JP2023105020A - 液体カラム内の物体からの光収集 - Google Patents

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Abstract

【課題】好適な液体カラム内の物体からの光収集を提供すること。【解決手段】光学配置は、物体と光学配置との間の液体カラムの光学屈折境界を横切る液体カラム内に配された物体から放射された出力光を受光する。光学配置は、調整済みの出力光が出力光よりも均一な強度を有するように出力光を調整する。いくつかの実施形態は、液体カラム内に配された物体から放射された出力光を受光するように構成された光学配置を対象とする。出力光は、物体と光学配置との間の液体カラムの光学屈折境界を横切る。光学配置は、調整済みの出力光が出力光の強度よりも均一な強度を有するように出力光を調整する。【選択図】図１Ａ

Description

物体判別技術は、異なる種類の物体を区別する。これらの技術は、細胞の種類にしたがって生物学的細胞をソーティングするのに特に有用である。ある細胞ソーティング方式は、細胞の種類を決定するために細胞から放射された光に依存する。いくつかの実施態様では、液体のカラム内で移動している細胞が励起光に曝され、その励起光に応答して細胞から放射された光が検出される。第１の種類の細胞は、例えば、波長及び／または強度といったいくつかの特性において第２の種類の細胞とは異なる出力光を生じさせる。細胞から放射された出力光の差を根拠として細胞の種類を判別し、細胞をソーティングすることができる。
いくつかの実施形態は、液体カラム内に配された物体から放射された出力光を受光するように構成された光学配置を対象とする。出力光は、物体と光学配置との間の液体カラムの光学屈折境界を横切る。光学配置は、調整済みの出力光が出力光の強度よりも均一な強度を有するように出力光を調整する。例えば、液体カラムの断面内で、調整済みの出力光の強度を物体の位置に関係なく実質的に均一とすることができる。
いくつかの実施形態によれば、光学装置は、光学配置を含み、さらに、調整済みの出力光を検出し、調整済みの出力光に応答して電気信号を提供する検出器を含む。
いくつかの実施形態によれば、判別システムは、励起光を生成し、励起光を液体カラム内の物体の方に向けるように構成された励起光源を含む。物体は、励起光に応答して出力光を放射する。システムは、出力光を受光するように構成された光学配置を含む。出力光は、物体と光学配置との間の液体カラムの光学屈折境界を横切る。光学配置は、調整済みの出力光が出力光の強度よりも均一な強度を有するように出力光を調整する。例えば、調整済みの出力光の強度は、液体カラムの断面内の物体の位置に関係なく実質的に均一である。光学検出器は、調整済みの出力光を検出し、調整済みの出力光に応答して電気信号を提供するように構成される。物体種類判別回路は、電気信号に基づいて第１の種類の物体と第２の種類の物体とを判別する。
本明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
光学配置であって、液体カラム内に配された物体から放射された出力光であって、前記物体と前記光学配置との間の前記液体カラムの光学屈折境界を横切る前記出力光を受光するように構成され、調整済みの出力光が前記出力光よりも均一な強度を有するように前記出力光を調整するように構成された、前記光学配置と、
前記調整済みの出力光を検出し、前記調整済みの出力光に応答して電気信号を提供するように構成された検出器と、
を含む、光学装置。
（項目２）
前記調整済みの出力光の前記強度が前記液体カラムの断面にわたって実質的に均一である、項目１に記載の光学装置。
（項目３）
前記液体カラム内の前記物体に励起光を提供するように配置された励起光源であって、前記励起光に応答して前記物体が前記出力光を放射する、前記励起光源と、
前記検出器に到達しないように前記励起光を実質的に遮断するように構成された光学フィルタと、
前記調整済みの出力光を収集し、前記調整済みの出力光を前記検出器の方に集束させるように配置された集束レンズと、
のうちの１つ以上をさらに含む、項目１に記載の装置。
（項目４）
前記検出器から前記電気信号を受信し、前記電気信号に基づいて第１の種類の物体と第２の種類の物体とを区別するように構成された電気回路をさらに含む、項目１に記載の装置。
（項目５）
前記電気信号の振幅が、前記調整済みの出力光の強度に応答し、
前記電気回路が、前記電気信号の振幅を閾値と比較することによって前記第１の種類の物体と前記第２の種類の物体とを区別するように構成される、項目４に記載の装置。
（項目６）
光学配置であって、液体カラム内に配された物体から放射された出力光であって、前記物体と前記光学配置との間の光学屈折境界を横切る前記出力光を受光するように構成され、調整済みの出力光が前記物体の位置に関係なく実質的に均一な強度を有するように前記出力光を調整するように構成された、前記光学配置。
（項目７）
前記光学配置が、前記液体カラム内の第２の位置から受光した光と比較して前記液体カラム内の第１の位置から前記光学配置で受光した光を優先的に減衰させるように構成され、
前記第２の位置が、前記光学配置の光学軸に垂直な軸に沿って前記第１の位置よりも前記液体カラムの中心から遠い、項目６に記載の光学配置。
（項目８）
前記光学配置が、前記液体カラム内の前記第１の位置からの光を減衰させるように構成されたマスクを含む、項目７に記載の光学配置。
（項目９）
前記マスクがワイヤを含む、項目８に記載の光学配置。
（項目１０）
前記光学配置が、前記光学軸に関してより小さい角度で前記物体から放射された前記出力光の第２の部分に比べて、前記光学軸に関してより大きい角度で前記物体から放射された前記出力光の第１の部分を優先的に収集するように構成される、項目７に記載の光学配置。
（項目１１）
前記光学配置が、前記出力光の前記第１の部分を優先的に収集するように構成された分割対物レンズを含む、項目１０に記載の光学配置。
（項目１２）
前記光の第１の部分が、
前記光学配置の前記光学軸に関して正の角度で前記物体から放射された出力光と、
前記光学配置の前記光学軸に関して負の角度で前記物体から放射された出力光と、
を含み、
前記分割対物レンズが、
前記光学配置の前記光学軸に関して正の角度で前記物体から放射された前記光を受光するように構成された第１のレンズと、
前記光学配置の前記光学軸に関して負の角度で前記物体から放射された前記光を受光するように構成された第２のレンズと、
を含む、項目１１に記載の光学配置。
（項目１３）
前記光学配置が、前記出力光の第２の部分を減衰させるように構成されたマスクをさらに含む、項目９に記載の光学配置。
（項目１４）
励起光を生成し、前記励起光を液体カラム内の物体の方に向けるように構成された励起光源であって、前記励起光に応答して前記物体が出力光を放射する、前記励起光源と、
光学配置であって、前記物体と前記光学配置との間の前記液体カラムの光学屈折境界を横切る出力光を受光するように構成され、調整済みの出力光が前記出力光よりも均一な強度を有するように前記出力光を調整するように構成された、前記光学配置と、
前記調整済みの出力光を検出し、前記調整済みの出力光に応答して電気信号を提供するように構成された光学検出器と、
前記電気信号に基づいて第１の種類の物体と第２の種類の物体とを判別するように構成された物体種類判別回路とを含む、判別システム。
（項目１５）
前記調整済みの出力光の強度が前記物体の位置に関係なく実質的に均一である、項目１４に記載のシステム。
（項目１６）
前記回路が、Ｘ／Ｙ精子細胞の判別を実行するように構成される、項目１４に記載のシステム。
（項目１７）
前記光学配置が、前記光学軸に関してより低い角度で前記物体から放射された前記出力光の第２の部分の収集に比べて、前記光学軸に関してより高い角度で前記物体から放射された前記出力光の第１の部分を優先的に収集するように構成された分割対物レンズを含む、項目１４に記載のシステム。
（項目１８）
前記光学配置が、前記液体カラム内の第２の位置から受光した出力光と比較して前記液体カラム内の第１の位置から受光した出力光を優先的に減衰させるように構成されたマスクを含み、
前記第２の位置が、前記光学配置の前記光学軸に垂直な軸に沿って前記第１の位置よりも前記液体カラムの中心から遠い、項目１４に記載のシステム。
（項目１９）
前記光学配置が、前記第１の位置から受光した前記出力光を減衰させる長尺マスク形状部であって、前記長尺マスク形状部の長さが前記長尺マスク形状部の幅よりも非常に大きく、前記長尺マスク形状部が、前記長尺マスク形状部の長手方向軸が前記液体カラム内の前記物体のフローの方向に対して実質的に平行であるように前記検出器の有効領域に近接して配される、前記長尺マスク形状部を含む、項目１４に記載のシステム。
（項目２０）
前記長尺マスク形状部が丸い断面積を有する、項目１９に記載のシステム。
（項目２１）
前記長尺マスク形状部が矩形断面積を有する、項目１９に記載のシステム。
（項目２２）
前記長尺マスク形状部が金属ワイヤである、項目１９に記載のシステム。
（項目２３）
前記長尺マスク形状部が、ガラス上に堆積されたトレースである、項目１９に記載のシステム。
（項目２４）
前記長尺マスク形状部がフィラメントである、項目１９に記載のシステム。
（項目２５）
前記長尺マスク形状部が、透明紙上に印刷されたインク線である、項目１９に記載のシステム。
（項目２６）
前記長尺マスク形状部が、前記検出器の有効領域のほぼ中心に配される、項目１９に記載のシステム。
（項目２７）
光学装置により、液体カラムの光学屈折境界を横切った前記液体カラム内の物体からの出力光を受光することと、
調整済みの出力光が前記液体カラム内の前記物体の位置に関係なく実質的に均一な強度を有するように前記出力光を調整することと、
前記調整済みの出力光を検出することと、
前記調整済みの出力光に応答して電気信号を生成することと、
を含む、方法。
（項目２８）
前記出力光を調整することが、
光学軸に関してより低い角度で前記物体から放射された前記出力光の第２の部分を収集することに比べて、前記光学軸に関してより高い角度で前記物体から放射された前記出力光の第１の部分を優先的に収集することと、
前記液体カラム内の第２の位置から受光した出力光の第２の部分に比べて前記液体カラム内の第１の位置から受光した前記出力光の第１の部分を減衰させることであって、前記第２の位置が、前記光学装置の光学軸に垂直な軸に沿って前記第１の位置よりも前記液体カラムの中心から遠い、前記減衰させることと、
のうちの少なくとも一方を含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
励起光を生成し、前記励起光を液体カラム内の物体の方に向けるように構成された励起光源であって、前記励起光に応答して前記物体が出力光を放射する、前記励起光源と、
光学配置であって、前記物体と前記光学配置との間の前記液体カラムの光学屈折境界を横切る出力光を受光するように構成され、前記光学配置が、調整済みの出力光が前記出力光の強度よりも均一な強度を有するように前記出力光を調整するように構成され、前記光学配置が、開口と、前記開口を少なくとも部分的に横切って配された長尺マスク形状部とを含むプレートを含み、前記長尺マスク形状部が、前記長尺マスク形状部の長手方向軸が前記液体カラム内の前記物体のフローの方向に対して実質的に平行になるように配置され、前記プレート及び前記長尺マスク形状部が、前記開口部よりも前記出力光に対して透過しにくい、前記光学配置と、
前記プレートに隣接して配され、前記開口を透過した前記調整済みの出力光を受光するように配置された光学検出器であって、前記光学検出器が、前記調整済みの出力光を検出し、前記調整済みの出力光に応答して電気信号を提供するように構成される、前記光学検出器と、
前記電気信号に基づいて第１の種類の物体と第２の種類の物体とを判別するように構成された物体種類判別回路と、
を含む、フローサイトメーターシステム。
（項目３０）
前記プレートと前記長尺マスク形状部とが、１つの単一の構造である、項目２９に記載のシステム。
（項目３１）
前記長尺マスク形状部が前記プレートに取り付けられている、項目２９に記載のシステム。
（項目３２）
前記出力光に対する前記プレートの光学的透明度が、前記プレートを横切る位置の関数として変化する、項目２９に記載のシステム。
（項目３３）
前記長尺マスク形状部の対向する長手方向端部が、互いに実質的に平行である、項目２９に記載のシステム。
（項目３４）
前記長尺マスク形状部の対向する長手方向端部が、互いに平行ではない、項目２９に記載のシステム。
（項目３５）
前記長尺マスク形状部の対向する長手方向端部が、前記長尺マスク形状部の長手方向軸に沿って先細になっている、項目２９に記載のシステム。
いくつかの実施形態による、光学装置を搭載したシステムの図である。 図１Ａのシステムの測定領域内の液体カラムのｘｙ面断面を示す。 液体カラムの液体－空気界面で実質的に光が屈折しない液体カラムの中心付近に位置する物体から放射された光を示す。 液体－空気界面で光の屈折を呈する液体カラムの楕円形コアの上方部に位置する物体から放射された光を示す。 面内光線密度の角度依存性のための解析式の展開を位置ｘの関数として示す。 異なる物体位置についての放射輝度の角度依存性を示すグラフの系列を提供する。 収集光学系の異なる開口数についてのｘ軸に沿った物体位置に関する液体カラムから収集された光の相対強度のグラフの系列を提供する。 物体の異なる位置についての放射輝度の角度依存性のグラフ及び除外の領域を示すグラフの系列を提供する。 除外される角度がないとき、－０．３ｒａｄと＋０．３ｒａｄの間の角度を有する光線が除外されるとき、及び－０．４ｒａｄと＋０．４ｒａｄの間の角度を有する光線が除外されるときの、ｘ軸に沿った物体位置に関する液体カラムから収集された光の相対強度を示す。 いくつかの実施形態による、検出済みの出力光の位置変化を低減した、液体カラム内で移動している物体を識別するための方式のフロー図である。 いくつかの実施形態による、光学装置を含む光学システムの光線追跡シミュレーションの上面図である。 いくつかの実施形態による、液体カラム内の物体についての検出済みの出力光の位置変化を低減するように構成された分割対物レンズの写真である。 図７の光学装置のシミュレーションされた性能を示す。 図７の光学装置のシミュレーションされた性能を示す。 いくつかの実施形態による、光学装置を含む光学システムの光線追跡シミュレーションの上面図である。 いくつかの実施形態による、長尺マスク形状部を含む光学装置を示す。 いくつかの実施形態による、開口を有するプレートと併せて使用可能である長尺マスク形状部を含む光学装置を表す。 いくつかの実施形態による、プレートの光学的透明度が位置によって滑らかに変化する、プレート及び長尺マスク形状部を含む光学装置を示す。 いくつかの実施形態による、プレートの光学的透明度が位置によって変化する、プレート及び長尺マスク形状部を含む光学装置を示す。 いくつかの実施形態による、単一の構造として形成されたプレート及び開口を横切って延びる長尺マスク形状部を含む光学装置の図である。 いくつかの実施形態による、長尺マスク形状部の長手方向端部の様々な構成を示す。 いくつかの実施形態による、長尺マスク形状部の長手方向端部の様々な構成を示す。 いくつかの実施形態による、長尺マスク形状部の長手方向端部の様々な構成を示す。 いくつかの実施形態による、ワイヤマスクを含む光学装置の写真である。 いくつかの実施形態による、単一の構造として形成された開口を横切って延びる長尺マスク形状部を有するプレートを含む光学装置の写真である。
図面は、必ずしも縮尺どおりではない。図面で使用された類似の数字は、類似の構成要素を示す。しかしながら、所与の図面の構成要素を指す数字の使用は、同一の数字を用いてラベル付けされた別の図面の構成要素を限定することを意図するものではないことが理解されよう。
本明細書で説明される実施形態は、異なる種類の物体を判別するためのデバイス、システム及び方法に関する。物体は、フローストリームなどの液体カラム内の物体の方に向けられた励起光に応答して出力光を放射する。いくつかの実施態様では、細胞の種類は、物体から放射された出力光の強度に基づいて区別される。本明細書で論じられる特定の実施形態は、Ｘ染色体精子細胞とＹ染色体精子細胞とを区別することを対象とする。本開示の方式は、より一般的には、ある物体の種類から放射された出力光が、別の物体の種類から放射された光と比較したときに少なくとも１つの特性において判別可能な差を有する限り、異なる種類の任意の物体を区別することに適用可能であることが認識されよう。提供されたいくつかの例では、液体カラムは、光の屈折が発生し得る曲線状の境界または界面を有するフローストリームである。例えば、液体カラムの曲線状の境界は、一般的に、円形の断面であってもよい。液体カラムは、堅固な壁によって境界付けすることができるか、または空気中に噴射されてもよい。物体は、中心コアを少なくとも部分的に取り囲むシース液によって成形された中心コアを含み得る液体カラムに沿って移動し得る。物体から放射された光は、液体カラムと空気との間の界面などの、物体と他の材料との間の少なくとも１つの光学屈折境界に突き当たる。
液体－空気界面における屈折に少なくとも部分的に起因して、カラム内の物体から放射された光の、液体カラムの外部の光収集効率は、従来技術のシステムの場合は物体の位置に依存する。位置によって変化する光収集効率は、物体から放射された光を正確に定量化する必要があり、そのような精度が物体のランダムな（直接観察できない）位置変動によって制限される用途においては好ましくない。本明細書で開示される方式は、ジェット・イン・エアー・フローサイトメーターなどの、そのような変動によって制限され得るシステムの精度を高める。以下でより詳細に論じられるように、液体カラム内の物体から収集された光強度の位置変化性は、光学システムの１つ以上の面（例えば、開口絞り、視野絞り）にて光線を選択的にマスキングして位置に対する強度の依存性を低減することによって対処することができる。
本明細書で概説される方式は、フローサイトメトリーに対して特に適用可能である。しかしながら、この方式は、界面によって放射光線経路の変化が検出器に対する物体の位置に依存して生じる、界面の反対側から光を放射する物体から界面の一方の側で光が収集される任意のシステムに適用することができる。本明細書の方式は、液体カラム内の位置変化を補償するように、物体から放射された出力光の光収集効率を調整する。
図１Ａにおいて模式的に示された「ジェット・イン・エアー」フローサイトメーターシステム１００は、本開示の概念を論じるために使用可能である、１つの種類のフローサイトメーターである。「ジェット・イン・エアー」フローサイトメーターシステム１００は、液体を高圧でチャンバ１１０に送り込んで、液体カラムを含むフローストリーム１５０を高速で、例えば、約２０ｍ／ｓでチャンバ１１０の出口ノズル１６０から噴出させる。出口ノズル１６０から放出された液体カラム１５０は、ほぼ円形の断面とすることができ、いくつかの実施態様では約１０μｍ～約１００μｍの直径を有し得る。フローストリーム１５０は、シースストリーム１５２内のコアストリーム１５１から構成される。ここで図１Ａの矢印は、コアストリーム及びシースストリーム１５１、１５２のフローの方向を示す。
チャンバ１１０内で、サンプル出力ノズル１１１は、複数の種類であり得る物体１７１、１７２を含むコアストリーム１５１を排出する。コアストリーム１５１は、シース液ノズル（図示せず）からチャンバ１１０内に排出されるシース液のストリーム１５２によって境界付けられ、成形される。シースストリーム１５２は、コアストリーム１５１を少なくとも部分的に取り囲み、シースストリーム１５２とコアストリーム１５１とは実質的に混合しない。チャンバ１１０の傾斜した、または角度付きの壁１１５により、フローストリーム１５０がチャンバ１１０の出口ノズル１６０から排出される前後でシースストリーム１５２が狭くなる、及び／またはフローストリーム１５０内のコアストリーム１５１の断面サイズが維持される。シースストリーム１５２の動きは、液体カラム１５０がチャンバ１１０から排出されるときにコアストリーム１５１内の物体１７１、１７２がフローストリーム１５０の中心に向かって移動するように制約される。フローストリーム１５０は、物体１７１、１７２を、例えば、一列でフローストリーム１５０の測定領域１７５に送り出す。
物体がフローストリーム１５０の測定領域１７５を通過するとき、励起光源１８０からの光は、物体１７１、１７２に励起光を提供する。励起光源１８０は、広波長帯域または狭波長帯域の光を提供することができる。例えば、励起光源１８０はレーザーであってもよい。いくつかの構成では、励起光は、光学要素１８１によって調整されてもよい。例えば、励起光は、レンズ１８１によって測定領域１７５に集束されてもよい。測定領域１７５内の物体は、励起光源１８０に応答して、光、例えば、散乱光または蛍光灯を放射する。
第１の種類の物体１７１は、第２の種類の物体１７２から放射された光と比較して、少なくとも１つの特性において異なる光を放射する。例えば、いくつかのシナリオでは、第１の種類の物体１７１は、第２の種類の物体１７２から放射された光よりも高い強度を有する光を放射する。
光学収集配置１９０は、液体－空気界面においてフローストリーム１５０の光学屈折境界を横切る測定領域１７５内の物体から放射された出力光１６１を収集するように配置される。光学配置１９０は、以下でより詳細に論じられるように、出力光１６１を調整して、測定領域１７５内の物体１７２ａから放射された光の位置依存性を補償する調整済みの出力光１６２を提供するように構成される。検出器１８５は、調整済みの出力光１６２を受光し、それに応答して、電気信号を生成する。いくつかのシナリオでは、電気信号の振幅が物体の種類ごとに異なってもよい。電気信号は、異なる種類の物体１７１、１７２を区別するために判別回路１８７によって使用される。例えば、判別回路１８７は、電気信号の振幅を閾値と比較して、第１の種類の物体１７１と第２の種類の物体１７２とを判別するように構成されてもよい。
図１Ｂは、測定領域１７５内のフローストリーム１５０のｘｙ面断面を示す。測定領域１７５のｘｙ断面において、コアストリーム１５１の形は楕円形であり、コアストリーム１５１の液体は、緩衝液中に懸濁された少なくとも１つの物体１７２ａを含む。シースストリーム１５２は、コアストリーム１５１を実質的に取り囲む。本開示におけるこの議論に使用された特定の例では、物体１７１、１７２は精子細胞であり、システム１００は、Ｘ染色体精子とＹ染色体精子とを判別するように実装される。
励起源１８０によって生成された集束レーザービームは、測定領域１７５内の精子細胞１７２ａを照射する。細胞１７１、１７２は蛍光染料によって染色されており、励起光により、測定領域内の細胞１７２ａは蛍光出力光を放射する。楕円形コア１５１の目的は、図１Ｂに示すように、精子細胞の平坦な側面が左右を向くように精子細胞１７２ａを配向させることである。この配向では、精子細胞１７２ａの平坦な側面は、それぞれ、レーザー１８０及び光学収集配置１９０に面している。
コアストリーム１５１が楕円形であるとき、精子細胞１７２ａは、コアストリーム１５１内でｘ軸に沿った任意の数の位置をとることができる。図１Ｂは、楕円形コア１５１内の精子細胞１７２ａの３つの可能な位置を示す。図１Ｂに示す配向では、コアストリーム１５１内の精子細胞１７２ａの第１の可能な位置は、楕円形コア１５１のほぼ中心（光学収集配置１９０の光学軸１９９上）にあり、第２の可能な位置は、コアストリーム１５１の上部（光学軸１９９の上）にあり、第３の可能な位置は、コアストリーム１５１の下部（光学軸１９９の下）にある。精子細胞１７２ａから放射された出力光線の位置に依存した屈折は、コアストリーム１５１内の異なる位置における液体－空気界面１５３において発生する。
精子細胞１７２ａが第１の位置に位置し、フローストリーム１５０が図１Ｂに示したように円形断面を有するとき、精子細胞１７２ａから放射された面内光線は、ほぼ通常、液体－空気界面１５３に入射する。コアの中心から離れた精子細胞１７２ａの箇所から放射された光線、または図の面から外れて放射された光線は、通常、界面１５３に正確に入射しない。これらの光線は、この単純化された議論では考慮されないが、当業者は、それらを含むように議論を一般化することが可能である方法を理解することができる。したがって、光の屈折は、液体－空気界面１５３において発生しない。
図２Ａの図は、図１Ｂに示した楕円形コア１５１内の第１の位置に精子細胞１７２ａがあるときに、精子細胞１７２ａから放射され、界面１５３を横切る出力光２９８の光屈折がないことを示す。それに対応して、図２Ａのフローストリーム１５０を出る光線２９８の面内密度は、光線角度に関して均一である。光線の角度密度が均一であることは、光線角度の関数として放射輝度が均一であることに対応する。
対照的に、精子細胞１７２ａが、光学軸１９９から外れ、楕円形コア１５１の上部または下部のより近くにある、例えば、図１Ｂに示した楕円形コア１５１の第２及び第３の位置にあるとき、精子細胞１７２ａから放射された出力光線の少なくとも一部は、斜めの角度で液体－空気界面１５３に突き当たる。これらの出力光線は、上記で論じられた通常の入射シナリオとは対照的に、液体－空気界面１５３において屈折する。最も斜めの光線は、最も激しく屈折する。光線の屈折により、液体－空気界面１５３を横切ってフローストリーム１５０を出る蛍光の放射輝度分布が不均一になり、ｘ軸に沿った細胞１７２ａの位置によって変化する。すなわち、この屈折により、フローストリーム１５０の外側で精子細胞１７２ａから放射された出力光の放射輝度分布が変わる。
例えば、細胞１７２ａが、光学軸１９９から外れて位置し、例えば、図１Ｂに示した第２または第３の位置にあるとき、光線の密度及びしたがって界面１５３の空気側の放射輝度は、光学軸１９９に関して正または負の光線角度で、それぞれ、光学軸１９９に平行な角度または負もしくは正の光線角度における界面１５３の空気側の放射輝度とそれぞれ比較するとより高い。正及び負は、図３の光線角度γの符号を指す。図２Ｂは、細胞１７２ａが楕円形コア１５１の第２の位置にあるときに細胞１７２ａから放射され、液体－空気界面１５３を通ってフローストリーム１５０を出る光線２９９を示す図である。このシナリオでは、正の光線角度における光線の密度、すなわち放射輝度は、光学軸１９９に平行な、または負の光線角度における光線の密度よりも大きい。所定の開口数（ＮＡ）を有する光学システムの場合、同一種類の細胞からシステムによって収集される光の量（例えば、収集効率）は、細胞が第１の位置にあるか、それとも第２の位置にあるかに応じて変化し得る。システム収集効率の位置依存性により、細胞種類の決定において誤りが起きる。
図３を参照すると、光線角度γ及び精子位置

の関数としての光線密度の解析式が、スネルの法則を使用して決定される。ここでγは、光学軸に関する、物体から放射された光線の液体－空気界面における屈折後の角度である。この解析では、フローストリームの２次元断面内の、またはこの２次元断面に接する光線のみが考慮される。
我々は、角度γに関して光線の密度を解きたい。これを使用して、各精子位置

について光学収集システムの入射瞳における光線の密度を決定することができる。これは、次のように記述することができる。
我々の目的では、精子細胞が全ての方向において均一に光を放射すると仮定することができる。したがって、角度θに関する放射光線の密度は次のとおりである。
すなわち、

まで均一に分布する。幾何学的解析により、
ここで、角度

及び距離

は図３に示されている。フローストリームは、屈折率

を有するため、スネルの法則によって角度間の別の関係が得られる。
界面外部の光線の密度

は、以下の式によって界面内部の光線の密度

と関係しており、

は、両偏光にわたる、界面を通る透過率の平均を表す。
透過率は、以下の式により、ｓ偏光とｐ偏光のフレネル反射係数

と関係している。
上記及び以下の追加の関係と共に式（７）を使用すると、
γに関する光線の密度の式が得られる。
ここで、光学収集配置のＮＡは、最大光線角度

の正弦によって与えられるため、ＮＡに関してこの角度を解くことができる。
最後に、精子位置

の関数としての相対的な収集光強度は、式（１５）を

まで積分し、その積分値によって

で正規化することによって与えられる。
式（１５）の光線密度分布の式を使用すると、異なる精子位置についての光線密度（放射輝度）の角度依存性を図４Ａのようにプロットすることができる。図４Ａにおいて、線のそれぞれは、所与の精子位置

についての角度γの関数としての光線の密度を表す。ここで、角度γはラジアンである。このプロットは、光線密度（放射輝度）が角度の関数として均一な場所である、

の周りで対称な範囲にある一連の位置に対応する（図４Ａのグラフ４０４に対応）。

が正のとき（例えば、図１Ｂの第２の位置、グラフ４０２に対応）、相対放射輝度は、正の光線角度γで高く、負の光線角度γで低く、

が負のとき（例えば、図１Ｂの第３の位置、グラフ４０３に対応）は逆になる。
収集光学系（図１Ａ及び１Ｂの光学収集配置１９０）の開口数が大きく、例えば、１に近い場合、楕円形コア内の物体から放射された光の位置に関する収集光強度の変化は比較的小さい。これは、物体から放射され、右に向けられる実質的に全ての光は、正確な光線方向に関係なく、収集光学系によって収集されることになり、放射光の総量は物体の位置に対して不変である（均一な励起として）ためである。対照的に、小さい開口数では、物体位置が変わると放射輝度分布が影響を受けるため、物体位置に関する収集強度の変化が比較的大きくなり、小さい開口数は、このように変わっている放射輝度分布の一部のみが収集されることを意味する。実際のシステムは、例えば、０．５未満または０．３未満といった、１よりも大幅に小さいＮＡを有し得る。図４Ｂに提供されたグラフの系列は、物体位置

の関数としての、異なるＮＡを有する収集光学系を通って物体から収集された光の相対強度を示す。図４Ａは、図４Ｂの異なる開口数によって取得された角度γの範囲を示す。
図４Ｂのグラフの系列において、グラフ４１２は、０．２の開口数（ＮＡ）を有する収集光学系（例えば、図１Ａ及び１Ｂに示した光学収集配置１９０）のｘ軸に沿った位置に関する相対強度を示し、グラフ４１４は、０．４のＮＡを有する収集光学系のｘ軸に沿った位置に関する相対強度を示し、グラフ４１６は、０．６のＮＡを有する収集光学系のｘ軸に沿った位置に関する相対強度を示し、グラフ４１８は、０．８のＮＡを有する収集光学系のｘ軸に沿った位置に関する相対強度を示し、グラフ４１９は、０．９のＮＡを有する収集光学系のｘ軸に沿った位置に関する相対強度を示す。図４Ａ及び４Ｂから、より小さいＮＡを有する収集光学系では、より大きいＮＡを有する収集光学系と比較したとき、物体位置に関する収集光強度により大きい変化が生じる。加えて、ＮＡがより大きい収集光学系は、より小さいＮＡを有する収集光学系よりも広い範囲の屈折角度を有する光線を収集するため、より高い全体収集効率を有する。
本明細書に開示される様々な実施形態は、フローストリーム内の物体位置に関する収集光強度の変化を低減する収集デバイス（例えば、図１Ａ及び１Ｂに示した配置１９０）を対象とする。本明細書で論じられるいくつかの実施形態は、光学軸に垂直な軸に沿ってフローストリームの中心から離れたフローストリームの半径の６０％未満である物体の位置の偏差に対して約３％未満もしくは約２％未満の、または約１％未満もの測定強度の変化を有する調整済みの出力光を提供することができる。多くの用途は、様々な原因に起因し得る強度測定誤差に影響されやすい。フローストリーム内の物体の位置を正確に制御することによって強度の変動を低減することは困難であるため、その代わりに、光学収集配置を入念に設計することによって物体位置に関する収集光強度の変化を低減することが有用である。Ｘ／Ｙ精子ソーティングなどの用途の場合、測定後の蛍光強度の集団間の差に基づいて２つ以上の細胞集団が分離されることが多い。ランダムな位置変動により、収集光強度の変動の大きさが２つの集団の蛍光強度の名目上の差よりも大きくなる場合、高収率と高純度とを両立しつつそれらを区別することはできない。Ｘ精子細胞とＹ精子細胞の蛍光強度の差は、典型的には、わずか数パーセントである（例えば、ウシ精子の場合には約４％）。現在の精子ソーターシステムは、理論的にはコアストリームのフロー速度を増加させることによって高スループットを実現することができるが、この影響でコアストリームの幅が増加する。その結果、フローストリームのコア内の精子の位置の不確実性が大きくなる。この位置の不確実性と収集蛍光強度の結果として生じる変動とにより、現在の精子ソーターシステムの最大スループットは、Ｘ精子とＹ精子の小さい蛍光強度の差が目立つ程度にまで制限される。
精子ソーター用途では、精子細胞は、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｈｏ３３３４２）の細胞透過性色素によって染色され得る。この色素は、細胞核に入り、生細胞の精子頭部内の二本鎖ＤＮＡの副溝中のＡ－Ｔ塩基対に選択的に結合する。典型的には、ＵＶレーザーを使用して、染色された精子細胞を励起する。光学的に（３５０ｎｍで、またはその付近で）励起されると、Ｈｏ３３３４２によって染色されたＹ染色体を持つ（男性）精子とＸ染色体を持つ（女性）精子とを、各細胞からの全蛍光の小さい差を測定することによって分離することができる。全蛍光の差は、染色体含有量に比例する精子細胞内の染色の量に比例する。この差は哺乳類の種によって異なるが、家畜では４％のオーダーである。
強度－位置補償のための１つの方式は、図４Ａ及び図４Ｂにおいて明らかである。図４Ａの括弧は、所与のＮＡを有する蛍光収集光学系に対応する統合された領域を強調している。図４ＡのＮＡについての物体位置に関する収集強度の変化のグラフが図４Ｂに提供されている。図４Ｂでは、所与のＮＡについて、収集光の強度を各精子位置の関数としてプロットすることができるように、蛍光収集領域にわたる積分が実行される。図４Ｂから、収集光学系のＮＡを増加させることが、収集光学系を介して集められた蛍光強度に対する物体位置の影響を減少させるのに役立つことは明らかである。
本明細書で説明される実施形態は、上記のように物体位置に関する収集光強度の変化を低減する収集光学系（例えば、図１Ａ及び１Ｂの光学収集配置１９０）に関する。いくつかの実施形態によれば、収集光学系は、「角度空間」内の光線をマスキングすることによって動作する、すなわち、収集光学系は、所望の強度対位置プロファイルを実現するために、様々な角度γからの光線を選択的に収集し、減衰させ、及び／または遮断する。実際には、「角度空間」マスキング機能は、光学システムの瞳（例えば、入射瞳、射出瞳、または開口絞り）において適用することができる。ここで、瞳面との光線交差の位置は角度γに対応する。いくつかの実施形態では、収集光学配置は、より低い角度の光線と比べてより高い角度の（光学軸から離れる方向を指す）光線を優先的に収集することにより、所望の、例えば、より平坦な強度対位置プロファイルを実現する。
図５Ａ及び５Ｂは、所与のＮＡにおいて低角度の屈折光線を除外することによって強度対位置曲線を平坦化する方法を示す。低角度の光線を除外すると強度対位置プロファイルにおいて最も大きい変化を生じさせる光線が除外される一方、大きい正の角度における放射輝度の角度変化によって大きい負の角度における対応する変化がキャンセルされる傾向がある。図５Ａは、ｘ軸に沿った物体の異なる位置についての相対放射輝度対光線角度γのプロットを示す。ここで、角度γはラジアンである。図５Ａにおいて、各グラフは、図３に示すように、フローストリームのコア内の物体位置ｘに対応する。図５Ａの括弧は、０．３ｒａｄ未満の角度の大きさを有する光線が除外されるとき（図５Ａの下の括弧）、及び０．４ｒａｄ未満の角度の大きさを有する光線が除外されるとき（図５Ａの上の括弧）の、各位置ｘについての収集光学系によって除外される光線の部分を示す。
図５Ｂは、除外される角度がないとき（グラフ５００）、－０．３ｒａｄと＋０．３ｒａｄの間の角度を有する光線が除外されるとき（グラフ５０３）、及び－０．４ｒａｄと＋０．４ｒａｄの間の角度を有する光線が除外されるとき（グラフ５０４）の相対収集光強度対ｘ軸に沿った物体の位置を示す。グラフ５Ｂは、より低い角度の光線が除外されるとき、相対強度対位置のグラフが、位置に関してより小さい強度変化を呈することを示す。
位置変化の存在下で液体カラム内を移動している物体を識別するための方式が、図６のフロー図に示されている。このプロセスは、調整済みの出力光の強度が未調整の出力光の強度よりも均一になるようにフローストリームの断面を通過する物体から放射された出力光を調整すること６２０を含む。いくつかの実施形態では、調整済みの出力光は、物体の位置に関係なく実質的に均一である。調整済みの出力光が検出され６３０、検出された調整済みの出力光に応答して電気信号が生成される６４０。プロセッサまたは他の回路は、異なる種類の物体を判別する６５０ためにその電気信号を使用してもよい。例えば、回路は、電気信号の振幅（検出された光の強度に対応する）を閾値と比較して、第１の種類の物体と第２の種類の物体とを判別してもよい。任意選択で、いくつかの実施態様では、励起光は、励起源によって生成され６１０、フローストリームの断面に向けられてもよい。その場合、物体は、励起光に応答して出力光を放射する。
図７は、いくつかの実施形態による、光学装置７１０を含む光学システム７００の光線追跡シミュレーションの上面図である。装置７１０は、液体カラムの断面の面内で収集光学系のＮＡを効果的に拡大して、図５Ａ及び図５Ｂの議論で述べたように、位置対強度プロファイルに変化を導入する傾向があるより低い角度の光線と比べて位置対強度の点でよりバランスのとれたより高い角度の光線を優先的に収集する。光学収集配置７１０は、調整済みの出力光の強度が物体から放射された出力光よりも均一になるように、フローストリームの断面において物体から放射された光を調整する。調整済みの出力光は、断面内の物体の位置に関係なく実質的に均一とすることができる。この特定の実施形態では、調整済みの出力光の強度は、収集配置の光学軸に垂直な軸に沿った物体の位置に関係なく実質的に均一である。他の実施形態では、調整済みの出力光の強度は、収集配置の光学軸などの別の軸に沿った物体の位置とは無関係に実質的に均一になり得る。
光収集配置７１０は、光学軸７９９に関してより低い角度で物体から放射された光線に比べて、光学配置の光学軸７９９に関してより高い角度で物体から放射された光線を優先的に収集する。いくつかの実施態様では、光学収集配置７１０は分割対物レンズである。分割対物レンズ７１０の第１の部分７１１は、物体（図７に示されていない物体）から放射されたより高い角度の光の第１の部分７５１を収集する。分割対物レンズ７１０の第２の部分７１２は、物体から放射されたより高い角度の光の第２の部分７５２を収集する。図７に示すように、いくつかの実施形態では、より低い角度の光線の収集をさらに阻止するマスクが、より低い角度の光線が遮断される任意の場所に、例えば、光がコリメートされる開口絞りまたは瞳面の付近に配されてもよい。例えば、マスク７８６は、図７に示すように、２つのレンズ７１１、７１２の間に配されてもよい。
図７に示すように、システム７００は、収集された光の部分をシステム７００の光学軸７９９に沿って、かつ検出器７８５の方に向け直すために、ミラー７２１、７２２、７２３、７２４を使用した折り返し光学システムとして実装されてもよい。ミラー７２１、７２２は、光の第１の部分７５１を光学軸の方に、かつこの光学軸に沿って向け直し、ミラー７２３、７２４は、光の第２の部分７５２を光学軸７９９の方に、かつこの光学軸に沿って向け直す。図７に示すように、システム７００は、任意選択で、励起光を実質的に減衰させるように構成された光学バンドパスまたはロングパスフィルタなどのフィルタ７３０を含んでもよい。システム７００は、光の第１及び第２の部分７５１、７５２を検出器７８５の方に集束させるように構成されたレンズ７４０を含むことができる。
図８は、物体位置に関する強度の変化を低減するように構成された分割対物レンズの写真である。分割対物設計により、蛍光収集光学系を、フローストリームを生成するノズルによって引き起こされる空間的障害のため、他の可能な場合よりもフローストリームのより近くに置くことができることに注意されるべきである。分割対物と同一の有効ＮＡを有する単一のレンズは大きすぎるため、フローストリームを生成するノズルの直下にその焦点を置くことができない。フローストリーム内の物体の光学的検出は、ストリームが最も安定した場所である、フローストリームがノズルを出た直後において最も適切なように実行されるため、ノズルに干渉しない高ＮＡ光学系を有することが重要である。
図９Ａは、図７のモデルに基づく分割対物レンズのシミュレーションされた性能対、空間マスク１０１０を使用しない図１０に示す比較配置のシミュレーションされた性能を示す。グラフ９０１は、上記で論じられた分割対物レンズを含むシステムの場合の物体位置に関する強度を提供する。グラフ９０２は、比較配置の強度対位置であり、比較のために図９Ａに提供されている。収集光強度に対する位置変化の影響が減少していることに加えて、分割対物配置の全体収集効率がより高いことに注意されたい。
この比較をより明確に示すために、図９Ｂでは、各グラフ９０１ａ、９０２ａが１００％に対して正規化されている。グラフ９０１ａは、分割対物レンズ配置の場合の中心位置に対する収集効率を提供する。グラフ９０２ａは、単一の対物レンズのみを有する比較システムの場合の中心位置に対する収集効率を示す。分割対物レンズでは、２０μｍの物体位置における中心収集効率からの偏差は１％未満となり、他方、比較配置では、同一の物体位置における中心収集効率からの偏差は１０％超となる。
他の方式を使用して位置対強度プロファイルの変化を減少させることも可能であり、それらの全ては、本開示の新規な態様とみなされる。例えば、分割対物レンズによって例示されるように、（例えば、光学システムの瞳に近い）角度空間において光線を選択する収集配置ではなく、（例えば、光学システムの像面に近い）像または位置空間において光線を選択することが可能である。位置空間において光線を選択する光学収集配置の一例は、光学システムの像面付近の空間マスクである。このようなマスクをより簡単に位置合わせし、位置合わせに対してより安定させるためには、光学システムの倍率を上げて、より大きいマスク形状サイズを使用できるようにすることが役立つ。
図１０は、フローストリーム断面の中心付近の物体から放射された光線を減衰させる一方、フローストリーム断面の上部及び下部にある物体から放射された光線を減衰させない光学収集配置１０１０、例えば空間マスクを含む光学システム１０００の光線追跡シミュレーションの上面図である。本明細書で使用される「減衰させる」という用語は、光線を部分的に遮断するか、または完全に遮断することを包含する。例えば、減衰させた光線は、その元の強度と比較したとき、２５％もしくは５０％もしくは７５％の、または１００％もの強度の低減を有し得る。ここで、２５％、５０％及び７５％の減衰は、部分的に遮断された光線に対応し、１００％の減衰は、完全に遮断された光線に対応する。図１０に示したシステム１０００は、物体（図１０には示されていない物体）から放射された光をコリメートする単一の対物レンズ１０７０を含む。システム１０００は、任意選択で、検出器１０８５に到達しないように励起光を遮断するように構成されたバンドパスフィルタまたはロングパスフィルタなどのフィルタ１０３０を含む。レンズ１０４０を使用して、収集光を検出器１０８５の高感度領域１０８６の方に集束させることができる。空間マスク１０１０は、フローストリーム断面１０５０の中心から放射された光線を検出器１０８５に到達しないように減衰させるか、または遮断する一方、フローストリーム断面１０５０の上部及び下部領域１０５１、１０５２から放射された光線を減衰させることも遮断することもせずに検出器１０８５に到達させるようにする。図１０では、フローストリーム断面１０５０の上部領域１０５１は、図１０の光学軸１０９９の上にあるフローストリーム断面の部分を指す。フローストリーム断面１０５０の下部領域１０５２は、図１０の光学軸１０９９の下にある。マスク１０１０は、放射光に対して不透明であってもよく、または半透明であってもよい。いくつかの実施形態では、マスク１０１０の光学的光学的透明度は、例えば、フローストリーム断面の中心の像がフローストリーム断面の上部及び／または下部の像よりも減衰するように、位置によって変化し得る。
物体位置による収集強度の変化を軽減する単純な空間マスクは、光学検出器１０８５の前かつフローストリームの像の付近にある細いワイヤ（例えば、約１００ミクロン～３００ミクロンの範囲の直径、例えば、約２００ミクロンの直径を有する）であり、ワイヤ軸は、フローストリームに対して平行に配向され、光学軸１０９９に関して名目上中心に置かれる。ワイヤの効果は、フローストリームの像（本実施形態では拡大された像）が現れる場所である像面１０８７にワイヤを出し入れすることによって変化させることができる。
物体位置による収集強度の変化を低減する空間マスクを図１１に示す。空間マスクは、長尺形状部１１１０を含む。この形状部は、円形の断面積を有する細いワイヤ、長方形の断面積を有するバー、または光学検出器の有効領域１１８５を少なくとも部分的に横切って、かつフローストリームの像付近に配された他のマスク形状部として実装され得る。長尺マスク形状部１１１０は、押出金属ワイヤ、エッチング済みの金属形状部、ヒトもしくは動物の毛、スライドガラス上に配されたトレース、または透明媒体上に印刷されたインク線を含む、多くの手法で実装することができる。
一般に、マスク形状部の長さＬは、その幅Ｗよりも非常に大きい。マスク形状部１１１０は、マスク形状部１１１０の長さがフローストリームに対して平行に伸び、マスク形状部１１１０がシステムの光学軸に関して名目上中心に置かれるように配向され得る（図１０を参照）。いくつかの実施形態では、マスク形状部１１１０は、約１００ミクロン～約３００ミクロン、例えば、約２００ミクロンの幅を有し得る。
図１２に示すように、長尺マスク形状部１２１０は、開口１２２２を有するプレート１２２０と併せて使用することができる。その場合、長尺マスク形状部１２１０は、図１２に示すように少なくとも部分的に開口１２２２を横切って配される。プレート１２２０は、わずかに異なる強度を有する２つの種類の物体間の最適な強度差を実現するためのシステム光学系の位置合わせにとって特に有用となることができる。
いくつかの実施形態では、プレートは、被検査物体から放射された光を検出器の有効領域１２３０に到達しないように部分的に遮断する（光の２５％超～７５％未満を遮断する）か、実質的に遮断する（光の７５％超を遮断する）か、または完全に遮断する（光の１００％を遮断する）材料によって作られてもよい。プレート１２２０の開口１２２２は、物体から放射された光の実質的に全てを検出器の有効領域１２３０に伝達する。プレート１２２０及び開口１２２２によってシステム光学系の位置合わせが容易になり、作業者は、第１の種類の物体から放射されたより低い光強度と第２の種類の物体から放射されたわずかにより高い光強度との間で最適なコントラストが実現されるようにマスク形状部１２１０を位置合わせすることが可能になる。
図１３は、プレートの光学的透明度がその長さ及び幅にわたって変化する別の実施形態を示す。この例では、プレート１３２０は、開口１３２２に近いほどより光学的に透明であり、開口から遠いほど透過しにくい。ただし、反対のシナリオも可能であり、その場合、プレートは、開口付近ではより透過しにくく、開口から離れるほど透過しやすくなる。
図１４は、ステップ状の光学的透明度の勾配を有するプレート１４２０の別のバージョンを示す。プレート１４２０は、領域１４２１ａ、１４２１ｂ、１４２１ｃ、１４２１ｄにおいて異なるステップで開口１４２２に近づくほど光学的により透過しやすくなる。図１３のプレート１３２０を図１４のプレート１４２０と比較すると、プレート１３２０の光学的透明度は、より低い光学的透明度を有するプレート１３２０の外端部からプレート１３２０の中心の開口１３２２に近づくほどより高い光学的透明度に移行する段階的移行をなす。
いくつかの実施形態では、開口プレートと開口を横切って延びる長尺マスク形状部とは、図１５に示すように単一の構造として形成される。図１５は、開口１５２２を二等分する長尺形状部１５１０を含むプレート１５２０を示す。いくつかの実施形態では、単一の開口プレート１５２０は、図１３及び図１４を参照して先に論じられ、示されたように光学的透明度の勾配を有することができる。図１５などの単一の開口プレートは、例えば、金属プレートをフォトエッチングすることによって形成することができる。
長尺マスク形状部１５１０の長手方向端部１５１０ａ、１５１０ｂは、それらを図１５に示したように平行である必要はない。いくつかの実施形態では、位置合わせプロセスは、図１６及び図１７に示すように非平行の長手方向端部１６１０ａ、１６１０ｂ、１７１０ａ、１７１０ｂを有する長尺マスク形状部１６１０、１７１０を有することによって強化されてもよい。いくつかの実施形態では、長尺マスク形状部１８１０の長手方向端部１８１０ａ、１８１０ｂは、図１８に示すように湾曲させることができる。
図１９は、いくつかの実施形態による、開口１９２２を有するプレート１９２０を含む光学配置を示す写真である。細いワイヤを含む長尺マスク形状部１９１０が、光電子倍増管検出器への入口の前にある開口１９２２を横切って位置付けられる。ワイヤは、先に論じられたように、フローストリーム断面の中心の物体から放射された光を優先的に減衰させることにより、フローストリーム内の物体から放射された出力光を調整する。光の優先的な減衰は、未調整の出力光と比較したとき、より均一な光強度対物体位置プロファイルを提供する。
図２０は、１つの単一の構造として形成されたプレート２０２０と開口２０２２を横切って延びる長尺マスク形状部２０１０とを含む、いくつかの実施形態による、光学配置を示す写真である。例えば、プレート及び長尺マスク形状部２０１０は、（分割された）開口２０２２をフォトエッチングすることによって形成されてもよい。
各種の実施形態の上記の説明は、例示及び説明の目的で提示されたものであり、限定的ではない。開示された実施形態は、網羅的であることも意図せず、可能な実施態様を開示された実施形態に限定することも意図しない。上の教示に照らして多くの修正及び変形が可能である。

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  1. 本明細書に記載の発明。
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