JP2023086679A - 幹細胞の製造方法及び体細胞の製造方法 - Google Patents

幹細胞の製造方法及び体細胞の製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】因子ＲＮＡを効率的に細胞に導入可能な幹細胞の製造方法を提供する。【解決手段】本開示によれば、体細胞を用意することと、体細胞を幹細胞に誘導する誘導因子ＲＮＡを搭載したウイルス由来のゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆い、ゲノムＲＮＡとは異なるウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスを用意することと、キメラウイルスを用いて、体細胞に誘導因子ＲＮＡを導入することと、を含む、幹細胞の製造方法が提供される。【選択図】図４

Description

本発明は、細胞技術に関し、幹細胞の製造方法及び体細胞の製造方法に関する。
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞とは、二つの特徴的な能力を有する細胞である。一つは、体を構成するあらゆる細胞へと変化することができる能力である。もう一つは、半永久的な増殖能を有することである。ｉＰＳ細胞はこの二つの能力を有するため、自己の体細胞からｉＰＳ細胞を作製し、目的の体細胞へ変化させることで、拒絶反応のない移植治療へと応用することができる。そのためｉＰＳ細胞は、再生医療の有力な技術になると考えられている。
ｉＰＳ細胞の誕生から現在までに、数多くのその作製方法が確立された。代表的なｉＰＳ細胞の作製方法としては、レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法が挙げられる。
レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法では、体細胞をレトロウイルスやレンチウイルスに感染させて、初期化因子をコードしている遺伝子を細胞内に導入する。レトロウイルスやレンチウイルスは、体細胞のゲノムに初期化因子を挿入することができ、初期化因子の細胞内での安定的な発現を誘導する。
しかし、レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法には、以下の問題点がある。まず、体細胞のゲノムへの初期化因子の挿入は、既存の遺伝子やプロモーターを傷つけるため、細胞の癌化の原因になり得る。また、ゲノム上に挿入された初期化因子は、ｉＰＳ細胞を体細胞に変化させた後に再度活性化するおそれがある。そのため、ｉＰＳ細胞由来の移植用細胞には癌化のリスクがある。例えば、マウスモデルにおいては、導入された初期化因子の再活性化が体細胞で見られ、癌化することが確認されている（例えば、非特許文献１参照。）。
エピソーマルベクターは環状ＤＮＡであり、核内で自己増幅する。エピソーマルベクターは、原理的にはゲノムに組み込まれないと考えられてきたが、最近の研究では、エピソーマルで作成されたｉＰＳ細胞のゲノム上に、エピソーマルベクターの断片が散在して挿入されることが報告されている。そのため、リプログラミング遺伝子が細胞内に残存しうるという問題がある。例えばｃ－ＭＹＣやＫＬＦ４が細胞内に残存すると、癌化の原因になる。リプログラミング遺伝子が細胞内に残存しているか否かを検査するには膨大な費用が必要である。移植細胞プール中の全ての細胞にエピソーマルプラスミドのゲノムへの挿入がなく、残存がないことを示すことは不可能である。
レトロウイルス／レンチウイルスを用いた方法、及びエピソーマルベクターを用いた方法には、上述した問題があるため、ＲＮＡを用いたｉＰＳ細胞の作製方法が提案されている（例えば、特許文献１から４、及び非特許文献１、２参照。）。
特許第４４７８７８８号公報 特許第４９３６４８２号公報 特許第５６３３０７５号公報 特許第５９６３３０９号公報
Nature 448, 313-317 Nature Biotechnol 26(3): 313-315, 2008.
因子ＲＮＡを効率的に細胞に導入する方法が求められている。そこで、本発明は、因子ＲＮＡを効率的に細胞に導入可能な幹細胞の製造方法及び体細胞の製造方法を提供することを目的の一つとする。
本発明の態様によれば、体細胞を用意することと、体細胞を幹細胞に誘導する誘導因子ＲＮＡを搭載したウイルス由来のゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆い、当該ゲノムＲＮＡとは異なるウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスを用意することと、キメラウイルスを用いて、体細胞に誘導因子ＲＮＡを導入することと、を含む、幹細胞の製造方法が提供される。
上記の幹細胞の製造方法において、ゲノムＲＮＡが、パラミクソウイルス由来であってもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、ゲノムＲＮＡが、センダイウイルス由来であってもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、ゲノムＲＮＡが、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子／Ｃ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、及びＬ遺伝子を含むセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能を全て欠損し、かつ、Ｌ遺伝子が持続的遺伝子発現を可能とする変異を有するセンダイウイルス遺伝子を有していてもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、エンベロープが、麻しんウイルス由来であってもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、体細胞が、血液細胞であってもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞が、Ｔ細胞を含まない血液細胞であってもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、血液細胞が、Ｔ細胞であってもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、Ｔ細胞がαβＴ細胞であってもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、Ｔ細胞がγδＴ細胞である、請求項７に記載の幹細胞の製造方法。
上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、ｉＰＳ細胞であってもよい。
上記の幹細胞の製造方法が、体細胞にリン酸化物を適用することをさらに含んでいてもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、リン酸化物が、非メバロン酸経路の中間生成物又は最終生成物であってもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、リン酸化物が、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－２－ブテニル二リン酸であってもよい。
上記の幹細胞の製造方法が、体細胞にビスホスホネートを適用することをさらに含んでいてもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、ビスホスホネートが、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、ミノドロン酸、それらの塩、及びそれらの水和物から選択される少なくとも一つであってもよい。
上記の幹細胞の製造方法が、体細胞にインターロイキンを適用することをさらに含んでいてもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、インターロイキンがＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２３からなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、γδ－ＴＣＲ再構成遺伝子を備えていてもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、幹細胞が、αβ－ＴＣＲ再構成遺伝子を備えていてもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、誘導因子ＲＮＡを導入された細胞を継代する際に、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を播種してもよい。
上記の幹細胞の製造方法において、誘導因子ＲＮＡを導入された細胞を継代する際に、低濃度で細胞を播種してもよい。
本発明の態様によれば、上記の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、幹細胞から体細胞を誘導することと、を含む、体細胞の製造方法が提供される。
上記の体細胞の製造方法において、体細胞が、血液細胞であってもよい。
上記の体細胞の製造方法において、血液細胞が、Ｔ細胞であってもよい。
上記の体細胞の製造方法において、幹細胞に誘導因子ＲＮＡを導入することにおいて、幹細胞の細胞塊をフィーダー細胞上に播種してもよい。
上記の体細胞の製造方法において、フィーダー細胞が間質細胞であってもよい。
本発明によれば、因子ＲＮＡを効率的に細胞に導入可能な幹細胞の製造方法及び体細胞の製造方法を提供可能である。
図１は、実施例１に係る細胞の写真を示す。 図２は、実施例１に係る細胞の写真を示す。 図３は、実施例１に係る細胞の写真を示す。 図４は、実施例１に係るフローサイトメーターによるドットプロットを示す。 図５は、実施例２に係る細胞の写真を示す。 図６は、実施例２に係るフローサイトメーターによるドットプロットを示す。 図７は、実施例２に係る細胞の写真を示す。 図８は、実施例２に係る細胞の写真を示す。 図９は、実施例２に係る細胞の写真を示す。 図１０は、実施例３に係るフローサイトメーターによるドットプロットを示す。 図１１は、実施例３に係るフローサイトメーターによるドットプロットを示す。 図１２は、実施例３に係る細胞の写真を示す。 図１３は、実施例３に係るフローサイトメーターによるドットプロットを示す。 図１４は、実施例４に係る細胞の写真を示す。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施形態は、この発明の技術的思想を具体化するための例示をするものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
実施形態に係る幹細胞の製造方法は、体細胞を用意することと、体細胞を幹細胞に誘導する誘導因子ＲＮＡを搭載したウイルス由来のゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆い、ゲノムＲＮＡとは異なるウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスを用意することと、キメラウイルを用いて、体細胞に誘導因子ＲＮＡを導入することと、を含む。幹細胞は、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）である。
体細胞はヒト由来であってもよいし、非ヒト動物由来であってもよい。体細胞の例としては、繊維芽細胞、血液細胞、歯髄幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、口腔上皮細胞、及び体性幹前駆細胞等が挙げられる。
血液細胞は、血液から分離される。血液は、例えば末梢血及び臍帯血であるが、これらに限定されない。血液は、成年から採取されてもよいし、未成年から採取されてもよい。採血の際には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ－Ａ）液等の抗凝固剤を用いてもよい。
血液細胞は、例えば、単核球（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、好中球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球等の有核細胞であり、赤血球、顆粒球、及び血小板を含まない。血液細胞は、例えば血管内皮前駆細胞、血液幹・前駆細胞、Ｔ細胞、又はＢ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、例えばαβＴ細胞であってもよいし、γδＴ細胞であってもよい。血液細胞は、γδＴ細胞でなくてもよい。血液細胞は、Ｔ細胞を含まない血液細胞であってもよい。
体細胞が血液細胞である場合、任意で、血液細胞に、リン酸化物を適用してもよい。リン酸化物は、非メバロン酸経路の中間生成物又は最終生成物であってもよい。非メバロン酸経路は、メバロン酸を経由しない、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の合成経路である。非メバロン酸経路の中間生成物の例としては、１－デオキシ－Ｄ－キシルロース５－リン酸（ＤＯＸＰ）、２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリスリトール４－リン酸（ＭＥＰ）、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチルエリトリトール（ＣＤＰ－ＭＥ）、４－ジホスホシチジル－２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリトリトール－２－リン酸（ＣＤＰ－ＭＥＰ）、２－Ｃ－メチル－Ｄ－エリトリトール－２，４－シクロピロリン酸（ＭＥｃＰＰ）、及び（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－２－ブテニル二リン酸（ＨＭＢ－ＰＰ）が挙げられる。
血液細胞にリン酸化物を適用する際には、血液細胞を培養する培地にリン酸化物を添加してもよい。培地中におけるリン酸化物の濃度は、例えば、１μｍｏｌ／Ｌ以上５０μｍｏｌ／Ｌ以下、３μｍｏｌ／Ｌ以上２０μｍｏｌ／Ｌ以下、あるいは５μｍｏｌ／Ｌ以上１２μｍｏｌ／Ｌ以下である。リン酸化物を添加した培地で血液細胞を１日以上、２日以上、あるいは３日以上培養してもよい。リン酸化物を添加した培地で血液細胞を１４日以下、１０日以上、あるいは７日以上培養してもよい。
体細胞が血液細胞である場合、任意で、血液細胞に、ビスホスホネートを適用してもよい。ビスホスホネートの例としては、ゾレドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、エチドロン酸、ミノドロン酸、それらの塩、及びそれらの水和物が挙げられる。
血液細胞にビスホスホネートを適用する際には、血液細胞を培養する培地にビスホスホネートを添加してもよい。培地中におけるビスホスホネートの濃度は、例えば、１μｍｏｌ／Ｌ以上５０μｍｏｌ／Ｌ以下、３μｍｏｌ／Ｌ以上２０μｍｏｌ／Ｌ以下、あるいは５μｍｏｌ／Ｌ以上１２μｍｏｌ／Ｌ以下である。ビスホスホネートを添加した培地で血液細胞を１日以上、２日以上、あるいは３日以上培養してもよい。ビスホスホネートを添加した培地で血液細胞を１４日以下、１０日以上、あるいは７日以上培養してもよい。
体細胞が血液細胞である場合、任意で、血液細胞にインターロイキンを適用してもよい。インターロイキンの例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２３が挙げられる。
血液細胞にインターロイキンを適用する際には、血液細胞を培養する培地にインターロイキンを添加してもよい。培地中におけるインターロイキンの濃度は、例えば、５ｎｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下、１０ｎｇ／ｍＬ以上９０ｎｇ／ｍＬ以下、あるいは１５ｎｇ／ｍＬ以上８０ｎｇ／ｍＬ以下である。インターロイキンを添加した培地で血液細胞を１日以上、２日以上、あるいは３日以上培養してもよい。インターロイキンを添加した培地で血液細胞を１４日以下、１０日以上、あるいは７日以上培養してもよい。
血液細胞にリン酸化物及び／又はビスホスホネートを適用した後にインターロイキンを適用してもよい。血液細胞にリン酸化物及び／又はビスホスホネートとインターロイキンを同時に適用してもよい。血液細胞にインターロイキンを適用した後にリン酸化物及び／又はビスホスホネートを適用してもよい。
体細胞を培養する培地の例としては、ＲＰＭＩ１６４０培地、最小必須培地（α－ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２培地、動物成分を含まない培地（ＲＰＭＩ培地）、及びＦＢＳを含まない培地が挙げられるが、これらに限定されない。誘導因子を導入する前に体細胞を培養する期間は任意であるが、例えば、２日以下であってもよい。
次に、体細胞に誘導因子を導入して、体細胞から幹細胞を誘導する。幹細胞を誘導することにおいて、誘導とは、リプログラミング、初期化、形質転換、及び細胞の運命変更(Cell fate reprogramming)等を指す。
体細胞に導入される誘導因子は、ＲＮＡである。ＲＮＡは、ｍＲＮＡであってもよい。誘導因子は、例えば、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、及びｃ－ＭＹＣを含む。誘導因子として、ＯＣＴ３／４を改良したＭ3Ｏを使用してもよい。また、誘導因子は、ＬＩＮ２８Ａ、ＦＯＸＨ１、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、Ｅ－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、ＴＨ２Ｂ、及びＰ５３ＤＤからなる群から選択される少なくとも一つであってもよい。これらの誘導因子のＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋから入手可能である。なお、ここでは遺伝子記号はヒトで記載しているが、大文字・小文字表記によって、種を制限することを意図するものではない。例えば、全て大文字表記していても、マウス又はラットの遺伝子を含むことを排除するものではない。ただし、実施例においては、実際に使用した生物種に則って、遺伝子記号を表記している。
誘導因子のＲＮＡは、プソイドウリジン（Ψ）、５－メチルウリジン（５ｍｅＵ）、Ｎ１－メチルシュードウリジン（ｍｅ１Ψ）、５－メトキシウリジン（５ｍｏＵ）、５－ヒドロキシメチルウリジン（５ｈｍＵ）、５－フォーミルウリジン（５ｆＵ）、５－カルボキシメチルエステルウリジン（５ｃａｍＵ）、チエノグアノシン（ｔｈＧ）、Ｎ４－メチルシチジン（ｍｅ４Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－メチオキシチジン（５ｍｏＣ）、５－ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５－ヒドロキシシチジン（５ｈｏＣ）、５－フォルムシチジン（５ｆＣ）、５－カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、Ｎ６－メチル－２－アミノアデノシン（ｍ６ＤＡＰ）、ジアミノプリン（ＤＡＰ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍまたはｍ２’－ＯＵ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、及びＮ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される少なくとも１つで修飾されていてもよい。
誘導因子のＲＮＡは、ポリアデニル化されていてもよい。
誘導因子のＲＮＡは、インビトロで転写される（ＩＶＴ）ＲＮＡのポリアデニル化によって調製されてもよい。ＲＮＡは、ポリ（Ａ）末端をコードするＤＮＡテンプレートを用いることによって、ＩＶＴの間にポリアデニル化されてもよい。ＲＮＡがキャッピングされてもよい。細胞における発現の効率性を最大化するために、大部分のＲＮＡ分子がキャップを含有することが好ましい。ＲＮＡは５’ｃａｐ［ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］構造を有していてもよい。当該配列はＲＮＡを安定化させ、転写を促進させる配列である。５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅをもつＲＮＡからは、脱リン酸化処理により５’ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを取り除いてもよい。ＲＮＡはＡｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）として［３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ］を有していてもよい。ＡＲＣＡは転写開始点より前に挿入される配列であり、転写されるＲＮＡの効率は二倍となる。ＲＮＡはＰｏｌｙＡテールを有していてもよい。
また、誘導因子のＲＮＡは、自己増殖能を持つリプリケイティブＲＮＡであってもよい。リプリケイティブＲＮＡとは、自己増殖能を持つＲＮＡであり、通常のＲＮＡと異なり、ＲＮＡの複製に必要なタンパク質を発現させる能力を併せ持っている。リプリケイティブＲＮＡはアルファウイルスの一種であるベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス由来である。リプリケイティブＲＮＡを細胞にトランスフェクションすると、誘導因子を作り続けるＲＮＡを細胞に発現させることができるため、ＲＮＡを細胞に複数回導入することを省くことが可能となる。
リプリケイティブＲＮＡの配列は、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、エバーグレーズ（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ）ウイルス、ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス、及び西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）からなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
また、リプリケイティブＲＮＡは、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ミデルブルグ（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ）ウイルス、チクングニア（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、オニョンニョン（Ｏ’ｎｙｏｎｇ－ｎｙｏｎｇ）ウイルス、ロスリバー（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、バーマフォレスト（Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ）ウイルス、ゲタ（Ｇｅｔａｈ）ウイルス、サギヤマ（Ｓａｇｉｙａｍａ）ウイルス、ベバル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス、ウナ（Ｕｎａ）ウイルス、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス、ババンキ（Ｂａｂａｎｋｉ）ウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、ハイランドＪ（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ）ウイルス、フォートモーガン（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ）ウイルス、ヌドゥム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、及びバギークリーク（Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ）ウイルスからなる群から選択されるアルファウイルスから得られる配列を含んでいてよい。
リプリケイティブＲＮＡは、例えば、５’から３’に向かって、（ＶＥＥ ＲＮＡレプリカーゼ）－（プロモーター）－（ＲＦ１）－（自己切断型ペプチド）－（ＲＦ２）－（自己切断型ペプチド）－（ＲＦ３）－（ＩＲＥＳもしくはコアプロモーター）－（ＲＦ４）－（ＩＲＥＳもしくは任意のプロモーター）－（任意に選択可能なマーカー）－（ＶＥＥ ３’ＵＴＲ及びポリＡテール）－（任意に選択可能なマーカー）－プロモーターを含んでいる。上記のＲＦ１－４は、多能性細胞への体細胞の脱分化を誘導する因子である。上記のＲＦ２－３、ＲＦ３－４、ＲＦ４は任意である。上記のＲＦ１－４は、ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ－２、ｃ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ＧＬＩＳ１、ＦＯＸＨ１、ｐ５３－ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ、ｐ５３－Ｐ２７５Ｓ、Ｌ－ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＤＰＰＡ２、ＤＰＰＡ４、ＤＰＰＡ５、ＺＩＣ３、ＢＣＬ－２、Ｅ－ＲＡＳ、ＴＰＴ１、ＳＡＬＬ２、ＮＡＣ１、ＤＡＸ１、ＴＥＲＴ、ＺＮＦ２０６、ＦＯＸＤ３、ＲＥＸ１、ＵＴＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ５、ＥＳＲＲＢ、ｍｉＲ－２９１－３ｐ、ｍｉＲ－２９４、ｍｉＲ－２９５、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＴＢＸ３、ＭＢＤ３ｓｈ、ＴＨ２Ａ、及びＴＨ２Ｂからなる群から選択されてもよい。
誘導因子は、誘導因子ＲＮＡを搭載したウイルス由来のゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆い、ゲノムＲＮＡとは異なるウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスを用いて体細胞に導入される。
キメラウイルスのゲノムＲＮＡは、パラミクソウイルス由来であってもよい。キメラウイルスのゲノムＲＮＡは、センダイウイルス由来であってもよい。センダイウイルスは、モノネガウイルス目パラミクソウイルス科に属する、ＲＮＡをゲノムとするウイルスである。野生型のセンダイウイルスは、ＲＮＡのゲノムと、ＲＮＡを内包する脂質二重膜からなるエンベロープと、を備える。
キメラウイルスのゲノムＲＮＡは、ステルス型ＲＮＡベクターであってもよい。
キメラウイルスのゲノムＲＮＡは、ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）遺伝子、リン酸化タンパク質（Ｐ）遺伝子／Ｃタンパク質（Ｃ）遺伝子、マトリクスタンパク質（Ｍ）遺伝子、膜融合タンパク質（Ｆ）遺伝子、赤血球凝集素－ノイラミニダーゼ（ＨＮ）遺伝子、及び巨大タンパク質（Ｌ）遺伝子を含むセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能を全て欠損し、かつ、Ｌ遺伝子が持続的遺伝子発現を可能とする変異を有するセンダイウイルス遺伝子と、誘導因子ＲＮＡと、を有していてもよい。
ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子／Ｃ遺伝子、及びＬ遺伝子は、ウイルスベクターの転写、複製に関与する。Ｆ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮＨ遺伝子は、ウイルスの粒子形成に関与する。そのため、Ｆ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮＨ遺伝子の機能を全て欠損させたウイルスベクターは、細胞に感染した後に、新規のウイルス粒子を形成できない。Ｆ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮＨ遺伝子の機能を全て欠損させるために、ゲノムＲＮＡにおいて、Ｆ遺伝子、Ｍ遺伝子、及びＮＨ遺伝子が欠失していてもよい。
持続的遺伝子発現を可能とする変異を有するＬ遺伝子は、アミノ酸配列の１６１８番目がバリンである巨大タンパク質をコードする。当該変異Ｌ遺伝子を有するウイルスベクターは、インターフェロン誘導能が低下するため、細胞傷害性がなく、持続感染能を有する。そのため、細胞内において、搭載された誘導因子ＲＮＡの発現が持続される。
体細胞から幹細胞が誘導された後、細胞からウイルスベクターを除去するために、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、及び変異Ｌ遺伝子の少なくともいずれかを標的とするｓｉＲＮＡを細胞に導入してもよい。例えば、変異Ｌ遺伝子の５２７番目又は１９１３番目のヌクレオチドを含む領域を標的とするｓｉＲＮＡを細胞に導入してもよい。
あるいは、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、及び変異Ｌ遺伝子の少なくともいずれかの非コード領域に、未分化細胞特異的マイクロＲＮＡの標的配列を付加してもよい。未分化細胞特異的マイクロＲＮＡの例としては、ｍｉＲ－３０２ａが挙げられる。幹細胞が体細胞から誘導されると、細胞において、ｍｉＲ－３０２ａ等の未分化細胞特異的ｍｉＲＮＡの発現が誘導される。未分化細胞特異的ｍｉＲＮＡが標的配列に結合すると、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、及び変異Ｌ遺伝子の少なくともいずれかの発現が抑制され、細胞からウイルスベクターが除去される。例えば、変異Ｌ遺伝子に、ｍｉＲ－３０２ａの標的配列が付加される。
キメラウイルスのゲノムＲＮＡは、３’末端側から、センダイウイルスのＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｃ遺伝子、及び持続的遺伝子発現を可能とする変異Ｌ遺伝子を有していてもよい。ゲノムＲＮＡは、Ｃ遺伝子と変異Ｌ遺伝子の間に、誘導因子ＲＮＡを有していてもよい。ゲノムＲＮＡは、Ｃ遺伝子と変異Ｌ遺伝子の間に、蛍光タンパク質のＲＮＡを有していてもよい。蛍光タンパク質の例としては、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein）が挙げられる。ゲノムは、Ｃ遺伝子と変異Ｌ遺伝子の間に、薬剤耐性遺伝子のＲＮＡを有していてもよい。
キメラウイルスのエンベロープは、例えば、麻しんウイルス由来である。
３’末端側から、センダイウイルスのＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｃ遺伝子、及び変異Ｌ遺伝子を有し、Ｃ遺伝子と変異Ｌ遺伝子の間に、ＥＧＦＰのＲＮＡと誘導因子ＲＮＡを有するゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆う麻しんウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスは、ＭＳＲＶ－１として、ときわバイオに作製を依頼した。ＭＳＲＶ－１の変異Ｌ遺伝子にｍｉＲ－３０２ａの標的配列を付加したキメラウイルスは、ＭＳＲＶ－２として、ときわバイオに作製を依頼した。
キメラウイルスの力価（タイター）の指標としては、感染多重度（ＭＯＩ）が挙げられる。キメラウイルスのＭＯＩは、例えば、０．１から１００．０、あるいは１．０から５０．０である
接着培養されている体細胞に、誘導因子を導入してもよいし、ゲル培地で浮遊培養されている体細胞に、誘導因子を導入してもよい。
誘導因子を導入される体細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、あるいはＬａｍｉｎｉｎ５１１（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ｎｉｐｐｉ）等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養してもよい。
誘導因子を導入される体細胞が培養される培地としては、例えば、Ｓｔｅｍｆｉｔ （Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地等の幹細胞培地を使用可能である。
ただし、幹細胞培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ｍＴｅＳＲ１、及びＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等を利用してもよい。幹細胞培地は、例えば、ディッシュ、ウェル、又はチューブ等に入れられる。体細胞へ誘導因子の導入を行った後、細胞を二次元培養しながら初期化させてもよいし、細胞を浮遊培養、三次元培養、あるいは攪拌培養しながら初期化させてもよい。拡大培養においても、二次元培養してもよいし、浮遊培養、三次元培養、あるいは攪拌培養してもよい。
体細胞に誘導因子を導入し、細胞を培養した後、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種する継代を少なくとも１回実行してもよい。継代することにおいて、誘導因子を導入された細胞のクローンどうしを混合してもよい。継代することにおいて、誘導因子を導入された細胞の異なるクローンどうしを混合してもよい。その後、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代することを、複数回実施してもよい。幹細胞が樹立するまで、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収した混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。なお、回収した混じり合った細胞の全てを培地に播種してもよい。
ここで、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、誘導因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、誘導因子を導入された細胞を、遺伝子発現状態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、誘導因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、誘導因子を導入された細胞を、リプログラミングの程度で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。
あるいは、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、誘導因子を導入された細胞を、形態で区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、誘導因子を導入された細胞を、形態で区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。あるいは、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、例えば、誘導因子を導入された細胞を、大きさ区別することなく継代することをいう。例えば、継代時に、誘導因子を導入された細胞を、大きさ区別することなく、同じ培養器に播種してもよい。
またあるいは、誘導因子を導入された細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代するとは、誘導因子を導入された細胞をクローニングすることなく継代することをいう。例えば、クローニングすることなく継代する場合、誘導因子を導入された細胞が形成するコロニーをピックアップしなくともよい。例えば、クローニングすることなく継代する場合、誘導因子を導入された細胞が形成する複数のコロニーを互いに分離しなくともよい。例えば、継代時に、複数の異なるコロニーを形成した細胞同士を混合して、同じ培養器に播種してもよい。また、例えば、クローニングすることなく継代する場合、誘導因子を導入された細胞が形成する単一のコロニーをクローニングしなくともよい。例えば、継代時に、コロニーどうしを混合して、同じ培養器に播種してもよい。
例えば、誘導因子を導入された細胞が接着培養されている場合、接着培養されている細胞を回収し、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を培地に播種して継代してもよい。例えば、継代時に、培養器から細胞を剥離し、剥離して混じり合った細胞の少なくとも一部を同じ培養器に播種してもよい。例えば、剥離液で培養器から細胞を剥がし、剥がして混じり合った細胞全体を継代してもよい。例えば、コロニーを形成していない細胞を継代してもよい。誘導因子を導入された細胞が浮遊培養されている場合、浮遊培養されている細胞全体を継代してもよい。
誘導因子を導入された細胞を継代する際、細胞は低濃度で培地あるいは培養器に播種されてもよい。ここで、低濃度とは、例えば、１ｃｅｌｌ／ｃｍ2以上であり、０．２５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以下、１．２５×１０3ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以下、０．２５×１０3ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以下、０．２５×１０2ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以下、あるいは０．２５×１０1ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2以下である。あるいは、低濃度とは、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、あるいは２個以下の細胞同士が接触可能であり、１１個以上の細胞同士が接触しない濃度である。なお、１０個以下の細胞同士が接触した細胞塊が複数あってもよい。あるいは、細胞容器底面全体が細胞で覆われた状態を１００％コンフルエントとして、低濃度とは、５％以下コンフルエント、４％以下コンフルエント、３％以下コンフルエント、２％以下コンフルエント、１％以下コンフルエント、０．５％以下コンフルエント、０．１％以下コンフルエント、０．０５％以下コンフルエント、あるいは０．０１％以下コンフルエントである。またあるいは、低濃度とは、例えば、播種された細胞においてシングルセル同士が接触しない濃度である。例えば、ウェルプレートのウェルに、シングルセルを播種してもよい。ウェルプレートは、１２ウェルプレートや９６ウェルプレートであってもよい。本発明者らの知見によれば、誘導因子を導入された細胞を継代する際、低濃度で細胞を培地に播種することにより、細胞から誘導される幹細胞におけるキメラウイルスの残存を抑制することが可能である。誘導される幹細胞において、キメラウイルスが残存する細胞の割合は、例えば４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下あるいは０％である。
誘導因子を導入された細胞は、閉鎖された培養器内で培養され、継代されてもよい。閉鎖された培養器は、例えば、外部と気体、ウイルス、微生物及び不純物等の交換をしない。また、誘導因子を導入された細胞を二次元培養で拡大培養してもよいし、三次元培養で拡大培養してもよい。
誘導因子を導入された細胞が幹細胞に誘導され、幹細胞が樹立された後、接着培養されている細胞全体を、幹細胞として凍結保存してもよい。例えば、剥離液で培養器から剥がれた細胞全体を幹細胞として凍結保存してもよい。また、誘導因子を導入された細胞が幹細胞に誘導された後、浮遊培養されている細胞全体を、幹細胞として凍結保存してもよい。
誘導された幹細胞は、未分化細胞マー力一であるＮａｎｏｇ、ＯＣＴ４、及びＳＯＸ２等を発現し得る。誘導された幹細胞は、ＴＥＲＴを発現し得る。誘導された幹細胞は、テ口メラーゼ活性を示し得る。
また、体細胞から幹細胞が誘導されたか否かは、例えば、細胞の形態から確認することができる。例えば、誘導された幹細胞は、ＥＳ細胞に類似する肩平なコロニーを形成し、アルカリホスファターゼを発現し得る。あるいは、体細胞から幹細胞が誘導されたか否かは、サイトフローメータで、未分化であることを示す細胞表面マーカーであるＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＳＥＡ－１、及びＳＳＥＡ５から選択される少なくとも一つの表面マーカーが陽性であるか否かを分析することにより行ってもよい。ＴＲＡ－１－６０は、ｉＰＳ／ＥＳ細胞に特異的な抗原であり、体細胞では検出されない。ｉＰＳ細胞はＴＲＡ－１－６０陽性画分からのみできることから、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞はｉＰＳ細胞と考えられる。
誘導された幹細胞は、例えば、γδ－ＴＣＲ再構成遺伝子を備えていてもよい。γδ－ＴＣＲ再構成遺伝子とは、ＴＣＲγ領域及びＴＣＲδ領域の再構成が生じた、ＴＣＲをコードする遺伝子である。ＴＣＲγ領域はＶγ－Ｊγを含む。ＴＣＲδ領域は、Ｖδ―Ｄδ―Ｊδを含む。誘導された幹細胞は、例えば、Ｊ１／Ｊ２遺伝子を有するγδ―ＴＣＲ再構成遺伝子を備えている。また、誘導された幹細胞は、例えば、αβ－ＴＣＲ再構成遺伝子を備えていてもよい。
実施形態に係る体細胞の製造方法は、上記の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、幹細胞から体細胞を誘導することと、を含む。
幹細胞の由来は任意である。幹細胞は、αβＴ細胞由来であってもよい。体細胞の例は、上述したとおりである。体細胞は、血液細胞であってもよい。血液細胞はαβＴ細胞であってもよい。幹細胞の由来となった体細胞と、幹細胞から誘導される体細胞は、同じ種類であってもよい。幹細胞から血液細胞を誘導する方法は、特に限定されない、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１等のＧＳＫ３阻害剤、ＢＭＰ－４等の骨形成タンパク質、ＶＥＧＦ等の成長因子を含む培地で、用意した細胞を４日間培養する。さらに、ＳＢ４３１５４２等のＡＬＫ５阻害剤、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦ等の成長因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む培地で、細胞を２日間培養する。さらに、ＶＥＧＦ等の成長因子、ＳＣＦ、ＩＬ－３及びＩＬ－６等のインターロイキン、Ｆｌｔ３Ｌ等のサイトカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む培地で細胞を２日間培養する。さらに、ＳＣＦ、ＩＬ－６等のインターロイキン、ＥＰＯを含む培地で細胞を培養する。これにより、幹細胞から血液細胞が誘導される。
あるいは、間質細胞（ストロマ細胞）上に幹細胞を播種して、幹細胞から血液細胞を誘導してもよい。間質細胞が骨髄由来であってもよい。間質細胞がＯＰ９細胞であってもよい。ＯＰ９細胞は、マクロファージ刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）を産生せず、幹細胞から血液細胞への分化を支持する機能を有する。例えば、幹細胞のコロニーを複数の細胞塊に分割し、幹細胞の細胞塊をフィーダー細胞としてのＯＰ９細胞上に播種する。培地には、インターロイキン－７及び幹細胞因子を添加してもよい。これにより、幹細胞から血液細胞が誘導される。誘導される血液細胞は、例えば、ＣＤ３４とＣＤ４３が陽性である。
ＣＤ３４陽性及びＣＤ４３陽性の細胞から、ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性の細胞を選別してもよい。ＣＤ４陽性及びＣＤ８陽性の細胞を、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及びインターロイキン－２を含む培地で培養して、ＣＤ４陰性である、ＣＤ８単陽性の細胞を誘導してもよい。
（実施例１）
終濃度が５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、終濃度が１０ｎｇ／ｍＬの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び終濃度が２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン－３（ＩＬ－３、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む血液細胞培地（ＲＰＭＩ Ｇｉｂｃｏ）を用意した。
ｈＯＣＴ３／４、ｈＫＬＦ４、ｈＳＯＸ２、及びｈ－ｃ－ＭＹＣを搭載するキメラウイルスとして、ＭＳＲＶ－１及びＭＳＲＶ－２（ときわバイオ）を用意した。
３’末端側から、センダイウイルスのＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｃ遺伝子、及び変異Ｌ遺伝子を有し、Ｃ遺伝子と変異Ｌ遺伝子の間に、ＥＧＦＰのＲＮＡと誘導因子ＲＮＡを有するゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆うセンダイウイルス由来のエンベロープと、を備えるウイルスであるＳＲＶ－２（ときわバイオ）を用意した。ＳＲＶ－２において、変異Ｌ遺伝子にｍｉＲ－３０２ａの標的配列が付加されている。ＳＲＶ－２は、ｈＯＣＴ３／４、ｈＫＬＦ４、ｈＳＯＸ２、及びｈ－ｃ－ＭＹＣを搭載している。
１５ｍＬのチューブに１０ｍＬの血液細胞培地を入れ、さらに、ヒト血液細胞を入れた。次に、２００ｇで５分間、血液細胞を遠心した。遠心後、血液細胞を採取し、血液細胞の数を数え、２×１０5個の血液細胞を分取した。１５ｍＬのチューブに１０ｍＬの血液細胞培地を入れ、さらに、２×１０5個の血液細胞を入れた。次に、２００ｇで５分間、血液細胞を遠心した。遠心後、チューブから血液細胞培地を除去し、新しい１ｍＬの血液細胞培地をチューブに入れた。血液細胞を血液細胞培地で懸濁し、血液細胞をラミニンコートディッシュに播種した。その後、血液細胞を、６日間、３７℃のインキュベーター内で培養し、非Ｔ細胞（ｎｏｎ－Ｔ ｃｅｌｌｓ）を増殖させた。なお、培養開始から３日目に、ディッシュに培地を追加した。
インキュベーターからディッシュを取り出し、ディッシュ内の血液細胞培地を除去し、ディッシュに１ｍＬの新しい血液細胞培地を入れた。さらに、各ディッシュの血液細胞培地に、ＭＳＲＶ－１、ＭＳＲＶ－２、又はＳＲＶ－２を添加した。これにより、血液細胞にＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣを導入した。感染多重度（ＭＯＩ）は、２０から３０になるよう調整した。
血液細胞培地にウイルスを添加してから２日目に、ディッシュから血液細胞培地を除去し、細胞を幹細胞培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、登録商標、味の素）で洗浄し、その後、１ｍＬの幹細胞培地をディッシュに入れた。その後、毎日、幹細胞培地の交換をした。また、コロニーが形成されるたびに、継代をした。
８日目に１回継代した後のｉＰＳ細胞様の細胞の写真を図１に示す。ＳＲＶ－２を導入した細胞において、蛍光が観察された。このことは、細胞内にウイルスベクターが残存していることを示している。ＭＳＲＶ－２を導入した細胞において、蛍光が観察されなかった。このことは、細胞内にキメラウイルスベクターが残存していないことを示している。
１０日目の細胞の写真を図２に示す。継代３回目の後、１５日目、図３に示すように、ＭＳＲＶ－２を導入した細胞において、蛍光が観察されなかった。また、ＭＳＲＶ－２を導入した細胞をフローサイトメーターで分析したところ、図４に示すように、ＥＧＦＰ陰性、ＴＲＡ－１－６０陽性であった。実施例１は、キメラウイルスのゲノムＲＮＡは、非キメラウイルスのゲノムＲＮＡより早く、細胞から消失することを示している。
（実施例２）
終濃度が２０ｎｇ／ｍＬのインターロイキン－２（ＩＬ－２、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、終濃度が１％のＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、終濃度が１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ、ｃｙｔｉｖａ）、終濃度が１２．５μＬ／ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む血液細胞培地（ＲＰＭＩ Ｇｉｂｃｏ）を用意した。
ＭＳＲＶ－１、ＭＳＲＶ－２、及びＳＲＶ－２（ときわバイオ）を用意した。
３’末端側から、センダイウイルスのＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｃ遺伝子、及び変異Ｌ遺伝子を有し、Ｃ遺伝子と変異Ｌ遺伝子の間に、ＥＧＦＰのＲＮＡと誘導因子ＲＮＡを有するゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆うセンダイウイルス由来のエンベロープと、を備えるウイルスであるＳＲＶ－１（ときわバイオ）を用意した。ＳＲＶ－１において、変異Ｌ遺伝子にｍｉＲ－３０２ａの標的配列が付加されていない。ＳＲＶ－１は、ｈＯＣＴ３／４、ｈＫＬＦ４、ｈＳＯＸ２、及びｈ－ｃ－ＭＹＣを搭載している。
１５ｍＬのチューブに１０ｍＬの血液細胞培地を入れ、さらに、ヒトαβＴ細胞を入れた。次に、２００ｇで５分間、αβＴ細胞を遠心した。遠心後、αβＴ細胞を採取し、αβＴ細胞の数を数え、５×１０5個のαβＴ細胞を分取した。１５ｍＬのチューブに１０ｍＬの血液細胞培地を入れ、さらに、５×１０5個のαβＴ細胞を入れた。次に、２００ｇで５分間、αβＴ細胞を遠心した。遠心後、チューブから血液細胞培地を除去し、新しい１ｍＬの血液細胞培地をチューブに入れた。αβＴ細胞を血液細胞培地で懸濁し、αβＴ細胞をラミニンコートしていない１２ウェルディッシュに播種した。その後、αβＴ細胞を、２日間、３７℃のインキュベーター内で培養した。
５×１０4個のαβＴ細胞を分取し、血液細胞培地を入れた６ウェルディッシュにαβＴ細胞を播種した。さらに、各ディッシュの血液細胞培地に、ＭＳＲＶ－１、ＭＳＲＶ－２、ＳＲＶ－１、又はＳＲＶ－２を添加した。これにより、αβＴ細胞にＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣを導入した。感染多重度（ＭＯＩ）は、1０から３０になるよう調整した。
血液細胞培地にウイルスを添加してから３日目に、ディッシュから血液細胞培地を除去し、細胞を幹細胞培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、登録商標、味の素）で洗浄し、その後、１ｍＬの幹細胞培地をディッシュに入れた。その後、２日に１回、培地を交換し、コロニーが形成されるたびに、継代をした。
５日目に１回継代した後のｉＰＳ細胞様の細胞の写真を図５に示す。ＳＲＶ－２を導入した細胞において、蛍光が観察された。このことは、細胞内にウイルスベクターが残存していることを示している。ＭＳＲＶ－２を導入した細胞において、蛍光が観察されなかった。このことは、細胞内にキメラウイルスベクターが残存していないことを示している。また、ＭＳＲＶ－２を導入した細胞をフローサイトメーターで分析したところ、図６に示すように、ＥＧＦＰ陰性、ＴＲＡ－１－６０陽性であった。
１４日目の細胞の写真を図７及び図８に示す。ＳＲＶ－１を導入された細胞は、３５個のコロニーを形成し、ＳＲＶ－２を導入された細胞は、１１０個のコロニーを形成した。ＭＳＲＶ－１を導入された細胞は、５００個以上のコロニーを形成し、ＭＳＲＶ－２を導入された細胞は、５００個以上のコロニーを形成した。実施例２は、キメラウイルスのゲノムＲＮＡは、非キメラウイルスのゲノムＲＮＡより早く、細胞から消失することを示している。また、実施例２は、キメラウイルスは幹細胞の誘導効率が高いことを示している。
（実施例３）
終濃度が２０％のＦＢＳ、及び終濃度が１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加されたαＭＥＭ培地をＯＰ９細胞用培地として用意した。
終濃度が１００ｍｍｏｌ／ＬのビタミンＣ、終濃度が１０μｇ／ｍＬのインターロイキン－７（ＩＬ－７）、終濃度が１０μｇ／ｍＬのＦＬＴ３リガンド、終濃度が１０μｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）を添加されたＯＰ９細胞用培地を分化誘導用培地として用意した。
実施例２で誘導されたｉＰＳ細胞のコロニーを０．２５％のトリプシンと１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶで培養器から剥離し、ピペッティングにより複数の細胞塊に分割した。フィーダー細胞としてＯＰ９細胞とＯＰ９／ＤＬＬ１細胞が培養されている培養器を用意した。ＯＰ９細胞とＯＰ９／ＤＬＬ１細胞は、ＯＰ９細胞用培地で培養されていた。フィーダー細胞上に、それぞれｉＰＳ細胞からなる複数の細胞塊を播種し、ビタミンＣを添加したＯＰ９細胞用培地を用いて細胞を１４日間培養した。
ｉＰＳ細胞を培養器からはがし、新たにＯＰ９細胞とＯＰ９／ＤＬＬ１細胞が培養されている培養器に播種し、分化誘導用培地を用いて、細胞を培養した。ｉＰＳ細胞をＯＰ９／ＤＬＬ１細胞上に播種してから５日目、９日目、及び１４日目の細胞の写真を図９に示す。ｉＰＳ細胞が、血液前駆細胞に分化していく経過が観察された。また、１４日目の細胞をフローサイトメトリーで分析した結果を図１０に示す。細胞は、血液細胞のマーカーであるＣＤ３４とＣＤ４３が陽性であることが確認された。その後、１６日目、２３日目、３０日目に、浮遊細胞のみを回収し、新たにＯＰ９細胞とＯＰ９／ＤＬＬ１細胞が培養されている培養器に播種して継代した。
ｉＰＳ細胞をフィーダー細胞上に播種してから３７日目、図１１に示すように、抗ＣＤ４マイクロビーズを用いて、誘導された血液細胞を磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）法で、ＣＤ４陽性及びＣＤ８α陽性の細胞を選別した。
ＭＡＣＳで選別された細胞を、分化誘導培地を用いて培養し、培地に抗ＣＤ３抗体（終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）、抗ＣＤ２８抗体（終濃度２ｎｇ／ｍＬ）、及びインターロイキン－２（ＩＬ－２、終濃度２００Ｕ／ｍＬ）を添加した。ＭＡＣＳで選別してから５日目の細胞と１１日目の細胞の写真を図１２に示す。
図１３日に示すように、ＭＡＣＳで選別されてから１０日目の細胞をフローサイトメーターで分析したところ、ＣＤ４陰性、ＣＤ８α陽性であった。実施例３は、細胞傷害性Ｔ細胞へと分化するＣＤ８α単陽性細胞を、ｉＰＳ細胞から分化できることを示している。
（実施例４）
終濃度が２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、終濃度が１０％のＦＢＳ（ｃｙｔｉｖａ）、終濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌのゾレドロン酸を含む血液細胞培地（ＲＰＭＩ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用意した。また、ＭＳＲＶ－２（ときわバイオ）を用意した。
１５ｍＬのチューブに１０ｍＬの血液細胞培地を入れ、さらに、ヒトγδＴ細胞を入れた。次に、２００ｇで５分間、γδＴ細胞を遠心した。遠心後、γδＴ細胞を採取し、γδＴ細胞の数を数え、５×１０5個のγδＴ細胞を分取した。１５ｍＬのチューブに１０ｍＬの血液細胞培地を入れ、さらに、５×１０5個のγδＴ細胞を入れた。次に、２００ｇで５分間、γδＴ細胞を遠心した。遠心後、チューブから血液細胞培地を除去し、新しい１ｍＬの血液細胞培地をチューブに入れた。γδＴ細胞を血液細胞培地で懸濁し、γδＴ細胞をラミニンコートしていない２６ウェルディッシュに播種した。その後、γδＴ細胞を、３日間、３７℃のインキュベーター内で培養した。１日に１回、ＩＬ－２を培地に添加した。
γδＴ細胞をウェルディッシュから回収し、２００ｇで５分間、γδＴ細胞を遠心した。遠心後、チューブから血液細胞培地を除去し、新しい２ｍＬの血液細胞培地をチューブに入れた。γδＴ細胞を血液細胞培地で懸濁し、γδＴ細胞をラミニンコートしていない２６ウェルディッシュに播種した。その後、γδＴ細胞を、３日間、３７℃のインキュベーター内で培養した。
１×１０5個のγδＴ細胞を分取し、血液細胞培地を入れた９６ウェルディッシュにγδＴ細胞を播種した。さらに、各ディッシュの血液細胞培地に、ＭＳＲＶ－２を添加した。これにより、γδＴ細胞にＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣを導入した。感染多重度（ＭＯＩ）は、３から３０になるよう調整した。
血液細胞培地にウイルスを添加してから３日目に、ディッシュから血液細胞培地を除去し、細胞を幹細胞培地（ＳｔｅｍＦｉｔ、登録商標、味の素）で洗浄し、その後、１ｍＬの幹細胞培地をディッシュに入れた。その後、２日に１回、培地を交換し、コロニーが形成されるたびに、継代をした。図１４に示すように、ｉＰＳ細胞様の細胞が観察された。実施例４は、キメラウイルスを用いて、γδＴ細胞から幹細胞が誘導されることを示している。

Claims (20)

  1. 体細胞を用意することと、
    体細胞を幹細胞に誘導する誘導因子ＲＮＡを搭載したウイルス由来のゲノムＲＮＡと、当該ゲノムＲＮＡを覆い、当該ゲノムＲＮＡとは異なるウイルス由来のエンベロープと、を備えるキメラウイルスを用意することと、
    前記キメラウイルスを用いて、前記体細胞に前記誘導因子ＲＮＡを導入することと、
    を含む、幹細胞の製造方法。
  2. 前記ゲノムＲＮＡが、パラミクソウイルス由来である、請求項１に記載の幹細胞の製造方法。
  3. 前記ゲノムＲＮＡが、センダイウイルス由来である、請求項１又は２に記載の幹細胞の製造方法。
  4. 前記ゲノムＲＮＡが、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子／Ｃ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子、ＨＮ遺伝子、及びＬ遺伝子を含むセンダイウイルス遺伝子のうち、Ｍ遺伝子、Ｆ遺伝子及びＨＮ遺伝子の各機能を全て欠損し、かつ、Ｌ遺伝子が持続的遺伝子発現を可能とする変異を有するセンダイウイルス遺伝子を有する、請求項１から３のいずれか１項に記載の幹細胞の製造方法。
  5. 前記エンベロープが、麻しんウイルス由来である、請求項１から４のいずれか１項に記載の幹細胞の製造方法。
  6. 前記体細胞が、血液細胞である、請求項１から５のいずれか１項に記載の幹細胞の製造方法。
  7. 前記血液細胞が、Ｔ細胞を含まない血液細胞である、請求項６に記載の幹細胞の製造方法。
  8. 前記血液細胞が、Ｔ細胞である、請求項６に記載の幹細胞の製造方法。
  9. 前記体細胞にリン酸化物を適用することをさらに含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の幹細胞の製造方法。
  10. 前記リン酸化物が、非メバロン酸経路の中間生成物又は最終生成物である、請求項９に記載の幹細胞の製造方法。
  11. 前記リン酸化物が、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－２－ブテニル二リン酸である、請求項９に記載の幹細胞の製造方法。
  12. 前記体細胞にビスホスホネートを適用することをさらに含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の幹細胞の製造方法。
  13. 前記体細胞にインターロイキンを適用することをさらに含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の幹細胞の製造方法。
  14. 前記誘導因子ＲＮＡを導入された細胞を継代する際に、回収して混じり合った細胞の少なくとも一部を播種する、請求項１から１３のいずれか１項に記載の幹細胞の製造方法。
  15. 前記誘導因子ＲＮＡを導入された細胞を継代する際に、低濃度で前記細胞を播種する、請求項１から１４のいずれか１項に記載の幹細胞の製造方法。
  16. 請求項１から１５のいずれか１項の記載の幹細胞の製造方法で製造された幹細胞を用意することと、
    前記幹細胞から体細胞を誘導することと、
    を含む、体細胞の製造方法。
  17. 前記体細胞が、血液細胞である、請求項１６に記載の体細胞の製造方法。
  18. 前記血液細胞が、Ｔ細胞である、請求項１７に記載の体細胞の製造方法。
  19. 前記幹細胞に前記誘導因子ＲＮＡを導入することにおいて、前記幹細胞の細胞塊をフィーダー細胞上に播種する、請求項１６から１８のいずれか１項に記載の体細胞の製造方法。
  20. 前記フィーダー細胞が間質細胞である、請求項１９に記載の体細胞の製造方法。
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