JP2023072735A - 乾皮症の治療又は予防用経口組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】 食品由来成分を有効成分として用いた乾皮症の治療又は予防用経口組成物を開発し、特にかゆみ過敏を伴う乾皮症の治療もしくは予防用の内服剤又は飲食品組成物を提供すること。【解決手段】 ノビレチン及び／又は４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する、乾皮症の治療又は予防用経口組成物、好適にはかゆみ過敏を伴う乾皮症の治療又は予防用である医薬品、医薬部外品又は飲食品組成物を提供する。ノビレチン及び４’－デメチルノビレチンは、食経験が豊富な植物であるカンキツ類の果実を原料としているため、これらを有効成分とする本発明の経口組成物は、安全性が高く副作用の心配がない。【選択図】 なし

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り 令和２年１１月２７日 第１３回セラミド研究会学術集会 ［刊行物等］ 令和２年１２月４日 ノビレチン研究会第４回学術研究会ホームページ ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃｏｍ／ｖｉｅｗ／ｎｏｂｉｌｅｔｉｎｒｅｓｅａｒｃｈ／ｍｅｅｔｉｎｇ／ａｎｒ２０２０ ［刊行物等］ 令和２年１２月１２日 ノビレチン研究会第４回学術研究会 ［刊行物等］ 令和３年６月２４日 第２１回日本抗加齢医学会総会ホームページ ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅ．ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ．ｃｏ．ｊｐ／２１ｊａａｍ／ ｈｔｔｐｓ：／／ｓｉｔｅ．ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ．ｃｏ．ｊｐ／２１ｊａａｍ／ｐｒｏｇｒａｍ／ ［刊行物等］ 令和３年６月２６日 第２１回日本抗加齢医学会総会 ［刊行物等］ 令和３年８月１０日 第１７回加齢皮膚医学研究会 予稿集、第２９頁、加齢皮膚医学研究会 ［刊行物等］ 令和３年８月２１日 第１７回加齢皮膚医学研究会 ［刊行物等］令和３年１１月１５日 第５回ノビレチン研究会学術研究会 予稿集、第４６頁、ノビレチン研究会 ［刊行物等］ 令和３年１１月１５日 第５回ノビレチン研究会学術研究会 予稿集、第３１頁、ノビレチン研究会 ［刊行物等］ 令和３年１１月１５日 第５回ノビレチン研究会学術研究会 予稿集、第２２頁、ノビレチン研究会

本発明は、ノビレチン及び／又は４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する乾皮症の治療又は予防用経口組成物、好適にはかゆみ過敏を伴う乾皮症の治療又は予防用の医薬品、医薬部外品又は飲食品組成物に関する。

肌は角層のバリア機能によって、外界からの異物の侵入を防ぎ、また体表からの水分の喪失を防いでいるが、水分保持のためには角層内脂質が重要な役割をもつことが知られている（例えば非特許文献１参照）。しかしながら、年を重ねるとバリア機能に必要な皮脂やうるおいが低下し、保湿機能は低下してくる。これに伴い、肌のかさつきやかゆみが生じるようになる。特に、冬の時期は、空気が乾燥し、高齢者においては膝から下のかさつきや入浴後にかゆみを生じやすい。また、高齢者に限らなくても、冷暖房や入浴時のこすり過ぎ、石鹸の使い過ぎ等、様々な理由で乾燥肌によるかゆみの悩みを抱えている人の割合は非常に多い。

このように、肌の乾燥状態であるドライスキン又は乾燥肌はかゆみを生じやすく、病名としては乾皮症と呼ばれる。乾燥状態を放置しておくと、皮膚表面近くまで神経線維が伸びてきて、衣服のこすれ等のわずかな外的刺激でも、過敏なかゆみ反応を呈する「かゆみ過敏（＝痒覚過敏、アロネーシス）」となる（例えば非特許文献２参照）。

乾皮症やかゆみ過敏の治療薬としての基本は外用の保湿剤であり、主にヘパリン類似物質含有製剤、尿素製剤、ワセリンが用いられている。その他、かゆみ止めの抗ヒスタミン薬やステロイド薬も用いられる。抗ヒスタミン薬は、神経線維の末端にあるかゆみを感じるレセプターのうち、ヒスタミンが結合するレセプターをブロックする。

一方、カンキツ類特有のポリメトキシフラボノイドであるノビレチン（3',4',5,6,7,8-ヘキサメトキシフラボン）は、近年、がん予防、老化抑制、抗動脈硬化作用等さまざまな生理作用が知られるようになってきた（例えば非特許文献３参照）。

本発明者らは、ノビレチンを多く含有するカンキツ類の果皮を用い、特定種類の麹菌で発酵することにより、ノビレチンが脱メチル化して４’－デメチルノビレチン（3',5,6,7,8-ペンタメトキシ-4'-ヒドロキシフラボン）に変換することを明らかにした。また、本発明者らは、４’－デメチルノビレチンが、優れた記憶改善作用を有することも見出した（例えば特許文献１参照）。

G. Imokawa, M. Hattori, J.Invest.Dermatol., 84, 282-284 (1985). 高森建二、日本香粧品学会誌 38,92-95（2014） A. Minagawa et.al., Jpn J. Cancer Res. 92(12):1322-8（2001）

特許第５６６７５６１号公報

しかしながら、上記した外用の保湿剤では、乾皮症やかゆみ過敏に対して十分な治療効果は得られない。また、かゆみを知覚するレセプターのうち、ヒスタミンが結合するレセプターはごく一部である。したがって、抗ヒスタミン薬によりヒスタミンのレセプターをブロックしても、かゆみを止めることはできない（例えば、非特許文献２及びM. Tominaga, K. Takamori (2013) Biol Pharm Bull., 36, 1241-1247参照）。さらに、ステロイド薬には副作用の問題がある。

このように、乾皮症やそれに伴うかゆみ過敏については、高い効果が得られ、かつ副作用の心配がない、実用的な治療薬がないのが現状である。かかる状況下、特に、簡便に使用でき、かつ安全性の高い内服剤の開発が望まれている。

本発明は、食品由来の安全性の高い成分を有効成分とする、乾皮症の治療又は予防用経口組成物を開発し、特にかゆみ過敏を伴う乾皮症の予防もしくは治療用の医薬品、医薬部外品又は飲食品組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、さらにノビレチン及び４’－デメチルノビレチンの機能性について検討を重ねた結果、驚くべきことに、ノビレチン及び４’－デメチルノビレチンの経口投与が、乾皮症モデルマウスにおいてかゆみ、特にかゆみ過敏（アロネーシス）に対する優れた抑制効果を奏することを発見した。そして、当該作用により、乾皮症及び乾皮症に伴うかゆみの予防又は治療に対しても、ノビレチン及び４’－デメチルノビレチンが有効であるものと推測された。これらの知見に基づいて、本発明者らは本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、ノビレチン及び／又は４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する乾皮症の治療又は予防用経口組成物に関する。

本明細書において「乾皮症」とは、ドライスキン、乾燥肌を含む肌の乾燥状態のことを指す。そして、上記乾皮症は、かゆみ及び／又はかゆみ過敏を伴う乾皮症であってもよい。

また、上記経口組成物は、医薬品、医薬部外品又は飲食品組成物の形態であってもよい。

本発明は、ノビレチン及び／又は４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する乾皮症の治療又は予防用経口組成物、特にかゆみ過敏を伴う乾皮症の治療もしくは予防用である内服剤又は飲食品組成物を提供することを可能とする。

また、ノビレチンはカンキツ類特有の成分である。４’－デメチルノビレチンは、ノビレチンの代謝産物のひとつであるが、ノビレチン又はそれを豊富に含むカンキツ類の果実から麹菌発酵法により生物変換して得ることができる。これらは食経験が豊富な植物であるカンキツ類の果実を原料としていることから、本発明の乾皮症の治療又は予防用経口組成物は、安全性が高く副作用の心配がない。

ＡＥＷ処置マウスの皮膚乾燥の状態を示す写真像図である（試験例１）。図中、（Ａ）はＷ処置＋０．５％ＣＭＣ投与群、（Ｂ）はＡＥＷ処置＋０．５％ＣＭＣ投与群、（Ｃ）はＡＥＷ処置＋ノビレチン（ＮＯＢ）投与群、（Ｄ）はＡＥＷ処置＋４’－デメチルノビレチン（４’ＮＯＢ）投与群、を表す。 ＡＥＷ処置マウスの皮膚乾燥スコアに対するノビレチン及び４’－デメチルノビレチン経口投与の影響を示すグラフである（試験例１）。図中、縦軸は皮膚乾燥スコア、横軸は各群を表す。箱ひげ図は、それぞれ上から最大値、７５％、５０％、２５％、最小値を表す。 ＡＥＷ処置マウスの皮膚バリア機能に対するノビレチン及び４’－デメチルノビレチン経口投与の影響を示すグラフである（試験例１）。図中、（Ａ）は経表皮水分蒸散量（単位：ｇ／ｍ^２／ｈ）、（Ｂ）は角層水分量（単位：ａ．ｕ．）の分布を表す。横軸は各群を表し、箱ひげ図は、それぞれ上から最大値、７５％、５０％、２５％、最小値を表す。 ＡＥＷ処置マウスの掻破行動に対するノビレチン及び４’－デメチルノビレチン経口投与の影響を示すグラフである（試験例１）。図中、縦軸は掻破行動回数（２時間）、横軸は各群を表し、箱ひげ図は、それぞれ上から最大値、７５％、５０％、２５％、最小値を表す。 ＡＥＷ処置マウスのアロネーシス（かゆみ過敏）に対するノビレチン及び４’－デメチルノビレチン経口投与の影響を示すグラフである（試験例１）。図中、（Ａ）は０．０７ｇ、（Ｂ）は０．１６ｇのｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを用いた場合のアロネーシスアッセイの結果を表す。縦軸はアロネーシススコア、横軸は各群を表し、箱ひげ図は、それぞれ上から最大値、７５％、５０％、２５％、最小値を表す。 ＡＥＷ処置マウスの自発的運動量に対するノビレチン及び４’－デメチルノビレチン経口投与の影響を示すグラフである（試験例１）。図中、縦軸は自発的運動量（単位：ｃｍ）、横軸は各群を表し、箱ひげ図は、それぞれ上から最大値、７５％、５０％、２５％、最小値を表す。 ヒト３次元培養表皮モデルに対して４’－デメチルノビレチン（ＤｅＮＯＢ）を添加したときの角層セラミド合成への効果を示すグラフである（試験例２）。図中、（Ａ）はトータルセラミド、（Ｂ）はセラミドＥＯＳ、（Ｃ）はセラミドＮＳ／ＮＤＳ、（Ｄ）はセラミドＮＰの結果を表す。縦軸はセラミド産生量（単位：μｇ／ｍｇ蛋白）、バーは標準偏差を表す。 ヒト３次元培養表皮モデルに対して４’－デメチルノビレチン含有組成物（ＤｅＮＯＢエキス）を添加したときの角層セラミド合成への効果を示すグラフである（試験例２）。図中、（Ａ）はトータルセラミド、（Ｂ）はセラミドＮＳ／ＮＤＳ、（Ｃ）はセラミドＮＰの結果を表す。縦軸はセラミド産生量（単位：μｇ／ｍｇ蛋白）、バーは標準偏差を表す。 セラミド生合成経路と関連遺伝子を示す図である。 ヒト３次元培養表皮モデルに対して４’－デメチルノビレチン（ＤｅＮＯＢ）を添加したときのセラミド生合成関連遺伝子への効果を示す図である（試験例３）。図中、（Ａ）はＣＥＲＳ１、（Ｂ）はＣＥＲＳ２、（Ｃ）はＵＧＣＧの結果を表す。グラフの縦軸は、無添加の対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるｍＲＮＡ発現量を１としたときの、ｍＲＮＡ発現量の割合（相対的ｍＲＮＡ発現量）を表す。バーは標準偏差を表す。 ヒト３次元培養表皮モデルに対して４’－デメチルノビレチン含有組成物（ＤｅＮＯＢエキス）を添加したときのセラミド生合成関連遺伝子への効果を示す図である（試験例３）。図中、（Ａ）はＣＥＲＳ１、（Ｂ）はＣＥＲＳ２、（Ｃ）はＵＧＣＧ、（Ｄ）はＳＭＳ２の結果を表す。グラフの縦軸は、無添加の対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるｍＲＮＡ発現量を１としたときの、ｍＲＮＡ発現量の割合（相対的ｍＲＮＡ発現量）を表す。バーは標準偏差を表す。

以下、本願の実施形態について詳細に説明する。

本実施形態は、ノビレチン及び／又は４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する乾皮症の治療又は予防用経口組成物に関する。

本実施形態に係る経口組成物は、乾皮症、好ましくはかゆみを伴う乾皮症、特に好ましくはかゆみ過敏を伴う乾皮症の予防もしくは治療効果を有することから、これらの効果を目的とした医薬品、医薬部外品とすることができる。

また、本実施形態に係る経口組成物は、乾皮症、好ましくはかゆみを伴う乾皮症、特に好ましくはかゆみ過敏を伴う乾皮症の予防もしくは改善効果を有することから、これらの効果を目的とした飲食品組成物とすることができる。

〔ノビレチン〕
本実施形態の有効成分であるノビレチン（式Ｉ）は、市販品を用いることができる。また、ノビレチンは、カンキツ類の‘果実’（果皮、果汁、果肉、種子などを含む果実全体）に多く含まれる。したがって、ノビレチンは、カンキツ類の果実、特には、ノビレチンの含有率、廃棄物の有効利用の観点から、‘果皮’を原料とするノビレチン含有組成物として用いることができる。

カンキツ類の果皮は、マーマレード、砂糖煮などのお菓子の原料として利用され、また、ノビレチン含量の高いマンダリンオレンジ（Citrus reticulata）の果皮はチンピとして長年の食経験があり、ノビレチン及びその含有組成物は、非常に安全性が高い。

また、カンキツ類の種類としては、ノビレチンを含有するカンキツ類であれば、如何なる品種、系統のもの（例えば、ポンカン、シークワーシャ、タンジェリン、タチバナなど）も用いることもできる。

なお、原料としては、カンキツ類の植物体の他の部分（例えば、葉、芽、茎、花、など）を含むものを用いてもよいが、ノビレチンの含有率の点でこれらを含まないものであることが望ましい。

ノビレチン含有組成物は、植物体そのままの形態、もしくは、細片化、破砕、擂潰、粉末化、乾燥などの加工処理のうちいずれか１つ以上を施したものであってもよい。

〔溶媒抽出〕
なお、純度の点を鑑みると、本実施形態の経口組成物の製造においては、前記ノビレチン含有組成物に対して溶液抽出を行って、抽出物を得ることが望ましい。

溶液抽出工程に用いる溶媒は、水、緩衝液、有機溶媒、又はそれらの含水溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ブタノールのような低級脂肪族アルコールや、アセトン、酢酸エチル、クロロホルムなどが挙げられる。

これらの溶媒の中でも、水、エタノールあるいは含水エタノールが抽出効率や取り扱いやすさ、安全性の面で特に好ましい。

また、特には、終濃度６０％以上、好ましくは終濃度７０％以上、さらに好ましくは終濃度９０％以上（いずれも容量比）のエタノールを用いて抽出を行うことで、不純物である多糖類の溶出を抑制でき、ノビレチンの抽出効率を向上できるため好ましい。

抽出条件としては、前記カンキツ類原料（好ましくは細片化物）に対して、前記溶媒を、１から５０倍量、好ましくは２～１５倍量（いずれも質量比）加え、０℃～溶媒の沸点の温度条件、好ましくは室温～溶媒の沸点以下の温度で、５分～１ヶ月間、好ましくは２０分～１週間、浸漬もしくは振盪することにより、抽出することが可能である。

得られた抽出液は、凍結乾燥やエバポレーター等を用いて乾燥させることで、濃縮乾固物とすることができる。

また、溶液抽出工程は、異なる複数の溶媒で、複数回行うこともできる。特に、一度目の抽出を水や低濃度の含水アルコールで行った場合、次に前記特定濃度以上のエタノールを用いた抽出を行うことで、ノビレチンの抽出効率を向上させることができる。

上記により得られた抽出物（前記抽出液や濃縮乾固物）は、そのまま本実施形態の経口組成物の有効成分として用いることができる。

〔精製〕
また、上記抽出物に対して、精製工程を行うことによって、ノビレチンの純度をさらに高めることができる。

精製工程としては、液－液分離抽出や、シリカゲル、化学修飾シリカゲル、活性炭、合成吸着樹脂担体等によるカラム精製により、高純度化を行うことができる。以下に好適な精製条件の一例を示す。

まず、抽出物（具体的にはエタノール抽出により得られた抽出物）を４０％エタノール溶液に溶かし、４０％エタノール（ｖ／ｖ）溶液で平衡化した多孔性合成吸着樹脂（具体的には、ダイヤイオンＨＰ２０〔三菱化学社製〕）のカラムに供する。そして、４０～５０％（具体的には４５％）（ｖ／ｖ）エタノール溶液で溶離される成分を除去する。次に、４５～６０％（具体的には５０％）（ｖ／ｖ）エタノールで溶出する成分を回収することより、ノビレチン高含有組成物を得ることができる。

また、上記のように得られたノビレチン高含有組成物は、さらにＯＤＳカラムクロマトグラフィー（具体的には６０％（ｖ／ｖ）メタノール溶出）、ＯＤＳ－ＨＰＬＣ（具体的には４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル・水の混合溶媒）に供し、目的ピークを採取することで、ノビレチンの純品を単離することができる。

ノビレチンは、経口投与により、乾皮症に伴うかゆみ、特にかゆみ過敏の改善効果を有するものである。

したがって、ノビレチンは、乾皮症、好ましくはかゆみ、特にかゆみ過敏を伴う乾皮症の治療もしくは予防用である経口組成物、具体的には、医薬品又は医薬部外品の有効成分として用いることができる。

また、ノビレチンは、乾皮症、好ましくはかゆみ、特にかゆみ過敏を伴う乾皮症の改善もしくは予防用である経口組成物、具体的には、飲食品組成物の有効成分として用いることができる。

〔４’－デメチルノビレチン〕
４’－デメチルノビレチン（式II）は市販されていないが、合成品を用いることができる。あるいは、上記した特許文献１の方法により、ノビレチンを含有するカンキツ類の果実、特に果皮を用いた麹菌発酵により得られた４’－デメチルノビレチン純品（単離物）又は４’－デメチルノビレチン含有組成物を用いることができる。合成品よりも、麹菌発酵によるノビレチンの生物変換を利用する特許文献１の方法の方が簡便かつ安価なため、好適である。

４’－デメチルノビレチンは、ノビレチンが体内で吸収された後にできる代謝産物の一つでもある。前述の通り、カンキツ類の果皮は長年の食経験があることから、４’－デメチルノビレチン及びその含有組成物は、非常に安全性が高い。

特許文献１に記載された方法に準じた、４’－デメチルノビレチン及びその含有組成物の製造方法について、以下に説明する。

〔発酵原料〕
麹菌発酵の原料は、ポリメトキシフラボノイドであるノビレチンを含有するカンキツ類の果実であるが、特には、前述の理由から果皮を用いることが望ましい。ここで、「カンキツ類」の種類及び「果実」については、前述した通りである。

なお、発酵原料としては、カンキツ類の植物体の他の部分（例えば、葉、芽、茎、花、など）を含むものを用いてもよいが、ノビレチンの含有率の点でこれらを含まないものであることが望ましい。

上記カンキツ類は、収穫・採取した生のもの、水洗いしたもの、を用いることが望ましいが、乾燥、凍結、長期保存したものなどであっても用いることができる。

また、カンキツ類はそのままの形態で用いてもよいが、刻むか、砕片化するか、擂潰するかのいずれか１以上の処理を行うことが望ましい。

当該工程は、カンキツ類をいくつかの破片に大きめに刻むこと、細かい小片に細断すること、破砕すること、擂り潰すこと、粉末状にすること、等、幅広い行為を含むものである。好ましくは、１～数ｃｍ程度に大きめに刻んだ状態にすることによって、行うことができる。

またさらには、これら発酵原料から、予めノビレチンを抽出して得た抽出物（エキス、乾燥物）や、純品のノビレチンとして単離したものを用いることもできる。

なお、これら発酵原料は、後記の麹菌発酵を行う前に、加熱処理を行って、原料中の雑菌を殺菌しておくことが好ましい。

〔麹菌発酵〕
前記発酵原料を発酵させる麹菌としては、例えばアスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）、アスペルギルス・ウサミ（Aspergillus usamii）、リゾプス属糸状菌（別名クモノスカビ）、などを用いることができる。また、これらを混合させて用いてもよい。

前記麹菌のうち好ましくは、アスペルギルス・カワチ（Aspergillus kawachii）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、を用いると、４’－デメチルノビレチンを高い含有率で得ることができる。

発酵原料へ前記麹菌を接種する方法としては、麹菌の胞子を発酵原料に直接振りかけて付着させることができる。また、予め前記麹菌を液体培養により予備発酵した培地を、発酵原料全体に行き渡るように接種してもよい。

前記麹菌を発酵原料に接種する場合の微生物発酵条件としては、好気的条件で行うことが望ましいことから、例えば有底円筒状の底部が広く深さが浅い容器が好適である。

このような容器の底部に、発酵原料を万遍なく広げ、空気との接触面積が大きくなるようにするとよい。

発酵温度としては、前記麹菌の生育に好適な条件として、好ましくは１０～４０℃、より好ましくは２０～４０℃、さらに好ましくは２５～３２℃で行われる。加えて、前記麹菌の生育に好適な条件として、暗所で発酵させるのが好ましい。また、原料中に十分な水分が含まれている状態であることが好ましい。

４’－デメチルノビレチンを多量に得るための微生物発酵の発酵期間としては、１～１４日間とすることができ、好ましくは２～１４日間、より好ましくは２～１０日間、さらに好ましくは２～４日間である。

この発酵期間が１日間未満の場合には、前記麹菌による微生物発酵がほとんど進行していないことから十分な４’－デメチルノビレチンが得られない。また、逆に１４日間を超える場合には、微生物変換により生成された４’－デメチルノビレチンの分解が進み、またカンキツ類由来の好ましい芳香が消失する。

また、当該麹菌発酵においては、麹菌から分泌される酵素によって、ノビレチンがデメチル化され、４’－デメチルノビレチンへと変換させるものである。

したがって、麹菌発酵を行う代わりに、当該麹菌もしくは発酵後に得られる発酵物から溶液抽出を行ってノビレチンをデメチル化する酵素を含む酵素液を得、当該酵素を用いて前記原料と酵素反応を行って反応物を得ることで、４’－デメチルノビレチンを得ることも可能である。

具体的には、当該麹菌発酵後の発酵物からの水溶解物を回収し、粗酵素液として用いることで、酵素反応を行うことができる。

上記の麹菌発酵を行うことによって、前記カンキツ類原料に含有されるポリメトキシフラボノイドであるノビレチンは、すべて４’－デメチルノビレチンに変換される。

具体的には、前記カンキツ類原料を麹菌発酵することによって、４’－デメチルノビレチンが乾燥重量あたり約０．５～１．５質量％（具体的には、約１質量％）という、高い含有率の麹菌発酵物を得ることができる。

したがって、ここで得られた麹菌発酵物を、得られたそのままの形態で、もしくは、加工（例えば、細片化、擂潰、粉末化、乾燥、など）して、本実施形態の経口組成物の有効成分として用いることができる。

〔溶液抽出〕
なお、４’－デメチルノビレチンの純度の点を鑑みると、本実施形態の経口組成物の製造においては、前記麹菌発酵の後に得られる発酵物から溶液抽出を行って、抽出物を得ることが望ましい。

当該溶液抽出工程は、前記麹菌発酵物に対して直接行うこともできるが、前記麹菌発酵物について、さらに細片化、破砕、擂潰、粉末化、乾燥などの加工処理のうちいずれか１つ以上を行った後に得られたものに対して行うことが望ましい。

溶液抽出工程に用いる溶媒については、前述のノビレチンの場合と同様である。特には、終濃度５５％以上、好ましくは終濃度６０％以上、さらに好ましくは終濃度８０％以上（いずれも容量比）のエタノールを用いて抽出を行うことで、不純物である多糖類の溶出を抑制でき、４’－デメチルノビレチンの抽出効率を向上できるため好ましい。

抽出条件については、前述のノビレチンの場合と同様である。得られた抽出液は、凍結乾燥やエバポレーター等を用いて乾燥させることで、濃縮乾固物とすることができる。

また、溶液抽出工程は、異なる複数の溶媒で、複数回行うこともできる。特に、一度目の抽出を水や低濃度の含水アルコールで行った場合、次に前記特定濃度以上のエタノールを用いた抽出を行うことで、４’－デメチルノビレチンの抽出効率を向上させることができる。

上記により得られた抽出物（前記抽出液や濃縮乾固物）は、そのまま本実施形態の経口組成物の有効成分として用いることができる。

〔精製〕
また、上記抽出物に対して、精製工程を行うことによって、４’－デメチルノビレチンの純度をさらに高めることができる。

精製工程としては、液－液分離抽出や、シリカゲル、化学修飾シリカゲル、活性炭、合成吸着樹脂担体等によるカラム精製により、高純度化を行うことができる。以下に好適な精製条件の一例を示す。

まず、抽出物（具体的にはエタノール抽出により得られた抽出物）を３０％（ｖ／ｖ）エタノール溶液に溶解し、３０～４０％（具体的には３５％）（ｖ／ｖ）エタノール溶液で平衡化した多孔性合成吸着樹脂（具体的には、ダイヤイオンＨＰ２０〔三菱化学社製〕）のカラムに供する。そして、３９～４３％（具体的には４３％）（ｖ／ｖ）エタノール溶液で溶出される成分を除去する。次に、４４～４６％（具体的には４５％）（ｖ／ｖ）エタノール溶液で溶出される成分を回収することにより、４’－デメチルノビレチン高含有組成物を得ることができる。

また、上記のように得られた４’－デメチルノビレチン高含有組成物は、さらにＯＤＳカラムクロマトグラフィー（具体的には６０％（ｖ／ｖ）メタノール溶出）、ＯＤＳ－ＨＰＬＣ（具体的には３８％（ｖ／ｖ）アセトニトリル・水の混合溶媒）に供し、目的ピークを採取することで、４’－デメチルノビレチンの純品を単離することができる。

上記により得られる４’－デメチルノビレチンは、４’位が脱メチル化したノビレチンのモノデメチル体である。４’－デメチルノビレチンは脱メチル化により極性が高くなり、ノビレチンに比べてアルコール、水への溶解性に優れる。

４’－デメチルノビレチンは、経口投与により、乾皮症及び／又はそれに伴うかゆみ、特にかゆみ過敏の改善効果を有するものである。ここで、後述の試験例１において認められるかゆみ過敏の抑制メカニズムとしては、乾燥により誘発される神経線維の表皮への侵入を抑制することによるものと考えられる。

一方、４’－デメチルノビレチンは、後述の試験例２及び３に示されるように角層セラミド合成促進作用をも有することから、皮膚バリア機能を向上させる、もしくは皮膚バリア機能の低下を抑制することによって、乾皮症及び／又はそれに伴うかゆみ、特にかゆみ過敏の改善効果が期待される。

このように、４’－デメチルノビレチンは神経線維の表皮への侵入抑制と皮膚バリア機能の両面から、乾皮症の治療又は予防に対して有効であると考えられる。

したがって、４’－デメチルノビレチンは、乾皮症、好ましくはかゆみ、特にかゆみ過敏を伴う乾皮症の治療もしくは予防用である経口組成物、具体的には、医薬品又は医薬部外品の有効成分として用いることができる。

また、４’－デメチルノビレチンは、乾皮症、好ましくはかゆみ、特にかゆみ過敏を伴う乾皮症の改善もしくは予防用である経口組成物、具体的には、飲食品組成物の有効成分として用いることができる。

〔乾皮症の治療又は予防用経口組成物〕
本実施形態の治療又は予防用経口組成物は、ノビレチン及び／又は４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有することを特徴とする。

また、前記経口組成物としては、具体的には、乾皮症、好ましくはかゆみ、特にかゆみ過敏を伴う乾皮症の治療もしくは予防用の医薬品、医薬部外品；乾皮症、好ましくはかゆみ、特にかゆみ過敏を伴う乾皮症の改善もしくは予防用の飲食品組成物；を挙げることができる。

ノビレチン及び４’－デメチルノビレチンは、上記工程で得られる各組成物（‘発酵物を直接含有する組成物’‘溶液抽出物’‘高含有組成物’）や、‘単離物’として各種原料に混合することで、本実施形態の経口組成物、医薬品、医薬部外品又は飲食品組成物の有効成分として用いることができる。

ここにおいて、「飲食品組成物」には、一般的な飲食物と機能性食品、機能性飲料が含まれる。

また、前記医薬品、医薬部外品は、内服剤の形態とすることが好ましい。

内服剤や飲食品組成物としてのノビレチン及び４’－デメチルノビレチンの有効摂取量は、それぞれ体重６０ｋｇの成人１日あたり、１ｍｇ以上、好ましくは５ｍｇ以上である。上記の量を経口摂取することにより、皮膚の乾燥により誘発されるかゆみ及びかゆみ過敏に対する優れた抑制作用が得られるとともに、角層セラミド合成促進作用に基づく皮膚バリア機能の改善作用が得られ、したがって乾皮症やそれに伴うかゆみ、特にかゆみ過敏に対する優れた治療、改善もしくは予防作用を得ることができる。

したがって、この必要量を確保できる形態や摂取方法（回数、量）で、本実施形態の経口組成物、医薬品、医薬部外品又は飲食品組成物を摂取することで、上記薬理作用が得られることが期待される。ただし、対象の年齢、体重、症状、摂取スケジュール、製剤形態などにより、摂取量を適宜決定することが望ましい。

また、経口組成物、医薬品、医薬部外品又は飲食品組成物におけるノビレチン及び４’－デメチルノビレチンの含有量としては、それぞれ上記必要な摂取量を担保できるように含有するものであればよいが、具体的には、０．００１質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上、さらに好ましくは０．１質量％以上となるように含有させることができる。また、上限としては、２０質量％以下を挙げることができる。

経口組成物、医薬品、医薬部外品の形態としては、例えば、粉末状、細粒状、顆粒状、などとすることができ、カプセルに充填する形態の他、水に分散した溶液の形態、クリーム状、賦形剤等と混和して得られる錠剤の形態とすることもできる。

本実施形態の経口組成物、医薬品、医薬部外品には、ノビレチン、４’－デメチルノビレチン又はその含有組成物以外にも、本発明の効果を奏する範囲内で、各種担体や添加剤、他の薬効成分などが含まれていても良い。

また、飲食品組成物としては、種々の食品原料や添加剤などと混合して、例えば、ビスケット、スナック菓子、ガム、チュアブル錠、清涼飲料水、ドリンク、スープ、ゼリー、キャンディ等の形態とすることができる。

以下、実施例を挙げて本発明の実施形態を説明するが、本発明の範囲はこれらにより限定されるものではない。なお、以下において「％」とは、特別な記載がない場合、「質量％」を意味する。

＜実施例１＞ ノビレチン含有組成物の調製
ポンカン果皮から以下の通り抽出し、ノビレチン含有組成物を調製した。

すなわち、ポンカン果皮８ｋｇを刻んで細片化し、９０％（ｖ/ｖ）エタノール８０Ｌを添加し、８０℃において１時間エキス抽出して抽出液を得た。当該抽出液を、あらかじめ４０％（ｖ/ｖ）エタノールで平衡化したダイヤイオンＨＰ２０（多孔性合成吸着樹脂カラム）に供し、６Ｌの４５％（ｖ/ｖ）エタノールで非吸着成分を除いた後、１２Ｌの５０％（ｖ/ｖ）エタノールで溶出する成分を回収した。当該回収物をロータリーエバポレーターで濃縮乾固することにより、ノビレチン１９％含有組成物を得た。

＜実施例２＞ ノビレチン単離物の調製
実施例１により得られたノビレチン含有組成物を以下の通り精製し、ノビレチンを単離した。

すなわち、ノビレチン含有組成物３ｇを４０％（ｖ/ｖ）メタノールに溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（内径４０ｍｍφ、長さ２０ｃｍカラムに和光ゲル５０Ｃ１８を１２０ｇ詰めた）に供した。４０％（ｖ/ｖ）メタノールで溶出する成分を除去し、６０％（ｖ/ｖ）メタノールで溶出する成分を得た。

そして、得られた画分を、分取ＨＰＬＣカラム（Mightysil RP-18GP Aqua 250-20（5μm）、関東化学（株）製）に供し、４０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの移動層によって、純品のノビレチン３５ｍｇを得た。

＜実施例３＞ ４’－デメチルノビレチン含有組成物の調製
特許文献１に記載の方法に準じて、ポンカン果皮を麹菌発酵することによりノビレチン変換物４’－デメチルノビレチン含有組成物を調製した。

すなわち、ポンカン果皮３０ｋｇを刻んで細片化し、蒸煮処理により滅菌処理を行った。得られたポンカン果皮に、全体に行き渡るようにアスペルギルス・アワモリ（（株）ビオック製）を接種した。そして、３０℃の恒温室内にて発酵処理（麹菌発酵）を好気的に４日間行うことで、麹菌発酵物を得た。

得られた麹菌発酵物６ｋｇに対して８０％（ｖ/ｖ）エタノール７５Ｌを添加し、８０℃において１時間エキス抽出して抽出液を得た。当該抽出液を、あらかじめ４０％（ｖ/ｖ）エタノールで平衡化したダイヤイオンＨＰ２０（多孔性合成吸着樹脂カラム）に供し、３Ｌの４３％（ｖ/ｖ）エタノールで非吸着成分を除いた後、１０Ｌの４５％（ｖ/ｖ）エタノールで溶出する成分を回収した。当該回収物をロータリーエバポレーターで濃縮乾固することにより、４’－デメチルノビレチン２０％含有組成物を得た。

＜実施例４＞ ４’－デメチルノビレチン単離物の調製
実施例３により得られた４’－デメチルノビレチン含有組成物を以下の通り精製し、４’－デメチルノビレチンを単離した。

すなわち、４’－デメチルノビレチン含有組成物６ｇを３０％（ｖ/ｖ）メタノールに溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（内径４０ｍｍφ、長さ２０ｃｍカラムに和光ゲル５０Ｃ１８を１２０ｇ詰めた）に供した。４０％（ｖ/ｖ）メタノールで溶出する成分を除去し、６０％（ｖ/ｖ）メタノールで溶出する成分を得た。

そして、得られた画分を、分取ＨＰＬＣカラム（Mightysil RP-18 GP Aqua 250-20（5μm）、関東化学（株）製）に供し、３８％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの移動層によって、純品の４’－デメチルノビレチン１２２ｍｇを得た。

＜試験例１＞ 乾皮症モデルマウスを用いた経口投与試験
アセトン／エーテル／水（ＡＥＷ）反復塗布（以下、「ＡＥＷ処置」と呼ぶ。）によって作製した乾皮症モデルマウスを用いて、皮膚バリア機能、かゆみ行動ならびにドライスキン誘発のアロネーシス（かゆみ過敏）に対するノビレチン及び４’－デメチルノビレチン（経口投与）の有効性について検討した。

（方法）
乾皮症モデルマウスの作製及びアロネーシスアッセイは、先の文献（Akiyama T. et al.,Mouse Model of Touch-Evoked Itch (Alloknesis), J. Invest. Dermatol. (2012) 132, 1886-1891; Bourane S. et al., Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons, Science (2015) 350(6260):550-554）に基づいて行った。

すなわち、ＡＥＷ処置開始３日前にＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの背部を剃毛した。剃毛皮膚にＡＥＷ処置（７日間、朝夕２回）することで乾皮症モデルマウスを作製した。ＡＥＷ処置は、アセトン(Ａ)とジエチルエーテル(Ｅ)を容量比１：１で混ぜたＡＥ溶液をコットンに染み込ませ、剃毛部に１５秒間塗布した。次に滅菌水をコットンに染み込ませ、剃毛部に３０秒間塗布した（ＡＥＷ群）。コントロール群には、滅菌水を４５秒間塗布した（Ｗ群）。

被験物質として２５ｍｇ／ｋｇ体重のノビレチン（実施例２調製品）又は２５ｍｇ／ｋｇ体重の４’－デメチルノビレチン（実施例４調製品）を１日１回、ＡＥＷ処置前にディスポーザブル経口ゾンデ（フチガミ器械社製）を用いてマウスに経口投与した。コントロール群のマウスには、被験物質の代わりに１００μＬ／１０ｇ体重の０．５％ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を経口投与した。

最後のＡＥＷ処置終了後に、剃毛部の経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）及び角層水分量（ＳＣ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）を測定することにより、乾皮症モデルマウスの皮膚バリア機能を評価した。剃毛部の皮膚状態は、発赤・出血、痂皮形成・乾燥、浮腫、擦傷・組織欠損の４つの指標について各３点、合計１２点満点の皮膚乾燥スコアで評価した。

最後のＡＥＷ処置から１６時間後に、次世代型擦過行動定量化システム「ＳＣＬＡＢＡ（登録商標）－Ｒｅａｌ」（ノベルテック社製）を用いて掻破行動を２時間測定し、ドライスキンによって誘発される自発的掻破行動を評価した。ＳＣＬＡＢＡ（登録商標）－Ｒｅａｌで得られたデータを元に、ＳＣＬＡＢＡ（登録商標）－Ｒｅａｌ Ｔｒａｃｋｉｎｇソフトウェアを用いて自発的運動量を測定した。

最後に、ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを用いて乾燥状態の皮膚に軽微な機械的刺激を与え、刺激直後に掻破行動が生じるか否かを解析するアロネーシスアッセイを行うことで、かゆみ過敏を評価した。

前処置として、１ケージにつき１匹ずつＡＥＷ処置マウス(もしくはＷ処置マウス)を入れ、少なくとも１時間、馴化した。マウス後頚部(ＡＥＷ処置部位又はＷ処置部位)に、屈曲力０．０７ｇ又は０．１６ｇのｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを垂直に押し当てる触刺激を、少なくとも５秒以上の間隔を空けて、３回与えた。この各３回の触刺激を１セットとして、１０セット実施した。各セットの間隔は、平均約７分３０秒とした。３０回（３回×１０セット）の各触刺激の直後にマウスが刺激部位に対し掻破行動を示した回数を１点として、アロネーシススコアを算出した。

各試験区の群分けは以下の通りである。
（１）Ｗ処置マウス＋０．５％ＣＭＣ投与群 （ｎ＝１１）
（２）ＡＥＷ処置マウス＋０．５％ＣＭＣ投与群 （ｎ＝１１）
（３）ＡＥＷ処置マウス＋２５ｍｇ／ｋｇノビレチン投与群 （ｎ＝１１）
（４）ＡＥＷ処置マウス＋２５ｍｇ／ｋｇ４’－デメチルノビレチン投与群 （ｎ＝１０）

（結果）
結果を図１～図５に示す。図１は、ＡＥＷ処置終了後の各群のマウスの皮膚乾燥の状態を示す写真像図である。図１中、（Ａ）はＷ処置＋０．５％ＣＭＣ投与群、（Ｂ）はＡＥＷ処置＋０．５％ＣＭＣ投与群、（Ｃ）はＡＥＷ処置＋ノビレチン（ＮＯＢ）投与群、（Ｄ）はＡＥＷ処置＋４’－デメチルノビレチン（４’ＮＯＢ）投与群、を表す。図２は、各群のマウスの皮膚乾燥スコアの分布を示すグラフである。図２中、横軸は各群を表し、箱ひげ図はそれぞれ、上から最大値、７５％、５０％、２５％、最小値を表す。なお、＊＊、＊＊＊はＷ＋０．５％ＣＭＣ群に比べて各々ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１で有意差があることを表す。

Ｗ＋０．５％ＣＭＣ群との外観及び皮膚乾燥スコアの比較において、ＡＥＷ＋０．５％ＣＭＣ群では、ＡＥＷ反復塗布によって有意にドライスキン（皮膚乾燥）が誘発されることが示された（図１、図２）。一方、ノビレチン及び４’－デメチルノビレチンの経口投与は、ＡＥＷ処置による皮膚乾燥に対して影響を与えなかった（図２）。

図３は、各群のマウスの（Ａ）経表皮水分蒸散量（単位：ｇ／ｍ^２／ｈ）及び（Ｂ）角層水分量（単位：ａ．ｕ．）の分布を示すグラフである。図３中、横軸は各群を表し、箱ひげ図はそれぞれ、上から最大値、７５％、５０％、２５％、最小値を表す。なお、＊＊、＊＊＊、＊＊＊＊はＷ＋０．５％ＣＭＣ群に比べて各々ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０００１で有意差があることを表す。

皮膚乾燥の評価は、経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）及び角層水分量（ＳＣ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）の２つのパラメーターを用いて行った。コントロールであるＷ＋０．５％ＣＭＣ群と比較して、ＡＥＷ＋０．５％ＣＭＣ群では、有意なＴＥＷＬ値の増加とＳＣ ｈｙｄｒａｔｉｏｎの低下が認められた。このことから、ＡＥＷ処置によって皮膚バリア機能が破綻し、ドライスキンが誘発されていることが確認された。ノビレチン及び４’－デメチルノビレチンの経口投与は、ドライスキンのパラメーターであるＴＥＷＬ及びＳＣ ｈｙｄｒａｔｉｏｎを有意に抑制しなかったが、これらパラメーターの改善傾向が認められた（図３）。

なお、後に詳述するように、４’－デメチルノビレチンには角層セラミド合成促進作用が認められるが、本試験例ではＡＥＷ処置によって角層セラミドを繰り返し除去してしまっているため、４’－デメチルノビレチンの経口投与による効果は出難いものと推察される。

図４は、各群のマウスの掻破行動回数（２時間）の分布を示すグラフである。図４中、横軸は各群を表し、箱ひげ図はそれぞれ、上から最大値、７５％、５０％、２５％、最小値を表す。

ドライスキンによって生じる自発的かゆみ行動を評価するために、ＳＣＬＡＢＡ（登録商標）－Ｒｅａｌを用いて掻破行動を２時間測定した。その結果、Ｗ＋０．５％ＣＭＣ群と比較し、ＡＥＷ＋０．５％ＣＭＣ群ではドライスキンによる自発的かゆみ行動が増加傾向を示した（有意差無し）。またＡＥＷ＋０．５％ＣＭＣ群と比較し、４’－デメチルノビレチン投与群ではドライスキンによる自発的かゆみ行動回数の減少傾向が認められた（図４）。

図５は、各群のマウスのアロネーシスアッセイの結果を示すグラフである。図５中、（Ａ）は０．０７ｇ、（ｂ）は０．１６ｇのｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを用いた場合のアロネーシススコアの分布を表す。また、横軸は各群を表し、箱ひげ図はそれぞれ、上から最大値、７５％、５０％、２５％、最小値を表す。なお、＊、＊＊＊、＊＊＊＊はＡＥＷ＋０．５％ＣＭＣ群に比べて各々ｐ＜０．０５、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０００１で有意差があることを表す。

ドライスキン誘発性アロネーシス（かゆみ過敏）に対するノビレチン及び４’－デメチルノビレチン経口投与の影響を検討するために、屈曲力０．０７ｇ及び０．１６ｇのｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを用いてアロネーシスアッセイを行った。その結果、Ｗ＋０．５％ＣＭＣ群と比較し、ＡＥＷ＋０．５％ＣＭＣ群ではアロネーシススコアが有意に高値を示したことから、ドライスキン誘発性アロネーシスを発症していることが確認された。このＡＥＷ＋０．５％ＣＭＣ群のアロネーシスは、（Ａ）０．０７ｇ及び（Ｂ）０．１６ｇのいずれにおいても、ノビレチン及び４’－デメチルノビレチン経口投与により有意に抑制された（図５）。

図６は、各群のマウスの自発的運動量（単位：ｃｍ）の分布を示すグラフである。図６中、横軸は各群を表し、箱ひげ図はそれぞれ、上から最大値、７５％、５０％、２５％、最小値を表す。

最後に、ノビレチン及び４’－デメチルノビレチンを投与したマウスの自発的運動量をＳＣＬＡＢＡ（登録商標）－Ｒｅａｌ Ｔｒａｃｋｉｎｇソフトウェアを用いて、各マウスの移動距離（２時間）を算出し、被験物質による鎮静効果の有無について検討した。その結果、ＡＥＷ＋０．５％ＣＭＣ群とノビレチン又は４’－デメチルノビレチン投与群の間で自発的運動量に有意な差は認められなかった（図６）。

本試験例では、ＡＥＷ処置による乾皮症モデルマウスを用いて、乾皮症に伴うかゆみ及びアロネーシス（かゆみ過敏）に対するノビレチン及び４’－デメチルノビレチン経口投与の影響を検討した。その結果、ノビレチン及び４’－デメチルノビレチン経口投与は、乾皮症に伴うアロネーシスを有意に抑制した（図５）。また、ノビレチン及び４’－デメチルノビレチン経口投与は、皮膚バリア機能及び乾皮症に伴う自発的かゆみ行動に対して改善傾向を示した（図３、図４）。

以上のことから、ノビレチン及び４’－デメチルノビレチン経口投与は、乾皮症ならびに乾皮症に伴うかゆみ及びかゆみ過敏に対する治療・予防効果を発揮することが示唆された。なお、図５において認められるかゆみ過敏の抑制メカニズムとしては、乾燥により誘発される神経線維の表皮への侵入を抑制することによるものと考えられる。

＜実施例５＞ ４’－デメチルノビレチン含有組成物及び単離物の調製
実施例３と同様にして、ポンカン果皮１０ｋｇを麹菌発酵することによりノビレチン変換物４’－デメチルノビレチン２１％含有組成物を調製した。

得られた４’－デメチルノビレチン含有組成物２ｇを２０％（ｖ/ｖ）メタノールに溶解し、ＯＤＳカラムクロマトグラフィー（内径２０ｍｍφ、長さ３０ｃｍカラムに和光ゲル５０Ｃ１８を３０ｇ詰めた）に供した。４０％（ｖ/ｖ）メタノールで溶出する成分を除去し、６０％（ｖ/ｖ）メタノールで溶出する成分を得た。

次いで、得られた成分について、展開溶媒ヘキサン／エタノール＝７：３の条件で分取ＴＬＣクロマトグラフィー（シリカゲル７０ＰＦ₂₅₄プレートワコー、膜厚０．７５ｍｍ、和光純薬製）を行い、４’－デメチルノビレチンを含む画分を、ＵＶランプを用いて確認しながら採取した。

そして、得られた画分を、分取ＨＰＬＣカラム（ＴＳＫ ＧＥＬ ＯＤＳ、東ソー社製、４．６ｍｍ×２５ｃｍ）に供し、３７％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの移動層によって、純品の４’－デメチルノビレチン２０ｍｇを得た。

＜試験例２＞４’－デメチルノビレチンの角層セラミド合成への効果
実施例５で調製した４’－デメチルノビレチン純品又は４’－デメチルノビレチン含有組成物をヒト３次元培養表皮モデル（角層モデル）に添加し、角層セラミド合成への効果を調べた。

（方法）
ヒト３次元培養表皮モデルはＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ ６Ｄ（Ｊ－ＴＥＣ社）を用いた。当該表皮モデルの開封後１日間は、付属の専用アッセイ培地（［ＥＰＩ－ＭＯＤＥＬ］［ＣＯＲＮＥＡ－ＭＯＤＥＬ］（Ｊ－ＴＥＣ社））で培養した。その後、上記アッセイ培地に対し、４’－デメチルノビレチン（１０μＭ）もしくは４’－デメチルノビレチン含有組成物（４．５，９，１８μｇ／ｍＬ）を溶解した培地で培養を行い、培養６日目で組織を回収した。なお、培地交換は１日おきに実施した。対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として、４’－デメチルノビレチン又は４’－デメチルノビレチン含有組成物の代わりにＤＭＳＯを０．１％（容量比）添加したアッセイ培地を用いて、同様に培養を行った。

角層セラミド産生量は、トータルセラミド、セラミドＥＯＳ、セラミドＮＳ／ＮＤＳ（ＮＳとＮＤＳの合計）、セラミドＮＰについて評価した（サンプル数：ｎ＝３）。各セラミドの定量方法は以下の通りである。

培養６日目に回収した組織をトリプシン処理し、角層を分離させた。得られた角層をＰＢＳで複数回洗浄後、抽出液（クロロホルム：メタノール：ＰＢＳ＝１：２：０．８（容量比））の入ったガラスホモジナイザーで角層を一定時間破砕した。破砕後は、角層を試験管に移し、ボルテックスで２０分間振盪した後、遠心分離にて沈殿物と上清を分離した。当該沈殿物はＢＣＡ法にてタンパク定量し、角層タンパク重量あたりのセラミド量の算出に使用した。

一方、上記の上清に抽出液（クロロホルム：ＰＢＳ＝１：１（容量比））を加え、ボルテックスで２０分間振盪したのち、遠心分離にて層を分離した。ガラスシリンジで下層のみを回収し、窒素乾固で完全に溶媒を除去した後、クロロホルム・メタノール混合液（クロロホルム：メタノール＝２：１（容量比））を所定量加えて溶解するまでボルテックス処理することで、サンプル溶液とした。

セラミドの定量は、「機能性化粧品素材開発のための実験法-in vitro/細胞/組織培養-」（芋川玄爾 監修、2007年、シーエムシー出版）を参考にして、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を使用して行った。標準物質として使用したｎｏｎ ｈｙｄｒｏｘｙ ｃｅｒａｍｉｄｅ及びｈｙｄｒｏｘｙ ｃｅｒａｍｉｄｅはＭａｔｒｅｙａ， ＬＬＣ社より購入し、Ｃｅｒａｍｉｄｅ III及びＣｅｒａｍｉｄｅ VIはＥｖｏｎｉｋ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ＡＧ社（Ｅｓｓｅｎ）より、Ｃｅｒａｍｉｄｅ ＴＩＣ－００１は高砂香料工業株式会社より、それぞれ供与された。各標準物質は、０．２ｍｇ／ｍＬとなるように、クロロホルム・メタノール混合液（クロロホルム：メタノール＝２：１（容量比））に溶解し、標準液とした。

所定量のサンプル溶液及び標準液をシリカゲルプレート（ＨＰＴＬＣガラスプレート シリカゲル６０ Ｆ₂₅₄（Ｍｅｒｃｋ社））に供与し、展開溶媒（クロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１（容量比））で展開した。取り出したＴＬＣプレートを室温で風乾後、展開溶媒（クロロホルム：メタノール：酢酸＝１９７：２：１（容量比））で再度展開した。取り出したＴＬＣプレートは室温で風乾した後、１０％硫酸銅・８％リン酸（各質量比）の混合溶液を噴霧し、１８０℃で６分間加熱してスポットを発色させた。発色したＴＬＣプレートはスキャン後、Ｉｍａｇｅ Ｊ（Ｗａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄ）にて解析し、各スポットの濃度及び大きさに基づいて各セラミドを定量した。

なお、セラミドＮＳ／ＮＤＳの定量においては、ｎｏｎ ｈｙｄｒｏｘｙ ｃｅｒａｍｉｄｅを標準物質として用いた。セラミドＡＳの定量には、ｈｙｄｒｏｘｙ ｃｅｒａｍｉｄｅを標準物質として用いた。セラミドＮＰの定量においては、Ｃｅｒａｍｉｄｅ IIIを標準物質として用いた。セラミドＡＰの定量においては、Ｃｅｒａｍｉｄｅ VIを標準物質として用いた。セラミドＮＤＳの定量においては、Ｃｅｒａｍｉｄｅ ＴＩＣ－００１を標準物質として用いた。トータルセラミドの定量においては、上記で求めたセラミドを含む、セラミドＥＯＳ、ＮＳ、ＮＤＳ、ＮＰ、ＥＯＨ、ＡＳ、ＮＨ、ＡＰ及びＡＨの合計量として算出した。

（結果）
結果を図７、図８に示す。図７は、ヒト３次元培養表皮モデルに対して４’－デメチルノビレチン（ＤｅＮＯＢ）を添加したときの角層セラミド合成への効果（６日後）を示すグラフである。図７中、（Ａ）はトータルセラミド、（Ｂ）はセラミドＥＯＳ、（Ｃ）はセラミドＮＳ／ＮＤＳ、（Ｄ）はセラミドＮＰの結果を表す。また、縦軸はセラミド産生量（単位：μｇ／ｍｇ蛋白）、バーは標準偏差を表し、＊、＊＊は無添加の対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて各々ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１で有意差があることを表す。

４’－デメチルノビレチンの添加により、トータルセラミドは１．５４倍、セラミドＥＯＳは１．５０倍、ＮＳ／ＮＤＳは１．５９倍、セラミドＮＰは１．５７倍へとそれぞれ有意に増大した（図７）。

図８は、ヒト３次元培養表皮モデルに対して４’－デメチルノビレチン（ＤｅＮＯＢ）含有組成物を添加したときの角層セラミド合成への効果（６日後）を示すグラフである。図８中、（Ａ）はトータルセラミド、（Ｂ）はセラミドＮＳ／ＮＤＳ、（Ｃ）はセラミドＮＰの結果を表す。また、縦軸はセラミド産生量（単位：μｇ／ｍｇ蛋白）、バーは標準偏差を表し、＊は無添加の対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べてｐ＜０．０５で有意差があることを示す。

４’－デメチルノビレチン含有組成物の添加により、トータルセラミドは１．３６倍、ＮＳ／ＮＤＳは１．３４倍、セラミドＮＰは１．４０倍へとそれぞれ有意に増大した（図８）。

（結論）
以上のことから、４’－デメチルノビレチン及び４’－デメチルノビレチン含有組成物の角層セラミド合成促進作用が明らかとなった。これにより、４’－デメチルノビレチンが皮膚バリア機能を向上させ、乾皮症の治療・予防効果を発揮する可能性が示唆された。

＜試験例３＞ ４’－デメチルノビレチンのセラミド合成酵素遺伝子発現への効果
実施例５で調製した４’－デメチルノビレチン純品又は４’－デメチルノビレチン含有組成物をヒト３次元培養表皮モデル（角層モデル）に添加し、角層セラミド合成酵素遺伝子発現への効果を調べた。図９は、セラミド生合成経路と関連遺伝子を示す図である。本試験例では、セラミド合成関連遺伝子として、セラミド合成酵素１（ＣＥＲＳ１）、２（ＣＥＲＳ２）、グルコシルセラミド合成酵素（ＵＧＣＧ）、スフィンゴミエリン合成酵素２（ＳＭＳ２）について検討した。

（方法）
ヒト３次元培養表皮モデルを上記試験例２と同様に培養し、評価物質添加後培養３日目に回収した組織から、トリプシン処理で表皮細胞を取り出した。ここで、アッセイ培地に対する４’－デメチルノビレチンの添加量は１０μＭ、４’－デメチルノビレチン含有組成物の添加量は９，１８μｇ／ｍＬとした。対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として、４’－デメチルノビレチン又は４’－デメチルノビレチン含有組成物の代わりにＤＭＳＯを０．１％（容量比）添加したアッセイ培地を用いて、同様に培養を行った。

得られた表皮細胞から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて総ＲＮＡを抽出し、Ｒｅｖｅｒ ＴｒａＡｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、総ＲＮＡからｃＤＮＡ合成を行った。次に、得られたｃＤＮＡを用いて、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法により、セラミド生合成関連酵素（ＣＥＲＳ１、ＣＥＲＳ２、ＵＧＣＧ及びＳＭＳ２）の遺伝子発現量を定量した。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法には、ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（ＴａＫａＲａ社）を使用し、ＣＥＲＳ１、ＣＥＲＳ２、ＵＧＣＧ及びＳＭＳ２のプライマーは表１に示す塩基配列からなるものを用いた。

なお、内部標準としてＧＡＰＤＨを用いた。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲの操作は定められた方法に従い、ＣＥＲＳ１、ＣＥＲＳ２、ＵＧＣＧ及びＳＭＳ２のｍＲＮＡの発現量を、内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの発現量に対する割合として求めた。ＣＥＲＳ１、ＣＥＲＳ２、ＵＧＣＧ及びＳＭＳ２の発現率は、対照（ＤＭＳＯ ０．１％）のｍＲＮＡ発現量に対する４’－デメチルノビレチンもしくは４’－デメチルノビレチン含有組成物添加群のｍＲＮＡ発現量の比率として算出した（サンプル数：ｎ＝３）。

（結果）
結果を図１０及び図１１に示す。図１０は、ヒト３次元培養表皮モデルに対して４’－デメチルノビレチン（ＤｅＮＯＢ）を添加したときのセラミド関連遺伝子への効果（３日後）を示すグラフである。図１０中、（Ａ）はＣＥＲＳ１、（Ｂ）はＣＥＲＳ２、（Ｃ）はＵＧＣＧの結果を表す。グラフの縦軸は、無添加の対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるｍＲＮＡ発現量を１としたときの、ｍＲＮＡ発現量の割合（相対的ｍＲＮＡ発現量）を表す。また、バーは標準偏差を表し、＊は無添加の対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べてｐ＜０．０５で有意差があることを示す。４’－デメチルノビレチンの添加により、ＣＥＲＳ１、ＣＥＲＳ２、ＵＧＣＧ共に発現量の有意な上昇が示された（図１０）。

図１１は、ヒト３次元培養表皮モデルに対して４’－デメチルノビレチン含有組成物（ＤｅＮＯＢエキス）を添加したときのセラミド関連遺伝子への効果を示す図である。図１１中、（Ａ）はＣＥＲＳ１、（Ｂ）はＣＥＲＳ２、（Ｃ）はＵＧＣＧ、（Ｄ）はＳＭＳ２の結果を表す。グラフの縦軸は、無添加の対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）におけるｍＲＮＡ発現量を１としたときの、ｍＲＮＡ発現量の割合（相対的ｍＲＮＡ発現量）を表す。また、バーは標準偏差を表し、＃、＊は無添加の対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて各々ｐ＜０．１で傾向、ｐ＜０．０５で有意差があることを表す。４’－デメチルノビレチン含有組成物の添加により、ＣＥＲＳ１、ＣＥＲＳ２、ＵＧＣＧ、ＳＭＳ２それぞれについて発現量の有意な上昇が示された（図１１）。

（結論）
以上のことから、４’－デメチルノビレチン又は４’－デメチルノビレチン含有組成物の培養細胞への添加により、セラミド合成酵素活性が亢進したことで、角層セラミド合成が促進されたことが裏付けられた。これにより、４’－デメチルノビレチンが皮膚バリア機能を向上させ、乾皮症の治療・予防効果を発揮する可能性が示唆された。

＜実施例６＞ 内服剤の処方例
処方例１
以下の量で各原料を配合し、常法によりノビレチン配合製剤（３００ｍｇ錠剤）を製造した。
ノビレチン含有組成物（実施例１調製品） ５０ｍｇ
デキストリン １６０ｍｇ
結晶セルロース、マルチトール、ショ糖脂肪酸エステル ９０ｍｇ

処方例２
以下の量で各原料を配合し、常法により４’－デメチルノビレチン配合製剤（３００ｍｇ錠剤）を製造した。
４’－デメチルノビレチン含有組成物（実施例３調製品） ５０ｍｇ
デキストリン １６０ｍｇ
結晶セルロース、マルチトール、ショ糖脂肪酸エステル ９０ｍｇ

処方例３
以下の量で各原料を配合し、常法によりノビレチン配合製剤（３００ｍｇ錠剤）を製造した。
ノビレチン（実施例２調製品） ５ｍｇ
デキストリン ２０５ｍｇ
結晶セルロース、マルチトール、ショ糖脂肪酸エステル ９０ｍｇ

処方例４
以下の量で各原料を配合し、常法により４’－デメチルノビレチン配合製剤（３００ｍｇ錠剤）を製造した。
４’－デメチルノビレチン（実施例４調製品） ５ｍｇ
デキストリン ２０５ｍｇ
結晶セルロース、マルチトール、ショ糖脂肪酸エステル ９０ｍｇ

＜実施例７＞ 飲食品組成物の製造例
以下の量で各原料を配合し、常法によりノビレチン配合飲料（１８０ｍＬ）を製造した。
ノビレチン含有組成物（実施例１調製品） ０．０２５ｇ
りんご濃縮果汁 ５ｇ
乳糖 ２ｇ
果糖ブドウ糖液糖 ５ｇ
酸味料（クエン酸） ０．３ｇ
甘味料（スクラロース） ０．０１ｇ
保存料（安息香酸Ｎａ） ０．０３ｇ
水 残分

上記の飲料において、ノビレチン含有組成物に代えて同量の４’－デメチルノビレチン含有組成物（実施例３調製品）を使用したこと以外は、上記と同様にして４’－デメチルノビレチン配合飲料（１８０ｍＬ）を製造した。

以上、図面を参照して、本発明の実施形態及び実施例について詳述してきたが、具体的な構成は、これらに限らず、本発明の要旨を逸脱しない程度の設計的変更は、本発明に含まれる。

例えば、前記実施例では、ポンカン果皮から抽出、精製されたノビレチン及び４’－デメチルノビレチン又はこれらの含有組成物による乾皮症改善効果について説明したが、これに限定されるものではなく、ポンカンの代わりにノビレチンを含有する任意のカンキツ類を抽出原料とするノビレチン及び４’－デメチルノビレチンを有効成分とする乾皮症の治療又は予防用経口組成物も、本発明に含めることができる。

本発明は、安全性の高い原料であるノビレチン及び４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有することにより、乾皮症及びそれに伴うかゆみ過敏に対する鎮掻効果を有し、乾皮症及びそれに伴うかゆみ過敏の治療又は予防用の医薬品、医薬部外品、飲食品組成物等に利用されることが期待される。

Claims (3)

1. ノビレチン及び／又は４’－デメチルノビレチンを有効成分として含有する、乾皮症の治療もしくは予防用経口組成物。
2. かゆみ過敏を伴う乾皮症の治療もしくは予防用の医薬品又は医薬部外品である、請求項１記載の経口組成物。
3. かゆみ過敏を伴う乾皮症の改善もしくは予防用の飲食品組成物である、請求項１記載の経口組成物。
   

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