では1つ以上の改変(例えば、突然変異または欠失)、または本明細書中に記載される他の改変は改変または遺伝子操作された細菌の細菌適合性を変化させない。いくつかの実施形態では1つ以上のファージ改変(例えば、突然変異または欠失または本明細書中に記載される他の改変)を含む操作された細菌はファージ突然変異の非存在下で、対応する同質遺伝子株と本質的に同一または少なくとも類似の細菌適合性を有する。さらなる実施形態において、ファージのゲノムにおける1つ以上の改変(例えば、突然変異または欠失)または本明細書中に記載される他の改変はファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較して、エフェクターを産生可能な操作された細菌の株活性(例えば、エフェクター活性または代謝活性)を変化させない。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ未変性の(例えば、突然変異または欠失または本明細書中に記載される他の未変性の)を含む非未変性のまたは遺伝子操作された細菌はファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較した場合、本質的に同一または少なくとも類似の細菌株活性(例えば、エフェクター活性または代謝活性)を有する。
さらに、ファージゲノム中のいくつかの実施形態では、1つ以上の改変(例えば、突然変異または欠失)または本明細書中に記載される他の改変は操作された細菌の細菌適合性を変更させる(例えば、増加または減少させる)。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ改変(例えば、突然変異または欠失)または本明細書中に記載される他の改変を含む操作された細菌はファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較して、改変された(例えば、減少または増加した)細菌適合性を有する。いくつかの実施形態では、ファージのゲノムにおいて本明細書中に記載される1つ以上の変更(例えば、突然変異または欠失)または他の変更はファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較して、エフェクターを産生可能な細菌の株活性(例えば、エフェクター活性または代謝活性)を変更(例えば、減少または増加)する。1つ以上のファージ改変(例えば、突然変異または欠失)または本明細書中に記載される他の改変を含むいくつかの実施形態では、未改変または遺伝子操作された細菌がファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株として、細菌株活性(例えば、エフェクター活性または代謝活性)を改変(例えば、減少または増加)した。
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が1つ以上の大腸菌Nissleバクテリオファージ(例えば、ファージ1、ファージ2、およびファージ3)を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がファージ3中に1つまたは突然変異を含む。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、1つ以上のファージ3遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入物が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09995、ECOLIN_100005、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置するか、またはそれらを含む。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。一実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
本開示がより容易に理解され得るために、特定の用語が最初に定義される。これらの定義は、本開示の残りの部分を考慮して、および当業者によって理解されるように読まれるべきである。他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。さらなる定義が詳細な説明の全体を通して記載されている。
「高フェニルアラニン血症(Hyperphenylalaninemia)」、「高フェニルアラニン血症(hyperphenylalaninemic)」、および「過剰なフェニルアラニン」は、体内の増加したまたは異常に高い濃度のフェニルアラニンを指すために本明細書において交換可能に使用される。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症の診断シグナルは、少なくとも2mg/dL、少なくとも4mg/dL、少なくとも6mg/dL、少なくとも8mg/dL、少なくとも10mg/dL、少なくとも12mg/dL、少なくとも14mg/dL、少なくとも16mg/dL、少なくとも18mg/dL、少なくとも20mg/dL、または少なくとも25mg/dLの血中フェニルアラニンレベルである。本明細書において使用される場合、高フェニルアラニン血症に関連する疾患には、限定されないが、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、および瀬川病が含まれる。罹患者は、進行性および不可逆性の神経学的欠損、精神遅滞、脳症、てんかん、湿疹、低成長、小頭症、振戦、四肢痙攣、および/または低色素沈着を患う可能性がある(Leonard 2006年)。高フェニルアラニン血症はまた、他の状態、例えば肝疾患に続発する可能性がある。
「フェニルアラニンアンモニアリアーゼ」および「PAL」は、フェニルアラニンをtrans−ケイ皮酸およびアンモニアに変換または処理するフェニルアラニン代謝酵素(PME)を指すために使用される。trans−ケイ皮酸は、毒性が低く、哺乳動物における肝臓酵素によって、尿中に分泌される馬尿酸に変換される。PALは、過剰のフェニルアラニンを代謝するための酵素PAHの代わりになり得る。PAL酵素活性はTHB補因子活性を必要としない。いくつかの実施形態では、PALは原核生物種に由来するPAL遺伝子によってコードされる。代替の実施形態では、PALは真核生物種に由来するPAL遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、PALは、限定されないが、アクロモバクター・キシロソキシダンス(Achromobacter xylosoxidans)、シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomonas aeruginosa)、フォトラブダス・ルミネセンス(Photorhabdus luminescens)、アナベナ・バリアビリス(Anabaena variabilis)、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を含む、細菌種に由来するPAL遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、PALは、アナベナ・バリアビリスに由来するPAL遺伝子によってコードされ、本明細書において「PAL1」と称される(Moffittら、2007年)。いくつかの実施形態では、PALは、フォトラブダス・ルミネセンスに由来するPAL遺伝子によってコードされ、本明細書において「PAL3」と称される(Williamsら、2005年)。いくつかの実施形態では、PALは、酵母種、例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)に由来するPAL遺伝子によってコードされる(Gilbertら、1985年)。いくつかの実施形態では、PALは、植物種、例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)に由来するPAL遺伝子によってコードされる(Wannerら、1995年)。PALの任意の適切なヌクレオチドおよびアミノ酸配列、またはその機能的断片が使用され得る。
「フェニルアラニンヒドロキシラーゼ」および「PAH」は、補因子テトラヒドロビオプテリンと併せてヒト体内でチロシンを作製するためにフェニルアラニンの芳香族側鎖のヒドロキシル化を触媒する酵素を指すために使用される。PAHをコードするヒト遺伝子は、22位と24.2位との間の第12染色体の長(q)腕に位置する。PAHのアミノ酸配列は哺乳動物の間で高度に保存されている。ヒトおよび哺乳動物PAHについての核酸配列は周知であり、広く利用可能である。PAHについての完全長ヒトcDNA配列は1985年に報告された(Kwokら、1985年)。PAHの活性断片もまた周知である(例えば、Kobeら、1997年)。
「L−アミノ酸デアミナーゼ」および「LAAD」は、それらのそれぞれのケト酸、アンモニア、および過酸化水素を生成するためにL−アミノ酸の立体特異的酸化的脱アミノ化を触媒する酵素を指すために使用される。例えば、LAADはフェニルアラニンのフェニルピルベートへの変換を触媒する。多数のLAAD酵素が当該分野において公知であり、それらの多くは、プロテウス属(Proteus)、プロビデンシア属(Providencia)、およびモルガネラ属(Morganella)などの細菌、または毒液に由来する。LAADはフェニルアラニン分解の速い反応速度を特徴とする(Houら、Appl Microbiol Technol.2015年10月;99(20):8391〜402頁;「Production of phenylpyruvic acid from L−phenylalanine using an L−amino acid deaminase from Proteus mirabilis:comparison of enzymatic and whole−cell biotransformation approaches」)。大部分の真核生物および原核生物のL−アミノ酸デアミナーゼは細胞外であるが、プロテウス種LAADは、酵素活性が存在する周辺質間隙に外側で面している細胞膜(内膜)に局在している。この局在化の結果として、内膜を通る細胞質へのフェニルアラニン輸送は、プロテウス属LAADにより媒介されるフェニルアラニン分解に必要とされない。フェニルアラニンは、トランスポーターを必要とせずに外膜を通して周辺質に容易に取り込まれ、基質の利用可能性を改善するトランスポーターの必要性を取り除く。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、限定されないが、プロテウス属、プロビデンシア属、およびモルガネラ属の細菌を含む、細菌種に由来するLAAD遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)である。いくつかの実施形態では、細菌種は、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるLAADは、周辺質間隙に面しており、周辺質間隙において触媒活性を生じる細胞膜に局在している。
「フェニルアラニン代謝酵素」または「PME」は、フェニルアラニンを分解することができる酵素を指すために使用される。当該技術分野において公知の任意のフェニルアラニン代謝酵素は、遺伝子操作された細菌によってコードされ得る。PMEには、限定されないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)、アミノトランスフェラーゼ、L−アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが含まれる。
フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼまたはアミノトランスフェラーゼとの反応は補因子を必要とするが、LAADおよびPALはさらなる補因子を全く必要としない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるPMEは補因子を必要とする。いくつかの実施形態では、この補因子は、遺伝子操作された細菌の投与と同時または連続して提供される。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は補因子を産生することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はアミノトランスフェラーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるPMEは補因子を必要としない。理論に束縛されるものではないが、補因子の必要性がないことは、酵素によるフェニルアラニン分解の速度が基質の利用可能性に依存し、補因子の利用可能性によって制限されないことを意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によって産生されるPMEはPALである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によって産生されるPMEはLAADである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はPMEの組合せをコードする。
いくつかの実施形態では、PMEの触媒活性は酸素レベルに依存する。いくつかの実施形態では、PMEは微好気的条件下で触媒的に活性である。非限定的な例として、LAAD触媒活性は酸素に依存する。いくつかの実施形態では、LAADは微好気的条件などの低酸素条件下で活性である。本発明のいくつかの実施形態では、PMEは、例えば結腸に見出されるような非常に低いレベルの酸素で、または酸素の非存在下で機能する。非限定的な例として、PAL活性は酸素の存在に依存しない。
本明細書中で使用される場合、「エフェクター」または「エフェクター分子」は、所望の機能を発揮する代謝産物またはポリぺポリペプチドのような分子を指し得る。エフェクターは、単一の遺伝子によってコードされ得る。例えば、単一の遺伝子は、分泌またはディスプレイされるポリペプチドをコードし得る。あるいは、エフェクターが複数の遺伝子(例えば、酪酸)を必要とする生合成経路によって合成され得る。生合成経路内の多数の遺伝子によってコードされるポリペプチド(例えば、所望の特性を有する代謝産物を合成する)はまた、エフェクターと呼ばれ得る。同様に、例えば、毒性代謝産物の分解のために、異化経路内の多数の遺伝子によってコードされるポリペプチドはまた、エフェクターと呼ばれ得る。これらのエフェクター分子はまた、「治療方法代謝産物」、「治療分子」または「治療用ポリペプチド」と呼ばれ得る。本明細書においてエフェクターと互換的に使用される他の用語は、「目的のポリペプチド」または「目的のポリペプチド」、「目的のタンパク質」、「目的のタンパク質」である。
本明細書中で使用される場合、「ペイロード」は、細菌のような遺伝子操作された微生物によって産生される目的の1つ以上のポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドをいう。いくつかの実施形態では、ペイロードが遺伝子または多数の遺伝子またはオペロンによってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードを含む1つ以上の遺伝子および/またはオペロンが微生物に対して内因性である。いくつかの実施形態では、ペイロードの1つ以上の要素が異なった微生物および/または生物に由来する。いくつかの実施形態では、ペイロードは治療用ペイロードである。いくつかの実施形態では、ペイロードが分子の生合成のための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードが分子の代謝、異化、または分解のための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードが分子の輸入のための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードが分子の輸出のための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは調節分子、例えばFNRのような転写調節因子である。いくつかの実施形態では、ペイロードがプロモーターまたはリプレッサーなどの調節要素を含む。いくつかの実施形態では、ペイロード発現がFNRSなどの誘導性プロモーターから駆動される。いくつかの実施形態では、ペイロード発現が構成的プロモーターから駆動される。いくつかの実施形態では、ペイロードが死滅スイッチのようなリプレッサー要素を含む。代わりの実施形態ではペイロードが生合成経路または生化学的経路によって産生され、ここで、生合成経路または生化学的経路は必要に応じて、微生物に対して内因性であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された微生物は2つ以上のペイロードを含む。
本発明は、とりわけ、その遺伝子操作された細菌,医薬組成物、ならびに高フェニルアラニン血症に関連する障害を調節および治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が非天然フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子を含み、哺乳動物中でフェニルアラニンをプロセシングおよび還元することができる。いくつかの実施形態では、本操作された細菌がフェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌がLAADをコードする遺伝子を含んでいてもよい。操作された細菌はまた、バイオセイフティーおよび/または生物学的封じ込めに関連する1つ以上の遺伝子配列(例えば、キルスイッチ、遺伝子ガードシステム、および/または栄養要求性)を含み得る。これらの遺伝子配列の発現は種々のプロモーター系(例えば、本明細書中に開示されるプロモーター系のいずれか)を使用して調節され得、このプロモーターは、1つ以上の異なる遺伝子を調節するための同じプロモーターであり得るか、異なる遺伝子を調節するための同じプロモーターの異なる複製であり得るか、または異なる遺伝子の発現を調節するために組み合わせて使用される異なるプロモーターの使用を含み得る。遺伝子発現を制御するための異なる調節系またはプロモーター系の使用は柔軟性(例えば、異なる環境条件下で遺伝子発現を差次的に制御する能力、および/または遺伝子発現を時間的に差次的に制御する能力)を提供し、また、遺伝子発現を「微調整」する能力を提供し、そのいずれかまたは全ては、遺伝子発現および/または細菌の成長を最適化するのに役立ち得る。これらの細菌を含む遺伝子操作された細菌および医薬組成物はPKUを含む高フェニルアラニン血症に関連する条件を治療および/または予防するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用することができる。特定の態様では、遺伝子操作された細菌を含む組成物が高フェニルアラニン血症に関連する障害を治療および/または予防するために、本発明の方法において使用され得る。
エフェクター分子はまた、抗癌分子を含む。「抗癌分子」は遺伝子操作された微生物(例えば、操作された細菌または操作された腫瘍溶解ウィルス)によって産生される1つ以上の目的の治療方法物質または薬物をいい、これらは、細胞増殖または増殖を減少および/または阻害し得る。いくつかの実施形態では、抗癌分子が癌を調節または治療するのに有効な治療分子である。いくつかの実施形態では、抗癌分子が遺伝子によってコードされる治療分子である。代わりの実施形態では抗癌分子が生化学的または生合成経路によって産生される治療分子であり、ここで、生合成経路または生化学的経路は必要に応じて、微生物に対して内因性であり得る。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された微生物が2つ以上の抗癌分子を産生し得る。抗癌分子の非限定的な例には、免疫チェックポイント阻害剤(例えば、CTLA−4抗体、PDL−1抗体)、細胞傷害剤(例えば、Cly A、FASL、TRAIL、TNF?α)、免疫刺激性サイトカインおよび共刺激性分子(例えば、OX40、CD28、ICOS、IL−2、IL−18、IL−15、IL−12、IFN−γ、IL−21、TNF、GM−CSF)、抗原および抗体(例えば、腫瘍抗原、CtxB?PSA融合タンパク質、CPV−OmpA融合タンパク質、NY−ESO−1腫瘍抗原、RAF1に対する抗体、抗VEGF、抗CXR4/CXCL12、抗GLP1、抗ガレクチン1、抗ガレクチン3)が含まれる。抗Tie2、抗CD47、免疫チェックポイントに対する抗体、免疫抑制性サイトカインおよびケモカインに対する抗体、DNA転移ベクトル 例えば、エンドスタチン、トロンボスポンジン−1、TRAIL、SMAC、Stat3、Bcl2、FLT3L、GM−CSF、IL−12、AFP、VEGFR2、および酵素(例えば、大腸菌CD、HSV−TK)。いくつかの実施形態では、抗癌分子がRNA干渉、マイクロRNA応答または抑制、TLR応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合(アプタマーまたはデコイオリゴ)、CRISPR干渉などの遺伝子編集を媒介する核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、細菌またはウイルスが例えば、バクトフェクションによって、哺乳動物細胞にDNAを移入するためのベクトルとして使用され得る(Bernardesら、2013)。
エフェクター分子の非限定的な例には、「抗炎症性分子」および/または「消化管バリア機能向上剤分子」が含まれる。抗炎症性分子および/または消化管バリア機能向上剤分子としては短鎖脂肪酸、酪酸、プロピオン酸、酢酸、IL−2、IL−22、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、GLP−2および類似体、GLP−1、IL−10、IL−27、TGF−β1、TGF−β2、N−アシルホスファチジルエタノールアミン(NAPE)、エラフィン(ペプチダーゼインヒビター3およびSKALPとも呼ばれる)、トレフォイル因子、メラトニン、トリプトファン、PGD 2、およびキヌレン酸、インドール代謝産物、ならびに本明細書中に開示される他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。このような分子には、炎症促進性分子を阻害する化合物、例えば、一本鎖可変抗体(scFv)、アンチセンスRNA、siRNA、またはTNF−α、IFN−γ、IL−1β、IL−6、IL−8、IL−17、および/またはケモカイン(例:CXCL−8およびCCL2)が含まれる。このような分子はまた、本明細書中に記載されるように、AHRアゴニスト(例えば、IL−22製造(例えば、インドール酢酸、インドール−3−アルデヒド、およびインドール)を生じる)およびPXRアゴニスト(例えば、IPA)を含む。そのような分子には、HDAC阻害剤(例えば、ブチレート)、GPR41および/またはGPR43の活性化因子(例えば、ブチレートおよび/またはプロピオン酸、または/または酢酸)、GPR109Aの活性化因子(例えば、ブチレート)、NF−kappaBシグナル阻害剤(例えば、ブチレート)、PPARガンマの調節因子(例えば、ブチレート)、AMPKシグナルの活性化因子(例えば、酢酸)、GLP−1秘密の調節因子も含まれる。このような分子はまた、ヒドロキシルラジカル捕捉剤および酸化防止剤(例えば、IPA)を含む。分子には、主に消炎鎮痛剤、例えばIL−10、または主に消化管バリア機能増強剤、例えばGLP−2がある。分子は、抗炎症および消化管バリア機能増強の両方であり得る。抗炎症および/または消化管バリア機能向上剤分子は単一の遺伝子によってコードされてもよく、例えば、エラフィンはPI3遺伝子によってコードされる。あるいは、抗炎症および/または消化管バリア機能向上剤分子が多数の遺伝子、例えば酪酸塩を必要とする生合成経路によって合成されてもよい。
エフェクター分子には、代謝性エフェクター分子も含まれる。「代謝エフェクター分子」および/または「満腹エフェクター分子」にはn−アシルホチジルエタノールアミン(NAPE)、n−アシルエタノールアミン(NAE)、グレリン受容体アンタゴニスト、ペプチドYY3−36、コレシストキニン(CCK)ファミリー分子、CCK33、CCK8、ボンベシンファミリー分子、ガストリン放出ペプチド(GRP)、ニューロメジンB(P)、グルカゴン、GLP−1、GLP−2、アポリポタンパク質A−IV、アミリン、ソマトスタチン、オキシントモジュリン、膵臓ペプチド、短鎖脂肪酸、酪酸、酢酸、セロトニン受容体アゴニストが含まれるが、これらに限定されない。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、ニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)、ヌクレオチドリボシド(NR)、ニコチンアミド、およびニコチン酸(NA)。このような分子はまた、代謝疾患を促進する分子を阻害する化合物(例えば、一本鎖可変抗体(scFv)、アンチセンスRNA、siRNA、またはジペプチジルペプチダーゼ−4(DPP4)もしくはグレリン受容体を阻害するshRNA)を含み得る。代謝および/または満腹エフェクター分子は単一の遺伝子によってコードされ得、例えば、グルカゴン様ペプチド1は、GLP−1遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、トリプトファンの製造または異化のための1つ以上の回路および/またはその代謝産物の1つを含む遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌物が1つ以上の代謝エフェクター分子および/または満腹エフェクター分子の発現のための遺伝子配列をさらに含む。
エフェクター分子の他の非限定的な例は係属中の同時所有国際特許出願PCT/US2016/34200(出願05/25)、PCT/US2017/013072(出願01/2017)、PCT/US2017/016603(出願02/04/2016)、PCT/US2017/017563(出願02/10/2017)、PCT/US2016/044922(出願07/29/016)、PCT/US2016/049781(出願08/31/2016)、PCT/US2016/37098(出願06/10/16)、PCT/US2016/069052(出願12/28/2016)、PCT/US2016/32562(出願05/13)に記載されている。PCT/US2016/062369(2016年11月16日出願)およびPCT/US2017/013072(これらの含有量は参照により本明細書に組み込まれる)。
特定の実施形態では、新たなまたは改善されたエフェクター(例えば、PME)は、当該分野において公知または本明細書に記載される方法に従って同定され得、遺伝子操作された細菌によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる酵素は、ウイルス、原核生物または真核生物から単離された野生型酵素である。いくつかの実施形態では、酵素配列は、安定性または触媒活性などの酵素の1つまたは複数の特異的性質を増加させるようにさらに改変または突然変異されている。
「フェニルアラニン代謝産物」とは、フェニルアラニンの分解の結果として生成される代謝産物を指す。代謝産物は、基質としてフェニルアラニンを使用して酵素によってフェニルアラニンから直接的に、またはフェニルアラニン代謝産物基質に対して作用する、代謝経路の下流の異なる酵素によって間接的に生成されてもよい。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、PMEをコードする遺伝子操作された細菌によって産生される。
いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、PAH活性から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたPAHから直接的または間接的に生じる。いくつかの実施形態では、代謝産物はチロシンである。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、不完全なPAH活性に起因してPKU患者の血液または尿中に蓄積する。このようなPKU代謝産物の非限定的な例は、フェニルピルビン酸およびフェニル−乳酸である。他の例には、フェニルアセテート、フェニルエチルアミン、およびフェニルアセチルグルタミンが含まれる。
いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、PAL作用から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたPALから直接的または間接的に生じる。このようなPAL代謝産物の非限定的な例は、trans−ケイ皮酸および馬尿酸である。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、LAAD作用から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたLAADから直接的または間接的に生じる。このようなLAAD代謝産物の例は、フェニルピルベートおよびフェニル乳酸である。
「フェニルアラニントランスポーター」は、フェニルアラニンを細菌細胞に輸送することができる膜輸送タンパク質を指すために使用される(例えば、Piら、1991年を参照のこと)。大腸菌(Escherichia coli)において、pheP遺伝子は、フェニルアラニン輸送を担う高親和性フェニルアラニン特異的パーミアーゼをコードする(Piら、1998年)。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、限定されないが、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、および大腸菌を含む、細菌種に由来するpheP遺伝子によってコードされる。他のフェニルアラニントランスポーターには、aroP遺伝子によってコードされ、高親和性でフェニルアラニンを含む3つの芳香族アミノ酸を輸送し、PhePと一緒に、フェニルアラニン取り込みの最大の部分を担うアーゲネラル(Aageneral)アミノ酸パーミアーゼが含まれる。さらに、低レベルのフェニルアラニン輸送活性は、LIV−I/LS系の活性まで追跡され、そのLIV−I/LS系は、2つの周辺質結合タンパク質である、LIV結合タンパク質(LIV−I系)およびLS結合タンパク質(LS系)、ならびに膜成分であるLivHMGFからなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターである。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、細菌種に由来するaroP遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、LIV結合タンパク質およびLS結合タンパク質ならびに細菌種に由来するLivHMGF遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、pheP、aroP、およびLIV−I/LS系から選択される1種より多いフェニルアラニントランスポーターを含む。
「フェニルアラニン」および「Phe」は、式C6H5CH2CH(NH2)COOHを有するアミノ酸を指すために使用される。フェニルアラニンは、チロシン、ドーパミン、ノルエピネフリン、およびエピネフリンの前駆体である。L−フェニルアラニンは必須アミノ酸であり、食品タンパク質中に主に見出されるフェニルアラニンの形態である。立体異性体D−フェニルアラニンは食品タンパク質中により少ない量で見出され、DL−フェニルアラニンは両方の形態の組合せである。フェニルアラニンは、L−フェニルアラニン、D−フェニルアラニン、およびDL−フェニルアラニンのうちの1つまたは複数を指すことができる。
本明細書で使用される「トランスポーター」という用語は、アミノ酸、ペプチド(ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチドなど)、毒素、代謝産物、基質、および他の生体分子などの分子を細胞外環境から微生物内へインポートする(import)ためのメカニズム(例えば、タンパク質、タンパク質、またはタンパク質複合体)を指すことを意味する。
「作動可能に連結している」とは、核酸配列、例えばcisで作用する核酸配列の発現を可能にするように調節領域配列に結合している、例えばPALをコードする遺伝子を指す。調節領域は、目的の遺伝子の転写を誘導することができ、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、5’および3’非翻訳領域、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、およびイントロンを含んでもよい核酸である。
「誘導可能なプロモーター」とは、1つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結している調節領域を指し、遺伝子の発現は前記調節領域の誘導因子の存在下で増加する。
「直接的に誘導可能なプロモーター」とは、エフェクター分子(例えば、PALなどのフェニルアラニン代謝酵素)をコードする遺伝子に作動可能に連結している調節領域を指し、前記調節領域の誘導因子の存在下で、前記エフェクター分子が発現される。「間接的に誘導可能なプロモーター」とは、2つ以上の調節領域、例えば、第1の分子、例えば、エフェクター分子をコードする遺伝子に作動可能に連結している第2の調節領域を調節できる、転写調節因子をコードする遺伝子に作動可能に連結している第1の調節領域を含む調節系を指す。第1の調節領域の誘導因子の存在下で、第2の調節領域は活性化または抑制され得、それによってエフェクター分子の発現を活性化または抑制する。直接的に誘導可能なプロモーターおよび間接的に誘導可能なプロモーターの両方は、「誘導可能なプロモーター」に包含される。
「外因性環境条件」または「環境条件」とは、本明細書に記載のプロモーターが直接的または間接的に誘導される設定または状況を指す。前記語句は、操作された微生物に対して外部であるが、宿主対象環境に対して内因性または天然である環境条件を指すことを意味する。したがって、「外因性」および「内因性」は、環境条件が哺乳動物の身体に対して内因性であるが、無傷微生物細胞に対して外部または外因性である環境条件を指すために交換可能に使用され得る。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の上部消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の下部消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の小腸に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素、微好気的、または嫌気的条件である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件とは、健康または疾患状態における哺乳動物の消化管に特異的である分子または代謝産物、例えばプロピオネートの存在を指す。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、腫瘍微小環境に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、腫瘍微小環境に特異的である分子または代謝産物である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、組織特異的または疾患特異的代謝産物または分子である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は低pH環境である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物はpH依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの態様では、細菌は酸素レベルを検知できる進化した転写因子を有する。異なるシグナル伝達経路が異なる酸素レベルによって誘発され得、異なる動態を伴って発生する。
本明細書中で使用される場合、「外因性環境条件」または「環境条件」はまた、操作された微生物の外部の設定または状況または環境条件のことを指し、微生物のin vitro培養条件に関連する。「外因性環境条件」はまた、生物の成長、生産、および製造中の条件を指す場合がある。そのような条件には、好気性培養条件、嫌気性培養条件、低酸素培養条件および設定酸素濃度下における他の条件も含まれる。そのような条件にはまた、培養液中のテトラサイクリン、アラビノース、IPTG、ラムノースなどの化学的および/または栄養性誘導物質の存在も含まれる。そのような条件にはまた、in vivo投与の前に微生物が増殖される温度も含まれる。例えば、特定のプロモーター系を使用すると、ある温度はペイロードの発現を許容するが、他の温度は許容しない。酸素レベル、温度および培地組成は、そのような外因性環境条件に影響を与える。そのような条件は、増殖速度、ペイロード(例えば、PALまたはLAADなどのPME)の誘導速度、トランスポーター(例えば、PheP)の誘導速度、ならびに菌株生産中の当該株の全体的な生存能力および代謝活性に影響を与える。
「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」とは、1つまたは複数の酸素レベル感受性転写因子が結合できる核酸配列を指し、対応する転写因子の結合および/または活性化は下流の遺伝子発現を活性化する。
酸素レベル依存性転写因子の例には、限定されないが、FNR、ANR、およびDNRが含まれる。対応するFNR応答性プロモーター、ANR応答性プロモーター、およびDNR応答性プロモーターは当該分野において公知である(例えば、Castiglioneら、2009年;Eiglmeierら、1989年;Galimandら、1991年;Hasegawaら、1998年;Hoerenら、1993年;Salmonら、2003年を参照のこと)。非限定的な例は表1に示される。
非限定的な例において、プロモーター(PfnrS)は、環境酸素が低いかまたは全くない条件下で高度に発現することが知られている、大腸菌Nissleフマレートおよび硝酸レダクターゼ遺伝子S(fnrS)に由来した(DurandおよびStorz、2010年;Boysenら、2010年)。PfnrSプロモーターは、Nissleにおいて天然に見出される包括的転写調節因子FNRによって嫌気的および/または低酸素条件下で活性化される。嫌気的および/または低酸素条件下で、FNRは二量体を形成し、その制御下で特異的遺伝子のプロモーターにおける特異的配列に結合し、それによってそれらの発現を活性化する。しかしながら、好気的条件下で、酸素はFNR二量体における鉄−硫黄クラスターと反応し、それらを不活性型に変換する。このように、PfnrS誘導性プロモーターはタンパク質またはRNAの発現をモジュレートするために採用される。PfnrSは、本出願において、FNRS、fnrS、FNR、P−FNRSプロモーターおよびプロモーターPfnrSを示す他のそのような関連した指定として交換可能に使用される。
[表1]転写因子ならびに応答遺伝子および調節領域の例
本明細書中で使用される場合、「調節可能な調節領域」は転写因子の直接的または間接的な制御下にあり、そして誘導物質のレベルに対して遺伝子発現を活性化し、抑制し、抑制解除し、またはそわなければ制御することができる核酸配列をいう。いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域はプロモーター配列を含む。誘導物質はRNS、または本明細書で説明される他の誘導物質とすることができ、調節可能な調節領域は、RNS−応答性調節領域、または本明細書で説明される他の応答性調節領域とすることができる。調節可能な調節領域は1つ以上のペイロードの製造のための遺伝子配列または遺伝子カセット(例えば、ブチロゲンまたは他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列)に作動可能に連結され得る。例えば、1つの具体的な実施形態において、調節可能な調節領域はRNS−抑制解除調節領域であり、RNSが存在する場合、RNS感知転写因子は、もはや調節領域に結合および/または抑制せず、それによって、作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットの発現を可能にする。この場合、調節可能な調節領域は、RNS量と比較して、遺伝子または遺伝子カセッテの発現を抑制解除する。各々の遺伝子または遺伝子カセットは、少なくとも1つのRNSを感知し得る転写因子によって直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域に作動可能に連結され得る。
いくつかの実施形態では、外因性環境条件は反応性酸素種の有無である。他の実施形態では、外因性環境条件が反応性窒素種(RNS)の有無である。いくつかの実施形態では,外因性環境条件は炎症反応に関与する生物学的分子、例えば、消化管の炎症障害に存在する分子である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件または信号が組み換え細菌細胞が存在する周囲に自然に存在するか、または自然に存在しない。いくつかの実施形態では、外因性環境条件または信号が例えば、生物学的状態の産生または除去および/または生物学的分子の投与または除去によって、人工的に産生される。
いくつかの実施形態では、外因性環境条件および/またはシグナルが誘導性プロモーターの活性を刺激する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件および/またはシグナルが哺乳動物の消化管内に自然には存在しない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターが本発明の医薬組成物と組合せて投与される分子または代謝産物、例えば、テトラサイクリン、アラビノース、または誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ任意の生物学的分子によって刺激される。いくつかの実施形態でに、外因性環境条件および/または信号を、本発明の組み換え細菌細胞を含む培養培地に添加する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件が哺乳動物の消化管内に天然に存在する(例えば、低酸素もしくは嫌気性条件、または炎症反応に関与する生物学的分子)。いくつかの実施形態では、外因性環境条件(例えば、in vivo)への曝露の喪失はプロモーター(例えば、消化管の外部の好気性環境)を誘導するための外因性環境条件が存在しないので、誘導性プロモーターの活性を阻害する。本明細書において使用される場合、「非天然」核酸配列とは、通常、細菌に存在しない核酸配列、例えば内因性配列の追加のコピー、または細菌の異なる種、株、もしくは亜株由来の配列などの異種配列、または同じ亜型の細菌由来の非改変配列と比較して改変および/もしくは突然変異されている配列を指す。いくつかの実施形態では、非天然核酸配列は合成の天然に存在しない配列である(例えば、Purcellら、2013年を参照のこと)。非天然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットにおける1つもしくは複数の遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態では、「非天然」とは、天然において互いに同じ関係で見出されない2つ以上の核酸配列を指す。非天然核酸配列はプラスミドまたは染色体上に存在し得る。さらに、任意の調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットの複数のコピーが細菌に存在してもよく、調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットの1つまたは複数のコピーは、突然変異されてもよいか、または別様で本明細書に記載されるように変化されてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、コピー数を高めるために、または複数の異なる機能を実行する遺伝子カセットの複数の異なる成分を含むように同じ調節領域、プロモーター、遺伝子、および/または遺伝子カセットの複数のコピーを含むように操作される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はエフェクター分子(例えば、PME)をコードする遺伝子を含み、当該遺伝子は天然では当該遺伝子に関連していない直接的または間接的に誘導可能なプロモーター、例えばエフェクター分子をコードする遺伝子に作動可能に連結しているFNRプロモーター、または第2のエフェクター分子に作動可能に連結しているParaBADプロモーター、に作動可能に連結している。
「構成的プロモーター」とは、その制御下および/またはそれが作動可能に連結しているコード配列または遺伝子の連続的な転写を促進することができるプロモーターを指す。構成的プロモーターおよびバリアントは当該分野において周知であり、限定されないが、BBa_J23100、構成的大腸菌σSプロモーター(例えば、osmYプロモーター(国際遺伝子操作機構(International Genetically Engineered Machine)(iGEM)標準生物学的パーツ登録所(Registry of Standard Biological Parts)名称BBa_J45992;BBa_J45993))、構成的大腸菌σ32プロモーター(例えば、htpGヒートショックプロモーター(BBa_J45504))、構成的大腸菌σ70プロモーター(例えば、lacqプロモーター(BBa_J54200;BBa_J56015)、大腸菌CreABCDリン酸検知オペロンプロモーター(BBa_J64951)、GlnRSプロモーター(BBa_K088007)、lacZプロモーター(BBa_K119000;BBa_K119001);M13K07遺伝子Iプロモーター(BBa_M13101);M13K07遺伝子IIプロモーター(BBa_M13102)、M13K07遺伝子IIIプロモーター(BBa_M13103)、M13K07遺伝子IVプロモーター(BBa_M13104)、M13K07遺伝子Vプロモーター(BBa_M13105)、M13K07遺伝子VIプロモーター(BBa_M13106)、M13K07遺伝子VIIIプロモーター(BBa_M13108)、M13110(BBa_M13110))、構成的バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)σAプロモーター(例えば、プロモーターveg(BBa_K143013)、プロモーター43(BBa_K143013)、PliaG(BBa_K823000)、PlepA(BBa_K823002)、Pveg(BBa_K823003))、構成的バチルス・サブティリスσBプロモーター(例えば、プロモーターctc(BBa_K143010)、プロモーターgsiB(BBa_K143011))、サルモネラ(Salmonella)プロモーター(例えば、サルモネラ由来のPspv2(BBa_K112706)、サルモネラ由来のPspv(BBa_K112707))、バクテリオファージT7プロモーター(例えば、T7プロモーター(BBa_I712074;BBa_I719005;BBa_J34814;BBa_J64997;BBa_K113010;BBa_K113011;BBa_K113012;BBa_R0085;BBa_R0180;BBa_R0181;BBa_R0182;BBa_R0183;BBa_Z0251;BBa_Z0252;BBa_Z0253))、バクテリオファージSP6プロモーター(例えば、SP6プロモーター(BBa_J64998))、およびそれらの機能的断片が含まれる。
「消化管」とは、食物の移動および消化、栄養素の吸収、ならびに老廃物の排出を担う器官、腺、管、および系を指す。ヒトにおいて、消化管は、口から始まり肛門で終わり、食道、胃、小腸、および大腸をさらに含む、胃腸(GI)管を含む。消化管はまた、脾臓、肝臓、胆嚢、および膵臓などの副器官および腺を含む。上部胃腸管は、食道、胃、および小腸の十二指腸を含む。下部胃腸管は、小腸の残りの部分、すなわち空腸および回腸、ならびに大腸の全て、すなわち盲腸、結腸、直腸、および肛門管を含む。細菌は、消化管全体にわたって、例えば胃腸管において、特に腸において見出され得る。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、消化管内で活性である(例えば、1つ以上のペイロード(例:PME)を発現する)。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、大腸において活性である(例えば、1つ以上のペイロード(例:PME)を発現する)。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、小腸において活性である(例えば、1つ以上のペイロード(例:PME)を発現する)。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、小腸および大腸において活性である。理論に縛られることは望まないが、フェニルアラニンの分解は、小腸においてアミノ酸吸収、例えばフェニルアラニン吸収が起こるので、小腸において非常に有効である。フェニルアラニンの血液への取り込みの防止または低減により、Pheレベルの上昇およびその結果生じるPheの毒性を回避することができる。さらに、腸と身体との間の広範な腸内循環は、PKUにおける全身性フェニルアラニンの除去を可能にし得る(例えば、Changらによって、PKUのラットモデルにおいて記載されている(Changら、「A new theory of enterorecirculation of amino acids and its use for depleting unwanted amino acids using oral enzyme−artificial cells, as in removing phenylalanine in phenylketonuria; Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol.1995年; 23巻(1):1−21頁))。血液由来のフェニルアラニンは小腸内に循環し(例えば、図15参照)、当該部位で活性な細菌によって除去され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は小腸を通過する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は、消化管内の滞留時間が長くなっている。いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌は小腸または大腸に定着する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は結腸に定着する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、消化管内の滞留時間が長くなっている。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は消化管に定着しない。
本明細書で使用される場合、用語「低酸素」は、大気中に存在する酸素(O2)のレベル、量、または濃度より低い酸素のレベル、量、または濃度を指すことを意味する(例えば、<21%O2; <160torrO2))。したがって、用語「低酸素条件(複数可)」または「低酸素環境」は、大気中に存在する酸素よりも低い酸素レベルを含む条件または環境を指す。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、哺乳類の消化管、例えば、内腔、胃、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、盲腸、結腸、遠位S状結腸、直腸および肛門管に見出される酸素(O2)のレベル、量、または濃度を指すこと意味する。いくつかの実施形態において、「低酸素」という用語は、0〜60mmHgのO2(0〜60torrのO2)(例えば、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、および60mmHgのO2)のレベル、量、または濃度を指すことを意味し、それらの任意およびすべての小数の増加を含む(例えば、0.2mmHg、0.5mmHgのO2、0.75mmHgのO2、1.25mmHgのO2、2.175mmHgのO2、3.45mmHgのO2、3.75mmHgのO2、4.5mmHgのO2、6.8mmHgのO2、11.35mmHgのO2、46.3mmHgのO2、58.75mmHgなどが含まれるが、これらの例示的な小数は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。)。いくつかの実施形態において、「低酸素」とは、約60mmHg以下のO2(例えば、0〜約60mmHgのO2)を指す。「低酸素」という用語はまた、0〜60mmHgの間(0mmHgと60mmHgを含めて)のO2のレベル、量、または濃度の範囲、例えば、0〜5mmHg O2、<1.5mmHg O2、6〜10mmHg、<8mmHg、47〜60mmHgなどを指すことができるが、これらの例示的範囲は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。例えば、Albenbergら、Gastroenterology、147巻(5):1055−1063頁(2014年);Bergofskyら、J Clin. Invest.、41巻(11):1971−1980頁(1962年);Cromptonら、J Exp. Biol.、43巻:473−478頁(1965年);Heら、PNAS(USA)、96巻:4586−4591頁(1999年);McKeown、Br. J. Radiol.、87巻:20130676(2014年)(doi:10.1259/brj.20130676)を参照されたい。前記の各文献では、様々な種の哺乳動物の消化管内に見出される酸素レベルが議論されており、これらの文献はそれぞれ全体とし本明細書に取り込まれる。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、哺乳動物の消化管以外の器官または組織、例えば尿生殖路、腫瘍組織などに見出される酸素(O2)のレベル、量または濃度を意味し、当該器官または組織では、酸素は低下したレベル、例えば、低酸素(hypoxic)または無酸素(anoxic)レベルで存在する。いくつかの実施形態では、「低酸素」とは、部分的に好気性、半好気性(semi aerobic)、微好気性(microaerobic)、超好気性(nanoaerobic)、微酸素性(microoxic)、低酸素性(hypoxic)、無酸素性(anoxic)および/または嫌気性条件に存在する酸素(O2)のレベル、量または濃度を意味する。例えば、表Aは、様々な器官および組織に存在する酸素量をまとめたものである。いくつかの実施形態では、酸素(O2)のレベル、量、または濃度は、液体中に存在する遊離の非化合物の酸素(O2)のレベルを指す溶存酸素(「DO」)の量として表され、典型的には、ミリグラムパーリッター(mg/L)、百万分率(ppm; 1mg/L=1ppm)またはマイクロモル(umole)(1μmol O2=0.022391mg/L O2)で報告されている。Fondriest Environmental、Inc.、 “Dissolved Oxygen”、環境測定の基礎、2013年11月19日、www.fondriest.com/environmental−measurements/parameters/water−quality/dissolved−oxygen/>。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、約6.0mg/L DO以下の酸素(O2)のレベル、量、または濃度を指すことを意味し、例えば6.0mg/L、5.0mg/L、4.0mg/L、3.0mg/L、2.0mg/L、1.0mg/L、または0mg/L、ならびにそれらの小数、例えば、3.25mg/L、2.5mg/L、1.75mg/L、1.5mg/L、1.25mg/L、0.9mg/L、0.8mg/L、0.7mg/L、0.6mg/L、0.5mg/L、0.4mg/L、0.3mg/L、0.2mg/Lおよび0.1mg/L DOである。これらの例示的な小数は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。液体または溶液中の酸素レベルは、空気飽和のパーセンテージまたは酸素飽和のパーセンテージとして報告され得る(溶液中の溶存酸素(O2)濃度と、安定な平衡下で一定の温度、圧力、および塩濃度の溶液についての最大溶存酸素量との比)。酸素の産生物または消費物を含まず、十分に酸素を供給された溶液(例えば、混合および/または撹拌された溶液)は、100%空気飽和である。いくつかの実施形態において、「低酸素」という用語は、40%以下の空気飽和、例えば、40%、39%、38%、37%、36%、35%、34%、33%、32%、31%、30%、29%、28%、27%、26%、25%、24%、23%、22%、21%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、および0%空気飽和を指すことを意味し、それらの任意およびすべての小数の増加(例えば、30.25%、22.70%、15.5%、7.7%、5.0%、2.8%、2.0%、1.65%、1.0%、0.9%、0.8%、0.75%、0.68% 0.5%、0.44%、0.3%、0.25%、0.2%、0.1%、0.08%、0.075%、0.058%、0.04%、0.032%、0.025%、0.01%など)ならびに0〜40%の間(0%と40%を含めて)の酸素飽和レベルの任意の範囲(例えば、0〜5%、0.05〜0.1%、0.1〜0.2%、0.1〜0.5%、0.5〜2.0%、0〜10%、5〜10%、10〜15%、15〜20%、20〜25%、25〜30%など)が含まれる。ここに列挙した例示的な小数および範囲は、説明のためのものであり、決して限定されることを意味するものではない。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、9%以下の酸素飽和、例えば、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0%のO2飽和を指すことを意味し、それらの任意およびすべての小数の増加(例えば、6.5%、5.0%、2.2%、1.7%、1.4%、0.9%、0.8%、0.75%、0.68%、0.5%、0.44%、0.3%、0.25%、0.2%、0.1%、0.08%、0.075%、0.058%、0.04%、0.032%、0.025%、0.01%など)ならびに0〜9%の間(0%と9%を含めて)の酸素飽和レベルの任意の範囲(例えば、0〜5%、0.05〜0.1%、0.1〜0.2%、0.1〜0.5%、0.5〜2.0%、0〜8%、5〜7%、0.3〜4.2%のO2など)が含まれる。ここに列挙した例示的な少数および範囲は、説明のためのものであり、決して限定的であることを意味するものではない。
いくつかの実施形態では本明細書中に記載されるプロモーターが培養容器(例えば、フラスコまたは発酵槽または他の適切な培養容器)中の状態によって直接的または間接的に誘導され、ここで、株はin vivo投与の前に増殖または維持される。in vivo投与の前に株の培養の間に提供されるこのような条件の非限定的な例としては、低酸素、嫌気性、微好気性、または好気性条件、他の定義された酸素レベル(例えば、以下に例示されるもの)、アラビノースの存在、IPTG、ラムノースの存在、または本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知の他の化学的および/または栄養性誘導物質が挙げられる。いくつかの実施形態では、培養容器内の条件が一定の酸素量、例えば、1%〜10%の酸素、10%〜20%の酸素、20%〜30%の酸素、30%〜40%の酸素、40%〜50%の酸素、60%〜70%の酸素、70%〜80%の酸素、80%〜90%の酸素、90%〜100%の酸素、および本明細書に記載されるような他の酸素量に設定され、この時点で、プロモーターが直接的または間接的に誘導される。
本明細書において使用される場合、「遺伝子」または「遺伝子配列」という用語は、遺伝子配列、例えば核酸配列を指すことを意味する。遺伝子、遺伝子配列または遺伝学的配列(genetic sequence)は、完全な遺伝子配列または部分的な遺伝子配列を含むことを意味する。遺伝子、遺伝子配列または遺伝学的配列は、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むことを意味し、また、タンパク質またはポリペプチドをコードしない遺伝学的配列、例えば、調節配列、リーダー配列、シグナル配列、または他の非タンパク質コード配列を含むことを意味する。
「微生物」とは、典型的に単細胞からなる微視的、超微視的、または超顕微鏡的なサイズの生物または微生物を指す。微生物の例には、細菌、酵母、ウイルス、寄生虫、真菌、特定の藻類、および原生動物が含まれる。いくつかの態様では、微生物は、目的の1つまたは複数の治療分子またはタンパク質を産生するように操作される(「操作された微生物」)。特定の態様では、微生物は、その環境、例えば消化管から特定の代謝産物または他の化合物を吸収し、異化するように操作される。特定の態様では、微生物は、特定の有益な代謝産物または他の化合物(合成または天然に存在する)を合成し、それらをその環境中へ放出するように操作される。特定の実施形態では、操作された微生物は操作された細菌である。特定の実施形態では、操作された微生物は操作されたウイルスである。
「非病原性細菌」とは、宿主において疾患または有害な反応を引き起こすことができない細菌を指す。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、消化管の常在微生物叢に存在する共生細菌である。非病原性細菌の例には、限定されないが、バチルス属(Bacillus)、バクテイロデス属(Bacteroides)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、ブレビ細菌属(Brevibacteria)、クロストリジウム属(Clostridium)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、エシェリキア属(Escherichia)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、およびスタフィロコッカス属(Staphylococcus)、例えば、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・サブティリス、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バクテロイデス・サブティリス(Bacteroides subtilis)、バクテロイデス・テタイオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron)、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・ラクティス(Bifidobacterium lactis)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、大腸菌(Escherichia coli)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ブルガリカス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・ジョンソニ(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス・パラカセイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ラクティス(Lactococcus lactis)、およびサッカロミセス・ブラウディ(Saccharomyces boulardii)が含まれる(Sonnenbornら、2009年;Dinleyiciら、2014年;米国特許第6,835,376号;米国特許第6,203,797号;米国特許第5,589,168号;米国特許第7,731,976号)。天然の病原性細菌は、病原性を低減または取り除くように遺伝子操作されてもよい。
「プロバイオティクス」は、適量の微生物を含有する宿主生物に対して健康の利点を与えることができる、生きている非病原性の微生物、例えば細菌を指すために使用される。いくつかの実施形態では、宿主生物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物はヒトである。非病原性細菌のいくつかの種、株、および/または亜型は、現在、プロバイオティクスとして認識されている。プロバイオティクス細菌の例には、限定されないが、ビフィド細菌属(Bifidobacteria)、エシェリキア属、ラクトバチルス属、およびサッカロミセス属、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、大腸菌株Nissle、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・プランタルム、およびサッカロミセス・ブラウディが含まれる(Dinleyiciら、2014年;米国特許第5,589,168号;米国特許第6,203,797号;米国特許第6,835,376号)。プロバイオティクスは細菌のバリアントまたは突然変異株であってもよい(Arthurら、2012年;Cuevas−Ramosら、2010年;Olierら、2012年;Nougayredeら、2006年)。非病原性細菌は、所望の生物学的特性、例えば生存率を向上または改善させるように遺伝子操作されてもよい。非病原性細菌は、プロバイオティクス特性を提供するように遺伝子操作されてもよい。プロバイオティクス細菌は、プロバイオティクス特性を向上または改善させるように遺伝子操作されてもよい。
本明細書において使用される場合、「安定に維持された」または「安定な」細菌は、非天然遺伝子物質、例えばエフェクター分子をコードする遺伝子を保有する細菌宿主細胞を指すために使用され、その非天然遺伝子物質が保持され、発現され、および/または増殖されるように、それは宿主ゲノム内に組み込まれるか、または自己複製染色体外プラスミド上で増殖する。安定な細菌は、in vitro、例えば培地中、および/またはin vivo、例えば消化管内で生存および/または増殖できる。例えば、安定な細菌は、PAL遺伝子を保有するプラスミドまたは染色体が宿主細胞中で安定に維持される、エフェクター分子(例えば、PAL)をコードする遺伝子を含む遺伝子組換え細菌であってもよく、それによりエフェクターは宿主細胞中で発現され得、宿主細胞はin vitroおよび/またはin vivoで生存および/または増殖できる。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質、例えば、PAL遺伝子の発現の安定性に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質、例えば、PAL遺伝子またはPAH遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす。
本明細書において使用される場合、「モジュレートする」および「治療する」という用語ならびにそれらの同語源語は、疾患、障害、および/もしくは状態、またはそれらのうちの少なくとも1つの識別できる症状の改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」とは、必ずしも患者によって識別できるとは限らない、少なくとも1つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」とは、物理的(例えば、識別できる症状の安定化)、生理的(例えば、物理的パラメータの安定化)のいずれかまたは両方で、疾患、障害、および/または状態の進行を阻害することを指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「治療する」とは、疾患、障害、および/もしくは状態の進行を遅らせること、またはそれらの進行を反転させることを指す。疾患、障害、または状態の治療には、基礎疾患の除去を必ずしも包含することなく、関連する症状を軽減または除去することが含まれる場合がある。例えば、原発性高フェニルアラニン血症は、治療法が知られていない先天的な遺伝子変異によって引き起こされる。高フェニルアラニン血症は、他の状態、例えば肝疾患に続発することもある。高フェニルアラニン血症の治療には、過剰なフェニルアラニンおよび/または関連する症状の軽減または除去が含まれる可能性があり、必ずしも基礎疾患の除去は含まれない。本明細書において使用される場合、「予防する」およびその同語源語は、発症を遅延させること、あるいは所与の疾患、障害および/もしくは状態またはそのような疾患、障害、および/もしくは状態に関連した症状に罹るリスクを低減させることを指す。
治療を必要とするものは、特定の医学的疾患を既に有する個体、および疾患を有するリスクがあるか、または最終的に疾患に罹り得る個体を含んでもよい。治療の必要性は、例えば、疾患の発生、疾患の存在もしくは進行、または疾患を有する対象の治療に対する受容の可能性に関連する1つまたは複数のリスク因子の存在によって評価される。
本明細書において使用される場合、「医薬組成物」とは、生理学的に適切な担体および/または賦形剤などの他の成分との本発明の遺伝子操作された細菌の調製物を指す。
交換可能に使用されてもよい「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に著しい刺激を引き起こさず、投与される細菌性化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を指す。助剤はこれらの語句に含まれる。
「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性な物質を指す。例には、限定されないが、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えばポリソルベート20を含む界面活性剤が含まれる。
「治療有効用量」および「治療有効量」という用語は、症状の発症の予防、遅延、または状態の症状の改善をもたらす化合物の量を指すために使用される。治療有効量は、例えば、重症度を治療し、予防し、低減させ、発症を遅延させ、および/または疾患もしくは状態の1つもしくは複数の症状の発生のリスクを低減させるのに十分であり得る。治療有効量、および投与の治療有効頻度は、当該分野において公知であり、以下に説明される方法によって決定され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」または「抗体」は1つ以上の特定の結合特異性を有する抗体およびその断片の全てのバリエーションを包含することを意味する。したがって、用語「抗体」または「抗体」は全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体(ScFv、ラクダ科動物)、Fab、Fab’、これらの断片の多量体バージョン(例えば、F(ab’)2)、一本鎖抗体(sdAB、VHH断片)、重鎖抗体(HCAb)、ナノボディ、ダイアボディ、およびミニボディを含むことを意味する。抗体は2つ以上の結合特異性、例えば、二重特異性を有することができる。用語「抗体」はいわゆる抗体模倣物を含むことも意味する。抗体模倣物は抗原に特異的に結合することができるが、抗体関連構造を有さない、単一アミノ酸鎖分子であり得る低分子、例えば、3〜30kDaを指す。抗体模倣物にはAffibody分子(タンパク質AのZドメイン)、Affilins(ガンマ−B結晶)、Ubiquitin、Affimers(シスタチン)、Affitins(Sac7d)(硫黄酸アルダリウス種々)、Alphabodys(三重らせんコイルドコイル)、Anticalins(リポカリン)、Avimers(様々なメンブランレセプターのドメイン)、DARPins(アンキリンリピートモチーフ)、Fynomers(FynのSH3ドメイン)、Kunitzドメイン、様々なプロテアーゼインヒビターのKunitzドメイン、およびMonobodiesが含まれるが、これらに限定されない。特定の態様では、「抗体」または「抗体」という語が単鎖抗体、単一領域抗体、およびラクダ抗体を指すことを意味する。癌およびさらなる抗癌抗体の処置における抗体の有用性は例えば、その全体が参考として援用される、Scottら、Antibody治療for Cancer、Nature Reviews Cancer April 2012 Volume 12に見出され得る。
「一本鎖抗体」または「一本鎖抗体」は、典型的には免疫グロブリンの重鎖、免疫グロブリンの軽鎖、および任意選択で、ジスルフィド結合などのリンカーまたは結合を含むペプチドを指す。一本鎖抗体は、従来の抗体に見られる一定Fc領域を欠く。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体が天然に存在する一本鎖抗体、例えばラクダ抗体である。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体が合成、操作、または改変された一本鎖抗体である。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体がリンカーの付加および定常領域の除去にもかかわらず、元の免疫グロブリンと比較して実質的に同じ抗原特異性を保持することができる。いくつかの態様では一本鎖抗体は「scFv抗体」であり得、これは例えば、米国特許第4,946,778号(その含有量はその全体が参考として本明細書中に援用される)に記載されるように、任意に、10〜約25アミノ酸の短いリンカーペプチドと連結された、免疫グロブリンの重鎖(VH)および軽鎖(VL)(任意の定常領域なし)の可変領域の融合タンパク質をいう。Fv断片は抗体の結合部位を保持する最小の断片であり、その結合部位は、元の抗体の特異性をいくつかの態様では維持することができる。一本鎖抗体の製造のための技術は、米国特許第4,946,778号に記載されている。scFvのVhおよびVL配列は、VLのC末端に接続するVHのN末端を介して、またはVLのN末端に接続するVHのC末端を介して接続することができる。ScFv断片は、いずれかの末端で他のエピトープタグまたはタンパク質ドメインに区別なく融合され得る独立したフォールディングエンティティである。様々な長さのリンカーを使用して、VhおよびVL配列を連結することができ、リンカーは、グリシンリッチ(柔軟性を提供する)およびセリンまたはトレオニンリッチ(溶解性を増加させる)であり得る。短リンカーは、2つのドメインの関連を妨げ、多量体(ダイアボディ、トライボディなど)をもたらす可能性がある。長いリンカーはタンパク質分解または弱いドメイン協会を生じ得る(Voelkelら、2011に記載される)。15〜20アミノ酸または18〜20アミノ酸の長さのリンカーが最も頻繁に使用される。他の柔軟なリンカーを含むリンカーのさらなる非限定的な例はチェンら、2013(Adv薬物Deliv Rev.2013 Oct 15; 65(10): 1357−1369.Fusion)に記載されているタンパク質リンカー:特性、設計および機能性(これらの内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される)。柔軟なリンカーはまた、グリジンおよびセリンのような小さなまたは極性のアミノ酸に富むが、柔軟性を維持するためにトレオニンおよびアラニンのような追加のアミノ酸、ならびに溶解性を改善するためにリジンおよびグルタミン酸のような極性のアミノ酸を含み得る。例示的なリンカーとしては(Gly−Gly−Gly−Gly−Gly−Ser)n、KESGSSEQLAQFRSLDおよびEGKSSGSESKST、(Gly)8、ならびにGlyおよびSerリッチフレキシブルリンカー、GSAGSAAGSGEFが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「単鎖抗体」はまた、ラクダ抗体および他の重鎖抗体を含む単一ドメイン抗体、ナノボディを含む軽鎖抗体、ならびにヒト、マウスまたは他の種に由来する単一ドメインVHまたはVLドメインを含む。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。単一ドメイン抗体は、ラクダ、ラマ、またはアルパカに由来するラクダ科動物の足場を有するドメイン抗原結合単位を含む。ラクダ科動物は、軽鎖を欠く機能的抗体を産生する。重鎖可変(VH)ドメインは、自律的に折り畳まれ、抗原結合ユニットとして独立して機能する。その結合面は、古典的な抗原結合分子(Fab)または一本鎖可変断片(scFv)における6つのCDRと比較して、3つのCDRのみを含む。ラクダ類抗体は、従来の抗体のものに匹敵する結合親和性を達成することができる。カスメリド足場にベース抗体は、当該分野で周知の方法を使用して産生され得る。軟骨魚はまた、重鎖抗体(IgNAR、「免疫グロブリン新規抗原レセプター」)を有し、そこからVNAR断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。あるいは、ヒトまたはマウス由来のIgG由来の二量体可変ドメインがモノマーに分割され得る。ナノボディは、軽鎖に由来する一本鎖抗体である。「単鎖抗体」という語はまた、抗体模倣物を指す。
いくつかの実施形態では、操作された微生物によって発現される抗体は二重特異性である。特定の実施形態では二重特異性抗体分子がscFvまたはその断片を含み、第1のエピトープに対する結合特異性を有し、scFvまたはその断片は第2のエピトープに対する結合特異性を有する。抗原結合断片または抗体部分には、二価scFv(ダイアボディ)、抗体分子が2つの異なったエピトープ、単一結合ドメイン(dAb)、およびミニボディを認識する二重特異性scFv抗体が含まれる。単量体単鎖ダイアボディ(scDb)は細菌および哺乳動物細胞において容易に組み立てられ、生理学的条件下で改善された安定性を示す(Voelkelら、2001およびその中の参考文献;タンパク質Eng.(2001)14(10):815−823(単量体および二量体二重特異性単鎖ダイアボディの発現のための最適化されたリンカー配列を記載する)。
「単離された」ポリペプチドもしくは断片,バリアント、またはそれらの誘導体は、その天然環境にないポリペプチドをいう。特別な水準の純化は必要とされない。細菌細胞または哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない宿主細胞において発現される組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は任意の好適な技術によって分離され、分画され、または部分的にもしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されたと考えられる。組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は組換えDNA技術によって産生された、すなわち、細胞、微生物または哺乳動物から産生され、ポリペプチドをコードする外因性の組換えDNA発現構築物によって形質転換されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。ほとんどの細菌培養物において発現されるタンパク質またはペプチドは、典型的にはグリカンを含まない。前記のポリペプチドの断片,誘導体,類似体またはバリアント、およびそれらの任意の組合せもまた、ポリペプチドとして含まれる。用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「類似体」は元のペプチドのアミノ酸配列に十分に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、対応する元のポリペプチドの少なくとも1つ以上の特性を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片としては、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片が挙げられる。断片はまた、本明細書中に記載される任意のポリペプチドに由来する特異的抗体または生物活性断片または免疫学的に活性な断片を含む。バリアントは、天然に存在してもよく、または天然に存在しなくてもよい。天然に存在しないバリアントは、当該分野で公知の突然変異誘発法的な方法を使用して産生され得る。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド(単数)」および「ポリペプチド(複数)」を含み、アミド結合(すなわちペプチド結合)によって直線状に連結しているアミノ酸モノマーからなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、2つ以上のアミノ酸の任意の鎖(複数可)を指し、特定の長さの産生物を指すわけではない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または2つ以上のアミノ酸の鎖(複数可)を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、または交換可能に使用されてもよい。「ジペプチド」という用語は、2つの連結しているアミノ酸のペプチドを指す。「トリペプチド」という用語は、3つの連結しているアミノ酸のペプチドを指す。「ポリペプチド」という用語はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断、または天然に存在しないアミノ酸による改変を含む、ポリペプチドの発現後改変の産生物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的起源に由来してもよいか、または組換え技術によって産生されてもよい。他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の遺伝子操作された細菌またはウイルスによって産生される。本発明のポリペプチドは、約3個以上、5個以上、10個以上、20個以上、25個以上、50個以上、75個以上、100個以上、200個以上、500個以上、1000個以上、または2,000個以上のアミノ酸のサイズであってもよい。ポリペプチドは、定義された三次元構造を有してもよいが、必ずしもこのような構造を有する必要はない。定義された三次元構造を有するポリペプチドは折り畳まれたと称され、定義された三次元構造を保有しないが、多数の異なる立体配座を採用できるポリペプチドは折り畳まれていないと称される。「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、タンパク質もしくはタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を指してもよいか、または非タンパク質配列、例えば、調節ペプチド配列、リーダーペプチド配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列、および他のペプチド配列から選択される配列に対応するアミノ酸配列を指してもよい。
ポリペプチドはまた、融合タンパク質も含む。本明細書において使用される場合、「バリアント」という用語は、元のペプチドまたは元のペプチドと十分に類似する配列を含む融合タンパク質を含む。本明細書において使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、2つ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を指す。典型的に、融合タンパク質は周知のin vitro組換え技術から生じる。融合タンパク質は、その融合タンパク質の成分である個々の元のタンパク質と類似した構造機能(しかし必ずしも同じ程度である必要はない)、および/または類似した調節機能(しかし必ずしも同じ程度である必要はない)、および/または類似した生化学機能(しかし必ずしも同じ程度である必要はない)および/または免疫学的活性(しかし必ずしも同じ程度である必要はない)を有してもよい。「誘導体」は、限定されないが、20個の標準的なアミノ酸の1つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドを含む。2つのペプチド間の「類似性」は、1つのペプチドのアミノ酸配列を第2のペプチドの配列と比較することによって決定される。1つのペプチドのアミノ酸は、それが同一または保存的アミノ酸置換である場合、第2のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。保存的置換には、Dayhoff,M.O.、ed.、The Atlas of Protein Sequence and Structure 5、National Biomedical Research Foundation、Washington,D.C.(1978年)、およびArgos、EMBO J.8(1989年)、779〜785頁に記載されているものが含まれる。例えば、以下の群の1つに属するアミノ酸は保存的変化または置換を表す:−Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr;−Cys、Ser、Tyr、Thr;−Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;−Lys、Arg、His;−Phe、Tyr、Trp、His;および−Asp、Glu。
本明細書において使用される場合、「十分に類似する」という用語は、第1および第2のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび/または共通の機能的活性を有するように、第2のアミノ酸配列と比較して十分または最低限の数の同一または等価のアミノ酸残基を含有する第1のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または少なくとも約100%同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、十分に類似していると本明細書において定義される。好ましくは、バリアントは本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似している。このようなバリアントは、一般に、本発明のペプチドの機能的活性を保持する。バリアントは、1つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、および/または置換によって、天然および野生型ペプチドとアミノ酸配列がそれぞれ異なるペプチドを含む。それらは天然に存在するバリアントおよび人工的に設計されたバリアントであってもよい。
本明細書において使用される場合、「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリンカー」または「リンカー」という用語は、2つのポリペプチド配列を接続または連結する、例えば2つのポリペプチドドメインを連結する合成または非天然もしくは天然に存在しないアミノ酸配列を指す。本明細書において使用される場合、「合成」という用語は、天然に存在しないアミノ酸配列を指す。例示的なリンカーが本明細書に記載される。さらなる例示的なリンカーは米国特許出願公開第20140079701号に提供されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、「コドン最適化配列」という用語は、既存のコード配列から改変された、あるいは例えば、コード配列から転写された転写RNA分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するように、またはコード配列の転写を改善するように設計された配列を指す。コドンの最適化には、限定されないが、発現宿主生物のコドンの選好性に適合するように、コード配列についてのコドンを選択することを含むプロセスが含まれる。「コドン最適化された」という用語は、核酸分子によってコードされるポリペプチドを改変することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映するために、当該核酸分子の遺伝子またはコード領域においてコドンを改変することを指す。このような最適化には、少なくとも1つ、または2つ以上、または相当な数のコドンを、宿主生物の遺伝子においてより頻繁に使用されている1つ以上のコドンで置換することが含まれる。「コドン最適化配列」とは、既存のコード配列から改変された、あるいは例えば、コード配列から転写された転写RNA分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するように、またはコード配列の転写を改善するように設計された配列を指す。いくつかの実施形態において、転写および/または翻訳の改善は、転写および/または翻訳のレベルを増加させることを含む。いくつかの実施形態では、転写および/または翻訳の改善は、転写および/または翻訳のレベルを低下させることを含む。いくつかの実施形態では、目的の構築物からの発現レベルを微調整するために、コドン最適化が用いられる。コドンの最適化には、発現宿主生物のコドン選好性に適合するように、コード配列のコドンを選択することを含むプロセスが含まれるが、これに限定されない。多くの生物は、成長ポリペプチド鎖において特定のアミノ酸の挿入をコードするために特定のコドンを使用するためのバイアスまたは選好性を示す。コドンの選好性またはコドンバイアス、生物間でのコドン使用頻度の差異は、遺伝暗号の縮重によって許容され、多くの生物の間で文書により十分に立証されている。コドンバイアスは、多くの場合、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率と相関し、次に、そのメッセンジャーRNA(mRNA)は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーRNA(tRNA)分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたtRNAの優性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいた所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。
本明細書において使用される場合、「分泌系」または「分泌タンパク質」という用語は、目的のタンパク質または治療タンパク質を微生物、例えば細菌細胞質から分泌または排出することができる天然または非天然の分泌機構を指す。分泌系は、単一タンパク質を含んでもよいか、または複合体、例えばHlyBDにおいて構築される2つ以上のタンパク質を含んでもよい。グラム陰性細菌についての分泌系の非限定的な例には、改変されたIII型鞭毛、I型(例えば、溶血素分泌系)、II型、IV型、V型、VI型、およびVII型分泌系、耐性−結節形成−分裂(resistance−nodulation−division)(RND)多剤排出ポンプ、種々の単一膜分泌系が含まれる。グラム陽性細菌についての分泌系の非限定的な例には、SecおよびTAT分泌系が含まれる。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、目的のタンパク質または治療タンパク質を特異的分泌系へ誘導するためのRNAまたはペプチド起源のいずれかの「分泌タグ」を含む。いくつかの実施形態では、分泌系は、操作した細菌から目的のタンパク質を分泌する前にこのタグを除去することができる。例えば、V型自己分泌媒介性分泌(auto−secretion−mediated secretion)において、N末端ペプチド分泌タグは、天然のSec系によって細胞質から周辺質区画への「パッセンジャー」ペプチドの転位の際に除去される。さらに、自己分泌因子が外膜を横切って移行すると、C末端分泌タグは、自己触媒的またはプロテアーゼによって触媒されるいずれかの、例えばOmpT切断によって除去され得、それによって目的のタンパク質を細胞外環境に放出する。
本明細書において使用される場合、「トランスポーター」という用語は、分子、例えば、アミノ酸、毒素、代謝産物、基質などを細胞外環境から微生物へ取り込むための機構、例えばタンパク質(複数可)を指すことを意味する。例えば、PhePなどフェニルアラニントランスポーターはフェニルアラニンを微生物に取り込む。
エフェクターはまた、免疫チェックポイントインヒビターを含む。「免疫チェックポイントインヒビター」または「免疫チェックポイント」は1つ以上の免疫チェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に減少させ、阻害し、妨害し、または調節する分子をいう。免疫チェックポイントタンパク質はT細胞の活性化または機能を調節し、当技術分野で知られている。非限定的な例としては、CTLA−4およびその配位子CD80およびCD86、ならびにPD−1およびその配位子PD−L1およびPD−L2が挙げられる。免疫チェックポイントタンパク質はT細胞応答の同時刺激または阻害相互作用に関与し、自己寛容および生理学的免疫反応を調節および維持する。例えばCTLA−4阻害剤を使用する全身性免疫療法は免疫調節を変化させ、免疫機能不全を誘発し、日和見的自己免疫障害をもたらし得る(例えば、Kongら、2014を参照のこと)。
本明細書中で使用される場合、遺伝子操作された微生物(例えば、操作された細菌もしくはファージ)、または生物学的分子を「阻害する」分子は対照(例えば、同じ条件下での同じ亜型の未処理対照または未改変微生物)と比較して、その生物学的分子の生物学的活性、生物学的機能、および/または数を減少、減少、または排除し得る細菌またはウイルスまたは分子をいう。
本明細書中で使用される場合、遺伝子操作された微生物(例えば、生物学的分子を「活性化する」または「刺激する」操作された細菌またはファージ分子)は対照(例えば、同じ条件下で、同じ亜型の未処理対照または未改変微生物)と比較して、その生物学的分子の生物学的活性、生物学的機能、および/または数量を活性化、増加、増強、または促進することができる細菌またはファージ分子をいう。
用語「ファージ」および「バクテリオファージ」は本明細書では互換的に使用される。両方の用語が細菌に感染し、細菌内で複製するウイルスを指す。本明細書で使用される「ファージ」またはバクテリオファージは集合的に、プロファージ、溶原性、休眠性、温帯性、無傷、欠陥、潜在性、およびサテライトファージ、ファージテールバクテリオシン、テリオオシン、および遺伝子導入剤を指す。
本明細書で用いる「プロファージ」という用語はバクテリオファージのゲノム物質を意味し、宿主細胞のレプリコンに組み込まれ、宿主と共に複製する。プロファージは特異的に活性化されるとファージを産生することができる。場合によってはプロファージはファージを産生することができないか、またはそうしたことがない(すなわち、欠陥プロファージまたは潜在的プロファージ)場合によっては、プロファージはサテライトファージも意味する。「プロファージ」および「内因性ファージ」という用語が本明細書では互換的に用いられる。
本明細書中で使用される場合、用語「溶原性ファージ」または「溶原バクテリオファージ」または「プロファージ」は細菌宿主のDNA内に存在し、そして細菌複製サイクルおよび細胞分裂の間に宿主と共に複製するファージをいうために、互換的に使用される。
本明細書中で使用される場合、細菌もしくは生物の「自然状態」または細菌の「自然状態」という用語は遺伝子工学によって改変されていない生物を指し、場合によっては、細菌もしくは生物の「自然状態」または細菌の「自然状態」という用語が定義されたエレメントに関して改変された同質遺伝子株と比較して、遺伝子工学によって改変されていない生物を指す。そのようなものとして、細菌は1つの規定された要素に関してはその自然状態にあり得るが、別の規定された要素に関してはその自然状態にはあり得ない。いくつかの実施形態では、細菌がその天然または天然の同じまたは異なったファージまたはプロファージの1つ以上を含み得る。いくつかの実施形態ではすなわち、その天然または天然の状態において、1つ以上の同じまたは異なった型のファージまたはプロファージを含む細菌は操作された株のための前駆体株に役立つ。従って、例えば、前駆体または親株がその天然の内因性ファージまたはプロファージを含む場合、同じ1つ以上の内因性ファージまたはプロファージが遺伝子操作された細菌中に存在してもよい。そのようなものとして、遺伝子操作された細菌はまた、その自然状態(ここで、ファージは、その自然状態にある規定された元素である)でプロファージを含む。
「内因性ファージ」または「内因性プロファージ」はまた、細菌(およびその親株)の自然状態で存在するファージをいう。
本明細書中で使用される場合、用語「ファージノックアウト」または「不活化ファージ」は、ファージ粒子をもはや産生および/またはパッケージングすることができないか、または野生型ファージ配列より少ないファージ粒子を産生するように改変されたファージをいう。いくつかの実施形態では、不活化ファージまたはファージノックアウトとはその溶原化状態におけるテンペレートファージの不活化、すなわちプロファージの不活化をいう。このような改変はファージにおける突然変異をいい;このような突然変異がファージゲノム内の1つ以上の位置(例えば、ファージゲノム内の1つ以上の遺伝子内)における、挿入、欠失(ファージゲノムの部分的または完全な欠失)、置換、逆位を含む。
本明細書中で使用される場合、用語「同質遺伝子」細菌株は遺伝的に同一であるか、または規定された変化を含むが、他の点では同一である細菌株をいう。例えば、同質遺伝子突然変異体は、典型的には1つまたは複数の既知の遺伝子またはタンパク質中に定義された突然変異を含むことを除いて、同一である2つの株を指す。そのようなものとして、ファージフリーまたはファージ少ない株は、誘導され得、そして細菌細胞からファージ粒子を放出し得るプロファージを含む対応する同質遺伝子株を有する。
本明細書中で使用されるように、形容詞「ファージフリー」、「ファージフリー」および「ファージレス」は1つ以上のプロファージ(そのうちの1つ以上が改変されている)を含む細菌または株を特徴付けるために、互換的に使用される。この改変は、プロファージの誘導またはファージ粒子の放出能力の喪失をもたらし得る。あるいは、改変が改変を伴わない同質遺伝子株と比較して、より効率的でないか、またはより頻繁でない誘導、またはより効率的でないか、またはより頻繁でないファージ放出を生じ得る。ファージを誘導および放出する能力は、本明細書中に記載されるようなプラークアッセイを使用して測定され得る。
本明細書中で使用される「溶原菌」という用語は溶菌に必要なファージ遺伝子が発現されない、溶原サイクルにあるプロファージを含む細菌を指す。
本明細書で使用されるファージ誘導とは、溶原性プロファージのライフサイクルの一部をいい、そこで溶解性ファージ遺伝子が活性化され、ファージ粒子が産生され、溶解が起こる。
本明細書中で使用される場合、誘導という用語は溶原性感染の増殖性感染への変換をいい、すなわち、誘導されたプロファージは、ファージ粒子の産生および放出を開始する。誘導はしばしば、細菌DNAへの損傷によって刺激され、そして細菌染色体からのプロファージの切除を含み得るか、または含まないかもしれない。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、治療、予防、管理、重症度の低下、改善、障害、疾患または状態の治療に有用である。いくつかの実施形態では、障害は自己免疫障害である。本明細書で使用される「自己免疫障害」には、急性散在性脳脊髄炎(ADEM)、急性壊死性出血性脳脳炎、アディソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗GBM/抗TBM腎炎、抗リン脂質症候群(APS)、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患(AIED)、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性tica麻疹、軸索および神経神経障害、バロ病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害(CIDP)、慢性再発多巣性オストミエリスト(CRMO)、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、CREST病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病(視神経脊髄炎)、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維化肺胞炎、巨細胞性動脈炎(側頭動脈炎)、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症(GPA)、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、妊娠性ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病、IgGA腎症、IgGA腎炎、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、苔癬硬化性苔癬、木質結膜炎、線形IgA疾患(LAD)、ループス(全身性エリテマトーデス)、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病(MCTD)、モーレン潰瘍、ミュシャ・ハーバーマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎(デビック)、好中球減少症、眼性瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回盲部リウマチ性眼炎、神経失調症、脳炎、発作性夜間血色素尿症(PNH)、パリーロンバーグ症候群、Parsonnage−Turner症候群、扁平部炎(末梢ブドウ膜炎)、天疱瘡、末梢神経障害、静脈性脳脊髄炎、悪性貧血、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、I型、II型、およびIII型自己免疫性多発性腺症候群、多発性筋痛症、心筋症、心筋炎症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊ode性膿皮症、純粋な赤血球無形成、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性関節炎、後発性多発性軟骨炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子と精巣の自己免疫、硬直した人の症候群、亜急性細菌性心内膜炎(SBE)、スサック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病(TTP)、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、1型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病(UCTD)、ブドウ膜炎、血管炎、水疱性皮膚炎、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、障害は移植片対宿主病である。
いくつかの実施形態では、疾患は代謝疾患である。本明細書中で使用される場合、「代謝性疾患」は1型糖尿病;2型糖尿病;メタボリックシンドローム;Bardet−Biedel症候群;Prader−Willi症候群;非アルコール性脂肪性肝疾患;結節性骨異栄養因子(BDNF)欠損;単心性1(SIM1)欠損;レプチン受容体欠損;プロオピラノコルチン(POMC)欠損;プロタンパク質スブチリシン/ケキシン1型(PCSK1)欠損;Src相同性2B1(SH2B1)欠損;プロホルモン変換酵素1/3欠損;メラノコルチン−4−受容体(MC4R)欠損;ウィルムス腫瘍、アニリジア、尿生殖器異常を含むが、これらに限定されない。副甲状腺機能低下症(WAGR)症候群;偽X症候群;Borjeson−Forsmann−Lehmann症候群;Alstrom症候群;Cohen症候群;および尺骨乳房症候群。
いくつかの実施形態では、障害はがんである。「癌」または「癌性」は調節されていない細胞増殖を特徴とする生理学的状態を指すために使用され、いくつかの実施形態では癌は腫瘍を指す。「腫瘍」が任意の腫瘍性細胞増殖もしくは増殖、または任意の前癌性もしくは癌性の細胞もしくは組織を指すために使用される。腫瘍は悪性であっても良性であってもよい。癌の種類には副腎癌、副腎皮質癌、虫垂癌、骨癌(例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫)、脳癌(例えば、星細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫)、細気管支腫瘍、乳癌、頸部癌、直腸癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、胆嚢癌、胃腸カルチノイド腫瘍、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、下咽頭癌が含まれるが、これらに限定されない。急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、肝癌、リンパ腫(エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫など)、悪性中皮腫、多発性骨髄異形成症候群、鼻腔がん、副鼻腔がん、鼻腔がん、神経芽細胞腫、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん(例えば、基底細胞がん、黒色腫)、小腸がん、胃がん、奇形腫、精巣がん、咽頭がん、胸腺がん、甲状腺がん、甲状腺がん、異常小児がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、Waldenstrhomマクログロブリン血症、およびWilms腫瘍。がん処置の副作用には日和見自己免疫障害、全身毒性、貧血、食欲不振、ブラダ内層の刺激、出血および打撲傷(血小板減少症)、味覚または臭いの変化、便秘、下痢、口渇、嚥下障害、浮腫、疲労、脱毛(脱毛症)、感染症、不妊症、リンパ浮腫、口内炎、悪心、疼痛、末梢神経障害、歯崩壊、尿路感染症、および/または記憶部および濃度に関する問題が含まれ得るが、これらに限定されない(米国国立がん研究所)。いくつかの実施形態では、障害は高アンモニア血症障害である。
いくつかの実施形態では障害が高アンモニア血症、尿素環障害、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、マプレシルアップ尿疾患、イソ吉草酸血症、高オキサリア、フェニルケトン尿素を含むが、これらに限定されない稀な疾患である。
上述の障害のうちの1つ以上の処置、予防、管理、改善のための例示的な回路は係属中の同時所有の国際特許出願PCT/US2016/34200、出願05/25/16、PCT/US2017/013072、出願01/11/2017、PCT/US2017/016603、出願02/04/2016、PCT/US2017/017563、出願02/10/2017、PCT/US2016/044922、出願07/29/016、PCT/US2016/049781、出願08/31/2016、PCT/US2016/37098、出願06/10/16、PCT/US2016/069052に記載されている。2016年12月28日出願、PCT/US2016/32562、2016年11月16日出願、およびPCT/US2017/013072。その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書において使用される場合、冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、明確に反対であることが示されていない限り、「少なくとも1つ」を意味すると理解されるべきである。
「および/または」という語句は、列挙における要素の間で使用される場合、(1)単一の列挙された要素のみが存在すること、または(2)列挙の1つより多い要素が存在することのいずれかを意味することを意図する。例えば、「A、Bおよび/またはC」は、その選択が、A単独;B単独;C単独;AおよびB;AおよびC;BおよびC;またはA、B、およびCであってもよいことを示す。「および/または」という語句は、列挙における要素の「少なくとも1つ」または「1つもしくは複数」と交換可能に使用されてもよい。
細菌
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される細菌が内因性ファージゲノムに対する1つ以上の突然変異または改変を含む。いくつかの実施形態では、細菌がその天然または天然のバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態では、ファージが特定の細菌の全ての分離中に存在する。いくつかの実施形態では、ファージが同じ種、株、または亜株の細菌中に存在する。いくつかの実施形態では、ファージはインタクトプロファージである。いくつかの実施形態では、ファージは欠陥プロファージである。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージが溶解サイクルに入ることを不可能にする。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が溶解サイクルを受けるファージの能力に影響を及ぼし、例えば、溶解段階を受け得る所与の集団における細菌の頻度を減少させるか、または数を減少させる。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージが他の細菌に感染するのを防止する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が細菌の適応度を変更させる(例えば、増加または減少させる)。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がエフェクター機能を変更させる(例えば、増加または減少させる)。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が細菌の適応度を変化させない。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がエフェクター機能を変化させない。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が大規模製造を含む、細菌が製造または生産される工程を改善する。これらの実施形態のいずれかにおいて、細菌はそわなければ、その自然状態であり得る。あるいはこれらの実施形態のいずれかにおいて、細菌は1つ以上のエフェクター分子をコードする遺伝子配列を含むようにさらに遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態では、1つ以上の変異ファージを含む細菌を細菌シャシー(chassis)として使用することができ、それに遺伝子回路が追加または改変される。
いくつかの実施形態では、細菌は非病原性細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は共生細菌である。いくつかの実施形態では、細菌はプロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は、病原性を低減させるか、または取り除くように改変または突然変異された天然の病原性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。例示的な細菌には、限定されないが、バチルス属、バクテイロデス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビ細菌属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、大腸菌、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、サッカロミセス属、およびスタフィロコッカス属、例えば、バチルス・コアグランス、バチルス・サブティリス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・サブティリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロングム、クロストリジウム・ブチリカム、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ラクティス、およびサッカロミセス・ブラウディが含まれる。特定の実施形態では、細菌は、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、バクテロイデス・サブティリス、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、クロストリジウム・ブチリカム、大腸菌Nissle、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、およびラクトコッカス・ラクティスからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、細菌は、最も特徴付けられたプロバイオティクスの1つに進化している腸内細菌科(Enterobacteriaceae family)のグラム陰性細菌である、大腸菌株Nissle 1917(E.coli Nissle)である(Ukenaら、2007年)。その株はその完全な無害により特徴付けられ(Schultz、2008年)、GRAS(一般に安全と認識されている(generally recognized as safe))状態を有する(Reisterら、2014年、下線は筆者による)。ゲノムシークエンシングにより、大腸菌Nissleが重要なビルレンス因子(例えば、大腸菌α−溶血素、P−線毛付着因子)を欠失していることが確認された(Schultz、2008年)。さらに、大腸菌Nissleは病原性接着因子を保有せず、腸毒素または細胞毒素を全く産生せず、侵襲性ではなく、尿路病原性ではないことが示されている(Sonnenbornら、2009年)。早くも1917年に、大腸菌Nissleは、治療的使用のために、Mutaflorと呼ばれる医薬用カプセルにパッケージ化された。大腸菌Nissleの治療効果および安全性は納得できるように証明されていることは一般に認められている(Ukenaら、2007年)。
いくつかの実施形態では、本開示の細菌または腫瘍標的細菌。腫瘍標的細菌は、WO2017/123675として公開された2017年1月11日出願の国際特許出願PCT/US2017/013072に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
当業者は、本明細書に開示される遺伝子組換えが、細菌の他の種、株、および亜型に適合され得ることを理解する。さらに、1つまたは複数の異なる種由来の遺伝子が互いに導入されてもよく、例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス由来のPAL遺伝子は大腸菌において発現され得(Sarkissianら、1999年)、原核生物および真核生物のフェニルアラニンアンモニアリアーゼは配列相同性を共有することが知られている(XiangおよびMoore、2005年)。
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書中に開示されるか、または当技術分野で公知であり、本開示に従って使用され得る細菌種のいずれかは、1つ以上の内因性ファージゲノムに対する1つ以上の突然変異または改変を含む。いくつかの実施形態では、内因性ファージゲノムに対する改変がファージゲノム内に1つ以上の欠失、挿入、置換、または逆位、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、改変はファージゲノム中の1つ以上の欠失である。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ遺伝子が欠失される。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ遺伝子が部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、改変がファージゲノムにおける1つ以上の挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載の抗生物質カセットをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ファージゲノム中の1つ以上の遺伝子が交互の遺伝子配列で置換される。いくつかの実施形態では、置換が抗生物質カセットをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ遺伝子の配列全体が逆転している。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ遺伝子の部分配列が逆転される。
非改変大腸菌Nissleおよび本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば、消化管もしくは血清中の防御因子によって(Sonnenbornら、2009年)、または投与後数時間もしくは数日の死滅スイッチ(kill switch)の活性化によって破壊され得る。このように、遺伝子操作された細菌は継続的な投与を必要とする場合がある。いくつかの実施形態では、滞留時間はヒト対象について計算される。in vivoでの滞留時間は、本発明の遺伝子操作された細菌について計算され得る(例えば、参照によりその全体が本明細書に援用されるWO2017087580の図68を参照のこと)。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はPALをコードする遺伝子を含み、PAL遺伝子は直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、細菌は非天然PAL遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌は天然のPAL遺伝子のさらなるコピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然ではPAL遺伝子に付随していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に開示される任意の1つ以上のプロモーターである。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はPAHをコードする遺伝子を含み、PAH遺伝子は直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、細菌は非天然のPAH遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌は天然のPAH遺伝子のさらなるコピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然ではPAH遺伝子に付随していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは本明細書に開示される任意の1つ以上のプロモーターである。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はLAADをコードする遺伝子を含み、LAAD遺伝子は直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、細菌は非天然のLAAD遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌は天然のLAAD遺伝子のさらなるコピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然ではLAAD遺伝子に付随していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは本明細書に開示される任意の1つ以上のプロモーターである。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする遺伝子をさらに含む。特定の実施形態では、細菌は、フェニルアラニントランスポーターをコードする天然遺伝子のさらなるコピーを含み、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。代替の実施形態では、細菌は、非天然フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子を含み、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。両方の実施形態は、「非天然」フェニルアラニントランスポーターという用語に包含される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、天然ではpheP遺伝子に付随していない。いくつかの実施形態では、同じプロモーターは、PhePおよびPALおよび/またはPAHおよび/またはLAADの発現を制御する。いくつかの実施形態では、PhePの発現を制御するプロモーターは、PALおよび/またはPAHおよび/またはLAADの発現を制御するプロモーターとは異なる。いくつかの実施形態では、PhePの発現を制御するプロモーターは、本明細書に開示される任意の1つ以上のプロモーターである。
いくつかの実施形態では、PAL、PAH、LAAD、および/またはphePに作動可能に連結しているプロモーターは、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の小腸に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の大腸に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素または嫌気的条件および/または低酸素条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的である分子または代謝産物、例えばプロピオネートの存在によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、テトラサイクリンへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、アラビノースへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、IPTGへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ラムノースまたは当業者に既知の他の化学的および/もしくは栄養性誘導物質への曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、外因性の環境温度によって直接的または間接的に制御される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、IPTGまたは他のlacI結合性化合物への曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ラムノースへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、温度の上昇によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、温度の低下によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。そのような分子はテトラサイクリンまたはIPTGまたはアラビノースまたは当業者に既知の他の化学的および/もしくは栄養性誘導物質であり得る。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、in vivo投与前に直接的または間接的に誘導される。菌株の培養中に提供されるこのような条件の非限定的な例には、低酸素、嫌気性、微好気性もしくは好気性条件、他の一定の酸素レベル(以下に例示されるものなど)、アラビノースの存在、IPTG、ラムノースまたは本明細書に記載されているか当技術分野で公知の他の化学的および/もしくは栄養性誘導物質の存在が含まれる。いくつかの実施形態では、培養容器中の条件は特定の酸素レベル、例えば、酸素1%〜10%、酸素10%〜20%、酸素20%〜30%、酸素30%〜40%、酸素40〜50%、酸素60〜70%、酸素70〜80%、酸素80〜90%、酸素90〜100%、および本明細書に記載される他の酸素レベルに設定され、その設定点においてプロモーターは直接的または間接的に誘導される。
バクテリオファージ
いくつかの実施形態では、本発明の細菌が1つ以上の溶原性、休眠性、温帯性、インタクト、欠陥、潜在性、またはサテライトファージ、またはバクテリオシン/ファージテールまたは遺伝子導入剤を、それらの自然状態で含む。いくつかの実施形態では、プロファージまたはバクテリオファージが目的の特定の細菌の全ての分離に存在する。いくつかの実施形態では、細菌はプロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、細菌が1つ以上のこのようなバクテリオファージを含む親株の遺伝子操作された誘導体である。従って、本発明のこのような細菌は、それらの自然状態であってもよく、または1つ以上のエフェクター分子の式または製造のための回路を含むようにさらに遺伝的に改変されていてもよい。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、細菌は、バクテリオファージの特性または挙動を変化させるプロファージまたはバクテリオファージゲノム内の1つ以上の改変または突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がプロファージが溶解処理に入るかまたはそれを完了することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージが同じまたは異なった型の他の細菌に感染することを妨げる。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異が細菌宿主の適応度を変化させる(例えば、減少または増大させる)。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変化、例えば減少または増大させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が細菌宿主の適応度を変化させない(例えば、減少または増大させない)。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変化させない、例えば減少させない、または増大させない。
ファージゲノムの大きさは、最小LeuconostocファージL5(2,435bp)、〜11.5 kbp(例えば、マイコプラズマファージP1)、〜21kbp(例えば、ラクトコッカス属ファージc2)、および〜30kbp(例えば、パスツレラファージF108)から、Bacillus megateriumファージGのほぼ500 kbpのゲノム(HatfullおよびHendrix; Bacteriophagesおよびそれらのゲノム、Curr Opin Virol.2011年10月1日;1(4):298〜303、およびその中の参考文献)まで、非常に多様である。ファージゲノムは、10個未満の遺伝子から数百個までの遺伝子をコードすることができる。細菌プラスミドに組み込まれるファージのいくつかの例も存在するが(Little、Loysogeny、Prophage Induction、and Lysogenic Conversion.In: Waldor MK、Friedman DI、Adhya S、editors.Phages Ther Role in Bacterial病因and Biotechnology.Washington DC: ASM Press; 2005 pp.37−54。場合によっては、ファージは常に細菌宿主染色体内の同じ位置に位置し、この位置は各ファージに特異的であり、すなわち、異なるファージは異なる位置に位置する。他のファージは、それらが多数の異なる場所で組み込まれ得るという点で、より許容性である。
従って、本開示の細菌は、長さが変化し得る1つ以上のファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約1bp〜10kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、細菌が長さが少なくとも約1bp〜10kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約10kb〜20kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約20kb〜30kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約30kb〜40kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約30kb〜40kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約40kb〜50kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約50kb〜60kbの長さの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約60kb〜70kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約70kb〜80kbの長さの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約80kb〜90kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約90kb〜100kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約100kb〜120kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約120kb〜140kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約140kb〜160kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約160kb〜180kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約180kb〜200kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約200kb〜180kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約160kb〜250kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約250kb〜300kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約300kb〜350kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約350kb〜400kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約400kb〜500kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが少なくとも約500kb〜1000kbの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が長さが1000kbを超えるバクテリオファージゲノムを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の細菌が1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子を含む1つ以上のファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約1〜5個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約5〜10個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約10〜15個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約15〜20個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約20〜25個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約25〜30個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約30〜35個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約35〜40個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約40〜45個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約45〜50個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約50〜55個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約55〜60個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約60〜65個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約65〜70個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約70〜75個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約75〜80個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約80〜85個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約85〜90個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約90〜95個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約95〜100個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約100〜115個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約115〜120個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約120〜125個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約125〜130個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約130〜135個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約135〜140個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約140〜145個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約145〜150個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約150〜160個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約160〜170個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約170〜180個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約180〜190個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約190〜200個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも約200〜300個の遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が約300を超える遺伝子を含むバクテリオファージゲノムを含む。
いくつかの実施形態では、ファージが特定の種における細菌宿主染色体内の同じ箇所または箇所に常にまたはほとんど常に箇所する。いくつかの実施形態では、ファージが特定の種における宿主染色体内の種々の位置に組み込まれて見出される。いくつかの実施形態では、ファージはプラスミド上に位置する。
プロファージ配列の存在はまた、ファージなしの同質遺伝子株には存在しない細菌に特定の特性を付与し得る。例えば、プロファージは、いくつかの場合において、細菌が抗生物質耐性を獲得すること、新しい環境ニッチに存在すること、密着性を改善すること、または病原性になることを可能にし得る。加えて、溶解処理を通じて、ある細菌からのDNAは別の細菌において拾い上げられ、放出されることができ、したがって、ファージは、遺伝子導入のための溶媒として機能する。
従って、いくつかの実施形態では、細菌が細菌に抗生物質耐性を与えるファージを含む。いくつかの実施形態では、細菌が細菌にさらなる適合性を与えるファージを含む。いくつかの実施形態では、細菌が細菌に新しい環境で増殖することができるファージを含む。いくつかの実施形態では、細菌が宿主遺伝物質を同じ種または異なった種の別の細菌に移すことができるファージを含む。
いくつかの実施形態では、プロファージが欠陥プロファージまたは潜在的プロファージであり得る。欠陥プロファージもはや溶解サイクルを経ることができない。クリプティックプロファージは、溶解サイクルを受けることができないか、または溶解サイクルを決して受けていないかもしれない。細菌ゲノムのプロファージの完全なレパートリーの機能的研究は、プロファージの大部分があるレベルで欠損していることを示唆する:切除、ビリオン形成、溶解、または感染能力(Bobayら、2014)。不完全なまたは潜在的なプロファージは、突然変異の減衰および/または何千もの細菌複製サイクルにわたる溶解サイクルに必須の1つ以上の遺伝子の喪失の試験結果として、多くの細菌において高いレベルの豊富さを生じる。(Bobay et al、Pervasive domestication of defective prohages by bacteria、Proc Natl Acad Sci U S A.).注目すべきは欠損プロファージはまた、宿主に適応的または好都合な機能性を提供し得る多くの遺伝子(例えば、相同組換え機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、さらなる感染の防止のための機構、またはバクテリオシンを含む)をしばしば含み、これは例えば、他の隣接する細菌種の増殖抑制を介する栄養素の競合において有用であり得る。例えば、いくつかの欠陥プロファージはEcoli K?12(例えば、Rac、e14、DLP12、およびQIN)およびBacillus subtilis(例えば、186およびSKIN)において特徴付けられている(Casjens、2001、およびその中の参考文献)。これらのファージの各々は、いくつかの機能的遺伝子を保有する。例えば、Racは、RecE相同組換え系をコードする。
従って、いくつかの実施形態では、細菌が1つ以上の欠陥または潜在的なプロファージを含む。いくつかの実施形態では、プロファージ遺伝子は相同組換え機能を付与する。いくつかの実施形態では、プロファージ遺伝子がさらなる感染を予防する機能を付与する。いくつかの実施形態では、プロファージ遺伝子はバクテリオシンを与える。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子が炭素利用を増加させること、浸透圧、酸化および酸ストレスに対する耐性を改善すること、種々の条件下での増殖を増加させること、リンおよび窒素利用を増強すること、またはバイオフィルム形成に影響を及ぼすことによって、有害な条件下での増殖を促進する。
いくつかの実施形態では、細菌が1つ以上のサテライトファージゲノムを含む。サテライトファージは、それ自体の構造タンパク質遺伝子を保有しておらず、他の特異的ファージの構造タンパク質によるカプセル化のための構成であるゲノムを有する(6およびKlugバクテリオファージP4:プロファージP2、ウイルス学、第51巻、第2号、1973年2月、327〜344頁のようなヘルパーに依存するサテライトウイルス)。従って、いくつかの実施形態では、細菌がそれ自身の構造遺伝子を持たないファージゲノムを含む。
いくつかの実施形態では、細菌が1つ以上のテリオオシンを含む。多くの細菌(グラム陽性およびグラム陰性の両方)は、ファージ頭部を伴わずに機能的であるファージ尾部に似た様々な粒子を産生し(テリオオシンと呼ばれる)、その多くはバクテリオシン特性を有することが示されている(GhequireおよびMot、The Tailocin Tale: Peeling off Phage; Trends in Microbiology、October 2015、Vol.23、No.10に概説されている。ファージ尾部様バクテリオシンは、収縮性ファージ尾部様(R型)および非収縮性であるが柔軟性ファミリー(F型)の2つの異なるファミリーに分類される。従って、いくつかの実施形態では、細菌がバクテリオシンまたは他の有益な特性を付与する1つ以上のテリオオシンを含む。
いくつかの実施形態では、細菌が1つ以上の遺伝子導入剤を含む。遺伝子導入剤(GTA)は、いくつかの細菌ゲノムによってコードされるファージ様元素である。GTAはファージに似ているが、典型的なファージを規定する顕著な能力を欠き、宿主細胞DNAのランダム断片をパッケージングし、次いでそれらを同じ種の他の細菌に水平に移す(ラングら、遺伝子導入剤:ファージ様遺伝子交換エレメント、ナットレブミクロビオール、2012年6月11日;10(7):472−482に概説されている)。そこでは、DNAが相同組換えによって、常在する同族染色体領域を置換することができる。しかしながら、粒子の大部分はGTAをコードする遺伝子を有していないので、これらの粒子はウイルスとして増殖することができない。
いくつかの実施形態では、細菌が1つ以上の糸状ビリオンを含む。糸状ビリオンはdsDNAプロファージとして組み込まれる(Marvin DAら、Structure and assembly of filamentous bacteriophages、Prog Biophys Mol Biol.2014 Apr;114(2):80−122に概説されている)。
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、1つ以上の酵素およびトランスポーターを発現する(例えば、フェニルアラニンの摂取のための)本明細書中に記載される遺伝子操作された細菌は、内因性プロファージまたはバクテリオファージゲノム内に1つ以上の改変または突然変異を含む。これらの改変は、プロファージの特性または挙動を変化させ得る。いくつかの実施形態では改変または突然変異が本質的に細菌適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株の適応度と本質的に同じである。プロファージは、実験的または計算的のいずれかで同定され得る。実験的アプローチは、宿主細菌をUV光または他のDNA損傷条件に曝露することによって、宿主細菌にファージ粒子を放出させることを含む。しかしながら、いくつかの場合において、プロファージが誘導される条件は未知であり、従って、斑アッセイ中にプラークが存在しないことは、プロファージが存在しないことを必ずしも証明しない。さらに、このアプローチは生存可能なファージの存在のみを示し得るが、欠陥プロファージを明らかにしない。このように、ゲノム配列データからのプロファージのコンピューターによる同定は、最も好ましい経路となっている。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がエフェクター機能に本質的に影響を及ぼさず、エフェクター機能は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株のエフェクター機能と本質的に同じである。表Hは、プロバイオティクス細菌の非限定的な例、およびファスタースコアリングによって決定される細菌ゲノムに含まれる可能性のあるバクテリオファージの数の一覧を提供する。表Iは、クロストリジウム株および電位ファージゲノムの一覧を提供する。ファースターは、生物(http://Phaster.ca/)中のファージ配列をバイオインフォマティックに同定するためのウェブサーバーである。PHASTERスコアリングは、PHASTER.caおよびZhouら(「PHAST: A Fast Phage Search tool」、Nucl.Acids Res.(2011)39(suppl 2): W347−W352)およびArndtら(Arndtら(2016)phaster:phaster:PHASTファージ検索ツールのより良好でより速いバージョン)に詳細に記載されている。Nucleic Acids Res、2016 May 3).。要約すると、提供された細菌ゲノム配列内のプロファージ領域(無傷、疑わしい、または不完全なものとして)をスコア化するために、異なる基準で3つの方法を適用する。第1の方法において、ファースターによって同定された特定のファージ生物の数が領域のCDSの総数の100%以上である場合、領域は、総スコア150でマークされる。100%未満の場合、方法2および3が使用される。第2法では提供された細菌ゲノム配列中のファースターによって同定された特定のファージ生物の数が領域のCDSの総数の50%を超える場合、そのファージ生物はその領域についての主要な電位ファージとみなされ、領域のタンパク質の総数中のこの表中のそのファージ生物の総数の割合が計算され、次いで100倍され、領域の長さ中のそのファージ生物の長さの割合が計算され、次いで50倍される(ファージヘッドのカプセル化能力が考慮される)。方法3では、特定のファージ関連キーワード(「キャプシド」、「ヘッド」、「インテグラーゼ」、「プレート」、「テール」、「ファイバー」、「コート」、「トランスポザーゼ」、「ポータル」、「ターミナーゼ」、「プロテアーゼ」または「ライシン」など)のいずれかが存在する場合、見つかったキーワードごとに得点を10だけ増加させる。領域のサイズが30Kbより大きい場合、スコアは10だけ増加される。その領域に少なくとも40タンパク質が存在する場合、得点は10だけ増加される。ファージ関連タンパク質および仮想タンパク質の全てが、この地域におけるタンパク質の総数の70%を超える場合、得点は10増加する。方法2の合計スコアを方法3の合計スコアと比較し、大きい方を領域の合計スコアとして選択する。領域の合計スコアが70未満である場合、それは不完全とマークされ、70〜90の間である場合、疑わしいとマークされ、90を超える場合、それは無傷とマークされる。
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載の細菌は、存在するプロファージまたはバクテリオファージゲノム内に1つ以上の改変または突然変異を含む。これらの改変は、プロファージの特性または挙動を変化させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がプロファージが溶解処理に入るかまたはそれを完了することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージが同じまたは異なった型の他の細菌に感染することを妨げる。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異が細菌宿主の適応度を変化させる(例えば、減少または増大させる)。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変化、例えば減少または増大させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が細菌宿主の適応度を変化させない(例えば、減少または増大させない)。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変化させない、例えば減少させない、または増大させない。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がフェニルアラニン消費を改善する。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン消費が未変性のファージを含む同質遺伝子株において観察されるレベルに類似したままである。いくつかの実施形態では改変または突然変異が本質的に細菌適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株の適応度と本質的に同じである。
いくつかの実施形態では、細菌が少なくとも約1〜2、少なくとも約2〜3、少なくとも約3〜4、少なくとも約4〜5、少なくとも約5〜6、少なくとも約6〜7、少なくとも約7〜8、少なくとも8〜9、少なくとも9〜10、少なくとも10〜11、少なくとも11〜12、少なくとも13〜14、少なくとも13〜14、少なくとも14〜15、少なくとも15〜16、少なくとも17〜18、少なくとも17〜18、少なくとも19〜20、少なくとも19〜20、少なくとも20〜21、少なくとも21〜22、少なくとも22〜23、少なくとも23〜24、少なくとも24〜25、少なくとも25〜26、少なくとも26〜27、少なくとも27〜28、少なくとも28を含む。少なくとも約30〜約29、少なくとも約30〜約31、少なくとも約30〜約31、少なくとも約32〜約33、少なくとも約34〜約35、少なくとも約36〜約37、少なくとも約38〜39、少なくとも約39〜40、少なくとも約40〜約41、少なくとも41〜42、少なくとも約43〜44、少なくとも約43〜44、少なくとも約45〜46、少なくとも約46〜47、少なくとも約47〜48、少なくとも約47〜48、少なくとも約49〜50、少なくとも約49〜50、少なくとも約50〜51、少なくとも約51〜52、少なくとも約52〜53、少なくとも約53〜54、少なくとも約54〜55、少なくとも約55〜56、少なくとも約56〜57、少なくとも約59〜58、少なくとも約60〜59、少なくとも約61〜60、少なくとも約63、少なくとも約64〜63、少なくとも約64〜65、少なくとも約66〜67、少なくとも約67〜68、少なくとも約69〜70、少なくとも約69〜70、少なくとも約70〜71、少なくとも約72〜73、少なくとも約72〜74、少なくとも約74〜75、少なくとも約76〜77、少なくとも約76〜77、少なくとも約77〜78、少なくとも約77〜78、少なくとも約78〜79、少なくとも約79〜80、少なくとも約80〜81、少なくとも約81〜82、少なくとも約82〜83、少なくとも約83〜84、少なくとも約84〜85、少なくとも約84〜85、少なくとも約86〜87、少なくとも約86〜87、少なくとも約88〜89、少なくとも約88〜89、少なくとも約88〜89、少なくとも約89〜90、少なくとも約90〜91、少なくとも約91〜92、少なくとも約92〜93、少なくとも約93〜94、少なくとも約94〜95、少なくとも約95〜96、少なくとも約96〜97、少なくとも約97〜98、少なくとも約98〜99、少なくとも約99〜100、または存在するプロファージまたはバクテリオファージゲノムに対する少なくとも約100以上の改変または変異。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がエフェクター機能、例えばフェニルアラニン消費を改善する。いくつかの実施形態ではエフェクター機能、例えば、フェニルアラニン消費は未変性のファージを含む同質遺伝子株において観察されるものと同様のままである。いくつかの実施形態では改変または突然変異が本質的に細菌適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株の適応度と本質的に同じである。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変を有さない同質遺伝子株と比較して、プロファージ溶解過程の進入または終了を、少なくとも約1〜2倍、少なくとも約2〜3倍、少なくとも約3〜4倍、少なくとも約4〜5倍、少なくとも約5〜10倍、少なくとも約10〜100倍、少なくとも約100〜1000倍減少させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がプロファージ溶解処理の進入または終了を完全に妨げる。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変なしの同質遺伝子株と比較して、プロファージ溶解処理の進入または終了を、少なくとも約1%〜10%、少なくとも約10%〜20%、少なくとも約20%〜30%、少なくとも約30%〜40%、少なくとも約40%〜50%、少なくとも約50%〜60%、少なくとも約60%〜70%、少なくとも約70%〜80%、少なくとも約80%〜90%、または少なくとも約90%〜100%減少させる。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変なしの同質遺伝子株と比較して、同一または異なる型の他の細菌に、少なくとも約1〜2倍、少なくとも約3〜4倍、少なくとも約4〜5倍、少なくとも約5〜10倍、少なくとも約10〜100倍、少なくとも約10〜20倍、少なくとも約20〜30倍、少なくとも約30〜40倍、少なくとも約40〜50倍、少なくとも約50〜60倍、少なくとも約60〜70倍、少なくとも約70〜80倍、少なくとも約80〜90倍、少なくとも約90〜100倍、または少なくとも約100〜1000倍感染することを、ファージが少なくとも約1〜2倍、少なくとも約3〜4倍、少なくとも約5〜10倍、少なくとも約10〜100倍、少なくとも約10〜20倍、少なくとも約20〜30倍、少なくとも約30〜40倍、少なくとも約50〜60倍、少なくとも約60〜70倍、少なくとも約70〜80倍、。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージが同じまたは異なった型の他の細菌に感染することを完全に防止する。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージが同じまたは異なる型の他の細菌に、少なくとも約1%〜10%、少なくとも約10%〜20%、少なくとも約20%〜30%、少なくとも約30%〜40%、少なくとも約40%〜50%、少なくとも約50%〜60%、少なくとも約60%〜70%、少なくとも約70%〜80%、少なくとも約80%〜90%、または少なくとも約90%〜100%感染することを防止する。
いくつかの実施形態では、変更または突然変異がファージ変更を伴わない同質遺伝子株と比較して、細菌宿主の適応度を、少なくとも約1〜2倍、少なくとも約2〜3倍、少なくとも約3〜4倍、少なくとも約4〜5倍、少なくとも約5〜10倍、少なくとも約10〜100倍、または少なくとも約100〜1000倍、変更または変更(例えば、減少または増加)する。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変を伴わない同質遺伝子株と比較して、ファージ改変を伴わない同質遺伝子株と比較して、細菌宿主の適応度を、例えば、少なくとも約1%〜10%、少なくとも約10%〜20%、少なくとも約20%〜30%、少なくとも約30%〜40%、少なくとも約40%〜50%、少なくとも約50%〜60%、少なくとも約60%〜70%、少なくとも約70%〜80%、少なくとも約80%〜90%、または少なくとも約90%〜100%変更または増加させる。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば、遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を、少なくとも約1〜2倍、少なくとも約2〜3倍、少なくとも約3〜4倍、少なくとも約4〜5倍、少なくとも約5〜10倍、少なくとも約10〜100倍、または少なくとも約100〜1000倍、例えば減少または増大させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変を伴わない同質遺伝子株に対して、例えば、遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を、少なくとも約1%〜10%、少なくとも約10%〜20%、少なくとも約20%〜30%、少なくとも約30%〜40%、少なくとも約40%〜50%、少なくとも約50%〜60%、少なくとも約60%〜70%、少なくとも約70%〜80%、少なくとも約80%〜90%、または少なくとも約90%〜100%変化させる(例えば、減少または増大させる)。
いくつかの実施形態では、この突然変異がファージゲノム配列内に1つ以上の欠失を含む。本明細書中で使用される場合、「欠失」はポリヌクレオチド配列からの1つ以上のヌクレオチドの除去を意味する。いくつかの実施形態では突然変異がファージゲノム配列への1つ以上の挿入を含む。本明細書中で使用される場合、「挿入」はポリヌクレオチド配列への1つ以上のヌクレオチドの付加を意味する。いくつかの実施形態では抗生物質カセットがファージゲノム配列内の1つ以上の位置に挿入され得る。いくつかの実施形態では突然変異がファージゲノム配列内の1つ以上の置換を含む。本明細書中で使用される場合、「置換」はポリヌクレオチド配列内の1つ以上のヌクレオチドを同数のヌクレオチドで置換することを意味する。いくつかの実施形態では突然変異がファージゲノム配列内の1つ以上の逆位を含む。本明細書中で使用される場合、「逆位」は2つ以上のヌクレオチドを含むセグメントがポリヌクレオチド配列内で末端から末端へ逆にされる場合を意味する。いくつかの実施形態では、逆位は特異的フリッパーゼによって支配され得る。複数のレベルの制御を含む例示的な回路は本明細書に例示されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、同時所有の係属中のPCT出願PCT/US2016/039434にも記載されている。
いくつかの実施形態では、ファージゲノム内の改変が1つ以上のファージゲノム遺伝子内の2つ以上の挿入、欠失、置換、または逆位の組み合わせである。
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、ファージゲノム内の1つ以上の遺伝子における1つ以上のフレームシフト突然変異を生じ得る。本明細書中で使用される場合、フレームシフト突然変異(フレーミングエラーまたはリーディングフレームシフトとも呼ばれる)は、3で割り切れないDNA配列中の多数のヌクレオチドのインデル(挿入または欠失)によって引き起こされる遺伝子突然変異をいう。欠失または挿入が起こる配列が早ければ早いほど、タンパク質はより変化する。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、ファージゲノム内の1つ以上の遺伝子における1つ以上のミスセンス突然変異を生じ得る。本明細書中で使用される場合、ミスセンス突然変異とは、単一の塩基類対の変化が得られるタンパク質における種々のアミノ酸の置換を引き起こす場合をいう。このアミノ酸置換は、影響を有さないか、またはタンパク質を非機能性にし得る。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、ファージゲノム内の1つ以上の遺伝子における1つ以上のナンセンス突然変異を生じ得る。本明細書中で使用される場合、ナンセンス突然変異は遺伝暗号によって特定される20個のアミノ酸のうちの1つに対応するセンスコドンが鎖終結コドンに変化し、それによって目的のポリぺプチドが切断される突然変異をいう。
いくつかの実施形態では、ファージゲノム内の改変が1つ以上のファージゲノム遺伝子内の2つ以上のフレームシフト、ナンセンスまたはミスセンス突然変異の組み合わせである。いくつかの実施形態では、改変されたバクテリオファージが細菌染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、改変されたバクテリオファージが細菌プラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、プラスミドを改変する。いくつかの実施形態では、プラスミドを完全に除去する。いくつかの実施形態では、ファージまたはプロファージが特定の種のすべての分離株に存在する。いくつかの実施形態では、プロファージが特定の門、目、サブ目、ファミリー、クラス、サブクラス属、種、サブ種、またはクレードのすべての分離株に存在する。
突然変異
いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約1〜500塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約500〜1000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約2000〜3000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約3000〜4000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約4000〜5000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約5,000〜6,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約6,000〜7,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約7,000〜8,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約8,000〜9,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約9,000〜10,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの少なくとも約10,000〜15,000塩基対を含む。いくつかの実施形態において、1以上の突然変異は、ファージゲノムの少なくとも約10,000〜15,000bp、ファージゲノムの少なくとも約20,000〜25,000bp、ファージゲノムの少なくとも約30,000〜35,000bp、ファージゲノムの少なくとも約35,000〜40,000bp、ファージゲノムの少なくとも約45,000〜50,000bp、ファージゲノムの少なくとも約55,000〜60,000bp、ファージゲノムの少なくとも約60,000〜65,000bp、ファージゲノムの少なくとも約65,000〜70,000bpを含む。ファージゲノムの少なくとも約70,000〜75,000bp、ファージゲノムの少なくとも約75,000〜80,000bp、ファージの少なくとも約85,000〜90,000 bp ファージゲノムの少なくとも約90,000〜95,000bp、ファージゲノムの少なくとも約100,000〜110,000bp、ファージゲノムの少なくとも約110,000〜120,000bp、ファージゲノムの少なくとも約120,000〜130,000bp、ファージゲノムの少なくとも約130,000〜140,000bp、ファージゲノムの少なくとも約140,000〜150,000bp、ファージゲノムの少なくとも約150,000〜200,000bp、又はファージゲノムの少なくとも約200,000bp以上である。1つの特定の実施形態において、9687bpのファージゲノムが変異される。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、変異ヌクレオチドは連続している。いくつかの実施形態では、少なくとも約0.1〜約2%、少なくとも約1〜約2%、少なくとも約3〜約4%、少なくとも約3〜約4%、少なくとも約5〜約6%、少なくとも約7〜約6%、少なくとも約7〜約8%、少なくとも約8〜9%、少なくとも約9〜約10%、少なくとも約11〜約12%、少なくとも約13〜約14%、少なくとも約14〜15%、少なくとも約15〜約16,16〜17%、少なくとも約17〜18%、少なくとも約18〜19%、少なくとも約19〜20%、少なくとも約20〜21%、少なくとも約21〜22%、少なくとも約22〜23%、少なくとも約23〜24%、少なくとも約24〜25%、 ファージゲノムの少なくとも約25〜26%、少なくとも約26〜27%、少なくとも約27〜28%、少なくとも約28〜29%、少なくとも約29〜30%が変異される。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約30〜40%が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約40〜50%が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約50〜60%が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約60〜70%が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約70〜80%が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約80〜90%が変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約90〜100%が変異している。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の遺伝子が変異される。いくつかの実施形態では、少なくとも約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、13個の遺伝子が完全にまたは部分的に変異している。一実施形態では、74個の遺伝子が完全にまたは部分的に変異している。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1%〜2%、少なくとも約3%〜4%、少なくとも約4%〜5%、少なくとも約5%〜6%、少なくとも約6%〜7%、少なくとも約7%〜8%、少なくとも約8%〜9%、少なくとも約9%〜10%、少なくとも約10%〜11%、少なくとも約11%〜12%、少なくとも約12%〜13%、少なくとも約13%〜14%、少なくとも約14%〜15%、少なくとも約15%〜16%、少なくとも約16%〜17%、少なくとも約17%〜18%、少なくとも約18%〜19%、少なくとも約19%〜20%、少なくとも約20%〜21%、少なくとも約21%〜22%、少なくとも約22%〜23%である。少なくとも約24%〜約25%、少なくとも約24%〜約25%、少なくとも約25%〜約26%、少なくとも約25%〜約25%、少なくとも約28%〜約29%、少なくとも約30%〜約31%、少なくとも約30%〜約31%、少なくとも約32%〜33%、少なくとも約32%〜約33%、少なくとも約34%〜35%、少なくとも約35%〜36%、少なくとも約36%〜37%、少なくとも約37%〜38%、少なくとも約38%〜39%、少なくとも約39%〜40%、少なくとも約40%〜41%、少なくとも約41%〜42%、少なくとも約42%〜43%、少なくとも約43%〜44%、少なくとも約44%〜45%少なくとも約45%〜約46%、少なくとも約45%〜約49%、少なくとも約50%〜約50%、少なくとも約51%〜約52%、少なくとも約51%〜約52%、少なくとも約53%〜約54%、少なくとも約54%〜55%、少なくとも約55%〜56%、少なくとも約56%〜57%、少なくとも約57%〜58%、少なくとも約58%〜59%、少なくとも約59%〜60%、少なくとも約60%〜61%、少なくとも約61%〜62%、少なくとも約62%〜63%、少なくとも約63%〜64%、少なくとも約64%〜65%、少なくとも約65%〜66%、少なくとも約66%〜67%、約69%〜70%、少なくとも約72%〜71%、少なくとも約72%〜73%、少なくとも約74%〜75%、少なくとも約74%〜75%、少なくとも約75%〜76%、少なくとも約76%〜77%、少なくとも約77%〜78%、少なくとも約78%〜79%、少なくとも約79%〜80%、少なくとも約80%〜81%、少なくとも約81%〜82%、少なくとも約82%〜83%、少なくとも約83%〜84%、少なくとも約84%〜85%、少なくとも約85%〜86%、少なくとも約86%〜87%、少なくとも約87%〜88%、少なくとも約88%〜89%、少なくとも約89%ファージゲノム内の遺伝子の少なくとも約90%〜91%、少なくとも約92%〜90%、少なくとも約92%〜93%、少なくとも約93%〜94%、少なくとも約94%〜95%、少なくとも約95%〜96%、少なくとも約96%〜97%、少なくとも約97%〜98%、少なくとも約98%〜99%、少なくとも約99%〜100%、または少なくとも約100%が完全にまたは部分的に変異している。
いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの開始または5’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がファージゲノムの末端または3’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異はファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態ではファージ遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、突然変異は散在した位置の1つ以上に位置する。
いくつかの実施形態では最適な突然変異、すなわち所望効果を達成するための部位は他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、1つ以上の必須遺伝子を含み得るので、突然変異に適し得る。いくつかの実施形態では調節エレメント(例えば、プロモーター)は変異される。いくつかの実施形態では、コード配列が変異される。いくつかの実施形態では、1つ以上の変異領域が溶解サイクルに必須の1つ以上の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、突然変異が溶解遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上の毒素をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が構造タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がヘッドストラクチャーのポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がテールストラクチャーのポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がカラーストラクチャーのポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がテールタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が外被構造のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上の平板タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異がバクテリオファージの構築に必要な1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のポータルタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異が組換えに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のインテグラーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のインベルターゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のトランスポザーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のプライマーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異がファージインサーションに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が付着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異がパッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、または包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。
いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。
いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。
いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする1つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする3つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする4つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする5つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ包装体に関与するポリペプチドをコードする90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子をコードするポリペプチド、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ包装体、およびそれらの組み合わせ内に位置するか、またはそれらを包含する、少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68。いくつかの実施形態では、突然変異がファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。
欠失
いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約1〜500塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約500〜1000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約2000〜3000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約3000〜4000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約4000〜5000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約5,000〜6,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約6,000〜7,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約7,000〜8,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約8,000〜9,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約9,000〜10,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの少なくとも約10,000〜15,000塩基対を含む。いくつかの実施形態において、1つ以上の欠失は、ファージゲノムの少なくとも約10,000〜15,000bp、ファージゲノムの少なくとも約20,000〜20,000bp、ファージゲノムの少なくとも約25,000〜30,000bp、ファージゲノムの少なくとも約30,000〜35,000bp、ファージゲノムの少なくとも約40,000〜45,000bp、ファージゲノムの少なくとも約45,000〜50,000bp、ファージゲノムの少なくとも約55,000〜60,000bp、ファージゲノムの少なくとも約60,000〜65,000bp、ファージゲノムの少なくとも約65,000〜70,000bpを含む。ファージゲノムの少なくとも約70,000−75,000bp、ファージゲノムの少なくとも約80,000−85,000bp、ファージの少なくとも約85,000−90,000bpファージゲノムの少なくとも約90,000〜95,000bp、ファージゲノムの少なくとも約95,000〜100,000bp、ファージゲノムの少なくとも約100,000〜110,000bp、ファージゲノムの少なくとも約110,000〜120,000bp、ファージゲノムの少なくとも約120,000〜130,000bp、ファージゲノムの少なくとも約130,000〜140,000bp、ファージゲノムの少なくとも約140,000〜150,000bp、ファージゲノムの少なくとも約150,000〜200,000bp、またはファージゲノムの200,000bpを超える。1つの特定の実施形態において、9687bpのファージゲノムが欠失される。いくつかの実施形態では、欠失ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、欠失ヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態では、少なくとも約0.1〜約2%、少なくとも約1〜約2%、少なくとも約3〜約4%、少なくとも約3〜約4%、少なくとも約5〜約6%、少なくとも約7〜約6%、少なくとも約7〜約8%、少なくとも約8〜9%、少なくとも約9〜約10%、少なくとも約11〜約12%、少なくとも約13〜約14%、少なくとも約14〜15%、少なくとも約15〜約16,16〜17%、少なくとも約17〜18%、少なくとも約18〜19%、少なくとも約19〜20%、少なくとも約20〜21%、少なくとも約21〜22%、少なくとも約22〜23%、少なくとも約23〜24%、少なくとも約24〜25%、ファージゲノムの少なくとも約25〜26%、少なくとも約26〜27%、少なくとも約27〜28%、少なくとも約28〜29%、少なくとも約29〜30%が欠失される。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約30〜40%が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約40〜50%が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約50〜60%が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約60〜70%が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約70〜80%が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約80〜90%が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約90〜100%が欠失している。
いくつかの実施形態では、1つ以上の遺伝子がファージゲノム内で部分的にまたは完全に欠失している。いくつかの実施形態では、1つ以上の遺伝子が完全に欠失され、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失される。一実施形態では、ファージゲノム内に1つの欠失が存在し、欠失の末端の1つまたは2つの遺伝子が部分的に欠失され、残りの遺伝子が完全に欠失される。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣り合っている。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣接していない。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の遺伝子が欠失している。いくつかの実施形態では、少なくとも約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、13個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。一実施形態では、74個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、少なくとも約1%〜2%、少なくとも約3%〜4%、少なくとも約4%〜5%、少なくとも約5%〜6%、少なくとも約6%〜7%、少なくとも約7%〜8%、少なくとも約8%〜9%、少なくとも約9%〜10%、少なくとも約10%〜11%、少なくとも約11%〜12%、少なくとも約12%〜13%、少なくとも約13%〜14%、少なくとも約14%〜15%、少なくとも約15%〜16%、少なくとも約16%〜17%、少なくとも約17%〜18%、少なくとも約18%〜19%、少なくとも約19%〜20%、少なくとも約20%〜21%、少なくとも約21%〜22%、少なくとも約22%〜23%である。少なくとも約24%〜約25%、少なくとも約24%〜約25%、少なくとも約25%〜約26%、少なくとも約25%〜約25%、少なくとも約28%〜約29%、少なくとも約30%〜約31%、少なくとも約30%〜約31%、少なくとも約32%〜33%、少なくとも約32%〜約33%、少なくとも約34%〜35%、少なくとも約35%〜36%、少なくとも約36%〜37%、少なくとも約37%〜38%、少なくとも約38%〜39%、少なくとも約39%〜40%、少なくとも約40%〜41%、少なくとも約41%〜42%、少なくとも約42%〜43%、少なくとも約43%〜44%、少なくとも約44%〜45%少なくとも約45%〜約46%、少なくとも約45%〜約49%、少なくとも約50%〜約50%、少なくとも約51%〜約52%、少なくとも約51%〜約52%、少なくとも約53%〜約54%、少なくとも約54%〜55%、少なくとも約55%〜56%、少なくとも約56%〜57%、少なくとも約57%〜58%、少なくとも約58%〜59%、少なくとも約59%〜60%、少なくとも約60%〜61%、少なくとも約61%〜62%、少なくとも約62%〜63%、少なくとも約63%〜64%、少なくとも約64%〜65%、少なくとも約65%〜66%、少なくとも約66%〜67%、約69%〜70%、少なくとも約72%〜71%、少なくとも約72%〜73%、少なくとも約74%〜75%、少なくとも約74%〜75%、少なくとも約75%〜76%、少なくとも約76%〜77%、少なくとも約77%〜78%、少なくとも約78%〜79%、少なくとも約79%〜80%、少なくとも約80%〜81%、少なくとも約81%〜82%、少なくとも約82%〜83%、少なくとも約83%〜84%、少なくとも約84%〜85%、少なくとも約85%〜86%、少なくとも約86%〜87%、少なくとも約87%〜88%、少なくとも約88%〜89%、少なくとも約89%ファージゲノム内の遺伝子の少なくとも約90%〜91%、少なくとも約92%〜90%、少なくとも約92%〜93%、少なくとも約93%〜94%、少なくとも約94%〜95%、少なくとも約95%〜96%、少なくとも約96%〜97%、少なくとも約97%〜98%、少なくとも約98%〜99%、少なくとも約99%〜100%、または少なくとも約100%が完全にまたは部分的に欠失している。
いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの開始または5’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がファージゲノムの末端または3’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失はファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態ではファージ遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、欠失は散在した位置の1つ以上に位置する。
いくつかの実施形態では最適な欠失、すなわち所望効果を達成するための部位は他のファージが他の細菌と相同性を分析することによって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、1つ以上の必須遺伝子を含み得るので、欠失に適し得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが欠失している。いくつかの実施形態では、コード配列が欠失される。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失領域が溶解サイクルに必須の1つ以上の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、欠失が溶解遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上の毒素をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が構造タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がヘッドストラクチャーのポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がテールストラクチャーのポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失がカラーストラクチャーのポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が外被構造のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上の平板タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失がバクテリオファージの構築に必要な1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のポータルタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失が組換えに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のインテグラーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のインベルターゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のトランスポザーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のプライマーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失がファージインサーションに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が付着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失がパッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、または包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。
いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。
いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。
いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする1つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする3つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする4つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする5つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、欠失がファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。
挿入
いくつかの実施形態では、挿入はファージゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、挿入をファージゲノムの調節領域に挿入する。いくつかの実施形態では、挿入物が1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約1〜500塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約500〜1000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約1000〜2000年塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約1000〜2000年塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約2000〜3000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約3000〜4000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約4000〜5000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約5,000〜6,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約6,000〜7,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約7,000〜8,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約8,000〜9,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約9,000〜10,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が少なくとも約10,000〜15,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態において、1つ以上の挿入は、長さが少なくとも約10,000〜15,000bp、長さが少なくとも約20,000〜20,000bp、長さが少なくとも約25,000〜30,000bp、長さが少なくとも約30,000〜35,000bp、長さが少なくとも約40,000〜45,000bp、長さが少なくとも約50,000〜55,000bp、長さが少なくとも約55,000〜60,000bp、長さが少なくとも約60,000〜65,000bp、長さが少なくとも約65,000〜70,000bp、長さが少なくとも約70,000〜75,000bp、長さが少なくとも約75,000〜80,000bp、長さが少なくとも約80,000〜85,000bpを含む。少なくとも約85,000〜90,000bp、少なくとも約95,000〜100,000bp、少なくとも約100,000〜110,000bpの長さ、 長さが少なくとも約110,000〜120,000bp、長さが少なくとも約120,000〜130,000bp、長さが少なくとも約130,000〜140,000bp、長さが少なくとも約140,000〜150,000bp、長さが少なくとも約150,000〜200,000bp、または長さが少なくとも約200,000bpを超える。1つの特定の実施形態において、9687bp長さが挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの1〜500塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約500〜1000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約2000〜3000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約3000〜4000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約4000〜5000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約5,000〜6,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約6,000〜7,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約7,000〜8,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約8,000〜9,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約9,000〜10,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの少なくとも約10,000〜15,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態において、1つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約10,000〜15,000bp、ファージゲノムの少なくとも約20,000〜25,000bp、ファージゲノムの少なくとも約30,000〜35,000bp、ファージゲノムの少なくとも約35,000〜40,000bp、ファージゲノムの少なくとも約45,000〜50,000bp、ファージゲノムの少なくとも約55,000〜60,000bp、ファージゲノムの少なくとも約60,000〜65,000bp、ファージゲノムの少なくとも約65,000〜70,000bp内に位置する。ファージゲノムの少なくとも約70,000〜75,000bp、ファージゲノムの少なくとも約75,000〜80,000bp、少なくとも約85,000〜90,000bpファージゲノム、ファージゲノムの少なくとも約90,000〜95,000bp、ファージゲノムの少なくとも約100,000〜110,000bp、ファージゲノムの少なくとも約110,000〜120,000bp、ファージゲノムの少なくとも約120,000〜130,000bp、ファージゲノムの少なくとも約130,000〜140,000bp、ファージゲノムの少なくとも約140,000〜150,000bp、ファージゲノムの少なくとも約150,000〜200,000bp、又はファージゲノムの少なくとも約200,000bp以上。1つの特定の実施形態において、9687bpのファージゲノムが挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも約0.1〜1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約7〜6%、少なくとも約7〜8%、少なくとも約8%、少なくとも約9〜10%、少なくとも約11〜11%、少なくとも約12〜13%、少なくとも約13〜14%、少なくとも約15〜14%、少なくとも約15〜16〜17%、少なくとも約18〜17%、少なくとも約18〜19%、少なくとも約19〜20%、少なくとも約20〜21%、少なくとも約21〜22%、少なくとも約22〜23%、少なくとも約23〜24%、少なくとも約3〜24%内に位置するファージゲノムの24〜25%、少なくとも約25〜26%、少なくとも約26〜27%、少なくとも約27〜28%、少なくとも約28〜29%、少なくとも約29〜30%。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約30〜40%が挿入される。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約40〜50%内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約50〜60%内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約60〜70%内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約70〜80%内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約80〜90%内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノムの少なくとも約90〜100%内に位置する。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の遺伝子が挿入を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、13個の遺伝子が挿入を含む。一実施形態では、74個の遺伝子が挿入を含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの開始または5’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの末端または3’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がファージゲノムの中央に位置する。いくつかの実施形態ではファージ遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、そして挿入は散在した位置の1つ以上に位置する。
いくつかの実施形態では最適な挿入のための、すなわち所望効果を達成するための部位は他のファージが他の細菌と相同性を分析することによって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、そして1つ以上の必須遺伝子を含み得るので、挿入に適切であり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが挿入される。いくつかの実施形態では、コード配列が挿入される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入された領域が溶解サイクルに必須の1つ以上の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、挿入が溶解遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上の毒素をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が構造タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がヘッドストラクチャーのポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がテールストラクチャーのポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がカラーストラクチャーのポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が外被構造のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上の平板タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がバクテリオファージの構築に必要な1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のポータルタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が組換えに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のインテグラーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のインベルターゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のトランスポザーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のプライマーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージインサーションに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が付着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がパッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする1つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする3つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする4つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする5つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
逆位
いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの調節領域に反転される。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約1〜500塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約500〜1000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約2000〜3000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約3000〜4000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約4000〜5000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約5,000〜6,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約6,000〜7,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約7,000〜8,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約8,000〜9,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約9,000〜10,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約10,000〜15,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約10,000〜15,000bp、少なくとも約20,000〜25,000bp、少なくとも約25,000〜30,000bp、少なくとも約30,000〜35,000bp、少なくとも約40,000〜45,000bp、少なくとも約50,000〜55,000bp、少なくとも約60,000〜65,000bp、少なくとも約65,000〜70,000bp、少なくとも約70,000〜75,000bp、少なくとも約80,000〜85,000bp、少なくとも約85,000〜90,000bp、少なくとも約90,000〜95,000bp、少なくとも約95,000〜100,000bpを含む。少なくとも約100,000〜110,000bp、少なくとも約120,000〜130,000bp、少なくとも約130,000〜140,000bp、少なくとも約140,000〜150,000bp、少なくとも約150,000〜200,000bp、または少なくとも約200,000bp以上。1つの特定の実施形態では、9687bpが逆方向である。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約1〜500塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約500〜1000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約2000〜3000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約3000〜4000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約4000〜5000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約5,000〜6,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約6,000〜7,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約7,000〜8,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約8,000〜9,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約9,000〜10,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの少なくとも約10,000〜15,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態において、1つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約10,000〜15,000bp、ファージゲノムの少なくとも約20,000〜25,000bp、ファージゲノムの少なくとも約25,000〜30,000bp、ファージゲノムの少なくとも約35,000〜40,000bp、ファージゲノムの少なくとも約45,000〜50,000bp、ファージゲノムの少なくとも約55,000〜60,000bp、ファージゲノムの少なくとも約60,000〜65,000bp、ファージゲノムの少なくとも約65,000〜70,000bp内に位置する。ファージゲノムの少なくとも約70,000〜75,000bp、ファージゲノムの少なくとも約75,000〜80,000bp、少なくとも約85,000〜90,000bpファージゲノム、ファージゲノムの少なくとも約90,000〜95,000bp、ファージゲノムの少なくとも約100,000〜110,000bp、ファージゲノムの少なくとも約110,000〜120,000bp、ファージゲノムの少なくとも約120,000〜130,000bp、ファージゲノムの少なくとも約130,000〜140,000bp、ファージゲノムの少なくとも約140,000〜150,000bp、ファージゲノムの少なくとも約150,000〜200,000bp、又はファージゲノムの少なくとも約200,000bp以上。1つの特定の実施形態では、ファージゲノムの9687bpが逆転している。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態において、逆位は、少なくとも約0.1〜1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約7〜6%、少なくとも約7〜8%、少なくとも約8%、少なくとも約9〜10%、少なくとも約11〜11%、少なくとも約11〜12%、少なくとも約13〜14%、少なくとも約15〜14%、少なくとも約15〜16〜17%、少なくとも約18〜17%、少なくとも約18〜19%、少なくとも約19〜20%、少なくとも約20〜21%、少なくとも約21〜22%、少なくとも約22〜23%、少なくとも約23〜24%、少なくとも約3〜24%内に位置する ファージゲノムの24〜25%、少なくとも約25〜26%、少なくとも約26〜27%、少なくとも約27〜28%、少なくとも約28〜29%、少なくとも約29〜30%。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約30〜40%が逆転している。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約40〜50%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約50〜60%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約60〜70%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約70〜80%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約80〜90%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位はファージゲノムの少なくとも約90〜100%内に位置する。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の遺伝子が逆位を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、13個の遺伝子が逆位を含む。一実施形態では、74個の遺伝子が逆位を含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの開始または5’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位がファージゲノムの末端または3’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位はファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態ではファージ遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、逆位は散在した位置の1つ以上に位置する。
いくつかの実施形態では最適な逆位、すなわち所望効果を達成するための部位は他のファージが他の細菌と相同性を分析することによって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、1つ以上の必須遺伝子を含み得るので、逆位に適し得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節要素は逆になっている。いくつかの実施形態では、コード配列は反転している。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆方向領域が溶解サイクルに必須の1つ以上の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、逆位が溶解遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上の毒素をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が構造タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上の平板タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がバクテリオファージの構築に必要な1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のポータルタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が組換えに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のインテグラーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のインベルターゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のトランスポザーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のプライマーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がファージ逆位に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が付着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がパッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする1つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする3つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする4つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする5つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、反転が少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、逆位がファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
置換
いくつかの実施形態では、この置換はファージゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、置換はファージゲノムの調節領域に置換される。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約1〜500塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約500〜1000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約2000〜3000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約3000〜4000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約4000〜5000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約5,000〜6,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約6,000〜7,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約7,000〜8,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約8,000〜9,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約9,000〜10,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約10,000〜15,000塩基対を含む。いくつかの実施形態において、1つ以上の置換は、少なくとも約10,000〜15,000bp、少なくとも約20,000〜25,000bp、少なくとも約25,000〜30,000bp、少なくとも約30,000〜35,000bp、少なくとも約40,000〜45,000bp、少なくとも約50,000〜55,000bp、少なくとも約60,000〜65,000bp、少なくとも約65,000〜70,000bp、少なくとも約70,000〜75,000bp、少なくとも約80,000〜85,000bp、少なくとも約85,000〜90,000bp、少なくとも約90,000〜95,000bp、少なくとも約95,000〜100,000bpを含む。少なくとも約100,000〜110,000bp、少なくとも約120,000〜130,000bp、少なくとも約130,000〜140,000bp、少なくとも約140,000〜150,000bp、少なくとも約150,000〜200,000bp、または少なくとも約200,000bp以上。1つの特定の実施形態では、9687bpが置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、置換ヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの1〜500塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約500〜1000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約2000〜3000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約3000〜4000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約4000〜5000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約5,000〜6,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約6,000〜7,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約7,000〜8,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約8,000〜9,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約9,000〜10,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約10,000〜15,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの少なくとも約10,000〜15,000bp、ファージゲノムの少なくとも約20,000〜25,000bp、ファージゲノムの少なくとも約25,000〜30,000bp、ファージゲノムの少なくとも約30,000〜35,000bp、ファージゲノムの少なくとも約40,000〜45,000bp、ファージゲノムの少なくとも約45,000〜50,000bp、ファージゲノムの少なくとも約50,000〜55,000bp、ファージゲノムの少なくとも約60,000〜65,000bp、ファージゲノムの少なくとも約65,000〜70,000bp内に位置する。ファージゲノムの少なくとも約70,000−75,000bp、ファージゲノムの少なくとも約75,000−80,000bp、ファージゲノムの少なくとも約85,000−90,000 bp ファージゲノムの少なくとも約90,000〜95,000,000bp、ファージゲノムの少なくとも約95,000〜100,000bp、ファージゲノムの少なくとも約100,000〜110,000bp、ファージゲノムの少なくとも約110,000〜120,000bp、ファージゲノムの少なくとも約120,000〜130,000bp、ファージゲノムの少なくとも約130,000〜140,000bp、ファージゲノムの少なくとも約140,000〜150,000bp、ファージゲノムの少なくとも約150,000〜200,000bp、またはファージゲノムの少なくとも約200,000bp以上。1つの特定の実施形態において、9687bpのファージゲノムが置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、置換ヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態において、置換は、少なくとも約0.1〜1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約7〜6%、少なくとも約7〜8%、少なくとも約8%、少なくとも約9〜10%、少なくとも約11〜11%、少なくとも約11〜12%、少なくとも約13〜14%、少なくとも約14〜15%、少なくとも約16〜17%、少なくとも約18〜17%、少なくとも約18〜19%、少なくとも約19〜20%、少なくとも約20〜21%、少なくとも約21〜22%、少なくとも約22〜23%、少なくとも約23〜24%、ファージゲノムの24〜25%、少なくとも約25〜26%、少なくとも約26〜27%、少なくとも約27〜28%、少なくとも約28〜29%、少なくとも約29〜30%。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約30〜40%が置換されている。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約40〜50%内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約50〜60%内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約60〜70%内に位置する。.いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約70〜80%内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約80〜90%内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノムの少なくとも約90〜100%内に位置する。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の遺伝子が置換を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、13個の遺伝子が置換を含む。一実施形態では、74個の遺伝子が置換を含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの開始または5’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの末端または3’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態ではファージ遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、置換は散在した位置のうちの1つ以上に位置する。
いくつかの実施形態では最適な置換のための、すなわち所望効果を達成するための部位は他のファージが他の細菌と相同性を分析することによって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、そして1つ以上の必須遺伝子を含み得るので、置換に適切であり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが置換されている。いくつかの実施形態では、コード配列が置換される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換領域が溶解サイクルに必須の1つ以上の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、置換が溶解遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上の毒素をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が構造タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上の平板タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がバクテリオファージの構築に必要な1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のポータルタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が組換えに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のインテグラーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のインベルターゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のトランスポザーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のプライマーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージ置換に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が付着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がパッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換のうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードするヒンジ内に位置する。
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする1遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする3遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする4つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする5つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノム内のいずれかまたはそれ以上の宿主タンパク質内に位置する。
大腸菌Nissle中のファージ
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が操作された大腸菌株Nissle 1917(大腸菌Nissle)である。本明細書中の実施例により詳細に記載されるように、日常的な試験手順は、エシェリヒア属coli Nissle 1917(Ecoli Nissle; Ecoli Nissle)および関連する操作された誘導体からのバクテリオファージ製造を同定した。バクテリオファージの供給源を決定するために、Ecoli Nissleのゲノムの共同バイオインフォマティクス評価、および遺伝子操作された誘導体を実施して、プロファージのエビデンスについて株のゲノム配列を分析し、機能的ファージを産生する可能性について任意の同定されたプロファージ元素を評価し、任意の機能的ファージ元素を、細菌ゲノム配列の中で同定された他の公知のファージと比較し、そしてプロファージ元素が他の配列決定されたエシェリヒア属coli(Ecoli)ゲノムにおいて見出される周波数を評価した。評価ツールは、ファージ予測ソフトウェア(PHASTおよびPHASTER)、SPAdesゲノムアセンブラソフトウェア、大きな参照ゲノム(BWA MEM)に対する低分岐配列をマッピングするためのソフトウェア、ゲノム配列アラインメントソフトウェア(MUMmer)、およびNational Center for Biotechnology Information(NCBI)非冗長データベースを含んだ。評価結果は、分析された大腸菌Nissleおよび操作された誘導体が3つのプロファージ元素(図1)を含み、3つのうちの2つ(ファージ2およびファージ3)がインタクトファージゲノムに特徴的なほとんどの遺伝的特徴を含むことを示す(図2、図3および図4)。2つの他の可能なファージ元素(図5Aおよび図5B)もまた同定された。注目すべきことに、操作された株は親Ecoli Nissleにおいて同定されなかったさらなるファージ元素を全く含まず、このことはこれらの株によって産生されるプラーク形成ユニットがこれらの内因性ファージの1つに由来することを示す。本明細書中に記載されるさらなる分析は、ファージ3をプラーク形成ファージ(ファージ3)として同定した。興味深いことに、ファージ3はほぼ6000の配列決定された大腸菌ゲノムの集合の中で大腸菌Nissleに独特であるが、他の推定プロファージ元素との相同性の短い領域に限定された関連配列が少数のゲノム中に見出される。実施例においてより詳細に記載されるように、ファージ3は誘導性であるが、他のファージのいずれも誘導性ではなく、誘導に際して細菌溶解を生じることが見出された。
プロファージは大腸菌株の間で非常に一般的であり、大腸菌Nissleは、配列決定された大腸菌ゲノムの十分に特徴付けられたセットにおいて見出される平均数と比較して、比較的少数のプロファージ配列を含む。このように、操作された株におけるプロファージの存在はこの種の自然状態の一部であり、そして分析された操作された株のプロファージの特徴は、前駆体株、大腸菌Nissleと一致した。
表Dは、ファージ3のゲノム内に含まれる遺伝子を列挙する。表E.ファージ3の配列を提供する。表Fは、大腸菌Nissleファージ3に含まれる遺伝子の配列を提供する。表Gは、大腸菌Nissleファージ3のゲノムによってコードされるポリペプチドの配列を提供する。
[表F]大腸菌Nissleのファージ3に含まれる遺伝子の配列
[表G]大腸菌Nissleファージ3のゲノムによってコードされるポリペプチド配列
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載される細菌は、大腸菌のNissleファージ3ゲノム内に1つ以上の改変または突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変がファージ3の特性または挙動を変化させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ3が溶解処理に入るか、または溶解処理を完了することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ3の溶解処理への進入能を低下させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が大腸菌Nissleファージ3が同じまたは異なった型の他の細菌に感染することを妨げる。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異が細菌宿主の適応度を変化させる(例えば、増大または減少させる)。いくつかの実施形態では改変または突然変異が本質的に細菌適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株の適応度と本質的に同じである。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変更、例えば増大または減少させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を改善する。いくつかの実施形態では改変または突然変異がエフェクター機能に本質的に影響を及ぼさず、エフェクター機能は改変または突然変異を伴わない同質遺伝子株のエフェクター機能と本質的に同じである。いくつかの実施形態では、エフェクター回路が最初にゲノム中に操作され、次いでファージが改変される。いくつかの実施形態では、改変されたファージ3を有する新しい筐体がエフェクター機能の操作の前に生成される。
いくつかの実施形態では、細菌が少なくとも約1〜2、少なくとも約2〜3、少なくとも約3〜4、少なくとも約4〜5、少なくとも約5〜6、少なくとも約6〜7、少なくとも約7〜8、少なくとも8〜9、少なくとも9〜10、少なくとも10〜11、少なくとも11〜12、少なくとも13〜14、少なくとも13〜14、少なくとも14〜15、少なくとも15〜16、少なくとも17〜18、少なくとも17〜18、少なくとも19〜20、少なくとも19〜20、少なくとも20〜21、少なくとも21〜22、少なくとも22〜23、少なくとも23〜24、少なくとも24〜25、少なくとも25〜26、少なくとも26〜27、少なくとも27〜28、少なくとも28を含む。少なくとも約30〜約29、少なくとも約30〜約31、少なくとも約30〜約31、少なくとも約32〜約33、少なくとも約34〜約35、少なくとも約36〜約37、少なくとも約38〜39、少なくとも約39〜40、少なくとも約40〜約41、少なくとも41〜42、少なくとも約43〜44、少なくとも約43〜44、少なくとも約45〜46、少なくとも約46〜47、少なくとも約47〜48、少なくとも約47〜48、少なくとも約49〜50、少なくとも約49〜50、少なくとも約50〜51、少なくとも約51〜52、少なくとも約52〜53、少なくとも約53〜54、少なくとも約54〜55、少なくとも約55〜56、少なくとも約56〜57、少なくとも約59〜58、少なくとも約60〜59、少なくとも約61〜60、少なくとも約63、少なくとも約64〜63、少なくとも約64〜65、少なくとも約66〜67、少なくとも約67〜68、少なくとも約69〜70、少なくとも約69〜70、少なくとも約70〜71、少なくとも約72〜73、少なくとも約72〜74、少なくとも約74〜75、少なくとも約76〜77、少なくとも約76〜77、少なくとも約77〜78、少なくとも約77〜78、少なくとも約78〜79、少なくとも約79〜80、少なくとも約80〜81、少なくとも約81〜82、少なくとも約82〜83、少なくとも約83〜84、少なくとも約84〜85、少なくとも約84〜85、少なくとも約86〜87、少なくとも約86〜87、少なくとも約88〜89、少なくとも約88〜89、少なくとも約89〜90、少なくとも約90〜91、少なくとも約91〜92、少なくとも約92〜93、少なくとも約93〜94、少なくとも約94〜95、少なくとも約95〜96、少なくとも約96〜97、少なくとも約97〜98、少なくとも約98〜99、少なくとも約99〜100、または少なくとも約100以上の改変または変異。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ3溶解過程の進入または終了を、少なくとも約1〜2倍、少なくとも約2〜3倍、少なくとも約3〜4倍、少なくとも約4〜5倍、少なくとも約5〜10倍、少なくとも約10〜100倍、少なくとも約100〜1000倍減少させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ3溶解処理の進入または終了を完全に減少させる。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ3溶解処理の進入または終了を、少なくとも約1%〜10%、少なくとも約10%〜20%、少なくとも約20%〜30%、少なくとも約30%〜40%、少なくとも約40%〜50%、少なくとも約50%〜60%、少なくとも約60%〜70%、少なくとも約70%〜80%、少なくとも約80%〜90%、または少なくとも約90%〜100%減少させる。
いくつかの実施形態では、改変または突然変異が大腸菌Nissleファージ3ゲノムが同じまたは異なった他の細菌に、少なくとも約1〜2倍、少なくとも約2〜3倍、少なくとも約3〜4倍、少なくとも約4〜5倍、少なくとも約5〜10倍、少なくとも約10〜100倍、少なくとも約100〜1000倍感染することを防止する。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が大腸菌Nissleファージ3が同じまたは異なった型の他の細菌に完全に感染することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異が大腸菌Nissleファージ3が同じまたは異なる型の他の細菌に、少なくとも約1%〜10%、少なくとも約10%〜20%、少なくとも約20%〜30%、少なくとも約30%〜40%、少なくとも約40%〜50%、少なくとも約50%〜60%、少なくとも約60%〜70%、少なくとも約70%〜80%、少なくとも約80%〜90%、または少なくとも約90%〜100%感染することを防止する。
いくつかの実施形態では、変更または突然変異がファージ変更を有さない同じ同質遺伝子株と比較して、細菌宿主の適応度を、少なくとも約1〜2倍、少なくとも約2〜3倍、少なくとも約3〜4倍、少なくとも約4〜5倍、少なくとも約5〜10倍、少なくとも約10〜100倍、少なくとも約100〜1000倍変化させ、増加させ、または減少させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変を有さない同じ同質遺伝子株と比較して、細菌宿主の適応度を、少なくとも約1%〜10%、少なくとも約10%〜20%、少なくとも約20%〜30%、少なくとも約30%〜40%、少なくとも約40%〜50%、少なくとも約50%〜60%、少なくとも約60%〜70%、少なくとも約70%〜80%、少なくとも約80%〜90%、または少なくとも約90%〜100%変更、増加または低減させる。
いくつかの実施形態では、変更または突然変異がファージ変更を有さない同じ同質遺伝子株と比較して、所望のエフェクター機能(例えば、遺伝子操作された細菌の)を、例えば、少なくとも約1〜2倍、少なくとも約2〜3倍、少なくとも約3〜4倍、少なくとも約4〜5倍、少なくとも約5〜10倍、少なくとも約10〜100倍、少なくとも約100〜1000倍、変化させる(例えば、増加または減少させる)。いくつかの実施形態では、改変または突然変異がファージ改変を伴わない同質遺伝子系統と比較して、遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能、例えば、少なくとも約1%〜10%、少なくとも約10%〜20%、少なくとも約20%〜30%、少なくとも約30%〜40%、少なくとも約40%〜50%、少なくとも約50%〜60%、少なくとも約60%〜70%、少なくとも約70%〜80%、少なくとも約80%〜90%、または少なくとも約90%〜100%を改変する。
いくつかの実施形態では、この突然変異が大腸菌Nissleファージ3ゲノム配列内に1つ以上の欠失を含む。いくつかの実施形態では、この突然変異が大腸菌Nissleファージ3ゲノム配列への1つ以上の挿入を含む。いくつかの実施形態では、抗生物質カセットが大腸菌Nissleファージ3ゲノム配列内の1つ以上の位置に挿入され得る。いくつかの実施形態では、この突然変異が大腸菌Nissleファージ3ゲノム配列内に1つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、この突然変異が大腸菌Nissleファージ3ゲノム配列内に1つ以上の逆位を含む。いくつかの実施形態では、逆位は特異的フリッパーゼによって支配され得る。複数のレベルの制御を含む例示的な回路は本明細書に例示されており、また、同時所有の係属中の国際特許出願PCT/US2016/039434にも記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の改変が1つ以上の大腸菌Nissleファージ3ゲノム遺伝子内の2つ以上の挿入、欠失、置換、または逆位の組み合わせである。
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の遺伝子における1つ以上のフレームシフト突然変異を生じ得る。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の遺伝子における1つ以上のミスセンス突然変異を生じ得る。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の遺伝子における1つ以上のナンセンス突然変異を生じ得る。
いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の改変が1つ以上の大腸菌Nissleファージ3ゲノム遺伝子内の2つ以上のフレームシフト、ナンセンスまたはミスセンス突然変異の組み合わせである。
突然変異
いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約1〜500塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約500〜1000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約1000〜2000年塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約1000〜2000年塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約2000〜3000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約3000〜4000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約4000〜5000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約5,000〜6,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約6,000〜7,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約7,000〜8,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約8,000〜9,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約9,000〜10,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が少なくとも約10,000〜15,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態において、1つ以上の変異は、少なくとも約10,000〜15,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約20,000〜25,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約30,000〜35,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約35,000〜40,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約40,000〜45,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約45,000〜50,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。大腸菌Nissleファージ3ゲノム、または少なくとも約55,000〜60,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム。1つの特定の実施形態では、9687bpの大腸菌(E.coli)Nissleファージ3ゲノムを変異させる。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、変異ヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態では、少なくとも約0.1〜約2%、少なくとも約1〜約2%、少なくとも約3〜約4%、少なくとも約3〜約4%、少なくとも約5〜約6%、少なくとも約7〜約6%、少なくとも約7〜約8%、少なくとも約8〜9%、少なくとも約9〜約10%、少なくとも約11〜約12%、少なくとも約13〜約14%、少なくとも約14〜15%、少なくとも約15〜約16,16〜17%、少なくとも約17〜18%、少なくとも約18〜19%、少なくとも約19〜20%、少なくとも約20〜21%、少なくとも約21〜22%、少なくとも約22〜23%、少なくとも約23〜24%、少なくとも約24〜25%、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約25〜26%、少なくとも約26〜27%、少なくとも約27〜28%、少なくとも約28〜29%、少なくとも約29〜30%が変異される。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約30〜40%が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約40〜50%が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約50〜60%が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約60〜70%が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約70〜80%が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約80〜90%が変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの90〜100%が変異している。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の遺伝子が変異される。いくつかの実施形態では、少なくとも約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、13個の遺伝子が完全にまたは部分的に変異している。一実施形態では、74個の遺伝子が完全にまたは部分的に変異している。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1%〜2%、少なくとも約3%〜4%、少なくとも約4%〜5%、少なくとも約5%〜6%、少なくとも約6%〜7%、少なくとも約7%〜8%、少なくとも約8%〜9%、少なくとも約9%〜10%、少なくとも約10%〜11%、少なくとも約11%〜12%、少なくとも約12%〜13%、少なくとも約13%〜14%、少なくとも約14%〜15%、少なくとも約15%〜16%、少なくとも約16%〜17%、少なくとも約17%〜18%、少なくとも約18%〜19%、少なくとも約19%〜20%、少なくとも約20%〜21%、少なくとも約21%〜22%、少なくとも約22%〜23%である。少なくとも約24%〜約25%、少なくとも約24%〜約25%、少なくとも約25%〜約26%、少なくとも約25%〜約25%、少なくとも約28%〜約29%、少なくとも約30%〜約31%、少なくとも約30%〜約31%、少なくとも約32%〜33%、少なくとも約32%〜約33%、少なくとも約34%〜35%、少なくとも約35%〜36%、少なくとも約36%〜37%、少なくとも約37%〜38%、少なくとも約38%〜39%、少なくとも約39%〜40%、少なくとも約40%〜41%、少なくとも約41%〜42%、少なくとも約42%〜43%、少なくとも約43%〜44%、少なくとも約44%〜45%少なくとも約45%〜約46%、少なくとも約45%〜約49%、少なくとも約50%〜約50%、少なくとも約51%〜約52%、少なくとも約51%〜約52%、少なくとも約53%〜約54%、少なくとも約54%〜55%、少なくとも約55%〜56%、少なくとも約56%〜57%、少なくとも約57%〜58%、少なくとも約58%〜59%、少なくとも約59%〜60%、少なくとも約60%〜61%、少なくとも約61%〜62%、少なくとも約62%〜63%、少なくとも約63%〜64%、少なくとも約64%〜65%、少なくとも約65%〜66%、少なくとも約66%〜67%、約69%〜70%、少なくとも約72%〜71%、少なくとも約72%〜73%、少なくとも約74%〜75%、少なくとも約74%〜75%、少なくとも約75%〜76%、少なくとも約76%〜77%、少なくとも約77%〜78%、少なくとも約78%〜79%、少なくとも約79%〜80%、少なくとも約80%〜81%、少なくとも約81%〜82%、少なくとも約82%〜83%、少なくとも約83%〜84%、少なくとも約84%〜85%、少なくとも約85%〜86%、少なくとも約86%〜87%、少なくとも約87%〜88%、少なくとも約88%〜89%、少なくとも約89%大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の遺伝子の少なくとも約90%〜91%、少なくとも約92%〜90%、少なくとも約91%〜92%、少なくとも約93%、少なくとも約93%〜94%、少なくとも約94%〜95%、少なくとも約95%〜96%、少なくとも約96%〜97%、少なくとも約97%〜98%、少なくとも約98%〜99%、少なくとも約99%〜100%、または少なくとも約100%が完全にまたは部分的に変異している。
いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの開始または5’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの末端または3’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では大腸菌Nissleファージ3遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、突然変異は散在した位置の1つ以上に位置する。
いくつかの実施形態では、突然変異が溶解遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上の毒素をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が構造タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がヘッドタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がテールタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がカラータンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が外被タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上の平板タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異がバクテリオファージの構築に必要な1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のポータルタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異が組換えに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のインテグラーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のインベルターゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のトランスポザーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のプライマーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異がファージインサーションに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が付着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この突然変異がパッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、または包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異が1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。
いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置し、それらを包含しない。
いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置し、それらを包含しない。
いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする1つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする3つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする4つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする5つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7つの遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8つの遺伝子に位置しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9つの遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14の遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、この突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子に位置する。いくつかの実施形態では、突然変異が細胞溶解、ファージ構造、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入に関与するポリペプチドをコードする90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個以上の遺伝子をコードするポリペプチド、およびそれらの組み合わせを少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79。いくつかの実施形態では、この突然変異がファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置し、それらを包含しない。
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10030、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10055、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10085、ECOLIN_10090、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_09965を包含するか、またはECOLIN_09965に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_09970を包含するか、またはECOLIN_09970に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_09975を包含するか、またはECOLIN_09975に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_09980を包含するか、またはECOLIN_09980に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_09985を包含するか、またはECOLIN_09985に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_09990を包含するか、またはECOLIN_09990に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_09995を包含するか、またはECOLIN_09995に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10000を包含するか、またはECOLIN_10000内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10005を包含するか、またはECOLIN_10005内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10010を包含するか、またはECOLIN_10010内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10015を包含するか、またはECOLIN_10015に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10020を包含するか、またはECOLIN_10020内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10025を包含するか、またはECOLIN_10025に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10030を包含するか、またはECOLIN_10030内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10035を包含するか、またはECOLIN_10035に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10040を包含するか、またはECOLIN_10040内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10045を包含するか、またはECOLIN_10045に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_10050を包含するか、またはECOLIN_10050内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10055を包含するか、またはECOLIN_10055に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10065を包含するか、またはECOLIN_10065に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10070を包含するか、またはECOLIN_10070内に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_10075を包含するか、またはECOLIN_10075に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10080を包含するか、またはECOLIN_10080に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10085を包含するか、またはECOLIN_10085に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10090を包含するか、またはECOLIN_10090内に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_10095を包含するか、またはECOLIN_10095に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10100を包含するか、またはECOLIN_10100に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10105を包含するか、またはECOLIN_10105に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10110を包含するか、またはECOLIN_10110内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10115を包含するか、またはECOLIN_10115に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10120を包含するか、またはECOLIN_10120内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10125を包含するか、またはECOLIN_10125内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10130を包含するか、またはECOLIN_10130内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10135を包含するか、またはECOLIN_10135に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10140を包含するか、またはECOLIN_10140内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10145を包含するか、またはECOLIN_10145内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10150を包含するか、またはECOLIN_10150内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10160を包含するか、またはECOLIN_10160内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10165を包含するか、またはECOLIN_10165に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10170を包含するか、またはECOLIN_10170内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10175を包含するか、またはECOLIN_10175内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10180を包含するか、またはECOLIN_10180に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10185を包含するか、またはECOLIN_10185内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10190を包含するか、またはECOLIN_10190内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10195を包含するか、またはECOLIN_10195内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_10200を含むか、またはECOLIN_10200に配置されている。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10205を包含するか、またはECOLIN_10205に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10210を包含するか、またはECOLIN_10210内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10220を包含するか、またはECOLIN_10220内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10225を包含するか、またはECOLIN_10225に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10230を包含するか、またはECOLIN_10230内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10235を包含するか、またはECOLIN_10235に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10240を包含するか、またはECOLIN_10240内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10245を包含するか、またはECOLIN_10245に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10250を包含するか、またはECOLIN_10250内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10255を包含するか、またはECOLIN_10255に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10260を包含するか、またはECOLIN_10260内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10265を包含するか、またはECOLIN_10265に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10270を包含するか、またはECOLIN_10270内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10275を包含するか、またはECOLIN_10275に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10280を包含するか、またはECOLIN_10280に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10290を包含するか、またはECOLIN_10290内に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_10295を包含するか、またはECOLIN_10295に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10300を包含するか、またはECOLIN_10300に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10305を包含するか、またはECOLIN_10305内に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10310を包含するか、またはECOLIN_10310に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10315を包含するか、またはECOLIN_10315に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10320を包含するか、またはECOLIN_10320に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10325を包含するか、またはECOLIN_10325に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10330を包含するか、またはECOLIN_10330に配置される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の突然変異がECOLIN_10335を包含するか、またはECOLIN_10335に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_10340を包含するか、またはECOLIN_10340に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がECOLIN_10345を包含するか、またはECOLIN_10345に位置する。
いくつかの実施形態では、突然変異が脂質A生合成(KDO)2−(ラウロイル)−脂質IVAアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ABCトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ABCトランスポーター膜成分、ATP依存性DNAヘリカーゼRuvB、ATP依存性DNAヘリカーゼRuvA、ホリデイジャンクションレゾルベーゼ、ジヒドロネオプテリン酸ピロホスファターゼ、ヒドロラーゼV、DNAポリメラーゼV、ファージテールタンパク質、宿主特異性タンパク質、ペプチダーゼP60、テールタンパク質、テールタンパク質、マイナーテールタンパク質U、DNA切断再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、DNAパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリンDNAメチラーゼ、セリンプロテアーゼから選択される1つまたは複数のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。抗終結蛋白質、抗リプレッサー、アデニンメチルトランスフェラーゼ、DNAメチルトランスフェラーゼECOLIN_10240、GntRファミリー転写調節因子ECOLIN_10245、cIリプレッサー、機能不明ドメイン(DUF4222);DNAリコンビナーゼ、多重抗生物質耐性調節因子(MarR)、P22のような蛋白質機能不明のタンパク質(DUF550);3’−5’エキソヌクレアーゼ、エクシオナーゼ、インテグラーゼ、およびtRNAメチルトランスフェラーゼ。一実施形態において、1つ以上のマイナーテールタンパク質U、テールタンパク質、DNA破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、キャプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼが変異される。
一実施形態では、突然変異がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分突然変異である。具体的な一実施形態では、突然変異がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分突然変異である。1つの具体的な実施形態では、突然変異がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分突然変異との完全な突然変異である。一実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから変異される。一実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから変異される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
欠失
いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約1〜500塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約500〜1000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約1000〜2000年塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約1000〜2000年塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約2000〜3000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約3000〜4000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約4000〜5000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約5,000〜6,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約6,000〜7,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約7,000〜8,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約8,000〜9,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約9,000〜10,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が少なくとも約10,000〜15,000塩基対の大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。いくつかの実施形態において、1つ以上の欠失は、少なくとも約10,000〜15,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約20,000〜25,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約30,000〜35,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約35,000〜40,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約40,000〜45,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム、少なくとも約50,000〜55,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノムを含む。大腸菌Nissleファージ3ゲノム、または少なくとも約55,000〜60,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム。1つの特定の実施形態では、9687bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノムが欠失される。いくつかの実施形態では、欠失ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、欠失ヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態では、少なくとも約0.1〜約2%、少なくとも約1〜約2%、少なくとも約3〜約4%、少なくとも約3〜約4%、少なくとも約5〜約6%、少なくとも約7〜約6%、少なくとも約7〜約8%、少なくとも約8〜9%、少なくとも約9〜約10%、少なくとも約11〜約12%、少なくとも約13〜約14%、少なくとも約14〜15%、少なくとも約15〜約16,16〜17%、少なくとも約17〜18%、少なくとも約18〜19%、少なくとも約19〜20%、少なくとも約20〜21%、少なくとも約21〜22%、少なくとも約22〜23%、少なくとも約23〜24%、少なくとも約24〜25%、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約25〜26%、少なくとも約26〜27%、少なくとも約27〜28%、少なくとも約28〜29%、少なくとも約29〜30%が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約30〜40%が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージゲノムの少なくとも約40〜50%が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約50〜60%が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージゲノムの少なくとも約60〜70%が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約70〜80%が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約80〜90%が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約90〜100%が欠失している。
いくつかの実施形態では、1つ以上の遺伝子が大腸菌Nissleファージ3ゲノム内で部分的にまたは完全に欠失している。いくつかの実施形態では、1つ以上の遺伝子が完全に欠失され、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失される。一実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内に1つの欠失が存在し、欠失の末端の1つまたは2つの遺伝子が部分的に欠失され、残りの遺伝子が完全に欠失される。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣り合っている。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣接していない。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の遺伝子が欠失している。いくつかの実施形態において、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、13個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。一実施形態では、74個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1%〜2%、少なくとも約3%〜4%、少なくとも約4%〜5%、少なくとも約5%〜6%、少なくとも約6%〜7%、少なくとも約7%〜8%、少なくとも約8%〜9%、少なくとも約9%〜10%、少なくとも約10%〜11%、少なくとも約11%〜12%、少なくとも約12%〜13%、少なくとも約13%〜14%、少なくとも約14%〜15%、少なくとも約15%〜16%、少なくとも約16%〜17%、少なくとも約17%〜18%、少なくとも約18%〜19%、少なくとも約19%〜20%、少なくとも約20%〜21%、少なくとも約21%〜22%、少なくとも約22%〜23%である。少なくとも約24%〜約25%、少なくとも約24%〜約25%、少なくとも約25%〜約26%、少なくとも約25%〜約25%、少なくとも約28%〜約29%、少なくとも約30%〜約31%、少なくとも約30%〜約31%、少なくとも約32%〜33%、少なくとも約32%〜約33%、少なくとも約34%〜35%、少なくとも約35%〜36%、少なくとも約36%〜37%、少なくとも約37%〜38%、少なくとも約38%〜39%、少なくとも約39%〜40%、少なくとも約40%〜41%、少なくとも約41%〜42%、少なくとも約42%〜43%、少なくとも約43%〜44%、少なくとも約44%〜45%少なくとも約45%〜約46%、少なくとも約45%〜約49%、少なくとも約50%〜約50%、少なくとも約51%〜約52%、少なくとも約51%〜約52%、少なくとも約53%〜約54%、少なくとも約54%〜55%、少なくとも約55%〜56%、少なくとも約56%〜57%、少なくとも約57%〜58%、少なくとも約58%〜59%、少なくとも約59%〜60%、少なくとも約60%〜61%、少なくとも約61%〜62%、少なくとも約62%〜63%、少なくとも約63%〜64%、少なくとも約64%〜65%、少なくとも約65%〜66%、少なくとも約66%〜67%、約69%〜70%、少なくとも約72%〜71%、少なくとも約72%〜73%、少なくとも約74%〜75%、少なくとも約74%〜75%、少なくとも約75%〜76%、少なくとも約76%〜77%、少なくとも約77%〜78%、少なくとも約78%〜79%、少なくとも約79%〜80%、少なくとも約80%〜81%、少なくとも約81%〜82%、少なくとも約82%〜83%、少なくとも約83%〜84%、少なくとも約84%〜85%、少なくとも約85%〜86%、少なくとも約86%〜87%、少なくとも約87%〜88%、少なくとも約88%〜89%、少なくとも約89%大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の遺伝子の少なくとも約90%〜91%、少なくとも約92%〜90%、少なくとも約92%〜93%、少なくとも約93%〜94%、少なくとも約94%〜95%、少なくとも約95%〜96%、少なくとも約96%〜97%、少なくとも約97%〜98%、少なくとも約98%〜99%、少なくとも約99%〜100%、または少なくとも約100%が完全にまたは部分的に欠失している。
いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの開始または5’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの末端または3’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では大腸菌Nissleファージ3遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、欠失は散在した位置の1つ以上に位置する。
いくつかの実施形態では最適な欠失、すなわち所望効果を達成するための部位は他の細菌、例えば他の大腸菌株における他のファージとの相同性の分析によって決定することができる。大腸菌Nissleファージ3における相同な保存領域はこれらが保存されており、1つ以上の必須遺伝子を含み得るので、欠失に適し得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが欠失している。いくつかの実施形態では、コード配列が欠失される。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失領域が溶解サイクルに必須の1つ以上の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、欠失が溶解遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上の毒素をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が構造タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のヘッドタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のテールタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のカラータンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上の外被タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上の平板タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失がバクテリオファージの構築に必要な1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のポータルタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失が組換えに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のインテグラーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のインベルターゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のトランスポザーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のプライマーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失がファージ挿入に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が付着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、この欠失がパッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、または包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。
いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置し、それらを包含しない。
いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置し、それらを包含しない。
いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする1つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする3つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする4つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含しない。いくつかの実施形態では、この欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置し、それらを包含しない。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする5つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9つの遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失が少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、欠失がファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10055、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110から選択される1つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10145、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10301、ECOLIN_10325、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345、ECOLIN_10345。
いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09965を包含するか、またはECOLIN_09965に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09970を包含するか、またはECOLIN_09970に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09975を包含するか、またはECOLIN_09975に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09980を包含するか、またはECOLIN_09980に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09985を包含するか、またはECOLIN_09985に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09990を包含するか、またはECOLIN_09990に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09995を包含するか、またはECOLIN_09995に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10000を包含するか、またはECOLIN_10000内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10005を包含するか、またはECOLIN_10005内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10010を包含するか、またはECOLIN_10010内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10015を包含するか、またはECOLIN_10015内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10020を包含するか、またはECOLIN_10020内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10025を包含するか、またはECOLIN_10025内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10030を包含するか、またはECOLIN_10030内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10035を包含するか、またはECOLIN_10035内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10040を包含するか、またはECOLIN_10040内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10045を包含するか、またはECOLIN_10045に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10050を包含するか、またはECOLIN_10050内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10055を包含するか、またはECOLIN_10055内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10065を包含するか、またはECOLIN_10065に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10070を包含するか、またはECOLIN_10070内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10075を包含するか、またはECOLIN_10075に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10080を包含するか、またはECOLIN_10080に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10085を包含するか、またはECOLIN_10085に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10090を包含するか、またはECOLIN_10090に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10095を包含するか、またはECOLIN_10095に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10100を包含するか、またはECOLIN_10100内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10105を包含するか、またはECOLIN_10105内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10110を包含するか、またはECOLIN_10110内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10115を包含するか、またはECOLIN_10115内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10120を包含するか、またはECOLIN_10120内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10125を包含するか、またはECOLIN_10125に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10130を包含するか、またはECOLIN_10130内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10135を包含するか、またはECOLIN_10135内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10140を包含するか、またはECOLIN_10140内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10145を包含するか、またはECOLIN_10145内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10150を包含するか、またはECOLIN_10150内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10160を包含するか、またはECOLIN_10160に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10165を包含するか、またはECOLIN_10165に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10170を包含するか、またはECOLIN_10170内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10175を包含するか、またはECOLIN_10175内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10180を包含するか、またはECOLIN_10180内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10185を包含するか、またはECOLIN_10185に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10190を包含するか、またはECOLIN_10190に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10195を包含するか、またはECOLIN_10195に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10200を包含するか、またはECOLIN_10200内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10205を包含するか、またはECOLIN_10205内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10210を包含するか、またはECOLIN_10210内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10220を包含するか、またはECOLIN_10220内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10225を包含するか、またはECOLIN_10225内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10230を包含するか、またはECOLIN_10230内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10235を包含するか、またはECOLIN_10235内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10240を包含するか、またはECOLIN_10240内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10245を包含するか、またはECOLIN_10245内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10250を包含するか、またはECOLIN_10250に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10255を包含するか、またはECOLIN_10255内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10260を包含するか、またはECOLIN_10260に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10265を包含するか、またはECOLIN_10265内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10270を包含するか、またはECOLIN_10270内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10275を包含するか、またはECOLIN_10275内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10280を包含するか、またはECOLIN_10280内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10290を包含するか、またはECOLIN_10290内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10295を包含するか、またはECOLIN_10295に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の欠失は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10300を包含するか、またはECOLIN_10300に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10305を包含するか、またはECOLIN_10305内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10310を包含するか、またはECOLIN_10310に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10315を包含するか、またはECOLIN_10315内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10320を包含するか、またはECOLIN_10320に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10325を包含するか、またはECOLIN_10325に位置する。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10330を包含するか、またはECOLIN_10330に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10335を包含するか、またはECOLIN_10335に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10340を包含するか、またはECOLIN_10340内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の欠失が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10345を包含するか、またはECOLIN_10345に位置する。
いくつかの実施形態では、突然変異が脂質A生合成(KDO)2−(ラウロイル)−脂質IVAアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ABCトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ABCトランスポーター膜成分、ATP依存性DNAヘリカーゼRuvB、ATP依存性DNAヘリカーゼRuvA、ホリデイジャンクションレゾルベーゼ、ジヒドロネオプテリン酸ピロホスファターゼ、ヒドロラーゼV、DNAポリメラーゼV、ファージテールタンパク質、宿主特異性タンパク質、ペプチダーゼP60、テールタンパク質、テールタンパク質、マイナーテールタンパク質U、DNA切断再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、DNAパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリンDNAメチラーゼ、セリンプロテアーゼから選択される1つまたは複数のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。抗終結蛋白質、抗リプレッサー、アデニンメチルトランスフェラーゼ、DNAメチルトランスフェラーゼECOLIN_10240、GntRファミリー転写調節因子ECOLIN_10245、cIリプレッサー、機能不明ドメイン(DUF4222);DNAリコンビナーゼ、多重抗生物質耐性調節因子(MarR)、P22のような蛋白質機能不明のタンパク質(DUF550);3’−5’エキソヌクレアーゼ、エクシオナーゼ、インテグラーゼ、およびtRNAメチルトランスフェラーゼ。一実施形態において、1つ以上のマイナーテールタンパク質U、テールタンパク質、DNA破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、キャプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼが欠失される。
1つの具体的な実施形態において、マイナーテールタンパク質U、テールタンパク質、DNA破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、キャプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼが欠失される。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。一実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
挿入
いくつかの実施形態では、挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、挿入を、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの調節領域に挿入する。いくつかの実施形態では、挿入されたポリヌクレオチドが1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約1〜500塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約500〜1000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約1000〜2000年塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約1000〜2000年塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約2000〜3000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約3000〜4000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約4000〜5000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約5,000〜6,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約6,000〜7,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約7,000〜8,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約8,000〜9,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約9,000〜10,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドが少なくとも約10,000〜15,000塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態において、1つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、長さが少なくとも約10,000〜15,000bp、長さが少なくとも約20,000〜20,000bp、長さが少なくとも約25,000〜30,000bp、長さが少なくとも約30,000〜35,000bp、長さが少なくとも約40,000〜45,000bp、長さが少なくとも約50,000〜55,000bp、長さが少なくとも約55,000〜60,000bp、長さが少なくとも約60,000〜65,000bp、長さが少なくとも約65,000〜70,000bp、長さが少なくとも約70,000〜75,000bp、長さが少なくとも約75,000〜80,000bp、長さが少なくとも約80,000〜85,000bpを含む。少なくとも約85,000〜90,000bp、少なくとも約90,000〜95,000bp、少なくとも約100,000〜110,000bpの長さ約110,000〜120,000bpの長さ、少なくとも約120,000〜130,000bpの長さ、少なくとも約130,000〜140,000bpの長さ、少なくとも約140,000〜150,000bpの長さ、少なくとも約150,000〜200,000bpの長さ、または少なくとも約200,000bp以上の長さ。1つの特定の実施形態において、少なくとも約9687bpの長さが挿入される。
いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約1〜500塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約500〜1000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約2000〜3000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約3000〜4000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約4000〜5000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約5,000〜6,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約6,000〜7,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約7,000〜8,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約8,000〜9,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約9,000〜10,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約10,000〜15,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約10,000〜15,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約20,000〜25,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約25,000〜30,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約30,000〜35,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約35,000〜40,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約40,000〜45,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約50,000〜55,000bp内に位置する。大腸菌Nissleファージ3ゲノム、または少なくとも約55,000〜60,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム。1つの特定の実施形態では、9687bpの大腸菌(E.coli)Nissleファージ3ゲノムが挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも約0.1〜1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約7〜6%、少なくとも約7〜8%、少なくとも約8%、少なくとも約9〜10%、少なくとも約11〜11%、少なくとも約12〜13%、少なくとも約13〜14%、少なくとも約15〜14%、少なくとも約15〜16〜17%、少なくとも約18〜17%、少なくとも約18〜19%、少なくとも約19〜20%、少なくとも約20〜21%、少なくとも約21〜22%、少なくとも約22〜23%、少なくとも約23〜24%、少なくとも約3〜24%内に位置する大腸菌Nissleファージ3ゲノムの24〜25%、少なくとも約25〜26%、少なくとも約26〜27%、少なくとも約27〜28%、少なくとも約28〜29%、少なくとも約29〜30%。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約30〜40%が挿入される。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約40〜50%内に位置する。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約50〜60%内に位置する。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約60〜70%内に位置する。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約70〜80%内に位置する。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約80〜90%内に位置する。いくつかの実施形態では、この挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約90〜100%内に位置する。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の遺伝子が挿入を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、13個の遺伝子が挿入を含む。一実施形態では、74個の遺伝子が挿入を含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの開始または5’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの末端または3’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、そして挿入は散在した位置の1つ以上に位置する。
いくつかの実施形態では最適な挿入、すなわち所望効果を達成するための部位は他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、そして1つ以上の必須遺伝子を含み得るので、挿入に適切であり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが挿入される。いくつかの実施形態では、コード配列が挿入される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入された領域が溶解サイクルに必須の1つ以上の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、挿入が溶解遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上の毒素をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入が構造タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がヘッドタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がテールタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がカラータンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が外被タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上の平板タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がバクテリオファージの構築に必要な1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のポータルタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が組換えに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のインテグラーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のインベルターゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のトランスポザーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のプライマーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がファージインサーションに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が付着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入がパッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする1つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする3つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする4つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする5つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージ集合、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、挿入がファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、挿入は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。
いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_09965に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_09970に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_09975に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_09980に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_09985に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_09990に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_09995に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10000に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10005に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10010に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10015に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10020に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10025に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10030に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10035に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10040に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10045に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10050に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10055に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10065に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10070に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10075に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10080に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10085に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10090に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10095に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10100に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10105に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10110に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10115に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10120に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10125に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10130に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10135に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10140に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10145に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10150に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10160に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10165に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10170に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10175に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10180に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10185に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10190に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10195に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10200に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10205に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10210に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10220に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10225に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10230に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10235に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10240に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10245に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10250に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10255に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10260に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10265に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10270に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10275に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10280に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10290に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10295に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10300に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10305に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10310に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10315に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10320に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10325に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10330に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10335に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10340に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の挿入がECOLIN_10345に配置される。
いくつかの実施形態では、突然変異が脂質A生合成(KDO)2−(ラウロイル)−脂質IVAアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ABCトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ABCトランスポーター膜成分、ATP依存性DNAヘリカーゼRuvB、ATP依存性DNAヘリカーゼRuvA、ホリデイジャンクションレゾルベーゼ、ジヒドロネオプテリン酸ピロホスファターゼ、ヒドロラーゼV、DNAポリメラーゼV、ファージテールタンパク質、宿主特異性タンパク質、ペプチダーゼP60、テールタンパク質、テールタンパク質、マイナーテールタンパク質U、DNA切断再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、DNAパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリンDNAメチラーゼ、セリンプロテアーゼから選択される1つまたは複数のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。抗終結蛋白質、抗リプレッサー、アデニンメチルトランスフェラーゼ、DNAメチルトランスフェラーゼECOLIN_10240、GntRファミリー転写調節因子ECOLIN_10245、cIリプレッサー、機能不明ドメイン(DUF4222); DNAリコンビナーゼ、多重抗生物質耐性調節因子(MarR)、P22のような蛋白質機能不明のタンパク質(DUF550);3’−5’エキソヌクレアーゼ、エクシオナーゼ、インテグラーゼ、およびtRNAメチルトランスフェラーゼ。一実施形態において、1つ以上のマイナーテールタンパク質U、テールタンパク質、DNA破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、キャプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは、1つ以上の挿入を含む。1つの具体的な実施形態において、マイナーテールタンパク質U、テールタンパク質、DNA破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、キャプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは、1つ以上の挿入を含む。
一実施形態では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数が挿入を含む。
逆位
いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、逆位を大腸菌Nissleファージ3ゲノムの調節領域に逆さまにする。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が1〜500塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約500〜1000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約2000〜3000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約3000〜4000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約4000〜5000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約5,000〜6,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約6,000〜7,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約7,000〜8,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約8,000〜9,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約9,000〜10,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約10,000〜15,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が少なくとも約10,000〜15,000bp、少なくとも約15,000〜20,000bp、少なくとも約20,000〜25,000bp、少なくとも約25,000〜30,000bp、少なくとも約30,000〜35,000bp、少なくとも約35,000〜40,000bp、少なくとも約40,000〜45,000bp、少なくとも約45,000〜50,000bp、少なくとも約50,000〜55,000bp、または少なくとも約55,000〜60,000bpを含む。1つの特定の実施形態では、9687bpが逆方向である。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約1〜500塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約500〜1000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約2000〜3000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約3000〜4000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約4000〜5000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約5,000〜6,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約6,000〜7,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約7,000〜8,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約8,000〜9,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約9,000〜10,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約10,000〜15,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約10,000〜15,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約20,000〜25,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約25,000〜30,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約30,000〜35,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約35,000〜40,000bp、大大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約40,000〜45,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約50,000〜55,000bp内に位置する。大腸菌Nissleファージ3ゲノム、または少なくとも約55,000〜60,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノム。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、逆方向ヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態において、逆位は、少なくとも約0.1〜1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約7〜6%、少なくとも約7〜8%、少なくとも約8%、少なくとも約9〜10%、少なくとも約11〜11%、少なくとも約11〜12%、少なくとも約13〜14%、少なくとも約15〜14%、少なくとも約15〜16〜17%、少なくとも約18〜17%、少なくとも約18〜19%、少なくとも約19〜20%、少なくとも約20〜21%、少なくとも約21〜22%、少なくとも約22〜23%、少なくとも約23〜24%、少なくとも約3〜24%内に位置する大腸菌Nissleファージ3ゲノムの24〜25%、少なくとも約25〜26%、少なくとも約26〜27%、少なくとも約27〜28%、少なくとも約28〜29%、少なくとも約29〜30%。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約30〜40%が逆転している。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約40〜50%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約50〜60%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約60〜70%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約70〜80%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約80〜90%内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約90〜100%内に位置する。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の遺伝子が逆位を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、13個の遺伝子が逆位を含む。一実施形態では、74個の遺伝子が逆位を含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの開始または5’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの末端または3’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では大腸菌Nissleファージ3遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、逆位は散在した位置の1つ以上に位置する。
いくつかの実施形態では最適な逆位、すなわち所望効果を達成するための部位は他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、1つ以上の必須遺伝子を含み得るので、逆位に適し得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節要素は逆になっている。いくつかの実施形態では、コード配列は反転している。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆方向領域が溶解サイクルに必須の1つ以上の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、逆位が溶解遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上の毒素をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が構造タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がヘッドタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がテールタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異がカラータンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、1つ以上の突然変異が外被タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上の平板タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がバクテリオファージの構築に必要な1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のポータルタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が組換えに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のインテグラーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のインベルターゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のトランスポザーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のプライマーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がファージ逆位に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が付着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位がパッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする1つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする3つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする4つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする5つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、反転が少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、逆位がファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、逆位は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10055、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110から選択される1つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10145、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300 ECOLIN_10301、ECOLIN_10325、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345、ECOLIN_10345。
いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09965を包含するか、またはECOLIN_09965に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09970を包含するか、またはECOLIN_09970に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09975を包含するか、またはECOLIN_09975に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09980を包含するか、またはECOLIN_09980に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09985を包含するか、またはECOLIN_09985に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09990を包含するか、またはECOLIN_09990に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_09995を包含するか、またはECOLIN_09995に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10000を包含するか、またはECOLIN_10000内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10005を包含するか、またはECOLIN_10005内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10010を包含するか、またはECOLIN_10010内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10015を包含するか、またはECOLIN_10015内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10020を包含するか、またはECOLIN_10020内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10025を包含するか、またはECOLIN_10025内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10030を包含するか、またはECOLIN_10030内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10035を包含するか、またはECOLIN_10035内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10040を包含するか、またはECOLIN_10040内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10045を包含するか、またはECOLIN_10045に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10050を包含するか、またはECOLIN_10050内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10055を包含するか、またはECOLIN_10055内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10065を包含するか、またはECOLIN_10065に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10070を包含するか、またはECOLIN_10070内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10075を包含するか、またはECOLIN_10075に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10080を包含するか、またはECOLIN_10080に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10085を包含するか、またはECOLIN_10085に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10090を包含するか、またはECOLIN_10090に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10095を包含するか、またはECOLIN_10095に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10100を包含するか、またはECOLIN_10100内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10105を包含するか、またはECOLIN_10105内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10110を包含するか、またはECOLIN_10110内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10115を包含するか、またはECOLIN_10115内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10120を包含するか、またはECOLIN_10120内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10125を包含するか、またはECOLIN_10125に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10130を包含するか、またはECOLIN_10130内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10135を包含するか、またはECOLIN_10135内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10140を包含するか、またはECOLIN_10140内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10145を包含するか、またはECOLIN_10145内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10150を包含するか、またはECOLIN_10150内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10160を包含するか、またはECOLIN_10160に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10165を包含するか、またはECOLIN_10165に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10170を包含するか、またはECOLIN_10170内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10175を包含するか、またはECOLIN_10175内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10180を包含するか、またはECOLIN_10180内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10185を包含するか、またはECOLIN_10185に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10190を包含するか、またはECOLIN_10190に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10195を包含するか、またはECOLIN_10195に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10200を包含するか、またはECOLIN_10200内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10205を包含するか、またはECOLIN_10205内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10210を包含するか、またはECOLIN_10210内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10220を包含するか、またはECOLIN_10220内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10225を包含するか、またはECOLIN_10225内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10230を包含するか、またはECOLIN_10230内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10235を包含するか、またはECOLIN_10235内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10240を包含するか、またはECOLIN_10240内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10245を包含するか、またはECOLIN_10245内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10250を包含するか、またはECOLIN_10250に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10255を包含するか、またはECOLIN_10255内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10260を包含するか、またはECOLIN_10260に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10265を包含するか、またはECOLIN_10265内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10270を包含するか、またはECOLIN_10270内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10275を包含するか、またはECOLIN_10275内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10280を包含するか、またはECOLIN_10280内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10290を包含するか、またはECOLIN_10290内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10295を包含するか、またはECOLIN_10295に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の逆位は(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10300を包含するか、またはECOLIN_10300に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10305を包含するか、またはECOLIN_10305内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10310を包含するか、またはECOLIN_10310に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10315を包含するか、またはECOLIN_10315内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10320を包含するか、またはECOLIN_10320に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10325を包含するか、またはECOLIN_10325に位置する。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10330を包含するか、またはECOLIN_10330に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10335を包含するか、またはECOLIN_10335に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10340を包含するか、またはECOLIN_10340内に位置する。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の逆位が(完全にまたは部分的に)ECOLIN_10345を包含するか、またはECOLIN_10345に位置する。
いくつかの実施形態では、突然変異が脂質A生合成(KDO)2−(ラウロイル)−脂質IVAアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ABCトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ABCトランスポーター膜成分、ATP依存性DNAヘリカーゼRuvB、ATP依存性DNAヘリカーゼRuvA、ホリデイジャンクションレゾルベーゼ、ジヒドロネオプテリン酸ピロホスファターゼ、ヒドロラーゼV、DNAポリメラーゼV、ファージテールタンパク質、宿主特異性タンパク質、ペプチダーゼP60、テールタンパク質、テールタンパク質、マイナーテールタンパク質U、DNA切断再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、DNAパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリンDNAメチラーゼ、セリンプロテアーゼから選択される1つまたは複数のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。抗終結蛋白質、抗リプレッサー、アデニンメチルトランスフェラーゼ、DNAメチルトランスフェラーゼECOLIN_10240、GntRファミリー転写調節因子ECOLIN_10245、cIリプレッサー、機能不明ドメイン(DUF4222);DNAリコンビナーゼ、多重抗生物質耐性調節因子(MarR)、P22のような蛋白質機能不明のタンパク質(DUF550);3’−5’エキソヌクレアーゼ、エクシオナーゼ、インテグラーゼ、およびtRNAメチルトランスフェラーゼ。一実施形態において、1つ以上のマイナーテールタンパク質U、テールタンパク質、DNA破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、キャプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは反転される。1つの具体的な実施形態において、マイナーテールタンパク質U、テールタンパク質、DNA破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、キャプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは反転される。
一実施形態では、逆位がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分逆位である。具体的な一実施形態では、逆位がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分逆位である。1つの具体的な実施形態では、逆位がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分逆位との完全な逆位である。一実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから反転される。一実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから反転される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
置換
いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムのコーディング領域にある。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの調節領域に置換される。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、そしてこのような抗生物質カセットの非限定的な例は、本明細書中に記載される。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約1〜500塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約500〜1000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約1000〜2000年塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約2000〜3000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約3000〜4000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約4000〜5000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約5,000〜6,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約6,000〜7,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約7,000〜8,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約8,000〜9,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約9,000〜10,000塩基対を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が少なくとも約10,000〜15,000塩基対を含む。いくつかの実施形態において、1つ以上の置換は、少なくとも約10,000〜15,000bp、少なくとも約20,000〜25,000bp、少なくとも約25,000〜30,000bp、少なくとも約30,000〜35,000bp、少なくとも約40,000〜45,000bp、少なくとも約50,000〜55,000bp、少なくとも約60,000〜65,000bp、少なくとも約65,000〜70,000bp、少なくとも約70,000〜75,000bp、少なくとも約80,000〜85,000bp、少なくとも約85,000〜90,000bp、少なくとも約90,000〜95,000bp、少なくとも約95,000〜100,000bpを含む。少なくとも約100,000〜110,000bp、少なくとも約120,000〜130,000bp、少なくとも約130,000〜140,000bp、少なくとも約140,000〜150,000bp、少なくとも約150,000〜200,000bp、または少なくとも約200,000bp以上。1つの特定の実施形態では、9687bpが置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、置換ヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの1〜500塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの500〜1000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約1000〜2000年塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約2000〜3000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約3000〜4000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約4000〜5000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約5,000〜6,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約6,000〜7,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約7,000〜8,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約8,000〜9,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約9,000〜10,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約10,000〜15,000塩基対内に位置する。いくつかの実施形態において、1つ以上の置換は、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約10,000〜15,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約20,000〜25,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約25,000〜30,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約30,000〜35,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約35,000〜40,000bp、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約45,000〜50,000bp内に位置する。大腸菌Nissleファージ3ゲノム、または少なくとも約55,000〜60,000bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノムが1つの特定の実施形態において、9687bpの大腸菌Nissleファージ3ゲノムが置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドが散在している。いくつかの実施形態では、置換ヌクレオチドは連続している。
いくつかの実施形態において、置換は、少なくとも約0.1〜1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約7〜6%、少なくとも約7〜8%、少なくとも約8%、少なくとも約9〜10%、少なくとも約11〜11%、少なくとも約11〜12%、少なくとも約13〜14%、少なくとも約14〜15%、少なくとも約16〜17%、少なくとも約18〜17%、少なくとも約18〜19%、少なくとも約19〜20%、少なくとも約20〜21%、少なくとも約21〜22%、少なくとも約22〜23%、少なくとも約23〜24%、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの24〜25%、少なくとも約25〜26%、少なくとも約26〜27%、少なくとも約27〜28%、少なくとも約28〜29%、少なくとも約29〜30%。いくつかの実施形態では、大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約30〜40%が置換されている。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約40〜50%内に位置する。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約50〜60%内に位置する。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約60〜70%内に位置する。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約70〜80%内に位置する。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約80〜90%内に位置する。いくつかの実施形態では、この置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの少なくとも約90〜100%内に位置する。
いくつかの実施形態では、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の遺伝子が置換を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、13個の遺伝子が置換を含む。一実施形態では、74個の遺伝子が置換を含む。
いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの開始または5’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの末端または3’末端に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が大腸菌Nissleファージ3ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では大腸菌Nissleファージ3遺伝子が細菌ゲノム内に散在し、そして置換は散在した位置の1つ以上に位置する。
いくつかの実施形態では最適な置換のための、すなわち所望効果を達成するための部位は他のファージが他の細菌と相同性を分析することによって決定することができる。ファージ中の相同な保存領域はこれらが保存されており、そして1つ以上の必須遺伝子を含み得るので、置換に適切であり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターのような調節エレメントが置換されている。いくつかの実施形態では、コード配列が置換される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換領域が溶解サイクルに必須の1つ以上の遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、置換が溶解遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のプロテアーゼまたはリシンをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上の毒素をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換が構造タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上の平板タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がバクテリオファージの構築に必要な1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のポータルタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が組換えに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のインテグラーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のインベルターゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のトランスポザーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が複製または翻訳に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のプライマーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のtRNA関連タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がファージ置換に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が付着部位をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換がパッケージングに関与する1つ以上のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上のターミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が1つ以上の宿主遺伝子をコードする1つ以上の遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換のうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上に関与する1つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。
いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする1つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする3つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする4つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする2つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする5つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする6つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする7つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする8つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする9つの遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする10個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする11個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする12個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする13個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする14個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする15個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換が少なくとも約16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99。いくつかの実施形態では、置換がファージゲノム内の1つ以上の宿主タンパク質内に位置する。
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、置換は、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_09995、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。
いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_09965に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_09970に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_09975に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_09980に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_09985に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_09990に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_09995に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10000に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10005に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10010に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10015に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10020に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10025に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10030に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10035に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10040に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10045に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10050に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10055に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10065に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10070に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10075に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10080に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10085に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10090に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10095に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10100に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10105に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10110に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10115に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10120に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10125に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10130に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10135に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10140に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10145に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10150に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10160に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10165に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10170に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10175に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10180に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10185に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10190に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10195に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10200に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10205に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10210に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10220に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10225に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10230に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10235に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10240に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10245に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10250に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10255に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10260に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10265に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10270に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10275に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10280に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10290に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10295に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10300に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10305に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10310に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10315に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10320に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10325に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10330に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10335に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10340に配置される。いくつかの実施形態では、1つ以上の置換がECOLIN_10345に配置される。
いくつかの実施形態では、突然変異が脂質A生合成(KDO)2−(ラウロイル)−脂質IVAアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ABCトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ABCトランスポーター膜成分、ATP依存性DNAヘリカーゼRuvB、ATP依存性DNAヘリカーゼRuvA、ホリデイジャンクションレゾルベーゼ、ジヒドロネオプテリン酸ピロホスファターゼ、ヒドロラーゼV、DNAポリメラーゼV、ファージテールタンパク質、宿主特異性タンパク質、ペプチダーゼP60、テールタンパク質、テールタンパク質、マイナーテールタンパク質U、DNA切断再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、DNAパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリンDNAメチラーゼ、セリンプロテアーゼから選択される1つまたは複数のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。抗終結蛋白質、抗リプレッサー、アデニンメチルトランスフェラーゼ、DNAメチルトランスフェラーゼECOLIN_10240、GntRファミリー転写調節因子ECOLIN_10245、cIリプレッサー、機能不明ドメイン(DUF4222);DNAリコンビナーゼ、多重抗生物質耐性調節因子(MarR)、P22のような蛋白質機能不明のタンパク質(DUF550);3’−5’エキソヌクレアーゼ、エクシオナーゼ、インテグラーゼ、およびtRNAメチルトランスフェラーゼ。一実施形態において、1つ以上のマイナーテールタンパク質U、テールタンパク質、DNA破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、キャプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは、1つ以上の置換を含む。1つの具体的な実施形態において、マイナーテールタンパク質U、テールタンパク質、DNA破断−再結合タンパク質、ペプチダーゼS14、キャプシドタンパク質、DNAパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは、1つ以上の置換を含む。
一実施形態では、置換がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全置換または部分置換である。特定の一実施形態では、置換がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な置換である。特定の一実施形態では、置換がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170の完全置換、ならびにECOLIN_10175の部分置換である。一実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから置換される。一実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから置換される。
エフェクター分子およびペイロード発現の調節
いくつかの実施形態では、変異した内因性ファージを含む細菌細胞がペイロードをコードする遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体をさらに含み、その結果、ペイロードは宿主細胞において発現され得、そして宿主細胞はin vitroで(例えば、培地において)および/またはin vivoで(例えば、腫瘍微小環境において)生存および/または増殖し得る。いくつかの実施形態では、細菌セルが2つ以上の別個のペイロードまたはオペロン、例えば、2つ以上のペイロード遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞が3つ以上の異なるトランスポーターまたはオペロン、例えば、3つ以上のペイロード遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞が少なくとも約4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上の異なるペイロードまたはオペロン、例えば、少なくとも約4、5、6、7、8、9、10個、またはそれ以上のペイロード遺伝子を含む。
一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン代謝酵素(PME)をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン代謝酵素(PME)をコードする遺伝子を含み、高フェニルアラニン血症を低減させることができる。
フェニルアラニン代謝酵素の例には、限定されないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)、アミノトランスフェラーゼ、L−アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが含まれる。フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼまたはアミノトランスフェラーゼとの反応は補因子を必要とするが、LAADおよびPALは追加の補因子を全く必要としない。理論に束縛されるものではないが、補因子を必要としないことは、遺伝子操作された細菌によってコードされる酵素によるフェニルアラニン分解が基質の利用可能性に依存し、補因子の利用可能性によって制限されないことを意味する。
いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は1つ以上のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL;EC4.3.1.24)は、L−フェニルアラニンをアンモニアおよびtrans−ケイ皮酸に変換する反応を触媒する酵素である。フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、L−Pheに特異的であり、L−チロシンにはより低い程度で特異的である。PALによって触媒される反応は、trans−ケイ皮酸およびアンモニアを生じるためのL−フェニルアラニンの自然発生する、非酸化的脱アミノ化である。哺乳動物酵素(PAH)と異なり、PALは単量体であり、補因子を必要としない(MacDonaldら、Biochem Cell Biol 2007年;85:273〜82頁. A modern view of phenylalanine ammonia lyase)。微生物において、それは、微生物が唯一の炭素および窒素源としてL−フェニルアラニン(L−Phe)を利用することを可能にする異化作用の役割を有する。一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はPAL遺伝子を含む。PALは、フェニルアラニンを非毒性レベルのtransケイ皮酸およびアンモニアに変換することができる。trans−ケイ皮酸(TCA)は、TCA代謝産物である安息香酸および馬尿酸にさらに変換され得る(Sarkissianら、J Mass Spectrom.2007年6月;42(6):811〜7頁;Quantitation of phenylalanine and its trans−cinnamic,benzoic and hippuric acid metabolites in biological fluids in a single GC−MS analysis)。PAL酵素活性はTHB補因子活性を必要としない。
いくつかの実施形態では、PALは、限定されないが、アクロモバクター・キシロソキシダンス、シュードモナス・アエルギノーザ、フォトラブダス・ルミネセンス、アナベナ・バリアビリス、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンスを含む、細菌種に由来するPAL遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、細菌種はフォトラブダス・ルミネセンスである。いくつかの実施形態では、細菌種は、アナベナ・バリアビリスである。いくつかの実施形態では、PALは、真核生物種、例えば、酵母種、植物種に由来するPAL遺伝子によってコードされる。複数の異なるPALタンパク質が当該分野において公知である。遺伝子操作された細菌は、PAL遺伝子が発現されると、同じ条件下で同じ細菌亜型の非改変細菌より多くのフェニルアラニンを変換する。したがって、PALを含む遺伝子操作された細菌は、PKUを含む、高フェニルアラニン血症に関連する状態を治療するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アナベナ・バリアビリスPAL(「PAL1」)を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フォトラブダス・ルミネセンスPAL(「PAL3」)を発現する。目的のPAL配列の非限定的な例は表2に示される。
いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つまたは複数のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチドおよび1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。LAADは、イミノ酸中間体を介してアンモニアおよび過酸化水素の産生と共に、立体特異的酸化、すなわち酸素を消費する、L−アミノ酸のα−ケト酸への脱アミノ化を触媒する。LAADは、ヘビ毒、および多くの細菌(Bifulcoら、2013年)、具体的にはプロテウス属、プロビデンシア属、およびモルガネラ属の細菌の細胞膜に見出される。LAAD(EC 1.4.3.2)は二量体構造を有するフラビン酵素である。各サブユニットは、非共有結合フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)補因子)を含有し、外部補因子を全く必要としない。プロテウス・ミラビリスは2種類のLAADを含有する(DuerreおよびChakrabarty 1975年)。1つは広範な基質特異性を有し、脂肪族および芳香族L−アミノ酸のケト酸、典型的にはL−フェニルアラニンへの酸化を触媒する(GenBank:U35383.1)(Baekら、Journal of Basic Microbiology 2011年、51、129〜135頁;「Expression and characterization of a second L−amino acid deaminase isolated from Proteus mirabilis in Escherichia coli」)。他の種類は塩基性L−アミノ酸に対して主に作用する(GenBank:EU669819.1)。細菌、真菌、および植物源由来のLAADは、窒素源としてL−アミノ酸(すなわち、酵素活性によって産生されたアンモニア)の利用に関与するように見える。ほとんどの真核生物および原核生物のL−アミノ酸デアミナーゼは、膜結合型であるプロテウス種LAAD由来を除いて、細胞外に分泌される。プロテウス・ミラビリスにおいて、LAADは、酵素活性が存在する周辺質間隙に外側で面している細胞膜に位置することが報告されている(Pelmont Jら、(1972年)「L−amino acid oxidases of Proteus mirabilis:general properties」 Biochimie 54:1359〜1374頁)。
一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はLAAD遺伝子を含む。LAADはフェニルアラニンを非毒性レベルのフェニルピルベートに変換することができ、そのフェニルピルベートはまた、例えば肝臓酵素によってフェニルラクテートにさらに分解され得る。フェニルピルベートは血液脳関門を横切ることができず、LAADにより、別の潜在的に有毒な代謝産物の蓄積を可能にせずに脳内のフェニルアラニンのレベルを低減させることができる。いくつかの実施形態では、LAADは、限定されないが、プロテウス属、プロビデンシア属、およびモルガネラ属の細菌を含む、細菌種に由来するLAAD遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ミラビリスである。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ブルガリスである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はプロテウス・ミラビリスLAAD酵素GenBank:U35383.1を発現する。目的のLAAD配列の非限定的な例は表2に示される。いくつかの実施形態では、LAAD酵素はヘビ毒に由来する。本発明によれば、遺伝子操作された細菌は、LAAD遺伝子が発現されると、同じ条件下で同じ細菌亜型の非改変細菌より多くのフェニルアラニンを変換する。したがって、LAADを含む遺伝子操作された細菌は、PKUを含む高フェニルアラニン血症に関連する状態を治療するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は天然に存在するような野生型酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は野生型配列に対する突然変異を含む酵素をコードする。いくつかの実施形態では、突然変異は酵素の安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、突然変異は酵素の触媒活性を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表2に列挙されたタンパク質の1つまたは複数をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号1〜8のいずれかの配列を含むポリペプチドの1つまたは複数をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号1〜8の配列のいずれかと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、突然変異を含む、表2の1つまたは複数の酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型PAHをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および/または活性を有する突然変異PAHをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型PALをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および/または活性を有する突然変異PALをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型LAADをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および/または活性を有する突然変異LAADをコードする。所望の特性を有する酵素をスクリーニングする方法は、当該分野において公知であり、本明細書に記載される。
PME、例えば、PAL、LAAD、またはPAH遺伝子(群)は、遺伝子操作された細菌におけるプラスミドまたは染色体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、PME遺伝子配列(群)は1つ以上の構成的プロモーター(複数可)の制御下で発現される。いくつかの実施形態では、PME遺伝子は、本明細書に記載されているような外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、PME遺伝子は、哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物の存在下などの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、PME遺伝子は、低酸素、微好気的、または嫌気的条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、PME遺伝子、例えばPAL遺伝子の発現は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素または嫌気的環境下で活性される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチド配列をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチド配列をコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は哺乳動物の消化管内のような低酸素または嫌気性条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は、胃、十二指腸および回腸を含むがそれらに限定されない近位の腸内において見出されるような酸素が供給された状態、低酸素状態、または微好気性状態によって直接的または間接的に誘導される。他の実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPMEポリペプチド配列をコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は、哺乳動物の消化管内に天然に存在する環境因子によって直接的または間接的に誘導される。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、哺乳動物の消化管内に天然には存在しない環境因子、例えばアラビノースまたはIPTGによって直接的または間接的に誘導される1つ以上のPME遺伝子配列をコードする。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、炎症状態下で哺乳類の消化管内に天然に存在する環境因子によって直接的または間接的に誘導される1つ以上のPME遺伝子配列をコードする。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチドをコードする遺伝子配列および1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は同一プロモーターまたは同一プロモーターの異なるコピーの制御下にあって、当該プロモーターは本明細書に記載のいずれかの環境条件および本明細書に記載のいずれかのプロモーターなどの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチドをコードする遺伝子配列および1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は異なるプロモーターの制御下にあって、当該プロモーターは本明細書に記載のいずれかの環境条件および本明細書に記載のいずれかのプロモーターなどの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチドをコードする遺伝子配列および1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチドをコードする遺伝子配列および1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該PAL遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にあり、当該LAAD遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、1つ以上のPALポリペプチドをコードする遺伝子配列および1つ以上のLAADポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該LAAD遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にあり、当該PAL遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にある。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、1つ以上のPheトランスポーターポリペプチドをコードする遺伝子配列をさらに含むことができ、当該遺伝子配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあることができ、Palおよび/またはLAAD遺伝子配列を制御するプロモーターと同じまたは異なるプロモーターであることができる。
他の実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のin vivo投与前に直接的または間接的に誘導される1つまたは複数のPME遺伝子配列をコードする;すなわち、1つ以上のPME遺伝子配列が誘導性プロモーターの制御化で発現し、当該誘導性プロモーターは、フラスコ、発酵槽、または他の培養容器内における細菌増殖中に、細菌の培養物中に与えられる特定の分子もしくは代謝産物、温度、酸素レベル、または他のパラメータに応答する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のin vivo投与前に直接的または間接的に誘導される1つまたは複数のPME遺伝子配列をコードする;1つ以上のPME遺伝子配列は、低酸素または嫌気性条件下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のin vivo投与前に直接的または間接的に誘導される1つまたは複数のPME遺伝子配列をコードする;1つ以上のPME遺伝子配列は好気性条件下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のin vivo投与前に直接的または間接的に誘導される1つまたは複数のPME遺伝子配列をコードする;1つ以上のPME遺伝子配列は、微好気性条件下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のin vivo投与前に直接的または間接的に誘導される1つまたは複数のPME遺伝子配列をコードする;1つ以上のPME遺伝子配列は、アラビノースの存在下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のin vivo投与前に直接的または間接的に誘導される1つまたは複数のPME遺伝子配列をコードする;1つ以上のPME遺伝子配列はIPTGの存在下で発現される。
ペイロード(および/または目的のポリペプチドおよび/または目的のタンパク質および/または治療用ポリペプチドおよび/または治療方法タンパク質および/または治療用ペプチドおよび/またはエフェクターおよび/またはエフェクター分子)は、本明細書に記載の代謝産物のいずれか、および/またはこのようなエフェクター分子の作製または異化のための酵素として機能する酵素またはポリペプチドのいずれかを含む。エフェクター分子およびペイロードには抗癌分子、免疫調節因子,消化管バリアエンハンサー分子、抗炎症分子、満腹分子または神経調節エフェクターが含まれるが、これらに限定されない。ペイロードの非限定的な例は係属中の同時所有国際特許出願PCT/US2016/34200、出願05/25/16、PCT/US2017/013072、出願01/11/2017、PCT/US2017/016603、出願02/04/2016、PCT/US2017/017563、出願02/10/2017、PCT/US2016/044922、出願07/29/016、PCT/US2016/049781、出願08/31/2016、PCT/US2016/37098、出願06/10/16、PCT/US2016/069052、出願12/28/2016、PCT/US2016/32562に記載されている。PCT/US2016/062369(2016年11月16日出願)およびPCT/US2017/013072(これらの含有量は参照により本明細書に援用される)。
本明細書中で使用される場合、「目的の遺伝子」または「目的の遺伝子配列」という語は抗癌分子、免疫調節因子,消化管バリアエンハンサー分子、抗炎症分子、満腹分子またはエフェクター、本明細書中に記載される神経調節分子、例えば、キヌレニナーゼ、トリプトファン産生酵素、トリプトファン分解酵素、1つ以上のキヌレニン産生酵素、セロトニンまたはメラトニン産生または分解酵素、インドール代謝産物産生または分解酵素(本明細書中に記載される)KP代謝産物産生または分解酵素をコードする任意のまたは複数の遺伝子配列および/または遺伝子カセット、ならびに1つ以上のエフェクター分子およびペイロードをコードする任意のまたは複数の遺伝子配列または遺伝子カセットを含むが、これらに限定されない。関心のある追加の遺伝子の非限定的な例は、係属中の同時所有国際特許出願PCT/US2016/34200、出願05/25/16、PCT/US2017/013072、出願01/11/2017、PCT/US2017/016603、出願02/04/2016、PCT/US2017/017563、出願02/10/2017、PCT/US2016/044922、出願07/29/016、PCT/US2016/049781、出願08/31/2016、PCT/US2016/37098、出願06/10/16、PCT/US2016/069052に記載されている。PCT/US2016/32562、PCT/US2016/062369、PCT/US2017/013072全体を参照する。
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が同じペイロード遺伝子の多数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、そして直接的または間接的に誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、そして低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、テトラサイクリンもしくはアラビノース、または本明細書中に記載される別の化学物質もしくは栄養性誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体上に存在し、そして直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体上に存在し、そして構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体中に存在し、そして低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体上に存在し、テトラサイクリンもしくはアラビノース、または本明細書中に記載される別の化学物質もしくは栄養性誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は2つ以上のペイロードを含み、その全てが染色体上に存在する。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌が2つ以上のペイロードを含み、その全ては1つ以上の同じまたは異なったプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は2つ以上のペイロードを含み、そのうちのいくつかは染色体上に存在し、そのうちのいくつかは1つ以上の同じまたは異なったプラスミド上に存在する。
上記の核酸の実施形態のいずれかにおいて、目的のポリぺポリペプチドの組み合わせを産生するための1つ以上のペイロードは、1つ以上の直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、1つ以上のペイロードが外因性環境条件(例えば、消化管、腫瘍微小環境、または他の組織特異的条件において見出される条件)下で誘導される直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、1つ以上のペイロードが消化管、腫瘍微小環境、または他の特異的条件において見出される代謝産物によって誘導される、直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、1つまたは複数のペイロードが低酸素または嫌気性条件下でを誘発する直接的または間接的な誘導性プロモーターに動作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、1つ以上のペイロードが本明細書中に記載されるように、炎症性条件下で誘導される直接的または間接的な誘導性プロモーター(例えば、RNS、ROS)に作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、1つ以上のペイロードが免疫抑制条件下(例えば、本明細書中に記載されるように、腫瘍または他の特異的組織において見出されるよう)で誘導される直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では2つ以上の遺伝子配列が化学物質または栄養性誘導物質への曝露によって誘導される直接的または間接的な誘導性プロモーターに連結され、これはin vivo条件下で存在しても存在しなくてもよく、そしてin vitro条件(株培養、増殖、産生など)、例えばテトラサイクリンまたはアラビノース、または本明細書中に記載される他のもの間に存在してもよい。いくつかの実施形態では、2つ以上のペイロードはすべて構成的プロモーターにリンクされる。
非限定的な例では、遺伝子操作された細菌が2つのペイロードを含むことができ、そのうちの1つは構成的プロモーターにリンクされ、そのうちの1つは直接または間接的に誘導性プロモーターにリンクされる。非限定的な例では、遺伝子操作された細菌が3つのペイロードを含むことができ、そのうちの1つは構成的プロモーターにリンクされ、そのうちの1つは直接的または間接的に誘導性プロモーターにリンクされ、そのうちの1つは第2の別の直接的または間接的に誘導性プロモーターにリンクされる。
いくつかの実施形態では、プロモーターが本明細書中に記載されるように、in vivo状態(例えば、消化管)で誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが本明細書中に記載されるように、in vitro条件(例えば、種々の細胞培養および/または細胞製造条件)下で誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターがin vivo条件(例えば、本明細書中に記載されるような消化管)下、およびin vitro条件(例えば、本明細書中に記載されるような種々の細胞培養および/または細胞産生および/または製造条件)下で誘導される。
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターが外因性環境条件(例えば、in vivoおよび/またはin vitroおよび/または産生/製造条件下)によって直接的に誘導される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターが外因性環境条件(例えば、in vivoおよび/またはin vitroおよび/または作製/製造条件下)によって間接的に誘導される。
いくつかの実施形態では、プロモーターが哺乳動物の消化管に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが腫瘍および/または哺乳動物の小腸の低酸素環境に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが低酸素または嫌気性条件(例えば、腫瘍の低酸素環境および/または哺乳動物の消化管の環境)によって、直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが腫瘍、特定の組織、または哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが細菌と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。
FNR依存性調節
遺伝子操作された細菌は目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含み、ここで、この遺伝子または遺伝子カセットは、外因性環境条件によって制御される直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では誘導性プロモーターは酸素レベル依存性プロモーターであり、目的のポリぺプチドは低酸素、微好気性、または嫌気性条件において発現される。例えば、低酸素状態において、酸素レベル依存性プロモーターは、対応する酸素レベル感知転写因子によって活性化され、それによって、目的のポリぺプチドの作製を駆動する。
細菌は、酸素レベルを検知することができる進化した転写因子を有する。異なるシグナル伝達経路は異なる酸素レベルによって誘発され得、異なる動態を伴って発生する。酸素レベル依存性プロモーターは、1つまたは複数の酸素レベル検知転写因子が結合できる核酸配列であり、対応する転写因子の結合および/または活性化は下流の遺伝子発現を活性化する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酸素レベル依存性プロモーターの制御下でペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。より具体的な態様では、遺伝子操作された細菌は、低酸素環境または嫌気性環境、例えば、腫瘍の低酸素環境および/または哺乳動物の消化管の環境、および/または他の特定の組織などで活性化される酸素レベル依存性プロモーターの制御下でペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。
特定の実施形態では、細菌細胞がフマル酸および硝酸レダクターゼ調節因子(FNR)応答性プロモーターの制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。大腸菌では、FNRが好気性代謝から嫌気性代謝への切り替えを制御する主要な転写活性化因子である(Undenら、1997)。嫌気性では、嫌気性増殖への適応に関与する数百の遺伝子を活性化する活性DNA結合タンパク質に二量体化する。好気状態では、FNRは酸素によって二量体化することが妨げられ、不活性である。FNR応答性プロモーターは以下の表3に列挙されるFNR応答性プロモーターを含むが、これに限定されない。下線を引いた配列は予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クローニングのために使用される制限部位である。
FNRプロモーター配列は当該分野で公知であり、そして任意の本発明FNRプロモーター配列が、遺伝子操作された細菌において使用され得る。任意の適切なFNRプロモーターは、任意の適切なペイロードと組み合わされてもよい。
非限定的なFNRプロモーター配列は、FNR応答性プロモーター配列を含む例示的な調節領域配列の核酸配列を示す表3に提供される。下線を引いた配列は予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列は、クローニングのために使用される制限部位である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌が配列番号:1A、配列番号:2A、配列番号:3A、配列番号:4A、配列番号:5A、配列番号:6A、配列番号:7A、nirB1プロモーター(配列番号:8A)、nirB2プロモーター(配列番号:9A)、nirB3プロモーター(配列番号:10A)、ydfZプロモーター(配列番号:11A)、強力なリボソーム結合部位に融合したnirBプロモーター(配列番号:12A)、強力なリボソーム結合部位に融合したydfZプロモーター(配列番号:13A)、fnrS、嫌気的に誘導された小RNA遺伝子(配列番号:14AまたはfnrS2プロモーター配列番号:15A)、crp結合部位に融合したnirBプロモーター(配列番号:16A)、およびcrp結合部位に融合したfnrS(配列番号:17A)のうちの1つ以上を含む。いくつかの実施形態では、FNR応答性プロモーターが配列番号1A〜17Aのいずれか1つの配列に少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%相同である。
いくつかの実施形態では、複数別個の核酸配列が遺伝子操作された細菌に挿入される。代わりの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が代替酸素レベル依存性プロモーター(例えば、DNR(Trunkら、2010)またはANR(Rayら、1997))の制御下で発現されるペイロード(例えば、PME(例えば、PAL))をコードする遺伝子を含む。これらの実施形態において、ペイロード遺伝子の発現は低酸素または嫌気性環境(例えば、消化管)において特に活性化される。いくつかの実施形態では、遺伝子発現が当該分野で公知の方法によって、例えば、リボソーム結合部位を最適化することおよび/またはmRNA安定性を増加させることによって、さらに最適化される。一実施形態では、哺乳動物の消化管はヒト哺乳動物の消化管である。
任意の適切なFNRプロモーターは、任意の適切なPALと組み合わせることができる。非限定的なFNRプロモーター配列は、表3に提供され、そして非限定的なPAL配列もまた、本明細書中に提供される。いくつかの実施形態では本発明の遺伝子操作された細菌がWO2017087580に開示される以下の配列番号のうちの1つ以上を含み、その含有量はその全体が本明細書中に参考として援用される:配列番号9、配列番号10、nirB1プロモーター(配列番号11)、nirB2プロモーター(配列番号12)、nirB3プロモーター(配列番号13)、ydfZプロモーター(配列番号14)、強力なリボソーム結合部位に融合されたnirBプロモーター(配列番号15)、強力なリボソーム結合部位に融合されたydfZプロモーター(配列番号16)、fnrS、嫌気的に誘導された低分子RNA遺伝子(fnrS1プロモーター配列番号9またはfnrS2プロモーター配列番号17)、crp結合部位に融合されたnirBプロモーター(配列番号18)、およびcrp結合部位に融合されたfnrS(配列番号19)のうちの1つ以上を含む。
別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元の嫌気的調節転写調節因子(ANR)の嫌気性調節の制御下で発現されるペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。シュードモナス・アエルギノーザ(P. aeruginosa)において、ANRは、「酸素制限または嫌気的条件下で誘導可能な生理学的機能の発現に必要とされる」(Wintelerら、1996年;Sawers 1991年)。シュードモナス・アエルギノーザANRは大腸菌FNRと相同であり、「コンセンサスFNR部位(TTGAT−−−−ATCAA)はANRおよびFNRによって効率的に認識された」(Wintelerら、1996年)。FNRと同様に、嫌気的状態において、ANRは嫌気的増殖に対する適応を担う多数の遺伝子を活性化する。好気的状態において、ANRは不活性である。シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringae)、およびシュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina)の全てはANRの機能的類似体を有する(Zimmermannら、1991年)。ANRによって調節されるプロモーター、例えば、arcDABCオペロンのプロモーターは当該分野において公知である(例えば、Hasegawaら、1998年を参照のこと)。
FNRファミリーはまた、「シュードモナス・アエルギノーザの嫌気的硝酸塩呼吸」(Hasegawaら、1998年)のためにANRと併せて必要とされる転写調節因子である、異化型硝酸塩呼吸調節因子(DNR)(Araiら、1995年)も含む。特定の遺伝子について、FNR結合モチーフは、「おそらくDNRによってのみ認識される」(Hasegawaら、1998年)。外因性環境条件および対応する調節領域によって制御される任意の適切な転写調節因子が使用され得る。非限定的な例には、ArcA/B、ResD/E、NreA/B/C、およびAirSRが含まれ、その他は当該分野において公知である。
他の実施形態では、ペイロードを産生するための1つまたは複数の遺伝子配列(例えば、PALなどのPME)は、転写活性化因子、例えばCRPについての結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現される。CRP(環状AMP受容体タンパク質またはカタボライト活性化タンパク質すなわちCAP)は、グルコースなどの急速に代謝可能な炭水化物が存在する場合、あまり有益ではない炭素源の取り込み、代謝、および同化を担う遺伝子を抑制することによって細菌において主要な調節的役割を果たす(Wuら、2015年)。グルコースに対するこの選好性は、グルコース抑制、および炭素カタボライト抑制と呼ばれている(Deutscher、2008年;GorkeおよびStulke、2008年)。いくつかの実施形態では、ペイロード分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、CRP結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ペイロードのための1つまたは複数の遺伝子配列は、CRP結合部位に融合したFNRプロモーターによって制御される。これらの実施形態では、環状AMPは、グルコースが環境中に存在しない場合にCRPに結合する。この結合により、CRPの立体配座変化が引き起こされ、CRPがその結合部位に強く結合することを可能にする。次いで、CRP結合は、直接的タンパク質間相互作用を介してFNRプロモーターに対してRNAポリメラーゼを動員することにより、遺伝子または遺伝子カセットの転写を活性化する。グルコースの存在下で、環状AMPはCRPに結合せず、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットの転写が抑制される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子についての結合部位に融合した酸素レベル依存性プロモーター(例えば、FNRプロモーター)は、例えば、グルコースをin vitroで増殖培地に添加することによって十分な量のグルコースが存在する場合に、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが嫌気的条件下で発現されないこと確実にするために使用される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が細菌の種々の種、株、または亜株由来の酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が細菌の種々の種、株、または亜株由来の酸素レベル感知転写因子、例えば、FNR、ANRまたはDNRを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が細菌の異なった種、株、または亜株からの酸素レベル感知転写因子および対応するプロモーターを含む。異種酸素量依存性転写調節因子および/またはプロモーターは同じ条件下での細菌中の天然遺伝子およびプロモーターと比較して、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子(例えば、低酸素または嫌気性環境中でペイロードを産生するための1つ以上の遺伝子配列)の転写を増加させる。特定の実施形態では、非天然酸素量依存性転写調節因子がNgonorrhoeae由来のFNRタンパク質である(例えば、Isabellaら、2011を参照のこと)。いくつかの実施形態では、対応する野生型転写調節因子は無傷のままであり、野生型活性を保持する。代わりの実施形態では、対応する野生型転写調節因子を欠失または変異させて、野生型活性を減少または排除する。
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が野生型酸素量依存性転写調節因子(例えば、FNR、ANR、またはDNR)、および同じ亜型の細菌由来の野生型プロモーターと比較して変異した対応するプロモーターを含む。変異プロモーターは同じ条件下で野生型プロモーターと比較して、低酸素または嫌気性環境において、野生型転写調節因子への結合を増強し、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子(例えば、ペイロードをコードする遺伝子)の転写を増加させる。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が野生型酸素量依存性プロモーター(例えば、FNR、ANR、またはDNRプロモーター)、および同じ亜型の細菌由来の野生型転写調節因子と比較して変異した対応する転写調節因子を含む。変異転写調節因子は同じ条件下で野生型転写調節因子と比較して、低酸素または嫌気性環境において、野生型プロモーターへの結合を増強し、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子(例えば、ペイロードをコードする遺伝子)の転写を増加させる。特定の実施形態では、変異体酸素レベル依存性転写調節因子が二量化およびFNR活性を増強するアミノ酸置換を含むFNRタンパク質である(例えば、Mooreら、(2006)を参照のこと)。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子および対応するプロモーターの両方を、低酸素条件中のペイロードの発現を増大させるために、同じ亜型の細菌由来の野生型配列に対して変異させる。
いくつかの実施形態では、細菌細胞が酸素レベル感知転写調節因子をコードする内因性遺伝子(例えば、FNR遺伝子)の多数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子はプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子が種々のプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子が同じプラスミド上に存在する。
いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子が種々の染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子およびペイロードをコードする遺伝子が同じ染色体上に存在する。場合によっては、発現安定性を高めるために、誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル感知転写調節因子を発現させることが有益であり得る。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現がペイロードをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは別のプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現がペイロードの発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子およびペイロードがプロモーター領域から分岐して転写される。
酸素レベル非依存性誘導性プロモーター
FNRS24Yを含むシステムなどの酸素レベル非依存性誘導性プロモーターシステムはPCT/US2016/062369(2016年11月16日出願、WO2017087580として公開)に記載されており、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
酸素レベルに応答して誘導されるプロモーターに加えて、PME遺伝子および/またはPheトランスポーター遺伝子は、反応性窒素種の存在下または反応性酸素種の存在下などの炎症状態に応答して誘導されるプロモーターによって調節することができる。そのような誘導性プロモーターの例は共同出願中の国際出願PCT/US2016/050836、2016年9月8日に提出されたものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、酸素独立プロモーターの制御下で1つ以上のPMEおよび/または1つ以上のpheトランスポーターを含む遺伝子操作された細菌物は、1つ以上のバクテリオファージをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージがバクテリオファージゲノム内の1つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、1つ以上のバクテリオファージ遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。
いくつかの実施形態ではのいくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が1つ以上の大腸菌を含み、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10090、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120から選択される1つ以上の遺伝子を含む。ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10325、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失を含む。ファージ3ゲノム。一実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
RNS依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝的に操作されたウイルスが誘導性プロモーターの制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、炎症状態によって活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルス。一実施形態において、ペイロードを産生するための遺伝子は炎症性環境(例えば、反応性窒素種またはRNSプロモーター)において活性化される炎症性依存性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも1つの反応性窒素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域を含む。好適なRNS誘導性プロモーター(例えば、反応性窒素種によって誘導可能)は国際特許出願PCT/US2016/062369(出願11/16/2016)に記載され、WO2017087580(公開WO2017/123675)として公開され、その含有量はその全体が本明細書中に参考として援用される。
ROS依存性調節
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルスが誘導性プロモーターの制御下で発現されるペイロードを産生するための遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞障害の条件下で活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルス。一実施形態において、ペイロードを産生するための遺伝子は細胞または組織損傷が存在する環境(例えば、反応性酸素種またはROSプロモーター)において活性化される細胞損傷依存性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が少なくとも1つの反応性酸素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域を含む。適当なROS誘導性プロモーター、例えば、反応性酸素種による誘導性は、国際特許出願PCT/US2017/013072、出願01/11/2017、WO2017/123675、国際特許出願PCT/US2016/032562、出願−5/13/2016、WO2016183531として公開され、PCT/US2016/062369、出願11/16/2016として公開され、WO2017087580として公開されている。
[表17]例示的なOxyRにより調節される調節領域のヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、調節領域配列が配列番号18C、配列番号19C、配列番号20C、および/または配列番号21Cの配列に少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%相同である。
プロピオナートおよび他のプロモーター
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が環境(例えば、腫瘍微小環境、特定の組織、または哺乳動物の消化管)における特定の分子または代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される1つ以上のペイロード遺伝子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。例えば、短鎖脂肪酸プロピオネートは消化管に局在する主要な微生物発酵代謝産物である(Hosseiniら、2011)。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセッテがプロピオン酸誘導性プロモーターの制御下にある。より具体的な実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセッテが哺乳動物の消化管中のプロピオン酸の存在によって活性化されるプロピオン酸誘導性プロモーターの制御下にある。健康および/または疾患で哺乳動物の消化管中に見出される任意の分子または代謝産物が、ペイロード発現を誘導するために使用され得る。誘導物質の非限定的な例としては、プロピオン酸塩、ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血中凝固因子II、VII、IX、およびX、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファフェトプロテイン、抗ミトコンドリア、平滑筋肉、および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン、アンモニア、およびマンガンが挙げられる。代わりの実施形態では、治療用ポリペプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが糖アラビノースの存在下で活性化されるpAraBADプロモーターの制御下にある。
いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットがプラスミド上に存在し、そして低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが染色体中に存在し、そして低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットがプラスミド上に存在し、そして腫瘍および/または哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが染色体上に存在し、そして腫瘍および/または哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが染色体上に存在し、そしてテトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットがプラスミド上に存在し、そしてテトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、遺伝子発現が当該分野で公知の方法によって、例えば、リボソーム結合部位(RBS)を最適化すること、転写調節因子を操作すること、および/またはmRNA安定性を増加させることによって、さらに最適化される。RBSの微調整および最適化のためのバイオインフォマティクスツールは、当技術分野で知られている。
本明細書中上記(および本明細書中の他の場所)に記載される実施形態のいずれかにおいて、操作された細菌は、本明細書中に議論されるプロモーターのいずれかの制御下で、1つ以上の遺伝子配列をコードする遺伝子配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が目的のポリペプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、その結果、この遺伝子または遺伝子カセットは宿主細胞において発現され得、そしてこの宿主細胞はin vitroで(例えば、培地において)および/またはin vivoで(例えば、消化管または腫瘍微小環境において)生存および/または成長し得る。いくつかの実施形態では、細菌が目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットの多数のコピーを含み得る。ペイロードを産生するためのいくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子カセッテが低コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドが発現の安定性を増加させるために有効であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドが非誘導条件下で漏出発現を減少させるのに有効であり得る。目的のポリぺプチドを産生するためのいくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子カセットが高コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドが遺伝子または遺伝子カセット発現を増加させるのに役立ち得る。目的のポリぺプチドを産生するためのいくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子カセットが染色体上で発現される。
他の誘導性プロモーター
いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、そして1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする遺伝子が染色体中に存在し、そして1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、細菌細胞が目的のポリペプチドをコードする、1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導可能な、1つ以上の遺伝子配列を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、その結果、目的のポリペプチドが宿主細胞中で発現され得、そして宿主細胞はin vitroで(例えば、培地中で、および/またはin vivoで(例えば、腫瘍中で、または消化管中で)生存および/または成長し得る。いくつかの実施形態では細菌細胞が目的のポリぺプチドをコードする1つ以上の遺伝子配列の2つ以上の異なるコピーを含み、これはプロモーター誘導性の1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって制御される。いくつかの実施形態ではこの遺伝子操作された細菌が目的のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子配列の多数のコピーを含み、これは1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導可能なプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする1つ以上の遺伝子配列がプラスミド上に存在し、そして1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導可能な直接的または間接的な誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする1つ以上の遺伝子配列が染色体上に存在し、そして直接的または間接的に誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする1つ以上の遺伝子配列が1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導される。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される目的のポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子配列がプラスミド上に存在し、そして1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって直接的または間接的に誘導可能なプロモーターaに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、細菌細胞が目的のポリペプチドが宿主細胞において発現され得るように、1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導される、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含み、そして宿主細胞はin vitroで(例えば、培養条件下で、および/またはin vivoで(例えば、消化管または腫瘍微小環境において)生存および/または増殖することができる。いくつかの実施形態では細菌細胞が目的のポリぺプチドの産生のための2つ以上の遺伝子配列を含み、そのうちの1つ以上は1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導される。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導される、目的のポリぺポリペプチドの産生のための同じ遺伝子配列の多数のコピーを含む。いくつかの実施形態ではこの遺伝子操作された細菌が目的のポリペプチドの製造のための種々の遺伝子配列の多数のコピーを含み、そのうちの1つ以上は1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導される。
いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドの製造のための遺伝子配列がプラスミド上に存在し、そして1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドの製造のための遺伝子配列が染色体中に存在し、そして1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は2つ以上の異なるPAL遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は同じPAL遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子はプラスミド上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子はプラスミド上に存在し、低酸素または嫌気条的件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子は染色体上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子は染色体に存在し、低酸素または嫌気的条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子はプラスミド上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子はプラスミド上に存在し、IPTGまたは別のLacI誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子はプラスミド上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子はプラスミド上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子は染色体上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子は染色体上に存在し、IPTGまたは別のLacI誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子は染色体上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子は染色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、PAL遺伝子は染色体上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、LAADが宿主細胞において発現され得、宿主細胞がin vitro、例えば培地中、および/またはin vivo、例えば消化管中で生存および/または増殖できるように、LAAD遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は2つ以上の異なるLAAD遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は同じLAAD遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、例えばアラビノースまたはテトラサイクリンによって誘導可能であるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体に存在し、例えばアラビノースまたはテトラサイクリンによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、IPTGまたは他のLacI誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体上に存在し、IPTGまたは他のLacI誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結している。いくつかの実施形態では、LAAD遺伝子は染色体上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結している。
PME遺伝子(例えば、PAL、PAH、および/またはLAAD)を含む細菌のこれらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、1つ以上のPheトランスポーターをコードする遺伝子配列をさらに含むことができ、当該Pheトランスポーター遺伝子配列はプラスミドまたは染色体上に存在することができる。当該プラスミドまたは染色体は、PME遺伝子の存在するものとは、同一または異なりることができる。Pheトランスポーター遺伝子配列は、PMR遺伝子配列と同一または異なるプロモーターの制御下にあり得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、FNR、ANR、またはDNR、および異なる細菌種由来の対応するプロモーターを含む。非天然の酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、前記プロモーターに作動可能に連結している遺伝子、例えばPALまたはPAHの転写を、低酸素または嫌気的環境において、同じ条件下の細菌における天然の転写調節因子およびプロモーターと比較して増加させる。非天然の酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、前記プロモーターに作動可能に連結している遺伝子、例えばPALまたはPAHの転写を、低酸素または嫌気的環境において、同じ条件下の野生型プロモーターと比較して増加させる。非天然の酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、前記プロモーターに作動可能に連結している遺伝子、例えばPALまたはPAHの転写を、低酸素または嫌気的環境において、同じ条件下の野生型転写調節因子と比較して増加させる。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、酸素レベル検知転写調節因子をコードする内因性遺伝子、例えばFNR遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子はプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびPALをコードする遺伝子は異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびPALをコードする遺伝子は同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびPALをコードする遺伝子は異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル検知転写調節因子をコードする遺伝子およびPALをコードする遺伝子は同じ染色体上に存在する。
一実施形態において、LAAD発現は、ParaBADpromoterの制御下にある。一実施形態では、LAAD発現が好気性または微好気性条件下で起こる。一実施形態において、PAL発現は、ParaBADpromoterの制御下にある。一実施形態では、PAL発現が好気性または微好気性条件下で起こる。一実施形態ではPAL発現が嫌気性または低酸素条件下で起こり、LADD発現は好気性または微好気性条件下で起こる。一実施形態において、PAL発現は嫌気性または低酸素条件下で生じ、LADD発現はParaBADプロモーターの制御下である。
いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチド(例えば、PALおよびLAAD遺伝子)を産生するための1つ以上の遺伝子または遺伝子カセットが存在し、そして各々の遺伝子は種々のプロモーター(例えば、この段落および本明細書中の他の箇所において議論されるプロモーターのいずれか)の制御下で発現される。
いくつかの実施形態では1つ以上のPME遺伝子(例えば、PALおよび/またはLAAD遺伝子)はアラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では1つ以上のPME遺伝子(例えば、PALおよび/またはLAAD遺伝子)はIPTGまたは他のLacI誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では1つ以上のPME遺伝子(例えば、PALおよび/またはLAAD遺伝子)はラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では1つ以上のPME遺伝子(例えば、PALおよび/またはLAAD遺伝子)は非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。
いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターが1つ以上の栄養および/または化学的誘導物質および/または代謝産物によって直接的または間接的に誘導される。
いくつかの実施形態では、1つ以上の誘導性プロモーターが目的の1つ以上のタンパク質のin vivo発現のために有益であるか、またはin vivo発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターが1つ以上の抗癌、満腹、消化管障壁向上剤、免疫調節および/または神経調節分子および/または目的の他のポリペプチドのin vivo発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のポリペプチドおよび/または目的の他のポリペプチドの発現がin vivoで1つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターが遺伝子操作された細菌と同時投与される化学物質および/または栄養性誘導物質および/または代謝産物によって直接的または間接的に誘導される。
目的の1つ以上のポリペプチドおよび/または目的の他のポリペプチドのいくつかの実施形態では、発現はin vivo投与前の株のin vitro増殖、調製、または製造の間に、化学的および/または栄養性誘導物質および/または代謝産物によって誘導される1つ以上のプロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、化学物質および/または栄養性誘導物質および/または代謝産物によって誘導されるプロモーターが培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化,剤型、および/または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、プロモーターが発現を誘導し、そして投与の前に目的のポリペプチドおよび/または他の目的のポリペプチドを細菌にプレロードするために、細菌培養物中に添加される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、化学物質および/または栄養性誘導物質および/または代謝産物によって誘導される培養物を好気的に増殖させる。いくつかの実施形態では、化学物質および/または栄養性誘導物質および/または代謝産物によって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
アラビノース代謝の遺伝子は、PAraBADプロモーターによって制御される1つのオペロン、AraBADにおいて組織化される。PAraBAD(またはPara)プロモーターは、誘導性発現系の基準を適切に満たす。PAraBADは多くの他の系よりも、ペイロード遺伝子発現の厳密な制御を示すが、これはおそらく、誘導物質およびリプレッサーの両方として機能するAraCの二重調節のためである。さらに、ParaBADベースの発現のレベルは、幅広いL−アラビノース濃度にわたって、微調整する発現レベルの積載量に調節することができる。しかし、サブ飽和L−アラビノース濃度に曝露された細胞集団は誘導細胞および非誘導細胞の2つの亜集団に分けられ、これは、L−アラビノーストランスポーターの利用能における個々の細胞間の差異によって決定される(Zhangら、Development and Application of an Arabinose−Inducible Expression System by Facilitating誘導物質Uptake in Corynebacterium glutamicum; Appl.Environ.Microbiol.2012年8月、第78巻、第16 5831−5838号)。あるいは、ParaBadからの誘導性発現が本明細書中に記載されるように、リボソーム結合部位(RBS)の最適化を通して制御または微調整され得る。
一実施形態において、目的の1つ以上のポリペプチド(例えば、1つ以上の治療用ポリペプチド)の発現は、1つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。
いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターが目的の1つ以上のタンパク質のin vivo発現のために有益であるか、またはその間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質の発現がin vivoで1つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターがアラビノースなどの遺伝子操作された細菌と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。
いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質の発現がin vivo投与前の株のin vitro増殖、調製、または製造の間に、1つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターが培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化,剤型、および/または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、プロモーターが細菌培養物中に添加されて発現を誘導し、投与前に細菌にペイロード(例えば、アラビノース)をプレロードする分子によって、直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、アラビノースによって誘導される培養物を好気的に増殖させる。いくつかの実施形態では、アラビノースによって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
一実施形態において、アラビノース誘導性プロモーターは第2のプロモーター(例えば、第2の構成的または誘導性プロモーター)と一緒に、目的の1つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では2つのプロモーターが構築物の近位に配置され、そしてその発現を駆動し、ここで、アラビノース誘導性プロモーターは第1のセットの外因性の条件下で発現を駆動し、そして第2のプロモーターは第2のセットの外因性の条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第1および第2の条件が2つの連続した培養条件(すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器(例えば、アラビノースおよびIPTG)中での培養物の調製の間)であり得る。別の非限定的な例では、第1の誘導条件が例えばアラビノース存在を含む培養条件であってもよく、第2の誘導条件はin vivo条件であってもよい。このようなin vivo条件には、低酸素、微好気性、または嫌気性条件、消化管代謝産物の存在、および/または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上のアラビノースプロモーターが同じ遺伝子配列の発現を駆動するFNRプロモーターと組み合わされて、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。
いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターが本明細書に記載される低コピープラスミドもしくは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターが細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質がアラビノースオペロンにノックインされ、そして天然のアラビノース誘導性プロモーターによって駆動される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号23の配列のいずれかと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性構築物が目的の1つ以上のタンパク質と同じプロモーターから分岐して転写されるAraCをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号24の配列のいずれかと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号25の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がラムノース誘導系を介して誘導可能な1つ以上の遺伝子配列を含む。遺伝子rhaBADは、rhaP BADプロモーターによって制御される1つのオペロンに組織化される。rhaP BADプロモーターは2つの活性化因子、RhaSおよびRhaRによって調節され、対応する遺伝子はrhaBADの逆方向に分岐転写される1つの転写ユニットに属する。L−ラムノースの存在下で、RhaRはrhaP RSプロモーターに結合し、RhaRおよびRhaSの産生を活性化する。次いで、RhaSはL−ラムノースと共にrhaP BADおよびrhaP Tプロモーターに結合し、構造遺伝子の転写を活性化する。アラビノースシステムとは対照的に、アラビノースシステムではAraCが提供され、遺伝子配列において多様に転写されるが、染色体から発現される量は多コピープラスミド上でさえ転写を活性化するのに充分であるため、ラムノース発現システムにおいて調節タンパク質をより大量に発現させる必要はない。従って、rhaP BADプロモーターのみが、発現されるべき遺伝子の上流にクローニングされる。rhaBAD転写の完全な誘導はまた、カタボリット抑止の重要な調節因子であるCRP−cAMP複合体の拘束を必要とする。あるいは、rhaBADからの誘導性発現が本明細書に記載されるように、リボソーム結合部位(RBS)の最適化によって制御または微調整することができる。一実施形態において、目的の1つ以上のタンパク質の発現は、1つ以上のラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。一実施形態では、積載量の発現がラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。
いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターが目的の1つ以上のタンパク質のin vivo発現のために有益であるか、またはin vivo発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質の発現がin vivoで1つ以上のラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターが、遺伝子操作された細菌と同時投与される分子(例えば、ラムノース)によって直接的または間接的に誘導される。
いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質の発現がin vivo投与前の株のin vitro増殖、調製、または製造の間に、1つ以上のラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターが培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化,剤型、および/または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、プロモーターが細菌培養物中に添加されて発現を誘導し、投与前に細菌にペイロード(例えば、ラムノース)をプレロードする分子によって、直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、ラムノースによって誘導される培養物が無菌的に増殖される。いくつかの実施形態では、ラムノースによって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
一実施形態において、ラムノース誘導性プロモーターは第2のプロモーター(例えば、第2の構成的または誘導性プロモーター)と一緒に、目的の1つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では2つのプロモーターが構築物の近位に配置され、そしてその発現を駆動し、ここで、ラムノース誘導性プロモーターは第1のセットの外因性の条件下で発現を駆動し、そして第2のプロモーターは第2のセットの外因性の条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第1および第2の条件が2つの連続した培養条件(すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器(例えば、ラムノースおよびアラビノース)中での培養物の調製の間)であり得る。別の非限定的な例では第1の誘導条件が例えば、ラムノース存在を含む培養条件であってもよく、第2の誘導条件はin vivo条件であってもよい。このようなin vivo条件には、低酸素、微好気性、または嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および/または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上のラムノースプロモーターが同じ遺伝子配列の発現を駆動するFNRプロモーターと組み合わされて、目的の1つ以上のタンパク質および/または転写調節因子(例えば、FNRS24Y)の発現を駆動する。
いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターが本明細書に記載される低コピープラスミドまたは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターが細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号26の配列のいずれかと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)誘導系またはLacプロモーターからの転写を誘導する他の化合物を介して誘導可能な1つ以上の遺伝子配列を含む。IPTGは、lacオペロンの転写を活性化するラクトース代謝産物であるアロラクトースの分子模倣物である。アロラクトースとは対照的に、IPTG中の硫黄原子は非加水劣化性化学ブロンドを産生し、これは、IPTGの劣化を防止し、濃度を一定に保つことを可能にする。IPTGはlacリプレッサーに結合し、アロステリック様式でlacオペレーターから四量体リプレッサー(lacI)を放出し、それによってlacオペロン中の遺伝子の転写を可能にする。IPTGは大腸菌によって代謝されないので、その濃度は一定のままであり、Lacプロモーター制御の発現速度は、in vivoおよびin vitroの両方で厳密に制御される。IPTG吸気は、他の輸送経路も関与するので、ラクトース透過酵素の動作に依存しない。PLacからの誘導性発現は本明細書に記載されるように、リボソーム結合部位(RBS)の最適化によって制御または微調整することができる。LacIを不活性化する他の化合物を、同様の様式でIPTGの代わりに使用することができる。
一実施形態において、目的の1つ以上のタンパク質の発現は、1つ以上のIPTG誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。
いくつかの実施形態では、IPTG誘導性プロモーターが目的の1つ以上のタンパク質のin vivo発現のために有益であるか、またはin vivo発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質の発現がin vivoで1つ以上のIPTG誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターが、遺伝子操作された細菌と共投与される分子、例えばIPTGによって直接的または間接的に誘導される。
いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質の発現がin vivo投与前の株のin vitro増殖、調製、または製造の間に、1つ以上のIPTG誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、IPTG誘導性プロモーターが培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化,剤型、および/または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、プロモーターが細菌培養物中に添加されて発現を誘導し、投与前に細菌にペイロード(例えば、IPTG)をプレロードする分子によって、直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、IPTGによって誘導される培養物を、無菌的に増殖させる。いくつかの実施形態では、IPTGによって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
一実施形態において、IPTG誘導性プロモーターは第2のプロモーター(例えば、第2の構成的または誘導性プロモーター)と一緒に、目的の1つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では2つのプロモーターが構築物の近位に配置され、そしてその発現を駆動し、ここで、IPTG誘導性プロモーターは第1のセットの外因性の条件下で発現を駆動し、そして第2のプロモーターは第2のセットの外因性の条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第1および第2の条件が2つの連続した培養条件(すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器(例えば、アラビノースおよびIPTG)中での培養物の調製の間)であり得る。別の非限定的な例では第1の誘導条件が例えば、IPTG存在を含む培養条件であってもよく、第2の誘導条件はin vivo条件であってもよい。このようなin vivo条件には、低酸素、微好気性、または嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および/または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上のIPTG誘導性プロモーターが同じ遺伝子配列の発現を駆動するFNRプロモーターと組み合わされて、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。
いくつかの実施形態では、IPTG誘導性プロモーターが本明細書に記載される低コピープラスミドもしくは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、IPTG誘導性プロモーターが細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号27の配列のいずれかと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、IPTG誘導性構築物が目的の1つ以上のタンパク質と同じプロモーターから分岐して転写されるlacIをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号28の配列のいずれかと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号29の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がテトラサイクリン誘導系を介して誘導可能な1つ以上の遺伝子配列を含む。開発された最初のシステムGossenおよびBujard(テトラサイクリン−応答性プロモーターによる哺乳動物細胞における遺伝子発現の厳密な制御Gossen MおよびBujard H.PNAS,1992 Jun 15;89(12):5547−51)は、テトラサイクリンオフとして知られている:テトラサイクリンの存在下ではtet−誘導性プロモーターからの発現が減少する。単純ヘルペスウイルス由来のVP16(ビリオンタンパク質16)のC‐端子領域とtetRを融合させることにより、テトラサイクリン制御トランスアクチベーター(tTA)を作製した。テトラサイクリンの非存在下では、tTAのtetR部はtetプロモーターのtetO配列に結合し、活性化領域は式を促進する。テトラサイクリンの存在下では、テトラサイクリンはtetRに結合し、tTAがtetO配列に結合するのを妨げる。次に、リバースTetリプレッサー(rTetR)が開発され、抑制よりもむしろ誘導のためにテトラサイクリンの存在に依存するようになった。新しいトランスアクチベーターrtTA(逆テトラサイクリン制御トランスアクチベーター)を、rTetRをVP16と融合させることによって作製した。システム上のテトラサイクリンはrtTA依存システムとしても知られている。
一実施形態において、目的の1つ以上のタンパク質の発現は、1つ以上のテトラサイクリン誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターが目的の1つ以上のタンパク質のin vivo発現のために有益であるか、またはその間に誘導される。いくつかの実施形態では目的の1つ以上のタンパク質および/または転写調節因子(例えば、FNRS24Y)の式はin vivoで1つ以上のテトラサイクリン誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターが、遺伝子操作された細菌と同時投与される分子、例えばテトラサイクリンによって直接的または間接的に誘導される。
いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質の発現がin vivo投与前の株のin vitro増殖、調製、または製造の間に、1つ以上のテトラサイクリン誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターが培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化,剤型、および/または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、プロモーターが細菌培養物中に添加されて式を誘導し、投与前に細菌にペイロード(例えば、テトラサイクリン)をプレロードする分子によって、直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、テトラサイクリンによって誘導される培養物を、無菌的に増殖させる。いくつかの実施形態では、テトラサイクリンによって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
一実施形態において、テトラサイクリン誘導性プロモーターは第2のプロモーター(例えば、第2の構成的または誘導性プロモーター)と一緒に、目的の1つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では2つのプロモーターが構築物の近位に配置され、そしてその発現を駆動し、ここで、テトラサイクリン誘導性プロモーターは第1のセットの外因性の条件下で発現を駆動し、そして第2のプロモーターは第2のセットの外因性の条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第1および第2の条件が2つの連続した培養条件(すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器(例えば、テトラサイクリンおよびIPTG)中での培養物の調製の間)であり得る。別の非限定的な例では第1の誘導条件が例えば、テトラサイクリンの存在を含む培養条件であってもよく、第2の誘導条件はin vivo条件であってもよい。このようなin vivo条件には、低酸素、微好気性、または嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および/または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上のテトラサイクリンプロモーターが同じ遺伝子配列の発現を駆動するFNRプロモーターと組み合わされて、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。
いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターが本明細書に記載される低コピープラスミドもしくは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターが細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号34の太字配列のいずれかと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む(プロモーターは太字である)。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性構築物が目的の1つ以上のタンパク質(単数または複数)いくつかの実施形態ではと同じプロモーターから分岐転写されるAraCをコードする遺伝子をさらに含み、遺伝子操作された細菌は表18のイタリック体(斜体リプレッサーは斜体)において配列番号34の配列のいずれかと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18のイタリック体中の配列番号34の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子配列を含む(テットリプレッサーはイタリック体中にある)。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がその式が温度感受性機構によって制御される1つ以上の遺伝子配列を含む。サーモレギュレーターは外部化学物質または特殊培地を使用しない強力な転写制御のために好都合である(例えば、Nemaniら、酵素−プロドラッグ治療のためのマイクロカプセル化大腸菌におけるシトシンデアミナーゼ式を誘導した;J Biotechnol.2015 Jun 10; 203: 32−40、およびその参考文献を参照のこと)突然変異cI857リプレッサーならびにpLおよび/またはpRファージλプロモーターを使用する熱磁気タンパク質式は、組換え細菌株を操作するために使用されている。λプロモーターの下流にクローン化された目的の遺伝子は、次いで、バクテリオファージλの変異体熱不安定性cI857リプレッサーによって効率的に調節され得る。37℃未満の温度では、cI857はpRプロモーターのoLまたはoR領域に結合し、RNAポリメラーゼによる転写を遮断する。より高い温度では、機能的cI857量体は不安定化され、oLまたはoR DNA配列への結合が阻止され、mRNA転写が開始される。例示的な構築物はWO2017087580の図88Aに示され、その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ParaBadからの誘導性発現は本明細書中に記載されるように、リボソーム結合部位(RBS)の最適化を通して制御され得るか、またはさらに微調整され得る。
一実施形態において、目的の1つ以上のタンパク質の発現は、1つ以上の温度調節プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、温度調節プロモーターは、目的の1つ以上のタンパク質のin vivo発現のために有益であるか、またはin vivo発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質の発現がin vivoで1つ以上の温度調節プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターが遺伝子操作された細菌と共投与される分子(例えば、温度)によって直接的または間接的に誘導される。
いくつかの実施形態では、目的の1つ以上のタンパク質の発現がin vivo投与の前のin vitro増殖、調製、または株の製造の間に、1つ以上の温度調節プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、関心のある1つまたは複数のタンパク質の産生を遮断することが好都合であり得る。これは、より低い温度(例えば、30℃)で株を成長させることによって、温度調節されたシステムにおいて行うことができる。次いで、温度を37℃および/または42℃に上昇させることによって、発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では,温度調節プロモーターは培養物中で誘導され、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化,剤型、および/または製造の間に使用される。いくつかの実施形態では、37℃〜42℃の間の温度によって誘導される培養物を、無菌的に増殖させる。いくつかの実施形態では、37℃〜42℃の間の温度によって誘導される培養物を嫌気的に増殖させる。
一実施形態において、温度調節プロモーターは第2のプロモーター(例えば、第2の構成的または誘導性プロモーター)と一緒に、目的の1つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では2つのプロモーターが構築物の近位に配置され、そしてその発現を駆動し、ここで、温度調節プロモーターは第1のセットの外因性の条件下で発現を駆動し、そして第2のプロモーターは第2のセットの外因性の条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第1および第2の条件が2つの連続した培養条件(すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器(例えば、温度調節およびアラビノース)における培養物の調製の間)であり得る。別の非限定的な例では第1の誘導条件が培養条件、例えば、許容温度であってもよく、第2の誘導条件はin vivo条件であってもよい。このようなin vivo条件には、低酸素、微好気性、または嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および/または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、1つ以上の温度調節プロモーターが同じ遺伝子配列の発現を駆動するFNRプロモーターと組み合わされて、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。
いくつかの実施形態では、温度調節プロモーターは本明細書中に記載される低コピープラスミドもしくは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では,温度調節プロモーターは細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の1つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号30の配列のいずれかと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、温度調節された構築物が目的の1つ以上のタンパク質と同じプロモーターから分岐して転写される、変異cI857リプレッサーをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号31の配列のいずれかと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号33の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチドをコードする1つ以上の遺伝子配列を含む。
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌がPssBプロモーターによって駆動されるシステムを介して間接的に誘導可能な1つ以上の遺伝子配列を含む。Pssbプロモーターは好気性条件下では活性であり、嫌気性条件下では遮断される。
このプロモーターは、好気性条件下で目的の遺伝子を発現するために使用され得る。このプロモーターはまた、嫌気性条件でのみ発現されるように、遺伝子産物の発現を厳密に制御するために使用され得る。このケースでは、酸素誘導PssBプロモーターが目的の遺伝子の発現を抑制するリプレッサーの発現を誘導する。結果として、目的の遺伝子はリプレッサーの非存在下(すなわち、嫌気性条件中)でのみ発現される。この戦略は、改善された微調整およびより厳格な制御のための追加レベルの制御という利点を有する。WO2017087580の図89AはPssBプロモーターの遺伝子構成の概略図を示しており、その全内容は参照により本明細書中に援用される。
一実施形態において、目的の1つ以上のタンパク質の発現は、1つ以上のPssBプロモーターの制御下で発現されるリプレッサーによって間接的に調節される。
いくつかの実施形態では、PssBプロモーターの誘導が目的の1つ以上のタンパク質のin vivo発現を間接的に駆動する。いくつかの実施形態では、PssBプロモーターの誘導がin vivo投与前のin vitro増殖、調製、または株の製造の間に、目的の1つ以上のタンパク質の発現を間接的に駆動する。いくつかの実施形態では、PssBプロモーターの誘導のための条件が培養、例えば、フラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で提供され、例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化,剤型、および/または製造の間に使用される。
いくつかの実施形態では、PssBプロモーターが本明細書に記載される低コピープラスミドもしくは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドから、目的の1つ以上のタンパク質の発現を間接的に駆動する。いくつかの実施形態では、PssBプロモーターが細菌染色体に組み込まれた構築物から、目的の1つ以上のタンパク質の発現を間接的に駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。
別の非限定的な例において、このストラテジーは例えば、条件的栄養要求株を作製するために、thyAおよび/またはdapAの発現を制御するために使用され得る。dapAまたはThyAの染色体コピーをノックアウトする。嫌気性条件では、dapAまたはthyAが発現し、株はdapまたはチミジンの非存在下で増殖することができる。好気的条件下では、dapAまたはthyAの式は遮断され、株はdapまたはチミジンの非存在下では増殖できない。このようなストラテジーは例えば、嫌気性条件(例えば、腫瘍微小環境の消化管および/または条件)下での細菌の生存を可能にするが、好気性条件下での生存を予防するために使用され得る(バイオセイフティースイッチ)。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が表18の配列番号35の配列のいずれかと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つ以上の遺伝子配列を含む。
誘導性プロモーターからの発現に有用な配列を表18に列挙する。
構成的プロモーター
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子がプラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子が染色体上に存在し、そして構成的プロモーターに作動可能に連結される。
いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが本明細書に記載されるように、in vivo条件、例えば、腫瘍微小環境の消化管および/または条件下で活性である。いくつかの実施形態では、このプロモーターが本明細書に記載されるように、in vitro条件(例えば、種々の細胞培養および/または細胞製造条件)下で活性である。いくつかの実施形態では、この構成的プロモーターがin vivo条件(例えば、本明細書中に記載されるような腫瘍微小環境の消化管および/または条件)下、およびin vitro条件(例えば、本明細書中に記載されるような種々の細胞培養および/または細胞産生および/または製造条件)下で活性である。
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結される構成的プロモーターが種々の外因性環境条件(例えば、in vivoおよび/またはin vitroおよび/または産生/製造条件下)において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが哺乳動物の消化管に特異的な、および/または腫瘍微小環境の状態に特異的な外因性環境条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが哺乳動物の小腸に特異的な外因性環境条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが哺乳動物の消化管の環境および/または腫瘍微小環境の状態のような低酸素または嫌気性条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが腫瘍微小環境の哺乳動物の消化管および/または状態に特異的な分子または代謝産物の存在下で活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターが細菌と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターがin vitro培養、細胞産生および/または製造条件の間に存在する分子または代謝産物または他の条件の存在下で活性である。
細菌の構成的プロモーターは当技術分野で公知であり、WO2017/123675として公開された、国際特許出願PCT/US2017/013072(2017年1月11日出願)に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。
リボソーム結合部位
いくつかの実施形態では、リボソーム結合部位が付加され、スイッチアウトされ(switched out)、または置換される。いくつかのリボソーム結合部位を試験することによって、発現レベルを所望のレベルに微調整することができる。RBSの非限定的な例は標準的な生物学的部分のレジストリに列挙されており、WO2017/123675として公開された、2017年1月11日に出願された国際特許出願PCT/US2017/013072に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。
株培養中のペイロードの誘導
培養中のペイロードの誘導は、国際特許出願PCT/US2017/013072(WO2017/123675として公開)、国際特許出願PCT/US2016/032562(WO2016183531として公開)、およびPCT/US2016/062369(WO2017/123675として公開)に記載されており、それぞれの全内容は参照により本明細書に援用される。
いくつかの実施形態では、投与の前に、目的の式および/またはペイロード活性のペイロードまたはタンパク質を予め誘導することが望ましい。このような関心対象のペイロードまたはタンパク質は、分泌物を意図したエフェクターであってもよく、またはエフェクターを産生するために代謝反応を触媒する酵素であってもよい。他の実施形態において、目的のタンパク質は、有害な代謝産物を異化する酵素である。このような状況では、株には関心のある活ペイロードまたはタンパク質が事前にロードされる。このような場合、本発明の遺伝子操作された細菌はin vivoでの投与の前に、細胞増殖、増殖、純化、発酵、および/または産生の間の細菌培養において提供される条件下で、目的の1つ以上のタンパク質を発現する。このような培養条件は例えば、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化,剤型、および/または製造の間に使用される、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器中で提供され得る。本明細書中で使用される場合、用語「細菌培養」または細菌細胞培養」または「培養」は細胞増殖、細胞膨張、回収、純化、発酵、および/または製造を含むいくつかの産生プロセスの間にin vitroで維持または増殖される細菌細胞または微生物をいい、本明細書中で使用される場合、用語「発酵」は、規定された条件下での細菌の増殖、増殖、および維持をいう。発酵は、誘導物質、栄養素の存在下、定義された温度などで、嫌気性または低酸素または酸素化条件を含む多くの細胞培養条件下で起こり得る。
培養条件は高細胞密度(高バイオマス)降伏を維持しながら、細胞の最適な活性および生存率を達成するように選択される。酸素レベル(例えば、低酸素、微好気性、好気性)、培地の温度、および栄養素および/または種々の増殖培地、培地中に提供される化学的および/または栄養性誘導物質および他の成分を含む、最適な活性、高収率および高生存率を達成するために、多数の細胞培養条件および操作パラメータをモニターし、調節する。
いくつかの実施形態では目的の1つ以上のタンパク質が直接的または間接的に誘導され、一方、株はin vivo投与のために増殖される。理論に束縛されることを望まないが、プレ誘導は例えば、消化管または腫瘍において、in vivo活性を増強し得る。特定の消化管区画内の細菌の滞留時間が比較的短い場合、細菌は、完全なin vivo誘発能に達することなく小腸を通過し得る。対照的に、株が予め誘導され、そして予め負荷されている場合、株は既に完全に活性であり、細菌が腸に到達することにつれて、より大きな活性をより迅速に可能にする。エルゴ、輸送時間は「浪費」されず、この場合、この株は最適に活性ではない。細菌が腸を通って移動し続けるにつれて、in vivo誘導は消化管の環境条件下(例えば、低酸素、または消化管代謝産物の存在下)で起こる。同様に、腫瘍標的化または他の細菌が予め誘導され、そしてプレロードされる場合、これは、本明細書中に記載されるように、全身投与または腫瘍内注射のいずれかによって、細菌が消化管または腫瘍に到達することにつれて、より迅速に、より大きな活性を可能にし得る。消化管または腫瘍に入ると、in vivo誘発が例えば、腫瘍微小環境の条件下で起こる。
一実施形態では、1つ以上のペイロードの発現は、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および/または産生の間に誘導される。一実施形態では、いくつかの目的のタンパク質の発現は、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および/または産生の間に誘導される。
いくつかの実施形態では、これらの株はin vivo投与前の株増殖の間、いかなるプレ誘導プロトコールもなしに投与される。
嫌気性誘導
いくつかの実施形態では、細胞が培養において嫌気性または低酸素条件下で誘導される。このような場合、細胞は一定のOD(例えば、0.1〜10の範囲内のOD)に達するまで(例えば、1.5〜3時間)成長され、一定の密度(例えば、1×108〜1×1011の範囲)および指数関数的成長を示し、次いで、約3〜5時間、嫌気性または低酸素状態にスイッチされる。いくつかの実施形態では、株は嫌気性または低酸素条件下で誘導され、例えば、FNRプロモーター活性を誘導し、1つ以上のFNRプロモーターの制御下で1つ以上のペイロードおよび/またはトランスポーターの発現を駆動する。
一実施形態において、1つ以上のペイロードの発現は1つ以上のFNRプロモーターの制御下にあり、そして嫌気性または低酸素条件下での、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および/または産生の間に誘導される。一実施形態において、いくつかの目的のタンパク質の発現は1つ以上のFNRプロモーターの制御下にあり、そして嫌気性または低酸素条件下での、細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および/または産生の間に誘導される。
理論に束縛されることを望むものではないが、FNRプロモーターの制御下で1つ以上のペイロードを含む株はこれらのプロモーターからのペイロードの発現を、in vitroで、嫌気性または低酸素培養条件下で、およびin vivoで、腫瘍微小環境の消化管および/または条件において見出される低酸素条件下で可能にし得る。
関心対象のペイロードに連結されたいくつかの実施形態では、プロモーターはアラビノース、クミン酸塩、およびサリチル酸塩、IPTG、ラムノース、テトラサイクリンによって誘導可能であり得、ならびに/または他の化学的および/もしくは栄養性誘導物質は化学薬品および/もしくは栄養性誘導物質の存在下で、嫌気性または低酸素条件下で誘導され得る。特に、株は遺伝子配列の組合せを含み得、そのいくつかはFNRプロモーターの制御下にあり、他は化学的および/または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、株は1つ以上のペイロード遺伝子配列および/または1つ以上のFNRプロモーターの制御下、ならびに本明細書中に記載される1つ以上の構成的プロモーターの制御下の1つ以上のペイロード遺伝子配列を含み得る。
好気性誘導
いくつかの実施形態では、好気性条件下で株を調製し、プレロードし、プレ誘導することが望ましい。これは、より効率的な増殖および生存を可能にし、そしていくつかの場合において、毒性代謝産物の蓄積を減少させる。このような場合、細胞は一定のOD(例えば、0.1〜10の範囲内のOD)に達するまで(例えば、1.5〜3時間)成長させられ、これは、一定の密度(例えば、1×108〜1×1011の範囲)および指数関数的成長を示し、次いで、誘導物質の付加または他の手段(例えば、許容温度へのシフト)を介して、約3〜5時間誘導される。
アラビノース、クミン酸塩、およびサリチル酸塩、IPTG、ラムノース、テトラサイクリン、および/または本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の他の化学的および/または栄養性誘導物質によって誘導可能ないくつかの実施形態では、プロモーターは細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および/または産生の間に、化学的および/または栄養性誘導物質の存在下で好気性条件下で誘導することができる。一実施形態において、1つ以上のペイロードの発現は化学的および/または栄養性誘導物質によって調節される1つ以上のプロモーターの制御下にあり、そして好気性条件下での細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型および/または産生の間に誘導される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された株は、好気性培養条件下で誘導される遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、これらの株は、腫瘍微小環境の消化管および/または状態におけるin vivo活性化のためのFNR誘導性遺伝子配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、これらの株は、腫瘍微小環境の消化管および/または状態におけるin vivo活性化のためのFNR誘導性遺伝子配列をさらに含まない。
微好気性誘導
いくつかの実施形態では生存率、増殖、および活性は微好気性条件下で細菌株を予め誘導することによって最適化される。いくつかの実施形態では、微好気性条件が最適な増殖、活性および生存率条件と、誘導のための最適条件との間の「残部をとる」のに最も適しており、特に、1つ以上のペイロードの発現が嫌気性および/または低酸素プロモーター(例えば、FNRプロモーター)によって駆動される場合である。このような場合、細胞は例えば、一定のOD、例えば、0.1〜10の範囲内のODに達するまで(例えば、1.5〜3時間)成長され、これは、一定の密度(例えば、1×108〜1×1011の範囲)および指数関数的成長を示し、次いで、誘導物質の付加または他の手段(例えば、許容温度へのシフト)を介して、約3〜5時間誘導される。
一実施形態において、1つ以上のペイロードの発現は1つ以上のFNRプロモーターの制御下にあり、そして微好気性条件下での細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および/または産生の間に誘導される。
理論に束縛されることを望むものではないが、FNRプロモーターの制御下で1つ以上のペイロードを含む株は、in vitroで、微好気性培養条件下で、およびin vivoで、腫瘍微小環境の消化管および/または条件において見出される低酸素条件下で、これらのプロモーターからのペイロードの発現を可能にし得る。
アラビノース、クミン酸塩、およびサリチル酸塩、IPTG、ラムノース、テトラサイクリン、および/または他の化学的および/または栄養性誘導物質によって誘導可能ないくつかの実施形態では、プロモーターは、化学物質および/または栄養性誘導物質の存在下で微好気性条件下で誘導することができる。特に、株は遺伝子配列の組合せを含み得、そのいくつかはFNRプロモーターの制御下にあり、他は化学的および/または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、株は1つ以上のFNRプロモーターの制御下にある1つ以上のペイロード遺伝子配列、および本明細書中に記載される1つ以上の構成的プロモーターの制御下にある1つ以上のペイロード遺伝子配列を含み得る。
一実施形態では、1つ以上のペイロードの発現は化学的および/または栄養性誘導物質によって調節される1つ以上のプロモーターの制御下にあり、そして微好気性条件下での細胞増殖、細胞膨張、発酵、回収、純化、剤型、および/または産生の間に誘導される。
いくつかの実施形態では、投与の前に、対象式および/またはペイロード活性のペイロードまたはタンパク質を予め誘導することが望ましい。このような関心対象のペイロードまたはタンパク質は、分泌物を意図したエフェクターであってもよく、またはエフェクターを産生するために代謝反応を触媒する酵素であってもよい。他の実施形態において、目的のタンパク質は、有害な代謝産物を異化する酵素である。このような状況では、株には活性ペイロードが予めロードされている
生体分子輸送能力が強化された細菌株の産生
それらの培養の容易さ、短い世代時間、非常に高い集団密度、および小さいゲノムのために、微生物は、短縮された時間スケールでユニークな表現型に進化され得る。適応実験室進化(ALE)は、選択圧下で微生物を継代して、好ましい表現型を有する株を進化させるプロセスである。最も一般的にはこれは炭素/エネルギー源の利用を増大させるために、または環境ストレス(例えば、温度、pH)に株を適応させるために適用され、それによって、炭素基材上でまたは応力のもとでより増殖可能な突然変異株は集団中のあまり適応されていない株よりも競合し、最終的には集団を支配するようになる。
この同じ処理は、栄養要求株を作成することによって、任意の必須代謝産物に拡張することができる。栄養要求株は必須代謝産物を合成することができない株であり、従って、増殖するために培地中に提供される代謝産物を有さなければならない。この筋書きでは栄養要求株を作成し、代謝産物の量を減少させて継代することによって、得られる優性株はこの必須代謝産物をより得て組み込むことができなければならない。
例えば、アミノ酸を産生するための生合成経路が破壊される場合、該アミノ酸の高親和性捕捉が可能な株は、ALEを介して進化され得る。第1に、株は、成長を支持するための最小濃度が確立されるまで、栄養要求性アミノ酸の種々の濃度で成長される。次いで、この株をその濃度で継代し、そして規則的な間隔で、より低い濃度のアミノ酸に希釈する。時間が経つにつれて、アミノ酸に対して最も競合的な細胞(成長を制限する濃度で)が集団を支配するようになる。これらの株は、おそらく、それらのアミノ酸トランスポーターにおいて突然変異を有し、必須アミノ酸および限定アミノ酸を移入する増大した能を生じる。
同様に、アミノ酸を形成するために上流代謝産物を使用することができない栄養要求株を使用することによって、上流代謝産物をより効率的に取り込むことができるだけでなく、代謝産物を必須の下流代謝産物に変換することもできる株を進化させることができる。これらの株はまた、上流代謝産物の輸入を増加させるために突然変異進化するが、下流酵素の式または反応速度を増加させるか、または競合的基材利用経路を減少させる突然変異も含み得る。
先の実施例では、微生物に固有の代謝産物を、突然変異栄養要求性を介して必須にし、選択を、内因性代謝産物の増殖制限補充と共に適用した。しかし、非天然化合物を消費することができる表現型は、それらの消費を必須化合物の産生に結びつけることによって進化させることができる。例えば、必須化合物または必須化合物の前駆体を産生し得る異なる生物由来の遺伝子が単離される場合、この遺伝子は、組換え的に導入され得、そして異種宿主において発現され得る。この新しい宿主株は、今や、以前は代謝不能であった基材から必須栄養素を合成することができる。これにより、すぐ下流の代謝産物を変換することができない栄養要求株を作製し、組換え酵素の同時発現を伴う非天然化合物の増殖制限量を選択することによって、同様のALE法を適用することができる。これは、非天然基材の運搬、異種酵素の発現および活性、ならびに下流の天然酵素の発現および活性の突然変異をもたらす。この処理における重要な要件は、非天然代謝産物の摂取を、成長に不可欠な代謝産物の産生に結びつけることができることであることを強調すべきである。
選択メカニズムの塩基類が確立され、最低レベルの補充が確立されると、実際のALE実験を進めることができる。このプロセスを通して、いくつかのパラメータを慎重に監視しなければならない。培養物を指数増殖期に維持し、彩度/固定相到達させないことが大切である。これは、各継代の間に増殖速度をチェックし、その後の希釈をそれに応じて調節しなければならないことを意味する。増殖速度が希釈が大きくなる程度まで改善される場合、栄養要求性補給の濃度は増殖速度が遅くなるように減少されるべきであり、選択圧は増加され、そして希釈は、継代の間に亜集団を大きく偏らせるほど重篤ではない。さらに、規則的な間隔で、細胞を希釈し、固体培地上で増殖させ、そして個々のクローンを試験して、ALE培養物において観察される成長速度表現型を確認すべきである。
ALE実験をいつ停止するかを予測するには、注意が必要である。進化を指向することの成果は実験を通して「スクリーニングされた」突然変異の数に直接的に結びついており、突然変異は一般に、DNAレプリケーションの間の誤差の機能であるので、累積細胞分裂(CCD)は、スクリーニングされた全変異体の代理として作用する。以前の研究は、種々の炭素源上での成長のための有利な表現型が約1011.2のCCD1において単離され得ることを示した。この速度は、DNA複製エラーの増加を引き起こすN−メチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)のような化学的変異原を培養物に添加することによって加速することができる。しかし、継代を続けると、成長速度がわずかに向上されるか、または向上されない場合、集団はある適応度最大値に収束し、ALE実験を停止することができる。
ALE実験の終わりに、細胞を希釈し、固体培地上で単離し、培養フラスコの成長表現型と一致する成長表現型についてアッセイすべきである。次いで、選択されたものからの最良のパフォーマーを、ゲノムDNAのために調製し、そして全ゲノム配列決定のために送る。改善された表現型を提供することができるが、サイレント突然変異(利益を提供しないが、所望の表現型を損なわないもの)も含むことができる、ゲノム周辺に生じる突然変異を明らかにする配列決定。NTGまたは他の化学的突然変異原の存在下で進化した培養物では、有意により多くのサイレントな背景技術突然変異が存在するのであろう。現在の状態で最良の性能の株に満足した場合、ユーザは、その株を用いたアプリケーションに進むことができる。さもなければ、寄与突然変異は、ゲノムエンジニアリング技術によって親株に突然変異を再導入することによって、進化した株からデコンボリューションされ得る。See Lee、D.−H.、Feist、AM.、Barrett、CL& Palsson、BO.Cumulative Number of Cell Divisions as a Meaningful Timescale for Adaptive Laboratory Evolution ofエシェリヒア属coli.。PLoS ONE 6、e26172 (2011)。
代謝産物輸送
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がトランスポーターをコードする遺伝子をさらに含む。トランスポーターは細胞内へのフェニルアラニン輸送を増強するために、遺伝子操作された細菌において発現本発明改変され得る。そのようなトランスポーターの非限定的な例は係属中の国際特許出願PCT/US2016/032565に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。
このようなトランスポーターは、代謝産物を細菌細胞に輸送することができる膜輸送タンパク質である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変細菌中のトランスポーターをコードする遺伝子は改変されていない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がトランスポーター遺伝子の多数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が非天然トランスポーター遺伝子の多数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌がその天然プロモーターによって制御されるトランスポーター遺伝子、誘導性プロモーター、天然プロモーターよりも強いプロモーター(例えば、GlnRSプロモーターまたはP(Bla)プロモーター)、または構成的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターが製造中の条件下または他のin vitro条件下で誘導される。いくつかの実施形態では、トランスポーター遺伝子の発現が、1つ以上のエフェクター分子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは別のプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、トランスポーター遺伝子の発現が、1つ以上のエフェクター分子の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、トランスポーター遺伝子および1つ以上のエフェクター分子が、プロモーター領域から多様に転写される。
いくつかの実施形態では、天然のトランスポーター遺伝子を突然変異誘発し、輸送の増加を示す突然変異体を選択し、突然変異誘発されたトランスポーター遺伝子を単離し、遺伝子操作された細菌に挿入する(例えば、Piら、1996;Piら、1998を参照)。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非改変の細菌と比較して、血中フェニルアラニンを少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍低減させるために、哺乳動物の消化管の低酸素環境などの外因性環境条件下でPALを産生する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、哺乳動物の消化管の低酸素環境などの外因性環境条件下でPALを産生し、同じ条件下で同じ亜型の非改変の細菌と比較して、尿中の馬尿酸を少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍増加させる。特定の非改変細菌は、感知できるレベルのフェニルアラニンの馬尿酸へのプロセシングを有さないであろう。これらの細菌の遺伝子組換え型を使用した実施形態では、フェニルアラニンのPAL媒介性プロセシングは外因性環境条件下で感知できる。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、in vitroの細菌培養条件下などの外因性環境条件下でPALを産生し、同じ条件下で同じ亜型の非改変の細菌と比較して、培地中のトランス−ケイ皮酸を少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍増加させる。フェニルアラニンは当該分野において公知の方法、例えば、血液採取および質量分析によって測定され得る。いくつかの実施形態では、ケイ皮酸はPAL活性を評価するために当該分野において公知の方法によって測定される。ケイ皮酸産生はフェニルアラニン分解と直接的に相関し、いくつかの実施形態では、ケイ皮酸は、株活性についての代替のバイオマーカーとして使用され得る(図16B)。ケイ皮酸は肝酵素によって馬尿酸にさらに分解され得、両方は実施例24〜26に記載されるように測定され得る。本明細書に示されるように、in vivoにおいてTCAは速やかに馬尿酸に変化され、その後馬尿酸は尿中に蓄積される。したがって、血液中および特に尿中の馬尿酸は、in vivoにおけるフェニルアラニン分解の遥かに優れたバイオマーカーになり得る。いくつかの実施形態では、PAL発現は当該分野において公知の方法、例えば血中のフェニルアラニンレベルの測定によって測定される。馬尿酸は本明細書の実施例、および当該分野おいて公知の方法で測定され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌と比較して、血中フェニルアラニンを少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍低減させるためにLAADを産生する。特定の非組換え細菌は感知できるレベルのフェニルアラニンプロセシングを有さない。これらの細菌の遺伝子組換え型を使用した実施形態では、フェニルアラニンのLAAD媒介性プロセシングは外因性環境条件下で感知できる。フェニルアラニンは当該分野において公知の方法、例えば、血液採取および質量分析によって測定され得る。LAADにより生成した分解産物であるピルビン酸およびフェニルピルベートは、実施例24〜26に記載されるように質量分析を使用して測定され得、LAAD活性のさらなる読み出し情報として使用され得る。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、in vivoまたはin vitroの細菌培養条件下などの外因性環境条件下で、2以上のPME、例えばPAL、PAH、および/またはLAADを産生し、同じ条件下で同じ亜型の非改変細菌と比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍、血中のフェニルアラニンを減少および/または培地中のトランス−ケイ皮酸を増加させる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、1つ以上のPheトランスポーターポリペプチドをコードする遺伝子配列をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、1つ以上のPME、例えば、PAL、LAAD、および/またはPAHは、低コピープラスミド上で発現される。
いくつかの実施形態では、1つまたは複数のトランスポーターをコードする遺伝子はプラスミド上または染色体内に位置し、発現は本明細書に開示されるプロモーターのいずれかによって調節され得る。
他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、in vivo投与を直接的または間接的に誘導する1つまたは複数のトランスポーターをコードします。たとえば、外因性in vivo環境(例えば、消化管)の特定の分子または代謝物に反応する条件である誘導性プロモーターの制御下で発現する。
いくつかの実施形態では、1つ以上のPME、例えば、PAL、LAAD、および/またはPAHは、低コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは非誘導条件下で発現の漏れを減少させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、1つ以上のPME、例えば、PAL、LAAD、および/またはPAHは、高コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、PME、例えば、PAL、LAAD、および/またはPAH発現を増加させるのに有用であり得、それによってフェニルアラニンの代謝を増加させ、高フェニルアラニン血症を低減させる。いくつかの実施形態では、高コピープラスミド上で発現されるPME、例えば、PAL、LAAD、および/またはPAHを含む遺伝子操作された細菌は、異種phePおよび天然phePのさらなるコピーの非存在下で、低コピープラスミド上で発現される同じPME、例えば、PAL、LAAD、および/またはPAHを含む遺伝子操作された細菌と比較してフェニルアラニン代謝を増加させないか、またはフェニルアラニンレベルを減少させない。高および低コピープラスミド上の同じPME遺伝子(群)、例えば、PAL、LAAD、および/またはPAH遺伝子(群)を含む遺伝子操作された細菌が生成された。例えば、高コピープラスミドおよび低コピープラスミド上のPAL1またはPAL3のいずれかが生成され、各々は代謝され、フェニルアラニンを同様のレベルまで低減させた(図15)。したがって、いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝の律速段階はフェニルアラニン利用可能性である(例えば、図16を参照のこと)。これらの実施形態では、細胞へのフェニルアラニン輸送を増加させ、それによってフェニルアラニン代謝を向上させることが有益であり得る。phePと併せて、低コピーPALプラスミドでさえ、試験試料からPheをほぼ完全に除去することができる(例えば、図16Aを参照のこと)。さらに、phePを組み込んでいるいくつかの実施形態では、高フェニルアラニン代謝を維持しながらPAL発現の安定性を向上させ、形質転換した細菌上の負の選択圧を低減させるために、併用して低コピーPAL発現プラスミドを使用することがさらに有益であり得る。代替の実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは高コピープラスミドと併用して使用される。
いくつかの実施形態では、トランスポーターはフェニルアラニン分解を増加させることができない。例えば、プロテウス・ミラビリスLAADは、酵素触媒作用が周辺質で発生する細胞膜に局在する。フェニルアラニンは、トランスポーターを必要とせずに外膜を容易に横切ることができる。したがって、遺伝子操作された細菌がLAADを発現する実施形態では、トランスポーターは、フェニルアラニン代謝を必要としなくてもよいか、または改善しなくてもよい。
いくつかの実施形態では、PME(複数可)、例えば、PAL、LAAD、および/またはPAH遺伝子は染色体上で発現される。いくつかの実施形態では、染色体からの発現はPMEの発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、PME遺伝子、例えば、PAL、LAAD、および/またはPAH遺伝子は、遺伝子操作された細菌における1つまたは複数の組み込み部位において細菌染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、PME遺伝子、例えば、PAL、LAAD、および/またはPAH遺伝子は、大腸菌Nissleにおける以下の挿入部位:malE/K、insB/I、araC/BAD、lacZ、agal/rsml、thyA、およびmalP/Tのうちの1つまたは複数において細菌ゲノムに挿入される。任意の適切な挿入部位が使用されてもよい(例えば、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるWO2017087580の図66を参照のこと)。挿入部位は、ゲノム内、例えば、(栄養要求株を作製するために)thyAなどの生存および/もしくは増殖に必要とされる遺伝子内、ゲノム複製部位付近などのゲノムの活性領域内、ならびに/またはアラビノースオペロンのAraBとAraCとの間などの、意図しない転写のリスクを低減させるために分岐プロモーターの間のいずれの場所にあってもよい。いくつかの実施形態では、PME遺伝子、例えば、PAL、PAH、および/またはLAADの1個より多いコピー、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個またはそれより多いコピーが、遺伝子操作された細菌における1つまたは複数の組み込み部位において細菌染色体に組み込まれる。PME遺伝子の1個より多いコピーは、同じPME遺伝子の1個より多いコピーまたは異なるPME遺伝子の1個より多いコピーであってもよい。
例示的な構築物は以下の表4〜13に示される。表4は、染色体への挿入のためのPhePおよびFNRプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列(配列番号21B)を示し、pheP配列には下線が引いてあり、FNRプロモーター配列は太字である。表5は、高コピープラスミド上でPAL1およびFNRプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列(配列番号22B)を示し、PAL1配列には下線が引いてあり、FNRプロモーター配列は太字である。表6は、高コピープラスミド上のPAL3およびFNRプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列(配列番号23B)を示し、PAL3配列には下線が引いてあり、FNRプロモーター配列は太字である。表7は、高コピープラスミド上のPAL1およびTetプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列(配列番号24B)を示し、PAL1配列には下線が引いてあり、Tetプロモーター配列は太字である。表8は、高コピープラスミド上のPAL3およびTetプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列(配列番号25B)を示し、PAL3配列には下線が引いてあり、Tetプロモーター配列は太字である。表9は、低コピープラスミド上のPAL1およびFNRプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列(配列番号26B)を示し、PAL1配列には下線が引いてあり、FNRプロモーター配列は太字である。表10は、低コピープラスミド上のPAL3およびFNRプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列(配列番号27B)を示し、PAL3配列には下線が引いてあり、FNRプロモーター配列は太字である。表11は、低コピープラスミド上のPAL1およびTetプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列(配列番号28B)を示し、PAL1配列には下線が引いてあり、Tetプロモーター配列は太字である。表12は、低コピープラスミド上のPAL3およびTetプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列(配列番号29B)を示し、PAL3配列には下線が引いてあり、Tetプロモーター配列は太字である。表13は、phePをコードする遺伝子、TetRをコードする遺伝子、および染色体への挿入のためのTetプロモーター配列を含む例示的な構築物の配列(配列番号30B)を示し、pheP配列には下線を引き、TetR配列は四角で囲い、FNRプロモーター配列は太字である。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は配列番号21B〜30Bのいずれかのうちの1つまたは複数の配列を含む遺伝子配列を含有する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号21B〜30Bの配列のうちのいずれかと少なくとも75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する1つまたは複数の配列を含む遺伝子配列を含有する。
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、1つ以上のPMEをコードする1つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、1つ以上の内因性バクテリオファージゲノムをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージが、バクテリオファージゲノム内の1つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異は欠失、挿入、置換および逆位を含み、そして1つ以上のバクテリオファージ遺伝子に位置し得るか、またはそれを包含し得る。
一実施形態では、大腸菌Nissleが1つまたは複数のPMEを含む遺伝子操作された細菌の出発点、親株、または「シャシー(chassis)」として使用される。一実施形態では、改変されたバクテリオファージがその天然の状態で大腸菌Nissleに内因性であるファージである。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が1つ以上の大腸菌を含む。Nissleバクテリオファージ(例えば、ファージ1、ファージ2、およびファージ3)。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がファージ3中に1つまたは突然変異を含む。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、1つ以上のファージ3遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10090、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120から選択される1つ以上の遺伝子を含む。ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10325、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が1つまたは複数のECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完成または部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
酸素消費酵素
LAADの触媒活性は酸素に依存し、従って、腸(例えば、結腸)における嫌気性および/または低酸素環境において活性でないかもしれない。酸素は、胃腸管のより近位の区画に存在する。
健康なマウスで測定した酸素圧を表17Aに示す。He et al、Proc Natl Acad Sci USA。1999 Apr 13;96(8):4586−91;「Noninvasive measurement of anatomic structure and intraluminal oxygenation in the gastrointestinal tract of living mice with spatial and spectral EPR imaging」の全内容が、参照により本明細書に援用される。近位から先端の位胃腸管への顕著な酸素勾配。胃腸管に沿って観察された酸素勾配は、プロセスの組合せによって説明することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、食品は嚥下されると、最初に環境室内大気の酸素圧と平衡化される。胃およびその後の小腸への通過時に、酸素レベルは、酸素が粘膜メンブランを横切って拡散することにつれて低下し得る。酸素の毛管量(すなわち、5〜10torr;参考文献9)との徐々の平衡化処理が起こり得る。結腸に移行すると、その重度の細菌コロニー形成と共に、酸素化のさらなる減少が生じる。最後に、遠位結腸ディスプレイの管腔は予想通り、この部位における嫌気性菌の存在量に基づいて低酸素症を顕著にした。
図25Bに示すように、LAAD活性は好気性条件下よりも低いレベルではあるが、微好気性条件下で保持される(図25Aおよび図25B)。したがって、LAADは、胃、十二指腸、空腸、および回腸のような腸のより近位の領域において活性であり得る。本発明の一部として、遺伝子操作された細菌によって発現されるLAADは好都合にはPALとは別の区画において活性であり得、これはFNRプロモーターの制御下にある場合、結腸において発現され得ることが意図される。1つの実施形態において、遺伝子操作された細菌は2つの酵素を発現し、これらは異なる酸素要求性を有し、および/または異なる酸素条件下で誘導され、その結果、PMEは胃腸系全体にわたって発現され、そして活性である。例えば、酸素の存在に依存する第1の酵素(例えば、LAAD)は構成的または誘導性プロモーター(例えば、パラBAD)の制御下で、胃、十二指腸および回腸の1つ以上において発現され、そして第2の酵素(例えば、PAL)は、FNRプロモーターの制御下で、結腸において発現される。いくつかの実施形態では、PALが小腸において見出される条件下、例えば、FNRプロモーター、構成的プロモーターの制御下、または本明細書中に記載される別の誘導性プロモーター下で発現される。いくつかの実施形態では、PALおよび/またはLAADがin vivo投与の前に予め誘導され、腸の近位部分において発現され、活性である。いくつかの実施形態では、PALおよび/またはLAADがin vivo投与の前に(好気的または嫌気的に、または本明細書に記載されるように、化学的および/または栄養性誘導物質の有無にかかわらず)予め誘導され、腸の遠位部分において発現され、活性である。
酸素制限条件下でLAAD活性をさらに増加させるために、いくつかの戦略を用いることができる。例えば、大量の酸素を消費する他の酵素の活性は、減少または消失され得る。そのような酵素の1つは、NADHデヒドロゲナーゼである。大腸菌は2つのNADHデヒドロゲナーゼ、nuoおよびndh2を有し、これらの酵素の両方のノックアウトが酸素消費を80%減少させることが示されている。いくつかの実施形態では、限界酸素を保存するために、すなわち、LAADを発現する遺伝子操作された細菌において、より低い外因性の酸素条件下でLAADが機能することを可能にするために、さらなる手段が講じられる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がさらに、酸素消費に関与する1つ以上の遺伝子における突然変異を含む。いくつかの実施形態では、大腸菌NADHデヒドロゲナーゼの一方または両方がノックアウトされる。いくつかの実施形態では、ノックアウトされたNADHデヒドロゲナーゼはヌーである。いくつかの実施形態では、ノックアウトされたNADHデヒドロゲナーゼはndh2である。いくつかの実施形態ではヌーとndh2はノックアウトされる。cydB(高親和性端子オキシダーゼのサブユニット)、cydD(チトクロームDを作るのに必要な酵素)、およびcyoABC(低親和性チトクロームオキシダーゼのサブユニット)のような呼吸鎖中の酵素を含む、大腸菌の酸素代謝に関与する他の酵素もノックアウトされ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がcydB、cydD、およびcyoABCから選択される1つ以上の遺伝子においてノックアウト突然変異/欠失を保有する。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる1つ以上のPMEが発現され、胃内で活性を示す。一実施形態において、遺伝子操作された細菌によってコードされる1つ以上のPMEは、十二指腸において発現され、そして活性を示す。一実施形態において、遺伝子操作された細菌によってコードされる1つ以上のPMEは、空腸において発現され、そして活性を示す。一実施形態において、遺伝子操作された細菌によってコードされる1つ以上のPMEは、回腸において発現され、そして活性を示す。一実施形態において、遺伝子操作された細菌によってコードされる1つ以上のPMEは、結腸において発現され、そして活性を示す。
フェニルアラニン輸送
細菌がPMEをコードする遺伝子を含むいくつかの実施形態では、当該細菌は、フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子をさらに含み得る。フェニルアラニントランスポーターは、細胞内へのフェニルアラニン輸送を増強するために、本発明の遺伝子操作された細菌において発現または改変され得る。
PhePは、細菌細胞にフェニルアラニンを輸送できる膜輸送タンパク質である(例えば、Piら、1991年を参照のこと)。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換え細菌における天然のpheP遺伝子は改変されていない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は天然のpheP遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は非天然のpheP遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、その天然のプロモーター、誘導可能なプロモーター、天然のプロモーターより強力なプロモーター、例えばGlnRSプロモーターもしくはP(Bla)プロモーター、または構成的プロモーターによって制御されるpheP遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および/または転写調節因子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および/または転写調節因子の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子およびフェニルアラニン代謝酵素および/または転写調節因子は、プロモーター領域から分岐して転写される。いくつかの実施形態では、PheP、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子のそれぞれの発現は、異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、PheP、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の発現は、同じプロモーターによって制御される。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された細菌中の天然pheP遺伝子は改変されず、そして天然pheP遺伝子の1つ以上の追加コピーがPALの発現を制御する同じ誘導性プロモーター(例えば、FNRプロモーター)、またはPALの発現を制御するものとは別の誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム中に挿入される。代わりの実施形態では、天然pheP遺伝子は改変されず、異なる細菌種由来の非天然pheP遺伝子のコピーがPALの発現を制御する同じ誘導性プロモーター(例えば、FNRプロモーター)、またはPALの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で、ゲノムに挿入される。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された細菌中の天然pheP遺伝子は改変されず、そして天然pheP遺伝子の1つ以上の追加コピーがプラスミド上の細菌中に存在し、そしてPALの発現を制御する同じ誘導性プロモーター(例えば、FNRプロモーター)、またはPMEの発現を制御するものとは異なった誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。代わりの実施形態では、天然pheP遺伝子は改変されておらず、異なる細菌種由来の非天然pheP遺伝子のコピーが細菌中のプラスミド上に存在し、PALの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、FNRプロモーター、またはPALの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。
いくつかの実施形態では、天然pheP遺伝子を突然変異させ、フェニルアラニン輸送の増加を示す突然変異体を選択し、突然変異phePを選択する。本明細書中に記載されるフェニルアラニントランスポーターの改変は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleであり、大腸菌Nissleの天然pheP遺伝子は改変されていない;天然の大腸菌NissleのpheP遺伝子の1つ以上の追加コピーを、PALの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばFNRプロモーター、またはPALの発現を制御するものとは別の誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で大腸菌Nissleゲノムに挿入する。別の実施形態では、大腸菌Nissleの天然pheP遺伝子は改変されず、異なる細菌由来の非天然pheP遺伝子のコピーがPALの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばFNRプロモーター、またはPALの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で大腸菌Nissleゲノムに挿入される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleであり、大腸菌Nissleの天然pheP遺伝子は改変されておらず、天然の大腸菌NissleのpheP遺伝子の1つ以上の追加コピーはプラスミド上の細菌に存在し、PALの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、FNRプロモーター、またはPALの発現を制御するものとは異なった誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。別の実施形態では、大腸菌Nissleの天然pheP遺伝子は改変されておらず、異なる細菌由来の非天然pheP遺伝子のコピーがプラスミド上の細菌に存在し、PALの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えばFNRプロモーター、またはPALの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。
他の実施形態では、1つまたは複数のPheトランスポーターをコードする遺伝子がプラスミド上または染色体内に位置してもよく、遺伝子発現はPME遺伝子を調節するプロモーターと同じであっても異なっていてもよい、本明細書に開示されるプロモーターのいずれかによって調節されてもよい。
エシェリヒア属大腸菌は、芳香族アミノ酸の集積のための5つの異なる輸送系(AroP、Mtr、PheP、TnaB、およびTyrP)を有することが報告されている。フェニルアラニンを含む3つの芳香族アミノ酸を、芳香族P遺伝子によってコードされる全般的なアミノ酸パーミアーゼが高親和性で輸送し、フェニルアラニン輸入のライオンシェアの原因であるPhePと一緒に考えられている。さらに、芳香族アミノ酸トランスポーター欠損大腸菌株(ΔaroP ΔpheΔmtr Δtna ΔtyrP)でフェニルアラニンの低濃度蓄積が観察され、2つのペリプラズム結合タンパク質、LIV結合タンパク質(LIV‐システム)およびLS結合タンパク質(LS系)、ならびにメンブラン成分であるLivHMGF(Koyanagiら、およびその参考文献;エシェリヒア属coli K‐12における第3フェニルアラニントランスポーターとしてのLIV‐I/LS系の同定)からなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターであるLIV‐I/LS系の活性が追跡された。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はaroP遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleであり、大腸菌Nissleの天然aroP遺伝子は改変されておらず、天然の大腸菌NissleのaroP遺伝子の1つ以上の追加コピーはプラスミド上の細菌または染色体中に存在し、PMEの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、FNRプロモーターまたはaraBADプロモーター、PMEの発現を制御するものとは別の誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。別の実施形態では、大腸菌Nissleの天然aroP遺伝子は改変されておらず、異なる細菌由来の非天然aroP遺伝子のコピーがプラスミド上または染色体中の細菌に存在し、PMEの発現を制御する同じ誘導性プロモーター、例えば、FNRプロモーターまたはAraBADプロモーター、またはPMEの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下にある。
他の実施形態では、遺伝子操作された細菌が同じまたは異なった誘導性または構成的プロモーターの制御下で、AroPおよびPhePを含む。
いくつかの実施形態では、pheP遺伝子は染色体上に発現される。いくつかの実施形態では、染色体からの発現がphePの発現の安定性を増加させるために有効であり得る。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子が遺伝子操作された細菌中の1つ以上の組み込み部位で細菌染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子が大腸菌Nissleにおける以下の挿入部位:malE/K、insB/I、araC/BAD、lacZ、agal/rsml、thyA、およびmalP/Tの1つ以上で細菌ゲノムに挿入される。任意の適切な挿入部位が使用され得る(例えば、その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580の図66を参照)。挿入部位はゲノムのどこにあってもよく、例えば、thyA(栄養要求株を作り出すため)のような生存および/または成長に必要な遺伝子;ゲノム複製部位付近のようなゲノムの活性領域;および/またはアラビノースオペロンのAraBとAraCとの間のような意図しない転写の危険性を減少させるための分岐プロモーターの間にあってもよい。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がin vivo投与の前に直接的または間接的に前もって誘導される、例えば、in vivo投与の前の株の産生の間に、フラスコ、発酵槽、または他の培養容器中の細菌の培養物中に提供される特異的分子または代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される、1つ以上のPheトランスポーターをコードする。
他の実施形態では、遺伝子操作された細菌がin vivo投与で直接的または間接的に誘導される、例えば、外因性のin vivo環境、例えば、消化管において応答性条件または特異的分子もしくは代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される、1つ以上のPheトランスポーターをコードする。いくつかの実施形態では、プロモーターが消化管特異的分子または低酸素状態によって誘導される。いくつかの実施形態では、細菌株が化学物質および/または栄養性誘導物質と組合せて投与される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が多数の作用機構および/または1つ以上の栄養要求性を含む。特定の実施形態では、細菌が染色体上の異なる組み込み部位(例えば、mallE/K、icS/nepI、malP/T、agaI/rsmI、cea)に挿入された酸素レベル依存性プロモーターの管轄下にある5個のPAL(例えば、PfnrS−PAL3)と、染色体上の異なる組み込み部位(例えば、lacZ)に挿入された酸素レベル依存性プロモーターの制御下にあるフェニルアラニントランスポーター遺伝子の1個のコピー(例えば、PfnrS−pheP)から構成されるように遺伝子組換えが行われる。より具体的な態様において、細菌は、カナマイシン耐性遺伝子、およびthyA遺伝子が欠失および/または無関係の遺伝子で置換されているthyA栄養要求性をさらに含むように遺伝子操作される。
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、1つ以上のフェニルアラニントランスポーターをコードする1つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、1つ以上の内因性バクテリオファージをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージがバクテリオファージゲノム内の1つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、1つ以上のバクテリオファージ遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。
いくつかの実施形態では、pheP遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および/または転写調節因子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および/または転写調節因子の発現を制御する同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子ならびにフェニルアラニン代謝酵素および/または転写調節因子は、プロモーター領域から多岐に転写される。いくつかの実施形態では、PheP、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の各々の発現は、異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、PheP、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の発現は、同じプロモーターによって制御される。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細菌における天然のpheP遺伝子は改変されず、天然のpheP遺伝子の1つまたは複数のさらなるコピーが、PALの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばFNRプロモーター、もしくはPALの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム内に挿入される。代替の実施形態では、天然のpheP遺伝子は改変されず、異なる細菌種由来の非天然のpheP遺伝子のコピーが、PALの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばFNRプロモーター、もしくはPALの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム内に挿入される。
いくつかの実施形態では、遺伝子組換え細菌における天然のpheP遺伝子は改変されず、天然のpheP遺伝子の1つまたは複数のさらなるコピーが、プラスミド上で、PALの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばFNRプロモーター、もしくはPMEの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。代替の実施形態では、天然のpheP遺伝子は改変されず、異なる細菌種由来の非天然のpheP遺伝子のコピーが、プラスミド上で、PALの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばFNRプロモーター、もしくはPALの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。
いくつかの実施形態では、天然pheP遺伝子は突然変異誘発され、フェニルアラニン輸送の増加を示す突然変異体が選択され、突然変異したpheP。本明細書に記載のフェニルアラニン輸送体の改変は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleであり、大腸菌Nissleにおける天然のpheP遺伝子は改変されず、1つまたは複数のさらなるコピーの天然の大腸菌Nissle pheP遺伝子が、PALの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばFNRプロモーター、もしくはPALの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で大腸菌Nissleゲノム内に挿入される。代替の実施形態では、大腸菌Nissleにおける天然のpheP遺伝子は改変されず、異なる細菌由来の非天然のpheP遺伝子のコピーが、PALの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばFNRプロモーター、もしくはPALの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で、大腸菌Nissleゲノム内に挿入される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleであり、大腸菌Nissleにおける天然のpheP遺伝子は改変されず、1つまたは複数のさらなるコピーの天然の大腸菌Nissle pheP遺伝子は、プラスミド上で、PALの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばFNRプロモーター、もしくはPALの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。代替の実施形態では、大腸菌Nissleにおける天然のpheP遺伝子は改変されず、異なる細菌由来の非天然のpheP遺伝子のコピーが、プラスミド上で、PALの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばFNRプロモーター、もしくはPALの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。
他の実施形態では、1つ以上のPheトランスポーター(複数可)をコードする遺伝子(群)は、プラスミドまたは染色体に位置することができ、その遺伝子発現は本明細書に開示される任意のプロモーターによって制御されることができ、そのプロモーターはPME遺伝子(群)を調節するプロモーターと同一または異なることができる。
大腸菌は、芳香族アミノ酸を蓄積するための5つの異なる輸送系(AroP、Mtr、PheP、TnaB、およびTyrP)を有することが報告されている。aroP遺伝子によってコードされる一般的なアミノ酸ペルメアーゼは、フェニルアラニンを含む3つの芳香族アミノ酸を高親和性で輸送し、PhePと一緒に、フェニルアラニン取り込みの大部分を担うと考えられている。さらに、フェニルアラニンの低レベルの蓄積が芳香族アミノ酸トランスポーター欠損大腸菌株(ΔaroP ΔpheP Δmtr Δtna ΔtyrP)において観察され、LIV−I/LS系の活性まで追跡され、そのLIV−I/LS系は、2つの周辺質結合タンパク質である、LIV結合タンパク質(LIV−I系)およびLS結合タンパク質(LS系)、ならびに膜成分、LivHMGFからなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターである(Koyanagiら、およびその中の参考文献;Identification of the LIV−I/LS System as the Third Phenylalanine Transporter in Escherichia coli K−12)。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はaroP遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleであり、大腸菌Nissleにおける天然のaroP遺伝子は改変されず、天然の大腸菌Nissle aroP遺伝子の1つまたは複数のさらなるコピーが、プラスミド上または染色体中で、PMEの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばFNRプロモーター、もしくはaraBADプロモーター、PMEの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。代替の実施形態では、大腸菌Nissleにおける天然のaroP遺伝子は改変されず、異なる細菌由来の非天然のaroP遺伝子のコピーは、プラスミド上または染色体中で、PMEの発現を制御する同じ誘導可能なプロモーター、例えばFNRプロモーターもしくはAraBADプロモーター、またはPMEの発現を制御するプロモーターと異なる誘導可能なプロモーター、あるいは構成的プロモーターの制御下で細菌に存在する。
他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じまたは異なる誘導可能なまたは構成的プロモーターの制御下で、AroPおよびPhePを含む。
いくつかの実施形態では、pheP遺伝子は染色体上で発現される。いくつかの実施形態では、染色体からの発現はphePの発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子は遺伝子操作された細菌における1つまたは複数の組み込み部位において細菌染色体内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、pheP遺伝子は、大腸菌Nissleにおける以下の挿入部位:malE/K、insB/I、araC/BAD、lacZ、agal/rsml、thyA、およびmalP/Tのうちの1つまたは複数において細菌ゲノム内に挿入される。任意の適切な挿入部位が使用されてもよい(例えば、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるWO2017087580の図66を参照のこと)。挿入部位は、ゲノム内、例えば、(栄養要求株を作製するために)thyAなどの生存および/もしくは増殖に必要とされる遺伝子内、ゲノム複製部位付近などのゲノムの活性領域内、ならびに/またはアラビノースオペロンのAraBとAraCとの間などの、意図しない転写のリスクを低減させるために分岐プロモーターの間のいずれの場所にあってもよい。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、1つ以上のPheトランスポーターをコードし、当該Pheトランスポーターは、in vivo投与前に直接または間接的にプレ誘導される(例えば、in vivo投与前の株の生産中に、フラスコ、発酵槽、または他の培養容器中の培養液に供給される特定の分子または代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現する)。
他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、1つ以上のPheトランスポーターをコードし、当該Pheトランスポーターはin vivo投与、直接的または間接的に誘導される(例えば、外因性in vivo環境(例えば、消化管)における応答条件であり、または特異的分子もしくは代謝産物に対する誘導性プロモーターの制御下で発現する。)。いくつかの実施形態では、プロモーターは、消化管に特異的な分子または低酸素状態によって誘導される。いくつかの実施形態では、細菌株は、化学的および/または栄養性誘導物質と組み合わせて投与される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は複数の作用機構および/または1つもしくは複数の栄養要求性を含む。特定の実施形態では、細菌は、染色体上の異なる組み込み部位(例えば、malE/K、yicS/nepI、malP/T、agaI/rsmI、およびcea)において挿入される酸素レベル依存性プロモーター(例えば、PfnrS−PAL3)の制御下でPALの5つのコピー、および染色体上の異なる組み込み部位(例えば、lacZ)において挿入される酸素レベル依存性プロモーター(例えば、PfnrS−pheP)の制御下でフェニルアラニントランスポーター遺伝子の1つのコピーを含むように遺伝子操作される。より特定の態様では、細菌は、カナマイシン耐性遺伝子、およびthyA栄養要求性をさらに含むように遺伝子操作され、thyA遺伝子は欠失され、および/または非関連遺伝子と置き換えられる。
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、1つ以上のフェニルアラニントランスポーターをコードする1つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、1つ以上の内因性バクテリオファージをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージがバクテリオファージゲノム内の1つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、1つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または1つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含する。
一実施形態では、大腸菌Nissleが、遺伝子操作された細菌の出発点、親株、または「シャシー(chassis)」として使用される。一実施形態では、改変されたバクテリオファージがその天然の状態で大腸菌Nissleに内因性であるファージである。
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が、1つ以上の大腸菌Nissleバクテリオファージ(例えば、ファージ1、ファージ2、およびファージ3)を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がファージ3において1つ以上の突然変異を含む。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、1つ以上のファージ3遺伝子内に位置するか、または1つ以上のファージ3遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が1つ以上の欠失を含む。
多数の作用機構
本発明のいくつかの実施形態では、EcNのゲノムに対する改変がジアミノピメラート栄養要求性を介して生物学的封じ込めを増強しながら、消化管中に見出される低酸素条件下でフェニルアラニン劣化を増強するために行われた。これらの遺伝子操作された細菌は、内因性EcNファージ3に対する1つ以上の改変をさらに含む。
いくつかの実施形態では、細菌が多数の作用機構(MoA)、例えば、同じ産物の複数のコピーを産生する回路(例えば、コピー数を増強するため)、または複数の異なった機能を実行する回路を含むように遺伝子操作される。挿入部位の例としてはWO2017087580の図66に示されるmalE/K、yicS/nepI、insB/I、araC/BAD、lacZ、agal/rsml、thyA、malP/T、dapA、およびcea、ならびにその他が挙げられるが、これらに限定されず、これらの含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、遺伝子操作された細菌は4つの異なった挿入部位、例えば、malE/K、insB/I、araC/BAD、およびlacZに挿入されたペイロードの4つのコピーを含むことができる。遺伝子操作された細菌はまた、4つの異なる挿入部位(例えば、malE/K、yicS/nepI、agaI/rsmI、およびcea)に挿入された同一または異なるペイロードの4つのコピー、ならびに異なる挿入部位(例えば、lacZ)に挿入された第3の同一または異なる遺伝子の1つのコピーを含み得る(WO2017087580の図13B、その含有量は、その全体が本明細書中に参考として援用される)。あるいは、遺伝子操作された細菌が3つの異なった挿入部位(例えば、malE/K、insB/I、およびlacZ)に挿入されたペイロードの3つのコピーを含み得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が、疾患または組織特異的分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応もしくは免疫抑制に関連する分子もしくは代謝産物の存在下、または炎症反応もしくは免疫抑制、肝臓障害、代謝疾患下、またはアラビノースなどのいくつかの実施形態ではまたは腫瘍微小環境中に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、記載された回路のいずれか1つ以上をIn低酸素条件で発現することができる。いくつかの実施形態では、記載される回路のいずれか1つ以上が1つ以上のプラスミド(例えば、高コピーまたは低コピー)上に存在するか、または細菌染色体中の1つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がさらに、記載された回路のうちの任意の1つ以上を発現することができ、以下のうちの1つ以上をさらに含む:(1)当技術分野で公知であり、本明細書で提供される任意の栄養要求性、例えば、thyA栄養要求性などの1つ以上の栄養要求性、(2)本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の死滅させるスイッチなどの1つ以上の死滅スイッチ回路、(3)1つ以上の抗生物質耐性回路、(4)本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の任意のトランスポーターなど、生物学的分子または基材をインポートするための1つ以上のトランスポーター、(5)本明細書に記載され、他の方法で当技術分野で公知の分泌回路などの1つ以上の分泌回路、および(6)そのような追加の回路のうちの1つ以上の組合せ。
いくつかの実施形態ではペイロードを産生するための遺伝子配列が発現される条件下で、細菌は同じ条件下での同じ亜型の非改変細菌と比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍、少なくとも約600倍、少なくとも約700倍、少なくとも約800倍、少なくとも約900倍、少なくとも約1,000倍、または少なくとも約1,500倍高いレベルで基質を代謝する。
これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、内因性ファージゲノムに対する1つ以上の突然変異または改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、突然変異がファージゲノム内の欠失、挿入、置換または逆位である。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のファージ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の遺伝子が置換される。いくつかの実施形態では、置換が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ遺伝子が逆転している。いくつかの実施形態では部分または1つ以上のファージ遺伝子が逆転している。
一実施形態では、本明細書中に記載される大腸菌Nissle細菌は、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内に、1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10055、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110から選択される1つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10145、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300 ECOLIN_10301、ECOLIN_10325、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
株培養中のPMEおよび/またはPheトランスポーターの誘導
本明細書中に記載されるPMEおよび/またはPheトランスポーターの誘導および前誘導のために、PCT/WO2017/087580 A1に記載されるように、プロトコールおよび戦略が使用され、その全内容は参照により本明細書中に明確に援用される。
本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は製造条件下(例えば、好気性、嫌気性、低酸素、または微好気性)で誘導される1つ以上のPMEおよび/または1つ以上のトランスポーターを含み、1つ以上の内因性バクテリオファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージがバクテリオファージゲノム内の1つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、1つ以上のバクテリオファージ遺伝子に位置するか、または1つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含する。
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が1つ以上の大腸菌Nissleバクテリオファージ(例えば、ファージ1、ファージ2、およびファージ3)を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がファージ3中に1つまたは突然変異を含む。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、1つ以上のファージ3遺伝子内に位置するか、または1つ以上のファージ3遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。1つの特定の実施形態では、欠失が、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が、配列番号281を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
プレ誘導の測定
いくつかの実施形態では、PMEおよび/またはPhePの発現が誘導されるそのような培養条件によって、同じ条件下で同じ亜型の非改変の細菌と比較して、またはベースラインレベルと比較して、培地中のフェニルアラニンが少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍減少する。いくつかの実施形態では、PMEおよび/またはPhePの発現が誘導されるそのような培養条件によって、同じ条件下で同じ亜型の非改変の細菌と比較して、またはベースラインレベルと比較して、培地中におけるトランス−ケイ皮酸(TCA)の生産が少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約40倍、または少なくとも約50倍になる。
いくつかの実施形態では、細菌培養物中のケイ皮酸の蓄積は、当該分野で公知であり本明細書に記載の方法によって測定される。ケイ皮酸産生は、フェニルアラニン分解と直接相関し、いくつかの実施形態では、ケイ皮酸は、株の増殖、生産および製造中の株活性の指標として使用され得る。したがって、フェニルアラニンの減少および/またはTCAの産生の測定は、in vivo投与前の治療株の誘導を測定および監視し、微調整するために使用され得る。
ファージ3
4つの異なる挿入部位、例えば、malE/K、insB/I、araC/BAD、およびlacZに挿入されたPAL
遺伝子操作された細菌はまた、4つの異なる挿入部位、例えば、malE/K、yicS/nepI、agaI/rsmI、およびceaにおいて挿入されたPALの4つのコピー、ならびに異なる組み込み部位、例えば、lacZにおいて挿入されたフェニルアラニントランスポーター遺伝子の1つのコピーを含んでもよい(図13B)。あるいは、遺伝子操作された細菌は、3つの異なる挿入部位、例えば、malE/K、insB/I、およびlacZにおいて挿入されたPALの3つのコピー、ならびに3つの異なる挿入部位、例えば、dapA、cea、およびaraC/BADにおいて挿入されたフェニルアラニントランスポーター遺伝子の3つのコピーを含んでもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、EcN内因性ファージ3に対する1つまたは複数の突然変異または改変をさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、(1)野生型または(安定性または代謝活性を増加させるための)突然変異型においてフェニルアラニンを分解するためPAL、PAH、および/またはLAAD、(2)野生型または(安定性または代謝活性を増加させるための)突然変異型においてフェニルアラニンを取り込むためのトランスポーターPhePおよび/またはAroP、(3)分泌および細胞外フェニルアラニン分解のためのPAL、PAH、LAAD、および/またはPheP、(4)本明細書に記載されているような分泌機構の成分、(5)栄養要求性、例えば、デルタThyAおよび/またはデルタdapA、(6)限定されないが、カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性を含む抗生物質耐性、(7)本明細書に記載されているように酸素代謝に関与する遺伝子の突然変異/欠失ならびに(8)内因性Nissleフェニルアラニン合成経路の遺伝子の突然変異/欠失(例えば、Phe栄養要求性についてデルタPheA)、(9)1つまたは複数のバイオセイフティーシステム構築物および/または死滅スイッチ、(10)1つ以上の他の調節因子、例えばFNRS24Y、(11)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つまたは複数の改変または突然変異、例えば、欠失、挿入、置換または逆位のうちの1つまたは複数をコードする1つまたは複数の遺伝子配列を含む。
本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、フェニルアラニンの消費のための遺伝子操作された細菌は、1つ以上の内因性バクテリオファージゲノムをさらに含む。いくつかの実施形態では、当該バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の1つ以上の遺伝子において突然変異されている。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、1つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または1つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、1つ以上の大腸菌Nissleバクテリオファージ、例えば、ファージ1、ファージ2、およびファージ3を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ファージ3おいて1つまたは複数の突然変異を含む。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、1つ以上のファージ3遺伝子内に位置するか、または1つ以上のファージ3遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入は抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、以下から選択される1つ以上の遺伝子内に位置する1つ以上の欠失を含む:ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09975、ECOLIN_09980、ECOLIN_09985、ECOLIN_09990、ECOLIN_09995、ECOLIN_10000、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10055、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。1つの特定の実施形態において、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列はファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
いくつかの実施形態では、ペイロード、例えばPME、Pheトランスポーターおよび/または転写調節因子を産生するための遺伝子配列が発現される条件下で、本開示の遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニンの分解およびTCAの生成の両方を、同一条件下の同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍、少なくとも約600倍、少なくとも約700倍、少なくとも約800倍、少なくとも約900倍、少なくとも約1000倍、または少なくとも約1500倍高いレベルで行う。
いくつかの実施形態では、ペイロード、例えばPME、Pheトランスポーターおよび/または転写調節因子を産生するための遺伝子配列が発現される条件下で、本開示の遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニンの分解および馬尿酸の生成の両方を、同一条件下の同じ亜型の未改変細菌と比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約10倍、少なくとも約15倍、少なくとも約20倍、少なくとも約30倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、少なくとも約200倍、少なくとも約300倍、少なくとも約400倍、少なくとも約500倍、少なくとも約600倍、少なくとも約700倍、少なくとも約800倍、少なくとも約900倍、少なくとも約1000倍、または少なくとも約1500倍高いレベルで行う。
いくつかの実施形態において、PMEおよび/またはPheトランスポーター(例えばPheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列は、構成的プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列は、直接的または間接的に外因性環境条件によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列は、低酸素もしくは嫌気性条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、当該PMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列の発現は、哺乳動物の消化管内の環境などの低酸素または嫌気性環境下で活性化される。本明細書に記載される例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター(例えば、FNR誘導性プロモーター)、アラビノース、テトラサイクリン、IPTG、ラムノース、ならびに他の化学的および/または栄養性誘導物質が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のこのような誘導性プロモーターは、本明細書に記載されるように、in vivo投与の前に菌株が調製される際に、in vitro培養条件下で誘導される。例示的な誘導性プロモーターの例には限定されないが、FNR応答性プロモーター、ParaBADプロモーター、およびPTetRプロモーター、Placプロモーター、rhaP BAD(ラムノース)プロモーターが含まれ、その各々について本明細書で詳細に記述する。誘導性プロモーターは、以下により詳細に記載される。
1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする少なくとも1つの遺伝子は、細菌細胞内のプラスミドまたは染色体上に存在し得る。一実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。別の実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列は、細菌細胞内の染色体に位置する。さらに別の実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列の天然コピーが細菌細胞内の染色体に位置し、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする1つ以上の遺伝子が細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列の天然コピーが細菌細胞内のプラスミド上に位置し、別種の細菌由来の少なくとも1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする少なくとも1つの遺伝子が細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列の天然コピーが染色体に位置し、別種の細菌由来の1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする1つ以上の遺伝子が細菌細胞の染色体に位置する。いくつかの実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列は低コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、1つ以上のPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)をコードする遺伝子配列は高コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、少なくとも1つのPMEおよび/またはPheトランスポーター(例えば、PheP)、および/または他の調節タンパク質(例えば、FNRS24Y)の発現を増加させるために有用であり得る。いくつかの実施形態では、上記の遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の内在性遺伝子における改変、突然変異、および/または欠失の1つ以上をさらに含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、1つ以上の内因性バクテリオファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の1つまたは複数の遺伝子において変異されている。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、1つまたは複数のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または1つまたは複数のバクテリオファージ遺伝子を包含し得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、1つ以上の大腸菌Nissleバクテリオファージ(例えば、ファージ1、ファージ2、およびファージ3)を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ファージ3において1つ以上の突然変異を含む。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、1つ以上のファージ3遺伝子内に位置するか、または1つ以上のファージ3遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が、以下から選択される1つ以上の遺伝子内に位置する1つ以上の欠失を含む:ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09975、ECOLIN_09980、ECOLIN_09985、ECOLIN_09990、ECOLIN_09995、ECOLIN_10000、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10035、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10055、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10185、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10235、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10265、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10305、ECOLIN_10310、ECOLIN_10315、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10335、ECOLIN_10340、およびECOLIN_10345。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170およびECOLIN_10175の1つ以上の完全または部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165およびECOLIN_10170の完全な欠失、ならびにECOLIN_10175の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株がFNR駆動PAL3(3×fnrS−PAL(malP/T、yicS/nepI、malE/K)、例えば、WO2017087580の配列番号38(その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる))およびFNR駆動phePの2つのコピー(2×fnrS−pheP(lacZ、agaI/rsmI)、例えば、WO2017087580の配列番号62(その内容全体が参照により本明細書に援用される))の3つの染色体挿入を含む。この株は、天然のパラプロモーター(Para::FNRS24Y、例えば、WO2017087580の配列番号64、その内容全体が参照により本明細書に援用される)によって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされたLAADの1コピーをさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、SYN−PKU707である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株がFNR駆動PAL3(3×fnrS−PAL(malP/T、yicS/nepI、malE/K)、例えば、WO2017087580の配列番号38(その内容全体が参照により本明細書に援用される))およびFNR駆動phePの2つのコピー(2×fnrS−pheP(lacZ、agaI/rsmI)、例えば、WO2017087580の配列番号62(その内容全体が参照により本明細書に援用される))の3つの染色体挿入を含む。この株は、天然のパラプロモーター(Para::FNRS24Y、例えば、WO2017087580の配列番号64、その内容全体が参照により本明細書に援用される)によって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされた変異型FNR転写因子FNRS24Yの1つの複製をさらに含む。dapA遺伝子が欠失しているdapA栄養要求性を含むようにゲノムをさらに操作する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、SYN−PKU712である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株はFNR駆動PAL3(3×fnrS−PAL(malP/T、yicS/nepI、malE/K)、例えば、WO2017087580の配列番号38(その内容全体が参照により本明細書に援用される))およびFNR駆動phePの2つのコピー(2×fnrS−pheP(lacZ、agaI/rsmI)、例えば、WO2017087580の配列番号62(その内容全体が参照により本明細書に援用される))の3つの染色体挿入を有する細菌染色体を含む。この株はさらに、天然のパラプロモーターによって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされた変異型FNR転写因子FNRS24Yの1コピー、および同じ挿入部位に挿入されたLAADの1コピー(Para::FNRS24Y−LAAD、例えば、WO2017087580の配列番号73(その内容全体が参照により本明細書に援用される))を含み、これは、内因性アラビノースプロモーターからのバイシストロニックメッセージとして転写される。dapA遺伝子が欠失しているdapA栄養要求性を含むようにゲノムをさらに操作する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、SYN−PKU708である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株はFNR駆動PAL3(3×fnrS−PAL(malP/T、yicS/nepI、malE/K)、例えば、WO2017087580の配列番号38(その内容全体が参照により本明細書に援用される))およびFNR駆動phePの2つのコピー(2×fnrS−pheP(lacZ、agaI/rsmI)、例えば、WO2017087580の配列番号62(その内容全体が参照により本明細書に援用される))の3つの染色体挿入を有する細菌染色体を含む。この株はさらに、天然のパラプロモーターによって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされた変異型FNR転写因子FNRS24Yの1コピー、および同じ挿入部位に挿入されたLAADの1コピー(Para::FNRS24Y−LAAD、例えば、WO2017087580の配列番号73(その内容全体が参照により本明細書に援用される))を含み、これは、内因性アラビノースプロモーターからのバイシストロニックメッセージとして転写される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、SYN−PKU711である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株はFNR駆動PAL3(3×fnrS−PAL(malP/T、yicS/nepI、malE/K)、例えばWO2017087580の配列番号38(その内容全体が参照により本明細書に援用される))の3つの染色体挿入、およびFNR駆動pheP(2×fnrS−pheP(lacZ、agaI/rsmI)、例えばWO2017087580の配列番号62(その内容全体が参照により本明細書に援用される)の2つのコピーを含む細菌染色体を含む。この株は天然のパラプロモーター(Para::LAAD、例えば、WO2017087580の配列番号40(その内容全体が参照により本明細書に援用される))によって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされたLAADの1コピーをさらに含む。dapA遺伝子が欠失しているdapA栄養要求性を含むようにゲノムをさらに操作する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、SYN−PKU709である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌株はFNR駆動PAL3(3×fnrS−PAL(malP/T、yicS/nepI、malE/K)、例えばWO2017087580の配列番号38(その内容全体が参照により本明細書に援用される))の3つの染色体挿入、およびFNR駆動pheP(2×fnrS−pheP(lacZ、agaI/rsmI)、例えばWO2017087580の配列番号62(その内容全体が参照により本明細書に援用される)の2つのコピーを含む細菌染色体を含む。この株は天然のパラプロモーター(Para::LAAD、例えば、WO2017087580の配列番号40(その含有量はその全体が本明細書中に参考として援用される))によって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされたLAADの1つのコピーをさらに含む。SYN−PKU710はIPTG誘導性PAL3の2つのコピー(2×LacIPAL、exo/ceaおよびrhtC/rhtB、例えば、WO2017087580の配列番号74(その内容全体が参照により本明細書に援用される))、dapA栄養要求性をさらに含み、そして全ての抗生物質耐性が治癒される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、SYN−PKU710である。
これらの実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載され、WO2017087580の図47に示される遺伝子操作されたものいずれかは、その内容全体が本明細書に参考として援用され、本明細書に記載される1つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載される1つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。非限定的な例ではECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は部分的または完全に欠失される。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌が(野生型遺伝子に加えて)2追加コピーのPhePを含む。これは、PheP遺伝子の1つが突然変異を獲得するケースにおいて、冗長性を提供する。一実施形態では、PheP遺伝子はlacZおよびagal/rsmlに挿入される。一実施形態では、PhePの2つのコピーがPfnrSプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がPAL3の3つのコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がmalEK、malPT、yicS/neplに挿入されたPAL3の3つのコピーを含む。一実施形態では、PAL3の3つのコピーの発現がPfnrSプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がLAADの1つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がアラビノースオペロンに挿入されたLAADの1つの複製を含む。一実施形態では、LAADが内因性パラバッドプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が栄養要求性、例えばdeltaThyAを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は抗生物質耐性を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が抗生物質耐性および栄養要求性(例えば、deltaThyA)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が栄養要求性、例えばdeltaThyAを含まない。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は抗生物質耐性を含まない。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が抗生物質耐性も栄養要求性も含まない(例えば、deltaThyA)。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌がPALの3コピー、例えばPAL3、PhePの2コピー(内因性PhePに加えて)、およびLAADの1コピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がPALの3コピー、例えばPAL3、PhePの2コピー(内因性PhePに加えて)、およびLAADの1コピー、および栄養要求性、例えばδThyAを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が3コピーのPAL、2コピーのPheP(内因性PhePに加えて)、および1コピーのLAAD、および抗生物質耐性遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が3コピーのPAL、2コピーのPheP(内因性PhePに加えて)、および1コピーのLAAD、ならびに抗生物質耐性遺伝子および栄養要求性、例えばδThyAを含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌が3コピーのPAL(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にある)、2コピーのPheP(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にある)、および1コピーのLAAD(内因性パラBADプロモーターの制御下にある)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が3コピーのPAL(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にある)、2コピーのPheP(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にある)、および1コピーのLAAD(内因性パラバッドプロモーターの制御下にある)、および抗生物質耐性を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が3コピーのPAL(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にある)、2コピーのPheP(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にある)、および1コピーのLAAD(内因性パラバッドプロモーターの制御下にある)、および栄養要求性、例えばδdapAを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がPALの3つのコピー(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にある)、PhePの2つのコピー(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にある)、およびLAADの1つのコピー(内因性パラバッドプロモーターの制御下にある)、ならびに抗生物質耐性および栄養要求性、例えばΔdapAを含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌が3コピーのPAL(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にあり、malEK、malPT、およびyicS/nepl部位に挿入される)、2コピーのPheP(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にあり、LacZおよびagal/rsml部位に挿入される)、および1コピーのLAAD(内因性パラビノースプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入される)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が3コピーのPAL(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にあり、malEK、malPT、およびyicS/nepl部位に挿入されている)、2コピーのPheP(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にあり、LacZおよびagal/rsml部位に挿入されている)、および1コピーのLAAD(内因性パラビノースプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入されている)を含み、さらに抗生物質耐性を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が3コピーのPAL(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にあり、malEK、malPT、およびyicS/nepl部位に挿入される)、2コピーのPheP(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にあり、LacZおよびagal/rsml部位に挿入される)、および1コピーのLAAD(内因性パラビノースプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入される)を含み、栄養要求性、例えば、ΔdapAをさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が3コピーのPAL(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にあり、malEK、malPT、およびyicS/nepl部位に挿入されている)、2コピーのPheP(それぞれPfnrSプロモーターの制御下にあり、LacZおよびagal/rsml部位に挿入されている)、および1コピーのLAAD(内因性パラビノースプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入されている)を含み、抗生物質耐性および栄養要求性、例えばΔdapAをさらに含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、SYN−PKU705である。一実施形態では、SYN−PKU705が抗生物質耐性をさらに含む。一実施形態では、SYN−PKU705が栄養要求性、例えばdeltaThyAをさらに含む。一実施形態では、SYN−PKU705が抗生物質耐性および栄養要求性、例えばdeltaThyAをさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載される遺伝子操作された任意のものは、本明細書に記載される1つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載される1つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。非限定的な例ではECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は部分的または完全に欠失される。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Cに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(低コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はさらに、WO2017087580の図61Aに示されるプラスミドを含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Bの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号97)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1001である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Cに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(低コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はさらに、WO2017087580の図61Aに示されるプラスミドを含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Dの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のlacI−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号98)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1002である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Dに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックされる(中コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はさらに、WO2017087580の図61Aに示されるプラスミドを含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Bの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号97)。一実施形態では、当該株はSYN-PKU1003である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Dに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(中コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Dの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のlacI−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号98)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1004である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Cに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックインされる(低コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Bの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号97)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1005である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Cに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックインされる(低コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Dの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のlacI−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号98)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1006である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Dに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(中コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Bの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号97)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1007である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Dに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックインされる(中コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Dの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のlacI−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号98)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1008である。
一実施形態では、WO2017087580の図61Cに示される構築物(その全内容が参照により本明細書に援用される)の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(低コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はbla遺伝子がWO2017087580の図65Bの構築物で置換されることを除いて、図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号97)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1009である。
一実施形態では、WO2017087580の図61Cに示される構築物(その全内容が参照により本明細書に援用される)の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックされる(低コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Dの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のlacI−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号98)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1010である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、WO2017087580の図61Dに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(中コピーRBS;dapA::構成的プロム1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)参考として本明細書中に援用される)。この株はさらに、WO2017087580の図61Aに示されるプラスミドを含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Bの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号97)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1011である。
一実施形態では、WO2017087580の図61Dに示される構築物(その全内容が参照により本明細書に援用される)の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(中コピーRBS;dapA::構成的プロム1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株は、bla遺伝子がWO2017087580の図65Dの構築物で置換されることを除いて、図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、その全内容が参照により本明細書に援用される(lacI−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号98、その全内容が参照により本明細書に援用される)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1012である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、WO2017087580の図61Cに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックされる(低コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)参照により本明細書に援用される)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Bの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号97)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1013である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、WO2017087580の図61Cに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックインされる(低コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)参照により本明細書に援用される)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Dの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のlacI−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号98)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1014である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、WO2017087580の図61Dに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(中コピーRBS;thyA::構成的プロム1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)参照により本明細書に援用される)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Bの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号97)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1015である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、WO2017087580の図61Dに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックインされる(中コピーRBS;thyA::構成的プロム1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)参照により本明細書に援用される)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Dの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のlacI−Ptac−PAL−PAL、例えば、WO2017087580の配列番号98)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1016である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Cに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(低コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Aの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号95)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1017である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Cに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(低コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Cの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号96)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1018である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Dに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(中コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Aの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号95)。一実施形態では、当該株は、SYN−PKU1019である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Dに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(中コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Cの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号96)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1020である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Cに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックインされる(低コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Aの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号95)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1021である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Cに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックインされる(低コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はさらに、WO2017087580の図61Bに示されるプラスミドを含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Cの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号96)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1022である。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Dに示される構築物とを含み、その内容全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(中コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Aの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号95)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1023である。
一実施形態では遺伝子操作された細菌は、phePの2つの染色体コピー(lacZ::PfnrS−pheP、agaI/rsmI::PfnrS−pheP)と、WO2017087580の図61Dに示される構築物とを含み、その含有量はその全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックインされる(中コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はさらに、WO2017087580の図61Bに示されるプラスミドを含み、bla遺伝子がWO2017087580の図65Cの構築物で置換されることを除いて、その全内容が参照により本明細書に援用される(その全内容が参照により本明細書に援用されるWO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号96)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1024である。
一実施形態では、WO2017087580の図61Cに示される構築物(その含有量がその全体が本明細書中に参考として援用される)の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックインされる(低コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はbla遺伝子がWO2017087580の図65Aの構築物で置換されることを除いて、図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はその全体が基準により本明細書に組み込まれる(LacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号95、その含有量はその全体が基準により本明細書に組み込まれる)。一実施形態では、当該株はSYN−PKU1025である。
一実施形態では、WO2017087580の図61Cに示される構築物(その含有量がその全体が本明細書中に参考として援用される)の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックされる(低コピーRBS;dapA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はWO2017087580の図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はbla遺伝子がWO2017087580の図65Cの構築物で置換されることを除いて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる(その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、WO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号96)。1つの実施形態において、当該株は、SYN−PKU1026である。
1つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はWO2017087580の図61Dに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックされる(中コピーRBS;dapA::構成的プロム1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)参考として本明細書中に援用される)。この株はbla遺伝子がWO2017087580の図65Aの構築物で置換されることを除いて、図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる(LacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号95、その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる)。1つの実施形態において、当該株は、SYN−PKU1027である。
一実施形態では、WO2017087580の図61Dに示される構築物(その含有量がその全体が本明細書中に参考として援用される)の遺伝子操作された細菌が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックされる(中コピーRBS;dapA::構成的プロム1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)。この株はbla遺伝子がWO2017087580の図65Cの構築物で置換されることを除いて、図61Aに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる(LacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号96、その含有量はその全体が参照により本明細書に援用される)。一実施形態では、株はSYN−PKU1028である。
1つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はWO2017087580の図61Cに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックされる(低コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)参考として本明細書中に援用される)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はbla遺伝子がWO2017087580の図65Aの構築物で置換されることを除いて、その全体が基準により本明細書に組み込まれる(その含有量はその全体が基準により本明細書に組み込まれる、WO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号95)。1つの実施形態において、当該株は、SYN−PKU1029である。
1つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はWO2017087580の図61Cに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックされる(低コピーRBS;thyA::構成的prom1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)参考として本明細書中に援用される)。この株はさらに、WO2017087580の図61Bに示されるプラスミドを含み、その含有量はbla遺伝子がWO2017087580の図65Cの構築物で置換されることを除いて、その全体が参照により本明細書に援用される(その含有量はその全体が参照により本明細書に援用される、WO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号96)。一実施形態では、株はSYN−PKU1030である。
1つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はWO2017087580の図61Dに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のdapA遺伝子座にノックされる(中コピーRBS;thyA::構成的プロム1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)参考として本明細書中に援用される)。この株はWO2017087580の図61Bに示されるプラスミドをさらに含み、その含有量はbla遺伝子がWO2017087580の図65Aの構築物で置換されることを除いて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる(その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、WO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号95)。一実施形態では、株はSYN−PKU1032である。
1つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はWO2017087580の図61Dに示される構築物を含み、その含有量は、その全体が細菌染色体上のthyA遺伝子座にノックされる(中コピーRBS;thyA::構成的プロム1(BBA_J26100)−Pi(R6K)−構成的プロモーター2(P1)−Kis抗毒素)参考として本明細書中に援用される)。この株はさらに、WO2017087580の図61Bに示されるプラスミドを含み、その含有量はbla遺伝子がWO2017087580の図65Cの構築物で置換されることを除いて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる(その含有量はその全体が参照により本明細書に組み込まれる、WO2017087580のLacI Fnrs−Ptac−PAL−PAL−PheP、例えば、WO2017087580の配列番号96)。一実施形態では、株はSYN−PKU1032である。これらの実施形態のいずれかにおいて、AIPS系を含む本明細書に記載の遺伝子操作された任意のものは、本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含む。
これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載される1つ以上の突然変異をさらに含む、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。非限定的な例ではECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は部分的または完全に削除される。
前述の実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載される細菌は大腸菌Nissleファージ3ゲノム内に、1つ以上の改変または突然変異、例えば、欠失、挿入、置換または逆位を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10055、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110から選択される1つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10145、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300 ECOLIN_10301、ECOLIN_10325、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)およびPAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)およびPAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)を含み、フェニルアラニントランスポーターの1つまたは複数のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)およびLAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)およびLAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含み、大腸菌Nissleであり、フェニルアラニントランスポーターの1つまたは複数のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)およびPAHの1つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)およびPAHの1つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの1つまたは複数のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)およびLAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)およびLAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含み、フェニルアラニントランスポーターの1つまたは複数のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)およびPAHの1つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下に)およびPAHの1つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの1つまたは複数のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAHの1つまたは複数のコピーおよびLAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAHの1つまたは複数のコピーおよびLAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含み、フェニルアラニントランスポーターの1つまたは複数のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。PMEおよびトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー、例えば(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAHの1つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー、例えば(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAHの1つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの1つまたは複数のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー、例えば(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー、例えば(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)を含み、フェニルアラニントランスポーターの1つまたは複数のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー、例えば(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびPAHの1つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー、例えば(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびPAHの1つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの1つまたは複数のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、LAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、PAHの1つまたは複数のコピー、およびPAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、LAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、PAHの1つまたは複数のコピー、およびPAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)を含み、フェニルアラニントランスポーターの1つまたは複数のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。PMEおよび/またはトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。あるいは、PMEおよび/またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。PMEおよび/またはトランスポーターは、低または高コピープラスミドに含まれるPMEおよび/またはトランスポーターと組み合わせて、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれにおいても、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下、PAL1の1つまたは複数のコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAHの1つまたは複数のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PAL3の1つまたは複数のコピー、例えば(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PAL1の1つまたは複数のコピー、例えば(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、LAADの1つまたは複数のコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)、およびPAHの1つまたは複数のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの1つまたは複数のコピー(例えば、PhePおよび/またはAroP、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)をさらに含む。PMEおよびトランスポーターは本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。あるいは、PMEおよび/またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの1つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの1つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの1つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの1つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。PMEおよびトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれてもよい。あるいは、配置されたPMEおよび/またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの2つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの2つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの2つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの2つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの3つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの3つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの3つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの4つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの4つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの4つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの4つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの5つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの5つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの1つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの5つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの1つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、PALの5つのコピー(例えば、PAL1またはPAL3、例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、PhePの2つのコピー(例えば、Pfnrプロモーターの制御下)、およびLAADの2つのコピー(例えば、ParaBADプロモーターの制御下)を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の1つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ3であり、1つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、EC
OLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170は、部分的にまたは完全に欠失されている。
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載される細菌は大腸菌Nissleファージ3ゲノム内に、1つ以上の改変または突然変異、例えば、欠失、挿入、置換または逆位を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10055、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110から選択される1つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10145、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300 ECOLIN_10301、ECOLIN_10325、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。比一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素のうちの1つ以上を含む:
a)高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)Photorhabdus由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)プロテウス・ミラビリス由来のL‐アミノ酸デアミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子;
d)栄養要求性(例えば、dapAまたはThyA)を生成するための内因性遺伝子の1つ以上の欠失;
e)抗生物質耐性;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
前述の実施形態のいずれにおいても、ファージ3の突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか1つにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。比一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素のうちの1つ以上を含む:
a)高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)Photorhabdus由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)プロテウス・ミラビリス由来のL‐アミノ酸デアミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子;
d)栄養要求性(例えば、dapAまたはThyA)を生成するための内因性遺伝子の1つ以上の欠失;および
e)1つ以上の改変または突然変異(例えば、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の欠失、挿入、置換または逆位)。
前述の実施形態のいずれにおいても、ファージ3の突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか1つにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。比一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む:
a)高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)Photorhabdus由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)プロテウス・ミラビリス由来のL‐アミノ酸デアミナーゼをコードする1つ以上の遺伝子;
d)栄養要求性(例えば、dapAまたはThyA)を生成するための内因性遺伝子の1つ以上の欠失;および
e)1つ以上の改変または突然変異(例えば、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の欠失、挿入、置換または逆位)。
前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか1つにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素のうちの1つ以上を含む:
a)外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)化学物質または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の1つ以上のコピー;
d)パルプの表現を誘発する化学的誘導物質と同一または異なった、化学的誘導物質によって誘発されるプロモーターの規制上の制御のもとに、プロテウス・ミラビリス由来のL−アミノ酸デミナーゼ(LAAD)をコード化する1つ以上の遺伝子;
e)栄養要求性(例えば、dapAまたはThyA)を生成するための内因性遺伝子の1つ以上の欠失;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
前述の実施形態のいずれにおいても、ファージ3の突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか1つにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む:
a)外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)化学物質または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の1つ以上のコピー;
d)パルプの表現を誘発する化学的誘導物質と同一または異なった、化学的誘導物質によって誘発されるプロモーターの規制上の制御のもとに、プロテウス・ミラビリス由来のL−アミノ酸デミナーゼ(LAAD)をコード化する1つ以上の遺伝子;
e)栄養要求性(例えば、dapAまたはThyA)を生成するための内因性遺伝子の1つ以上の欠失;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか1つにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む:
a)外因性環境条件で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の2つの追加コピー;
b)外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の3コピー;
c)化学物質または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の2コピー;
d)化学的誘導物質によって誘発されるプロモーターの規制上のプロテウス・ミラビリス由来のL−アミノ酸デミナーゼ(LAAD)をコードした遺伝子のうち、パルの表現を誘発する化学的誘導物質と同一または異なったもの1個;
e)栄養要求性を生成するための内因性dapAの1つ以上の欠失;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
前述の実施形態のいくつかにおいて、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか1つにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素のうちの1つ以上を含む:
a)嫌気性−誘導性プロモーター(PfnrS)および嫌気性応答性転写活性化因子FNRの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)PfnrSおよびFNRの調節制御下でフォトラブダス・ルミネセンスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)合成プロモーター(Ptac)およびラクトース応答性転写リプレッサーLacIの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の1つ以上のコピー;
d)アラビノース−誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性化因子AraCの調節制御下でプロテウス・ミラビリスに由来するL−アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする1つ以上の遺伝子;
e)栄養要求性(例えば、dapAまたはThyA)を生成するための内因性遺伝子の1つ以上の欠失;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(例えば、欠失、挿入、置換または逆位)。
前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか1つにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む:
a)嫌気性−誘導性プロモーター(PfnrS)および嫌気性応答性転写活性化因子FNRの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の1つ以上の追加コピー;
b)PfnrSおよびFNRの調節制御下でフォトラブダス・ルミネセンスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子のもう1つのコピー;
c)合成プロモーター(Ptac)およびラクトース応答性転写リプレッサーLacIの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の1つ以上のコピー;
d)アラビノース−誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性化因子AraCの調節制御下でプロテウス・ミラビリスに由来するL−アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする1つ以上の遺伝子;
e)栄養要求性(例えば、dapAまたはThyA)を生成するための内因性遺伝子の1つ以上の欠失;および
f)1つ以上の改変または突然変異(例えば、大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の欠失、挿入、置換または逆位)。
上記の実施形態のいくつかにおいて、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか1つにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む修正ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
1つの具体的な実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素の各々を含む:
a)嫌気性−誘導性プロモーター(PfnrS)およびlacZおよびagal/rsml遺伝子座で染色体に挿入された嫌気性応答性転写活性化因子の調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の2つの追加コピー;
b)malEK、malPT、yicS/nepI遺伝子座の染色体に挿入されたPfnrSとFNRの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする3コピー;
c)合成プロモーター(Plac)とラクトース応答性転写リプレッサーLacI(exo/ceaおよびrhtC/rhtB遺伝子座に挿入)の調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の2つの追加コピー;
d)アラビノース−誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性化因子(AraC)の調節制御下でプロテウス・ミラビリス由来のL−アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の1部、天然アラビノースプロモーター下でLAAD;
e)ジアミノピメラート栄養要求株を作製するために4−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするdapA遺伝子の欠失;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の1つ以上の改変または突然変異(欠失、挿入、置換、逆位など)。
前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか1つにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10045、ECOLIN_10050、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10085、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115から選択される1つ以上の遺伝子に位置する。ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10195、ECOLIN_10200、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10310、ECOLIN_10320、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
1つの具体的な実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素の各々を含む:
a)嫌気性−誘導性プロモーター(PfnrS)およびlacZおよびagal/rsml遺伝子座で染色体に挿入された嫌気性応答性転写活性化因子FNRの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の2つの追加コピー;
b)PfnrSとFNRの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の3コピーを、malEK、malPT、yicS/nepI遺伝子座の染色体に挿入した;
c)合成プロモーター(Plac)およびラクトース応答性転写リプレッサーLacIの調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の2つの追加コピーは、exo/ceaおよびrhtC/rhtB遺伝子座に挿入される;
d)アラビノース−誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性化因子(AraC)の調節制御下でプロテウス・ミラビリス由来のL−アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)を符号化し、天然アラビノースプロモーター下でLAADを有する遺伝子の1部;
e)4−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードしてジアミノピメラート栄養要求株を産生するdapA遺伝子の欠失;および
f)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の領域のA欠失であって、欠失領域は、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、および部分的ECOLIN_10165を含む。
1つの具体的な実施形態では、遺伝子操作された細菌が以下の要素の各々を含む:
a)嫌気性−誘導性プロモーター(PfnrS)およびlacZおよびagal/rsml遺伝子座で染色体に挿入された嫌気性応答性転写活性化因子の調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の2つの追加コピー;
b)malEK、malPT、yicS/nepI遺伝子座の染色体に挿入されたPfnrSとFNRの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする3コピー;
c)合成プロモーター(Plac)とラクトース応答性転写リプレッサーLacI(exo/ceaおよびrhtC/rhtB遺伝子座に挿入)の調節制御下にあるPALをコードする遺伝子の2つの追加コピー;
d)アラビノース−誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性化因子(AraC)の調節制御下でプロテウス・ミラビリス由来のL−アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の1部、天然アラビノースプロモーター下でLAAD;
e)4−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードしてジアミノピメラート栄養要求株を産生するdapA遺伝子の欠失;および
g)大腸菌Nissleファージ3ゲノム内の領域の欠失(欠失領域は配列番号130からなる)。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Nissleである。いくつかの実施形態では、この株はSYN−PKU−2002と同じ改変である。いくつかの実施形態では、この株はSYN−PKU−2002である。
表14は、本開示の遺伝子操作された細菌の非限定的な例を含む。特定の実施形態では、表14の遺伝子操作された細菌は分泌のためのPMEをさらに含む。
遺伝子操作された生物、例えば操作された細菌または操作されたOVが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または他の抗癌分子、消化管バリアエンハンサー分子、抗炎症性分子、神経調節性分子、satietyエフェクター、DNA、RNA、小分子、または微生物から分泌されることを目的としたその他の分子を産生する本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、操作された微生物は、分泌機構、および分泌系をコードする対応する遺伝子配列を含み得る。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを代謝するための1つ以上のPMEを、分泌のための1つ以上のPMEと組合せて含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを代謝するための1つ以上のPMEと、分泌のための1つ以上のPMEと組み合わされたフェニルアラニントランスポーターとを含む。1つの実施形態において、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンを代謝するための1つ以上のPMEおよび分泌のための1つ以上のPMEと組み合わされたフェニルアラニントランスポーターを含み、そしてまた、栄養要求性および/または抗生物質耐性を含む。本明細書に記載される分泌系は、多数の作用機構との遺伝子操作された細菌においてPMEを分泌するために利用される。
これらの実施形態のいずれにおいても、本明細書に記載される細菌は大腸菌Nissleファージ3ゲノム内に、1つ以上の改変または突然変異、例えば、欠失、挿入、置換または逆位を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、ECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_100005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10055、ECOLIN_10070、ECOLIN_10075、ECOLIN_10080、ECOLIN_10090、ECOLIN_10095、ECOLIN_10100、ECOLIN_10105、ECOLIN_10110から選択される1つ以上の遺伝子を包含するか、またはそれらに位置する。ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10145、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10200、ECOLIN_10205、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10255、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10275、ECOLIN_10280、ECOLIN_10290、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300 ECOLIN_10301、ECOLIN_10325、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345、ECOLIN_10345。一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。
分泌
遺伝子操作された微生物がタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または他の抗癌、免疫調節、DNA、RNA、微生物から分泌されることを意図した小分子または他の分子を産生する、本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、操作された微生物は、分泌機構および分泌系をコードする対応する遺伝子配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞外環境において細菌細胞質から抗癌分子を分泌することができる天然の分泌機構または非天然の分泌機構をさらに含む。多くの細菌は細菌細胞外被を横切って基質を輸送するために高度な分泌系に進化している。小分子、タンパク質、およびDNAなどの基質は、細胞外間隙または周辺質(消化管内腔または他の間隙など)内に放出され得、標的細胞内に注入され得るか、または細菌膜に付随され得る。
グラム陰性細菌において、分泌機構は内膜および外膜の一方または両方に及んでもよい。
タンパク質、例えば、治療用ポリペプチドを細胞外間隙に移行するために、ポリペプチドは最初に細胞内で翻訳され、内膜を横切って動員され、最終的に外膜を横切って動員されなければならない。多くのエフェクタータンパク質(例えば、治療用ポリペプチド)−特に真核生物起源のもの−は、三次および四次構造を安定化させるためにジスルフィド結合を含有する。外膜を横切ってポリペプチドを移行させるために、これらの結合は周辺質シャペロンの支援を受けて酸化周辺質区画内で正確に形成することができるが、ジスルフィド結合は還元されなければならず、タンパク質は再び折り畳まれなくなる。
グラム陰性およびグラム陽性細菌からの異種ポリペプチド、例えば、エフェクター分子の分泌のための適切な分泌系は、係属中の同時所有の国際特許出願PCT/US2016/34200、出願05/25/16、PCT/US2017/013072、出願01/2017、PCT/US2017/016603、出願02/04/2016、PCT/US2017/017563、出願02/10/2017、PCT/US2016/044922、出願07/29/016、PCT/US2016/049781、出願08/31/2016、PCT/US2016/37098、出願06/10/16、PCT/US2016/069052に記載されている。PCT/US2016/32562、PCT/US2016/062369、PCT/US2017/013072その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
表面ディスプレイ
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌および/または微生物が細菌および/または微生物の表面上に固定または提示される、本明細書に記載される目的のポリぺプチドをコードする1つ以上の遺伝子および/または遺伝子カセットをコードする。細菌および/または微生物にディスプレイまたは固定されるペイロード分子の例は本明細書中に記載されるペイロード分子または他のエフェクターのいずれかであり、そして酵素(例えば、PMEまたはキヌレニナーゼ)、抗体(例えば、scFv断片)、および腫瘍特異的抗原またはネオ抗原を含むが、これらに限定されない。
グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の表面上の異種ポリペプチド、例えばエフェクター分子の表面ディスプレイに適したシステムは、国際公開第2017/123675号として公開された国際特許出願PCT/US2017/013072に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
必須遺伝子および栄養要求株
本明細書において使用される場合、「必須遺伝子」という用語は、細胞増殖および/または生存に必要とされる遺伝子を指す。細菌の必須遺伝子は当業者に周知であり、遺伝子の指向性欠失ならびに/またはランダム突然変異誘発およびスクリーニングによって同定され得る。(例えば、ZhangおよびLin、「DEG 5.0,a database of essential genes in both prokaryotes and eukaryotes」、Nucl Acids Res、2009年;37:D455−D458ならびにGerdesら、「Essential genes on metabolic maps」、Curr Opin Biotechnol、2006年;17(5):448〜456頁を参照のこと、それらの各々の全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる)。
「必須遺伝子」は、生物が生存している状況および環境に依存し得る。例えば、必須遺伝子の突然変異、改変、または除去により、栄養要求株になる本開示の遺伝子操作された細菌が得られ得る。栄養要求性の改変は、細菌がその必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子を欠いているため、生存または増殖に必須の外部から加えられた栄養素の非存在下で細菌を死滅させることを意図する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌のいずれかもまた、細胞生存および/または増殖に必要な遺伝子の欠失または突然変異を含む。一実施形態では、必須遺伝子はDNA合成遺伝子、例えばthyAである。別の実施形態では、必須遺伝子は細胞壁合成遺伝子、例えばdapAである。さらに別の実施形態では、必須遺伝子は、アミノ酸遺伝子、例えばserAまたはMetAである。対応する野生型遺伝子産物が細菌において産生されない限り、限定されないが、cysE、glnA、ilvD、leuB、lysA、serA、metA、glyA、hisB、ilvA、pheA、proA、thrC、trpC、tyrA、thyA、uraA、dapA、dapB、dapD、dapE、dapF、flhD、metB、metC、proAB、およびthi1を含む、細胞生存および/または増殖に必要な任意の遺伝子が標的化されてもよい。表18Aは、栄養要求性株を産生するために破壊または欠失され得る例示的な細菌遺伝子を列挙する。これらには、限定されないが、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要な遺伝子が含まれる。
[表18A]栄養要求株の産生に有用な細菌遺伝子の非限定的な例
表19Aは、経管栄養の24時間後および48時間後に検出したときのマウスの消化管における種々のアミノ酸栄養要求株の生存を示す。これらの栄養要求株は、大腸菌のNissle株ではないBW25113を使用して生成された。
[表19A]マウス消化管におけるアミノ酸栄養要求株の生存
例えば、チミンは細菌細胞増殖に必要とされる核酸であり、その非存在下では、細菌は細胞死を受ける。thyA遺伝子は、dUMPをdTMPに変換することによってチミン合成における第1段階を触媒する酵素である、チミジル酸シンテターゼをコードする(Satら、2003年)。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、thyA遺伝子が欠失し、および/または非関連遺伝子と置き換えられているthyA栄養要求株である。thyA栄養要求株は、例えば、in vitroで増殖培地にチミンを添加することによって、またはin vivoでヒトの消化管に天然に見出される高いチミンレベルの存在下で十分な量のチミンが存在する場合にのみ増殖できる。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、細菌が哺乳動物の消化管に存在する場合に相補される遺伝子の栄養要求性である。十分な量のチミンがないと、thyA栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変は、細菌細胞が栄養要求性の遺伝子産物の非存在下(例えば消化管の外部)で生存しないことを確実にするために使用される。
ジアミノピメリン酸(DAP)は、リシン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、細菌細胞壁成長に必要とされる(Meadowら、1959年;Clarksonら、1971年)。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌のいずれかは、dapDが欠失し、および/または非関連遺伝子と置き換えられているdapD栄養要求株である。例えば、in vitroでDAPを増殖培地に添加することによって、またはin vivoでヒトの消化管に天然に見出される高いDAPレベルの存在下で、十分な量のDAPが存在する場合にのみdapD栄養要求株は増殖できる。十分な量のDAPがないと、dapD栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変は、細菌細胞が栄養要求性の遺伝子産物の非存在下(例えば消化管の外部)で生存しないことを確実にするために使用される。
他の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、uraAが欠失し、および/または非関連遺伝子と置き換えられているuraA栄養要求株である。uraA遺伝子は、ピリミジンウラシルの取り込みおよびその後の代謝を促進する膜結合性トランスポーターであるUraAをコードする(Andersenら、1995年)。uraA栄養要求株は、例えば、in vitroで増殖培地にウラシルを添加することによって、またはin vivoでヒトの消化管に天然に見出される高いウラシルレベルの存在下で十分な量のウラシルが存在する場合にのみ増殖できる。十分な量のウラシルがないと、uraA栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変は、細菌が、栄養要求性の遺伝子産物の非存在下(例えば、消化管の外部)で生存しないことを確実にするために使用される。
複合的な集団において、細菌がDNAを共有することは可能である。非常にまれな状況において、栄養要求性細菌株は、ゲノム欠失を修復し、栄養要求株を恒久的に救出する非栄養要求性株からDNAを受け取ることができる。したがって、1つより多い栄養要求株で細菌株を操作することにより、栄養要求性を救出するのに十分な時間、DNA転移が発生する可能性を大きく減少させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、細胞生存および/または増殖に必要な2つ以上の遺伝子の欠失または突然変異を含む。
必須遺伝子の他の例には、限定されないが、yhbV、yagG、hemB、secD、secF、ribD、ribE、thiL、dxs、ispA、dnaX、adk、hemH、lpxH、cysS、fold、rplT、infC、thrS、nadE、gapA、yeaZ、aspS、argS、pgsA、yefM、metG、folE、yejM、gyrA、nrdA、nrdB、folC、accD、fabB、gltX、ligA、zipA、dapE、dapA、der、hisS、ispG、suhB、tadA、acpS、era、rnc、ftsB、eno、pyrG、chpR、lgt、fbaA、pgk、yqgD、metK、yqgF、plsC、ygiT、pare、ribB、cca、ygjD、tdcF、yraL、yihA、ftsN、murI、murB、birA、secE、nusG、rplJ、rplL、rpoB、rpoC、ubiA、plsB、lexA、dnaB、ssb、alsK、groS、psd、orn、yjeE、rpsR、chpS、ppa、valS、yjgP、yjgQ、dnaC、ribF、lspA、ispH、dapB、folA、imp、yabQ、ftsL、ftsI、murE、murF、mraY、murD、ftsW、murG、murC、ftsQ、ftsA、ftsZ、lpxC、secM、secA、can、folK、hemL、yadR、dapD、map、rpsB、infB、nusA、ftsH、obgE、rpmA、rplU、ispB、murA、yrbB、yrbK、yhbN、rpsI、rplM、degS、mreD、mreC、mreB、accB、accC、yrdC、def、fmt、rplQ、rpoA、rpsD、rpsK、rpsM、entD、mrdB、mrdA、nadD、hlepB、rpoE、pssA、yfiO、rplS、trmD、rpsP、ffh、grpE、yfjB、csrA、ispF、ispD、rplW、rplD、rplC、rpsJ、fusA、rpsG、rpsL、trpS、yrfF、asd、rpoH、ftsX、ftsE、ftsY、frr、dxr、ispU、rfaK、kdtA、coaD、rpmB、dfp、dut、gmk、spot、gyrB、dnaN、dnaA、rpmH、rnpA、yidC、tnaB、glmS、glmU、wzyE、hemD、hemC、yigP、ubiB、ubiD、hemG、secY、rplO、rpmD、rpsE、rplR、rplF、rpsH、rpsN、rplE、rplX、rplN、rpsQ、rpmC、rplP、rpsC、rplV、rpsS、rplB、cdsA、yaeL、yaeT、lpxD、fabZ、lpxA、lpxB、dnaE、accA、tilS、proS、yafF、tsf、pyrH、olA、rlpB、leuS、lnt、glnS、fldA、cydA、infA、cydC、ftsK、lolA、serS、rpsA、msbA、lpxK、kdsB、mukF、mukE、mukB、asnS、fabA、mviN、rne、yceQ、fabD、fabG、acpP、tmk、holB、lolC、lolD、lolE、purB、ymfK、minE、mind、pth、rsA、ispE、lolB、hemA、prfA、prmC、kdsA、topA、ribA、fabI、racR、dicA、ydfB、tyrS、ribC、ydiL、pheT、pheS、yhhQ、bcsB、glyQ、yibJ、およびgpsAが含まれる。他の必須遺伝子は当業者に公知である。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は合成リガンド依存性必須遺伝子(SLiDE)細菌細胞である。SLiDE細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ増殖する1つまたは複数の必須遺伝子において突然変異を有する合成栄養要求株である(LopezおよびAnderson、「Synthetic Auxotrophs with Ligand−Dependent Essential Genes for a BL21(DE3)Biosafety Strain」、ACS Synth Biol 2015年;4(12):1279〜1286頁、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる)。
いくつかの実施形態では、SLiDE細菌細胞は必須遺伝子における突然変異を含む。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、pheS、dnaN、tyrS、metG、およびadkからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異:H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I、およびS345Cのうちの1つまたは複数を含むdnaNである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I、およびS345Cを含むdnaNである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異:F125G、P183T、P184A、R186A、およびI188Lのうちの1つまたは複数を含むpheSである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異F125G、P183T、P184A、R186A、およびI188Lを含むpheSである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異:L36V、C38A、およびF40Gのうちの1つまたは複数を含むtyrSである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異L36V、C38A、およびF40Gを含むtyrSである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異:E45Q、N47R、I49G、およびA51Cのうちの1つまたは複数を含むmetGである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異E45Q、N47R、I49G、およびA51Cを含むmetGである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異:I4L、L5I、およびL6Gのうちの1つまたは複数を含むadkである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異I4L、L5I、およびL6Gを含むadkである。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はリガンドによって相補される。いくつかの実施形態では、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、2−アミノベンゾチアゾール、インドール−3−酪酸、インドール−3−酢酸、およびL−ヒスチジンメチルエステルからなる群から選択される。例えば、metGにおける突然変異(E45Q、N47R、I49G、およびA51C)を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、2−アミノベンゾチアゾール、インドール−3−酪酸、インドール−3−酢酸、またはL−ヒスチジンメチルエステルによって相補される。dnaNにおける突然変異(H191N、R240C、I317S、F319V、L340T、V347I、およびS345C)を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、または2−アミノベンゾチアゾールによって相補される。pheSにおける突然変異(F125G、P183T、P184A、R186A、およびI188L)を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは2−アミノベンゾチアゾールによって相補される。tyrSにおける突然変異(L36V、C38A、およびF40G)を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは2−アミノベンゾチアゾールによって相補される。adkにおける突然変異(I4L、L5IおよびL6G)を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールによって相補される。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、それをリガンドに対して栄養要求性にする1つより多い突然変異必須遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は2つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、tyrSにおける突然変異(L36V、C38A、およびF40G)およびmetGにおける突然変異(E45Q、N47R、I49G、およびA51C)を含む。他の実施形態では、細菌細胞は3つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、tyrSにおける突然変異(L36V、C38A、およびF40G)、metGにおける突然変異(E45Q、N47R、I49G、およびA51C)、およびpheSにおける突然変異(F125G、P183T、P184A、R186A、およびI188L)を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、必須遺伝子が、WO2017087580の図85〜86に示されるアラビノース系を使用して置き換えられている条件付き栄養要求株である。
いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は栄養要求株であり、また、本明細書に記載される死滅スイッチ成分および系のいずれかなどの死滅スイッチ回路も含む。例えば、遺伝子操作された細菌は、細胞生存および/または増殖に必要とされる必須遺伝子、例えばDNA合成遺伝子、例えばthyA、細胞壁合成遺伝子、例えばdapAおよび/またはアミノ酸遺伝子、例えばserAもしくはMetAにおける欠失または突然変異を含んでもよく、また、環境条件および/もしくはシグナル(記載されるアラビノース系など)に応答して発現される1つもしくは複数の転写活性化因子によって調節されるか、または外因性環境条件および/もしくはシグナル(本明細書に記載されるリコンビナーゼ系など)を検知すると発現される1つもしくは複数のリコンビナーゼによって調節される毒素遺伝子も含んでもよい。他の実施形態は、Wrightら、「GeneGuard:A Modular Plasmid System Designed for Biosafety」、ACS Synth Biol、2015年;4(3):307〜316頁に記載されており、その全内容は参照により本明細書に明確に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は栄養要求株であり、また、本明細書に記載される死滅スイッチ成分および系のいずれかなどの死滅スイッチ回路、ならびに条件付き複製起点などの別のバイオセキュリティー系も含む(Wrightら、2015年)。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、1つ以上のバイオセイフティープラスミドと組み合わせて細菌染色体に組み込まれた1つ以上のAIPS構築物を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、プラスミド複製開始タンパク質がトランスで提供される(すなわち、染色体に組み込まれたバイオセイフティー構築物によってコードされる)条件付き複製起点(COR)を含む。いくつかの実施形態において、染色体に組み込まれた構築物は、栄養要求性(例えば、dapAまたはthyA栄養要求性)が生じるように宿主にさらに導入され、当該栄養要求性は、バイオセイフティープラスミド構築物から発現する遺伝子産物によって補充される。いくつかの実施形態では、バイオセイフティープラスミドは広域スペクトル毒素(例えば、Kis)をさらにコードするが、組み込みバイオセイフティー構築物は抗毒素(例えば、抗Kis)をコードし、両方の構築物を含む細菌細胞ではプラスミド増殖が可能になる。理論に縛られることを望むものではないが、この機構は、プラスミドDNA自体が野生型細菌によって維持されることを不利にすることによって、プラスミド散布を選択しないように機能する。そのようなバイオセイフティーシステムの非限定的な例が、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるWO2017087580の図61A、図61B、図61C、および図61Dに示されている。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号81、82、83、84、85またはその機能的断片のDNA配列に、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%相同な染色体に挿入されたバイオセイフティー構築物核酸配列(プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる)を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号86、87、88またはその機能的断片のポリペプチド配列に、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%相同なポリぺチド配列をコードする染色体に挿入されたバイオセイフティー構築物核酸配列(プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる)を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号89、90、91、92、93、94またはその機能的断片のDNA配列に、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%相同な染色体ベースのバイオセイフティー構築物核酸配列(プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる)を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるWO2017087580の配列番号89、90、91、92、93、94またはその機能的断片のDNA配列によってコードされるポリペプチド配列に、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%相同なポリペプチド配列をコードする染色体ベースのバイオセイフティー構築物核酸配列(プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる)を含む。
いくつかの実施形態では本遺伝子操作された細菌がWO2017087580の配列番号36、37、74、95、96、98、99、100、113のDNA配列と少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%相同であるプラスミドベースのバイオセイフティー構築物ペイロード核酸配列を含み、その内容はその全体が本明細書中に参考として援用される。いくつかの実施形態では本遺伝子操作された細菌がWO2017087580の配列番号36、37、74、95、96、98、99、100、113のDNA配列によって符号化されるポリペプチドと少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%相同であるポリペプチドをコードするプラスミドベースのバイオセイフティー構築物ペイロード核酸配列を含み、その含有量はその全体が本明細書中に参考として援用される。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がPALの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がPhePの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がLAADの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がPALの1つ以上のコピーおよびPhePの1つ以上のコピーを含む。
いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がPALの1つ以上のコピーおよびLAADの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がLAADの1つ以上のコピーおよびPhePの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物がPALの1つ以上のコピーおよびPhePの1つ以上のコピーおよびLAADの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン異化プラスミドペイロード(すなわち、PAL、PheP、および/またはLAAD)は本明細書中に記載されるような1つ以上の構成的または誘導性プロモーター(例えば、低酸素、アラビノース、IPTG誘導性、またはそれらの組合せ)の制御下にある。いくつかの実施形態では、このプロモーターはプレ誘導に有効である。いくつかの実施形態では、本プロモーターはin vivo活性化に有効である。いくつかの実施形態では、本プロモーターがプレ誘導およびin vivo活性に有効である。いくつかの実施形態では、この構築物は2つ以上のプロモーターから構築物されており、その中には導入前に役立つものもあり、中には生体活性に役立つものもある。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニンの異化のためのペイロード構築物を含むプラスミドベースのバイオセイフティー構築物核酸配列(染色体ベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる)を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、PALの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、PhePの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、LAADの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、PALの1つ以上のコピーおよびPhePの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、PALの1つ以上のコピーおよびLAADの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、LAADの1つ以上のコピーおよびPhePの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、PALの1つ以上のコピーおよびPhePの1つ以上のコピーおよびLAADの1つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン異化プラスミドペイロード(すなわち、PAL、PheP、および/またはLAAD)は、本明細書に記載の1つ以上の構成的または誘導性プロモーター(例えば、低酸素、アラビノース、IPTG誘導性、またはそれらの組み合わせ)の制御下にある。いくつかの実施形態では、プロモーターはプレ誘導に有用である。いくつかの実施形態では、プロモーターはin vivoでの活性化に有用である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、プレ誘導およびin vivo活性に有用である。いくつかの実施形態では、構築物は2つ以上のプロモーターを含み、当該プロモーターの一部はプレ誘導に有用であり、一部はin vivo活性に有用である。
これらの実施形態のいずれかにおいて、栄養要求性を含む遺伝子操作された細菌は、内因性ファージゲノムに対する1つ以上の突然変異または改変を含む。いくつかの実施形態では、内因性ファージゲノムに対する改変がファージゲノム内の1つ以上の欠失、挿入、置換、または逆位、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のファージ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の遺伝子が置換される。いくつかの実施形態では、置換が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ遺伝子が逆転している。1つ以上のファージ遺伝子のいくつかの実施形態では部分は逆転している。
いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が大腸菌Nissleに由来し、そして1つ以上の大腸菌Nissleバクテリオファージ(例えば、ファージ1、ファージ2、およびファージ3)を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がファージ3中に1つまたは突然変異を含む。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、1つ以上のファージ3遺伝子に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がECOLIN_09965、ECOLIN_09970、ECOLIN_09980、ECOLIN_09990、ECOLIN_10005、ECOLIN_10010、ECOLIN_10015、ECOLIN_10020、ECOLIN_10025、ECOLIN_10030、ECOLIN_10040、ECOLIN_10045、ECOLIN_10065、ECOLIN_10070、ECOLIN_10080、ECOLIN_10090、ECOLIN_10100、ECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120から選択される1つ以上の遺伝子を含む。ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10160、ECOLIN_10175、ECOLIN_10180、ECOLIN_10190、ECOLIN_10205、ECOLIN_10210、ECOLIN_10220、ECOLIN_10225、ECOLIN_10230、ECOLIN_10240、ECOLIN_10245、ECOLIN_10250、ECOLIN_10260、ECOLIN_10270、ECOLIN_10280、ECOLIN_10295、ECOLIN_10300、ECOLIN_10300 ECOLIN_10325、ECOLIN_10325、ECOLIN_10330、ECOLIN_10345。一実施形態では、遺伝子操作された細菌がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、ECOLIN_10170、およびECOLIN_10175のうちの1つまたは複数の完全または部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失がECOLIN_10110、ECOLIN_10115、ECOLIN_10120、ECOLIN_10125、ECOLIN_10130、ECOLIN_10135、ECOLIN_10140、ECOLIN_10145、ECOLIN_10150、ECOLIN_10160、ECOLIN_10165、およびECOLIN_10170と、ECOLIN_10175の部分的な欠失との完全な欠失である。1つの実施形態において、配列番号130の配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。1つの実施形態において、配列番号130を含む配列は、ファージ3ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号281からなる改変ファージゲノム配列を含む。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が1つ以上のエフェクター分子をコードする1つ以上の遺伝子を含む1つ以上の回路をさらに含む。いくつかの実施形態では、本遺伝子操作された細菌が疾患または組織特異的分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応もしくは免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、または炎症反応もしくは免疫抑制、肝臓障害、代謝疾患下、またはアラビノースなどのいくつかの実施形態ではまたは腫瘍微小環境中に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、In低酸素条件で、任意の1つ以上の回路を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載される回路のいずれか1つ以上が1つ以上のプラスミド(例えば、高コピーまたは低コピー)上に存在するか、または細菌染色体中の1つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がさらに、記載された回路のうちの任意の1つ以上を発現することができ、以下のうちの1つ以上をさらに含む:(1)当技術分野で公知であり、本明細書で提供される任意の栄養要求性、例えば、thyA栄養要求性などの1つ以上の栄養要求性、(2)本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の死滅させるスイッチなどの1つ以上の死滅スイッチ回路、(3)1つ以上の抗生物質耐性回路、(4)本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の任意のトランスポーターなど、生物学的分子または基材をインポートするための1つ以上のトランスポーター、(5)本明細書に記載され、他の方法で当技術分野で公知の分泌回路などの1つ以上の分泌回路、および(6)そのような追加の回路のうちの1つ以上の組合せ。
Phe栄養要求性の付加はまた、フェニルアラニン分解速度を増加させるための有用性も有することができる。例えば、pheA遺伝子の欠失により、フェニルアラニン栄養要求性がもたらされる。内因性細菌のフェニルアラニン産生の停止によって、環境からの取り込みの増加を促すことができ、また、環境から取り込まれたフェニルアラニンの分解の増加ももたらすことができる。
遺伝子調節回路
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の構築物を発現するための多層遺伝子調節回路を含む。適切な多層遺伝子調節回路は、国際公開第2016/210378号として公開され、2016年6月24日に出願された国際特許出願PCT/US2016/39434に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。遺伝子調節回路は、抗癌分子を産生したり、栄養要求性をレスキューする変異細菌をスクリーニングするのに有用である。特定の実施形態において、本発明は、1つ以上の目的の遺伝子を産生する遺伝子操作された細菌を選択する方法を提供する。
宿主−プラスミド相互依存性
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はまた、宿主−プラスミド相互依存性を生じるように改変されているプラスミドも含む。特定の実施形態では、相互依存性宿主−プラスミドプラットフォームは、抗生物質非依存性プラスミドシステム(AIPS)である(Wrightら、2015年)。これらおよび他のシステムおよびプラットフォームは、WO2017/123675として公開された2017年1月11日出願の国際特許出願PCT/US2017/013072に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
死滅スイッチ
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はまた、死滅スイッチを含む。死滅スイッチは、外部刺激に応答して遺伝子操作された細菌を能動的に死滅させることを意図する。細菌が生存のための必須栄養素を欠いているために細菌が死滅する栄養要求性突然変異とは対照的に、死滅スイッチは、細胞死を引き起こす微生物内の毒性分子の産生を誘導する環境における特定の要因によって誘発される。適切な死滅スイッチは、WO2016210373として公開された2016年6月24日出願の国際特許出願PCT/US2016/039427に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。
医薬組成物および製剤
本発明の遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患、例えばPKUを治療、管理、改善、および/または予防するために使用され得る。単独で、または予防剤、治療剤、および/もしくは薬学的に許容される担体と組み合わせて1つまたは複数の遺伝子操作された細菌を含む本発明の医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される遺伝子組換えを含むように操作された細菌の1つの種、株、または亜型を含む。代替の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される遺伝子組換えを含むように各々操作された細菌の2つ以上の種、株、および/または亜型を含む。
本明細書に記載される医薬組成物は、製剤学的用途のための組成物への活性成分の処理を容易にする、賦形剤および助剤を含む1つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して従来の方式で製剤化され得る。医薬組成物を製剤化する方法は当該分野において公知である(例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、Easton、PAを参照のこと)。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腸溶コーティングされてもよいか、またはコーティングされなくてもよい、錠剤、粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット、または粉剤を形成するように錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、従来の混合、溶解、造粒、粉状化、乳化、カプセル化、封入、または噴霧乾燥に供される。適切な製剤は投与経路に依存する。
本明細書に記載される遺伝子操作された細菌は、任意の適切な剤形(例えば、液体、カプセル、サシェ、硬質カプセル、軟質カプセル、錠剤、腸溶コーティング錠剤、懸濁粉末、顆粒、または経口投与用のマトリクス持続放出製剤)で、および任意の適切な種類の投与(例えば、経口、局所、注射、即時放出、パルス放出、遅延放出、または持続放出)のための医薬組成物に製剤化され得る。遺伝子操作された細菌についての適切な投薬量は、約105〜1012細菌、例えば約105細菌、約106細菌、約107細菌、約108細菌、約109細菌、約1010細菌、約1011細菌、または約1011細菌の範囲であり得る。組成物は、1日に1回もしくは複数回、1週に1回もしくは複数回、1カ月に1回もしくは複数回投与されてもよい。組成物は、食事の前、間、または後に投与され得る。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事を食べる前に投与される。一実施形態では、医薬組成物は現在の食事とともに投与される。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事を食べた後に投与される。
遺伝子操作された細菌は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、バッファー、緩衝剤、界面活性剤、中性またはカチオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または薬剤を含む医薬組成物に製剤化され得る。例えば、医薬組成物は、限定されないが、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えばポリソルベート20を含む界面活性剤の付加を含んでもよい。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、重炭酸ナトリウム溶液、例えば1モルの重炭酸ナトリウム溶液(例えば胃などの酸性細胞環境を緩衝するため)中で製剤化され得る。遺伝子操作された細菌は中性または塩形態として投与および製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンなどのアニオンと形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンなどのカチオンと形成される塩が含まれる。
本明細書に開示される遺伝子操作された細菌は、局所的に投与されてもよく、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、噴霧、エアロゾル、溶液、エマルションの形態、または当業者に周知の他の形態で製剤化されてもよい。例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.、Easton、PAを参照のこと。一実施形態では、噴霧可能ではない局所剤形に関して、局所適用に適合し、水より大きい動粘性係数を有する担体または1つもしくは複数の賦形剤を含む、粘性から半固体または固体形態が利用される。適切な製剤には、限定されないが、滅菌され得るか、または種々の特性、例えば浸透圧に影響を与える助剤(例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、バッファー、または塩)と混合され得る、溶液、懸濁剤、エマルション、クリーム、軟膏、粉剤、塗布薬、膏薬などが含まれる。他の適切な局所剤形には、噴霧可能なエアロゾル調製物が含まれ、固体または液体不活性担体と組み合わせた活性成分が、加圧された揮発性物質(例えば、フレオンなどのガス状推進剤)と共に混合物中またはスクイーズボトル内に充填される。保湿剤または保水剤もまた、医薬組成物および剤形に加えられてもよい。このようなさらなる成分の例は当業者に周知である。一実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は衛生製品として製剤化されてもよい。例えば、衛生製品は、抗菌製剤、または発酵ブロスなどの発酵製品であってもよい。衛生用品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト、ローション、およびリップクリームであってもよい。
本明細書に開示される遺伝子操作された細菌は、経口投与され、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして製剤化されてもよい。経口用途のための医薬組成物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体賦形剤を使用し、任意選択で、得られた混合物を粉砕し、所望の場合、適切な助剤を加えた後に顆粒の混合物を処理して作製され得る。適切な賦形剤には、限定されないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤;トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボメチルセルロースナトリウム(sodium carbomethylcellulose)などのセルロース組成物;および/またはポリビニルピロリドン(PVP)もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの生理学的に許容されるポリマーが含まれる。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのそれらの塩などの崩壊剤もまた、添加されてもよい。
錠剤またはカプセルは、結合剤(例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリン、およびトラガカント);充填剤(例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム);潤滑剤(例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、L−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ);錠剤崩壊剤(例えば、デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉末);または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に許容される賦形剤と共に従来の手段によって調製されてもよい。錠剤は当該分野において周知の方法によってコーティングされ得る。コーティングシェルが存在してもよく、一般的な膜には、限定されないが、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物、他の生分解性ポリマー、アルギン酸−ポリリシン−アルギン酸(APA)、アルギン酸−ポリメチレン−co−グアニジン−アルギン酸(A−PMCG−A)、ヒドロキシメチルアクリレート−メチルメタクリレート(hydroymethylacrylate−methyl methacrylate)(HEMA−MMA)、多層HEMA−MMA−MAA、ポリアクリロニトリル塩化ビニル(PAN−PVC)、アクリロニトリル/メタリルスルホン酸ナトリウム(AN−69)、ポリエチレングリコール/ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン/ポリジメチルシロキサン(PEG/PD5/PDMS)、ポリN,N−ジメチルアクリルアミド(PDMAAm)、封入シリカ、硫酸セルロース/アルギ酸ナトリウム/ポリメチレン−co−グアニジン(CS/A/PMCG)、酢酸フタル酸セルロース、アルギン酸カルシウム、k−カラギーナン−ローカストビーンガムゲルビーズ、ジェラン−キサンタンビーズ、ポリ(ラクチド−co−グリコリド)、カラギーナン、デンプンポリ−無水物、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸、および腸溶コーティングポリマーが含まれる。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、消化管または消化管の特定の領域、例えば大腸に放出するために腸溶コーティングされる。胃から結腸までの典型的なpHプロファイルは、約1〜4(胃)、5.5〜6(十二指腸)、7.3〜8.0(回腸)、および5.5〜6.5(結腸)である。いくつかの疾患では、pHプロファイルは変更されてもよい。いくつかの実施形態では、コーティングは放出部位を特定するために特定のpH環境で分解される。いくつかの実施形態では、少なくとも2つのコーティングが使用される。いくつかの実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングは異なるpHレベルにて分解される。
経口投与用の液体調製物は、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための溶液、シロップ、懸濁剤、または乾燥製剤の形態を取ることができる。このような液体調製物は、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用油脂);乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア);非水性ビヒクル(例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油);および防腐剤(例えば、メチルもしくはプロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)などの薬学的に許容される薬剤を用いて従来の手段によって調製され得る。調製物はまた、必要に応じて緩衝塩、香味料、着色剤、および甘味剤を含有してもよい。経口投与用の調製物は、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌の徐放、制御放出、または持続放出のために適切に製剤化され得る。
一実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、小児対象への投与に適した組成物に製剤化され得る。当該分野において周知のように、子供は、異なる胃内容排出速度、pH、胃腸透過性など含む、多くの態様において成人と異なる(Ivanovskaら、2014年)。さらに、小児の製剤許容性ならびに投与経路および味覚特質などの好みが、許容される小児の服薬順守を達成するのに重要である。したがって、一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、飲み込みやすいもしくは溶解可能な剤形、または香味料、甘味料、もしくは味覚遮断剤を加えた組成物などの、より口当たりの良い組成物を含んでもよい。一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物はまた、成人への投与にも適していてもよい。
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、溶液、シロップ、懸濁剤、エリキシル剤、懸濁剤または溶液として復元するための粉末、分散性/発泡性錠剤、チュアブル錠、グミキャンディー、ロリポップ、アイスキャンディー、トローチ、チューインガム、経口薄片、口腔内崩壊錠、サシェ、軟質ゼラチンカプセル、散剤経口粉末、または顆粒を含んでもよい。一実施形態では、組成物は、キャンディー弾力性、所望のかみごたえのある稠度(chewy consistency)、およびより長い保存期間を与える、ゼラチンベースから作製されたグミキャンディーである。いくつかの実施形態では、グミキャンディーはまた、甘味料または香味料を含んでもよい。
一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は香味料を含んでもよい。本明細書において使用される場合、「香味料」は、製剤に明確な味および香りを与える物質(液体または固体)である。香味料はまた、製剤の嗜好性を改善するのにも役立つ。香味料には、限定されないが、イチゴ、バニラ、レモン、ブドウ、バブルガム、およびチェリーが含まれる。
特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と共に経口投与されてもよい。化合物はまた、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、または対象の食事に直接組み込まれてもよい。経口治療投与のために、化合物は賦形剤と共に組み込まれてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウエハーなどの形態で使用されてもよい。非経口投与以外によって化合物を投与するために、その不活性化を阻止するために物質で化合物をコーティングするか、または物質と共に化合物を同時投与することが必要な場合がある。
別の実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、食べられる製品、例えば食品であってもよい。一実施形態では、食品は、ミルク、濃縮乳、発酵乳(ヨーグルト、酢乳、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料)、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜−果物ジュース、果物ジュース、スポーツドリンク、菓子、キャンディー、乳児用食品(乳児用ケーキなど)、栄養食品、動物飼料、または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は発酵乳製品などの発酵食品である。一実施形態では、発酵乳製品はヨーグルトである。別の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクセーキ、またはケフィアである。別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、プロバイオティクスとして機能することが意図される他の生細菌細胞を含有する調製物中に組み合わされる。別の実施形態では、食品は飲料である。一実施形態では、飲料は、果物ジュースベースの飲料または植物もしくはハーブ抽出物を含有する飲料である。別の実施形態では、食品はゼリーまたはプディングである。本発明の組換え細菌の投与に適した他の食品は当該分野において周知である。例えば、それらの各々の全内容が参照により本明細書に明確に組み込まれる米国特許出願公開第2015/0359894号および米国特許出願公開第2015/0238545号を参照のこと。さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、パン、ヨーグルト、またはチーズなどの食品に注入され、噴霧され、または振りかけられる。
いくつかの実施形態では、組成物は、腸溶コーティングされているか、またはコーティングされていない、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、または微小錠剤によって、腸内投与、空腸内投与、十二指腸内投与、回腸内投与、胃バイパス投与、または結腸内投与用に製剤化される。医薬組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を使用して、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物に製剤化されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液、またはエマルションであってもよく、懸濁剤、安定化剤および/または分散剤を含有してもよい。
本明細書に記載される遺伝子操作された細菌は、鼻腔内投与されてもよく、エアロゾル形態、噴霧、ミストで、または液滴の形態で製剤化されてもよく、便宜上、適切な推進剤(例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス)を使用して加圧パックまたは噴霧器からエアロゾル噴霧提示の形態で送達されてもよい。加圧エアロゾル投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入具または注入器における使用のための(例えば、ゼラチンの)カプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有して製剤化されてもよい。
遺伝子操作された細菌は、デポー製剤として投与され、製剤化されてもよい。このような長時間作用する製剤は、移植または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射、もしくは点滴を含む、注射によって投与されてもよい。例えば、組成物は、適切なポリマーもしくは疎水性材料(例えば、許容される油中のエマルションとして)またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として(例えば、難溶性塩として)製剤化されてもよい。
いくつかの実施形態では、単回剤形の薬学的に許容される組成物が本明細書に開示される。単回剤形は液体または固体形態であってもよい。単回剤形は、改変せずに患者に直接投与されてもよいか、または投与前に希釈もしくは復元されてもよい。特定の実施形態では、単回剤形は、複数の錠剤、カプセル、丸薬などを含む経口用量を含む、ボーラス形態、例えば、単回注射、単回経口用量で投与されてもよい。代替の実施形態では、単回剤形は、例えば点滴によって一定の期間にわたって投与されてもよい。
医薬組成物の単回剤形は、医薬組成物をより少ない一定量、単回投与容器、単回投与液体形態、または腸溶コーティングされてもよいか、もしくはコーティングされていなくてもよい、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット、もしくは粉末などの単回投与固体形態に分けることによって調製されてもよい。固体形態の単回用量は、患者に投与する前に液体、典型的には滅菌水または生理食塩水を加えることによって復元されてもよい。
他の実施形態では、組成物は制御放出または持続放出系において送達され得る。一実施形態では、ポンプが制御または持続放出を達成するために使用されてもよい。別の実施形態では、ポリマー材料が本開示の治療の制御または持続放出を達成するために使用されてもよい(例えば、米国特許第5,989,463号を参照のこと)。持続放出製剤に使用されるポリマーの例には、限定されないが、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン−co−酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコライド(PLG)、ポリ無水物、ポリ(N−ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド−co−グリコライド)(PLGA)、およびポリオルトエステルが含まれる。持続放出製剤に使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能な不純物を含まず、保管時に安定であり、滅菌され、生分解性であり得る。いくつかの実施形態では、制御または持続放出系は予防または治療標的に近接して配置されてもよく、それによって全身用量の一部しか必要とされない。当業者に公知の任意の適切な技術が使用されてもよい。
投薬レジメンは治療応答を提供するように調節されてもよい。投薬は、疾患の重症度および応答性、投与経路、治療の時間的経過(数日から数カ月から数年)、および疾患の改善時期を含む、いくつかの要因に依存し得る。例えば、単一ボーラスが一度に投与されてもよく、いくつかの分割用量が所定の期間にわたって投与されてもよく、または用量は、治療状況によって示されるように減少もしくは増加されてもよい。投薬量についての仕様は活性化合物の特有の特徴および達成される特定の治療効果によって決定される。投薬量の値は、軽減されるべき状態の種類および重症度によって変わり得る。任意の特定の対象について、特定の投薬レジメンは、個々の必要性および治療を行う医師の専門的判断に従って経時的に調節されてもよい。本明細書において提供される化合物の毒性および治療効果は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な薬剤的手順によって決定され得る。例えば、LD50、ED50、EC50、およびIC50が決定され得、毒性と治療効果との間の用量比(LD50/ED50)が治療指数として計算され得る。有毒な副作用を示す組成物が、副作用を低減させるために潜在的な損傷を最小化するための注意深い変更を行って使用されてもよい。投薬は最初に細胞培養アッセイおよび動物モデルから推定されてもよい。in vitroおよびin vivoアッセイならびに動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための広範な投薬量を決定する際に使用され得る。
成分は、別個に、または例えば、活性剤の量を示すアンプルもしくはサシェなどの密閉容器中の乾燥した凍結乾燥粉末もしくは水を含まない濃縮物として、単位剤形で一緒に混合されて供給される。投与様式が注射による場合、注射のための滅菌水または生理食塩水のアンプルが、成分が投与前に混合され得るように提供され得る。
医薬組成物は薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器にパッケージ化されてもよい。一実施形態では、医薬組成物の1つまたは複数は、密閉容器中の乾燥滅菌した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給され、対象への投与のために適切な濃度に(例えば水または生理食塩水を用いて)復元され得る。一実施形態では、予防もしくは治療剤または医薬組成物の1つまたは複数は、2℃から8℃の間で保存された密閉容器中の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給され、復元後、1時間以内、3時間以内、5時間以内、6時間以内、12時間以内、24時間以内、48時間以内、72時間以内、または1週間以内に投与される。凍結乾燥剤形のために原則として0〜10%のスクロース(最適には0.5〜1.0%)の抗凍結剤が含まれてもよい。他の適切な抗凍結剤には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。他の適切な増量剤には、グリシンおよびアルギニン(それらのいずれも0〜0.05%の濃度で含まれてもよい)、ならびにポリソルベート−80(最適には0.005〜0.01%の濃度で含まれる)が含まれる。さらなる界面活性剤には、限定されないが、ポリソルベート20およびBRIJ界面活性剤が含まれる。医薬組成物は注射溶液として調製されてもよく、吸収または分散を増加させるために使用されるアジュバント、例えばヒアルロニダーゼなどの、アジュバントとして有用な薬剤をさらに含んでもよい。
治療方法
本発明の別の態様は、本明細書に開示された操作された細菌を含む組成物物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明がそれを必要とする被験体に、内因性または天然ファージゲノム中に改変を含む操作された細菌を含む組成物を投与することを含む、疾患の治療法を提供する。
本発明の別の態様は、高フェニルアラニン血症に関連する高フェニルアラニン血症または症状に関連する疾患を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明が高フェニルアラニン血症に関連する高フェニルアラニン血症または症状に関連する疾患を治療するための方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書に開示される操作された細菌を含む組成物物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明が1つまたは複数のPME、例えばPAHおよび/またはPAH、および/またはLAADをコードする遺伝子配列を含む操作された細菌を含む組成物物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、高フェニルアラニン血症に関連する高フェニルアラニン血症または症状に関連する疾患を治療するための一方法を提供する。いくつかの実施形態では、この操作された細菌が内因性または天然のファージゲノムにおける改変を含み得る。いくつかの実施形態では、この遺伝子操作された細菌が1つ以上のエフェクター分子(例えば、1つ以上のPME、例えば、PAHおよび/またはPAH、および/またはLAADおよび/または1つ以上のPheトランスポーターをコードする遺伝子配列)をコードする1つ以上の遺伝子を含む1つ以上の回路をさらに含む。いくつかの実施形態では、本遺伝子操作された細菌が疾患または組織特異的分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応もしくは免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、または炎症反応もしくは免疫抑制、肝臓障害、代謝疾患下、またはアラビノースなどのいくつかの実施形態ではまたは腫瘍微小環境中に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、In低酸素条件で、任意の1つ以上の回路を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載される回路のいずれか1つ以上が1つ以上のプラスミド(例えば、高コピーまたは低コピー)上に存在するか、または細菌染色体中の1つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がさらに、記載された回路のうちの任意の1つ以上を発現することができ、以下のうちの1つ以上をさらに含む:(1)当技術分野で公知であり、本明細書で提供される任意の栄養要求性、例えば、thyA栄養要求性などの1つ以上の栄養要求性、(2)本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の死滅させるスイッチなどの1つ以上の死滅スイッチ回路、(3)1つ以上の抗生物質耐性回路、(4)本明細書に記載されるか、または当技術分野で公知の任意のトランスポーターなど、生物学的分子または基材をインポートするための1つ以上のトランスポーター、(5)本明細書に記載され、他の方法で当技術分野で公知の分泌回路などの1つ以上の分泌回路、および(6)そのような追加の回路のうちの1つ以上の組合せ。これらの実施形態のいずれかにおいて、内因性ファージゲノムに対する改変は、ファージゲノム内の1つ以上の欠失、挿入、置換、または逆位、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、欠失が1つ以上のファージ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上の遺伝子が置換される。いくつかの実施形態では、置換が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のファージ遺伝子が逆転している。1つ以上のファージ遺伝子のいくつかの実施形態では部分は逆転している。
いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患または高フェニルアラニン血症に関連する症状の治療方法を提供し、それを必要とする対象に操作された細菌を含む組成物を投与することを含み、操作された細菌は、1つ以上のPME(例えば、PAHおよび/またはPAH、および/またはLAAD)をコードする遺伝子配列、ならびに必要に応じて1つ以上のPheトランスポーターをコードする遺伝子配列を含む。上記の1つ以上のPMEをコードする遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にあり、上記の1つ以上のPheトランスポーターをコードする遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にあり、誘導性プロモーターは、例えば、本明細書に記載のいずれかの誘導性プロモーターである。遺伝子配列は、同一または異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、1つ以上のPME(例えば、PAHおよび/またはPAH、および/またはLAAD)をコードする1つ以上の遺伝子配列は、構成的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、1つ以上のPheトランスポーターをコードする1つ以上の遺伝子配列は、構成的プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、細菌は、以下の1つ以上を含み得る:1つ以上の栄養要求性、1つ以上の死滅スイッチ、遺伝子ガードコンポーネント、および/または抗生物質耐性。いくつかの実施形態では、挿入は、本明細書に記載の抗生物質カセットを含む。
いくつかの実施形態では、疾患は、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、自己免疫疾患、癌、腫瘍、代謝性疾患(2型糖尿病、肥満、肝性脳症、非アルコール性脂肪肝、および付随疾患または関連疾患)、瀬川病およびまれな代謝障害からなる群から選択される。そのようなまれな代謝障害の非限定的な例は、メープルシロップ尿症、イソベレリン酸血症、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、高シュウ酸尿症、フェニルケトン尿症、および高アンモニア血症を含む。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症はその他の疾患、例えば、肝疾患に続発する。いくつかの実施形態では、本発明は、限定はしないが、神経障害、知能障害、脳症、てんかん、湿疹、成長障害(reduced growth)、小頭症、振戦、四肢痙縮および/または色素沈着低下を含む、これらの疾患に関連する1つまたは複数の症状(複数可)を低減、回復させるか、または排除するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療する対象は、ヒト患者である。
特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、代謝産物の蓄積に関連する疾患または障害(例えば、PKUなどの高フェニルアラニン血症)を治療するために、食餌中の代謝産物を代謝することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は食物タンパク質と同時に送達する。その他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は食物タンパク質と同時には送達しない。研究によって、小腸への膵分泌およびその他の腺分泌物は、高レベルのタンパク質、酵素およびポリペプチドを含有し、これらの異化反応の結果として産生されるアミノ酸は「腸管再循環」として知られるプロセスで血中に再吸収されることが示された(Chang、2007年;Sarkissian等、1999年)。したがって、小腸内の高いフェニルアラニンレベルは部分的には食物摂取とは無関係である可能性があり、PALによる分解に利用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌および食物タンパク質は、絶食またはフェニルアラニン制限食の期間後に送達する。これらの実施形態では、高フェニルアラニン血症に罹患している患者は、実質的に通常の食事またはフェニルアラニンを含まない食事よりも制限の少ない食事を再開することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、高フェニルアラニン血症、例えば、PKUに関連する疾患を治療するために、他の原料、例えば、血液からフェニルアラニンを代謝することができる。これらの実施形態では、遺伝子操作された細菌は食物タンパク質と同時に送達する必要はなく、例えば、血液から消化管までフェニルアラニン勾配が生成され、遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを代謝し、高フェニルアラニン血症を低減させる。
この方法は、本明細書で記載した細菌の少なくとも1種の遺伝子操作された種、株、またはサブタイプを含む医薬組成物を調製し、この医薬組成物を治療有効量で対象に投与することを含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば、液体懸濁液で経口投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ジェルカップで凍結乾燥し、経口投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、栄養チューブまたは胃シャントによって投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、直腸内、例えば、浣腸剤によって投与する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、局所的、小腸内、空腸内、十二指腸内、回腸内および/または結腸内に投与する。
特定の実施形態では、本明細書で記載した医薬組成物は、特定の代謝産物または他のタイプのバイオマーカー分子または対象の障害に関連するもしくはその原因となる分子のレベルを低減させるために投与される。いくつかの実施形態では、本発明の開示の方法は、対象のフェニルアラニンレベルを未治療または対照の対象のレベルと比較して少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ超低減させる。いくつかの実施形態では、低減は医薬組成物の投与前後の対象のフェニルアラニンレベルを比較することによって測定する。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症を治療または回復させる方法は、状態または障害の1つまたは複数の症状を少なくとも約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%またはそれ超改善させる。
医薬組成物の投与前、投与中、および投与後に、被験体中の障害(例えば、フェニルアルニン)に関連する、またはその原因となる一定の代謝産物または他の型のバイオマーカー分子または分子のレベルを、生物学的サンプル(例えば、血、血清,血漿,尿、腹膜液、脳脊髄液、糞便物質、腸粘膜擦過物、組織から収集されたサンプル、および/または胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管のうちの1つ以上の内容物から収集されたサンプル)中で測定し得る。いくつかの実施形態では、この方法が一定の代謝産物(例えば、フェニルアラニン)または他の型のバイオマーカー分子または障害に関連するかまたはその原因となる分子のレベルを減少させるための、本発明の組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、この方法が代謝産物または他の種の分子を被験体中の検出不能なレベルまで減少させるための、本組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、この方法が代謝産物または他の種の分子の濃度を、検出不可能なレベルまで、または処置前の被験体のレベルの約1%、2%、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、または80%未満まで減少させるための本発明の組成物の投与を包含し得る。
被験体内の回路の導入に応じて遺伝子操作された細菌の投与に応じて蓄積する代謝産物または他の種の分子の量は生物学的サンプル(例えば、血、血清,血漿,尿、腹膜液、脳脊髄液、糞便物質、腸粘膜擦過物、組織から収集されたサンプル、および/または胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管のうちの1つ以上の内容物から収集されたサンプル)において測定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法が一定の代謝産物または他の型のバイオマーカー分子または障害に関連するかまたはその原因となる分子のレベルを減少させ、そして遺伝子操作された細菌の投与の結果として蓄積する代謝産物または他の型の分子のレベルの増加を生じるための、本発明の組成物の投与を包含し得る。いくつかの実施形態では、この方法が1つの代謝産物または他の種の分子を被験体中の検出不可能なレベルまで減少させ、同時にかつ比例して別の代謝産物または他の種の分子のレベルを増大させるための、本発明の組成物の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、この方法が本発明の組成物の投与を含み得、代謝産物または他の種の分子の濃度を、処置前の代謝産物の被験体量の約1%、2%、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、または99%まで、または100%まで上昇させる。このような増加は例えば、尿、血中、糞便中、または腫瘍中で測定され得る。
いくつかの実施形態では、馬尿酸の産生量およびその蓄積速度を測定することによって、哺乳動物被験体(例えば、動物モデルまたはヒト)の尿中において、PALを発現する遺伝子操作された細菌の活性(例えば、フェニルアラニン分解活性)を検出することができる。馬尿酸はPAL特異的な分解産物であり、ヒト尿中に通常は低濃度で存在する。馬尿酸は、PAL経路を介したフェニルアラニンの代謝の最終産物である。フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、フェニルアラニンのケイ皮酸への変換を媒介する。ケイ皮酸は消化管内で産生されると、吸収されて肝臓で速やかに馬尿酸に変換され、肝臓で排出される(Hoskins JAおよびGray、Phenylalanine ammonia lyase in the management of phenylketonuria: the relationship between ingested cinnamate and urinary hippurate in humans.J Res Commun Chem Pathol Pharmacol.1982年2月; 35巻(2):275−82頁)。フェニルアラニンは1:1の比で馬尿酸に変換される。すなわち1モルのPheが1モルの馬尿酸に変換される。したがって、尿中の馬尿酸レベルの変化は、前記のメカニズムを利用する療法の効果の非侵襲的尺度として使用することができる。
したがって、馬尿酸は、PALベースのレジメンを受けている患者において、食事の順守および治療効果をモニタリングを可能にするバイオマーカーとして機能する可能性を有する。患者の管理において、馬尿酸は、血液Pheレベル測定の補助として使用することができる。また、馬尿酸は尿バイオマーカーであるため、特に子供のタンパク質摂取量を調整するうえで、利点を有しうる−成長に基づいてニーズが変化するため、困難でありうる。
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、被験体の尿中の馬尿酸レベルを未処置またはコントロールの被験体のレベルと比べて、少なくとも約10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはそれ以上、増加させる。いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物の投与前後の被験体における馬尿酸レベルを比較することによって、当該増加量を測定する。
このセクションでは、「PALベースの薬物」という用語は、PAL活性を有する任意の薬物、ポリペプチド、生物学的または治療レジメン、例えばPEG−PAL、Kuvan、本開示の細菌(例えば、PALおよび場合によってはPhePトランスポーターをコードする細菌)を含む組成物を指す。いくつかの実施形態では、本開示は、被験体、例えば哺乳動物被験体にPALベースの薬物を投与し、PAL活性の尺度として被験体において産生される馬尿酸量を測定することによって、in vivoでPAL活性を測定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、被験体、例えば哺乳動物被験体にPALベースの薬物を投与し、PAL治療活性の尺度として被験体において産生される馬尿酸量を測定することによって、PALベースの薬物の治療活性をモニタリングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、被験体、例えば哺乳動物被験体にPALベースの薬物を投与し、PAL活性を決定するために被験体において産生される馬尿酸量を測定して、被験体におけるPAL活性を増加または減少させるために薬物の投薬量を調整(例えば、増加または減少)することによって、PALベースの薬物の用量を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症を有する被験体のタンパク質摂取および/または食事を調整する方法を提供し、被験体へのPALベースの薬物の投与、被験体の馬尿酸産生量の測定、被験体におけるPAL活性を増加または減少させるために被験体のタンパク質摂取を調整すること、もしくは被験体の食事を調節することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症を有する被験体のタンパク質摂取および/または食事療法に対する遵守を確認するための方法を提供し、被験体へのPALベースの薬物投与、被験体の馬尿酸産生量の測定、およびPAL被験におけるPAL活性の測定を含む。
本明細書中に開示される方法のいくつかの実施形態において、血液中のフェニルアラニンレベルおよび尿中の馬尿酸レベルの両方が被験体においてモニターされる。いくつかの実施形態では、フェニルアラニンの分解速度を決定するために、血液中のフェニルアラニンおよび尿中の馬尿酸を複数の時点で測定する。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸レベルを用いて、動物モデルにおけるPAL活性または株活性を評価する。
いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、作用の機構を証明するために株に使用される。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定を、単独または血中フェニルアラニン測定と組み合わせて、株におけるPAL活性およびLAAD活性を区別するためのツールとして使用し、全株活性に対する各酵素の寄与を決定することができる。
いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定を単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて使用して、動物モデルおよびヒト被験体における安全性を評価する。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定を、単独または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、所望の薬理学的効果および安全性のための用量応答および最適レジメンの評価に使用する。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、有効性および/または毒性の代替エンドポイントとして使用される。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定を、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて使用して、治療菌株を含むレジメンに対する患者の応答を予測する。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、薬物療法に応答する可能性のある特定の患者集団の同定のために使用される。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独または血中フェニルアラニン測定と組み合わせて、特定の有害作用を回避するために使用される。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせると、患者選択に有用である。
いくつかの実施形態では、PALを発現する治療用PKU株の投与を含むレジメンで、PKU患者のタンパク質摂取/食事を調節するための1つの方法として、尿中の馬尿酸測定を、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて使用する。
いくつかの実施形態では、単独または血液フェニルアラニン測定と組み合わせた馬尿酸の尿レベルの測定を用いて、組換えPALの活性を測定および/またはモニターする。いくつかの実施形態において、馬尿酸の尿レベルの測定は、組換えペグ化PAL(Peg−PAL)の活性を測定および/またはモニターするために使用される。いくつかの実施形態では、単独または血液フェニルアラニン測定と組み合わせた馬尿酸の尿レベルの測定は、本明細書に記載されている治療菌株と組み合わせて投与される組換えPALの活性を測定および/またはモニターするために使用される。
いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独で、または血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、他のバイオマーカー、例えば臨床安全性バイオマーカーと併用される。いくつかの実施形態では、特定の代謝産物または他の種類の分子の増加および/または減少の測定は、他のバイオマーカー、例えば臨床安全バイオマーカーの測定と組み合わせて使用される。そのような安全性マーカーの非限定的な例には、身体検査、バイタルサイン、および心電図(ECG)が含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の肝臓安全性試験、例えば血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)、アラニントランスアミナーゼ(ALT)、アルカリホスファターゼ(ALP)、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)およびビリルビンが含まれる。このようなバイオセイフティーマーカーには、腎臓安全性試験、例えば当該分野で公知のもの、例えば血中尿素窒素(BUN)、血清クレアチニン、糸球体濾過率(GFR)、クレアチニンクリアランス、血清電解質(ナトリウム、カリウム、塩化物および重炭酸塩)、および徹底的な尿分析(色、pH、比重、グルコース、タンパク質、ケトン体、および血液、白血球、外観の顕微鏡検査)、ならびにシスタチン−c、β2−ミクログロブリン、尿酸、クラスタリン、N−アセチル−β−D−グルコサミニダーゼ、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)、N−アセチル−β−D−グルコサミニダーゼ(NAG)、および腎臓損傷分子−1(KIM−1)が含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の血液学的安全性バイオマーカー、例えば、全血球数、全ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数、平均赤血球体積、平均細胞ヘモグロビン、赤血球分布幅%、平均細胞ヘモグロビン濃度、総白血球数、特定の白血球数(好中球、リンパ球、好塩基球、好酸球および単球)および血小板が含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の骨安全性マーカー、例えば、血清カルシウムおよび無機リン酸が含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の基本代謝安全性バイオマーカー、例えば、血糖、トリグリセリド(TG)、総コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロール(LDLc)、および高密度リポタンパク質コレステロール(HDL−c)が含まれる。当該分野で公知の他の特異的安全性バイオマーカーには、例えば、血清免疫グロブリンレベル、C反応性タンパク質(CRP)、フィブリノーゲン、甲状腺刺激ホルモン(TSH)、チロキシン、テストステロン、インスリン、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、クレアチンキナーゼ(CK)およびそのアイソザイム、心臓トロポニン(cTn)、およびメトヘモグロビンが含まれる。
いくつかの実施形態において、LAADを発現する遺伝子操作された細菌の活性は、糞便中で特異的に検出され、他の大腸菌株と区別することができる。この目的のために、フェニルアラニンデアミナーゼ試験「フェニルアラニンアガースラント(Phenylalanine Agar Slant)」を使用することができる。微生物がフェニルアラニンを消費して、フェニルアラニンをフェニルピルビン酸に変換できるかどうかを決定するために、フェニルアラニンアガーが用いられる。フェニルアラニンアガー上に試料を含むチューブに試験化学物質を添加すると、フェニルピルビン酸が緑色化合物に変換され、検査が陽性であることを示す。野生型大腸菌は、フェニルアラニンからフェニルピルビン酸を産生可能な酵素をコードしないので、フェニルピルビン酸を産生せず、他の大腸菌株との区別が可能である。そのため、野生型大腸菌は、フェニルピルビン酸を産生しない。遺伝子操作された細菌は、当該分野で公知のPCRベースの検査によって、フェニルピルビン酸を産生することができる他の細菌種と区別することができる。例えば、種に特異的な配列を増幅することができる。例えば、様々な細菌の保存領域を増幅するユニバーサルPCRは、検体のスクリーニングにおいて病原体を検出するのに理想的である。この目的のために、16S rRNA遺伝子の保存領域を、ユニバーサルPCRの標的遺伝子として使用することができる;16S rRNA遺伝子は種特異的領域を含み、当該領域によって多数の細菌種を区別することができる。
いくつかの実施形態では、フェニルアラニンデアミナーゼ試験を使用して、糞便サンプル中の遺伝子操作された細菌を検出することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌を他の細菌種と区別するためにPCRに基づく試験を行うことができる。
いくつかの実施形態では、ペイロード、例えばPMEおよび/またはPhePを産生するための遺伝子、遺伝子(複数可)または遺伝子カセットのmRNA発現レベルを増幅、検出および/または定量化するために、定量的PCR(qPCR)を使用する。プライマーは、当該分野で公知の方法に従って、サンプル中のmRNAを検出するために設計および使用され得る。いくつかの実施形態では、ペイロードRNAを含み得るサンプル反応混合物にフルオロフォアを添加し、サーマルサイクラーを使用してサンプル反応混合物を特定波長の光で照射し、フルオロフォアによるその後の発光を検出する。反応混合物を所定の時間、所定の温度に加熱および冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、90〜100℃、60〜70℃、および30〜50℃に加熱および冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、93〜97℃、55〜65℃、および35〜45℃に加熱および冷却する。いくつかの実施形態において、蓄積アンプリコンは、qPCRの各サイクルの後に定量化される。蛍光が閾値を超えるサイクル数が閾値サイクル(CT)である。各サンプルについて少なくとも1つのCT結果が生成され、当該CT結果はペイロードのmRNA発現レベルを決定するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、ペイロードのmRNA発現レベルを増幅、検出、および/または定量化するために、定量的PCR(qPCR)を使用する。プライマーは、当該分野で公知の方法に従って、サンプル中のmRNAを検出するために設計および使用され得る。いくつかの実施形態では、ペイロード(複数可)、例えばPMEおよび/またはPhePおよび/またはFNRS24Y、mRNAを含有し得るサンプル反応混合物にフルオロフォアを添加し、サーマルサイクラーを用いてサンプル反応混合物を特定波長の光で照射し、フルオロフォアによるその後の発光を検出する。反応混合物を所定の時間、所定の温度に加熱および冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、90〜100℃、60〜70℃、および30〜50℃に加熱および冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、93〜97℃、55〜65℃、および35〜45℃に加熱および冷却する。いくつかの実施形態において、蓄積アンプリコンは、qPCRの各サイクルの後に定量化される。蛍光が閾値を超えるサイクル数が閾値サイクル(CT)である。各試料について少なくとも1つのCT結果が生成され、当該CT結果は、ペイロード、例えばPMEおよび/またはPhePおよび/またはFNRS24YのmRNA発現レベルを決定するために使用され得る。
特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、内因性または天然の大腸菌Nissleファージ3が本明細書に記載されるように改変された大腸菌Nissleである。いくつかの実施形態では、ファージ3は、改変のためにもはや溶解サイクルを受けることができない。いくつかの実施形態では、溶解サイクルは、改変により減少するか、または頻度が低くなる。遺伝子操作された細菌は、例えば、消化管内もしくは血清中の防御因子によって(Sonnenborn等、2009年)、または死滅スイッチの活性化によって、投与の数時間または数日後に破壊されることがある。したがって、遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物は、治療有効用量および頻度で再投与してもよい。マウスにおいてin vivoにおけるNissleの滞留期間の長さを図68に示す。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は投与後の数時間以内または数日以内に破壊されず、消化管で増殖して定着することができ
る。
本発明の方法は、医薬組成物を単独で、または1つまたは複数の治療薬とさらに組み合わせて投与することを含むことができる。高フェニルアラニン血症の治療のためのいくつかの実施形態では、医薬組成物は、補因子テトラヒドロビオプテリン(例えば、クバン/サプロプテリン)、大型中性アミノ酸(例えば、チロシン、トリプトファン)、グリコマクロペプチド、プロバイオテック(例えば、VSL3)、酵素(例えば、ペグ化PAL)、および/またはフェニルケトン尿症の治療で使用されるその他の薬剤(Al HafidおよびChristodoulou、2015年)と併せて投与され得る。参照によりその全内容が援用されるWO2017087580 A1を参照のこと。
1つまたは複数のさらなる治療薬の選択において肝心なことは、薬剤(複数可)が本発明の遺伝子操作された細菌と適合すること、例えば、薬剤(複数可)が細菌を妨害したり、死滅させたりしてはならないことである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は食物と一緒に投与する。他の実施形態では、医薬組成物は食物を食べる前後に投与する。医薬組成物は、1つまたは複数の食事の改善、例えば、低フェニルアラニン食と組み合わせて投与することができる。医薬組成物の投与量および投与頻度は、疾患の症状の重症度および進行に基づいて選択することができる。適切な治療有効用量および/または投与頻度は、治療する臨床医が選択することができる。本発明の方法にはまた、本明細書で記載した医薬組成物を含むキットが含まれる。キットには、限定はしないが、使用説明書、その他の試薬、例えば、標識、さらなる治療薬、対象における障害に関連する代謝産物または他の種類の分子のレベルを測定するための装置または材料、投与用に本発明の医薬組成物を調製するための装置またはその他の材料および対象に投与するための装置またはその他の材料を含む、1つまたは複数のその他の構成要素を含めることができる。使用説明書には、例えば、障害を有する患者における推奨投与量および/または投与形式などの治療的応用のための指導を含めることができる。キットはさらに、1つまたは複数の別々の医薬品調製物において、少なくとも1つのさらなる治療薬、および/または適切ならば製剤化された本発明の1つまたは複数の遺伝子操作されたさらなる細菌株を含有することができる。
いくつかの実施形態では、キットは医薬組成物を対象に投与するために使用する。いくつかの実施形態では、キットは医薬組成物を単独で、または1つまたは複数のさらなる治療薬と組み合わせて対象に投与するために使用する。いくつかの実施形態では、キットは医薬組成物の対象への投与前、投与中、投与後の対象における代謝産物または他の種類の分子のレベルを測定するために使用する。特定の実施形態では、キットは、代謝産物または他の種類の分子のレベルが増加するか、または異常に高いとき、医薬組成物を単独で、または1つまたは複数のさらなる治療薬と組み合わせて投与および/または再投与するために使用する。高フェニルアラニン血症に関連するいくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症の診断シグナルは、少なくとも2mg/dL、少なくとも4mg/dL、少なくとも6mg/dL、少なくとも8mg/dL、少なくとも10mg/dL、少なくとも12mg/dL、少なくとも14mg/dL、少なくとも16mg/dL、少なくとも18mg/dL、少なくとも20mg/dLまたは少なくとも25mg/dLの血中フェニルアラニンレベルである。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約0.15から約8.01μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約0.15から約2μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約0.6から約8.01μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約0.2から約2.67μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約0.15から約0.6μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約0.22から約0.9μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約0.3から約1.21μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約0.54から約2.16μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約1.13から約4.53μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約1.84から約7.38μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約1.61から約6.43μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約2から約8.01μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約0.1から約1μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約1から約2μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約2から約3μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約3から約4μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約4から約5μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約5から約6μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約6から約7μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約7から約8μmol/109CFU/時間の標的分解速度を実現する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は0.15μmol/109CFU/時間未満の標的低減速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約8.01μmol/109CFU/時間超の標的低減速度を実現する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は約178mgと2382mgとの間の標的低減速度を実現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は1.08mmolから14.42mmolの標的低減速度を実現する。いくつかの実施形態では、低減は1.08mmol未満である。いくつかの実施形態では、低減は14.42mmol超である。
いくつかの実施形態では、標的低減速度および標的分解速度は、古典的PKUフェニルアラニンレベルをベースにしている。いくつかの実施形態では、標的低減速度および標的分解速度は、軽度PKUで認められたフェニルアラニンレベルをベースにしている。いくつかの実施形態では、標的低減速度および標的分解速度は、軽度高フェニルアラニン血症で認められたフェニルアラニンレベルをベースにしている。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌の投与により、(部分的または完全な)食事の自由化が可能になる(図28を参照)。
in vivoにおける治療
本発明の遺伝子操作された細菌は、in vivoにおいて、例えば動物モデルにおいて評価することができる。疾患または状態の任意の適切な動物モデルが使用され得る。いくつかの実施形態では、動物モデルはマウスモデルである。例えば、参照によりその全内容が援用されるWO2017/087580 A1を参照。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌の投与から生じる任意の潜在的な毒性を決定するために、薬物動態学試験および薬力学試験を、非ヒト霊長類において実施することができる。そのような研究の非限定的な例を、実施例30および31に記載する。
スクリーニング方法
本開示のいくつかの実施形態では、遺伝子操作株は、例えば、エフェクターの活性を増加させる(例えば、PME酵素活性を増加させる)か、または株が代謝産物を取り込む能力を増加(例えば、フェニルアラニン取り込み能力の増加)させるために、スクリーニング方法および選択方法を使用することによって改善することができる。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、エフェクター活性が改善した細菌株を生成するために役立つ。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、代謝産物の取り込み能力が改善した細菌株を生成するために役立つ。いくつかの実施形態では、スクリーニングによって、エフェクター活性が改善し、基質取り込みも増強された細菌株を同定することができる。使用することができるスクリーニング方法の非限定的例は、本明細書に記載されている。
生体分子を輸送する能力が増強した細菌株の作製
いくつかの実施形態では、ALE法は、フェニルアラニン取り込みが改善した遺伝子操作された細菌を同定するために使用することができる。
PME活性を改善するための特異的なスクリーニング
遺伝子選択を使用するスクリーニングは、遺伝子操作された細菌におけるフェニルアラニン消費を改善するために実行する。毒性のあるフェニルアラニン類似体は、細胞タンパク質に組み込まれることによって作用(MOA)機構を発揮し、細胞死をもたらす。パラログp−フルオロ−DL−フェニルアラニンおよびオルソログo−フルオロ−DL−フェニルアラニンなどのこれらの化合物は、活性が増加したPAL酵素を選択するための非標的アプローチに有用である。これらの毒性化合物は、細胞タンパク質に取り込まれるよりもPALによって非毒性代謝物に代謝され得ると仮定すると、フェニルアラニン分解活性が改善した遺伝子操作された細菌は、高レベルのこれらの化合物に耐性があり、これに基づいてスクリーニングし、選択することができる。
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実施例3.代謝産物の測定
以下の実施例は、本開示の実施形態の例である。当業者ならば、本開示の趣旨または範囲を変化させることなく実施することができる数々の改変および変更を認識するだろう。このような改変および変更は、本開示の範囲内に包含される。実施例は、決して本開示を限定しない。
フェニルアラニンの定量化(塩化ダンシル誘導体化)
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、サンプル中のフェニルアラニンレベルの定量化を必要とする、本明細書に記載のin vitroおよびin vivoアッセイについては、共同所有の係属中の2016年5月13日出願の国際特許出願PCT/US2016/032562、およびPCT/US2016/062369に記載されているように、塩化ダンシル誘導体化プロトコールが用いられた。上記文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に援用される。
トランス−ケイ皮酸の定量(トリフルオロエチルアミン誘導体化)
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、試料中のトランス−ケイ皮酸レベルの定量を必要とする本明細書で記載したin vitroおよびin vivoアッセイのために、トリフルオロエチルアミン誘導体化プロトコールを、共同所有の保留中のPCT/US2016/032562(出願日2016年5月13日)、およびPCT/US2016/062369(それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される)に記載されているように使用した。
フェニルアラニン、トランス−ケイ皮酸、フェニル酢酸、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸、馬尿酸および安息香酸の定量(2−ヒドラジノキノリン誘導体化)
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、試料中のフェニルアラニン、トランス−ケイ皮酸、フェニル酢酸、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸、馬尿酸および安息香酸レベルの定量を必要とする本明細書で記載したin vitroおよびin vivoアッセイのために、2−ヒドラジノキノリン誘導体化プロトコールを、共同所有の保留中の国際特許出願PCT/US2016/032562(出願日2016年5月13日)、およびPCT/US2016/062369(それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される)に記載されているように使用した。
LC−MS/MSによる血漿および尿中の馬尿酸、トランス−ケイ皮酸、フェニルアラニン、およびフェニルピルビン酸の定量化
馬尿酸、トランス−ケイ皮酸、フェニルアラニン、およびLC−MS/MSによる尿のフェニルピルビン酸定量は、共同所有の係属中の国際特許出願PCT/US2016/032562(出願日2016年5月13日)およびPCT/US2016/062369(これらの各々の全内容は参照により本明細書に援用される)に記載されるように測定された。
PCT/US2016/062369(2016年11月16日出願)の実施例1〜55は種々のPhe消費株の構築および活性を記載しており、これらの各々の全内容は参照により本明細書に援用される。
実施例27.SYN−PKU−710のin vitro活性
SYN−PKU−710はフェニルアラニンを消費し、非毒性代謝産物トランス−ケイ皮酸(TCA)およびフェニルピルビン酸(PP)に変換することによって高フェニルアラニン血症を治療するように設計された大腸菌Nissle1917(EcN)(参考文献)に由来する操作された細菌である。これは腸で見出されるフェニルアラニンを遮断し、分解することによって作用し、これは血液中へのフェニルアラニンの流入を減少させる。SYN−PKU−710は、ヒト消化管の微好気性(低酸素)環境におけるフェニルアラニンの劣化を可能にする一連の遺伝子操作によって作製された。ジアミノピメラート栄養要求性を介して生物学的封じ込めを増強しながら、消化管中に見出される低酸素条件下でフェニルアラニン劣化を増強するために、EcNのゲノムに以下の改変を行った:
a)嫌気性−誘導性プロモーター(PfnrS)および嫌気性応答性転写活性化因子FNRの調節制御下での高親和性フェニルアラニントランスポーター(PheP)をコードする内因性Nissle遺伝子の2つの追加コピーの挿入
b)PfnrSおよびFNRの調節制御下でのフォトラブダス・ルミネセンス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)をコードする遺伝子の3コピーの挿入
c)合成プロモーター(Plac)およびラクトース応答性転写リプレッサーLacIの調節制御下でのPALをコードする遺伝子の2つの追加コピーの挿入
d)アラビノース−誘導性プロモーター(PBAD)およびアラビノース応答性転写活性化因子AraCの調節制御下でのプロテウス・ミラビリス由来のL−アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)をコードする遺伝子の挿入
e)ジアミノピメラート栄養要求株を作製するための4−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリネートシンターゼをコードするdapAジーンの欠失
SYN−PKU−710は、ヒト消化管の微好気性(低酸素)環境におけるフェニルアラニンの劣化を可能にするように設計された一連の遺伝子操作においてEcNから誘導された。高親和性フェニルアラニントランスポーターであるPhePをコードする内因性遺伝子の2つの追加コピーのゲノム挿入を、EcN染色体内で行った。このトランスポーターは、環境フェニルアラニンの細菌細胞への取り込みを可能にする。さらに、生物フォトラブダス・ルミネセンスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子の3コピーを染色体に組み込んだ。PALは、フェニルアラニンの非毒性製品トランス−ケイ皮酸への変換を触媒する。PhePおよびPALをコードする遺伝子を、嫌気性−誘導性プロモーター(PfnrS)および嫌気性応答性転写活性化因子FNRの調節制御下に置いた。これらの調節成分は、フェニルアラニン劣化マシーナリーがヒト消化管の無酸素環境において産生されることを確実にする。合成プロモーター(Plac)およびLacI転写リプレッサーの制御下で、PALをコードする追加コピー遺伝子をNissle染色体に挿入した。これらのコピーは、ラクトースまたはラクトース類似体が転写抑制を緩和するために使用される場合、式のために誘導され得、そして薬物物質の製造の間のフェニルアラニン分解活性の誘導のために利用されることが想定される。このように、LacI仲介誘導による初期歪効力はSYN−PKU−710投与に際しては即座に活動を可能にし、PfnrS仲介誘導は、投与後の非効率性導入を可能にする。SYN‐PKU‐710におけるフェニルアラニン分解の第二経路を、酸素の存在下でフェニルアラニンをフェニルピルビン酸に変換する生物プロテウス・ミラビリス由来のL‐アミノ酸デアミナーゼ(I)をコードする遺伝子の染色体挿入を通して導入した。この遺伝子は薬物物質の産生中にアラビノースに反応してAraCによって誘導されるLAADの発現を可能にするように、内因性NisslearaC遺伝子の下流に挿入された。PALおよびLAADの活性は添加剤であることが示されている。LAADの介在物は、近位胃腸管においてより豊富に見出されると予想される利用可能な酸素を利用する機構である。
SYN‐PKU‐710はまた、細菌増殖に必須の4‐ヒドロキシ‐テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするジアミノピメラート(dapA)遺伝子の欠失で改変した。この欠失により、SYN−PKU−710はジアミノピメラートを合成することができなくなり、それにより、株が外因的にジアミノピメラートを補充されない限り、細菌の細胞壁の適切な産生が妨げられる。外部の製造目的のために、SYN−PKU−710はまた、フェーズ粒子の表現能力を除去するその内生的固有速度の一部(VII)を欠失して修正された。本稿では、内産生分の一部の欠失を構成する株をSYN−PKU−2002と呼ぶ。
SYN−PKU−710に関連するシーケンスおよび追加の詳細は国際特許出願PCT/US2016/032562(2016年5月13日出願)およびPCT/US2016/062369(2016年11月16日出願)に記載されており、これら各々の全内容は参照により本明細書に援用される。
In vitro活性を測定するために、一晩培養物をLBで1:100に希釈し、振盪しながら(250rpm)37℃で増殖させた。増殖1.5時間後に、培養物を90%N2、5%CO2、5%H2を供給したCoy嫌気性チャンバーに入れた。誘導して4時間後に、細菌をペレットにして、PBSで洗浄し、アッセイ緩衝液(0.5%グルコース、8.4%炭酸水素ナトリウムおよびPhe4mMを含むM9最少培地)に再懸濁した。30分から90分のフェニルアラニン分解速度(すなわち、アッセイ溶液の消失)またはケイ皮酸塩蓄積を1e9細胞に正規化した。表59は、全株の正規化した速度を示し、遺伝子操作されたプラスミドを保有する株および染色体挿入を含む遺伝子操作された株の非限定的例の遺伝子型および活性について記載している。
[表59]遺伝子操作されたプラスミドの保有株および染色体挿入を含む遺伝子操作された株の遺伝子型および活性
[表77]バイオセイフティーシステム構築物および配列成分
I. 実施例55.大腸菌Nissle1917およびその操作された派生物のプロファージバイオインフォマティクス分析
A.概要
目的:日常的な試験手順により、大腸菌Nissle1917(E.coli Nissle;E.coli Nissle)および関連する操作された派生物からのバクテリオファージ産生が同定された。バクテリオファージの供給源を決定するために、大腸菌Nissleのゲノムの共同バイオインフォマティクス評価、およびプロファージのエビデンスについて株のゲノム配列を分析するため、機能的ファージを産生する可能性について同定されたプロファージ元素を評価するため、細菌ゲノム配列の中で同定された他の既知のファージと任意の機能的ファージ元素を比較するため、およびプロファージ元素が他の配列決定されたエシェリヒア属coli(Ecoli)ゲノム中で見出される周波数を評価するために、操作された誘導体が行われた。
実験手順
1.バイオ分析方法
a.ファージ予測
ファージ予測ソフトウェア(PHAST)(Zhouら、「PHAST: A Fast Phage Search Tool」Nucl.Acids Res.(2011)39(suppl 2): W347−W352)を使用して、公開され公に入手可能な大腸菌Nissleゲノム(GenbankアクセッションNZ_CP007799.1)(Reisterら、グラム陰性プロバイオティクス大腸菌株Nissle 1917の完全ゲノム配列;J Biotechnol.2014 10月10日;187:106−7)内、ならびにDSM 6601、ロット番号Jul91(DSMZ、Braunschweig、ドイツ)に由来する大腸菌Nissleの単一増殖から作製された研究セルバンクであるSYN001−大腸菌Nissle1917内でプロファージを検索した。
b.DNAシークエンシングおよびアセンブリ
遺伝子操作された株のゲノム配列は、Illumina MiSeq DNAシーケンサーを用いて外部資源(GENEWIZ、Boston MA)によって生成された。ファージ配列の配列を調べるために、まず、デフォルトパラメーターを用いてゲノムアセンブラーソフトウェア(SPAdes)バージョン3.9.1を用いてゲノム配列決定読み取りを組み立てる必要があった(Nurkら、Assembling single−cell genomes and mini−metagenomes from chimeric MDA products; J Comput Biol.2013 Oct; 20(10):714−37。500ヌクレオチド未満の長さを有する足場を廃棄した。
c.遺伝子操作された株に特異的な可能性のある配列領域の同定
元の大腸菌Nissle株には存在しない可能性がある配列を同定するために、大型リファレンスゲノム(BWA MEM)に対して低発散配列をマッピングするためのソフトウェア(LiおよびDurbin、Burrows−Wheeler変換を用いた高速かつ正確なショートリードアラインメント; Bioinformatics.2009 Jul 15;25(14):1754−60)を用いて、原料リードデータを3つのリファレンスゲノムのそれぞれにアラインメントした。3つの参考ゲノムは公開された配列および公的に入手可能な大腸菌Nissleゲノム(Genbank accession NZ_CP007799.1)(Reisterら、Complete genome sequence of gram−ne gram−negativeプロバイオティクス大腸菌株Nissle 1917; J Biotechnol.2014 10月10日; 187: 106−7)、Genewizによって配列決定された大腸菌NissleゲノムのSYN001(野生型大腸菌Nissle)版、および操作された株を作製するために使用された特異的な操作工程から生じる変化と共にSYN001の配列に基づいた操作された株のゲノムについての予想される配列であった。操作された株の予想される配列に対応しない配列に焦点を当てるために、読み取りを各参照に整列させ、そしてソフトウェアSamtools(Liら、The Sequence Alignment/Map format and SAMtools; Bioinformatics.2009 Aug 15;25(16):2078−9)に従って各参照に別々に整列させた読み取りを廃棄し、そして各参照ゲノムに整列しなかった残りの読み取りをさらに分析した。同じプロセスを使用して、操作された株におけるユニークな配列を同定した。
3つの参考文献の各々にマッピングされなかった読み取りは、ゲノムアセンブラソフトウェアSPAdesバージョン3.9.1を用いて、デフォルトパラメーターでアセンブルした(Nurkら、Assembling single−cell genomes and mini−metagenomes from chimeric MDA products; J Comput Biol.2013 Oct; 20(10):714−。これらの組み立てられた足場は、Blastツール(Altschul et al、Basic local alignment search tool; J Mol Biol.1990 Oct 5; 215(3): 403−10)を用いて、National Center for Biotechnology Information(NCBI)中の非冗長データベースと比較することによって、ファージ関連配列の存在をチェックするために。
これらの結果を検証するために、ゲノム配列アラインメントソフトウェア(MUMmer)(Delcher et al、Fast algorithms for large−scale genome alignment and comparison; Nucleic Acids Res.2002 Jun 1; 30(11): 2478−83)を用いて、遺伝子操作された株のアセンブリ全体と公的に入手可能なCP007799.1参照ゲノムとの間で全ゲノムアラインメントを行った。これらのアラインメントは、参照アセンブリにマッピングされなかった新しいアセンブリから独特の配列を同定した。Blastツール(Altschul et al、Basic local alignment search tool; J Mol Biol.1990 Oct 5; 215(3): 403−10)を用いて、NCBI中の非冗長データベースとユニーク配列を再び比較し、ファージ関連配列の存在をチェックした。このアプローチの結果、3つの電位ファージが同定された。
d.他のゲノムにおけるファージ3とのマッチングの検索
PHASTバイオインフォマティックツールによって同定されたファージ3配列の大きさをさらに精緻化するために、ファージ3配列のコア領域を、大腸菌Nissleにおけるファージ3の59キロ塩基(kb)領域を、ファージ3を含まない大腸菌BW25113の密接に関連するゲノムに整列させることによって決定した。大腸菌Nissle由来の59kbファージ3配列の左側および右側末端の領域は宿主染色体(非ファージ)配列に対応すると思われる大腸菌BW25113中の遺伝子のゲノム構成と一致したが、大腸菌Nissle由来のファージ3配列の中央の43kb領域はEcoli BW25113中には発明、Ecoli BW25113中に存在する2つの宿主染色体遺伝子間の挿入として現れた。従って、このアラインメントにより、43kbのコアファージ3領域が観察され、これは大腸菌Nissleに独特であり、ファージ3の真の限界を含むようであった。次いで、この43kbのコアファージ3配列を、MUMmerアラインメントソフトウェアDElcherら、大規模ゲノムアラインメントおよび比較のための高速アルゴリズム; Nucleic Acids Resを使用して、NCBIからダウンロードされた5691大腸菌および赤痢菌アセンブリの包括的な組に対してアラインメントについて比較した。2002 Jun 1;30(11):2478−83)。大腸菌外のファージ3のインスタンスを同定するために、43kbのコアファージ3全体を、ブラストツール(Altschulら、Basic local alignment search tool; J Mol Biol.1990 Oct 5;215(3):403−10)を用いて非冗長NCBIデータベースと比較した。
他のゲノムにおけるファージ3への部分的ヒットがより大きなファージ元素の一部であるかどうかを決定するために、ファージ3への部分的マッチングを有する足場を他のゲノムから抽出し、そしてPHAST(Zhouら、「PHAST: A Fast phage Search Tool」、Nucl.Acids Res.(2011)、39(suppl 2):W347−W352)を使用して、これらの領域内のプロファージの存在を予測した。
e.大腸菌の大規模ファージ予測
任意の型のプロファージが配列決定されたEcoli株の間で見出される周波数を評価するために、PHAST(PHASTER)Arndt D.ら、PHASTER:PHASTERの新たに公開されたより効率的なバージョン:PHASTファージ検索ツールのより良好でより速いバージョン。核酸研究所。44, W16−W21(2016)を使用して、大腸菌ゲノムの大きなセット内の任意のプロファージ元素の存在を検索した。ファージ予測アルゴリズムの精度は、高品質ゲノムの使用に依存するので、287の高品質参照配列(Refseq)大腸菌ゲノムのセットを、この検索のために使用した。
B.結果
1.大腸菌Nissleのファージ含有量
3つの高い信頼性の予測されるプロファージ配列が、本明細書中でファージ1、ファージ2、およびファージ3と呼ばれる大腸菌Nissleゲノムの各バージョン内に見出された(図1)。これらの高スコアファージの3つすべてを、PHASTによって「インタクト」ファージと命名し、これらがファージの主要成分のすべてを含むことを示した(図1)。大腸菌Nissle(ファージ3)における最も長い予測ファージは全部で68タンパク質を含み、ファージ尾部、頭部、ポータル,ターミナーゼ、リシン、カプシド、およびインテグラーゼを含み、これらはすべて無傷であるよう。ファージ2は全部で69タンパク質を含み、ファージトランスポザーゼ、溶解、ターミナーゼ、頭部、ポータル、カプシド、および尾部タンパク質を含む。ファージ2の詳細な調査はint/xis遺伝子対が可動性遺伝要素によって破壊されていること、およびcIリプレッサーが別々のDNA結合ペプチドおよび感知ペプチドに断片化されていることを明らかにし、これはこのファージの誘導を妨げると予想される。大腸菌Nissle、ファージ1で予測されるインタクトファージの最短は全部で32タンパク質を含み、溶解およびトランスポザーゼ官能を含む。しかしながら、ファージ1と呼ばれる推定上のプロファージ元素内に多くの構造遺伝子が存在しないことから、生存可能なファージ粒子を放出するその可能性が疑問視される。ファージ1〜3の特徴を表84に要約する。
2.操作された株は、大腸菌Nissleと同じファージ含有量を有する
操作された株の組み立てられたゲノム内で、PHASTは、元の大腸菌Nissleゲノムにおいて予測されたのと同じファージ含有量を予測した。大腸菌Nissle内で「インタクト」ファージとして同定された3つのファージの全ても、操作された株のゲノム内で同定された(ファージ1〜3)。
3.操作された株は追加のプロファージエレメントを含有しない
操作された株の生の配列決定読み取りの大部分は、参照ゲノムにマッピングされ、操作された株ゲノムに独特であった配列は非常に少なかった。少量のユニークな配列内にファージ配列の証拠はなかった。組み立てた場合、これらの独特の配列は各々が長さ<2kbを有し、既知のファージ配列と類似性がない3つの足場のみをもたらした。この結果は大腸菌Nissle参照ゲノムに対する完全な操作された株アセンブリの全ゲノムアラインメントを実施し、そして参照にマッピングされなかった操作された株内の領域を同定することによって確認された。この手順を用いて、2つの同じ短い配列を同定した。これらの短い配列のいずれも、任意の公知のファージ配列といかなる類似性も有さなかった。操作された株に特有のこれらの非常に短い配列は、ファージではなく、サンプル中の疑似DNAを表すよう。
4.ファージ3は大腸菌Nissleに特異的である
実験室研究により、大腸菌Nissleによって放出されたプラーク形成ファージ粒子、および操作された株は、ファージ3(SYN−17.002)のみに由来することが決定された。従って、他の大腸菌ゲノムにおけるファージ3(プロファージとして)の存在の評価を行った。NCBIからダウンロードした5691のEcoliおよびShigellaゲノムアセンブリの広範なデータセット内で、全長ファージ3は、大腸菌Nissleにおいてのみ見出された。ファージ3の全長を100%の同一性でカバーする2つの全長、43kbの一致のみが存在し、これらの両方は大腸菌Nissleゲノムの異なるバージョン(GCA_000333215.1およびGCA_000714595.1)に対応し、データセット内の他のEcoliゲノムにおいて、5つの追加の長い部分一致(14−20kb、97−99.6%の同一性を有する)、および4つの他のより短い部分一致(5−10kb、95−98%の同一性)が存在した(図10)。同じ集合体の複数足場の間で分割された、いくつかの他のより短い断片も同定された。部分的なマッチングはファージ3の別領域にマッピングされ、図10に示される。
他のゲノムにおいてこれらの部分的な一致を含む足場を抽出し、そしてファージ3に対する各々の部分的な一致が、ファージ3に対して他の類似性を有さない他のゲノム内のより長いプロファージの断片を含むことを決定するために使用した。これらの領域は常に、他のゲノムにおけるより長く高スコアの「完全である」ファージ予測の一部であり、大腸菌Nissleの外側のこれらのファージは「ハイブリッド」ファージに対応し、配列の一部はファージ3に一致し、残りはファージ3とは異なるファージ配列に対応する。これらの結果は、大腸菌中に存在する最も近い関連ファージがファージ3 DNA配列とそれらのゲノムの約半分までを共有することを示す。大腸菌以外では、いくつかの部分的な一致がより遠くに関連したEnterobacter(長さ10〜18kb)内で同定され、96〜97%の同一性を有した。
5.大腸菌全体の予測ファージの分布
ファージは、大腸菌において非常に一般的である。Refseqデータベース中の大腸菌ゲノムのほとんど全ては、PHASTERファージ予測ソフトウェアツールを用いて評価されるように、少なくとも1つの「無傷の」高スコアファージを含み、いくつかは20までを有する(図12)。大腸菌ゲノム中の予測ファージの平均数は6.4であり、これは、PHASTERによって大腸菌Nissleについて予測された数よりも実質的に高い。このより新しいファージ予測ツールを使用して、2つのより長いファージのみが、大腸菌Nissleにおいて同定される(これらは本明細書中でファージ2およびファージ3と呼ばれる)。従って、大腸菌Nissleは、ほとんどの他の大腸菌よりも実質的に少ない予測ファージを有する。
C.結論
バイオインフォマティクス分析の結論は以下の通りである:第1に、大腸菌Nissleおよび操作された誘導体は3つの候補プロファージ元素を含み、3つのうちの2つ(ファージ2およびファージ3)は、インタクトファージゲノムに特徴的なほとんどの遺伝的特徴を含む。さらに、ファージ3はほとんど6000の配列決定された大腸菌ゲノムのコレクションの中で大腸菌Nissleに独特であるが、他の推定プロファージ元素との相同性の短い領域に限定された関連配列が少数のゲノムにおいて見出される。第4に、プロファージは大腸菌株の間で非常に一般的であり、大腸菌Nissleは、配列決定された大腸菌ゲノムの十分に特徴付けられたセットにおいて見出される平均と比較して、比較的少数を含有する。これらのデータは大腸菌Nissleの操作株におけるプロファージの存在がこの種の自然状態の結果であり、そして分析されたこのような操作株のプロファージの特徴が前駆体株大腸菌Nissleと一致したという結論を支持する。
実施例56.大腸菌Nissleおよび遺伝子操作された派生物からのバクテリオファージの検出および特性評価のための一般的なプロトコール
エシェリヒア属coli Nissle 1917(大腸菌Nissle)および工学処理された誘導体試験は、確認されたバクテリオファージプラークアッセイ中のファージ3の低量存在について陽性であった。バクテリオファージプラークアッセイを行って、バクテリオファージの存在およびレベルを決定した。要するに、一晩増殖させた試験細菌の培養物からの上澄み液をファージ感受性指標株と混合し、バクテリオファージの存在を示すプラークの産生を検出するために軟寒天中で平板培養した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーを、バイオインフォマティクス分析において同定された3つの異なる内因性プロファージを検出するために設計し、ファージ特異的DNAの存在についてプラークを評価するために使用した。
D.実験手順
1.ファージ試験プロトコール:マイトマイシンC誘導データ解析を使用した大腸菌の細菌ウイルスのプラークアッセイ
マイトマイシンCファージ誘発法(STM−V708法、エシェリヒア属coli(大腸菌)由来の細菌ウイルスのプラークアッセイ)を用いて、ファージの産生について細胞株を分析した。Sinsheimer RLに記載されているように、マイトマイシンC誘導を使用する。バクテリオファージX174の純化および特性。J. 分子。Biol.。1959; 1:37−42、and Clowes、RC and Hayes、WExperiments in microbial genetics.John Wiley & Sons、NY 1968(これらの各々の含有量は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。簡単に述べると、サンプル(細胞膨張を支持するためにチミジンを補充した培地を適宜用いて)および対照細胞を一晩増殖させた。サンプル,ポジティブコントロール(大腸菌、EMG 2: K(ラムダ)、ATCC 23716、または当量)およびネガティブコントロール(大腸菌、ATCC 13706、または当量)の一部を除去し、遠心分離し、それぞれの上澄み液をプラークアッセイでバクテリオファージの存在について調べた。マイトマイシンCを、最終濃度2μg/mLで、残りのサンプル、陽性および陰性細菌培養物に添加した。次いで、培養物を37±2℃に置き、ポジティブコントロール中で溶解が起こるまで(〜4.5時間)、300〜400rpmで振盪した。それぞれの培養物をクロロホルムで処理し、遠心分離し、上澄み液の0.1mlアリコートをバクテリオファージの存在について調べた。これを達成するために、上澄み液をファージ感受性大腸菌株ATCC 13706と混合し、0.7%アガロース溶液と混合し、そしてローンとして溶解性ブロスカンテン培地(LB)上にプレーティングした。プラークがポジティブコントロール中に存在し、プラークがネガティブコントロール中に存在しない場合、試験は有効であるとみなした。
2.特定のバクテリオファージのPCR検出
a.ファージ特異的PCRプライマーの選択
オリゴヌクレオチドポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プライマーを、大腸菌Nissleの3つの推定プロファージ領域のそれぞれに対して特異性を有するように設計し、Integrated DNA Technologies(IDT、Skokie、IL)から注文した。プライマーはNissleゲノムを注意深く調べた後に選択し、ファージ特異的タンパク質をコードすると予想される独特の領域内に完全に結合するように設計した(表85)。
[表85]大腸菌Nissle用のファージ特異的プライマーおよびコントロールプライマー
大腸菌Nissleゲノムおよび関連株内で見出されるが、3つのファージ元素の外側に位置する必須細菌特異的遺伝子であるrpoBに特異的に結合するオリゴヌクレオチドPCRプライマーのさらなる一対を設計した。rpoBに結合したプライマセットは、ゲノムDNA調製物の質およびPCRプロトコールの有効性の両方のポジティブコントロールとして役立った。さらに、ファージDNAはrpoB遺伝子を含むべきではなく、したがって、これらのプライマーはまた、ファージ−プラークピッキング技術の純度のためのコントロールとして役立った。25回のPCR反応サイクルが対応するファージによって産生されたプラークについての特異的ファージPCRプライマー対を有する強力なバンドを産生するのに十分であったが、25回のサイクルを有する同じプラークDNAを使用して、rpoBプライマーでは弱いバンドのみが観察されたか、またはしばしばバンドが観察されなかったことが決定された(データは示さず)。このため、プラークサンプルのPCR解析を25サイクル行った。
a.PCR反応条件およびプライマー特異性の確認
上記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、大腸菌NissleゲノムDNA(gDNA)に対してPCRを行い、ファージ1、2、および3ならびにrpoB宿主ゲノム制御について予想されるPCR産物が産生されたかどうかを決定した。ファージ陰性株ATCC 13706はPCR反応のネガティブコントロールとして働いた。PCR反応のためのgDNA鋳型を調製するために、大腸菌NissleをLB培地中で37±2℃で増殖させ、250回転/分(rpm)で一晩振盪した。100μLの固定相培養物を1.5mLのエッペンドルフチューブに添加し、>20,000×g(15,000rpm)で微量遠心分離機中で30秒間回転させた。上澄み液を除去し、セルペレットを100μLの滅菌水に再懸濁した。この100μLの懸濁液を0.2mlのさらさら壁管に移し、エッペンドルフマスターサイクラープロサーモサイクラー中で98℃で10分間加熱した。得られた溶液は、PCR反応に適したgDNAを含んでいた。DNAヌクレオチドおよびポリメラーゼの供給源としてMyTaq(商標)Red Mix(Bioline)を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、DNA増幅を支持し、DNA鋳型として大腸菌NissleのgDNAを用い、表86の条件に従って混合した。ポリメラーゼ連鎖反応を、表87に記載されるように、Eppendorf Mastercycler Proサーモサイクラーにおいて行った。PCRの完了後、5μLの反応物またはDNA標準(1kB+ラダー、Invitrogen)を、電気泳動による分離およびSyngene紫外線(UV)トランスイルミネーターを使用する可視化のために、0.8%アガロースゲル上にロードした。
[表86]大腸菌Nissleから推定プロファージ領域を増幅するPCRの調合
[表87]大腸菌Nissleからプロファージ領域を増幅するためのPCR反応サイクル
バクテリオファージ力価アッセイは、有効な方法を用いて行った。PCR解析は、大腸菌Nissleに由来する数え上げ可能なバクテリオファージプラーク(適用可能な場合)または操作された株を含む、得られたファージ力価プレートの上澄み液について行った。プラークを生成したファージの同一性をPCRによって決定した。個々のプラークの寒天プラグを、2μLピペットチップを用いて培養プレートから除去した。各プラグを0.5mLの滅菌蒸留水に再懸濁した。プラグ再懸濁液を15秒間ボルテックスし、次いで1μLをDNA鋳型としてPCR反応に添加した。ファージ特異的PCR反応を、DNAヌクレオチドおよびポリメラーゼの供給源としてMyTaq(商標)Red Mix(Bioline)を用いて実施し、DNA増幅を支持し、DNA鋳型としてプラグ再懸濁液を用い、表5の条件に従って混合した。上記の表85からのプライマーの各組を、大腸菌NissleおよびATCC13706gDNAを陽性およびネガティブコントロールとして用いて、3つの推定ファージの各々を同定するために別々のPCR反応に使用した。PCR反応は表89の条件に従って行い、プラーク中に存在する任意の残留宿主染色体DNAの増幅を防止するために、限られたサイクル数(25サイクル)で行った。PCRの完了後、5μLの反応物またはDNA標準(1kB+ラダー、Invitrogen)を、電気泳動による分離およびSyngene UVトランスイルミネーターを用いた可視化のために、0.8%アガロースゲル上にロードした。
[表88]プラークプラグから大腸菌Nissle特異的ファージを増幅するためのPCR反応条件
[表89]プラークプラグからプロファージ領域を増幅するためのPCR反応サイクル
実施例57.大腸菌Nissleおよびファージ存在のためのMutaflorのテスト
4.ファージ試験データの要約
いくつかのサンプル中のファージの存在を検出するための独立した分析を行った。分析は、微生物および細胞培養物のドイツコレクションからの大腸菌Nissleのセルバンクサンプル(本明細書中ではSYN001と呼ぶ)、および大腸菌Nissleを含有するムタフロアのカプセルが非誘導および誘導(マイトマイシンC処置)条件下で低濃度のファージを可変的に発現することを示した(表90)。
興味深いことに、大腸菌Nissle株は、いずれの条件においてもファージを示さないCTMロットによって見られるように、常に誘導性であるとは限らない。さらに、誘導性大腸菌Nissle細胞(MutaflorおよびSYN001)が検出可能なファージを発現する場合でさえ、その量は、他の大腸菌Nissle株についての誘導されていないまたは誘導された条件下で見られる最大量に類似する。対照的に、バクテリオファージラムダプロファージを含む大腸菌K−12株であるポジティブコントロール株ATCC23716,2は、誘発後に大腸菌Nissleまたはその誘導体よりも5〜6桁多いファージを産生した。これは、まだ理解されていない理由のために、大腸菌Nissle株の誘導能の明らかな欠如を実証する。
5.大腸菌NissleゲノムDNAに対するファージ特異的プライマーの検証
PCR分析法がプラーク産生ファージを同定し得ることを検証するために、プロファージ1、2、3または宿主rpoB遺伝子のいずれかに特異的なプライマーを使用して、大腸菌Nissle gDNAに対してPCR分析を行った(表85)。ここでは示されていないが、指標株ATCC13706に対する同じプライマーを用いた同様の分析はファージプライマーについてのバンドおよびrpoBについてのわずかなバンドを与えず、これは3つの大腸菌Nissleプロファージを欠くが、大腸菌Nissle遺伝子といくらかの配列類似性を有するrpoB遺伝子を含むこの株と一致する。各プライマーセットはアガロースゲル電気泳動によって判断されるように、正しいサイズの単一のDNA製品を産生し、これは、図13に示される。この試験結果に基づいて、これらのプライマー対を使用して、異なるファージの存在について、表90に要約される分析からの個々のプラーク由来のファージDNAを評価した。
6.ファージ1、2、および3の存在に関する個々のプラークの分析
プラークアッセイからの計数可能なプラークを有するプレートを、PCR解析によって分析した。ポリメラーゼ連鎖反応分析を、プロファージ1、2、3または宿主rpoB遺伝子のいずれかに特異的なプライマーを使用して、計数可能なプラークを有するプレートからの10個のプラークに対して行い、プラークを作製したファージの同一性を決定した。いくつかの場合において、明らかに列挙可能なプラークを有するプレートは10未満のプラークを含み、この場合、全てのプラークが使用された。しかしながら、少なくとも6つのプラークを全ての分析について試験した。実行されたすべてのPCR反応において、プロファージ3に特異的なプライマーのみがPCR産物を産生し、これは、表90に列挙される各試験株およびバッチについてのすべての場合において真実であった。このデータの代表的なゲル分析を図14に示す;図14の左側のパネルは、大腸菌のアッセイから採取された個々のプラークプラグについて可視化された代表的な組のPCR反応を示す。右側のパネルは大腸菌NissleまたはATCC13706(CRLファージアッセイで使用されるファージ陰性指標株)のいずれか由来のgDNAを使用し、常在性プロファージ3を含まない対照試験を示す。この後者の発見は、ファージプラークPCR分析において観察された陽性結果がATCC13706プレーティング株における配列との交差反応の結果ではないことを確認する。
E.結論
結論として、これらのデータは、発現可能なプロファージエレメントが評価された大腸菌Nissle株およびMutaflor株に存在することを実証する。これは、発現可能なプロファージが大腸菌Nissleに存在することを示す。非誘導状態では、大腸菌NissleおよびMutaflorが検出可能なプラークを全くまたは低レベルで産生しない。すべての場合に産生されたファージ量は、ポジティブコントロール株ATCC23716よりも5〜6桁低かった。これらの細菌ゲノムのバイオインフォマティクス分析に基づいて、PCRアッセイを開発し、これらの株において同定された3つの内因性プロファージ元素のいずれかが活性ファージ粒子の供給源であるかどうかを決定した。結果はこのプロファージゲノムがファージ感受性大腸菌株ATCC13706(これはファージ3配列を天然には含まない)上に形成されたプラークから独特に増幅されたので、大腸菌Nissle試験結果のプラークは本明細書中でファージ3と呼ばれる、バイオインフォマティックに同定された3つのプロファージ元素のうちの1つのみに試験結果することを示す。総合すると、これらのデータはファージ3が陽性ファージ試験結果の原因物質であり、これらの株でファージ産生に観察可能な差異がないようという結論を強く支持する。この情報はまた、これらの株によって産生されるファージが、市販のMutaflorカプセルを含む、大腸菌Nissleに天然のプロファージ元素の試験結果であることを確立する。
1.結果および結論の要約
結論として、これらのデータは、発現可能なプロファージ元素が大腸菌Nissleに内因性であることを実証する。検証されたプラークアッセイによって決定された、試験された株によってファージ粒子が産生された頻度は同様の低水準で定量的にであり、これは、一般に発現可能なプロファージが大腸菌Nissleに存在することを示している。これらの細菌ゲノムのバイオインフォマティクス分析(実施例55)に基づいて、大腸菌Nissleで同定された3つの内因性プロファージエレメントのいずれかがプラーク形成ファージ粒子の供給源であるかどうかを決定するために、PCRアッセイを開発した。結果は、プラークが大腸菌Nissleから発現される場合、バイオインフォマティックに同定された3つのプロファージエレメントのうちの1つのみ、プロファージ3から生じることを示す。このプロファージゲノムは、ファージ感受性エシェリヒア属coli(大腸菌)株ATCC13706(これはプロファージ3配列を天然には含まない)上に形成されたプラークからのPCRによって独特に増幅された。総合すると、これらのデータはプロファージ3が陽性ファージ試験結果の原因物質であり、これらの株でファージ産生に観察可能な差異がないようという結論を強く支持する。この情報はまた、これらの株によって産生されるファージが、市販のMutaflorを含む、大腸菌Nissleに天然のプロファージエレメントの試験結果であることを確立する。
実施例58.SYN001、SYN−PKU−710、SYN−PKU1033、およびSYN−PKU1034のファージテスト
本研究では、大腸菌Nissleのプラークアッセイ、およびフェニルアラニン消費回避回路、SYN−PKU−710、SYN−PKU1033およびSYN−PKU1034を含む技術系株を用いて、株が生産するフェーズレベルを決定した。表91は、本研究で使用した株の説明を提供する。
各株を、対数期にマイトマイシンCの有無、および定置夜間からマイトマイシンCの有無で試験した。CFUカウントを測定した後、上澄み液をプラークアッセイのために処理して、細胞当たりに産生されるプラークの量を測定した。
以下の試験株を、LB(DAP 100ug/mLを必要に応じて含む)、14mLの培養管中、37℃で250rpmで振盪しながら3mL中で一晩増殖させた:SYN01(Nissle);ATC13706(ネガティブコントロール);SYN−PKU−710;SYN−PKU1033、およびSYN−PKU1034。ATCC13706のさらなる20mL培養物を、感受性プラークインジケーター株として使用するために、125mLバッフル付きフラスコ(37C、250rpm)中でLB中で増殖させた。これらの一晩培養物を使用して、125mLバッフル付きフラスコ中で1:100希釈(DAP 100ug/mL、適切な場合)で、LB中の10mL培養物に2連で接種した。各株について、一方のフラスコは2ug/mLのマイトマイシンCを含み、他方の培養物を対数期非誘導対照として使用した。全てのフラスコを37℃の振盪(250rpm)で4.5時間増殖させた。次に、培養物および静止した誘導されない一晩の培養物を、96ウェルプレート中のPBS中で10倍希釈し、そして細胞数の判定のためにプレーティングした。10−3から10−8希釈に及ぶスポット希釈物10ulを、各株について、1プレートあたり(LBプレート−DAP 100ug/mL、適切な場合)、2連で平板培養した。
細胞を計数した後、それぞれの培養物からの1mL(1株あたり3培養物)を1.5mLのエッペンドルフチューブに移し、50uLのクロロホルムを添加した。チューブを15〜30秒間ボルテックスし、細胞をマイクロ遠心分離機中で最大速度で2分間スピンダウンした。
上澄み液を、ウェル当たり180uLのLBを含む96ウェルプレート中で希釈した。それぞれの株について200uLの純上澄み液を第1のウェルに添加し、マルチチャネルピペットを用いて10倍希釈を行った。感受性対照株を調製するために、10mLのATCC13706を15mLファルコン管中で4000×gでスピンダウンし、上澄み液をデカントし、細胞を等容量の10mM硫酸マグネシウム中に再懸濁した。
100ulのATCC13706細胞懸濁液を含む14mlの培養管を、適切な株および上澄み液の希釈のために調製した。ニート上澄み液および上澄み液希釈液をチューブに添加し、細胞/上澄み液混合物を最低5分間インキュベートした。
インキュベーション後、酵母抽出物を欠くLB培地中の7g/L寒天からなる液体トップ寒天3mLを試験管に添加し、混合物を適切に標識されたLBプレート上に直ちに均一に注いだ。プレートを乾燥させた後、それらを37℃の静的インキュベーターに移動させ、反転させ、一晩インキュベートした。プラーク数を表92に示す。
コロニー計数は2ug/mLのマイトマイシンCがすべてのNissle株について完全に致死的であったが、2μg/mLが細胞の約90%を死滅させたATCC13706については致死的ではなかったことを示した。
ファージ3に特異的なプライマーを用いてファージ3DNAが存在することを確認するために、PCR分析を行った(示さず)。
実施例59.抗生物質カセットの染色体挿入を使用した大腸菌Nissleからのファージ産生の非活性化
バイオインフォマティックアプローチは、活性ファージを含むと推定されるゲノムの3つの領域を同定するのに役立った(実施例55を参照のこと)。活性ファージは塩基類2,035,867と2,079,177の間のゲノム座に由来することを示した。
F.ノックアウトプライマー設計
ファージを不活性化するために、λレッド組換えを用いて、9,687塩基類対欠失を作製した。λレッド組み換えは、バクテリオファージλ由来の組換え酵素を用いて、隣接相同性によって指向される大腸菌の染色体に特注DNA片を挿入する手法である。まず、プラスミドpKD3からフリッパーゼ認識部位(FRT)に隣接するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を増幅するためにプライマーを設計し、合成した(表93)。Nissleに導入されると、このカセットは抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を提供する。さらに、これらのプライマーは、抗生物質カセットをファージ遺伝子座に導くゲノムに対して60塩基類対のホモロジーを含む。Phage3 KO FWDおよびPhage3 KO REVプライマーを使用して、1178塩基類対直鎖状DNA断片をPCR増幅し、これをPCR精製した。得られたDNA鋳型を組換えに使用した。
[表93]ファージ3の不活性化に使用されるプライマー
G.λレッドシステムの導入
ファージの欠失のためのNissle株を調製するために、最初に、pKD46プラスミドを大腸菌Nissle宿主株に形質転換することによって、ラムダレッド系を導入した。大腸菌Nissle細胞をLB媒体中で一晩増殖させた。一晩培養物を5mlのLB媒体で1:100に希釈し、0.4〜0.6のOD600に達するまで増殖させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを4℃に予備冷却し、大腸菌細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を1mlの4℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を0.5mlの4℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を0.1mlの4℃水中に再懸濁する。エレクトロポレーターを2.5kVに設定した。1ngのpKD46プラスミドDNAを大腸菌細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、無菌の冷却したキュベットにピペットで移した。乾燥キュベットをサンプルチャンバーに入れ、電気脈拍を適用した。室温のSOC培地1mlを直ちに加え、培養管に移し、30℃で1時間インキュベートした。細胞を選択培地プレート上に広げ、30℃で一晩インキュベートした。
H.Nissle中のファージのλレッド不活性化
組み換え構築物を、pKD46を含む大腸菌Nissleに形質転換して、ファージ配列を欠失させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを4℃に予備冷却し、一晩培養物をカルベニシリンを含有する5mLのLB媒体で1:100に希釈し、OD600=0.1に達するまで増殖させた。次に、0.05mLの100×L−アラビノースストック溶液を添加して、pKD46λレッド発現を誘導した。培養物を、OD600=0.4〜0.6に達するまで増殖させた。次いで、大腸菌細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を1mlの4℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を0.5mlの4℃水中に再懸濁した。大腸菌を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を0.1mlの4℃水中に再懸濁した。エレクトロポレーターを2.5kVに設定し、0.5μgの組み換え構築物を細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、滅菌冷却キュベットにピペットで移した。乾燥キュベットをサンプル室に入れ、電気パルスを施し、1mlの室温SOC培地を即座に加え、混合物を培養管に移植し、37℃で1時間インキュベートした。細胞を、35μg/mLクロラムフェニコールを含有するLBプレート上に広げ、一晩インキュベートした。
I.突然変異の検証
突然変異の存在をコロニーPCRによって確認した。コロニーをピペットチップで拾い上げ、ピペットで上下させることによって20μlの冷ddH2Oに再懸濁した。3μlの懸濁液を、後の使用のために適切な抗生物質を含むインデックスプレート上にピペットで移した。インデックスプレートを37℃で一晩成長させた。PCRマスターミックスを、5μlの10×PCR緩衝液、0.6μlの10mM dNTP、0.4μlの50mM Mg2SO4、6.0μlの10×向上剤、および3.0μlのddH2O(PCR反応当たり15μlのマスターミックス)を使用して作製した。CAT遺伝子(100μMストック)または挿入されたCAT遺伝子(100μMストック)に隣接するゲノム配列に固有のプライマー2μLをddH2O16μLに混合することによって、10μMプライマーミックスを作製した。使用したプライマーの配列を表94に示す。各20μlの反応について、15μLのPCRマスターミックス、2.0μLのコロニー懸濁液(鋳型)、2.0μLのプライマーミックス、および1.0μLのPfx Platinum DNA PolをPCRチューブ中で混合した。PCRサーモサイクラーを以下のようにプログラムし、ステップ2〜4を34回繰り返した:1)94℃で5:00分、2)94℃で0:15分、3)55℃で0:30分、4)68℃で2:00分、5)68℃で7:00分、次いで4℃に冷却し、PCR産物を、10μLの各アンプリコンおよび2.5μLの5×色素を使用するゲル電気泳動によって分析した。PCR産物は、CAT遺伝子がゲノムに挿入された場合にのみ形成される(それによって、ファージを欠失および不活性化する)。
[表94]ファージ3の欠失を確認するためのプライマー
J.変異体からの抗生物質耐性の除去
抗生物質耐性遺伝子をプラスミドpCP20で除去した。プラスミドpCP20は、FRT部位を組み換えてCAT遺伝子を除去するフリッパーゼリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミドである。欠失ファージ配列を有する株を、0.4〜0.6のOD600に達するまで、37℃で抗生物質を含有するLB媒体中で増殖させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを4℃に予備冷却し、細胞を2,000rpmで5分間4℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を1mlの4℃水中に再懸濁した。細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を0.5mlの4℃水中に再懸濁した。細胞を2,000rpmで5分間、4℃で遠心分離し、上澄み液を除去し、細胞を0.1mlの4℃水中に再懸濁した。エレクトロポレーターを2.5kVに設定し、1ngのpCP20プラスミドDNAを細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、無菌の冷却したキュベットにピペットで移した。乾燥キュベットをサンプルチャンバーに入れ、電気脈拍を適用した。室温のSOC培地1mlを直ちに加え、培養管に移し、30℃で1〜3時間インキュベートした。次に、200μLの細胞をカルベニシリンプレート上に広げ、200μLの細胞をクロラムフェニコールプレート上に広げ、両方を37℃で一晩増殖させた。カルベニシリンプレートは、pCP20を有する細胞を含む。細胞を一晩インキュベートし、十分なOD600まで一晩増殖しなかったコロニーをさらに24時間インキュベートした。クロラムフェニコールプレートは、エレクトロポレーションで生き残った細胞の多くの指標を提供する。カルベニシリンプレートからの形質転換体を43℃で非選択的に精製し、一晩増殖させた。
精製した形質転換体を、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールに対する感受性について試験した。43℃で増殖させたプレートからコロニーを採取し、10μLのLB媒体に再懸濁した。3μLの細胞懸濁液を3つのプレートの各々にピペットで移した:1)37℃でインキュベートしたクロラムフェニコールを含むLBプレート(これは、宿主株のゲノム中のCAT遺伝子の有無について試験する);2)30℃でインキュベートしたカルベニシリンを含むLBプレート(これはpCP20プラスミド由来のβ−ラクタマーゼ(CarbR)遺伝子の有無について試験する);および3)37℃でインキュベートした抗生物質を含まないLBプレート(コロニーについてクロラムフェニコールまたはカルベニシリンプレート上で成長が観察されない場合、CAT遺伝子およびpCP20プラスミドの両方が失われ、そしてコロニーをさらなる分析のために保存した)。保存されたコロニーをLBプレート上に再リークして単一コロニーを得、37℃で一晩増殖させた。ファージ配列の欠失はゲノムのファージ遺伝子座領域を配列決定することによって、より重要なことには、プラーク形成の非存在を表現型的に検証することによって確認した(本質的に、実施例57または58に記載され、実施例60に記載されるようなプロトコールに従って)。
表95は、ファージ不活性化のために除かれた大腸菌Nissleファージ3の部分を列挙する。
表Eは、欠失によって不活性化されたファージ3遺伝子を列挙する。
[表E]欠失によって不活性化されたファージ3遺伝子
表Fは、欠失を含むファージ3の配列を示す。
実施例59に記載されるように、pKD3に対する40bpのオーバーハングおよび相同性を有するプライマーを使用して、ファージゲノムの10kB領域を標的とするノックアウトを作製した(λレッド組換え、続いてクロラムフェニコール耐性についての選択)。得られた4つのクローン化を選択した。ファージ3ゲノムにおけるクロラムフェニコールカセットの挿入の存在についてスクリーニングするためのプライマーを使用して、予想される200bpのバンドが、4つのクローン化すべてについて見られ、ファージ3ゲノムに特異的なポジティブな挿入を示した。
同じ4つのクロラムフェニコール耐性コロニーを、14mLの培養管中の1mLのLBに再懸濁した。チューブを37℃、250rpmで振盪しながら増殖させた。細胞が対数期初期に達したとき、培養物を2つの500ulアリコートに分割し;一方のアリコートをマイトマイシンC(2ug/mL)で処理し;他方を未処理のままにした。3.5時間後、400ulのそれぞれの培養物を除去し、20ulのクロロホルムを添加した。サンプルを15秒間ボルテックスし、最大速度で1分間遠心分離機で遠心分離した。表96は、カウントされたプラークの数を示す。SYN−902は、pKD46プラスミドを含む野生型Nissleである。
結論として、ノックアウト株のいずれにおいてもプラークは観察されなかったが、ポジティブコントロールは多数のプラークを産生した。これらの結果は、野生型大腸菌Nissle中のファージ3の10kb内部領域の欠失が、マイトマイシンC処理後のプラーク形成を防ぐことを示している。
実施例61:ファージ3ノックアウト株におけるファージ検出アッセイ(野生型NissleおよびSYN−PKU−1034)
この研究は、野生型NissleおよびSYN−PKU−1034でのファージ3ノックアウトが、プラークアッセイにおいて陰性試験をもたらすかどうかを試験するために実施された。
本研究では、大腸菌Nissle(SYN01)、SYN‐903(Nissleバックグラウンドにおけるファージ3ノックアウト)、SYN‐PKU‐1034d「phi」3(陰性株におけるファージ3ノックアウト)、SYN‐PKU‐710(ポジティブコントロール)、およびATCC13706(ネガティブコントロール)からの上澄み液をファージの存在について試験した。
一方の末端のクロラムフェニコール(cm)カセットおよび他方のファージ3に特異的なプライマーセットを使用するPCR分析は、クローン化SYN−PKU−1034ファージ3KOがクロラムフェニコールカセットの正確な挿入について陽性であることを以前に示した(データ示さず)。CMカセットの挿入は、実施例59で上述したように行った。
ファージテストのために、菌株(SYN01(Nissle)、ATC13706(ネガティブコントロール)、SYN−PKU−710、SYN−PKU−1033、SYN−PKU−1034、ATCC13706(感受性プラークインジケーター菌株)を、LB(必要に応じてDAP 100ug/mLを含む)、3mL中、250rpmで37℃で振盪しながら14mLの培養管中で一晩増殖させた。酵母抽出物を欠くLB培地中の7g/L寒天からなる上部寒天を調製し、融解し、45℃に保って液体を維持する。
一晩培養物を使用して、1:100希釈で125mLバッフル付きフラスコ中で、10 LBにDAP 100ug/mLを適切な場合に接種した。各試験株を、2つの10mL培養物に接種した:ファージを誘導するために2ug/mLのマイトマイシンCを有する1つのフラスコ、および対数期非誘導対照としての第2のフラスコ。全てのフラスコを37℃の振盪(250rpm)で増殖させた。全ての培養物を4.5時間増殖させ、96ウェルプレート中のPBS中で10倍に希釈し、そして細胞数の判定のためにプレートした。10−3から10−8の希釈物に及ぶスポット希釈物(10ul)を、各株について、1プレートあたり(LBプレート−DAP100ug/mL、適切な場合)、2連で平板培養した。
細胞計数の終了後、それぞれの培養物から1mL(1株あたり3培養物)を取り出し、1.5mLのエッペンドルフに入れ、50uLのクロロホルムを添加し、チューブを15〜30秒間ボルテックスした。細胞を、マイクロ遠心分離機中で2分間、最大速度で遠心分離した。一方、96ウェルプレートを、柱2〜5および8〜11においてウェル当たり180uLのLBを含むように調製した。この平板中で上澄み液の希釈を行った。それぞれの株について200uLのニート上澄み液を、サンプル1〜8については縦列1に、サンプル9〜15については縦列7に添加した。縦列2〜5および8〜11からのマルチチャネルピペットを用いて10倍希釈を行った。
感受性対照株を調製するために、10mLのATCC13706を15mLのファルコン管中で4000×gでスピンダウンし、上澄み液をデカントし、細胞を等容量の10mM硫酸マグネシウム中に再懸濁した。14mlの培養管を設定し、適宜株について標識し、上澄み液の希釈液を添加した。各チューブに、100ulのATCC13706細胞懸濁液を添加した。ニート上澄み液およびその希釈液を適切なチューブに加え、細胞/上澄み液混合物を最低5分間インキュベートした。
インキュベーション後、3mLの上部寒天を試験管に添加し、混合物を直ちに(注ぐことによって)標識LBプレート上に広げた。プレートを乾燥させ、次いで37℃の静的インキュベーターに移動させ、反転させ、そして一晩インキュベートした。結果を表987に示す。
上記表に見られるように、ファージ3はプラーク形成に関与し、ファージ染色体内の中央遺伝子の欠失はプラークの形成を阻害することができる。肉眼的観察は、ファージ配列の欠失によって引き起こされるいかなる種類の成長欠陥も示唆しなかった。
実施例62:SYN−PKU−2001、SYN−PKU−1035、およびSYN−PKU−1036のファージテスト
この研究は抗生物質カセットがプラスミド背景技術から除去された種々のフェニルアラニン株におけるファージ産生を評価し、このカセットの除去がファージ粒子の再形成を可能にしないことを確認するために行われた。
また、SYN−PKU−710のファージ3ノックアウト版もテストされたが、それでもまだcmカセットが含まれていた。表99は、この研究で使用した株および関連する背景技術株を記載する。
ATCC13706コントロール、SYN−PKU−2001、SYN−PKU−1035、およびSYN−PKU−1036の培養物を、37℃で振盪する14mLチューブ中の3mL培養物で一晩増殖させた。次に、マイトマイシンC(2μg/mL)を含む新しい培地に細胞を希釈した。本質的に実施例58に記載されるように、プラークアッセイを実施した。プラーク数を表100に示す。
これらの結果から、SYN−PKU−710におけるフェーズ3のノックアウトは、上澄み液からpfuをもたらさなかったことが示された。プラスミド株におけるファージ3ノックアウトからのカセットの治癒はまた、上澄み液におけるpfu形成をもたらさなかった。
実施例63:SYN−PKU−2002の産生および分析
フェニルアラニン消費株SYN−PKU−710について、フェーズ3がノックアウトされクロラムフェニコールカセットが切断されたバージョンを解析した。まず、プラーク形成をプラークアッセイで評価した。次に、この株のトランスケイ皮酸産生能をSYN−PKU−710と比較し、ファージの除去がin vitroでのフェニルアラニン消費活性の変化を引き起こすかどうかを決定した。関連するPhe分解領域のサンガー配列決定を行って、フェニルアラニン消費回路を確認した。
まず、クロラムフェニコールカセットを硬化させるために、SYN−PKU−2001(デルタファージ3::cm挿入によるSYN−PKU−7103)をpCP20で形質転換し、4種類のカルベニシリン耐性形質転換体を選択して解析した。クロラムフェニコールカセットの除去を最初にPCRによって確認した。これらの形質転換体を42℃で一晩成長させてpCP20プラスミドを硬化させ、次いでLBプレート(成長がないことを確実にするための対照としてのプレーンLBプレート、プラスミドおよびLBクロラムフェニコールの喪失を確認するためのLBプラスカルベニシリン、および染色体Cmカセットの除去を確認するためのLBクロラムフェニコール、ならびに株が成長するLB Dap(dap栄養要求性))上に画線した。細胞をまた、Phe寒天上に画線し、そしてスポットした塩化第二鉄を、LAAD活性がなお存在することを確実にするためにした。4つのクローン化はすべて直ちに深緑色に変わり、LAAD陽性の試験結果を示した。1つのクローン化をさらなる分析のために維持し、SYN−PKU−2002と命名した。
次に、SYN−PKU−2002を、ネガティブコントロールとしてATCC13706およびポジティブコントロールとしてSYN−PKU−710を用いてファージ試験のために調製した。プラックアッセイは、本質的に実施例58に記載したように実施した。Phage試験の結果、SYN−PKU−2002からアンデュースおよびミトマイシンCが誘発した上澄み液にはプラークがないことが示された(データは示されていない)。
次に、フラスコをSYN−PKU−2002の活性を試験するために調製した。活性は、IPTG誘導ありまたはなし(好気的)、および嫌気性誘導ありで試験した。このアッセイを実施するために、SYN−PKU−2002の一晩培養物を、125mLバッフル付きフラスコ中の10mL培養物中で1:100に逆希釈した(接種した3つのフラスコ、それぞれの条件について1)。細胞を1時間40分間増殖させ、その時点で細胞は対数期初期に入った。一方のフラスコは触れずに残り、他方は1mMの最終濃度でIPTGを受け、第3のフラスコは90%N2、5%CO2、および5%H2を供給する嫌気性チャンバーに移動した。細胞を4.5時間誘導させた。次いで、本明細書の他の箇所に記載されるように、標準プロトコールに従って、TCA製造アッセイを行った。本質的に、50mMフェニルアラニンを含むアッセイ緩衝液に細菌を再懸濁した。290nmでの吸光度によるトランス−ケイ皮酸定量化のために、アリコートをセルアッセイから20分毎に1.5時間除去した。
表101に見られるように、SYN−PKU−2002のIPTGおよび嫌気性誘導の両方が観察された。
すべてのサンプルはサンガーシークエンシングに送られ、SYN−PKU−2002中のすべてのPhe分解関連領域の配列が正確であることが確認された。
結論として、SYN−PKU−2002は、ミトマイシンCを用いて非誘導または誘発された上澄み液を用いた場合、ATCC13706に対するプラーク形成ユニット(pfus)を生産しておらず、SYN−PKU−2002には抗生物質マーカーは含まれず、遺伝子も含まれない。これはまた、IPTGおよび嫌気性誘導の両方を伴うフェニルアラニン分解活性を有する。フェニルアラニン劣化に関与する全ての関連領域を配列決定した。従って、SYN−PKU−2002は、ファージを産生しないことを除いて、SYN2619に対して機能的に当量であるよう。
実施例64:SYN−PKU−2002のin vitro活性測定
SYN−PKU−2002の一晩培養物からの1:100逆希釈を、1.5時間対数期初期まで増殖させた後、本明細書に記載されるように、誘導のために1mM IPTGおよび0.1%アラビノースの存在下で4時間嫌気性チャンバーに移した。活性アッセイを行うために、1e8細胞を再懸濁し、アッセイ緩衝液(0.5%ブドウ糖、50mM Phe、および50mM フェニルアラニンを含む50mM MOPSを含むM9培地)中でインキュベートした。上澄み液サンプルを経時的に採取し、TCA(PALの製品)を290nmでの吸光度によって測定して、TCA産生/PAL活性の速度を決定した。フェニルピルビン酸は、本明細書に記載のLCMS法を用いて測定した。結果を図16Aおよび図16Bに示す。
実施例65:In vivoにおけるSYN−PKU−2002の活性分析−フェニルケトン尿症(PKU)の腸循環モデルにおけるin vivo活性に対するSYN‐PKU‐710からのファージ3欠失の影響
In vivoで馬尿酸を産生するSYN−PKU−2002の活性を評価する。本研究では、SYN−PKU−710およびSYN−PKU−2002をフラスコ中で増殖させ、嫌気的に誘導し、SYN−PKU−2002が馬尿酸を産生し、血清Pheを減少させる機能に対するファージ欠失の影響を、SYN−PKU−710株を含む同質遺伝子ファージとのin vivoでの比較を通して評価する。
SYN−PKU−710およびSYN−PKU−2002の一晩培養物をそれぞれ用いて、500mLのLBを含む4つの2LフラスコにDAP100ug/mLを接種する。これらの培養物を1時間45分間増殖させ、次いで、90%N2、5%CO2、および5%H2を4時間供給する嫌気性チャンバーに移す。次いで、細胞を4600XGで12分間遠心分離し、10mLの製剤バッファー(グリセロール:15%(v/v)、ショ糖:10%(w/v)(100g/L)、MOPS: 10mM(2.1g/L)、NaCl: 25mM(1.46g/L))に再懸濁する。数個の40 ulアリコートを取り出し、細胞計数および活性測定に使用する。活動は、実質的に例63に記載されているように決定され、それぞれSYN−PKU−710およびSYN−PKU−2002について測定される。生存率は、SYN−PKU−710およびSYN−PKU−2002のセロメーターカウントにより測定した。SYN−PKU901(ストレプトマイシン耐性Nissle、8e10 cfu/ml)を対照として使用する。細胞をPBSで10mLにし、次いで1M重炭酸塩と9:1で混合して、4e10細胞の毎日の強制経口投与する(3×300ul照射量)のための調製において、100mM重炭酸塩の最終濃度を達成する。
ファージ正SYN−PKU−710対同質遺伝子ファージレス株SYN−PKU−2002のin vivoでの有効性を比較するために、株をin enu2マウスに投与する。SYN−PKU901を対照として投与する。6〜18週齢以内のCRL(GEMS)由来の雌型BTBR−Pah enu2マウス(20〜35g)を、少なくとも2日間設備に順応させる。動物をフェニルアラニン欠乏食餌(Teklad TD.97152)に置き、試験開始の少なくとも2日前に、0.5g/LのL−フェニルアラニン(Sigma)および5%ショ糖/L(Sigma)のフェニルアラニン富化水を与える。フェニルアラニン富化水を研究期間中除去し、通常の水で置き換える。
検討の日に、マウスを重量に従って以下のように処置群に無作為化したする:群1:H2O(n=9);群2:SYN−PKU901(n=9);群3:SYN−PKU−710(n=9);群4:SYN−PKU−2002(n=9)。ベースラインフェニルアラニンレベルを決定するために、顎下皮膚穿刺によって血中サンプルを収集する。次いで、マウスに、平均基重量に従って、重量1グラム当たり0.1mgのフェニルアラニンの単回用量を皮下注射によって投与する。Phe攻撃の1、2および3時間後に、細菌(または水)を経口強制経口投与する(3×300ul)によってマウスに投与する。動物から採血し、Phe攻撃の4時間後まで、すべての動物から尿を収集する。採血後20分以内に遠心分離機(4℃で10分間2000g)で血漿するまで、血中サンプルを氷上に保持する。次いで、血漿を、MS分析のために96ウェルプレートに移す。尿を5mLチューブに集め、体積を記録した後、馬尿酸解析のためにサンプルをMSに移す。
実施例66:SYN−PKU−2002投与時のin vivo血清Pheおよび馬尿酸の測定
SYN−PKU−2002の活性をin vivoで評価した。研究のための細胞を調製するために、SYN−PKU901およびSYN−PKU−2002一晩培養物をそれぞれ使用して、500mLのLBを含有する4つの2LフラスコにDAP100ug/mLを接種した。これらの培養物を1時間45分間増殖させ、次いで、90%N2、5%CO2、および5%H2を4時間供給する嫌気性チャンバーに移した。次いで、細胞を4600XGで12分間遠心分離し、10mLの製剤バッファー(グリセロール:15%(v/v)、ショ糖:10%(w/v)(100g/L)、MOPS:10mM(2.1g/L)、NaCl:25mM(1.46g/L))に再懸濁した。数個の40ulアリコートを取り出し、細胞計数および活性測定に使用した。生存率は、セロメーターカウント(4連)6.94e10 cfu/ml(+/5.78e9)によって測定した。
活性は、プレートベースのアッセイを用いて決定した。簡単に述べると、1×108 cfu(セロメーターにより測定)を、微量遠心管中の1mLの予め温めたアッセイ緩衝液(0.5%ブドウ糖、50mM MOPS、および50mMフェニルアラニンを含む1×M9最小培地)に添加し、短時間ボルテックスし、直ちに37℃のヒートブロックまたは恒温水槽中に置いて静置インキュベーションした(t=0)。アッセイ緩衝液中に再懸濁した細胞からの上澄み液サンプルを、290nmの吸光度で分光光度計を用いて、いくつかの時点にわたりTCAの存在量について分析した。TCA検出のための正確なOBwindowは、比較的狭い濃度範囲で生じる。この理由から、上澄み液サンプルを希釈して、吸光度計測値が検知のための直鎖状領域に入ることを確実にした。測定値をTCA検量線と比較した。活性は、2.72umol/hr/1e9 cfu(+/−0.15umol/hr/1e9 cfu)であると決定された。
検討の4日前(すなわち、4〜1日目)から始めて、Pah ENU2/2マウス(〜11〜15週齢)を、0.5g/Lのフェニルアラニンを補充したフェニルアラニンを含まない固形飼料および水上で維持した。研究当日、マウスを重量に従って以下のように処置群に無作為化した:群1:SYN−PKU901(n=9);群2:群2:SYN−PKU−2002(n=9)。ベースラインフェニルアラニンレベルを決定するために、顎下皮膚穿刺によって血中サンプルを収集した。次いで、マウスに、平均基重量に従って、重量1グラム当たり0.1mgのフェニルアラニンの単回用量を皮下注射によって投与した。Phe攻撃の1、2および3時間後に、細菌(または水)を経口強制経口投与する(3×250ul)によってマウスに投与した。全血を、各時点で顎下出血を介して収集した。代謝ケージングにおける尿収集は1stの細菌照射量の直後に開始し、検討の期間(4時間)にわたって収集し続けた。
採血後20分以内に遠心分離機(4℃で10分間2000g)で血漿するまで、血中サンプルを氷上に保持した。次いで、血漿を、MS解析のために96ウェルプレートに移した。尿を5mLチューブに集め、体積を記録した後、分析のためにサンプルをMSに移した。結果を図17Aおよび図17Bに示し、SYN−PKU−2002がSYN−PKU−710と同様の様式で、Phe射出後のフェニルアラニンの変化の減少を引き起こし、馬尿酸を産生することを示す。
実施例67:フェニルケトン尿症のENU2マウスモデルにおけるSYN−PKU−2002の有効性
本研究の目的は、経口SYN‐PKU‐2002投与後の尿中馬尿酸(HA)、トランス‐シンナメート(TCA)およびフェニルアラニン(Phe)の産生により測定した、フェニルケトン尿症(PKU)のENU2マウスモデルにおけるフェニルアラニン(Phe)分解プロバイオティクスSYN‐PKU‐2002の用量依存性in vivo活性を調べることであった。PKUに関するSYN−PKU−2002の有効性は、血漿TCAおよびHAの出現と関連して、食事性Phe吸気とは無関係にPah enu2/enu2マウスにおいて経口投与されたSYN−PKU−2002が血漿Phe量を低下させる能力によって測定され、また、皮下(SQ)注射によるPhe投与後の血漿におけるこれらの代謝産物を測定することによっても評価された。
最初の試験では、Phe欠乏食で維持した雌型Pahenu2/enu2マウスの重量を測定し、次に重量別に無作為に2処置群に割り付けた(それぞれn=9)。血液(抗凝固剤として使用されるリチウムヘパリン)を、顎下出血(T=0時間)を介して各マウスから得た。次いで、マウスにPhe(0.1mg/g)のSQ射出を行い、尿収集のために代謝ケージ(3匹/ケージ)に直ちに入れた。Phe注射の1、2、および3時間後に、マウスに、振盪フラスコ(5×1010細胞総投与量、3時間毎の強制経口投与するに均等に分割)中で増殖させ、前もって誘導した制御SYN−PKU901(群1)またはSYN−PKU−2002(群2)細胞のいずれかを強制経口投与した。注射の4時間後に、血漿(抗凝固剤として使用されるリチウムヘパリン)を顎下出血によって得、そして尿を収集した。液クロマトグラフィー‐タンデムマススペクトロスコピー(LC‐MS/MS)を用いて、血漿および尿中のPhe、TCAおよびHAの濃度を測定した。
この研究は、マウスを強制飼養するために使用されるSYN−PKU−2002試験品を、薬物物質のスケールアップを意図したものと同様の方法を使用して、バイオリアクター中で増殖させ、活性化したことを除いて、実施例65に記載の研究と同様に実施した。Phe欠乏食で維持された雌型ENU2マウス(n=63)を秤量し、次いで重量により7処置群に無作為化した(それぞれn=9)。次いで、マウスにPhe(0.1mg/g)をSQ注射し、尿収集のために即座に代謝ケージに入れた。SYN−PKU−2002を、Phe注射の1、2、および3時間後に6用量群に強制経口投与した(n=9/用量群を3匹のマウス/ケージの3つの代謝ケージに分割)。投与群には、1×1011、5×1010、2.5×1010、1.25×1010、6.25×109、または全部で3.13×109細胞を、3時間毎の強制経口投与するにわたって等しく分割して与えた。SYN−PKU901を、1×10OB細胞の最高用量で対照群(n=9)に強制経口投与した。尿を4時間かけて収集した。血漿(抗凝固剤として使用されるリチウムヘパリン)。SYN−PKU−2002およびSYN−PKU901処置マウスの両方について、最高用量群(1×1011細胞)でのT=0時間およびT=4時間での顎下出血により、血漿のPhe変化の判定のために得られた。LC−MS/MSを用いて、血漿および尿中Phe、HA,TCAを測定した。定量的LC?MS/MS法は、血漿または尿中のフェニルピルビン酸を測定するのに利用方法なかった。
結果を図17Aおよび図18Bに示す。最初の研究ではSQ Phe射出(0.1mg/g)後、血漿Phe増加は同用量の対照株SYN−PKU901と比較して、5×1010 SYN−PKU−2002細胞の経口用量を受けたENU2マウスにおいて有意に鈍化した(37.7%減少、p = 0.0002)。試験の0〜4時間の試料採取期間中に排泄された尿中HAの量は、尿中HA濃度に収集された尿の体積を乗じることによって決定した。尿中HA濃度は対照株SYN−PKU901で処置したマウスにおいて定量下限(BLLOQ;<0.04mM)未満であったが、SYN−PKU−2002を投与したマウスにおける濃度は高く(6.59〜7.97mMの範囲)、4時間にわたって測定可能なHA排泄(10.24±0.59μmol)をもたらした。TCAおよびHAはいずれのマウスの血漿でもT=0では観察されなかったが、SYN−PKU−2002を投与した群では投与4時間後に検出された。TCAおよびHAはいずれの時点でも対照株SYN−PKU901で処置したマウスの血漿において測定不能であり、TCAの増加がSYN−PKU−2002活性によるものであることを示し、in vivoでSYN−PKU−2002機能を実証した。尿中Phe,TCA濃度はいずれのサンプルもBLLOQであった。
第2の研究では、SYN−PKU−2002をバイオリアクター中で、薬物物質のスケールアップに使用した方法と同様の条件下で増殖させた場合にも、有効性が観察された。ENU2マウスにおけるSQ Phe注射(0.1mg/g)後、血漿Phe増加は、等照射量のSYN−PKU901細胞と比較して、1×1011 SYN−PKU−2002細胞の経口照射量を受けた群において有意に鈍化した(29.3%減少、p=0.02)。さらに、SYN−PKU−2002を線量依存的に処置したポートフォリオにおいて、尿HA排泄の上昇が観察された(15.61±0.81±9.81±2.11,4.52±1.7,2.97±0.55,1.24±0.23,0.86±0.25μmolのHAを、それぞれ1×1011、5×1010、2.5×1010,1.25×1010,6.25×109または3.13×109のSYN−PKU−2002の各細胞を施用したポートフォリオに排除した)。SYN−PKU−2002に使用した最高用量である1×10OBSYN−PKU901細胞で処置したマウスは、大量のHA(0.08±0.02μmol)を排泄しなかった。最初の研究と同様に、TCAおよびHAはT=0でいずれのマウスの血漿でも観察されなかったが、SYN−PKU−2002を受けた群では投与後4時間で検出され、SYN−PKU901を受けた動物では検出されなかった。尿中のHA排泄は投与されたSYN−PKU−2002細胞の量とよく相関し、代謝産物HAがin vivoSYN−PKU−2002活性の有望なバイオマーカーであることを示した。
結論として、これらのデータはENU2マウスモデルにおいて、血漿TCAおよびHAの環流を増加させ、SYN−PKU−2002活性を大幅に増加させることにより、in vivoでのSYN−PKU−2002のPhe代謝活性を実証する。検討の第2の部分は、薬物物質のスケールアップを意図した処理を用いてバイオリアクター中で増殖させたSYN−PKU−2002がin vivoで活性であることを示した。この実験では血漿Pheレベルが経口投与された対照株SYN−PKU901と共にPheのSQ注射を与えられたマウスにおいて増加した;しかし、SYN−PKU−2002を経口投与されたマウスはSQ Phe注射後の血漿Phe濃度において有意に鈍いスパイクを有した。重要なことに、この結果は全身循環Pheが腸内再循環を介して腸に到達し、続いて胃腸管(GI)管において経口投与されたSYN−PKU−2002によって分解されることを示す。この試験は、SYN−PKU−2002がタンパク質の食餌摂取とは無関係に、独立循環フェニル量を低下させることができることを実証した
実施例68:ファージ含有フェニルアラニン消費株とファージフリーフェニルアラニン消費株との間のin vivoにおける生存率の比較
フェニルアラニン株SYN−PKU−710を含むファージとそのファージ非含有対応物SYN−PKU−2002との間の生存率、輸送またはコロニー形成の電位差を同定するために、in vivo競合試験を実施し、SYN−PKU−710対同質遺伝子ファージレスSYN−PKU−2002株の競合指数が生成された。SYN−PKU−710もSYN−PKU−2002も抗生物質カセットを有していないため、本研究では抗生物質耐性未硬化の顕著な株を用いた。SYN−PKU−710については、クロラムフェニコール/カナマイシン(cm/kan)標識株SYN−PKU−713を使用した。SYN−PKU−2002については、クロラムフェニコール(cm)標識株SYN−PKU−2001を使用した。表102は、この研究に関連する株を列挙する。
簡潔に言えば、SYN−PKU−713およびSYN−PKU−2001の翌日物培養液を用いて、500mLのバフレッドフラスク中の100mLのLB(同じくDAP 100ug/mlおよび適切な抗生物質を含む)を接種した。培養物を6時間増殖させ、その時点で、収集のために4000×gの遠心分離機中で15分間遠心分離した。上澄み液を廃棄した。細胞を約7mlの製剤バッファー(グリセロール:15%(v/v)、ショ糖:10%(w/v)(100g/L)、MOPS:10mM(2.1g/L)、NaCl:25mM(1.46g/L))に再懸濁した。細胞を650uLアリコートにアリコートし、−80℃で凍結した。より小さなアリコートを、細胞プレーティングおよび生存率判定のために除去した。セロメーターを用いて、生存率は非常に高く、細胞数は株間でかなり同等であることが示された。
入力(強制経口投与する)および出力(糞便)が一貫して比較され得るように、この研究(入力を含む)についての全ての細胞カウントを平板培養によって得た。2つの650uLアリコートを氷上で解凍し、1:1で混合し、重炭酸ナトリウム中で希釈し(9部の細胞:1部の1M重炭酸塩(144μL))、次いで、kan/cmおよびcm上で定量するために4連で播種した(10倍の10uLスポット播種による−8−>−10希釈から)。
第1日目に、野生型B6(n=6)のネズミに200μl細胞(各株約3X10£9)を注入した。糞便ペレットを、強制経口投与する6時間前および6時間後に収集した。2日目および3日目に、マウスに200μl細胞を強制経口投与し、糞便ペレットを強制経口投与する6時間前および6時間後に収集した。4日目および5日目に、糞便ペレットを回収した。
毎日、収集した糞ペレットを、1mlのPBSを含むチューブ中で秤量し、ホモジナイズした。糞ペレット中のNissleのCFUを測定するために、ホモジナイズした糞ペレットを連続希釈し、それぞれのサンプルを、クロラムフェニコールを含有するLBプレートおよびカナマイシンを含有するプレート上にプレートした。プレートを37℃で一晩インキュベートし、コロニーを計数した。糞便中の2系統の量を決定するために、全組換えNissleをcm版にカウントし、kan版上で得られたSYN−PKU−713の数を総量から差し引いてSYN−PKU−2001CFU数を決定した。
結果を図19に示し、競合指数(SYN−PKU−713投入量/SYN−PKU−2001排出量)を表103に示す。
結果は、Nissle SYN−PKU−713のファージフリーPKU株とSYN−PKU−2001との間に輸送または定着において大きな差がないことを示している。
実施例69:大腸菌Nissle由来の株についての一般的なバクテリオファージ試験プロトコール
以下の手順は、EcNプロファージ/ファージ中に見出されるDNA配列を検出する。プライマーが欠失したプロファージの領域の外側で増幅してSYN−PKU−2002の細菌株を生成するので、それはSYN−PKU−2002のEcNゲノム内のファージおよびプロファージDNAを増幅する。
バリデートされたバクテリオファージ(ファージ)方法、GP−V708、マイトマイシンC誘導を用いた大腸菌由来の細菌ウイルスのプラークアッセイは、プラークアッセイを用いてファージの存在を測定する。試験は、検出されたファージが内因性EcNプロファージ由来であり、汚染ファージまたは外来剤由来ではないことを確認する。
プラークアッセイは、37±2℃で10mMチミジンを補充した濃縮媒体中で増殖させ、200〜300rpmで一晩振盪する、凍結サンプル、陰性および陽性細菌培養物のループフルまたはスクレープで開始する。サンプル,ポジティブコントロール(大腸菌、EMG 2:K[λ]、ATCC 23716、または当量)およびネガティブコントロール(大腸菌、ATCC 13706、または当量)の一部を除去し、遠心分離し、それぞれの上澄み液をプラークアッセイでバクテリオファージの存在について調べる。マイトマイシンCを、最終濃度2μg/mLで、残りのサンプル、陽性および陰性細菌培養物に添加する。次いで、培養物を37±2℃に置き、溶解がポジティブコントロール中で起こるまで(〜4.5時間)、300〜400rpmで振盪する。それぞれの培養物をクロロホルムで処理し、遠心分離し、上澄み液の0.1mlアリコートをバクテリオファージの存在について試験する。これを達成するために、上澄み液をファージ感受性大腸菌株ATCC 13706と混合し、0.7%アガロース溶液と混合し、ローンとしてLB寒天上にプレーティングする。プラークがポジティブコントロール中に存在し、プラークがネガティブコントロール中に存在しない場合、試験は有効であると考えられる。
列挙可能なプラークを含む目的の株を含むプレートを、エンドポイントPCRによって同一性試験して、プラークが内因性EcNプロファージから生成されたファージ由来であることを確認する。これは、最初に2μLのピペットチップで個々のプラークの寒天プラグを作製し、それぞれのプラグを0.5mlのイオン交換水に再懸濁することによって達成される。プラグ再懸濁液を15秒間ボルテックスし、1μLをPCRのための鋳型として使用する。ネガティブコントロールとして、同じプレートからの寒天栓を、プラークを含まない領域から作製する。利用可能な場合には、1サンプルあたり全部で10個のプラークを試験する。1サンプルにつき10個未満のプラークを形成する場合には、全てのプラークを分析する。1サンプルにつき1個のネガティブコントロール栓を試験する。さらなるコントロールとして、EcNおよびATCC13706の純粋なブロス培養物を、200〜300RPMで振盪しながら、37±2℃で濃縮媒体中で一晩増殖させる。100μLの定置培養物を0.2mlのさらさらウォールチューブに添加し、エッペンドルフマスターサイクラープロサーモサイクラー中で98℃で10分間加熱して、PCRのための鋳型として使用するゲノム溶解物を調製する。
それぞれのPCRアッセイの鋳型として使用した全サンプルおよび制御は、以下の通りであった:
a.サンプル:計数可能な平板から採取した10個までの再懸濁プラーク1μL
b.ネガティブコントロール:計数可能なサンプル板から非プラーク領域から採取した1個のプラグ1μL
c.ネガティブコントロール:大腸菌、ATCC 13706、または当量株(プラークインジケーター株)の溶解静置培養物から1μL
d.ポジティブコントロール:目的の細胞株の溶解した定置培養物から1μL
PCRを用いてEcN特異的ファージ領域を増幅し、続いてゲル電気泳動により反応の終点でPCR増幅断片を検知する。EcN特異的ファージの増幅に使用したプライマー(Integrated DNA Technologies、Skokie、IL)を表104に示す。プライマーはEcNファージを注意深い検査した後に選択し、EcN特異的ファージ内の領域を増幅したが、プラーク検出に使用されるファージ感受性大腸菌株ATCC13706内のゲノムDNA内のいずれの領域にも結合しなかった。
[表104]EcN−ファージ特異的PCRプライマー
反応は、エッペンドルフマスターサイクラープロPCRマシン(Eppendorf Mastercycler Pro PCR machine)を使用して、0.2mL薄壁チューブで実行される。
PCRマスターミックス19μLを各0.2mLのPCRチューブに加えた後、1μLのPCRテンプレートを個々のチューブに加える。チューブに蓋をし、PCRマシンに設置し、表106のパラメータに従って反応サイクルを実行する。
それぞれの規格、サンプル、または制御反応の5μLを、電解による分離とSyngene UVトランジュミネータを使用した可視化のために、0.8%のアガロセゲルにロードする。増幅されたバンドのおおよその大きさはEcN特異的ファージの存在について350塩基対であるが、ネガティブコントロールはバンドを全く産生しない。
実施例70:SYN−PKU−2002毒性試験
GLP毒性試験の投与期間は、BID投与(1日2回)の雄および雌CD−1マウスにおいて28日間である。照射量は、1×109、1×1010、および1×1011 CFUのおよその範囲をカバーする。最高濃度は、実現可能な最大用量である。マウスを、試験品関連死亡率、臨床観察、体重、血液学、臨床化学、ならびに肉眼的および顕微鏡的病理について評価する。投与を中止した後、マウスから糞便サンプルを数日間採取し、qPCR分析を用いてSYN−PKU−2002 DNAの存在を検定し、経時的なSYN−PKU−2002の低下を決定する。血液はまた、qPCRを使用して、SYN−PKU−2002 DNAの存在について評価される。28日間のマウスGLP毒性試験の設計を表107に概説する。
[表107]28日齢マウスのGLP毒性試験のデザイン
実施例71:豚モデルにおける胃フェニルピルビン酸の評価
SYN−PKU−2002の投与前および投与後の様々な時点での2匹のブタ(十二指腸カニューレを有していた)における胃フェニルピルビン酸のレベル。
SYN−PKU−2002の投与の2日前に、2匹のブタに、タンパク質シェイク/リンゴジュースを含む流動食を2日間与えた。0日目に、ブタを麻酔し、挿管し、約250ml(〜50g)のペプトン、3×10e12細菌(30ml中のSYN−PKU−2001)+24mlの1M重炭酸塩面一(2g)をT=0で注入した。
次に、1mlの胃サンプルをT=0、15分、30分、45分、60分、75分、90分、105分、120分にかけた。サンプルをすぐに遠心分離し、上澄み液を凍結させ、沈殿を有する管を4℃に置いた。さらに、1mlの血中サンプルを、T=0、30分、60分、90分、amd120分で採取し、ヘパリン処理したチューブに収集し、スピンし、血漿収集し、そして凍結した。できれば、尿を集め、凍結した。結果を図20に示し、LAADが胃で活性であることを示す。
実施例72:非ヒト霊長類における経口トランス−ケイ皮酸の尿中馬尿酸への変換効率
次に、SYN−PKU−2002活性および有効性の研究を、ヒトに対してより関連性のある代謝およびGI生理機能を有する翻訳モデルで絶食した健康な非ヒト霊長類(NHP)に拡張した。6匹のカニクイザル(2.5〜4kg)のコホートを使用した。PKU表現型ではないが、健康なNHP生理は健康なヒトにおいて最初に行われる可能性が高い将来の臨床研究に情報を与えるのに有用である。
本明細書中に記載される全てのNHP研究は、動物福祉法規則(連邦規則コード、第9号)、検討動物福祉局からの検討動物のヒトのケアおよび使用に関する公衆衛生サービスポリシー、および国立研究評議会からの検討動物のケアおよび使用に関するガイドの全ての適用可能なセクションに従って、Charles River Labs(Shrewsbury、MA)で実施された。2〜5歳の6人の男性NHP被験者(2.5〜4kg)を使用し、国際的な霊長類認定固形飼料(PMI栄養、5048)で維持した。被験体を一晩(16時間)絶食させた後、全ての研究を開始した。すべての研究について、投薬の直前に、動物を個々のケージに分け、尿の収集を補助するために、それぞれのケージの底部に角度のついたパンを挿入した。全ての経口投与のために、経口胃管を使用した。
第1に、サルにおける経口投与されたTCAの尿中HAへの変換効率を、その後の実験で使用するための正規化因子の計算のために測定した。各NHPに、120mM重炭酸ナトリウムに溶解した肉由来のペプトン(500g/L;Sigma,70174)10mLおよび13C−水(12.5mg/mL;Cambridge Isotopes Lab、CLM−7498−PK)15mLを経口投与し、続いて2mL水洗した。このようにして、SYN−PKUのin vivoPAL/Phe分解活性を、尿中HA回復から推測することができた。同位体標識13C−TCAを経口投与し、ウリナリ13C−HAを測定した。経口投与された13C−TCAの平均41.9±10.3%が、ウリナリ13C−HAとして回収された(図21)。
実施例73:非ヒト霊長類(NHP)のプロファイリングおよび有効性
非ヒト霊長類モデルにおけるSYN−PKU−2002の有効性が評価された。
本明細書中に記載される全ての研究において、動物を個々のケージに分離し、そして投薬の直前に尿の収集を補助するために、角度の付いた皿を各々のケージの底部に挿入した。全ての経口投与のために、経口胃管を使用した。
NHPは、肉からのペプトン10mL(500g/mL)または水を模擬として経口投与した。次に、NHPを10mlのSYN−PKU−2002を製剤バッファー(以前はバイオ反応器で活性化し氷を融解)または製剤バッファー単独でモックとして注射した。最後に、NHPに5mLの0.36M重炭酸ナトリウムを投与し、続いて2mLの水でフラッシュした。適用可能な場合、投薬レジメンの1時間後、動物に12.5mLの13C−Phe(20mg/mL)を静脈内注射した。動物を静脈穿刺により0、0.5、1、2、4および6時間で採血した。適用可能な場合、動物に、模擬タンパク質投与後、3.5mLのd5−Phe(20mg/mL;CDN同位体、D−1589)を与えた。投与後6時間で、尿収集パンを取り出し、内容物を体積測定のためにメスシリンダーに注いだ。全てのサンプルをLC−MS/MS分析まで−80℃で保存した。
曲線下面積(AUC)を、RおよびPKNCA包装体(Denny W、DS.、およびBuckeridge C...Simple、automatic、noncompartmental analysis: The PKNCA R包装体.J Pharmk PharmD 42.1、11−107、doi:10.1007/s10928−015−9432−2(2015))を用いて直鎖状台形法で計算し、AUCを記述するモデルをrstanarm包装体で推定した。d5−PheについてのAUC0−lastは、直鎖状−up/ログ−down方法で計算した。標識したPhe AUCの平均および信頼できる間隔および処置差を、処置(溶媒または細胞)に対する固定効果および動物当たりのランダム効果を有する階層的ベイズモデルを用いて計算した。
バイオリアクターにおける菌株の成長と誘導のために、不滅ループを用いて500mlのUltra−yield(登録商標)フラスク(Thomson)において、50mlのFM2媒体(補足表2)の中の細胞を接合した。細胞を、OD600of 〜5に達するまで、350rpmで振盪しながら37℃で増殖させ、その時点で、30mLの培養物を使用して、Eppendorf BioFlow 115バイオリアクター(〜0.02の開始OD600)中の4LのFM2に接種した。発酵槽は撹拌、大気、および酸素補給を用いて60%溶存酸素に制御し、水酸化アンモニウムを用いてpH7に制御した。約1.5のOD 600で、細胞を低酸素環境(10%溶存酸素)の産生およびIPTG(1mM)の添加により活性化した。OD600of 〜20で、L−アラビノース(0.15%最終濃度)を添加し、細胞をさらに1時間増殖させた。4,500×Gで30分間、4℃で遠心分離することによって細胞を回収し、製剤バッファーに再懸濁し、試験当日まで−80℃で保存した。
まず、絶食サルにSYN−PKU−2002投与の有無にかかわらず5gのペプチドチャレンジを投与し、尿中HAを測定した。全ての動物は、SYN−PKU−2002で処置した場合、細胞投与なしのベースラインレベルと比較して有意なHA応答を示した(図22A、左側)。興味深いことに、有意なHAは、ペプチドチャレンジを与えなかった絶食サルにおいて回収され(図22A、右側)、霊長類胃腸管がPheのリザーバであり得ることを示唆する。先の両方の実験(図22A)において、サルにおける腸内再循環の過程を調べるために、SYN−PKU−2002を受けた被験体にも、ペプチドチャレンジの1時間後に13C−Pheを静脈内注射し、13C−HAを尿中で測定した(図22B)。No 13C−HAはペプチドを投与されていない群で検出されたが、13C−HAはペプチドチャレンジを投与された群で検出され、腸内再循環が霊長類で起こり、タンパク質摂取と関連し、SYN−PKU−2002によって消費され得るPheを提供することができることを実証した。
最終検討では、サルにおけるSYN−PKU−2002の血清Phe低下能を測定した。しかし、健康な被験体(非PKU)では高濃度のタンパク質が血清フェニル量をわずかに上昇させることさえ必要とされるので、これは困難である(体重によると、サルで使用される5gのペプチドチャレンジは通常の成人男性では〜100gの攻撃に等しい)。ベースラインPheレベルおよび機能的PAH酵素による血清ポストペプチドチャレンジにおけるその低ダイナミックレスポンスは、SYN−PKU−2002による血清Phe低下の検知を難読化する。これらの理由から、経口重水素化Phe(d5−Phe)攻撃を行った。d5−Pheの投与平均(70mg)は典型的な食事中に存在しうる平均と質平均し、〜30gのタンパク質に含まれるPheの体重に等しく、典型的な食事中に存在しうる平均と質平均する(Layman、DKDietary Guidelinesは、成人のタンパク質の必要性についての新たな理解を反映すべきである。Nutr Metab(Lond)6、12、doi:10.1186/1743−7075−6−12 (2009))。予想通り、ベースラインd5−Pheは尿および血清では検出できなかったが、その投与後に血中で検出することができた(図22CおよびD)。SYN−PKU−2002投与後、尿における正規化d 5−HA回収は、投与されたd 5−Pheの大部分がd 5−HAに代謝されたことを実証した(図22C)。SYN−PKU−2002−特異的代謝産物d 5−HAおよびd 5−TCAも血清で検出された(図23AおよびB)最も重要なことは、血清d 5−Pheの上昇がSYN−PKU投与時に著しく鈍化し(図22B)、血清d 5−PheのAUCの著しい有意な低下と同時に認められたことである(図22C;58%低下、90%信頼水準29.4〜57.8%)。
サルの胃腸管における高安静時Phe量はまた、SYN−PKU−2002を受けたがペプチドチャレンジを受けなかった絶食動物において観察された有意なHA回収から推測することができる。腸内再循環はサルにも存在することが示されたが、非PKU背景での作業が難しく、これらの動物において容易にサンプル腸溶出液できないことはこの過程の機構的塩基類を理解するためにより多くの作業を行わなければならないことを示している。それにもかかわらず、基材のリザーバの維持は、SYN−PKU−2002の治療方法的有用性を増大させ、PKU患者における食事による治療方法投与の時期に課される制約を少なくすることができる。
実施例74:非ヒト霊長類でのPhe発現におけるLAADの評価
LAAD発現の有効性およびPheのPAL代謝に対する負の効果の決定が評価された。
T=0で、尿パンを空にし、非ヒト霊長類(NHP)に、11mL中の肉由来のペプトン5.5g、および経口強制経口投与する細菌10mLを経口投与した。SYN−PKU−2001(5×1011CFU)経口強制経口投与する株をNHP1−3に投与した。SYN‐PKU‐2001(5×1011CFU)をNHP4‐6に投与した。両方の株を、製剤バッファー(バイオリアクター中で活性化して以前に増殖させ、氷上で解凍した)または模擬物として製剤バッファー単独に懸濁した。同時に、NHP1〜10は全て、5mLの0.36M重炭酸ナトリウムを投与し、続いて5mLの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により0、0.5、1、2、4および6時間で採血した。投与6時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、5mlの体積を計測した。結果を図24Aおよび図24Bに示すが、LAADの発現がPheのPAL代謝に対して負の効果を有さなかったことが確認される。
実施例75:非ヒト霊長類(NHP)による経口トレーサ試験
経口トレーサ試験を行って、活性をさらに特徴づけた。T=0で、尿パンを空にし、NHPに、11mL、4mLのD5−フェニルアラニン(20mg/mL)、および10mLの細菌(5.2×1011 CFU SYN−PKU−2001)中の肉由来のペプトン5.5gの経口強制経口投与するのを投与した。同時に、NHP1〜10は全て、5mLの0.36M重炭酸ナトリウムを投与し、続いて2mLの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により0、0.5、1、2、4および6時間で採血した。投与6時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、5mlの体積を計測した。図25は、投与時の血中Pheレベルの大きなスパイクを示す。
経口トレーサ研究対照については、T=0で、尿パンを空にし、NHPに、11mL、4mLのD5−フェニルアラニン(20mg/mL)、および10mLの製剤バッファー中の肉由来のペプトン5.5gの経口強制経口投与するのを投与した。同時に、全てのNHPに5mLの0.36M重炭酸ナトリウムを投与し、続いて2mLの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により0、0.5、1、2、4および6時間で採血した。投与6時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、5mlの体積を計測した。
図25の結果は、SYN−PKU−2002を用いた経口強制経口投与する投与がPheを効果的に代謝し、対照投与量において観察される血中Pheレベルの急上昇を減少させることを示す。
実施例76:SYN−PKU−2002の用量依存的応答
4件の研究により、タンパク質に富む食事の後のSYN−PKU−2002の単回投与後の非ヒト霊長類(NHP)におけるPheの用量依存的変換および血漿バイオマーカーt−桂皮酸(TCA)および馬尿酸(HA)の産生の成功が確認された。
試験1:T=0で、尿パンを空にし、10個のNHPに、11mlの水中の肉由来のペプトン5.5gを経口投与した。NHP1〜5に、4mLのSYN−PKU−2002(3.6×1011CFU)の経口強制経口投与するのを投与した。NHP6〜10に、4mLの製剤バッファー、2mLのSYN−PKU−2002(1.8×1011CFU)の経口強制経口投与するのを投与し、続いて6mLの製剤バッファーの経口強制経口投与するのを投与した。同時に、NHP 1〜10は全て、5mLの0.36M重炭酸ナトリウムを投与し、続いて5mLの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により0、0.5、1、2、4および6時間で採血した。投与6時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、5mlの体積を計測した。
試験2:10個のNHPに、11mL中の肉由来のペプトン5.5gを経口投与した。NHP1〜5を8mLのSYN−PKU−2002(7.2×1011CFU)菌株で強制飼養した。NHP6〜10に、1mLのSYN−PKU−2002(9.0×1010CFU)を強制経口投与し、続いて7mLの製剤バッファーを投与した。同時に、NHP1〜10の全てに5mLの0.36M重炭酸ナトリウムを投与し、続いて水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により0、0.5、1、2、4および6時間で採血した。投与6時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、5mlの体積を計測した。
試験3:10個のNHPに、11mL中の肉由来のペプトン5.5gを経口投与した。NHP1〜5を、製剤バッファー(2.3×1010CFU)で希釈した8mLのSYN−PKU−2002で強制飼養した。NHP6〜10を、製剤バッファー(4.5×1010CFU)で希釈した8mlの希釈SYN−PKU−2002で強制経口投与した。同時に、NHP1〜10は全て、5mLの0.36M重炭酸ナトリウムを投与し、続いて5mLの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により0、0.5、1、2、4および6時間で採血した。投与6時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、5mlの体積を計測した。NHPの1〜10人すべてが前夜絶食した。
試験4:10個のNHPを、11mL中の肉由来のペプトン5.5gを経口投与した。NHP1〜5を、8mlの希釈SYN−PKU−2002(3.3×10OBCFU)で強制経口投与した。NHP6〜10を、8mLの希釈SYN−PKU−2002(1.1×10OBCFU)で強制経口投与した。同時に、NHP1〜10は全て、5mLの0.36M重炭酸ナトリウムを投与し、続いて5mLの水でフラッシュした。動物を静脈穿刺により0、0.5、1、2、4および6時間で採血した。投与6時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、5mlの体積を計測した。NHPの1〜10人すべてが前夜絶食した。
結果を図に示す。117A、117B、117C、および117Dは、Phe代謝が9×10OBCFU以上の用量で明らかであったことを示す。さらに、Pheの用量依存的変換およびバイオマーカーTCAおよび馬尿酸の産生が観察された。
実施例77:SYN−PKU−2002を有する非ヒト霊長類におけるカゼイン試験
Phe、TCA、およびHA消費を発現させるために、ペプトン(小ペプチドで構成される)をカゼイン(全タンパク質)で置換することの有効性が評価された。
T=0で、尿パンを空にし、NHPに28mlのカゼイン(4.5g)/ビオカーボネート/D5−フェニルアラニン(25mg;8mg/kg)の経口強制経口投与する物を投与した。NHP1〜5にはさらに、3.5mLのSYN−PKU−2002(5×1011CFU)の経口強制経口投与するのを投与し、NHP6〜10には、経口強制経口投与するのを介して3.5mLの製剤バッファーを投与した。同時に、NHPを2mLの水でフラッシュして投与した。動物を静脈穿刺により0、0.5、1、2、4および6時間で採血した。投与6時間後、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、5mlの体積を計測した。結果を図に示す。118A−118C。
この研究からの試験結果は、本開示の遺伝子操作された細菌株が天然に消化されるPheを消費し得、そしてD5−Phe消費の際に制御において観察される血液Pheにおけるスパイクを予防し得ることを実証する。
実施例78:Phe代謝は臨床的に重要である
非ヒト霊長類における開示された研究は、Phe代謝の関連性、およびPKU患者の食事に及ぼし得る深刻な影響を実証する。医学研究所は、フェニルアラニンが80〜90mg/g全タンパク質であると推定される食事基準摂取量を確立した。ヒトに対するタンパク質の再推奨摂取量は50g(2000カロリー食)である。無制限のアメリカの食事は、タンパク質全体(男性)約100gと雌型(雌型)約70gを提供する。従って、無制限の食餌は、約6〜9gのフェニルアラニンを提供する。
PKUが4歳を超える患者に推奨されるフェニルアラニン消費は200〜1100mg(Vockley、et al.2014、その全内容は引用により本明細書に組み込まれる)であるか、または約<10gタンパク質/日である。上記の研究に基づいて、SYN−PKU−2002の最高投与量は患者において1日当たり3回の5×1011用量に外挿することができる(NHPにおける尿中HAの35%回収を仮定する)。前記投与量は、ヒトにおける約25gの食品タンパク質摂取(70kgのヒトでは25mg/kg=1.7g)を支持するPheの毎日の代謝を予測する。したがって、Pheの照射量は、PKU患者が無制限の食事後に24時間で受けるPhe摂取量の約25%である(図28)。これは、1日の推奨タンパク質摂取量の〜50%に相当する(アメリカのRDA参照;制限のないアメリカの食事が全タンパク質の平均約100g(男性)と70g(雌型)を提供すると仮定)。PKU患者については、これはタンパク質取り込みの2.5倍の増大をもたらし、その結果、PKU患者の食事および生活様式が自由になる。
いくつかの実施形態では本発明の細菌と処置すると、PKU患者は1日当たりの食品タンパク質摂取量を10g以上、約10g〜約30g、約10g〜約25g、約10g〜約20g、約10g〜約15gに増大させることができる。いくつかの実施形態では本発明の細菌と処置すると、PKU患者は1日当たりの食品タンパク質摂取量を約15g、約20g、または約25gに増大させることができる。
いくつかの実施形態では本発明の遺伝子操作された細菌と処置すると、PKU患者は毎日のタンパク質摂取量を約2.5倍に増大させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、PKU患者は毎日のタンパク質摂取量を約2.0倍に増大させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、PKU患者はいくつかの実施形態では約1.5倍だけ毎日のタンパク質摂取を増加させることができ、遺伝子操作された細菌と処置すると、PKU患者は約1.0倍だけ毎日のタンパク質摂取を増加させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、PKU患者は毎日のタンパク質摂取を約3倍、3.5倍、または4倍増大させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、PKU患者は毎日のタンパク質摂取を約50%増大させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、PKU患者は毎日のタンパク質摂取を約5%〜10%、10%〜20%、20%〜30%、30%〜40%、40%〜50%、50%〜60%、60%〜70%、70%〜80%、80%〜90%、90%〜100%増大させることができる。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌と処置すると、PKU患者は毎日のタンパク質摂取を約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、および90%〜100%増大させることができる。
実施例79:様々な濃度のジアミノピメリン酸における大腸菌Nissle1917のDAP栄養要求株であるSYN766の増殖の特性評価
細菌の増殖および分裂に必要なDAPの最小量を決定するために、EcNのDAP栄養要求株であるSYN766の増殖が、ある範囲のDAP濃度でのインキュベーションによって特性評価された。
全ての細菌培養を、≦−65℃で保存したグリセロールストックから開始した。細菌を、100μg/mLのDAPを補充したLB培養液中で、37℃、250rpmで振盪しながら、14mLの培養管中で一晩増殖させた。次いで、一晩培養物を、種々のDAP濃度を有する100μLのLBを含有する96ウェルプレートのウェル中で1:100に希釈した。
全ての実験において、96ウェルプレートをパラフィルムで密封し、Synergy(登録商標)Neo Microplate Reader(BioTek Instruments、Inc.、Winooski、VT)で分析した。プレートを振盪しながら37℃で960分間インキュベートし、OD600を10分毎に測定した。
データをGen5(登録商標)ソフトウェアバージョン2.06(BioTek Instruments、Inc.、Winooski、VT)で収集し、Microsoft(登録商標)Excelにエクスポートして平均および標準誤差を計算し、GraphPad Prismバージョン7.03(GraphPad Software、Inc.、San Diego、CA)で処理した。
SYN766(EcNのDAP栄養要求株)を分析して、成長に必要なDAPの濃度を決定した;データを図32に示す。50μg/mLおよび100μg/mLの濃度のDAPを有する液体培地において、SYN766は約1のOD600ofで固定相に入る前に、350分間指数関数的に増殖した。25μg/mLのDAP濃度で、細胞は200分間増殖し、OD600of 0.15に達した後、減少した。成長は600分後に再開し、約0.8の最終OD600ofに達し、これはDAP濃度が少なくとも50μg/mLである場合よりも有意に少ない総細胞質量であった。6μg/mLおよび12μg/mLのDAPでは、SYN766が約180分間指数関数的に増殖し、その後、実験の残部の間、減少するOOBBを示した。DAP濃度が6μg/mL未満であった場合、SYN766は実験の残部の間、減少するOOBBを示す前に、約100分間成長を示した。
実施例80:ジアミノピメリン酸を含まないLB増殖培地における大腸菌Nissle1917の様々な株の増殖の特性評価
DAPを含まない培地中で種々の改変EcN株を増殖させ、DAP栄養要求株および原栄養生物の増殖特性を確認した。実施例79に記載したものと同様の成長条件を使用した。フェニルアラニンを消費するように改変されたEcNの種々の株を、DAPの非存在下および存在下で増殖するそれらの能力について分析した。結果を図33に示す。非栄養要求性株、SYN001、SYN‐PKU901およびSYN3282は、約1.2のOD600で固定相に入る前に約400分間指数関数的に増殖した。同様の条件下で、DAP栄養要求株、SYN766、SYN−PKU−2001、およびSYN−PKU−2002は最初の90分間、約0.010の接種OD600内に留まり、その後、低下を示し始め、約0.005のOD600で実験を終了した。これは、dapAの欠失がDAPの外部供給源の非存在下で成長の停止を生じることを示す。SYN3282におけるPhe劣化に関与する遺伝子の存在は、野生型株と比較して成長に影響を及ぼさなかった。DAP栄養要求性とSYN‐PKU‐2001およびSYN‐PKU‐2002におけるPhe劣化に関与する遺伝子との組合せは、DAP栄養要求性単独で観察された成長障害に影響を及ぼさなかった(SYN766)。これらの試験結果は、DAP栄養要求性がこれらの操作された株の増殖および生存を調節する主要な要因であることを示す。
実施例81:100μg/mLジアミノピメリン酸を含むLB増殖培地での大腸菌Nissle1917の様々な株の増殖の特性評価
EcNの種々の改変株を、実施例79に記載されるものと同一の増殖条件を使用して、100μg/mLのDAPを含む培地中で増殖させた。実施例80の結果とは対照的に、100μg/mLのDAPを補充したLB中で増殖させた場合、試験したEcN株の全てが同等の増殖を示した(図34参照)。非栄養要求性株SYN001、SYN‐PKU901およびSYN3282ならびに栄養要求性株SYN766、SYN‐PKU‐2001およびSYN‐PKU‐2002は、約1.4のOD600で定常期に入る前に約400分間指数関数的に増殖した。
実施例82:経口投与後のC57BL/6マウスにおける操作された大腸菌Nissle1917の糞便排泄とクリアランス
本試験の主な目的は、野生型EcNと比較したDAP栄養要求性および/またはPhe分解活性を含む株の糞便排泄の動態を決定することであった。本研究に利用したEcN株には、野生型(SYN−PKU901)、DAP栄養要求株(SYN766)、Phe分解活性をコードするように遺伝子操作した株(SYN3282)、およびDAP栄養要求性およびPhe分解活性の両方を有する株(SYN−PKU−2001)が含まれた。SYN−PKU−2001は臨床候補株SYN−PKU−2002の代理であるが、選択培地上にプレーティングすることによって腸内容物および生物組織中の他の微生物叢から単離することを可能にするクロラムフェニコール耐性カセットを含む。SYN3282はSYN−PKU−2001と同一であるが、DAP栄養要求性を有していない。このために、雌型C57BL/6マウスを秤量し、重量によって3処置群に無作為化した(それぞれn=5)。それぞれの群は、約3×109CFU/株(200μL/照射量)で2つの混合菌株を含む単回経口投与を受ける。DAP栄養要求性の影響を検討するために群1にSYN−PKU901およびSYN766を投与し、Phe分解活性の影響を検討するために群2にSYN−PKU901およびSYN3282を投与し、DAP栄養要求性およびPhe分解活性の両方の併用効果を検討するために群3にSYN−PKU−2001およびSYN3282を投与した。
投与前に、糞便サンプルを、T=0で個々のマウスから収集し、シリアル微量希釈平板培養によって処理して、群内に投与される細菌株について選択的なLB寒天平板上の、もしあれば、生存CFUのベースライン濃度を決定した。次いで、細菌用量を、T=0時間の糞便収集の直後に投与した。指定された時点で糞便を収集するために、回収可能な糞便サンプルが産生されるまで、それぞれのマウスを小さな空のピペットチップボックス中で単離した。サンプルを2mlのエッペンドルフチューブに移した。免震の30分以内にサンプルが産生されなかった場合、その時点を分析から除外した。投与後4、6、8、24、30、および48時間目に、各マウスから糞便ペレットを回収し、秤量した。
秤量した糞便ペレットの処理のために、1mlのPBSをそれぞれのサンプルに添加し、使い捨てペレットペストル(Kimble、749521−150)を手動整粒化に使用した。次に、サンプルを最高速度で10〜20秒間ボルテックスした。10μLの微量希釈液を使用して、サンプルを6桁にわたって1:10に希釈した。これらの希釈液10μLおよび未希釈便ホモジネートを、適切な選択LBカンテンプレート上にプレートした。希釈物を、抗生物質またはDAP(適切な場合、SYN−PKU901=ストレプトマイシン300μg/mL;SYN3282=クロラムフェニコール30μg/mL;SYN766/SYN−PKU−2001=クロラムフェニコール30μg/mLおよびDAP100μg/mL)を補充したLB寒天上にプレートした。プレートを37℃で一晩インキュベートし、次の日にコロニーを手動でカウントした。プレートを37℃±2℃で一晩インキュベートした。コロニーを、少なくとも10個であるが200個以下の個々のコロニーを含む希釈液中で手動で計数した。最終的なCFU数は、CFU/糞便ホモジネートmLの計算のためにカウントされたコロニー数を乗じた希釈係数を用いた逆算によって決定した。CFU/mg糞便の算出のために、この数値を糞便ペレットの質量で割った。
次に、それらの同質遺伝子親と比較した、改変EcN株における突然変異/操作の効果(もしあれば)を試験した。各時点で排泄された各株の量を、最初の照射量におけるその株のCFUの数で割った。この規格化を用いて、研究群内の2つの株を、排泄およびクリアランス動態について直接的に比較することができた。
結果を図35A〜35Cに示す。マウスのいずれについても、投与前(T=0時間)の糞便サンプルにおいて選択培地上でCFUは検出されず、投与後に検出されたCFUはEcN由来株に起因し、マイクロビオームからの背景技術成長に起因しないことが実証された。3基すべてにおいて、細菌のすべての菌株は投与後4時間で糞便の最高量に達し、経時的に着実に減少した。24時間までに、糞便中の細菌数は、全ての株について3〜4桁低下した。30時間までに、群1および3からの少なくとも2匹のマウス、ならびに群2のすべてのマウスは、糞便中に検出可能なEcN由来細菌を含まなかった。48時間までに、全てのEcN由来細菌が糞便から除去された。すべての細菌について同様の消失速度が観察されたので、改変EcN株における排泄の動態に明らかな差はなく、DAP栄養要求性(SYN766、1基)、Phe分解活性(SYN3282、2基)、およびそれらの組合せ(SYN−PKU−2001、3基)のいずれも、野生型SYN−PKU901株と比較して、マウスモデルにおいて腸の輸送時間または株の生存に有意な影響を及ぼさなかったことが示された。
その結果、C57BL/6マウスの糞便からの細菌の消失は、Iの栄養要求性および/またはPhe分解活性によって変化しなかった。経口投与されたEcN由来細菌株はすべて、遺伝子型にかかわらず、48時間以内にマウスの糞便から排除され、EcNおよびその誘導体は長期間生存できないことを示唆した。
実施例83:健康なマウスにおける大腸菌Nissle1917の派生物SYN−PKU901およびSYN−PKU−2001のin vivoでの生存
この薬理学的研究の目的は、雌C57BL/6マウスにおいて、同一のジアミノピメラート(DAP)栄養要求性およびフェニルアラニン(Phe)劣化要素を含有するSYN−PKU−2002の代理株である遺伝子操作EcN誘導体SYN−PKU−2001と比較して、エシェリヒア属coli Nissle(EcN)野生型株SYN−PKU901の生存、胃腸管(GI)分配または完全クリアランスまでの時間の差を評価することであった。SYN−PKU901またはSYN−PKU−2001の9×109CFUの単回経口投与後の雌型C57BL/6マウスの複数GIセグメントにおいて、48時間にわたるコロニー形成単位(CFU)を数えることによって、GI分布、輸送およびクリアランス動態を測定した。
この研究に利用したEcN株は、野生型コントロールであるSYN−PKU901、およびPhe分解活性およびDAP栄養要求性をコードするように遺伝子操作された株であるSYN−PKU−2001を含んでいた。SYN−PKU−2001は臨床候補株SYN−PKU−2002の代理であるが、生物学的組織からの選択プレーティングを可能にするクロラムフェニコール耐性カセットを含む。
雌型C57BL/6マウスの重量を測定し、重量によって12処置群(それぞれn=3)およびコントロール群(n=3)に無作為化した。コントロール群(T=0)のマウスを、炭酸ガス窒息、続いて頸部脱臼により屠殺した。胃、小腸(SI)、盲腸、および結腸を注意深く切除した。SIをさらに3つの等しい長さのセクション(上部、中間、および下部)に分割した。それぞれの臓器部を氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)0.5mLでフラッシュし、流出液を別々の1.5mLのエッペンドルフチューブに集めた。PBS/流出液サンプルを秤量し、選択培地上での連続希釈播種によって加工するまで氷上で維持して、それぞれの腸区分の流出液中の生存CFUを決定した。100mM重炭酸ナトリウムを含む剤型では、処置群の動物に9×109CFUのSYN−PKU901(6群)またはSYN−PKU−2001(6群)を経口投与した。投与後0.25、0.5、1、4、24、および48時間で、SYN−PKU901−およびSYN−PKU−2001−処置群を屠殺し、組織を対照群と同じ様式で処理した。
CFU/mLを計算するために、それぞれの秤量した流出液サンプル10μLを、滅菌96ウェルプレート中のPBS中で実施した10倍微量希釈系列で使用した。希釈していない流出液および希釈液の10μLを、抗生物質またはDAPを添加したLBアガー平板上にプレーティングする(SYN−PKU901=ストレプトマイシン300μg/mL;SYN−PKU−2001 =クロラムフェニコール30μg/mLおよびDAP100μg/mL)。プレートを37℃で一晩インキュベートし、次の日にコロニーを手動でカウントした。
CFU判定のために、計数は、少なくとも10個であるが200個以下の個々のコロニーを含有する希釈液中のコロニーを手動で計数することによって収集した。最低希釈(未希釈流出液の平板培養)でのみコロニーが観察された場合、10未満であっても、すべてのコロニーを計数し、スコア化した。最終的なCFUカウントは、カウントされたコロニーの数および収集された流出液の体積の両方を乗じた希釈係数を使用する逆計算によって決定された。
図36A〜Fの試験結果を参照。細菌を与えなかったマウスの流出液サンプル、選択培地上にCFUは検出されず、投与後の流出液において検出されたCFUはEcN由来株に起因し、微生物叢からの背景技術成長に起因しないことを実証した。SYN−PKU−2001またはSYN−PKU901(制御)のいずれかを投与したマウスの胃、上部小腸、中小腸、下部小腸、盲腸および結腸から得られた流出液において、経時的な生存率および消化管分布は、最初の24時間にわたって非常に類似していた。投与48時間後にいずれの細菌についてもCFUは見出されず、この時点までに完全なクリアランスを示した。
結論として、SYN‐PKU‐2001のDAP栄養要求性および/またはフェニルアラニン分解活性は、SYN‐PKU901コントロール株と比較して、C57BL/6マウスの胃腸管からの生存、消化管分布またはクリアランス完成までの期間を変化させなかった。48時間以内に経口投与されたすべてのEcN由来株の完全なクリアランスは、EcNおよびその派生物が長期間生存できなかったことを示唆する。
実施例84:バイオリアクターで増殖した大腸菌のSYN−PKU−2002株におけるフェニルアラニンのトランス−ケイ皮酸およびフェニルピルビン酸への分解
バイオリアクター中で増殖させ活性化させた改変エシェリヒア属大腸菌Nissle 1917(EcN)SYN‐PKU‐2002株におけるフェニルアラニン(Phe)の代謝産物トランス‐シナメート(TCA)およびフェニルピルビン酸(PP)への転換を、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL)およびL‐アミノ酸デアミナーゼ(LAAD)活性の尺度として決定した。さらなる目的には、バイオリアクター活性化SYN−PKU−2002がPhe劣化の基材としてPhe含有ペプチドまたは全タンパク質の複合混合物を使用追加のかどうかを決定することが含まれた。
フェニルケトン尿症(PKU)の治療方法処置を意図したPhe分解株であるEcN由来株SYN‐PKU‐2002を、SYN‐PKU‐2002のスケールアップに用いられることを意図した工程に従い、バイオリアクター中で増殖させ、活性化した。5Lスケールで実施されたこの方法は、培養物の撹拌速度の制御によって達成された低溶存酸素(DO)環境の産生を含んでいた。低DOは、PALおよび高親和性フェニルアラニントランスポーター、PhePをコードする遺伝子の染色体に組み込まれたコピーの発現を活性化した。低DOへの降下後、イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG; 1mM)を添加してPALの追加コピーの発現を活性化し、L−アラビノース(最終濃度0.15%)を添加してLAADの発現を活性化した。高密度成長後、細胞を集中させ、グリセロールベースの製剤バッファー中≦65℃で凍結させた。
1×108活性化細胞を、50mM Phe、Phe−Pro、Phe−Gly−Gly、Phe−Val、Phe−Ala、またはGly−Pheペプチドを含むアッセイ培地中で、または肉、トリプトン、または全カゼイン紛体由来の20g/Lのペプトン中で、37℃で好気的にインキュベートした。上澄み液サンプルを30分および60分で除去し、Phe、TCA、およびPPの濃度をLC MS/MSによって決定した。
図31AおよびBの試験結果を参照SYN−PKU−2002におけるPALおよびLAAD活性の両方は遊離Pheを基材として使用した場合にin vitroで検出され得るが、提供された基材がPhe含有ペプチドの形成になった場合にのみPAL活性が観察され、LAADはPheの他の供給源よりも遊離アミノ酸にアクセスすることがより良好であり得ることが実証された。未消化カゼインタンパク質を基材として使用した場合、PALまたはLAAD活性は観察されなかった。
これらのデータはバイオリアクター中で増殖させたSYN−PKU−2002がPALおよびLAAD Ph分解経路の両方の増殖および活性化が可能であることを実証し、SYN−PKU−2002がより高い体積で活性化されたバラ物薬物の産生に従うことを示唆する。さらに、哺乳動物胃腸管における正常な消化処理の間に遊離Pheに加えて産生されるようPhe含有ペプチドの複合混合物はSYN−PKU−2002のPAL成分によって代謝されるが、LAAD成分によっては代謝されないことが実証された。
実施例85:健康な非ヒト霊長類におけるSYN−PKU−2002の用量応答試験
健康な雄カニクイザルにおけるSYN−PKU−2002のフェニルアラニン代謝活性は、3.3×109〜7.2×1011コロニー形成単位(CFU)の範囲の投与量レベルでのSYN−PKU−2002の投与後のフェニルアラニン(Phe)のレベルおよび血漿および尿におけるその代謝産物を測定することによって特徴付けられた。
本研究では、健康な雄カニクイザル(2.8〜4.5kg)を一晩絶食させた。投与前に、血漿サンプル(ヘパリン)を用いて、非標識Pheおよびダウン下流代謝産物のベースラインを確立した。動物に、経口強制経口投与することにより、11mLのペプトン(5.5g)、SYN−PKU−2002(3.3×109〜7.2×1011CFU/照射量の範囲の照射量)、および5mLの0.36M重炭酸ナトリウムの連続溶液を投与した。投与0.5、1、2、4および6時間後に血漿を採取し、分析まで凍結した。研究群の間に収集した血漿サンプルを、液体クロマトグラフィー−タンデムマススペクトロメトリー(LC−MS/MS)を用いて、フェニル、フェニルピルビン酸(PP)、トランス−ケイ皮酸(TCA)、およびヒップピューレート(HA)の存在について分析した。投与後6時間にわたって尿を収集し、体積を測定し、5mLのアリコートを凍結し、LC−MS/MS分析まで保存した。
健康なサルへのペプトンの投与は、投与後約1時間でピークに達する血漿フェニル濃度の急上昇をもたらした(図26D参照)。5.5gのペプトンを投与した健康なサルにSYN−PKU−2002を経口投与すると、このPheスパイクが鈍化した。Pheの全範囲,血漿濃度に完全に用量比例するわけではないが、一般にSYN−PKU−2002投与群では特に9×1010CFU以上の用量で低かった。SYN−PKU−2002投与後のPheの低下と同時に、TCAの血漿濃度(Pheのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ代謝の直接産物、図26C参照)およびHA(TCAの代謝産物、図26Bおよび図38参照)は用量依存的に増加した;しかし、最高用量(低用量は測定されなかった)で処置されたサルにおいて、PP(PheのL−アミノ酸デアミナーゼ代謝の直接産物)の検出可能な血漿濃度はなかった。馬尿酸は尿中に急速に排泄されることが知られており、血漿のTCAおよびHA濃度の増加と一致し、尿中HA排泄は、一般的に用量依存的に増加した(図26Aを参照のこと、最高用量のサルの尿においてPPは検出されなかった)。
これらの研究は、SYN−PKU−2002が雄カニクイザルにおいてPheを代謝することができることを実証する。PPは、最高投与量で処置したサルの血漿および尿では検出されなかった。6時間にわたる尿中HA排泄の用量依存的増加と同様に、フェニルアラニン代謝産物TCAおよびHAの血漿濃度の用量依存的増加があった。このことは、SYN−PKU−2002における2つのPhe分解酵素の間で、PALがサルにおけるPhe代謝の大部分を担っており、このモデルにおいてLAADからの寄与はほとんどまたは全くないことを示している。さらに、この研究は、HAおよびTCAが将来の臨床研究においてSYN−PKU−2002活性のバイオマーカーとして潜在的に役立ち得ることを示す。
実施例86:非ヒト霊長類におけるSYN−PKU−2001の胃腸管特性評価
健康なカニクイザルの胃腸管の様々なセグメント内でのSYN−PKU−2001のフェニルアラニン代謝活性およびコロニー形成を特徴付けるために、2つの研究を行った。第1の研究では、動物を、それぞれ3匹の雌の2基に分け、5.5グラムのペプトン、5mLの0.36M重炭酸ナトリウム、25mg/kgのD5−フェニルアラニン、およびSYN−PKU−2001またはブランク対照のいずれかを投与した。投与の2時間後、動物を安楽死させ、サンプルを収集した。第2の研究では、3匹の雄サルの1群に、5.5グラムのペプトン、5mLの0.36M重炭酸ナトリウム、25mg/kgのD5−フェニルアラニン、およびSYN−PKU−2001を投与し、動物を安楽死させ、投与後0.5時間にサンプル収集した。
両方の研究において、動物に、1日目に単一の経口強制経口投与することによって試験品(下表を参照のこと)を投与した。キャップをした細菌チューブを、各用量投与の前に3回反転させた。投薬剤型は、プラスチックシリンジに取り付けられた使い捨てカテーテルを用いて経口強制経口投与することにより投与された。投与後、強制経口投与する管を5mlの動物用飲料水ですすぎ、動物の胃の中に入れた。それぞれの動物にクリーニング強制経口投与する管を投与した。投与の最初の日を1日目とした。動物は、用量投与のために一時的に拘束され、鎮静されなかった。
製剤バッファーおよびD5−フェニルアラニン(20mg/mL)は使用するまで4℃で維持され、使用する時点でアリコートが取り出され、投薬前に少なくとも30分間室温まで温められた。重炭酸ナトリウム(0.36M)は、周囲温度で保存および投与された。
以下の表に示されているのは、各群の動物に使用される用量およびレジメンである。
5.5gのペプトンの照射量は1日当たり100gのタンパク質を消費する典型的な60kgの個体に基づいており、本発明者らは、これをシミュレートして、給餌後の血中のPheおよび尿中のPheの代謝産物を測定することができるようにした。25mg/kgのD5−フェニルアラニンの経口投与量を選択したが、これはこのレベルで投与した場合、マウスの尿中に測定可能なレベルのD5−馬尿酸を与えるからである。
両方の研究において、動物を一晩絶食させ、投与前の1日目に体重を測定した。抗凝固剤としてヘパリンを用いて大腿静脈から血中サンプル(5ml)を採取し、粉砕したウェットアイス上に置いた後、遠心分離した。遠心分離後、得られた血漿を分離し、2つのアリコートに移し、ドライアイス上で即座に凍結させ、−80℃に設定したフリーザーに移した。サンプルを、分析のために別の設備にドライアイス上で輸送した。
動物を、市販の獣医学的安楽死溶液の、経皮カテーテルセットアップを使用して、尾静脈を後静脈注射による照射量の2時間後(鎮静なし)(検討1)または0.5時間後(検討2)に安楽死させた。
組織の採取および保存表で特定される組織は、示されているようにすべての動物から収集された。
腹痛の後、胃および結腸をクランプした。さらなるクランプを使用して、約30cmのセグメントで小腸を切除した。10mLの冷滅菌生理食塩水を胃に注入し、内容物を緩めるためにマッサージした。胃を開き、内容物を標識した50mLコニカルチューブに排出し、体積を記録した。約1mLの含有量を分析設備に移し、収集時にプレートに移した。残りの胃内容物を、3つの異なるアリコート: 1mL、1.6mL(凍結前にスポンサーがグリセロールを添加した)に分離し、残った。残りの胃組織(全体および標識されたジップロックバッグに収集された)を、内容物と共に、同日の宅配便(氷上で凍結)を介して分析施設に出荷されるまで、氷上で凍結した。
小腸の各約30cmセグメントに15mLの冷滅菌生理食塩水を注射し、内容物を標識した50mL円錐管に収集し、体積を記録した。各セグメントからの約1mLの含有量を、収集時に分析施設からプレートに移した。残りの内容物を3つの異なるアリコート:1mL、1.6mL(凍結前にスポンサーがグリセロールを添加した)に分離し、残った。小腸組織切片(標識ジップロック袋に集めた)を、内容物と共に、同日の宅配便(氷上で凍結)を介して分析施設に出荷するまで氷上で凍結した。
第1の研究では、20mL以下の近位結腸内容物を、湿った氷上に維持されたクリーニング、予め秤量されたガラス瓶に収集した(希釈せずに)。約1mLの含有量を分析設備に移し、収集時にプレートに移した。2つの異なるアリコート:ドライアイス上で凍結した1mLおよび1.6mL(凍結前にスポンサーがグリセロールを添加した)を、予め同定したチューブに移した。次いで、結腸を開き、残りの内容物を除去し、ガラス瓶に移した(50mL未満が以前に収集された場合)。組織を鉗子で把持し、滅菌生理食塩水を含む湯溜まり部中で穏やかにリンスした。次いで、清潔なスパチュラを用いて結腸組織を拭き取り、粘液を標識し、予め秤量したガラス瓶に集めた。粘液サンプルを、解析設備に移すまで湿った氷上に保持した。ティッシュをジップロックバッグに集め(全体)、同日配達業者(氷上で凍結)を介して分析施設に出荷するまで氷上で凍結した。
第2の研究では、15mLの冷滅菌生理食塩水を近位結腸に注入し、内容物を標識した50mL円錐管に収集し、体積を記録した。約1mLの含有量を分析設備に移し、収集時にプレートに移した。残りの内容物を3つの異なるアリコートに分離した:1mL、1.6mL(凍結前にスポンサーがグリセロールを添加した)、および残った。大腸組織(標識ジップロック袋に集めた)を、同日配達業者(氷上で凍結)を介して、以下の住所の分析施設に内容物と共に出荷するまで氷上で凍結した。
胃腸管のそれぞれの部分について測定されたPhe量およびCFUカウントを図38に示す。投与2時間後および投与0.5時間後のいずれにおいても、フェニルアラニン濃度は胃で最も高く、消化管中に次第に低下した。投与2時間後には、10%未満のフェニルアラニンが胃および十二指腸で認められた。投与量の2時間後、SYN−PKU−2001は回腸および近位結腸において主に見出され、そこでは非常に少ない基材が利用可能であった。これは、SYN−PKU−2001活性が基材の利用可能性によって制限され、したがって食物と共に摂取されるべきであることを示唆する。