JP2020525012A5

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Publication number: JP2020525012A5
Application number: JP2019571258A
Authority: JP
Filing date: 2018-06-21
Publication date: 2021-07-26
Anticipated expiration: 2038-06-21

Description

障害の処置のための細菌

本出願は、２０１７年６月２１日に出願された米国仮出願第６２／５２３，２２５号、２０１７年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／５５２，７８５号、２０１７年８月３１日に出願された米国仮出願第６２／５５２，８２９号、２０１８年１月５日に出願された米国仮出願第６２／６１４，２１３号、２０１８年１月３１日に出願された米国仮出願第６２／６２４，２９９号、および２０１７年６月２１日に出願された米国仮出願第６２／５２３，２０２号を参照により本明細書に組み込み、これらのそれぞれの内容全体は、それぞれの全体において参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

プロバイオティクス細菌が、例えばクローン疾患および炎症性腸症候群のような胃腸障害を含む、消化管に関連する様々な疾患または障害の処置または予防に有用であることを示唆する科学的エビデンスが増えている。より近年、遺伝子操作された細菌は胃腸疾患のための潜在的な新しい治療方法処置様式として出現し、そしてまた、細菌治療の分野を、代謝疾患、炎症性疾患、および癌を含む多数の他の適応症に開いた。遺伝子操作された細菌の１つの利点は、１つ以上の疾患メカニズムを特異的に標的とすることができることである。例えば、胃腸障害の場合、細菌は、例えば、国際公開第２０１６１４１１０８号に記載されるように、抗炎症剤または破壊された消化管バリアの治癒を助ける薬剤、例えば、短鎖脂肪酸ブチラートの発現のための遺伝子を含むように操作され得る。遺伝子操作された細菌は、代謝またはＩＥＭにおける先天性エラーから生じる稀な代謝障害を含むが、これらに限定されない、様々な代謝障害の処置様式と見なすこともできる。例えば、国際公開第２０１６０９０３４３号に記載されるように、細菌は、フェニルアラニンを代謝する１つ以上の酵素を発現し、それによって胃腸管内の過剰なフェニルアラニンを消費することによって、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を処置するように遺伝子改変されている。

バクテリオファージは世界で最も一般的な生物学的実体であり、グラム陽性およびグラム陰性の両方の大多数の細菌種が細菌染色体中にいわゆるプロファージとして組み込まれる１つ以上のＤＮＡバクテリオファージを含むことが十分に実証されている（Ｃｌｏｋｉｅら、ＰｈａｇｅｓｉｎＮａｔｕｒｅ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．２０１１年１月−２月；１（１）：３１−４５頁）。

ＤＮＡファージは、溶菌性であっても、テンペレート（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）であってもよい。溶菌性ファージは細菌細胞に感染し、その後、溶解した細胞から放出される子孫ファージの合成をプログラムする。逆に、テンペレートｆＤＮＡファージはそれらの宿主細菌と安定な関係を確立し、組み込まれたファージＤＮＡ（即ち、プロファージ）は宿主のゲノムと協調して複製され、宿主に損傷を与えるファージ遺伝子は発現されない。しかし、バクテリオファージ粒子はインタクトプロファージを含む細胞から、誘導と呼ばれるプロセスによって放出され得、その誘導の間に、溶菌性成長に必要なプロファージ遺伝子が作動し、子孫ファージ粒子が産生され、細胞の溶解によって細胞から放出される（Ｃａｓｊｅｎｓ、Ｐｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｗｈａｔｈａｖｅｗｅｌｅａｒｎｅｄｓｏｆａｒ？；ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３年７月；４９（２）：２７７−３００頁において概説されている）。いくつかの場合において、誘導は、プロファージを保有する細菌の小画分または大画分において、自然にかつランダムに起こり得る。他の場合には、特定の、しばしば未定義の環境シグナルが、多くの細胞において特定のプロファージの同時誘導を引き起こし、細菌細胞の死を引き起こし得る。

全てのプロファージが溶菌サイクルを経る能力を有するわけではない。非機能的、すなわち、欠陥（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）またはクリプティック（ｃｒｙｐｔｉｃ）プロファージは、突然変異による崩壊および／または何千もの細菌複製サイクルにわたる溶菌サイクルに必須の１つ以上の遺伝子の損失の結果として、多くの細菌において高レベルの存在量に達し得る（Ｂｏｂａｙら、Ｐｅｒｖａｓｉｖｅｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｆｅｃｔｉｖｅｐｒｏｐｈａｇｅｓｂｙｂａｃｔｅｒｉａ、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１４年８月１９日；１１１（３３）：１２１２７−１２１３２頁、およびその中の参考文献）。

いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のファージゲノムを含む細菌であって、前記ファージゲノムの１つ以上は欠陥がある、細菌を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のファージゲノムを含む細菌であって、前記ファージゲノムの１つ以上は溶菌性ファージが産生されないように欠陥がある、細菌を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のファージゲノムを含む細菌であって、前記ファージゲノムの１つ以上は、１つ以上のファージ遺伝子が発現されない点で欠陥がある、細菌を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上のファージゲノムを含む細菌であって、前記１つ以上のファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子は、１つ以上の突然変異を含む、細菌を提供する。いくつかの実施形態では、前記１つ以上のファージゲノムは、前記プロバイオティクス細菌の自然状態において存在する。いくつかの実施形態では、前記細菌は１つ以上の溶原性ファージをコードする。いくつかの実施形態では、前記細菌は、１つ以上の欠陥ファージまたはクリプティックファージまたはサテライトファージをコードする。いくつかの実施形態では、前記細菌は、１つ以上のテリオオシン（ｔａｉｌｉｏｃｉｎ）または遺伝子導入剤をコードする。

本開示のいくつかの実施形態では、前記ファージゲノムの１つ以上は突然変異している。そのような突然変異は、１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の欠失を含み得る。あるいは、前記突然変異は、１つ以上のファージ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の挿入を含み得る。別の実施形態では、前記突然変異は、１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の置換を含み得る。別の実施形態では、前記突然変異は、前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の逆位を含む。さらに、前記突然変異は、１つ以上の欠失、挿入、置換または逆位の任意の組合せを含み得る。特定の実施形態では、前記１つ以上の突然変異は、前記細菌からのファージ粒子の産生および放出を、前記１つ以上のファージゲノム中に前記１つ以上の標的化突然変異を有さない同じ細菌と比較して低減または防止する。いくつかの実施形態では、前記細菌はプロバイオティクス細菌である。そのようなプロバイオティクス細菌の非限定的な例としては、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）株Ｎｉｓｓｌｅである。いくつかの実施形態では、突然変異した前記ファージゲノムは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ１ゲノム、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ２ゲノムおよび／または大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムである。一実施形態では、前記突然変異したファージゲノムは、前記大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムである。一実施形態では、前記突然変異は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子を含む：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、前記突然変異、例えば１つ以上の欠失は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子を含む：ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５。本明細書に開示される細菌と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物。

いくつかの実施形態では、前記細菌は、１つ以上のエフェクター分子の発現のための１つ以上の回路をさらに含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症を軽減するための組成物および治療方法に関する。いくつかの実施形態では、前記組成物は、フェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）を発現することができる遺伝子操作された細菌を含む。例えば、参照によりその内容全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０Ａ１を参照されたい。フェニルアラニンは、食品タンパク質において主に見出される必須アミノ酸である。典型的に、少量がタンパク質合成のために利用され、残りは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）および補因子テトラヒドロビオプテリンを必要とする酵素経路においてチロシンにヒドロキシル化される。高フェニルアラニン血症は、有毒であり、脳障害を引き起こす可能性がある、過剰なレベルのフェニルアラニンに関連する疾患の群である。原発性高フェニルアラニン血症は、ＰＡＨ遺伝子の突然変異および／または補因子代謝の遮断によって生じるＰＡＨ活性の欠損によって引き起こされる。

フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、ＰＡＨ遺伝子の突然変異によって引き起こされる高フェニルアラニン血症の重症型である。ＰＫＵは、世界中で最も一般的な先天性代謝異常（３，０００人の出生のうちで１人）として位置付けられている常染色体性劣性遺伝病であり、米国において約１３，０００人の患者に影響を及ぼしている。４００超の異なるＰＡＨ遺伝子突然変異が同定されている（Ｈｏｅｋｓら、２００９年）。血液中のフェニルアラニン（ｐｈｅ）の蓄積は、小児および成人の中枢神経系に深刻な損傷を引き起こす可能性がある。新生児で未処置の場合、ＰＫＵは不可逆的な脳損傷を引き起こす可能性がある。ＰＫＵの処置は現在、食事からフェニルアラニンを完全に排除することを含む。タンパク質のほとんどの天然源は、必須アミノ酸であり成長に必要なフェニルアラニンを含有する。これは、ＰＫＵの患者が、成長のためにちょうど十分なフェニルアラニンを供給するアミノ酸サプリメントとともに、医療食品とｐｈｅフリータンパク質サプリメントに依存していることを意味する。この食事療法は患者にとっては困難であり、生活の質に影響を与える。

現在のＰＫＵ療法は、タンパク質制限からなる大幅に変更された食事を必要とする。一般的に、出生時からの処置により、脳障害および精神遅滞は低減する（Ｈｏｅｋｓら、２００９年；Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）。しかしながら、タンパク質制限食は注意深くモニターされなければならず、必須アミノ酸およびビタミンが食事中に補われなければならない。さらに、低タンパク質食品へのアクセスは、高タンパク質の変更されていない食品よりもコストがかかるので課題である（Ｖｏｃｋｌｅｙら、２０１４年）。ＰＫＵを有する小児において、低フェニルアラニン食を続けることで成長遅延が一般的である（Ｄｏｂｂｅｌａｅｒｅら、２００３年）。成人において、骨粗鬆症、母性ＰＫＵ、およびビタミン欠乏症などの新たな問題が発生する場合がある（Ｈｏｅｋｓら、２００９年）。血液脳関門を自由に通過することができる血液中の過剰なレベルのフェニルアラニンは、神経学的障害、行動障害（例えば、過敏症、疲労）、および／または身体症状（例えば、痙攣、皮膚発疹、カビ臭い体臭）の原因となる可能性もある。国際的ガイドラインは生涯にわたる食事によるフェニルアラニン制限を推奨しているが、これは困難であり、非現実的であると広範に見なされており（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）、「ＰＫＵを伴う生活にとっての最大の課題である低ｐｈｅ食の生涯にわたる遵守を克服するために、継続的な努力が必要とされる」（Ｍａｃｌｅｏｄら、２０１０年）。

残留ＰＡＨ活性を有する患者のサブセットにおいて、補因子テトラヒドロビオプテリン（ＴＨＢ、ＢＨ４、Ｋｕｖａｎ、またはサプロプテリンとも称される）の経口投与が、血中フェニルアラニンレベルを低下させるために食事制限と一緒に使用され得る。しかしながら、補因子療法はコストがかかり、フェニルケトン尿症の軽症型に適しているだけである。Ｋｕｖａｎの年間コストは、例えば、患者１人当たり５７，０００ドルもの高さになる場合がある。さらに、Ｋｕｖａｎの副作用には、胃炎および重度のアレルギー反応（例えば、喘鳴、立ちくらみ、吐き気、皮膚の潮紅）が含まれ得る。

酵素フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）は、フェニルアラニンを無毒なレベルのアンモニアおよびトランス−ケイ皮酸に代謝することができる。ＰＡＨと異なり、ＰＡＬは、フェニルアラニンを代謝するためにＴＨＢ補因子活性を必要としない。ＰＡＬを使用した経口酵素療法の研究が行われているが、「ＰＡＬは手頃なコストにて十分な量で利用できないので、ヒトおよび動物でさえも研究は継続されなかった」（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）。組換えＰＡＬ（ＰＥＧ−ＰＡＬ）のペグ化形態もまた、注射可能な処置形態として開発中である。しかしながら、ＰＥＧ−ＰＡＬを投与されたほとんどの対象は、注射部位反応に悩まされ、かつ／またはこの治療用酵素に対する抗体が発生した（Ｌｏｎｇｏら、２０１４年）。したがって、ＰＫＵを含む高フェニルアラニン血症に関連する疾患のための、効果的で、信頼性の高い、かつ／または長期的な処置に対する大きな満たされていない必要性が存在している。より多くの天然タンパク質の消費を可能にしながら、患者の血中Ｐｈｅレベルを制御する処置に対する満たされていない必要性が存在している。

いくつかの実施形態では、本開示は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼおよび／またはフェニルアラニンヒドロキシラーゼおよび／またはＬ−アミノ酸デアミナーゼをコードおよび発現し、高フェニルアラニン血症を軽減することができる遺伝子操作された細菌を提供する。フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）酵素は、フェニルアラニンを無毒なレベルのアンモニアおよびトランス−ケイ皮酸（ｔｒａｎｓｃｉｎｎａｍｉｃａｃｉｄ）に代謝することができる。ＰＡＨとは異なり、ＰＡＬはフェニルアラニンを代謝するためにＴＨＢ補因子活性を必要としない。Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）は、フェニルアラニンの酸化的脱アミノ化を触媒して、フェニルピルビン酸、ならびに微量のアンモニアおよび過酸化水素を生成する。フェニルピルビン酸（ＰＰＡ）は、医薬品、食品、および化学工業において広範に使用されており、ＰＰＡは、多くのキラル薬および食品添加物の製造における原料中間体であるＤ−フェニルアラニンを合成するための出発物質である。したがって、ＬＡＡＤは工業的ＰＰＡ生産の観点から研究されている（Ｈｏｕら、２０１５年、ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５年１０月；９９（２０）：８３９１〜４０２頁；「ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃａｃｉｄｆｒｏｍＬ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｕｓｉｎｇａｎＬ−ａｍｉｎｏａｃｉｄｄｅａｍｉｎａｓｅｆｒｏｍＰｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃａｎｄｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」）。フェニルピルビン酸は、血液脳関門を横切ることができず（Ｓｔｅｅｌｅ、ＦｅｄＰｒｏｃ．１９８６年６月；４５（７）：２０６０〜４頁；「Ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｔｒａｎｓｐｏｒｔｏｆｔｈｅａｌｐｈａ−ｋｅｔｏａｃｉｄａｎａｌｏｇｓｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．」、この変換はＰＫＵの神経学的表現型を制御する際に有用であることを示している。

特定の態様では、本開示は、哺乳動物の高フェニルアラニン血症を軽減することができる遺伝子操作された細菌に関する。特定の態様では、本明細書に開示される組成物および方法は、高フェニルアラニン血症（例えば、フェニルケトン尿症）に関連する疾患を処置するために使用され得る。特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は非病原性であり、フェニルアラニンの毒性レベルを低下させるために消化管に導入され得る。特定の実施形態では、フェニルアラニンアンモニアリアーゼおよび／またはフェニルアラニンヒドロキシラーゼおよび／またはＬ−アミノ酸デアミナーゼは遺伝子操作された細菌によって安定に産生され、かつ／または遺伝子操作された細菌はｉｎｖｉｖｏおよび／またはｉｎｖｉｔｒｏで安定に維持される。特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニンの取り込みを増加させるためのフェニルアラニントランスポーター遺伝子をさらに含む。本発明は、遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物、ならびに高フェニルアラニン血症に関連する障害をモジュレートおよび処置する方法も提供する。

遺伝子操作された細菌は、バイオセイフティーおよび／または生物学的封じ込め、例えば、死滅スイッチ、遺伝子ガードシステムおよび／または栄養要求性に関連する１つ以上の遺伝子配列も含み得る。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、抗生物質耐性遺伝子を含み得る。これらの遺伝子配列の発現は、本明細書に開示されるプロモーター系のいずれかなどのさまざまなプロモーター系を使用して調節され得、当該プロモーター系は、１つ以上の異なる遺伝子を調節するための同じプロモーターの使用を含んでもよく、異なる遺伝子を調節するための同じプロモーターの異なるコピーの使用を含んでもよく、かつ／または異なる遺伝子の発現を調節するために組み合わせて使用される異なるプロモーターの使用を含んでもよい。遺伝子発現を制御するために異なる調節系またはプロモーター系を使用することによって、柔軟性（例えば、異なる環境条件下で遺伝子発現を差異的に制御する能力および／または遺伝子発現を時間的に制御する能力）がもたらされ、また遺伝子発現を「微調整」する能力ももたらされ、これら調節のいずれかまたはすべてが遺伝子発現および／または細菌の増殖を最適化するのに役立ち得る。

いくつかの実施形態では、細菌は、低酸素条件で、疾患もしくは組織特異的分子または代謝産物の存在下で、炎症または炎症反応または免疫抑制、肝臓障害、代謝疾患に関連する分子または代謝産物の存在下で、あるいは消化管または腫瘍微小環境に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、任意の１つ以上のエフェクター分子を発現することができる。いくつかの実施形態では、任意の１つ以上の回路が１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体中の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、のうちの１つ以上をさらに含む：（１）当技術分野で公知であり、本明細書で提供される任意の栄養要求性（例えば、ｔｈｙＡまたはｄａｐＢ栄養要求性）などの１つ以上の栄養要求性、（２）本明細書に記載されているか、または当技術分野で公知の死滅スイッチのいずれかなどの１つ以上の死滅スイッチ回路、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載されているか、または当技術分野で公知のトランスポーターのいずれかなどの生物学的分子または基質を取り込むための１つ以上のトランスポーター、（５）本明細書に記載されていて、そうでなければ当技術分野で公知の分泌回路のいずれかなどの１つ以上の分泌回路、および（６）そのような追加回路の１つ以上の組み合わせ。細菌の組成物、ならびに１つ以上の疾患もしくは障害の処置、予防または管理のための方法も提供される。

図１Ａは、ＰＨＡＳＴ分析からのＥｃＮゲノム（ＣＰ００７７９９．１）上の予測されるファージの位置の概略図を示す。３つの高スコアのインタクトファージは、ファージ１〜３とラベル付けされている。ファージ１（ＰＨＡＳＴスコア１１０）は長さ１８．８ｋｂであり、ＥｃＮゲノム内の座標２４１，５６３〜２６０，４４１にわたる。ファージ２（ＰＨＡＳＴスコア１５０）は長さ５２．４ｋｂであり、１，３２５，８８３〜１，３７８，２８７にわたる。ファージ３（ＰＨＡＳＴスコア１５０）は５９ｋｂの長さであり、３，４０５，１０１〜３，４１８，１８０にわたる。また、ＰＨＡＳＴアルゴリズムによって「不完全」または「疑わしい」と指定された、いくつかの低スコアファージも同定され、それらはファージの主要成分のすべてを含まず、したがって、部分的なファージまたは偽陽性予測を表す可能性がある。略語：ＥｃＮ＝大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７；ＰＨＡＳＴ＝ファージ・サーチ・ツール・ソフトウェア（ＰｈａｇｅＳｅａｒｃｈＴｏｏｌｓｏｆｔｗａｒｅ）；ｋｂ＝キロ塩基。図１Ｂは、ＰＨＡＳＴＥＲスコアリングによる、Ｎｉｓｓｌｅゲノム中の５つの推定プロファージ（３つのインタクトプロファージ、１つの不完全なプロファージ、および１つの疑わしいプロファージ）を説明する表を示す。Ｐｈａｓｔツールを使用した、Ｎｉｓｓｌｅにおける３つの高スコアファージのうちの１つであって、本明細書で「ファージ１」と呼ばれ、ファージのすべての主要成分を含むものを示す概略図である。推定遺伝子は、Ｈｙｐ＝仮想、ＰＬＰ＝他のファージ様タンパク質、Ｏｔｈ＝その他、ＲＮＡ＝ｔＲＮＡ、ＴＲＡ＝トランスポザーゼとラベル付けされている。Ｐｈａｓｔツールを使用した、Ｎｉｓｓｌｅにおける３つの高スコアファージのうちの１つであって、本明細書で「ファージ２」と呼ばれ、ファージのすべての主要成分を含むものを示す概略図である。推定遺伝子は、Ｈｙｐ＝仮想、ＰＬＰ＝他のファージ様タンパク質、Ｏｔｈ＝その他、ＲＮＡ＝ｔＲＮＡ、ＴＲＡ＝トランスポザーゼ、Ｌｙｓ＝溶解、Ｔｅｒ＝ターミナーゼ、Ｃｏａ＝コート、Ｓｈａ＝尾部シャフト、Ｆｉｂ＝尾部繊維とラベル付けされている。Ｐｈａｓｔツールを使用した、Ｎｉｓｓｌｅにおける３つの高スコアファージのうちの１つであって、本明細書で「ファージ３」と呼ばれ、ファージのすべての主要成分を含むものを示す概略図である。推定遺伝子は、Ｈｙｐ＝仮想、ＰＬＰ＝他のファージ様タンパク質、Ｏｔｈ＝その他、ＲＮＡ＝ｔＲＮＡ、ＴＲＡ＝トランスポザーゼ、Ｌｙｓ＝溶解、Ｔｅｒ＝ターミナーゼ、Ｃｏａ＝コート、Ｓｈａ＝尾部シャフト、Ｆｉｂ＝尾部繊維とラベル付けされている。図５Ａは、Ｐｈａｓｔツールを用いて同定された２つのより低いスコアの「不完全」ファージまたは「疑わしい」ファージのうちの最初のものを示す。推定遺伝子は、Ｈｙｐ＝仮想、ＰＬＰ＝他のファージ様タンパク質、Ｏｔｈ＝その他、ＲＮＡ＝ｔＲＮＡ、ＴＲＡ＝トランスポザーゼ、ｉｎｔ＝インテグラーゼ、Ａｔｔ＝接着部位とラベル付けされている。図５Ｂは、Ｐｈａｓｔツールを用いて同定された２つのより低いスコアの「不完全」ファージまたは「疑わしい」ファージのうちの２番目のものを示す。推定遺伝子は、Ｈｙｐ＝仮想、ＰＬＰ＝他のファージ様タンパク質、Ｏｔｈ＝その他とラベル付けされている。予測されたＮｉｓｓｌｅファージ３配列（５９，０５６ｂｐ）の概略図である。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で用いられているファージ３ゲノム内のファージ３欠失の概念図である。例えばＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２に含まれるような、ノックアウト欠失を含む４９，４９６ｂｐのファージ３配列を示す概念図である。例えばＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で欠失されたように、ファージを不活性化するために欠失され得るファージのセクションの概念図である。他の大腸菌株の配列にアラインメントする４３ｋｂファージ３配列内の部分領域を示す概略図である。ファージ３として同定された配列を、ＮＣＢＩからダウンロードした５６９１の大腸菌および赤痢菌のゲノムアセンブリと比較した。左側の列には、分析において陽性であった大腸菌ゲノムの受託番号が列挙されている。図の上部には、配列の開始からのｋｂ数に応じたＤＮＡ配列の座標がある。線は、ファージ３のＤＮＡ配列とアラインメントする各特定の大腸菌ゲノム由来の配列を示す。略語：Ｅ．ｃｏｌｉ＝大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）；ｋｂ＝キロ塩基；ＮＣＢＩ＝米国国立生物工学情報センター；ＤＮＡ＝デオキシリボ核酸。他の大腸菌株の配列にアラインメントする４３ｋｂファージ３配列内の部分領域を示す概略図である。影付きのボックス内の領域は、ファージ３ノックアウト戦略における欠失のための部位として選択された。Ｒｅｆｓｅｑ由来の２８７の大腸菌ゲノムのセットにわたる予測された「インタクト」ファージの数の分布を示す棒グラフである。Ｒｅｆｓｅｑデータベースを、公開された完全な大腸菌ゲノム中に存在するインタクトファージの数について分析した。ヒストグラムは非正規分布を示しているが、ほとんどすべての大腸菌ゲノムがインタクトプロファージを含み、公開された完全な大腸菌ゲノムの大部分がＥｃＮよりも多くのインタクトプロファージを含むことは明らかである。略語：Ｅ．ｃｏｌｉ＝大腸菌；ＥｃＮ＝大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７；Ｒｅｆｓｅｑ＝基準配列。ファージ特異的ＰＣＲプライマーを検証するＤＮＡゲル電気泳動実験を示す図である。ＥｃＮゲノムＤＮＡに対するファージ１、２および３ならびにｒｐｏＢについてのＰＣＲプライマーペアの性能を示す。略語：ｂｐ＝塩基対；ＥｃＮ＝大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ；ｒｐｏＢ＝細菌ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット。ＡＴＣＣ１３７０６プラークプラグから増幅されたＥｃＮプロファージ領域を示すＤＮＡゲル電気泳動実験を示す図である。略語：ｂｐ＝塩基対；ＥｃＮ＝大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７；ｒｐｏＢ＝細菌ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニット。ＳＣフェニルアラニン注射の４時間後のベースラインに対する血中フェニーラニン濃度を、ＳＹＮ−ＰＫＵ７１０株とＳＹＮ−ＰＫＵ７０８株とで比較した図である。体重１ｇあたり０．１ｍｇの皮下注射により、マウスにフェニルアラニンを単回投与した。Ｐｈｅチャレンジの１、２および３時間後に、細菌（または水）を強制経口投与（３００μｌ／用量、合計３×ｅ１０ｃｆｕ／マウス）によってマウスに投与した。ＳＹＮ−ＰＫＵ７１０およびＳＹＮ−ＰＫＵ７０８におけるΔＰｈｅの減少率は、それぞれ２９％および４０％と計算された。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２におけるＴＣＡ産生（図１６Ａ）およびフェニルピルビン酸産生（図１６Ｂ）を示す折れ線グラフである。いずれも、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２によるｉｎｖｉｔｒｏでのフェニルアラニン分解の尺度である。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２は、好気的に（非誘導状態）またはＩＰＴＧおよびアラビノースを添加して嫌気的に（誘導状態）、溶原性ブロス（ＬＢ）中で増殖させることによって調製された。Ｉｎｖｉｔｒｏでは、フェニルアラニンの存在下での活性化ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のインキュベーションは、時間の経過とともにＴＣＡおよびＰＰの産生をもたらし、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２がフェニルアラニンを代謝することができることを実証している。図１７Ａおよび図１７Ｂは、ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅまたはファージフリー株ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（ファージフリーのＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０）のいずれかで強制経口投与されたマウスにおけるフェニルアラニンレベルの変化および馬尿酸の回収量を示す。マウスにフェニルアラニン（体重１ｇあたり０．１ｍｇ）を皮下注射により単回投与した。Ｐｈｅチャレンジの１、２および３時間後に、細菌（または水、示さず）を強制経口投与（３×２５０ｕｌ）によってマウスに投与した。各時点で顎下出血を介して全血を収集し、フェニルアラニンレベルについて分析した。代謝ケージでの尿収集は、最初の細菌投与の直後に開始され、研究期間中収集され続け、馬尿酸レベルについて分析された。Ｐｈｅチャレンジ後のフェニルアラニンレベルの変化（図１８Ａ）と、示された用量のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で処理した動物から採取した尿からの馬尿酸の回収量（図１８Ｂ）を示すグラフである。簡単に述べると、動物を代謝ケージに移し（ケージあたり３匹のマウス、群あたり２ケージ）、皮下注射によりフェニルアラニンの単回用量を投与した（体重１グラムあたり０．１ｍｇ）。Ｐｈｅチャレンジの１、２および３時間後に、１×１０^１１、５×１０^１０、２．５×１０^１０、１．２５×１０^１０、６．２５×１０^９、または３．１３×１０^９細胞の用量で、細菌を経口強制経口によってマウスに投与した。１×１０^１１細胞の最高用量で、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１をコントロール群（ｎ＝９）に強制経口投与した。Ｐｈｅチャレンジの４時間後まで、全ての動物から尿を収集した。血清Ｐｈｅの変化を決定するために、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で処置したマウスとＳＹＮ−ＰＫＵ９０１で処置したマウスの両方について、最高用量群（１×１０^１１細胞）でＴ＝０時間およびＴ＝４時間での顎下出血によって、血液を採取した。ファージ含有株ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３とファージフリー株ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１との間のｉｎｖｉｖｏ競合実験の結果を示すグラフである。マウスに等量（約３×１０^９の細胞）を３日間毎日投与した。実施例に記載されているように、毎日糞便ペレットを収集し、２つの株の異なる抗生物質耐性に基づいてプレーティングアッセイでＣＦＵを決定した。結果は、ＮｉｓｓｌｅのファージフリーＰＫＵ株ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐７１３とＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００１株との間で、輸送またはコロニー形成に大きな差異がないことを示している。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１の投与前後のさまざまな時点での２匹のブタにおける胃のフェニルピルビン酸の測定値を示すグラフである。非ヒト霊長類における経口トランス−ケイ皮酸から尿中馬尿酸への変換効率を示すグラフである。ＮＨＰ（ｎ＝６）に^１３Ｃ−トランス−ケイ皮酸（^１３Ｃ−ＴＣＡ）を経口投与し、６時間かけて尿を採取した。^１３Ｃ−馬尿酸（^１３Ｃ−ＨＡ）を質量分析によって測定した。投与された^１３Ｃ−ＴＣＡの関数としての回収された尿中^１３Ｃ−ＨＡのパーセンテージが計算され、その後の実験でＨＡ回収の正規化因子として用いられた。この因子は、ＨＡに変換されないか、または不完全な尿収集によって失われるＴＣＡを説明するため、株活性のより正確な説明を可能にする。図２２Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるプロファイリングおよび有効性を示すグラフである。図２２Ａでは、絶食させたＮＨＰ（ｎ＝６）に、５ｇのペプチド（左）もしくはモックチャレンジ（右）のみ（黒色バー）、または５ｇのペプチド（左）もしくはモックチャレンジ（右）を５×１０^１１細胞のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２とともに（ストライプバー）投与し、尿を６時間収集した。正規化されたＨＡ回収量は、平均±標準偏差として示されている。図２２Ａで実施された研究中にＳＹＮ−ＰＫＵを投与された動物はまた、ペプチドまたはモックチャレンジの１時間後に^１３Ｃ−フェニルアラニンを静脈内（ＩＶ）投与された（図２２Ｂ）。正規化された尿中^１３Ｃ−ＨＡ（これは、静脈内投与された^１３Ｃ−Ｐｈｅにのみ由来し得る）は、ペプチドチャレンジを投与された動物において見出され、黒色の棒として表示される。絶食させたままの動物では、尿中^１３Ｃ−ＨＡは回収されなかった。図２２Ｃでは、絶食させたＮＨＰは、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の投与のありまたはなしで、ｄ_５−フェニルアラニン（ｄ_５−Ｐｈｅ）を経口投与された。破線は投与されたｄ_５−Ｐｈｅの量を表す。ｄ_５−馬尿酸（ｄ_５−ＨＡ）は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（ストリップバー）を投与された動物にのみ見出された。データは、正規化されたｄ_５−ＨＡ回収量の平均±標準偏差（ｎ＝６）を表している。血清ｄ_５−Ｐｈｅは、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（薄い灰色の線）またはモック投与（濃い灰色の線）を受けたＮＨＰにおいて測定された（図２２Ｄ）。データは、ｄ_５−Ｐｈｅ濃度の平均±標準偏差（ｎ＝６）を表している。図２２Ｅでは、ＮＨＰは、ｄ_５−Ｐｈｅのみを投与されたか、またはｄ_５−ＰｈｅをＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の５×１０^１１個の細胞と共に投与された。血液を６時間にわたって収集し、血清ｄ_５−Ｐｈｅの曲線下面積を計算した。データは、ＡＵＣ±９０％信頼水準の上限および下限をそれぞれ示す。非ヒト霊長類の血清におけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２特異的代謝産物の検出を示すグラフである（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳを用いて、ｄ５‐ＨＡ（図２３Ａ）およびｄ５‐ＴＣＡ（図２３Ｂ）の血清濃度を、ｄ５‐ＰｈｅとＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２を経口投与した非ヒト霊長類において測定した。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の非存在下でｄ５−Ｐｈｅを投与した場合、検出可能なｄ５−ＨＡまたはｄ５−ＴＣＡは検出されなかった（データ示さず）。これらの代謝産物の存在は、これらの動物におけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２特異的活性を実証している。ＮＨＰにおけるトランス−ケイ皮酸の尿中馬尿酸への変換を示す図である（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が、健康な非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において経口投与されたときに、Ｐｈｅを代謝することを示すグラフである。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の強制経口投与は、放射性標識Ｐｈｅと一緒にタンパク質チャレンジを投与したときに観察される血中Ｐｈｅレベルのスパイクを低減する。図２６Ａ、図２６Ｂ、図２６Ｃ、および図２６Ｄは、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２およびタンパク質ミール（ｍｅａｌ）の単回投与時の、非ヒト霊長類におけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２用量依存的なＰｈｅの変換と血漿バイオマーカーの産生を示すグラフであり、ＮＨＰモデルにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の著しい活性および有効性を示している。絶食させたＮＨＰ（１用量群あたりｎ＝５）に、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の指示用量（ＣＦＵ）とともに５ｇのペプチドボーラスを投与した。尿を６時間にわたって収集し、血清を０、０．５、１、２、４および６時間で収集した。図２６Ａは、平均±標準偏差として示された、用量群からの正規化された尿中ＨＡ回収量を示すグラフである。図２６Ｂおよび図２６Ｃは、血清ＨＡおよび血清ＴＣＡの濃度について計算されたＡＵＣを示すグラフである。白色のバーは、平均ＡＵＣ±標準偏差を表す。図２６Ｄは、示された時点で決定された血清Ｐｈｅ濃度を示すグラフである。用量反応で投与された３つの最高用量は、これらの３つの用量が血清ＰｈｅのＡＵＣの有意な減少を示したので、細胞なしのコントロールと比較して示されている（ｐ＜０．０５）。ＮＨＰにおける、カゼインからのＰｈｅのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２用量依存的変換（図２７Ａ）、ＴＣＡレベル（図２７Ｂ）、および馬尿酸（図２７Ｃ）示すグラフである。血液代謝産物を６時間収集した。タンパク質摂取量の増加をもたらす、ＮＨＰにおけるＰｈｅのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２変換を示すグラフであり、当該タンパク質摂取量の増加は、ＰＫＵ患者のタンパク質摂取量の２．５倍の増加に相当する。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のｉｎｖｉｔｒｏ活性を示すグラフである。１×１０^８個の活性細胞を、５０ｍＭのＰｈｅアッセイ緩衝液中で、ＰＡＬ活性（濃い青棒、左のｙ軸）およびＬＡＡＤ活性（水色棒、右のｙ軸）について分析した。細胞を、Ｌ−アラビノースで（＋ａｒａ）、ＩＰＴＧで（＋ＩＰＴＧ）または嫌気性チャンバー中で（−Ｏ_２）プレ誘導し、ＴＣＡおよびＰＰの速度を、経時的なＴＣＡおよびＰＰ産生の線形回帰によって計算した。グラフには、３つの生物学的複製の平均および標準偏差が表示されている。 IｎｖｉｔｒｏでのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２増殖に対するｄａｐＡ欠失の効果を示すグラフである。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（ＥｃＮ）およびｄａｐＡ遺伝子中に突然変異を含むＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２の増殖を特徴づけるために、両方の株を、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ；１００μｇ／ｍＬ）を含む（＋）または含まない（−）ＬＢ中にて、３７℃で９６０分間、一定の振盪下でインキュベートした。ＯＤ６００を１０分毎に測定して、経時的な細胞増殖を評価した。３つの生物学的複製と２つの技術的複製の平均を、各時点についてプロットする。データは、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が増殖培地に外因性ＤＡＰを添加しないと増殖できないことを示している。ペプチドに対するＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のＰＡＬ活性を示したグラフである（図３１Ａおよび図３１Ｂ）。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２をバイオリアクター中で増殖させ、ＰＡＬおよびＬＡＡＤ活性について誘導した。活性化された細胞を、遊離Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅの形態の５０ｍＭＰｈｅを含むＰｈｅアッセイ培地中にて、または５ｇ／Ｌのペプトンもしくはトリプトン中にて、３７℃で６０分間インキュベートした。産生されたトランス‐ケイ皮酸（図３１Ａ）またはフェニルピルビン酸（図３１Ｂ）の総濃度をＬＣ‐ＭＳ／ＭＳにより経時的に決定し、ＴＣＡおよびＰＰの産生速度を線形回帰によって計算した。有意なＰＡＬ活性が全ての基質で観察された。ＬＡＡＤ活性は、遊離Ｐｈｅを基質として使用した場合にのみ観察され、複雑な基質であるペプトンまたはトリプトンを使用した場合には活性が少なくなった。グラフには、３つの生物学的複製の平均および標準偏差が示されている。さまざまな濃度のジアミノピメリン酸におけるジアミノピメリン酸栄養要求株であるＳＹＮ７６６の増殖特性を示すグラフである。ＳＹＮ７６６（大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７、ΔｄａｐＡ）を、一定の振盪下で、３７℃で９６０分間、減少する濃度のＤＡＰを含む増殖培地中でインキュベートした。経時的な細胞増殖を評価するために、ＯＤ６００を１０分毎に測定した。３つの生物学的複製の平均を、各時点についてプロットする。ジアミノピメリン酸を含まないＬＢ増殖培地における大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのさまざまな株の増殖特性を示すグラフである。ＤＡＰの非存在下でのＥｃＮのさまざまな改変株の増殖特性を特徴付けるために、培養物を、ＤＡＰを含まないＬＢ中、３７℃で９６０分間、一定の振盪下でインキュベートした。経時的な細胞増殖を評価するために、ＯＤ６００を１０分毎に測定した。３つの生物学的複製および２つの技術的複製の平均を、各時点についてプロットする。１００μｇ／ｍＬのジアミノピメリン酸を含むＬＢ増殖培地におけるＥｃＮのさまざまな株の増殖特性を示すグラフである。ＤＡＰの存在下でのＥｃＮのさまざまな改変株の増殖特性を特徴付けるために、それらを、１００μｇ／ｍＬのＤＡＰを含む増殖培地中、３７℃で９６０分間、絶えず振盪しながらインキュベートした。経時的な細胞増殖を評価するために、ＯＤ６００を１０分毎に測定した。３つの生物学的複製の平均を、各時点についてプロットする。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥｃＮの生存および輸送に対するＤＡＰ栄養要求性およびＰｈｅ分解活性の効果を示す図である（図３５Ａ、Ｂ、およびＣ）。図３５Ａは、群１のマウス（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１／ＳＹＮ７６６）における糞便クリアランスに対するＤＡＰ栄養要求性の効果を示す。図３５Ｂは、群２のマウス（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１／ＳＹＮ３２８２）における糞便クリアランスに対するＰｈｅ分解についての遺伝子操作の効果を示す。図３５Ｃは、群３のマウス（ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１／ＳＹＮ３２８２）における糞便クリアランスに対するＰｈｅ分解およびＤＡＰ栄養要求性についての遺伝子操作の効果を示す。混合用量の細菌をＣ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に経口投与した。投与された細菌の数を決定するために、ＣＦＵカウントのために用量を４連で（ｉｎｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）プレーティングした。各時点で、糞便を収集し、ホモジナイズし、抗生物質選択培地での細菌ＣＦＵ決定のためにプレーティングした。各時点について、データは５つの糞便サンプルの平均ＣＦＵ／ｍｇカウント±標準偏差を表し、付録に別段の記載がない限り、投与した最初のＣＦＵの割合として各株について正規化されている。この正規化により、Ｔ＝０で投与された各株の実際のＣＦＵが変動しても、群内の２つの株の間の生存／クリアランスの直接的な比較が可能になる。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥｃＮ輸送およびクリアランスに対するＤＡＰ栄養要求性およびＰｈｅ分解活性の効果を示す図である（図３６Ａ〜Ｆ）。ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１またはＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１をＣ５７ＢＬ／６マウスに経口投与した（９×１０^９ＣＦＵ／用量、ｎ＝３／時点）。示された時間に、胃（Ａ）、上部小腸（Ｂ）、中小腸（Ｃ）、下部小腸（Ｄ）、盲腸（Ｅ）および結腸（Ｆ）からの流出液を収集し、ＣＦＵカウントのためにプレーティングした。ＣＦＵの決定は、抗生物質選択培地での微量希釈によって行われた。各時点について、データは、３つの流出液サンプルから決定されたＣＦＵ±標準偏差を表す。投与後４８時間では、いずれのサンプルにおいてもＣＦＵは測定されず、完全な細菌クリアランスを示した。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２ゲノムの概略図である。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２におけるゲノム改変部位の位置が示され、ｋｂｐの指定は、０／５．４Ｍｂ参照マーカーに対する染色体の位置を示している。染色体の複製起点を赤色の線で示す。緑色のテキストボックスはＰｈｅＰ遺伝子の挿入を示し、紫色のテキストボックスはＰＡＬ遺伝子の挿入を示し、オレンジ色のテキストボックスはＬＡＡＤ遺伝子の挿入を示し、Δ記号の付いた灰色のテキストボックスはｄａｐＡおよびΦ欠失の位置を示す。括弧内のイタリック体の遺伝子名は、挿入された遺伝子を囲む上流および下流の遺伝子を指す。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２およびタンパク質ミール（ｍｅａｌ）の単回投与時の、非ヒト霊長類におけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２用量依存的なＰｈｅの変換と血漿バイオマーカーの産生を示す図であり、ＮＨＰモデルにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の著しい活性および有効性を示している。絶食させたＮＨＰ（１用量群あたりｎ＝５）に、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の指示用量（ＣＦＵ）とともに５ｇのペプチドボーラスを投与した。時間０での投与後、０、０．５、１、２、４および６時間で血漿を収集した。各点は、投与後の時点で血漿中において測定されたＨＡ濃度を表す。標準偏差は、各点における縦棒として示されている。非ヒト霊長類の胃腸管内でのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１の特性評価を示す図である。カニクイザルに５．５グラムのペプトン、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウム、２５ｍｇ／ｋｇのＤ５−フェニルアラニン、およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１を投与し、投与後０．５時間または２時間で安楽死させた。安楽死させた後、胃腸管のさまざまなセクションから組織サンプルを収集し、分析して、各セクションにおけるＰｈｅおよびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１の濃度を決定した。

一態様では、本開示は、内因性ファージを含み、ファージ配列に対する１つ以上の改変を含む細菌を提供する。いくつかの実施形態では、改変はプロファージ配列の特性を変化させる。このような突然変異は、１つ以上のファージ遺伝子の１つ以上の部分的または完全な欠失、１つ以上のファージ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の挿入、ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の１つ以上の部分的または完全な置換、１つ以上のファージ遺伝子の１つ以上の逆位、またはそれらの組み合わせを含む。

本開示は、障害の処置のための新規な細菌を含む組成物を提供し、当該細菌はそれらの自然状態において１つ以上のバクテリオファージまたはプロファージを含む。いくつかの実施形態では、細菌は、１つ以上のファージのゲノムに対する１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変は、ファージまたはプロファージを不活性にする。いくつかの実施形態では、これらの細菌は、１つ以上のエフェクター分子の発現または産生のための１つ以上の遺伝子を含むように、さらに遺伝子改変される。障害の処置のための新規な治療におけるこれらの遺伝子操作された細菌の生産および使用のための方法が提供される。

一実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは、遺伝子操作された細菌の出発点、親株、または「シャシー（ｃｈａｓｓｉｓ）」として使用される。一実施形態では、改変されたバクテリオファージは、そのファージにおいて大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに内因性であるファージであり、その自然状態で細菌中に存在する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のエフェクター（例えば、ＰＭＥ）をコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬをコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤをコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬをコードする１つ以上の遺伝子およびＬＡＡＤをコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）をコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）をコードする１つ以上の遺伝子およびＰＡＬをコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）をコードする１つ以上の遺伝子およびＬＡＡＤをコードする１つ以上の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）をコードする１つ以上の遺伝子、ＬＡＡＤをコードする１つ以上の遺伝子、およびＰＡＬをコードする１つ以上の遺伝子を含む。前述の実施形態のいずれかにおいて、フェニルアラニンの消費のための遺伝子操作された細菌は、その元の状態に対して１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、内因性バクテリオファージゲノム。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において突然変異されている。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または１つ以上のバクテリオファージ遺伝子を含む。

バクテリオファージは世界で最も一般的な生物学的実体であり、グラム陽性およびグラム陰性の両方の細菌種の大部分が、細菌染色体中にいわゆるプロファージとして組み込まれている１つ以上のＤＮＡバクテリオファージを含むことが十分に実証されている（Ｃｌｏｋｉｅら、ＰｈａｇｅｓｉｎＮａｔｕｒｅ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ．２０１１年１月−２月；１（１）：３１−４５頁）。例えば、大腸菌株に関する２つの別々の研究では、分析された２７の大腸菌株から５１の異なる機能性ファージが放出され、試験された１０７の大腸菌株のうち８３が少なくとも１つの機能性ファージタイプを放出することが示された（Ｃａｓｊｅｎｓ，Ｐｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｗｈａｔｈａｖｅｗｅｌｅａｒｎｅｄｓｏｆａｒ？；ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３年７月；４９（２）：２７７−３００頁；Ｏｓａｗａら，ＧｅｎｏｔｙｐｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｓｏｆＳｈｉｇａｔｏｘｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇｐｈａｇｅｓｆｒｏｍｅｎｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＯ１５７：Ｈ７ｉｓｏｌａｔｅｓ；ＪＭｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００１年）４９：５６５−５７４頁、およびＳｃｈｉｃｋｌｍａｉｅｒら，ＡｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｐｒｏｐｈａｇｅｓａｍｏｎｇｎａｔｕｒａｌｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａａｎｄＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｗｉｔｈｅｍｐｈａｓｉｓｏｎｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ．ＡｎｔｏｎｉｅＶａｎＬｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ（１９９８年）７３：４９−５４頁）。

図１２に示すように、ほとんどすべての大腸菌ゲノムはインタクトプロファージを含み、公開されている完全な大腸菌ゲノムの大部分はＥｃＮよりも多くのインタクトプロファージを含む。略語：Ｅ．ｃｏｌｉ＝大腸菌；ＥｃＮ＝大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７；Ｒｅｆｓｅｑ＝基準配列。

グラム陽性菌の中で、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）、および他の多くのゲノムは、ほとんどインタクトなプロファージを含むことが示されている（Ｋｕｎｓｔら、１９９７年；Ｂｏｌｏｔｉｎら、Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅｂａｃｔｅｒｉｕｍＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２００１年）３９０：２４９−２５６頁；Ｎｏｌｌｉｎｇら、Ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｓｏｌｖｅｎｔ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ．ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ（２００１年）１８３：４８２３−４８３８頁；Ｂｏｌｏｔｉｎら、ＴｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｌａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉｕｍＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓＩＬ１４０３．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ（２００１年）１１：７３１−７５３頁）。

ＤＮＡファージは、溶菌性であっても、テンペレート（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）であってもよい。溶菌性ファージは細菌細胞に感染し、次いで、子孫ファージの合成をプログラムし、その後、当該子孫ファージが溶解した細胞から放出される。逆に、テンペレートＤＮＡファージは、宿主細菌との安定な関係を確立する。この関係では、組み込まれたファージＤＮＡ（すなわち、プロファージ）が宿主のゲノムと協調して複製され、宿主に損傷を与えるファージ遺伝子は発現しない。しかしながら、バクテリオファージ粒子は、誘導と呼ばれるプロセスによってインタクトプロファージを含む細胞から放出され得、その誘導の間に、溶菌増殖に必要なプロファージ遺伝子がオンになり、子孫ファージ粒子が産生され、細胞の溶解によって細胞から放出される（Ｃａｓｊｅｎｓ，Ｐｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｗｈａｔｈａｖｅｗｅｌｅａｒｎｅｄｓｏｆａｒ？；ＭｏｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３年７月；４９（２）：２７７−３００頁において概説されている）。誘導は、場合によっては、プロファージを含む細菌のごく一部または大部分において自発的かつランダムに起こり得るか、または、特異的な、多くの場合未定義の環境シグナルが、多くの細胞において特定のプロファージの同時誘導を引き起こし得、細菌細胞の死をもたらす。いくつかの場合には、プロファージ配列の存在はまた、いくつかの細菌がファージなしでは有さない特性（例えば、抗生物質耐性、さまざまな環境条件で存在する能力、接着の改善、病原性、または遺伝子の水平伝播の促進）を有することを可能にし得る（Ｃａｓｊｅｎｓら、２００１年）。

全てのプロファージが溶菌サイクルを経る能力を有するわけではない。非機能性プロファージ、すなわち、欠陥プロファージまたはクリプティックプロファージは、突然変異崩壊および／または何千回もの細菌複製サイクルにわたる溶菌サイクルに必須の１つ以上の遺伝子の喪失の結果として、多くの細菌において高レベルの存在量に達し得る（Ｂｏｂａｙら、Ｐｅｒｖａｓｉｖｅｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｆｅｃｔｉｖｅｐｒｏｐｈａｇｅｓｂｙｂａｃｔｅｒｉａ，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．２０１４年８月１９日；１１１（３３）：１２１２７−１２１３２頁、およびその中の参考文献）。注目すべきことに、欠陥プロファージはまた、多くの場合、相同組換え機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、さらなる感染の予防またはバクテリオシンを含む、宿主に有利な機能を提供することができる多くの遺伝子を含み、これらは、例えば他の隣接する細菌種の増殖抑制を通じて、栄養素の競争に役立つ可能性がある。

ファージは、多くの方法で、大腸菌における遺伝子発現および適応度にプラスの影響を及ぼすことができる。クリプティックファージ、溶原性ファージ、および溶菌性ファージは、悪環境条件下での生存を促進する複数の利益を宿主にもたらすことが示されている。例えば、ファージによって細菌に導入された遺伝子配列は、異なる栄養素もしくは異なるニッチへの適応、または競合株を排除する能力の増加に関連付けられている。休眠性プロファージはまた、別のファージ（例えば、溶菌性ファージ）による重複感染を防ぐことが示されている。

いくつかの研究は、内因性ファージが特定の炭素源で増殖する細菌の能力に影響を与えることを示している。ラムダに加えて、活性なＭｕ、Ｐ１およびＰ２プロファージならびにクリプティックプロファージＣＰ４−５７は、グルコース制限条件および他の増殖条件下で増殖を増加させる（Ｅｄｌｉｎ，Ｇ．，Ｌｉｎ，Ｌ．＆Ｂｉｔｎｅｒ，Ｒ．ＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅｆｉｔｎｅｓｓｏｆＰ１，Ｐ２，ａｎｄＭｕｌｙｓｏｇｅｎｓｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２１，５６０−５６４頁（１９７７年）；Ｅｄｌｉｎ，Ｇ．，Ｌｉｎ，Ｌ．＆Ｋｕｄｍａｒ，Ｒ． λ ＬｙｓｏｇｅｎｓｏｆＥ．ｃｏｌｉｒｅｐｒｏｄｕｃｅｍｏｒｅｒａｐｉｄｌｙｔｈａｎｎｏｎ−ｌｙｓｏｇｅｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ２５５，７３５−７３７頁（１９７５年）；Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｋｉｍ，Ｙ．＆Ｗｏｏｄ，Ｔ．Ｋ．ＣｏｎｔｒｏｌａｎｄｂｅｎｅｆｉｔｓｏｆＣＰ４−５７ｐｒｏｐｈａｇｅｅｘｃｉｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｂｉｏｆｉｌｍｓ．ＩＳＭＥＪ．３，１１６４−１１７９頁（２００９年））。別の研究では、λが大腸菌ゲノムに組み込まれると、貧弱な炭素源で増殖する細胞の能力が停止することが示された。この場合、代謝の制限は、細菌に生存利益を付与し得る。グルコースが乏しい環境で細菌の増殖を遅らせることは、細菌が免疫系による検出を逃れるのを助け、生存の可能性を高める可能性がある。

他の生存特性も同様に影響され得る。Ｗａｎｇらは、９つのクリプティックプロファージのすべてを欠く単一の大腸菌株を作製した。この研究では、これらのプロファージが、浸透圧、酸化および酸のストレスに耐えるために、さまざまな条件下での増殖を増加させ、リンおよび窒素の利用を増強するために、ならびにバイオフィルム形成に影響を与えるために有益であることが示された（Ｗａｎｇら、Ｃｒｙｐｔｉｃｐｒｏｐｈａｇｅｓｈｅｌｐｂａｃｔｅｒｉａｃｏｐｅｗｉｔｈａｄｖｅｒｓｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１１４６）。病原性細菌プロファージでは、いくつかの研究により、獲得が病原菌の毒性の変化と関連することが示唆されている。

したがって、当業者は、改変、例えば、内因性プロファージの一部または全体の突然変異または欠失が、細菌の適応度を変化させ得る（例えば、ネガティブな影響を与え得る）ことを期待し得る。さらに、内因性プロファージが、このエフェクターを産生することができる遺伝子操作された細菌において、エフェクター活性を変化させ得る（例えば、ネガティブな影響を与え得る）と考える人がいるかもしれない。これは、内因性プロファージが特定の菌株亜型の全ての検体に存在する場合に特に当てはまる−これは、プロファージ配列を含む細菌が、そのプロファージを欠く細菌の形態を進化的に打ち負かすことができたことを示している。

本開示においてさらに記載されるように、特定の条件下で溶解を経ることができ、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのすべての検体に存在する、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ中のプロファージが同定された。驚くべきことに、細菌の適応度、滞留時間および活性の試験は、内因性ファージにおける突然変異または欠失を含む細菌が本質的に同じである（例えば、少なくとも同程度の大きさである）ことを示した。

同様のアッセイ条件下では、株間でＰｈｅ分解活性（ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏでの）に識別可能な差異はなかった。例えば、同様のアッセイ条件下では、Ｐｈｅ消費は２つの株の間で同じ大きさである（例えば、図１５および図１７Ａを参照のこと）。ファージ含有株とファージフリー株との間のｉｎｖｉｖｏ競合研究は、ＮｉｓｓｌｅのファージフリーＰＫＵ株の間で輸送またはコロニー形成に識別可能な差異がないことを示している（例えば、図１９を参照のこと）。

したがって、いくつかの実施形態では、ファージのゲノムにおける１つ以上の改変、例えば、突然変異または欠失または本明細書に記載の他の改変は、改変または遺伝子操作された細菌の細菌適応度を変化させない。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ改変、例えば、突然変異または欠失または本明細書に記載の他の改変を含む操作された細菌は、ファージ突然変異の非存在下の対応する同質遺伝子株と本質的に同じまたは少なくとも類似の細菌適応度を有する。さらなる実施形態では、ファージのゲノムにおける１つ以上の改変、例えば、突然変異または欠失または本明細書に記載の他の改変は、ファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較して、エフェクターを産生することができる操作された細菌の株活性（例えば、エフェクター活性または代謝活性）を変化させない。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ改変、例えば、突然変異または欠失または本明細書に記載の他の改変を含む非改変細菌または遺伝子操作された細菌は、ファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較した場合、本質的に同じまたは少なくとも類似の細菌株活性（例えば、エフェクター活性または代謝活性）を有する。

さらに、いくつかの実施形態では、ファージゲノムにおける１つ以上の改変、例えば、突然変異または欠失または本明細書に記載の他の改変は、操作された細菌の細菌適応度を変化させる（例えば、増加または減少させる）。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ改変、例えば、突然変異または欠失または本明細書に記載の他の改変を含む操作された細菌は、ファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較して、変化した（例えば、減少または増加した）細菌適応度を有する。いくつかの実施形態では、ファージのゲノムにおける１つ以上の改変、例えば、突然変異または欠失または本明細書に記載の他の改変は、ファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株と比較して、エフェクターを産生することができる細菌の株活性（例えば、エフェクター活性または代謝活性）を変化させる（例えば、減少または増加させる）。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ改変、例えば、突然変異または欠失または本明細書に記載の他の改変を含む非改変細菌または遺伝子操作された細菌は、ファージ突然変異を有さない対応する同質遺伝子株として、変化（例えば、減少または増加）した細菌株活性（例えば、エフェクター活性または代謝活性）を有する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ（例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ファージ３における１つ以上の突然変異を含む。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のファージ３遺伝子内に位置するか、または１つ以上のファージ３遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入物は抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子を含む：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全な欠失または部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

本開示がより容易に理解され得るために、特定の用語が最初に定義される。これらの定義は、本開示の残りの部分を考慮して、および当業者によって理解されるように読まれるべきである。他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。さらなる定義が詳細な説明の全体を通して記載されている。

「高フェニルアラニン血症（Ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｉａ）」、「高フェニルアラニン血症（ｈｙｐｅｒｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｍｉｃ）」、および「過剰なフェニルアラニン」は、体内の増加したまたは異常に高い濃度のフェニルアラニンを指すために本明細書において交換可能に使用される。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症の診断シグナルは、少なくとも２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｄＬ、または少なくとも２５ｍｇ／ｄＬの血中フェニルアラニンレベルである。本明細書において使用される場合、高フェニルアラニン血症に関連する疾患には、限定されないが、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、および瀬川病が含まれる。罹患者は、進行性および不可逆性の神経学的欠損、精神遅滞、脳症、てんかん、湿疹、低成長（ｒｅｄｕｃｅｄｇｒｏｗｔｈ）、小頭症、振戦、四肢痙攣、および／または低色素沈着を患う可能性がある（Ｌｅｏｎａｒｄ２００６年）。高フェニルアラニン血症はまた、他の状態、例えば肝疾患に続発する可能性がある。

「フェニルアラニンアンモニアリアーゼ」および「ＰＡＬ」は、フェニルアラニンをトランス−ケイ皮酸およびアンモニアに変換または処理するフェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）を指すために使用される。トランス−ケイ皮酸は、毒性が低く、哺乳動物における肝臓酵素によって、尿中に分泌される馬尿酸に変換される。ＰＡＬは、過剰のフェニルアラニンを代謝するための酵素ＰＡＨの代わりになり得る。ＰＡＬ酵素活性はＴＨＢ補因子活性を必要としない。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは原核生物種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。代替の実施形態では、ＰＡＬは真核生物種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、限定されないが、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を含む、細菌種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、アナベナ・バリアビリスに由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされ、本明細書において「ＰＡＬ１」と称される（Ｍｏｆｆｉｔｔら、２００７年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、フォトラブダス・ルミネセンスに由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされ、本明細書において「ＰＡＬ３」と称される（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、２００５年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、酵母種、例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる（Ｇｉｌｂｅｒｔら、１９８５年）。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、植物種、例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる（Ｗａｎｎｅｒら、１９９５年）。ＰＡＬの任意の適切なヌクレオチドおよびアミノ酸配列、またはその機能性断片が使用され得る。

「フェニルアラニンヒドロキシラーゼ」および「ＰＡＨ」は、補因子テトラヒドロビオプテリンと併せてヒト体内でチロシンを作製するために、フェニルアラニンの芳香族側鎖のヒドロキシル化を触媒する酵素を指すために使用される。ＰＡＨをコードするヒト遺伝子は、２２位と２４．２位との間の第１２染色体の長（ｑ）腕に位置する。ＰＡＨのアミノ酸配列は哺乳動物の間で高度に保存されている。ヒトおよび哺乳動物ＰＡＨについての核酸配列は周知であり、広く利用可能である。ＰＡＨについての完全長ヒトｃＤＮＡ配列は１９８５年に報告された（Ｋｗｏｋら、１９８５年）。ＰＡＨの活性断片もまた周知である（例えば、Ｋｏｂｅら、１９９７年）。

「Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ」および「ＬＡＡＤ」は、それらのそれぞれのケト酸、アンモニア、および過酸化水素を生成するために、Ｌ−アミノ酸の立体特異的酸化的脱アミノ化を触媒する酵素を指すために使用される。例えば、ＬＡＡＤはフェニルアラニンのフェニルピルビン酸への変換を触媒する。多数のＬＡＡＤ酵素が当該分野において公知であり、それらの多くは、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、およびモルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）などの細菌、または毒液に由来する。ＬＡＡＤはフェニルアラニン分解の速い反応速度を特徴とする（Ｈｏｕら、ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌ．２０１５年１０月；９９（２０）：８３９１〜４０２頁；「ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃａｃｉｄｆｒｏｍＬ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｕｓｉｎｇａｎＬ−ａｍｉｎｏａｃｉｄｄｅａｍｉｎａｓｅｆｒｏｍＰｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｅｎｚｙｍａｔｉｃａｎｄｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」）。大部分の真核生物および原核生物のＬ−アミノ酸デアミナーゼは細胞外であるが、プロテウス種ＬＡＡＤは、細胞膜（内膜）に局在し、酵素活性が存在するペリプラズム間隙の外側を向いている。この局在化の結果として、内膜を通る細胞質へのフェニルアラニン輸送は、プロテウス属ＬＡＡＤにより媒介されるフェニルアラニン分解に必要とされない。フェニルアラニンは、トランスポーターを必要とせずに外膜を通してペリプラズムに容易に取り込まれ、基質の利用可能性を改善するトランスポーターの必要性を取り除く。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、限定されないが、プロテウス属、プロビデンシア属、およびモルガネラ属の細菌を含む、細菌種に由来するＬＡＡＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌種は、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるＬＡＡＤは細胞膜に局在し、ペリプラズム間隙に面しており、ペリプラズム間隙において触媒活性が発生する。

「フェニルアラニン代謝酵素」または「ＰＭＥ」は、フェニルアラニンを分解することができる酵素を指すために使用される。当該技術分野において公知の任意のフェニルアラニン代謝酵素は、遺伝子操作された細菌によってコードされ得る。ＰＭＥには、限定されないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが含まれる。

フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼまたはアミノトランスフェラーゼとの反応は補因子を必要とするが、ＬＡＡＤおよびＰＡＬはさらなる補因子を全く必要としない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるＰＭＥは補因子を必要とする。いくつかの実施形態では、この補因子は、遺伝子操作された細菌の投与と同時にまたは連続して提供される。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は補因子を産生することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はアミノトランスフェラーゼをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされるＰＭＥは補因子を必要としない。理論に束縛されるものではないが、補因子の必要性がないことは、酵素によるフェニルアラニン分解の速度が基質の利用可能性に依存し、補因子の利用可能性によって制限されないことを意味する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によって産生されるＰＭＥはＰＡＬである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によって産生されるＰＭＥはＬＡＡＤである。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＭＥの組合せをコードする。

いくつかの実施形態では、ＰＭＥの触媒活性は酸素レベルに依存する。いくつかの実施形態では、ＰＭＥは微好気性条件下で触媒的に活性である。非限定的な例として、ＬＡＡＤ触媒活性は酸素に依存する。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤは微好気性条件などの低酸素条件下で活性である。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＭＥは、例えば結腸に見出されるような非常に低いレベルの酸素で、または酸素の非存在下で機能する。非限定的な例として、ＰＡＬ活性は酸素の存在に依存しない。

本明細書中で使用される場合、「エフェクター」または「エフェクター分子」は、所望の機能を発揮する代謝産物またはポリペプチドのような分子を指し得る。エフェクターは、単一の遺伝子によってコードされ得る。例えば、単一の遺伝子は、分泌またはディスプレイされるポリペプチドをコードし得る。あるいは、エフェクターは複数の遺伝子を必要とする生合成経路によって合成され得る（例えば、ブチラート）。例えば、所望の特性を有する代謝産物を合成する、生合成経路内の複数の遺伝子によってコードされるポリペプチドもエフェクターと呼ばれ得る。同様に、例えば、毒性代謝産物の分解のために、異化経路内の複数の遺伝子によってコードされるポリペプチドもエフェクターと呼ばれ得る。これらのエフェクター分子はまた、「治療用代謝産物」、「治療用分子」または「治療用ポリペプチド」と呼ばれ得る。本明細書においてエフェクターと互換的に使用される他の用語は、「目的のポリペプチド」または「目的のポリペプチド（複数）」、「目的のタンパク質」、「目的のタンパク質（複数）」である。

本明細書中で使用される場合、「ペイロード」は、細菌などの遺伝子操作された微生物によって産生される１つ以上の目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ペイロードは、１つもしくは複数の遺伝子またはオペロンによってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードを含む１つ以上の遺伝子および／またはオペロンは、微生物に対して内因性である。いくつかの実施形態では、ペイロードの１つ以上の要素は、異なる微生物および／または生物に由来する。いくつかの実施形態では、ペイロードは治療用ペイロードである。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子の生合成のための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子の代謝、異化、または分解のための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子のインポートのための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、分子のエクスポートのための遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、ペイロードは、調節分子、例えばＦＮＲなどの転写調節因子である。いくつかの実施形態では、ペイロードは、プロモーターまたはリプレッサーなどの調節要素を含む。いくつかの実施形態では、ペイロード発現は、ＦＮＲＳなどの誘導性プロモーターから駆動される。いくつかの実施形態では、ペイロード発現は、構成的プロモーターから駆動される。いくつかの実施形態では、ペイロードは、死滅スイッチなどのリプレッサー要素を含む。代わりの実施形態では、ペイロードは、生合成経路または生化学的経路によって産生され、当該生合成経路または生化学的経路は任意に微生物に対して内因性であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された微生物は、２つ以上のペイロードを含む。

本発明は、とりわけ、遺伝子操作された細菌、その医薬組成物、ならびに高フェニルアラニン血症に関連する障害をモジュレートおよび処置する方法を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、非天然フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子を含み、哺乳動物においてフェニルアラニンを処理および減少させることができる。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌はまた、ＬＡＡＤをコードする遺伝子を含み得る。操作された細菌はまた、バイオセイフティーおよび／または生物学的封じ込め、例えば、死滅スイッチ、遺伝子ガードシステム、および／または栄養要求性に関連する１つ以上の遺伝子配列を含み得る。これらの遺伝子配列の発現は、種々のプロモーター系、例えば、本明細書中に開示されるプロモーター系のいずれかを使用して調節され得、該プロモーターは、１つ以上の異なる遺伝子を調節する同じプロモーターであり得るか、異なる遺伝子を調節する同じプロモーターの異なるコピーであり得るか、または異なる遺伝子の発現を調節するために組み合わせて使用される異なるプロモーターの使用を含み得る。遺伝子発現を制御するための異なる調節系またはプロモーター系の使用は柔軟性（例えば、異なる環境条件下で遺伝子発現を差次的に制御する能力、および／または遺伝子発現を時間的に差次的に制御する能力）を与え、かつ遺伝子発現を「微調整」する能力も与え、当該調節のいずれかまたは全ては、遺伝子発現および／または細菌の増殖を最適化するのに役立ち得る。遺伝子操作された細菌およびそれらの細菌を含む医薬組成物は、ＰＫＵを含む高フェニルアラニン血症に関連する状態を処置および／または予防するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用され得る。特定の態様では、遺伝子操作された細菌を含む組成物は、高フェニルアラニン血症に関連する障害を処置および／または予防するために、本開示の方法において使用され得る。

エフェクター分子はまた、抗癌分子を含む。「抗癌分子」は、遺伝子操作された微生物（例えば、操作された細菌または操作された腫瘍溶解性ウイルス）によって産生される１つ以上の目的の治療用物質または薬物を指し、これらは、細胞の増殖または複製を減少および／または阻害することができる。いくつかの実施形態では、抗癌分子は、癌をモジュレートまたは処置するのに有用な治療用分子である。いくつかの実施形態では、抗癌分子は、遺伝子によってコードされる治療用分子である。代わりの実施形態では、抗癌分子は、生化学的または生合成経路によって産生される治療用分子であり、当該生合成経路または生化学的経路は任意に微生物に対して内因性であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された微生物は、２つ以上の抗癌分子を産生することができる。抗癌分子の非限定的な例には、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ−４抗体、ＰＤ−１抗体、ＰＤＬ−１抗体）、細胞毒性剤（例えば、ＣｌｙＡ、ＦＡＳＬ、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ−α）、免疫刺激性サイトカインおよび共刺激性分子（例えば、ＯＸ４０、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＣＬ２１、ＩＬ−２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２１、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）、抗原および抗体（例えば、腫瘍抗原、ネオ抗原、ＣｔｘＢ−ＰＳＡ融合タンパク質、ＣＰＶ−ＯｍｐＡ融合タンパク質、ＮＹ−ＥＳＯ−１腫瘍抗原、ＲＡＦ１、免疫抑制分子に対する抗体、抗ＶＥＧＦ、抗ＣＸＲ４／ＣＸＣＬ１２、抗ＧＬＰ１、抗ＧＬＰ２、抗ガレクチン１、抗ガレクチン３、抗Ｔｉｅ２、抗ＣＤ４７、免疫チェックポイントに対する抗体、免疫抑制性サイトカインおよびケモカインに対する抗体）、ＤＮＡトランスファーベクター（例えば、エンドスタチン、トロンボスポンジン−１、ＴＲＡＩＬ、ＳＭＡＣ、Ｓｔａｔ３、Ｂｃｌ２、ＦＬＴ３Ｌ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、ＡＦＰ、ＶＥＧＦＲ２）、および酵素（例えば、大腸菌ＣＤ、ＨＳＶ−ＴＫ）が含まれる。いくつかの実施形態では、抗癌分子には、ＲＮＡ干渉、ｍｉｃｒｏＲＮＡ応答または阻害、ＴＬＲ応答、アンチセンス遺伝子調節、標的タンパク質結合（アプタマーまたはデコイオリゴ）、ＣＲＩＳＰＲ干渉などの遺伝子編集を媒介する核酸分子が含まれる。いくつかの実施形態では、細菌またはウイルスは、例えばバクトフェクション（ｂａｃｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）によって、ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入するためのベクターとして使用され得る（Ｂｅｒｎａｒｄｅｓら、２０１３年）。

エフェクター分子の非限定的な例には、「抗炎症性分子」および／または「消化管バリア機能エンハンサー分子」が含まれる。抗炎症性分子および／または消化管バリア機能エンハンサー分子としては、短鎖脂肪酸、ブチラート、プロピオネート、アセテート、ＩＬ−２、ＩＬ−２２、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ＧＬＰ−２および類似体、ＧＬＰ−１、ＩＬ−１０、ＩＬ−２７、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、Ｎ−アシルホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）、エラフィン（ペプチダーゼインヒビター３およびＳＫＡＬＰとも呼ばれる）、トレフォイル因子、メラトニン、トリプトファン、ＰＧＤ_２、およびキヌレン酸、インドール代謝産物、および他のトリプトファン代謝産物、ならびに本明細書中に開示される他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。このような分子には、炎症促進性分子を阻害する化合物、例えば、一本鎖可変抗体（ｓｃＦｖ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、および／もしくはケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ−８およびＣＣＬ２）を中和するｓｈＲＮＡが含まれる。このような分子には、本明細書中に記載されるような、（例えば、ＩＬ−２２産生をもたらす）ＡＨＲアゴニスト（例えば、インドール酢酸、インドール−３−アルデヒド、およびインドール）およびＰＸＲアゴニスト（例えば、ＩＰＡ）も含まれる。このような分子には、ＨＤＡＣ阻害剤（例えば、ブチラート）、ＧＰＲ４１および／またはＧＰＲ４３の活性化因子（例えば、ブチラートおよび／またはプロピオネートおよび／またはアセテート）、ＧＰＲ１０９Ａの活性化因子（例えば、ブチラート）、ＮＦ−ｋａｐｐａＢシグナル伝達の阻害剤（例えば、ブチラート）、ＰＰＡＲγのモジュレーター（例えば、ブチラート）、ＡＭＰＫシグナル伝達の活性化因子（例えば、アセテート）、およびＧＬＰ−１分泌のモジュレーターも含まれる。このような分子には、ヒドロキシルラジカル捕捉剤および酸化防止剤（例えば、ＩＰＡ）も含まれる。分子は、主に抗炎症性（例えば、ＩＬ−１０）、または主に消化管バリア機能増強性（例えばＧＬＰ−２）であり得る。分子は、抗炎症性および消化管バリア機能増強性の両方であり得る。抗炎症性および／または消化管バリア機能エンハンサー分子は、単一の遺伝子によってコードされてもよく、例えば、エラフィンはＰＩ３遺伝子によってコードされる。あるいは、抗炎症性および／または消化管バリア機能エンハンサー分子は、複数の遺伝子、を必要とする生合成経路によって合成されてもよい（例えば、ブチラート）。

エフェクター分子には、代謝エフェクター分子も含まれる。「代謝エフェクター分子」および／または「満腹エフェクター分子（ｓａｔｉｅｔｙｅｆｆｅｃｔｏｒｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」には、ｎ−アシル−ホスファチジルエタノールアミン（ＮＡＰＥ）、ｎ−アシル−エタノールアミン（ＮＡＥ）、グレリン受容体アンタゴニスト、ペプチドＹＹ３−３６、コレシストキニン（ＣＣＫ）ファミリー分子、ＣＣＫ５８、ＣＣＫ３３、ＣＣＫ２２、ＣＣＫ８、ボンベシンファミリー分子、ボンベシン、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、ニューロメジンＢ（Ｐ）、グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ、アミリン、ソマトスタチン、エンテロスタチン、オキシントモジュリン、膵臓ペプチド、短鎖脂肪酸、ブチラート、プロピオネート、アセテート、セロトニン受容体アゴニスト、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドモノヌクレオチド（ＮＭＮ）、ヌクレオチドリボシド（ＮＲ）、ニコチンアミド、およびニコチン酸（ＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。このような分子はまた、代謝疾患を促進する分子を阻害する化合物（例えば、ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ４）またはグレリン受容体を阻害する一本鎖可変抗体（ｓｃＦｖ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｓｈＲＮＡ）を含み得る。代謝および／または満腹エフェクター分子は単一の遺伝子によってコードされ得、例えば、グルカゴン様ペプチド１は、ＧＬＰ−１遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、トリプトファンおよび／またはその代謝産物の１つの産生または異化のための１つ以上の回路を含有する遺伝子配列を含む遺伝子操作された細菌は、１つ以上の代謝エフェクター分子および／または満腹エフェクター分子の発現のための遺伝子配列をさらに含む。

エフェクター分子の他の非限定的な例は、係属中の共同所有の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３４２００（出願日２０１６年５月２５日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願日２０１７年１月１１日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０３（出願日２０１７年２月３日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０９（出願日２０１６年２月４日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５６３（出願日２０１７年２月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５５２（出願日２０１７年２月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９２２（出願日２０１６年７月２９日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９７８１（出願日２０１６年８月３１日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３７０９８（出願日２０１６年６月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９０５２（出願日２０１６年１２月２８日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（出願日２０１６年１１月１６日）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

特定の実施形態では、新たなまたは改善されたエフェクター（例えば、ＰＭＥ）は、当該分野において公知または本明細書に記載される方法に従って同定され得、遺伝子操作された細菌によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる酵素は、ウイルス、原核生物または真核生物から単離された野生型酵素である。いくつかの実施形態では、酵素配列は、安定性または触媒活性などの酵素の１つ以上の特異的性質を増加させるようにさらに改変または突然変異されている。

「フェニルアラニン代謝産物」とは、フェニルアラニンの分解の結果として生成される代謝産物を指す。代謝産物は、基質としてフェニルアラニンを使用する酵素によってフェニルアラニンから直接的に、またはフェニルアラニン代謝産物基質に対して作用する、代謝経路の下流の異なる酵素によって間接的に生成され得る。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＰＭＥをコードする遺伝子操作された細菌によって産生される。

いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＰＡＨ活性から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたＰＡＨから直接的または間接的に生じる。いくつかの実施形態では、代謝産物はチロシンである。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、欠陥のあるＰＡＨ活性に起因してＰＫＵ患者の血液または尿中に蓄積する。このようなＰＫＵ代謝産物の非限定的な例は、フェニルピルビン酸およびフェニル−乳酸である。他の例には、フェニルアセテート、フェニルエチルアミン、およびフェニルアセチルグルタミンが含まれる。

いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＰＡＬ作用から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたＰＡＬから直接的または間接的に生じる。このようなＰＡＬ代謝産物の非限定的な例は、トランス−ケイ皮酸および馬尿酸である。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝産物は、ＬＡＡＤ作用から、例えば、遺伝子操作された細菌によって産生されたＬＡＡＤから直接的または間接的に生じる。このようなＬＡＡＤ代謝産物の例は、フェニルピルビン酸およびフェニル乳酸である。

「フェニルアラニントランスポーター」は、フェニルアラニンを細菌細胞に輸送することができる膜輸送タンパク質を指すために使用される（例えば、Ｐｉら、１９９１年を参照のこと）。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）において、ｐｈｅＰ遺伝子は、フェニルアラニン輸送を担う高親和性フェニルアラニン特異的パーミアーゼをコードする（Ｐｉら、１９９８年）。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、限定されないが、アシネトバクター・カルコアセティカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅｎｔｅｒｉｃａ）、および大腸菌を含む、細菌種に由来するｐｈｅＰ遺伝子によってコードされる。他のフェニルアラニントランスポーターには、ａｒｏＰ遺伝子によってコードされ、高親和性でフェニルアラニンを含む３つの芳香族アミノ酸を輸送し、ＰｈｅＰと一緒に、フェニルアラニン取り込みの最大の部分を担うアーゲネラル（Ａａｇｅｎｅｒａｌ）アミノ酸パーミアーゼが含まれる。さらに、低レベルのフェニルアラニン輸送活性は、ＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系の活性まで追跡され、そのＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系は、２つのペリプラズム結合タンパク質である、ＬＩＶ結合タンパク質（ＬＩＶ−Ｉ系）およびＬＳ結合タンパク質（ＬＳ系）、ならびに膜成分であるＬｉｖＨＭＧＦからなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターである。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、細菌種に由来するａｒｏＰ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、ＬＩＶ結合タンパク質およびＬＳ結合タンパク質ならびに細菌種に由来するＬｉｖＨＭＧＦ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰ、ａｒｏＰ、およびＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系から選択される１種より多いフェニルアラニントランスポーターを含む。

「フェニルアラニン」および「Ｐｈｅ」は、式Ｃ_６Ｈ_５ＣＨ_２ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯＯＨを有するアミノ酸を指すために使用される。フェニルアラニンは、チロシン、ドーパミン、ノルエピネフリン、およびエピネフリンの前駆体である。Ｌ−フェニルアラニンは必須アミノ酸であり、食品タンパク質中に主に見出されるフェニルアラニンの形態である。立体異性体Ｄ−フェニルアラニンは食品タンパク質中により少ない量で見出され、ＤＬ−フェニルアラニンは両方の形態の組合せである。フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルアラニン、Ｄ−フェニルアラニン、およびＤＬ−フェニルアラニンのうちの１つまたは複数を指すことができる。

本明細書で使用される「トランスポーター」という用語は、アミノ酸、ペプチド（ジペプチド、トリペプチド、ポリペプチドなど）、毒素、代謝産物、基質、および他の生体分子などの分子を細胞外環境から微生物内へ取り込む（ｉｍｐｏｒｔ）ためのメカニズム（例えば、タンパク質、タンパク質、またはタンパク質複合体）を指すことを意味する。

「作動可能に連結されている」とは、核酸配列、例えばｃｉｓで作用する核酸配列の発現を可能にするように調節領域配列に結合している、例えばＰＡＬをコードする遺伝子を指す。調節領域は、目的の遺伝子の転写を指示することができ、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、プロモーター制御エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域、転写開始部位、終止配列、ポリアデニル化配列、およびイントロンを含み得る核酸である。

「誘導可能なプロモーター（誘導性プロモーター）」とは、１つまたは複数の遺伝子に作動可能に連結されている調節領域を指し、当該遺伝子の発現は前記調節領域の誘導物質の存在下で増加する。

「直接的に誘導可能なプロモーター」とは、エフェクター分子（例えば、ＰＡＬなどのフェニルアラニン代謝酵素）をコードする遺伝子に作動可能に連結されている調節領域を指し、前記調節領域の誘導物質の存在下で、前記エフェクター分子が発現される。「間接的に誘導可能なプロモーター」とは、２つ以上の調節領域、例えば、第１の分子（例えば、エフェクター分子をコードする遺伝子に作動可能に連結されている第２の調節領域を調節可能な転写調節因子）をコードする遺伝子に作動可能に連結されている第１の調節領域、を含む調節系を指す。第１の調節領域の誘導物質の存在下で、第２の調節領域は活性化または抑制され得、それによってエフェクター分子の発現を活性化または抑制する。直接的に誘導可能なプロモーターおよび間接的に誘導可能なプロモーターの両方は、「誘導可能なプロモーター（誘導性プロモーター）」に包含される。

「外因性環境条件」または「環境条件」とは、本明細書に記載のプロモーターが直接的または間接的に誘導される設定または状況を指す。前記語句は、操作された微生物に対して外部であるが、宿主対象環境に対して内因性または天然である環境条件を指すことを意味する。したがって、「外因性」および「内因性」は、環境条件が哺乳動物の身体に対して内因性であるが、インタクト微生物細胞に対して外部または外因性である環境条件を指すために交換可能に使用され得る。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の消化管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の上部胃腸管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の下部胃腸管に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は哺乳動物の小腸に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素、微好気性、または嫌気性条件である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件とは、健康または疾患状態における哺乳動物の消化管に特異的である分子または代謝産物、例えばプロピオネートの存在を指す。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、腫瘍微小環境に特異的である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、腫瘍微小環境に特異的である分子または代謝産物である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、組織特異的または疾患特異的な代謝産物または分子である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は低ｐＨ環境である。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物はｐＨ依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された微生物は、酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの態様では、細菌は酸素レベルを検知できる進化した転写因子を有する。異なるシグナル伝達経路が異なる酸素レベルによって誘発され得、異なる動態を伴って発生する。

本明細書中で使用される場合、「外因性環境条件」または「環境条件」はまた、操作された微生物の外部の設定または状況または環境条件のことを指し、微生物のｉｎｖｉｔｒｏ培養条件に関連する。「外因性環境条件」はまた、生物の成長、生産、および製造中の条件を指す場合がある。そのような条件には、好気性培養条件、嫌気性培養条件、低酸素培養条件および設定酸素濃度下における他の条件も含まれる。そのような条件にはまた、培養培地中のテトラサイクリン、アラビノース、ＩＰＴＧ、ラムノースなどの化学的および／または栄養性誘導物質の存在も含まれる。そのような条件にはまた、ｉｎｖｉｖｏ投与の前に微生物が増殖される温度も含まれる。例えば、特定のプロモーター系を使用すると、ある温度はペイロードの発現を許容するが、他の温度は許容しない。酸素レベル、温度および培地組成は、そのような外因性環境条件に影響を与える。そのような条件は、増殖速度、ペイロード（例えば、ＰＡＬまたはＬＡＡＤなどのＰＭＥ）の誘導速度、トランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）の誘導速度、ならびに菌株生産中の当該株の全体的な生存能力および代謝活性に影響を与える。

「酸素レベル依存性プロモーター」または「酸素レベル依存性調節領域」とは、１つまたは複数の酸素レベル感受性転写因子が結合できる核酸配列を指し、対応する転写因子の結合および／または活性化は下流の遺伝子発現を活性化する。

酸素レベル依存性転写因子の例には、限定されないが、ＦＮＲ、ＡＮＲ、およびＤＮＲが含まれる。対応するＦＮＲ応答性プロモーター、ＡＮＲ応答性プロモーター、およびＤＮＲ応答性プロモーターは当該分野において公知である（例えば、Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｅら、２００９年；Ｅｉｇｌｍｅｉｅｒら、１９８９年；Ｇａｌｉｍａｎｄら、１９９１年；Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年；Ｈｏｅｒｅｎら、１９９３年；Ｓａｌｍｏｎら、２００３年を参照のこと）。非限定的な例は表１に示される。

非限定的な例において、プロモーター（ＰｆｎｒＳ）は、環境酸素が低いかまたは全くない条件下で高度に発現することが知られている、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅフマレートおよび硝酸レダクターゼ遺伝子Ｓ（ｆｎｒＳ）に由来した（ＤｕｒａｎｄおよびＳｔｏｒｚ、２０１０年；Ｂｏｙｓｅｎら、２０１０年）。ＰｆｎｒＳプロモーターは、Ｎｉｓｓｌｅにおいて天然に見出される包括的転写調節因子ＦＮＲによって嫌気性および／または低酸素条件下で活性化される。嫌気性および／または低酸素条件下で、ＦＮＲは二量体を形成し、その制御下で特異的遺伝子のプロモーターにおける特異的配列に結合し、それによってそれらの発現を活性化する。しかしながら、好気性条件下で、酸素はＦＮＲ二量体における鉄−硫黄クラスターと反応し、それらを不活性型に変換する。このように、ＰｆｎｒＳ誘導性プロモーターはタンパク質またはＲＮＡの発現をモジュレートするために採用される。ＰｆｎｒＳは、本出願において、ＦＮＲＳ、ｆｎｒＳ、ＦＮＲ、Ｐ−ＦＮＲＳプロモーターおよびプロモーターＰｆｎｒＳを示す他のそのような関連した名称として交換可能に使用される。

［表１］転写因子ならびに応答遺伝子および調節領域の例

本明細書中で使用される場合、「調節可能な調節領域」は転写因子の直接的または間接的な制御下にあり、誘導物質のレベルに対して遺伝子発現を活性化、抑制、抑制解除、または制御することができる核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、調節可能な調節領域はプロモーター配列を含む。誘導物質は、ＲＮＳまたは本明細書に記載される他の誘導物質であり得、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ−応答性調節領域または本明細書に記載される他の応答性調節領域であり得る。調節可能な調節領域は、１つ以上のペイロードの産生のための遺伝子配列または遺伝子カセット、例えば、ブチロジーニック（ｂｕｔｙｒｏｇｅｎｉｃ）または他の遺伝子カセットまたは遺伝子配列に作動可能に連結され得る。例えば、特定の一実施形態では、調節可能な調節領域は、ＲＮＳ−抑制解除調節領域であり、ＲＮＳが存在する場合、ＲＮＳ感知転写因子は、もはや調節領域に結合および／または抑制せず、それによって、作動可能に連結された遺伝子または遺伝子カセットの発現を可能にする。この場合、調節可能な調節領域は、ＲＮＳレベルに対して遺伝子または遺伝子カセットの発現を抑制解除する。各遺伝子または遺伝子カセットは、少なくとも１つのＲＮＳを感知可能な転写因子によって直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域に作動可能に連結され得る。

いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、反応性酸素種の存在または非存在である。他の実施形態では、外因性環境条件は、反応性窒素種（ＲＮＳ）の存在または非存在である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件は、炎症反応に関与する生物学的分子、例えば、消化管の炎症障害に存在する分子である。いくつかの実施形態では、外因性環境条件またはシグナルは、組み換え細菌細胞が存在する環境に自然に存在するかまたは自然に存在しない。いくつかの実施形態では、外因性環境条件またはシグナルは、例えば、生物学的状態の生成もしくは除去および／または生物学的分子の投与もしくは除去によって、人工的に生成される。

いくつかの実施形態では、外因性環境条件および／またはシグナルは、誘導性プロモーターの活性を刺激する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件および／またはシグナルは、哺乳動物の消化管内に自然に存在しない。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、本発明の医薬組成物と組合せて投与される分子または代謝産物、例えば、テトラサイクリン、アラビノース、または誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ任意の生物学的分子によって刺激される。いくつかの実施形態では、外因性環境条件および／またはシグナルは、本発明の組み換え細菌細胞を含む培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターを活性化するのに役立つ外因性環境条件は、哺乳動物の消化管内に自然に存在する（例えば、低酸素もしくは嫌気性条件、または炎症反応に関与する生物学的分子）。いくつかの実施形態では、外因性環境条件（例えば、ｉｎｖｉｖｏ）への曝露の喪失は、当該外因性環境条件がプロモーターを誘導するために存在しない（例えば、消化管の外部の好気性環境）ので、誘導性プロモーターの活性を阻害する。本明細書において使用される場合、「非天然」核酸配列とは、通常、細菌に存在しない核酸配列、例えば内因性配列の追加のコピー、または細菌の異なる種、株、もしくは亜株由来の配列などの異種配列、または同じ亜型の細菌由来の非改変配列と比較して改変および／もしくは突然変異されている配列を指す。いくつかの実施形態では、非天然核酸配列は合成の、天然に存在しない配列である（例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌら、２０１３年を参照のこと）。非天然核酸配列は、調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットにおける１つもしくは複数の遺伝子であってもよい。いくつかの実施形態では、「非天然」とは、天然において互いに同じ関係で見出されない２つ以上の核酸配列を指す。非天然核酸配列はプラスミドまたは染色体上に存在し得る。さらに、任意の調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットの複数のコピーが細菌に存在してもよく、当該調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットの１つまたは複数のコピーは、突然変異されていてもよく、または本明細書に記載されるように別様で変更されていてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、コピー数を高めるために、または複数の異なる機能を実行する遺伝子カセットの複数の異なる成分を含むために、同じ調節領域、プロモーター、遺伝子、および／または遺伝子カセットの複数のコピーを含むように操作される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はエフェクター分子（例えば、ＰＭＥ）をコードする遺伝子を含み、当該遺伝子は、天然では当該遺伝子に関連していない直接的または間接的に誘導可能なプロモーター、例えばエフェクター分子をコードする遺伝子に作動可能に連結されているＦＮＲプロモーター、または第２のエフェクター分子に作動可能に連結されているＰａｒａＢＡＤプロモーター、に作動可能に連結されている。

「構成的プロモーター」とは、その制御下にあるおよび／またはそれが作動可能に連結されているコード配列または遺伝子の連続的な転写を促進することができるプロモーターを指す。構成的プロモーターおよびバリアントは当該分野において周知であり、限定されないが、ＢＢａ＿Ｊ２３１００、構成的大腸菌σ^Ｓプロモーター（例えば、ｏｓｍＹプロモーター（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＭａｃｈｉｎｅ（ｉＧＥＭ）の標準生物学的パーツ・レジストリ名ＢＢａ＿Ｊ４５９９２；ＢＢａ＿Ｊ４５９９３））、構成的大腸菌σ^３２プロモーター（例えば、ｈｔｐＧヒートショックプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ４５５０４））、構成的大腸菌σ^７０プロモーター（例えば、ｌａｃｑプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ５４２００；ＢＢａ＿Ｊ５６０１５）、大腸菌ＣｒｅＡＢＣＤリン酸検知オペロンプロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９５１）、ＧｌｎＲＳプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ０８８００７）、ｌａｃＺプロモーター（ＢＢａ＿Ｋ１１９０００；ＢＢａ＿Ｋ１１９００１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｉプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０１）；Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０２）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０３）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＩＶプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０４）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子Ｖプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０５）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０６）、Ｍ１３Ｋ０７遺伝子ＶＩＩＩプロモーター（ＢＢａ＿Ｍ１３１０８）、Ｍ１３１１０（ＢＢａ＿Ｍ１３１１０））、構成的バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）σ^Ａプロモーター（例えば、プロモーターｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、プロモーター４３（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１３）、Ｐ_ｌｉａＧ（ＢＢａ＿Ｋ８２３０００）、Ｐ_ｌｅｐＡ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００２）、Ｐ_ｖｅｇ（ＢＢａ＿Ｋ８２３００３））、構成的バチルス・サブティリスσ^Ｂプロモーター（例えば、プロモーターｃｔｃ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１０）、プロモーターｇｓｉＢ（ＢＢａ＿Ｋ１４３０１１））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）プロモーター（例えば、サルモネラ由来のＰｓｐｖ２（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０６）、サルモネラ由来のＰｓｐｖ（ＢＢａ＿Ｋ１１２７０７））、バクテリオファージＴ７プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター（ＢＢａ＿Ｉ７１２０７４；ＢＢａ＿Ｉ７１９００５；ＢＢａ＿Ｊ３４８１４；ＢＢａ＿Ｊ６４９９７；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１０；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１１；ＢＢａ＿Ｋ１１３０１２；ＢＢａ＿Ｒ００８５；ＢＢａ＿Ｒ０１８０；ＢＢａ＿Ｒ０１８１；ＢＢａ＿Ｒ０１８２；ＢＢａ＿Ｒ０１８３；ＢＢａ＿Ｚ０２５１；ＢＢａ＿Ｚ０２５２；ＢＢａ＿Ｚ０２５３））、バクテリオファージＳＰ６プロモーター（例えば、ＳＰ６プロモーター（ＢＢａ＿Ｊ６４９９８））、およびそれらの機能性断片が含まれる。

「消化管」とは、食物の移動および消化、栄養素の吸収、ならびに老廃物の排出を担う器官、腺、管、および系を指す。ヒトにおいて、消化管は、口から始まり肛門で終わり、食道、胃、小腸、および大腸をさらに含む、胃腸（ＧＩ）管を含む。消化管はまた、脾臓、肝臓、胆嚢、および膵臓などの副器官および腺を含む。上部胃腸管は、食道、胃、および小腸の十二指腸を含む。下部胃腸管は、小腸の残りの部分、すなわち空腸および回腸、ならびに大腸の全て（すなわち盲腸、結腸、直腸、および肛門管）を含む。細菌は、消化管全体にわたって、例えば胃腸管において、特に腸において見出され得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、消化管において活性である（例えば、１つ以上のペイロード（例：ＰＭＥ）を発現する）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、大腸において活性である（例えば、１つ以上のペイロードを発現する）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、小腸において活性である（例えば、１つ以上のペイロードを発現する）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、小腸および大腸において活性である。理論に縛られることは望まないが、フェニルアラニンの分解は、小腸においてアミノ酸吸収、例えばフェニルアラニン吸収が起こるので、小腸において非常に有効であり得る。フェニルアラニンの血液への取り込みの防止または低減により、Ｐｈｅレベルの上昇およびその結果生じるＰｈｅの毒性を回避することができる。さらに、腸と身体の間のアミノ酸の広範な腸内再循環は、ＰＫＵにおける全身性フェニルアラニンの除去を可能にし得る（例えば、Ｃｈａｎｇらによって、ＰＫＵのラットモデルにおいて記載されている（Ｃｈａｎｇら、「Ａｎｅｗｔｈｅｏｒｙｏｆｅｎｔｅｒｏｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓａｎｄｉｔｓｕｓｅｆｏｒｄｅｐｌｅｔｉｎｇｕｎｗａｎｔｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄｓｕｓｉｎｇｏｒａｌｅｎｚｙｍｅ−ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｅｌｌｓ，ａｓｉｎｒｅｍｏｖｉｎｇｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｉｎｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ；ＡｒｔｉｆＣｅｌｌｓＢｌｏｏｄＳｕｂｓｔｉｔＩｍｍｏｂｉｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９５年；２３巻（１）：１−２１頁））。血液由来のフェニルアラニンは小腸内に循環し（例えば、図１５参照）、当該部位で活性な細菌によって除去され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は小腸を通過する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、消化管内の滞留時間が長くなっている。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は小腸または大腸にコロニーを形成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は結腸にコロニーを形成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、消化管内の滞留時間が長くなっている。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は消化管にコロニーを形成しない。

本明細書で使用される場合、用語「低酸素」は、大気中に存在する酸素（Ｏ_２）のレベル、量、または濃度より低い酸素のレベル、量、または濃度を指すことを意味する（例えば、＜２１％Ｏ_２；＜１６０ｔｏｒｒＯ_２））。したがって、用語「低酸素条件（複数可）」または「低酸素環境」は、大気中に存在する酸素よりも低い酸素レベルを含む条件または環境を指す。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、哺乳動物の消化管、例えば、内腔、胃、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、盲腸、結腸、遠位Ｓ状結腸、直腸および肛門管に見出される酸素（Ｏ_２）のレベル、量、または濃度を指すこと意味する。いくつかの実施形態において、「低酸素」という用語は、０〜６０ｍｍＨｇのＯ_２（０〜６０ｔｏｒｒのＯ_２）（例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、および６０ｍｍＨｇのＯ_２）のレベル、量、または濃度を指すことを意味し、それらの任意およびすべての小数の増加を含む（例えば、０．２ｍｍＨｇ、０．５ｍｍＨｇのＯ_２、０．７５ｍｍＨｇのＯ_２、１．２５ｍｍＨｇのＯ_２、２．１７５ｍｍＨｇのＯ_２、３．４５ｍｍＨｇのＯ_２、３．７５ｍｍＨｇのＯ_２、４．５ｍｍＨｇのＯ_２、６．８ｍｍＨｇのＯ_２、１１．３５ｍｍＨｇのＯ_２、４６．３ｍｍＨｇのＯ_２、５８．７５ｍｍＨｇなどが含まれるが、これらの例示的な小数は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。）。いくつかの実施形態において、「低酸素」とは、約６０ｍｍＨｇ以下のＯ_２（例えば、０〜約６０ｍｍＨｇのＯ_２）を指す。「低酸素」という用語はまた、０〜６０ｍｍＨｇの間（０ｍｍＨｇと６０ｍｍＨｇを含めて）のＯ_２のレベル、量、または濃度の範囲、例えば、０〜５ｍｍＨｇＯ_２、＜１．５ｍｍＨｇＯ_２、６〜１０ｍｍＨｇ、＜８ｍｍＨｇ、４７〜６０ｍｍＨｇなどを指すことができるが、これらの例示的範囲は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。例えば、Ａｌｂｅｎｂｅｒｇら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１４７巻（５）：１０５５−１０６３頁（２０１４年）；Ｂｅｒｇｏｆｓｋｙら、ＪＣｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、４１巻（１１）：１９７１−１９８０頁（１９６２年）；Ｃｒｏｍｐｔｏｎら、ＪＥｘｐ．Ｂｉｏｌ．、４３巻：４７３−４７８頁（１９６５年）；Ｈｅら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９６巻：４５８６−４５９１頁（１９９９年）；ＭｃＫｅｏｗｎ、Ｂｒ．Ｊ．Ｒａｄｉｏｌ．、８７巻：２０１３０６７６（２０１４年）（ｄｏｉ：１０．１２５９／ｂｒｊ．２０１３０６７６）を参照されたい。前記の各文献では、様々な種の哺乳動物の消化管内に見出される酸素レベルが議論されており、これらの文献はそれぞれ全体とし本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、哺乳動物の消化管以外の器官または組織、例えば尿生殖路、腫瘍組織などに見出される酸素（Ｏ_２）のレベル、量または濃度を意味し、当該器官または組織では、酸素は低下したレベル、例えば、低酸素（ｈｙｐｏｘｉｃ）または無酸素（ａｎｏｘｉｃ）レベルで存在する。いくつかの実施形態では、「低酸素」とは、部分的に好気性、半好気性（ｓｅｍｉａｅｒｏｂｉｃ）、微好気性（ｍｉｃｒｏａｅｒｏｂｉｃ）、超好気性（ｎａｎｏａｅｒｏｂｉｃ）、微酸素性（ｍｉｃｒｏｏｘｉｃ）、低酸素性（ｈｙｐｏｘｉｃ）、無酸素性（ａｎｏｘｉｃ）および／または嫌気性条件に存在する酸素（Ｏ_２）のレベル、量または濃度を意味する。例えば、表Ａは、様々な器官および組織に存在する酸素量をまとめたものである。いくつかの実施形態では、酸素（Ｏ_２）のレベル、量、または濃度は、液体中に存在する遊離の非化合物の酸素（Ｏ_２）のレベルを指す溶存酸素（「ＤＯ」）の量として表され、典型的には、ミリグラムパーリッター（ｍｇ／Ｌ）、百万分率（ｐｐｍ；１ｍｇ／Ｌ＝１ｐｐｍ）またはマイクロモル（ｕｍｏｌｅ）（１μｍｏｌＯ_２＝０．０２２３９１ｍｇ／ＬＯ_２）で報告されている。ＦｏｎｄｒｉｅｓｔＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ、Ｉｎｃ．、 “ＤｉｓｓｏｌｖｅｄＯｘｙｇｅｎ”、環境測定の基礎、２０１３年１１月１９日、ｗｗｗ．ｆｏｎｄｒｉｅｓｔ．ｃｏｍ／ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ−ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ／ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ／ｗａｔｅｒ−ｑｕａｌｉｔｙ／ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ−ｏｘｙｇｅｎ／＞。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、約６．０ｍｇ／ＬＤＯ以下の酸素（Ｏ_２）のレベル、量、または濃度を指すことを意味し、例えば６．０ｍｇ／Ｌ、５．０ｍｇ／Ｌ、４．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、２．０ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、または０ｍｇ／Ｌ、ならびにそれらの小数、例えば、３．２５ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、１．７５ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、１．２５ｍｇ／Ｌ、０．９ｍｇ／Ｌ、０．８ｍｇ／Ｌ、０．７ｍｇ／Ｌ、０．６ｍｇ／Ｌ、０．５ｍｇ／Ｌ、０．４ｍｇ／Ｌ、０．３ｍｇ／Ｌ、０．２ｍｇ／Ｌおよび０．１ｍｇ／ＬＤＯである。これらの例示的な小数は、説明の目的でここに挙げたものであって、決して限定されることを意味するものではない。液体または溶液中の酸素レベルは、空気飽和のパーセンテージまたは酸素飽和のパーセンテージとして報告され得る（溶液中の溶存酸素（Ｏ_２）濃度と、安定な平衡下で一定の温度、圧力、および塩濃度の溶液についての最大溶存酸素量との比）。酸素の産生物または消費物を含まず、十分に酸素を供給された溶液（例えば、混合および／または撹拌された溶液）は、１００％空気飽和である。いくつかの実施形態において、「低酸素」という用語は、４０％以下の空気飽和、例えば、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、および０％空気飽和を指すことを意味し、それらの任意およびすべての小数の増加（例えば、３０．２５％、２２．７０％、１５．５％、７．７％、５．０％、２．８％、２．０％、１．６５％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７５％、０．６８％０．５％、０．４４％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０８％、０．０７５％、０．０５８％、０．０４％、０．０３２％、０．０２５％、０．０１％など）ならびに０〜４０％の間（０％と４０％を含めて）の酸素飽和レベルの任意の範囲（例えば、０〜５％、０．０５〜０．１％、０．１〜０．２％、０．１〜０．５％、０．５〜２．０％、０〜１０％、５〜１０％、１０〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％など）が含まれる。ここに列挙した例示的な小数および範囲は、説明のためのものであり、決して限定されることを意味するものではない。いくつかの実施形態では、「低酸素」という用語は、９％以下の酸素飽和、例えば、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０％のＯ_２飽和を指すことを意味し、それらの任意およびすべての小数の増加（例えば、６．５％、５．０％、２．２％、１．７％、１．４％、０．９％、０．８％、０．７５％、０．６８％、０．５％、０．４４％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１％、０．０８％、０．０７５％、０．０５８％、０．０４％、０．０３２％、０．０２５％、０．０１％など）ならびに０〜９％の間（０％と９％を含めて）の酸素飽和レベルの任意の範囲（例えば、０〜５％、０．０５〜０．１％、０．１〜０．２％、０．１〜０．５％、０．５〜２．０％、０〜８％、５〜７％、０．３〜４．２％のＯ_２など）が含まれる。ここに列挙した例示的な少数および範囲は、説明のためのものであり、決して限定的であることを意味するものではない。

［表Ａ］腸の酸素圧

いくつかの実施形態では本明細書中に記載されるプロモーターが培養容器（例えば、フラスコまたは発酵槽または他の適切な培養容器）中の状態によって直接的または間接的に誘導され、該培養容器中で、株はｉｎｖｉｖｏ投与の前に増殖または維持される。ｉｎｖｉｖｏ投与前の株の培養中に提供されるこのような条件の非限定的な例としては、低酸素、嫌気性、微好気性、または好気性条件、他の定義された酸素レベル（例えば、以下に例示されるもの）、アラビノースの存在、ＩＰＴＧ、ラムノース、または本明細書中に記載されているかもしくは当該分野で公知の他の化学的および／または栄養性誘導物質の存在が挙げられる。いくつかの実施形態では、培養容器内の条件は、一定の酸素レベル、例えば、１％〜１０％の酸素、１０％〜２０％の酸素、２０％〜３０％の酸素、３０％〜４０％の酸素、４０％〜５０％の酸素、６０％〜７０％の酸素、７０％〜８０％の酸素、８０％〜９０％の酸素、９０％〜１００％の酸素、および本明細書に記載される他の酸素レベルに設定され、その設定点においてプロモーターが直接的または間接的に誘導される。

本明細書において使用される場合、「遺伝子」または「遺伝子配列」という用語は、遺伝子配列、例えば核酸配列を指すことを意味する。遺伝子、遺伝子配列または遺伝学的配列（ｇｅｎｅｔｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、完全な遺伝子配列または部分的な遺伝子配列を含むことを意味する。遺伝子、遺伝子配列または遺伝学的配列は、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むことを意味し、かつ、タンパク質またはポリペプチドをコードしない遺伝学的配列、例えば、調節配列、リーダー配列、シグナル配列、または他の非タンパク質コード配列を含むことも意味する。

「微生物」とは、典型的に単細胞からなる微視的（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）、超微視的（ｓｕｂｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）、または超顕微鏡的（ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ）なサイズの生物または微生物を指す。微生物の例には、細菌、酵母、ウイルス、寄生虫、真菌、特定の藻類、および原生動物が含まれる。いくつかの態様では、微生物は、１つ以上の目的の治療用分子またはタンパク質を産生するように操作される（「操作された微生物」）。特定の態様では、微生物は、その環境、例えば消化管から特定の代謝産物または他の化合物を取り込み、異化するように操作される。特定の態様では、微生物は、特定の有益な代謝産物または他の化合物（合成または天然に存在する）を合成し、それらをその環境中へ放出するように操作される。特定の実施形態では、操作された微生物は、操作された細菌である。特定の実施形態では、操作された微生物は、操作されたウイルスである。

「非病原性細菌」とは、宿主において疾患または有害な反応を引き起こすことができない細菌を指す。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌は、消化管の常在微生物叢に存在する共生細菌である。非病原性細菌の例には、限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテイロデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビ細菌属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サブティリス、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ）、バクテロイデス・サブティリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｏｎｇｕｍ）、クロストリジウム・ブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）、およびサッカロミセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｂｏｕｌａｒｄｉｉ）が含まれる（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年；Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第６，８３５，３７６号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第７，７３１，９７６号）。天然の病原性細菌は、病原性を低減または取り除くように遺伝子操作されてもよい。

「プロバイオティクス」は、適量の微生物を含有する宿主生物に対して健康の利点を与えることができる、生きている非病原性の微生物、例えば細菌を指すために使用される。いくつかの実施形態では、宿主生物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主生物はヒトである。非病原性細菌のいくつかの種、株、および／または亜型は、現在、プロバイオティクスとして認識されている。プロバイオティクス細菌の例には、限定されないが、ビフィド細菌属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、エシェリヒア属、ラクトバチルス属、およびサッカロミセス属、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、エンテロコッカス・フェシウム、大腸菌、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・プランタルム、およびサッカロミセス・ブラウディが含まれる（Ｄｉｎｌｅｙｉｃｉら、２０１４年；米国特許第５，５８９，１６８号；米国特許第６，２０３，７９７号；米国特許第６，８３５，３７６号）。プロバイオティクスは細菌のバリアントまたは突然変異株であってもよい（Ａｒｔｈｕｒら、２０１２年；Ｃｕｅｖａｓ−Ｒａｍｏｓら、２０１０年；Ｏｌｉｅｒら、２０１２年；Ｎｏｕｇａｙｒｅｄｅら、２００６年）。非病原性細菌は、所望の生物学的特性、例えば生存率を向上または改善させるように遺伝子操作されてもよい。非病原性細菌は、プロバイオティクス特性を提供するように遺伝子操作されてもよい。プロバイオティクス細菌は、プロバイオティクス特性を向上または改善させるように遺伝子操作されてもよい。

本明細書において使用される場合、「安定に維持された」または「安定な」細菌は、非天然遺伝子物質、例えばエフェクター分子をコードする遺伝子を保有する細菌宿主細胞を指すために使用され、その非天然遺伝子物質が保持され、発現され、および／または増殖されるように、それは宿主ゲノム内に組み込まれるか、または自己複製染色体外プラスミド上で増殖する。安定な細菌は、ｉｎｖｉｔｒｏ、例えば培地中、および／またはｉｎｖｉｖｏ、例えば消化管内で生存および／または増殖できる。例えば、安定な細菌は、ＰＡＬ遺伝子を保有するプラスミドまたは染色体が宿主細胞中で安定に維持される、エフェクター分子（例えば、ＰＡＬ）をコードする遺伝子を含む遺伝子組換え細菌であってもよく、それによりエフェクターは宿主細胞中で発現され得、宿主細胞はｉｎｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎｖｉｖｏで生存および／または増殖できる。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質、例えば、ＰＡＬ遺伝子の発現の安定性に影響を及ぼす。いくつかの実施形態では、コピー数は、非天然遺伝物質、例えば、ＰＡＬ遺伝子またはＰＡＨ遺伝子の発現レベルに影響を及ぼす。

本明細書において使用される場合、「モジュレートする」および「処置する」という用語ならびにそれらの同語源語は、疾患、障害、および／もしくは状態、またはそれらのうちの少なくとも１つの識別できる症状の改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」とは、必ずしも患者によって識別できるとは限らない、少なくとも１つの測定可能な物理的パラメータの改善を指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」とは、物理的（例えば、識別できる症状の安定化）、生理的（例えば、物理的パラメータの安定化）またはそれら両方のいずれかで、疾患、障害、および／または状態の進行を阻害することを指す。別の実施形態では、「モジュレートする」および「処置する」とは、疾患、障害、および／もしくは状態の進行を遅らせること、またはそれらの進行を反転させることを指す。疾患、障害、または状態を処置することは、基礎疾患の除去を必ずしも包含することなく、関連する症状を軽減または除去することを包含し得る。例えば、原発性高フェニルアラニン血症は、既知の治療法がない先天性の遺伝子変異によって引き起こされる。高フェニルアラニン血症は、他の状態、例えば肝疾患に続発することもある。高フェニルアラニン血症を処置することは、過剰なフェニルアラニンおよび／または関連する症状を軽減または除去することを含み得、必ずしも基礎疾患の除去を包含しない。本明細書において使用される場合、「予防する」およびその同語源語は、発症を遅延させること、あるいは所与の疾患、障害および／もしくは状態またはそのような疾患、障害、および／もしくは状態に関連した症状に罹るリスクを低減させることを指す。

処置を必要とするものは、特定の医学的疾患を既に有する個体、および疾患を有するリスクがあるか、または最終的に疾患に罹り得る個体を含んでもよい。処置の必要性は、例えば、疾患の発生、疾患の存在もしくは進行、または疾患を有する対象の処置に対する受容の可能性に関連する１つまたは複数のリスク因子の存在によって評価される。

本明細書において使用される場合、「医薬組成物」とは、生理学的に適切な担体および／または賦形剤などの他の成分との本発明の遺伝子操作された細菌の調製物を指す。

交換可能に使用されてもよい「生理学的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、生物に著しい刺激を引き起こさず、投与される細菌性化合物の生物学的活性および特性を無効にしない担体または希釈剤を指す。アジュバントはこれらの語句に含まれる。

「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性な物質を指す。例には、限定されないが、重炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えばポリソルベート２０を含む界面活性剤が含まれる。

「治療有効用量」および「治療有効量」という用語は、症状の発症の予防、遅延、または状態の症状の改善をもたらす化合物の量を指すために使用される。治療有効量は、例えば、重症度を処置し、予防し、低減させ、発症を遅延させ、および／または疾患もしくは状態の１つ以上の症状の発生リスクを低減させるのに十分であり得る。治療有効量、および投与の治療有効頻度は、当該分野において公知であり、以下に説明される方法によって決定され得る。

本明細書中で使用される場合、用語「抗体」または「抗体（複数）」は１つ以上の特定の結合特異性を有する抗体およびその断片の全てのバリエーションを包含することを意味する。したがって、用語「抗体」または「抗体（複数）」は、全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体（ＳｃＦｖ、ラクダ科動物）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、これらの断片の多量体バージョン（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ、Ｖ_ＨＨ断片）、重鎖抗体（ＨＣＡｂ）、ナノボディ、ダイアボディ、およびミニボディを含むことを意味する。抗体は、２つ以上の結合特異性、例えば、二重特異性を有することができる。用語「抗体」はいわゆる抗体模倣物を含むことも意味する。抗体模倣物は、抗原に特異的に結合することができるが、抗体関連構造を有さない、単一アミノ酸鎖分子であり得る低分子（例えば、３〜３０ｋＤａ）を指す。抗体模倣物には、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子（プロテインＡのＺドメイン）、アフィリン（Ａｆｆｉｌｉｎ）（γ−Ｂクリスタリン）、ユビキチン、アフィマー（Ａｆｆｉｍｅｒ）（シスタチン）、アフィチン（Ａｆｆｉｔｉｎ）（Ｓａｃ７ｄ）（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来）、アルファボディ（三重らせんコイルドコイル）、アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎ）（リポカリン）、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）（様々な膜受容体のドメイン）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリンリピートモチーフ）、Ｆｙｎｏｍｅｒ（ＦｙｎのＳＨ３ドメイン）、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド（様々なプロテアーゼ阻害剤のＫｕｎｉｔｚドメイン）、エカランチド（Ｋａｌｂｉｔｏｒ）、およびモノボディが含まれるが、これらに限定されない。特定の態様では、用語「抗体」または「抗体（複数）」は、一本鎖抗体（複数可）、単一ドメイン抗体（複数可）、およびラクダ抗体（複数可）を指すことを意味する。癌の処置における抗体の有用性および追加の抗癌抗体は、例えば、その全体が参考として援用される、Ｓｃｏｔｔら、「ＡｎｔｉｂｏｄｙＴｈｅｒａｐｙｆｏｒＣａｎｃｅｒ、ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＣａｎｃｅｒ、２０１２年４月、第１２巻」に見出され得る。

「一本鎖抗体」または「一本鎖抗体（複数可）」は、典型的には免疫グロブリンの重鎖、免疫グロブリンの軽鎖、および任意にジスルフィド結合などのリンカーまたは結合を含むペプチドを指す。一本鎖抗体は、従来の抗体に見られる定常Ｆｃ領域を欠く。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体は、天然に存在する一本鎖抗体、例えばラクダ抗体である。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体が合成、操作、または改変された一本鎖抗体である。いくつかの実施形態では、一本鎖抗体は、リンカーの付加および定常領域の除去にもかかわらず、元の免疫グロブリンと比較して実質的に同じ抗原特異性を保持することができる。いくつかの態様では、一本鎖抗体は「ｓｃＦｖ抗体」であり得、これは例えば、米国特許第４，９４６，７７８号（その内容はその全体が参考として本明細書に援用される）に記載されるように、任意に、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで連結された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）（定常領域なし）の可変領域の融合タンパク質を指す。Ｆｖ断片は抗体の結合部位を保持する最小の断片であり、その結合部位は、いくつかの態様では、元の抗体の特異性を維持し得る。一本鎖抗体の製造のための技術は、米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている。ｓｃＦｖのＶｈおよびＶＬ配列は、ＶＬのＣ末端に接続するＶＨのＮ末端を介して、またはＶＬのＮ末端に接続するＶＨのＣ末端を介して接続することができる。ＳｃＦｖ断片は、いずれかの末端で他のエピトープタグまたはタンパク質ドメインに区別なく融合され得る独立したフォールディングエンティティである。様々な長さのリンカーを使用して、ＶｈおよびＶＬ配列を連結することができ、該リンカーは、グリシンリッチ（柔軟性を提供する）およびセリンまたはスレオニンリッチ（溶解性を増加させる）であり得る。短いリンカーは、２つのドメインの会合を妨げ、多量体（ダイアボディ、トリボディなど）をもたらし得る。長いリンカーは、タンパク質分解または弱いドメイン会合を生じ得る（Ｖｏｅｌｋｅｌら、２０１１年に記載される）。１５〜２０アミノ酸または１８〜２０アミノ酸の長さのリンカーが最も頻繁に使用される。他の柔軟なリンカーを含むリンカーのさらなる非限定的な例は、チェンら、２０１３年（ＡｄｖＤｒｕｇＤｅｌｉｖＲｅｖ．２０１３年１０月１５日；６５（１０）：１３５７−１３６９頁、ＦｕｓｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎＬｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，ＤｅｓｉｇｎａｎｄＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。柔軟なリンカーはまた、グリジンおよびセリンなどの小さなまたは極性のアミノ酸に富むが、柔軟性を維持するためにスレオニンおよびアラニンなどの追加のアミノ酸、ならびに溶解性を改善するためにリジンおよびグルタミン酸などの極性のアミノ酸を含み得る。例示的なリンカーとしては、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ、ＫＥＳＧＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤおよびＥＧＫＳＳＧＳＥＳＫＳＴ、（Ｇｌｙ）８、ならびにＧｌｙおよびＳｅｒリッチなフレキシブルリンカー、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「一本鎖抗体」には、ラクダ抗体および他の重鎖抗体を含む単一ドメイン抗体、ナノボディを含む軽鎖抗体、ならびにヒト、マウスまたは他の種に由来する単一ドメインＶＨまたはＶＬドメインも含まれる。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、魚、サメ、ヤギ、ウサギ、およびウシを含むがこれらに限定されない任意の種に由来し得る。単一ドメイン抗体には、ラクダ、ラマ、またはアルパカに由来するラクダ科動物スキャフォールドを有するドメイン抗原結合ユニットが含まれる。ラクダ科動物は、軽鎖を欠く機能的抗体を産生する。重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、自律的に折り畳まれ、抗原結合ユニットとして独立して機能する。その結合表面は、古典的な抗原結合分子（Ｆａｂ）または一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）における６つのＣＤＲと比較して、３つのＣＤＲのみを含む。ラクダ科動物の抗体は、従来の抗体のものに匹敵する結合親和性を達成することができる。ラクダ科動物スキャフォールドをベースとする抗体は、当該分野で周知の方法を使用して産生され得る。軟骨魚にも重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ、「免疫グロブリン新規抗原受容体」）があり、それからＶＮＡＲ断片と呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。あるいは、ヒトまたはマウス由来のＩｇＧ由来の二量体可変ドメインがモノマーに分割され得る。ナノボディは、軽鎖に由来する一本鎖抗体である。用語「一本鎖抗体」はまた、抗体模倣物を指す。

いくつかの実施形態では、操作された微生物によって発現される抗体は二重特異性である。特定の実施形態では、二重特異性抗体分子はｓｃＦｖまたはその断片を含み、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、ｓｃＦｖまたはその断片は第２のエピトープに対する結合特異性を有する。抗原結合断片または抗体部分には、二価ｓｃＦｖ（ダイアボディ）、抗体分子が２つの異なるエピトープを認識する二重特異性ｓｃＦｖ抗体、単一結合ドメイン（ｄＡｂ）、およびミニボディが含まれる。単量体の一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は細菌および哺乳動物細胞において容易に組み立てられ、生理学的条件下で改善された安定性を示す（Ｖｏｅｌｋｅｌら、２００１年およびその中の参考文献；ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．（２００１年）１４（１０）：８１５−８２３頁（単量体および二量体の二重特異性一本鎖ダイアボディの発現のための最適化されたリンカー配列を記載する）。

「単離された」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、その自然環境にないポリペプチドを指す。特定のレベルの精製は必要でない。細菌細胞または哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない宿主細胞において発現される組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に、本発明の目的のために単離されたと見なされる。組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生された、すなわち、ポリペプチドをコードする外因性組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換された細胞、微生物または哺乳動物から産生されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。ほとんどの細菌培養物において発現されるタンパク質またはペプチドは、通常、グリカンを含まない。前述のポリペプチドの断片，誘導体，類似体またはバリアント、およびそれらの任意の組合せも、ポリペプチドとして含まれる。用語「断片」、「バリアント」、「誘導体」および「類似体」は、元のペプチドのアミノ酸配列に十分に類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、対応する元のポリペプチドの少なくとも１つ以上の特性を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドの断片には、タンパク質分解断片、ならびに欠失断片が含まれる。断片には、本明細書中に記載される任意のポリペプチドに由来する特異的抗体または生物活性断片または免疫学的に活性な断片も含まれる。バリアントは、天然に存在してもよく、または非天然に存在してもよい。天然に存在しないバリアントは、当該分野で公知の突然変異誘発法を使用して産生され得る。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。

本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド（単数）」および「ポリペプチド（複数）」を含み、アミド結合（すなわちペプチド結合）によって直線状に連結しているアミノ酸モノマーからなる分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖（複数可）を指し、特定の長さの産生物を指すわけではない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖（複数可）を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはこれらの用語のいずれかと交換可能に使用されてもよい。「ジペプチド」という用語は、２つの連結しているアミノ酸のペプチドを指す。「トリペプチド」という用語は、３つの連結しているアミノ酸のペプチドを指す。「ポリペプチド」という用語はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化、タンパク質分解的切断、または天然に存在しないアミノ酸による改変を含む、ポリペプチドの発現後改変の産生物を指すことを意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的起源に由来してもよく、または組換え技術によって産生されてもよい。他の実施形態では、ポリペプチドは、本発明の遺伝子操作された細菌またはウイルスによって産生される。本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１０００個以上、または２，０００個以上のアミノ酸のサイズであってもよい。ポリペプチドは、定義された三次元構造を有してもよいが、必ずしもこのような構造を有する必要はない。定義された三次元構造を有するポリペプチドは折り畳まれたと称され、定義された三次元構造を保有しないが、多数の異なるコンホメーションを採用できるポリペプチドは折り畳まれていないと称される。「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、タンパク質もしくはタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を指してもよく、または非タンパク質配列、例えば、調節ペプチド配列、リーダーペプチド配列、シグナルペプチド配列、リンカーペプチド配列、および他のペプチド配列から選択される配列に対応するアミノ酸配列を指してもよい。

ポリペプチドはまた、融合タンパク質も含む。本明細書において使用される場合、「バリアント」という用語は、元のペプチドの配列または元のペプチドと十分に類似する配列を含む融合タンパク質を含む。本明細書において使用される場合、「融合タンパク質」という用語は、２つ以上の異なるタンパク質のアミノ酸配列を含むキメラタンパク質を指す。典型的に、融合タンパク質は周知のｉｎｖｉｔｒｏ組換え技術から生じる。融合タンパク質は、その融合タンパク質の成分である個々の元のタンパク質と類似した構造機能（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）、および／または類似した調節機能（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）、および／または類似した生化学機能（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）および／または免疫学的活性（しかし必ずしも同じ程度である必要はない）を有してもよい。「誘導体」は、限定されないが、２０個の標準的なアミノ酸の１つまたは複数の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドを含む。２つのペプチド間の「類似性」は、１つのペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列と比較することによって決定される。１つのペプチドのアミノ酸は、それが同一または保存的アミノ酸置換である場合、第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似している。保存的置換には、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、ｅｄ．、ＴｈｅＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ５、ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８年）、およびＡｒｇｏｓ、ＥＭＢＯＪ．８（１９８９年）、７７９〜７８５頁に記載されているものが含まれる。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は保存的変化または保存的置換を表す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。

本明細書において使用される場合、「十分に類似する」という用語は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能的活性を有するように、第２のアミノ酸配列と比較して十分なまたは最低限の数の同一または等価のアミノ酸残基を含有する第１のアミノ酸配列を意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列は、十分に類似していると本明細書において定義される。好ましくは、バリアントは本発明のペプチドのアミノ酸配列と十分に類似している。このようなバリアントは、一般に、本発明のペプチドの機能的活性を保持する。バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換によって、天然および野生型ペプチドとアミノ酸配列がそれぞれ異なるペプチドを含む。それらは天然に存在するバリアントおよび人工的に設計されたバリアントであってもよい。

本明細書において使用される場合、「リンカー」、「リンカーペプチド」または「ペプチドリンカー」または「リンカー」という用語は、２つのポリペプチド配列を接続または連結する、例えば２つのポリペプチドドメインを連結する合成または非天然もしくは天然に存在しないアミノ酸配列を指す。本明細書において使用される場合、「合成」という用語は、天然に存在しないアミノ酸配列を指す。例示的なリンカーが本明細書に記載される。さらなる例示的なリンカーは米国特許出願公開第２０１４００７９７０１号に提供されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

本明細書において使用される場合、「コドン最適化配列」という用語は、既存のコード配列から改変された、あるいは例えば、コード配列から転写された転写ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するように、またはコード配列の転写を改善するように設計された配列を指す。コドンの最適化には、限定されないが、発現宿主生物のコドンの選好性に適合するように、コード配列についてのコドンを選択することを含むプロセスが含まれる。「コドン最適化された」という用語は、核酸分子によってコードされるポリペプチドを変更することなく、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映するために、当該核酸分子の遺伝子またはコード領域においてコドンを改変することを指す。このような最適化には、少なくとも１つ、または２つ以上、または相当な数のコドンを、宿主生物の遺伝子においてより頻繁に使用されている１つ以上のコドンで置換することが含まれる。「コドン最適化配列」とは、既存のコード配列から改変された、あるいは例えば、コード配列から転写された転写ＲＮＡ分子の発現宿主細胞もしくは生物における翻訳を改善するように、またはコード配列の転写を改善するように設計された配列を指す。いくつかの実施形態において、転写および／または翻訳の改善は、転写および／または翻訳のレベルを増加させることを含む。いくつかの実施形態では、転写および／または翻訳の改善は、転写および／または翻訳のレベルを低下させることを含む。いくつかの実施形態では、目的の構築物からの発現レベルを微調整するために、コドン最適化が用いられる。コドンの最適化には、発現宿主生物のコドン選好性に適合するように、コード配列のコドンを選択することを含むプロセスが含まれるが、これに限定されない。多くの生物は、伸長中のポリペプチド鎖への特定のアミノ酸の挿入をコードするために、特定のコドンを使用するためのバイアスまたは選好性を示す。コドンの選好性またはコドンバイアス、生物間でのコドン使用頻度の差異は、遺伝暗号の縮重によって許容され、多くの生物の間で文書により十分に立証されている。コドンバイアスは、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、そのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率は、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されたｔＲＮＡの優性は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整され得る。

本明細書において使用される場合、「分泌系」または「分泌タンパク質」という用語は、目的のタンパク質または治療用タンパク質を微生物、例えば細菌細胞質から分泌またはエクスポートすることができる天然または非天然の分泌機構を指す。分泌系は、単一のタンパク質を含んでもよく、またはＨｌｙＢＤなど複合体に組み立てられた２つ以上のタンパク質を含んでもよい。グラム陰性細菌の分泌系の非限定的な例には、改変されたＩＩＩ型鞭毛、Ｉ型（例えば、溶血素分泌系）、ＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型、およびＶＩＩ型分泌系、耐性−結節形成−分裂（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ−ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（ＲＮＤ）多剤排出ポンプ、様々な単一膜分泌系が含まれる。グラム陽性細菌の分泌系の非限定的な例には、ＳｅｃおよびＴＡＴ分泌系が含まれる。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、目的のタンパク質または治療用タンパク質を特定の分泌系へ導くためのＲＮＡまたはペプチド起源の「分泌タグ」を含む。いくつかの実施形態では、分泌系は、操作された細菌から目的のタンパク質を分泌する前に、このタグを除去することができる。例えば、Ｖ型自己分泌媒介性分泌（ａｕｔｏ−ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）において、Ｎ末端ペプチド分泌タグは、天然Ｓｅｃ系による細胞質からペリプラズム区画への「パッセンジャー」ペプチドの移行時に除去される。さらに、自己分泌因子（ａｕｔｏ−ｓｅｃｒｅｔｏｒ）が外膜を横切って移行すると、Ｃ末端分泌タグは、自己触媒的またはプロテアーゼ触媒的切断によって除去され得、それによって目的のタンパク質が細胞外環境に放出される。

本明細書において使用される場合、「トランスポーター」という用語は、分子、例えば、アミノ酸、毒素、代謝産物、基質などを細胞外環境から微生物へ取り込むための機構、例えばタンパク質（複数可）を指すことを意味する。例えば、ＰｈｅＰなどフェニルアラニントランスポーターは、フェニルアラニンを微生物に取り込む。

エフェクターはまた、免疫チェックポイント阻害剤を含む。「免疫チェックポイント阻害剤」または「免疫チェックポイント」は、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質を完全にまたは部分的に減少、阻害、妨害、またはモジュレートする分子をいう。免疫チェックポイントタンパク質はＴ細胞の活性化または機能を調節し、当技術分野で知られている。非限定的な例としては、ＣＴＬＡ−４およびそのリガンドであるＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびにＰＤ−１およびそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２が挙げられる。免疫チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞応答の共刺激または阻害相互作用に関与し、自己寛容および生理学的免疫反応を調節および維持する。例えば、ＣＴＬＡ−４阻害剤を使用する全身性免疫療法は、免疫調節を変化させ、免疫機能不全を誘発し、日和見自己免疫障害をもたらし得る（例えば、Ｋｏｎｇら、２０１４年を参照のこと）。

本明細書中で使用される場合、遺伝子操作された微生物、例えば、生物学的分子を「阻害する」操作された細菌もしくはファージ、または分子は、コントロール（例えば、同じ条件下にある未処理コントロールまたは同じ亜型の未改変微生物）と比較して、その生物学的分子の生物学的活性、生物学的機能、および／または数を低減、減少、または排除することができる細菌またはウイルスまたは分子を指す。

本明細書中で使用される場合、遺伝子操作された微生物、例えば、生物学的分子を「活性化」または「刺激」する操作された細菌またはファージ分子は、コントロール（例えば、同じ条件下にある未処理コントロールまたは同じ亜型の未改変微生物）と比較して、その生物学的分子の生物学的活性、生物学的機能、および／または数を活性化、増加、増強、または促進することができる細菌またはファージ分子を指す。

用語「ファージ」および「バクテリオファージ」は本明細書では互換的に使用される。両方の用語が、細菌に感染し、細菌内で複製するウイルスを指す。本明細書で使用される「ファージ」またはバクテリオファージは、プロファージ、溶原性ファージ、休眠性ファージ、テンペレートファージ、インタクトファージ、欠陥ファージ、クリプティックファージおよびサテライトファージ、ファージ尾部バクテリオシン、テリオオシン、ならびに遺伝子導入剤を総称して指す。

本明細書中で使用される場合、「プロファージ」という用語は、バクテリオファージのゲノム物質を意味し、宿主細胞のレプリコンに組み込まれ、宿主と共に複製する。プロファージは特異的に活性化されると、ファージを産生することができる。場合によっては、プロファージは、ファージを産生することができないか、またはファージを産生したことがない（すなわち、欠陥プロファージまたはクリプティックプロファージ）。場合によっては、プロファージはサテライトファージも意味する。用語「プロファージ」および「内因性ファージ」は、本明細書では互換的に用いられる。

本明細書中で使用される場合、用語「テンペレートファージ」または「テンペレートバクテリオファージ」または「プロファージ」は、細菌宿主のＤＮＡ内に存在し、かつ細菌複製サイクルおよび細胞分裂の間、宿主と共に複製するファージを指すために、互換的に使用される。

本明細書中で使用される場合、細菌もしくは生物の「自然状態」または細菌の「自然状態」という用語は、遺伝子工学によって改変されていない生物を指す。いくつかの場合では、細菌もしくは生物の「自然状態」または細菌の「自然状態」という用語は、定義された要素に関して改変された同質遺伝子型株と比較して、遺伝子工学によって改変されていない生物を指す。したがって、細菌は１つの定義された要素に関してはその自然状態にあるが、別の定義された要素に関してはその自然状態にない場合がある。いくつかの実施形態では、細菌は、その自然または天然状態において、同じまたは異なるファージまたはプロファージの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、その天然または自然状態において１つ以上の同じまたは異なった型のファージまたはプロファージを含む細菌は、操作された株のための前駆株として機能する。その結果、同じ１つ以上の内因性ファージまたはプロファージは、例えば前駆株または親株がその天然状態においてそのような内因性ファージまたはプロファージを含む場合、遺伝子操作された細菌中にも存在し得る。したがって、遺伝子操作された細菌は、その自然状態においてプロファージも含む（ここで、ファージは、その自然状態にある定義された要素である）。

「内因性ファージ」または「内因性プロファージ」はまた、細菌（およびその親株）の自然状態において存在するファージを指す。

本明細書中で使用される場合、「ファージノックアウト」または「不活化ファージ」という用語は、もはやファージ粒子を産生および／またはパッケージングすることができないように、あるいは野生型ファージ配列より少ないファージ粒子を産生するように改変されたファージを指す。いくつかの実施形態では、不活化ファージまたはファージノックアウトとは、溶原性状態にあるテンペレートファージの不活化、すなわちプロファージの不活化を指す。このような改変は、ファージにおける突然変異を指す；このような突然変異には、ファージゲノム内の１つ以上の位置、例えば、ファージゲノム内の１つ以上の遺伝子内における、挿入、欠失（ファージゲノムの部分的または完全な欠失）、置換、逆位が含まれる。

本明細書中で使用される場合、「同質遺伝子型」細菌株という用語は、遺伝的に同一であるか、または定義された変化を含むが、他の点では同一である細菌株を指す。例えば、同質遺伝子型突然変異体は、典型的には、一方が１つ以上の既知の遺伝子またはタンパク質における定義された突然変異を含むことを除いて、同一である２つの株を指す。したがって、ファージフリーまたはファージレス株は、プロファージを含む対応する同質遺伝子型株を有し、該プロファージは誘導されて、細菌細胞からファージ粒子を放出することができる。

本明細書中で使用される場合、形容詞「ファージフリー（ｐｈａｇｅ−ｆｒｅｅ）」、「ファージフリー（ｐｈａｇｅｆｒｅｅ）」および「ファージレス（ｐｈａｇｅｌｅｓｓ）」は、１つ以上のプロファージ（そのうちの１つ以上が改変されている）を含む細菌または株を特徴付けるために、互換的に使用される。改変は、プロファージが誘導される能力またはファージ粒子を放出する能力の喪失をもたらし得る。あるいは、改変は、改変を伴わない同質遺伝子型株と比較して、より低効率もしくはより低頻度の誘導、またはより低効率もしくはより低頻度のファージ放出をもたらし得る。ファージを誘導および放出する能力は、本明細書中に記載されるようなプラークアッセイを使用して測定され得る。

本明細書中で使用される場合、「溶原菌（ｌｙｓｏｇｅｎ）」という用語は、溶菌に必要なファージ遺伝子が発現されない、溶原サイクルにあるプロファージを含む細菌を指す。

本明細書中で使用される場合、ファージ誘導とは、溶菌性ファージ遺伝子が活性化され、ファージ粒子が産生されて溶菌が起こる、溶原性プロファージのライフサイクルの一部を指す。

本明細書中で使用される場合、誘導という用語は、溶原性感染の増殖性感染への変換を指し、すなわち、誘導されたプロファージは、ファージ粒子の産生および放出を開始する。誘導はしばしば、細菌ＤＮＡへの損傷によって刺激され、細菌染色体からのプロファージの切除を含んでも含まなくてもよい。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、障害、疾患または状態の処置、予防、管理、重症度の軽減、改善、治癒に有用である。いくつかの実施形態では、障害は自己免疫障害である。本明細書中で使用される場合、「自己免疫障害」には、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アディソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性じん麻疹、軸索および神経ニューロパシー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コガン症候群、寒冷凝集素病、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎を伴う肉芽腫症（ＧＰＡ）、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠ヘルペス、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性特発性関節炎、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線形ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ループス（全身性エリテマトーデス）、慢性ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ミュシャ・ハーバーマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼部瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（連鎖球菌感染性小児自己免疫神経精神障害、ＰｅｄｉａｔｒｉｃＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＮｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンバーグ症候群、神経痛性筋萎縮症（Ｐａｒｓｏｎｎａｇｅ−Ｔｕｒｎｅｒｓｙｎｄｒｏｍｅ）、扁平部炎（末梢ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子と精巣の自己免疫、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、喘息、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、水疱性皮膚病、白斑、およびウェゲナー肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、障害は移植片対宿主病である。

いくつかの実施形態では、疾患は代謝疾患である。本明細書中で使用される場合、「代謝疾患」には、１型糖尿病；２型糖尿病；メタボリックシンドローム；バルデ・ビードル症候群；プラダー・ウィリー症候群；非アルコール性脂肪性肝疾患；結節性硬化症；オルブライト症候群；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）欠損；ｓｉｎｇｌｅ−ｍｉｎｄｅｄ１（ＳＩＭ１）欠損；レプチン欠損；レプチン受容体欠損；プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）欠陥；プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン１型（ＰＣＳＫ１）欠損；Ｓｒｃホモロジー２Ｂ１（ＳＨ２Ｂ１）欠損；プロホルモン転換酵素１／３欠損；メラノコルチン−４−受容体（ＭＣ４Ｒ）欠損；ウィルムス腫瘍、無虹彩症、泌尿生殖器奇形、および精神遅滞（ＷＡＧＲ）症候群；偽性副甲状腺機能低下症１Ａ型；脆弱Ｘ症候群；Ｂｏｒｊｅｓｏｎ−Ｆｏｒｓｍａｎｎ−Ｌｅｈｍａｎｎ症候群；アルストレーム症候群；コーエン症候群；および尺骨・乳房症候群を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、障害は癌である。「癌」または「癌性」は、無秩序な細胞増殖を特徴とする生理学的状態を指すために使用される。いくつかの実施形態では、癌は腫瘍を指す。「腫瘍」は、任意の腫瘍性細胞の成長または増殖、あるいは任意の前癌性または癌性の細胞または組織を指すために使用される。腫瘍は悪性であっても良性であってもよい。癌の種類には、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌（例えば、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性線維性組織球腫）、脳癌（例えば、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫）、気管支腫瘍、中枢神経系腫瘍、乳癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、胆嚢癌、消化器癌、消化管カルチノイド、消化管間質性腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、心臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、下咽頭癌、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病）、肝癌、肺癌、リンパ腫（例えば、エイズ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫）、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔癌、副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌（例えば、基底細胞癌、黒色腫）、小腸癌、胃癌、奇形腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、珍しい小児癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。癌処置の副作用には、日和見自己免疫障害、全身毒性、貧血、食欲不振、膀胱内壁の刺激、出血および紫斑（血小板減少症）、味覚または嗅覚の変化、便秘、下痢、口渇、嚥下障害、浮腫、疲労、脱毛（脱毛症）、感染症、不妊症、リンパ浮腫、口内炎、吐き気、痛み、末梢神経障害、虫歯、尿路感染症、および／または記憶および集中に関する問題が含まれ得るが、これらに限定されない（米国国立癌研究所）。いくつかの実施形態では、障害は高アンモニア血症障害である。

いくつかの実施形態では、障害は、高アンモニア血症、尿素サイクル異常症、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、メープルシロップ尿症、イソ吉草酸血症、高シュウ酸尿症、フェニルケトン尿症を含むが、これらに限定されない稀な疾患である。

上述の障害の１つ以上の処置、予防、重症度の軽減、管理、改善、治癒のための例示的な回路は、係属中の共同所有の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３４２００（出願日２０１６年５月２５日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願日２０１７年１月１１日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０３（出願日２０１７年２月３日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０９（出願日２０１６年２月４日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５６３（出願日２０１７年２月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５５２（出願日２０１７年２月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９２２（出願日２０１６年７月２９日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９７８１（出願日２０１６年８月３１日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３７０９８（出願日２０１６年６月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９０５２（出願日２０１６年１２月２８日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（出願日２０１６年１１月１６日）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に援用される。

本明細書において使用される場合、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、明確に反対であることが示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

「および／または」という語句は、列挙における要素の間で使用される場合、（１）単一の列挙された要素のみが存在すること、または（２）列挙の１つより多い要素が存在することのいずれかを意味することを意図する。例えば、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」は、その選択が、Ａ単独；Ｂ単独；Ｃ単独；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；またはＡ、Ｂ、およびＣであり得ることを示す。「および／または」という語句は、列挙における要素の「少なくとも１つ」または「１つもしくは複数（１つ以上）」と交換可能に使用され得る。

（細菌）
いくつかの実施形態では、本明細書中に開示される細菌は、内因性ファージゲノムに対する１つ以上の突然変異または改変を含む。いくつかの実施形態では、細菌は、その自然状態または天然状態においてバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態では、ファージは、特定の細菌の全ての分離株に存在する。いくつかの実施形態では、ファージは、同じ種、株、または亜株の細菌に存在する。いくつかの実施形態では、ファージはインタクトプロファージである。いくつかの実施形態では、ファージは欠陥プロファージである。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ファージを溶菌サイクルに入ることができないようにする。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、溶菌サイクルを経るファージの能力に影響を及ぼし、例えば、溶菌段階を経ることができる所与の集団内の細菌の頻度または数を減少させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ファージが他の細菌に感染するのを防止する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は細菌の適応度を変化させる（例えば、増加または減少させる）。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異はエフェクター機能を変化させる（例えば、増加または減少させる）。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は細菌の適応度を変化させない。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異はエフェクター機能を変化させない。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、大規模製造を含む、細菌が製造または産生されるプロセスを改善する。これらの実施形態のいずれかにおいて、細菌は、さもなければその自然状態であり得る。あるいは、これらの実施形態のいずれかにおいて、細菌は１つ以上のエフェクター分子をコードする遺伝子配列を含むように、さらに遺伝子操作され得る。

いくつかの実施形態では、１つ以上の変異ファージを含む細菌が細菌シャシー（ｃｈａｓｓｉｓ）として使用され得、それに遺伝子回路が追加または改変される。

いくつかの実施形態では、細菌は非病原性細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は共生細菌である。いくつかの実施形態では、細菌はプロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は、病原性を低減させるか、または取り除くように改変または突然変異された天然の病原性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陰性細菌である。いくつかの実施形態では、非病原性細菌はグラム陽性細菌である。例示的な細菌には、限定されないが、バチルス属、バクテイロデス属、ビフィドバクテリウム属、ブレビ細菌属、クロストリジウム属、エンテロコッカス属、大腸菌、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、サッカロミセス属、およびスタフィロコッカス属、例えば、バチルス・コアグランス、バチルス・サブティリス、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・サブティリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロングム、クロストリジウム・ブチリカム、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ジョンソニ、ラクトバチルス・パラカセイ、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ラクティス、およびサッカロミセス・ブラウディが含まれる。特定の実施形態では、細菌は、バクテロイデス・フラジリス、バクテロイデス・テタイオタオミクロン、バクテロイデス・サブティリス、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ラクティス、クロストリジウム・ブチリカム、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロイテリ、およびラクトコッカス・ラクティスからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、細菌は、最も特徴付けられているプロバイオティクスの１つに進化した腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅｆａｍｉｌｙ）のグラム陰性細菌である、大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（Ｅ．ｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ）である（Ｕｋｅｎａら、２００７年）。その株はその完全な無害性により特徴付けられ（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）、ＧＲＡＳ（一般に安全と認識されている（ｇｅｎｅｒａｌｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄａｓｓａｆｅ））ステータスを有する（Ｒｅｉｓｔｅｒら、２０１４年、下線は筆者による）。ゲノムシークエンシングにより、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅが重要な毒性因子（例えば、大腸菌α−溶血素、Ｐ−線毛付着因子）を欠失していることが確認された（Ｓｃｈｕｌｔｚ、２００８年）。さらに、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは病原性接着因子を保有せず、腸毒素または細胞毒素を全く産生せず、侵襲性ではなく、尿路病原性ではないことが示されている（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）。早くも１９１７年に、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは、治療的使用のために、Ｍｕｔａｆｌｏｒと呼ばれる医薬用カプセルにパッケージ化された。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの治療効果および安全性が説得力のある形で証明されていることは、一般に認められている（Ｕｋｅｎａら、２００７年）。

いくつかの実施形態では、本開示の細菌は腫瘍標的細菌である。腫瘍標的細菌は、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された、２０１７年１月１１日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。

当業者は、本明細書に開示される遺伝子改変が、細菌の他の種、株、および亜型に適合され得ることを理解するであろう。さらに、１つ以上の異なる種由来の遺伝子を相互に導入することができ、例えば、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）由来のＰＡＬ遺伝子を大腸菌において発現させることができる（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、１９９９年）。

これらの実施形態のいずれかにおいて、本明細書中に開示されるかまたは当技術分野で公知であり、本開示に従って使用され得る細菌種のいずれかは、１つ以上の内因性ファージゲノムへの１つ以上の突然変異または改変を含む。いくつかの実施形態では、内因性ファージゲノムへの改変は、ファージゲノム内の１つ以上の欠失、挿入、置換、もしくは逆位、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、改変は、ファージゲノム内の１つ以上の欠失である。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子が欠失している。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子が部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、改変は、ファージゲノムにおける１つ以上の挿入である。いくつかの実施形態では、挿入は、本明細書に記載の抗生物質カセットをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ファージゲノム内の１つ以上の遺伝子が代替の遺伝子配列で置換される。いくつかの実施形態では、置換は、抗生物質カセットをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子の配列全体が逆位している。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子の部分配列が逆位している。

非改変大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば、消化管もしくは血清中の防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎら、２００９年）、または投与後数時間もしくは数日の死滅スイッチ（ｋｉｌｌｓｗｉｔｃｈ）の活性化によって破壊され得る。したがって、遺伝子操作された細菌は、継続的な投与を必要とする場合がある。いくつかの実施形態では、滞留時間はヒト対象について計算される。ｉｎｖｉｖｏでの滞留時間は、本発明の遺伝子操作された細菌について計算され得る（例えば、参照によりその全内容が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６８を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬをコードする遺伝子を含み、ＰＡＬ遺伝子は直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、細菌は非天然のＰＡＬ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌は天然のＰＡＬ遺伝子の追加コピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然ではＰＡＬ遺伝子に関連していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に開示されるプロモーターのいずれか１つ以上である。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＨをコードする遺伝子を含み、ＰＡＨ遺伝子は直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、細菌は非天然のＰＡＨ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌は天然のＰＡＨ遺伝子の追加コピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然ではＰＡＨ遺伝子に関連していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に開示されるプロモーターのいずれか１つ以上である。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤをコードする遺伝子を含み、ＬＡＡＤ遺伝子は直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、細菌は非天然のＬＡＡＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌は天然のＬＡＡＤ遺伝子の追加コピーを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは天然ではＬＡＡＤ遺伝子に関連していない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本明細書に開示されるプロモーターのいずれか１つ以上である。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする遺伝子をさらに含む。特定の実施形態では、細菌は、フェニルアラニントランスポーターをコードする天然遺伝子の追加コピーを含み、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。代替の実施形態では、細菌は、非天然フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子を含み、フェニルアラニントランスポーター遺伝子は、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結されている。両方の実施形態は、「非天然」フェニルアラニントランスポーターという用語に包含される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、天然ではｐｈｅＰ遺伝子に関連していない。いくつかの実施形態では、同じプロモーターが、ＰｈｅＰおよびＰＡＬおよび／またはＰＡＨおよび／またはＬＡＡＤの発現を制御する。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰの発現を制御するプロモーターは、ＰＡＬおよび／またはＰＡＨおよび／またはＬＡＡＤの発現を制御するプロモーターとは異なる。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰの発現を制御するプロモーターは、本明細書に開示されるプロモーターのいずれか１つ以上である。

いくつかの実施形態では、ＰＡＬ、ＰＡＨ、ＬＡＡＤ、および／またはｐｈｅＰに作動可能に連結されているプロモーターは、外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の小腸に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の大腸に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素または嫌気性条件および／または低酸素条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的である分子または代謝産物、例えばプロピオネートの存在によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、テトラサイクリンへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、アラビノースへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＩＰＴＧへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ラムノースまたは当業者に既知の他の化学的および／もしくは栄養性誘導物質への曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、外因性の環境温度によって直接的または間接的に制御される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＩＰＴＧまたは他のｌａｃＩ結合性化合物への曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ラムノースへの曝露によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、温度の上昇によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、温度の低下によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。そのような分子は、テトラサイクリンまたはＩＰＴＧまたはアラビノースまたは当業者に既知の他の化学的および／もしくは栄養性誘導物質であり得る。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｉｎｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される。ｉｎｖｉｖｏ投与前の菌株の培養中に提供されるこのような条件の非限定的な例には、低酸素、嫌気性、微好気性もしくは好気性条件、他の定義された酸素レベル（以下に例示されるものなど）、アラビノースの存在、ＩＰＴＧ、ラムノースまたは本明細書に記載されているか当技術分野で公知の他の化学的および／もしくは栄養性誘導物質の存在が含まれる。いくつかの実施形態では、培養容器中の条件は特定の酸素レベル、例えば、酸素１％〜１０％、酸素１０％〜２０％、酸素２０％〜３０％、酸素３０％〜４０％、酸素４０％〜５０％、酸素６０％〜７０％、酸素７０％〜８０％、酸素８０〜９０％、酸素９０％〜１００％、および本明細書に記載される他の酸素レベルに設定され、その設定点においてプロモーターは直接的または間接的に誘導される。

（バクテリオファージ）
いくつかの実施形態では、本発明の細菌は、１つ以上の溶原性ファージ、休眠性ファージ、テンペレートファージ、インタクトファージ、欠陥ファージ、クリプティックファージもしくはサテライトファージ、またはバクテリオシン／ファージ尾部または遺伝子導入剤を、それらの自然状態で含む。いくつかの実施形態では、プロファージまたはバクテリオファージは、目的の特定の細菌の全ての分離株に存在する。いくつかの実施形態では、細菌はプロバイオティクス細菌である。いくつかの実施形態では、細菌は、このようなバクテリオファージの１つ以上を含む親株の遺伝子操作された誘導体である。従って、本発明のこのような細菌は、それらの自然状態であってもよく、または１つ以上のエフェクター分子の発現または産生のための回路を含むようにさらに遺伝的に改変されていてもよい。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、細菌は、バクテリオファージの特性または挙動を変化させる、プロファージまたはバクテリオファージゲノム内の１つ以上の改変または突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、プロファージが溶菌プロセスに入ること、またはそれを完了することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージが同じまたは異なる型の他の細菌に感染することを妨げる。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、細菌宿主の適応度を変化させる（例えば、減少または増大させる）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変化させる（例えば、減少または増大させる）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、細菌宿主の適応度を変化させない（例えば、減少または増大させない）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変化させない（例えば、減少または増大させない）。

ファージゲノムサイズは、最小のＬｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃファージＬ５（２，４３５ｂｐ）、〜１１．５ｋｂｐ（例えば、マイコプラズマファージＰ１）、〜２１ｋｂｐ（例えば、ラクトコッカスファージｃ２）、および〜３０ｋｂｐ（例えば、ＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａファージＦ１０８）から、ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍファージＧのほぼ５００ｋｂｐのゲノムまで大きく変動する（ＨａｔｆｕｌｌａｎｄＨｅｎｄｒｉｘ；ＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓａｎｄｔｈｅｉｒＧｅｎｏｍｅｓ，ＣｕｒｒＯｐｉｎＶｉｒｏｌ．２０１１年１０月１日；１（４）：２９８−３０３頁、およびその中の参考文献）。ファージゲノムは、１０個未満の遺伝子から数百個までの遺伝子をコードし得る。細菌プラスミドに組み込まれるファージのいくつかの例も存在するが、テンペレートファージまたはプロファージは、通常、細菌宿主の染色体に組み込まれている（ＷａｌｄｏｒＭＫ，ＦｒｉｅｄｍａｎＤＩ，ＡｄｈｙａＳ編ＰｈａｇｅｓＴｈｅｉｒＲｏｌｅｉｎＢａｃｔｅｒｉａｌＰａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ワシントンＤＣ：ＡＳＭＰｒｅｓｓ；２００５年、３７−５４頁中のＬｉｔｔｌｅ，Ｌｏｙｓｏｇｅｎｙ，ＰｒｏｐｈａｇｅＩｎｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄＬｙｓｏｇｅｎｉｃＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）。場合によっては、ファージは常に細菌宿主染色体内の同じ位置にあり、この位置は各ファージに特異的、すなわち、異なるファージは異なる位置にある。他のファージは、それらが多数の異なる場所で組み込まれ得るという点で、より許容性である。

従って、本開示の細菌は、長さが変化し得る１つ以上のファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約１ｂｐ〜１０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、細菌は、長さが少なくとも約１ｂｐ〜１０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約１０ｋｂ〜２０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約２０ｋｂ〜３０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約３０ｋｂ〜４０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約３０ｋｂ〜４０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約４０ｋｂ〜５０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約５０ｋｂ〜６０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が、長さが少なくとも約６０ｋｂ〜７０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約７０ｋｂ〜８０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約８０ｋｂ〜９０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約９０ｋｂ〜１００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約１００ｋｂ〜１２０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約１２０ｋｂ〜１４０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約１４０ｋｂ〜１６０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約１６０ｋｂ〜１８０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約１８０ｋｂ〜２００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約２００ｋｂ〜１８０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約１６０ｋｂ〜２５０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約２５０ｋｂ〜３００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約３００ｋｂ〜３５０ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約３５０ｋｂ〜４００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約４００ｋｂ〜５００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが少なくとも約５００ｋｂ〜１０００ｋｂの範囲のバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、長さが１０００ｋｂを超えるバクテリオファージゲノムを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の細菌は、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子を含有する１つ以上のファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１〜５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約５〜１０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１０〜１５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１５〜２０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約２０〜２５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約２５〜３０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約３０〜３５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約３５〜４０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約４０〜４５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約４５〜５０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約５０〜５５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約５５〜６０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約６０〜６５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約６５〜７０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約７０〜７５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約７５〜８０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約８０〜８５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約８５〜９０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約９０〜９５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約９５〜１００個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１００〜１１５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１１５〜１２０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１２０〜１２５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１２５〜１３０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１３０〜１３５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１３５〜１４０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１４０〜１４５個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１４５〜１５０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１５０〜１６０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１６０〜１７０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１７０〜１８０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１８０〜１９０個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約１９０〜２００個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、少なくとも約２００〜３００個の遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約３００個を超える遺伝子を含有するバクテリオファージゲノムを含む。

いくつかの実施形態では、ファージは、常にまたはほとんど常に、特定の種の細菌宿主染色体内の同じ場所または位置にある。いくつかの実施形態では、ファージは、特定の種の宿主染色体内の異なる位置に組み込まれて見出される。いくつかの実施形態では、ファージはプラスミド上にある。

プロファージ配列の存在はまた、ファージなしの同質遺伝子型株には存在しない細菌に特定の特性を付与し得る。例えば、プロファージは、いくつかの場合において、細菌が抗生物質耐性を獲得すること、新しい環境ニッチに存在すること、接着を改善すること、または病原性になることを可能にし得る。加えて、溶菌プロセスを通じて、ある細菌由来のＤＮＡがピックアップされ、別の細菌において放出され得るため、ファージは、遺伝子導入のためのビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）として機能する。

従って、いくつかの実施形態では、細菌は、該細菌に抗生物質耐性を付与するファージを含む。いくつかの実施形態では、細菌は、該細菌にさらなる適応度を付与するファージを含む。いくつかの実施形態では、細菌は、該細菌に新しい環境で増殖する能力を付与するファージを含む。いくつかの実施形態では、細菌は、宿主遺伝物質を同じまたは異なる種の別の細菌に移動する能力を付与するファージを含む。

いくつかの実施形態では、プロファージは、欠陥プロファージまたはクリプティックプロファージであり得る。欠陥プロファージは、もはや溶菌サイクルを経ることができない。クリプティックプロファージは、溶菌サイクルを経ることができないか、または溶菌サイクルを経たことがない場合がある。細菌ゲノムのプロファージの全レパートリーの機能的研究は、プロファージの大部分があるレベルで欠陥があることを示唆する：切除、ビリオン形成、溶解、または感染能力（Ｂｏｂａｙら、２０１４年）。欠陥プロファージまたはクリプティックプロファージは、突然変異による崩壊および／または何千もの細菌複製サイクルにわたる溶菌サイクルに必須の１つ以上の遺伝子の損失の結果として、多くの細菌において高レベルの存在量に達し得る（Ｂｏｂａｙら、Ｐｅｒｖａｓｉｖｅｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎｏｆｄｅｆｅｃｔｉｖｅｐｒｏｐｈａｇｅｓｂｙｂａｃｔｅｒｉａ、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ）。注目すべきことに、欠陥プロファージはまた、相同組換え機能を有するタンパク質をコードする遺伝子、さらなる感染の防止のための機構、または（例えば他の隣接する細菌種の増殖阻害を通じて、栄養素のための競合において有用であり得る）バクテリオシンを含む、適応性のまたは有利な機能を宿主にもたらし得る多くの遺伝子をしばしば含む。例えば、いくつかの欠陥プロファージは、大腸菌Ｋ−１２（例えば、Ｒａｃ、ｅ１４、ＤＬＰ１２、およびＱＩＮ）およびバチルス・サブティリス（例えば、１８６およびＳＫＩＮ）において特徴付けられている（Ｃａｓｊｅｎｓ、２００１年、およびその中の参考文献）。これらのファージの各々は、いくつかの機能的遺伝子を保有する。例えば、Ｒａｃは、ＲｅｃＥ相同組換えシステムをコードする。

従って、いくつかの実施形態では、細菌は、１つ以上の欠陥またはクリプティックプロファージを含む。いくつかの実施形態では、プロファージ遺伝子は相同組換え機能を付与する。いくつかの実施形態では、プロファージ遺伝子は、さらなる感染を予防する機能を付与する。いくつかの実施形態では、プロファージ遺伝子は、バクテリオシンを付与する。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は、炭素利用を増加させること、様々な条件下での増殖を増加させるために浸透圧、酸化および酸ストレスに対する耐性を向上させること、リンおよび窒素利用を強化すること、またはバイオフィルム形成に影響を及ぼすことによって、悪条件下での増殖を促進する。

いくつかの実施形態では、細菌は、１つ以上のサテライトファージゲノムを含む。サテライトファージは、それ自身の構造タンパク質遺伝子を持たないその他の点では機能的なファージであり、他の特定のファージの構造タンパク質によるカプセル化のために構成されたゲノムを持っている（ＳｉｘおよびＫｌｕｇ、ＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＰ４：ａｓａｔｅｌｌｉｔｅｖｉｒｕｓｄｅｐｅｎｄｉｎｇｏｎａｈｅｌｐｅｒｓｕｃｈａｓｐｒｏｐｈａｇｅＰ２、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第５１巻、第２号、１９７３年２月、３２７〜３４４頁）。従って、いくつかの実施形態では、細菌は、それ自身の構造遺伝子を持たないファージゲノムを含む。

いくつかの実施形態では、細菌は１つ以上のテリオオシンを含む。グラム陽性菌およびグラム陰性菌の両方の多くの細菌は、ファージ頭部を伴わずに機能的であるファージ尾部に似た様々な粒子を産生し（テリオオシンと呼ばれる）、その多くはバクテリオシン特性を有することが示されている（ＧｈｅｑｕｉｒｅおよびＭｏｔ、ＴｈｅＴａｉｌｏｃｉｎＴａｌｅ：ＰｅｅｌｉｎｇｏｆｆＰｈａｇｅ；ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１５年１０月、第２３巻、第１０号に概説されている）。ファージ尾部様バクテリオシンは、収縮性ファージ尾部様（Ｒ型）と、非収縮性だが柔軟なもの（Ｆ型）の２つの異なるファミリーに分類される。従って、いくつかの実施形態では、細菌は、バクテリオシンまたは他の有益な特性を付与する１つ以上のテリオオシンを含む。

いくつかの実施形態では、細菌は、１つ以上の遺伝子導入剤を含む。遺伝子導入剤（ＧＴＡ）は、いくつかの細菌ゲノムによってコードされるファージ様要素である。ＧＴＡはファージに似ているが、典型的なファージを規定する特徴的な能力を欠き、宿主細胞ＤＮＡのランダム断片をパッケージングして、それらを同じ種の他の細菌に水平に移す（Ｌａｎｇら、Ｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒａｇｅｎｔｓ：ｐｈａｇｅ−ｌｉｋｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃｅｘｃｈａｎｇｅ，ＮａｔＲｅｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２年６月１１日；１０（７）：４７２−４８２頁に概説されている）。そこで、ＤＮＡは、相同組換えによって、常在の同族染色体領域（ｃｏｇｎａｔｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌｒｅｇｉｏｎ）を置換することができる。しかしながら、粒子の大部分はＧＴＡをコードする遺伝子を有していないので、これらの粒子はウイルスとして増殖することができない。

いくつかの実施形態では、細菌は、１つ以上の糸状ビリオンを含む。糸状ビリオンは、ｄｓＤＮＡプロファージとして組み込まれる（ＭａｒｖｉｎＤＡら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ、ＰｒｏｇＢｉｏｐｈｙｓＭｏｌＢｉｏｌ．２０１４年４月；１１４（２）：８０−１２２頁に概説されている）。

本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、（例えば、フェニルアラニンの消費のための）１つ以上の酵素およびトランスポーターを発現する本明細書中に記載の遺伝子操作された細菌は、内因性プロファージまたはバクテリオファージゲノム内に１つ以上の改変または突然変異を含む。これらの改変は、プロファージの特性または挙動を変化させ得る。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、実質的に細菌の適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は、改変または突然変異のない同質遺伝子型株の適応度と実質的に同じである。プロファージは、実験的または計算的のいずれかで同定され得る。実験的アプローチは、宿主細菌をＵＶ光または他のＤＮＡ損傷条件に曝露することによって、ファージ粒子を放出するように宿主細菌を誘導することを含む。しかしながら、場合によっては、プロファージが誘導される条件が不明であり、従って、プラークアッセイにおけるプラークの非存在は、プロファージの非存在を必ずしも証明しない。さらに、このアプローチは生存可能なファージの存在のみを示すことができるが、欠陥プロファージは明らかにしない。したがって、ゲノム配列データからのプロファージの計算による同定が、最も好ましい経路となっている。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、エフェクター機能に実質的に影響を及ぼさず、エフェクター機能は、改変または突然変異なしの同質遺伝子型株のエフェクター機能と実質的に同じである。表Ｈは、プロバイオティクス細菌の非限定的な例、およびＰｈａｓｔｅｒスコアリングによって決定された細菌ゲノムに含まれる潜在的なバクテリオファージの数の一覧を提供する。表Ｉは、クロストリジウム株および潜在的なファージゲノムの一覧を提供する。Ｐｈａｓｔｅｒは、生物中のファージ配列をバイオインフォマティックで同定するためのウェブサーバーである（ｈｔｔｐ：／／ｐｈａｓｔｅｒ．ｃａ／）。Ｐｈａｓｔｅｒスコアリングは、ｐｈａｓｔｅｒ．ｃａおよびＺｈｏｕら（“ＰＨＡＳＴ：ＡＦａｓｔＰｈａｇｅＳｅａｒｃｈｔｏｏｌ”、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１１年）３９（ｓｕｐｐｌ２）：Ｗ３４７−Ｗ３５２）およびＡｒｎｄｔら（Ａｒｎｄｔら（２０１６年）ＰＨＡＳＴＥＲ：ａｂｅｔｔｅｒ，ｆａｓｔｅｒｖｅｒｓｉｏｎｏｆｔｈｅＰＨＡＳＴｐｈａｇｅｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２０１６年５月３日）に詳細に記載されている。簡単に説明すると、３つの方法が異なる基準で適用され、与えられた細菌ゲノム配列中のプロファージ領域（インタクト、疑わしい、または不完全）をスコアリングする。第１の方法では、Ｐｈａｓｔｅｒによって同定された特定のファージオルガニズムの数がその領域のＣＤＳの総数の１００％以上である場合、その領域に合計スコア１５０がマークされる。１００％未満の場合、方法２および３が使用される。方法２では、与えられた細菌ゲノム配列中のＰｈａｓｔｅｒによって同定された特定のファージオルガニズムの数が、その領域のＣＤＳの総数の５０％を超える場合、そのファージオルガニズムは、その領域についての主要な潜在的なファージとみなされる；その領域のタンパク質の総数におけるこの表中のそのファージオルガニズムの総数のパーセンテージが計算され、次いで１００倍される；その領域の長さにおけるそのファージオルガニズムの長さのパーセンテージが計算され、次いで５０倍される（ファージ頭部のカプセル化能力が考慮される）。方法３では、特定のファージ関連キーワード（「カプシド」、「頭部」、「インテグラーゼ」、「基盤」、「尾部」、「繊維」、「コート」、「トランスポザーゼ」、「ポータル」、「ターミナーゼ」、「プロテアーゼ」または「リシン」など）のいずれかが存在する場合、見つかったキーワードごとにスコアを１０だけ増加させる。領域のサイズが３０Ｋｂより大きい場合、スコアは１０だけ増加される。その領域に少なくとも４０のタンパク質が存在する場合、スコアは１０だけ増加される。ファージ関連タンパク質および仮想タンパク質の全てが、領域内のタンパク質の総数の７０％を超える場合、スコアは１０だけ増加される。方法２の合計スコアを方法３の合計スコアと比較し、大きい方を領域の合計スコアとして選択する。領域の合計スコアが７０未満である場合、不完全とマークされ、７０〜９０の間である場合、疑わしいとマークされ、９０を超える場合、インタクトとマークされる。

［表Ｈ］一般的なプロバイオティクスの適合株

［表Ｉ］クロストリジウム株

これらの実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載の細菌は、既存のプロファージまたはバクテリオファージゲノム内に１つ以上の改変または突然変異を含む。これらの改変は、プロファージの特性または挙動を変化させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、プロファージが溶菌プロセスに入ること、またはそれを完了することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージが同じまたは異なる型の他の細菌に感染することを妨げる。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、フェニルアラニン消費を改善する。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン消費は、未改変ファージを含む同質遺伝子型株において観察されるレベルと同様のままである。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、実質的に細菌適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は、改変または突然変異なしの同質遺伝子型株の適応度と実質的に同じである。

いくつかの実施形態では、細菌は、既存のプロファージおよび細菌ファージゲノムに対して、少なくとも約１〜２個、少なくとも約２〜３個、少なくとも約３〜４個、少なくとも約４〜５個、少なくとも約５〜６個、少なくとも約６〜７個、少なくとも約７〜８個、少なくとも約８〜９個、少なくとも約９〜１０個、少なくとも約１０〜１１個、少なくとも約１１〜１２個、少なくとも約１２〜１３個、少なくとも約１３〜１４個、少なくとも約１４〜１５個、少なくとも約１５〜１６個、少なくとも約１６〜１７個、少なくとも約１７〜１８個、少なくとも約１８〜１９個、少なくとも約１９〜２０個、少なくとも約２０〜２１個、少なくとも約２１〜２２個、少なくとも約２２〜２３個、少なくとも約２３〜２４個、少なくとも約２４〜２５個、少なくとも約２５〜２６個、少なくとも約２６〜２７個、少なくとも約２７〜２８個、少なくとも約２８〜２９個、少なくとも約２９〜３０個、少なくとも約３０〜３１個、少なくとも約３１〜３２個、少なくとも約３２〜３３個、少なくとも約３３〜３４個、少なくとも約３４〜３５個、少なくとも約３５〜３６個、少なくとも約３６〜３７個、少なくとも約３７〜３８個、少なくとも約３８〜３９個、少なくとも約３９〜４０個、少なくとも約４０〜４１個、少なくとも約４１〜４２個、少なくとも約４２〜４３個、少なくとも約４３〜４４個、少なくとも約４４〜４５個、少なくとも約４５〜４６個、少なくとも約４６〜４７個、少なくとも約４７〜４８個、少なくとも約４８〜４９個、少なくとも約４９〜５０個、少なくとも約５０〜５１個、少なくとも約５１〜５２個、少なくとも約５２〜５３個、少なくとも約５３〜５４個、少なくとも約５４〜５５個、少なくとも約５５〜５６個、少なくとも約５６〜５７個、少なくとも約５７〜５８個、少なくとも約５８〜５９個、少なくとも約５９〜６０個、少なくとも約６０〜６１個、少なくとも約６１〜６２個、少なくとも約６２〜６３個、少なくとも約６３〜６４個、少なくとも約６４〜６５個、少なくとも約６５〜６６個、少なくとも約６６〜６７個、少なくとも約６７〜６８個、少なくとも約６８〜６９個、少なくとも約６９〜７０個、少なくとも約７０〜７１個、少なくとも約７１〜７２個、少なくとも約７２〜７３個、少なくとも約７３〜７４個、少なくとも約７４〜７５個、少なくとも約７５〜７６個、少なくとも約７６〜７７個、少なくとも約７７〜７８個、少なくとも約７８〜７９個、少なくとも約７９〜８０個、少なくとも約８０〜８１個、少なくとも約８１〜８２個、少なくとも約８２〜８３個、少なくとも約８３〜８４個、少なくとも約８４〜８５個、少なくとも約８５〜８６個、少なくとも約８６〜８７個、少なくとも約８７〜８８個、少なくとも約８８〜８９個、少なくとも約８９〜９０個、少なくとも約９０〜９１個、少なくとも約９１〜９２個、少なくとも約９２〜９３個、少なくとも約９３〜９４個、少なくとも約９４〜９５個、少なくとも約９５〜９６個、少なくとも約９６〜９７個、少なくとも約９７〜９８個、少なくとも約９８〜９９個、少なくとも約９９〜１００個、または少なくとも約１００個以上の改変または突然変異を含む。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、エフェクター機能、例えばフェニルアラニン消費を改善する。いくつかの実施形態では、エフェクター機能、例えば、フェニルアラニン消費は、未改変ファージを含む同質遺伝子型株において観察されるものと同様のままである。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、実質的に細菌適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は、改変または突然変異なしの同質遺伝子型株の適応度と実質的に同じである。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ改変なしの同質遺伝子型株と比較して、プロファージ溶菌プロセスのエントリ（ｅｎｔｒｙ）または完了を、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１００〜１０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、プロファージ溶菌処理のエントリまたは完了を完全に妨げる。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ改変なしの同質遺伝子型株と比較して、プロファージ溶菌プロセスのエントリまたは完了を、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％減少させる。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ改変なしの同質遺伝子型株と比較して、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１０〜２０倍、少なくとも約２０〜３０倍、少なくとも約３０〜４０倍、少なくとも約４０〜５０倍、少なくとも約５０〜６０倍、少なくとも約６０〜７０倍、少なくとも約７０〜８０倍、少なくとも約８０〜９０倍、少なくとも約９０〜１００倍、または少なくとも約１００〜１０００倍、ファージが同じまたは異なる型の他の細菌に感染することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または変異は、ファージが同じまたは異なる型の他の細菌に感染することを完全に妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％、ファージが同じまたは異なる型の他の細菌に感染することを妨げる。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ改変なしの同質遺伝子型株と比較して、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、または少なくとも約１００〜１０００倍、細菌宿主の適応度を変化させる（例えば、減少または増大させる）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ改変なしの同質遺伝子株と比較して、例えば、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％、細菌宿主の適応度を変化させる（例えば、減少または増大させる）。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、または少なくとも約１００〜１０００倍変化させる（例えば、減少または増大させる）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を、ファージ改変なしの同質遺伝子型株と比較して、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％変化させる（例えば、減少または増大させる）。

いくつかの実施形態では、突然変異は、ファージゲノム配列内の１つ以上の欠失を含む。本明細書中で使用される場合、「欠失」は、ポリヌクレオチド配列からの１つ以上のヌクレオチドの除去を指す。いくつかの実施形態では、突然変異は、ファージゲノム配列への１つ以上の挿入を含む。本明細書中で使用される場合、「挿入」は、ポリヌクレオチド配列への１つ以上のヌクレオチドの付加を指す。いくつかの実施形態では、抗生物質カセットが、ファージゲノム配列内の１つ以上の位置に挿入され得る。いくつかの実施形態では、突然変異は、ファージゲノム配列内の１つ以上の置換を含む。本明細書中で使用される場合、「置換」は、ポリヌクレオチド配列内の１つ以上のヌクレオチドを同数のヌクレオチドで置換することを指す。いくつかの実施形態では、突然変異は、ファージゲノム配列内の１つ以上の逆位を含む。本明細書中で使用される場合、「逆位」は、２つ以上のヌクレオチドを含むセグメントがポリヌクレオチド配列内で末端と末端を逆にされた場合を指す。いくつかの実施形態では、逆位は、特定のフリッパーゼによって支配され得る。複数レベルの制御を含む例示的な回路が、本明細書に例示されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される共同所有の係属中のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３９４３４にも記載されている。

いくつかの実施形態では、ファージゲノム内の改変は、１つ以上のファージゲノム遺伝子内の挿入、欠失、置換、または逆位の２つ以上の組み合わせである。

本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、ファージゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のフレームシフト突然変異を生じ得る。本明細書中で使用される場合、フレームシフト突然変異（フレーミングエラーまたはリーディングフレームシフトとも呼ばれる）は、３で割り切れないＤＮＡ配列中の多数のヌクレオチドの挿入欠失（挿入または欠失）によって引き起こされる遺伝的変異を指す。配列中のより早い場所で欠失または挿入が発生するほど、タンパク質はより変化する。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、ファージゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のミスセンス突然変異を生じ得る。本明細書中で使用される場合、ミスセンス突然変異とは、単一の塩基対の変化が、得られるタンパク質における異なるアミノ酸の置換を引き起こす場合を指す。このアミノ酸置換は影響を有さないか、またはタンパク質を非機能性にし得る。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、ファージゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のナンセンス突然変異を生じ得る。本明細書中で使用される場合、ナンセンス突然変異は、遺伝暗号によって特定される２０個のアミノ酸のうちの１つに対応するセンスコドンが鎖終結コドンに変化し、それによって目的のポリぺプチドがトランケーションされる（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）突然変異を指す。

いくつかの実施形態では、ファージゲノム内の改変は、１つ以上のファージゲノム遺伝子内の２つ以上のフレームシフト、ナンセンスまたはミスセンス突然変異の組み合わせである。いくつかの実施形態では、改変されたバクテリオファージは細菌染色体上に位置する。いくつかの実施形態では、改変されたバクテリオファージは細菌プラスミド上に位置する。いくつかの実施形態では、プラスミドが改変される。いくつかの実施形態では、プラスミドが完全に除去される。いくつかの実施形態では、ファージまたはプロファージは、特定の種のすべての分離株に存在する。いくつかの実施形態では、プロファージは、特定の門、目、亜目、ファミリー、クラス、サブクラス属、種、亜種、またはクレードのすべての分離株に存在する。

（突然変異）
いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約１〜５００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約５００〜１０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約２０００〜３０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約３０００〜４０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約４０００〜５０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約５０００〜６０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約６０００〜７０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約７０００〜８０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約８０００〜９０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約９０００〜１００００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１以上の突然変異は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１５０００〜２００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約２００００〜２５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約２５０００〜３００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約３００００〜３５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約３５０００〜４００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約４５０００〜５００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約５００００〜５５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約５５０００〜６００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約６００００〜６５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約６５０００〜７００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約７００００〜７５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約７５０００〜８００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約８５０００〜９００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約９００００〜９５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約９５０００〜１０００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１０００００〜１１００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１１００００〜１２００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１２００００〜１３００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１３００００〜１４００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１４００００〜１５００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１５００００〜２０００００塩基対のファージゲノム、または少なくとも約２０００００塩基対超のファージゲノムを含む。特定の一実施形態では、９６８７塩基対のファージゲノムが突然変異している。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドは連続している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約１〜２％、少なくとも約２〜３％、少なくとも約３〜４％、少なくとも約４〜５％、少なくとも約５〜６％、少なくとも約６〜７％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１０〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜１６％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約３０〜４０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約５０〜６０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約６０〜７０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約７０〜８０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約８０〜９０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約９０〜１００％が突然変異している。

いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が突然変異している。いくつかの実施形態では、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、または１２０個の遺伝子が突然変異している。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が完全にまたは部分的に突然変異している。一実施形態では、７４個の遺伝子が完全にまたは部分的に突然変異している。

いくつかの実施形態では、ファージゲノム内の遺伝子の少なくとも約１％〜２％、少なくとも約２％〜３％、少なくとも約３％〜４％、少なくとも約４％〜５％、少なくとも約５％〜６％、少なくとも約６％〜７％、少なくとも約７％〜８％、少なくとも約８％〜９％、少なくとも約９％〜１０％、少なくとも約１０％〜１１％、少なくとも約１１％〜１２％、少なくとも約１２％〜１３％、少なくとも約１３％〜１４％、少なくとも約１４％〜１５％、少なくとも約１５％〜１６％、少なくとも約１６％〜１７％、少なくとも約１７％〜１８％、少なくとも約１８％〜１９％、少なくとも約１９％〜２０％、少なくとも約２０％〜２１％、少なくとも約２１％〜２２％、少なくとも約２２％〜２３％、少なくとも約２３％〜２４％、少なくとも約２４％〜２５％、少なくとも約２５％〜２６％、少なくとも約２６％〜約２７％、少なくとも約２７％〜２８％、少なくとも約２８％〜２９％、少なくとも約２９％〜３０％、少なくとも約３０％〜３１％、少なくとも約３１％〜３２％、少なくとも約３２％〜３３％、少なくとも約３３％〜３４％、少なくとも約３４％〜３５％、少なくとも約３５％〜３６％、少なくとも約３６％〜３７％、少なくとも約３７％〜３８％、少なくとも約３８％〜３９％、少なくとも約３９％〜４０％、少なくとも約４０％〜４１％、少なくとも約４１％〜４２％、少なくとも約４２％〜４３％、少なくとも約４３％〜４４％、少なくとも約４４％〜４５％、少なくとも約４５％〜４６％、少なくとも約４６％〜４７％、少なくとも約４７％〜４８％、少なくとも約４８％〜４９％、少なくとも約４９％〜５０％、少なくとも約５０％〜５１％、少なくとも約５１％〜５２％、少なくとも約５２％〜５３％、少なくとも約５３％〜５４％、少なくとも約５４％〜５５％、少なくとも約５５％〜５６％、少なくとも約５６％〜５７％、少なくとも約５７％〜５８％、少なくとも約５８％〜５９％、少なくとも約５９％〜６０％、少なくとも約６０％〜６１％、少なくとも約６１％〜６２％、少なくとも約６２％〜６３％、少なくとも約６３％〜６４％、少なくとも約６４％〜６５％、少なくとも約６５％〜６６％、少なくとも約６６％〜６７％、少なくとも約６７％〜６８％、少なくとも約６８％〜６９％、少なくとも約６９％〜７０％、少なくとも約７０％〜７１％、少なくとも約７１％〜７２％、少なくとも約７２％〜７３％、少なくとも約７３％〜７４％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７５％〜７６％、少なくとも約７６％〜７７％、少なくとも約７７％〜７８％、少なくとも約７８％〜７９％、少なくとも約７９％〜８０％、少なくとも約８０％〜８１％、少なくとも約８１％〜８２％、少なくとも約８２％〜８３％、少なくとも約８３％〜８４％、少なくとも約８４％〜８５％、少なくとも約８５％〜８６％、少なくとも約８６％〜８７％、少なくとも約８７％〜８８％、少なくとも約８８％〜８９％、少なくとも約８９％〜９０％、少なくとも約９０％〜９１％、少なくとも約９１％〜９２％、少なくとも約９２％〜９３％、少なくとも約９３％〜９４％、少なくとも約９４％〜９５％、少なくとも約９５％〜９６％、少なくとも約９６％〜９７％、少なくとも約９７％〜９８％、少なくとも約９８％〜９９％、少なくとも約９９％〜１００％、または少なくとも約１００％が完全にまたは部分的に突然変異している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ファージゲノムの最初（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ファージゲノムの最後（ｅｎｄ）または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、突然変異は散在した位置の１つ以上に位置する。

いくつかの実施形態では、最適な突然変異のための領域、すなわち所望の効果を達成するための領域は、他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定され得る。ファージ中の相同な保存領域は保存されており、１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、突然変異に適している場合がある。いくつかの実施形態では、プロモーターなどの調節エレメントが突然変異している。いくつかの実施形態では、コード配列が突然変異している。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異領域は、溶菌サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、突然変異は、溶菌遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のプロテアーゼまたはリシン（ｌｙｓｉｎ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、頭部構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、尾部構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、カラー構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、尾部タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、コート構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上の基盤タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、バクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のポータル（ｐｏｒｔａｌ）タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のインベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のプライマーゼ（ｐｒｉｍａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、ファージ挿入に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、接着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、パッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。

いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。

いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。

いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１個の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、ファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。

（欠失）
いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約１〜５００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約５００〜１０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約２０００〜３０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約３０００〜４０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約４０００〜５０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約５０００〜６０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約６０００〜７０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約７０００〜８０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約８０００〜９０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約９０００〜１００００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対のファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１５０００〜２００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約２００００〜２５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約２５０００〜３００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約３００００〜３５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約３５０００〜４００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約４００００〜４５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約４５０００〜５００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約５００００〜５５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約５５０００〜６００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約６００００〜６５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約６５０００〜７００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約７００００〜７５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約７５０００〜８００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約８００００〜８５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約８５０００〜９００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約９００００〜９５０００塩基対のファージゲノム、少なくとも約９５０００〜１０００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１０００００〜１１００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１１００００〜１２００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１２００００〜１３００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１３００００〜１４００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１４００００〜１５００００塩基対のファージゲノム、少なくとも約１５００００〜２０００００塩基対のファージゲノム、または２０００００塩基対超のファージゲノムを含む。特定の一実施形態では、９６８７塩基対のファージゲノムが欠失している。いくつかの実施形態では、欠失したヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、欠失したヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約１〜２％、少なくとも約２〜３％、少なくとも約３〜４％、少なくとも約４〜５％、少なくとも約５〜６％、少なくとも約６〜７％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１０〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜１６％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、または少なくとも約２９〜３０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約３０〜４０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約５０〜６０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約６０〜７０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約７０〜８０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約８０〜９０％が欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約９０〜１００％が欠失している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が、ファージゲノム内で部分的にまたは完全に欠失している。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が完全に欠失し、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。一実施形態では、ファージゲノム内に１つの欠失があり、当該欠失の末端の１つまたは２つの遺伝子が部分的に欠失し、残りの遺伝子が完全に欠失している。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣接している。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣接していない。

いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が欠失している。いくつかの実施形態では、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、または１２０個の遺伝子が欠失している。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。一実施形態では、７４個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、ファージゲノム内の遺伝子の少なくとも約１％〜２％、少なくとも約２％〜３％、少なくとも約３％〜４％、少なくとも約４％〜５％、少なくとも約５％〜６％、少なくとも約６％〜７％、少なくとも約７％〜８％、少なくとも約８％〜９％、少なくとも約９％〜１０％、少なくとも約１０％〜１１％、少なくとも約１１％〜１２％、少なくとも約１２％〜１３％、少なくとも約１３％〜１４％、少なくとも約１４％〜１５％、少なくとも約１５％〜１６％、少なくとも約１６％〜１７％、少なくとも約１７％〜１８％、少なくとも約１８％〜１９％、少なくとも約１９％〜２０％、少なくとも約２０％〜２１％、少なくとも約２１％〜２２％、少なくとも約２２％〜２３％、少なくとも約２３％〜２４％、少なくとも約２４％〜２５％、少なくとも約２５％〜２６％、少なくとも約２６％〜２７％、少なくとも約２７％〜２８％、少なくとも約２８％〜２９％、少なくとも約２９％〜３０％、少なくとも約３０％〜３１％、少なくとも約３１％〜３２％、少なくとも約３２％〜３３％、少なくとも約３３％〜３４％、少なくとも約３４％〜３５％、少なくとも約３５％〜３６％、少なくとも約３６％〜３７％、少なくとも約３７％〜３８％、少なくとも約３８％〜３９％、少なくとも約３９％〜４０％、少なくとも約４０％〜４１％、少なくとも約４１％〜４２％、少なくとも約４２％〜４３％、少なくとも約４３％〜４４％、少なくとも約４４％〜４５％、少なくとも約４５％〜４６％、少なくとも約４６％〜４７％、少なくとも約４７％〜４８％、少なくとも約４８％〜４９％、少なくとも約４９％〜５０％、少なくとも約５０％〜５１％、少なくとも約５１％〜５２％、少なくとも約５２％〜５３％、少なくとも約５３％〜５４％、少なくとも約５４％〜５５％、少なくとも約５５％〜５６％、少なくとも約５６％〜５７％、少なくとも約５７％〜５８％、少なくとも約５８％〜５９％、少なくとも約５９％〜６０％、少なくとも約６０％〜６１％、少なくとも約６１％〜６２％、少なくとも約６２％〜６３％、少なくとも約６３％〜６４％、少なくとも約６４％〜６５％、少なくとも約６５％〜６６％、少なくとも約６６％〜６７％、少なくとも約６７％〜６８％、少なくとも約６８％〜６９％、少なくとも約６９％〜７０％、少なくとも約７０％〜７１％、少なくとも約７１％〜７２％、少なくとも約７２％〜７３％、少なくとも約７３％〜７４％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７５％〜７６％、少なくとも約７６％〜７７％、少なくとも約７７％〜７８％、少なくとも約７８％〜７９％、少なくとも約７９％〜８０％、少なくとも約８０％〜８１％、少なくとも約８１％〜８２％、少なくとも約８２％〜８３％、少なくとも約８３％〜８４％、少なくとも約８４％〜８５％、少なくとも約８５％〜８６％、少なくとも約８６％〜８７％、少なくとも約８７％〜８８％、少なくとも約８８％〜８９％、少なくとも約８９％〜９０％、少なくとも約９０％〜９１％、少なくとも約９１％〜９２％、少なくとも約９２％〜９３％、少なくとも約９３％〜９４％、少なくとも約９４％〜９５％、少なくとも約９５％〜９６％、少なくとも約９６％〜９７％、少なくとも約９７％〜９８％、少なくとも約９８％〜９９％、少なくとも約９９％〜１００％、または少なくとも約１００％が完全にまたは部分的に欠失している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、ファージゲノムの最初（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、ファージゲノムの最後（ｅｎｄ）または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、ファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、欠失は散在した位置の１つ以上に位置する。

いくつかの実施形態では、最適な欠失のための領域、すなわち所望の効果を達成するための領域は、他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定され得る。ファージ中の相同な保存領域は保存されており、１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、欠失に適している場合がある。いくつかの実施形態では、プロモーターなどの調節エレメントが欠失している。いくつかの実施形態では、コード配列が欠失している。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失領域は、溶菌サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、欠失は、溶菌遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のプロテアーゼまたはリシン（ｌｙｓｉｎ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、頭部構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、尾部構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、カラー構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、コート構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上の基盤タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、バクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のポータル（ｐｏｒｔａｌ）タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のインベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のプライマーゼ（ｐｒｉｍａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、ファージ挿入に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、接着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、パッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。

いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。

いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。

いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１個の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、ファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置するか、またはそれを包含する。

（挿入）
いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、挿入はファージゲノムの調節領域に挿入される。いくつかの実施形態では、挿入は１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約１〜５００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約５００〜１０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約２０００〜３０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約３０００〜４０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約４０００〜５０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約５０００〜６０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約６０００〜７０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約７０００〜８０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約８０００〜９０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約９０００〜１００００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対の長さ、少なくとも約１５０００〜２００００塩基対の長さ、少なくとも約２００００〜２５０００塩基対の長さ、少なくとも約２５０００〜３００００塩基対の長さ、少なくとも約３００００〜３５０００塩基対の長さ、少なくとも約３５０００〜４００００塩基対の長さ、少なくとも約４００００〜４５０００塩基対の長さ、少なくとも約４５０００〜５００００塩基対の長さ、少なくとも約５００００〜５５０００塩基対の長さ、少なくとも約５５０００〜６００００塩基対の長さ、少なくとも約６００００〜６５０００塩基対の長さ、少なくとも約６５０００〜７００００塩基対の長さ、少なくとも約７００００〜７５０００塩基対の長さ、少なくとも約７５０００〜８００００塩基対の長さ、少なくとも約８００００〜８５０００塩基対の長さ、少なくとも約８５０００〜９００００塩基対の長さ、少なくとも約９００００〜９５０００塩基対の長さ、少なくとも約９５０００〜１０００００塩基対の長さ、少なくとも約１０００００〜１１００００塩基対の長さ、少なくとも約１１００００〜１２００００塩基対の長さ、少なくとも約１２００００〜１３００００塩基対の長さ、少なくとも約１３００００〜１４００００塩基対の長さ、少なくとも約１４００００〜１５００００塩基対の長さ、少なくとも約１５００００〜２０００００塩基対の長さ、または少なくとも約２０００００塩基対超の長さを含む。特定の一実施形態では、９６８７塩基対の長さが挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約５０００〜６０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約６０００〜７０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約７０００〜８０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約８０００〜９０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約９０００〜１００００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１５０００〜２００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約２００００〜２５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約２５０００〜３００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約３００００〜３５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約３５０００〜４００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約４００００〜４５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約４５０００〜５００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約５００００〜５５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約５５０００〜６００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約６００００〜６５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約６５０００〜７００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約７００００〜７５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約７５０００〜８００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約８００００〜８５０００塩基対内、少なくとも約８５０００〜９００００塩基対内、ファージゲノム、ファージゲノムの少なくとも約９００００〜９５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約９５０００〜１０００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１０００００〜１１００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１１００００〜１２００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１２００００〜１３００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１３００００〜１４００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１４００００〜１５００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１５００００〜２０００００塩基対内、またはファージゲノムの少なくとも約２０００００塩基対超内に位置する。特定の一実施形態では、ファージゲノムの９６８７塩基対が挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノムの少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約１〜２％、少なくとも約２〜３％、少なくとも約３〜４％、少なくとも約４〜５％、少なくとも約５〜６％、少なくとも約６〜７％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１０〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜１６％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％内に位置する。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約３０〜４０％が挿入される。いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。

いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が挿入を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、または１２０個の遺伝子が挿入を含む。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が挿入を含む。一実施形態では、７４個の遺伝子が挿入を含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの最初（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの最後（ｅｎｄ）または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、挿入は散在した位置の１つ以上に位置する。

いくつかの実施形態では、最適な挿入のための領域、すなわち所望の効果を達成するための領域は、他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定され得る。ファージ中の相同な保存領域は保存されており、１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、挿入に適している場合がある。いくつかの実施形態では、プロモーターなどの調節エレメントが挿入される。いくつかの実施形態では、コード配列が挿入される。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入領域は、溶菌サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、挿入は、溶菌遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のプロテアーゼまたはリシン（ｌｙｓｉｎ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、頭部構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、尾部構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、カラー構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、コート構造のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上の基盤タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、バクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のポータル（ｐｏｒｔａｌ）タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のインベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のプライマーゼ（ｐｒｉｍａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、ファージ挿入に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、接着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、パッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。

いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。

いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。

いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、ファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置する。

（逆位）
いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの調節領域に逆位（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）される。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約１〜５００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約５００〜１０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約２０００〜３０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約３０００〜４０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約４０００〜５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約５０００〜６０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約６０００〜７０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約７０００〜８０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約８０００〜９０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約９０００〜１００００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対、少なくとも約１５０００〜２００００塩基対、少なくとも約２００００〜２５０００塩基対、少なくとも約２５０００〜３００００塩基対、少なくとも約３００００〜３５０００塩基対、少なくとも約３５０００〜４００００塩基対、少なくとも約４００００〜４５０００塩基対、少なくとも約４５０００〜５００００塩基対、少なくとも約５００００〜５５０００塩基対、少なくとも約５５０００〜６００００塩基対、少なくとも約６００００〜６５０００塩基対、少なくとも約６５０００〜７００００塩基対、少なくとも約７００００〜７５０００塩基対、少なくとも約７５０００〜８００００塩基対、少なくとも約８００００〜８５０００塩基対、少なくとも約８５０００〜９００００塩基対、少なくとも約９００００〜９５０００塩基対、少なくとも約９５０００〜１０００００塩基対、少なくとも約１０００００〜１１００００塩基対、少なくとも約１１００００〜１２００００塩基対、少なくとも約１２００００〜１３００００塩基対、少なくとも約１３００００〜１４００００塩基対、少なくとも約１４００００〜１５００００塩基対、少なくとも約１５００００〜２０００００塩基対、または少なくとも約２０００００塩基対超を含む。特定の一実施形態では、９６８７塩基対が逆位している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約５０００〜６０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約６０００〜７０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約７０００〜８０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約８０００〜９０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約９０００〜１００００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１５０００〜２００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約２００００〜２５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約２５０００〜３００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約３００００〜３５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約３５０００〜４００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約４００００〜４５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約４５０００〜５００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約５００００〜５５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約５５０００〜６００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約６００００〜６５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約６５０００〜７００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約７００００〜７５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約７５０００〜８００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約８００００〜８５０００塩基対内、少なくとも約８５０００〜９００００塩基対内、ファージゲノム、ファージゲノムの少なくとも約９００００〜９５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約９５０００〜１０００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１０００００〜１１００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１１００００〜１２００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１２００００〜１３００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１３００００〜１４００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１４００００〜１５００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１５００００〜２０００００塩基対内、またはファージゲノムの少なくとも約２０００００塩基対超内に位置する。特定の一実施形態では、ファージゲノムの９６８７塩基対が逆位している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約１〜２％、少なくとも約２〜３％、少なくとも約３〜４％、少なくとも約４〜５％、少なくとも約５〜６％、少なくとも約６〜７％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１０〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜１６％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％内に位置する。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約３０〜４０％が逆位している。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。

いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が逆位を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、または１２０個の遺伝子が逆位を含む。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が逆位を含む。一実施形態では、７４個の遺伝子が逆位を含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの最初（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの最後（ｅｎｄ）または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、ファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、逆位は散在した位置の１つ以上に位置する。

いくつかの実施形態では、最適な逆位のための領域、すなわち所望の効果を達成するための領域は、他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定され得る。ファージ中の相同な保存領域は保存されており、１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、逆位に適している場合がある。いくつかの実施形態では、プロモーターなどの調節要素が逆位している。いくつかの実施形態では、コード配列が逆位している。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位領域は、溶菌サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、逆位は、溶菌遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のプロテアーゼまたはリシン（ｌｙｓｉｎ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上の基盤タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、バクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のポータル（ｐｏｒｔａｌ）タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のインベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のプライマーゼ（ｐｒｉｍａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージ逆位（ｐｈａｇｅｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、接着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、パッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。

いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位（ｐｈａｇｅｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。

いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位（ｐｈａｇｅｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。

いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置する。

（置換）
いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノムの調節領域に置換される（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約１〜５００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約５００〜１０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約２０００〜３０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約３０００〜４０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約４０００〜５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約５０００〜６０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約６０００〜７０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約７０００〜８０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約８０００〜９０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約９０００〜１００００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対、少なくとも約１５０００〜２００００塩基対、少なくとも約２００００〜２５０００塩基対、少なくとも約２５０００〜３００００塩基対、少なくとも約３００００〜３５０００塩基対、少なくとも約３５０００〜４００００塩基対、少なくとも約４００００〜４５０００塩基対、少なくとも約４５０００〜５００００塩基対、少なくとも約５００００〜５５０００塩基対、少なくとも約５５０００〜６００００塩基対、少なくとも約６００００〜６５０００塩基対、少なくとも約６５０００〜７００００塩基対、少なくとも約７００００〜７５０００塩基対、少なくとも約７５０００〜８００００塩基対、少なくとも約８００００〜８５０００塩基対、少なくとも約８５０００〜９００００塩基対、少なくとも約９００００〜９５０００塩基対、少なくとも約９５０００〜１０００００塩基対、少なくとも約１０００００〜１１００００塩基対、少なくとも約１１００００〜１２００００塩基対、少なくとも約１２００００〜１３００００塩基対、少なくとも約１３００００〜１４００００塩基対、少なくとも約１４００００〜１５００００塩基対、少なくとも約１５００００〜２０００００塩基対、または少なくとも約２０００００塩基対超を含む。特定の一実施形態では、９６８７塩基対が置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約５０００〜６０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約６０００〜７０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約７０００〜８０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約８０００〜９０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約９０００〜１００００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１５０００〜２００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約２００００〜２５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約２５０００〜３００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約３００００〜３５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約３５０００〜４００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約４００００〜４５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約４５０００〜５００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約５００００〜５５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約５５０００〜６００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約６００００〜６５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約６５０００〜７００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約７００００〜７５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約７５０００〜８００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約８００００〜８５０００塩基対内、少なくとも約８５０００〜９００００塩基対内、ファージゲノム、ファージゲノムの少なくとも約９００００〜９５０００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約９５０００〜１０００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１０００００〜１１００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１１００００〜１２００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１２００００〜１３００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１３００００〜１４００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１４００００〜１５００００塩基対内、ファージゲノムの少なくとも約１５００００〜２０００００塩基対内、またはファージゲノムの少なくとも約２０００００塩基対超内に位置する。特定の一実施形態では、ファージゲノムの９６８７塩基対が置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノムの少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約１〜２％、少なくとも約２〜３％、少なくとも約３〜４％、少なくとも約４〜５％、少なくとも約５〜６％、少なくとも約６〜７％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１０〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜１６％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％内に位置する。いくつかの実施形態では、ファージゲノムの少なくとも約３０〜４０％が置換されている。いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。

いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が置換を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、または１２０個の遺伝子が置換を含む。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が置換を含む。一実施形態では、７４個の遺伝子が置換を含む。

いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの最初（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの最後（ｅｎｄ）または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ファージゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、置換は散在した位置の１つ以上に位置する。

いくつかの実施形態では、最適な置換のための領域、すなわち所望の効果を達成するための領域は、他の細菌中の他のファージとの相同性の分析によって決定され得る。ファージ中の相同な保存領域は保存されており、１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、置換に適している場合がある。いくつかの実施形態では、プロモーターなどの調節エレメントが置換される。いくつかの実施形態では、コード配列が置換される。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換領域は、溶菌サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、置換は、溶菌遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上のプロテアーゼまたはリシン（ｌｙｓｉｎ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上の基盤タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、バクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上のポータル（ｐｏｒｔａｌ）タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上のインベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上のトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上のプライマーゼ（ｐｒｉｍａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、ファージ置換（ｐｈａｇｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、接着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、パッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。

いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換（ｐｈａｇｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。

いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換（ｐｈａｇｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置する。

いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ置換、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、ファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置する。

（大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ中のファージ）
本明細書中に記載のいくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、操作された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）株Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ）である。本明細書の実施例においてより詳細に記載されるように、日常的な試験手順により、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ；Ｅ．ｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ）および関連する操作された誘導体からのバクテリオファージ産生が同定された。バクテリオファージのソースを特定するために、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび操作された誘導体のゲノムの共同バイオインフォマティクス評価が行われ、プロファージの証拠について菌株のゲノム配列を分析し、機能的ファージ産生の可能性について任意の同定されたプロファージ要素を評価し、任意の機能的ファージ要素を細菌ゲノム配列から同定された他の既知ファージと比較し、他の配列決定された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムにおいてプロファージ要素が見つかる頻度を評価した。評価ツールには、ファージ予測ソフトウェア（ＰＨＡＳＴおよびＰＨＡＳＴＥＲ）、ＳＰＡｄｅｓゲノムアセンブラソフトウェア、より大きな参照ゲノムに対して低分岐配列をマッピングするためのソフトウェア（ＢＷＡＭＥＭ）、ゲノム配列アラインメントソフトウェア（ＭＵＭｍｅｒ）、およびアメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）非冗長データベースが含まれていた。評価結果は、分析された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび操作された誘導体が３つの候補プロファージ要素（図１）を含み、３つのうちの２つ（ファージ２およびファージ３）がインタクトファージゲノムに特徴的なほとんどの遺伝的特徴を含むことを示している（図２、図３および図４）。他の２つの可能なファージ要素（図５Ａおよび図５Ｂ）も同定された。注目すべきことに、操作された株は、親の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおいて同定されなかった追加のファージ要素を全く含まず、このことはこれらの株によって産生されるプラーク形成単位がこれらの内因性ファージの１つに由来することを示している。本明細書に記載されるさらなる分析は、ファージ３をプラーク形成ファージ（ファージ３）として同定した。興味深いことに、他の推定プロファージ要素との相同性の短い領域に限定された関連配列が少数のゲノム中で見つかるものの、ファージ３は、ほぼ６０００の配列決定された大腸菌ゲノムのコレクションの中で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに固有である。実施例においてより詳細に記載されるように、他のファージのいずれも誘導性ではないが、ファージ３は誘導性であり、誘導時に細菌溶解を引き起こすことが見出された。

プロファージは大腸菌株の間で非常に一般的であり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは、十分に特徴付けられた配列決定された大腸菌ゲノムのセットにおいて見出される平均数と比較して、比較的少数のプロファージ配列を含む。したがって、操作された株におけるプロファージの存在は、この種の自然状態の一部であり、分析された操作された株のプロファージの特徴は、前駆株、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅと一致していた。

表Ｄは、ファージ３のゲノム内に含まれる遺伝子を列挙する。表Ｅは、ファージ３の配列を示している。表Ｆは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのファージ３に含まれる遺伝子の配列を示している。表Ｇは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３のゲノムによってコードされるポリペプチドの配列を示している。

［表Ｄ］ファージ３ゲノム

［表Ｅ］ファージ３ゲノム配列

［表Ｆ］大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのファージ３に含まれる遺伝子の配列

［表Ｇ］大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３のゲノムによってコードされるポリペプチドの配列

これらの実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載される細菌は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に１つ以上の改変または突然変異を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ファージ３の特性または挙動を変化させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ３が溶菌プロセスに入るか、または溶菌プロセスを完了することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ３が溶菌プロセスに入る能力を低下させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３が同じまたは異なる型の他の細菌に感染することを妨げる。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、細菌宿主の適応度を変化させる（例えば、増大または減少させる）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、実質的に細菌適応度に影響を及ぼさず、細菌適応度は改変または突然変異なしの同質遺伝子型株の適応度と実質的に同じである。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を変化させる（例えば、増大または減少させる）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を改善する。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、エフェクター機能に実質的に影響を及ぼさず、エフェクター機能は改変または突然変異なしの同質遺伝子型株のエフェクター機能と実質的に同じである。いくつかの実施形態では、エフェクター回路が最初にゲノム中に組み込まれ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｉｎｔｏｔｈｅｇｅｎｏｍｅ）、次いでファージが改変される。いくつかの実施形態では、改変されたファージ３を有する新しいシャシー（ｃｈａｓｓｉｓ）が、エフェクター機能（複数可）の操作の前に生成される。

いくつかの実施形態では、細菌は、少なくとも約１〜２、少なくとも約２〜３、少なくとも約３〜４、少なくとも約４〜５、少なくとも約５〜６、少なくとも約６〜７、少なくとも約７〜８、少なくとも約８〜９、少なくとも約９〜１０、少なくとも約１０〜１１、少なくとも約１１〜１２、少なくとも約１２〜１３、少なくとも約１３〜１４、少なくとも約１４〜１５、少なくとも約１５〜１６、少なくとも約１６〜１７、少なくとも約１７〜１８、少なくとも約１８〜１９、少なくとも約１９〜２０、少なくとも約２０〜２１、少なくとも約２１〜２２、少なくとも約２２〜２３、少なくとも約２３〜２４、少なくとも約２４〜２５、少なくとも約２５〜２６、少なくとも約２６〜２７、少なくとも約２７〜２８、少なくとも約２８〜２９、少なくとも約２９〜３０、少なくとも約３０〜３１、少なくとも約３１〜３２、少なくとも約３２〜３３、少なくとも約３３〜３４、少なくとも約３４〜３５、少なくとも約３５〜３６、少なくとも約３６〜３７、少なくとも約３７〜３８、少なくとも約３８〜３９、少なくとも約３９〜４０、少なくとも約４０〜４１、少なくとも約４１〜４２、少なくとも約４２〜４３、少なくとも約４３〜４４、少なくとも約４４〜４５、少なくとも約４５〜４６、少なくとも約４６〜４７、少なくとも約４７〜４８、少なくとも約４８〜４９、少なくとも約４９〜５０、少なくとも約５０〜５１、少なくとも約５１〜５２、少なくとも約５２〜５３、少なくとも約５３〜５４、少なくとも約５４〜５５、少なくとも約５５〜５６、少なくとも約５６〜５７、少なくとも約５７〜５８、少なくとも約５８〜５９、少なくとも約５９〜６０、少なくとも約６０〜６１、少なくとも約６１〜６２、少なくとも約６２〜６３、少なくとも約６３〜６４、少なくとも約６４〜６５、少なくとも約６５〜６６、少なくとも約６６〜６７、少なくとも約６７〜６８、少なくとも約６８〜６９、少なくとも約６９〜７０、少なくとも約７０〜７１、少なくとも約７１〜７２、少なくとも約７２〜７３、少なくとも約７３〜７４、少なくとも約７４〜７５、少なくとも約７５〜７６、少なくとも約７６〜７７、少なくとも約７７〜７８、少なくとも約７８〜７９、少なくとも約７９〜８０、少なくとも約８０〜８１、少なくとも約８１〜８２、少なくとも約８２〜８３、少なくとも約８３〜８４、少なくとも約８４〜８５、少なくとも約８５〜８６、少なくとも約８６〜８７、少なくとも約８７〜８８、少なくとも約８８〜８９、少なくとも約８９〜９０、少なくとも約９０〜９１、少なくとも約９１〜９２、少なくとも約９２〜９３、少なくとも約９３〜９４、少なくとも約９４〜９５、少なくとも約９５〜９６、少なくとも約９６〜９７、少なくとも約９７〜９８、少なくとも約９８〜９９、少なくとも約９９〜１００、または少なくとも約１００以上の改変または変異を含む。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ３溶菌プロセスのエントリ（ｅｎｔｒｙ）または完了を、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１００〜１０００倍減少させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ３溶解プロセスのエントリ（ｅｎｔｒｙ）または完了を完全に減少させる。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ３溶菌プロセスのエントリ（ｅｎｔｒｙ）または完了を、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％減少させる。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１００〜１０００倍、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムが同じまたは異なる他の細菌に感染することを妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３が同じまたは異なる型の他の細菌に感染することを完全に妨げる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３が同じまたは異なる型の他の細菌に感染することを妨げる。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ改変なしの同じ同質遺伝子型株と比較して、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１００〜１０００倍、細菌宿主の適応度を変化、増大、または減少させる。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、ファージ改変なしの同じ同質遺伝子型株と比較して、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％、細菌宿主の適応度を変化、増大、または減少させる。

いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、例えば、遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を、ファージ改変なしの同じ同質遺伝子型株と比較して、少なくとも約１〜２倍、少なくとも約２〜３倍、少なくとも約３〜４倍、少なくとも約４〜５倍、少なくとも約５〜１０倍、少なくとも約１０〜１００倍、少なくとも約１００〜１０００倍変化させる（例えば、増大または減少させる）。いくつかの実施形態では、改変または突然変異は、例えば遺伝子操作された細菌の所望のエフェクター機能を、ファージ改変なしの同質遺伝子型株と比較して、少なくとも約１％〜１０％、少なくとも約１０％〜２０％、少なくとも約２０％〜３０％、少なくとも約３０％〜４０％、少なくとも約４０％〜５０％、少なくとも約５０％〜６０％、少なくとも約６０％〜７０％、少なくとも約７０％〜８０％、少なくとも約８０％〜９０％、または少なくとも約９０％〜１００％変化させる（例えば、増大または減少させる）。

いくつかの実施形態では、突然変異は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列内の１つ以上の欠失を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列への１つ以上の挿入を含む。いくつかの実施形態では、抗生物質カセットが、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列内の１つ以上の位置に挿入され得る。いくつかの実施形態では、突然変異は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列内の１つ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム配列内の１つ以上の逆位を含む。いくつかの実施形態では、逆位は、特定のフリッパーゼによって支配され得る。複数レベルの制御を含む例示的な回路が、本明細書に例示されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される共同所有の係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３９４３４にも記載されている。

いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の改変は、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム遺伝子内の挿入、欠失、置換、または逆位の２つ以上の組み合わせである。

本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のフレームシフト突然変異を生じ得る。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のミスセンス突然変異を生じ得る。本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の遺伝子における１つ以上のナンセンス突然変異を生じ得る。

いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の改変は、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム遺伝子内の２つ以上のフレームシフト、ナンセンスまたはミスセンス突然変異の組み合わせである。

（突然変異）
いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約１〜５００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約５００〜１０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約２０００〜３０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約３０００〜４０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約４０００〜５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約５０００〜６０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約６０００〜７０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約７０００〜８０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約８０００〜９０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約９０００〜１００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約１５０００〜２００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約２００００〜２５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約２５０００〜３００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約３００００〜３５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約３５０００〜４００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約４００００〜４５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約４５０００〜５００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約５００００〜５５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、または少なくとも約５５０００〜６００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。特定の一実施形態では、９６８７塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムが突然変異している。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、突然変異ヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約１〜２％、少なくとも約２〜３％、少なくとも約３〜４％、少なくとも約４〜５％、少なくとも約５〜６％、少なくとも約６〜７％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１０〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜１６％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０〜４０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０〜５０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０〜６０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０〜７０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０〜８０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０〜９０％が突然変異している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの９０〜１００％が突然変異している。

いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の遺伝子の少なくとも約１％〜２％、少なくとも約２％〜３％、少なくとも約３％〜４％、少なくとも約４％〜５％、少なくとも約５％〜６％、少なくとも約６％〜７％、少なくとも約７％〜８％、少なくとも約８％〜９％、少なくとも約９％〜１０％、少なくとも約１０％〜１１％、少なくとも約１１％〜１２％、少なくとも約１２％〜１３％、少なくとも約１３％〜１４％、少なくとも約１４％〜１５％、少なくとも約１５％〜１６％、少なくとも約１６％〜１７％、少なくとも約１７％〜１８％、少なくとも約１８％〜１９％、少なくとも約１９％〜２０％、少なくとも約２０％〜２１％、少なくとも約２１％〜２２％、少なくとも約２２％〜２３％、少なくとも約２３％〜２４％、少なくとも約２４％〜２５％、少なくとも約２５％〜２６％、少なくとも約２６％〜約２７％、少なくとも約２７％〜２８％、少なくとも約２８％〜２９％、少なくとも約２９％〜３０％、少なくとも約３０％〜３１％、少なくとも約３１％〜３２％、少なくとも約３２％〜３３％、少なくとも約３３％〜３４％、少なくとも約３４％〜３５％、少なくとも約３５％〜３６％、少なくとも約３６％〜３７％、少なくとも約３７％〜３８％、少なくとも約３８％〜３９％、少なくとも約３９％〜４０％、少なくとも約４０％〜４１％、少なくとも約４１％〜４２％、少なくとも約４２％〜４３％、少なくとも約４３％〜４４％、少なくとも約４４％〜４５％、少なくとも約４５％〜４６％、少なくとも約４６％〜４７％、少なくとも約４７％〜４８％、少なくとも約４８％〜４９％、少なくとも約４９％〜５０％、少なくとも約５０％〜５１％、少なくとも約５１％〜５２％、少なくとも約５２％〜５３％、少なくとも約５３％〜５４％、少なくとも約５４％〜５５％、少なくとも約５５％〜５６％、少なくとも約５６％〜５７％、少なくとも約５７％〜５８％、少なくとも約５８％〜５９％、少なくとも約５９％〜６０％、少なくとも約６０％〜６１％、少なくとも約６１％〜６２％、少なくとも約６２％〜６３％、少なくとも約６３％〜６４％、少なくとも約６４％〜６５％、少なくとも約６５％〜６６％、少なくとも約６６％〜６７％、少なくとも約６７％〜６８％、少なくとも約６８％〜６９％、少なくとも約６９％〜７０％、少なくとも約７０％〜７１％、少なくとも約７１％〜７２％、少なくとも約７２％〜７３％、少なくとも約７３％〜７４％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７５％〜７６％、少なくとも約７６％〜７７％、少なくとも約７７％〜７８％、少なくとも約７８％〜７９％、少なくとも約７９％〜８０％、少なくとも約８０％〜８１％、少なくとも約８１％〜８２％、少なくとも約８２％〜８３％、少なくとも約８３％〜８４％、少なくとも約８４％〜８５％、少なくとも約８５％〜８６％、少なくとも約８６％〜８７％、少なくとも約８７％〜８８％、少なくとも約８８％〜８９％、少なくとも約８９％〜９０％、少なくとも約９０％〜９１％、少なくとも約９１％〜９２％、少なくとも約９２％〜９３％、少なくとも約９３％〜９４％、少なくとも約９４％〜９５％、少なくとも約９５％〜９６％、少なくとも約９６％〜９７％、少なくとも約９７％〜９８％、少なくとも約９８％〜９９％、少なくとも約９９％〜１００％、または少なくとも約１００％が完全にまたは部分的に突然変異している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの最初（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの最後（ｅｎｄ）または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、突然変異は散在した位置の１つ以上に位置する。

いくつかの実施形態では、突然変異は、溶菌遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のプロテアーゼまたはリシン（ｌｙｓｉｎ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、頭部タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、尾部タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、カラータンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、コートタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上の基盤タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、バクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のポータル（ｐｏｒｔａｌ）タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のインベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のプライマーゼ（ｐｒｉｍａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、ファージ挿入に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、接着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、パッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、突然変異は、１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。

いくつかの実施形態では、突然変異は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ挿入、または宿主タンパク質、およびそれらの組み合わせのうちの１つ以上に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする遺伝子内に位置するか、またはそれらを包含しない。

本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、改変は、以下から選択される１つ以上の遺伝子を包含するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。

いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０００５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５内に位置する。

いくつかの実施形態では、突然変異は、脂質Ａ生合成（ＫＤＯ）２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーターＡＴＰａｓｅ、高親和性亜鉛トランスポーター膜コンポーネント、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡ、Ｈｏｌｌｉｄａｙジャンクションレゾルバーゼ、ジヒドロネオプテリン三リン酸ピロホスファターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｎｅｏｐｔｅｒｉｎｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、アスパルチル−ｔＲＮＡシンテターゼ、ヒドロラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ＭｓｇＡ、ファージ尾部タンパク質、尾部タンパク質、宿主特異的タンパク質、ペプチダーゼＰ６０、尾部タンパク質、尾部タンパク質、尾部繊維タンパク質、マイナーテールタンパク質Ｕ（ＭｉｎｏｒｔａｉｌｐｒｏｔｅｉｎＵ）、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリン、ＤＮＡアデニンメチラーゼ、セリンプロテアーゼ、抗終結蛋白質（ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ）、アンチリプレッサー、クロスオーバージャンクションエンドデオキシリボヌクレアーゼ、アデニンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＧｎｔＲファミリー転写調節因子ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ｃＩリプレッサー、未知の機能のドメイン（ＤＵＦ４２２２）；ＤＮＡリコンビナーゼ、多数の抗生物質耐性調節因子（ＭａｒＲ）、Ｐ２２における未知のｅａｄ様タンパク質、機能不明のタンパク質（ＤＵＦ５５０）；３’−５’エキソヌクレアーゼ、エキシシオナーゼ、インテグラーゼ、およびｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼから選択される１つ以上のポリペプチド内に位置するか、またはそれらを包含する。一実施形態では、マイナーテールタンパク質Ｕ、尾部タンパク質、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼの１つ以上が突然変異している。

一実施形態では、突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な突然変異である。特定の一実施形態では、突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な突然変異である。特定の一実施形態では、突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な突然変異、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な突然変異である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから突然変異している。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから突然変異している。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含む改変されたファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変されたファージゲノム配列を含む。

（欠失）
いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約１〜５００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約５００〜１０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約２０００〜３０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約３０００〜４０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約４０００〜５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約５０００〜６０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約６０００〜７０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約７０００〜８０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約８０００〜９０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約９０００〜１００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約１５０００〜２００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約２００００〜２５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約２５０００〜３００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約３００００〜３５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約３５０００〜４００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約４００００〜４５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約４５０００〜５００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、少なくとも約５００００〜５５０００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム、または少なくとも約５５０００〜６００００塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムを含む。特定の一実施形態では、９６８７塩基対の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムが欠失している。いくつかの実施形態では、欠失したヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、欠失したヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約１〜２％、少なくとも約２〜３％、少なくとも約３〜４％、少なくとも約４〜５％、少なくとも約５〜６％、少なくとも約６〜７％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１０〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜１６％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０〜４０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージゲノムの少なくとも約４０〜５０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０〜６０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０〜７０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０〜８０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０〜９０％が欠失している。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９０〜１００％が欠失している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内で部分的にまたは完全に欠失している。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が完全に欠失し、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。一実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に１つの欠失があり、当該欠失の末端の１つまたは２つの遺伝子が部分的に欠失し、残りの遺伝子が完全に欠失している。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣接している。いくつかの実施形態では、欠失した遺伝子は互いに隣接していない。

いくつかの実施形態では、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の遺伝子が欠失している。いくつかの実施形態では、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、または１２０個の遺伝子が欠失している。いくつかの実施形態では、１３個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。一実施形態では、７４個の遺伝子が完全にまたは部分的に欠失している。

いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の遺伝子の少なくとも約１％〜２％、少なくとも約２％〜３％、少なくとも約３％〜４％、少なくとも約４％〜５％、少なくとも約５％〜６％、少なくとも約６％〜７％、少なくとも約７％〜８％、少なくとも約８％〜９％、少なくとも約９％〜１０％、少なくとも約１０％〜１１％、少なくとも約１１％〜１２％、少なくとも約１２％〜１３％、少なくとも約１３％〜１４％、少なくとも約１４％〜１５％、少なくとも約１５％〜１６％、少なくとも約１６％〜１７％、少なくとも約１７％〜１８％、少なくとも約１８％〜１９％、少なくとも約１９％〜２０％、少なくとも約２０％〜２１％、少なくとも約２１％〜２２％、少なくとも約２２％〜２３％、少なくとも約２３％〜２４％、少なくとも約２４％〜２５％、少なくとも約２５％〜２６％、少なくとも約２６％〜約２７％、少なくとも約２７％〜２８％、少なくとも約２８％〜２９％、少なくとも約２９％〜３０％、少なくとも約３０％〜３１％、少なくとも約３１％〜３２％、少なくとも約３２％〜３３％、少なくとも約３３％〜３４％、少なくとも約３４％〜３５％、少なくとも約３５％〜３６％、少なくとも約３６％〜３７％、少なくとも約３７％〜３８％、少なくとも約３８％〜３９％、少なくとも約３９％〜４０％、少なくとも約４０％〜４１％、少なくとも約４１％〜４２％、少なくとも約４２％〜４３％、少なくとも約４３％〜４４％、少なくとも約４４％〜４５％、少なくとも約４５％〜４６％、少なくとも約４６％〜４７％、少なくとも約４７％〜４８％、少なくとも約４８％〜４９％、少なくとも約４９％〜５０％、少なくとも約５０％〜５１％、少なくとも約５１％〜５２％、少なくとも約５２％〜５３％、少なくとも約５３％〜５４％、少なくとも約５４％〜５５％、少なくとも約５５％〜５６％、少なくとも約５６％〜５７％、少なくとも約５７％〜５８％、少なくとも約５８％〜５９％、少なくとも約５９％〜６０％、少なくとも約６０％〜６１％、少なくとも約６１％〜６２％、少なくとも約６２％〜６３％、少なくとも約６３％〜６４％、少なくとも約６４％〜６５％、少なくとも約６５％〜６６％、少なくとも約６６％〜６７％、少なくとも約６７％〜６８％、少なくとも約６８％〜６９％、少なくとも約６９％〜７０％、少なくとも約７０％〜７１％、少なくとも約７１％〜７２％、少なくとも約７２％〜７３％、少なくとも約７３％〜７４％、少なくとも約７４％〜７５％、少なくとも約７５％〜７６％、少なくとも約７６％〜７７％、少なくとも約７７％〜７８％、少なくとも約７８％〜７９％、少なくとも約７９％〜８０％、少なくとも約８０％〜８１％、少なくとも約８１％〜８２％、少なくとも約８２％〜８３％、少なくとも約８３％〜８４％、少なくとも約８４％〜８５％、少なくとも約８５％〜８６％、少なくとも約８６％〜８７％、少なくとも約８７％〜８８％、少なくとも約８８％〜８９％、少なくとも約８９％〜９０％、少なくとも約９０％〜９１％、少なくとも約９１％〜９２％、少なくとも約９２％〜９３％、少なくとも約９３％〜９４％、少なくとも約９４％〜９５％、少なくとも約９５％〜９６％、少なくとも約９６％〜９７％、少なくとも約９７％〜９８％、少なくとも約９８％〜９９％、少なくとも約９９％〜１００％、または少なくとも約１００％が完全にまたは部分的に欠失している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの最初（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの最後（ｅｎｄ）または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、欠失は散在した位置の１つ以上に位置する。

いくつかの実施形態では、最適な欠失のための領域、すなわち所望の効果を達成するための領域は、他の細菌（例えば、他の大腸菌株）中の他のファージとの相同性の分析によって決定され得る。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３中の相同な保存領域は保存されており、１つ以上の必須遺伝子を含み得るので、欠失に適している場合がある。いくつかの実施形態では、プロモーターなどの調節エレメントが欠失している。いくつかの実施形態では、コード配列が欠失している。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失領域は、溶菌サイクルに必須の１つ以上の遺伝子を含む。

いくつかの実施形態では、欠失は、溶菌遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のプロテアーゼまたはリシン（ｌｙｓｉｎ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上の頭部タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上の尾部タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のカラータンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のコートタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上の基盤タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、バクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のポータル（ｐｏｒｔａｌ）タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のインベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のプライマーゼ（ｐｒｉｍａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、ファージ挿入に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、接着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、パッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、または包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、欠失は、１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。

本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、挿入は、以下から選択される１つ以上の遺伝子を（完全にまたは部分的に）包含するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。

いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０００５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５内に位置する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の欠失は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５内に位置する。

いくつかの実施形態では、突然変異は、脂質Ａ生合成（ＫＤＯ）２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーターＡＴＰａｓｅ、高親和性亜鉛トランスポーター膜コンポーネント、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡ、Ｈｏｌｌｉｄａｙジャンクションレゾルバーゼ、ジヒドロネオプテリン三リン酸ピロホスファターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｎｅｏｐｔｅｒｉｎｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、アスパルチル−ｔＲＮＡシンテターゼ、ヒドロラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ＭｓｇＡ、ファージ尾部タンパク質、尾部タンパク質、宿主特異的タンパク質、ペプチダーゼＰ６０、尾部タンパク質、尾部タンパク質、尾部繊維タンパク質、マイナーテールタンパク質Ｕ（ＭｉｎｏｒｔａｉｌｐｒｏｔｅｉｎＵ）、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリン、ＤＮＡアデニンメチラーゼ、セリンプロテアーゼ、抗終結蛋白質（ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ）、アンチリプレッサー、クロスオーバージャンクションエンドデオキシリボヌクレアーゼ、アデニンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＧｎｔＲファミリー転写調節因子ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ｃＩリプレッサー、未知の機能のドメイン（ＤＵＦ４２２２）；ＤＮＡリコンビナーゼ、多数の抗生物質耐性調節因子（ＭａｒＲ）、Ｐ２２における未知のｅａｄ様タンパク質、機能不明のタンパク質（ＤＵＦ５５０）；３’−５’エキソヌクレアーゼ、エキシシオナーゼ、インテグラーゼ、およびｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼから選択される１つ以上のポリペプチド内に位置するか、またはそれらを包含する。一実施形態では、マイナーテールタンパク質Ｕ、尾部タンパク質、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼの１つ以上が欠失している。

特定の一実施形態では、マイナーテールタンパク質Ｕ、尾部タンパク質、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼが欠失している。一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。特定の一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な欠失である。特定の一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失している。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失している。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含む改変されたファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変されたファージゲノム配列を含む。

（挿入）
いくつかの実施形態では、挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、挿入は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの調節領域に挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたポリヌクレオチドは、１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約１〜５００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約５００〜１０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約１０００〜２０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約１０００〜２０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約２０００〜３０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約３０００〜４０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約４０００〜５０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約５０００〜６０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約６０００〜７０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約７０００〜８０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約８０００〜９０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約９０００〜１００００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対の長さを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入されたポリヌクレオチドは、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対の長さ、少なくとも約１５０００〜２００００塩基対の長さ、少なくとも約２００００〜２５０００塩基対の長さ、少なくとも約２５０００〜３００００塩基対の長さ、少なくとも約３００００〜３５０００塩基対の長さ、少なくとも約３５０００〜４００００塩基対の長さ、少なくとも約４００００〜４５０００塩基対の長さ、少なくとも約４５０００〜５００００塩基対の長さ、少なくとも約５００００〜５５０００塩基対の長さ、少なくとも約５５０００〜６００００塩基対の長さ、少なくとも約６００００〜６５０００塩基対の長さ、少なくとも約６５０００〜７００００塩基対の長さ、少なくとも約７００００〜７５０００塩基対の長さ、少なくとも約７５０００〜８００００塩基対の長さ、少なくとも約８００００〜８５０００塩基対の長さ、少なくとも約８５０００〜９００００塩基対の長さ、少なくとも約９００００〜９５０００塩基対の長さ、少なくとも約９５０００〜１０００００塩基対の長さ、少なくとも約１０００００〜１１００００塩基対の長さ、少なくとも約１１００００〜１２００００塩基対の長さ、少なくとも約１２００００〜１３００００塩基対の長さ、少なくとも約１３００００〜１４００００塩基対の長さ、少なくとも約１４００００〜１５００００塩基対の長さ、少なくとも約１５００００〜２０００００塩基対の長さ、または少なくとも約２０００００塩基対超の長さを含む。特定の一実施形態では、少なくとも約９６８７塩基対の長さが挿入される。

いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０００〜６０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０００〜７０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０００〜８０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０００〜９０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９０００〜１００００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１５０００〜２００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２００００〜２５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２５０００〜３００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３００００〜３５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３５０００〜４００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４００００〜４５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４５０００〜５００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５００００〜５５０００塩基対内、または大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５５０００〜６０００塩基対内に位置する。特定の一実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの９６８７塩基対が挿入される。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、挿入されたヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約１〜２％、少なくとも約２〜３％、少なくとも約３〜４％、少なくとも約４〜５％、少なくとも約５〜６％、少なくとも約６〜７％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１０〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜１６％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％内に位置する。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０〜４０％が挿入される。いくつかの実施形態では、挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。

いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの最初（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの最後（ｅｎｄ）または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、挿入は散在した位置の１つ以上に位置する。

いくつかの実施形態では、挿入は、溶菌遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のプロテアーゼまたはリシン（ｌｙｓｉｎ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、頭部タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、尾部タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、カラータンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、コートタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上の基盤タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、バクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のポータル（ｐｏｒｔａｌ）タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のインベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のプライマーゼ（ｐｒｉｍａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、ファージ挿入に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、接着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、パッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、挿入は、１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。

本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、挿入は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。

いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５内に位置する。

いくつかの実施形態では、突然変異は、脂質Ａ生合成（ＫＤＯ）２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーターＡＴＰａｓｅ、高親和性亜鉛トランスポーター膜コンポーネント、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡ、Ｈｏｌｌｉｄａｙジャンクションレゾルバーゼ、ジヒドロネオプテリン三リン酸ピロホスファターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｎｅｏｐｔｅｒｉｎｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、アスパルチル−ｔＲＮＡシンテターゼ、ヒドロラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ＭｓｇＡ、ファージ尾部タンパク質、尾部タンパク質、宿主特異的タンパク質、ペプチダーゼＰ６０、尾部タンパク質、尾部タンパク質、尾部繊維タンパク質、マイナーテールタンパク質Ｕ（ＭｉｎｏｒｔａｉｌｐｒｏｔｅｉｎＵ）、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリン、ＤＮＡアデニンメチラーゼ、セリンプロテアーゼ、抗終結蛋白質（ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ）、アンチリプレッサー、クロスオーバージャンクションエンドデオキシリボヌクレアーゼ、アデニンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＧｎｔＲファミリー転写調節因子ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ｃＩリプレッサー、未知の機能のドメイン（ＤＵＦ４２２２）；ＤＮＡリコンビナーゼ、多数の抗生物質耐性調節因子（ＭａｒＲ）、Ｐ２２における未知のｅａｄ様タンパク質、機能不明のタンパク質（ＤＵＦ５５０）；３’−５’エキソヌクレアーゼ、エキシシオナーゼ、インテグラーゼ、およびｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼから選択される１つ以上のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。一実施形態では、マイナーテールタンパク質Ｕ、尾部タンパク質、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼの１つ以上は、１つ以上の挿入を含む。特定の一実施形態では、マイナーテールタンパク質Ｕ、尾部タンパク質、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは、１つ以上の挿入を含む。

一実施形態では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上が挿入を含む。

（逆位）
いくつかの実施形態では、逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの調節領域に逆位（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）される。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、１〜５００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約５００〜１０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約２０００〜３０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約３０００〜４０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約４０００〜５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約５０００〜６０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約６０００〜７０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約７０００〜８０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約８０００〜９０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約９０００〜１００００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対、少なくとも約１５０００〜２００００塩基対、少なくとも約２００００〜２５０００塩基対、少なくとも約２５０００〜３００００塩基対、少なくとも約３００００〜３５０００塩基対、少なくとも約３５０００〜４００００塩基対、少なくとも約４００００〜４５０００塩基対、少なくとも約４５０００〜５００００塩基対、少なくとも約５００００〜５５０００塩基対、または少なくとも約５５０００〜６００００塩基対を含む。特定の一実施形態では、９６８７塩基対が逆位している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０００〜６０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０００〜７０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０００〜８０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０００〜９０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９０００〜１００００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１５０００〜２００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２００００〜２５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２５０００〜３００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３００００〜３５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３５０００〜４００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４００００〜４５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４５０００〜５００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５００００〜５５０００塩基対内、または大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５５０００〜６００００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、逆位したヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約１〜２％、少なくとも約２〜３％、少なくとも約３〜４％、少なくとも約４〜５％、少なくとも約５〜６％、少なくとも約６〜７％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１０〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜１６％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、少なくとも約２９〜３０％内に位置する。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０〜４０％が逆位している。いくつかの実施形態では、逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。

いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの最初（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの最後（ｅｎｄ）または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、逆位は散在した位置の１つ以上に位置する。

いくつかの実施形態では、逆位は、溶菌遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のプロテアーゼまたはリシン（ｌｙｓｉｎ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上の毒素をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上の抗生物質耐性関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のファージ翻訳関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、構造タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。このような構造遺伝子には、頭部、尾部、カラー、またはコートのポリペプチドをコードする遺伝子が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、頭部タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、尾部タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、カラータンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の突然変異は、コートタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置するか、またはそれを包含する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上の基盤タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、バクテリオファージの構築に必要な１つ以上のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のポータル（ｐｏｒｔａｌ）タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、組換えに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のインテグラーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のインベルターゼ（ｉｎｖｅｒｔａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のトランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、複製または翻訳に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のプライマーゼ（ｐｒｉｍａｓｅ）をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージ逆位（ｐｈａｇｅｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）に関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、接着部位をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、パッケージングに関与する１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上のターミナーゼをコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、１つ以上の宿主遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子内に位置する。

いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする６個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする７個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする８個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする９個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１０個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１１個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１２個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１３個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１４個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構成、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする１５個の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング組換え、複製または翻訳、ファージ逆位、およびそれらの組み合わせに関与するポリペプチドをコードする少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個以上の遺伝子内に位置する。いくつかの実施形態では、逆位は、ファージゲノム内の１つ以上の宿主タンパク質内に位置する。

本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、逆位は、以下から選択される１つ以上の遺伝子を（完全にまたは部分的に）包含するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。

いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０００５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１００９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５内に位置する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の逆位は、（完全にまたは部分的に）ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５を包含するか、またはＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５内に位置する。

いくつかの実施形態では、突然変異は、脂質Ａ生合成（ＫＤＯ）２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーターＡＴＰａｓｅ、高親和性亜鉛トランスポーター膜コンポーネント、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡ、Ｈｏｌｌｉｄａｙジャンクションレゾルバーゼ、ジヒドロネオプテリン三リン酸ピロホスファターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｎｅｏｐｔｅｒｉｎｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、アスパルチル−ｔＲＮＡシンテターゼ、ヒドロラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ＭｓｇＡ、ファージ尾部タンパク質、尾部タンパク質、宿主特異的タンパク質、ペプチダーゼＰ６０、尾部タンパク質、尾部タンパク質、尾部繊維タンパク質、マイナーテールタンパク質Ｕ（ＭｉｎｏｒｔａｉｌｐｒｏｔｅｉｎＵ）、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリン、ＤＮＡアデニンメチラーゼ、セリンプロテアーゼ、抗終結蛋白質（ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ）、アンチリプレッサー、クロスオーバージャンクションエンドデオキシリボヌクレアーゼ、アデニンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＧｎｔＲファミリー転写調節因子ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ｃＩリプレッサー、未知の機能のドメイン（ＤＵＦ４２２２）；ＤＮＡリコンビナーゼ、多数の抗生物質耐性調節因子（ＭａｒＲ）、Ｐ２２における未知のｅａｄ様タンパク質、機能不明のタンパク質（ＤＵＦ５５０）；３’−５’エキソヌクレアーゼ、エキシシオナーゼ、インテグラーゼ、およびｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼから選択される１つ以上のポリペプチド内に位置するか、またはそれらを包含する。一実施形態では、マイナーテールタンパク質Ｕ、尾部タンパク質、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼの１つ以上が逆位している。特定の一実施形態では、マイナーテールタンパク質Ｕ、尾部タンパク質、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼが逆位している。

一実施形態では、逆位は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な逆位である。特定の一実施形態では、逆位は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な逆位である。特定の一実施形態では、逆位は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な逆位、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な逆位である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから逆位している。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから逆位している。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含む改変されたファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変されたファージゲノム配列を含む。

（置換）
いくつかの実施形態では、置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムのコード領域にある。いくつかの実施形態では、置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの調節領域に置換される（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）。いくつかの実施形態では、置換は、１つ以上の抗生物質カセットを含む。適切な抗生物質カセットは当該分野で公知であり、このような抗生物質カセットの非限定的な例は本明細書中に記載されている。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールである。いくつかの実施形態では、抗生物質はカナマイシンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はアンピシリンである。いくつかの実施形態では、抗生物質はクロラムフェニコールおよびカナマイシンである。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約１〜５００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約５００〜１０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約１０００〜２０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約２０００〜３０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約３０００〜４０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約４０００〜５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約５０００〜６０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約６０００〜７０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約７０００〜８０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約８０００〜９０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約９０００〜１００００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、少なくとも約１００００〜１５０００塩基対、少なくとも約１５０００〜２００００塩基対、少なくとも約２００００〜２５０００塩基対、少なくとも約２５０００〜３００００塩基対、少なくとも約３００００〜３５０００塩基対、少なくとも約３５０００〜４００００塩基対、少なくとも約４００００〜４５０００塩基対、少なくとも約４５０００〜５００００塩基対、少なくとも約５００００〜５５０００塩基対、少なくとも約５５０００〜６００００塩基対、少なくとも約６００００〜６５０００塩基対、少なくとも約６５０００〜７００００塩基対、少なくとも約７００００〜７５０００塩基対、少なくとも約７５０００〜８００００塩基対、少なくとも約８００００〜８５０００塩基対、少なくとも約８５０００〜９００００塩基対、少なくとも約９００００〜９５０００塩基対、少なくとも約９５０００〜１０００００塩基対、少なくとも約１０００００〜１１００００塩基対、少なくとも約１１００００〜１２００００塩基対、少なくとも約１２００００〜１３００００塩基対、少なくとも約１３００００〜１４００００塩基対、少なくとも約１４００００〜１５００００塩基対、少なくとも約１５００００〜２０００００塩基対、または少なくとも約２０００００塩基対超を含む。特定の一実施形態では、９６８７塩基対が置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、置換ヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの１〜５００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの５００〜１０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１０００〜２０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２０００〜３０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０００〜４０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０００〜５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０００〜６０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０００〜７０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０００〜８０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０００〜９０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９０００〜１００００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１００００〜１５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約１５０００〜２００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２００００〜２５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約２５０００〜３００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３００００〜３５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３５０００〜４００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４００００〜４５０００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４５０００〜５００００塩基対内、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５００００〜５５０００塩基対内、または大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５５０００〜６００００塩基対内に位置する。特定の一実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの９６８７塩基対が置換される。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは散在している。いくつかの実施形態では、置換されたヌクレオチドは連続している。

いくつかの実施形態では、置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約０．１〜１％、少なくとも約１〜２％、少なくとも約２〜３％、少なくとも約３〜４％、少なくとも約４〜５％、少なくとも約５〜６％、少なくとも約６〜７％、少なくとも約７〜８％、少なくとも約８〜９％、少なくとも約９〜１０％、少なくとも約１０〜１１％、少なくとも約１１〜１２％、少なくとも約１２〜１３％、少なくとも約１３〜１４％、少なくとも約１４〜１５％、少なくとも約１５〜１６％、少なくとも約１６〜１７％、少なくとも約１７〜１８％、少なくとも約１８〜１９％、少なくとも約１９〜２０％、少なくとも約２０〜２１％、少なくとも約２１〜２２％、少なくとも約２２〜２３％、少なくとも約２３〜２４％、少なくとも約２４〜２５％、少なくとも約２５〜２６％、少なくとも約２６〜２７％、少なくとも約２７〜２８％、少なくとも約２８〜２９％、または少なくとも約２９〜３０％内に位置する。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約３０〜４０％が置換されている。いくつかの実施形態では、置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約４０〜５０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約５０〜６０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約６０〜７０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約７０〜８０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約８０〜９０％内に位置する。いくつかの実施形態では、置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの少なくとも約９０〜１００％内に位置する。

いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの最初（ｂｅｇｉｎｎｉｎｇ）または５’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの最後（ｅｎｄ）または３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムの中間に位置する。いくつかの実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３遺伝子は細菌ゲノム内に散在し、置換は散在した位置の１つ以上に位置する。

本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、置換は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。

いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０内に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５内に位置する。

いくつかの実施形態では、突然変異は、脂質Ａ生合成（ＫＤＯ）２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーターＡＴＰａｓｅ、高親和性亜鉛トランスポーター膜コンポーネント、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡ、Ｈｏｌｌｉｄａｙジャンクションレゾルバーゼ、ジヒドロネオプテリン三リン酸ピロホスファターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｎｅｏｐｔｅｒｉｎｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、アスパルチル−ｔＲＮＡシンテターゼ、ヒドロラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ＭｓｇＡ、ファージ尾部タンパク質、尾部タンパク質、宿主特異的タンパク質、ペプチダーゼＰ６０、尾部タンパク質、尾部タンパク質、尾部繊維タンパク質、マイナーテールタンパク質Ｕ（ＭｉｎｏｒｔａｉｌｐｒｏｔｅｉｎＵ）、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリン、ＤＮＡアデニンメチラーゼ、セリンプロテアーゼ、抗終結蛋白質（ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ）、アンチリプレッサー、クロスオーバージャンクションエンドデオキシリボヌクレアーゼ、アデニンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＧｎｔＲファミリー転写調節因子ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ｃＩリプレッサー、未知の機能のドメイン（ＤＵＦ４２２２）；ＤＮＡリコンビナーゼ、多数の抗生物質耐性調節因子（ＭａｒＲ）、Ｐ２２における未知のｅａｄ様タンパク質、機能不明のタンパク質（ＤＵＦ５５０）；３’−５’エキソヌクレアーゼ、エキシシオナーゼ、インテグラーゼ、およびｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼから選択される１つ以上のポリペプチドに位置するか、またはそれらを包含する。一実施形態では、マイナーテールタンパク質Ｕ、尾部タンパク質、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼの１つ以上は、１つ以上の置換を含む。特定の一実施形態では、マイナーテールタンパク質Ｕ、尾部タンパク質、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、およびターミナーゼは、１つ以上の置換を含む。

一実施形態では、置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な置換である。特定の一実施形態では、置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な置換である。特定の一実施形態では、置換は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な置換、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な置換である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから置換される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから置換される。

（エフェクター分子およびペイロード発現の調節）
いくつかの実施形態では、突然変異した内因性ファージを含む細菌細胞は、ペイロードが宿主細胞において発現され得、かつ宿主細胞がｉｎｖｉｔｒｏで（例えば、培地中で）および／またはｉｎｖｉｖｏで（例えば、腫瘍微小環境で）生存および／または増殖することができるように、ペイロードをコードする遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体をさらに含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、２個以上の異なるペイロードまたはオペロン、例えば、２個以上のペイロード遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、３個以上の異なるトランスポーターまたはオペロン、例えば、３個以上のペイロード遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の異なるペイロードまたはオペロン、例えば、少なくとも約４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上のペイロード遺伝子を含む。

一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）をコードする遺伝子を含み、高フェニルアラニン血症を軽減することができる。

フェニルアラニン代謝酵素の例には、限定されないが、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、アミノトランスフェラーゼ、Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）、およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼが含まれる。フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼまたはアミノトランスフェラーゼとの反応は補因子を必要とするが、ＬＡＡＤおよびＰＡＬは追加の補因子を全く必要としない。理論に束縛されるものではないが、補因子を必要としないことは、遺伝子操作された細菌によってコードされる酵素によるフェニルアラニン分解が基質の利用可能性に依存し、補因子の利用可能性によって制限されないことを意味する。

いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は１つ以上のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ；ＥＣ４．３．１．２４）は、Ｌ−フェニルアラニンをアンモニアおよびトランス−ケイ皮酸に変換する反応を触媒する酵素である。フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｌ−Ｐｈｅに特異的であり、Ｌ−チロシンにはより低い程度で特異的である。ＰＡＬによって触媒される反応は、トランス−ケイ皮酸およびアンモニアを生じるためのＬ−フェニルアラニンの自発的、非酸化的脱アミノ化である。哺乳動物酵素（ＰＡＨ）と異なり、ＰＡＬは単量体であり、補因子を必要としない（ＭａｃＤｏｎａｌｄら、ＢｉｏｃｈｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌ２００７年；８５：２７３〜８２頁．Ａｍｏｄｅｒｎｖｉｅｗｏｆｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅ）。微生物において、それは、微生物が唯一の炭素および窒素源としてＬ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）を利用することを可能にする異化作用の役割を有する。一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はＰＡＬ遺伝子を含む。ＰＡＬは、フェニルアラニンを非毒性レベルのトランスケイ皮酸およびアンモニアに変換することができる。トランス−ケイ皮酸（ＴＣＡ）は、ＴＣＡ代謝産物である安息香酸および馬尿酸にさらに変換され得る（Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎら、ＪＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．２００７年６月；４２（６）：８１１〜７頁；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｎｄｉｔｓｔｒａｎｓ−ｃｉｎｎａｍｉｃ，ｂｅｎｚｏｉｃａｎｄｈｉｐｐｕｒｉｃａｃｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｌｕｉｄｓｉｎａｓｉｎｇｌｅＧＣ−ＭＳａｎａｌｙｓｉｓ）。ＰＡＬ酵素活性はＴＨＢ補因子活性を必要としない。

いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、限定されないが、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、フォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を含む、細菌種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、細菌種はフォトラブダス・ルミネセンスである。いくつかの実施形態では、細菌種は、アナベナ・バリアビリスである。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、真核生物種、例えば、酵母種、植物種に由来するＰＡＬ遺伝子によってコードされる。複数の異なるＰＡＬタンパク質が当該分野において公知である。遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ遺伝子が発現されると、同じ条件下で同じ細菌亜型の非改変細菌より多くのフェニルアラニンを変換する。したがって、ＰＡＬを含む遺伝子操作された細菌は、ＰＫＵを含む高フェニルアラニン血症に関連する状態を処置するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アナベナ・バリアビリスＰＡＬ（「ＰＡＬ１」）を発現する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フォトラブダス・ルミネセンスＰＡＬ（「ＰＡＬ３」）を発現する。目的のＰＡＬ配列の非限定的な例は表２に示される。

いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドおよび１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。ＬＡＡＤは、イミノ酸中間体を介したアンモニアおよび過酸化水素の産生と共に、立体特異的酸化、すなわち酸素を消費する、Ｌ−アミノ酸のα−ケト酸への脱アミノ化を触媒する。ＬＡＡＤは、ヘビ毒、および多くの細菌（Ｂｉｆｕｌｃｏら、２０１３年）、具体的にはプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、およびモルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）の細菌の細胞膜に見出される。ＬＡＡＤ（ＥＣ１．４．３．２）は二量体構造を有するフラビン酵素である。各サブユニットは、非共有結合フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）補因子）を含有し、外部補因子を全く必要としない。プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）は２種類のＬＡＡＤを含有する（ＤｕｅｒｒｅおよびＣｈａｋｒａｂａｒｔｙ１９７５年）。１つは広範な基質特異性を有し、脂肪族および芳香族Ｌ−アミノ酸（典型的には、Ｌ−フェニルアラニンへ）のケト酸への酸化を触媒する（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３５３８３．１）（Ｂａｅｋら、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｓｉｃＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２０１１年、５１、１２９〜１３５頁；「ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｓｅｃｏｎｄＬ−ａｍｉｎｏａｃｉｄｄｅａｍｉｎａｓｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＰｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ」）。他の種類は塩基性Ｌ−アミノ酸に対して主に作用する（ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＵ６６９８１９．１）。細菌、真菌、および植物源由来のＬＡＡＤは、窒素源としてのＬ−アミノ酸（すなわち、酵素活性によって産生されたアンモニア）の利用に関与するように見える。ほとんどの真核生物および原核生物のＬ−アミノ酸デアミナーゼは、膜結合型であるプロテウス種由来ＬＡＡＤを除いて、細胞外に分泌される。プロテウス・ミラビリスにおいて、ＬＡＡＤは細胞膜に位置し、酵素活性が存在するペリプラズム間隙の外側を向いていることが報告されている（ＰｅｌｍｏｎｔＪら、（１９７２年）「Ｌ−ａｍｉｎｏａｃｉｄｏｘｉｄａｓｅｓｏｆＰｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ：ｇｅｎｅｒａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ」Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ５４：１３５９〜１３７４頁）。

一実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤ遺伝子を含む。ＬＡＡＤはフェニルアラニンを非毒性レベルのフェニルピルビン酸（ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ）に変換することができ、そのフェニルピルビン酸はまた、例えば肝臓酵素によってフェニル乳酸（ｐｈｅｎｙｌｌａｃｔａｔｅ）にさらに分解され得る。フェニルピルビン酸は血液脳関門を横切ることができず、ＬＡＡＤにより、別の潜在的に有毒な代謝産物の蓄積を可能にせずに脳内のフェニルアラニンのレベルを低減させることができる。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤは、限定されないが、プロテウス属、プロビデンシア属、およびモルガネラ属の細菌を含む、細菌種に由来するＬＡＡＤ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ミラビリスである。いくつかの実施形態では、細菌種はプロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はプロテウス・ミラビリスＬＡＡＤ酵素ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ３５３８３．１を発現する。目的のＬＡＡＤ配列の非限定的な例は表２に示される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ酵素はヘビ毒に由来する。本発明によれば、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤ遺伝子が発現されると、同じ条件下で同じ細菌亜型の非改変細菌より多くのフェニルアラニンを変換する。したがって、ＬＡＡＤを含む遺伝子操作された細菌は、ＰＫＵを含む高フェニルアラニン血症に関連する状態を処置するために、体内のフェニルアラニンを非毒性分子に代謝するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、天然に存在するような野生型酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型配列に対する突然変異を含む酵素をコードする。いくつかの実施形態では、突然変異は酵素の安定性を増加させる。いくつかの実施形態では、突然変異は酵素の触媒活性を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表２に列挙されたタンパク質の１つ以上をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１〜８のいずれかの配列を含むポリペプチドの１つ以上をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号１〜８の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、突然変異を含む、表２の１つ以上の酵素をコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＰＡＨをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および／または活性を有する突然変異ＰＡＨをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＰＡＬをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および／または活性を有する突然変異ＰＡＬをコードする。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型ＬＡＡＤをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、増加した安定性および／または活性を有する突然変異ＬＡＡＤをコードする。所望の特性を有する酵素をスクリーニングする方法は、当該分野において公知であり、本明細書に記載される。

［表２］フェニルアラニン代謝酵素の配列

ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、またはＰＡＨ遺伝子（群）は、遺伝子操作された細菌におけるプラスミドまたは染色体上に存在し得る。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子配列（群）は１つ以上の構成的プロモーター（複数可）の制御下で発現される。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子は、本明細書に記載されているような外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子は、哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物の存在下などの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、ＰＭＥ遺伝子は、低酸素、微好気性、または嫌気性条件によって直接的または間接的に誘導されるプロモーターの制御下で発現され、ＰＭＥ遺伝子、例えばＰＡＬ遺伝子の発現は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素または嫌気性環境下で活性される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチド配列をコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチド配列をコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は哺乳動物の消化管のような低酸素または嫌気性条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は、胃、十二指腸および回腸を含むがそれらに限定されない近位の腸内において見出される条件などの、酸素化、低酸素、または微好気性条件によって直接的または間接的に誘導される。他の実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＭＥポリペプチド配列をコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は、哺乳動物の消化管内に天然に存在する環境因子によって直接的または間接的に誘導される。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、哺乳動物の消化管内に天然には存在しない環境因子、例えばアラビノースまたはＩＰＴＧによって直接的または間接的に誘導される１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列をコードする。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、炎症状態下で哺乳類の消化管内に天然に存在する環境因子によって直接的または間接的に誘導される１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列をコードする。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドをコードする遺伝子配列および１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は同一プロモーターまたは同一プロモーターの異なるコピーの制御下にあって、当該プロモーターは本明細書に記載のいずれかの環境条件および本明細書に記載のいずれかのプロモーターなどの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドをコードする遺伝子配列および１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は異なるプロモーターの制御下にあって、当該プロモーターは本明細書に記載のいずれかの環境条件および本明細書に記載のいずれかのプロモーターなどの外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドをコードする遺伝子配列および１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドをコードする遺伝子配列および１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該ＰＡＬ遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にあり、当該ＬＡＡＤ遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、１つ以上のＰＡＬポリペプチドをコードする遺伝子配列および１つ以上のＬＡＡＤポリペプチドをコードする遺伝子配列を含み、当該ＬＡＡＤ遺伝子配列は構成的プロモーターの制御下にあり、当該ＰＡＬ遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にある。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、１つ以上のＰｈｅトランスポーターポリペプチドをコードする遺伝子配列をさらに含み得、当該遺伝子配列は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得、Ｐａｌおよび／またはＬＡＡＤ遺伝子配列を制御するプロモーターと同じまたは異なるプロモーターであり得る。

他の実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；すなわち、１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列が誘導性プロモーターの制御化で発現し、当該誘導性プロモーターは、フラスコ、発酵槽、または他の培養容器内における細菌増殖中に、細菌の培養物中に与えられる特定の分子もしくは代謝産物、温度、酸素レベル、または他のパラメータに応答する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；当該１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列は、低酸素または嫌気性条件下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；当該１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列は、好気性条件下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；当該１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列は、微好気性条件下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；当該１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列は、アラビノースの存在下で発現される。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、細菌細胞培養中のｉｎｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的に誘導される１つまたは以上のＰＭＥ遺伝子配列をコードする；当該１つ以上のＰＭＥ遺伝子配列は、ＩＰＴＧの存在下で発現される。

ペイロード（および／または目的のポリペプチドおよび／または目的のタンパク質および／または治療用ポリペプチドおよび／または治療用タンパク質および／または治療用ペプチドおよび／またはエフェクターおよび／またはエフェクター分子）は、本明細書に記載の代謝産物のいずれか、および／またはそのようなエフェクター分子の産生または異化のための酵素として機能する酵素またはポリペプチドのいずれかを含む。エフェクター分子およびペイロードには、抗癌分子、免疫モジュレーター，消化管バリアエンハンサー分子、抗炎症性分子、満腹分子（ｓａｔｉｅｔｙｍｏｌｅｃｕｌｅ）または神経調節エフェクターが含まれるが、これらに限定されない。ペイロードの非限定的な例は係属中の共同所有の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３４２００（出願日２０１６年５月２５日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願日２０１７年１月１１日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０３（出願日２０１７年２月３日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０９（出願日２０１６年２月４日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５６３（出願日２０１７年２月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５５２（出願日２０１７年２月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９２２（出願日２０１６年７月２９日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９７８１（出願日２０１６年８月３１日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３７０９８（出願日２０１６年６月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９０５２（出願日２０１６年１２月２８日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（出願日２０１６年１１月１６日）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。

本明細書中で使用される場合、「目的の遺伝子」または「目的の遺伝子配列」という用語は、限定はされないが、本明細書に記載の抗癌分子、免疫モジュレーター、消化管バリアエンハンサー分子、抗炎症性分子、満腹分子またはエフェクター、神経調節分子（例えば、キヌレニナーゼ、トリプトファン産生酵素、トリプトファン分解酵素、1つ以上のキヌレニン産生酵素、セロトニンまたはメラトニン産生または分解酵素、（本明細書に記載の）インドール代謝産物産生または分解酵素、ＫＰ代謝産物産生または分解酵素を含む、１つ以上のエフェクター分子またはペイロードをコードする任意のまたは複数の遺伝子および／または遺伝子配列および／または遺伝子カセットを含む。目的の追加の遺伝子の非限定的な例は、係属中の共同所有の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３４２００（出願日２０１６年５月２５日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願日２０１７年１月１１日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０３（出願日２０１７年２月３日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０９（出願日２０１６年２月４日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５６３（出願日２０１７年２月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５５２（出願日２０１７年２月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９２２（出願日２０１６年７月２９日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９７８１（出願日２０１６年８月３１日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３７０９８（出願日２０１６年６月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９０５２（出願日２０１６年１２月２８日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（出願日２０１６年１１月１６日）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、これらの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じペイロード遺伝子の複数コピーを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子はプラスミド上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子はプラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子はプラスミド上に存在し、低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンもしくはアラビノース、または本明細書中に記載される別の化学的もしくは栄養性誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は染色体上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は染色体上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は染色体中に存在し、低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は染色体上に存在し、テトラサイクリンもしくはアラビノース、または本明細書中に記載される別の化学的もしくは栄養性誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は２つ以上のペイロードを含み、その全てが染色体上に存在する。いくつかの実施形態では遺伝子操作された細菌は２つ以上のペイロードを含み、その全てが１つ以上の同じまたは異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は２つ以上のペイロードを含み、そのうちのいくつかは染色体上に存在し、そのうちのいくつかは１つ以上の同じまたは異なるプラスミド上に存在する。

上記の核酸の実施形態のいずれかにおいて、目的のポリペプチドの組み合わせを産生するための１つ以上のペイロードは、１つ以上の直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のペイロードは、外因性環境条件（例えば、消化管、腫瘍微小環境、または他の組織特異的状態において見出される条件）下で誘導される直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のペイロードは、消化管、腫瘍微小環境、または他の特異的状態において見出される代謝産物によって誘導される、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のペイロードは、低酸素または嫌気性条件下で誘導される直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のペイロードは、本明細書中に記載されるような炎症性状態（例えば、ＲＮＳ、ＲＯＳ）下で誘導される直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、１つ以上のペイロードは、例えば本明細書中に記載される腫瘍または他の特定の組織において見出されるような免疫抑制条件下で誘導される直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝子配列が、化学的または栄養性誘導物質への曝露によって誘導される直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに連結され、当該化学的または栄養性誘導物質（テトラサイクリンまたはアラビノース、または本明細書に記載の他のものなどの）はｉｎｖｉｖｏ条件下で存在しても存在しなくてもよく、ｉｎｖｉｔｒｏ条件（株の培養、増殖、製造）中に存在してよい。いくつかの実施形態では、２つ以上のペイロードはすべて構成的プロモーターに連結される。

非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は２つのペイロードを含むことができ、そのうちの１つは構成的プロモーターに連結され、そのうちの１つは直接または間接的に誘導可能なプロモーターに連結される。非限定的な例では、遺伝子操作された細菌は３つのペイロードを含むことができ、そのうちの１つは構成的プロモーターに連結され、そのうちの１つは直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに連結され、そのうちの１つは第２の別の直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに連結される。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｉｎｖｉｖｏ条件下、例えば、本明細書に記載されるような消化管で誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｉｎｖｉｔｒｏ条件下、例えば、本明細書に記載されるような様々な細胞培養および／または細胞製造条件下で誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｉｎｖｉｖｏ条件（例えば、本明細書に記載されるような消化管）下、およびｉｎｖｉｔｒｏ条件（例えば、本明細書に記載されるような様々な細胞培養ならびに／または細胞産生および／もしくは製造条件）下で誘導される。

いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターは、外因性環境条件（例えば、ｉｎｖｉｖｏおよび／またはｉｎｖｉｔｒｏおよび／または産生／製造条件）によって直接的に誘導される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターは、外因性環境条件（例えば、ｉｎｖｉｖｏおよび／またはｉｎｖｉｔｒｏおよび／または産生／製造条件）によって間接的に誘導される。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、腫瘍および／または哺乳動物の小腸の低酸素環境に特異的な外因性環境条件によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは低酸素または嫌気性条件（例えば、腫瘍の低酸素環境および／または哺乳動物の消化管の環境）によって、直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、腫瘍、特定の組織、または哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、細菌細胞と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。

（ＦＮＲ依存性調節）
本発明の遺伝子操作された細菌は、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含み、当該遺伝子または遺伝子カセットは、外因性環境条件によって制御される直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは酸素レベル依存性プロモーターであり、目的のポリぺプチドは低酸素、微好気性、または嫌気性条件において発現される。例えば、低酸素条件において、酸素レベル依存性プロモーターは、対応する酸素レベル感知転写因子によって活性化され、それによって、目的のポリぺプチドの産生を駆動する。

細菌は、酸素レベルを感知することができる転写因子を進化させてきた。異なるシグナル伝達経路は異なる酸素レベルによって誘発され得、異なる動態を伴って発生する。酸素レベル依存性プロモーターは、１つ以上の酸素レベル感知転写因子が結合できる核酸配列であり、対応する転写因子の結合および／または活性化は下流の遺伝子発現を活性化する。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酸素レベル依存性プロモーターの制御下でペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。より具体的な態様では、遺伝子操作された細菌は、低酸素または嫌気性環境、例えば、腫瘍の低酸素環境および／または哺乳動物の消化管の環境、および／または他の特定の組織の環境で活性化される酸素レベル依存性プロモーターの制御下でペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。

特定の実施形態では、細菌細胞は、フマレートおよび硝酸レダクターゼ調節因子（ＦＮＲ）応答性プロモーターの制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。大腸菌では、ＦＮＲは、好気性代謝から嫌気性代謝への切り替えを制御する主要な転写活性化因子である（Ｕｎｄｅｎら、１９９７年）。嫌気性状態では、ＦＮＲは二量体化して活性なＤＮＡ結合タンパク質となり、嫌気性増殖への適応に関与する何百もの遺伝子を活性化する。好気性状態では、ＦＮＲは酸素によって二量体化することが妨げられ、不活性である。ＦＮＲ応答性プロモーターには、以下の表３に列挙されるＦＮＲ応答性プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。下線を引いた配列は予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列はクローニングに使用される制限部位である。

［表３］ＦＮＲプロモーター配列

ＦＮＲプロモーター配列は当該分野で公知であり、任意の適切なＦＮＲプロモーター配列が、本発明の遺伝子操作された細菌において使用され得る。任意の適切なＦＮＲプロモーターを、任意の適切なペイロードと組み合わせてよい。

非限定的なＦＮＲプロモーター配列は、ＦＮＲ応答性プロモーター配列を含む例示的な調節領域配列の核酸配列を示す表３に提供される。下線を引いた配列は予測されるリボソーム結合部位であり、太字の配列はクローニングに使用される制限部位である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、以下のうちの１つ以上を含む：配列番号：１Ａ、配列番号：２Ａ、配列番号：３Ａ、配列番号：４Ａ、配列番号：５Ａ、配列番号：６Ａ、配列番号：７Ａ、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号：８Ａ）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号：９Ａ）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号：１０Ａ）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号：１１Ａ）、強力なリボソーム結合部位に融合されたｎｉｒＢプロモーター（配列番号：１２Ａ）、強力なリボソーム結合部位に融合されたｙｄｆＺプロモーター（配列番号：１３Ａ）、ｆｎｒＳ、嫌気的に誘導されたｓｍａｌｌＲＮＡ遺伝子（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号：１４ＡまたはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号：１５Ａ）、ｃｒｐ結合部位に融合されたｎｉｒＢプロモーター（配列番号：１６Ａ）、およびｃｒｐ結合部位に融合されたｆｎｒＳ（配列番号：１７Ａ）。いくつかの実施形態では、ＦＮＲ応答性プロモーターは、配列番号１Ａ〜１７Ａのいずれか１つの配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。

いくつかの実施形態では、複数の異なる核酸配列が遺伝子操作された細菌に挿入される。代替の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、代替の酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＤＮＲ（Ｔｒｕｎｋら、２０１０年）またはＡＮＲ（Ｒａｙら、１９９７年））の制御下で発現されるペイロード（例えば、ＰＡＬなどのＰＭＥ）をコードする遺伝子を含む。これらの実施形態では、ペイロード遺伝子の発現は、消化管内などの低酸素または嫌気性環境において特に活性化される。いくつかの実施形態では、遺伝子発現は当該分野で公知の方法によって、例えば、リボソーム結合部位の最適化および／またはｍＲＮＡ安定性の増加によって、さらに最適化される。一実施形態では、哺乳動物の消化管は、ヒト哺乳動物の消化管である。

任意の適切なＦＮＲプロモーターを、任意の適切なＰＡＬと組み合わせることができる。非限定的なＦＮＲプロモーター配列は表３に提供され、非限定的なＰＡＬ配列も本明細書中に提供される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ＷＯ２０１７０８７５８０に開示される以下の配列番号のうちの１つ以上を含み、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される：配列番号９、配列番号１０、ｎｉｒＢ１プロモーター（配列番号１１）、ｎｉｒＢ２プロモーター（配列番号１２）、ｎｉｒＢ３プロモーター（配列番号１３）、ｙｄｆＺプロモーター（配列番号１４）、強力なリボソーム結合部位に融合されたｎｉｒＢプロモーター（配列番号１５）、強力なリボソーム結合部位に融合されたｙｄｆＺプロモーター（配列番号１６）、ｆｎｒＳ、嫌気的に誘導されたｓｍａｌｌＲＮＡ遺伝子（ｆｎｒＳ１プロモーター配列番号９またはｆｎｒＳ２プロモーター配列番号１７）、ｃｒｐ結合部位に融合されたｎｉｒＢプロモーター（配列番号１８）、およびｃｒｐ結合部位に融合されたｆｎｒＳ（配列番号１９）。

別の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アルギニンデイミナーゼおよび硝酸還元転写調節因子（ＡＮＲ）の嫌気性調節の制御下で発現されるペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）では、ＡＮＲは、「酸素制限または嫌気性条件下で誘導可能な生理学的機能の発現に必要とされる」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年；Ｓａｗｅｒｓ１９９１年）。シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＡＮＲは大腸菌ＦＮＲと相同であり、「コンセンサスＦＮＲ部位（ＴＴＧＡＴ−−−−ＡＴＣＡＡ）は、ＡＮＲおよびＦＮＲによって効率的に認識された」（Ｗｉｎｔｅｌｅｒら、１９９６年）。ＦＮＲと同様に、嫌気的状態において、ＡＮＲは嫌気性増殖への適応に関与する多数の遺伝子を活性化する。好気性状態にでは、ＡＮＲは不活性である。シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ）、およびシュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｍｅｎｄｏｃｉｎａ）の全てが、ＡＮＲの機能性類似体を有する（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎら、１９９１年）。ＡＮＲによって調節されるプロモーター（例えば、ａｒｃＤＡＢＣオペロンのプロモーター）は、当該分野において公知である（例えば、Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年を参照のこと）。

ＦＮＲファミリーはまた、「シュードモナス・アエルギノーザの嫌気性硝酸塩呼吸」（Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年）のためにＡＮＲと併せて必要とされる転写調節因子である、異化型硝酸塩呼吸調節因子（ＤＮＲ）（Ａｒａｉら、１９９５年）も含む。特定の遺伝子について、ＦＮＲ結合モチーフは、「おそらくＤＮＲによってのみ認識される」（Ｈａｓｅｇａｗａら、１９９８年）。外因性環境条件および対応する調節領域によって制御される任意の適切な転写調節因子が使用され得る。非限定的な例には、ＡｒｃＡ／Ｂ、ＲｅｓＤ／Ｅ、ＮｒｅＡ／Ｂ／Ｃ、およびＡｉｒＳＲが含まれ、その他は当該分野において公知である。

他の実施形態では、ペイロード（例えば、ＰＡＬなどのＰＭＥ）を産生するための１つ以上の遺伝子配列は、転写活性化因子（例えば、ＣＲＰ）に対する結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーターの制御下で発現される。ＣＲＰ（サイクリックＡＭＰ受容体タンパク質またはカタボライト活性化タンパク質またはＣＡＰ）は、グルコースなどの急速に代謝可能な炭水化物が存在する場合、より不利な炭素源の取り込み、代謝、および同化を担う遺伝子を抑制することによって、細菌において主要な調節的役割を果たす（Ｗｕら、２０１５年）。グルコースに対するこの選好性は、グルコース抑制、および炭素カタボライト抑制と呼ばれている（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、２００８年；ＧｏｒｋｅおよびＳｔｕｌｋｅ、２００８年）。いくつかの実施形態では、ペイロード分子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、ＣＲＰ結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ペイロードのための１つ以上の遺伝子配列は、ＣＲＰ結合部位に融合されたＦＮＲプロモーターによって制御される。これらの実施形態では、サイクリックＡＭＰは、グルコースが環境中に存在しない場合にＣＲＰに結合する。この結合により、ＣＲＰのコンホメーション変化が引き起こされ、ＣＲＰがその結合部位に強く結合することが可能になる。次いで、ＣＲＰ結合は、直接的タンパク質間相互作用を介してＦＮＲプロモーターにＲＮＡポリメラーゼをリクルートすることにより、遺伝子または遺伝子カセットの転写を活性化する。グルコースの存在下では、サイクリックＡＭＰはＣＲＰに結合せず、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットの転写は抑制される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子対する結合部位に融合された酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）は、（例えば、グルコースをｉｎｖｉｔｒｏで増殖培地に添加することによって）十分な量のグルコースが存在する場合に、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットが嫌気性条件下で発現されないこと確実にするために使用される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株、または亜株由来の酸素レベル依存性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株、または亜株由来の酸素レベル感知転写因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲまたはＤＮＲを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細菌の異なる種、株、または亜株由来の酸素レベル感知転写因子および対応するプロモーターを含む。異種酸素レベル依存性転写調節因子および／またはプロモーターは、同じ条件下の細菌における天然遺伝子およびプロモーターと比較して、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子（例えば、低酸素または嫌気性環境でペイロードを産生するための１つ以上の遺伝子配列）の転写を増加させる。特定の実施形態では、非天然の酸素レベル依存性転写調節因子は、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来のＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｉｓａｂｅｌｌａら、２０１１年を参照のこと）。いくつかの実施形態では、対応する野生型転写調節因子はインタクトのままであり、野生型活性を保持する。代替の実施形態では、野生型活性を減少または排除するために、対応する野生型転写調節因子を欠失または突然変異させる。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型酸素レベル依存性転写調節因子（例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲ）、および同じ亜型の細菌由来の野生型プロモーターと比較して突然変異している対応するプロモーターを含む。突然変異したプロモーターは、同じ条件下の野生型プロモーターと比較して、低酸素または嫌気性環境において、野生型転写調節因子への結合を増強し、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子（例えば、ペイロードをコードする遺伝子）の転写を増加させる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、野生型酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲプロモーター）、および同じ亜型の細菌由来の野生型転写調節因子と比較して突然変異している対応する転写調節因子を含む。突然変異した転写調節因子は、同じ条件下の野生型転写調節因子と比較して、低酸素または嫌気性環境において、野生型プロモーターへの結合を増強し、前記プロモーターに作動可能に連結された遺伝子（例えば、ペイロードをコードする遺伝子）の転写を増加させる。特定の実施形態では、突然変異酸素レベル依存性転写調節因子は、二量体化およびＦＮＲ活性を高めるアミノ酸置換を含むＦＮＲタンパク質である（例えば、Ｍｏｏｒｅら、（２００６年）を参照のこと）。いくつかの実施形態では、低酸素条件でのペイロード発現を増加させるために、酸素レベル感知転写調節因子および対応するプロモーターの両方が、同じ亜型の細菌由来の野生型配列に対して突然変異している。

いくつかの実施形態では、細菌細胞は、酸素レベル感知転写調節因子をコードする内因性遺伝子（例えば、ＦＮＲ遺伝子）の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子はプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ペイロードをコードする遺伝子とは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ペイロードをコードする遺伝子とは、同じプラスミド上に存在する。

いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ペイロードをコードする遺伝子とは、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ペイロードをコードする遺伝子とは、同じ染色体上に存在する。場合によっては、発現安定性を高めるために、誘導性プロモーターの制御下で酸素レベル感知転写調節因子を発現させることが有利であり得る。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイロードをコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは別のプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子の発現は、ペイロードの発現を制御するプロモーターと同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、転写調節因子およびペイロードは、プロモーター領域から分岐して転写される。

（酸素レベル非依存性誘導性プロモーター）
ＦＮＲＳ２４Ｙを含むシステムなどの酸素レベル非依存性誘導性プロモーターシステムは、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（出願日２０１６年１１月１６日、ＷＯ２０１７０８７５８０として公開）に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

酸素レベルに応答して誘導されるプロモーターに加えて、ＰＭＥ遺伝子および／またはＰｈｅトランスポーター遺伝子は、反応性窒素種の存在下または反応性酸素種の存在下などの炎症状態に応答して誘導されるプロモーターによって調節され得る。そのような誘導性プロモーターの例は、同時係属、共同所有の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５０８３６（出願日２０１６年９月８日）にあり、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。

本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、酸素非依存性プロモーターの制御下にある１つ以上のＰＭＥおよび／または１つ以上のｐｈｅトランスポーターを含む遺伝子操作された細菌は、１つ以上のバクテリオファージをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において突然変異している。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または１つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の大腸菌を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、以下から選択される１つ以上の遺伝子に位置する１つ以上の欠失を含む：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失を含む。ファージ３ゲノム。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列が、ファージ３ゲノムから欠失している。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含む改変されたファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変されたファージゲノム配列を含む。

（ＲＮＳ依存性調節）
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝的に操作されたウイルスは、誘導性プロモーターの制御下で発現されるペイロードをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、炎症状態によって活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルス。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子は、炎症性環境において活性化される炎症依存性プロモーター、例えば、反応性窒素種またはＲＮＳプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、少なくとも１つの反応性窒素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域を含む。（例えば、反応性窒素種によって誘導可能な）好適なＲＮＳ誘導性プロモーターは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（出願日２０１６年１１月１６日、ＷＯ２０１７０８７５８０として公開）に記載され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

（ＲＯＳ依存性調節）
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルスは、誘導性プロモーターの制御下で発現されるペイロードを産生するための遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞障害の条件によって活性化されるプロモーターの制御下でペイロードを発現する遺伝子操作された細菌または遺伝的操作されたウイルス。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子は、細胞または組織損傷が存在する環境、例えば、反応性酸素種またはＲＯＳプロモーターにおいて活性化される細胞損傷依存性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、少なくとも１つの反応性酸素種を感知することができる転写因子によって直接的または間接的に制御される調節可能な調節領域を含む。例えば反応性酸素種によって誘導可能な、好適なＲＯＳ誘導性プロモーターは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願日２０１７年１月１１日、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開）、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（出願日２０１６年５月１３日、ＷＯ２０１６１８３５３１として公開）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（出願日２０１６年１１月１６日、ＷＯ２０１７０８７５８０として公開）に記載されており、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

［表１７］例示的なＯｘｙＲ調節された調節領域のヌクレオチド配列

いくつかの実施形態では、調節領域配列は、配列番号１８Ｃ、配列番号１９Ｃ、配列番号２０Ｃ、および／または配列番号２１Ｃの配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同である。

（プロピオネートおよび他のプロモーター）
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、環境（例えば、腫瘍微小環境、特定の組織、または哺乳動物の消化管）における特定の分子または代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される１つ以上のペイロード遺伝子を産生するための遺伝子または遺伝子カセットを含む。例えば、短鎖脂肪酸プロピオネートは、消化管に局在する主要な微生物発酵代謝産物である（Ｈｏｓｓｅｉｎｉら、２０１１年）。一実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、プロピオネート誘導性プロモーターの制御下にある。より具体的な実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、哺乳動物の消化管内のプロピオネートの存在によって活性化されるプロピオネート誘導性プロモーターの制御下にある。健康状態および／または疾患状態の哺乳動物の消化管に見出される任意の分子または代謝産物が、ペイロード発現を誘導するために使用され得る。誘導物質の非限定的な例としては、プロピオネート（ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ビリルビン（ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、およびＸ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、肝炎抗原および抗体、アルファフェトプロテイン（ａｌｐｈａｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、抗ミトコンドリア、平滑筋、および抗核抗体、鉄、トランスフェリン、フェリチン、銅、セルロプラスミン（ｃｅｒｕｌｏｐｌａｓｍｉｎ）、アンモニア、およびマンガンが挙げられる。代替の実施形態では、治療用ポリペプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、糖アラビノースの存在下で活性化されるｐＡｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。

いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットはプラスミド上に存在し、低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは染色体中に存在し、低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットはプラスミド上に存在し、腫瘍および／または哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは染色体上に存在し、腫瘍および／または哺乳動物の消化管に特異的な分子または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは染色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットはプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、遺伝子発現は、当該分野で公知の方法によって、例えば、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化、転写調節因子の操作、および／またはｍＲＮＡ安定性の増加によって、さらに最適化される。ＲＢＳの微調整および最適化のためのバイオインフォマティクスツールは、当技術分野で知られている。

本明細書で上述した（および本明細書中の他の場所に記載される）実施形態のいずれかにおいて、操作された細菌は、本明細書中に記載されるプロモーターのいずれかの制御下にある１つ以上の遺伝子配列をコードする遺伝子配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、遺伝子または遺伝子カセットが宿主細胞において発現され得、かつ宿主細胞がｉｎｖｉｔｒｏで（例えば、培地中で）および／またはｉｎｖｉｖｏで（例えば、消化管または腫瘍微小環境において）生存および／または増殖することができるように、目的のポリペプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットを保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、細菌は、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットの複数のコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、低コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、低コピープラスミドは、非誘導条件下で漏出発現（ｌｅａｋｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を減少させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、高コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、遺伝子または遺伝子カセットの発現を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための遺伝子または遺伝子カセットは、染色体上で発現される。

（他の誘導性プロモーター）
いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする遺伝子はプラスミド上に存在し、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする遺伝子は染色体中に存在し、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、細菌細胞は、目的のポリペプチドが宿主細胞において発現され得、かつ宿主細胞がｉｎｖｉｔｒｏで（例えば、培地中で）および／またはｉｎｖｉｖｏで（例えば、腫瘍中または消化管中で）生存および／または増殖することができるように、目的のポリペプチドをコードする、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導可能な１つ以上の遺伝子配列を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、目的のポリぺプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列の２つ以上の異なるコピーを含み、これは１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導可能なプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列の複数のコピーを含み、これは１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導可能なプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列はプラスミド上に存在し、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導可能な直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列は染色体上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列が、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導される。

いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される目的のポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列はプラスミド上に存在し、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、目的のポリペプチドが宿主細胞において発現され得、かつ宿主細胞がｉｎｖｉｔｒｏで（例えば、培養条件下で）および／またはｉｎｖｉｖｏで（例えば、消化管または腫瘍微小環境において）生存および／または増殖することができるように、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導される、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、目的のポリぺプチドの産生のための２つ以上の遺伝子配列を含み、そのうちの１つ以上は、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導される、目的のポリペプチドの産生のための同じ遺伝子配列の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、目的のポリペプチドの産生のための異なる遺伝子配列の複数のコピーを含み、そのうちの１つ以上は、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導される。

いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドの産生のための遺伝子配列はプラスミド上に存在し、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドの産生のための遺伝子配列は染色体中に存在し、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つ以上の異なるＰＡＬ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じＰＡＬ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体に存在し、低酸素または嫌気性条件下で誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、ＩＰＴＧまたは別のＬａｃＩ誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子はプラスミド上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、ＩＰＴＧまたは別のＬａｃＩ誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ遺伝子は染色体上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤが宿主細胞において発現され得、かつ宿主細胞がｉｎｖｉｔｒｏで（例えば、培地中で）および／またはｉｎｖｉｖｏで（例えば、消化管中で）生存および／または増殖することができるように、ＬＡＡＤ遺伝子を保有する安定に維持されたプラスミドまたは染色体を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、２つ以上の異なるＬＡＡＤ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じＬＡＡＤ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、例えばアラビノースまたはテトラサイクリンによって誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、直接的または間接的に誘導可能なプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体に存在し、例えばアラビノースまたはテトラサイクリンによって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、ＩＰＴＧまたは他のＬａｃＩ誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子はプラスミド上に存在し、テトラサイクリンへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、ＩＰＴＧまたは他のＬａｃＩ誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ＬＡＡＤ遺伝子は染色体上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。

ＰＭＥ遺伝子（例えば、ＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤ）を含む細菌のこれらの実施形態のいずれかにおいて、細菌は、１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする遺伝子配列をさらに含み得、当該Ｐｈｅトランスポーター遺伝子配列はプラスミドまたは染色体上に存在し得、当該プラスミドまたは染色体は、ＰＭＥ遺伝子の位置と同じまたは異なるプラスミドまたは染色体であり得る。Ｐｈｅトランスポーター遺伝子配列は、ＰＭＲ遺伝子配列と同じまたは異なるプロモーターの制御下にあり得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酸素レベル依存性転写調節因子、例えば、ＦＮＲ、ＡＮＲ、またはＤＮＲと、異なる細菌種由来の対応するプロモーターとを含む。非天然の酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、前記プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子、例えばＰＡＬまたはＰＡＨの転写を、低酸素または嫌気性環境において、同じ条件下の細菌における天然の転写調節因子およびプロモーターと比較して増加させる。非天然の酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、前記プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子、例えばＰＡＬまたはＰＡＨの転写を、低酸素または嫌気性環境において、同じ条件下の野生型プロモーターと比較して増加させる。非天然の酸素レベル依存性転写調節因子およびプロモーターは、前記プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子、例えばＰＡＬまたはＰＡＨの転写を、低酸素または嫌気性環境において、同じ条件下の野生型転写調節因子と比較して増加させる。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、酸素レベル感知転写調節因子をコードする内因性遺伝子、例えばＦＮＲ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子はプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ＰＡＬをコードする遺伝子とは、異なるプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ＰＡＬをコードする遺伝子とは、同じプラスミド上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子は染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ＰＡＬをコードする遺伝子とは、異なる染色体上に存在する。いくつかの実施形態では、酸素レベル感知転写調節因子をコードする遺伝子と、ＰＡＬをコードする遺伝子とは、同じ染色体上に存在する。

一実施形態では、ＬＡＡＤ発現は、Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーターの制御下にある。一実施形態では、ＬＡＡＤ発現は、好気性または微好気性条件下で起こる。一実施形態では、ＰＡＬ発現は、Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーターの制御下にある。一実施形態では、ＰＡＬ発現は、好気性または微好気性条件下で起こる。一実施形態では、ＰＡＬ発現は嫌気性または低酸素条件下で起こり、ＬＡＤＤ発現は好気性または微好気性条件下で起こる。一実施形態では、ＰＡＬ発現は嫌気性または低酸素条件下で起こり、ＬＡＤＤ発現はＰ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーターの制御下にある。

いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドを産生するための１つ以上の遺伝子または遺伝子カセット（例えば、ＰＡＬおよびＬＡＡＤ遺伝子）が存在し、各遺伝子は異なるプロモーター、例えば、本段落および本明細書中の他の箇所において議論されるプロモーターのいずれかの制御下で発現される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ遺伝子は、アラビノースへの曝露によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ遺伝子は、ＩＰＴＧまたは他のＬａｃＩ誘導物質への曝露によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ遺伝子は、ラムノースへの曝露によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤ遺伝子は、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。

いくつかの実施形態では、目的のポリぺプチドをコードする遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターは、１つ以上の栄養性および／または化学的誘導物質および／または代謝産物によって直接的または間接的に誘導される。

いくつかの実施形態では、１つ以上の誘導性プロモーターは、目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現のために有用であるか、または目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、１つ以上の抗癌分子、満腹分子、消化管バリアエンハンサー分子、免疫調節分子および／または神経調節分子および／または目的の他のポリペプチドのｉｎｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のポリペプチドおよび／または目的の他のポリペプチドの発現は、ｉｎｖｉｖｏで１つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される化学的および／または栄養性誘導物質および／または代謝産物によって、直接的または間接的に誘導される。

いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のポリペプチドおよび／または目的の他のポリペプチドの発現は、ｉｎｖｉｖｏ投与前の株のｉｎｖｉｔｒｏでの増殖、調製、または製造の間に化学的および／または栄養性誘導物質および／または代謝産物により誘導される１つ以上のプロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、化学的および／または栄養性誘導物質および／または代謝産物によって誘導されるプロモーターは、培養物中で誘導される（例えば、細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造などの間に使用されるフラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖される）。いくつかの実施形態では、発現を誘導し、投与前に目的のポリペプチドおよび／または他の目的のポリペプチドを細菌にプレロードするために、プロモーターは細菌培養物に添加される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、化学的および／または栄養性誘導物質および／または代謝産物によって誘導される培養物は、好気的に増殖される。いくつかの実施形態では、化学的および／または栄養性誘導物質および／または代謝産物によって誘導される培養物は、嫌気的に増殖される。

アラビノース代謝の遺伝子は、ＰＡｒａＢＡＤプロモーターによって制御される１つのオペロン、ＡｒａＢＡＤに編成されている。ＰＡｒａＢＡＤ（またはＰａｒａ）プロモーターは、誘導性発現システムの基準を適切に満たす。ＰＡｒａＢＡＤは、他の多くのシステムよりも、ペイロード遺伝子発現のより厳密な制御を示すが、これは、誘導物質およびリプレッサーの両方として機能するＡｒａＣの二重の調節機能によるものと考えられる。さらに、ＰａｒａＢＡＤベースの発現レベルを広範囲のＬ−アラビノース濃度にわたってモジュレートして、ペイロードの発現レベルを微調整することができる。しかしながら、亜飽和（ｓｕｂ−ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ）Ｌ−アラビノース濃度に曝露された細胞集団は、誘導細胞および非誘導細胞の２つの亜集団に分けられ、これは、Ｌ−アラビノーストランスポーターの利用能における個々の細胞間の差異によって決定される（Ｚｈａｎｇら、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎＡｒａｂｉｎｏｓｅ−ＩｎｄｕｃｉｂｌｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｂｙＦａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇＩｎｄｕｃｅｒＵｐｔａｋｅｉｎＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ；Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２年８月、第７８巻、第１６号、５８３１−５８３８頁）。あるいは、ＰａｒａＢａｄからの誘導性発現は、本明細書に記載されているように、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化を通じて制御または微調整され得る。

一実施形態では、目的の１つ以上のポリペプチド、例えば、１つ以上の治療用ポリペプチドの発現は、１つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。

いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現のために有用であるか、または目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、ｉｎｖｉｖｏで１つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される分子（例えば、アラビノース）によって直接的または間接的に誘導される。

いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、ｉｎｖｉｖｏ投与前の株のｉｎｖｉｔｒｏでの増殖、調製、または製造の間に、１つ以上のアラビノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、培養物中で誘導される（例えば、細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造などの間に使用されるフラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖される）。いくつかの実施形態では、発現を誘導し、投与前にペイロード（例えば、アラビノース）を細菌にプレロードするために、プロモーターは細菌培養物に添加される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、アラビノースによって誘導される培養物は好気的に増殖される。いくつかの実施形態では、アラビノースによって誘導される培養物は嫌気的に増殖される。

一実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、第２のプロモーター（例えば、第２の構成的または誘導性プロモーター）と一緒に、目的の１つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターが構築物の近位に配置されて、その発現を駆動し、ここで、アラビノース誘導性プロモーターが第１セットの外因性条件下で発現を駆動し、第２のプロモーターが第２セットの外因性条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件は、２つの連続した培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器における培養物の調製中の条件、例えば、アラビノースおよびＩＰＴＧ）であり得る。別の非限定的な例では、第１の誘導条件は、例えば、アラビノースの存在を含む培養条件であり得、第２の誘導条件はｉｎｖｉｖｏ条件であり得る。そのようなｉｎｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気性、もしくは嫌気性条件、消化管代謝産物の存在、および／または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のアラビノースプロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターと組み合わされて、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。

いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、本明細書に記載される低コピープラスミドまたは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドからの目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性プロモーターは、細菌染色体に組み込まれた構築物からの目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。

いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質がアラビノースオペロンにノックインされ、天然のアラビノース誘導性プロモーターによって駆動される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号２３の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、アラビノース誘導性構築物は、目的の１つ以上のタンパク質と同じプロモーターから分岐して転写される、ＡｒａＣをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号２４の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号２５の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がラムノース誘導システムを介して誘導可能な１つ以上の遺伝子配列を含む。遺伝子ｒｈａＢＡＤは、ｒｈａＰＢＡＤプロモーターによって制御される１つのオペロンで編成されている。ｒｈａＰＢＡＤプロモーターは２つの活性化因子、ＲｈａＳおよびＲｈａＲによって調節され、対応する遺伝子はｒｈａＢＡＤの逆方向に分岐して転写される１つの転写ユニットに属する。Ｌ−ラムノースの存在下で、ＲｈａＲはｒｈａＰＲＳプロモーターに結合し、ＲｈａＲおよびＲｈａＳの産生を活性化する。次いで、ＲｈａＳはＬ−ラムノースと共にｒｈａＰＢＡＤおよびｒｈａＰＴプロモーターに結合し、構造遺伝子の転写を活性化する。ＡｒａＣが提供され、遺伝子配列において分岐して転写されるアラビノースシステムとは対照的に、染色体から発現される量がマルチコピープラスミド上でも転写を活性化するのに十分であるため、ラムノース発現システムでは調節タンパク質を大量に発現させる必要はない。従って、ｒｈａＰＢＡＤプロモーターのみが、発現される遺伝子の上流にクローニングされる。ｒｈａＢＡＤ転写の完全な誘導はまた、カタボライト抑制（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）の重要な調節因子であるＣＲＰ−ｃＡＭＰ複合体の結合を必要とする。あるいは、ｒｈａＢＡＤからの誘導性発現は、本明細書に記載されるように、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化を通じて制御または微調整され得る。一実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、１つ以上のラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。一実施形態では、ペイロードの発現は、ラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。

いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターは、目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現のために有用であるか、または目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、ｉｎｖｉｖｏで１つ以上のラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される分子、例えば、ラムノースによって直接的または間接的に誘導される。

いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、ｉｎｖｉｖｏ投与前の株のｉｎｖｉｔｒｏでの増殖、調製、または製造の間に、１つ以上のラムノース誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターは、培養物中で誘導される（例えば、細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造などの間に使用されるフラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖される）。いくつかの実施形態では、発現を誘導し、投与前にペイロード（例えば、ラムノース）を細菌にプレロードするために、プロモーターは細菌培養物に添加される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、ラムノースによって誘導される培養物は好気的に増殖される。いくつかの実施形態では、ラムノースによって誘導される培養物は嫌気的に増殖される。

一実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターは、第２のプロモーター（例えば、第２の構成的または誘導性プロモーター）と一緒に、目的の１つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターが構築物の近位に配置されて、その発現を駆動し、ここで、ラムノース誘導性プロモーターが第１セットの外因性条件下で発現を駆動し、第２のプロモーターが第２セットの外因性条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件は、２つの連続した培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器における培養物の調製中の条件、例えば、ラムノースおよびアラビノース）であり得る。別の非限定的な例では、第１の誘導条件は、例えば、ラムノースの存在を含む培養条件であり得、第２の誘導条件はｉｎｖｉｖｏ条件であり得る。そのようなｉｎｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気性、もしくは嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および／または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のラムノースプロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターと組み合わされて、目的の１つ以上のタンパク質および／または転写調節因子（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）の発現を駆動する。

いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターは、本明細書に記載される低コピープラスミドまたは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドからの目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、ラムノース誘導性プロモーターは、細菌染色体に組み込まれた構築物からの目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号２６の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導システムまたはＬａｃプロモーターからの転写を誘導した他の化合物を介して誘導可能な１つ以上の遺伝子配列を含む。ＩＰＴＧは、ｌａｃオペロンの転写を活性化するラクトース代謝産物であるアロラクトースの分子模倣物である。アロラクトースとは対照的に、ＩＰＴＧ中の硫黄原子は非加水分解性化学結合を生成し、当該結合はＩＰＴＧの分解を防ぎ、その濃度を一定に保つことを可能にする。ＩＰＴＧはｌａｃリプレッサーに結合し、アロステリック様式でｌａｃオペレーターから四量体リプレッサー（ｌａｃＩ）を放出し、それによってｌａｃオペロンにおける遺伝子の転写を可能にする。ＩＰＴＧは大腸菌によって代謝されないので、その濃度は一定のままであり、Ｌａｃプロモーター制御の発現速度は、ｉｎｖｉｖｏおよびｉｎｖｉｔｒｏの両方で厳密に制御される。他の輸送経路も関与しているので、ＩＰＴＧの摂取はラクトースパーミアーゼの作用に依存しない。ＰＬａｃからの誘導性発現は、本明細書に記載されるように、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化を通じて制御または微調整され得る。ＬａｃＩを不活性化する他の化合物を、同様の方法でＩＰＴＧの代わりに使用することができる。

一実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、１つ以上のＩＰＴＧ誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。

いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現のために有用であるか、または目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、ｉｎｖｉｖｏで１つ以上のＩＰＴＧ誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される分子、例えば、ＩＰＴＧによって直接的または間接的に誘導される。

いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、ｉｎｖｉｖｏ投与前の株のｉｎｖｉｔｒｏでの増殖、調製、または製造の間に、１つ以上のＩＰＴＧ誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、培養物中で誘導される（例えば、細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造などの間に使用されるフラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖される）。いくつかの実施形態では、発現を誘導し、投与前にペイロード（例えば、ＩＰＴＧ）を細菌にプレロードするために、プロモーターは細菌培養物に添加される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧによって誘導される培養物は好気的に増殖される。いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧによって誘導される培養物は嫌気的に増殖される。

一実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、第２のプロモーター（例えば、第２の構成的または誘導性プロモーター）と一緒に、目的の１つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターが構築物の近位に配置されて、その発現を駆動し、ここで、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターが第１セットの外因性条件下で発現を駆動し、第２のプロモーターが第２セットの外因性条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件は、２つの連続した培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器における培養物の調製中の条件、例えば、アラビノースおよびＩＰＴＧ）であり得る。別の非限定的な例では、第１の誘導条件は、例えば、ＩＰＴＧの存在を含む培養条件であり得、第２の誘導条件はｉｎｖｉｖｏ条件であり得る。そのようなｉｎｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気性、もしくは嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および／または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターと組み合わされて、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。

いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、本明細書に記載される低コピープラスミドまたは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドからの目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、細菌染色体に組み込まれた構築物からの目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号２７の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、ＩＰＴＧ誘導性構築物は、目的の１つ以上のタンパク質と同じプロモーターから分岐して転写される、ｌａｃＩをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号２８の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号２９の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、テトラサイクリン誘導システムを介して誘導可能な１つ以上の遺伝子配列を含む。ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｔｉｇｈｔｃｏｎｔｒｏｌｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓｂｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．ＧｏｓｓｅｎＭ＆ＢｕｊａｒｄＨ．ＰＮＡＳ、１９９２年６月１５日；８９（１２）：５５４７−５１頁）が開発した最初のシステムは、テトラサイクリンオフとして知られている：テトラサイクリンの存在下で、ｔｅｔ−誘導性プロモーターからの発現が減少する。テトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｔＴＡ）は、単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ１６（ビリオンタンパク質１６）のＣ末端ドメインにｔｅｔＲを融合することによって作製された。テトラサイクリンの非存在下では、ｔＴＡのｔｅｔＲ部分はｔｅｔプロモーター中のｔｅｔＯ配列に結合し、活性化ドメインは発現を促進する。テトラサイクリンの存在下では、テトラサイクリンはｔｅｔＲに結合し、ｔＴＡがｔｅｔＯ配列に結合するのを妨げる。次に、リバースＴｅｔリプレッサー（ｒＴｅｔＲ）が開発され、抑制ではなく誘導のためにテトラサイクリンの存在に依存するようになった。新しいトランス活性化因子ｒｔＴＡ（リバーステトラサイクリン制御トランス活性化因子）は、ＶＰ１６にｒＴｅｔＲを融合することによって作製された。テトラサイクリンオンシステムは、ｒｔＴＡ依存システムとしても知られている。

一実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、１つ以上のテトラサイクリン誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現のために有用であるか、または目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質および／または転写調節因子（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）の発現は、ｉｎｖｉｖｏで１つ以上のテトラサイクリン誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される分子、例えば、テトラサイクリンによって直接的または間接的に誘導される。

いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、ｉｎｖｉｖｏ投与前の株のｉｎｖｉｔｒｏでの増殖、調製、または製造の間に、１つ以上のテトラサイクリン誘導性プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、培養物中で誘導される（例えば、細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造などの間に使用されるフラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖される）。いくつかの実施形態では、発現を誘導し、投与前にペイロード（例えば、テトラサイクリン）を細菌にプレロードするために、プロモーターは細菌培養物に添加される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、テトラサイクリンによって誘導される培養物は、好気的に増殖される。いくつかの実施形態では、テトラサイクリンによって誘導される培養物は嫌気的に増殖される。

一実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、第２のプロモーター（例えば、第２の構成的または誘導性プロモーター）と一緒に、目的の１つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では２つのプロモーターが構築物の近位に配置されて、その発現を駆動し、ここで、テトラサイクリン誘導性プロモーターが第１セットの外因性条件下で発現を駆動し、第２のプロモーターが第２セットの外因性条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件は、２つの連続した培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器における培養物の調製中の条件、例えば、テトラサイクリンおよびＩＰＴＧ）であり得る。別の非限定的な例では、第１の誘導条件は、例えば、テトラサイクリンの存在を含む培養条件であり得、第２の誘導条件はｉｎｖｉｖｏ条件であり得る。そのようなｉｎｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気性、もしくは嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および／または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のテトラサイクリンプロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターと組み合わされて、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。

いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、本明細書に記載される低コピープラスミドまたは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドからの目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性プロモーターは、細菌染色体に組み込まれた構築物からの目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号３４の太字の配列（ｔｅｔプロモーターは太字である）のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、テトラサイクリン誘導性構築物は、目的の１つ以上のタンパク質と同じプロモーターから分岐して転写される、ＡｒａＣをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号３４のイタリック体の配列（Ｔｅｔリプレッサーはイタリック体である）のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号３４のイタリック体の配列（Ｔｅｔリプレッサーはイタリック体である）のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その発現が温度感受性機構によって制御される１つ以上の遺伝子配列を含む。外部の化学物質または特殊な培地を使用せずに強力な転写制御を行うため、温度調節因子は有利である（例えば、Ｎｅｍａｎｉら、ＭａｇｎｅｔｉｃｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａｉｎｄｕｃｅｄｃｙｔｏｓｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄＥ．ｃｏｌｉｆｏｒｅｎｚｙｍｅ−ｐｒｏｄｒｕｇｔｈｅｒａｐｙ；ＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５年６月１０日；２０３：３２−４０頁、およびその中の参考文献を参照）。突然変異ｃＩ８５７リプレッサーとｐＬおよび／またはｐＲファージλプロモーターを使用した温度調節タンパク質発現は、組換え細菌株を操作するために使用されている。λプロモーターの下流にクローニングされた目的の遺伝子は、次いで、バクテリオファージλの突然変異体熱不安定性ｃＩ８５７リプレッサーによって効率的に調節され得る。３７℃未満の温度では、ｃＩ８５７はｐＲプロモーターのｏＬまたはｏＲ領域に結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を遮断する。より高い温度では、機能的なｃＩ８５７二量体は不安定化され、ｏＬまたはｏＲＤＮＡ配列への結合が阻止され、ｍＲＮＡ転写が開始される。例示的な構築物はＷＯ２０１７０８７５８０の図８８Ａに示され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。ＰａｒａＢａｄからの誘導性発現は、本明細書中に記載されるように、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の最適化を通じて制御またはさらに微調整され得る。

一実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、１つ以上の温度調節プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、温度調節プロモーターは、目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現のために有用であるか、または目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現の間に誘導される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、ｉｎｖｉｖｏで１つ以上の温度調節プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、本発明の遺伝子操作された細菌と同時投与される分子、例えば、温度によって直接的または間接的に誘導される。

いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、ｉｎｖｉｖｏ投与の前の株のｉｎｖｉｔｒｏでの増殖、調製、または製造の間に、１つ以上の温度調節プロモーターによって直接的または間接的に駆動される。いくつかの実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の産生を遮断することが有利であり得る。これは、より低い温度、例えば３０℃で株を増殖させることにより、温度調節システムにおいて行うことができる。次いで、温度を３７℃および／または４２℃に上昇させることによって、発現を誘導することができる。いくつかの実施形態では、温度調節プロモーターは、培養物中で誘導される（例えば、細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造などの間に使用されるフラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で増殖される）。いくつかの実施形態では、３７℃〜４２℃の間の温度によって誘導される培養物は好気的に増殖される。いくつかの実施形態では、３７℃〜４２℃の間の温度によって誘導される培養物は嫌気的に増殖される。

一実施形態では、温度調節プロモーターは、第２のプロモーター（例えば、第２の構成的または誘導性プロモーター）と一緒に、目的の１つ以上のタンパク質を含む構築物の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、２つのプロモーターが構築物の近位に配置されて、その発現を駆動し、ここで、温度調節プロモーターが第１セットの外因性条件下で発現を駆動し、第２のプロモーターが第２セットの外因性条件下で発現を駆動する。非限定的な例では、第１および第２の条件は、２つの連続した培養条件（すなわち、フラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器における培養物の調製中の条件、例えば、温度調節およびアラビノース）であり得る。別の非限定的な例では、第１の誘導条件は培養条件、例えば許容温度であり得、第２の誘導条件はｉｎｖｉｖｏ条件であり得る。そのようなｉｎｖｉｖｏ条件には、低酸素、微好気性、もしくは嫌気性条件、腫瘍微小環境の条件、消化管代謝産物の存在、および／または細菌株と組合せて投与される代謝産物が含まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の温度調節プロモーターは、同じ遺伝子配列の発現を駆動するＦＮＲプロモーターと組み合わされて、目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。

いくつかの実施形態では、温度調節プロモーターは、本明細書中に記載される低コピープラスミドまたは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドからの目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。いくつかの実施形態では、温度調節プロモーターは、細菌染色体に組み込まれた構築物からの目的の１つ以上のタンパク質の発現を駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号３０の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、温度調節された構築物は、目的の１つ以上のタンパク質と同じプロモーターから分岐して転写される、突然変異ｃＩ８５７リプレッサーをコードする遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号３１の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号３３の配列のいずれかによってコードされるポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰｓｓＢプロモーターによって駆動されるシステムを介して間接的に誘導可能な１つ以上の遺伝子配列を含む。Ｐｓｓｂプロモーターは好気性条件下で活性であり、嫌気性条件下で遮断される。

このプロモーターは、好気性条件下で目的の遺伝子を発現させるために使用され得る。このプロモーターはまた、嫌気性条件下でのみ発現されるように、遺伝子産物の発現を厳密に制御するために使用され得る。この場合、酸素により誘導されるＰｓｓＢプロモーターは、目的の遺伝子の発現を抑制するリプレッサーの発現を誘導する。結果として、目的の遺伝子は、リプレッサーの非存在下（すなわち、嫌気性条件下）でのみ発現される。この戦略は、改善された微調整およびより厳密な制御のための追加の制御レベルという利点を有する。参照によりその内容全体が本明細書中に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図８９Ａは、ＰｓｓＢプロモーターの遺伝子構成の概略図を示している。

一実施形態では、目的の１つ以上のタンパク質の発現は、１つ以上のＰｓｓＢプロモーターの制御下で発現されるリプレッサーによって間接的に調節される。

いくつかの実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターの誘導は、目的の１つ以上のタンパク質のｉｎｖｉｖｏ発現を間接的に駆動する。いくつかの実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターの誘導は、ｉｎｖｉｖｏ投与前の株のｉｎｖｉｔｒｏでの増殖、調製、または製造の間に、目的の１つ以上のタンパク質の発現を間接的に駆動する。いくつかの実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターの誘導のための条件は培養物中、例えば、細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造などの間に使用されるフラスコ、発酵槽または他の適切な培養容器中で提供される。

いくつかの実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターは、本明細書に記載される低コピープラスミドまたは高コピープラスミドまたはバイオセイフティーシステムプラスミドからの目的の１つ以上のタンパク質の発現を間接的に駆動する。いくつかの実施形態では、ＰｓｓＢプロモーターは、細菌染色体に組み込まれた構築物からの目的の１つ以上のタンパク質の発現を間接的に駆動する。例示的な挿入部位は、本明細書に記載される。

別の非限定的な例では、この戦略は、ｔｈｙＡおよび／またはｄａｐＡの発現を制御するために、例えば、条件的栄養要求株を作製するために使用され得る。ｄａｐＡまたはＴｈｙＡの染色体コピーはノックアウトされる。嫌気性条件では、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡが（場合によっては）発現され、株はｄａｐまたはチミジンの非存在下で増殖することができる。好気的条件下では、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡの発現は遮断され、株はｄａｐまたはチミジンの非存在下で増殖できない。そのような戦略は、例えば、嫌気性条件（例えば、消化管および／または腫瘍微小環境の条件）下での細菌の生存を可能にするが、好気性条件下での生存を防止するために使用され得る（バイオセイフティースイッチ）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、表１８の配列番号３５の配列のいずれかと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の遺伝子配列を含む。

誘導性プロモーターからの発現に有用な配列を表１８に列挙する。

［表１８］誘導性プロモーター構築物の配列

（構成的プロモーター）
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子はプラスミド上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は染色体上に存在し、非許容温度から許容温度への温度変化によって誘導されるプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子は染色体上に存在し、構成的プロモーターに作動可能に連結される。

いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、ｉｎｖｉｖｏ条件（例えば、本明細書に記載されるような消化管および／または腫瘍微小環境の条件）下で活性である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ｉｎｖｉｔｒｏ条件（例えば、本明細書に記載されるような様々な細胞培養および／または細胞製造条件）下で活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、ｉｎｖｉｖｏ条件（例えば、本明細書に記載されるような消化管および／または腫瘍微小環境の条件）下、ならびにｉｎｖｉｔｒｏ条件（例えば、本明細書に記載されるような様々な細胞培養および／または細胞産生および／または細胞製造条件）下で活性である。

いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターは、様々な外因性環境条件（例えば、ｉｎｖｉｖｏおよび／またはｉｎｖｉｔｒｏおよび／または産生／製造条件）において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の消化管に特異的な、および／または腫瘍微小環境の条件に特異的な外因性環境条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の小腸に特異的な外因性環境条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の消化管の環境および／または腫瘍微小環境の条件などの低酸素または嫌気性条件において活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、哺乳動物の消化管および／または腫瘍微小環境の条件に特異的な分子または代謝産物の存在下で活性である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、細菌細胞と同時投与される分子によって直接的または間接的に誘導される。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、ｉｎｖｉｔｒｏ培養、細胞産生および／または製造条件の間に存在する分子または代謝産物または他の条件の存在下で活性である。

細菌の構成的プロモーターは当技術分野で公知であり、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願日２０１７年１月１１日）に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。

（リボソーム結合部位）
いくつかの実施形態では、リボソーム結合部位が追加、スイッチアウト（ｓｗｉｔｃｈｅｄｏｕｔ）、または置換される。いくつかのリボソーム結合部位を試験することによって、発現レベルを所望のレベルに微調整することができる。ＲＢＳの非限定的な例は、標準生物学的パーツ・レジストリに列挙され、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願日２０１７年１月１１日）に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。

（株培養中のペイロードの誘導）
培養中のペイロードの誘導は、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願日２０１７年１月１１日）、ＷＯ２０１６１８３５３１として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）、およびＷＯ２０１７０８７５８０として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（出願日２０１６年１１月１６日）に記載されており、それらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。

いくつかの実施形態では、投与前に、目的のペイロードもしくはタンパク質の発現および／またはペイロード活性をプレ誘導する（ｐｒｅ−ｉｎｄｕｃｅ）ことが望ましい。そのような目的のペイロードまたはタンパク質は、分泌を目的とするエフェクターであってもよく、または代謝反応を触媒してエフェクターを産生する酵素であってもよい。他の実施形態では、目的のタンパク質は、有害な代謝産物を異化する酵素である。そのような状況では、株は、活性なペイロードまたは目的のタンパク質でプレロードされる。そのような場合、本発明の遺伝子操作された細菌は、ｉｎｖｉｖｏでの投与前の細胞増殖、増幅、精製、発酵、および／または製造中の細菌培養物において提供される条件下で、目的の１つ以上のタンパク質を発現する。そのような培養条件は、例えば細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造の間に使用されるフラスコ、発酵槽、または他の適切な培養容器中において提供され得る。本明細書中で使用される場合、「細菌培養物」または「細菌細胞培養物」または「培養物」という用語は、細胞増殖、細胞増幅、回収、精製、発酵、および／または製造を含むいくつかの生産プロセス中にｉｎｖｉｔｒｏで維持または増殖される細菌細胞または微生物を指す。本明細書中で使用される場合、「発酵」という用語は、定義された条件下での細菌の増殖、増幅、および維持を指す。発酵は、嫌気性または低酸素または酸素化条件、誘導物質、栄養素の存在下、定義された温度などを含む多くの細胞培養条件下で起こり得る。

培養条件は、高細胞密度（高バイオマス）の収量を維持しながら、細胞の最適な活性および生存率を達成するように選択される。最適な活性、高収量、および高い生存率を達成するために、酸素レベル（例えば、低酸素、微好気性、好気性）、培地の温度、および栄養素および／または異なる増殖培地、培地中に提供される化学的および／または栄養性誘導物質ならびに他の成分を含む、多くの細胞培養条件および操作パラメータが監視および調整される。

いくつかの実施形態では、株をｉｎｖｉｖｏ投与のために増殖させる間に、目的の１つ以上のタンパク質が直接的または間接的に誘導される。理論に束縛されることを望まないが、プレ誘導は、例えば、消化管または腫瘍における、ｉｎｖｉｖｏ活性を高め得る。特定の消化管区画における細菌の滞留時間が比較的短い場合、細菌は完全なｉｎｖｉｖｏ誘導能力に達することなく小腸を通過し得る。対照的に、株がプレ誘導およびプレロードされている場合、株は既に完全に活性であり、細菌が腸に到達すると、より迅速により大きな活性が可能になる。それゆえに、株が最適に活性ではない輸送時間は、「浪費」されない。細菌が腸を移動し続けるにつれて、ｉｎｖｉｖｏ誘導が消化管の環境条件（例えば、低酸素、または消化管代謝産物の存在）下で起こる。同様に、腫瘍標的化または他の細菌がプレ誘導およびプレロードされる場合、このことは、本明細書中に記載されるように、全身投与または腫瘍内注射のいずれかによって細菌が消化管または腫瘍に到達すると、より大きな活性をより迅速に可能にし得る。消化管または腫瘍に入ると、例えば、腫瘍微小環境の条件下で、ｉｎｖｉｖｏ誘導が起こる。

一実施形態では、１つ以上のペイロードの発現は、細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造の間に誘導される。一実施形態では、目的のいくつかの異なるタンパク質の発現は、細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造の間に誘導される。

いくつかの実施形態では、株は、ｉｎｖｉｖｏ投与前の株増殖中に、プレ誘導（ｐｒｅ−ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）プロトコールなしで投与される。

（嫌気性誘導）
いくつかの実施形態では、細胞は、培養中の嫌気性または低酸素条件下で誘導される。そのような場合、一定の密度（例えば、１×１０^８〜１×１０^１１の範囲）を示す一定のＯＤ（例えば、０．１〜１０の範囲内のＯＤ）および指数関数的増殖に達するまで、（例えば、１．５〜３時間）細胞を増殖させ、その後、嫌気性または低酸素条件に約３〜５時間切り替える。いくつかの実施形態では、株は、例えばＦＮＲプロモーター活性を誘導し、１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下で１つ以上のペイロードおよび／またはトランスポーターの発現を駆動するために、嫌気性または低酸素条件下で誘導される。

一実施形態では、１つ以上のペイロードの発現は、１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、嫌気性または低酸素条件下での細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造の間に誘導される。一実施形態では、目的のいくつかのタンパク質の発現は、１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、嫌気性または低酸素条件下での細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または産生の間に誘導される。

理論に束縛されることを望むものではないが、ＦＮＲプロモーターの制御下にある１つ以上のペイロードを含む株は、嫌気性または低酸素培養条件下のｉｎｖｉｔｒｏで、ならびに消化管および／または腫瘍微小環境の条件において見出される低酸素条件下のｉｎｖｉｖｏで、これらのプロモーターからのペイロードの発現を可能にし得る。

いくつかの実施形態では、目的のペイロードに連結されたプロモーターは、アラビノース、クミン酸塩（ｃｕｍａｔｅ）、およびサリチル酸塩（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリン、ならびに／または他の化学的および／もしくは栄養性誘導物質によって誘導可能であり得、化学的および／または栄養性誘導物質の存在下で、嫌気性または低酸素条件下で誘導され得る。特に、株は遺伝子配列の組合せを含み得、それらの一部はＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他のものは化学的および／または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、株は、１つ以上のペイロード遺伝子配列および／または１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下にある１つ以上のペイロード遺伝子配列、および本明細書に記載の１つ以上の構成的プロモーターの制御下にある１つ以上のペイロード遺伝子配列を含み得る。

（好気性誘導）
いくつかの実施形態では、好気性条件下で株を調製、プレロード、プレ誘導することが望ましい。これにより、より効率的な増殖および生存が可能になり、場合によっては、毒性代謝産物の蓄積が減少する。そのような場合、一定の密度（例えば、１×１０^８〜１×１０^１１の範囲）を示す一定のＯＤ（例えば、０．１〜１０の範囲内のＯＤ）および指数関数的増殖に達するまで、（例えば、１．５〜３時間）細胞を増殖させ、その後、誘導物質の添加または他の手段（例えば、許容温度へのシフト）により、約３〜５時間誘導する。

いくつかの実施形態では、アラビノース、クミン酸塩（ｃｕｍａｔｅ）、およびサリチル酸塩（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリン、ならびに／または本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の他の化学的および／もしくは栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターは、細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造の間に、化学的および／または栄養性誘導物質の存在下で、好気性条件下で誘導され得る。一実施形態では、１つ以上のペイロードの発現は、化学的および／または栄養性誘導物質によって調節される１つ以上のプロモーターの制御下にあり、好気性条件下での細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型および／または製造の間に誘導される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された株は、好気性培養条件下で誘導される遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、これらの株は、消化管および／または腫瘍微小環境の条件におけるｉｎｖｉｖｏ活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、これらの株は、消化管および／または腫瘍微小環境の条件におけるｉｎｖｉｖｏ活性化のためのＦＮＲ誘導性遺伝子配列をさらに含まない。

（微好気性誘導）
いくつかの実施形態では、生存能力、増殖、および活性は、微好気性条件下で細菌株をプレ誘導することによって最適化される。いくつかの実施形態では、微好気性条件は、最適な増殖、活性および生存能力の条件と、誘導のための最適条件との間の「バランスをとる」のに最適である；特に、１つ以上のペイロードの発現が、嫌気性および／または低酸素プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）によって駆動される場合。そのような場合、例えば、一定の密度（例えば、１×１０^８〜１×１０^１１の範囲）を示す一定のＯＤ（例えば、０．１〜１０の範囲内のＯＤ）および指数関数的増殖に達するまで、（例えば、１．５〜３時間）細胞を増殖させ、その後、誘導物質の添加または他の手段（例えば、許容温度へのシフト）により、約３〜５時間誘導する。

一実施形態では、１つ以上のペイロードの発現は１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下にあり、微好気性条件下での細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造の間に誘導される。

理論に束縛されることを望むものではないが、ＦＮＲプロモーターの制御下にある１つ以上のペイロードを含む株は、微好気性培養条件下のｉｎｖｉｔｒｏで、ならびに消化管および／または腫瘍微小環境の条件において見出される低酸素条件下のｉｎｖｉｖｏで、これらのプロモーターからのペイロードの発現を可能にし得る。

いくつかの実施形態では、アラビノース、クミン酸塩（ｃｕｍａｔｅ）、およびサリチル酸塩（ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）、ＩＰＴＧ、ラムノース、テトラサイクリン、ならびに／または他の化学的および／もしくは栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターは、化学的および／または栄養性誘導物質の存在下で、微好気性条件下で誘導され得る。特に、株は遺伝子配列の組合せを含み得、それらの一部はＦＮＲプロモーターの制御下にあり、他のものは化学的および／または栄養性誘導物質によって誘導されるプロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、株は、１つ以上のＦＮＲプロモーターの制御下にある１つ以上のペイロード遺伝子配列、および本明細書に記載の１つ以上の構成的プロモーターの制御下にある１つ以上のペイロード遺伝子配列を含み得る。

一実施形態では、１つ以上のペイロードの発現は、化学的および／または栄養性誘導物質によって調節される１つ以上のプロモーターの制御下にあり、微好気性条件下での細胞増殖、細胞増幅、発酵、回収、精製、剤型、および／または製造の間に誘導される。

いくつかの実施形態では、投与前に、目的のペイロードもしくはタンパク質の発現および／またはペイロード活性をプレ誘導する（ｐｒｅ−ｉｎｄｕｃｅ）ことが望ましい。そのような目的のペイロードまたはタンパク質は、分泌を目的とするエフェクターであってもよく、または代謝反応を触媒してエフェクターを産生する酵素であってもよい。他の実施形態では、目的のタンパク質は、有害な代謝産物を異化する酵素である。そのような状況では、株は、活性なペイロードでプレロードされる。

（生体分子を輸送する能力が強化された細菌株の生成）
微生物は、それらの培養の容易さ、短い世代時間、非常に高い集団密度および小さいゲノムのため、短縮されたタイムスケールで固有の表現型に進化され得る。適応実験室進化（ＡＬＥ）は、好ましい表現型を有する株を進化させるために、選択圧下で微生物を継代するプロセスである。最も一般的には、これは、炭素／エネルギー源の利用を増大させるために、または環境ストレス（例えば、温度、ｐＨ）に株を適応させるために適用され、それにより、炭素基質上またはストレス下で増殖する能力がより高い突然変異株は、集団内の適応性がより低い菌株を打ち負かすことになり、最終的には集団を支配するようになる。

この同じ方法を、栄養要求株を作製することにより、任意の必須代謝産物に拡張することができる。栄養要求株は、必須代謝産物を合成することができない株であり、したがって、増殖するために培地に代謝産物が供給されていなければならない。このシナリオでは、栄養要求株を作製して、代謝産物の量を減少させながらそれを継代することによって、得られる優性株はこの必須代謝産物を獲得する能力および組み込む能力がより高いはずである。

例えば、アミノ酸を産生するための生合成経路が破壊される場合、該アミノ酸の高親和性捕捉が可能な株は、ＡＬＥを介して進化され得る。まず、増殖を支持するための最小濃度が確立されるまで、様々な濃度の栄養要求性アミノ酸中で株を増殖させる。次いで、該株をその濃度で継代し、規則的な間隔で希釈して漸減アミノ酸濃度にする。時間が経つにつれて、アミノ酸について−増殖制限濃度で−最も競争力の高い細胞が集団を支配するようになる。これらの株は、必須の制限アミノ酸を取り込む能力の増大をもたらす、それらのアミノ酸−トランスポーターにおける突然変異を有する可能性が高いであろう。

同様に、アミノ酸を形成するために上流代謝産物を使用することができない栄養要求株を使用することによって、上流代謝産物をより効率的に取り込むことができるだけでなく、代謝産物を必須の下流代謝産物に変換することもできる株を進化させることができる。これらの株はまた、上流代謝産物の取り込みを増加させるために突然変異を進化させ得るが、下流酵素の発現または反応速度を増加させるか、または競合的基質利用経路を減少させる突然変異も含み得る。

先の例では、突然変異栄養要求性によって微生物に固有の代謝産物を必須とし、内因性代謝産物の増殖制限性補給と共にセレクションを適用した。しかし、非天然化合物を消費することができる表現型を、それらの消費を必須化合物の産生に結びつけることにより、進化させることができる。例えば、必須化合物または必須化合物の前駆体を産生することができる異なる生物からの遺伝子を単離した場合、この遺伝子を異種宿主に組換え導入し、その異種宿主において発現させることができる。この新たな宿主株には、以前は代謝できなかった基質から必須栄養素を合成する能力が今ではあることになる。これにより、直ぐ下流の代謝産物を変換することができない栄養要求株を作製し、組換え酵素の同時発現とともに増殖制限量の非天然化合物中でセレクションすることにより、同様のＡＬＥプロセスを適用することができる。この結果、非天然基質の輸送、異種酵素の発現および活性、ならびに下流の天然酵素の発現および活性における突然変異が生じることになる。強調すべきは、このプロセスにおける重要な要件が、非天然代謝産物の消費を増殖に必須の代謝産物の産生に結びつける能力であることである。

選択機構の基礎を確立し、最小補給レベルを確定したら、実際のＡＬＥ実験に取りかかることができる。このプロセスを通して、いくつかのパラメータを注意深くモニターしなければならない。重要なのは、培養物を指数増殖期で維持し、飽和／静止期に到達させないことである。これは、各継代の間に増殖速度をチェックし、その後の希釈をそれに応じて調節しなければならないことを意味する。希釈が大きくなる程度にまで増殖速度が向上する場合、増殖速度が遅くなるように、選択圧が高くなるように、そして継代中に亜集団を大きく偏らせるほど希釈が厳しくないように、栄養要求性補給の濃度を減少させるべきである。さらに、規則的な間隔で細胞を希釈し、固体培地上で増殖させ、個々のクローンを試験して、ＡＬＥ培養物において観察される増殖速度表現型を確認すべきである。

ＡＬＥ実験をいつ停止するかを予測するにも、注意が必要である。進化を方向づけることの成功は、実験を通して「スクリーニングされた」突然変異の数に直接関係しており、突然変異は、一般に、ＤＮＡ複製中のエラーの関数であるので、累積細胞分裂（ＣＣＤ）は、スクリーニングされた全突然変異体のプロキシ（ｐｒｏｘｙ）として作用する。以前の研究により、異なる炭素源上での増殖に有益な表現型を、約１０^１１．２ＣＣＤ^１で単離することができることが示されている。この速度は、ＤＮＡ複製エラーの増加を引き起こすＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの化学的突然変異原の培地への添加により、加速させることができる。しかし、連続継代の結果、増殖速度の向上がほとんどまたは全くなくなると、集団は、ある適応度最大値に収束し、ＡＬＥ実験を停止することができる。

ＡＬＥ実験の終わりに、細胞を希釈し、固体培地上で単離し、培養フラスコのものにマッチする増殖表現型についてアッセイするべきである。次いで、選択されたものから最も性能のよいものがゲノムＤＮＡ用に調製され、全ゲノム配列決定に送られる。配列決定は、向上した表現型をもたらすことができるゲノムの周囲に存在する突然変異を明らかにすることになるが、サイレント突然変異（恩恵をもたらさないが、所望の表現型を損なわないもの）も含有することになる。ＮＴＧまたは他の化学的突然変異原の存在下で進化させた培養物には、それよりサイレント性が有意に高いバックグラウンド突然変異が存在することになる。その現状で最も性能の良い株に納得がいけば、使用者は、その株での応用に進むことができる。そうでなければ、ゲノム操作技術により親株に突然変異を再導入することにより、進化株から寄与突然変異をデコンボリュートすることができる。例えば、Ｌｅｅ，Ｄ．−Ｈ．、Ｆｅｉｓｔ，Ａ．Ｍ．、Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｃ．Ｌ．およびＰａｌｓｓｏｎ，Ｂ．ＯＥ．、ＣｕｍｕｌａｔｉｖｅＮｕｍｂｅｒｏｆＣｅｌｌＤｉｖｉｓｉｏｎｓａｓａＭｅａｎｉｎｇｆｕｌＴｉｍｅｓｃａｌｅｆｏｒＡｄａｐｔｉｖｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．、ＰＬｏＳＯＮＥ６、ｅ２６１７２（２０１１年）を参照されたい。

（代謝産物の輸送）
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、トランスポーターをコードする遺伝子をさらに含む。トランスポーターは、細胞内へのフェニルアラニン輸送を増強するために、本発明の遺伝子操作された細菌において発現または改変され得る。そのようなトランスポーターの非限定的な例は、係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６５に記載されており、その全内容は参照により本明細書に援用される。

そのようなトランスポーターは、代謝産物を細菌細胞に輸送することができる膜輸送タンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子改変された細菌におけるトランスポーターをコードする遺伝子は、改変されていない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、トランスポーター遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、非天然トランスポーター遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、その天然プロモーター、誘導性プロモーター、天然プロモーターよりも強力なプロモーター（例えば、ＧｌｎＲＳプロモーターまたはＰ（Ｂｌａ）プロモーター）、または構成的プロモーターによって制御されるトランスポーター遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、製造中の条件下または他のｉｎｖｉｔｒｏ条件下で誘導される。いくつかの実施形態では、トランスポーター遺伝子の発現は、１つ以上のエフェクター分子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは別のプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、トランスポーター遺伝子の発現は、１つ以上のエフェクター分子の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、トランスポーター遺伝子および１つ以上のエフェクター分子は、プロモーター領域から分岐して転写される。

いくつかの実施形態では、天然のトランスポーター遺伝子を突然変異誘発し、輸送の増加を示す突然変異体を選択し、突然変異誘発されたトランスポーター遺伝子を単離し、遺伝子操作された細菌に挿入する（例えば、Ｐｉら、１９９６年；Ｐｉら、１９９８年を参照）。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して、血中フェニルアラニンを少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍低減させるために、哺乳動物の消化管の低酸素環境などの外因性環境条件下でＰＡＬを産生する。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、哺乳動物の消化管の低酸素環境などの外因性環境条件下でＰＡＬを産生し、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して、尿中の馬尿酸を少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍増加させる。特定の非改変細菌は、感知できるレベルのフェニルアラニンの馬尿酸へのプロセシングを有さないであろう。これらの細菌の遺伝子改変型を使用した実施形態では、フェニルアラニンのＰＡＬ媒介性プロセシングは外因性環境条件下で感知できる。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ｉｎｖｉｔｒｏの細菌培養条件下などの外因性環境条件下でＰＡＬを産生し、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して、培地中のトランス−ケイ皮酸を少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍増加させる。フェニルアラニンは当該分野において公知の方法、例えば、血液サンプリングおよび質量分析によって測定され得る。いくつかの実施形態では、ケイ皮酸はＰＡＬ活性を評価するために、当該分野において公知の方法によって測定される。ケイ皮酸産生はフェニルアラニン分解と直接的に相関し、いくつかの実施形態では、ケイ皮酸は、株活性についての代替のバイオマーカーとして使用され得る（図１６Ｂ）。ケイ皮酸は肝酵素によって馬尿酸にさらに分解され得、両方は実施例２４〜２６に記載されるように測定され得る。本明細書に示されるように、ｉｎｖｉｖｏにおいてＴＣＡは速やかに馬尿酸に変化され、その後馬尿酸が尿中に蓄積される。したがって、血液中および特に尿中の馬尿酸は、ｉｎｖｉｖｏにおけるフェニルアラニン分解の遥かに優れたバイオマーカーであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＬ発現は当該分野において公知の方法、例えば血中のフェニルアラニンレベルの測定によって測定される。馬尿酸は、本明細書の実施例に記載の方法、および当該分野おいて公知の方法で測定され得る。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して、血中フェニルアラニンを少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍低減させるためにＬＡＡＤを産生する。特定の非組換え細菌は、感知できるレベルのフェニルアラニンプロセシングを有さない。これらの細菌の遺伝子改変型を使用した実施形態では、フェニルアラニンのＬＡＡＤ媒介性プロセシングは外因性環境条件下で感知できる。フェニルアラニンは当該分野において公知の方法、例えば、血液サンプリングおよび質量分析によって測定され得る。ＬＡＡＤにより生成した分解産物であるピルビン酸およびフェニルピルビン酸は、実施例２４〜２６に記載されるように質量分析を使用して測定され得、ＬＡＡＤ活性のさらなる読み出し情報として使用され得る。

いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏの細菌培養条件下などの外因性環境条件下で、２以上のＰＭＥ、例えばＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤを産生し、同じ条件下の同じ亜型の非改変細菌と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍、血中のフェニルアラニンを減少および／または培地中のトランス−ケイ皮酸を増加させる。これらの実施形態のいずれにおいても、細菌は、１つ以上のＰｈｅトランスポーターポリペプチドをコードする遺伝子配列をさらに含み得る。

いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨは、低コピープラスミド上で発現される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のトランスポーターをコードする遺伝子はプラスミド上または染色体に位置し、発現は本明細書に開示されるプロモーターのいずれかによって調節され得る。

他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｉｎｖｉｖｏ投与で直接的または間接的に誘導される１つ以上のトランスポーターをコードし、例えば、外因性ｉｎｖｉｖｏ環境（例えば、消化管）における条件または特定の分子もしくは代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、プロモーターは、消化管特異的な分子または低酸素条件によって誘導される。いくつかの実施形態では、細菌株は、化学的および／または栄養性誘導物質と組み合わせて投与される。

いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨは、高コピープラスミド上で発現される。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、ＰＭＥ、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨの発現を増加させ、それによりフェニルアラニンの代謝を増加させ、高フェニルアラニン血症を軽減するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、高コピープラスミド上で発現されるＰＭＥ（例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ）を含む遺伝子操作された細菌は、異種ｐｈｅＰおよび天然ｐｈｅＰの追加コピーの非存在下で、低コピープラスミド上で発現される同じＰＭＥ（例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ）を含む遺伝子操作された細菌と比較して、フェニルアラニン代謝を増加させないか、またはフェニルアラニンレベルを減少させない。高コピープラスミドおよび低コピープラスミド上に同じＰＭＥ遺伝子（例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子）を含む遺伝子操作された細菌が生成された。例えば、高コピープラスミドおよび低コピープラスミド上のＰＡＬ１またはＰＡＬ３のいずれかが生成され、それぞれがフェニルアラニンを代謝し、同様のレベルに減少させた（図１５）。したがって、いくつかの実施形態では、フェニルアラニン代謝の律速段階は、フェニルアラニンの利用可能性である（例えば、図１６を参照）。これらの実施形態では、細胞内へのフェニルアラニン輸送を増加させ、それによりフェニルアラニン代謝を増強することが有利であり得る。ｐｈｅＰと組み合わせることで、低コピーのＰＡＬプラスミドでも、試験サンプルからＰｈｅをほぼ完全に排除することができる（例えば、図１６Ａを参照）。さらに、ｐｈｅＰを組み込んでいるいくつかの実施形態では、高フェニルアラニン代謝を維持しながらＰＡＬ発現の安定性を向上させ、形質転換した細菌上の負の選択圧を低減させるために、併用して低コピーＰＡＬ発現プラスミドを使用することがさらに有益であり得る。代替の実施形態では、フェニルアラニントランスポーターは、高コピープラスミドと組み合わせて使用される。

いくつかの実施形態では、トランスポーターは、フェニルアラニン分解を増加させない場合がある。例えば、プロテウス・ミラビリスＬＡＡＤは細胞膜に局在し、酵素触媒作用はペリプラズムで発生する。フェニルアラニンは、トランスポーターを必要とせずに外膜を容易に横切ることができる。したがって、遺伝子操作された細菌がＬＡＡＤを発現する実施形態では、トランスポーターは、フェニルアラニン代謝を必要としなくてもよいか、または改善しなくてもよい。

いくつかの実施形態では、ＰＭＥ（複数可）、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子は染色体上で発現される。いくつかの実施形態では、染色体からの発現は、ＰＭＥの発現の安定性を増加させるのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子は、遺伝子操作された細菌における１つ以上の組み込み部位において細菌染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬ、ＬＡＡＤ、および／またはＰＡＨ遺伝子は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ａｇａｌ／ｒｓｍｌ、ｔｈｙＡ、およびｍａｌＰ／Ｔのうちの１つ以上において細菌ゲノムに挿入される。任意の適切な挿入部位を使用してよい（例えば、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６６を参照のこと）。挿入部位は、ゲノム内のどこにあってもよく、例えば、（栄養要求株を作製するために）ｔｈｙＡなどの生存および／もしくは増殖に必要とされる遺伝子内、ゲノム複製部位付近などのゲノムの活性領域内、ならびに／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒａＣとの間などの意図しない転写のリスクを低減させるための分岐プロモーターの間にあってよい。いくつかの実施形態では、ＰＭＥ遺伝子、例えば、ＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤの１個より多いコピー、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個またはそれより多いコピーが、遺伝子操作された細菌における１つ以上の組み込み部位において細菌染色体に組み込まれる。ＰＭＥ遺伝子の１個より多いコピーは、同じＰＭＥ遺伝子の１個より多いコピー、または異なるＰＭＥ遺伝子の１個より多いコピーであり得る。

例示的な構築物は以下の表４〜１３に示される。表４は、染色体への挿入のためのＰｈｅＰおよびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２１Ｂ）を示し、ｐｈｅＰ配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表５は、高コピープラスミド上のＰＡＬ１およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２２Ｂ）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表６は、高コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２３Ｂ）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表７は、高コピープラスミド上のＰＡＬ１およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２４Ｂ）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表８は、高コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２５Ｂ）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表９は、低コピープラスミド上のＰＡＬ１およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２６Ｂ）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表１０は、低コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＦＮＲプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２７Ｂ）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。表１１は、低コピープラスミド上のＰＡＬ１およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２８Ｂ）を示し、ＰＡＬ１配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表１２は、低コピープラスミド上のＰＡＬ３およびＴｅｔプロモーター配列をコードする遺伝子を含む例示的な構築物の配列（配列番号２９Ｂ）を示し、ＰＡＬ３配列には下線が引いてあり、Ｔｅｔプロモーター配列は太字である。表１３は、ｐｈｅＰをコードする遺伝子、ＴｅｔＲをコードする遺伝子、および染色体への挿入のためのＴｅｔプロモーター配列を含む例示的な構築物の配列（配列番号３０Ｂ）を示し、ｐｈｅＰ配列には下線が引いてあり、ＴｅｔＲ配列は四角で囲い、ＦＮＲプロモーター配列は太字である。

［表４］

［表５］

［表６］

［表７］

［表８］

［表９］

［表１０］

［表１１］

［表１２］

［表１３］

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２１Ｂ〜３０Ｂのいずれかの１つ以上の配列を含む遺伝子配列を含有する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２１Ｂ〜３０Ｂの配列のうちのいずれかと少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する１つ以上の配列を含む遺伝子配列を含有する。

本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、１つ以上のＰＭＥをコードする１つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、１つ以上の内因性バクテリオファージゲノムをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において突然変異されている。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置し得るか、または１つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含し得る。

一実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅが、１つ以上のＰＭＥを含む遺伝子操作された細菌の出発点、親株、または「シャシー（ｃｈａｓｓｉｓ）」として使用される。一実施形態では、改変されたバクテリオファージは、その自然状態で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに対して内因性であるファージである。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ、例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ファージ３における１つ以上の突然変異を含む。そのような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、１つ以上のファージ３遺伝子内に位置するか、または１つ以上のファージ３遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入は抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５から選択される１つ以上の遺伝子内に位置する１つ以上の欠失を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な欠失を含む。特定の一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含む改変されたファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変されたファージゲノム配列を含む。

（酸素消費酵素）
ＬＡＡＤの触媒活性は酸素に依存し、従って、腸（例えば、結腸）内の嫌気性および／または低酸素環境において活性でないかもしれない。酸素は、胃腸管のより近位の区画に存在する。

健康なマウスで測定した酸素圧を表１７Ａに示す。」参照によりその全内容が本明細書に援用される、Ｈｅら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９９９年４月１３日；９６（８）：４５８６−９１頁；“ＮｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆａｎａｔｏｍｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｉｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔｏｆｌｉｖｉｎｇｍｉｃｅｗｉｔｈｓｐａｔｉａｌａｎｄｓｐｅｃｔｒａｌＥＰＲｉｍａｇｉｎｇ”。近位から遠位の胃腸管への顕著な酸素勾配。Ｈｅによって指摘されたように、胃腸管に沿って観察される酸素勾配は、プロセスの組合せによって説明することができる。理論に束縛されることを望むものではないが、食物は嚥下されると、最初に周囲の室内空気の酸素圧と平衡化される。胃およびその後の小腸への通過時に、酸素が粘膜メンブランを横切って拡散するにつれて、酸素レベルは低下し得る。毛細管レベルの酸素（すなわち、５〜１０ｔｏｒｒ；参考文献９）と徐々に平衡化するプロセスが起こり得る。細菌コロニー形成が激しい結腸への通過時に、酸素化のさらなる減少が生じる。最後に、遠位結腸の内腔は、この部位の嫌気性細菌の量に基づいて予想される通り、顕著な低酸素状態を示す。

［表１７Ａ］胃腸管区画における酸素圧

図２５Ｂに示すように、ＬＡＡＤ活性は好気性条件下よりも低いレベルではあるが、微好気性条件下で保持される（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。したがって、ＬＡＡＤは、胃、十二指腸、空腸、および回腸などの腸のより近位の領域において活性であり得る。本開示の一部として、遺伝子操作された細菌によって発現されるＬＡＡＤは、有利にはＰＡＬとは異なる区画において活性であり得、ＦＮＲプロモーターの制御下にある場合、結腸において発現され得ることが意図される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は２つの酵素を発現し、これらは異なる酸素要求性を有し、かつ／または異なる酸素条件下で誘導され、その結果、ＰＭＥは胃腸系全体にわたって発現されて活性である。例えば、酸素の存在に依存する第１の酵素（例えば、ＬＡＡＤ）は、構成的または誘導性プロモーター（例えば、ＰａｒａＢＡＤ）の制御下で、胃、十二指腸および回腸の１つ以上において発現され、第２の酵素（例えば、ＰＡＬ）は、ＦＮＲプロモーターの制御下で、結腸において発現される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬは、例えばＦＮＲプロモーター、構成的プロモーターまたは本明細書中に記載される別の誘導性プロモーターの制御下で、小腸において見出される条件下で発現される。いくつかの実施形態では、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤは、ｉｎｖｉｖｏ投与前にプレ誘導され、腸の近位部分において発現されて活性である。いくつかの実施形態では、ＰＡＬおよび／またはＬＡＡＤは、ｉｎｖｉｖｏ投与前に（本明細書に記載されるように、好気的もしくは嫌気的に、または化学的および／もしくは栄養性誘導物質有りまたは無しで）プレ誘導され、腸の遠位部分において発現されて活性である。

酸素制限条件下でＬＡＡＤ活性をさらに増加させるために、いくつかの戦略を用いることができる。例えば、大量の酸素を消費する他の酵素の活性を低下または消滅させることができる。そのような酵素の１つは、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼである。大腸菌は２つのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ｎｕｏおよびｎｄｈ２を有し、これらの酵素の両方のノックアウトが酸素消費を８０％減少させることが示されている。いくつかの実施形態では、制限酸素を保存するために、すなわち、ＬＡＡＤを発現する遺伝子操作された細菌において、より低い外因性酸素条件下でＬＡＡＤが機能することを可能にするために、さらなる手段が講じられる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、酸素消費に関与する１つ以上の遺伝子における突然変異をさらに含む。いくつかの実施形態では、大腸菌ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの一方または両方がノックアウトされる。いくつかの実施形態では、ノックアウトされたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼはｎｕｏである。いくつかの実施形態では、ノックアウトされたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼはｎｄｈ２である。いくつかの実施形態では、ｎｕｏおよびｎｄｈ２がノックアウトされる。ｃｙｄＢ（高親和性ターミナルオキシダーゼのサブユニット）、ｃｙｄＤ（チトクロームＤを作るのに必要な酵素）、およびｃｙｏＡＢＣ（低親和性チトクロームオキシダーゼのサブユニット）などの呼吸鎖中の酵素を含む、大腸菌の酸素代謝に関与する他の酵素もノックアウトされ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｃｙｄＢ、ｃｙｄＤ、およびｃｙｏＡＢＣから選択される１つ以上の遺伝子におけるノックアウト突然変異／欠失を保有する。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つ以上のＰＭＥは、胃内で発現されて活性を示す。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つ以上のＰＭＥは、十二指腸において発現されて活性を示す。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つ以上のＰＭＥは、空腸において発現されて活性を示す。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つ以上のＰＭＥは、回腸において発現されて活性を示す。一実施形態では、遺伝子操作された細菌によってコードされる１つ以上のＰＭＥは、結腸において発現されて活性を示す。

（フェニルアラニン輸送）
細菌がＰＭＥをコードする遺伝子を含むいくつかの実施形態では、細菌は、フェニルアラニントランスポーターをコードする遺伝子をさらに含み得る。フェニルアラニントランスポーターは、細胞内へのフェニルアラニン輸送を増強するために、本発明の遺伝子操作された細菌において発現または改変され得る。

ＰｈｅＰは、細菌細胞にフェニルアラニンを輸送できる膜輸送タンパク質である（例えば、Ｐｉら、１９９１年を参照のこと）。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子組換え細菌における天然のｐｈｅＰ遺伝子は改変されていない。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、天然のｐｈｅＰ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、非天然のｐｈｅＰ遺伝子の複数のコピーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、その天然プロモーター、誘導性プロモーター、天然プロモーターより強力なプロモーター（例えばＧｌｎＲＳプロモーターまたはＰ（Ｂｌａ）プロモーター）、または構成的プロモーターによって制御されるｐｈｅＰ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターとは異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子およびフェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子は、プロモーター領域から分岐して転写される。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰ、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子のそれぞれの発現は、異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰ、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の発現は、同じプロモーターによって制御される。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変された細菌における天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、天然ｐｈｅＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーが、ＰＡＬの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム中に挿入される。代替の実施形態では、天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌種由来の非天然ｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、ＰＡＬの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノムに挿入される。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変された細菌における天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、天然ｐｈｅＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーが、ＰＡＬの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＭＥの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上に存在する。代替の実施形態では、天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌種由来の非天然ｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、ＰＡＬの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上に存在する。

いくつかの実施形態では、天然ｐｈｅＰ遺伝子を突然変異誘発し、フェニルアラニン輸送の増加を示す突然変異体を選択し、突然変異誘発されたｐｈｅＰ。本明細書に記載のフェニルアラニントランスポーターの改変は、プラスミドまたは染色体上に存在し得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されていない；天然の大腸菌ＮｉｓｓｌｅのｐｈｅＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーが、ＰＡＬの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノム内に挿入される。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌由来の非天然ｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、ＰＡＬの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノム内に挿入される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、天然の大腸菌ＮｉｓｓｌｅのｐｈｅＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーは、ＰＡＬの発現を制御する同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上に存在する。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌由来の非天然ｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、ＰＡＬの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上に存在する。

他の実施形態では、１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする遺伝子がプラスミド上または染色体に位置し得、遺伝子発現は、ＰＭＥ遺伝子を調節するプロモーターと同じであっても異なってもよい、本明細書に開示されるプロモーターのいずれかによって調節され得る。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）は、芳香族アミノ酸の蓄積のために５つの異なる輸送系（ＡｒｏＰ、Ｍｔｒ、ＰｈｅＰ、ＴｎａＢ、およびＴｙｒＰ）を有することが報告されている。ａｒｏＰ遺伝子によってコードされる一般的なアミノ酸パーミアーゼは、フェニルアラニンを含む３つの芳香族アミノ酸を高親和性で輸送し、ＰｈｅＰと一緒に、フェニルアラニン取り込みの最大の部分を担うと考えられている。さらに、低レベルのフェニルアラニンの蓄積が芳香族アミノ酸トランスポーター欠損大腸菌株（ΔａｒｏＰΔｐｈｅΔｍｔｒΔｔｎａΔｔｙｒＰ）において観察され、ＬＩＶ‐Ｉ／ＬＳ系の活性まで追跡され、そのＬＩＶ‐Ｉ／ＬＳ系は、２つのペリプラズム結合タンパク質である、ＬＩＶ結合タンパク質（ＬＩＶ‐Ｉ系）およびＬＳ結合タンパク質（ＬＳ系）、ならびに膜成分であるＬｉｖＨＭＧＦからなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターである（Ｋｏｙａｎａｇｉら、およびその中の参考文献；ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＬＩＶ−Ｉ／ＬＳＳｙｓｔｅｍａｓｔｈｅＴｈｉｒｄＰｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２）。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はａｒｏＰ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然ａｒｏＰ遺伝子は改変されておらず、天然の大腸菌ＮｉｓｓｌｅのａｒｏＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーが、ＰＭＥの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えばＦＮＲプロモーター、またはａｒａＢＡＤプロモーター）、ＰＭＥの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上または染色体内に存在する。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの天然ａｒｏＰ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌由来の非天然ａｒｏＰ遺伝子のコピーが、ＰＭＥの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーターまたはＡｒａＢＡＤプロモーター）、またはＰＭＥの発現を制御するものとは異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上または染色体内に存在する。

他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、同じもしくは異なる誘導性または構成的プロモーターの制御下にあるＡｒｏＰおよびＰｈｅＰを含む。

いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子は染色体上で発現される。いくつかの実施形態では、染色体からの発現は、ｐｈｅＰの発現の安定性を増加させるために有用であり得る。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子は、遺伝子操作された細菌における１つ以上の組み込み部位において細菌染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける以下の挿入部位：ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ａｇａｌ／ｒｓｍｌ、ｔｈｙＡ、およびｍａｌＰ／Ｔのうちの１つ以上において細菌ゲノムに挿入される。任意の適切な挿入部位を使用してよい（例えば、参照によりその内容の全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６６を参照のこと）。挿入部位は、ゲノムのどこにあってもよく、例えば、（栄養要求株を作り出すため）ｔｈｙＡなどの生存および／もしくは増殖に必要とされる遺伝子内、ゲノム複製部位付近などのゲノムの活性領域内、ならびに／またはアラビノースオペロンのＡｒａＢとＡｒａＣとの間のなどの意図しない転写のリスクを低減させるための分岐プロモーターの間にあってよい。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｉｎｖｉｖｏ投与前に直接的または間接的にプレ誘導される（例えば、ｉｎｖｉｖｏ投与前の株の産生中に、フラスコ、発酵槽、または他の培養容器内の細菌の培養物において提供される特定の分子または代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される）１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする。

他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｉｎｖｉｖｏ投与で直接的または間接的に誘導される（例えば、外因性のｉｎｖｉｖｏ環境、例えば、消化管における条件または特定の分子もしくは代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される）１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする。いくつかの実施形態では、プロモーターは、消化管特異的分子または低酸素条件によって誘導される。いくつかの実施形態では、細菌株は、化学物質および／または栄養性誘導物質と組合せて投与される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、多数の作用機構および／または１つ以上の栄養要求性を含む。特定の実施形態では、細菌は、染色体上の異なる組み込み部位（例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＰ／Ｔ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ、およびｃｅａ）に挿入された酸素レベル依存性プロモーターの制御下にあるＰＡＬの５コピー（例えば、Ｐ_ｆｎｒＳ−ＰＡＬ３）と、染色体上の異なる組み込み部位（例えば、ｌａｃＺ）に挿入された酸素レベル依存性プロモーターの制御下にあるフェニルアラニントランスポーター遺伝子の１コピー（例えば、Ｐ_ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）とを含むように遺伝子操作される。より具体的な態様では、細菌は、カナマイシン耐性遺伝子と、ｔｈｙＡ遺伝子が欠失および／または無関係の遺伝子で置換されているｔｈｙＡ栄養要求性とをさらに含むように遺伝子操作される。

本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、１つ以上のフェニルアラニントランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子を含む遺伝子操作された細菌は、１つ以上の内因性バクテリオファージをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において突然変異している。そのような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または１つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含する。

いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターと異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子の発現は、フェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子の発現を制御するのと同じプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ｐｈｅＰ遺伝子ならびにフェニルアラニン代謝酵素および／または転写調節因子は、プロモーター領域から多岐に転写される。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰ、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の各々の発現は、異なるプロモーターによって制御される。いくつかの実施形態では、ＰｈｅＰ、フェニルアラニン代謝酵素、および転写調節因子をコードする遺伝子の発現は、同じプロモーターによって制御される。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変された細菌における天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、天然ｐｈｅＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーが、ＰＡＬの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えばＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム内に挿入される。代替の実施形態では、天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌種由来の非天然ｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、ＰＡＬの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下でゲノム内に挿入される。

いくつかの実施形態では、遺伝子改変された細菌における天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、天然ｐｈｅＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーが、ＰＡＬの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＭＥの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上に存在する。代替の実施形態では、天然ｐｈｅＰ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌種由来の非天然ｐｈｅＰ遺伝子のコピーが、ＰＡＬの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター）、またはＰＡＬの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上に存在する。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）は、芳香族アミノ酸の蓄積のために５つの異なる輸送系（ＡｒｏＰ、Ｍｔｒ、ＰｈｅＰ、ＴｎａＢ、およびＴｙｒＰ）を有することが報告されている。ａｒｏＰ遺伝子によってコードされる一般的なアミノ酸パーミアーゼは、フェニルアラニンを含む３つの芳香族アミノ酸を高親和性で輸送し、ＰｈｅＰと一緒に、フェニルアラニン取り込みの最大の部分を担うと考えられている。さらに、低レベルのフェニルアラニンの蓄積が芳香族アミノ酸トランスポーター欠損大腸菌株（ΔａｒｏＰΔｐｈｅＰΔｍｔｒΔｔｎａΔｔｙｒＰ）において観察され、ＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系の活性まで追跡され、そのＬＩＶ−Ｉ／ＬＳ系は、２つのペリプラズム結合タンパク質である、ＬＩＶ結合タンパク質（ＬＩＶ−Ｉ系）およびＬＳ結合タンパク質（ＬＳ系）、ならびに膜成分であるＬｉｖＨＭＧＦからなる分枝鎖アミノ酸トランスポーターである（Ｋｏｙａｎａｇｉら、およびその中の参考文献；ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＬＩＶ−Ｉ／ＬＳＳｙｓｔｅｍａｓｔｈｅＴｈｉｒｄＰｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２）。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はａｒｏＰ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅであり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然ａｒｏＰ遺伝子は改変されておらず、天然の大腸菌ＮｉｓｓｌｅのａｒｏＰ遺伝子の１つ以上の追加コピーが、プラスミド上または染色体中で、ＰＭＥの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーター、またはａｒａＢＡＤプロモーター）、ＰＭＥの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上または染色体内に存在する。代替の実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおける天然ａｒｏＰ遺伝子は改変されておらず、異なる細菌由来の非天然ａｒｏＰ遺伝子のコピーが、ＰＭＥの発現を制御するのと同じ誘導性プロモーター（例えば、ＦＮＲプロモーターまたはＡｒａＢＡＤプロモーター）、またはＰＭＥの発現を制御するプロモーターと異なる誘導性プロモーター、または構成的プロモーターの制御下で細菌中のプラスミド上または染色体内に存在する。

他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｉｎｖｉｖｏ投与で直接的または間接的に誘導される（例えば、外因性のｉｎｖｉｖｏ環境、例えば、消化管における条件または特定の分子もしくは代謝産物に応答する誘導性プロモーターの制御下で発現される）１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする。いくつかの実施形態では、プロモーターは、消化管特異的分子または低酸素条件によって誘導される。いくつかの実施形態では、細菌株は、化学的および／または栄養性誘導物質と組み合わせて投与される。

一実施形態では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅが、遺伝子操作された細菌の出発点、親株、または「シャシー（ｃｈａｓｓｉｓ）」として使用される。一実施形態では、改変されたバクテリオファージは、その天然の状態で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに対して内因性であるファージである。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ（例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ファージ３における１つ以上の突然変異を含む。そのような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、１つ以上のファージ３遺伝子内に位置するか、または１つ以上のファージ３遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入は抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は１つ以上の欠失を含む。

（多数の作用機構）
本開示のいくつかの実施形態では、ＥｃＮのゲノムに対する改変は、ジアミノピメリン酸栄養要求性を介して生物学的封じ込めを増強しながら、消化管内に見出される低酸素条件下でのフェニルアラニン分解を増強するために行われた。これらの遺伝子操作された細菌は、内因性ＥｃＮファージ３に対する１つ以上の改変をさらに含む。

いくつかの実施形態では、細菌が多数の作用機構（ＭｏＡ）、例えば、同じ産物の複数のコピーを産生する回路（例えば、コピー数を増強するため）、または複数の異なった機能を実行する回路を含むように遺伝子操作される。挿入部位の例としてはｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、ｌａｃＺ、ａｇａｌ／ｒｓｍｌ、ｔｈｙＡ、ｍａｌＰ／Ｔ、ｄａｐＡ、およびｃｅａ、ならびにＷＯ２０１７０８７５８０の図６６に示されるその他のものが挙げられるが、これらに限定されず、その全内容は参照により本明細書に援用される。例えば、遺伝子操作された細菌は４つの異なった挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、およびｌａｃＺに挿入されたペイロードの４つのコピーを含むことができる。遺伝子操作された細菌はまた、４つの異なる挿入部位（例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ、およびｃｅａ）に挿入された同一または異なるペイロードの４つのコピー、ならびに異なる挿入部位（例えば、ｌａｃＺ）に挿入された第３の同一または異なる遺伝子の１つのコピーを含み得る（ＷＯ２０１７０８７５８０の図１３Ｂを参照。その全内容は参照により本明細書に援用される）。あるいは、遺伝子操作された細菌が３つの異なった挿入部位（例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、およびｌａｃＺ）に挿入されたペイロードの３つのコピーを含み得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下、疾患または組織特異的な分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応または免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、肝臓障害の存在下、代謝疾患の存在下、またはアラビノースなどの消化管または腫瘍微小環境中に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、記載された回路のいずれか１つ以上を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載される回路のいずれか１つ以上が１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体中の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌がさらに、記載された回路のうちの任意の１つ以上を発現することができ、以下のうちの１つ以上をさらに含む：（１）当技術分野で公知であり、本明細書で提供される任意の栄養要求性、例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性などの１つ以上の栄養要求性、（２）本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の任意の死滅スイッチなどの１つ以上の死滅スイッチ回路、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の任意のトランスポーターなど、生物学的分子または基質を取り込むための１つ以上のトランスポーター、（５）本明細書に記載され、当技術分野で公知の任意の分泌回路などの１つ以上の分泌回路、および（６）そのような追加の回路のうちの１つ以上の組合せ。

いくつかの実施形態では、ペイロードを産生するための遺伝子配列が発現される条件下で、細菌は同じ条件下における同じ亜型の非改変細菌と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍高いレベルでエフェクターを産生するかまたは基質を代謝する。

これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、内因性ファージゲノムに対する１つ以上の突然変異または改変をさらに含む。いくつかの実施形態では、突然変異がファージゲノム内の欠失、挿入、置換または逆位である。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、欠失が１つ以上のファージ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が置換される。いくつかの実施形態では、置換が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子が逆位している。いくつかの実施形態では、部分または１つ以上のファージ遺伝子が逆位している。

一実施形態では、本明細書中に記載される大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細菌は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に、１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入が本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、以下から選択される１つ以上の遺伝子を（完全にまたは部分的に）包含するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

（株培養中のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーターの誘導）
本明細書中に記載されるＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーターの誘導および前誘導のために、ＰＣＴ／ＷＯ２０１７／０８７５８０Ａ１に記載されるように、プロトコールおよび戦略が使用され、その全内容は参照により本明細書に明確に援用される。

本明細書中に記載される実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は製造条件下（例えば、好気性、嫌気性、低酸素、または微好気性）で誘導される１つ以上のＰＭＥおよび／または１つ以上のトランスポーターを含み、１つ以上の内因性バクテリオファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において変異されている。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または１つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ（例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ファージ３における１つ以上の突然変異を含む。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のファージ３遺伝子内に位置するか、または１つ以上のファージ３遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入は抗生物質カセットを含む。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

プレ誘導の測定

いくつかの実施形態では、ＰＭＥおよび／またはＰｈｅＰの発現が誘導されるそのような培養条件は、同じ条件下における同じ亜型の非改変細菌と比較して、またはベースラインレベルと比較して、培養物中のフェニルアラニンの少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＭＥおよび／またはＰｈｅＰの発現が誘導されるそのような培養条件は、同じ条件下における同じ亜型の非改変細菌と比較して、またはベースラインレベルと比較して、培養物中のトランス−ケイ皮酸（ＴＣＡ）の少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、または少なくとも約５０倍の生産をもたらす。

いくつかの実施形態では、細菌培養物中のケイ皮酸の蓄積は、当該分野で公知であり本明細書に記載の方法によって測定される。ケイ皮酸産生は、フェニルアラニン分解と直接相関し、いくつかの実施形態では、ケイ皮酸は、株の増殖、生産および製造中の株活性の指標として使用され得る。したがって、フェニルアラニンの減少および／またはＴＣＡの産生の測定は、ｉｎｖｉｖｏ投与前の治療株の誘導を測定および監視し、微調整するために使用され得る。

ファージ３

ＰＡＬは、４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、ａｒａＣ／ＢＡＤ、およびｌａｃＺに挿入される。遺伝子操作された細菌はまた、４つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ、およびｃｅａにおいて挿入されたＰＡＬの４つのコピー、ならびに異なる挿入部位、例えば、ｌａｃＺにおいて挿入されたフェニルアラニントランスポーター遺伝子の１つのコピーを含み得る（図１３Ｂ）。あるいは、遺伝子操作された細菌は、３つの異なる挿入部位、例えば、ｍａｌＥ／Ｋ、ｉｎｓＢ／Ｉ、およびｌａｃＺにおいて挿入されたＰＡＬの３つのコピー、ならびに３つの異なる挿入部位、例えば、ｄａｐＡ、ｃｅａ、およびａｒａＣ／ＢＡＤにおいて挿入されたフェニルアラニントランスポーター遺伝子の３つのコピーを含み得る。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、ＥｃＮ内因性ファージ３に対する１つ以上の突然変異または改変をさらに含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、以下のうちの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子配列を含む：（１）野生型または（安定性または代謝活性を増加させるための）突然変異型における、フェニルアラニン分解のためのＰＡＬ、ＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤ、（２）野生型または（安定性または代謝活性を増加させるための）突然変異型におけるフェニルアラニン取り込みのためのトランスポーターＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、（３）分泌および細胞外フェニルアラニン分解のためのＰＡＬ、ＰＡＨ、ＬＡＡＤ、および／またはＰｈｅＰ、（４）本明細書に記載されているような分泌マシーナリーの成分、（５）栄養要求性、例えば、ΔＴｈｙＡおよび／またはΔｄａｐＡ、（６）限定されないが、カナマイシンまたはクロラムフェニコール耐性を含む抗生物質耐性、（７）本明細書に記載されているような酸素代謝に関与する遺伝子における突然変異／欠失、（８）内因性Ｎｉｓｓｌｅフェニルアラニン合成経路の遺伝子における突然変異／欠失（例えば、Ｐｈｅ栄養要求性のためのΔＰｈｅＡ）、（９）１つ以上のバイオセイフティーシステム構築物および／または死滅スイッチ、（１０）１つ以上の他の調節因子、例えばＦＮＲＳ２４Ｙ、（１１）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異、例えば、欠失、挿入、置換または逆位。

本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、フェニルアラニンの消費のための遺伝子操作された細菌は、１つ以上の内因性バクテリオファージゲノムをさらに含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において突然変異されている。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または１つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ、例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ファージ３おける１つ以上の突然変異を含む。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のファージ３遺伝子内に位置するか、または１つ以上のファージ３遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入は抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置する１つ以上の欠失を含む：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。具体的な一実施形態において、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列はファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

いくつかの実施形態では、ペイロード、例えばＰＭＥ、Ｐｈｅトランスポーターおよび／または転写調節因子を産生するための遺伝子配列が発現される条件下で、本開示の遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン分解およびＴＣＡ生成の両方を、同一条件下における同じ亜型の非改変細菌と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍高いレベルで行う。

いくつかの実施形態では、ペイロード、例えばＰＭＥ、Ｐｈｅトランスポーターおよび／または転写調節因子を産生するための遺伝子配列が発現される条件下で、本開示の遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニン分解および馬尿酸生成の両方を、同一条件下における同じ亜型の非改変細菌と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１，０００倍、または少なくとも約１，５００倍高いレベルで行う。

いくつかの実施形態では、ＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えばＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、構成的プロモーターの制御下で発現される。別の実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、直接的または間接的に外因性環境条件によって誘導されるプロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、直接的または間接的に低酸素または嫌気性条件によって誘導されるプロモーターの制御下で発現され、当該ＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列の発現は、哺乳動物の消化管の環境などの低酸素または嫌気性環境下で活性化される。本明細書に記載される例示的な誘導性プロモーターには、酸素レベル依存性プロモーター（例えば、ＦＮＲ誘導性プロモーター）、アラビノース、テトラサイクリン、ＩＰＴＧ、ラムノース、ならびに他の化学的および／または栄養性誘導物質が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のこのような誘導性プロモーターは、本明細書に記載されるように、ｉｎｖｉｖｏ投与の前に菌株が調製される際に、ｉｎｖｉｔｒｏ培養条件下で誘導される。誘導性プロモーターの例には、限定されないが、ＦＮＲ応答性プロモーター、Ｐ_{ａｒａＢＡＤ}プロモーター、およびＰ_ＴｅｔＲプロモーター、Ｐｌａｃプロモーター、ｒｈａＰＢＡＤ（ラムノース）プロモーターが含まれ、その各々について本明細書で詳細に記述する。誘導性プロモーターは、以下により詳細に記載される。

１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする少なくとも１つの遺伝子は、細菌細胞内のプラスミドまたは染色体上に存在し得る。一実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、細菌細胞内のプラスミド上に位置する。別の実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は、細菌細胞内の染色体に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列の天然コピーが細菌細胞内の染色体に位置し、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする１つ以上の遺伝子が細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列の天然コピーが細菌細胞内のプラスミド上に位置し、別種の細菌由来の少なくとも１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする少なくとも１つの遺伝子が細菌細胞内のプラスミド上に位置する。さらに別の実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列の天然コピーが細菌細胞の染色体に位置し、別種の細菌由来の１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする１つ以上の遺伝子が細菌細胞の染色体に位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は低コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）をコードする遺伝子配列は高コピープラスミド上で発現する。いくつかの実施形態では、高コピープラスミドは、少なくとも１つのＰＭＥおよび／またはＰｈｅトランスポーター（例えば、ＰｈｅＰ）、および／または他の調節タンパク質（例えば、ＦＮＲＳ２４Ｙ）の発現を増加させるために有用であり得る。いくつかの実施形態では、上記の遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の内在性遺伝子における改変、突然変異、および／または欠失のうち１つ以上をさらに含む。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の内因性バクテリオファージゲノムを含む。いくつかの実施形態では、バクテリオファージは、バクテリオファージゲノム内の１つ以上の遺伝子において変異されている。そのような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のバクテリオファージ遺伝子内に位置するか、または１つ以上のバクテリオファージ遺伝子を包含し得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ（例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ファージ３における１つ以上の突然変異を含む。このような突然変異は、欠失、挿入、置換および逆位を含み、１つ以上のファージ３遺伝子内に位置するか、または１つ以上のファージ３遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌が、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置する１つ以上の欠失を含む：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＦＮＲ駆動ＰＡＬ３の３つの染色体挿入（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８）と、ＦＮＲ駆動ｐｈｅＰの２つのコピー（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２）を含む。この株は、変異型ＦＮＲ転写因子ＦＮＲＳ２４Ｙの１コピーをさらに含む。この株は、天然のパラプロモーターによって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされたＬＡＡＤの１コピーをさらに含む（Ｐａｒａ：：ＦＮＲＳ２４Ｙ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６４）。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０７である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＦＮＲ駆動ＰＡＬ３の３つの染色体挿入（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８）と、ＦＮＲ駆動ｐｈｅＰの２つのコピー（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２）を含む。この株は、天然のパラプロモーターによって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされた変異型ＦＮＲ転写因子ＦＮＲＳ２４Ｙの１コピーをさらに含む（Ｐａｒａ：：ＦＮＲＳ２４Ｙ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６４）。ゲノムは、ｄａｐＡ遺伝子が欠失しているｄａｐＡ栄養要求性を含むようにさらに操作される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７１２である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＦＮＲ駆動ＰＡＬ３の３つの染色体挿入（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８）と、ＦＮＲ駆動ｐｈｅＰの２つのコピー（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２）とを有する細菌染色体を含む。この株は、天然のパラプロモーターによって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされた変異型ＦＮＲ転写因子ＦＮＲＳ２４Ｙの１コピーと、同じ挿入部位に挿入されたＬＡＡＤの１コピーをさらに含み（Ｐａｒａ：：ＦＮＲＳ２４Ｙ−ＬＡＡＤ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号７３）、これは、内因性アラビノースプロモーターからバイシストロニックメッセージとして転写される。ゲノムは、ｄａｐＡ遺伝子が欠失しているｄａｐＡ栄養要求性を含むようにさらに操作される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０８である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＦＮＲ駆動ＰＡＬ３の３つの染色体挿入（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８）と、ＦＮＲ駆動ｐｈｅＰの２つのコピー（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２）とを有する細菌染色体を含む。この株は、天然のパラプロモーターによって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされた変異型ＦＮＲ転写因子ＦＮＲＳ２４Ｙの１コピーと、同じ挿入部位に挿入されたＬＡＡＤの１コピーをさらに含み（Ｐａｒａ：：ＦＮＲＳ２４Ｙ−ＬＡＡＤ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号７３）、これは、内因性アラビノースプロモーターからバイシストロニックメッセージとして転写される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７１１である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＦＮＲ駆動ＰＡＬ３の３つの染色体挿入（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えばその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８）と、ＦＮＲ駆動ｐｈｅＰの２つのコピー（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２）とを含有する細菌染色体を含む。この株は、天然のパラプロモーターによって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされたＬＡＡＤの１コピー（Ｐａｒａ：：ＬＡＡＤ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号４０）をさらに含む。ゲノムは、ｄａｐＡ遺伝子が欠失しているｄａｐＡ栄養要求性を含むようにさらに操作される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０９である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＦＮＲ駆動ＰＡＬ３の３つの染色体挿入（３×ｆｎｒＳ−ＰＡＬ（ｍａｌＰ／Ｔ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ、ｍａｌＥ／Ｋ）、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３８）と、ＦＮＲ駆動ｐｈｅＰの２つのコピー（２×ｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ（ｌａｃＺ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ）、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号６２）とを含有する細菌染色体を含む。この株は、天然のパラプロモーターによって駆動される発現を有するアラビノースオペロンにノックインされたＬＡＡＤの１コピーをさらに含む（Ｐａｒａ：：ＬＡＡＤ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号４０）。ＳＹＮ−ＰＫＵ７１０は、ＩＰＴＧ誘導性ＰＡＬ３の２つのコピー（２×ＬａｃＩＰＡＬ、ｅｘｏ／ｃｅａおよびｒｈｔＣ／ｒｈｔＢ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号７４）、ｄａｐＡ栄養要求性をさらに含み、そして全ての抗生物質耐性が治癒される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７１０である。

これらの実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載され、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図４７に示される遺伝子操作されたものいずれかは、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載される１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載される１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的または完全に欠失される。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（野生型遺伝子に加えて）ＰｈｅＰの２つの追加コピーを含む。これにより、ＰｈｅＰ遺伝子の１つが突然変異を獲得した場合に、冗長性が提供される。一実施形態では、ＰｈｅＰ遺伝子はｌａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌで挿入される。一実施形態では、ＰｈｅＰの２つのコピーはＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌はＰＡＬ３の３つのコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、ｙｉｃＳ／ｎｅｐｌで挿入されたＰＡＬ３の３つのコピーを含む。一実施形態では、ＰＡＬ３の３つのコピーの発現は、ＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌はＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、アラビノースオペロンに挿入されたＬＡＡＤの１つのコピーを含む。一実施形態では、ＬＡＡＤは内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は栄養要求性（例えば、ΔＴｈｙＡ）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は抗生物質耐性を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗生物質耐性および栄養要求性（例えば、ΔＴｈｙＡ）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は栄養要求性（例えば、ΔＴｈｙＡ）を含まない。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は抗生物質耐性を含まない。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、抗生物質耐性も栄養要求性（例えば、ΔＴｈｙＡ）も含まない。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３コピー（例えば、ＰＡＬ３）、ＰｈｅＰの２コピー（内因性ＰｈｅＰに加えて）、およびＬＡＡＤの１コピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３コピー（例えば、ＰＡＬ３）、ＰｈｅＰの２コピー（内因性ＰｈｅＰに加えて）、およびＬＡＡＤの１コピー、ならびに栄養要求性（例えば、ΔＴｈｙＡ）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３コピー、ＰｈｅＰの２コピー（内因性ＰｈｅＰに加えて）、およびＬＡＡＤの１コピー、ならびに抗生物質耐性遺伝子を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３コピー、ＰｈｅＰの２コピー（内因性ＰｈｅＰに加えて）、およびＬＡＡＤの１コピー、ならびに抗生物質耐性遺伝子および栄養要求性（例えば、ΔＴｈｙＡ）を含む。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）ＰＡＬの３コピー、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）ＰｈｅＰの２コピー、および（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある）ＬＡＡＤの１コピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）ＰＡＬの３コピー、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）ＰｈｅＰの２コピー、および（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある）ＬＡＡＤの１コピー、ならびに抗生物質耐性を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）ＰＡＬの３コピー、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）ＰｈｅＰの２コピー、および（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある）ＬＡＡＤの１コピー、ならびに栄養要求性（例えば、ΔｄａｐＡ）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）ＰＡＬの３コピー、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にある）ＰｈｅＰの２コピー、および（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にある）ＬＡＡＤの１コピー、ならびに抗生物質耐性および栄養要求性（例えば、ΔｄａｐＡ）を含む。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位に挿入される）ＰＡＬの３コピー、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位に挿入される）２コピーのＰｈｅＰ、および（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入される）１コピーのＬＡＡＤを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位に挿入される）ＰＡＬの３コピー、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位に挿入される）ＰｈｅＰの２コピー、および（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入される）ＬＡＡＤの１コピーを含み、抗生物質耐性をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位に挿入される）ＰＡＬの３コピー、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位に挿入される）ＰｈｅＰの２コピー、および（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入される）ＬＡＡＤの１コピーを含み、栄養要求性（例えば、ΔｄａｐＡ）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐｌ部位に挿入される）ＰＡＬの３コピー、（それぞれＰｆｎｒＳプロモーターの制御下にあり、ＬａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ部位に挿入される）ＰｈｅＰの２コピー、および（内因性ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下にあり、内因性アラビノースオペロンに挿入される）ＬＡＡＤの１コピーを含み、抗生物質耐性および栄養要求性（例えば、ΔｄａｐＡ）をさらに含む。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５である。一実施形態では、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５は抗生物質耐性をさらに含む。一実施形態では、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５は栄養要求性（例えば、ΔＴｈｙＡ）をさらに含む。一実施形態では、ＳＹＮ−ＰＫＵ７０５は、抗生物質耐性および栄養要求性（例えば、ΔＴｈｙＡ）をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載される遺伝子操作された任意のものは、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載される１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載される１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失される。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００１である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００２である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその全内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その全内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００３である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００４である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００５である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００６である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００７である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００８である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１００９である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１０である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１１である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１２である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１３である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１４である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｂの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９７）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１５である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｄの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ｌａｃＩ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９８）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１６である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１７である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１８である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０１９である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２０である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２１である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２２である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２３である。

一実施形態では遺伝子操作された細菌は、ｐｈｅＰの２つの染色体コピー（ｌａｃＺ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ、ａｇａＩ／ｒｓｍＩ：：ＰｆｎｒＳ−ｐｈｅＰ）と、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２４である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２５である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０２６である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、株は、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０２７である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｄａｐＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、図６１Ａに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２８である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０２９である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｃに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（低コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０３０である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｄａｐＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ａの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９５）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０３２である。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｄに示される構築物を含み、細菌染色体上のｔｈｙＡ遺伝子座にノックインされている（中コピーＲＢＳ；ｔｈｙＡ：：構成的ｐｒｏｍ１（ＢＢＡ＿Ｊ２６１００）−Ｐｉ（Ｒ６Ｋ）−構成的プロモーター２（Ｐ１）−Ｋｉｓ抗毒素）。この株は、ｂｌａ遺伝子がその内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６５Ｃの構築物で置換されることを除いて、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ｂに示されるプラスミドをさらに含む（ＬａｃＩＦｎｒｓ−Ｐｔａｃ−ＰＡＬ−ＰＡＬ−ＰｈｅＰ、例えば、その内容全体が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号９６）。一実施形態では、株はＳＹＮ−ＰＫＵ１０３２である。これらの実施形態のいずれかにおいて、ＡＩＰＳ系を含む本明細書に記載の遺伝子操作された任意のものは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノム本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。

これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載されるバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載される１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失している。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失される。

前述の実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載される細菌は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に１つ以上の改変または突然変異、例えば、欠失、挿入、置換または逆位を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入は、本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、以下から選択される１つ以上の遺伝子を（完全にまたは部分的に）包含するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全または部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）と、ＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）と、ＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つ以上のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）と、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）と、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含み、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ由来であり、フェニルアラニントランスポーターの１つ以上のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）と、ＰＡＨの１つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）と、ＰＡＨの１つ以上のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つ以上のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）と、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）と、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つ以上のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）と、ＰＡＨの１つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下に）と、ＰＡＨの１つ以上のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つ以上のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＨの１つ以上のコピーと、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＨの１つ以上のコピーと、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つ以上のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。ＰＭＥおよびトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれ得る。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つ以上のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つ以上のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つ以上のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つ以上のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つ以上のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、ＰＡＨの１つ以上のコピー、およびＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、ＰＡＨの１つ以上のコピー、およびＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）を含み、フェニルアラニントランスポーターの１つ以上のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれ得る。あるいは、ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは、低または高コピープラスミドに含まれるＰＭＥおよび／またはトランスポーターと組み合わせて、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれ得る。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つ以上のコピーを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬ３の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰＡＬ１の１つ以上のコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＬＡＡＤの１つ以上のコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）、およびＰＡＨの１つ以上のコピーを含み、フェニルアラニントランスポーターの１つ以上のコピー（例えば、ＰｈｅＰおよび／またはＡｒｏＰ、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）をさらに含む。ＰＭＥおよびトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれ得る。あるいは、ＰＭＥおよび／またはトランスポーターは、低または高コピープラスミドに含まれてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ由来であり、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの１つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。ＰＭＥおよびトランスポーターは、本明細書に記載される挿入部位のいずれかに組み込まれ得る。あるいは、配置されたＰＭＥおよび／またはトランスポーターは低または高コピープラスミドに含まれてもよい。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの２つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの３つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの３つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの３つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ由来であり、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの４つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、前段落に記載された遺伝子操作された細菌のいずれかは、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの１つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの１つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＰＡＬの５つのコピー（例えば、ＰＡＬ１またはＰＡＬ３、例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、ＰｈｅＰの２つのコピー（例えば、Ｐｆｎｒプロモーターの制御下）、およびＬＡＡＤの２つのコピー（例えば、ＰａｒａＢＡＤプロモーターの制御下）を含む。これらの実施形態のいずれかにおいて、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載のバクテリオファージゲノムをさらに含み、当該バクテリオファージゲノムは本明細書に記載の１つ以上の突然変異をさらに含む。非限定的な例では、ファージゲノムはファージ３であり、１つ以上の遺伝子が部分的に欠失されている。
非限定的な例では、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０は、部分的にまたは完全に欠失されている。

これらの実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載される細菌は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に１つ以上の改変または突然変異、例えば、欠失、挿入、置換または逆位を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入は、本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、以下から選択される１つ以上の遺伝子を包含するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、以下の要素のうちの１つ以上を含む：
ａ）高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ‐アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子；
ｄ）栄養要求性を生成するための内因性遺伝子（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）の１つ以上の欠失；
ｅ）抗生物質耐性；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。

前述の実施形態のいずれかにおいて、ファージ３における突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入は抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、以下から選択される１つ以上の遺伝子に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、以下の要素のうちの１つ以上を含む：
ａ）高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ‐アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子；
ｄ）栄養要求性を生成するための内因性遺伝子（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）の１つ以上の欠失；および
ｅ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む：
ａ）高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）フォトラブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ‐アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子；
ｄ）栄養要求性を生成するための内因性遺伝子（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）の１つ以上の欠失；および
ｅ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。

前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入は抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、以下から選択される１つ以上の遺伝子に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素のうちの１つ以上を含む：
ａ）外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）化学的誘導物質または栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の１つ以上のコピー；
ｄ）ＰＡＬの発現を誘導する化学的誘導物質と同一または異なった化学的誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にある、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ−アミノ酸デミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子；
ｅ）栄養要求性を生成するための内因性遺伝子（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）の１つ以上の欠失；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む：
ａ）外因性環境条件下で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）化学的誘導物質または栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の１つ以上のコピー；
ｄ）ＰＡＬの発現を誘導する化学的誘導物質と同一または異なった化学的誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にある、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ−アミノ酸デミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコード化する１つ以上の遺伝子；
ｅ）栄養要求性を生成するための内因性遺伝子（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）の１つ以上の欠失；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。

前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入は抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、以下から選択される１つ以上の遺伝子に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌が配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む：
ａ）外因性環境条件で誘導可能なプロモーターの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の２つの追加コピー；
ｂ）外因性環境条件で誘導可能なフォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の３つのコピー；
ｃ）化学的誘導物質または栄養性誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の２つのコピー；
ｄ）ＰＡＬの発現を誘導する化学的誘導物質と同一または異なった化学的誘導物質によって誘導可能なプロモーターの調節制御下にある、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ−アミノ酸デミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の１つのコピー；
ｅ）栄養要求性を生成するための内因性ｄａｐＡの１つ以上の欠失；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。

前述の実施形態のいくつかにおいて、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入は抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、以下から選択される１つ以上の遺伝子に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含む改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素のうちの１つ以上を含む：
ａ）嫌気性誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）および嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）ＰｆｎｒＳおよびＦＮＲの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）合成プロモーター（Ｐｔａｃ）およびラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の１つ以上のコピー；
ｄ）アラビノース誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子ＡｒａＣの調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子；
ｅ）栄養要求性を生成するための内因性遺伝子（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）の１つ以上の欠失；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素を含む：
ａ）嫌気性誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）および嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の１つ以上の追加コピー；
ｂ）ＰｆｎｒＳおよびＦＮＲの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子のもう１つのコピー；
ｃ）合成プロモーター（Ｐｔａｃ）およびラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の１つ以上のコピー；
ｄ）アラビノース誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子ＡｒａＣの調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子；
ｅ）栄養要求性を生成するための内因性遺伝子（例えば、ｄａｐＡまたはＴｈｙＡ）の１つ以上の欠失；および
ｆ）大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。

上記の実施形態のいくつかにおいて、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入は抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。前述の実施形態のいずれか１つにおいて、欠失は、以下から選択される１つ以上の遺伝子に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

具体的な一実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素の各々を含む：
ａ）ｌａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ遺伝子座で染色体に挿入された、嫌気性誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）および嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の２つの追加コピー；
ｂ）ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ遺伝子座で染色体に挿入された、ＰｆｎｒＳおよびＦＮＲの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の３つのコピー；
ｃ）ｅｘｏ／ｃｅａおよびｒｈｔＣ／ｒｈｔＢ遺伝子座に挿入された、合成プロモーター（Ｐｌａｃ）およびラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の２つの追加コピー；
ｄ）
ｅ）アラビノース誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子（ＡｒａＣ）の調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の１つのコピー（ＬＡＡＤは天然アラビノースプロモーター下にある）；
ｆ）ジアミノピメリン酸栄養要求株を作製するための４−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするｄａｐＡ遺伝子の欠失；および大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）。

具体的な一実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素の各々を含む：
ａ）ｌａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ遺伝子座で染色体に挿入された、嫌気性誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）および嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の２つの追加コピー；
ｂ）ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ遺伝子座で染色体に挿入された、ＰｆｎｒＳおよびＦＮＲの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の３つのコピー；
ｃ）ｅｘｏ／ｃｅａおよびｒｈｔＣ／ｒｈｔＢ遺伝子座に挿入された、合成プロモーター（Ｐｌａｃ）およびラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の２つの追加コピー；
ｄ）アラビノース誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子（ＡｒａＣ）の調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の１つのコピー（ＬＡＡＤは天然アラビノースプロモーター下にある）；
ｅ）ジアミノピメリン酸栄養要求株を作製するための４−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするｄａｐＡ遺伝子の欠失；および
ｆ）欠失領域が、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、および部分的にＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５を含む、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の領域の欠失。

具体的な一実施形態では、遺伝子操作された細菌は以下の要素の各々を含む：
ａ）ｌａｃＺおよびａｇａｌ／ｒｓｍｌ遺伝子座で染色体に挿入された、嫌気性誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）および嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の２つの追加コピー；
ｂ）ｍａｌＥＫ、ｍａｌＰＴ、およびｙｉｃＳ／ｎｅｐＩ遺伝子座で染色体に挿入された、ＰｆｎｒＳおよびＦＮＲの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の３つのコピー；
ｃ）ｅｘｏ／ｃｅａおよびｒｈｔＣ／ｒｈｔＢ遺伝子座に挿入された、合成プロモーター（Ｐｌａｃ）およびラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の２つの追加コピー；
ｄ）アラビノース誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子（ＡｒａＣ）の調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の１つのコピー（ＬＡＡＤは天然アラビノースプロモーター下にある）；
ｅ）ジアミノピメリン酸栄養要求株を作製するための４−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするｄａｐＡ遺伝子の欠失；および
ｇ）欠失領域が配列番号１３０からなる、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内の領域の欠失。
一実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅである。いくつかの実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２と同じ改変を含む。いくつかの実施形態では、当該株はＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２である。

表１４は、本開示の遺伝子操作された細菌の非限定的な例を含む。特定の実施形態では、表１４の遺伝子操作された細菌は、分泌のためのＰＭＥをさらに含む。

［表１４］本開示の実施形態の非限定的な例

遺伝子操作された生物、例えば操作された細菌または操作されたＯＶが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または他の抗癌分子、消化管バリアエンハンサー分子、抗炎症性分子、神経調節性分子、満腹エフェクター（ｓａｔｉｅｔｙｅｆｆｅｃｔｏｒ）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子、または微生物から分泌されることを目的としたその他の分子を産生する本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、操作された微生物は、分泌機構、および分泌系をコードする対応する遺伝子配列を含み得る。

一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、分泌のための１つ以上のＰＭＥと組合せて、フェニルアラニンを代謝するための１つ以上のＰＭＥを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、分泌のための１つ以上のＰＭＥと組合せて、フェニルアラニンを代謝するための１つ以上のＰＭＥとフェニルアラニントランスポーターとを含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、分泌のための１つ以上のＰＭＥと組合せて、フェニルアラニンを代謝するための１つ以上のＰＭＥとフェニルアラニントランスポーターとを含み、栄養要求性および／または抗生物質耐性も含む。本明細書に記載される分泌系は、多数の作用機構を有する遺伝子操作された細菌においてＰＭＥを分泌するために利用される。

これらの実施形態のいずれかにおいて、本明細書に記載される細菌は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノム内に１つ以上の改変または突然変異（例えば、欠失、挿入、置換または逆位）を含む。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。本明細書に記載される実施形態のいずれかにおいて、欠失は、以下から選択される１つ以上の遺伝子を（完全にまたは部分的に）包含するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子に位置する：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全なまたは部分的な欠失である。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。

（分泌）
遺伝子操作された微生物がタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または他の抗癌分子、免疫調節分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子、または微生物から分泌されることを目的としたその他の分子を産生する本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、操作された微生物は、分泌機構、および分泌系をコードする対応する遺伝子配列を含み得る。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、細胞外環境において細菌細胞質から抗癌分子を分泌することができる天然の分泌機構または非天然の分泌機構をさらに含む。多くの細菌は、細菌の細胞外被を横切って基質を輸送するために高度な分泌系を進化させてきた。小分子、タンパク質、およびＤＮＡなどの基質は、細胞外空間またはペリプラズム（消化管内腔または他の空間など）に放出されるか、標的細胞に注入されるか、または細菌膜に結合され得る。

グラム陰性細菌において、分泌マシーナリーは内膜および外膜の一方または両方にまたがることができる。

タンパク質、例えば、治療用ポリペプチドを細胞外空間に移行するために、ポリペプチドは最初に細胞内で翻訳され、内膜を横切って動員され、最終的に外膜を横切って動員されなければならない。多くのエフェクタータンパク質（例えば、治療用ポリペプチド）、特に真核生物起源のものは、三次および四次構造を安定化させるためにジスルフィド結合を含む。これらの結合はペリプラズムシャペロンの助けを借りて酸化的なペリプラズム区画で正しく形成され得るが、外膜を横切ってポリペプチドを移行させるためには、ジスルフィド結合が還元されて、タンパク質がアンフォールド（ｕｎｆｏｌｄｅｄ）されなければならない。

グラム陰性およびグラム陽性細菌からの異種ポリペプチド、例えば、エフェクター分子の分泌のための適切な分泌系は、係属中の共有の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３４２００（出願日２０１６年５月２５日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願日２０１７年１月１１日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０３（出願日２０１７年２月３日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６６０９（出願日２０１６年２月４日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５６３（出願日２０１７年２月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１７５５２（出願日２０１７年２月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４９２２（出願日２０１６年７月２９日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９７８１（出願日２０１６年８月３１日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３７０９８（出願日２０１６年６月１０日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９０５２（出願日２０１６年１２月２８日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（出願日２０１６年１１月１６日）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２に記載されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に援用される。

（表面ディスプレイ）
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌および／または微生物は、本明細書に記載される目的のポリぺプチドをコードする１つ以上の遺伝子および／または遺伝子カセットをコードし、当該目的のポリぺプチドは、細菌および／または微生物の表面上に固定またはディスプレイされる。細菌および／または微生物にディスプレイまたは固定されるペイロード分子の例は、本明細書に記載のペイロード分子または他のエフェクターのいずれかであり、限定されないが、酵素（例えば、ＰＭＥまたはキヌレニナーゼ）、抗体（例えば、ｓｃＦｖ断片）、および腫瘍特異的抗原またはネオ抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）を含む。

グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の表面上での異種ポリペプチド（例えば、エフェクター分子）の表面ディスプレイに適したシステムは、国際公開第２０１７／１２３６７５号として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願日２０１７年１月１１日）に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。

（必須遺伝子および栄養要求株）
本明細書において使用される場合、「必須遺伝子」という用語は、細胞増殖および／または生存に必要とされる遺伝子を指す。細菌の必須遺伝子は当業者に周知であり、遺伝子の指向性欠失（ｄｉｒｅｃｔｅｄｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｓ）および／またはランダム突然変異誘発ならびにスクリーニングによって同定され得る（例えば、ＺｈａｎｇおよびＬｉｎ、「ＤＥＧ５．０，ａｄａｔａｂａｓｅｏｆｅｓｓｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｓｉｎｂｏｔｈｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓａｎｄｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ」、ＮｕｃｌＡｃｉｄｓＲｅｓ、２００９年；３７：Ｄ４５５−Ｄ４５８、およびＧｅｒｄｅｓら、「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｓｏｎｍｅｔａｂｏｌｉｃｍａｐｓ」、ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００６年；１７（５）：４４８〜４５６頁を参照。これらの各々の内容全体は参照により明示的に本明細書に援用される）。

「必須遺伝子」は、生物が生存している状況および環境に依存し得る。例えば、必須遺伝子の突然変異、改変、または除去により、本開示の遺伝子操作された細菌は栄養要求株になるかもしれない。栄養要求性の改変は、細菌がその必須栄養素を産生するのに必要な遺伝子を欠いているため、生存または増殖に必須の外部から加えられた栄養素の非存在下で細菌を死滅させることを意図する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌のいずれかは、細胞の生存および／または増殖に必要な遺伝子における欠失または突然変異も含む。一実施形態では、必須遺伝子はＤＮＡ合成遺伝子（例えば、ｔｈｙＡ）である。別の実施形態では、必須遺伝子は細胞壁合成遺伝子（例えば、ｄａｐＡ）である。さらに別の実施形態では、必須遺伝子はアミノ酸遺伝子（例えば、ｓｅｒＡまたはＭｅｔＡ）である。対応する野生型遺伝子産物が細菌において産生されない限り、限定されないが、ｃｙｓＥ、ｇｌｎＡ、ｉｌｖＤ、ｌｅｕＢ、ｌｙｓＡ、ｓｅｒＡ、ｍｅｔＡ、ｇｌｙＡ、ｈｉｓＢ、ｉｌｖＡ、ｐｈｅＡ、ｐｒｏＡ、ｔｈｒＣ、ｔｒｐＣ、ｔｙｒＡ、ｔｈｙＡ、ｕｒａＡ、ｄａｐＡ、ｄａｐＢ、ｄａｐＤ、ｄａｐＥ、ｄａｐＦ、ｆｌｈＤ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｐｒｏＡＢ、およびｔｈｉ１を含む、細胞の生存および／または増殖に必要な任意の遺伝子を標的にすることができる。表１８Ａは、栄養要求性株を産生するために破壊または欠失され得る例示的な細菌遺伝子を列挙する。これらには、限定されないが、オリゴヌクレオチド合成、アミノ酸合成、および細胞壁合成に必要な遺伝子が含まれる。

［表１８Ａ］栄養要求株の産生に有用な細菌遺伝子の非限定的な例

表１９Ａは、強制経口投与の２４時間後および４８時間後に検出された、マウスの消化管における種々のアミノ酸栄養要求株の生存を示す。これらの栄養要求株は、大腸菌の非Ｎｉｓｓｌｅ株であるＢＷ２５１１３を使用して産生された。

［表１９Ａ］マウス消化管におけるアミノ酸栄養要求株の生存

例えば、チミンは細菌細胞の増殖に必要とされる核酸であり、その非存在下では、細菌は細胞死を起こす。ｔｈｙＡ遺伝子は、ｄＵＭＰをｄＴＭＰに変換することによってチミン合成における第１段階を触媒する酵素であるチミジル酸シンテターゼをコードする（Ｓａｔら、２００３年）。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞はｔｈｙＡ栄養要求株であり、ｔｈｙＡ遺伝子の欠失および／またはｔｈｙＡ遺伝子の非関連遺伝子による置換を有する。ｔｈｙＡ栄養要求株は、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏで増殖培地にチミンを添加することによって、またはｉｎｖｉｖｏでヒトの消化管に天然に見出される高いチミンレベルの存在下で十分な量のチミンが存在する場合にのみ増殖することができる。いくつかの実施形態では、本開示の細菌細胞は、細菌が哺乳動物の消化管に存在する場合に補完される遺伝子において栄養要求性である。十分な量のチミンがないと、ｔｈｙＡ栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変は、細菌細胞が栄養要求性の遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管の外部）で生存しないことを確実にするために使用される。

ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）は、リジン生合成経路内で合成されるアミノ酸であり、細菌の細胞壁成長に必要とされる（Ｍｅａｄｏｗら、１９５９年；Ｃｌａｒｋｓｏｎら、１９７１年）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌のいずれかはｄａｐＤ栄養要求株であり、ｄａｐＤの欠失および／またはｄａｐＤの非関連遺伝子による置換を有する。ｄａｐＤ栄養要求株は、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏで増殖培地にＤＡＰを添加することによって、またはｉｎｖｉｖｏでヒトの消化管に天然に見出される高いＤＡＰレベルの存在下で十分な量のＤＡＰが存在する場合にのみ増殖することができる。十分な量のＤＡＰがないと、ｄａｐＤ栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変は、細菌細胞が栄養要求性の遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管の外部）で生存しないことを確実にするために使用される。

他の実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌はｕｒａＡ栄養要求株であり、ｕｒａＡの欠失および／またはｕｒａＡの非関連遺伝子による置換を有する。ｕｒａＡ遺伝子は、ピリミジンウラシルの取り込みおよびその後の代謝を促進する膜結合性トランスポーターであるＵｒａＡをコードする（Ａｎｄｅｒｓｅｎら、１９９５年）。ｕｒａＡ栄養要求株は、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏで増殖培地にウラシルを添加することによって、またはｉｎｖｉｖｏでヒトの消化管に天然に見出される高いウラシルレベルの存在下で十分な量のウラシルが存在する場合にのみ増殖することができる。十分な量のウラシルがないと、ｕｒａＡ栄養要求株は死滅する。いくつかの実施形態では、栄養要求性の改変は、細菌が栄養要求性の遺伝子産物の非存在下（例えば、消化管の外部）で生存しないことを確実にするために使用される。

複合的な集団では、細菌がＤＮＡを共有することが可能である。非常にまれな状況において、栄養要求性細菌株は非栄養要求性株からＤＮＡを受け取ることができ、当該非栄養要求性株はゲノム欠失を修復し、栄養要求株を恒久的にレスキューする。したがって、複数の栄養要求性を有する細菌株を操作することにより、ＤＮＡ転移が栄養要求性をレスキューするのに十分な時間発生する可能性を大きく減少させることができる。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、細胞の生存および／または増殖に必要な２つ以上の遺伝子における欠失または突然変異を含む。

必須遺伝子の他の例には、限定されないが、ｙｈｂＶ、ｙａｇＧ、ｈｅｍＢ、ｓｅｃＤ、ｓｅｃＦ、ｒｉｂＤ、ｒｉｂＥ、ｔｈｉＬ、ｄｘｓ、ｉｓｐＡ、ｄｎａＸ、ａｄｋ、ｈｅｍＨ、ｌｐｘＨ、ｃｙｓＳ、ｆｏｌｄ、ｒｐｌＴ、ｉｎｆＣ、ｔｈｒＳ、ｎａｄＥ、ｇａｐＡ、ｙｅａＺ、ａｓｐＳ、ａｒｇＳ、ｐｇｓＡ、ｙｅｆＭ、ｍｅｔＧ、ｆｏｌＥ、ｙｅｊＭ、ｇｙｒＡ、ｎｒｄＡ、ｎｒｄＢ、ｆｏｌＣ、ａｃｃＤ、ｆａｂＢ、ｇｌｔＸ、ｌｉｇＡ、ｚｉｐＡ、ｄａｐＥ、ｄａｐＡ、ｄｅｒ、ｈｉｓＳ、ｉｓｐＧ、ｓｕｈＢ、ｔａｄＡ、ａｃｐＳ、ｅｒａ、ｒｎｃ、ｆｔｓＢ、ｅｎｏ、ｐｙｒＧ、ｃｈｐＲ、ｌｇｔ、ｆｂａＡ、ｐｇｋ、ｙｑｇＤ、ｍｅｔＫ、ｙｑｇＦ、ｐｌｓＣ、ｙｇｉＴ、ｐａｒｅ、ｒｉｂＢ、ｃｃａ、ｙｇｊＤ、ｔｄｃＦ、ｙｒａＬ、ｙｉｈＡ、ｆｔｓＮ、ｍｕｒＩ、ｍｕｒＢ、ｂｉｒＡ、ｓｅｃＥ、ｎｕｓＧ、ｒｐｌＪ、ｒｐｌＬ、ｒｐｏＢ、ｒｐｏＣ、ｕｂｉＡ、ｐｌｓＢ、ｌｅｘＡ、ｄｎａＢ、ｓｓｂ、ａｌｓＫ、ｇｒｏＳ、ｐｓｄ、ｏｒｎ、ｙｊｅＥ、ｒｐｓＲ、ｃｈｐＳ、ｐｐａ、ｖａｌＳ、ｙｊｇＰ、ｙｊｇＱ、ｄｎａＣ、ｒｉｂＦ、ｌｓｐＡ、ｉｓｐＨ、ｄａｐＢ、ｆｏｌＡ、ｉｍｐ、ｙａｂＱ、ｆｔｓＬ、ｆｔｓＩ、ｍｕｒＥ、ｍｕｒＦ、ｍｒａＹ、ｍｕｒＤ、ｆｔｓＷ、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＣ、ｆｔｓＱ、ｆｔｓＡ、ｆｔｓＺ、ｌｐｘＣ、ｓｅｃＭ、ｓｅｃＡ、ｃａｎ、ｆｏｌＫ、ｈｅｍＬ、ｙａｄＲ、ｄａｐＤ、ｍａｐ、ｒｐｓＢ、ｉｎｆＢ、ｎｕｓＡ、ｆｔｓＨ、ｏｂｇＥ、ｒｐｍＡ、ｒｐｌＵ、ｉｓｐＢ、ｍｕｒＡ、ｙｒｂＢ、ｙｒｂＫ、ｙｈｂＮ、ｒｐｓＩ、ｒｐｌＭ、ｄｅｇＳ、ｍｒｅＤ、ｍｒｅＣ、ｍｒｅＢ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、ｙｒｄＣ、ｄｅｆ、ｆｍｔ、ｒｐｌＱ、ｒｐｏＡ、ｒｐｓＤ、ｒｐｓＫ、ｒｐｓＭ、ｅｎｔＤ、ｍｒｄＢ、ｍｒｄＡ、ｎａｄＤ、ｈｌｅｐＢ、ｒｐｏＥ、ｐｓｓＡ、ｙｆｉＯ、ｒｐｌＳ、ｔｒｍＤ、ｒｐｓＰ、ｆｆｈ、ｇｒｐＥ、ｙｆｊＢ、ｃｓｒＡ、ｉｓｐＦ、ｉｓｐＤ、ｒｐｌＷ、ｒｐｌＤ、ｒｐｌＣ、ｒｐｓＪ、ｆｕｓＡ、ｒｐｓＧ、ｒｐｓＬ、ｔｒｐＳ、ｙｒｆＦ、ａｓｄ、ｒｐｏＨ、ｆｔｓＸ、ｆｔｓＥ、ｆｔｓＹ、ｆｒｒ、ｄｘｒ、ｉｓｐＵ、ｒｆａＫ、ｋｄｔＡ、ｃｏａＤ、ｒｐｍＢ、ｄｆｐ、ｄｕｔ、ｇｍｋ、ｓｐｏｔ、ｇｙｒＢ、ｄｎａＮ、ｄｎａＡ、ｒｐｍＨ、ｒｎｐＡ、ｙｉｄＣ、ｔｎａＢ、ｇｌｍＳ、ｇｌｍＵ、ｗｚｙＥ、ｈｅｍＤ、ｈｅｍＣ、ｙｉｇＰ、ｕｂｉＢ、ｕｂｉＤ、ｈｅｍＧ、ｓｅｃＹ、ｒｐｌＯ、ｒｐｍＤ、ｒｐｓＥ、ｒｐｌＲ、ｒｐｌＦ、ｒｐｓＨ、ｒｐｓＮ、ｒｐｌＥ、ｒｐｌＸ、ｒｐｌＮ、ｒｐｓＱ、ｒｐｍＣ、ｒｐｌＰ、ｒｐｓＣ、ｒｐｌＶ、ｒｐｓＳ、ｒｐｌＢ、ｃｄｓＡ、ｙａｅＬ、ｙａｅＴ、ｌｐｘＤ、ｆａｂＺ、ｌｐｘＡ、ｌｐｘＢ、ｄｎａＥ、ａｃｃＡ、ｔｉｌＳ、ｐｒｏＳ、ｙａｆＦ、ｔｓｆ、ｐｙｒＨ、ｏｌＡ、ｒｌｐＢ、ｌｅｕＳ、ｌｎｔ、ｇｌｎＳ、ｆｌｄＡ、ｃｙｄＡ、ｉｎｆＡ、ｃｙｄＣ、ｆｔｓＫ、ｌｏｌＡ、ｓｅｒＳ、ｒｐｓＡ、ｍｓｂＡ、ｌｐｘＫ、ｋｄｓＢ、ｍｕｋＦ、ｍｕｋＥ、ｍｕｋＢ、ａｓｎＳ、ｆａｂＡ、ｍｖｉＮ、ｒｎｅ、ｙｃｅＱ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、ｔｍｋ、ｈｏｌＢ、ｌｏｌＣ、ｌｏｌＤ、ｌｏｌＥ、ｐｕｒＢ、ｙｍｆＫ、ｍｉｎＥ、ｍｉｎｄ、ｐｔｈ、ｒｓＡ、ｉｓｐＥ、ｌｏｌＢ、ｈｅｍＡ、ｐｒｆＡ、ｐｒｍＣ、ｋｄｓＡ、ｔｏｐＡ、ｒｉｂＡ、ｆａｂＩ、ｒａｃＲ、ｄｉｃＡ、ｙｄｆＢ、ｔｙｒＳ、ｒｉｂＣ、ｙｄｉＬ、ｐｈｅＴ、ｐｈｅＳ、ｙｈｈＱ、ｂｃｓＢ、ｇｌｙＱ、ｙｉｂＪ、およびｇｐｓＡが含まれる。他の必須遺伝子は当業者に知られている。

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、合成リガンド依存性必須遺伝子（ＳＬｉＤＥ）細菌細胞である。ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、特定のリガンドの存在下でのみ増殖する、１つ以上の必須遺伝子における突然変異を有する合成栄養要求株である（ＬｏｐｅｚおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、「ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＡｕｘｏｔｒｏｐｈｓｗｉｔｈＬｉｇａｎｄ−ＤｅｐｅｎｄｅｎｔＥｓｓｅｎｔｉａｌＧｅｎｅｓｆｏｒａＢＬ２１（ＤＥ３）ＢｉｏｓａｆｅｔｙＳｔｒａｉｎ」、ＡＣＳＳｙｎｔｈＢｉｏｌ２０１５年；４（１２）：１２７９〜１２８６頁を参照。その全内容は参照により明示的に本明細書に援用される）。

いくつかの実施形態では、ＳＬｉＤＥ細菌細胞は、必須遺伝子における突然変異を含む。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、ｐｈｅＳ、ｄｎａＮ、ｔｙｒＳ、ｍｅｔＧ、およびａｄｋからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異のうちの１つ以上を含むｄｎａＮである：Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃ。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃを含むｄｎａＮである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異のうちの１つ以上を含むｐｈｅＳである：Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌを含むｐｈｅＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異のうちの１つ以上を含むｔｙｒＳである：Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇを含むｔｙｒＳである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異のうちの１つ以上を含むｍｅｔＧである：Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃを含むｍｅｔＧである。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、以下の突然変異のうちの１つ以上を含むａｄｋである：Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇ。いくつかの実施形態では、必須遺伝子は、突然変異Ｉ４Ｌ、Ｌ５Ｉ、およびＬ６Ｇを含むａｄｋである。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はリガンドによって補完される。いくつかの実施形態では、リガンドは、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、およびＬ−ヒスチジンメチルエステルからなる群から選択される。例えば、ｍｅｔＧにおける突然変異（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、２−アミノベンゾチアゾール、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、またはＬ−ヒスチジンメチルエステルによって補完される。ｄｎａＮにおける突然変異（Ｈ１９１Ｎ、Ｒ２４０Ｃ、Ｉ３１７Ｓ、Ｆ３１９Ｖ、Ｌ３４０Ｔ、Ｖ３４７Ｉ、およびＳ３４５Ｃ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾール、インドール、または２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ｐｈｅＳにおける突然変異（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ｔｙｒＳにおける突然変異（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたは２−アミノベンゾチアゾールによって補完される。ａｄｋにおける突然変異（Ｉ４Ｌ、Ｌ５ＩおよびＬ６Ｇ）を含む細菌細胞は、ベンゾチアゾールまたはインドールによって補完される。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、当該遺伝子操作された細菌をリガンドに対して栄養要求性にする複数の変異必須遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、２つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）およびｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）における突然変異を含む。他の実施形態では、細菌細胞は、３つの必須遺伝子における突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌細胞は、ｔｙｒＳ（Ｌ３６Ｖ、Ｃ３８Ａ、およびＦ４０Ｇ）、ｍｅｔＧ（Ｅ４５Ｑ、Ｎ４７Ｒ、Ｉ４９Ｇ、およびＡ５１Ｃ）、およびｐｈｅＳ（Ｆ１２５Ｇ、Ｐ１８３Ｔ、Ｐ１８４Ａ、Ｒ１８６Ａ、およびＩ１８８Ｌ）における突然変異を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は条件付き栄養要求株であり、その必須遺伝子はＷＯ２０１７０８７５８０の図８５〜８６に示されるアラビノース系を使用して置換されている。

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は栄養要求株であり、また、本明細書に記載される死滅スイッチ成分および系のいずれかなどの死滅スイッチ回路も含む。例えば、遺伝子操作された細菌は、細胞の生存および／または増殖に必要とされる必須遺伝子における、例えば、ＤＮＡ合成遺伝子（例：ｔｈｙＡ）、細胞壁合成遺伝子（例：ｄａｐＡ）および／またはアミノ酸遺伝子（例：ｓｅｒＡまたはＭｅｔＡ）における欠失または突然変異を含んでもよく、また、環境条件および／またはシグナル（記載されるアラビノース系など）に応答して発現される１つ以上の転写活性化因子によって調節されるか、または外因性環境条件および／もしくはシグナル（本明細書に記載されるリコンビナーゼ系など）を検知すると発現される１つ以上のリコンビナーゼによって調節される毒素遺伝子も含んでもよい。他の実施形態は、Ｗｒｉｇｈｔら、「ＧｅｎｅＧｕａｒｄ：ＡＭｏｄｕｌａｒＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍＤｅｓｉｇｎｅｄｆｏｒＢｉｏｓａｆｅｔｙ」、ＡＣＳＳｙｎｔｈＢｉｏｌ、２０１５年；４（３）：３０７〜３１６頁に記載されており、その内容全体は参照により明示的に本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は栄養要求株であり、また、本明細書に記載される死滅スイッチ成分および系のいずれかなどの死滅スイッチ回路、ならびに条件付き複製起点などの別のバイオセキュリティー系も含む（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年）。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のバイオセイフティープラスミドと組み合わせて、細菌染色体に組み込まれた１つ以上のＡＩＰＳ構築物を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドは、プラスミド複製開始タンパク質がトランスで提供される（すなわち、染色体に組み込まれたバイオセイフティー構築物によってコードされる）条件付き複製起点（ＣＯＲ）を含む。いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれた構築物は、栄養要求性（例えば、ｄａｐＡまたはｔｈｙＡ栄養要求性）が生じるように宿主にさらに導入され、当該栄養要求性は、バイオセイフティープラスミド構築物から発現される遺伝子産物によって補完される。いくつかの実施形態では、バイオセイフティープラスミドは広域スペクトル毒素（例えば、Ｋｉｓ）をさらにコードするが、組み込まれたバイオセイフティー構築物は抗毒素（例えば、抗Ｋｉｓ）をコードし、両方の構築物を含む細菌細胞ではプラスミド増殖が可能になる。理論に縛られることを望むものではないが、この機構は、プラスミドＤＮＡ自体を野生型細菌による維持に不利にすることによって、プラスミド拡散を防ぐように機能する。そのようなバイオセイフティーシステムの非限定的な例が、参照によりその内容全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６１Ａ、図６１Ｂ、図６１Ｃ、および図６１Ｄに示されている。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号８１、８２、８３、８４、８５またはそれらの機能性断片のＤＮＡ配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な、染色体に挿入されたバイオセイフティー構築物核酸配列（プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号８６、８７、８８またはそれらの機能性断片のポリペプチド配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同なポリぺチド配列をコードする、染色体に挿入されたバイオセイフティー構築物核酸配列（プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる）を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号８９、９０、９１、９２、９３、９４またはそれらの機能性断片のＤＮＡ配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同な染色体ベースのバイオセイフティー構築物核酸配列（プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号８９、９０、９１、９２、９３、９４またはそれらの機能性断片のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同なポリペプチド配列をコードする染色体ベースのバイオセイフティー構築物核酸配列（プラスミドベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる）を含む。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３６、３７、７４、９５、９６、９８、９９、１００、１１３またはそれらの機能性断片のＤＮＡ配列に少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同なプラスミドベースのバイオセイフティー構築物ペイロード核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、参照によりその内容全体が本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の配列番号３６、３７、７４、９５、９６、９８、９９、１００、１１３またはそれらの機能性断片のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチドに少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％相同なポリペプチドをコードするプラスミドベースのバイオセイフティー構築物ペイロード核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーとＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーとＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＬＡＡＤの１つ以上のコピーとＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーとＰｈｅＰの１つ以上のコピーとＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン異化プラスミドペイロード（すなわち、ＰＡＬ、ＰｈｅＰ、および／またはＬＡＡＤ）は本明細書中に記載の１つ以上の構成的または誘導性プロモーター（例えば、低酸素、アラビノース、ＩＰＴＧ誘導性、またはそれらの組合せ）の制御下にある。いくつかの実施形態では、プロモーターはプレ誘導に有用である。いくつかの実施形態では、プロモーターはｉｎｖｉｖｏ活性化に有用である。いくつかの実施形態では、プロモーターはプレ誘導およびｉｎｖｉｖｏ活性に有用である。いくつかの実施形態では、構築物は２つ以上のプロモーターを含み、当該プロモーターの一部はプレ誘導に有用であり、一部はｉｎｖｉｖｏ活性に有用である。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、フェニルアラニンの異化のためのペイロード構築物を含むプラスミドベースのバイオセイフティー構築物核酸配列（染色体ベースのバイオセイフティー構築物と組み合わせられる）を含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーとＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーとＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＬＡＡＤの１つ以上のコピーとＰｈｅＰの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、プラスミドベースの構築物は、ＰＡＬの１つ以上のコピーとＰｈｅＰの１つ以上のコピーとＬＡＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、フェニルアラニン異化プラスミドペイロード（すなわち、ＰＡＬ、ＰｈｅＰ、および／またはＬＡＡＤ）は、本明細書に記載の１つ以上の構成的または誘導性プロモーター（例えば、低酸素、アラビノース、ＩＰＴＧ誘導性、またはそれらの組み合わせ）の制御下にある。いくつかの実施形態では、プロモーターはプレ誘導に有用である。いくつかの実施形態では、プロモーターはｉｎｖｉｖｏ活性化に有用である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、プレ誘導およびｉｎｖｉｖｏ活性に有用である。いくつかの実施形態では、構築物は２つ以上のプロモーターを含み、当該プロモーターの一部はプレ誘導に有用であり、一部はｉｎｖｉｖｏ活性に有用である。

これらの実施形態のいずれかにおいて、栄養要求性を含む遺伝子操作された細菌は、内因性ファージゲノムに対する１つ以上の突然変異または改変を含む。いくつかの実施形態では、内因性ファージゲノムに対する改変は、ファージゲノム内の１つ以上の欠失、挿入、置換、または逆位、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、欠失は１つ以上のファージ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入は本明細書に記載される抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が置換される。いくつかの実施形態では、置換は抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子が逆位している。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子の一部が逆位している。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来し、１つ以上の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅバクテリオファージ（例えば、ファージ１、ファージ２、およびファージ３）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ファージ３における１つ以上の突然変異を含む。このような突然変異には、欠失、挿入、置換および逆位が含まれ、１つ以上のファージ３遺伝子に位置するか、または１つ以上のファージ３遺伝子を包含する。いくつかの実施形態では、挿入が抗生物質カセットを含む。前述の実施形態のいくつかでは、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、以下から選択される１つ以上の遺伝子に位置する１つ以上の欠失を含む：ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５のうちの１つ以上の完全なまたは部分的な欠失を含む。具体的な一実施形態では、欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である。一実施形態では、配列番号１３０の配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、配列番号１３０を含む配列は、ファージ３ゲノムから欠失される。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１を含有する改変ファージゲノム配列を含む。一実施形態では、遺伝子操作された細菌は、配列番号２８１からなる改変ファージゲノム配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のエフェクター分子をコードする１つ以上の遺伝子を含む１つ以上の回路をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下、疾患もしくは組織特異的分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応または免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、肝臓障害、代謝疾患、またはアラビノースなどの消化管または腫瘍微小環境中に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、任意の１つ以上の回路を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載される回路のいずれか１つ以上が１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体中の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はさらに、記載された回路のうちの任意の１つ以上を発現することができ、以下のうちの１つ以上をさらに含む：（１）当技術分野で公知であり本明細書で提供される任意の栄養要求性（例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性）など、１つ以上の栄養要求性、（２）本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の任意の死滅スイッチなど、１つ以上の死滅スイッチ回路、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の任意のトランスポーターなど、生物学的分子または基質を取り込むための１つ以上のトランスポーター、（５）本明細書に記載されるか当技術分野で公知の任意の分泌回路など、１つ以上の分泌回路、および（６）そのような追加の回路のうちの１つ以上の組合せ。

Ｐｈｅ栄養要求性の付加はまた、フェニルアラニン分解速度を増加させるための有用性も有し得る。例えば、ｐｈｅＡ遺伝子の欠失により、フェニルアラニン栄養要求性がもたらされる。内因性の細菌フェニルアラニン産生をオフすることによって、これは環境からの取り込みの増加を促し、また環境から取り込まれたフェニルアラニンの分解の増加ももたらし得る。

（遺伝子調節回路）
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、本明細書に記載の構築物を発現するための多層遺伝子調節回路を含む。適切な多層遺伝子調節回路は、国際公開第２０１６／２１０３７８号として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／３９４３４（出願日２０１６年６月２４日）に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。遺伝子調節回路は、抗癌分子を産生するか栄養要求性をレスキューする変異細菌をスクリーニングするのに有用である。特定の実施形態において、本発明は、１つ以上の目的の遺伝子を産生する遺伝子操作された細菌を選択する方法を提供する。

（宿主−プラスミド相互依存性）
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、宿主−プラスミド相互依存性を生じるように改変されたプラスミドも含む。特定の実施形態では、相互依存性宿主−プラスミドプラットフォームは、抗生物質非依存性プラスミドシステム（ＡＩＰＳ）である（Ｗｒｉｇｈｔら、２０１５年）。これらおよびその他のシステムならびにプラットフォームは、ＷＯ２０１７／１２３６７５として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１３０７２（出願日２０１７年１月１１日）に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。

（死滅スイッチ）
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、死滅スイッチも含む。死滅スイッチは、外部刺激に応答して遺伝子操作された細菌を積極的に死滅させることを目的とする。細菌が生存のための必須栄養素を欠いているために細菌が死滅する栄養要求性突然変異とは対照的に、死滅スイッチは、細胞死を引き起こす微生物内の毒性分子の産生を誘導する環境内の特定の要因によって誘発される。適切な死滅スイッチは、ＷＯ２０１６２１０３７３として公開された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３９４２７（出願日２０１６年６月２４日）に記載されており、その内容はその全体が参照により本明細書に援用される。

（医薬組成物および製剤）
本発明の遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患、例えばＰＫＵを処置、管理、改善、および／または予防するために使用され得る。単独で、または予防剤、治療剤、および／もしくは薬学的に許容される担体と組み合わせて１つ以上の遺伝子操作された細菌を含む本発明の医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される遺伝子改変を含むように操作された細菌の１つの種、株、または亜型を含む。代替の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される遺伝子改変を含むように各々操作された細菌の２つ以上の種、株、および／または亜型を含む。

本明細書に記載される医薬組成物は、医薬品用途のための組成物への活性成分の加工を容易にする賦形剤および助剤を含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して、従来の方式で製剤化され得る。医薬組成物を製剤化する方法は当該分野において公知である（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照のこと）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、錠剤化、凍結乾燥、直接圧縮、従来の混合、溶解、造粒、粉状化、乳化、カプセル化、封入、または噴霧乾燥に供されて、腸溶コーティングまたは非コーティングされ得る錠剤、粒剤、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット、または粉剤を形成する。適切な製剤は投与経路に依存する。

本明細書に記載される遺伝子操作された細菌は、任意の適切な剤形（例えば、液体、カプセル、サシェ、硬質カプセル、軟質カプセル、錠剤、腸溶コーティング錠剤、懸濁粉末、顆粒、または経口投与用のマトリクス持続放出製剤）で、および任意の適切な種類の投与（例えば、経口、局所、注射、即時放出、パルス放出、遅延放出、または持続放出）のための医薬組成物に製剤化され得る。遺伝子操作された細菌についての適切な投与量は、約１０^５〜１０^１２細菌、例えば約１０^５細菌、約１０^６細菌、約１０^７細菌、約１０^８細菌、約１０^９細菌、約１０^１０細菌、約１０^１１細菌、または約１０^１１細菌の範囲であり得る。組成物は、１日に１回以上、１週に１回以上、１カ月に１回以上投与され得る。組成物は、食事の前に、その間に、またはその後に投与され得る。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事を食べる前に投与される。一実施形態では、医薬組成物は食事とともに投与される。一実施形態では、医薬組成物は、対象が食事を食べた後に投与される。

遺伝子操作された細菌は、１つ以上の薬学的に許容される担体、増粘剤、希釈剤、バッファー、緩衝剤、界面活性剤、中性またはカチオン性脂質、脂質複合体、リポソーム、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容される担体または薬剤を含む医薬組成物に製剤化され得る。例えば、医薬組成物は、限定されないが、重炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種類のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール、ならびに例えばポリソルベート２０を含む界面活性剤の付加を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、重炭酸ナトリウム溶液、例えば重炭酸ナトリウムの１モル溶液（例えば胃などの酸性細胞環境を緩衝するため）中で製剤化され得る。遺伝子操作された細菌は、中性または塩形態として投与および製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどのアニオンで形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどのカチオンで形成される塩が含まれる。

本明細書に開示される遺伝子操作された細菌は局所的に投与され、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ローション、ゲル、シャンプー、噴霧、エアロゾル、溶液、エマルションの形態、または当業者に周知の他の形態で製剤化され得る。例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」、ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照。一実施形態では、噴霧可能ではない局所剤形に関して、局所適用に適合し、水より大きい動粘性係数を有する担体または１つ以上の賦形剤を含む粘性から半固体または固体形態が利用される。適切な製剤には、限定されないが、溶液、懸濁剤、エマルション、クリーム、軟膏、粉剤、塗布薬、膏薬などが含まれ、これらは種々の特性（例えば、浸透圧）に影響を与えるために、滅菌されるかまたは助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝液、または塩）と混合され得る。他の適切な局所剤形には、噴霧可能なエアロゾル調製物が含まれ、固体または液体の不活性担体と組み合わせた活性成分が、加圧された揮発性物質（例えば、フレオンなどのガス状推進剤）との混合物またはスクイーズボトルにパッケージされる。保湿剤または保水剤もまた、医薬組成物および剤形に添加され得る。このような追加成分の例は当業者に周知である。一実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は衛生製品として製剤化されてもよい。例えば、衛生製品は、抗菌製剤、または発酵ブロスなどの発酵製品であってもよい。衛生用品は、例えば、シャンプー、コンディショナー、クリーム、ペースト、ローション、およびリップクリームであってもよい。

本明細書に開示される遺伝子操作された細菌は経口投与され、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして製剤化され得る。経口使用のための医薬組成物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体賦形剤を使用し、必要に応じて得られた混合物を粉砕し、所望の場合には適切な助剤を添加した後に顆粒の混合物を処理して作製され得る。適切な賦形剤には、限定されないが、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボメチルセルロースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍｃａｒｂｏｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）などのセルロース組成物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの生理学的に許容されるポリマーが含まれる。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤も添加され得る。

錠剤またはカプセルは、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、スクロース、グルコース、ソルビトール、デンプン、ガム、カオリン、およびトラガカント）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、カルシウム、アルミニウム、亜鉛、ステアリン酸、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、安息香酸ナトリウム、Ｌ−ロイシン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；錠剤崩壊剤（例えば、デンプン、ジャガイモデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、糖、セルロース誘導体、シリカ粉末）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤と共に従来の手段によって調製され得る。錠剤は当該分野において周知の方法によってコーティングされ得る。コーティングシェルが存在してもよく、一般的な膜には、限定されないが、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリ無水物、他の生分解性ポリマー、アルギン酸−ポリリシン−アルギン酸（ＡＰＡ）、アルギン酸−ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン−アルギン酸（Ａ−ＰＭＣＧ−Ａ）、ヒドロキシメチルアクリレート−メチルメタクリレート（ｈｙｄｒｏｙｍｅｔｈｙｌａｃｒｙｌａｔｅ−ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、多層ＨＥＭＡ−ＭＭＡ−ＭＡＡ、ポリアクリロニトリル塩化ビニル（ＰＡＮ−ＰＶＣ）、アクリロニトリル／メタリルスルホン酸ナトリウム（ＡＮ−６９）、ポリエチレングリコール／ポリペンタメチルシクロペンタシロキサン／ポリジメチルシロキサン（ＰＥＧ／ＰＤ５／ＰＤＭＳ）、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＰＤＭＡＡｍ）、封入シリカ、硫酸セルロース／アルギ酸ナトリウム／ポリメチレン−ｃｏ−グアニジン（ＣＳ／Ａ／ＰＭＣＧ）、酢酸フタル酸セルロース、アルギン酸カルシウム、ｋ−カラギーナン−ローカストビーンガムゲルビーズ、ジェラン−キサンタンビーズ、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、カラギーナン、デンプンポリ−無水物、デンプンポリメタクリレート、ポリアミノ酸、および腸溶コーティングポリマーが含まれる。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、消化管または消化管の特定の領域（例えば、大腸）への放出のために腸溶コーティングされる。胃から結腸までの典型的なｐＨプロファイルは、約１〜４（胃）、５．５〜６（十二指腸）、７．３〜８．０（回腸）、および５．５〜６．５（結腸）である。いくつかの疾患では、ｐＨプロファイルは変更され得る。いくつかの実施形態では、コーティングは放出部位を特定するために特定のｐＨ環境で分解される。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのコーティングが使用される。いくつかの実施形態では、外側コーティングおよび内側コーティングは異なるｐＨレベルで分解される。

経口投与用の液体調製物は、使用前に水または他の適切なビヒクルを用いて構成するための溶液、シロップ、懸濁剤、または乾燥製品の形態を取ることができる。このような液体調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化食用油脂）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分画植物油）；および防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの薬学的に許容される薬剤を用いて従来の手段によって調製され得る。調製物は、必要に応じて緩衝塩、香味料、着色剤、および甘味剤をも含み得る。経口投与用の調製物は、本明細書に記載される遺伝子操作された細菌の徐放、制御放出、または持続放出のために適切に製剤化され得る。

一実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌は、小児対象への投与に適した組成物に製剤化され得る。当該分野において周知のように、子供は、異なる胃内容排出速度、ｐＨ、胃腸透過性などを含む多くの点で成人と異なる（Ｉｖａｎｏｖｓｋａら、２０１４年）。さらに、小児の製剤許容性ならびに投与経路および味覚特質などの好みが、許容される小児の服薬順守を達成するのに重要である。したがって、一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、飲み込みやすいもしくは溶解可能な剤形、または香味料、甘味料、もしくは味覚遮断剤を加えた組成物などのより口当たりの良い組成物を含み得る。一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、成人への投与にも適していてよい。

一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は、溶液、シロップ、懸濁剤、エリキシル剤、懸濁剤または溶液として再構成するための粉末、分散性／発泡性錠剤、チュアブル錠、グミキャンディー、ロリポップ、フリーザーポップ、トローチ、チューインガム、経口薄片、口腔内崩壊錠、サシェ、軟質ゼラチンカプセル、散剤経口粉末、または顆粒を含み得る。一実施形態では、組成物は、キャンディーに弾力性、所望のかみごたえのある稠度（ｃｈｅｗｙｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）およびより長い保存期間を与えるゼラチンベースから作製されたグミキャンディーである。いくつかの実施形態では、グミキャンディーは、甘味料または香味料も含み得る。

一実施形態では、小児対象への投与に適した組成物は香味料を含み得る。本明細書において使用される場合、「香味料」は、製剤に明確な味および香りを与える物質（液体または固体）である。香味料はまた、製剤の嗜好性を改善するのにも役立つ。香味料には、限定されないが、イチゴ、バニラ、レモン、ブドウ、バブルガム、およびチェリーが含まれる。

特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、例えば、不活性希釈剤または吸収可能な食用担体と共に経口投与され得る。化合物はまた、硬質または軟質シェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に圧縮されてもよく、または対象の食事に直接組み込まれてもよい。経口治療投与のために、化合物は賦形剤と共に組み込まれてもよく、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ、ウエハーなどの形態で使用されてもよい。非経口投与以外によって化合物を投与する場合、化合物をその不活性化を阻止するための物質でコーティングするか、または化合物を当該物質と共に同時投与することが必要な場合がある。

別の実施形態では、本発明の組換え細菌を含む医薬組成物は、食べられる製品、例えば食品であってもよい。一実施形態では、食品は、ミルク、濃縮乳、発酵乳（ヨーグルト、酢乳、フローズンヨーグルト、乳酸菌発酵飲料）、粉ミルク、アイスクリーム、クリームチーズ、ドライチーズ、豆乳、発酵豆乳、野菜−果物ジュース、果物ジュース、スポーツドリンク、菓子、キャンディー、乳児用食品（乳児用ケーキなど）、栄養食品、動物飼料、または栄養補助食品である。一実施形態では、食品は発酵乳製品などの発酵食品である。一実施形態では、発酵乳製品はヨーグルトである。別の実施形態では、発酵乳製品は、チーズ、ミルク、クリーム、アイスクリーム、ミルクセーキ、またはケフィアである。別の実施形態では、本発明の組換え細菌は、プロバイオティクスとして機能することが意図される他の生細菌細胞を含有する調製物中に組み合わされる。別の実施形態では、食品は飲料である。一実施形態では、飲料は、果物ジュースベースの飲料または植物もしくはハーブ抽出物を含有する飲料である。別の実施形態では、食品はゼリーまたはプディングである。本発明の組換え細菌の投与に適した他の食品は当該分野において周知である。例えば、それらの各々の全内容が参照により本明細書に明示的に援用される米国特許出願公開第２０１５／０３５９８９４号および米国特許出願公開第２０１５／０２３８５４５号を参照のこと。さらに別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、パン、ヨーグルト、またはチーズなどの食品中に注入されるか、その上に噴霧されるか、またはその上に振りかけられる。

いくつかの実施形態では、組成物は、腸溶コーティングまたは非コーティングされたナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、または微小錠剤によって、腸内投与、空腸内投与、十二指腸内投与、回腸内投与、胃バイパス投与、または結腸内投与用に製剤化される。医薬組成物はまた、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの従来の坐剤の基剤を使用して、坐剤または停留浣腸などの直腸組成物に製剤化されてもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液、またはエマルションであってもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤を含有してもよい。

本明細書に記載される遺伝子操作された細菌は、鼻腔内投与されてもよく、エアロゾル形態、噴霧、ミストで、または液滴の形態で製剤化されてもよく、便宜上、適切な推進剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用して加圧パックまたは噴霧器からエアロゾル噴霧提示の形態で送達されてもよい。加圧エアロゾル投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入具または注入器における使用のための（例えば、ゼラチンの）カプセルおよびカートリッジは、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含有して製剤化されてもよい。

遺伝子操作された細菌は、デポー製剤として投与され、製剤化されてもよい。このような長時間作用する製剤は、移植または静脈内注射、皮下注射、局所注射、直接注射、もしくは点滴を含む、注射によって投与されてもよい。例えば、組成物は、適切なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）製剤化されてもよい。

いくつかの実施形態では、単回剤形の薬学的に許容される組成物が本明細書に開示される。単回剤形は液体または固体形態であってもよい。単回剤形は、改変せずに患者に直接投与されてもよいか、または投与前に希釈もしくは復元されてもよい。特定の実施形態では、単回剤形は、複数の錠剤、カプセル、丸薬などを含む経口用量を含む、ボーラス形態、例えば、単回注射、単回経口用量で投与されてもよい。代替の実施形態では、単回剤形は、例えば点滴によって一定の期間にわたって投与されてもよい。

医薬組成物の単回剤形は、医薬組成物をより少ない一定量、単回投与容器、単回投与液体形態、または腸溶コーティングされてもよいか、もしくはコーティングされていなくてもよい、錠剤、顆粒、ナノ粒子、ナノカプセル、マイクロカプセル、微小錠剤、ペレット、もしくは粉末などの単回投与固体形態に分けることによって調製されてもよい。固体形態の単回用量は、患者に投与する前に液体、典型的には滅菌水または生理食塩水を加えることによって復元されてもよい。

他の実施形態では、組成物は制御放出または持続放出系において送達され得る。一実施形態では、ポンプが制御または持続放出を達成するために使用され得る。別の実施形態では、ポリマー材料が、本開示の治療法の制御放出または持続放出を達成するために使用され得る（例えば、米国特許第５，９８９，４６３号を参照）。持続放出製剤に使用されるポリマーの例には、限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコライド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコライド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが含まれる。持続放出製剤に使用されるポリマーは、不活性で、浸出可能な不純物を含まず、保管時に安定であり、滅菌され、生分解性であり得る。いくつかの実施形態では、制御または持続放出系は予防または治療標的に近接して配置され得、それによって全身用量の一部しか必要とされない。当業者に公知の任意の適切な技術が使用され得る。

投薬レジメンは治療応答を提供するように調節されてもよい。投薬は、疾患の重症度および応答性、投与経路、治療の時間的経過（数日から数カ月から数年）、および疾患の改善時期を含む、いくつかの要因に依存し得る。例えば、単一ボーラスが一度に投与されてもよく、いくつかの分割用量が所定の期間にわたって投与されてもよく、または用量は、治療状況によって示されるように減少もしくは増加されてもよい。投薬量についての仕様は活性化合物の特有の特徴および達成される特定の治療効果によって決定される。投薬量の値は、軽減されるべき状態の種類および重症度によって変わり得る。任意の特定の対象について、特定の投薬レジメンは、個々の必要性および治療を行う医師の専門的判断に従って経時的に調節されてもよい。本明細書において提供される化合物の毒性および治療効果は、細胞培養または動物モデルにおける標準的な薬剤的手順によって決定され得る。例えば、ＬＤ_５０、ＥＤ_５０、ＥＣ_５０、およびＩＣ_５０が決定され得、毒性および治療効果の間の用量比（ＬＤ_５０／ＥＤ_５０）が治療指数として計算され得る。有毒な副作用を示す組成物が、副作用を低減させるために潜在的な損傷を最小化するための注意深い変更と共に使用され得る。投与量は、最初に細胞培養アッセイおよび動物モデルから推定され得る。ｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイならびに動物実験から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量の範囲を策定する際に使用され得る。

成分は、例えば活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器中の乾燥した凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々に供給されるかまたは単位剤形で一緒に混合される。投与様式が注射による場合、注射のための滅菌水または生理食塩水のアンプルが、成分が投与前に混合され得るように提供され得る。

医薬組成物は、薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器にパッケージングされ得る。一実施形態では、医薬組成物の１つ以上は、密閉容器中の乾燥滅菌凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給され、対象への投与のために適切な濃度に（例えば、水または生理食塩水を用いて）再構成され得る。一実施形態では、予防もしくは治療剤または医薬組成物の１つ以上は、２℃〜８℃の間で保存された密閉容器中の乾燥滅菌凍結乾燥粉末として供給され、再構成された後、１時間以内、３時間以内、５時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内、７２時間以内、または１週間以内に投与される。凍結乾燥剤形のために原則として０〜１０％のスクロース（最適には０．５〜１．０％）の抗凍結剤が含まれ得る。他の適切な抗凍結剤には、トレハロースおよびラクトースが含まれる。他の適切な増量剤には、グリシンおよびアルギニン（それらのいずれも０〜０．０５％の濃度で含まれ得る）、ならびにポリソルベート−８０（最適には０．００５〜０．０１％の濃度で含まれる）が含まれる。さらなる界面活性剤には、限定されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤が含まれる。医薬組成物は注射可能な溶液として調製され得、吸収または分散を増加させるために使用されるもの（例えばヒアルロニダーゼ）などのアジュバントとして有用な薬剤をさらに含み得る。

（処置方法）
本開示の別の態様は、それを必要とする対象に、本明細書に開示される操作された細菌を含む組成物を投与することを含む疾患の処置方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、それを必要とする対象に、内因性または天然ファージゲノムにおける改変を含む操作された細菌を含有する組成物を投与することを含む疾患の処置方法を提供する。

本開示の別の態様は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患または高フェニルアラニン血症に関連する症状の処置方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患または高フェニルアラニン血症に関連する疾患の処置方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に開示される操作された細菌を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患または高フェニルアラニン血症に関連する症状の処置方法であって、それを必要とする対象に、１つ以上のＰＭＥ、例えばＰＡＨおよび／またはＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤをコードする遺伝子配列を含む操作された細菌を含有する組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、操作された細菌は、内因性または天然のファージゲノムにおける改変を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１つ以上のエフェクター分子（例えば、１つ以上のＰＭＥ、例えば、ＰＡＨおよび／またはＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤおよび／または１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする遺伝子配列）をコードする１つ以上の遺伝子を含有する１つ以上の回路をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、低酸素条件下、疾患もしくは組織特異的分子または代謝産物の存在下、炎症または炎症反応または免疫抑制に関連する分子または代謝産物の存在下、肝臓障害、代謝疾患、またはアラビノースなどの消化管または腫瘍微小環境中に存在しても存在しなくてもよい何らかの他の代謝産物の存在下で、任意の１つ以上の回路を発現することができる。いくつかの実施形態では、記載される回路のいずれか１つ以上が１つ以上のプラスミド（例えば、高コピーまたは低コピー）上に存在するか、または細菌染色体中の１つ以上の部位に組み込まれる。また、いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌はさらに、記載された回路のうちの任意の１つ以上を発現することができ、以下のうちの１つ以上をさらに含む：（１）当技術分野で公知であり本明細書で提供される任意の栄養要求性（例えば、ｔｈｙＡ栄養要求性）など、１つ以上の栄養要求性、（２）本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の任意の死滅スイッチなど、１つ以上の死滅スイッチ回路、（３）１つ以上の抗生物質耐性回路、（４）本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の任意のトランスポーターなど、生物学的分子または基質を取り込むための１つ以上のトランスポーター、（５）本明細書に記載されるか当技術分野で公知の任意の分泌回路など、１つ以上の分泌回路、および（６）そのような追加の回路のうちの１つ以上の組合せ。これらの実施形態のいずれかにおいて、内因性ファージゲノムに対する改変は、ファージゲノム内の１つ以上の欠失、挿入、置換、または逆位、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、突然変異は欠失である。いくつかの実施形態では、欠失は１つ以上のファージ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ファージ遺伝子は部分的に欠失している。いくつかの実施形態では、突然変異は挿入である。いくつかの実施形態では、挿入は本明細書に記載されるような抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子が置換される。いくつかの実施形態では、置換は抗生物質カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子が逆位している。いくつかの実施形態では、１つ以上のファージ遺伝子の一部が逆位している。

いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患または高フェニルアラニン血症に関連する症状の処置方法を提供し、それを必要とする対象に、１つ以上のＰＭＥ（例えば、ＰＡＨおよび／またはＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤ）をコードする遺伝子配列、ならびに任意に１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする遺伝子配列を含む操作された細菌を含有する組成物を投与することを含み、当該１つ以上のＰＭＥをコードする遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にあり、当該１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする遺伝子配列は誘導性プロモーターの制御下にあり、誘導性プロモーターは、例えば、本明細書に開示されるいずれかの誘導性プロモーターである。遺伝子配列は、同一または異なる誘導性プロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰＭＥ（例えば、ＰＡＨおよび／またはＰＡＨ、および／またはＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子配列は、構成的プロモーターの制御下にある。いくつかの実施形態では、１つ以上のＰｈｅトランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子配列は、構成的プロモーターの制御下にある。他の実施形態では、細菌は、以下のうちの１つ以上を含み得る：１つ以上の栄養要求性、１つ以上の死滅スイッチ、遺伝子ガードコンポーネント、および／または抗生物質耐性。いくつかの実施形態では、挿入は、本明細書に記載の抗生物質カセットを含む。

いくつかの実施形態では、疾患は、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、自己免疫疾患、癌、腫瘍、代謝疾患（例えば、２型糖尿病、肥満、肝性脳症、非アルコール性脂肪性肝疾患、および付随疾患または関連疾患）、瀬川病、およびまれな代謝障害からなる群から選択される。そのようなまれな代謝障害の非限定的な例は、メープルシロップ尿症、イソ吉草酸血症、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、高シュウ酸尿症、フェニルケトン尿症、および高アンモニア血症を含む。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症は、他の状態、例えば肝疾患に続発する。いくつかの実施形態では、本発明は、限定はしないが、神経学的欠損、精神遅滞、脳症、てんかん、湿疹、低成長（ｒｅｄｕｃｅｄｇｒｏｗｔｈ）、小頭症、振戦、四肢痙攣、および／または低色素沈着を含む、これらの疾患に関連する１つ以上の症状を軽減、改善、または排除するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、処置される対象は、ヒト患者である。

特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、代謝産物の蓄積に関連する疾患または障害（例えば、ＰＫＵなどの高フェニルアラニン血症）を処置するために、食餌中の代謝産物を代謝することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、食物タンパク質と同時に送達される。他の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、食物タンパク質と同時に送達されない。研究によって、小腸への膵分泌およびその他の腺分泌物は、高レベルのタンパク質、酵素およびポリペプチドを含有し、これらの異化反応の結果として産生されるアミノ酸は「腸内再循環」として知られるプロセスで血中に再吸収されることが示された（Ｃｈａｎｇ、２００７年；Ｓａｒｋｉｓｓｉａｎ等、１９９９年）。したがって、フェニルアラニンの高い腸内レベルは、食物摂取と部分的に独立している可能性があり、ＰＡＬによる分解に利用できる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌および食物タンパク質は、絶食またはフェニルアラニン制限食の期間後に送達される。これらの実施形態では、高フェニルアラニン血症を患っている患者は、実質的に通常の食事、またはフェニルアラニンを含まない食事よりも制限の少ない食事を再開することができるかもしれない。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、高フェニルアラニン血症に関連する疾患、例えば、ＰＫＵを処置するために、血液などの追加の供給源からフェニルアラニンを代謝することができるかもしれない。これらの実施形態では、遺伝子操作された細菌は食物タンパク質と同時に送達される必要はなく、例えば血液から消化管までフェニルアラニン勾配が生成され、遺伝子操作された細菌はフェニルアラニンを代謝し、高フェニルアラニン血症を軽減する。

この方法は、本明細書に記載の細菌の少なくとも１つの遺伝子操作された種、株、または亜型を有する医薬組成物を調製することと、当該医薬組成物を治療有効量で対象に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、例えば液体懸濁液で経口投与される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、ジェルカップ（ｇｅｌｃａｐ）内で凍結乾燥され、経口投与される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、栄養チューブまたは胃シャントを介して投与される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、（例えば、浣腸剤によって）直腸内に投与される。いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作された細菌は、局所的、小腸内、空腸内、十二指腸内、回腸内および／または結腸内に投与される。

特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、特定の代謝産物または他のタイプのバイオマーカー分子または対象における障害に関連するもしくはその原因となる分子のレベルを低減させるために投与される。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、対象におけるフェニルアラニンのレベルを未処置またはコントロールの対象のレベルと比較して少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上低減させる。いくつかの実施形態では、低減は、医薬組成物の投与前後の対象におけるフェニルアラニンのレベルを比較することによって測定される。いくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症を処置または改善する方法は、状態または障害の１つ以上の症状を少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上改善する。

医薬組成物の投与前、投与中、および投与後に、特定の代謝産物または他のタイプのバイオマーカー分子または対象における障害に関連するもしくはその原因となる分子（例えば、フェニルアラニン）の対象におけるレベルは、生物学的サンプル（例えば、血、血清、血漿、尿、腹膜液、脳脊髄液、糞便物質、腸粘膜擦過物、組織から収集されたサンプル、および／または以下のうちの１つ以上の内容物から収集されたサンプル：胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管）中で測定され得る。いくつかの実施形態では、この方法は、特定の代謝産物（例えば、フェニルアラニン）または他のタイプのバイオマーカー分子または障害に関連するもしくはその原因となる分子のレベルを減少させるために、本発明の組成物を投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、代謝産物または他のタイプの分子を対象において検出不能なレベルまで減少させるために、本組成物の投与をすることを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、代謝産物または他のタイプの分子の濃度を、検出不能なレベルまで、または処置前の対象のレベルの約１％、２％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、または８０％未満まで減少させるために、本発明の組成物を投与することを含み得る。

対象における内の回路の導入時に遺伝子操作された細菌の投与に応答して蓄積する代謝産物または他のタイプの分子のレベルは、生物学的サンプル（例えば、血、血清、血漿、尿、腹膜液、脳脊髄液、糞便物質、腸粘膜擦過物、組織から収集されたサンプル、および／または以下のうちの１つ以上の内容物から収集されたサンプル：胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、および肛門管）において測定され得る。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、特定の代謝産物または他のタイプのバイオマーカー分子または障害に関連するもしくはその原因となる分子のレベルを低減させるために、本発明の組成物を投与することを含み得、遺伝子操作された細菌の投与の結果として蓄積する代謝産物または他のタイプの分子のレベルの増加をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、１つの代謝産物または他のタイプの分子を対象において検出不能なレベルまで低減させ、同時にかつ比例して別の代謝産物または他のタイプの分子のレベルを増大させるために、本発明の組成物を投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、この方法は、本発明の組成物を投与することを含み得、代謝産物または他のタイプの分子の濃度を、処置前の代謝産物の対象レベルの約１％超、２％超、５％超、１０％超、２０％超、２５％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、９０％超、９５％超、または９９％まで、または１００％まで増加させる。このような増加は、例えば、尿、血中、糞便中、または腫瘍中で測定され得る。

いくつかの実施形態では、馬尿酸の産生量およびその蓄積速度を測定することによって、哺乳動物対象（例えば、動物モデルまたはヒト）の尿中において、ＰＡＬを発現する遺伝子操作された細菌の活性（例えば、フェニルアラニン分解活性）を検出することができる。馬尿酸はＰＡＬ特異的な分解産物であり、ヒト尿中に通常は低濃度で存在する。馬尿酸は、ＰＡＬ経路を介したフェニルアラニンの代謝の最終産物である。フェニルアラニンアンモニアリアーゼは、フェニルアラニンのケイ皮酸への変換を媒介する。ケイ皮酸は消化管内で産生されると、吸収されて肝臓で速やかに馬尿酸に変換され、肝臓で排出される（ＨｏｓｋｉｎｓＪＡおよびＧｒａｙ、Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅｉｎｔｈｅｍａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ：ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｉｎｇｅｓｔｅｄｃｉｎｎａｍａｔｅａｎｄｕｒｉｎａｒｙｈｉｐｐｕｒａｔｅｉｎｈｕｍａｎｓ．ＪＲｅｓＣｏｍｍｕｎＣｈｅｍＰａｔｈｏｌＰｈａｒｍａｃｏｌ．１９８２年２月；３５巻（２）：２７５−８２頁）。フェニルアラニンは１：１の比で馬尿酸に変換される。すなわち１モルのＰｈｅが１モルの馬尿酸に変換される。したがって、尿中の馬尿酸レベルの変化は、このメカニズムを利用する療法の効果の非侵襲的尺度として使用され得る。

このように、馬尿酸は、ＰＡＬベースのレジメンを受けている患者において、食事の順守および処置効果のモニタリングを可能にするバイオマーカーとして機能する可能性を有する。馬尿酸は患者の管理における血液Ｐｈｅレベル測定の補助として使用することができ、馬尿酸は尿バイオマーカーであるため、タンパク質摂取量を調整する（成長に基づいて必要量が変化するため困難でありうる）のに特に子供において利点を有し得る。

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、対象の尿中の馬尿酸レベルを未処置またはコントロールの対象におけるレベルと比べて、少なくとも約１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上増加させる。いくつかの実施形態では、増加は、本開示の医薬組成物の投与の前後で対象における馬尿酸レベルを比較することによって測定される。

このセクションでは、「ＰＡＬベースの薬物」という用語は、ＰＡＬ活性を有する任意の薬物、ポリペプチド、バイオロジック（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）または処置レジメン、例えばＰＥＧ−ＰＡＬ、Ｋｕｖａｎ、本開示の細菌（例えば、ＰＡＬおよび任意にＰｈｅＰトランスポーターをコードする細菌）を含む組成物を指す。いくつかの実施形態では、本開示は、対象（例えば、哺乳動物対象）にＰＡＬベースの薬物を投与し、ＰＡＬ活性の尺度として対象において産生される馬尿酸量を測定することによって、ｉｎｖｉｖｏでＰＡＬ活性を測定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象（例えば、哺乳動物対象）にＰＡＬベースの薬物を投与し、ＰＡＬ治療活性の尺度として対象において産生される馬尿酸量を測定することによって、ＰＡＬベースの薬物の治療活性をモニターする方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象（例えば、哺乳動物対象）にＰＡＬベースの薬物を投与し、ＰＡＬ活性を決定するために対象において産生される馬尿酸量を測定し、対象におけるＰＡＬ活性を増加または減少させるために薬物の投与量を調節（例えば、増加または減少）することによって、ＰＡＬベースの薬物の投与量を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症を有する対象のタンパク質摂取および／または食事を調節する方法を提供し、当該方法は、ＰＡＬベースの薬物を対象に投与すること、対象において産生される馬尿酸量を測定すること、対象におけるＰＡＬ活性を増加または減少させるために対象のタンパク質摂取を調節するか、対象の食事を調節することを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、高フェニルアラニン血症を有する対象のタンパク質摂取および／または食事レジメンに対する遵守を確認するための方法を提供し、当該方法は、ＰＡＬベースの薬物を対象に投与すること、対象において産生される馬尿酸量を測定すること、および対象におけるＰＡＬ活性を測定することを含む。

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、血液フェニルアラニンレベルおよび尿の馬尿酸レベルの両方が対象においてモニターされる。いくつかの実施形態では、フェニルアラニンの分解速度を決定するために、血液フェニルアラニンおよび尿中の馬尿酸は複数の時点で測定される。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸レベルを用いて、動物モデルにおけるＰＡＬ活性または株活性を評価する。

いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、作用の機構を証明するために株に使用される。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、株におけるＰＡＬおよびＬＡＡＤ活性を区別するためのツールとして使用され、全株活性への各酵素の寄与を決定することができる。

いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、動物モデルおよびヒト対象における安全性を評価するために使用される。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、用量応答の評価と所望の薬理学的効果および安全性のための最適レジメンの評価に使用される。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、有効性および／または毒性のための代替エンドポイントとして使用される。いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、治療菌株を含むレジメンに対する患者の応答を予測するために使用される。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、薬物療法に応答する可能性が高い特定の患者集団の同定のために使用される。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独でまたは血中フェニルアラニン測定と組み合わせて、特定の有害事象を回避するために使用される。いくつかの実施形態において、尿中の馬尿酸測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、患者の選択に有用である。

いくつかの実施形態では、尿中の馬尿酸測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、ＰＡＬを発現する治療用ＰＫＵ株の投与を含むレジメンで、ＰＫＵ患者のタンパク質摂取／食事を調節するための１つの方法として使用される。

いくつかの実施形態では、馬尿酸の尿レベルの測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、組換えＰＡＬの活性を測定および／またはモニターするために使用される。いくつかの実施形態において、馬尿酸の尿レベルの測定は、組換えペグ化ＰＡＬ（Ｐｅｇ−ＰＡＬ）の活性を測定および／またはモニターするために使用される。いくつかの実施形態では、馬尿酸の尿レベルの測定は、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせて、本明細書に記載の治療菌株と組み合わせて投与される組換えＰＡＬの活性を測定および／またはモニターするために使用される。

いくつかの実施形態において、単独でまたは血液フェニルアラニン測定と組み合わせた尿中の馬尿酸測定は、他のバイオマーカー（例えば、臨床安全性バイオマーカー）と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、特定の代謝産物または他のタイプの分子の増加および／または減少の測定は、他のバイオマーカー（例えば、臨床安全バイオマーカー）の測定と組み合わせて使用される。そのような安全性マーカーの非限定的な例には、身体検査、バイタルサイン、および心電図（ＥＣＧ）が含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の肝臓安全性試験、例えば、血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）およびビリルビンが含まれる。このようなバイオセイフティーマーカーには、腎臓安全性試験、例えば当該分野で公知のもの、例えば血中尿素窒素（ＢＵＮ）、血清クレアチニン、糸球体濾過率（ＧＦＲ）、クレアチニンクリアランス、血清電解質（ナトリウム、カリウム、塩化物および重炭酸塩）、および徹底的な尿分析（色、ｐＨ、比重、グルコース、タンパク質、ケトン体、および血液、白血球、外観の顕微鏡検査）、ならびにシスタチン−ｃ、β２−ミクログロブリン、尿酸、クラスタリン、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）、および腎臓損傷分子−１（ＫＩＭ−１）も含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の血液学的安全性バイオマーカー、例えば、全血球数、全ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数、平均赤血球体積、平均細胞ヘモグロビン、赤血球分布幅％、平均細胞ヘモグロビン濃度、総白血球数、特定の白血球数（好中球、リンパ球、好塩基球、好酸球および単球）および血小板が含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の骨安全性マーカー、例えば、血清カルシウムおよび無機リン酸が含まれる。他の非限定的な例には、当該分野で公知の基本代謝安全性バイオマーカー、例えば、血糖、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬｃ）、および高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−ｃ）が含まれる。当該分野で公知の他の特異的安全性バイオマーカーには、例えば、血清免疫グロブリンレベル、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、フィブリノーゲン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、チロキシン、テストステロン、インスリン、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）およびそのアイソザイム、心臓トロポニン（ｃＴｎ）、およびメトヘモグロビンが含まれる。

いくつかの実施形態において、ＬＡＡＤを発現する遺伝子操作された細菌の活性は、糞便中で特異的に検出され、他の大腸菌株と区別され得る。この目的のために、フェニルアラニンデアミナーゼ試験「フェニルアラニンアガースラント（ＰｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅＡｇａｒＳｌａｎｔ）」を使用することができる。微生物がフェニルアラニンを使用して、フェニルアラニンをフェニルピルビン酸に変換できるかどうかを決定するために、フェニルアラニンアガーが用いられる。フェニルアラニンアガー上にサンプルを含むチューブに試験化学物質を添加すると、フェニルピルビン酸が緑色化合物に変換され、検査が陽性であることを示す。野生型大腸菌は、フェニルアラニンからフェニルピルビン酸を産生することができる酵素をコードしないので、フェニルピルビン酸を産生せず、他の大腸菌株との区別が可能である。遺伝子操作された細菌は、当該分野で公知のＰＣＲベースの試験によって、フェニルピルビン酸を産生することができる他の細菌種と区別することができる。例えば、種に特異的な配列を増幅することができる。例えば、様々な細菌における保存領域を増幅するユニバーサルＰＣＲは、検体のスクリーニングにおいて病原体を検出するのに理想的である。この目的のために、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の保存領域を、ユニバーサルＰＣＲのための標的遺伝子として使用することができる；１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は種に特異的な領域を含み、当該領域によって多数の細菌種を区別することができる。

いくつかの実施形態では、フェニルアラニンデアミナーゼ試験を使用して、糞便サンプル中の遺伝子操作された細菌を検出することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌を他の細菌種と区別するためにＰＣＲベースの試験を行うことができる。

いくつかの実施形態では、ペイロード（例えば、ＰＭＥおよび／またはＰｈｅＰ）を産生するための遺伝子、遺伝子（複数可）または遺伝子カセットのｍＲＮＡ発現レベルを増幅、検出および／または定量化するために、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用する。プライマーは、当該分野で公知の方法に従って、サンプル中のｍＲＮＡを検出するために設計および使用され得る。いくつかの実施形態では、ペイロードＲＮＡを含み得るサンプル反応混合物にフルオロフォアを添加し、サーマルサイクラーを使用してサンプル反応混合物を特定波長の光で照射し、フルオロフォアによるその後の発光を検出する。反応混合物を所定の時間、所定の温度に加熱および冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、９０〜１００℃、６０〜７０℃、および３０〜５０℃に加熱および冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、９３〜９７℃、５５〜６５℃、および３５〜４５℃に加熱および冷却する。いくつかの実施形態において、蓄積アンプリコンは、ｑＰＣＲの各サイクルの後に定量化される。蛍光が閾値を超えるサイクル数が閾値サイクル（ＣＴ）である。各サンプルについて少なくとも１つのＣＴ結果が生成され、当該ＣＴ結果はペイロードのｍＲＮＡ発現レベルを決定するために使用され得る。

いくつかの実施形態では、ペイロードのｍＲＮＡ発現レベルを増幅、検出、および／または定量化するために、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用する。プライマーは、当該分野で公知の方法に従って、サンプル中のｍＲＮＡを検出するために設計および使用され得る。いくつかの実施形態では、ペイロード（複数可）、例えばＰＭＥおよび／またはＰｈｅＰおよび／またはＦＮＲＳ２４Ｙ、ｍＲＮＡを含有し得るサンプル反応混合物にフルオロフォアを添加し、サーマルサイクラーを用いてサンプル反応混合物を特定波長の光で照射し、フルオロフォアによるその後の発光を検出する。反応混合物を所定の時間、所定の温度に加熱および冷却する。特定の実施形態では、加熱および冷却を所定のサイクル数繰り返す。いくつかの実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、９０〜１００℃、６０〜７０℃、および３０〜５０℃に加熱および冷却する。特定の実施形態では、反応混合物を所定のサイクル数、９３〜９７℃、５５〜６５℃、および３５〜４５℃に加熱および冷却する。いくつかの実施形態において、蓄積アンプリコンは、ｑＰＣＲの各サイクルの後に定量化される。蛍光が閾値を超えるサイクル数が閾値サイクル（ＣＴ）である。各サンプルについて少なくとも１つのＣＴ結果が生成され、当該ＣＴ結果は、ペイロード（例えば、ＰＭＥおよび／またはＰｈｅＰおよび／またはＦＮＲＳ２４Ｙ）のｍＲＮＡ発現レベルを決定するために使用され得る。

特定の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、内因性または天然の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３が本明細書に記載されるように改変された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅである。いくつかの実施形態では、ファージ３は、改変のためにもはや溶菌サイクルを経ることができない。いくつかの実施形態では、溶菌サイクルは、改変のために減少するかまたは頻度が低くなる。遺伝子操作された細菌は、例えば、消化管内または血清中の防御因子によって（Ｓｏｎｎｅｎｂｏｒｎ等、２００９年）、または死滅スイッチの活性化によって、投与の数時間または数日後に破壊され得る。したがって、遺伝子操作された細菌を含む医薬組成物は、治療有効用量および頻度で再投与され得る。マウスにおけるｉｎｖｉｖｏでのＮｉｓｓｌｅの滞留期間の長さを、その全内容が参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７０８７５８０の図６８に示す。代替の実施形態では、遺伝子操作された細菌は、投与後の数時間以内または数日以内に破壊されず、消化管で増殖およびコロニー形成し得る。

本発明の方法は、単独でまたは１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて、医薬組成物を投与することを含み得る。高フェニルアラニン血症の処置のためのいくつかの実施形態では、医薬組成物は、補因子テトラヒドロビオプテリン（例えば、Ｋｕｖａｎ／サプロプテリン）、大型中性アミノ酸（例えば、チロシン、トリプトファン）、グリコマクロペプチド、プロバイオティクス（例えば、ＶＳＬ３）、酵素（例えば、ペグ化ＰＡＬ）、および／またはフェニルケトン尿症の処置で使用されるその他の薬剤と併せて投与され得る（ＡｌＨａｆｉｄおよびＣｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ、２０１５年）。参照によりその全内容が援用されるＷＯ２０１７０８７５８０Ａ１を参照。

１つ以上の追加の治療薬の選択における重要な考慮事項は、当該治療薬が本発明の遺伝子操作された細菌と適合すべきである（例えば、当該治療薬が細菌を妨害または死滅させてはならない）ことである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は食物と一緒に投与される。代替の実施形態では、医薬組成物は食物を食べる前または後に投与される。医薬組成物は、１つ以上の食事の変更、（例えば、低フェニルアラニン食）と組み合わせて投与され得る。医薬組成物の投与量および投与頻度は、症状の重症度および疾患の進行に基づいて選択され得る。適切な治療有効用量および／または投与頻度は、処置している臨床医によって選択され得る。本発明の方法にはまた、本明細書で記載した医薬組成物を含むキットが含まれる。キットには、限定されないが、使用説明書、他の試薬（例えば、標識、追加の治療薬）、対象における障害に関連する代謝産物または他のタイプの分子のレベルを測定するための装置または材料、投与用の本発明の医薬組成物を調製するための装置または他の材料、および対象に投与するための装置または他の材料を含む、１つ以上の他の要素が含まれ得る。使用説明書は、例えば障害のある患者における、推奨投与量および／または投与様式などの治療用途のためのガイダンスを含むことができる。キットは、少なくとも１つの追加の治療薬、および／または１つ以上の別個の医薬品調製物中に、適切に製剤化された本発明の１つ以上の追加の遺伝子操作された細菌株をさらに含むことができる。

いくつかの実施形態では、キットが、医薬組成物を対象に投与するために使用される。いくつかの実施形態では、キットは、単独でまたは１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて、医薬組成物を対象に投与するために使用される。いくつかの実施形態では、キットは、医薬組成物の対象への投与前に、その間に、またはその後に、対象における代謝産物または他のタイプの分子のレベルを測定するために使用される。特定の実施形態では、代謝産物または他のタイプの分子のレベルが増加するかまたは異常に高いときに、キットは、単独でまたは１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて、医薬組成物を投与および／または再投与するために使用される。高フェニルアラニン血症に関連するいくつかの実施形態では、高フェニルアラニン血症の診断シグナルは、少なくとも２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１２ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１４ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１６ｍｇ／ｄＬ、少なくとも１８ｍｇ／ｄＬ、少なくとも２０ｍｇ／ｄＬ、または少なくとも２５ｍｇ／ｄＬの血液フェニルアラニンレベルである。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約０．１５〜約８．０１μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約０．１５〜約２μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約０．６〜約８．０１μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約０．２〜約２．６７μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約０．１５〜約０．６μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約０．２２〜約０．９μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約０．３〜約１．２１μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約０．５４〜約２．１６μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約１．１３〜約４．５３μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約１．８４〜約７．３８μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約１．６１〜約６．４３μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約２〜約８．０１μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約０．１〜約１μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約１〜約２μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約２〜約３μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約３〜約４μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約４〜約５μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約５〜約６μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約６〜約７μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約７〜約８μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間の標的分解速度を達成する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、０．１５μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間未満の標的低減速度を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約８．０１μｍｏｌ／１０^９ＣＦＵ／時間超の標的分解速度を達成する。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、約１７８ｍｇ〜２３８２ｍｇの標的減少量を達成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌は、１．０８ｍｍｏｌ〜１４．４２ｍｍｏｌの標的減少量を達成する。いくつかの実施形態では、減少量は１．０８ｍｍｏｌ未満である。いくつかの実施形態では、減少量は１４．４２ｍｍｏｌ超である。

いくつかの実施形態では、標的減少量および標的分解速度は、古典的ＰＫＵフェニルアラニンレベルに基づく。いくつかの実施形態では、標的減少量および標的分解速度は、軽度ＰＫＵで認められたフェニルアラニンレベルに基づく。いくつかの実施形態では、標的減少量および標的分解速度は、軽度高フェニルアラニン血症で認められたフェニルアラニンレベルに基づく。

いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌の投与により、（部分的または完全な）食事の自由化が可能になる（図２８を参照）。

（ｉｎｖｉｖｏにおける処置）
本発明の遺伝子操作された細菌は、ｉｎｖｉｖｏにおいて（例えば、動物モデルにおいて）評価され得る。疾患または状態の任意の適切な動物モデルが使用され得る。いくつかの実施形態では、動物モデルはマウスモデルである。例えば、参照によりその全内容が援用されるＷＯ２０１７／０８７５８０Ａ１を参照。

いくつかの実施形態において、遺伝子操作された細菌の投与から生じる任意の潜在的な毒性を決定するために、薬物動態学および薬力学試験を、非ヒト霊長類において実施することができる。そのような試験の非限定的な例を、実施例３０および３１に記載する。

（スクリーニング方法）

本開示のいくつかの実施形態では、遺伝子操作された株は、スクリーニングおよび選択方法を使用することによって、例えば、エフェクターの活性を増加させる（例えば、ＰＭＥ酵素活性を増加させる）か、または株が代謝産物を取り込む能力を増加させる（例えば、フェニルアラニン取り込み能力を増加させる）ために改善され得る。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、エフェクター活性が改善した細菌株を生成するために役立つ。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、代謝産物の取り込み能力が改善した細菌株を生成するために役立つ。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、改善されたエフェクター活性および増強された基質取り込みの両方を有する細菌株を同定し得る。使用され得るスクリーニング方法の非限定的例は、本明細書に記載されている。

（生体分子を輸送する能力が増強した細菌株の作製）
いくつかの実施形態では、フェニルアラニン取り込みが改善した遺伝子操作された細菌を同定するために、ＡＬＥ法が使用され得る。

（ＰＭＥ活性を改善するための特異的なスクリーニング）
遺伝子選択を使用するスクリーニングは、遺伝子操作された細菌におけるフェニルアラニン消費を改善するために実施される。毒性のあるフェニルアラニン類似体は、細胞タンパク質に取り込まれることによって、その作用機構（ＭＯＡ）を発揮し、細胞死をもたらす。パラログｐ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンおよびオルソログｏ−フルオロ−ＤＬ−フェニルアラニンなどのこれらの化合物は、活性が増加したＰＡＬ酵素を選択するための非標的アプローチに有用である。これらの毒性化合物は細胞タンパク質に取り込まれるよりも、ＰＡＬによって非毒性代謝産物に代謝され得ると仮定すると、フェニルアラニン分解活性が改善した遺伝子操作された細菌は、これらの化合物のより高いレベルに耐えることができ、これに基づいてスクリーニングおよび選択され得る。

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実施例３．代謝産物の測定
以下の実施例は、本開示の実施形態の例である。当業者ならば、本開示の趣旨または範囲を変化させることなく実施することができる数々の改変および変更を認識するだろう。このような改変および変更は、本開示の範囲内に包含される。実施例は、決して本開示を限定しない。

フェニルアラニンの定量（塩化ダンシル誘導体化）
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、サンプル中のフェニルアラニンレベルの定量を必要とする本明細書に記載のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイのために、共同所有の係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されているように、塩化ダンシル誘導体化プロトコールが用いられた。

トランス−ケイ皮酸の定量（トリフルオロエチルアミン誘導体化）
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、サンプル中のトランス−ケイ皮酸レベルの定量を必要とする本明細書に記載のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイのために、共同所有の係属中のＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されているように、トリフルオロエチルアミン誘導体化プロトコールが用いられた。

フェニルアラニン、トランス−ケイ皮酸、フェニル酢酸、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸、馬尿酸および安息香酸の定量（２−ヒドラジノキノリン誘導体化）
遺伝子操作された細菌がフェニルアラニンを分解する能力を評価し、サンプル中のフェニルアラニン、トランス−ケイ皮酸、フェニル酢酸、フェニルピルビン酸、フェニル乳酸、馬尿酸および安息香酸レベルの定量を必要とする本明細書に記載のｉｎｖｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏアッセイのために、共同所有の係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（それぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されているように、２−ヒドラジノキノリン誘導体化プロトコールが用いられた。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる血漿および尿中の馬尿酸、トランス−ケイ皮酸、フェニルアラニン、およびフェニルピルビン酸の定量
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる血漿および尿中の馬尿酸、トランス−ケイ皮酸、フェニルアラニン、およびフェニルピルビン酸の定量は、共同所有の係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（出願日２０１６年５月１３日）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（これらの各々の全内容は参照により本明細書に援用される）に記載されているように測定された。

ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（２０１６年１１月１６日出願）の実施例１〜５５は種々のＰｈｅ消費株の構築および活性について記載しており、これらの各々の全内容は参照により本明細書に援用される。

実施例２７．ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０のｉｎｖｉｔｒｏ活性
ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０は、フェニルアラニンを消費して非毒性代謝産物トランス−ケイ皮酸（ＴＣＡ）およびフェニルピルビン酸（ＰＰ）に変換することによって高フェニルアラニン血症を処置するように設計された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（ＥｃＮ）（参考文献）に由来する操作された細菌である。これは腸内に見出されるフェニルアラニンを遮断および分解することによって作用し、血液中へのフェニルアラニンの流入を減少させる。ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０は、ヒト消化管の微好気性（低酸素）環境におけるフェニルアラニンの分解を可能にする一連の遺伝子操作によって作製された。ジアミノピメリン酸栄養要求性を介して生物学的封じ込めを増強しながら、消化管中に見出される低酸素条件下でのフェニルアラニン分解を増強するために、ＥｃＮのゲノムに以下の改変を行った：
ａ）嫌気性誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）および嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下にある高親和性フェニルアラニントランスポーター（ＰｈｅＰ）をコードする内因性Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子の２つの追加コピーの挿入
ｂ）ＰｆｎｒＳおよびＦＮＲの調節制御下にあるフォトラブダス・ルミネセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の３つのコピーの挿入
ｃ）合成プロモーター（Ｐｌａｃ）およびラクトース応答性転写リプレッサーＬａｃＩの調節制御下にあるＰＡＬをコードする遺伝子の２つの追加コピーの挿入
ｄ）アラビノース誘導性プロモーター（ＰＢＡＤ）およびアラビノース応答性転写活性化因子ＡｒａＣの調節制御下にあるプロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）由来のＬ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の挿入
ｅ）ジアミノピメリン酸栄養要求株を作製するための４−ヒドロキシ−テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするｄａｐＡ遺伝子の欠失

ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０は、ヒト消化管の微好気性（低酸素）環境におけるフェニルアラニンの分解を可能にするように設計された一連の遺伝子操作においてＥｃＮから誘導された。高親和性フェニルアラニントランスポーターであるＰｈｅＰをコードする内因性遺伝子の２つの追加コピーのゲノム挿入を、ＥｃＮ染色体内で行った。このトランスポーターは、環境フェニルアラニンの細菌細胞への取り込みを可能にする。さらに、生物フォトラブダス・ルミネセンスに由来するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする遺伝子の３つのコピーを染色体に組み込んだ。ＰＡＬは、フェニルアラニンの非毒性産物トランス−ケイ皮酸への変換を触媒する。ＰｈｅＰおよびＰＡＬをコードする遺伝子を、嫌気性誘導性プロモーター（ＰｆｎｒＳ）および嫌気性応答性転写活性化因子ＦＮＲの調節制御下に置いた。これらの調節成分は、フェニルアラニン分解マシーナリーがヒト消化管の無酸素環境において産生されることを確実にする。合成プロモーター（Ｐｌａｃ）およびＬａｃＩ転写リプレッサーの制御下で、ＰＡＬをコードする遺伝子の追加コピーをＮｉｓｓｌｅ染色体に挿入した。これらのコピーは、ラクトースまたはラクトース類似体が転写抑制を緩和するために使用される場合、発現のために誘導され得、そして薬物物質の製造の間のフェニルアラニン分解活性の誘導のために利用されることが想定される。このように、ＬａｃＩを介した誘導による初期の株の効力は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０投与時の即時活性を可能にし、ＰｆｎｒＳを介した誘導は、投与後のｄｅｎｏｖｏ効力の誘導を可能にする。ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐７１０におけるフェニルアラニン分解の第二経路を、酸素の存在下でフェニルアラニンをフェニルピルビン酸に変換する生物プロテウス・ミラビリス由来のＬ‐アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする遺伝子の染色体挿入を介して導入した。この遺伝子は、薬物物質の製造中にアラビノースに応答してＡｒａＣによってＬＡＡＤの発現が誘導されることを可能にする方法で、内因性ＮｉｓｓｌｅのａｒａＣ遺伝子の下流に挿入された。ＰＡＬおよびＬＡＡＤの活性は相加的であることが示されている。ＬＡＡＤを含めることは、近位胃腸管においてより豊富に見出されると予想される利用可能な酸素を利用する機構である。

ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐７１０はまた、細菌増殖に必須の４‐ヒドロキシ‐テトラヒドロピコリン酸シンターゼをコードするジアミノピメリン酸（ｄａｐＡ）遺伝子の欠失で改変された。この欠失により、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０はジアミノピメリン酸を合成することができなくなり、それにより、株が外因的にジアミノピメリン酸を補充されない限り、細菌の細胞壁の適切な産生が妨げられる。外部製造の目的のために、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０はまた、ファージ粒子を発現する能力を除去するその内因性プロファージ（Φ）の一部の欠失で改変された。その内因生プロファージの一部の欠失を含む株は、本明細書でＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２と呼ばれる。

ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０に関連する配列および追加の詳細は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３２５６２（２０１６年５月１３日出願）およびＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６２３６９（２０１６年１１月１６日出願）に記載されており、これら各々の全内容は参照により本明細書に援用される。

Ｉｎｖｉｔｒｏ活性を測定するために、一晩培養物をＬＢで１：１００に希釈し、振盪しながら（２５０ｒｐｍ）３７℃で増殖させた。増殖１．５時間後に、９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、５％Ｈ_２を供給したＣｏｙ嫌気性チャンバーに培養物を入れた。誘導して４時間後に、細菌をペレットにして、ＰＢＳで洗浄し、アッセイ緩衝液（０．５％グルコース、８．４％炭酸水素ナトリウムおよびＰｈｅ４ｍＭを含むＭ９最少培地）に再懸濁した。３０分から９０分のフェニルアラニン分解速度（すなわち、アッセイ溶液からの消失）またはケイ皮酸の蓄積は１ｅ９細胞に対して正規化された。表５９は、全株についての正規化した速度を示し、操作されたプラスミド保有株および染色体挿入を含む操作された株の非限定的例の遺伝子型および活性について記載している。

［表５９］操作されたプラスミド保有株および染色体挿入を含む操作された株の遺伝子型および活性

［表７７］バイオセイフティーシステム構築物および配列成分

Ｉ．（実施例５５．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７およびその操作された派生物のプロファージバイオインフォマティクス分析）
Ａ．概要
目的：日常的な試験手順により、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ；Ｅ．ｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ）および関連する操作された派生物からのバクテリオファージ産生が確認された。バクテリオファージの供給源を決定するために、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび操作された派生物のゲノムの共同バイオインフォマティクス評価を実施して、プロファージのエビデンスについて株のゲノム配列を分析し、機能的ファージを産生する可能性について同定されたプロファージ要素を評価し、細菌ゲノム配列の中で同定された他の既知のファージと任意の機能的ファージ要素を比較し、およびプロファージ要素が他の配列決定された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム中で見出される頻度を評価した。

実験手順
１．バイオ分析方法
ａ．ファージ予測
ファージ予測ソフトウェア（ＰＨＡＳＴ）（Ｚｈｏｕら、「ＰＨＡＳＴ：ＡＦａｓｔＰｈａｇｅＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ」Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１１）３９（ｓｕｐｐｌ２）：Ｗ３４７−Ｗ３５２）を使用して、公開され公に入手可能な大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノム内（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮＺ＿ＣＰ００７７９９．１）（Ｒｅｉｓｔｅｒら、Ｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅｐｒｏｂｉｏｔｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｓｔｒａｉｎＮｉｓｓｌｅ１９１７；ＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４年１０月１０日；１８７：１０６−７頁）、ならびにＳＹＮ００１（ＤＳＭ６６０１、ロット番号Ｊｕｌ９１（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）に由来する大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの単一増殖から作製された研究セルバンクである大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７）内でプロファージを検索した。

ｂ．ＤＮＡシークエンシングおよびアセンブリ
遺伝子操作された株のゲノム配列は、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑＤＮＡシーケンサーを用いて外部リソース（ＧＥＮＥＷＩＺ、ボストン、マサチューセッツ州）によって生成された。ファージ配列を調べるために、まず、デフォルトパラメーターを用いたゲノムアセンブラソフトウェア（ＳＰＡｄｅｓ）バージョン３．９．１を使用してゲノムシークエンシング読み取りをアセンブルする必要があった（Ｎｕｒｋら、Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌｇｅｎｏｍｅｓａｎｄｍｉｎｉ−ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓｆｒｏｍｃｈｉｍｅｒｉｃＭＤＡｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＪＣｏｍｐｕｔＢｉｏｌ．２０１３年１０月；２０（１０）：７１４−３７頁）。５００ヌクレオチド未満の長さを有するスキャフォールドは廃棄された。

ｃ．遺伝子操作された株に特異的な潜在的な配列領域の同定
操作された株には存在する可能性があるが、元の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株には存在しない可能性がある配列を同定するために、生の読み取りデータは、大きなリファレンスゲノムに対して低発散配列をマッピングするためのソフトウェア（ＢＷＡＭＥＭ）を使用して、３つのリファレンスゲノムのそれぞれにアラインメントされた（ＬｉおよびＤｕｒｂｉｎ，ＦａｓｔａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｓｈｏｒｔｒｅａｄａｌｉｇｎｍｅｎｔｗｉｔｈＢｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍ；Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９年７月１５日；２５（１４）：１７５４−６０頁）。３つのリファレンスゲノムは、公開されている配列と公的に入手可能な大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノム（ＧｅｎｂａｎｋアクセッションＮＺ＿ＣＰ００７７９９．１）（Ｒｅｉｓｔｅｒら、Ｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｇｒａｍ−ｎｅｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅプロバイオティクス大腸菌株Ｎｉｓｓｌｅ１９１７；ＪＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４年１０月１０日；１８７：１０６−７頁）、Ｇｅｎｅｗｉｚによって配列決定された大腸菌ＮｉｓｓｌｅゲノムのＳＹＮ００１（野生型大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ）バージョン、および遺伝子操作された株を作製するために使用された特定の操作ステップから生じる変化とともにＳＹＮ００１の配列に基づいた操作された株のゲノムの予想される配列であった。操作された株の予想される配列に対応しなかった配列に焦点を当てるために、読み取りを各リファレンスにアラインし、ソフトウェアＳａｍｔｏｏｌｓ（Ｌｉら、ＴｈｅＳｅｑｕｅｎｃｅＡｌｉｇｎｍｅｎｔ／ＭａｐｆｏｒｍａｔａｎｄＳＡＭｔｏｏｌｓ；Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００９年８月１５日；２５（１６）：２０７８−９頁）に従って各リファレンスに別々にアラインされたものを破棄し、各リファレンスゲノムにアラインされなかった残りの読み取りをさらに分析した。同じプロセスを使用して、操作された株におけるユニーク配列を同定した。

３つの参考文献の各々にマッピングされなかった読み取りは、ゲノムアセンブラソフトウェアＳＰＡｄｅｓバージョン３．９．１を用いて、デフォルトパラメーターでアセンブルした（Ｎｕｒｋら、Ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌｇｅｎｏｍｅｓａｎｄｍｉｎｉ−ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓｆｒｏｍｃｈｉｍｅｒｉｃＭＤＡｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＪＣｏｍｐｕｔＢｉｏｌ．２０１３年１０月；２０（１０）：７１４−３７頁）。これらのアセンブルされたスキャフォールドは、Ｂｌａｓｔツール（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ；ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１９９０年１０月５日；２１５（３）：４０３−１０頁）を用いて、それらをアメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）中の非冗長データベースに対して比較することによって、ファージ関連配列の存在についてチェックされた。

これらの結果を検証するために、ゲノム配列アラインメントソフトウェア（ＭＵＭｍｅｒ）（Ｄｅｌｃｈｅｒら、Ｆａｓｔａｌｇｏｒｉｔｈｍｓｆｏｒｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅｇｅｎｏｍｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａｎｄ年６月１日；３０（１１）：２４７８−８３頁）を用いて、遺伝子操作された株のアセンブリ全体と公的に入手可能なＣＰ００７７９９．１リファレンスゲノムとの間で全ゲノムアラインメントを行った。これらのアラインメントにより、リファレンスアセンブリにマッピングされなかった新しいアセンブリからのユニーク配列が同定された。Ｂｌａｓｔツール（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ；ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１９９０年１０月５日；２１５（３）：４０３−１０頁）を用いて、ユニーク配列をＮＣＢＩ中の非冗長データベースに対して再び比較し、ファージ関連配列の存在についてチェックした。このアプローチの結果、３つの潜在的ファージが同定された。

ｄ．他のゲノムにおけるファージ３との一致の検索
ＰＨＡＳＴバイオインフォマティックツールによって同定されたファージ３配列のサイズをさらに精緻化するために、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおけるファージ３の５９キロ塩基（ｋｂ）領域を、ファージ３を含まない大腸菌ＢＷ２５１１３の密接に関連するゲノムにアラインメントすることによって、ファージ３配列のコア領域を決定した。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ由来の５９ｋｂファージ３配列の左側および右側末端の領域は、宿主の染色体（非ファージ）配列に対応する可能性が高い大腸菌ＢＷ２５１１３における遺伝子のゲノム構成と一致した；しかしながら、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ由来のファージ３配列の中央にある４３ｋｂ領域は、大腸菌ＢＷ２５１１３には存在せず、大腸菌ＢＷ２５１１３に存在する２つの宿主染色体遺伝子間の挿入として現れた。したがって、このアラインメントにより、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに固有であり、ファージ３の真のリミットを含む可能性が高い４３ｋｂのコアファージ３領域が観察された。次いで、この４３ｋｂのコアファージ３配列を、ＭＵＭｍｅｒアラインメントソフトウェア（Ｄｅｌｃｈｅｒｅｔａｌ．，Ｆａｓｔａｌｇｏｒｉｔｈｍｓｆｏｒｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅｇｅｎｏｍｅａｌｉｇｎｍｅｎｔａｎｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２００２年６月１日；３０（１１）：２４７８−８３頁）を使用してＮＣＢＩからダウンロードした５６９１個の大腸菌および赤痢菌アセンブリの包括的なセットに対してアラインメントのために比較した。大腸菌外のファージ３のインスタンスを同定するために、Ｂｌａｓｔツール（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｂａｓｉｃｌｏｃａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ；ＪＭｏｌＢｉｏｌ．１９９０年１０月５日；２１５（３）：４０３−１０頁）を使用して、４３ｋｂのコアファージ３領域全体を非冗長ＮＣＢＩデータベースと比較した。

他のゲノムにおけるファージ３への部分的ヒットがより大きなファージ要素の一部であるかどうかを決定するために、ファージ３への部分的マッチングを有するスキャフォールドを他のゲノムから抽出し、ＰＨＡＳＴ（Ｚｈｏｕら、「ＰＨＡＳＴ：ＡＦａｓｔｐｈａｇｅＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ」、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１１年）、３９（ｓｕｐｐｌ２）：Ｗ３４７−Ｗ３５２）を使用して、これらの領域内のプロファージの存在を予測した。

ｅ．大腸菌全体の大規模ファージ予測
任意の型のプロファージが配列決定された大腸菌株の中で見出される頻度を評価するために、新たに公開されたより効率的なバージョンのＰＨＡＳＴ（ＰＨＡＳＴＥＲ）（ＡｒｎｄｔＤら、ＰＨＡＳＴＥＲ：ａｂｅｔｔｅｒ，ｆａｓｔｅｒｖｅｒｓｉｏｎｏｆｔｈｅＰＨＡＳＴｐｈａｇｅｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．４４，Ｗ１６−Ｗ２１（２０１６年））を使用して、大腸菌ゲノムの大きなセット内の任意のプロファージ要素の存在を検索した。ファージ予測アルゴリズムの精度は、高品質ゲノムの使用に依存するので、この検索には２８７個の高品質リファレンス配列（Ｒｅｆｓｅｑ）大腸菌ゲノムのセットを使用した。

Ｂ．結果
１．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅのファージ含有量
３つの高信頼性の予測されるプロファージ配列が、本明細書中でファージ１、ファージ２、およびファージ３と呼ばれる大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムの各バージョン内に見出された（図１）。これらの高スコアファージの３つすべては、ＰＨＡＳＴによって「インタクト」ファージと指定されており、これらがファージの主要成分のすべてを含むことを示している（図１）。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（ファージ３）における最も長い予測ファージは全部で６８個のタンパク質を含み、ファージ尾部、頭部、ポータル，ターミナーゼ、リシン、カプシド、およびインテグラーゼを含み、これらはすべてインタクトのようである。ファージ２は全部で６９個のタンパク質を含み、ファージトランスポザーゼ、溶解、ターミナーゼ、頭部、ポータル、カプシド、および尾部タンパク質を含む。ファージ２の詳細な調査は、ｉｎｔ／ｘｉｓ遺伝子対が可動性遺伝要素によって破壊されていること、およびｃＩリプレッサーが別々のＤＮＡ結合および感知ペプチドに断片化されていることを明らかにし、これはこのファージの誘導を妨げると予想される。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅで予測された最も短いインタクトファージであるファージ１は全部で３２個のタンパク質を含み、溶解およびトランスポザーゼ機能を含む。しかしながら、ファージ１と呼ばれる推定プロファージ要素内に多くの構造遺伝子が存在しないことから、生存可能なファージ粒子を放出するその可能性が疑問視される。ファージ１〜３の特徴を表８４に要約する。

ｉ．［表８４］推定ファージの特徴の概要

２．操作された株は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅと同じファージ含有量を有する
操作された株のアセンブルされたゲノム内で、ＰＨＡＳＴは、元の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムにおいて予測されたのと同じファージ含有量を予測した。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ内で「インタクト」ファージとして同定された３つのファージの全ては、操作された株のゲノム内でも同定された（ファージ１〜３）。

３．操作された株は追加のプロファージ要素を含有しない
操作された株の生の配列決定読み取りの大部分は、リファレンスゲノムにマッピングされ、操作された株ゲノムに固有の配列はほとんどなかった。少量のユニークな配列内にファージ配列の証拠はなかった。アセンブルされた場合、これらのユニーク配列は、それぞれ長さ２ｋｂ未満の３つのスキャフォールドのみをもたらし、既知のファージ配列との類似性はなかった。この結果は、完全な操作株アセンブリの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅリファレンスゲノムへの全ゲノムアラインメントを実施し、リファレンスにマッピングされなかった操作された株内の領域を同定することによって確認された。この手順を用いて、同じ短い配列の２つが同定された。これらの短い配列のいずれも、任意の公知のファージ配列といかなる類似性も有さなかった。操作された株に特有のこれらの非常に短い配列は、ファージではなく、サンプル中の偽のＤＮＡ（ｓｐｕｒｉｏｕｓＤＮＡ）を表している可能性がある。

４．ファージ３は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに特異的である
実験室研究により、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅによって放出されたプラーク形成ファージ粒子、および操作された株は、ファージ３（ＳＹＮ−１７．００２）のみに由来することが決定された。従って、他の大腸菌ゲノムにおけるファージ３（プロファージとして）の存在の評価を行った。ＮＣＢＩからダウンロードした５６９１の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳｈｉｇｅｌｌａゲノムアセンブリの広範なデータセット内で、全長ファージ３は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおいてのみ見出された。ファージ３の全長を１００％の同一性でカバーする２つの全長、４３ｋｂの一致のみが存在し、これらの両方は大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムの異なるバージョン（ＧＣＡ＿０００３３３２１５．１およびＧＣＡ＿０００７１４５９５．１）に対応する。データセット内の他の大腸菌ゲノムにおいて、５つの追加の長い部分一致（１４−２０ｋｂ、９７−９９．６％の同一性を有する）、および４つの他のより短い部分一致（５−１０ｋｂ、９５−９８％の同一性）が存在した（図１０）。同じアセンブリの複数スキャフォールドの間で分割された、いくつかの他のより短い断片も同定された。部分的なマッチングはファージ３の異なる領域にマッピングされ、図１０に示されている。

他のゲノムにおいてこれらの部分的な一致を含むスキャフォールドを抽出し、ファージ３に対する各々の部分的な一致が、ファージ３に対して他の類似性を有さない他のゲノム内のより長いプロファージの断片を含むことを決定するために使用した。これらの領域は常に、他のゲノムにおけるより長く高スコアの「インタクト」ファージ予測の一部であった。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの外側のこれらのファージは「ハイブリッド」ファージに対応し、配列の一部はファージ３に一致し、残りはファージ３とは異なるファージ配列に対応する。これらの結果は、大腸菌中に存在する最も近い関連ファージがファージ３のＤＮＡ配列とそれらのゲノムの約半分までを共有することを示す。大腸菌以外では、いくつかの部分的な一致がより遠縁のエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）内で同定され、長さ１０〜１８ｋｂ、９６〜９７％の同一性を有していた。

５．大腸菌全体の予測ファージの分布
ファージは、大腸菌において非常に一般的である。Ｒｅｆｓｅｑデータベース中の大腸菌ゲノムのほとんど全ては、ＰＨＡＳＴＥＲファージ予測ソフトウェアツールを用いて評価されるように、少なくとも１つの「インタクト」高スコアファージを含み、いくつかは２０までを有する（図１２）。大腸菌ゲノム中の予測ファージの平均数は６．４であり、これは、ＰＨＡＳＴＥＲによって大腸菌Ｎｉｓｓｌｅについて予測された数よりも実質的に高い。このより新しいファージ予測ツールを使用して、２つのより長いファージのみが、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおいて同定される（これらは本明細書中でファージ２およびファージ３と呼ばれる）。従って、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは、ほとんどの他の大腸菌よりも実質的に少ない予測ファージを有する。

Ｃ．結論
バイオインフォマティクス分析の結論は以下の通りである：第１に、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび操作された派生物は３つの候補プロファージ要素を含み、３つのうちの２つ（ファージ２およびファージ３）は、インタクトファージゲノムに特徴的なほとんどの遺伝的特徴を含む。さらに、ファージ３は、ほぼ６０００の配列決定された大腸菌ゲノムのコレクションの中で大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに特有であるが、他の推定プロファージ要素との相同性の短い領域に限定された関連配列が少数のゲノムにおいて見出される。第４に、プロファージは大腸菌株の間で非常に一般的であり、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅは、配列決定された大腸菌ゲノムの十分に特徴付けられたセットにおいて見出される平均と比較して、比較的少数を含有する。これらのデータは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの操作株におけるプロファージの存在がこの種の自然状態の結果であり、分析されたこのような操作株のプロファージの特徴が前駆株である大腸菌Ｎｉｓｓｌｅと一致したという結論を支持する。

実施例５６．大腸菌Ｎｉｓｓｌｅおよび遺伝子操作された派生物からのバクテリオファージの検出および特性評価のための一般的なプロトコール

大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（Ｅ．ｃｏｌｉＮｉｓｓｌｅ）および操作された派生物の試験は、検証されたバクテリオファージプラークアッセイにおいて、ファージ３の低レベルの存在について陽性であった。バクテリオファージプラークアッセイを行って、バクテリオファージの存在およびレベルを決定した。簡単に述べると、一晩増殖させた試験細菌の培養物からの上清をファージ感受性指標株と混合し、バクテリオファージの存在を示すプラークの形成を検出するために軟寒天にプレーティングした。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーは、バイオインフォマティクス分析において同定された３つの異なる内因性プロファージを検出するために設計され、ファージ特異的ＤＮＡの存在についてプラークを評価するために使用された。

Ｄ．実験手順
１．ファージ試験プロトコール：マイトマイシンＣ誘導データ解析を使用した大腸菌からの細菌ウイルスのプラークアッセイ
マイトマイシンＣファージ誘導手順（ＳＴＭ−Ｖ−７０８法、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からの細菌ウイルスのプラークアッセイ）を用いて、ファージの産生について細胞株を分析した。ＳｉｎｓｈｅｉｍｅｒＲＬ．ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＸ１７４．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５９年；１：３７−４２頁、およびＣｌｏｗｅｓ，ＲＣおよびＨａｙｅｓ，Ｗ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｉｎｍｉｃｒｏｂｉａｌｇｅｎｅｔｉｃｓ．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ．１９６８年（これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されているように、マイトマイシンＣ誘導を使用する。簡単に述べると、サンプル（細胞増幅を支持するためにチミジンを補充した培地を適宜用いて）およびコントロール細胞を一晩増殖させた。サンプル、ポジティブコントロール（大腸菌、ＥＭＧ２：Ｋ（ラムダ）、ＡＴＣＣ２３７１６、または均等物）およびネガティブコントロール（大腸菌、ＡＴＣＣ１３７０６、または均等物）の一部を除去し、遠心分離し、それぞれの上清をプラークアッセイでバクテリオファージの存在について調べた。マイトマイシンＣを、最終濃度２μｇ／ｍＬで、残りのサンプル、ポジティブおよびネガティブ細菌培養物に添加した。次いで、培養物を３７±２℃に置き、ポジティブコントロール中で溶解が起こるまで（〜４．５時間）、３００〜４００ｒｐｍで振盪した。それぞれの培養物をクロロホルムで処理し、遠心分離し、上清の０．１ｍｌアリコートをバクテリオファージの存在について調べた。これを達成するために、上清をファージ感受性大腸菌株ＡＴＣＣ１３７０６と混合し、０．７％アガロース溶液と混合し、溶原性ブロス（ＬＢ）寒天培地上にローンとして（ａｓａｌａｗｎ）プレーティングした。プラークがポジティブコントロール中に存在し、プラークがネガティブコントロール中に存在しない場合、試験は有効であるとみなされた。

２．特定のバクテリオファージのＰＣＲ検出
ａ．ファージ特異的ＰＣＲプライマーの選択
オリゴヌクレオチドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの３つの推定プロファージ領域のそれぞれに対して特異性を有するように設計され、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、Ｓｋｏｋｉｅ、イリノイ州）に注文された。プライマーはＮｉｓｓｌｅゲノムを注意深く調べた後に選択され、ファージ特異的タンパク質は、コードすると予想されるユニーク領域内に完全に結合するように設計された（表８５）。

［表８５］大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ用のファージ特異的プライマーおよびコントロールプライマー

大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムおよび関連株内で見出されるが、３つのファージ要素の外側に位置する必須細菌特異的遺伝子であるｒｐｏＢに特異的に結合するオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーのさらなる一対を設計した。ｒｐｏＢに結合したプライマーセットは、ゲノムＤＮＡ調製のクオリティーおよびＰＣＲプロトコールの有効性の両方のポジティブコントロールとして役立った。さらに、ファージＤＮＡはｒｐｏＢ遺伝子を含むべきではなく、したがって、これらのプライマーはまた、ファージ−プラークピッキング技術の純度のためのコントロールとして役立った。２５回のＰＣＲ反応サイクルは、その対応するファージによって生成されたプラークに対して特異的なファージＰＣＲプライマー対で強いバンドを生成するのに十分であったが、２５回のサイクルで同じプラークＤＮＡを使用したｒｐｏＢプライマーでは、弱いバンドのみが観察されたか、またはしばしばバンドが観察されなかったことが決定された（データは示さず）。このため、プラークサンプルのＰＣＲ解析を２５サイクル行った。

ａ．ＰＣＲ反応条件およびプライマー特異性の確認
上記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、大腸菌ＮｉｓｓｌｅゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に対してＰＣＲを行い、ファージ１、２、および３ならびにｒｐｏＢ宿主ゲノムコントロールについて予想されるＰＣＲ産物が産生されたかどうかを決定した。ファージ陰性株ＡＴＣＣ１３７０６はＰＣＲ反応のネガティブコントロールとして機能した。ＰＣＲ反応のためのｇＤＮＡ鋳型を調製するために、大腸菌ＮｉｓｓｌｅをＬＢ培地中で３７±２℃で増殖させ、２５０回転／分（ｒｐｍ）で一晩振盪した。１００μＬの静止期培養物を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに添加し、微量遠心分離機中で＞２０，０００×ｇ（１５，０００ｒｐｍ）にて３０秒間遠心した。上清を除去し、細胞ペレットを１００μＬの滅菌水に再懸濁した。この１００μＬの懸濁液を０．２ｍｌの薄壁チューブに移し、エッペンドルフマスターサイクラープロ（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒＰｒｏ）サーモサイクラーにおいて９８℃で１０分間加熱した。得られた溶液は、ＰＣＲ反応に適したｇＤＮＡを含んでいた。ＤＮＡ増幅を支持するためのＤＮＡヌクレオチドおよびポリメラーゼの供給源としてＭｙＴａｑ（商標）ＲｅｄＭｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用い、ＤＮＡ鋳型として大腸菌ＮｉｓｓｌｅのｇＤＮＡを用い、表８６の条件に従って混合して、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。ポリメラーゼ連鎖反応を、表８７に記載されるように、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒＰｒｏサーモサイクラーにおいて行った。ＰＣＲの完了後、５μＬの反応物またはＤＮＡスタンダード（１ｋＢ^＋ラダー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、電気泳動による分離およびＳｙｎｇｅｎｅ紫外線（ＵＶ）トランスイルミネーターを使用する可視化のために、０．８％アガロースゲル上にロードした。

［表８６］大腸菌Ｎｉｓｓｌｅから推定プロファージ領域を増幅するためのＰＣＲ調製

［表８７］大腸菌Ｎｉｓｓｌｅからプロファージ領域を増幅するためのＰＣＲ反応サイクル

３．特異的ファージに対する個々のプラークの試験
バクテリオファージ力価アッセイは、検証済みの方法を用いて行われた。ＰＣＲ分析は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅまたは操作された株に由来する計数可能な（ｅｎｕｍｅｒａｂｌｅ）バクテリオファージプラーク（適用可能な場合）を含む、得られたファージ力価プレートの上清で行われた。プラークを生成したファージの同一性をＰＣＲによって決定した。個々のプラークの寒天プラグを、２μＬのピペットチップを用いて培養プレートから除去した。各プラグを０．５ｍＬの滅菌蒸留水に再懸濁した。プラグ再懸濁液を１５秒間ボルテックスし、次いで１μＬをＤＮＡ鋳型としてＰＣＲ反応に添加した。ＤＮＡ増幅を支持するためのＤＮＡヌクレオチドおよびポリメラーゼの供給源としてＭｙＴａｑ（商標）ＲｅｄＭｉｘ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）を用い、ＤＮＡ鋳型としてプラグ再懸濁液を用い、表５の条件に従って混合して、ファージ特異的ＰＣＲ反応を行った。上記の表８５からのプライマーの各組を、大腸菌ＮｉｓｓｌｅおよびＡＴＣＣ１３７０６のｇＤＮＡをポジティブおよびネガティブコントロールとして用いて、３つの推定ファージの各々を同定するために別々のＰＣＲ反応に使用した。ＰＣＲ反応は表８９の条件に従って行い、プラーク中に存在する任意の残留宿主染色体ＤＮＡの増幅を防止するために、限られたサイクル数（２５サイクル）で行った。ＰＣＲの完了後、５μＬの反応物またはＤＮＡスタンダード（１ｋＢ＋ラダー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、電気泳動による分離およびＳｙｎｇｅｎｅＵＶトランスイルミネーターを用いた可視化のために、０．８％アガロースゲル上にロードした。

［表８８］プラークプラグから大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ特異的ファージを増幅するためのＰＣＲ反応条件

［表８９］プラークプラグからプロファージ領域を増幅するためのＰＣＲ反応サイクル

実施例５７．ファージ存在のための大腸菌ＮｉｓｓｌｅおよびＭｕｔａｆｌｏｒの試験
４．ファージ試験データの要約
いくつかのサンプル中のファージの存在を検出するための独立した分析が行われた。分析により、微生物および細胞培養物のドイツコレクションからの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅの細胞バンクサンプル（本明細書ではＳＹＮ００１と呼ぶ）、および大腸菌Ｎｉｓｓｌｅを含有するＭｕｔａｆｌｏｒのカプセルが、非誘導および誘導（マイトマイシンＣ処置）条件下で低レベルのファージを可変的に発現することが示された（表９０）。

興味深いことに、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株は、いずれの条件においてもファージがないことを示すＣＴＭロットで見られるように、常に誘導性であるとは限らない。さらに、誘導性大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細胞（ＭｕｔａｆｌｏｒおよびＳＹＮ００１）が検出可能なファージを発現する場合でも、そのレベルは、他の大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株の非誘導または誘導条件下で見られる最大レベルと同様である。対照的に、バクテリオファージラムダプロファージを含む大腸菌Ｋ−１２株であるポジティブコントロール株ＡＴＣＣ２３７１６，^２は、誘導後に大腸菌Ｎｉｓｓｌｅまたはその派生物よりも５〜６桁多いファージを産生した。このことは、まだ理解されていない理由により、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ株の誘導性が明らかに欠如していることを実証する。

［表９０］ファージプラークアッセイ試験結果の概要

５．大腸菌ＮｉｓｓｌｅゲノムＤＮＡに対するファージ特異的プライマーの検証
ＰＣＲ分析法がプラーク産生ファージを同定し得ることを検証するために、プロファージ１、２、３または宿主ｒｐｏＢ遺伝子のいずれかに特異的なプライマーを使用して、大腸菌ＮｉｓｓｌｅｇＤＮＡに対してＰＣＲ分析を行った（表８５）。ここでは示されていないが、指標株ＡＴＣＣ１３７０６に対する同じプライマーを用いた同様の分析では、ファージプライマーについてのバンドはなく、ｒｐｏＢについてのバンドはわずかであり、この株が３つの大腸菌Ｎｉｓｓｌｅプロファージを欠くが、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ遺伝子といくらかの配列類似性を有するｒｐｏＢ遺伝子を含むことと一致する。各プライマーセットは、図１３に示されるアガロースゲル電気泳動によって判断されるように、正しいサイズの単一のＤＮＡ産物を産生した。この結果に基づいて、これらのプライマーペアを使用して、異なるファージの存在について、表９０に要約される分析からの個々のプラーク由来のファージＤＮＡを評価した。

６．ファージ１、２、および３の存在に関する個々のプラークの分析
プラークアッセイからの計数可能なプラークを有するプレートを、ＰＣＲ分析によって分析した。ポリメラーゼ連鎖反応分析を、プロファージ１、２、３または宿主ｒｐｏＢ遺伝子のいずれかに特異的なプライマーを使用して、計数可能なプラークを有するプレートからの１０個のプラークに対して行い、プラークを作ったファージの同一性を決定した。いくつかの場合において、明らかに計数可能なプラークを有するプレートは１０個未満のプラークを含み、この場合、全てのプラークが使用された。しかしながら、少なくとも６個のプラークが全ての分析のために試験された。実行されたすべてのＰＣＲ反応において、プロファージ３に特異的なプライマーのみがＰＣＲ産物を産生し、これは、表９０に列挙される各試験株およびバッチについてのすべての場合において真実であった。このデータの代表的なゲル分析を図１４に示す；図１４の左側のパネルは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ−Ｍｕｔａｆｌｏｒのアッセイから得られた個々のプラークプラグについて可視化されたＰＣＲ反応の代表的なセットを示す。右側のパネルは、大腸菌ＮｉｓｓｌｅまたはＡＴＣＣ１３７０６（ＣＲＬファージアッセイで使用されるファージ陰性指標株）のいずれか由来のｇＤＮＡを使用し、常在プロファージ３を含まないコントロール試験を示す。この後者の発見は、ファージプラークＰＣＲ分析において観察された陽性結果が、ＡＴＣＣ１３７０６プレーティング株中の配列との交差反応の結果ではないことを確認している。

Ｅ．結論
結論として、これらのデータは、発現可能なプロファージ要素が評価された大腸菌ＮｉｓｓｌｅおよびＭｕｔａｆｌｏｒ株に存在することを実証している。このことは、発現可能なプロファージが大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに存在することを示す。非誘導状態では、大腸菌ＮｉｓｓｌｅおよびＭｕｔａｆｌｏｒは、検出可能なプラークを全く産生しないか、低レベルの検出可能なプラークを産生する。すべての場合において産生されたファージのレベルは、ポジティブコントロール株ＡＴＣＣ２３７１６よりも５〜６桁低かった。これらの細菌ゲノムのバイオインフォマティクス分析に基づいて、ＰＣＲアッセイを開発し、これらの株において同定された３つの内因性プロファージ要素のいずれかが活性ファージ粒子の供給源であるかどうかを決定した。結果は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに由来するプラークが、本明細書でファージ３と呼ばれるバイオインフォマティクス的に同定された３つのプロファージ要素のうちの１つのみに起因することを示している（このプロファージゲノムは、（ファージ３配列を天然には含まない）ファージ感受性大腸菌株ＡＴＣＣ１３７０６上に形成されたプラークからユニークに（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）増幅されたため）。まとめると、これらのデータはファージ３が陽性ファージ試験結果の原因物質であり、これらの株の間でファージ産生に観察可能な違いはないらしいという結論を強く支持する。この情報はまた、これらの株によって産生されるファージが、市販のＭｕｔａｆｌｏｒカプセルを含む、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに天然のプロファージ要素の結果であることを確立する。

１．結果および結論の要約：
結論として、これらのデータは、発現可能なプロファージ要素が大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに内因性であることを実証する。検証されたプラークアッセイによって決定された、試験された株によってファージ粒子が産生された頻度は、定量的に同様の低レベルであり、一般に発現可能なプロファージが大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに存在することを示している。これらの細菌ゲノムのバイオインフォマティクス分析（実施例５５）に基づいて、ＰＣＲアッセイを開発し、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅで同定された３つの内因性プロファージ要素のいずれかがプラーク形成ファージ粒子の供給源であるかどうかを決定した。結果は、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅから発現される場合、プラークがバイオインフォマティクス的に同定された３つのプロファージ要素のうちの１つのみ、すなわちプロファージ３に起因することを示す。このプロファージゲノムは、（プロファージ３配列を天然には含まない）ファージ感受性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＡＴＣＣ１３７０６上に形成されたプラークからＰＣＲによってユニークに（ｕｎｉｑｕｅｌｙ）増幅された。まとめると、これらのデータはプロファージ３が陽性ファージ試験結果の原因物質であり、これらの株の間でファージ産生に観察可能な違いはないらしいという結論を強く支持する。この情報はまた、これらの株によって産生されるファージが、市販のＭｕｔａｆｌｏｒカプセルを含む、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに天然のプロファージ要素の結果であることを確立する。

実施例５８．ＳＹＮ００１、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０３３、およびＳＹＮ−ＰＫＵ１０３４のファージ試験
本研究では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ、ならびにフェニルアラニン消費回路を含む操作された株、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０、ＳＹＮ−ＰＫＵ１０３３およびＳＹＮ−ＰＫＵ１０３４についてのプラークアッセイを実施して、各株によって産生されるファージのレベルを決定した。表９１は、本研究で使用した株の説明を提供する。

［表９１］株についての説明

各株は、対数期におけるマイトマイシンＣの有無、および静止した一晩からのマイトマイシンＣなしで試験された。細胞あたりに生成されたプラークの量を決定するために、プラークアッセイのために上清を処理する前に、ＣＦＵカウントを決定した。

以下の試験株を、１４ｍＬ培養チューブ内の３ｍｌのＬＢ中で（１００ｕｇ／ｍＬのＤＡＰを必要に応じて含む）、３７℃にて２５０ｒｐｍで振盪しながら一晩増殖させた：ＳＹＮ０１（Ｎｉｓｓｌｅ）；ＡＴＣ１３７０６（ネガティブコントロール）；ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０；ＳＹＮ−ＰＫＵ１０３３、およびＳＹＮ−ＰＫＵ１０３４。ＡＴＣＣ１３７０６の追加の２０ｍＬ培養物を、感受性プラーク指標株として使用するために、１２５ｍＬバッフル付きフラスコ（３７℃、２５０ｒｐｍ）内のＬＢ中で増殖させた。これらの一晩培養物を使用して、１２５ｍＬバッフル付きフラスコに１：１００希釈（必要に応じてＤＡＰ１００ｕｇ／ｍＬ）でＬＢ中の１０ｍＬ培養物を２回接種した。各株について、一方のフラスコは２μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣを含み、他方の培養物を対数期非誘導コントロールとして使用した。全てのフラスコを振盪（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃で４．５時間増殖させた。次に、培養物および静止した非誘導一晩培養物を、９６ウェルプレート中のＰＢＳで１０倍希釈し、細胞数を決定するためにプレーティングした。１０^−３〜１０^−８希釈に及ぶ１０ｕｌのスポット希釈物を、各株について２回ずつプレートごとにプレーティングした（ＬＢプレート−必要に応じてＤＡＰ１００μｇ／ｍＬ）。

細胞をカウントした後、各培養物（１株あたり３培養物）から１ｍＬを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、５０μＬのクロロホルムを添加した。チューブを１５〜３０秒間ボルテックスし、細胞をマイクロ遠心分離機にて最大速度で２分間スピンダウンした。

上清を、ウェル当たり１８０ｕＬのＬＢを含む９６ウェルプレート中で希釈した。各株について２００μＬの純上清（ｎｅａｔｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を最初のウェルに添加し、マルチチャネルピペットを用いて１０倍希釈を行った。感受性コントロール株を調製するために、１０ｍＬのＡＴＣＣ１３７０６を１５ｍＬファルコン管中で４０００×ｇでスピンダウンし、上清をデカントし、細胞を等量の１０ｍＭ硫酸マグネシウム中に再懸濁した。

１００ｕｌのＡＴＣＣ１３７０６細胞懸濁液を含む１４ｍｌ培養チューブを、適切な株および上清の希釈のために調製した。純上清（ｎｅａｔｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）および上清希釈液をチューブに加え、細胞／上清混合物を最低５分間インキュベートした。

インキュベーション後、酵母エキスを含まないＬＢ培地中の７ｇ／Ｌ寒天からなる３ｍＬの液体トップ寒天をチューブに添加し、混合物を適切に標識されたＬＢプレート上に直ちに均一に注いだ。プレートを乾燥させた後、それらを３７℃の静的インキュベーターに移し、反転させて、一晩インキュベートした。プラーク数を表９２に示す。

［表９２］プラーク数

コロニーカウントは、２ｕｇ／ｍＬのマイトマイシンＣがすべてのＮｉｓｓｌｅ株に対して完全に致死的であるが、２μｇ／ｍＬが細胞の約９０％を死滅させたＡＴＣＣ１３７０６に対してはそうではないことを示した。

ファージ３に特異的なプライマーを用いて、ファージ３ＤＮＡが存在することを確認するために、ＰＣＲ分析を行った（示さず）。

実施例５９．抗生物質カセットの染色体挿入を使用した大腸菌Ｎｉｓｓｌｅからのファージ産生の非活性化
バイオインフォマティックアプローチは、活性ファージを含むと推定されるゲノムの３つの領域を同定するのに役立った（実施例５５を参照のこと）。自社開発のＰＣＲ法を用いて、活性ファージは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅゲノムの塩基２，０３５，８６７塩基と２，０７９，１７７塩基の間のゲノム遺伝子座に由来することが示された。

Ｆ．ノックアウトプライマーの設計
ファージを不活性化するために、λレッド組換えを用いて、９，６８７塩基対の欠失を作製した。λレッド組み換えは、バクテリオファージλ由来の組換え酵素を用いて、隣接する相同性によって指示された大腸菌の染色体にカスタムＤＮＡ片を挿入する手順である。まず、プラスミドｐＫＤ３からフリッパーゼ認識部位（ＦＲＴ）に隣接するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を増幅するために、プライマーを設計および合成した（表９３）。Ｎｉｓｓｌｅに導入されると、このカセットは抗生物質クロラムフェニコールに対する耐性を提供する。さらに、これらのプライマーは、抗生物質カセットをファージ遺伝子座に導く、ゲノムに対して６０塩基対の相同性を含む。Ｐｈａｇｅ３ＫＯＦＷＤおよびＰｈａｇｅ３ＫＯＲＥＶプライマーを使用して、１１７８塩基対の線状ＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、これをＰＣＲ精製した。得られたＤＮＡ鋳型を組換えに使用した。

［表９３］ファージ３の不活性化に使用されるプライマー

太字＝Nissleゲノムに対する相同性；イタリック体＝ｐKD3に対する相同性

Ｇ．λレッドシステムの導入
ファージ欠失のためのＮｉｓｓｌｅ株を調製するために、最初に、ｐＫＤ４６プラスミドを大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ宿主株に形質転換することによって、ラムダレッドシステムを導入した。大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ細胞をＬＢ培地中で一晩増殖させた。一晩培養物を５ｍｌのＬＢ培地で１：１００に希釈し、ＯＤ_６００＝０．４〜０．６に達するまで増殖させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを４℃に予備冷却した。大腸菌細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍｌの４℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍｌの４℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．１ｍｌの４℃水中に再懸濁した。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定した。１ｎｇのｐＫＤ４６プラスミドＤＮＡを大腸菌細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、滅菌済みの冷却キュベットにピペットで移した。乾燥させたキュベットをサンプルチャンバーに入れ、電気パルスを印加した。室温のＳＯＣ培地１ｍｌを直ちに加え、混合物を培養チューブに移し、３０℃で１時間インキュベートした。細胞を選択培地プレート上に広げ、３０℃で一晩インキュベートした。

Ｈ．Ｎｉｓｓｌｅにおけるファージのλレッド不活性化
組み換え構築物を、ｐＫＤ４６を含む大腸菌Ｎｉｓｓｌｅに形質転換して、ファージ配列を欠失させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを４℃に予備冷却した。一晩培養物をカルベニシリンを含有する５ｍＬのＬＢ培地で１：１００に希釈し、ＯＤ６００＝０．１に達するまで増殖させた。次に、０．０５ｍＬの１００×Ｌ−アラビノースストック溶液を添加して、ｐＫＤ４６λレッド発現を誘導した。培養物を、ＯＤ６００＝０．４〜０．６に達するまで増殖させた。次いで、大腸菌細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍｌの４℃水中に再懸濁した。大腸菌細胞を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍｌの４℃水中に再懸濁した。大腸菌を２，０００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．１ｍｌの４℃水中に再懸濁した。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定し、０．５μｇの組み換え構築物を細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、滅菌済みの冷却キュベットにピペットで移した。乾燥させたキュベットをサンプルチャンバーに入れ、電気パルスを印加した。１ｍｌの室温ＳＯＣ培地を直ちに加え、混合物を培養チューブに移し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、３５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上に広げ、一晩インキュベートした。

Ｉ．突然変異の確認
突然変異の存在をコロニーＰＣＲによって確認した。コロニーをピペットチップで拾い上げ、上下にピペッティングすることによって２０μｌの冷ｄｄＨ２Ｏに再懸濁した。３μｌの懸濁液を、後の使用のために適切な抗生物質を含むインデックスプレート上にピペットで移した。インデックスプレートを３７℃で一晩増殖させた。ＰＣＲマスターミックスを、５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液、０．６μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ、０．４μｌの５０ｍＭＭｇ_２ＳＯ_４、６．０μｌの１０×エンハンサー、および３．０μｌのｄｄＨ２Ｏ（ＰＣＲ反応当たり１５μｌのマスターミックス）を使用して作製した。ＣＡＴ遺伝子に対してユニークなプライマー（１００μＭストック）または挿入されたＣＡＴ遺伝子に隣接するゲノム配列に対してユニークなプライマー（１００μＭストック）２μＬを１６μＬのｄｄＨ２Ｏに混合することによって、１０μＭプライマーミックスを作製した。使用したプライマーの配列を表９４に示す。各２０μｌの反応について、１５μＬのＰＣＲマスターミックス、２．０μＬのコロニー懸濁液（鋳型）、２．０μＬのプライマーミックス、および１．０μＬのＰｆｘＰｌａｔｉｎｕｍＤＮＡＰｏｌをＰＣＲチューブ中で混合した。ＰＣＲサーモサイクラーを以下のようにプログラムし、ステップ２〜４を３４回繰り返した：１）９４℃で５：００分、２）９４℃で０：１５分、３）５５℃で０：３０分、４）６８℃で２：００分、５）６８℃で７：００分、その後４℃に冷却。ＰＣＲ産物を、１０μＬの各アンプリコンおよび２．５μＬの５×色素を使用するゲル電気泳動によって分析した。ＰＣＲ産物は、ＣＡＴ遺伝子がゲノムに挿入された（それによって、ファージを欠失および不活性化する）場合にのみ形成される。

［表９４］ファージ３の欠失を確認するためのプライマー

Ｊ．変異体からの抗生物質耐性の除去
抗生物質耐性遺伝子をプラスミドｐＣＰ２０で除去した。プラスミドｐＣＰ２０は、ＦＲＴ部位を組み換えてＣＡＴ遺伝子を除去するフリッパーゼリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミドである。欠失ファージ配列を有する株を、ＯＤ６００＝０．４〜０．６に達するまで、３７℃で抗生物質を含有するＬＢ培地中で増殖させた。全てのチューブ、溶液、およびキュベットを４℃に予備冷却した。細胞を２，０００ｒｐｍにて４℃で５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を１ｍｌの４℃水中に再懸濁した。細胞を２，０００ｒｐｍにて４℃で５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．５ｍｌの４℃水中に再懸濁した。細胞を２，０００ｒｐｍにて４℃で５分間遠心分離し、上清を除去し、細胞を０．１ｍｌの４℃水中に再懸濁した。エレクトロポレーターを２．５ｋＶに設定し、１ｎｇのｐＣＰ２０プラスミドＤＮＡを細胞に添加し、ピペッティングによって混合し、滅菌済みの冷却キュベットにピペットで移した。乾燥させたキュベットをサンプルチャンバーに入れ、電気パルスを印加した。室温のＳＯＣ培地１ｍｌを直ちに加え、混合物を培養チューブに移し、３０℃で１〜３時間インキュベートした。次に、２００μＬの細胞をカルベニシリンプレート上に広げ、２００μＬの細胞をクロラムフェニコールプレート上に広げ、両方を３７℃で一晩増殖させた。カルベニシリンプレートは、ｐＣＰ２０を有する細胞を含む。細胞を一晩インキュベートし、十分なＯＤ６００まで一晩増殖しなかったコロニーをさらに２４時間インキュベートした。クロラムフェニコールプレートは、いくつの細胞がエレクトロポレーションで生き残ったかの指標を提供する。カルベニシリンプレートからの形質転換体を４３℃で非選択的に精製し、一晩増殖させた。

精製した形質転換体を、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールに対する感受性について試験した。４３℃で増殖させたプレートからのコロニーを採取し、１０μＬのＬＢ培地に再懸濁した。３μＬの細胞懸濁液を以下の３つのプレートの各々の上にピペットで移した：１）３７℃でインキュベートしたクロラムフェニコールを含むＬＢプレート（これは、宿主株のゲノム中のＣＡＴ遺伝子の有無について試験する）；２）３０℃でインキュベートしたカルベニシリンを含むＬＢプレート（これはｐＣＰ２０プラスミド由来のβ−ラクタマーゼ（ＣａｒｂＲ）遺伝子の有無について試験する）；および３）３７℃でインキュベートした抗生物質を含まないＬＢプレート。コロニーについてクロラムフェニコールまたはカルベニシリンプレート上で増殖が観察されなかった場合、ＣＡＴ遺伝子およびｐＣＰ２０プラスミドの両方が失われており、コロニーをさらなる分析のために保存した。保存されたコロニーをＬＢプレート上に再ストリークしてシングルコロニーを得、３７℃で一晩増殖させた。ファージ配列の欠失は、ゲノムのファージ遺伝子座領域を配列決定することによって、そしてより重要なことに、プラーク形成の非存在を表現型的に検証することによって確認された（本質的に、実施例５７または５８に記載され、かつ例えば実施例６０に記載されるようなプロトコールに従って）。

表９５は、ファージ不活性化のために除かれた大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３の部分を列挙する。

［表９５］ファージ３から除かれた配列

表Ｅは、欠失によって不活性化されたファージ３遺伝子を列挙する。

［表Ｅ］欠失によって不活性化されたファージ３遺伝子

表Ｆは、欠失を含むファージ３の配列を示す。

［表Ｆ］欠失を有するファージ３配列

実施例６０．（クロラムフェニコールカセット除去前の）野生型大腸菌Nissleのファージ３ノックアウトの試験
実施例５９に記載されるように、４０ｂｐのオーバーハングおよびｐＫＤ３に対する相同性を有するプライマーを使用して、ファージゲノムの１０ｋＢ領域を標的とするノックアウトを作製した（λレッド組換え、続いてクロラムフェニコール耐性についての選択）。得られた４つのクローンを選択した。ファージ３ゲノムにおけるクロラムフェニコールカセットの挿入の存在についてスクリーニングするためのプライマーを使用して、予想される２００ｂｐのバンドが、４つのクローンすべてについて見られ、ファージ３ゲノムに特異的なポジティブな挿入を示した。

同じ４つのクロラムフェニコール耐性コロニーを、１４ｍＬの培養チューブ中の１ｍＬのＬＢに再懸濁した。培養チューブを２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させた。細胞が対数期初期に達したとき、培養物を２つの５００ｕｌアリコートに分割し；一方のアリコートをマイトマイシンＣ（２ｕｇ／ｍＬ）で処理し；他方を未処理のままにした。３．５時間後、４００ｕｌのそれぞれの培養物を除去し、２０ｕｌのクロロホルムを添加した。サンプルを１５秒間ボルテックスし、遠心分離機にて最大速度で１分間遠心分離した。表９６は、カウントされたプラークの数を示す。ＳＹＮ−９０２は、ｐＫＤ４６プラスミドを含む野生型Ｎｉｓｓｌｅである。

ｉ．［表９６］プラーク数

結論として、ノックアウト株のいずれにおいてもプラークは観察されなかったが、ポジティブコントロールは多数のプラークを産生した。これらの結果は、野生型大腸菌Ｎｉｓｓｌｅにおけるファージ３の１０ｋｂ内部領域の欠失が、マイトマイシンＣ処理後のプラーク形成を防ぐことを示している。

実施例６１：ファージ３ノックアウト株におけるファージ検出アッセイ（野生型ＮｉｓｓｌｅおよびＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３４）
この研究は、野生型ＮｉｓｓｌｅおよびＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３４におけるファージ３ノックアウトが、プラークアッセイにおいてネガティブ試験（ｎｅｇａｔｉｖｅｔｅｓｔ）をもたらすかどうかを試験するために実施された。表９７に、この研究で使用した株について記載する。

［表９７］株についての説明

この研究では、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（ＳＹＮ０１）、ＳＹＮ‐９０３（Ｎｉｓｓｌｅバックグラウンドにおけるファージ３ノックアウト）、ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐１０３４ｄ「ｐｈｉ」３（ネガティブ株におけるファージ３ノックアウト）、ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐７１０（ポジティブコントロール）、およびＡＴＣＣ１３７０６（ネガティブコントロール）からの上清をファージの存在について試験した。

一方の末端にクロラムフェニコール（ｃｍ）カセット、もう一方の末端にファージ３に特異的なプライマーセットを使用したＰＣＲ分析により、クローンＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３４ファージ３ＫＯがクロラムフェニコールカセットの正しい挿入について陽性であることが以前に示された（データ示さず）。ＣＭカセットの挿入は、実施例５９で上述したように行った。

ファージ試験のために、株（ＳＹＮ０１（Ｎｉｓｓｌｅ）、ＡＴＣ１３７０６（ネガティブコントロール）、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０、ＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３３、ＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３４、ＡＴＣＣ１３７０６（感受性プラーク指標株））を、１４ｍＬの培養チューブ内の３ｍｌのＬＢ中で（必要に応じて１００ｕｇ／ｍＬのＤＡＰを含む）、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩増殖させた。酵母エキスを含まないＬＢ培地中の７ｇ／Ｌ寒天からなるトップ寒天を調製し、融解し、液体を維持するために４５℃で保存した。

一晩培養物を使用して、１００ｕｇ／ｍＬのＤＡＰを含む１０ＬＢを、必要に応じて１：１００希釈で１２５ｍＬバッフル付きフラスコ中において接種した。各試験株を、２つの１０ｍＬ培養物に接種した：ファージを誘導するための２μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣを有する１つのフラスコ、および対数期非誘導コントロールとしての第２のフラスコ。全てのフラスコを振盪（２５０ｒｐｍ）しながら３７℃で増殖させた。全ての培養物を４．５時間増殖させ、９６ウェルプレート中のＰＢＳ中で１０倍に希釈し、細胞数の判定のためにプレーティングした。１０^−３〜１０^−８の希釈にまたがるスポット希釈物（１０μｌ）を、各株について、１プレートあたり（ＬＢプレート−必要に応じてＤＡＰ１００ｕｇ／ｍＬ）２回ずつプレーティングした。

細胞カウントの終了後、各培養物から１ｍＬ（１株あたり３培養物）を取り出し、１．５ｍＬのエッペンドルフに入れ、５０ｕＬのクロロホルムを添加し、チューブを１５〜３０秒間ボルテックスした。細胞を、マイクロ遠心分離機にて最大速度で２分間遠心分離した。一方、９６ウェルプレートを、カラム２〜５および８〜１１においてウェル当たり１８０ｕＬのＬＢを含むように調製した。このプレートにおいて上清の希釈を行った。各株について２００ｕＬのニート上清を、サンプル１〜８についてはカラム１に、サンプル９〜１５についてはカラム７に添加した。１０倍希釈は、マルチチャネルピペットを使用して、カラム２〜５および８〜１１から行われた。

感受性コントロール株を調製するために、１０ｍＬのＡＴＣＣ１３７０６を１５ｍＬのファルコンチューブにおいて４０００×ｇでスピンダウンし、上清をデカントし、細胞を等容量の１０ｍＭ硫酸マグネシウム中に再懸濁した。１４ｍｌの培養チューブを設定し、適切な株の標識を付け、上清の希釈液を添加した。各チューブに、１００ｕｌのＡＴＣＣ１３７０６細胞懸濁液を添加した。ニート上清およびその希釈液を適切なチューブに加え、細胞／上清混合物を最低５分間インキュベートした。

インキュベーション後、３ｍＬのトップ寒天をチューブに添加し、混合物を直ちに（注ぐことによって）標識ＬＢプレート上に広げた。プレートを乾燥させ、次いで３７℃の静的インキュベーターに移動させ、反転させ、そして一晩インキュベートした。結果を表９８７に示す。

［表９８］プラーク数

上記表に見られるように、ファージ３はプラーク形成に関与し、ファージ染色体内のセントラル遺伝子（ｃｅｎｔｒａｌｇｅｎｅｓ）における欠失はプラークの形成を阻害することができる。肉眼的観察は、ファージ配列の欠失によって引き起こされるいかなる種類の増殖欠陥も示唆しなかった。

実施例６２：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１、ＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３５、およびＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３６のファージ試験
この研究は、抗生物質カセットがプラスミドバックグラウンドから除去された種々のフェニルアラニン株におけるファージ産生を評価し、このカセットの除去がファージ粒子の再形成を可能にしないことを確認するために行われた。

さらに、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０のファージ３ノックアウトバージョンであるが、ｃｍカセットを依然として含むものが試験された。表９９は、この研究で使用した株および関連するバックグラウンド株を記載する。

［表９９］株についての説明

ＡＴＣＣ１３７０６コントロール、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１、ＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３５、およびＳＹＮ−ＰＫＵ−１０３６の培養物を、１４ｍＬチューブ内の３ｍＬ培養物中で、３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。次に、マイトマイシンＣ（２μｇ／ｍＬ）を含む新しい培地に細胞を希釈した。プラークアッセイは、本質的に実施例５８に記載されるように行われた。プラーク数を表１００に示す。

［表１００］プラーク数

これらの結果から、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０におけるフェーズ３のノックアウトは、上清からｐｆｕ（プラーク形成単位）をもたらさなかったことが示された。プラスミド株におけるファージ３ノックアウトからのカセットの治癒はまた、上清におけるｐｆｕ形成をもたらさなかった。

実施例６３：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の生成および分析
ファージ３がノックアウトされ、クロラムフェニコールカセットが治癒されたフェニルアラニン消費株ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０のバージョンが分析された。まず、プラーク形成をプラークアッセイで評価した。次に、この株がトランス−ケイ皮酸を産生する能力をＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０と比較して、ファージの除去がｉｎｖｉｔｒｏでのフェニルアラニン消費活性に変化を引き起こすかどうかを決定した。関連するＰｈｅ分解領域のサンガー配列決定を行って、フェニルアラニン消費回路を確認した。

まず、クロラムフェニコールカセットを治癒するために、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１（Δファージ３：：ｃｍ挿入を有するＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０３）をｐＣＰ２０で形質転換し、４つのカルベニシリン耐性形質転換体を分析のために選択した。クロラムフェニコールカセットの除去を最初にＰＣＲによって確認した。これらの形質転換体を４２℃で一晩増殖させてｐＣＰ２０プラスミドを治癒し、次いでＬＢプレート（増殖がないことを確認するためのコントロールとしてのプレーンＬＢプレート、プラスミドの喪失を確認するためのＬＢ＋カルベニシリンおよび染色体Ｃｍカセットの除去を確認するためのＬＢクロラムフェニコール、ならびに株がその上で増殖するＬＢＤａｐ（ｄａｐ栄養要求性））上にストリークした。ＬＡＡＤ活性がまだ存在することを確認するために、細胞をＰｈｅ寒天およびスポットされた塩化第二鉄上にストリークした。４つのクローンすべてが直ちに濃い緑色に変わり、ＬＡＡＤ陽性の結果を示した。さらなる分析のために１つのクローンを維持し、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２と命名した。

次に、ネガティブコントロールとしてＡＴＣＣ１３７０６を使用し、ポジティブコントロールとしてＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０を使用して、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２をファージ試験のために調製した。プラークアッセイは、本質的に実施例５８に記載されているように実施した。ファージ試験の結果は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２からの非誘導およびマイトマイシンＣ誘導上清においてプラークを示さなかった（データは示されていない）。

次に、フラスコをＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の活性を試験するために調製した。活性は、ＩＰＴＧ誘導（好気的に）ありまたはなし、および嫌気性誘導ありで試験した。このアッセイを実施するために、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の一晩培養物を、１２５ｍＬバッフル付きフラスコ内の１０ｍＬ培養物で１：１００に逆希釈した（３つのフラスコに接種した（各条件について１つのフラスコ））。細胞を１時間４０分間増殖させ、その時点で細胞は対数期初期に入った。１つのフラスコはそのままにし、もう１つのフラスコは最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを受け取り、３番目フラスコは９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、および５％Ｈ_２を供給する嫌気性チャンバーに移した。細胞を４．５時間誘導させた。次いで、本明細書の他の箇所に記載されている標準プロトコールに従って、ＴＣＡ産生アッセイを行った。基本的に、５０ｍＭフェニルアラニンを含むアッセイ緩衝液に細菌を再懸濁した。２９０ｎｍでの吸光度によるトランス−ケイ皮酸定量のために、アリコートを細胞アッセイから２０分毎に１．５時間除去した。

表１０１に見られるように、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のＩＰＴＧおよび嫌気性誘導の両方が観察された。

［表１０１］Ｉｎｖｉｔｒｏ活性測定

すべてのサンプルはサンガーシークエンシングのために送られ、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２におけるすべてのＰｈｅ分解関連領域の配列は正確であることが確認された。

結論として、非誘導またはマイトマイシンＣで誘導された培養物からの上清を用いた場合、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２は、ＡＴＣＣ１３７０６に対してプラーク形成単位（ｐｆｕ）を産生しない。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２は抗生物質マーカーを含まず、プラスミドも含まない。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２はまた、ＩＰＴＧおよび嫌気性誘導の両方でフェニルアラニン分解活性を有する。フェニルアラニン分解に関与する全ての関連領域が配列決定された。従って、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２は、ファージを産生しないことを除いて、ＳＹＮ２６１９に対して機能的に同等であるように見える。

実施例６４：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のｉｎｖｉｔｒｏ活性測定
ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の一晩培養物の１：１００逆希釈物を、対数期初期まで１．５時間増殖させた後、本明細書に記載の誘導のために１ｍＭＩＰＴＧおよび０．１％アラビノースの存在下で４時間嫌気性チャンバーに移した。活性アッセイを行うために、１ｅ８の細胞を再懸濁し、アッセイ緩衝液（０．５％グルコース、５０ｍＭＰｈｅ、および５０ｍＭフェニルアラニンを含有する５０ｍＭＭＯＰＳを含むＭ９培地）中でインキュベートした。上清サンプルを経時的に採取し、ＴＣＡ（ＰＡＬの産物）を２９０ｎｍでの吸光度によって測定して、ＴＣＡ産生／ＰＡＬ活性の速度を決定した。フェニルピルビン酸は、本明細書に記載のＬＣＭＳ法を用いて測定した。結果を図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。

実施例６５：ＩｎｖｉｖｏにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の活性分析−フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の腸内再循環モデルにおけるｉｎｖｉｖｏ活性に対するＳＹＮ‐ＰＫＵ‐７１０からのファージ３欠失の影響
Ｉｎｖｉｖｏで馬尿酸を産生するＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の活性を評価する。本研究では、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２をフラスコ中で増殖させ、嫌気的に誘導し、馬尿酸を産生し、血清Ｐｈｅを減少させるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の能力に対するファージ欠失の影響を、ｉｎｖｉｖｏでＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０株を含む同質遺伝子ファージとの比較を通して評価する。

ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の一晩培養物をそれぞれ用いて、ＤＡＰ１００μｇ／ｍＬを含有する５００ｍＬのＬＢを含む４つの２Ｌフラスコに接種する。これらの培養物を１時間４５分間増殖させ、次いで、９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、および５％Ｈ_２を供給する嫌気性チャンバーに４時間移す。次いで、細胞を４６００×Ｇで１２分間遠心分離し、１０ｍＬの製剤緩衝液（グリセロール：１５％（ｖ／ｖ）、スクロース：１０％（ｗ／ｖ）（１００ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ：１０ｍＭ（２．１ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ：２５ｍＭ（１．４６ｇ／Ｌ））に再懸濁する。いくつかの４０μｌアリコートを取り出し、細胞カウントおよび活性測定のために使用する。活性は、本質的に実施例６３に記載されているように決定され、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２についてそれぞれ測定される。生存率は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のセロメーター（ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）カウントにより決定される。ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ストレプトマイシン耐性Ｎｉｓｓｌｅ、８ｅ１０ｃｆｕ／ｍｌ）をコントールとして使用する。細胞をＰＢＳで１０ｍＬにし、次いで４ｅ１０細胞の毎日の強制経口投与（３×３００μｌ用量）に備えて、１Ｍ重炭酸塩と９：１で混合し、最終濃度１００ｍＭ重炭酸塩を達成する。

ファージ陽性ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０と同質遺伝子ファージレス株ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の有効性をｉｎｖｉｖｏで比較するために、株をｅｎｕ２マウスに投与する。ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１はコントロールとして投与される。６〜１８週齢のＣＲＬ（ＧＥＭＳ）由来の雌のＢＴＢＲ−Ｐａｈｅｎｕ２マウス（２０〜３５ｇ）を、少なくとも２日間施設に順応させることができる。動物はフェニルアラニン欠乏食（ＴｅｋｌａｄＴＤ．９７１５２）に置かれ、研究開始の少なくとも２日前に、０．５ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン（Ｓｉｇｍａ）および５％スクロース／Ｌ（Ｓｉｇｍａ）のフェニルアラニン富化水が与えられる。フェニルアラニン富化水は研究期間中除去され、通常の水で置き換えられる。

研究当日、マウスを以下のように体重に従って処置群にランダム化する：群１：Ｈ_２Ｏ（ｎ＝９）；群２：ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝９）；群３：ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０（ｎ＝９）；群４：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（ｎ＝９）。ベースラインフェニルアラニンレベルを決定するために、顎下皮膚穿刺によって血液サンプルを収集する。次いで、平均群体重に応じて、体重１グラム当たり０．１ｍｇのフェニルアラニンの単回用量を皮下注射によってマウスに投与する。Ｐｈｅチャレンジの１、２および３時間後に、細菌（または水）を強制経口投与によってマウスに投与する（３×３００μｌ）。動物から採血し、Ｐｈｅチャレンジ後４時間まですべての動物から尿を収集する。採血から２０分以内に遠心分離機（２０００ｇ、４℃で１０分間）で血漿を処理するまで、血液サンプルを氷上に保持する。次いで、血漿を、ＭＳ分析のために９６ウェルプレートに移す。尿を５ｍＬチューブに集め、体積を記録した後、馬尿酸分析のためにサンプルをＭＳに移す。

実施例６６：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２投与時のｉｎｖｉｖｏ血清Ｐｈｅおよび馬尿酸測定
ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の活性をｉｎｖｉｖｏで評価した。研究のための細胞を調製するために、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の一晩培養物をそれぞれ使用して、ＤＡＰ１００μｇ／ｍＬを含有する５００ｍＬのＬＢを含む４つの２Ｌフラスコに接種した。これらの培養物を１時間４５分間増殖させ、次いで、９０％Ｎ_２、５％ＣＯ_２、および５％Ｈ_２を供給する嫌気性チャンバーに４時間移した。次いで、細胞を４６００×Ｇで１２分間遠心分離し、１０ｍＬの製剤緩衝液（グリセロール：１５％（ｖ／ｖ）、スクロース：１０％（ｗ／ｖ）（１００ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ：１０ｍＭ（２．１ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ：２５ｍＭ（１．４６ｇ／Ｌ））に再懸濁した。いくつかの４０μｌアリコートを取り出し、細胞カウントおよび活性測定のために使用した。セロメーター（ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）カウント（４回行った）によって決定された生存率は、６．９４ｅ１０ｃｆｕ／ｍｌ（＋／−５．７８ｅ９）であった。

活性は、プレートベースのアッセイを用いて決定した。簡単に述べると、１×１０^８ｃｆｕ（セロメーター（ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）により決定）を、微量遠心管中の１ｍＬの予め温めたアッセイ緩衝液（０．５％グルコース、５０ｍＭＭＯＰＳ、および５０ｍＭフェニルアラニンを含む１×Ｍ９最小培地）に添加し、短時間ボルテックスし、直ちに３７℃のヒートブロックまたは恒温水槽中に置いて静置インキュベーションした（ｔ＝０）。アッセイ緩衝液中に再懸濁した細胞からの上清サンプルを、２９０ｎｍの吸光度で分光光度計を用いて、いくつかの時点にわたりＴＣＡの存在量について分析した。ＴＣＡ検出のための正確なＯＤ_２９０ウィンドウは、比較的狭い濃度範囲で発生する。この理由から、吸光度測定値が検出のための線形範囲に収まるように、上清サンプルを希釈した。測定値をＴＣＡ検量線と比較した。活性は、２．７２μｍｏｌ／時間／１ｅ９ｃｆｕ（＋／−０．１５μｍｏｌ／時間／１ｅ９ｃｆｕ）であると決定された。

研究の４日前（すなわち、−４−１日目）から、ＰａｈＥＮＵ２／２マウス（〜１１〜１５週齢）を、フェニルアラニンを含まない固形飼料と０．５ｇ／Ｌのフェニルアラニンを添加した水とで飼育した。研究当日、マウスを以下のように体重に従って処置群にランダム化した：群１：ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（ｎ＝９）；群２：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（ｎ＝９）。ベースラインフェニルアラニンレベルを決定するために、顎下皮膚穿刺によって血液サンプルを収集した。次いで、平均群体重に応じて、体重１グラム当たり０．１ｍｇのフェニルアラニンの単回用量を皮下注射によってマウスに投与した。Ｐｈｅチャレンジの１、２および３時間後に、細菌（または水）を強制経口投与によってマウスに投与した（３×２５０ｕｌ）。全血を、各時点で顎下出血を介して収集した。代謝ケージングでの尿収集は、一回目の細菌投与の直後に開始され、研究期間中（４時間）収集され続けた。

採血から２０分以内に遠心分離機（２０００ｇ、４℃で１０分間）で血漿を処理するまで、血液サンプルを氷上に保持した。次いで、血漿を、ＭＳ分析のために９６ウェルプレートに移した。尿を５ｍＬチューブに集め、体積を記録した後、分析のためにサンプルをＭＳに移した。結果を図１７Ａおよび図１７Ｂに示し、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０と同様に、Ｐｈｅ注射後のフェニルアラニンの変化を減少させ、馬尿酸を産生することを示している。

実施例６７：フェニルケトン尿症のＥＮＵ２マウスモデルにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の有効性
この研究の目的は、経口ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２投与後の尿中馬尿酸（ＨＡ）、トランス‐ケイ皮酸（ＴＣＡ）およびフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の産生により測定した、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）のＥＮＵ２マウスモデルにおけるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）分解プロバイオティクスＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２の用量依存的なｉｎｖｉｖｏ活性を調べることであった。ＰＫＵに関連するＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の有効性は、経口投与されたＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が、血漿ＴＣＡおよびＨＡの出現とともに、食事によるＰｈｅ摂取とは無関係にＰａｈ^{ｅｎｕ２／ｅｎｕ２}マウスにおいて血漿Ｐｈｅレベルを低下させる能力によって測定され、また皮下（ＳＱ）注射によるＰｈｅ投与後の血漿中のこれらの代謝産物を測定することによっても評価された。

最初の試験では、Ｐｈｅ欠乏食で飼育した雌のＰａｈ^{ｅｎｕ２／ｅｎｕ２}マウスの体重を測定し、次に体重によって無作為に２つの処置群にランダム化した（それぞれｎ＝９）。血液（抗凝固剤として使用されるリチウムヘパリン）を、顎下出血を介して各マウスから得た（Ｔ＝０時間）。次いで、マウスにＰｈｅ（０．１ｍｇ／ｇ）のＳＱ注射を行い、尿収集のために直ちに代謝ケージ（３匹／ケージ）に入れた。Ｐｈｅ注射の１、２、および３時間後に、マウスに、振盪フラスコ中で増殖およびプレ誘導させたコントロールＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（群１）またはＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（群２）細胞のいずれかを強制経口投与した（総投与量５×１０^１０細胞、３時間毎の強制経口投与に均等に分割）。注射の４時間後に、血漿（抗凝固剤として使用されるリチウムヘパリン）を顎下出血によって得て、尿を収集した。液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ‐ＭＳ／ＭＳ）を用いて、血漿および尿中のＰｈｅ、ＴＣＡおよびＨＡの濃度を測定した。

この研究は、マウスを強制経口投与するために使用されるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２試験品を、薬物物質のスケールアップを意図したものと同様のプロセスを使用して、バイオリアクター中で増殖および活性化したことを除いて、実施例６５に記載の研究と同様に実施した。Ｐｈｅ欠乏食で飼育した雌のＥＮＵ２マウス（ｎ＝６３）の体重を測定し、次いで体重によって７つの処置群にランダム化した（それぞれｎ＝９）。次いで、マウスにＰｈｅ（０．１ｍｇ／ｇ）をＳＱ注射し、尿収集のために直ちに代謝ケージに入れた。Ｐｈｅ注射の１、２、および３時間後に、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を６つの用量群に強制経口投与した（ｎ＝９／用量群は、３匹のマウス／ケージの３つの代謝ケージに分割された）。用量群は、合計１×１０^１１、５×１０^１０、２．５×１０^１０、１．２５×１０^１０、６．２５×１０^９、または３．１３×１０^９の細胞を受け取り、それらは３時間毎の強制経口投与に均等に分割して与えた。ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１は、１×１０^１１細胞の最高用量でコントロール群（ｎ＝９）に強制経口投与された。尿を４時間にわたって採取した。血漿（抗凝固剤として使用されるリチウムヘパリン）は、血漿Ｐｈｅ変化の測定のために、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２およびＳＹＮ−ＰＫＵ９０１で処置されたマウスの両方について、最高用量群（１×１０^１１細胞）においてＴ＝０時間およびＴ＝４時間で顎下出血によって得られた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて、血漿および尿中のＰｈｅ、ＨＡ，ＴＣＡを測定した。定量的ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法は、血漿または尿中のフェニルピルビン酸を測定するのに利用できなかった。

結果を図１７Ａおよび図１８Ｂに示す。最初の研究では、Ｐｈｅ（０．１ｍｇ／ｇ）のＳＱ注射後、５×１０^１０のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２細胞の経口投与を受けたＥＮＵ２マウスでは、同用量のコントロール株ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１と比較して、血漿Ｐｈｅの増加が大幅に鈍化した（３７．７％減少、ｐ＝０．０００２）。研究の０〜４時間のサンプリング期間中に排泄された尿中ＨＡの量は、尿中ＨＡ濃度に収集された尿の量を乗じることによって決定された。尿中ＨＡ濃度はコントロール株ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１で処置したマウスにおいて定量下限（ＢＬＬＯＱ；＜０．０４ｍＭ）未満であったが、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を投与したマウスにおける濃度は高く（６．５９〜７．９７ｍＭの範囲）、４時間にわたって測定可能なＨＡ排泄（１０．２４±０．５９μｍｏｌ）をもたらした。ＴＣＡおよびＨＡはいずれのマウスの血漿でもＴ＝０では観察されなかったが、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を投与した群では投与の４時間後に検出された。ＴＣＡおよびＨＡは、いずれの時点でもコントロール株ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１で処置したマウスの血漿において測定不能であり、ＴＣＡの増加がＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２活性によるものであることを示し、ｉｎｖｉｖｏでのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の機能を実証している。ＰｈｅおよびＴＣＡの尿中濃度はすべてのサンプルでＢＬＬＯＱであった。

第２の研究では、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２をバイオリアクター中で、薬物物質のスケールアップに使用した方法と同様の条件下で増殖させた場合にも、有効性が観察された。ＥＮＵ２マウスにおけるＰｈｅ（０．１ｍｇ／ｇ）のＳＱ注射後、１×１０^１１のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２細胞の経口投与を受けた群では、同用量のＳＹＮ−ＰＫＵ９０１細胞と比較して、血漿Ｐｈｅの増加が大幅に鈍化した（２９．３％減少、ｐ＝０．０２）。さらに、尿中ＨＡ排泄の増加が、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で処置されたマウスにおいて、用量依存的に観察された（１５．６１±０．８１、９．８１±２．１１、４．５２±１．７０、２．９７±０．５５、１．２４±０．２３、および０．８６±０．２５μｍｏｌのＨＡが、それぞれ１×１０^１１、５×１０^１０、２．５×１０^１０、１．２５×１０^１０、６．２５×１０^９、または３．１３×１０^９のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を投与したマウスにおいて排泄された）。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２に対して使用された最高用量である１×１０^１１のＳＹＮ−ＰＫＵ９０１細胞で処置したマウスは、大量のＨＡを排泄しなかった（０．０８±０．０２μｍｏｌ）。最初の研究と同様に、ＴＣＡおよびＨＡはいずれのマウスの血漿でもＴ＝０では観察されなかったが、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を受けた群では投与後４時間で検出され、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１を受けた動物では検出されなかった。尿中のＨＡ排泄は投与されたＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２細胞の量とよく相関しており、代謝産物ＨＡがｉｎｖｉｖｏでのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２活性の有望なバイオマーカーであることを示している。

結論として、これらのデータは、ＥＮＵ２マウスモデルにおいて、血漿ＴＣＡおよびＨＡの循環を増加させ、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２活性を大幅に増加させることにより、ｉｎｖｉｖｏでのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のＰｈｅ代謝活性を実証している。研究の第２の部分では、薬物物質のスケールアップを意図したプロセスを用いてバイオリアクター中で増殖させたＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２がｉｎｖｉｖｏで活性であることが示された。この実験では、コントロール株ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１の経口投与と共にＰｈｅのＳＱ注射を行うと、血漿Ｐｈｅレベルがマウスにおいて増加した；しかしながら、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を経口投与されたマウスでは、ＰｈｅのＳＱ注射後の血漿Ｐｈｅ濃度のスパイクが大幅に鈍化した。重要なことに、この結果は、全身循環しているＰｈｅが腸内再循環を介して腸に到達し、その後、胃腸管（ＧＩ）管において経口投与されたＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２によって分解されることを示している。この実験は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２がタンパク質の食事摂取量とは無関係に、血中の循環Ｐｈｅレベルを低下させることができることを実証した。

実施例６８：ｉｎｖｉｖｏでのファージ含有フェニルアラニン消費株とファージフリーフェニルアラニン消費株との間の生存率の比較
ファージ含有フェニルアラニン株ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０とそのファージフリー対応物ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２との間の生存率、輸送（ｔｒａｎｓｉｔ）またはコロニー形成の潜在的な違いを特定するために、ｉｎｖｉｖｏ競合研究を実施し、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０と同質遺伝子のファージレスＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２株の競合指数が生成された。ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０もＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２も抗生物質カセットを有していないため、この研究では抗生物質耐性が治癒されていない標識株が用いられた。ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１０については、クロラムフェニコール／カナマイシン（ｃｍ／ｋａｎ）標識株ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３を使用した。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２については、クロラムフェニコール（ｃｍ）標識株ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１を使用した。表１０２は、この研究に関連する株を列挙している。

［表１０２］株についての説明

簡単に述べると、ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１の一晩培養物を用いて、５００ｍＬのバッフル付きフラスコ内の１００ｍＬのＬＢ（ＤＡＰ１００ｕｇ／ｍｌおよび適切な抗生物質も含む）を接種した。培養物を６時間増殖させ、その時点で、収集のために遠心分離機中にて４０００×ｇで１５分間遠心分離した。上清を廃棄した。細胞を約７ｍｌの製剤緩衝液（グリセロール：１５％（ｖ／ｖ）、スクロース：１０％（ｗ／ｖ）（１００ｇ／Ｌ）、ＭＯＰＳ：１０ｍＭ（２．１ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ：２５ｍＭ（１．４６ｇ／Ｌ））に再懸濁した。細胞を６５０μＬのアリコートに分注し、−８０℃で凍結した。細胞プレーティングおよび生存率決定のために、より小さなアリコートを取り出した。セロメーター（ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ）を用いて、生存率は非常に高く、細胞数は株間でかなり同等であることが示された。

この研究の全ての細胞数（投入量を含む）は、投入量（強制経口投与）と排出量（糞便）が一貫して比較され得るように、プレーティングによって取得された。２つの６５０ｕＬアリコートを氷上で解凍し、１：１で混合し、重炭酸ナトリウムで希釈し（９部の細胞：１部の１Ｍ重炭酸塩（１４４μＬ））、次いで、ｋａｎ／ｃｍおよびｃｍ上で定量するために４連でプレーティングした（１０倍の１０μＬスポットプレーティングによる−８−＞−１０希釈）。

第１日目に、野生型Ｂ６（ｎ＝６）マウスに２００μｌの細胞（各株約３×１０^９）を強制経口投与した。糞便ペレットを、強制経口投与の６時間前および６時間後に収集した。２日目および３日目に、マウスに２００μｌの細胞を強制経口投与し、糞便ペレットを強制経口投与の６時間前および６時間後に収集した。４日目および５日目に、糞便ペレットを回収した。

毎日、収集した糞便ペレットを１ｍｌのＰＢＳを含むチューブ中で秤量し、ホモジナイズした。糞便ペレット中のＮｉｓｓｌｅのＣＦＵを決定するために、ホモジナイズした糞便ペレットを段階的に希釈し、クロラムフェニコールを含有するＬＢプレートとカナマイシンを含有するプレートの上に各サンプルをプレーティングした。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、コロニーをカウントした。糞便中の２つの株の量を決定するために、総組換えＮｉｓｓｌｅをｃｍプレート上でカウントし、ｋａｎプレート上で得られたＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３の数を総量から差し引いて、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１のＣＦＵ数を決定した。

結果を図１９に示し、競合指数（ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３投入量／ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１排出量）を表１０３に示す。

［表１０３］排出量の競合指数

結果は、ＮｉｓｓｌｅのファージフリーＰＫＵ株ＳＹＮ−ＰＫＵ−７１３とＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１との間で輸送（ｔｒａｎｓｉｔ）またはコロニー形成に大きな違いがないことを示している。

実施例６９：大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ由来の株についての一般的なバクテリオファージ試験プロトコール
以下の手順は、ＥｃＮプロファージ／ファージ中に見出されるＤＮＡ配列を検出する。上記手順は、プライマーが欠失されたプロファージの領域の外側で増幅してＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の細菌株を生成するので、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２におけるＥｃＮゲノム内のファージおよびプロファージＤＮＡを増幅する。

検証済みのバクテリオファージ（ファージ）法、ＧＰ−Ｖ７０８、マイトマイシンＣ誘導を用いた大腸菌由来の細菌ウイルスのプラークアッセイ（ＰｌａｑｕｅＡｓｓａｙｏｆＢａｃｔｅｒｉａｌＶｉｒｕｓｆｒｏｍＥ．ｃｏｌｉＵｓｉｎｇＭｉｔｏｍｙｃｉｎＣＩｎｄｕｃｔｉｏｎ）は、プラークアッセイを用いてファージの存在を測定する。試験により、検出されたファージは内因性ＥｃＮプロファージ由来であり、汚染ファージまたは外来物質由来ではないことが確認される。

プラークアッセイは、凍結サンプルのループフル（ｌｏｏｐｆｕｌ）またはスクレープ、１０ｍＭチミジンを添加した濃縮培地中で２００〜３００ｒｐｍにて振盪しながら３７±２℃で一晩増殖させた陰性および陽性細菌培養物で開始する。サンプル、ポジティブコントロール（大腸菌、ＥＭＧ２：Ｋ［λ］、ＡＴＣＣ２３７１６、または同等物）およびネガティブコントロール（大腸菌、ＡＴＣＣ１３７０６、または同等物）の一部を除去し、遠心分離し、それぞれの上清をプラークアッセイでバクテリオファージの存在について調べる。マイトマイシンＣを、最終濃度２μｇ／ｍＬで、残りのサンプル、陽性および陰性細菌培養物に添加する。次いで、培養物を３７±２℃に置き、溶解がポジティブコントロールで起こるまで（〜４．５時間）３００〜４００ｒｐｍで振盪する。各培養物をクロロホルムで処理し、遠心分離し、上清の０．１ｍｌアリコートをバクテリオファージの存在について調べる。これを達成するために、上清をファージ感受性大腸菌株ＡＴＣＣ１３７０６と混合し、０．７％アガロース溶液と混合し、ＬＢ寒天上にローンとして（ａｓａｌａｗｎ）プレーティングする。プラークがポジティブコントロール中に存在し、かつプラークがネガティブコントロール中に存在しない場合、試験は有効であると見なされる。

計数可能なプラークを含有する目的の株を含むプレートは、プラークが内因性ＥｃＮプロファージから生成されたファージに由来することを確認するために、エンドポイントＰＣＲによって同一性試験される。これは、最初に２μＬのピペットチップで個々のプラークの寒天プラグを作製し、各プラグを０．５ｍｌの脱イオン水に再懸濁することによって達成される。プラグ再懸濁液を１５秒間ボルテックスし、１μＬをＰＣＲのための鋳型として使用する。ネガティブコントロールとして、同じプレートからの寒天プラグを、プラークを含まない領域から作製する。利用可能な場合には、１サンプルあたり合計１０個のプラークを試験する。１サンプルあたり１０個未満のプラークが形成される場合には、全てのプラークを分析する。１サンプルにつき１個のネガティブコントロールプラグを試験する。追加のコントロールとして、ＥｃＮおよびＡＴＣＣ１３７０６の純粋なブロス培養物を、２００〜３００ＲＰＭで振盪しながら、３７±２℃の濃縮培地で一晩増殖させる。１００μＬの定常培養物（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｓ）を０．２ｍｌの薄壁チューブに添加し、エッペンドルフマスターサイクラープロ（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒＰｒｏ）サーモサイクラーにて９８℃で１０分間加熱して、ＰＣＲのための鋳型として使用するゲノムライセートを調製する。

各ＰＣＲアッセイの鋳型として使用された全体的なサンプルおよびコントロールは、以下の通りであった：
ａ．サンプル：計数可能なプレートから採取した最大１０個の再懸濁プラーク１μＬ
ｂ．ネガティブコントロール：計数可能なサンプルプレートの非プラーク領域から採取した１個のプラグ１μＬ
ｃ．ネガティブコントロール：大腸菌、ＡＴＣＣ１３７０６、または同等の株（プラーク指標株）の溶解した定常培養物（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｓ）１μＬ
ｄ．ポジティブコントロール：目的の細胞株の溶解した定常培養物（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙｃｕｌｔｕｒｅｓ）１μＬ

ＰＣＲを用いてＥｃＮ特異的ファージの領域を増幅した後、ゲル電気泳動により反応の終点でのＰＣＲ増幅断片を検出する。ＥｃＮ特異的ファージの増幅に使用したプライマー（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｋｏｋｉｅ、イリノイ州）を表１０４に示す。プライマーはＥｃＮファージを注意深く調べた後に選択され、ＥｃＮ特異的ファージ内の領域を増幅するが、プラーク検出に使用されるファージ感受性大腸菌株ＡＴＣＣ１３７０６内のゲノムＤＮＡ中のいずれの領域にも結合しない。

［表１０４］ＥｃＮ−ファージ特異的ＰＣＲプライマー

反応は、エッペンドルフマスターサイクラープロＰＣＲマシン（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＭａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒＰｒｏＰＣＲｍａｃｈｉｎｅ）を使用して、０．２ｍＬ薄壁チューブで実行される。ファージ特異的プライマー用にマスターミックスを調製する。プライマーは、ヌクレアーゼフリーの滅菌水中で最終濃度１００μＭに再構成される。マスターミックスは、表１０５のレシピに従って調製される。

［表１０５］ＰＣＲマスターミックスの調製

ＰＣＲマスターミックス１９μＬを各０．２ｍＬのＰＣＲチューブに加えた後、１μＬのＰＣＲ鋳型を個々のチューブに加える。チューブに蓋をし、ＰＣＲマシンに設置し、表１０６のパラメータに従って反応サイクルを実行する。

［表１０６］ＰＣＲ反応サイクル

各スタンダード、サンプル、またはコントロール反応の５μＬを、電気泳動による分離とＳｙｎｇｅｎｅＵＶトランスイミネータを使用した可視化のために、０．８％アガロースゲル上にロードする。増幅されたバンドのおおよそのサイズは、ＥｃＮ特異的ファージの存在について３５０ｂｐであるが、ネガティブコントロールはバンドを全く生成しない。

実施例７０：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２毒性試験
ＧＬＰ毒性試験の投与期間は、ＢＩＤ投与の雄および雌のＣＤ−１マウスで２８日間である（１日２回）。投与量は、１×１０^９、１×１０^１０、および１×１０^１１ＣＦＵのおよその範囲をカバーする。最高濃度は、実現可能な最大用量である。マウスは、試験品に関連する死亡率、臨床観察、体重、血液学、臨床化学、ならびに肉眼的および顕微鏡的病理について評価される。投与を中止した後、マウスから糞便サンプルを数日間採取し、ｑＰＣＲ分析を用いてＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のＤＮＡの存在をアッセイし、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の経時的な減少を決定する。血液はまた、ｑＰＣＲを使用して、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のＤＮＡの存在について評価される。２８日間のマウスＧＬＰ毒性試験の設計の概要を表１０７に示す。

［表１０７］２８日間のマウスＧＬＰ毒性試験の設計

実施例７１：ブタモデルにおける胃フェニルピルビン酸の評価
ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の投与前および投与後の様々な時点での２匹のブタ（十二指腸カニューレを有していた）における胃フェニルピルビン酸のレベル。

ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の投与の２日前に、２匹のブタに、タンパク質シェイク／リンゴジュースを含む液体食を２日間与えた。０日目に、ブタに麻酔をかけ、挿管し、約２５０ｍｌ（約５０ｇ）のペプトン、３×１０ｅ１２の細菌（３０ｍｌ中のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１）＋２４ｍｌの１Ｍ重炭酸塩フラッシュ（２ｇ）をＴ＝０で注入した。

次に、１ｍｌの胃サンプルを、Ｔ＝０、１５分、３０分、４５分、６０分、７５分、９０分、１０５分、１２０分で採取した。サンプルを直ちに遠心分離し、上清を凍結し、沈殿の入ったチューブを４℃に置いた。さらに、１ｍｌの血中サンプルを、Ｔ＝０、３０分、６０分、９０分、および１２０分で採取し、ヘパリン処理したチューブに収集し、遠心分離し、血漿を収集および凍結した。可能であれば、尿を採取して凍結した。結果を図２０に示し、ＬＡＡＤが胃で活性であることを示している。

実施例７２：非ヒト霊長類における経口トランス−ケイ皮酸の尿中馬尿酸への変換効率

次に、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の活性および有効性の研究を、ヒトに対してより関連性の高い代謝およびＧＩ生理学を有するトランスレーショナルモデルである、絶食した健康な非ヒト霊長類（ＮＨＰ）に拡張した。６匹のカニクイザル（２．５〜４ｋｇ）のコホートを使用した。ＰＫＵ表現型ではないが、健康なＮＨＰの生理学は、健康なヒトにおいて最初に行われる可能性が高い将来の臨床研究に情報を与えるのに有用である。

本明細書に記載される全てのＮＨＰ研究は、動物福祉法規則の最終規則（連邦規則集、第９条）、実験動物福祉局からの実験動物の人道的ケアおよび使用に関する公衆衛生サービスポリシー、および国立研究評議会からの実験動物のケアおよび使用のためのガイドの該当するすべてのセクションに準拠して、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＬａｂｓ（Ｓｈｒｅｗｓｂｕｒｙ、マサチューセッツ州）で実施された。２〜５歳の６匹の雄のＮＨＰ対象（２．５〜４ｋｇ）を使用し、国際認定霊長類固形飼料（ＰＭＩ栄養、５０４８）で飼育した。全ての研究を開始する前に、対象を一晩（１６時間）絶食させた。すべての研究において、投与の直前に、動物を個々のケージに分け、尿の収集を補助するために角度のついたパンを各ケージの底に挿入した。全ての経口投与のために、経口胃管を使用した。

第１に、サルにおける経口投与されたＴＣＡの尿中ＨＡへの変換効率を、その後の実験で使用するための正規化因子の計算のために測定した。各ＮＨＰに、肉由来のペプトン（５００ｇ／Ｌ；Ｓｉｇｍａ、７０１７４）１０ｍＬと、１２０ｍＭ重炭酸ナトリウムに溶解したおよび^１３Ｃ−ＴＣＡ（１２．５ｍｇ／ｍＬ；ＣａｍｂｒｉｄｇｅＩｓｏｔｏｐｅｓＬａｂ、ＣＬＭ−７４９８−ＰＫ）１５ｍＬを経口投与した後、２ｍＬの水フラッシュを投与した。このようにして、ＳＹＮ−ＰＫＵのｉｎｖｉｖｏでのＰＡＬ／Ｐｈｅ分解活性を、尿中ＨＡの回収から推測することができる。同位体標識^１３Ｃ−ＴＣＡを経口投与し、尿中^１３Ｃ−ＨＡを測定した。経口投与した^１３Ｃ−ＴＣＡの平均４１．９±１０．３％が、尿中^１３Ｃ−ＨＡとして回収された（図２１）。

実施例７３：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるプロファイリングおよび有効性
非ヒト霊長類モデルにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の有効性を評価した。

本明細書に記載される全ての研究において、投与の直前に、動物を個々のケージに分け、尿の収集を補助するために角度のついたパンを各ケージの底に挿入した。全ての経口投与のために、経口胃管を使用した。

ＮＨＰに、肉由来のペプトン１０ｍＬ（５００ｇ／ｍＬ）または水をモック（ｍｏｃｋ）として経口投与した。次に、製剤緩衝液に再懸濁された１０ｍｌのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（予めバイオリアクター中で増殖および活性化され、氷上で解凍された）、または製剤緩衝液のみをモックとしてＮＨＰに投与した。最後に、ＮＨＰに５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与した後、２ｍＬの水でフラッシュした。該当する場合、投薬レジメンの１時間後に、動物に１２．５ｍＬの^１３Ｃ−Ｐｈｅ（２０ｍｇ／ｍＬ）を静脈内注射した。動物は、静脈穿刺によって、０、０．５、１、２、４および６時間で採血された。該当する場合、モックタンパク質（ｍｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ）投与後、動物に３．５ｍＬのｄ_５−Ｐｈｅ（２０ｍｇ／ｍＬ；ＣＤＮＩｓｏｔｏｐｅｓ、Ｄ−１５８９）を与えた。投与後６時間で、尿収集パンを取り出し、内容物を体積測定のためにメスシリンダーに注いだ。全てのサンプルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−８０℃で保存した。

Ｐｈｅの曲線下面積（ＡＵＣ）は、ＲおよびＰＫＮＣＡパッケージ（ＤｅｎｎｙＷ，Ｄ．Ｓ．およびＢｕｃｋｅｒｉｄｇｅＣ．Ｓｉｍｐｌｅ，ａｕｔｏｍａｔｉｃ，ｎｏｎｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌａｎａｌｙｓｉｓ：ＴｈｅＰＫＮＣＡＲｐａｃｋａｇｅ．ＪＰｈａｒｍｋＰｈａｒｍＤ４２．１，１１−１０７頁、ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０９２８−０１５−９４３２−２（２０１５年））を用いて線形台形法で計算され、ＡＵＣを説明するモデルはｒｓｔａｎａｒｍパッケージで推定された。ｄ_５−ＰｈｅについてのＡＵＣ０−ｌａｓｔは、リニアアップ／ログダウン法（ｌｉｎｅａｒ−ｕｐ／ｌｏｇ−ｄｏｗｎｍｅｔｈｏｄ）で計算された。標識ＰｈｅのＡＵＣの平均および信頼区間と処置差は、処置（ビヒクルまたは細胞）に対する固定効果および動物ごとのランダム効果を有する階層ベイズモデルを用いて計算された。

バイオリアクターにおける株の増殖および誘導のために、滅菌ループを用いて、５００ｍｌのＵｌｔｒａ−ｙｉｅｌｄ（商標）フラスコ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）内の５０ｍｌのＦＭ２培地（補足表２）に細胞を接種した。ＯＤ_６００が約５に達するまで細胞を３５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させ、その時点で、培養物の３０ｍＬを使用して、ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＢｉｏＦｌｏｗ１１５バイオリアクター内の４ＬのＦＭ２に接種した（開始時のＯＤ_６００は約０．０２）。発酵槽は撹拌、空気、および酸素補給により６０％の溶存酸素に制御され、水酸化アンモニウムを用いてｐＨ７に制御された。ＯＤ_６００〜１．５で、低酸素環境（１０％溶存酸素）の作製とＩＰＴＧ（１ｍＭ）の添加により、細胞を活性化した。ＯＤ_６００〜２０で、Ｌ−アラビノース（最終濃度０．１５％）を添加し、細胞をさらに１時間増殖させた。４，５００×Ｇ、４℃で３０分間遠心分離することによって細胞を回収し、製剤緩衝液に再懸濁し、試験当日まで−８０℃で保存した。

最初に、絶食させたサルに、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２投与の有無にかかわらず５ｇのペプチドチャレンジを投与し、尿中ＨＡを測定した。全ての動物は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２で処置した場合、細胞投与なしのベースラインレベルと比較して有意なＨＡ応答を示した（図２２Ａ、左）。興味深いことに、ペプチドチャレンジを与えなかった絶食サルにおいて有意なＨＡが回収され（図２２Ａ、右）、霊長類の胃腸管がＰｈｅのリザーバであり得ることを示唆している。先の両方の実験（図２２Ａ）において、サルにおける腸内再循環の過程を調べるために、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を受けた対象はまた、ペプチドチャレンジの１時間後に^１３Ｃ−Ｐｈｅを静脈内注射され、^１３Ｃ−ＨＡが尿中で測定された（図２２Ｂ）。ペプチドを投与されなかった群では^１３Ｃ−ＨＡは検出されなかったが、ペプチドチャレンジを投与された群では^１３Ｃ−ＨＡが検出され、腸内再循環が霊長類で起こり、タンパク質摂取と関連しており、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２によって消費され得るＰｈｅを提供することができることを実証した。

最終的な研究では、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２がサルの血清Ｐｈｅを低下させる能力が決定された。しかしながら、血清Ｐｈｅレベルをわずかに上昇させるだけでも高濃度のタンパク質が必要であるため、これは健康な対象（非ＰＫＵ）では困難である（体重で、サルで使用される５ｇペプチドチャレンジは、平均的な成人男性で約１００ｇチャレンジに相当する）。ベースラインＰｈｅレベルと、機能的ＰＡＨ酵素によるペプチドチャレンジ後の血清におけるその低い動的応答は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２による血清Ｐｈｅ低下の検出を不明瞭にする。これらの理由から、経口重水素化Ｐｈｅ（ｄ_５−Ｐｈｅ）チャレンジを行った。投与されたｄ_５−Ｐｈｅの量（７０ｍｇ）は、平均的な成人男性のための約３０ｇのタンパク質に含まれるＰｈｅと体重で等しく、通常の食事中に存在し得る量と一致した（Ｌａｙｍａｎ，Ｄ．Ｋ．ＤｉｅｔａｒｙＧｕｉｄｅｌｉｎｅｓｓｈｏｕｌｄｒｅｆｌｅｃｔｎｅｗｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｓａｂｏｕｔａｄｕｌｔｐｒｏｔｅｉｎｎｅｅｄｓ．ＮｕｔｒＭｅｔａｂ（Ｌｏｎｄ）６，１２，ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４３−７０７５−６−１２（２００９年））。予想通り、ベースラインｄ_５−Ｐｈｅは尿および血清では検出できなかったが、その投与後に血中で検出することができた（図２２ＣおよびＤ）。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２投与後、尿における正規化されたｄ_５−ＨＡ回収は、投与されたｄ_５−Ｐｈｅの大部分がｄ_５−ＨＡに代謝されたことを実証している（図２２Ｃ）。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の特異的代謝産物ｄ_５−ＨＡおよびｄ_５−ＴＣＡも血清中で検出された（図２３ＡおよびＢ）。最も重要なことは、血清ｄ_５−Ｐｈｅの増加がＳＹＮ−ＰＫＵ投与時に著しく鈍化し（図２２Ｂ）、血清ｄ_５−ＰｈｅのＡＵＣの著しく有意な減少を伴ったことである（図２２Ｃ）；５８％減少、９０％信頼レベル２９．４〜５７．８％）。

サルの胃腸管における高い安静時Ｐｈｅレベルはまた、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を受けたがペプチドチャレンジを受けなかった絶食動物において観察された有意なＨＡ回収から推測することができる。腸内再循環はサルにも存在することが示されたが、非ＰＫＵバックグラウンドでの作業が困難であり、これらの動物において腸溶出液を容易にサンプリングできないことは、このプロセスのメカニズムの基礎を理解するために、より多くの作業を行わなければならないことを示している。それにもかかわらず、基質のリザーバの維持は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の治療方法的有用性を高め、ＰＫＵ患者における食事による治療的投与のタイミングに対する制約を少なくし得る。

実施例７４：非ヒト霊長類でのＰｈｅ発現におけるＬＡＡＤの評価
ＬＡＡＤ発現の有効性およびＰｈｅのＰＡＬ代謝に対する負の効果の決定が評価された。

Ｔ＝０で、尿パンを空にし、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）は１１ｍＬ中の肉由来のペプトン５．５ｇ、および強制経口投与細菌１０ｍＬを経口投与された。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１（５×１０^１１ＣＦＵ）強制経口投与株をＮＨＰ１−３に投与した。ＬＡＡＤを含まないＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００１（５×１０^１１ＣＦＵ）をＮＨＰ４‐６に投与した。両方の株は製剤緩衝液に懸濁された（予めバイオリアクター中で増殖および活性化され、氷上で解凍された）か、または製剤緩衝液のみをモックとして用いた。同時に、ＮＨＰ１〜１０は全て、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与された後、５ｍＬの水でフラッシュされた。動物は、静脈穿刺によって０、０．５、１、２、４および６時間で採血された。投与後６時間で、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。結果を図２４Ａおよび図２４Ｂに示すが、ＬＡＡＤの発現がＰｈｅのＰＡＬ代謝に対して負の効果を有さなかったことが確認される。

実施例７５：非ヒト霊長類（ＮＨＰ）による経口トレーサ試験
活性をさらに特徴づけるために、経口トレーサ試験が実施された。Ｔ＝０で、尿パンを空にし、ＮＨＰは１１ｍＬ中の肉由来のペプトン５．５ｇ、４ｍＬのＤ５−フェニルアラニン（２０ｍｇ／ｍＬ）、および１０ｍＬの細菌（５．２×１０^１１ＣＦＵのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１）を強制経口投与された。同時に、ＮＨＰ１〜１０は全て、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与された後、２ｍＬの水でフラッシュされた。動物は、静脈穿刺によって０、０．５、１、２、４および６時間で採血された。投与後６時間で、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。図２５は、投与時の血中Ｐｈｅレベルの大きなスパイクを示している。

経口トレーサ試験コントロールについては、Ｔ＝０で、尿パンを空にし、ＮＨＰは１１ｍＬ中の肉由来のペプトン５．５ｇ、４ｍＬのＤ５−フェニルアラニン（２０ｍｇ／ｍＬ）、および１０ｍＬの製剤緩衝液を強制経口投与された。同時に、全てのＮＨＰは、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与された後、２ｍＬの水でフラッシュされた。動物は、静脈穿刺によって０、０．５、１、２、４および６時間で採血された。投与後６時間で、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。

図２５の結果は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２による強制経口投与がＰｈｅを効果的に代謝し、コントロール投与量において観察された血中Ｐｈｅレベルのスパイクを低減することを示している。

実施例７６：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の用量依存的応答
４つの研究により、タンパク質が豊富な食事後のＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の単回投与後、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＰｈｅの用量依存的な変換の成功と、血漿バイオマーカーｔ−ケイ皮酸（ＴＣＡ）および馬尿酸（ＨＡ）の産生が確認された。

試験１：Ｔ＝０で、尿パンを空にし、１０匹のＮＨＰに、１１ｍｌの水中の肉由来のペプトン５．５ｇを経口投与した。ＮＨＰ１−５に、４ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（３．６×１０^１１ＣＦＵ）を強制経口投与した。ＮＨＰ６−１０に、４ｍＬの製剤緩衝液、２ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（１．８×１０^１１ＣＦＵ）を強制経口投与した後、６ｍＬの製剤緩衝液を強制経口投与した。同時に、ＮＨＰ１〜１０は全て、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与された後、５ｍＬの水でフラッシュされた。動物は、静脈穿刺によって０、０．５、１、２、４および６時間で採血された。投与後６時間で、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。

試験２：１０匹のＮＨＰに、１１ｍＬ中の肉由来のペプトン５．５ｇを経口投与した。ＮＨＰ１〜５に、８ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（７．２×１０^１１ＣＦＵ）細菌株を強制経口投与した。ＮＨＰ６〜１０に、１ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（９．０×１０^１０ＣＦＵ）を強制経口投与した後、７ｍＬの製剤緩衝液を強制経口投与した。同時に、ＮＨＰ１〜１０の全ては、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与された後、水でフラッシュされた。動物は、静脈穿刺によって０、０．５、１、２、４および６時間で採血された。投与後６時間で、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。

試験３：１０匹のＮＨＰに、１１ｍＬ中の肉由来のペプトン５．５ｇを経口投与した。ＮＨＰ１〜５に、製剤緩衝液で希釈した８ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（２．３×１０^１０ＣＦＵ）を強制経口投与した。ＮＨＰ６〜１０に、製剤緩衝液で希釈した８ｍｌの希釈ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（４．５×１０^１０ＣＦＵ）を強制経口投与した。同時に、ＮＨＰ１〜１０は全て、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与された後、５ｍＬの水でフラッシュされた。動物は、静脈穿刺によって０、０．５、１、２、４および６時間で採血された。投与後６時間で、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。ＮＨＰ１〜１０のすべてを前夜絶食させた。

試験４：１０匹のＮＨＰに、１１ｍＬ中の肉由来のペプトン５．５ｇを経口投与した。ＮＨＰ１〜５に、８ｍｌの希釈ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（３．３×１０^９ＣＦＵ）を強制経口投与した。ＮＨＰ６〜１０に、８ｍＬの希釈ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（１．１×１０^１０ＣＦＵ）を強制経口投与した。同時に、ＮＨＰ１〜１０は全て、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムを投与された後、５ｍＬの水でフラッシュされた。動物は、静脈穿刺によって０、０．５、１、２、４および６時間で採血された。投与後６時間で、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。ＮＨＰ１〜１０のすべてを前夜絶食させた。

図１１７Ａ、１１７Ｂ、１１７Ｃ、および１１７Ｄに示す結果は、Ｐｈｅ代謝が９×１０^１０ＣＦＵ以上の用量で明らかであったことを示している。さらに、Ｐｈｅの用量依存的変換と、バイオマーカーＴＣＡおよび馬尿酸の産生が観察された。

実施例７７：ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２による非ヒト霊長類におけるカゼイン試験
Ｐｈｅ、ＴＣＡ、およびＨＡ消費を発現させるために、ペプトン（小ペプチドで構成される）をカゼイン（全タンパク質）で置換することの有効性が評価された。

Ｔ＝０で、尿パンを空にし、ＮＨＰに２８ｍｌのカゼイン（４．５ｇ）／重炭酸塩／Ｄ５−フェニルアラニン（２５ｍｇ；８ｍｇ／ｋｇ）を強制経口投与した。ＮＨＰ１〜５にはさらに、３．５ｍＬのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（５×１０^１１ＣＦＵ）を強制経口投与し、ＮＨＰ６〜１０には、強制経口投与によって３．５ｍＬの製剤緩衝液を投与した。同時に、ＮＨＰに２ｍＬの水によるフラッシュを投与した。動物は、静脈穿刺によって０、０．５、１、２、４および６時間で採血された。投与後６時間で、尿収集パンを取り出し、内容物をメスシリンダーに注ぎ、５ｍｌの体積を計測した。結果を図１１８Ａ−１１８Ｃに示す。

この研究の結果は、本開示の遺伝子操作された細菌株が、自然に消化されたＰｈｅを消費することができ、Ｄ５−Ｐｈｅの消費時にコントロールで観察される血中Ｐｈｅのスパイクを防ぐことができることを実証している。

実施例７８：Ｐｈｅ代謝は臨床的に関連している
非ヒト霊長類において開示された研究は、Ｐｈｅ代謝の関連性と、それがＰＫＵ患者の食事に及ぼし得る重大な影響を実証している。米国医学研究所（ＴｈｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ）は、フェニルアラニンが８０〜９０ｍｇ／ｇ全タンパク質であると想定される食事基準摂取量を確立した。ヒトに推奨されるタンパク質の摂取量は５０ｇである（２０００カロリーの食事の場合）。無制限のアメリカの食事は、平均して、約１００ｇの全タンパク質（男性）と約７０ｇの全タンパク質（女性）を提供する。従って、無制限の食事は、約６〜９ｇのフェニルアラニンを提供する。

４歳を超えるＰＫＵ患者に推奨されるフェニルアラニン消費量は、２００〜１１００ｍｇ（Ｖｏｃｋｌｅｙ、ｅｔａｌ．２０１４、その全内容は参照により本明細書に援用される）、または約＜１０ｇタンパク質／日である。上記の研究に基づいて、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の最高投与量は、患者の１日当たり３回の５×１０^１１投与量に推定することができる（ＮＨＰにおける尿中ＨＡの３５％回収を仮定）。前記投与量は、ヒトにおける約２５ｇの食事性タンパク質摂取量（７０ｋｇのヒトでは２５ｍｇ／ｋｇ＝１．７ｇ）をサポートする、Ｐｈｅの毎日の代謝を予測する。したがって、Ｐｈｅの投与量は、無制限の食事後のＰＫＵ患者が２４時間で受けるＰｈｅ摂取量の約２５％である（図２８）。これは、１日の推奨タンパク質摂取量の約５０％である（ＵＳＲＤＡ参照；無制限のアメリカの食事が、平均して約１００ｇ（男性）および約７０ｇ（女性）の全タンパク質を提供すると仮定）。ＰＫＵ患者の場合、これにより、タンパク質摂取量が２．５倍に増え、ＰＫＵ患者の食事およびライフスタイルが解放される。

いくつかの実施形態では、本開示の細菌で処置すると、ＰＫＵ患者は１日当たりの食事性タンパク質摂取量を１０ｇ超（約１０ｇ〜約３０ｇ、約１０ｇ〜約２５ｇ、約１０ｇ〜約２０ｇ、約１０ｇ〜約１５ｇ）に増やすことができる。いくつかの実施形態では、本開示の細菌で処置すると、ＰＫＵ患者は１日当たりの食事性タンパク質摂取量を約１５ｇ、約２０ｇ、または約２５ｇに増やすことができる。

いくつかの実施形態では、本開示の遺伝子操作された細菌で処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取量を約２．５倍に増やすことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌で処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取量を約２．０倍に増やすことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌で処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取量を約１．５倍に増やすことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌で処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取量を約１．０倍に増やすことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌で処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取量を約３倍、３．５倍、または４倍に増やすことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌で処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取量を約５０％増やすことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌で処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取量を約５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜１００％増やすことができる。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細菌で処置すると、ＰＫＵ患者は毎日のタンパク質摂取量を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、および９０％〜１００％増やすことができる。

実施例７９：様々な濃度のジアミノピメリン酸における大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７のＤＡＰ栄養要求株ＳＹＮ７６６の増殖の特性評価
細菌の増殖および分裂に必要なＤＡＰの最小量を決定するために、ＥｃＮのＤＡＰ栄養要求株であるＳＹＮ７６６の増殖を、ある範囲のＤＡＰ濃度でのインキュベーションによって特性評価した。

全ての細菌培養は、−６５℃以下で保存されたグリセロールストックから開始された。細菌は、１００μｇ／ｍＬのＤＡＰを添加したＬＢブロス中で、３７℃、２５０ｒｐｍで振盪しながら、１４ｍＬ培養チューブ中で一晩増殖させた。次いで、一晩培養物を、様々なＤＡＰ濃度のＬＢ１００μＬを含む９６ウェルプレートのウェルで１：１００に希釈した。

全ての実験において、９６ウェルプレートをパラフィルムで密封し、Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＮｅｏＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、バーモント州）で分析した。プレートを振盪しながら３７℃で９６０分間インキュベートし、ＯＤ_６００を１０分毎に測定した。

データをＧｅｎ５（商標）ソフトウェアバージョン２．０６（ＢｉｏＴｅｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ．、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、バーモント州）で収集し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌにエクスポートして平均および標準誤差を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン７．０３（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、ＳａｎＤｉｅｇｏ、カリフォルニア州）で処理した。

ＥｃＮのＤＡＰ栄養要求株であるＳＹＮ７６６を分析して、増殖に必要なＤＡＰ濃度を決定した；データを図３２に示す。５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの濃度のＤＡＰを含む液体培地において、ＳＹＮ７６６は３５０分間指数関数的に増殖した後、ＯＤ_６００が約１で静止期に入った。２５μｇ／ｍＬのＤＡＰ濃度では、細胞は２００分間増殖し、ＯＤ_６００が０．１５に達した後、減少した。増殖は６００分後に再開し、約０．８の最終ＯＤ_６００に達した。これは、ＤＡＰ濃度が少なくとも５０μｇ／ｍＬである場合よりも有意に少ない総細胞量であった。６μｇ／ｍＬおよび１２μｇ／ｍＬのＤＡＰでは、ＳＹＮ７６６は約１８０分間指数関数的に増殖した後、実験の残りの期間、減少するＯＤ_６００を示した。ＤＡＰ濃度が６μｇ／ｍＬ未満であった場合、ＳＹＮ７６６は約１００分間増殖を示した後、実験の残りの期間、減少するＯＤ_６００を示した。

実施例８０：ジアミノピメリン酸を含まないＬＢ増殖培地における大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７の様々な株の増殖の特性評価
ＥｃＮの様々な改変株を、ＤＡＰを含まない培地で増殖させ、ＤＡＰ栄養要求株および原栄養株の増殖特性を確認した。実施例７９に記載したものと同様の増殖条件を使用した。フェニルアラニンを消費するように改変されたＥｃＮの様々な株を、ＤＡＰの非存在下および存在下で増殖するそれらの能力について分析した。結果を図３３に示す。非栄養要求株ＳＹＮ００１、ＳＹＮ‐ＰＫＵ９０１およびＳＹＮ３２８２は、約４００分間指数関数的に増殖した後、ＯＤ_６００が約１．２で静止期に入った。同様の条件下で、ＤＡＰ栄養要求株ＳＹＮ７６６、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２は、最初の９０分間は接種ＯＤ_６００の約０．０１０以内にとどまり、その後減少を示し始め、ＯＤ_６００が約０．００５で実験を終了した。これは、ｄａｐＡを欠失させると、ＤＡＰの外部供給源の非存在下で増殖が停止することを示している。ＳＹＮ３２８２におけるＰｈｅ分解に関与する遺伝子の存在は、野生型株と比較して増殖に影響を与えなかった。ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００１およびＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２におけるＤＡＰ栄養要求性とＰｈｅ分解に関与する遺伝子との組合せは、ＤＡＰ栄養要求性のみ（ＳＹＮ７６６）で観察された増殖障害に影響を与えなかった。これらの結果は、ＤＡＰ栄養要求性がこれらの操作された株の増殖および生存を調節する主な要因であることを示している。

実施例８１：１００μｇ／ｍＬジアミノピメリン酸を含むＬＢ増殖培地での大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７の様々な株の増殖の特性評価

ＥｃＮの様々な改変株を、実施例７９に記載されているものと同一の増殖条件を使用して、１００μｇ／ｍＬのＤＡＰを含む培地中で増殖させた。実施例８０の結果とは対照的に、１００μｇ／ｍＬのＤＡＰを添加したＬＢ中で増殖させた場合、試験したＥｃＮ株の全てが同等の増殖を示した（図３４参照）。非栄養要求株ＳＹＮ００１、ＳＹＮ‐ＰＫＵ９０１およびＳＹＮ３２８２と、栄養要求株ＳＹＮ７６６、ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００１およびＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２は、約４００分間指数関数的に増殖した後、ＯＤ_６００が約１．４で静止期に入った。

実施例８２：経口投与後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける操作された大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７の糞便排泄およびクリアランス

この試験の主な目的は、野生型ＥｃＮと比較して、ＤＡＰ栄養要求性および／またはＰｈｅ分解活性を含む株の糞便排泄の動態を決定することであった。この研究に利用されたＥｃＮ株には、野生型（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１）、ＤＡＰ栄養要求株（ＳＹＮ７６６）、Ｐｈｅ分解活性をコードするように遺伝子操作された株（ＳＹＮ３２８２）、およびＤＡＰ栄養要求性およびＰｈｅ分解活性の両方を有する株（ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１）が含まれた。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１は臨床候補株ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の代理であるが、選択培地上にプレーティングすることによって、腸内容物および生体組織中の他の微生物叢からそれを単離することを可能にするクロラムフェニコール耐性カセットを含む。ＳＹＮ３２８２はＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１と同一であるが、ＤＡＰ栄養要求性を有していない。この目的のために、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの体重を測定し、体重によって３つの処置群（それぞれｎ＝５）にランダム化した。各群は、約３×１０^９ＣＦＵ／株（２００μＬ／用量）で２つの混合菌株を含む単回経口投与を受ける。群１はＤＡＰ栄養要求性の効果を調べるために、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１およびＳＹＮ７６６を投与され、群２はＰｈｅ分解活性の効果を調べるために、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１およびＳＹＮ３２８２を投与され、群３はＤＡＰ栄養要求性およびＰｈｅ分解活性の両方の併用効果を調べるために、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１およびＳＹＮ３２８２を投与された。

投与前に、糞便サンプルをＴ＝０で個々のマウスから収集し、連続微量希釈プレーティングによって処理して、もしあるならば、群内で投与される細菌株に選択的なＬＢ寒天プレート上で生存可能なＣＦＵのベースラインレベルを決定した。次いで、Ｔ＝０時間での糞便収集の直後に細菌用量を投与した。指定された時点で糞便を収集するために、回収可能な糞便サンプルが産生されるまで、各マウスを小さな空のピペットチップボックスに隔離した。サンプルを２ｍｌのエッペンドルフチューブに移した。隔離から３０分以内にサンプルが産生されなかった場合、その動物についての時点は分析から除外された。投与後４、６、８、２４、３０、および４８時間に、各マウスから糞便ペレットを収集し、秤量した。

秤量した糞便ペレットの処理のために、１ｍｌのＰＢＳを各サンプルに添加し、使い捨てペレット乳棒（Ｋｉｍｂｌｅ、７４９５２１−１５０）を使用して、手動でホモジェナイズした。次に、サンプルを最大速度で１０〜２０秒間ボルテックスした。１０μＬの微量希釈液を使用して、サンプルを６桁にわたって１：１０に希釈した。これらの希釈液１０μＬと未希釈糞便ホモジネートを、適切な選択的ＬＢ寒天プレート上にプレーティングした。必要に応じて抗生物質またはＤＡＰを添加したＬＢ寒天上に希釈物をプレートティングした（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１＝ストレプトマイシン３００μｇ／ｍＬ；ＳＹＮ３２８２＝クロラムフェニコール３０μｇ／ｍＬ；ＳＹＮ７６６／ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１＝クロラムフェニコール３０μｇ／ｍＬおよびＤＡＰ１００μｇ／ｍＬ）。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、次の日にコロニーを手動でカウントした。プレートを３７℃±２℃で一晩インキュベートした。コロニーは、１０個以上２００個以下の個々のコロニーを含む希釈液において手動でカウントされた。最終的なＣＦＵ数は、糞便ホモジネートのＣＦＵ／ｍＬの計算のためにカウントされたコロニー数を乗じた希釈係数を用いた逆算によって決定された。この値を糞便ペレットの重量で割って、ＣＦＵ／ｍｇ糞便を算出した。

次に、もしあれば、それらの同質遺伝子の親と比較した改変ＥｃＮ株における突然変異／操作の効果を調べた。各時点で排泄された各株の量を、初期用量におけるその株のＣＦＵの数で割った。この正規化を用いて、試験群内の２つの株を、排泄およびクリアランス動態について直接的に比較することができた。

結果を図３５Ａ〜３５Ｃに示す。マウスのいずれについても、投与前（Ｔ＝０時間）の糞便サンプルにおいて選択培地上でＣＦＵは検出されず、投与後に検出されたＣＦＵが、マイクロバイオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）からのバックグラウンド増殖ではなく、ＥｃＮ由来株に起因することを実証している。３つの群すべてにおいて、すべての細菌株は投与後４時間で糞便中のピーク量に達し、時間の経過とともに着実に減少した。２４時間までに、糞便中の細菌数は、全ての株で３〜４桁減少した。３０時間までに、群１および３からの少なくとも２匹のマウス、ならびに群２のすべてのマウスは、糞便中に検出可能なＥｃＮ由来細菌を含んでいなかった。４８時間までに、全てのＥｃＮ由来細菌が糞便から除去された。すべての細菌について同様の排泄率が観察されたので、改変ＥｃＮ株における排泄の動態に明らかな違いはなく、ＤＡＰ栄養要求性（ＳＹＮ７６６、群１）、Ｐｈｅ分解活性（ＳＹＮ３２８２、群２）、およびそれらの組合せ（ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１、群３）のいずれも、野生型ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１株と比較して、マウスモデルにおける腸輸送時間または株生存に有意な影響を及ぼさないことが示された。

結論として、ＥｃＮにおけるＤＡＰ栄養要求性および／またはＰｈｅ分解活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの糞便からの細菌の生存または消失を経時的に変化させなかった。経口投与されたすべてのＥｃＮ由来細菌株は、遺伝子型にかかわらず、４８時間以内にマウスの糞便から除去され、ＥｃＮおよびその派生物は長期間生存できないことを示唆している。

実施例８３：健康なマウスにおける大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７の派生物ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１のｉｎｖｉｖｏ生存

この薬理学的研究の目的は、雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、同一のジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）栄養要求性およびフェニルアラニン（Ｐｈｅ）分解要素を含有するＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の代理株である遺伝子操作ＥｃＮ誘導体ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１と比較して、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ（ＥｃＮ）野生型株ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１の生存率、胃腸管（ＧＩ）分布または完全クリアランスまでの時間の違いを評価することであった。ＧＩ分布、輸送（ｔｒａｎｓｉｔ）およびクリアランス動態は、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１またはＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１の９×１０^９ＣＦＵの単回経口投与後に、雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの複数のＧＩセグメントにおいて、４８時間にわたってコロニー形成単位（ＣＦＵ）を数えることによって測定された。

この研究に利用されたＥｃＮ株は、野生型コントロールであるＳＹＮ−ＰＫＵ９０１と、Ｐｈｅ分解活性およびＤＡＰ栄養要求性をコードするように遺伝子操作された株であるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１とを含んでいた。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１は臨床候補株ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の代理であるが、生物体組織からの選択プレーティングを可能にするクロラムフェニコール耐性カセットを含む。

雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの体重を測定し、体重によって１２の処置群（それぞれｎ＝３）およびコントロール群（ｎ＝３）にランダム化した。コントロール群のマウス（Ｔ＝０）を、二酸化炭素窒息とそれに続く頸部脱臼によって犠牲にした。胃、小腸（ＳＩ）、盲腸、および結腸を注意深く切除した。ＳＩをさらに３つの等しい長さのセクション（上部、中間、および下部）に分割した。各臓器セクションを氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）０．５ｍＬでフラッシュし、流出液を別々の１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに集めた。ＰＢＳ／流出液サンプルを秤量し、選択培地上での連続希釈プレーティングによって処理するまで氷上で維持して、各腸セグメントの流出液における生存可能なＣＦＵを決定した。１００ｍＭ重炭酸ナトリウムを含む製剤では、処置群の動物に９×１０^９ＣＦＵのＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（６群）またはＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１（６群）を経口投与した。投与後０．２５、０．５、１、４、２４、および４８時間で、ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１−およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１−処置群を犠牲にし、組織をコントロール群と同じ方法で処理した。

ＣＦＵ／ｍＬを計算するために、秤量した各流出液サンプル１０μＬを、滅菌９６ウェルプレート中のＰＢＳ中で実施された１０倍微量希釈系列で使用した。１０μＬの未希釈流出液および希釈液を、必要に応じて抗生物質またはＤＡＰを添加したＬＢ寒天培地上にプレーティングした（ＳＹＮ−ＰＫＵ９０１＝ストレプトマイシン３００μｇ／ｍＬ；ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１＝クロラムフェニコール３０μｇ／ｍＬおよびＤＡＰ１００μｇ／ｍＬ）。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、次の日にコロニーを手動でカウントした。

ＣＦＵを決定するために、カウントは、少なくとも１０個以上２００個以下の個々のコロニーを含む希釈液中のコロニーを手動でカウントすることによって収集された。コロニーが最低希釈（未希釈流出液のプレーティング）でのみ観察された場合、１０個未満であっても、すべてのコロニーがカウントおよびスコアリングされた。最終的なＣＦＵ数は、カウントされたコロニーの数と収集された流出液の体積の両方を乗じた希釈係数を用いた逆計算によって決定された。

図３６Ａ〜Ｆの結果を参照。細菌を投与されなかったマウスの流出液サンプルでは、選択培地上にＣＦＵは検出されず、投与後の流出液において検出されたＣＦＵが微生物叢からのバックグラウンド増殖ではなく、ＥｃＮ由来株に起因することを実証していた。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１またはＳＹＮ−ＰＫＵ９０１（コントロール）のいずれかを投与されたマウスの胃、上部小腸、中小腸、下部小腸、盲腸および結腸から得られた流出液において、時間の経過に伴う生存率およびＧＩ分布は、最初の２４時間にわたって非常に類似していた。投与４８時間後では、どちらの細菌についてもＣＦＵは検出されず、この時点までに完全にクリアランスされたことを示している。

結論として、ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００１のＤＡＰ栄養要求性および／またはフェニルアラニン分解活性は、ＳＹＮ‐ＰＫＵ９０１コントロール株と比較して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胃腸管からの完全なクリアランスまでの生存、ＧＩ分布または時間を変化させなかった。４８時間以内に経口投与されたすべてのＥｃＮ由来株の完全なクリアランスは、ＥｃＮおよびその派生物が長期間生存可能でなかったことを示唆している。

実施例８４：バイオリアクターで増殖させた大腸菌株ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２におけるフェニルアラニンのトランス−ケイ皮酸およびフェニルピルビン酸への分解

バイオリアクター中で増殖および活性化された改変大腸菌Ｎｉｓｓｌｅ１９１７（ＥｃＮ）ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２株におけるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の代謝産物トランス−ケイ皮酸（ＴＣＡ）およびフェニルピルビン酸（ＰＰ）への変換を、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）およびＬ‐アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）活性の尺度として決定した。追加の目的には、バイオリアクターで活性化されたＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が、Ｐｈｅ分解の基質としてＰｈｅ含有ペプチドまたは全タンパク質の複合混合物（ｃｏｍｐｌｅｘｍｉｘｔｕｒｅｓ）を使用できるかどうかを決定することが含まれていた。

フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の治療的処置を目的したＰｈｅ分解株であるＥｃＮ由来株ＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２は、臨床試験のためのＳＹＮ‐ＰＫＵ‐２００２のスケールアップに使用することを目的したプロセスに従って、バイオリアクター中で増殖および活性化された。５Ｌスケールで実施されたこのプロセスには、培養物の撹拌速度の制御によって達成された低溶存酸素（ＤＯ）環境の作製が含まれていた。低ＤＯは、ＰＡＬおよび高親和性フェニルアラニントランスポーターＰｈｅＰをコードする遺伝子の染色体に組み込まれたコピーの発現を活性化した。低ＤＯへの降下後、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；１ｍＭ）を添加してＰＡＬの追加コピーの発現を活性化し、Ｌ−アラビノース（最終濃度０．１５％）を添加してＬＡＡＤの発現を活性化した。高密度増殖後、細胞を濃縮し、グリセロールベースの製剤緩衝液中にて６５℃以下で凍結した。

１×１０^８の活性化細胞を、５０ｍＭのＰｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｖａｌ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、もしくはＧｌｙ−Ｐｈｅペプチドを含むアッセイ培地中で、または肉、トリプトン、もしくは全カゼインパウダー（ｗｈｏｌｅｃａｓｅｉｎｐｏｗｄｅｒ）由来の２０ｇ／Ｌのペプトン中で、３７℃で好気的にインキュベートした。上清サンプルを３０分および６０分で除去し、Ｐｈｅ、ＴＣＡ、およびＰＰの濃度をＬＣＭＳ／ＭＳによって決定した。

図３１ＡおよびＢの結果を参照。遊離Ｐｈｅを基質として使用した場合、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のＰＡＬおよびＬＡＡＤ活性の両方がｉｎｖｉｔｒｏで検出され得るが、提供された基質がＰｈｅ含有ペプチドの形態である場合、ＰＡＬ活性のみが観察され、ＬＡＡＤはＰｈｅの他の供給源よりも遊離アミノ酸へのアクセスに優れることが実証された。未消化カゼインタンパク質を基質として使用した場合、ＰＡＬまたはＬＡＡＤ活性は観察されなかった。

これらのデータは、バイオリアクター中で増殖させたＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が、ＰＡＬおよびＬＡＡＤＰｈｅ分解経路の両方の増殖および活性化が可能であることを実証しており、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が活性化されたバルク薬物の大量生産により適していることを示唆している。さらに、哺乳動物の胃腸管における正常な消化過程の間に遊離Ｐｈｅに加えて産生される可能性が高いＰｈｅ含有ペプチドの複合混合物（ｃｏｍｐｌｅｘｍｉｘｔｕｒｅｓ）は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のＰＡＬ成分によって代謝されるが、ＬＡＡＤ成分によっては代謝されないことが実証された。

実施例８５：健康な非ヒト霊長類におけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の用量応答試験
健康な雄のカニクイザルにおけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２のフェニルアラニン代謝活性は、３．３×１０^９〜７．２×１０^１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）の範囲の用量レベルでＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を投与した後、血漿および尿中のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）およびその代謝産物のレベルを測定することによって特性評価された。

この試験では、健康な雄のカニクイザル（２．８〜４．５ｋｇ）を一晩絶食させた。投与前に、血漿サンプル（ヘパリン）を採取して、非標識Ｐｈｅおよび下流代謝産物のベースラインを確立した。動物に、強制経口投与によって、１１ｍＬのペプトン（５．５ｇ）、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２（３．３×１０^９〜７．２×１０^１１ＣＦＵ／用量の範囲の用量）、および５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウムの連続溶液を投与した。投与後０．５、１、２、４および６時間で血漿を収集し、分析まで凍結した。研究アーム中に収集された血漿サンプルは、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて、Ｐｈｅ、フェニルピルビン酸（ＰＰ）、トランス−ケイ皮酸（ＴＣＡ）、および馬尿酸（ＨＡ）の存在について分析された。投与後６時間にわたって尿を収集し、体積を測定し、５ｍＬのアリコートを凍結し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで保存した。

健康なサルへのペプトンの投与は、投与後約１時間でピークに達する血漿フェニル濃度のスパイクをもたらした（図２６Ｄ参照）。５．５ｇのペプトンを投与された健康なサルにＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２を経口投与すると、このＰｈｅスパイクが鈍化した。全範囲にわたって完全に用量に比例するわけではないが、Ｐｈｅの血漿濃度は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２投与群で、特に９×１０^１０ＣＦＵ投与レベルの以上で一般的に低かった。ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２投与後のＰｈｅの減少と同時に、ＴＣＡ（Ｐｈｅのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ代謝の直接産物、図２６Ｃ参照）およびＨＡ（ＴＣＡの代謝産物、図２６Ｂおよび図３８参照）の血漿濃度は用量依存的に増加した；しかしながら、最高用量（低用量は測定されなかった）で処置されたサルにおいて、ＰＰ（ＰｈｅのＬ−アミノ酸デアミナーゼ代謝の直接産物）の検出可能な血漿濃度はなかった。馬尿酸は尿中に急速に排泄されることが知られており、血漿ＴＣＡおよびＨＡ濃度の増加と一致して、尿中ＨＡ排泄は一般的に用量依存的に増加した（図２６Ａを参照のこと、最高用量のサルの尿においてＰＰは検出されなかった）。

これらの試験は、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２が雄のカニクイザルにおいてＰｈｅを代謝することができることを実証している。ＰＰは、最高用量で処置されたサルの血漿および尿では検出されなかった。フェニルアラニン代謝産物ＴＣＡおよびＨＡの血漿濃度が用量依存的に増加し、６時間にわたって尿中ＨＡ排泄が用量依存的に増加した。このことは、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２の２つのＰｈｅ分解酵素の間で、ＰＡＬがサルにおけるＰｈｅ代謝の大部分を担っており、このモデルではＬＡＡＤからの寄与はほとんどまたは全くないことを示している。さらに、この試験は、ＨＡおよびＴＣＡが将来の臨床研究においてＳＹＮ−ＰＫＵ−２００２活性のバイオマーカーとして潜在的に役立つ可能性があることを示している。

実施例８６：非ヒト霊長類におけるＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１の胃腸管特性評価
健康なカニクイザルの胃腸管の様々なセグメント内でのＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１のフェニルアラニン代謝活性およびコロニー形成を特性評価するために、２つの試験を行った。第１の試験では、動物を、それぞれ３匹の雌からなる２つの群に分け、５．５グラムのペプトン、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウム、２５ｍｇ／ｋｇのＤ５−フェニルアラニン、およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１またはブランクコントロールのいずれかを投与した。投与の２時間後、動物を安楽死させ、サンプルを収集した。第２の試験では、３匹の雄のサルからなる１つの群に、５．５グラムのペプトン、５ｍＬの０．３６Ｍ重炭酸ナトリウム、２５ｍｇ／ｋｇのＤ５−フェニルアラニン、およびＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１を投与し、投与の０．５時間後に動物を安楽死させ、サンプルを収集した。

両方の試験において、動物は１日目に１回の強制経口投与によって試験品（下表を参照のこと）を投与された。キャップをした細菌チューブを、各用量投与の前に３回反転させた。用量製剤は、プラスチックシリンジに取り付けられた使い捨てカテーテルを用いた強制経口投与によって投与された。投与後、強制経口投与チューブを５ｍｌの動物用飲料水で動物の胃内にリンスした。各動物は、清潔な強制経口チューブで投与された。投与の最初の日を１日目とした。動物は用量投与のために一時的に拘束され、鎮静されなかった。

試験品およびコントロール品の同定

製剤緩衝液およびＤ５−フェニルアラニン（２０ｍｇ／ｍＬ）は使用するまで４℃で維持され、使用する時点でアリコートが取り出され、投薬前に少なくとも３０分間室温まで温められた。重炭酸ナトリウム（０．３６Ｍ）は、周囲温度で保存および投与された。

以下の表に示されているのは、動物の各群に使用される用量およびレジメンである。

実験デザイン

５．５ｇのペプトンの投与量は、１日あたり１００ｇのタンパク質を消費する典型的な６０ｋｇの個体に基づいており、これをシミュレートして、給餌後の血中のＰｈｅと尿中のＰｈｅの代謝産物を測定することができるようにしたかったのである。２５ｍｇ／ｋｇのＤ５−フェニルアラニンの経口投与量が選択されたのは、このレベルで投与された場合、マウスの尿中に測定可能なレベルのＤ５−馬尿酸が得られるためである。

両方の試験において、動物を一晩絶食させ、投与前の１日目に体重を測定した。抗凝固剤としてヘパリンを用いて大腿静脈から血液サンプル（５ｍｌ）を採取し、粉砕した湿った氷の上に置いた後、遠心分離した。遠心分離後、得られた血漿を分離し、２つのアリコートに移し、ドライアイス上で直ちに凍結し、−８０℃に設定したフリーザーに移した。サンプルが、分析のために別の施設にドライアイス上で送られた。

動物は、市販の獣医学的安楽死溶液の経皮カテーテルセットアップを使用して、尾静脈を介した静脈注射により、投与後２時間（試験１）または０．５時間（試験２）で安楽死させた（鎮静なし）。

試験のための最終手順

組織の採取および保存の表で特定される組織は、示されているようにすべての動物から採取された。

組織の採取および保存

失血後、胃と結腸をクランプした。追加のクランプを使用して、約３０ｃｍのセグメントで小腸を切除した。１０ｍＬの冷滅菌生理食塩水を胃に注入し、マッサージして内容物をほぐした。胃を開き、内容物をラベルの付いた５０ｍＬコニカルチューブに排出し、体積を記録した。約１ｍＬの内容物は、収集時にプレーティングするために分析施設に移された。残りの胃内容物を３つの異なるアリコートに分離した：１ｍＬ、１．６ｍＬ（凍結前にそのスポンサーにグリセロールを添加した）、および残り。残りの胃組織（全体およびラベル付きのジップロックバッグに収集したもの）は、内容物とともに同日宅配便（ドライアイスで凍結）によって分析施設に発送されるまでドライアイス上で凍結された。

小腸の約３０ｃｍの各セグメントに、１５ｍＬの冷滅菌生理食塩水を注入し、内容物をラベル付きの５０ｍＬコニカルチューブに収集し、体積を記録した。各セグメントからの約１ｍＬの内容物は、収集時にプレーティングするために分析施設に移された。残りの内容物を３つの異なるアリコートに分離した：１ｍＬ、１．６ｍＬ（凍結前にそのスポンサーにグリセロールを添加した）、および残り。小腸組織切片（ラベル付きのジップロックバッグに収集したもの）は、内容物とともに同日宅配便（ドライアイスで凍結）によって分析施設に発送されるまでドライアイス上で凍結された。

第１の試験では、２０ｍＬ以下の近位結腸内容物を、湿った氷上に維持した清潔で予め秤量されたガラス瓶に収集した（希釈せずに）。約１ｍＬの内容物は、収集時にプレーティングするために分析施設に移された。以下の２つの異なるアリコートを予め特定したチューブに移した：ドライアイス上で凍結した１ｍＬと１．６ｍＬ（凍結前にそのスポンサーにグリセロールを添加した）。次いで、結腸を開き、残りの内容物を取り出してガラス瓶に移した（以前に収集されたのが５０ｍＬ未満の場合）。組織をピンセットでつかみ、滅菌生理食塩水を含む洗面器内で穏やかにリンスした。次いで、清潔なスパチュラを用いて結腸組織をこすり取り、ラベル付きの予め秤量したガラス瓶に粘液を集めた。粘液サンプルは、分析施設に移されるまで湿った氷上に保管された。組織はジップロックバッグに（全体で）収集され、同日宅配便（ドライアイスで凍結）によって分析施設に発送されるまでドライアイス上で凍結された。

第２の試験では、１５ｍＬの冷滅菌生理食塩水を近位結腸に注入し、内容物をラベル付きの５０ｍＬコニカルチューブに収集し、体積を記録した。約１ｍＬの内容物は、収集時にプレーティングするために分析施設に移された。残りの内容物を３つの異なるアリコートに分離した：１ｍＬ、１．６ｍＬ（凍結前にそのスポンサーにグリセロールを添加した）、および残り。大腸組織（ラベル付きのジップロックバッグに収集したもの）は、内容物とともに同日宅配便（ドライアイスで凍結）によって以下の住所の分析施設に発送されるまでドライアイス上で凍結された。

胃腸管の各部分で測定されたＰｈｅレベルおよびＣＦＵカウントを図３８に示す。投与の２時間後および０．５時間後の両方で、フェニルアラニン濃度は胃で最も高く、消化管のさらに下部で徐々に低下することが明らかになった。投与２時間後には、１０％未満のフェニルアラニンが胃および十二指腸で認められた。投与の２時間後、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１は回腸および近位結腸で主に見出され、そこでは利用可能な基質はごくわずかである。このことは、ＳＹＮ−ＰＫＵ−２００１活性が基質の利用可能性によって制限され、したがって食物と共に摂取する必要があることを示唆している。

Claims

非天然フェニルアラニン代謝酵素（ＰＭＥ）をコードする１つ以上の遺伝子を含み、かつ１つ以上のファージゲノムを更に含む細菌であって、前記１つ以上のファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子は、１つ以上の突然変異を含む、細菌。
前記１つ以上の突然変異が以下から選択される、請求項１に記載の細菌：
ａ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の欠失；
ｂ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の挿入；
ｃ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の置換；
ｄ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の逆位；および
ｅ．ａ、ｂ、ｃ、およびｄのうちの２つ以上の組み合わせ。
請求項１または２に記載の細菌であって、前記１つ以上の突然変異は、前記細菌からのファージ粒子の放出を、前記１つ以上のファージゲノム中に前記１つ以上の標的化突然変異を有さない同じ細菌と比較して低減または防止する、細菌。
１つ以上のファージゲノムを含む細菌であって、前記ファージは、溶菌増殖、遺伝子の水平伝播、細胞溶解、ファージ構造、ファージアセンブリ、ファージパッケージング、組換え、複製、翻訳、ファージ挿入、およびそれらの組み合わせに関連する１つ以上のファージ遺伝子中に１つ以上の突然変異を含む、細菌。
前記１つ以上のファージ遺伝子は、プロテアーゼをコードする遺伝子、リシンをコードする遺伝子、毒素をコードする遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、ファージ翻訳関連タンパク質をコードする遺伝子、構造タンパク質遺伝子、基盤タンパク質遺伝子、バクテリオファージアセンブリ遺伝子、ポータル（ｐｏｒｔａｌ）タンパク質遺伝子、組換え遺伝子、インテグラーゼをコードする遺伝子、インベルターゼをコードする遺伝子、トランスポザーゼをコードする遺伝子、複製関連タンパク質をコードする遺伝子、プライマーゼをコードする遺伝子、ｔＲＮＡ関連タンパク質をコードする遺伝子、ファージ挿入遺伝子、接着部位遺伝子、パッケージング遺伝子、ターミナーゼをコードする遺伝子、テリオオシンをコードする遺伝子、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項４に記載の細菌。
前記突然変異は、脂質Ａ生合成（ＫＤＯ）２−（ラウロイル）−脂質ＩＶＡアシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、亜鉛ＡＢＣトランスポーター基質結合タンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーターＡＴＰａｓｅ、高親和性亜鉛トランスポーター膜コンポーネント、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＢ、ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼＲｕｖＡ、Ｈｏｌｌｉｄａｙジャンクションレゾルバーゼ、ジヒドロネオプテリン三リン酸ピロホスファターゼ（ｄｉｈｙｄｒｏｎｅｏｐｔｅｒｉｎｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、アスパルチル−ｔＲＮＡシンテターゼ、ヒドロラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＶ、ＭｓｇＡ、ファージ尾部タンパク質、尾部タンパク質、宿主特異的タンパク質、ペプチダーゼＰ６０、尾部タンパク質、尾部繊維タンパク質、マイナーテールタンパク質Ｕ（ＭｉｎｏｒｔａｉｌｐｒｏｔｅｉｎＵ）、ＤＮＡ切断−再結合タンパク質、ペプチダーゼＳ１４、カプシドタンパク質、ＤＮＡパッケージングタンパク質、ターミナーゼ、リゾチーム、ホリン、ＤＮＡアデニンメチラーゼ、セリンプロテアーゼ、抗終結タンパク質（ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ）、アンチリプレッサー、クロスオーバージャンクションエンドデオキシリボヌクレアーゼ、アデニンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＧｎｔＲファミリー転写調節因子ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ｃＩリプレッサー、未知の機能のドメイン（ＤＵＦ４２２２）、ＤＮＡリコンビナーゼ、多数の抗生物質耐性調節因子（ＭａｒＲ）、Ｐ２２における未知のｅａｄ様タンパク質、機能不明のタンパク質（ＤＵＦ５５０）、３’−５’エキソヌクレアーゼ、エキシシオナーゼ、インテグラーゼ、ｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、およびそれらの組み合わせをコードする遺伝子中にある、請求項４または５に記載の細菌。
前記１つ以上の突然変異が以下から選択される、請求項４〜６の何れか１項に記載の細菌：
ａ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の欠失；
ｂ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子への１つ以上のヌクレオチドの１つ以上の挿入；
ｃ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の置換；
ｄ．前記ファージゲノム中の１つ以上のファージ遺伝子の一部の配列または完全な配列の１つ以上の逆位；および
ｅ．ａ、ｂ、ｃ、およびｄのうちの２つ以上の組み合わせ。
前記１つ以上のファージゲノムは、前記細菌の自然状態において存在する、請求項４〜７の何れか１項に記載の細菌。
前記１つ以上のファージゲノムは、１つ以上の溶原性ファージ、欠陥ファージもしくはクリプティックファージ、またはサテライトファージをコードする、請求項４〜８の何れか１項に記載の細菌。
請求項４〜９の何れか１項に記載の細菌であって、前記１つ以上の突然変異は、前記細菌からのファージ粒子の放出を、前記１つ以上のファージゲノム中に前記１つ以上の標的化突然変異を有さない同じ細菌と比較して低減または防止する、細菌。
バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）株Ｎｉｓｓｌｅ、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）からなる群から選択されるプロバイオティクス細菌である、請求項４〜１０の何れか１項に記載の細菌。
前記１つ以上のファージゲノムは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ１ゲノム、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ２ゲノムおよび大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムのうちの１つ以上から選択される、請求項４〜１１の何れか１項に記載の細菌。
前記ファージゲノムは、大腸菌Ｎｉｓｓｌｅファージ３ゲノムであり、前記突然変異は、以下から選択される１つ以上の遺伝子内に位置するか、または以下から選択される１つ以上の遺伝子を含む、請求項１２に記載の細菌：
ＥＣＯＬＩＮ＿０９９６５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９７５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９８５、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９０、ＥＣＯＬＩＮ＿０９９９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０００５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１００９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１８５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２５５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２７５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２８０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０２９５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３００、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３０５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０３４０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０３４５。
前記突然変異は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の完全な欠失または部分的な欠失を含む、請求項１３に記載の細菌。
前記欠失は、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１１５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１２５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１３５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１４５、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１５０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６０、ＥＣＯＬＩＮ＿１０１６５、およびＥＣＯＬＩＮ＿１０１７０の完全な欠失、ならびにＥＣＯＬＩＮ＿１０１７５の部分的な欠失である、請求項１４に記載の細菌。
前記欠失は配列番号１３０を含む、請求項１５に記載の細菌。
前記欠失は配列番号１３０からなる、請求項１６に記載の細菌。
１つ以上の追加の遺伝子改変を含む、請求項１４に記載の細菌。
前記１つ以上の追加の遺伝子改変は、１つ以上の内因性遺伝子における１つ以上の突然変異を含む、請求項１８に記載の細菌。
前記１つ以上の追加の遺伝子改変は、１つ以上の非天然遺伝子の追加を含む、請求項１８に記載の細菌。
抗生物質耐性を更に含む、請求項１〜２０の何れか１項に記載の細菌。
請求項１〜２１の何れか１項に記載の細菌と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的に許容される組成物。
経口投与用に製剤化された、請求項２２に記載の組成物。
ａ）非天然フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をコードする１つ以上の遺伝子；
ｂ）非天然フェニルアラニントランスポーターをコードする１つ以上の遺伝子；および任意に、
ｃ）非天然Ｌ−アミノ酸デアミナーゼ（ＬＡＡＤ）をコードする１つ以上の遺伝子
を含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の細菌。
高フェニルアラニン血症または高フェニルアラニン血症に関連する疾患の処置のための薬剤の調製における、請求項１〜２１および２４の何れか１項に記載の細菌または請求項２２および２３の何れか１項に記載の組成物の使用であって、それを必要とする患者に投与するステップを含む、使用。
前記疾患は、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、瀬川病、進行性および不可逆性の神経学的欠損、精神遅滞、脳症、てんかん、湿疹、低成長、小頭症、振戦、四肢痙攣、低色素沈着および肝疾患からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
高フェニルアラニン血症または高フェニルアラニン血症に関連する疾患を処置するための薬剤の製造における、請求項１〜２１および２４の何れか１項に記載の細菌または請求項２２および２３の何れか１項に記載の組成物の使用。
前記疾患は、フェニルケトン尿症、古典的または典型的フェニルケトン尿症、異型フェニルケトン尿症、永続的軽度高フェニルアラニン血症、非フェニルケトン尿症高フェニルアラニン血症、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠損症、補因子欠損症、ジヒドロプテリジンレダクターゼ欠損症、テトラヒドロプテリンシンターゼ欠損症、瀬川病、進行性および不可逆性の神経学的欠損、精神遅滞、脳症、てんかん、湿疹、低成長、小頭症、振戦、四肢痙攣、低色素沈着および肝疾患からなる群から選択される、請求項２７に記載の使用。