JP2023114693A - 重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法 - Google Patents
重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】迅速かつ簡便に、ＩｇＭとＩｇＧとを区別して検出することができる重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出法を提供する。【解決手段】重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キットは、重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された組換え核酸タンパク質と、血液検体に暴露される検体反応部、及び血液検体中の重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核酸タンパク質に対する抗体を捕捉する捕捉部３１を有するクロマトグラフ媒体１０と、を備える。捕捉部３１は、抗体としてのＩｇＭ抗体と特異的に結合する抗ＩｇＭ抗体が固定化されたＩｇＭ抗体捕捉部３１ａ、及び抗体としてのＩｇＧ抗体と特異的に結合するＩｇＧ抗体捕捉分子が固定化されたＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂの少なくとも一方を備える。【選択図】図１
Description
特許法第３０条第２項適用申請有り アドレス：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｃｖｉｍ．ｏｒｇ／２０２１／、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｃｖｉｍ．ｏｒｇ／２０２１／ｐｒｏｇｒａｍ．ｈｔｍｌ、掲載日：令和３年２月９日 集会名、アドレス：第１７回日本獣医内科学アカデミー学術大会、オンライン開催 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｊｃｖｉｍ．ｏｒｇ／２０２１／、開催日（ウェブサイトでの公開日）：令和３年２月１９日
本発明は、重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法に関する。
重症熱性血小板減少症候群（ｓｅｖｅｒｅ ｆｅｖｅｒ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、以下「ＳＦＴＳ」ともいう）は、ブニヤウイルス科フレボウイルス属のＳＦＴＳウイルス（以下「ＳＦＴＳＶ」ともいう）によるマダニ媒介性の新興感染症である。ＳＦＴＳＶの感染例が中国、韓国、日本、ベトナム、及び台湾で報告されている。
ヒトにおけるＳＦＴＳは、発熱、筋肉痛、腹痛、意識障害、神経症状、又は多臓器不全等の症状を呈する。現在までに約６００名の感染が報告されており、致死率は約３０％と高い。
また、ＳＦＴＳは人獣共通感染症であり、ヒト、ネコ、及びイヌを含む多くの動物種がＳＦＴＳＶに感染し得るため、マダニと野生生物の間でウイルスが維持されている。中でもネコの発症例が３００例以上あり、ネコにおける致死率は約６０％と非常に高い。また、ＳＦＴＳＶに感染したネコ等の伴侶動物と濃厚接触した飼い主又は獣医療関係者の感染が報告されている。しかし、ＳＦＴＳは新興感染症であるため、多くの獣医師が診療経験を持たない。
現在、ＳＦＴＳの確定診断には、ＥＬＩＳＡ又はＲＴ－ＰＣＲが利用されている。しかし、いずれの検査も医療機関又は動物病院ではなく外部で行われるため診断に一定の時間を要する。特にネコ等の小動物においてはＳＦＴＳの進行が非常に速いため、迅速に診断し、早期に治療を開始することが重要である。したがって、一般の医療機関又は動物病院において検査が可能な迅速簡易検査法が求められている。
特許文献１には、重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キットが記載されている。当該キットは、重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核タンパク質（以下「核酸タンパク質」又は「ＮＰ」とも称する）に結合する抗体を、イムノクロマト法により検出することができる。したがって、一般の医療機関で使用することができ、ＳＦＴＳを迅速に診断することができる。
ＳＦＴＳＶに感染すると、まずＩｇＭ抗体が産生され、約２週間後にＩｇＧが産生される。上記特許文献１に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キットは、ＩｇＭとＩｇＧを区別して検出することができないため、対象が現在ＳＦＴＳウイルスに感染しているのか、過去に感染したことがあるために抗体が検出されるのかが判別できない。特にネコにおけるＳＦＴＳは進行が非常に速いため、現在ＳＦＴＳＶに感染していることを確認するには、ＩｇＧ抗体と区別してＩｇＭ抗体を検出することが特に重要である。また、ＳＦＴＳＶの中和抗体はＩｇＧ抗体であるため、ＳＦＴＳの個体が回復期に入ったことを確認するには、ＩｇＭ抗体と区別してＩｇＧ抗体を検出することが重要である。
本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであり、迅速かつ簡便に、重症熱性血小板減少症候群ウイルスに対するＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体とを区別して検出することができる重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出法を提供することを目的とする。
本発明の第１の観点に係る重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キットは、
重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された組換え核酸タンパク質と、
血液検体に暴露される検体反応部、及び前記血液検体中の重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核酸タンパク質に対する抗体を捕捉する捕捉部を有するクロマトグラフ媒体と、
を備え、
前記捕捉部は、前記抗体としてのＩｇＭ抗体と特異的に結合する抗ＩｇＭ抗体が固定化されたＩｇＭ抗体捕捉部、及び前記抗体としてのＩｇＧ抗体と特異的に結合するＩｇＧ抗体捕捉分子が固定化されたＩｇＧ抗体捕捉部の少なくとも一方を備える。
重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された組換え核酸タンパク質と、
血液検体に暴露される検体反応部、及び前記血液検体中の重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核酸タンパク質に対する抗体を捕捉する捕捉部を有するクロマトグラフ媒体と、
を備え、
前記捕捉部は、前記抗体としてのＩｇＭ抗体と特異的に結合する抗ＩｇＭ抗体が固定化されたＩｇＭ抗体捕捉部、及び前記抗体としてのＩｇＧ抗体と特異的に結合するＩｇＧ抗体捕捉分子が固定化されたＩｇＧ抗体捕捉部の少なくとも一方を備える。
また、前記検体反応部は、前記組換え核酸タンパク質を有する、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
前記ＩｇＧ抗体捕捉分子は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇである、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
前記組換え核酸タンパク質は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、
こととしてもよい。
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、
こととしてもよい。
また、前記組換え核酸タンパク質は、
発色分子で標識されている、
こととしてもよい。
発色分子で標識されている、
こととしてもよい。
また、前記血液検体は、ヒト、ネコ、又はイヌの血液検体である、
こととしてもよい。
こととしてもよい。
本発明の第２の観点に係る重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法は、
クロマトグラフ媒体上の捕捉部に捕捉された血液検体に含まれる重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核酸タンパク質に対する抗体を、前記抗体に結合した、重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された組換え核酸タンパク質を介して検出し、
前記捕捉部は、前記抗体としてのＩｇＭ抗体と特異的に結合する抗ＩｇＭ抗体が固定化されたＩｇＭ抗体捕捉部、及び前記抗体としてのＩｇＧ抗体と特異的に結合するＩｇＧ抗体捕捉分子が固定化されたＩｇＧ抗体捕捉部の少なくとも一方を備える。
クロマトグラフ媒体上の捕捉部に捕捉された血液検体に含まれる重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核酸タンパク質に対する抗体を、前記抗体に結合した、重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された組換え核酸タンパク質を介して検出し、
前記捕捉部は、前記抗体としてのＩｇＭ抗体と特異的に結合する抗ＩｇＭ抗体が固定化されたＩｇＭ抗体捕捉部、及び前記抗体としてのＩｇＧ抗体と特異的に結合するＩｇＧ抗体捕捉分子が固定化されたＩｇＧ抗体捕捉部の少なくとも一方を備える。
本発明によれば、迅速かつ簡便に、重症熱性血小板減少症候群ウイルスに対するＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体とを区別して検出することができる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本発明は下記の実施の形態及び図面によって限定されるものではない。なお、下記の実施の形態において、“有する”、“含む”又は“含有する”といった表現は、“からなる”又は“から構成される”という意味も包含する。
本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、血液検体に含まれるＳＦＴＳＶのＮＰに対する抗体（以下「抗ＮＰ抗体」という）を検出するためのキットである。本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットにより検出し得る抗ＮＰ抗体は、抗ＮＰ ＩｇＭ抗体（ＩｇＭ抗体）及び抗ＮＰ ＩｇＧ抗体（ＩｇＧ抗体）である。被験個体の血液検体に抗ＮＰ抗体であるＩｇＭ抗体が検出された場合、当該被験個体は現在ＳＦＴＳＶに感染している、すなわちＳＦＴＳであることが強く推認される。血液検体に抗ＮＰ抗体であるＩｇＧ抗体が検出された場合、被験個体がＳＦＴＳＶに感染している又は感染していた、すなわちＳＦＴＳである又はＳＦＴＳであったと診断される。血液検体は、被験個体の全血であってもよく、被験個体の血液に含まれる血清及び血漿等の成分であってもよい。また、血液検体は、被験個体の全血、血清及び血漿等の成分を緩衝液等で希釈した検体であってもよい。
ＳＦＴＳＶは、１本鎖ＲＮＡウイルスである。ＳＦＴＳＶのゲノムＲＮＡは、Ｌ分節、Ｍ分節及びＳ分節の３分節で構成される。ＮＰは、非構造タンパク質とともにＳ分節にコードされている。ＳＦＴＳＶが属するブニヤウイルス目において、ＮＰは高度な免疫原性を有し、抗原又は抗体検出の標的として様々な分野で選択されている。
本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、イムノクロマトグラフィーで血液検体中の抗ＮＰ抗体を検出する。このため、ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、クロマトグラフ媒体１０を備える。
図１（Ａ）はクロマトグラフ媒体１０の構成を示す図である。図１（Ａ）に示されたＸ－Ｘ’破線でクロマトグラフ媒体１０を切断し、分解したクロマトグラフ媒体１０を矢視したときの状態を図１（Ｂ）に示す。クロマトグラフ媒体１０は、サンプルパッド１、コンジュゲートパッド２、メンブレン３、吸収パッド４及びバッキングシート５を備える。
サンプルパッド１は、血液検体が滴下される部材である。サンプルパッド１は、サンプルパッド１に滴下された血液検体が浸透する媒体であれば、任意の媒体で形成される。サンプルパッド１は、コンジュゲートパッド２に接している。
検体反応部としてのコンジュゲートパッド２は、発色分子で標識した重症熱性血小板減少症候群ウイルスの組換えＮＰ（以下「ｒＮＰ」とする）を有する。ｒＮＰは、公知の方法で構築される発現系で発現させることができる。発現系は、例えば、ＳＦＴＳＶのＮＰをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した細胞である。好ましくは、発現系は大腸菌で構築される。発現系で発現されたｒＮＰは、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィー等の任意の精製方法によって精製される。好適には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（以下「ＧＳＴ」とする）がＣ末端に付加されたｒＮＰ（ｒＮＰ－ＧＳＴ）がアフィニティークロマトグラフィーで精製される。
ｒＮＰは、人為的に発現させたＮＰであって、ＳＦＴＳＶの種々の株におけるＮＰのアミノ酸配列を有するものであれば特に限定されない。例えば、ｒＮＰのアミノ酸配列は、国内で分離されたＳＦＴＳＶ日本系統１型（Ｊ１）株のＮＰのアミノ酸配列である（配列番号１）。なお、精製のためにｒＮＰにＧＳＴを付加する場合、ＧＳＴはｒＮＰのアミノ酸配列に含まないものとする。
ｒＮＰを標識するための発色分子は、例えば、着色セルロース粒子、金コロイド粒子、又はポリスチレン粒子等の、当該分野で知られる任意の発色分子を使用することができる。好適には、発色分子は着色セルロース粒子である。
コンジュゲートパッド２は、サンプルパッド１と接する面の反対側の面でメンブレン３と接している。メンブレン３は、例えば、ニトロセルロースシート等のイムノクロマトグラフ用濾紙である。
メンブレン３は、血液検体中のＳＦＴＳＶのＮＰに対する抗体を捕捉する捕捉部３１を有する。捕捉部３１は、上記抗体としてのＩｇＭ抗体と特異的に結合する抗ＩｇＭ抗体が固定化されたＩｇＭ抗体捕捉部３１ａ、及び上記抗体としてのＩｇＧ抗体と特異的に結合するＩｇＧ抗体捕捉分子が固定化されたＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂを備えるＩｇＭ抗体又はＩｇＧ抗体と特異的に結合するとは、ＩｇＭ抗体又はＩｇＧ抗体に対する結合親和性が、例えば、ウシ血清アルブミン等の非特異的な物質に対する結合親和性よりも高いことを意味する。捕捉部３１がＩｇＭ抗体捕捉部３１ａ及びＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂの両方を含むことで、単一のキットでＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体の両方をそれぞれ区別して検出することができる。特に、ネコ等の小動物では、衰弱時に多量の採血をすると命に関わる危険があるため、この構成が好適である。
血液検体は、ヒト、ネコ、又はイヌ等を含む任意の動物種の血液検体であってもよい。好適には、血液検体は、ヒト、ネコ、又はイヌの血液検体である。最も好適には、血液検体は、ネコの血液検体である。
血液検体がヒトの血液検体である場合、抗ＩｇＭ抗体は、抗ヒトＩｇＭ抗体である。血液検体がネコの血液検体である場合、抗ＩｇＭ抗体は、抗ネコＩｇＭ抗体である。抗ＩｇＭ抗体を産生する動物種は特に限定されず、ヤギ、マウス、ラット、又はウサギ等、任意の動物種が産生する抗ＩｇＭ抗体を選択することができ、市販の抗ＩｇＭ抗体であってもよい。
ＩｇＧ抗体捕捉分子は、ＩｇＧ抗体以外の抗体とは実質的に結合せず、ＩｇＧ抗体と結合する物質であれば特に限定されない。ＩｇＧ抗体捕捉分子は、例えばプロテインＡ／Ｇ、プロテインＡ、プロテインＧ、又は抗ＩｇＧ抗体である。ＩｇＧ抗体捕捉分子は、好適にはプロテインＡ／Ｇである。血液検体がヒトの血液検体である場合、ＩｇＧ抗体捕捉分子として使用できる抗ＩｇＧ抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体である。血液検体がネコの血液検体である場合、ＩｇＧ抗体捕捉分子として使用できる抗ＩｇＧ抗体は、抗ネコＩｇＧ抗体である。抗ＩｇＧ抗体を産生する動物種は特に限定されず、ヤギ、マウス、ラット、又はウサギ等、任意の動物種が産生する抗体を選択することができ、市販の抗ＩｇＧ抗体であってもよい。
なお、実質的に結合しないとは、全く結合しないか、又は本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットによる検出結果に影響しない程度の結合を意味する。
メンブレン３に固定化される抗ＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体捕捉分子の濃度は特に限定されず、適用する血液検体の希釈倍率等に応じて適宜調製され得るが、例えば０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、好適には０．５～１．５ｍｇ／ｍＬである。血液検体として適切な溶媒で１０～５０倍に希釈した被験個体の血清を用いる場合、例えば、捕捉部３１に直線状に塗布される抗ＩｇＭ抗体溶液及びＩｇＧ抗体捕捉分子溶液の濃度は、０．１～１０μｇ／ｃｍ、好ましくは０．５～５μｇ／ｃｍ、より好ましくは０．７５～１．５μｇ／ｃｍ、特に好ましくは１．０μｇ／ｃｍである。
また、メンブレン３は、ｒＮＰに対する抗体を表面に直線状に塗布し固定したコントロールライン３２を有する。コントロールライン３２に固定化された抗体は、例えば、抗ｒＮＰ－ＧＳＴ抗体又は抗ｒＮＰ抗体である。抗体を産生する動物種は特に限定されず、Ｔウサギ、ヤギ、又はニワトリ等の任意の生物種が産生する抗体を選択することができる。当該抗体は、動物に抗原としてのｒＮＰ又はｒＮＰ－ＧＳＴを免疫し、公知の方法で作製できる。
コントロールライン３２に固定化される抗体の濃度は特に限定されず、適用する血液検体の希釈倍率等に応じて適宜調製され得るが、例えば０．００１～０．１ｍｇ／ｍＬ、好適には０．００５～０．１５ｍｇ／ｍＬである。血液検体として１０～５０倍に適切な溶媒で希釈した被験個体の血清を用いる場合、例えば、コントロールライン３２に直線状に塗布される抗体の濃度は、０．００１～１０μｇ／ｃｍ、好ましくは０．０１～１．０μｇ／ｃｍ、より好ましくは０．０１～１．０μｇ／ｃｍ、特に好ましくは０．０１μｇ／ｃｍである。
メンブレン３は、コンジュゲートパッド２と接する面と同じ面で吸収パッド４と接している。吸収パッド４は、サンプルパッド１に滴下された血液検体を吸い上げる。吸収パッド４は、液体を速やかに吸収保持できる素材であればよく、例えば、濾紙、綿布、ポリエチレン又はポリプロピレン等からなる不織布等を吸収パッド４に用いることができる。
メンブレン３は、コンジュゲートパッド２と接する面の反対側の面でバッキングシート５に貼り付けられている。バッキングシート５は、サンプルパッド１、コンジュゲートパッド２、メンブレン３、及び吸収パッド４を固定する台紙である。サンプルパッド１、コンジュゲートパッド２、メンブレン３及び吸収パッド４は、上から図１（Ｂ）に示す順番でバッキングシート５の表面に固定される。
続いて、本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出方法について説明する。当該ＳＦＴＳＶ抗体検出方法は、第１の反応ステップ、第２の反応ステップ及び検出ステップを含む。第１の反応ステップでは、コンジュゲートパッド２に保持されたｒＮＰを血液検体に暴露する。より詳細には、サンプルパッド１に反応用緩衝液に混合された血液検体が滴下されると、血液検体は毛細管現象によってコンジュゲートパッド２へ浸透する。そして、コンジュゲートパッド２に保持されたｒＮＰと血液検体に含まれる抗ＮＰ抗体とが抗原抗体反応によって結合して、ｒＮＰと抗ＮＰ抗体との複合体（ｒＮＰ－抗ＮＰ抗体複合体）が形成される。ｒＮＰと抗ＮＰ抗体との複合体は、毛細管現象でメンブレン３を移動する。
第２の反応ステップでは、ｒＮＰに結合した抗ＮＰ抗体を、メンブレン３の抗ＩｇＭ抗体捕捉部３１ａ及び抗ＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂで捕捉する。まず、ＩｇＭ抗体捕捉部３１ａにおいて、ｒＮＰとＩｇＭ抗体と抗ＩｇＭ抗体との複合体（ｒＮＰ－ＩｇＭ抗体－抗ＩｇＭ抗体複合体）が形成され、当該複合体は、ＩｇＭ抗体捕捉部３１ａで堰き止められる。続いて、ｒＮＰとＩｇＧ抗体とＩｇＧ抗体捕捉分子との複合体（ｒＮＰ－ＩｇＧ抗体－ＩｇＧ抗体捕捉分子複合体）が形成され、当該複合体は、ＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂで堰き止められる。
第１の反応ステップにおいて、抗ＮＰ抗体と複合体を形成しなかったｒＮＰは、捕捉部３１で捕捉されずに、コントロールライン３２に達する。コントロールライン３２において、抗ＮＰ抗体と複合体を形成しなかったｒＮＰは、抗ｒＮＰ抗体又はｒＮＰ－ＧＳＴ抗体によって捕捉される。
検出ステップでは、捕捉部３１で捕捉された血液検体に含まれる抗ＮＰ抗体を、該抗ＮＰ抗体に結合したｒＮＰの標識を介して検出する。ＩｇＭ抗体捕捉部３１ａ及びＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂには、ｒＮＰが有する発色分子が濃縮されるため、ＩｇＭ抗体捕捉部３１ａ及びＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂが直線状に呈色する。目視で呈色を判定することで、抗ＮＰ抗体を検出できる。
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、迅速かつ簡便にＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体とを区別して検出することができる。当該ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、下記実施例２に示すように、急性期及び回復期のいずれの血清からも高い特異性及び感度で抗ＮＰ抗体を検出できる。
なお、本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、サンプルパッド１を備えることとしたが、サンプルパッド１を省いた構成でもよい。この場合、コンジュゲートパッド２に血液検体を滴下すればよい。
また、ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、コンジュゲートパッド２を備えない構成、すなわちハーフストリップの構成をとることもできる。ハーフストリップの構成とする場合、例えば、ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、サンプルパッド１、メンブレン３、及び吸収パッド４を備えるクロマトグラフ媒体１０と、試薬としてｒＮＰとを備える。当該ＳＦＴＳＶ抗体検出キットを用いたＳＦＴＳＶ抗体検出方法では、まず、ｒＮＰが血液検体に加えられて検体が調製される。当該検体中では、血液検体に含まれていた抗ＮＰ抗体がｒＮＰと反応し、ｒＮＰ－抗ＮＰ抗体複合体が形成される。
続いて、当該検体がサンプルパッド１に滴下されると、ｒＮＰと抗ＮＰ抗体との複合体は、毛細管現象でメンブレン３を移動する。そして、ｒＮＰに結合した抗ＮＰ抗体を、抗ＩｇＭ抗体捕捉部３１ａ及び抗ＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂに捕捉させる。
なお、サンプルパッド１から捕捉部３１までの長さは、滴下する血液検体の量及び濃度等によって適宜設定される。また、本実施の形態では、サンプルパッド１に血液検体が滴下されることとしたが、サンプルパッド１を血液検体に浸す、すなわちディップスティック式としてもよい。
本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、簡便に使用するために、上記ＳＦＴＳＶ抗体検出キットの構成が一体となったカセット型又はカートリッジ型の検出キットであることが好ましい。
なお、血液検体からＩｇＭ抗体が検出されることは、被験個体のＳＦＴＳＶへの感染を示す。血液検体からＩｇＧ抗体が検出されることは、被験個体のＳＦＴＳＶへの感染あるいは既往を示す。また、血液検体からＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体の両方が検出される、又はＳＦＴＳである被験個体の血液検体からＩｇＧ抗体が検出されることは、被験個体がＳＦＴＳＶに感染し、現在回復に向かっていることを示す。このため、上記実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、ＳＦＴＳＶ検出キットとして使用されてもよい。また、上記実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、ＳＦＴＳ診断キットとして使用されてもよい。また、当該ＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、感染急性期における医療機関又は動物病院での迅速診断を実現し、発症早期の投与が望ましいとされるＳＦＴＳ治療薬のコンパニオン診断としても有用である。
なお、捕捉部３１は、ＩｇＭ抗体捕捉部３１ａ及びＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂの一方のみを有する構成としてもよい。捕捉部３１としてＩｇＭ抗体捕捉部３１ａのみを有する場合、本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、ＩｇＧと区別してＩｇＭを検出することができる。捕捉部３１としてＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂのみを有する場合、本実施の形態に係るＳＦＴＳＶ抗体検出キットは、ＩｇＭと区別してＩｇＧを検出することができる。また、本実施の形態では、コンジュゲートパッド２から吸収パッド４に向かってＩｇＭ抗体捕捉部３１ａ、ＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂの順に配置されているが、ＩｇＧ抗体捕捉部３１ｂ、ＩｇＭ抗体捕捉部３１ａの順で配置されてもよい。
実施例１：イムノクロマトグラフィーの作製
（ＳＦＴＳＶのＮＰをコードする遺伝子の増幅及び組換えタンパク質の精製）
以下、別段の記載がない限り、各キットは添付のプロトコールに従って使用した。核酸抽出装置ｍａｇＬＥＡＤ ６ｇＣ及び試薬キットｍａｇＤＥＡ ＤｘＳＶ（ＰＳＳ社製）を用いて、ＳＦＴＳＶ日本系統１型（Ｊ１）株感染ネコ血清からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲを行い、ＳＦＴＳＶのＮＰ遺伝子全長を増幅した。ＲＴ－ＰＣＲに用いたプライマーとして、ＮＰ－Ｆ（配列番号２）及びＮＰ－Ｒ（配列番号３）を用いた。得られた８８０ｂｐの増幅産物を、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで処理した大腸菌用発現ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１（Ｃｙｔｉｔａ社製）に挿入した。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換し、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（最終濃度１ｍＭ）による誘導後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いてＧＳＴ融合組換え核酸タンパク質（ｒＮＰ－ＧＳＴ）を溶出した。回収したｒＮＰ－ＧＳＴの一部を、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（１０ユニット、Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いてＧＳＴを切断し、組換え核酸タンパク質（ｒＮＰ）として回収した。回収したｒＮＰ－ＧＳＴ、ｒＮＰ、及びＧＳＴをＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析し、目的のタンパク質が回収できていることを確認した（図２）。
（ＳＦＴＳＶのＮＰをコードする遺伝子の増幅及び組換えタンパク質の精製）
以下、別段の記載がない限り、各キットは添付のプロトコールに従って使用した。核酸抽出装置ｍａｇＬＥＡＤ ６ｇＣ及び試薬キットｍａｇＤＥＡ ＤｘＳＶ（ＰＳＳ社製）を用いて、ＳＦＴＳＶ日本系統１型（Ｊ１）株感染ネコ血清からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲを行い、ＳＦＴＳＶのＮＰ遺伝子全長を増幅した。ＲＴ－ＰＣＲに用いたプライマーとして、ＮＰ－Ｆ（配列番号２）及びＮＰ－Ｒ（配列番号３）を用いた。得られた８８０ｂｐの増幅産物を、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ社製）を用いて、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩで処理した大腸菌用発現ベクターｐＧＥＸ－６Ｐ－１（Ｃｙｔｉｔａ社製）に挿入した。このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換し、イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（最終濃度１ｍＭ）による誘導後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いてＧＳＴ融合組換え核酸タンパク質（ｒＮＰ－ＧＳＴ）を溶出した。回収したｒＮＰ－ＧＳＴの一部を、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（１０ユニット、Ｃｙｔｉｖａ社製）を用いてＧＳＴを切断し、組換え核酸タンパク質（ｒＮＰ）として回収した。回収したｒＮＰ－ＧＳＴ、ｒＮＰ、及びＧＳＴをＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析し、目的のタンパク質が回収できていることを確認した（図２）。
（コントロール用ポリクローナル抗体の作製）
ウサギに１ｍｇ／ｍＬのｒＮＰ－ＧＳＴを免疫し、その血清を得た（株式会社スクラムに委託）。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを用いたアフィニティカラムＳｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（コスモ・バイオ社製）を用いて、推奨プロトコールに従って、血清から抗ＮＰ－ＧＳＴウサギポリクローナルＩｇＧ抗体を精製した。
ウサギに１ｍｇ／ｍＬのｒＮＰ－ＧＳＴを免疫し、その血清を得た（株式会社スクラムに委託）。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇを用いたアフィニティカラムＳｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ ｂａｓｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（コスモ・バイオ社製）を用いて、推奨プロトコールに従って、血清から抗ＮＰ－ＧＳＴウサギポリクローナルＩｇＧ抗体を精製した。
（メンブレンへの抗体塗布）
ニトロセルロースメンブレン（ＦＦ １２０ＨＰ Ｐｌｕｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に捕捉用抗体を塗布した。１つ目のテストラインには抗ネコＩｇＭヤギ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）、２つ目のテストラインには抗ネコＩｇＧヤギ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）又はＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、２００ｍＭリン酸緩衝液を用いてそれぞれ１．０ｍｇ／ｍＬに調整し、１．０μｇ／ｃｍで塗布した。コントロールラインには、上記で精製した抗ＮＰ－ＧＳＴウサギポリクローナルＩｇＧ抗体を０．０１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．０１μｇ／ｃｍで塗布した。メンブレンに各抗体を塗布した後、５０℃で３０分間乾燥させ、０．５％カゼイン及び５０ｍＭホウ酸を用いて室温で３０分間ブロッキングし、０．５％スクロース、０．０５％コール酸ナトリウム、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌにより、室温で３０分間洗浄及び安定化処理を行い、その後、５０℃で３０分間乾燥させた。
ニトロセルロースメンブレン（ＦＦ １２０ＨＰ Ｐｌｕｓ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に捕捉用抗体を塗布した。１つ目のテストラインには抗ネコＩｇＭヤギ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）、２つ目のテストラインには抗ネコＩｇＧヤギ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）又はＰｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、２００ｍＭリン酸緩衝液を用いてそれぞれ１．０ｍｇ／ｍＬに調整し、１．０μｇ／ｃｍで塗布した。コントロールラインには、上記で精製した抗ＮＰ－ＧＳＴウサギポリクローナルＩｇＧ抗体を０．０１ｍｇ／ｍＬに調整し、０．０１μｇ／ｃｍで塗布した。メンブレンに各抗体を塗布した後、５０℃で３０分間乾燥させ、０．５％カゼイン及び５０ｍＭホウ酸を用いて室温で３０分間ブロッキングし、０．５％スクロース、０．０５％コール酸ナトリウム、及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌにより、室温で３０分間洗浄及び安定化処理を行い、その後、５０℃で３０分間乾燥させた。
（着色セルロース粒子への抗原感作）
着色セルロース粒子（ｎａｎｏａｃｔ、旭化成社製）に、１００ｍＭ ＭＥＳ、及び上記で精製したｒＮＰ（粒子重量対比１．８％）を添加し、超音波分散後、３７℃で２時間静置した。その後、カゼイン（１．０％カゼイン、１００ｍＭホウ酸、ｐＨ９．２）によるブロッキングを行い、洗浄後、塗布液（０．２％カゼイン、１５％スクロース、３３ｍＭホウ酸、ｐＨ９．２）中に浮遊させた。
着色セルロース粒子（ｎａｎｏａｃｔ、旭化成社製）に、１００ｍＭ ＭＥＳ、及び上記で精製したｒＮＰ（粒子重量対比１．８％）を添加し、超音波分散後、３７℃で２時間静置した。その後、カゼイン（１．０％カゼイン、１００ｍＭホウ酸、ｐＨ９．２）によるブロッキングを行い、洗浄後、塗布液（０．２％カゼイン、１５％スクロース、３３ｍＭホウ酸、ｐＨ９．２）中に浮遊させた。
ポリエステル製コンジュゲートパッド（２５０Ｙ、旭化成社製）を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０水溶液に浸し、３０秒間超音波処理を行った後、３７℃で３０分間乾燥させた。マイクロピペットを用いて、２１０μＬの抗体感作セルロース粒子を１０ｍｍ×８０ｍｍのコンジュゲートパッドに均一に塗布した。
（イムノクロマトキットの組み立て）
上記のメンブレン及びコンジュゲートパッド、サンプルパッド（Ｓ－０６、旭化成社製）、ならびに吸収パッド（ＡＢ－０２、旭化成社製）をパッキングシート（フォーディクス社製）の所定の位置にそれぞれ配置して組み立てた。その後、これを５ｍｍ幅に裁断し、イムノクロマトストリップとした。
上記のメンブレン及びコンジュゲートパッド、サンプルパッド（Ｓ－０６、旭化成社製）、ならびに吸収パッド（ＡＢ－０２、旭化成社製）をパッキングシート（フォーディクス社製）の所定の位置にそれぞれ配置して組み立てた。その後、これを５ｍｍ幅に裁断し、イムノクロマトストリップとした。
実施例２．イムノクロマトグラフィーによる抗ＮＰ抗体の検出
ネコの血清検体を用いて、実施例１で作成したイムノクロマトストリップの評価を行った。検体、２０１８年から２０２０年までに、ＰＣＲ又はＥＬＩＳＡによりＳＦＴＳと診断されたネコ血清１１検体と、健康なネコの血清２検体の計１３検体を用いた。各検体を展開液（０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、１．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、０．１％硫酸アンモニウム、ＰＢＳ）で１０倍希釈した。これをサンプルパッドに４０μＬ添加し、室温で３０分間静置した。目視により、－、±、＋、＋＋の４段階で評価を行い、＋及び＋＋を陽性と判定した。
ネコの血清検体を用いて、実施例１で作成したイムノクロマトストリップの評価を行った。検体、２０１８年から２０２０年までに、ＰＣＲ又はＥＬＩＳＡによりＳＦＴＳと診断されたネコ血清１１検体と、健康なネコの血清２検体の計１３検体を用いた。各検体を展開液（０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、１．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、０．１％硫酸アンモニウム、ＰＢＳ）で１０倍希釈した。これをサンプルパッドに４０μＬ添加し、室温で３０分間静置した。目視により、－、±、＋、＋＋の４段階で評価を行い、＋及び＋＋を陽性と判定した。
イムノクロマト法の結果をＥＬＩＳＡでの結果と比較するために、上記イムノクロマト法で使用した検体と同一の１３検体を用いて、ＳＦＴＳＶ感染Ｈｕｈ７細胞を抗原とした間接ＥＬＩＳＡ法による試験を行い、ＯＤ値が０．５超の検体を陽性と判定した。
（結果）
表１に示すように、本実施例のイムノクロマトグラフィーでは、急性期又は急性期～回復期のネコの検体（検体番号６～９）からは、１つの検体（検体番号９）を除きＩｇＭ抗体を検出することができた。回復期のネコの検体（検体番号１～３、１０、１１）には、ＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体が両方検出された検体（検体番号１、２）、ＩｇＧ抗体のみが検出された検体（検体番号３）、いずれも検出されなかった検体（検体番号１０、１１）があった。回復期のうち、検体番号１～３についてはＥＬＩＳＡ法と一致する結果であり、実際に検体に含まれる抗体量を反映しているものと考えられる。また、陰性のネコの検体（検体番号４、５）では、ＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体のいずれも検出されず、偽陽性はみられなかった。
表１に示すように、本実施例のイムノクロマトグラフィーでは、急性期又は急性期～回復期のネコの検体（検体番号６～９）からは、１つの検体（検体番号９）を除きＩｇＭ抗体を検出することができた。回復期のネコの検体（検体番号１～３、１０、１１）には、ＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体が両方検出された検体（検体番号１、２）、ＩｇＧ抗体のみが検出された検体（検体番号３）、いずれも検出されなかった検体（検体番号１０、１１）があった。回復期のうち、検体番号１～３についてはＥＬＩＳＡ法と一致する結果であり、実際に検体に含まれる抗体量を反映しているものと考えられる。また、陰性のネコの検体（検体番号４、５）では、ＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体のいずれも検出されず、偽陽性はみられなかった。
急性期のネコの検体（検体番号８）では、ＩｇＭ抗体のみが検出された。この結果は、当該ネコのＳＦＴＳが、中和抗体であるＩｇＧ抗体を産生する段階にまだ入っていないことを示唆している。このことから、結果により被験個体が現在ＳＦＴＳのどの段階にあるのかを推測できる可能性が示され、ＩｇＭ抗体とＩｇＧ抗体とを区別して検出することの重要性が示された。
従来法であるＥＬＩＳＡ法との比較では、本実施例のイムノクロマト法で、ＩｇＭ抗体が陽性であると判定された検体、及びＩｇＧ抗体が陽性であると判定された検体の１００％が、ＥＬＩＳＡ法でも同様の判定であった。イムノクロマト法でＩｇＭ抗体が陰性であると判定された検体、及びＩｇＧ抗体が陰性であると判定された検体の７５％が、ＥＬＩＳＡ法でも同様の判定であった。ＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の双方について、イムノクロマト法とＥＬＩＳＡ法の一致率は８４．６％であった。これらのことから、本実施例のイムノクロマト法は、従来法であるＥＬＩＳＡ法と比較して遜色のない性能を有し、臨床において十分使用可能であることが示された。
検体番号６、１２、１３に加え、別の３検体（２０２０－６、ＶＬ１０４及び２０１９－１２３）について間接ＥＬＩＳＡ法、ＰＣＲ及び本実施例のイムノクロマト法を比較した結果を図３に示す。
本発明は、本発明の広義の精神と範囲を逸脱することなく、様々な実施の形態及び変形が可能とされるものである。また、上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等な発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
本発明は、ＳＦＴＳＶ抗体の検出及びＳＦＴＳの診断に好適である。
１ サンプルパッド
２ コンジュゲートパッド
３ メンブレン
４ 吸収パッド
５ バッキングシート
１０ クロマトグラフ媒体
３１ 捕捉部
３１ａ 抗ＩｇＭ抗体捕捉部
３１ｂ 抗ＩｇＧ抗体捕捉部
３２ コントロールライン
２ コンジュゲートパッド
３ メンブレン
４ 吸収パッド
５ バッキングシート
１０ クロマトグラフ媒体
３１ 捕捉部
３１ａ 抗ＩｇＭ抗体捕捉部
３１ｂ 抗ＩｇＧ抗体捕捉部
３２ コントロールライン
Claims (7)
- 重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された組換え核酸タンパク質と、
血液検体に暴露される検体反応部、及び前記血液検体中の重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核酸タンパク質に対する抗体を捕捉する捕捉部を有するクロマトグラフ媒体と、
を備え、
前記捕捉部は、前記抗体としてのＩｇＭ抗体と特異的に結合する抗ＩｇＭ抗体が固定化されたＩｇＭ抗体捕捉部、及び前記抗体としてのＩｇＧ抗体と特異的に結合するＩｇＧ抗体捕捉分子が固定化されたＩｇＧ抗体捕捉部の少なくとも一方を備える、
重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。 - 前記検体反応部は、前記組換え核酸タンパク質を有する、
請求項１に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。 - 前記ＩｇＧ抗体捕捉分子は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｇである、
請求項１又は２に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。 - 前記組換え核酸タンパク質は、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、
請求項１から３のいずれか１項に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。 - 前記組換え核酸タンパク質は、
発色分子で標識されている、
請求項１から４のいずれか１項に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。 - 前記血液検体は、ヒト、ネコ又はイヌの血液検体である、
請求項１から５のいずれか１項に記載の重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット。 - クロマトグラフ媒体上の捕捉部に捕捉された血液検体に含まれる重症熱性血小板減少症候群ウイルスの核酸タンパク質に対する抗体を、前記抗体に結合した、重症熱性血小板減少症候群ウイルスの標識された組換え核酸タンパク質を介して検出し、
前記捕捉部は、前記抗体としてのＩｇＭ抗体と特異的に結合する抗ＩｇＭ抗体が固定化されたＩｇＭ抗体捕捉部、及び前記抗体としてのＩｇＧ抗体と特異的に結合するＩｇＧ抗体捕捉分子が固定化されたＩｇＧ抗体捕捉部の少なくとも一方を備える、
重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022017149A JP2023114693A (ja) | 2022-02-07 | 2022-02-07 | 重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2022017149A JP2023114693A (ja) | 2022-02-07 | 2022-02-07 | 重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023114693A true JP2023114693A (ja) | 2023-08-18 |
Family
ID=87569763
Family Applications (1)
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| JP2022017149A Pending JP2023114693A (ja) | 2022-02-07 | 2022-02-07 | 重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出キット及び重症熱性血小板減少症候群ウイルス抗体検出方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2023114693A (ja) |
-
2022
- 2022-02-07 JP JP2022017149A patent/JP2023114693A/ja active Pending
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