JP2023101096A - 希少糖の効率的な生産用単糖間平衡反応促進剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 希少糖の効率的な生産。【解決手段】 有機ゲルマニウム化合物からなり、少なくとも一つが希少糖である単糖間での平衡状態を含む化学反応系に用いるための単糖間平衡反応促進剤。単糖間の平衡反応における平衡比を有機ゲルマニウム化合物との錯体形成能の強度が大きい単糖側にシフトさせるための促進剤である。有機ゲルマニウム化合物がポリ-トランス-２-カルボキシエチルゲルマセスキオキサン（Ｇｅ-１３２）を含む、若しくはそれからなる。【選択図】図１
Description
本発明は、希少糖の効率的な生産に用いられる有機ゲルマニウム化合物からなる単糖間平衡反応促進剤およびそれを用いた希少糖の効率的な生産方法に関する。
希少糖とは、糖の基本単位である単糖のうち、自然界に大量に存在するD-グルコース（ブドウ糖）に代表される「天然型単糖」に対して、「自然界に微量にしか存在しない単糖」と定義付けられている。希少糖の存在量は非常に少なく、D-グルコース（ブドウ糖）に比べて圧倒的に存在量が少ない。近年、希少糖は、種々の生理効果を有することから注目され、研究が盛んにおこなわれているが、工業的に広く使用されるためには、これらの希少糖が効率的に生産されることが不可欠である。そのなかでも、現在、大量生産が可能な希少糖は、D-プシコースおよびD-アロースである。D-プシコースは、英語名の一つにD-ａｌｌｕｌｏｓｅがあるが、以後、本発明ではD-アルロースを用いることとする。
D-アルロースは、ケトヘキソースに分類されるアルロースのＤ体であり、六炭糖（ヘキソース）である。希少糖生産の観点からイソメラーゼを考えた場合、D-タガトース3-エピメラーゼ（ＤＴＥ）とともにL-ラムノースイソメラーゼが基盤酵素と言える。
D-アルロースは、ケトヘキソースに分類されるアルロースのＤ体であり、六炭糖（ヘキソース）である。希少糖生産の観点からイソメラーゼを考えた場合、D-タガトース3-エピメラーゼ（ＤＴＥ）とともにL-ラムノースイソメラーゼが基盤酵素と言える。
従来の技術は、純粋な希少糖D-アルロースをケトース３－エピメラーゼ（例えば、D-アルロース３－エピメラーゼ）を用いてD-フルクトースを原料として生産している。希少糖D-アルロースはD-フルクトースにエピメラーゼを作用し、D-フルクトースとD-アルロースの混合物を作り、それを分離精製することで粉末結晶のD-アルロースを作ることができる。このD-アルロースはそれ自身で甘味料、医薬品等の用途があり、世界中で大量生産され販売が始まっている。このD-アルロースはエネルギーゼロで各種機能性があることから、特に甘味料としての販売が先行している。
さらに進んで、世界で戦える製品としてのD-グルコース、D-フルクトースおよびD-アルロースからなる３種の糖を含有するD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料を求めて、世界的な規模の大量生産方法（新製造プロセス）の提供を目的とした発明が提案されている。製造コストの大半を占める原材料費を「D-グルコースとD-フルクトースを含む混合糖である安価な異性化糖または転化糖を」を用いること、擬似移動層クロマトグラフィーは用いることなく生産することで多工程プロセスの短工程化すること、ならびに、酵素の高耐久性（寿命）に由来する低コスト酵素触媒の利用とを組み合わせて、D-グルコース、D-フルクトースおよびD-アルロースからなる３種の糖を含有するD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の十分価格競争力を有する世界的な規模の大量生産方法を提供することができるとしている（ＰＣＴ／ＪＰ２０２１／０１７５６５）。異性化糖の生産においては製造コストの大半を占める原材料費が占めることが多く、酵素触媒性能向上のメリットが占める割合は大きくないとはいえ、世界レベルでの競争になってビジネス規模が非常に大きくなるにつれて、触媒性能改善の利益は大きい。
大量生産が始まったD-アルロースはD-プシコースともいい、D-フルクトースのエピマーであり、砂糖の７０％程度の甘味度があり、甘味の質においてD-フルクトースに類似している。D-アルロースはD-フルクトースと異なり、体内吸収時にほとんど代謝されずカロリーはほぼゼロに近く、脂質合成酵素の活性を抑制することで腹部脂肪を減少させる機能が明らかにされている。今までにD-アルロースは、低カロリー甘味料として（特許文献１）、体重減少に有効な甘味料として（非特許文献１および２）使用できることが報告され、特許文献２には、D-アルロースの血糖上昇抑制作用に着目し、健康食品、糖尿病患者用飲食品、痩身用飲食品などに使用することが記載されている。
また、D-タガトースは、砂糖の９０％程度の甘味度でエネルギーが２ｋｃａｌ／ｇであり、低カロリー甘味料として用いられている。また、ＨＤＬコレステロールの上昇効果や体脂肪蓄積抑制効果（特許文献３）を有し、D-アルロースと同様に食後血糖上昇抑制作用を有することもわかっている。
これら希少糖の製造には、現在イソメラーゼによる方法が使用されており、これは有用な酵素反応が見出された結果である。そのイソメラーゼの一種であるケトース３－エピメラーゼは、複数のケトースを基質とすることができ、基質となるケトースのうち最も３位のエピ化活性が高いケトースを名称に入れて、たとえばD-タガトースに対して３位のエピ化活性が最も高い酵素をD-タガトース３－エピメラーゼと呼ぶことがある。このD-タガトース３－エピメラーゼ（ＤＴＥ）を利用することにより、D-フルクトースから希少糖であるD-アルロースを製造する技術が確立されている。
たとえば、非特許文献３には、シュードモナス チコリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｃｉｃｈｏｒｉｉ）ＳＴ-２４株由来のD-ケトース３－エピメラーゼが開示されており、この酵素を利用することによりD-フルクトースからD-アルロースが製造できることが記載されている。しかしながら、この酵素は別名D-タガトース３－エピメラーゼとも呼ばれるように、D-タガトースの３位のエピ化活性が最も高く、D-フルクトースへの作用は比較的弱い。
ｃｉｃｈｏｒｉｉ）ＳＴ-２４株由来のD-ケトース３－エピメラーゼが開示されており、この酵素を利用することによりD-フルクトースからD-アルロースが製造できることが記載されている。しかしながら、この酵素は別名D-タガトース３－エピメラーゼとも呼ばれるように、D-タガトースの３位のエピ化活性が最も高く、D-フルクトースへの作用は比較的弱い。
また、特許文献４にはアグロバクテリウム ツメファシエンス（
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のD-アルロース３－エピメラーゼを用いるD-アルロースの生成方法が、特許文献５には、アルスロバクター グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のケトース３－エピメラーゼを用いるD-アルロースの製造方法が報告されているが、これらのケトース３－エピメラーゼは、D-アルロースやD-タガトースを工業的規模で大量生産できる程、活性の高いものではない。
そのような時、食品を製造する際に使用が認められ毒性がないとされる微生物由来であり、かつ活性が高く耐熱性を有し、高活性でD-フルクトースからD-アルロースへの異性化を触媒できる新規なケトース３－エピメラーゼが見出された（特許文献７）。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のD-アルロース３－エピメラーゼを用いるD-アルロースの生成方法が、特許文献５には、アルスロバクター グロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）由来のケトース３－エピメラーゼを用いるD-アルロースの製造方法が報告されているが、これらのケトース３－エピメラーゼは、D-アルロースやD-タガトースを工業的規模で大量生産できる程、活性の高いものではない。
そのような時、食品を製造する際に使用が認められ毒性がないとされる微生物由来であり、かつ活性が高く耐熱性を有し、高活性でD-フルクトースからD-アルロースへの異性化を触媒できる新規なケトース３－エピメラーゼが見出された（特許文献７）。
Asia Pac.J.Clin.Nutr.(2001)10,233-237
Asia Pac.J.Clin.Nutr.(2004)13,127
Biosci.Biotech.Biochem.(1993)57,1037-1039
J.Appl.Glycosci. (2016)63,39-45
Future.Med.Chem.(2015)7（10）1233-1246
Biol.Trace Elem.Res.(2018)181（1）164-172
平衡反応を用いる異性化糖の生産においては製造コストの大半を占める原材料費が占めることが多く、酵素触媒性能向上のメリットが占める割合は大きくないとはいえ、世界レベルでの競争になっており、ビジネス規模が非常に大きくなるにつれて、触媒性能改善の利益は大きくなってきた。例えば、特許文献７のケトース３－エピメラーゼの耐熱性に基づき、世界規模での利用に拍車がかかっており（ＰＣＴ／ＪＰ２０２１／０１７５６５）、当該酵素の世界的供給に触媒ビジネスやライセンスビジネスの構築が期待される。
一般には、平衡反応においては、目的物の収率を上げるためには反応条件や原料の選択が重要である。アルドース構造を有する化合物のケトース構造を有する化合物への異性化には有機ゲルマニウム化合物を主剤とする促進剤が開発されている（非特許文献４）が、少なくとも一つが希少糖である単糖間での平衡状態を含む化学反応系を用いるビジネス、およびケトース３－エピメラーゼ（例えば、D-アルロース３－エピメラーゼ）の平衡反応を用いるビジネスそのものは始まったばかりであり、世界各国に生産拠点を増加する準備にむけて動き始めてはいるが、少なくとも一つが希少糖である単糖間での平衡状態を含む化学反応系で、および、ケトース３－エピメラーゼ（例えば、D-アルロース３－エピメラーゼ）を用いる平衡反応で効率的な変換方法については従来実用化されていないのが実情である。
本発明は、例えば、製造コストの大半を占める原材料費をたとえば「D-グルコースとD-フルクトースを含む混合糖である安価な異性化糖または転化糖を」を用いること、擬似移動層クロマトグラフィーは用いることなく生産することで多工程プロセスの短工程化すること、酵素の高耐久性（寿命）に由来する低コスト酵素触媒の利用、ならびに、固定化酵素の乾燥体の利用とを組み合わせて、D-アルロースの、あるいは、D-グルコース、D-フルクトースおよびD-アルロースからなる３種の糖を含有するD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の十分価格競争力を有する世界的な規模の大量生産方法を全世界に広めるために、イソメラーゼ、例えばケトース３－エピメラーゼ（D-アルロース３－エピメラーゼなど）またはケトース３－エピメラーゼ活性を有するタンパク質を用いる効率的な変換方法の提供を目的としている。
一般には、平衡反応においては、目的物の収率を上げるためには反応条件や原料の選択が重要である。アルドース構造を有する化合物のケトース構造を有する化合物への異性化には有機ゲルマニウム化合物を主剤とする促進剤が開発されている（非特許文献４）が、少なくとも一つが希少糖である単糖間での平衡状態を含む化学反応系を用いるビジネス、およびケトース３－エピメラーゼ（例えば、D-アルロース３－エピメラーゼ）の平衡反応を用いるビジネスそのものは始まったばかりであり、世界各国に生産拠点を増加する準備にむけて動き始めてはいるが、少なくとも一つが希少糖である単糖間での平衡状態を含む化学反応系で、および、ケトース３－エピメラーゼ（例えば、D-アルロース３－エピメラーゼ）を用いる平衡反応で効率的な変換方法については従来実用化されていないのが実情である。
本発明は、例えば、製造コストの大半を占める原材料費をたとえば「D-グルコースとD-フルクトースを含む混合糖である安価な異性化糖または転化糖を」を用いること、擬似移動層クロマトグラフィーは用いることなく生産することで多工程プロセスの短工程化すること、酵素の高耐久性（寿命）に由来する低コスト酵素触媒の利用、ならびに、固定化酵素の乾燥体の利用とを組み合わせて、D-アルロースの、あるいは、D-グルコース、D-フルクトースおよびD-アルロースからなる３種の糖を含有するD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の十分価格競争力を有する世界的な規模の大量生産方法を全世界に広めるために、イソメラーゼ、例えばケトース３－エピメラーゼ（D-アルロース３－エピメラーゼなど）またはケトース３－エピメラーゼ活性を有するタンパク質を用いる効率的な変換方法の提供を目的としている。
本発明は、以下の（１）ないし（９）の単糖間平衡反応促進剤を要旨とする。
（１）有機ゲルマニウム化合物からなり、少なくとも一つが希少糖である単糖間での平衡状態を含む化学反応系に用いるための単糖間平衡反応促進剤。
（２）単糖間の平衡反応における平衡比を有機ゲルマニウム化合物との錯体形成能の強度が大きい単糖側にシフトさせるための促進剤である、上記（１）に記載の単糖間平衡反応促進剤。
（３）ケトースおよびケトース間での平衡状態を含む化学反応系である、上記（１）または（２）に記載の単糖間平衡反応促進剤。
（４）イソメラーゼ存在下の単糖間の変換反応系である、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
（５）イソメラーゼ存在下が、ケトース３－エピメラーゼまたはケトース３－エピメラーゼ活性を有するタンパク質存在下である、上記（４）に記載の単糖間平衡反応促進剤。
（６）有機ゲルマニウム化合物がポリ-トランス-２-カルボキシエチルゲルマセスキオキサン（Ｇｅ-１３２）を含む、若しくはそれからなる、上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
（７）希少糖が少なくともD-アルロースを含むことを特徴とする、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
（８）反応物質である単糖（ａ）と生成物質である単糖（ｂ）間で平衡状態にある化学反応系である、上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
（９）反応物質である単糖（ａ）がD-フルクトース、生成物質である単糖（ｂ）がD-アルロースであり、平衡比を７６：２４から３８：６２に変更可能である、上記（８）に記載の単糖間平衡反応促進剤。
（１）有機ゲルマニウム化合物からなり、少なくとも一つが希少糖である単糖間での平衡状態を含む化学反応系に用いるための単糖間平衡反応促進剤。
（２）単糖間の平衡反応における平衡比を有機ゲルマニウム化合物との錯体形成能の強度が大きい単糖側にシフトさせるための促進剤である、上記（１）に記載の単糖間平衡反応促進剤。
（３）ケトースおよびケトース間での平衡状態を含む化学反応系である、上記（１）または（２）に記載の単糖間平衡反応促進剤。
（４）イソメラーゼ存在下の単糖間の変換反応系である、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
（５）イソメラーゼ存在下が、ケトース３－エピメラーゼまたはケトース３－エピメラーゼ活性を有するタンパク質存在下である、上記（４）に記載の単糖間平衡反応促進剤。
（６）有機ゲルマニウム化合物がポリ-トランス-２-カルボキシエチルゲルマセスキオキサン（Ｇｅ-１３２）を含む、若しくはそれからなる、上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
（７）希少糖が少なくともD-アルロースを含むことを特徴とする、上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
（８）反応物質である単糖（ａ）と生成物質である単糖（ｂ）間で平衡状態にある化学反応系である、上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
（９）反応物質である単糖（ａ）がD-フルクトース、生成物質である単糖（ｂ）がD-アルロースであり、平衡比を７６：２４から３８：６２に変更可能である、上記（８）に記載の単糖間平衡反応促進剤。
また、本発明は、以下の（１０）の希少糖を効率的に生産する方法を要旨とする。
（１０）上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤を用いることを特徴とする、単糖間の変換反応により希少糖を効率的に生産する方法。
（１０）上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤を用いることを特徴とする、単糖間の変換反応により希少糖を効率的に生産する方法。
本発明により、反応物質である単糖（ａ）と生成物質である単糖（ｂ）間で平衡状態にある化学反応系で単糖（ｂ）として希少糖、例えばD-アルロースを効率的な変換方法で生産することができる、単糖間平衡反応促進剤を提供することができる。
また、本発明は、例えば、製造コストの大半を占める原材料費をたとえば「D-グルコースとD-フルクトースを含む混合糖である安価な異性化糖または転化糖を」を用いること、擬似移動層クロマトグラフィーは用いることなく生産することで多工程プロセスの短工程化すること、酵素の高耐久性（寿命）に由来する低コスト酵素触媒の利用、ならびに、固定化酵素の乾燥体の利用とを組み合わせて、D-アルロースの、あるいは、D-グルコース、D-フルクトースおよびD-アルロースからなる３種の糖を含有するD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の十分価格競争力を有する世界的な規模の大量生産方法を全世界に広めるために、イソメラーゼ、例えばケトース３－エピメラーゼ（D-アルロース３－エピメラーゼなど）またはケトース３－エピメラーゼ活性を有するタンパク質を用いる効率的な変換方法を提供することができる。
また、本発明は、例えば、製造コストの大半を占める原材料費をたとえば「D-グルコースとD-フルクトースを含む混合糖である安価な異性化糖または転化糖を」を用いること、擬似移動層クロマトグラフィーは用いることなく生産することで多工程プロセスの短工程化すること、酵素の高耐久性（寿命）に由来する低コスト酵素触媒の利用、ならびに、固定化酵素の乾燥体の利用とを組み合わせて、D-アルロースの、あるいは、D-グルコース、D-フルクトースおよびD-アルロースからなる３種の糖を含有するD-アルロースの機能性を持つ砂糖に近い味質の甘味料の十分価格競争力を有する世界的な規模の大量生産方法を全世界に広めるために、イソメラーゼ、例えばケトース３－エピメラーゼ（D-アルロース３－エピメラーゼなど）またはケトース３－エピメラーゼ活性を有するタンパク質を用いる効率的な変換方法を提供することができる。
希少糖について説明する。
希少糖とは自然界に希にしか存在しない単糖（アルドース、ケトース）およびその誘導体（糖アルコール）と定義づけることができる。
一般に自然界に多量に存在するアルドースとしてはD-グルコース、D-ガラクトース、D-マンノース、D-リボース、D-キシロース、L-アラビノースの６種類あり、それ以外のアルドースは希少糖と定義される。ケトースとしては、D-フルクトースが存在しており、他のケトースは希少糖といえる。他のケトースとして、D-アルロース、D-タガトース、D-ソルボース、L-フルクトース、L-アルロース、L-タガトース、L-ソルボースが挙げられる。また糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはD-ソルビトールが比較的多いがそれ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖といえる。
希少糖とは自然界に希にしか存在しない単糖（アルドース、ケトース）およびその誘導体（糖アルコール）と定義づけることができる。
一般に自然界に多量に存在するアルドースとしてはD-グルコース、D-ガラクトース、D-マンノース、D-リボース、D-キシロース、L-アラビノースの６種類あり、それ以外のアルドースは希少糖と定義される。ケトースとしては、D-フルクトースが存在しており、他のケトースは希少糖といえる。他のケトースとして、D-アルロース、D-タガトース、D-ソルボース、L-フルクトース、L-アルロース、L-タガトース、L-ソルボースが挙げられる。また糖アルコールは単糖を還元してできるが、自然界にはD-ソルビトールが比較的多いがそれ以外のものは量的には少ないので、これらも希少糖といえる。
これらの糖は、酸化還元酵素の反応、アルドース異性化酵素の反応、アルドース還元酵素の反応で変換できることは、知られている。D-グルコース（ブドウ糖）やD-フルクトースは自然界に多量に存在する糖であり安価であるが、これらから希少糖を合成することができなかった。ところが、新規な酵素が発見された。それはガラクチトールからD-タガトースを合成する酵素を持つ菌の培養液中に、全く予期しなかったD-ソルボースが発見されたことに端を発する。その原因を調べた結果、この菌がD-タガトース３エピメラーゼ（ＤＴＥ）という酵素を産生していることを発見した（特許文献２）。このＤＴＥはこれまでつながらなかったD-タガトースとD-ソルボースの間をつなぐ酵素であることがわかる。そしてさらに驚くことに、このＤＴＥは全てのケトースの３位をエピ化する酵素であり、これまで合成接続できなかったD-フルクトースとD-アルロース、L-ソルボースとL-タガトース、D-タガトースとD-ソルボース、L-アルロースとL-フルクトース、に作用するという非常に幅広い基質特異性を有する、すなわち非常に幅広く基質を選択できるというユニークな酵素であることが分かった。このＤＴＥの発見によって、すべての単糖がリング状につながり、単糖の知識の構造化が完成し、イズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）と名付けた（図１１参照）。
図１１で示される生産過程と分子構造（Ｄ型、Ｌ型）により、炭素数４から６の単糖全てをつないだ連携図がイズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）の全体図である。図１１から理解できることは、単糖は、炭素数４、５、６全てがつながっているということである。全体図は、イズモリングＣ６の中でのつながりと、イズモリングＣ５の中でのつながりと、イズモリングＣ４の中でのつながりと、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６が全てつながっていることである。炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリングは、図１１の下段に示すように、炭素数が６つの単糖（ヘキソース）は全部で３４種類あり、アルドースが１６種類、ケトースが８種類、糖アルコールが１０種類ある。これらの糖は、酸化還元酵素の反応、アルドース異性化酵素の反応、アルドース還元酵素の反応で変換できることは、本発明者らの研究を含めた研究で知られている。
この図１１の下段を見ると、左側にＬ型、右側にＤ型、真ん中にＤＬ型があり、しかもリングの中央（星印）を中心としてＬ型とＤ型が点対称になっていることもわかる。例えば、D-グルコースとL-グルコースは、中央の点を基準として点対称になっている。しかもイズモリングの価値は、全ての単糖の生産の設計図にもなっていることである。先の例で、D-グルコースを出発点としてL-グルコースを生産しようと思えば、D-グルコースを異性化→エピ化→還元→酸化→エピ化→異性化するとＬ-グルコースが作れることを示している。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリングを使って、自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係が示されている。D-グルコース、D-フルクトース、D-マンノースと、牛乳中の乳糖から生産できるD-ガラクトースは、自然界に多く存在し、それ以外のものは微量にしか存在しない希少糖と分類される。ＤＴＥの発見によって、D-グルコースからD-フルクトース、D-アルロースを製造し、さらにD-アロース、アリトール、D-タリトールを製造することができるようになった。希少糖D-アルロースは、これまで入手自体が困難であったが、自然界に多量に存在する単糖から希少糖を大量生産する方法が開発されつつあり、その技術を利用して製造することができる。
炭素数が５つの単糖（ペントース）のイズモリングは、図１１の中段に示すように、炭素数６のイズモリングよりも小さいリングである。しかし、Ｃ６のイズモリングと同じようにアルドース８個、ケトース４個および糖アルコール４個全てを含むことに変わりは無く、全てが酵素反応で結ばれる。異なる点は、酸化還元反応、異性化反応のみでリング状に全てが連結できることである。一方、ＤＴＥを用いることによって、さらに効率のよい生産経路が設計できることがわかる。
炭素数５のイズモリングの特徴は、炭素数６のイズモリングが点対象に全単糖が配置されているのに対し、左右が対象に配置されていることが大きな特徴である。これら全ペントースは、酵素反応により連結されていることから、炭素数６のイズモリングの場合と全く同様に、すべてのペントースが構造的に整理され（知識の構造化）、全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できる意義を持っている。
炭素数が４つの単糖（テトロース）のイズモリングについての説明は省略する。
イズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）の意義をまとめると、生産過程と分子構造（Ｄ型、Ｌ型）により、すべての単糖が構造的に整理され（知識の構造化）、単糖の全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できること、が挙げられる。
この図１１の下段を見ると、左側にＬ型、右側にＤ型、真ん中にＤＬ型があり、しかもリングの中央（星印）を中心としてＬ型とＤ型が点対称になっていることもわかる。例えば、D-グルコースとL-グルコースは、中央の点を基準として点対称になっている。しかもイズモリングの価値は、全ての単糖の生産の設計図にもなっていることである。先の例で、D-グルコースを出発点としてL-グルコースを生産しようと思えば、D-グルコースを異性化→エピ化→還元→酸化→エピ化→異性化するとＬ-グルコースが作れることを示している。
炭素数が６つの単糖（ヘキソース）のイズモリングを使って、自然界に多量に存在する糖と微量にしか存在しない希少糖との関係が示されている。D-グルコース、D-フルクトース、D-マンノースと、牛乳中の乳糖から生産できるD-ガラクトースは、自然界に多く存在し、それ以外のものは微量にしか存在しない希少糖と分類される。ＤＴＥの発見によって、D-グルコースからD-フルクトース、D-アルロースを製造し、さらにD-アロース、アリトール、D-タリトールを製造することができるようになった。希少糖D-アルロースは、これまで入手自体が困難であったが、自然界に多量に存在する単糖から希少糖を大量生産する方法が開発されつつあり、その技術を利用して製造することができる。
炭素数が５つの単糖（ペントース）のイズモリングは、図１１の中段に示すように、炭素数６のイズモリングよりも小さいリングである。しかし、Ｃ６のイズモリングと同じようにアルドース８個、ケトース４個および糖アルコール４個全てを含むことに変わりは無く、全てが酵素反応で結ばれる。異なる点は、酸化還元反応、異性化反応のみでリング状に全てが連結できることである。一方、ＤＴＥを用いることによって、さらに効率のよい生産経路が設計できることがわかる。
炭素数５のイズモリングの特徴は、炭素数６のイズモリングが点対象に全単糖が配置されているのに対し、左右が対象に配置されていることが大きな特徴である。これら全ペントースは、酵素反応により連結されていることから、炭素数６のイズモリングの場合と全く同様に、すべてのペントースが構造的に整理され（知識の構造化）、全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できる意義を持っている。
炭素数が４つの単糖（テトロース）のイズモリングについての説明は省略する。
イズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）の意義をまとめると、生産過程と分子構造（Ｄ型、Ｌ型）により、すべての単糖が構造的に整理され（知識の構造化）、単糖の全体像が把握できること、研究の効果的、効率的なアプローチが選択できること、最適な生産経路が設計できること、欠落部分について予見できること、が挙げられる。
本発明で使用するイソメラーゼ、特に、酵素ケトース３-エピメラーゼについて、D-キシロースイソメラーゼおよびL-ラムノースイソメラーゼとともに説明する。
イソメラーゼは、生体分子を異性体に転換させる反応を触媒する一群の酵素の総称であり、異性化酵素ともいう。イソメラーゼは「化学式は変化しない反応」を触媒する。
本発明においてイソメラーゼとは、単糖であるアルドースとケトースを結びつける酵素のアルドースイソメラーゼ、ケトースとケトースを結びつける酵素のケトース３-エピメラーゼをいう。ヘキソースに作用するイソメラーゼは「化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６は変化しない反応」を触媒する。光学異性の相互変換を触媒するイソメラーゼの内、基質分子内に複数ある不斉点〈立体構造〉の1つを異性化する酵素をエピメラーゼと呼ぶ。糖は多数の不斉点を持つために異性化酵素は一般にはエピメラーゼと呼ばれる。エピメラーゼは単糖の場合、Ｃに結合したＯＨ基の位置を反対側に移動させる酵素であり、「化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６は変化しない反応」を触媒する。従ってイソメラーゼに属する酵素である。イソメラーゼがエピメラーゼよりも上位に存在する。
すなわち、酵素「イソメラーゼ」とは、この業界で良く知られており、例えばケトース３-エピメラーゼ、アルドースイソメラーゼのD-キシロースイソメラーゼ、グルコースイソメラーゼが挙げられる。たとえばアルドースイソメラーゼは「分子内での水素の移動」を触媒し、Ｃ１とＣ２間の酸化還元反応を進める。
イソメラーゼは、生体分子を異性体に転換させる反応を触媒する一群の酵素の総称であり、異性化酵素ともいう。イソメラーゼは「化学式は変化しない反応」を触媒する。
本発明においてイソメラーゼとは、単糖であるアルドースとケトースを結びつける酵素のアルドースイソメラーゼ、ケトースとケトースを結びつける酵素のケトース３-エピメラーゼをいう。ヘキソースに作用するイソメラーゼは「化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６は変化しない反応」を触媒する。光学異性の相互変換を触媒するイソメラーゼの内、基質分子内に複数ある不斉点〈立体構造〉の1つを異性化する酵素をエピメラーゼと呼ぶ。糖は多数の不斉点を持つために異性化酵素は一般にはエピメラーゼと呼ばれる。エピメラーゼは単糖の場合、Ｃに結合したＯＨ基の位置を反対側に移動させる酵素であり、「化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ６は変化しない反応」を触媒する。従ってイソメラーゼに属する酵素である。イソメラーゼがエピメラーゼよりも上位に存在する。
すなわち、酵素「イソメラーゼ」とは、この業界で良く知られており、例えばケトース３-エピメラーゼ、アルドースイソメラーゼのD-キシロースイソメラーゼ、グルコースイソメラーゼが挙げられる。たとえばアルドースイソメラーゼは「分子内での水素の移動」を触媒し、Ｃ１とＣ２間の酸化還元反応を進める。
希少糖生産の観点からイソメラーゼを考えた場合、（ｉ）D-タガトース３-エピメラーゼ（ＤＴＥ）とともに（ii）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｔｕｔｚｅｒｉから単離されたL-ラムノースイソメラーゼ（ＬＲｈＩ, EC 5.3.1.14）が基盤酵素と言える。
（ｉ）ケトース3-エピメラーゼの一種であるD-タガトース3-エピメラーゼ（ＤＴＥ）は1991年に香川大学農学部キャンパスから単離された微生物
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉから見つかった酵素である。D-タガトース３-エピメラーゼは、D-タガトースの炭素第３位の水酸基の向きを反転してD-ソルボースに転換する。この反応は可逆的な平衡反応であり，D-タガトースとD-ソルボースの平衡比は２０：８０である。また、本酵素はD-タガトースとD-ソルボースだけでなく、D-フルクトースとD-アルロース（平衡比７０：３０）、L-タガトースとL-ソルボース（平衡比２７：７３）、L-アルロースとL-フルクトース（平衡比２４：７６）といったすべての炭素数６のケトースに作用すること、D-キシルロースとD-リブロース（平衡比８５：１５）やL-キシルロースとL-リブロース（平衡比７０：３０）といった炭素数５のケトースのエピ化反応も触媒することが可能な広い基質特異性を示している。本酵素の発見により、香川大学では多数存在する希少糖の生産が可能になるとともに、希少糖生産酵素研究を進める原動力になったと言える。
（ii）アルドースイソメラーゼはケトースとアルドースを相互変換する異性化酵素である。炭素数６の単糖では１６種のアルドヘキソースがそれぞれに対応する８種のケトヘキソースに相互変換することができる。その基質特異性に応じてさまざまな酵素名で呼ばれる。
最も有名なアルドースイソメラーゼはD-キシロースをD-キシルロースに変換するD-キシロースイソメラーゼであるが，D-グルコースをD-フルクトースに変換するD-グルコースイソメラーゼやD-マンノースをD-フルクトースに変換するD-マンノースイソメラーゼとともに生体内で代謝酵素として働いているものも多い。
ただし、グルコースイソメラーゼは科学的正式名称ではない。酵素の名称としてグルコースイソメラーゼは国際生化学分子生物学連合で登録されているＥＣ番号には入れられていない。これは「科学的な酵素の名称」ではない。D-キシロースイソメラーセが科学的名称でグルコースイソメラーゼは商業名として一般に使用されているのみである。
本発明者らはこれまでにさまざまな基質特異性を示す異性化酵素を見いだしており、D-キシロースイソメラーゼ、D-アラビノースイソメラーゼ、L-アラビノースイソメラーゼ、L-リボースイソメラーゼ、L-ラムノースイソメラーゼなどがある。
D-タガトース３-エピメラーゼ（ＤＴＥ）とともに基盤酵素と言えるのが，
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉから単離されたL-ラムノースイソメラーゼ（ＬＲｈＩ, EC 5.3.1.14）であるが、ＬＲｈＩはL-ラムノース－L-ラムニュロース間の可逆的な異性化反応を触媒する酵素である。
P. ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来ＬＲｈＩはL-ラムノース－L-ラムニュロース間だけでなくL-リキソース－L-キシルロース間、L-マンノース－L-フルクトース間、D-グロース－D-ソルボース間、D-リボース－D-リブロース間、D-アロース－D-アルロース間、L-タロース－L-タガトース間にも作用できる幅広い基質特異性が明らかとなった。これらの構造を考えたところ炭素第２位と炭素第３位の水酸基が右側にあるアルドースと対応するケトース間の異性化反応を触媒することが明らかとなり、この広い基質特異性を利用し、D-アルロースからD-アロースへの変換を中心に、イズモリング上のさまざまな希少アルドース生産が可能である。
D-アラビノースイソメラーゼについて、一般にアルドースイソメラーゼは基質特異性が比較的広い。基質特異性が広いといっても、基質となるアルドースは３～４種が通常である。D-アラビノースイソメラーゼは、D-アラビノース、L-ガラクトースおよびL-フコース等に作用する等のように、構造が比較的類似したものに作用するのである。
また、L-アラビノースイソメラーゼについても、L-アラビノースとL-リブロース以外にL-アルトロースとL-アルロース、D-ガラクトースとD-タガトースにも作用する。また、L-エリトルロースを、L-アラビノースイソメラーゼによりL-エリトルロースとL-トレオースの平衡混合物に変換する。
L-リボースイソメラーゼについて、L-リボースイソメラーゼは、基質として、L-リボースのみならず、D-リキソース、D-タロース、D-マンノース、L-アロース及びL-グロースにも作用する。これらのアルドースは異性化され、それぞれ対応するケトースになる。
（ｉ）ケトース3-エピメラーゼの一種であるD-タガトース3-エピメラーゼ（ＤＴＥ）は1991年に香川大学農学部キャンパスから単離された微生物
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉから見つかった酵素である。D-タガトース３-エピメラーゼは、D-タガトースの炭素第３位の水酸基の向きを反転してD-ソルボースに転換する。この反応は可逆的な平衡反応であり，D-タガトースとD-ソルボースの平衡比は２０：８０である。また、本酵素はD-タガトースとD-ソルボースだけでなく、D-フルクトースとD-アルロース（平衡比７０：３０）、L-タガトースとL-ソルボース（平衡比２７：７３）、L-アルロースとL-フルクトース（平衡比２４：７６）といったすべての炭素数６のケトースに作用すること、D-キシルロースとD-リブロース（平衡比８５：１５）やL-キシルロースとL-リブロース（平衡比７０：３０）といった炭素数５のケトースのエピ化反応も触媒することが可能な広い基質特異性を示している。本酵素の発見により、香川大学では多数存在する希少糖の生産が可能になるとともに、希少糖生産酵素研究を進める原動力になったと言える。
（ii）アルドースイソメラーゼはケトースとアルドースを相互変換する異性化酵素である。炭素数６の単糖では１６種のアルドヘキソースがそれぞれに対応する８種のケトヘキソースに相互変換することができる。その基質特異性に応じてさまざまな酵素名で呼ばれる。
最も有名なアルドースイソメラーゼはD-キシロースをD-キシルロースに変換するD-キシロースイソメラーゼであるが，D-グルコースをD-フルクトースに変換するD-グルコースイソメラーゼやD-マンノースをD-フルクトースに変換するD-マンノースイソメラーゼとともに生体内で代謝酵素として働いているものも多い。
ただし、グルコースイソメラーゼは科学的正式名称ではない。酵素の名称としてグルコースイソメラーゼは国際生化学分子生物学連合で登録されているＥＣ番号には入れられていない。これは「科学的な酵素の名称」ではない。D-キシロースイソメラーセが科学的名称でグルコースイソメラーゼは商業名として一般に使用されているのみである。
本発明者らはこれまでにさまざまな基質特異性を示す異性化酵素を見いだしており、D-キシロースイソメラーゼ、D-アラビノースイソメラーゼ、L-アラビノースイソメラーゼ、L-リボースイソメラーゼ、L-ラムノースイソメラーゼなどがある。
D-タガトース３-エピメラーゼ（ＤＴＥ）とともに基盤酵素と言えるのが，
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉから単離されたL-ラムノースイソメラーゼ（ＬＲｈＩ, EC 5.3.1.14）であるが、ＬＲｈＩはL-ラムノース－L-ラムニュロース間の可逆的な異性化反応を触媒する酵素である。
P. ｓｔｕｔｚｅｒｉ由来ＬＲｈＩはL-ラムノース－L-ラムニュロース間だけでなくL-リキソース－L-キシルロース間、L-マンノース－L-フルクトース間、D-グロース－D-ソルボース間、D-リボース－D-リブロース間、D-アロース－D-アルロース間、L-タロース－L-タガトース間にも作用できる幅広い基質特異性が明らかとなった。これらの構造を考えたところ炭素第２位と炭素第３位の水酸基が右側にあるアルドースと対応するケトース間の異性化反応を触媒することが明らかとなり、この広い基質特異性を利用し、D-アルロースからD-アロースへの変換を中心に、イズモリング上のさまざまな希少アルドース生産が可能である。
D-アラビノースイソメラーゼについて、一般にアルドースイソメラーゼは基質特異性が比較的広い。基質特異性が広いといっても、基質となるアルドースは３～４種が通常である。D-アラビノースイソメラーゼは、D-アラビノース、L-ガラクトースおよびL-フコース等に作用する等のように、構造が比較的類似したものに作用するのである。
また、L-アラビノースイソメラーゼについても、L-アラビノースとL-リブロース以外にL-アルトロースとL-アルロース、D-ガラクトースとD-タガトースにも作用する。また、L-エリトルロースを、L-アラビノースイソメラーゼによりL-エリトルロースとL-トレオースの平衡混合物に変換する。
L-リボースイソメラーゼについて、L-リボースイソメラーゼは、基質として、L-リボースのみならず、D-リキソース、D-タロース、D-マンノース、L-アロース及びL-グロースにも作用する。これらのアルドースは異性化され、それぞれ対応するケトースになる。
エピメラーゼはイソメラーゼの中に含まれるので、（ａ）「D-グルコースをD-フルクトースに異性化する酵素」、（ｂ）「D-フルクトースをD-アルロースに異性化する酵素」と表現することができる。
上記の（ａ）「D-グルコースをD-フルクトースに異性化する酵素」について、この中には、例えばある微生物のL-ラムノースイソメラーゼがD-グルコースに作用し、D-フルクトースに変換するものがあったとしてもそのL-ラムノースイソメラーゼも含まれる。あらゆる微生物、植物、動物等の生物が持つタンパク質がD-グルコースをD-フルクトースに変換するものも全てが含まれる。
また、（ｂ）「D-フルクトースをD-アルロースに異性化する酵素」について、これにはあらゆる生物の生産するタンパク質がD-フルクトースをD-アルロースへ変換する場合においてもこれに含まれる。
従って、ＥＣ番号に「ＥＣ.５.-(異性化酵素)」に属する全ての酵素を含む。たとえ新たに発見された酵素、他の異性化酵素に分類されているものがこれらの反応を触媒し得る作用をわずかでも持っていると、それを含むことを意味する。本発明で使用する『イソメラーゼ』という名称は単糖であるアルドースとケトースを結びつける、ケトースとケトースを結びつける、広い酵素群を含むものとして使用している。
上記の（ａ）「D-グルコースをD-フルクトースに異性化する酵素」について、この中には、例えばある微生物のL-ラムノースイソメラーゼがD-グルコースに作用し、D-フルクトースに変換するものがあったとしてもそのL-ラムノースイソメラーゼも含まれる。あらゆる微生物、植物、動物等の生物が持つタンパク質がD-グルコースをD-フルクトースに変換するものも全てが含まれる。
また、（ｂ）「D-フルクトースをD-アルロースに異性化する酵素」について、これにはあらゆる生物の生産するタンパク質がD-フルクトースをD-アルロースへ変換する場合においてもこれに含まれる。
従って、ＥＣ番号に「ＥＣ.５.-(異性化酵素)」に属する全ての酵素を含む。たとえ新たに発見された酵素、他の異性化酵素に分類されているものがこれらの反応を触媒し得る作用をわずかでも持っていると、それを含むことを意味する。本発明で使用する『イソメラーゼ』という名称は単糖であるアルドースとケトースを結びつける、ケトースとケトースを結びつける、広い酵素群を含むものとして使用している。
本発明の実施例で使用しいているD-アルロース３-エピメラーゼ（ＤＡＥ）について説明する。
例えば、Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２０２であるが、２０２０年２月１５日で保管終了している公知菌株である。特許文献６ではＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ.由来のＤＥＡと記載されており、その後の研究でL-リブロース３-エピメラーゼであることが判明した。これもケトース３-エピメラーゼの一種である。
この菌株をL-ラムノースで培養すると、L-ラムノースイソメラーゼおよびD-アルロース３-エピメラーゼ（ＤＡＥ）を生産する。反応物質であるD-フルクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フルクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ、生成物質である希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させるために用いる。
このD-アルロース３-エピメラーゼ（ＤＡＥ）は、D-フルクトースをD-アルロースへ異性化する酵素であれば、酵素の起源や分類名称が何であってもよい。L-ラムノースイソメラーゼ（ＬＲｈＩ）も、D-アルロースをD-アロースへ異性化する酵素であれば、酵素の起源や分類名称が何であってもよい。
例えば、Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６は受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２０２であるが、２０２０年２月１５日で保管終了している公知菌株である。特許文献６ではＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ.由来のＤＥＡと記載されており、その後の研究でL-リブロース３-エピメラーゼであることが判明した。これもケトース３-エピメラーゼの一種である。
この菌株をL-ラムノースで培養すると、L-ラムノースイソメラーゼおよびD-アルロース３-エピメラーゼ（ＤＡＥ）を生産する。反応物質であるD-フルクトースを希少糖D-アルロースに異性化するD-フルクトースと希少糖D-アルロース間の平衡反応により異性化を進行させ、生成物質である希少糖D-アルロース含有量に達した段階で反応を終了させるために用いる。
このD-アルロース３-エピメラーゼ（ＤＡＥ）は、D-フルクトースをD-アルロースへ異性化する酵素であれば、酵素の起源や分類名称が何であってもよい。L-ラムノースイソメラーゼ（ＬＲｈＩ）も、D-アルロースをD-アロースへ異性化する酵素であれば、酵素の起源や分類名称が何であってもよい。
例えば、食品を製造する際に使用が認められ毒性がないとされる微生物由来であり、かつ活性が高く耐熱性を有し、高活性でD-フルクトースからD-アルロースへの異性化を触媒できるとして見出されたアルスロバクター グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）Ｍ３０株が例示される。Ｍ３０株は、日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に２０１１年６月２２日原寄託されたＮＩＴＥ Ｐ－１１１１からブダペスト条約に基づく寄託への移管を２０１２年５月２日に請求し、受託番号 ＮＩＴＥ ＢＰ－１１１１として国際寄託されている。
また、シュードモナス属に属する細菌由来のD-ケトヘキソース３-エピメラーゼ（特許文献７）が例示される。
さらにまた、アルスロバクター ヒスチジノロボランス(
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ)Ｙ５８６－１株由来のケトース３－エピメラーゼが好ましいものとして例示される(特許文献８)。
Ｙ５８６－１株は、２０１８年１１月７日に日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２-５-８所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに国際寄託し、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８１３として寄託されている。
また、シュードモナス属に属する細菌由来のD-ケトヘキソース３-エピメラーゼ（特許文献７）が例示される。
さらにまた、アルスロバクター ヒスチジノロボランス(
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌｏｖｏｒａｎｓ)Ｙ５８６－１株由来のケトース３－エピメラーゼが好ましいものとして例示される(特許文献８)。
Ｙ５８６－１株は、２０１８年１１月７日に日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２-５-８所在の独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに国際寄託し、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２８１３として寄託されている。
該Ｙ５８６－１株由来のケトース３－エピメラーゼは、特許文献５に記載されたアルスロバクター グロビフォルミス由来のケトース３－エピメラーゼに比べて、培養液あたりで生産される酵素が約２倍高い活性を有するので、それを用いることで効率よくD-アルロースの大量生産が可能になる。また、酵素の至適温度が７０℃と高く、しかも８０℃においても、至適温度での７０℃での活性を１００とした相対活性が５９．４と約６０％あり、高耐熱性である。しかも、６０℃で１時間保温処理した後の残存活性も４９．４％という熱耐性を有することから、至適温度の７０℃での反応において、より多量の生産物を得ることができる。この酵素のもつ優れた耐熱性は、酵素のアミノ酸置換変異体の作成により、さらに高めることができるという特性がある。
すなわち、該Ｙ５８６－１株由来のケトース３－エピメラーゼの遺伝子に突然変異を導入して、対応するアミノ酸残基を部位特異的変異操作により他のアミノ酸残基に置換して、様々なアミノ酸置換を有する変異体を調製することにより、アミノ酸置換していない野生型酵素より耐熱性の高い酵素を得ることができ、その変異体を用いることができる。反応温度７０℃と５０℃におけるケトース３－エピメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）、あるいは、６０℃で１時間保温後の残存活性、という２つの指標で耐熱性を評価した、耐熱性を有する変異体である。それにより用いるD-アルロース３-エピメラーゼの高耐熱性からの該酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性に基づく工業的に実用可能な低コストの製造方法を実現した。
さらに、部位特異的変異操作による塩基置換により変化させて各種のケトース３－エピメラーゼ変異体を作成し、その中から、酵素の寿命を高める上で重要な性質は耐熱性であるという酵素一般の技術常識を考慮して、野生型より耐熱性の高いアミノ酸置換変異体が得られる部位のものを選択し、そのうち親株野生型組換え酵素Ｙ５８６－１株 ＤＡＥ（１．７８）を上回る変異酵素は３７種中２０種得られたところ、当該国際出願の明細書中の表１０の８番目に記載されたアミノ酸置換変異体を用いことができる。
当該変異体は、（１）変異配列名と（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
（１）Y586DAE_V129IA200VS218N
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列
MKIGCHGLVWTGRFDAEGIRYSVQKTKEAGFDLIEFPLMDPFSFDVATAKSALAEHGLTASASLGLSEATDVSSEDPAIVKAGEELLNRALDVLAELGATDFCGVIYSAMKKYMEPATEQGLSNSKAAIGRVVDRAAGLGINVSLEVVNRYETNVLNTGRQALSYLSDVKRPNLGVHLDTYHMNIEESDMFSPVLDTAEVLKYVHIGESHRGYLGTGNVDFDNFFKALGRIGYDGPVVFESFSSAVVAPDLSRMLGIWRNLWADNEELGAHANAFIRDKLTAIKTIELH
このような耐熱性を有する変異体を用いることで、高耐熱性と高生産性からは、活性というよりも酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性がもたらされる。
いずれにせよこれらの酵素は、精製酵素を使っても良いし、該酵素を生産微生物でも良い。
すなわち、該Ｙ５８６－１株由来のケトース３－エピメラーゼの遺伝子に突然変異を導入して、対応するアミノ酸残基を部位特異的変異操作により他のアミノ酸残基に置換して、様々なアミノ酸置換を有する変異体を調製することにより、アミノ酸置換していない野生型酵素より耐熱性の高い酵素を得ることができ、その変異体を用いることができる。反応温度７０℃と５０℃におけるケトース３－エピメラーゼ活性の比（Ｔ７０／Ｔ５０）、あるいは、６０℃で１時間保温後の残存活性、という２つの指標で耐熱性を評価した、耐熱性を有する変異体である。それにより用いるD-アルロース３-エピメラーゼの高耐熱性からの該酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性に基づく工業的に実用可能な低コストの製造方法を実現した。
さらに、部位特異的変異操作による塩基置換により変化させて各種のケトース３－エピメラーゼ変異体を作成し、その中から、酵素の寿命を高める上で重要な性質は耐熱性であるという酵素一般の技術常識を考慮して、野生型より耐熱性の高いアミノ酸置換変異体が得られる部位のものを選択し、そのうち親株野生型組換え酵素Ｙ５８６－１株 ＤＡＥ（１．７８）を上回る変異酵素は３７種中２０種得られたところ、当該国際出願の明細書中の表１０の８番目に記載されたアミノ酸置換変異体を用いことができる。
当該変異体は、（１）変異配列名と（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
（１）Y586DAE_V129IA200VS218N
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列
MKIGCHGLVWTGRFDAEGIRYSVQKTKEAGFDLIEFPLMDPFSFDVATAKSALAEHGLTASASLGLSEATDVSSEDPAIVKAGEELLNRALDVLAELGATDFCGVIYSAMKKYMEPATEQGLSNSKAAIGRVVDRAAGLGINVSLEVVNRYETNVLNTGRQALSYLSDVKRPNLGVHLDTYHMNIEESDMFSPVLDTAEVLKYVHIGESHRGYLGTGNVDFDNFFKALGRIGYDGPVVFESFSSAVVAPDLSRMLGIWRNLWADNEELGAHANAFIRDKLTAIKTIELH
このような耐熱性を有する変異体を用いることで、高耐熱性と高生産性からは、活性というよりも酵素の高耐久性（寿命）に由来するトータルの生産性がもたらされる。
いずれにせよこれらの酵素は、精製酵素を使っても良いし、該酵素を生産微生物でも良い。
本発明においては、精製酵素または、該酵素生産微生物は、精製酵素または、該酵素生産微生物を固定化した固定化酵素、固定化微生物として用いられる。
［酵素の固定化］
固定化酵素を用いることで、連続的で大量のエピ化反応を行うことが可能となり、該酵素として耐熱性の酵素を用いると、その寿命が延びる。酵素を固定化する担体として公知の任意のものを用いることができる。
酵素はイオン交換樹脂、合成吸着剤などの適切な基材に固定化して用いることがもっとも実用的である。イオン交換樹脂、例えば塩基性陰イオン交換樹脂としては、強塩基性陰イオン交換樹脂あるいは弱塩基性陰交換樹脂のいずれでも用いることができ、たとえば、強塩基性陰イオン交換樹脂としては、ＨＰＡ２５Ｌ（三菱ケミカル社製）、ＩＲＡ９０４ＣＬ（オルガノ社製）等が挙げられ、弱塩基性陰イオン交換樹脂としてはＷＡ３０（三菱ケミカル社製）、ＦＰＡ５４、ＦＰＡ９５（オルガノ社製）等が挙げられる。 固定化したケトース３－エピメラーゼは、その異性化能が消失したあとに容易に溶離させることができることから、固定化担体の再生を非常に簡便に行うことができ、生産コストを下げることができる。耐熱性の酵素を用いると、その寿命が延び、生産コストをいっそう下げることができる。
酵素による異性化は、酵素を固定化しての利用が可能であり、種々の固定化方法によって安定で利用しやすい固定化酵素を得ることができる。固定化酵素を用いることで、連続的に大量の異性化および異性化反応を行うことが可能である。たとえば、それぞれ１０００Ｕ／湿重量樹脂（ｇ）の活性を有する固定化酵素を使用して行われる。菌体細胞を破壊するかして得られた破壊細胞の溶液から粗酵素液として採取し、カラム充填したイオン交換樹脂、合成吸着剤などに対し、該粗酵素液を低温（４℃）下で通液させ、イオン交換樹脂に粗酵素タンパク質を結合させ、精製水を通液させて洗浄し、固定化酵素を得ることができる。商業的生産に完全に満足できる安定性（活性維持）の点で連続生産に耐えられる固定化系が得られる。得られた固定化酵素を用いて連続的で大量の異性化反応（エピ化反応）を行うことができる。
［酵素の固定化］
固定化酵素を用いることで、連続的で大量のエピ化反応を行うことが可能となり、該酵素として耐熱性の酵素を用いると、その寿命が延びる。酵素を固定化する担体として公知の任意のものを用いることができる。
酵素はイオン交換樹脂、合成吸着剤などの適切な基材に固定化して用いることがもっとも実用的である。イオン交換樹脂、例えば塩基性陰イオン交換樹脂としては、強塩基性陰イオン交換樹脂あるいは弱塩基性陰交換樹脂のいずれでも用いることができ、たとえば、強塩基性陰イオン交換樹脂としては、ＨＰＡ２５Ｌ（三菱ケミカル社製）、ＩＲＡ９０４ＣＬ（オルガノ社製）等が挙げられ、弱塩基性陰イオン交換樹脂としてはＷＡ３０（三菱ケミカル社製）、ＦＰＡ５４、ＦＰＡ９５（オルガノ社製）等が挙げられる。 固定化したケトース３－エピメラーゼは、その異性化能が消失したあとに容易に溶離させることができることから、固定化担体の再生を非常に簡便に行うことができ、生産コストを下げることができる。耐熱性の酵素を用いると、その寿命が延び、生産コストをいっそう下げることができる。
酵素による異性化は、酵素を固定化しての利用が可能であり、種々の固定化方法によって安定で利用しやすい固定化酵素を得ることができる。固定化酵素を用いることで、連続的に大量の異性化および異性化反応を行うことが可能である。たとえば、それぞれ１０００Ｕ／湿重量樹脂（ｇ）の活性を有する固定化酵素を使用して行われる。菌体細胞を破壊するかして得られた破壊細胞の溶液から粗酵素液として採取し、カラム充填したイオン交換樹脂、合成吸着剤などに対し、該粗酵素液を低温（４℃）下で通液させ、イオン交換樹脂に粗酵素タンパク質を結合させ、精製水を通液させて洗浄し、固定化酵素を得ることができる。商業的生産に完全に満足できる安定性（活性維持）の点で連続生産に耐えられる固定化系が得られる。得られた固定化酵素を用いて連続的で大量の異性化反応（エピ化反応）を行うことができる。
［有機ゲルマニウム化合物について］
本発明で使用する有機ゲルマニウム化合物が、ポリ-トランス-２-カルボキシエチルゲルマセスキオキサン（Ｇｅ-１３２）を含む、若しくはそれからなる。
ポリ-トランス-２-カルボキシエチルゲルマセスキオキサン（Ｇｅ-１３２）は公知の化合物であり、化１で表される、ゲルマニウム原子と酸素原子とが交互に結合して構成された、あたかもクラウンエーテルのような１２員環を基本構造とするシート状巨大分子の常温で固体の結晶性化合物である。その誘導体も公知の化合物であり、非特許文献４～６、特許文献９、１０などにＧｅ-１３２と同様に用いられることが記載されている。
（１）
また、Ｇｅ-１３２はさまざまな毒性試験で安全である。Ｇｅ-１３２は、免疫調節、骨粗鬆症の抑制、抗炎症作用、抗リウマチ作用といった様々な生理作用を持つ有機ゲルマニウム化合物である。Ｇｅ-１３２は機能性食品や化粧品の成分として使用されている。
本発明で使用する有機ゲルマニウム化合物が、ポリ-トランス-２-カルボキシエチルゲルマセスキオキサン（Ｇｅ-１３２）を含む、若しくはそれからなる。
ポリ-トランス-２-カルボキシエチルゲルマセスキオキサン（Ｇｅ-１３２）は公知の化合物であり、化１で表される、ゲルマニウム原子と酸素原子とが交互に結合して構成された、あたかもクラウンエーテルのような１２員環を基本構造とするシート状巨大分子の常温で固体の結晶性化合物である。その誘導体も公知の化合物であり、非特許文献４～６、特許文献９、１０などにＧｅ-１３２と同様に用いられることが記載されている。
また、Ｇｅ-１３２はさまざまな毒性試験で安全である。Ｇｅ-１３２は、免疫調節、骨粗鬆症の抑制、抗炎症作用、抗リウマチ作用といった様々な生理作用を持つ有機ゲルマニウム化合物である。Ｇｅ-１３２は機能性食品や化粧品の成分として使用されている。
Ｇｅ-１３２は、化２で示されるように、水中では加水分解して単量体である３-（トリヒドロキシゲルミル）プロピオン酸（ＴＨＧＰ）となる。
（２）
生体内は水分に富んでいるため、Ｇｅ-１３２は生体内では加水分解を受けてＴＨＧＰ又はその塩を生成していると考えられる。ＴＨＧＰの溶液を乾固させると、複数のＴＨＧＰが脱水縮合したポリマー構造の固体有機ゲルマニウム化合物が生成される。Ｇｅ-１３２はこうして生成される固体有機ゲルマニウム化合物の一種である。
生体内は水分に富んでいるため、Ｇｅ-１３２は生体内では加水分解を受けてＴＨＧＰ又はその塩を生成していると考えられる。ＴＨＧＰの溶液を乾固させると、複数のＴＨＧＰが脱水縮合したポリマー構造の固体有機ゲルマニウム化合物が生成される。Ｇｅ-１３２はこうして生成される固体有機ゲルマニウム化合物の一種である。
ＴＨＧＰは、化３で示されるように、糖類などが有する１，２-シスジオール構造と錯体を形成する。
（３）
その強度は糖によって異なり、化４で示されるように、D-グルコースとD-フルクトースを比較した場合、D-フルクトースの方が錯体を形成しやすい。
（４）
このようにＴＨＧＰは、シス-ジオール含有化合物との脱水縮合によりラクトン型のＴＨＧＰ-シス-ジオール錯体を形成し、当該シス-ジオール含有化合物の生理的機能を制御するものと考えられている（非特許文献５）。相互作用による生理的機能制御の例として、ＴＨＧＰがアデノシンやＡＴＰと錯体を形成することでこれらとＰ１あるいはＰ２受容体との結合を阻害し、疼痛抑制に関与し得ることが報告されている（非特許文献６）。このような知見から、Ｇｅ-１３２が示す種々の生理作用は、生体内で加水分解されることで生成するＴＨＧＰと生体成分との相互作用によって発揮されているものと考えられている。
その強度は糖によって異なり、化４で示されるように、D-グルコースとD-フルクトースを比較した場合、D-フルクトースの方が錯体を形成しやすい。
このようにＴＨＧＰは、シス-ジオール含有化合物との脱水縮合によりラクトン型のＴＨＧＰ-シス-ジオール錯体を形成し、当該シス-ジオール含有化合物の生理的機能を制御するものと考えられている（非特許文献５）。相互作用による生理的機能制御の例として、ＴＨＧＰがアデノシンやＡＴＰと錯体を形成することでこれらとＰ１あるいはＰ２受容体との結合を阻害し、疼痛抑制に関与し得ることが報告されている（非特許文献６）。このような知見から、Ｇｅ-１３２が示す種々の生理作用は、生体内で加水分解されることで生成するＴＨＧＰと生体成分との相互作用によって発揮されているものと考えられている。
ＴＨＧＰ存在下でD-グルコースを基質にD-キシロースイソメラーゼを反応させた場合、化５で示されるように、平衡比が錯体を形成しやすいD-フルクトース側に偏ることが報告されている（非特許文献４）。D-グルコースとD-フルクトースの平衡比は５５：４５から２０：８０に変化する。
（５）
ＴＨＧＰ濃度の考察
一般式６で示すように、Gｅ-１３２の１モルおよび単糖1モルは、水中では、ＴＨＧＰ２モルと単糖１モルになる。
（６）
実験例６で説明されているように、１Ｍの糖に対して１ＭのＴＨＧＰを用いるのが平衡比への影響を調査するには最適であることが示唆されている。
一般式６で示すように、Gｅ-１３２の１モルおよび単糖1モルは、水中では、ＴＨＧＰ２モルと単糖１モルになる。
実験例６で説明されているように、１Ｍの糖に対して１ＭのＴＨＧＰを用いるのが平衡比への影響を調査するには最適であることが示唆されている。
以下に、本発明の実施例の実験例からの結果をまとめる。
Ｇｅ-１３２による希少糖生産の最適化のため、すべてのイズモリング反応に対する効果を調査できる。
ＤＴＥは全てのケトースの３位をエピ化する酵素であり、D-フルクトースとD-アルロース、L-ソルボースとL-タガトース、D-タガトースとD-ソルボース、L-アルロースとL-フルクトース、に作用するという非常に幅広い基質特異性を有する酵素である。このＤＴＥの発見によって、すべての単糖がリング状につながり、単糖の知識の構造化が完成し、イズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）と名付けた（図１１）。
実施例の実験例でＴＨＧＰが糖の平衡比に及ぼす影響の調査を実施した。ポリ-トランス-２-カルボキシエチルゲルマセスキオキサン（Ｇｅ-１３２）は示性式［（ＧｅＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）２Ｏ３］ｎで表される水溶性の有機ゲルマニウム化合物であり、水溶液中で３-（トリヒドロキシゲルミル）プロピオン酸（ＴＨＧＰ）に加水分解される。ＴＨＧＰは糖類などが有する１，２-シスジオール構造と錯体を形成する。その強度は糖によって異なることが知られており、D-グルコースとD-フルクトースを比較した場合、D-フルクトースの方が錯体を形成しやすい。ＴＨＧＰ存在下でD-グルコースを基質にD-キシロースイソメラーゼを反応させた場合、平衡比が錯体を形成しやすいD-フルクトース側に偏ることが報告されている。しかしながら、少なくとも１種の希少糖を含む単糖間での平衡状態を含む化学反応系において、あるいは、ケトースおよびケトース間での平衡状態を含む化学反応系において、同様の挙動を示すことは、実験的に証明されている報告は見いだせない。
Ｇｅ-１３２による希少糖生産の最適化のため、すべてのイズモリング反応に対する効果を調査できる。
ＤＴＥは全てのケトースの３位をエピ化する酵素であり、D-フルクトースとD-アルロース、L-ソルボースとL-タガトース、D-タガトースとD-ソルボース、L-アルロースとL-フルクトース、に作用するという非常に幅広い基質特異性を有する酵素である。このＤＴＥの発見によって、すべての単糖がリング状につながり、単糖の知識の構造化が完成し、イズモリング（Ｉｚｕｍｏｒｉｎｇ）と名付けた（図１１）。
実施例の実験例でＴＨＧＰが糖の平衡比に及ぼす影響の調査を実施した。ポリ-トランス-２-カルボキシエチルゲルマセスキオキサン（Ｇｅ-１３２）は示性式［（ＧｅＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ）２Ｏ３］ｎで表される水溶性の有機ゲルマニウム化合物であり、水溶液中で３-（トリヒドロキシゲルミル）プロピオン酸（ＴＨＧＰ）に加水分解される。ＴＨＧＰは糖類などが有する１，２-シスジオール構造と錯体を形成する。その強度は糖によって異なることが知られており、D-グルコースとD-フルクトースを比較した場合、D-フルクトースの方が錯体を形成しやすい。ＴＨＧＰ存在下でD-グルコースを基質にD-キシロースイソメラーゼを反応させた場合、平衡比が錯体を形成しやすいD-フルクトース側に偏ることが報告されている。しかしながら、少なくとも１種の希少糖を含む単糖間での平衡状態を含む化学反応系において、あるいは、ケトースおよびケトース間での平衡状態を含む化学反応系において、同様の挙動を示すことは、実験的に証明されている報告は見いだせない。
実施例の実験例におけるＴＨＧＰが希少糖の平衡比に及ぼす影響を調査した結果をまとめた。
１． 固定化グルコースイソメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、D-グルコースをD-フルクトースに変換するD-グルコースとD-フルクトース間の平衡反応は、５５：４５で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、１９：８１で平衡に達した。
２． ケトース３-エピメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、D-フルクトースをD-アルロースに変換するD-フルクトースとD-アルロース間の平衡反応は、７６：２４で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、３８：６２で平衡に達した。
３． ケトース３-エピメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、L-ソルボースをL-タガトースに変換するL-ソルボースとL-タガトースの平衡反応は、７４：２６で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、７４：２６で平衡に達した。
４． L-ラムノースイソメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、D-アルロースをD-アロースに変換するD-アルロースとD-アロース間の平衡反応は、６６：３４で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、１００：０で平衡に達した。
５． D-キシルロースイソメラーゼおよびケトース３-エピメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、D-キシロースをD-キシルロースおよびD-リブロースに変換するD-キシロースとD-キシルロースおよびD-リブロース間の平衡反応は、７３：１６：１１で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、１１：６１：２８で平衡に達した。
６． D-キシロースイソメラーゼおよびケトース３-エピメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、D-グルコースをD-フルクトースおよびD-アルロースに変換するD-グルコースとD-フルクトースおよびD-アルロース間の平衡反応は、４５：４０：１５で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、６：３６：５８で平衡に達した。
１． 固定化グルコースイソメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、D-グルコースをD-フルクトースに変換するD-グルコースとD-フルクトース間の平衡反応は、５５：４５で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、１９：８１で平衡に達した。
２． ケトース３-エピメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、D-フルクトースをD-アルロースに変換するD-フルクトースとD-アルロース間の平衡反応は、７６：２４で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、３８：６２で平衡に達した。
３． ケトース３-エピメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、L-ソルボースをL-タガトースに変換するL-ソルボースとL-タガトースの平衡反応は、７４：２６で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、７４：２６で平衡に達した。
４． L-ラムノースイソメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、D-アルロースをD-アロースに変換するD-アルロースとD-アロース間の平衡反応は、６６：３４で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、１００：０で平衡に達した。
５． D-キシルロースイソメラーゼおよびケトース３-エピメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、D-キシロースをD-キシルロースおよびD-リブロースに変換するD-キシロースとD-キシルロースおよびD-リブロース間の平衡反応は、７３：１６：１１で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、１１：６１：２８で平衡に達した。
６． D-キシロースイソメラーゼおよびケトース３-エピメラーゼを作用させて、Ｇｅ-１３２の存在なしで、D-グルコースをD-フルクトースおよびD-アルロースに変換するD-グルコースとD-フルクトースおよびD-アルロース間の平衡反応は、４５：４０：１５で平衡に達した。Ｇｅ-１３２の存在下では、６：３６：５８で平衡に達した。
本発明の単糖間平衡反応促進剤は、ケトースおよびケトース間での平衡状態を含む化学反応系であれば、D-グルコースとD-フルクトースおよびD-アルロース間の平衡反応のように、同時に、アルドースおよびケトース間での平衡状態が存在していてもよい。
イズモリングに含まれるすべての異性化反応のみならず、少なくとも一つが希少糖である単糖間での平衡状態を含む化学反応系における、単糖の異性化酵素全般に適用され得る。
イズモリングに含まれるすべての異性化反応のみならず、少なくとも一つが希少糖である単糖間での平衡状態を含む化学反応系における、単糖の異性化酵素全般に適用され得る。
以下に、本発明の詳細を実施例で示す。本発明はこれらの実施例で限定されることはない。
本実験例で使用した
１．超音波ホモジナイザー：Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓоｎｉｆｉｅｒ（登録商標） Ｍоｄｅｌｓ ４５０Ｄ（Ｂｒａｎｓоｎ社製）
２．有機ゲルマニウム化合物：（株）浅井ゲルマニウム研究所製のＧｅ―１３２
３．酵素：
［実験例１］Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株
［実験例２］スイートザイム（Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ）（ノボザイムズ ジャパン（株））、固定化グルコースイソメラーゼであり、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来
［実験例３］Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来組換えL-ラムノースイソメラーゼ（ＬＲｈＩ）
〔L-ラムノースイソメラーゼは出願全周知の酵素であり、単糖間の平衡反応における平衡比を有機ゲルマニウム化合物との錯体形成能の強度を調べるためには、L-ラムノースイソメラーゼであれば酵素の起源や分類名称が何であってもよいことは明らかである。
念のために述べると、実験に用いたＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２０２（特許文献６）であり、２０２０年２月１５日で保管終了しているが、本学農学部で保管しており、分譲可能である。また、ＮＮ-６株の特徴を解析する上で必須となるゲノムの全塩基配列を解析し、得られた配列情報から遺伝子の同定と機能の推定を行って、データベースに登録済みである。その情報（配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）は、本出願後に公開される投稿論文発表と同時に公開される。〕
配列番号２
MAEFRIAQDVVARENDKRAKALKEDYEALGANLARRGIDIEAVTGKVENFFVAVPSWGVGTGGTRFARFPGAGEPRGIFDKLDDCAVIQQLTRATPNVSLHIPWDKADPKELKAKGDALGLGFDAMNSNTFSDAPGQKHSYKYGSLSHTDAATRAQAVEHNLECIEIGKAIGSKALTVWVGDGSNFPGQSDFTKAFERYLAAMAEIYKGLPDDWKLFSEHKMYEPAFYSTVVQDWGTNYLIAQTLGPKAQCLVDLGHHAPNTNIEMIVARLIQFGKLGGFHFNDSKYGDDDLDAGAIEPYRLFLVFNELVDAEARGVKGFHPAHMIDQSHNVTDPIESLINSANEIRRAYAQALLVDRMALSGYQDDNDALMATETLKRAYRTDVEPILAEARRRTGGAVDPVATYRASGYRAKVAAERPASVAGGGGII
［実験例４］Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来組換えL-リブロース３-エピメラーゼ（ＬＲＥＡ）
〔L-リブロース3-エピメラーゼAは出願全周知の酵素である。単糖間の平衡反応における平衡比を有機ゲルマニウム化合物との錯体形成能の強度を調べるためには、L-リブロース３-エピメラーゼであれば酵素の起源や分類名称が何であってもよいことは明らかである。
念のために述べると、実験に用いたＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２０２（特許文献６）であり、２０２０年２月１５日で保管終了しているが、本学農学部で保管しており、分譲可能である。また、ＮＮ-６株の特徴を解析する上で必須となるゲノムの全塩基配列を解析し、得られた配列情報から遺伝子の同定と機能の推定を行って、データベースに登録済みである。その情報（（配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）は、本出願後に公開される投稿論文発表と同時に公開される。〕
配列番号３
MKNKLGLHANVWVRDWGREDCVLAVNKTAELGFDIIEISAPDPKALDIAFTAAELRKAGISANLSLGLDAESDISSGDPARVKAGETRLREVIAAAAELGSSHVCGILYSAFQKYPEPPTAAGIAGAVEVLRRIGEEAGRHGITLGLEVVNRYETNVLNTAGQGVEFCKRVGLPNVKVHLDSYHMNIEEADMEMALVDTGAHLGYFHIGESNRGYLGAGSVDFGRIFNGLARIGYDGPIVFESFSSAVVGQPLCGILGIWRNLWEDGEDLARHAKTFIEARLKSAREVGLEASRSTLP
［実験例５］固定化Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来D-キシロースイソメラーゼ(ＤＸＩ)およびL-リブロース３-エピメラーゼ(ＬＲＥ)
実験例４と同様に、実験例５のＬＲＥは、特許文献６ではＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ.由来のＤＥＡと記載されており、その後の研究でL-リブロース３-エピメラーゼであることが判明した。これもケトース３-エピメラーゼの一種である。また、本菌株のＬＲＥは複数あり、組換えＬＲＥのうちの１種をＬＲＥＡとしている。
D-キシロースイソメラーゼは出願全周知の酵素である。単糖間の平衡反応における平衡比を有機ゲルマニウム化合物との錯体形成能の強度を調べるためには、D-キシロースイソメラーゼであれば酵素の起源や分類名称が何であってもよいことは明らかである。
念のために述べると、実験に用いたＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２０２（特許文献６）であり、２０２０年２月１５日で保管終了しているが、本学農学部で保管しており、分譲可能である。また、ＮＮ-６株の特徴を解析する上で必須となるゲノムの全塩基配列を解析し、得られた配列情報から遺伝子の同定と機能の推定を行って、データベースに登録済みである。その情報（配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）は、上記２種（配列番号２，３）と異なり、未登録である。元菌のD-キシロースイソメラーゼのN末端アミノ酸配列および、以下の配列の相同性検索の結果からD-キシロースイソメラーゼであると判断している。
配列番号４
MATGFFGDIAKIRYEGPESTNPLAFRHYNPDEIVMGKRMEDHLRFAVAYWHTFVWPGGDPFGGQTFERPWFEDSMKAAKLKADVAFEFFQLLGVPFYCFHDADVRPEGKDFVENTRNLNEIVDYFAEKQAATGVKLLWGTANLFSNRRYMGGAATNPDPDVFAFAAATVKTCIDATQRLGGDNYVLWGGREGYETLLNTNLGQELDQLGRFVNMVVEYKHKIGFKGAILIEPKPQEPTKHQYDYDVATVYGFLKKYGLENEVKLNIEQGHAILAGHSFEHELALANALGIFGSIDMNRNDYQSGWDTDQFPNNVPEMALAYYQVLAGGGFTTGGTNFDAKLRRQSIEPADLLIGHIGGMDCCARGLKAAAKMIEDKALSGPLAERYAGWQKPEAQKILSGGSSLEALEAYVRGGNVNPQPRSGRQEFLENVVNRYV
［実験例６］Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来ＤＴＥ組換え大腸菌を培養した。
本実験例で使用した
１．超音波ホモジナイザー：Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓоｎｉｆｉｅｒ（登録商標） Ｍоｄｅｌｓ ４５０Ｄ（Ｂｒａｎｓоｎ社製）
２．有機ゲルマニウム化合物：（株）浅井ゲルマニウム研究所製のＧｅ―１３２
３．酵素：
［実験例１］Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株
［実験例２］スイートザイム（Ｓｗｅｅｔｚｙｍｅ）（ノボザイムズ ジャパン（株））、固定化グルコースイソメラーゼであり、Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｓｐ．由来
［実験例３］Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来組換えL-ラムノースイソメラーゼ（ＬＲｈＩ）
〔L-ラムノースイソメラーゼは出願全周知の酵素であり、単糖間の平衡反応における平衡比を有機ゲルマニウム化合物との錯体形成能の強度を調べるためには、L-ラムノースイソメラーゼであれば酵素の起源や分類名称が何であってもよいことは明らかである。
念のために述べると、実験に用いたＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２０２（特許文献６）であり、２０２０年２月１５日で保管終了しているが、本学農学部で保管しており、分譲可能である。また、ＮＮ-６株の特徴を解析する上で必須となるゲノムの全塩基配列を解析し、得られた配列情報から遺伝子の同定と機能の推定を行って、データベースに登録済みである。その情報（配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）は、本出願後に公開される投稿論文発表と同時に公開される。〕
配列番号２
MAEFRIAQDVVARENDKRAKALKEDYEALGANLARRGIDIEAVTGKVENFFVAVPSWGVGTGGTRFARFPGAGEPRGIFDKLDDCAVIQQLTRATPNVSLHIPWDKADPKELKAKGDALGLGFDAMNSNTFSDAPGQKHSYKYGSLSHTDAATRAQAVEHNLECIEIGKAIGSKALTVWVGDGSNFPGQSDFTKAFERYLAAMAEIYKGLPDDWKLFSEHKMYEPAFYSTVVQDWGTNYLIAQTLGPKAQCLVDLGHHAPNTNIEMIVARLIQFGKLGGFHFNDSKYGDDDLDAGAIEPYRLFLVFNELVDAEARGVKGFHPAHMIDQSHNVTDPIESLINSANEIRRAYAQALLVDRMALSGYQDDNDALMATETLKRAYRTDVEPILAEARRRTGGAVDPVATYRASGYRAKVAAERPASVAGGGGII
［実験例４］Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来組換えL-リブロース３-エピメラーゼ（ＬＲＥＡ）
〔L-リブロース3-エピメラーゼAは出願全周知の酵素である。単糖間の平衡反応における平衡比を有機ゲルマニウム化合物との錯体形成能の強度を調べるためには、L-リブロース３-エピメラーゼであれば酵素の起源や分類名称が何であってもよいことは明らかである。
念のために述べると、実験に用いたＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２０２（特許文献６）であり、２０２０年２月１５日で保管終了しているが、本学農学部で保管しており、分譲可能である。また、ＮＮ-６株の特徴を解析する上で必須となるゲノムの全塩基配列を解析し、得られた配列情報から遺伝子の同定と機能の推定を行って、データベースに登録済みである。その情報（（配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）は、本出願後に公開される投稿論文発表と同時に公開される。〕
配列番号３
MKNKLGLHANVWVRDWGREDCVLAVNKTAELGFDIIEISAPDPKALDIAFTAAELRKAGISANLSLGLDAESDISSGDPARVKAGETRLREVIAAAAELGSSHVCGILYSAFQKYPEPPTAAGIAGAVEVLRRIGEEAGRHGITLGLEVVNRYETNVLNTAGQGVEFCKRVGLPNVKVHLDSYHMNIEEADMEMALVDTGAHLGYFHIGESNRGYLGAGSVDFGRIFNGLARIGYDGPIVFESFSSAVVGQPLCGILGIWRNLWEDGEDLARHAKTFIEARLKSAREVGLEASRSTLP
［実験例５］固定化Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来D-キシロースイソメラーゼ(ＤＸＩ)およびL-リブロース３-エピメラーゼ(ＬＲＥ)
実験例４と同様に、実験例５のＬＲＥは、特許文献６ではＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ.由来のＤＥＡと記載されており、その後の研究でL-リブロース３-エピメラーゼであることが判明した。これもケトース３-エピメラーゼの一種である。また、本菌株のＬＲＥは複数あり、組換えＬＲＥのうちの１種をＬＲＥＡとしている。
D-キシロースイソメラーゼは出願全周知の酵素である。単糖間の平衡反応における平衡比を有機ゲルマニウム化合物との錯体形成能の強度を調べるためには、D-キシロースイソメラーゼであれば酵素の起源や分類名称が何であってもよいことは明らかである。
念のために述べると、実験に用いたＳｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６は、受託番号ＮＩＴＥ Ｐ－０２２０２（特許文献６）であり、２０２０年２月１５日で保管終了しているが、本学農学部で保管しており、分譲可能である。また、ＮＮ-６株の特徴を解析する上で必須となるゲノムの全塩基配列を解析し、得られた配列情報から遺伝子の同定と機能の推定を行って、データベースに登録済みである。その情報（配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質）は、上記２種（配列番号２，３）と異なり、未登録である。元菌のD-キシロースイソメラーゼのN末端アミノ酸配列および、以下の配列の相同性検索の結果からD-キシロースイソメラーゼであると判断している。
配列番号４
MATGFFGDIAKIRYEGPESTNPLAFRHYNPDEIVMGKRMEDHLRFAVAYWHTFVWPGGDPFGGQTFERPWFEDSMKAAKLKADVAFEFFQLLGVPFYCFHDADVRPEGKDFVENTRNLNEIVDYFAEKQAATGVKLLWGTANLFSNRRYMGGAATNPDPDVFAFAAATVKTCIDATQRLGGDNYVLWGGREGYETLLNTNLGQELDQLGRFVNMVVEYKHKIGFKGAILIEPKPQEPTKHQYDYDVATVYGFLKKYGLENEVKLNIEQGHAILAGHSFEHELALANALGIFGSIDMNRNDYQSGWDTDQFPNNVPEMALAYYQVLAGGGFTTGGTNFDAKLRRQSIEPADLLIGHIGGMDCCARGLKAAAKMIEDKALSGPLAERYAGWQKPEAQKILSGGSSLEALEAYVRGGNVNPQPRSGRQEFLENVVNRYV
［実験例６］Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来ＤＴＥ組換え大腸菌を培養した。
［実験例１］
実験方法
１－１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来D-タガトース3-エピメラーゼ(ＤＴＥ)を用いたD-フルクトースとD-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
〈実験方法の概略〉ＳＴ-２４株由来組換えＤＴＥの調製（ＳＴ-２４ :
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４、ＤＴＥ: D-tagatose 3-epimerase）→前培養（３ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、一晩）→培養（１００ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、O.D.６００ｎｍ=０．４－０．８）→誘導（１ｍＭ ＩＰＴＧ、４時間）→緩衝液（５０ｍ Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））による洗浄×2→超音波処理（振幅４０％、２０秒、４セット）→遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、５分）→酵素反応→ＨＰＬＣ分析
１－１－１）ＴＨＧＰ溶液の調整
Ｇｅ-１３２を少量の超純水に懸濁し、Ｇｅ-１３２が完全に溶解するまで水酸化ナトリウム水溶液を添加した。その後、ｐＨ７．５になるまで水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ＴＨＧＰが２Ｍとなるように超純水でメスアップした。
１－１－２）菌体の培養
１００μｇ/ｍＬのアンピシリンを含むＳＢ培地３ｍＬに組換え大腸菌を植菌し、一晩前培養した。前培養液１００μＬを同培地１００ｍＬに植え継ぎ、３０℃、２００ｒｐｍでＯ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．４－０．８になるまで培養した。その後、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、３０℃、２００ｒｐｍで４時間誘導した。培地組成は表１に示した。表１に示す通り、ＳＢ培地（ｐＨ７．０）は、ポリペプトン ３．５％、イースト抽出物 ２％、NａＣｌ １％、アンピシリン １００μｇ/ｍＬで構成される。
実験方法
１－１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来D-タガトース3-エピメラーゼ(ＤＴＥ)を用いたD-フルクトースとD-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
〈実験方法の概略〉ＳＴ-２４株由来組換えＤＴＥの調製（ＳＴ-２４ :
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４、ＤＴＥ: D-tagatose 3-epimerase）→前培養（３ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、一晩）→培養（１００ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、O.D.６００ｎｍ=０．４－０．８）→誘導（１ｍＭ ＩＰＴＧ、４時間）→緩衝液（５０ｍ Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））による洗浄×2→超音波処理（振幅４０％、２０秒、４セット）→遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、５分）→酵素反応→ＨＰＬＣ分析
１－１－１）ＴＨＧＰ溶液の調整
Ｇｅ-１３２を少量の超純水に懸濁し、Ｇｅ-１３２が完全に溶解するまで水酸化ナトリウム水溶液を添加した。その後、ｐＨ７．５になるまで水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ＴＨＧＰが２Ｍとなるように超純水でメスアップした。
１－１－２）菌体の培養
１００μｇ/ｍＬのアンピシリンを含むＳＢ培地３ｍＬに組換え大腸菌を植菌し、一晩前培養した。前培養液１００μＬを同培地１００ｍＬに植え継ぎ、３０℃、２００ｒｐｍでＯ．Ｄ．６００ｎｍ＝０．４－０．８になるまで培養した。その後、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、３０℃、２００ｒｐｍで４時間誘導した。培地組成は表１に示した。表１に示す通り、ＳＢ培地（ｐＨ７．０）は、ポリペプトン ３．５％、イースト抽出物 ２％、NａＣｌ １％、アンピシリン １００μｇ/ｍＬで構成される。
１－１－３）酵素反応
１００００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により１－１－２）の培養液から菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。
洗浄後の菌体を同緩衝液５ｍＬに懸濁し、振幅（Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）４０％、２０秒で４回超音波破砕した後、４℃、９０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心後の上清を粗酵素として０．５ＭのD-フルクトースを基質に酵素反応させた。反応液から適宜６００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。
酵素反応の条件を表２に示した。表２に示す通り、D-フルクトースのための酵素反応の条件は、１Ｍ Ｇｅ-１３２ ３００μＬ、１Ｍ D-フルクトース １５０μＬ、酵素 １５０μＬ、温度 ４０℃、緩衝液 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる。
ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。
１００００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により１－１－２）の培養液から菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で２回洗浄した。
洗浄後の菌体を同緩衝液５ｍＬに懸濁し、振幅（Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）４０％、２０秒で４回超音波破砕した後、４℃、９０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心後の上清を粗酵素として０．５ＭのD-フルクトースを基質に酵素反応させた。反応液から適宜６００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。
酵素反応の条件を表２に示した。表２に示す通り、D-フルクトースのための酵素反応の条件は、１Ｍ Ｇｅ-１３２ ３００μＬ、１Ｍ D-フルクトース １５０μＬ、酵素 １５０μＬ、温度 ４０℃、緩衝液 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）からなる。
ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。
１－１－４）酸処理条件の検討
ＴＨＧＰと糖の配位結合を解離させるため、熱処理後のサンプル１００μＬに０－３Ｎの塩酸を１００μＬ添加し、氷上で数時間静置してＧｅ-１３２を析出させた。その後、１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を回収した。
１－１－５）ＨＰＬＣ分析
１―１－４）で得られたサンプルを糖濃度が５０ｍＭとなるように超純水で希釈した。希釈したサンプルに乾燥させた脱塩樹脂（陽イオン交換樹脂ダイヤイオンSK1B(H+型)および陰イオン交換樹脂アンバーライトIRA411(CO3 2-型)を１：１で混合したもの）を添加し、室温で３０分撹拌して脱塩処理した。脱塩後の反応液をウルトラフリー-MC.GV ０．２２μｍに移し６０００ｒｐｍの遠心分離によりろ過した。得られたサンプルを表３に示した条件でＨＰＬＣ分析し、糖組成を分析した。さらに、コントロールの反応開始時点の基質のエリア面積を１００％として糖の回収率を算出した。
ＴＨＧＰと糖の配位結合を解離させるため、熱処理後のサンプル１００μＬに０－３Ｎの塩酸を１００μＬ添加し、氷上で数時間静置してＧｅ-１３２を析出させた。その後、１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を回収した。
１－１－５）ＨＰＬＣ分析
１―１－４）で得られたサンプルを糖濃度が５０ｍＭとなるように超純水で希釈した。希釈したサンプルに乾燥させた脱塩樹脂（陽イオン交換樹脂ダイヤイオンSK1B(H+型)および陰イオン交換樹脂アンバーライトIRA411(CO3 2-型)を１：１で混合したもの）を添加し、室温で３０分撹拌して脱塩処理した。脱塩後の反応液をウルトラフリー-MC.GV ０．２２μｍに移し６０００ｒｐｍの遠心分離によりろ過した。得られたサンプルを表３に示した条件でＨＰＬＣ分析し、糖組成を分析した。さらに、コントロールの反応開始時点の基質のエリア面積を１００％として糖の回収率を算出した。
１－１－６）希釈濃度の検討
マイクロチューブに２ＭのＴＨＧＰ溶液（ｐＨ７．５）と１ＭのD-グルコース、D-フルクトース、D-アルロース溶液を１５０μＬずつ添加し、常温で数時間静置させ、ＴＨＧＰと糖を結合させた。上記の混合液から１００μＬを回収し２Ｎの塩酸を１００μＬ添加し、氷中で数時間静置してＧｅ-１３２を析出させた。その後、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を回収した。塩酸処理した混合液および、塩酸添加前の混合液を糖濃度が５ｍＭ、２．５ｍＭ、１ｍＭになるよう超純水で希釈し、１－１－５）と同様にＨＰＬＣ分析にて糖の量を測定した。ポジティブコントロールとしてＴＨＧＰの代わりに超純水を添加したものとエリア面積を比較することで糖の解離率を算出した。
１－１－７）D-フルクトースとD-アルロースの平衡比へのＴＨＧＰの影響の調査
１－１－３）と同様に酵素を調製し、反応液を６００μＬにスケールダウンして酵素反応させた。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。熱処理後のサンプル８０μＬに２Ｎの塩酸を８０μＬ添加し、氷中で数時間静置してＧｅ-１３２を析出させた。１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により上清を回収し、糖濃度が１ｍＭになるよう超純水で希釈した。１－１－５）と同様に操作を施してＨＰＬＣ分析し、糖組成を確認した。
マイクロチューブに２ＭのＴＨＧＰ溶液（ｐＨ７．５）と１ＭのD-グルコース、D-フルクトース、D-アルロース溶液を１５０μＬずつ添加し、常温で数時間静置させ、ＴＨＧＰと糖を結合させた。上記の混合液から１００μＬを回収し２Ｎの塩酸を１００μＬ添加し、氷中で数時間静置してＧｅ-１３２を析出させた。その後、１５０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、上清を回収した。塩酸処理した混合液および、塩酸添加前の混合液を糖濃度が５ｍＭ、２．５ｍＭ、１ｍＭになるよう超純水で希釈し、１－１－５）と同様にＨＰＬＣ分析にて糖の量を測定した。ポジティブコントロールとしてＴＨＧＰの代わりに超純水を添加したものとエリア面積を比較することで糖の解離率を算出した。
１－１－７）D-フルクトースとD-アルロースの平衡比へのＴＨＧＰの影響の調査
１－１－３）と同様に酵素を調製し、反応液を６００μＬにスケールダウンして酵素反応させた。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。熱処理後のサンプル８０μＬに２Ｎの塩酸を８０μＬ添加し、氷中で数時間静置してＧｅ-１３２を析出させた。１５０００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により上清を回収し、糖濃度が１ｍＭになるよう超純水で希釈した。１－１－５）と同様に操作を施してＨＰＬＣ分析し、糖組成を確認した。
［結果および考察］
１－２．実験例１の結果および考察
１－２－１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来DTEを用いたD-フルクトースとD-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査結果
ＳＴ-２４株由来のＤＴＥをD-フルクトースに４８時間反応させた。ＴＨＧＰを添加した反応液をそのままＨＰＬＣ分析すると糖の総エリア面積が減少していたため、塩酸処理によりＧｅ-１３２を析出させることで回収率の改善を試みた。
反応液に等量の０－３Ｎ塩酸を添加したところ、２Ｎまでは塩酸の濃度が増加すると糖の転換率および回収率が増加した(図１，２)。２Ｎと３Ｎではほとんど差が見られなかったため、２Ｎの塩酸による酸処理が最適条件とした。
ＴＨＧＰと単糖の錯体は希釈によって解離するため、最適な糖液の希釈濃度を検討した(図３)。D-グルコースは５ｍＭに希釈することでほぼ完全に解離した。D-フルクトースは５ｍＭの希釈では完全に解離せず、１ｍＭに希釈することでほぼ完全に解離した。D-アルロースは１ｍＭに希釈しても６４．４％しか解離しなかった。２Ｎの塩酸で処理した後に１ｍＭまで希釈することによりほぼ１００％解離した。したがって、ＨＰＬＣ分析する際は塩酸処理した後、１ｍＭに希釈することを最適条件とした。範囲としては０ｍＭ以上であればよく、最適なのは１ｍＭである。
以上の結果より、D-アルロース、D-フルクトース、D-グルコースの順番で錯体形成能が高いことが示唆された。
再度ＳＴ-２４株由来のＤＴＥをD-フルクトースに４８時間反応させ、上記の条件でＨＰＬＣ分析した。酵素反応ＴＨＧＰ無添加の反応液は反応開始４８時間後D-フルクトース:D-アルロース＝７６．７：２３．３となった(図４上)。一方、ＴＨＧＰを添加した反応液は反応開始４８時間後にD-フルクトース:D-アルロース＝３７．５：６２．５となり、D-アルロース側に平衡が偏った(図４下)。そのため、D-アルロースはD-フルクトースよりもＴＨＧＰとの錯体形成能が高いことが示唆された。
１－２．実験例１の結果および考察
１－２－１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来DTEを用いたD-フルクトースとD-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査結果
ＳＴ-２４株由来のＤＴＥをD-フルクトースに４８時間反応させた。ＴＨＧＰを添加した反応液をそのままＨＰＬＣ分析すると糖の総エリア面積が減少していたため、塩酸処理によりＧｅ-１３２を析出させることで回収率の改善を試みた。
反応液に等量の０－３Ｎ塩酸を添加したところ、２Ｎまでは塩酸の濃度が増加すると糖の転換率および回収率が増加した(図１，２)。２Ｎと３Ｎではほとんど差が見られなかったため、２Ｎの塩酸による酸処理が最適条件とした。
ＴＨＧＰと単糖の錯体は希釈によって解離するため、最適な糖液の希釈濃度を検討した(図３)。D-グルコースは５ｍＭに希釈することでほぼ完全に解離した。D-フルクトースは５ｍＭの希釈では完全に解離せず、１ｍＭに希釈することでほぼ完全に解離した。D-アルロースは１ｍＭに希釈しても６４．４％しか解離しなかった。２Ｎの塩酸で処理した後に１ｍＭまで希釈することによりほぼ１００％解離した。したがって、ＨＰＬＣ分析する際は塩酸処理した後、１ｍＭに希釈することを最適条件とした。範囲としては０ｍＭ以上であればよく、最適なのは１ｍＭである。
以上の結果より、D-アルロース、D-フルクトース、D-グルコースの順番で錯体形成能が高いことが示唆された。
再度ＳＴ-２４株由来のＤＴＥをD-フルクトースに４８時間反応させ、上記の条件でＨＰＬＣ分析した。酵素反応ＴＨＧＰ無添加の反応液は反応開始４８時間後D-フルクトース:D-アルロース＝７６．７：２３．３となった(図４上)。一方、ＴＨＧＰを添加した反応液は反応開始４８時間後にD-フルクトース:D-アルロース＝３７．５：６２．５となり、D-アルロース側に平衡が偏った(図４下)。そのため、D-アルロースはD-フルクトースよりもＴＨＧＰとの錯体形成能が高いことが示唆された。
［実験例２］
実験方法
２－１）スイートザイムを用いたD-グルコースとD-フルクトース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
〈調査方法の概略〉スイートザイムの調製（超純水によるスイートザイムの洗浄×10）→酵素反応→熱処理（１００℃、３分）→ＨＣｌ処理（１Ｎ ＨＣｌ）→１ｍＭに希釈→ＨＰＬＣ分析）
２－１－１）酵素反応
１－１－１）に準じた操作により２Ｍ ＴＨＧＰ水溶液（ｐＨ７．０）を調整した。０．０５ｇのスイートザイムを１．５ｍＬマイクロチューブに添加し、純水で１０回洗浄した。洗浄したスイートザイムを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄して置換した。これを用いてD-グルコースを基質に酵素反応した。ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。
D-グルコースのための酵素反応の条件（酵素反応の組成など）を表４に示した。表４に示す通り、１Ｍ Ｇｅ-１３２（ｐＨ７．０） ３００μＬ、１Ｍ D-グルコースおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３００μＬ、スイートザイム ０．０５ｇ、温度 ４０℃、緩衝液 ５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）からなる。
実験方法
２－１）スイートザイムを用いたD-グルコースとD-フルクトース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
〈調査方法の概略〉スイートザイムの調製（超純水によるスイートザイムの洗浄×10）→酵素反応→熱処理（１００℃、３分）→ＨＣｌ処理（１Ｎ ＨＣｌ）→１ｍＭに希釈→ＨＰＬＣ分析）
２－１－１）酵素反応
１－１－１）に準じた操作により２Ｍ ＴＨＧＰ水溶液（ｐＨ７．０）を調整した。０．０５ｇのスイートザイムを１．５ｍＬマイクロチューブに添加し、純水で１０回洗浄した。洗浄したスイートザイムを５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄して置換した。これを用いてD-グルコースを基質に酵素反応した。ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。
D-グルコースのための酵素反応の条件（酵素反応の組成など）を表４に示した。表４に示す通り、１Ｍ Ｇｅ-１３２（ｐＨ７．０） ３００μＬ、１Ｍ D-グルコースおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３００μＬ、スイートザイム ０．０５ｇ、温度 ４０℃、緩衝液 ５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）からなる。
２－１－２）ＨＰＬＣ分析
１－１－７）と同様に反応液を希釈し、１－１－５）と同様の操作を施して糖組成を分析した。
１－１－７）と同様に反応液を希釈し、１－１－５）と同様の操作を施して糖組成を分析した。
［結果および考察］
２－２．実験例２の結果および考察
２－２－１）スイートザイムを用いたD-グルコースとD-フルクトース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査結果
スイートザイムを用いてD-グルコースを基質に酵素反応させた。ＴＨＧＰ無添加の反応液は反応開始８時間後にD-グルコース:D-フルクトース＝５４．７：４５．３となり、反応開始４８時間後ではD-グルコース:D-フルクトース＝４８．６：５１．４となった(図５上)。２４時間後以降はD-フルクトースの比率が増加しているが、この時点では菌体（雑菌）が生えていたため、D-グルコースが資化され見かけ上のD-フルクトース比が増加したと考えられた。
一方、ＴＨＧＰを添加した反応液は反応開始８時間後にD-グルコース:D-フルクトース＝１８．６：８１．４となり、反応開始４８時間後ではD-グルコース:D-フルクトース＝９．１：９０．９となった。そのため、D-フルクトースはD-グルコースよりもＴＨＧＰとの錯体形成能が高いことが示唆された(図５下)。
２－２－１）の結果を踏まえて、D-アルロース、D-フルクトース、D-グルコースの順番でＴＨＧＰとの錯体形成能が高く、反応時の平衡比もこの順に偏ることが示唆された。
２－２．実験例２の結果および考察
２－２－１）スイートザイムを用いたD-グルコースとD-フルクトース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査結果
スイートザイムを用いてD-グルコースを基質に酵素反応させた。ＴＨＧＰ無添加の反応液は反応開始８時間後にD-グルコース:D-フルクトース＝５４．７：４５．３となり、反応開始４８時間後ではD-グルコース:D-フルクトース＝４８．６：５１．４となった(図５上)。２４時間後以降はD-フルクトースの比率が増加しているが、この時点では菌体（雑菌）が生えていたため、D-グルコースが資化され見かけ上のD-フルクトース比が増加したと考えられた。
一方、ＴＨＧＰを添加した反応液は反応開始８時間後にD-グルコース:D-フルクトース＝１８．６：８１．４となり、反応開始４８時間後ではD-グルコース:D-フルクトース＝９．１：９０．９となった。そのため、D-フルクトースはD-グルコースよりもＴＨＧＰとの錯体形成能が高いことが示唆された(図５下)。
２－２－１）の結果を踏まえて、D-アルロース、D-フルクトース、D-グルコースの順番でＴＨＧＰとの錯体形成能が高く、反応時の平衡比もこの順に偏ることが示唆された。
［実験例３］
実験方法
３－１）Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来組換えＬＲｈＩを用いたD-アロースとD-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
〈調査方法の概略〉ＮＮ-６株由来ＬＲｈＩの調製（ＮＮ-６：Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６、ＬＲｈＩ: L-ラムノースイソメラーゼ）→前培養（３ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、一晩）→培養（１００ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、Ｏ.Ｄ.６００ｎｍ＝０．４－０．８）→誘導（１ｍＭ ＩＰＴＧ、４時間）→緩衝液（５０ｍＭ グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０））による洗浄×２→超音波処理（振幅４０％、２０秒、４セット）→遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、５分）→酵素反応→ＨＰＬＣ分析
３－１－１）ＴＨＧＰ溶液の調整
１－１－１）と同様の操作を施し、２Ｍ ＴＨＧＰ水溶液（ｐＨ９．０）を調整した。
３－１－２）菌体の培養
１－１－２）と同様の操作を施し、Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来L-ラムノースイソメラーゼ(ＬＲｈＩ)組換え大腸菌を培養した。
３－１－３）酵素反応
１００００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により３－１－２）の培養液から菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＭグリシン‐ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）で２回洗浄した。洗浄後の菌体を同緩衝液５ｍＬに懸濁し、振幅４０％、２０秒で４回超音波破砕した後、４℃、９０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心後の上清を粗酵素としてD-アロースを基質に酵素反応させた。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。
D-アロースのための酵素反応の条件（酵素反応の組成など）を表５に示した。表５に示すとおり、１Ｍ Ｇｅ-１３２（ｐＨ９．０） ５００μＬ、１Ｍ D-アロースおよび４ｍＭ ＭｎＣｌ２ ２５０μＬ、酵素 ２５０μＬ、温度 ４５℃、緩衝液 ５０ｍＭ グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）からなる。
ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。
実験方法
３－１）Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来組換えＬＲｈＩを用いたD-アロースとD-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
〈調査方法の概略〉ＮＮ-６株由来ＬＲｈＩの調製（ＮＮ-６：Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６、ＬＲｈＩ: L-ラムノースイソメラーゼ）→前培養（３ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、一晩）→培養（１００ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、Ｏ.Ｄ.６００ｎｍ＝０．４－０．８）→誘導（１ｍＭ ＩＰＴＧ、４時間）→緩衝液（５０ｍＭ グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０））による洗浄×２→超音波処理（振幅４０％、２０秒、４セット）→遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、５分）→酵素反応→ＨＰＬＣ分析
３－１－１）ＴＨＧＰ溶液の調整
１－１－１）と同様の操作を施し、２Ｍ ＴＨＧＰ水溶液（ｐＨ９．０）を調整した。
３－１－２）菌体の培養
１－１－２）と同様の操作を施し、Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来L-ラムノースイソメラーゼ(ＬＲｈＩ)組換え大腸菌を培養した。
３－１－３）酵素反応
１００００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により３－１－２）の培養液から菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＭグリシン‐ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）で２回洗浄した。洗浄後の菌体を同緩衝液５ｍＬに懸濁し、振幅４０％、２０秒で４回超音波破砕した後、４℃、９０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心後の上清を粗酵素としてD-アロースを基質に酵素反応させた。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。
D-アロースのための酵素反応の条件（酵素反応の組成など）を表５に示した。表５に示すとおり、１Ｍ Ｇｅ-１３２（ｐＨ９．０） ５００μＬ、１Ｍ D-アロースおよび４ｍＭ ＭｎＣｌ２ ２５０μＬ、酵素 ２５０μＬ、温度 ４５℃、緩衝液 ５０ｍＭ グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）からなる。
ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。
３－１－４）ＨＰＬＣ分析
１－１－７）と同様に反応液を希釈し、１－１－５）と同様の操作を施して糖組成を分析した。
１－１－７）と同様に反応液を希釈し、１－１－５）と同様の操作を施して糖組成を分析した。
［結果および考察］
３－２．実験例３の結果および考察
３－２－１）Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来組換えＬＲｈＩを用いたD-アロースとD-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査結果
ＮＮ-６株由来組換えＬＲｈＩを用いてD-アロースを基質に酵素反応させた。ＴＨＧＰ無添加の反応液は反応開始１４４時間後にD-アロース:D-アルロース＝３６．９：６３．１となった(図６上)。ＴＨＧＰを添加した反応液は反応開始１４４時間後にD-アロース:D-アルロース＝０：１００となり、完全にD-アルロース側に平衡が移動した(図６下)。
D-アルロースはアロースと比較してＴＨＧＰとの錯体形成能が極めて高いことが示唆された。
３－２．実験例３の結果および考察
３－２－１）Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来組換えＬＲｈＩを用いたD-アロースとD-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査結果
ＮＮ-６株由来組換えＬＲｈＩを用いてD-アロースを基質に酵素反応させた。ＴＨＧＰ無添加の反応液は反応開始１４４時間後にD-アロース:D-アルロース＝３６．９：６３．１となった(図６上)。ＴＨＧＰを添加した反応液は反応開始１４４時間後にD-アロース:D-アルロース＝０：１００となり、完全にD-アルロース側に平衡が移動した(図６下)。
D-アルロースはアロースと比較してＴＨＧＰとの錯体形成能が極めて高いことが示唆された。
［実験例４］
実験方法
４－１）Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来組換えL-リブロース3-エピメラーゼＡを用いたL-ソルボースとL-タガトース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
〈調査方法の概略〉ＮＮ-６株由来ＬＲＥＡの調製（ＮＮ-６:Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６、ＬＲＥＡ：L-リボース３-エピメラーゼＡ）→前培養（３ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、一晩）→培養（１００ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、Ｏ.Ｄ.６００ｎｍ＝０．４－０．８）→誘導（１ｍＭ ＩＰＴＧ、４時間）→緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））による洗浄×２→超音波処理（振幅４０％、２０秒、４セット）→遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、５分）→酵素反応→ＨＰＬＣ分析
４－１－１）ＴＨＧＰ溶液の調整
１－１－１）と同様の操作を施し、２Ｍ ＴＨＧＰ水溶液（ｐＨ７．０）を調整した。
４－１－２）菌体の培養
１－１－２）と同様の操作を施し、ＮＮ-6由来L-リブロース-エピメラーゼ（ＬＲＥＡ）組換え大腸菌を培養した。
４－１－３）酵素反応
１００００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により４－１－２）の培養液から菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。洗浄後の菌体を同緩衝液５ｍＬに懸濁し、振幅４０％、２０秒で４回超音波破砕した後、４℃、９０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心後の上清を粗酵素としてL-ソルボースを基質に酵素反応させた。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。
酵素反応の条件を表６に示した。表６に示す通り、２Ｍ ＴＨＧＰ（ｐＨ１０．０） ５００μＬ、２Ｍ L-ソルボースおよび４ｍＭ ＭｎＣｌ２ ２５０μＬ、酵素 ２５０μＬ、温度 ４５℃、緩衝液 ５０ｍＭ グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）からなる。
ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。
実験方法
４－１）Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来組換えL-リブロース3-エピメラーゼＡを用いたL-ソルボースとL-タガトース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
〈調査方法の概略〉ＮＮ-６株由来ＬＲＥＡの調製（ＮＮ-６:Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６、ＬＲＥＡ：L-リボース３-エピメラーゼＡ）→前培養（３ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、一晩）→培養（１００ｍL、３０℃、２００ｒｐｍ、Ｏ.Ｄ.６００ｎｍ＝０．４－０．８）→誘導（１ｍＭ ＩＰＴＧ、４時間）→緩衝液（５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））による洗浄×２→超音波処理（振幅４０％、２０秒、４セット）→遠心分離（４℃、１２０００ｒｐｍ、５分）→酵素反応→ＨＰＬＣ分析
４－１－１）ＴＨＧＰ溶液の調整
１－１－１）と同様の操作を施し、２Ｍ ＴＨＧＰ水溶液（ｐＨ７．０）を調整した。
４－１－２）菌体の培養
１－１－２）と同様の操作を施し、ＮＮ-6由来L-リブロース-エピメラーゼ（ＬＲＥＡ）組換え大腸菌を培養した。
４－１－３）酵素反応
１００００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により４－１－２）の培養液から菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。洗浄後の菌体を同緩衝液５ｍＬに懸濁し、振幅４０％、２０秒で４回超音波破砕した後、４℃、９０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心後の上清を粗酵素としてL-ソルボースを基質に酵素反応させた。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。
酵素反応の条件を表６に示した。表６に示す通り、２Ｍ ＴＨＧＰ（ｐＨ１０．０） ５００μＬ、２Ｍ L-ソルボースおよび４ｍＭ ＭｎＣｌ２ ２５０μＬ、酵素 ２５０μＬ、温度 ４５℃、緩衝液 ５０ｍＭ グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）からなる。
ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。
４－１－４）ＨＰＬＣ分析
１－１－７）と同様に反応液を希釈し、１－１－５）と同様の操作を施して糖組成を分析した。
１－１－７）と同様に反応液を希釈し、１－１－５）と同様の操作を施して糖組成を分析した。
［結果および考察］
４－２．実験例４の結果および考察
４－２－１）ＮＮ-６由来ＬＲＥＡを用いたL-ソルボースとL-タガトース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査結果
ＮＮ-６株由来ＬＲＥＡを用いてL-ソルボースを基質に酵素反応させたＴＨＧＰ無添加の反応液は反応開始９６時間後にL-ソルボース：L-タガトース＝７４．０：２６．０となった(図７)。
図７に示すとおり、ＴＨＧＰを添加した反応液は反応開始９６時間後にL-ソルボース:L-タガトース＝７３．７：２５．３となり、ＴＨＧＰの添加ではL-タガトース、L-ソルボース間の平衡比はほぼ変わらなかった。
以上の結果より、L-タガトースとL-ソルボースはＴＨＧＰに対して同程度の錯体形成能を有していることが示唆された。
４－２．実験例４の結果および考察
４－２－１）ＮＮ-６由来ＬＲＥＡを用いたL-ソルボースとL-タガトース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査結果
ＮＮ-６株由来ＬＲＥＡを用いてL-ソルボースを基質に酵素反応させたＴＨＧＰ無添加の反応液は反応開始９６時間後にL-ソルボース：L-タガトース＝７４．０：２６．０となった(図７)。
図７に示すとおり、ＴＨＧＰを添加した反応液は反応開始９６時間後にL-ソルボース:L-タガトース＝７３．７：２５．３となり、ＴＨＧＰの添加ではL-タガトース、L-ソルボース間の平衡比はほぼ変わらなかった。
以上の結果より、L-タガトースとL-ソルボースはＴＨＧＰに対して同程度の錯体形成能を有していることが示唆された。
［実験例５］
実験方法
５－１）固定化ＮＮ-６由来D-キシロースイソメラーゼ(ＤＸＩ)およびL-リブロース３-エピメラーゼ(ＬＲＥ)を用いたD-キシロースとD-キシルロース、D-リブロース間およびD-グルコースとD-フルクトース、D-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
〈実験方法の概略〉固定化酵素の調製（固定化：ＮＮ-６由来D-キシロースイソメラーゼ(ＤＸＩ)の固定化、ＮＮ-６由来L-リブロース3-エピメラーゼ(ＬＲＥ)の固定化）→緩衝液（グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）による洗浄×２→超音波処理（振幅７％、４分、９セット）→金属処理（１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、３０分）→熱処理（５５℃、１０分）→ポリエチレングリコール分画（１０％―２０％）→固定化（ＨＰＡ２５Ｌ、４℃、一晩）→酵素反応→ＨＰＬＣ分析
５－１－１）ＴＨＧＰ溶液の調整
１－１－１）と同様の操作を施し、２Ｍ ＴＨＧＰ水溶液（ｐＨ７．０）を調整した。
５－１－２）菌体の培養と固定化酵素の調製
１％D-キシロースを炭素源として含むＹＥ培地３ｍＬにＮＮ-6株を植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。この培養液１００μＬを同培地１００ｍＬに植継ぎ、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。続いて、この培養液全量を同培地１０Ｌに植継ぎ、孔径０．２２μｍのフィルターに空気を３ｍＬ/ｍｉｎで通気しながら３０℃、２００ｒｐｍで２１時間培養した。培地組成は表７に示した。
実験方法
５－１）固定化ＮＮ-６由来D-キシロースイソメラーゼ(ＤＸＩ)およびL-リブロース３-エピメラーゼ(ＬＲＥ)を用いたD-キシロースとD-キシルロース、D-リブロース間およびD-グルコースとD-フルクトース、D-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
〈実験方法の概略〉固定化酵素の調製（固定化：ＮＮ-６由来D-キシロースイソメラーゼ(ＤＸＩ)の固定化、ＮＮ-６由来L-リブロース3-エピメラーゼ(ＬＲＥ)の固定化）→緩衝液（グリシン‐ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．５）による洗浄×２→超音波処理（振幅７％、４分、９セット）→金属処理（１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、３０分）→熱処理（５５℃、１０分）→ポリエチレングリコール分画（１０％―２０％）→固定化（ＨＰＡ２５Ｌ、４℃、一晩）→酵素反応→ＨＰＬＣ分析
５－１－１）ＴＨＧＰ溶液の調整
１－１－１）と同様の操作を施し、２Ｍ ＴＨＧＰ水溶液（ｐＨ７．０）を調整した。
５－１－２）菌体の培養と固定化酵素の調製
１％D-キシロースを炭素源として含むＹＥ培地３ｍＬにＮＮ-6株を植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。この培養液１００μＬを同培地１００ｍＬに植継ぎ、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間培養した。続いて、この培養液全量を同培地１０Ｌに植継ぎ、孔径０．２２μｍのフィルターに空気を３ｍＬ/ｍｉｎで通気しながら３０℃、２００ｒｐｍで２１時間培養した。培地組成は表７に示した。
５－１－３）部分精製
１００００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により５－１－２）の培養液から菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＭグリシン－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。洗浄後の菌体を同緩衝液に懸濁し、振幅７０％、４分で９回超音波破砕した。破砕液を４℃、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し１００００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。得られた粗酵素液に終濃度１ｍＭとなるように塩化マンガンを添加した後、６０℃、３０分の熱処理により不要なタンパク質を沈殿させた。遠心分離により不溶性タンパク質を除去した。その上清に、ポリエチレングリコール#６０００（ＰＥＧ）分画により両酵素を部分精製した。
１００００ｒｐｍ、４℃、５分間の遠心分離により５－１－２）の培養液から菌体を回収した。得られた菌体を５０ｍＭグリシン－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した。洗浄後の菌体を同緩衝液に懸濁し、振幅７０％、４分で９回超音波破砕した。破砕液を４℃、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し１００００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。得られた粗酵素液に終濃度１ｍＭとなるように塩化マンガンを添加した後、６０℃、３０分の熱処理により不要なタンパク質を沈殿させた。遠心分離により不溶性タンパク質を除去した。その上清に、ポリエチレングリコール#６０００（ＰＥＧ）分画により両酵素を部分精製した。
５－１－５）酵素の固定化
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨＰＡ２５Ｌに部分精製酵素を添加し、冷蔵庫で一晩固定化させた。
５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨＰＡ２５Ｌに部分精製酵素を添加し、冷蔵庫で一晩固定化させた。
５－１－６）固定化酵素反応
５－１－５）で得られた固定化酵素を用いて、D-キシロースまたはD-グルコースを基質に酵素反応させた。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。酵素反応の条件を表８に示した。表８に示すとおり、固定化酵素 １０Ｕ、２Ｍ ＴＨＧＰ（ｐＨ７．０） １５００μL、２Ｍ 基質、２ｍＭ ＣоＣｌ２および２ｍＭ ＭｎＣｌ２ １５００μL、温度 ５０℃、撹拌 ６０ｒｐｍ、緩衝液 ５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）からなる。
ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。
５－１－５）で得られた固定化酵素を用いて、D-キシロースまたはD-グルコースを基質に酵素反応させた。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。酵素反応の条件を表８に示した。表８に示すとおり、固定化酵素 １０Ｕ、２Ｍ ＴＨＧＰ（ｐＨ７．０） １５００μL、２Ｍ 基質、２ｍＭ ＣоＣｌ２および２ｍＭ ＭｎＣｌ２ １５００μL、温度 ５０℃、撹拌 ６０ｒｐｍ、緩衝液 ５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）からなる。
ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。
５－１－７）ＨＰＬＣ分析
１－１－７）と同様に反応液を希釈し、１－１－５）と同様の操作を施して糖組成を分析した。
１－１－７）と同様に反応液を希釈し、１－１－５）と同様の操作を施して糖組成を分析した。
［結果および考察］
５－２．実験例５の結果および考察
５－２－１）固定化Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来ＤＸＩおよびＬＲＥを用いたD-キシロースとD-キシルロース、D-リブロース間およびD-グルコースとD-フルクトース、D-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査結果
D-キシロースを炭素源として培養したＮＮ-６株の菌体抽出液を金属処理、熱処理およびＰＥＧ分画によって部分精製した。ＰＥＧ１０－２０％画分にＤＸＩ活性の９０％が回収され、この画分を固定化酵素に用いた。
５－２．実験例５の結果および考察
５－２－１）固定化Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ. ＮＮ-６由来ＤＸＩおよびＬＲＥを用いたD-キシロースとD-キシルロース、D-リブロース間およびD-グルコースとD-フルクトース、D-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査結果
D-キシロースを炭素源として培養したＮＮ-６株の菌体抽出液を金属処理、熱処理およびＰＥＧ分画によって部分精製した。ＰＥＧ１０－２０％画分にＤＸＩ活性の９０％が回収され、この画分を固定化酵素に用いた。
固定化酵素を用いてD-キシロースを基質に酵素反応させた。ＴＨＧＰ無添加の反応液は反応開始４時間後に平衡に達し、この時点でD-キシロース：D-キシルロース:D-リブロース＝７４．３：１５．４：１０．４となった（図８上）。ＴＨＧＰを添加した場合は反応開始後６時間で平衡に達し、この時点でD-キシロース:D-キシルロース:D-リブロースの比が１１．５：６１．３：２７．２となりD-キシルロースやD-リブロースに平衡が偏った（図８下）。そのため、D-キシルロース、D-リブロース、D-キシロースの順で錯体形成能が高いことが示唆された。
同じ固定化酵素を用いてD-グルコースを基質に酵素反応させた。ＴＨＧＰ無添加の反応液は反応開始４８時間後に平衡に達し、D-グルコース:D-フルクトース:D-アルロース＝４４．６：３９．９：１５．５となった（図９上）。ＴＨＧＰ添加した反応液も反応開始後４８時間で平衡に達した。この時点でD-グルコース:D-フルクトース:D-アルロース=６．９：３５．８：５７．３となり、無添加時よりD-アルロースに平衡が偏っていた（図９下）。各段階の平衡比はD-グルコース:D-フルクトース=１６．１：８３．８、D-フルクトース:D-アルロース＝３８．５：６１．４となり、１－１）や１－２）の結果と近い値になった。
同じ固定化酵素を用いてD-グルコースを基質に酵素反応させた。ＴＨＧＰ無添加の反応液は反応開始４８時間後に平衡に達し、D-グルコース:D-フルクトース:D-アルロース＝４４．６：３９．９：１５．５となった（図９上）。ＴＨＧＰ添加した反応液も反応開始後４８時間で平衡に達した。この時点でD-グルコース:D-フルクトース:D-アルロース=６．９：３５．８：５７．３となり、無添加時よりD-アルロースに平衡が偏っていた（図９下）。各段階の平衡比はD-グルコース:D-フルクトース=１６．１：８３．８、D-フルクトース:D-アルロース＝３８．５：６１．４となり、１－１）や１－２）の結果と近い値になった。
［実験例６］
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来組換えＤＴＥを用いたD-フルクトースとD-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
実験方法
６－１－１）ＴＨＧＰ溶液の調整
１－１－１）と同様の操作を施し、２Ｍ ＴＨＧＰ水溶液（ｐＨ７．５）を調整した。
６－１－２）菌体の培養
１－１－２）と同様の操作を施し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来ＤＴＥ組換え大腸菌を培養した。
６－１－３）酵素反応
１－１－１）と同様に粗酵素を調製した。６－１－１）で調整したＴＨＧＰ溶液を適宜希釈して使用し、ＴＨＧＰの終濃度が０－１Ｍの範囲でD-フルクトースを基質に酵素反応させた。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。酵素反応の条件を表１２に示した。表１２に示すとおり、０．２Ｍ ＴＨＧＰ（ｐＨ７．５） ５００μL、２Ｍ D-フルクトース２５０μL、温度 ４０℃、緩衝液 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．5）からなる。
ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来組換えＤＴＥを用いたD-フルクトースとD-アルロース間の平衡比におけるＴＨＧＰの影響の調査
実験方法
６－１－１）ＴＨＧＰ溶液の調整
１－１－１）と同様の操作を施し、２Ｍ ＴＨＧＰ水溶液（ｐＨ７．５）を調整した。
６－１－２）菌体の培養
１－１－２）と同様の操作を施し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来ＤＴＥ組換え大腸菌を培養した。
６－１－３）酵素反応
１－１－１）と同様に粗酵素を調製した。６－１－１）で調整したＴＨＧＰ溶液を適宜希釈して使用し、ＴＨＧＰの終濃度が０－１Ｍの範囲でD-フルクトースを基質に酵素反応させた。反応液から適宜１００μＬサンプリングし、１００℃、３分間の熱処理により反応を停止させた。酵素反応の条件を表１２に示した。表１２に示すとおり、０．２Ｍ ＴＨＧＰ（ｐＨ７．５） ５００μL、２Ｍ D-フルクトース２５０μL、温度 ４０℃、緩衝液 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．5）からなる。
ＴＨＧＰ溶液の代わりに超純水を添加したものをネガティブコントロールとした。
６－１－４）ＨＰＬＣ分析
１－１－７）と同様に反応液を希釈し、１－１－５）と同様の操作を施して糖組成を分析した。
１－１－７）と同様に反応液を希釈し、１－１－５）と同様の操作を施して糖組成を分析した。
［結果および考察］
６－２．実験例６の結果および考察
６－２－１）ＴＨＧＰ濃度の検討結果
終濃度０－１ＭのＴＨＧＰを添加したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来ＤＴＥを用いて０．５Ｍ D-フルクトースを基質に酵素反応させた。０．５ＭまではＴＨＧＰの濃度の増加に伴ってD-アルロースの平衡比も高まったが、それ以上の濃度では大きな平衡比の変化が見られなかった（図１０）。そのため、１Ｍの糖に対して１ＭのＴＨＧＰを用いるのが平衡比への影響を調査するには最適であると示唆された。
理論的には等モルで混合であるが、ＴＨＧＰを添加する量はわずかでも平衡比は変わる。範囲としては０ｍＭ以上であればよく、最適なのは１ｍＭである。
６－２．実験例６の結果および考察
６－２－１）ＴＨＧＰ濃度の検討結果
終濃度０－１ＭのＴＨＧＰを添加したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｉｃｈｏｒｉｉ ＳＴ-２４株由来ＤＴＥを用いて０．５Ｍ D-フルクトースを基質に酵素反応させた。０．５ＭまではＴＨＧＰの濃度の増加に伴ってD-アルロースの平衡比も高まったが、それ以上の濃度では大きな平衡比の変化が見られなかった（図１０）。そのため、１Ｍの糖に対して１ＭのＴＨＧＰを用いるのが平衡比への影響を調査するには最適であると示唆された。
理論的には等モルで混合であるが、ＴＨＧＰを添加する量はわずかでも平衡比は変わる。範囲としては０ｍＭ以上であればよく、最適なのは１ｍＭである。
本発明者らのグループで発見した基盤酵素である（ｉ）D-タガトース３-エピメラーゼ（ＤＴＥ）および（ii）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｔｕｔｚｅｒｉから単離されたL-ラムノースイソメラーゼ（L-ｒｈａｍｎоｓｅ ｉｓоｍｅｒａｓｅ; ＬＲｈＩ, EC 5.3.1.14）を活用して、D-アルロースおよびそれを含む組成物の生産を安価な原料から効率よく生産するために、世界レベルで通用する非常に大きな規模のビジネスに育てるのに役立つ技術のひとつであると期待される。
Claims (10)
- 有機ゲルマニウム化合物からなり、少なくとも一つが希少糖である単糖間での平衡状態を含む化学反応系に用いるための単糖間平衡反応促進剤。
- 単糖間の平衡反応における平衡比を有機ゲルマニウム化合物との錯体形成能の強度が大きい単糖側にシフトさせるための促進剤である、請求項１に記載の単糖間平衡反応促進剤。
- ケトースおよびケトース間での平衡状態を含む化学反応系である、請求項１または２に記載の単糖間平衡反応促進剤。
- イソメラーゼ存在下の単糖間の変換反応系である、請求項１ないし３のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
- イソメラーゼ存在下が、ケトース３－エピメラーゼまたはケトース３－エピメラーゼ活性を有するタンパク質存在下である、請求項４に記載の単糖間平衡反応促進剤。
- 有機ゲルマニウム化合物がポリ-トランス-２-カルボキシエチルゲルマセスキオキサン（Ｇｅ-１３２）を含む、若しくはそれからなる、請求項１ないし５のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
- 希少糖が少なくともD-アルロースを含むことを特徴とする、請求項１ないし６のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
- 反応物質である単糖（ａ）と生成物質である単糖（ｂ）間で平衡状態にある化学反応系である、請求項１ないし７のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤。
- 反応物質である単糖（ａ）がD-フルクトース、生成物質である単糖（ｂ）がD-アルロースであり、平衡比を７６：２４から３８：６２に変更可能である、請求項８に記載の単糖間平衡反応促進剤。
- 請求項１ないし９のいずれかに記載の単糖間平衡反応促進剤を用いることを特徴とする、単糖間の変換反応により希少糖を効率的に生産する方法。
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|---|---|---|---|
| JP2022001470A JP2023101096A (ja) | 2022-01-07 | 2022-01-07 | 希少糖の効率的な生産用単糖間平衡反応促進剤 |
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