JP2023066301A

JP2023066301A - 抗酸化活性を有するボトリオコッセン又はスクアレンのチオール修飾体

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Publication number: JP2023066301A
Application number: JP2021176973A
Authority: JP
Inventors: 信渡邉; Makoto Watanabe; 宏美黒川; Hiromi Kurokawa; 翔渡邉; Sho Watanabe; イスデプスキーアンドレアス; Isdepsky Andreas; 秀徳路川; Hidenori Michikawa; 裕史松井; Yasushi Matsui; 正志木島; Masashi Kijima
Original assignee: Mobiol; Mobiol Technologies Co Ltd; University of Tsukuba NUC
Current assignee: Mobiol; Mobiol Technologies Co Ltd; University of Tsukuba NUC
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2021-10-28
Publication date: 2023-05-15

Abstract

【課題】本発明は、抗酸化活性を有するボトリオコッセン又はスクアレン由来の新規化合物、それらの製造方法、及びそれら新規化合物を有効成分として含有する抗酸化組成物に関する。【解決手段】ボトリオコッセン又はスクアレンにチオ酢酸を付加したチオールアセテート誘導体、及びそれらのＰｙ－Ｓ－Ｓ－Ｐｙ変性物が強力な抗酸化活性を有することが見出され、本発明に至った。【選択図】図２

Description

本発明は、抗酸化活性を有するボトリオコッセン又はスクアレン由来の新規化合物、それらの製造方法、及びそれら新規化合物を有効成分として含有する抗酸化組成物に関する。

生体内の様々な代謝過程で生成される活性酸素種（ＲＯＳ）は、様々な症状や疾患（例えば炎症、アレルギー反応、関節の障害、関節リウマチ、骨粗鬆症、心血管疾患、癌）の発症又は進行に関与することが知られている。例えば、ＲＯＳにより脂質分子が酸化されると、低密度リポタンパク質の過酸化が起こって動脈でプラークが形成されることがあり、これが心血管疾患やアテローム性動脈硬化症を引き起こし得る。また、ＲＯＳによりタンパク質分子が酸化的修飾を受けると、組織構造の変化や免疫異常が起こる可能性があり、関節リウマチや結合組織の損傷につながり、皮膚の外観や機能が変化することがある。また、酸化ストレスは疲労など身体的負荷に関与するだけでなく、精神面にも支障をきたすことも知られている。

消化管は生体内で最大のＲＯＳ発生組織であることが知られている。胃潰瘍、潰瘍性大腸炎、膵炎、脂肪肝等の疾患はＲＯＳにより惹起される。梗塞の予防において広く服用される非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）は、副反応として胃粘液の減少と消化管内でのＲＯＳ産生を誘導する。胃粘液の減少により組織が胃液に曝露すると組織が傷害し、ＲＯＳの産生が誘導される。さらにミトコンドリアの膜電位低下の結果からもＲＯＳ産生は誘導される。このようなＲＯＳ産生の結果消化管胃粘膜傷害から消化管出血を招く。過剰な出血は死に直結するため、ＮＳＡＩＤｓは胃薬と併用される。胃薬は減少した粘液の産生を促進することでＲＯＳを抑制する。また一部の抗凝固剤では服用による食道傷害が報告されており、この傷害にもＲＯＳの関与が示唆されている。

このような有害なＲＯＳを消去する仕組みとして、代表的なＲＯＳの消去酵素であるスーパオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、活性酸素種のスーパーオキシドを酸素及び過酸化水素に変換する反応を触媒する。形成された過酸化水素も有害であるが、これは更にカタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）によって消去される。

各種ビタミン、ポリフェノール、カテキン、グルタチオン、アスコルビン酸塩、トコフェロール、ユビキノン、ビリルビン、尿酸、イオウ化合物などの様々な低分子が、生体内の抗酸化機構と協調して、又は独立して、外来的抗酸化剤として機能し得る。例えばビタミンＢ２はＧＰｘの補酵素として作用し、ポリフェノールはＳＯＤ様活性を有する。カロテノイドも抗酸化剤として機能し、酸化的ストレス及び関連する慢性疾患に対し防御的効果を発揮し得る。例えば非特許文献１は、冠状動脈心疾患、白内障及び癌等種々の慢性疾患とカロテノイドとの間の関係についての報告をまとめている。

従って、そのような抗酸化活性を有する物質を有効成分とする医薬品は、ＲＯＳの作用に関連する疾患または症状の治療または予防のために好ましく利用され得る。実際に、抗酸化物質の服用による消化管傷害の予防（非特許文献２）や、腸内細菌叢の改善（非特許文献３）も報告されている。

良好な抗酸化活性を有する新規化合物や、既存の化合物が有する良好な抗酸化活性の発見は、医薬、食品及び化粧品の分野において需要の高い抗酸化剤の選択肢を広げるものとして、大いに歓迎される。

例えば、特許文献１は、優れた抗酸化作用を示すフラボノイド化合物としてルテオリン６－Ｃ－アラビノシドを合成し、当該化合物、その製造方法並びにそれを有効成分とする抗酸化剤を開示している。また、特許文献２は、エピガロカテキン二量体及び三量体がスーパーオキシドアニオンラジカルを消去する活性を有することを開示している。あるいは、特許文献３は、新規な含窒素ヘテロ環化合物又はその塩、それらを含有する酸化ストレス関連疾患の治療薬を開示している。

：特開２００６－２６５２４９：特開２０１０－２８０７１６：特開２００７－０１６０１１：再表２０１２／０７７８０１：再表２０１２／０７７７９９：特開２０１３／０３５７９１

：Canfield, et al. (1992), Proc. Soc. Exp. Biol. Med． 200:260 ：Sha S. et al. (2013), Biomaterials, Nov; Vol34 (33), pp8393-8400) ：Long BV. Et al. (2014), J. Gastroenterol, May; Vol49(5), pp806-813) ：BioScience, Biotechnology, and Biochemistry 75, 2246-2248 ：Science Advances 01 Jan 2020: Vol. 6, no. 1, eaax8358 ：Kawashima et al., Algal Reasearch 46 (2020) 101724

本発明は、抗酸化活性を有するボトリオコッセン又はスクアレン由来の新規化合物、それらの製造方法、及びそれら新規化合物を有効成分として含有する抗酸化組成物を提供することを目的とする。

抗酸化物質の一つとして知られるイオウ化合物の中でも特に酸化型グルタチオン等過イオウ（＞Ｓ＝Ｓ）化合物は、抗酸化機能に加え、近年哺乳類で発見されたイオウ呼吸を通じたイオウ代謝により、環境ストレスを緩和し、様々な疾患に効果を発揮することが示唆されている唯一の成分である。したがって他の抗酸化成分と比較して今後の発展性は非常に高い。しかしながら、よく知られている酸化型（Ｓ＝Ｓ）、還元型（Ｓ－）のグルタチオン総含有量は、一般に生体内で０．３％程度、高蓄積酵母菌でも４～５％程度で、さらに酸化型はその１／１０程度しか存在しない（今堀，２００７）。このため市場価格が極めて高価となり、実用化・普及化の大きな隘路となっていた。

グルタチオンの優れた抗酸化機能は、チオール基（Ｒ－Ｓ－Ｈ）の働きによって担保されている。これはチオール基の高い求核性によるものである。チオールによって修飾された化合物が同様に良好な抗酸化機能を有することが予想されたが、これまでチオール修飾した化合物の報告は少なく、それらの抗酸化機能は検討されていない。

川島らは、不飽和炭化水素ボトリオコッセン：

の二重結合にチオール－エン反応を用いてチオールを導入し、ボトリオコッセンのチオール誘導体ボトリオコッセンペンタチオレート2a、2b及び2cが合成されることを報告している（非特許文献６）。この研究に着目し、発明者らはチオール－エン反応を用いてボトリオコッセンの様々なチオール誘導体を作製してそれらの抗酸化活性を評価したところ、導入されたチオールの種類によって誘導体の抗酸化作用は様々であった。例えばボトリオコッセンの側鎖部分の二重結合にチオールが重合したボトリオコッセンチオール誘導体（ＢＯＴ－ＳＨ）：

において、抗酸化効果は認められなかった。一方、ボトリオコッセンの側鎖部分の二重結合にチオールアセテートが重合したボトリオコッセンチオールアセテート誘導体（Ｂｏｔ－ＳＡｃ）：

において、特に強力な抗酸化活性が認められた。

また、ボトリオコッセンと類似の構造を有するスクアレン：

の主鎖の二重結合にチオールアセテートが重合したスクアレンチオールアセテート誘導体（ＳＱ－ＳＡｃ）：

は既知の化合物であったが、これもボトリオコッセンチオールアセテート誘導体と同様に、抗酸化活性を有することが見出された。

更に、上記ＢＯＴ－ＳＡｃのＰｙ－Ｓ－Ｓ－Ｐｙ変性物（ＢＯＴ－ＳＳＰｙ）：

が、元のＢＯＴ－ＳＡｃを上回る強力な抗酸化活性を有することが見出された。

生体内でＲＯＳが種々の疾患又は症状に関与することが知られており、抗酸化物質の服用はそのような疾患または症状の予防又は抑制に有用である。下記実施例において示すように、本願発明に係る抗酸化組成物は、ラット胃粘膜正常細胞に非ステロイド性抗炎症薬のインドメタシンや抗凝固剤のダビガトランを暴露して誘導されるＲＯＳ産生、及びそれらの薬剤の作用に伴う細胞傷害やアポトーシスを強力に抑制した。実施例において示されたこれらの細胞保護効果は、本願発明に係る医薬組成物が有する抗酸化能が、ＲＯＳが関与する細胞の状態の改善にまで及ぶことを示している。

ボトリオコッセン及びスクアレンは、それらを産生する微細藻類を培養して工業的規模で生産する手段が確立しており（特許文献４、非特許文献４及び特許文献５）、それらから出発して簡単なチオール－エン反応を用いて高度な抗酸化活性を有する化合物を取得出来るという本願発明は、安価かつ大量生産に適した新規の抗酸化生物材料として、医薬、食品、飼料、保健分野の市場における高い需要を大いに満たすものである。

従って、本願は、以下の発明を提供する。

１．式（Ｉ）：

で表される化合物。
２．式（ＩＩ）：

で表される化合物。
３．項目１又は２のいずれかに記載の化合物、及び式（ＩＩＩ）：

で表される化合物、からなる群から選択される化合物を有効成分として含有する、抗酸化活性を有する抗酸化組成物。
４．生体内の活性酸素種（ＲＯＳ）に関連する疾患若しくは症状、又は美容上の問題の治療及び予防及び／又は軽減のための、項目３に記載の抗酸化組成物。
５．生体内の抗酸化機能を補助、改善又は強化するための栄養補助組成物又は飼料用組成物である、項目３又は４のいずれかに記載の抗酸化組成物。
６．経口摂取用のトローチ、ピル、カプセル、薬液又は錠剤の形態である、項目３～５のいずれか１項に記載の抗酸化組成物。
７．項目１に記載の化合物を製造する方法であって、
ｉ）ボトリオコッセン、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン及びＴＨＦを混合する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で得た混合物にチオ酢酸を添加する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得た混合物をＵＶ照射下撹拌する工程、及び
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の反応産物を濃縮し、項目１に記載の化合物を精製する工程、
を含む、製造方法。
８．項目２に記載の化合物を製造する方法であって、
ｉ）項目１に記載の化合物、ＬｉＯＨ、ＥｔＯＨ及び蒸留水を混合する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で得た反応産物からＥｔＯＨを分留除去し、飽和食塩水及びジクロロメタンを添加する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得た混合物からジクロロメタン相を回収する工程、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）のジクロロメタン相を濃縮して得た粗生成物に、クロロホルム、２，２´－ジピリジルジスルフィドを添加して撹拌する工程、及び
ｖ）工程ｉｖ）の反応産物を濃縮し、項目２に記載の化合物を精製する工程、
を含む、製造方法。

ＢＯＴ－ＳＨ及びＢＯＴ－ＳＡｃの抗酸化効果をＥＳＲを用いて評価した結果を示す。ＢＯＴ－ＳＨでは一重項酸素及びヒドロキシラジカルの消去能が確認されなかった。一方、ＢＯＴ－ＳＡｃではこれらのラジカルの消去能が確認された。

ＢＯＴ－ＳＡｃ及びＳＱ－ＳＡｃの抗酸化活性をＥＳＲを用いて評価した結果を示す。両方の化合物において、一重項酸素、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカルの顕著な消去能が確認された。

ＥＳＲを用いて評価したＢＯＴ－ＳＡｃの抗酸化活性が対照と比較して有意であることを示す。

ＥＳＲを用いて評価したＢＯＴ－ＳＳＰｙの抗酸化活性が対照と比較して有意であることを示す。

ラット胃粘膜正常細胞ＲＧＭ１に対するＢＯＴ－ＳＡｃ及びＢＯＴ－ＳＳＰｙの抗酸化効果を評価した結果を示す。ＢＯＴ－ＳＡｃ又はＢＯＴ－ＳＳＰｙを添加した条件では細胞内の蛍光が不含の場合に比べて弱く、ＢＯＴ－ＳＡｃ又はＢＯＴ－ＳＳＰｙにより、インドメタシン起因性ＲＯＳ産生が顕著に抑制されることが実証された。

ラット胃粘膜正常細胞ＲＧＭ１に対するＢＯＴ－ＳＳＰｙの抗酸化効果を評価した結果を示す。ＢＯＴ－ＳＳＰｙを添加した条件では細胞内の蛍光が不含の場合に比べて弱く、ＢＯＴ－ＳＳＰｙにより、タビガトラン起因性ＲＯＳ産生が顕著に抑制されることが実証された。

ＢＯＴ－ＳＳＰｙによるインドメタシン由来細胞傷害の軽減効果を評価した結果を示す。インドメタシン曝露によりＢＯＴ－ＳＳＰｙ不含では細胞生存率はインドメタシン無曝露群に対し５０％まで低下したが、１００μＭのＢＯＴ－ＳＳＰｙでは８６％と細胞傷害を有意に軽減できることが分かった。

ＢＯＴ－ＳＳＰｙによるダビガトラン由来細胞傷害の軽減効果を評価した結果を示す。ダビガトラン曝露によりＢＯＴ－ＳＳＰｙ不含では細胞生存率はタビガトラン無曝露群に対し３３％まで低下したが、１００μＭのＢＯＴ－ＳＳＰｙでは５４％と細胞傷害を有意に軽減できることが分かった。

ＢＯＴ－ＳＳＰｙによるインドメタシン由来アポトーシス誘導の抑制効果を評価した結果を示す。インドメタシンへの曝露が行われなかった試料に比べ、インドメタシン曝露試料ではＢＡＸの発現が有意に増加し、一方ＢＯＴ－ＳＳＰｙ含有条件では、ＢＡＸの発現は有意に低下した。

ボトリオコッセンは、ボトリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）の一部の株が生産する、以下の構造

を有する、トリテルペン炭化水素の一種である。このボトリオコッセンを生産するボトリオコッカス・ブラウニー・レース－Ｂは、ボトリオコッセンを高純度で大量に蓄積し、生産したボトリオコッセンを細胞外に分泌するという性質があるため、ボトリオコッセンの大量生産において有用である（特許文献４）。

ボトリオコッセンは、それ自体ディーゼルオイルとして船舶や農耕作業用車に直接利用できるが、さらに既存の触媒クラッキングにより、軽油、ナフサ、灯油、ガソリンに転換することができる。また、ボトリオコッセンは優れた保湿性を有しているため、化粧品に配合する保湿成分としての用途も見出されている（特許文献６）。このようにボトリオコッセンは産業上の様々な用途における利用が見込まれる価値の高い材料であり、本発明のＢＯＴ－ＳＡｃは、ボトリオコッセンの更なる有望な用途として、優れた抗酸化活性を有する新規化合物の材料としての利用を提案するものである。

更に、Ｓ－Ｓ構造が強力な抗酸化活性をもたらすという知見に基づき（非特許文献５）生成した、ＢＯＴ－ＳＡｃのＰｙ－Ｓ－Ｓ－Ｐｙ変性物：

スクアレンは、以下の構造

を有する、トリテルペン炭化水素の一種である。スクアレンは、ステロールの前駆体として心疾患予防や腫瘍形成の抑制に効果があると期待されているほか、水素添加により優れた潤滑性及び保湿効果を有する化粧品材料スクアランを生産できる。これまでスクアレンは専ら深海鮫の肝油を供給源としていたが、深海鮫は乱獲により個体数を減らしており、スクアレンの持続可能な供給が今後困難になる可能性が高い。一方、極めて高効率でスクワレンを生産するオーランチオキトリウム属藻類ｔｓｕｋｕｂａ－３株が見出され、深海鮫に代わるスクアレン供給源としての利用が試みられている（非特許文献４）。

スクアレンのチオールアセテート誘導体：

は既に公知であったが、その機能性については知られていなかった。本発明において、スクアレンと分子構造の類似するボトリオコッセンのチオールアセテート誘導体が強力な抗酸化活性を有することが示されたことから、当該ＳＱ－ＳＡｃの抗酸化活性も試験したところ、同様に抗酸化活性を有することが新たに見出された。

本発明において、前記ボトリオコッセンにチオ酢酸を付加することにより、チオールアセテート誘導体が生産される。この付加反応はチオール－エン反応と呼ばれ、その簡単さ、高い反応性及び利用可能な試薬の幅広さからクリック化学と見做されるものである。ボトリオコッセンは炭化水素側鎖に５個、主鎖に１個の二重結合を有しているが、このチオール－エン反応を用いて、側鎖の５個の二重結合の全てにチオ酢酸が付加する。反応条件により側鎖の一部にチオ酢酸が付加していないものや、主鎖の二重結合にもチオ酢酸が付加したものも僅かに存在し得るが、それらも本発明のＢＯＴ－ＳＡｃに含まれる。

スクアレンは、６個の二重結合が全て炭化水素主鎖に有る点でボトリオコッセンと相違している。チオール－エン反応によるチオ酢酸付加でそれら６個の二重結合の全てにチオ酢酸が付加する。後述のようにＢＯＴ－ＳＡｃとＳＱ－ＳＡｃは抗酸化活性に顕著な差異が有り、そのような差異はチオ酢酸基と炭化水素主鎖との間の位置関係に関連していると考えられる。

Ｐｙ－Ｓ－Ｓ－Ｐｙはチオールと反応してＲ－Ｓ－Ｓ－Ｐｙを形成する試薬である。ただし、Ｒ－Ｓ－Ｓ－ＰｙとＲ’－ＳＨは容易に反応してＲ－Ｓ－Ｓ－Ｒ’を形成する。

前記チオールアセテート誘導体及びその変性物は、高度な抗酸化活性を有している。本発明中、「抗酸化活性」とは、一重項酸素（１Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（ＯＨ－）及びスーパーオキシドアニオン（Ｏ２－）等の活性酸素種（ＲＯＳ）を除去する作用のこと、又は生体内でＲＯＳによって引き起こされる細胞若しくは組織の障害やＲＯＳに関連する疾患若しくは症状、又は美容上の問題を防止又は抑制する作用を意味する。

好ましくは、抗酸化活性は任意の適切な方法を用いて評価されてもよく、利用可能な評価方法として、例えば、実施例で用いられている活性酸素種の消去活性の測定、ＤＤＰＨ（２，２－ジフェニル－１－ピクリルヒドラジル）ラジカル消去活性の測定、又はＯＲＡＣ（Oxygen Radical Absorbance Capacity）評価などが挙げられる。当該評価結果は、本願発明に係るチオールアセテート誘導体及びその変性物の製造プロセスを最適化するのに、又は所望の抗酸化活性を生じるのに必要用量を推定するのに利用され得る。

また、前記チオールアセテート誘導体及びその変性物は、それらを有効成分として含有する抗酸化組成物として調製され得る。当該抗酸化組成物には、調製過程での変性を防止する、抗酸化活性を強化する、保存安定性を改善する、物理化学的特性を変化させる、あるいは他の栄養特性を付与するため様々な添加物が添加されてもよく、そのような添加物として、脂質、炭水化物、有機酸、ビタミン、ミネラル、抗生物質、香料、着色料、保存料、賦形剤、増量剤、増粘剤、接着剤、水和剤、崩壊剤、乳化剤、ｐＨ調整剤等、最終製品の属する分野で許容される任意の添加物が挙げられる。

前記抗酸化組成物は、身体内のＲＯＳに関連する様々な疾患又は症状の治療及び予防及び／又は軽減のための抗酸化医薬組成物又は抗酸化美容組成物として調製され得る。あるいは、前記抗酸化組成物は、抗酸化活性を有する栄養補助組成物又は飼料用組成物として調製され得る。それら各用途の組成物の形態、組成、物理化学的特性、用量、用法等諸条件は、各分野の当業者が具体的用途に応じて適宜選択し得る設計事項である。

本発明の更なる態様において、前記抗酸化組成物は、単独で、又は当該組成物と同じく抗酸化作用を有する、又は他の生理活性を有する他の物質と組み合わせて使用され得る。

好ましくは、前記抗酸化組成物は経口製剤として調製され得る。当該経口製剤は、医薬として通常許容される１又は２以上の任意の賦形剤を更に含み得る。

好ましくは、前記抗酸化組成物は、トローチ、ピル、カプセル、薬液、錠剤などとして処方される。

前記経口製剤は、好ましくは、酸化ストレスに関連する疾患又は身体の不調の治療又は予防のために栄養サプリメントとして摂取され得る。

前記経口製剤は、所望の効能を発揮するのに有用な１又は２以上のさらなる物質、化合物、薬物又は組成物と組み合わせて摂取され得る。

実施例１ＢＯＴ－ＳＡｃの合成

アルゴン雰囲気下、石英試験管に、ボトリオコッセン（１．２０ｇ，２．５７ｍｍｏｌ）、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（３３．３ｍｇ，０．１３０ｍｍｏｌ，５ｍｏｌ％）及びＴＨＦ（２ｍＬ）を加え、室温で混合した。当該混合物を０℃に冷却し、チオ酢酸（１．３２ｍＬ，１８．５ｍｍｏｌ，７．２ｍｏｌｅｑｕｉｖ．）を加えた後、ＵＶ（３６５ｎｍ，ハンディーＵＶランプ使用，４ＷＵＶランプ１本）照射下、１．５時間室温にて攪拌した。反応終了後、反応混合物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル６：１）にて精製を行うことで、目的のチオールアセテート誘導体ＢＯＴ－ＳＡｃ（１．７２ｇ，２．０３ｍｍｏｌ，７９％）を得た。¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃)δ = 0.76-1.01 (m, 24 H, CH3 x 8), 1.02-2.02 (m, 27 H, CH₂ x 9 + CH x 9), 2.28-2.36 (m, 15 H, CH₃COS^- x 5), 2.63-3.05 (m, 10 H, AcS-CH₂ x 5), 5.09-5.27 (m, 2 H, C=CH x 2) ppm

実施例２ＳＱ－ＳＡｃの合成

アルゴン雰囲気下、石英試験管に、スクアレン（１．０３ｇ，２．５１ｍｍｏｌ）、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン（３３．６ｍｇ，０．１３１ｍｍｏｌ，５ｍｏｌ％）及びＴＨＦ（２ｍＬ）を加え、室温で混合した。当該混合物を０℃に冷却し、チオ酢酸（１．２９ｍＬ，１８．１ｍｍｏｌ，７．２ｍｏｌｅｑｕｉｖ．）を加えた後、ＵＶ（３６５ｎｍ，ハンディーＵＶランプ使用，４ＷＵＶランプ１本）照射下、１．５時間室温にて攪拌した。反応終了後、反応混合物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル６：１）にて精製を行うことで、目的のチオラート誘導体ＳＱ－ＳＡｃ（１．８９ｇ，２．１８ｍｍｏｌ，８７％）を得た。¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃)δ = 0.78-1.04 (m, 24 H, CH₃ x 8), 1.06-1.82 (m, 24 H, CH₂ x 10 + CH x 4), 1.85-2.02 (m, 2 H, CH x 2), 2.31-2.36 (m, 18 H, CH₃COS^- x 6), 3.37-3.62 (m, 6 H, AcS^-CH^- x 6) ppm

実施例３ＢＯＴ－ＳＳＰｙの合成

３０ｍＬナスフラスコに、実施例１で取得したＢＯＴ－ＳＡｃ（５５０ｍｇ，０．６４９ｍｍｏｌ）、ＬｉＯＨ（１６４ｍｇ，６．８６ｍｍｏｌ，１０ｅｑ．）、ＥｔＯＨ（１２ｍＬ）及び蒸留水（１ｍＬ）を入れ、室温で４時間攪拌した。当該反応混合物の反応の進行をＴＬＣ確認した後に、一度エタノールをエバポレーターで除去し、飽和食塩水、ジクロロメタンを加え分液ロートに移した。１Ｎ塩酸を用いてｐＨ＝１～２程度になるよう調整した後に、ジクロロメタンを用いて５回抽出を行った。ジクロロメタン層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ別後、ろ液をエバポレーターにて濃縮し、粗生成物を得た。当該粗生成物の入った３０ｍＬナスフラスコに、クロロホルム（３ｍＬ）、２，２´－ジピリジルジスルフィド（７１８ｍｇ，３．２６ｍｍｏｌ）を入れ、アルゴン風船を用いて内部の気体をアルゴンに置換した後、室温で１２時間攪拌した。ＴＬＣで反応の進行を確認した後に、エバポレーターを用いて濃縮し、得られた濃縮物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン：酢酸エチル＝４：１→１：１→酢酸エチルのみ）で精製した。途切れることなく多数のスポットが確認されたため、Ｐｙ－Ｓ－Ｓ－Ｐｙとｈｅｘ：ＥＡ＝４：１で原点に確認されるＰｙ－Ｓ－Ｓ－Ｐｙ変性物（単離・ＮＭＲは測定済み、構造はまだ決定していない）以外のすべてのスポットを１つにまとめて濃縮して、目的のＢＯＴ－ＳＳＰｙを４１４ｍｇ得た。

実施例４ＢＯＴ－ＳＡｃ、ＳＱ－ＳＡｃ及びＢＯＴ－ＳＳＰｙの抗酸化効果
実施例１～３において取得したＢＯＴ－ＳＡｃ、ＳＱ－ＳＡｃ及びＢＯＴ－ＳＳＰｙのの抗酸化活性を、電子スピン共鳴法（Electron Spin Resonance; ESR）を用いて評価した。Ｂｏｔ－ＳＡｃ及びＳＱ－ＳＡｃはエタノールで、ＢＯＴ－ＳＳＰｙはＤＭＳＯで溶解して、１０，０００μＭの試験試料を調製した。

一重項酸素（１Ｏ２）測定方法
Ａｃｉｄｒｅｄ及びＴＥＭＰＯをＭｉｌｌｉＱ水で溶解し、それぞれ２ｍＭ、１００ｍＭの終濃度になるよう調製した。１００μＬＡｃｉｄｒｅｄ、１００μＬＴＥＭＰＯ及び３０μＬの前記試験試料と７０μＬＭｉｌｌｉＱ水を混合し、波長５４０ｎｍの光を３０秒間照射した。照射後溶液をパスツールピペットにロードし、電子スピン共鳴装置（ＪＥＯＬ－ＴＥ、日本電子株式会社、東京）で測定した。測定条件は下記の通りである。
sweep width: 7.5 mT, gain: 50-500, modulation width: 0.2 mT, time contrast: 0.1 s, center field: 335.5 mT, sweep time: 0.5 min.

ヒドロキシラジカル（ＯＨ－）測定方法
スピントラップ剤ＣＹＰＭＰＯをＭｉｌｌｉＱ水で溶解し、１００ｍＭの終濃度になるよう調製した。１６μＬ過酸化水素、２０μＬＣＹＰＭＰＯ及び２０μＬの前記試験試料と１４４μＬＭｉｌｌｉＱ水を混合し、波長４０５ｎｍの光を１０秒間照射した。照射後の試料溶液のＥＳＲを、一重項酸素と同様に測定した。

スーパーオキシドアニオン（Ｏ２－）測定方法
スピントラップ剤ＣＹＰＭＰＯをＭｉｌｌｉＱ水で溶解し、１００ｍＭの終濃度になるよう調製した。ヒポキサンチンをＮａＯＨで溶解し、２０ｍＭの終濃度になるよう調製した。２０μＬヒポキサンチンと１０μＬＣＹＰＭＰＯの混合溶液をＡ溶液、１．６μＬキサンチンオキシダーゼ（２５Ｕ／ｍＬ）と１０μＬＣＹＰＭＰＯの混合溶液をＢ溶液、２０μｌの前記試験試料と１３８．４μＬＭｉｌｌｉＱ水をＣ溶液とし、これらＡ、ＢおよびＣ溶液を混和した試料溶液のＥＳＲを一重項酸素測定と同様に測定した。

測定結果
ＳＱ－ＳＡｃ及びＢＯＴ－ＳＡｃにおいて、一重項酸素、スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカル消去能が確認された（図２）。さらにＢＯＴ－ＳＡｃ（図３）及びＢＯＴ－ＳＳＰｙ（図４）において、これらＲＯＳの消去能は、対照と比較して有意であることが示された。一方、ＢＯＴ－ＳＨにおいて顕著なＲＯＳ消去能は見られなかった（図１）。

実施例５ＢＯＴ－ＳＡｃ及びＢＯＴ－ＳＳＰｙの細胞に対する抗酸化効果
ラット胃粘膜正常細胞ＲＧＭ１に対するＢＯＴ－ＳＡｃ及びＢＯＴ－ＳＳＰｙの抗酸化効果を評価した。評価は、非ステロイド性抗炎症薬のインドメタシンや抗凝固剤のダビガトランへの暴露により惹起されるＲＯＳ産生の抑制により行われた。

ＲＧＭ１を２４穴プレートに播種し、二晩培養した。培養後、細胞を１０、１００μＭのＢＯＴ－ＳＡｃ又はＢＯＴ－ＳＳＰｙと１ｍＭのインドメタシンを含有する培地中で１時間培養した。培養後上清を除去し、５μＭのヒドロキシフェニルフルオレセイン（ＨＰＦ）を添加し、１５分培養した。ＨＰＦは活性酸素種の検出蛍光試薬である。上清を緩衝液に差し換え、細胞内の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。ＢＯＴ－ＳＡｃ又はＢＯＴ－ＳＳＰｙ不含条件では細胞内に蛍光が観察され、これはインドメタシンにより細胞内のＲＯＳ産生量が増加したことを示す。一方ＢＯＴ－ＳＡｃ又はＢＯＴ－ＳＳＰｙを添加した条件では細胞内の蛍光が不含に比べて弱く、ＢＯＴ－ＳＡｃ又はＢＯＴ－ＳＳＰｙにより、インドメタシン起因性ＲＯＳ産生が顕著に抑制されることが実証された（図５）。

ＢＯＴ－ＳＳＰｙについては、ダビガトラン暴露によるＲＯＳ酸性に対する抑制効果も同様に評価された。ＲＧＭ１を２４穴プレートに播種し、二晩培養した。培養後、細胞を１０、１００μＭのＢＯＴ－ＳＳＰｙ及び２５μＭのダビガトランを添加した培地中で６時間培養した。培養後上清を除去し、５μＭのＨＰＦを添加し１５分培養した。上清を緩衝液に差し換え、細胞内の蛍光を蛍光顕微鏡で観察した。ＢＯＴ－ＳＳＰｙ不含条件では細胞内に蛍光が観察され、これはダビガトランにより細胞内のＲＯＳ産生量が増加したことを示す。一方ＢＯＴ－ＳＳＰｙを添加した条件では、細胞内の蛍光が不含に比べて弱く、ＢＯＴ－ＳＳＰｙにより、タビガトラン起因性ＲＯＳ産生が顕著に抑制されることが実証された（図６）。

実施例６：薬剤由来細胞傷害に対するＢＯＴ－ＳＳＰｙの胞保護効果
インドメタシンやダビガトランにより産生が惹起されたＲＯＳ産生は、細胞傷害を誘導する。斯かる細胞傷害は抗酸化物質により軽減できる。本試験において、ＢＯＴ－ＳＳＰｙがこれらの薬剤に由来する細胞傷害を軽減できるか検討した。

ＲＧＭ１を９６穴プレートに播種し、二晩培養した。培養後、細胞を１０、１００μＭのＢＯＴ－ＳＳＰｙと５００μＭのインドメタシン又は５０μＭのダビガトランを添加した培地中で２４時間培養した。培養後上清を除去し、培地に対して１０％ＣＣＫ８含有培地で反応させた。４５０ｎｍに対する吸光度が１になるまで吸光度を測定した。インドメタシンに曝露しなかった細胞の生存率を１００％とした。インドメタシン曝露によりＢＯＴ－ＳＳＰｙ不含では細胞生存率は５０％まで低下したが、１００μＭのＢＯＴ－ＳＳＰｙでは８６％と細胞傷害を有意に軽減できることが分かった（図７）。ダビガトラン曝露によりＢＯＴ－ＳＳＰｙ不含では細胞生存率は３３％まで低下したが、１００μＭのＢＯＴ－ＳＳＰｙでは５４％と細胞傷害を有意に軽減できることが分かった（図８）。

実施例７：インドメタシン由来アポトーシスに対するＢＯＴ－ＳＳＰｙの胞保護効果
インドメタシンにより産生が惹起されたＲＯＳ産生は、アポトーシスを誘導する。本試験において、ＢＯＴ－ＳＳＰｙがインドメタシンに由来するアポトーシスを抑制できるか検討した。

ＢＡＸはタンパク質の一つで、ミトコンドリアの電位依存性アニオンチャネルと相互作用して開口を増加させ、膜電位の消失とシトクロムｃの放出を引き起こす。ＢＡＸの発現増加はアポトーシスの誘導の指標である。

ＲＧＭ１を６０ｍｍのディッシュに播種し、二晩培養した。培養後、１０、１００μＭのＢＯＴ－ＳＳＰＹと５００μＭのインドメタシンを添加した培地中で２４時間培養した。培養後細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＲＩＰＡ緩衝剤で細胞を回収し、これを超音波破砕した懸濁物を試験試料とした。試験試料のＢＡＸ量をウェスタンブロッティング法で測定した。インドメタシンへの曝露が行われなかった試料に比べ、インドメタシン曝露試料ではＢＡＸの発現が有意に増加していた。一方ＢＯＴ－ＳＳＰｙ含有条件では、ＢＡＸの発現は有意に低下し、これはＢＯＴ－ＳＳＰｙがインドメタシン起因性アポトーシスを抑制したことを示す（図９）。

Claims

式（Ｉ）：

で表される化合物。
式（ＩＩ）：

で表される化合物。
請求項１又は２のいずれかに記載の化合物、及び式（ＩＩＩ）：

で表される化合物、からなる群から選択される化合物を有効成分として含有する、抗酸化活性を有する抗酸化組成物。
生体内の活性酸素種（ＲＯＳ）に関連する疾患若しくは症状、又は美容上の問題の治療及び予防及び／又は軽減のための、請求項３に記載の抗酸化組成物。
生体内の抗酸化機能を補助、改善又は強化するための栄養補助組成物又は飼料用組成物である、請求項３又は４のいずれかに記載の抗酸化組成物。
経口摂取用のトローチ、ピル、カプセル、薬液又は錠剤の形態である、請求項３～５のいずれか１項に記載の抗酸化組成物。
請求項１に記載の化合物を製造する方法であって、
ｉ）ボトリオコッセン、２，２－ジメトキシ－２－フェニルアセトフェノン及びＴＨＦを混合する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で得た混合物にチオ酢酸を添加する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得た混合物をＵＶ照射下撹拌する工程、及び
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の反応産物を濃縮し、請求項１に記載の化合物を精製する工程、
を含む、製造方法。
請求項２に記載の化合物を製造する方法であって、
ｉ）請求項１に記載の化合物、ＬｉＯＨ、ＥｔＯＨ及び蒸留水を混合する工程、
ｉｉ）工程ｉ）で得た反応産物からＥｔＯＨを分留除去し、飽和食塩水及びジクロロメタンを添加する工程、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）で得た混合物からジクロロメタン相を回収する工程、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）のジクロロメタン相を濃縮して得た粗生成物に、クロロホルム、２，２´－ジピリジルジスルフィドを添加して撹拌する工程、及び
ｖ）工程ｉｖ）の反応産物を濃縮し、請求項２に記載の化合物を精製する工程、
を含む、製造方法。