JP2023058381A - タンパク質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、ポリエチレンテレフタレート分解用組成物、及びリサイクル品の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】耐熱性及びＰＥＴ加水分解活性に優れる新規のタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、前記組換えベクターを含む形質転換体、前記タンパク質を含むポリエチレンテレフタレート分解用組成物、及び前記タンパク質を用いたリサイクル品の製造方法を提供する。【解決手段】タンパク質はＰＥＴ加水分解活性を有し、ＰＥＴ２野生型に対してＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を少なくとも有する。【選択図】図６Ａ

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り （１）Ａｋｉｈｉｋｏ Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｎａｏｙａ Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｎｏｂｕｙａｓｕ Ｋｏｇａ，ａｎｄ Ｒｙｏｔａ Ｉｉｎｏ，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｃｈａｒｇｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ＰＥＴ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ＰＥＴ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．２０２１，１１，８５５０－８５６４（令和３年６月２９日公開） （２）第３回ＥｘＣＥＬＬＳシンポジウム オンラインポスター（令和２年１２月２１日公開） （３）令和３年７月１日付プレスリリース（国立大学法人 静岡大学のウェブサイトに掲載されたｐｄｆ資料） （４）令和３年７月１日付プレスリリース（国立大学法人 静岡大学のウェブサイト） （５）令和３年７月１日付プレスリリース（大学共同利用機関法人 自然科学研究機構分子化学研究所のウェブサイト）

本開示は、タンパク質、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、ポリエチレンテレフタレート分解用組成物、及びリサイクル品の製造方法に関する。

プラスチックによる環境汚染の解決や持続可能な社会の構築が重要視されている。その中でポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）は国内で生産されているプラスチックの約４％を占めており、飲料ボトル、衣類等、身近に使用されている。現在ＰＥＴの大半は焼却処分されたり、カーペット等に変換利用されたりしているが、持続可能な利用のためには再利用することが望ましい。現在実用化されているＰＥＴのリサイクルでは、粉砕後熱処理して再成形する物理リサイクルと、化学触媒で分解後再重合するケミカルリサイクルの２通りが採用されている。しかしながら、前者では物性の低下や着色が問題となり、後者では危険性の高い薬品や高温処理が必要である。腐食性の高い薬品の使用量と必要な熱量を減らすことができる酵素を用いたＰＥＴ分解技術は今後の社会で重要となる技術である。

ＰＥＴ分解酵素として、ＰＥＴ資化性細菌由来のＩｓＰＥＴａｓｅの活性を向上させた変異体が報告されている（特許文献１参照）。また、ワックス層であるクチンを分解するクチナーゼを起源とするＣｕｔ１９０（特許文献２参照）、並びに耐熱性及びＰＥＴ分解活性を向上させた変異体としてもう１つのクチナーゼであるＬＣＣも報告されている（特許文献３、４参照）。

一方でＰＥＴのエステル結合は、上記以外のエステラーゼでも分解が可能である。例えば、２００９年にリパーゼとして発見された環境ゲノム由来のＬｉｐＩＡＦ５．２酵素（非特許文献１参照）は、２０１８年に、ＰＥＴ分解活性を持つことが報告され、ＰＥＴ２と命名された（非特許文献２参照）。

国際公開第２０１９／１６８８１１号 特開２０１５－１１９６７０号公報 国際公開第２０１２／０９９０１８号 特表２０１９－５２７０６０号公報

Meilleur, C.; Hupe, J. F.; Juteau, P.; Shareck, F. Isolation and Characterization of a New Alkali-Thermostable Lipase Cloned from a Metagenomic Library. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2009, 36, 853-61. Danso, D.; Schmeisser, C.; Chow, J.; Zimmermann, W.; Wei, R.; Leggewie, C.; Li, X.; Hazen, T.; Streit, W. R. New Insights into the Function and Global Distribution of Polyethylene Terephthalate (Pet)-Degrading Bacteria and Enzymes in Marine and Terrestrial Metagenomes. Appl. Environ. Microbiol. 2018, 84, No. e02773-17.

従来知られているＰＥＴ分解酵素は、リサイクルに使用するうえではそれぞれ課題を有する。例えば、ＩｓＰＥＴａｓｅは耐熱性が低いという問題がある。また、Ｃｕｔ１９０及びＬＣＣはカルシウムイオン依存性を有し、不純物を可能な限り低減することが望まれるリサイクルに用いるうえでは不利である。さらに、ＰＥＴ２も、耐熱性とＰＥＴ分解活性は他の酵素と比較して高いとはいえなかった。

本開示は、耐熱性及びＰＥＴ加水分解活性に優れる新規のタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、前記組換えベクターを含む形質転換体、前記タンパク質を含むポリエチレンテレフタレート分解用組成物、及び前記タンパク質を用いたリサイクル品の製造方法を提供することに関する。

上記課題を解決するための手段は、以下の態様を含む。
＜１＞ ポリエチレンテレフタレート加水分解活性を有する、以下のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列；
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｒ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列；
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｒ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異を有するアミノ酸配列；又は
（Ｃ１）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｒ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異を有するアミノ酸配列。
＜２＞ 前記ポリエチレンテレフタレート加水分解活性のｐＨ７．０における至適温度が６０．０℃超である、＜１＞に記載のタンパク質。
＜３＞ 融解温度が７０．０℃以上である、＜１＞又は＜２＞に記載のタンパク質。
＜４＞ 前記ポリエチレンテレフタレート加水分解活性が、カルシウムイオン非依存性である、＜１＞～＜３＞のいずれか１項に記載のタンパク質。
＜５＞ ｐＨ７．０において、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質よりも高いポリエチレンテレフタレート加水分解活性を有する、＜１＞～＜４＞のいずれか１項に記載のタンパク質。
＜６＞ 前記Ｒ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異の箇所の２つのシステイン残基がジスルフィド結合を形成する、＜１＞～＜５＞のいずれか１項に記載のタンパク質。
＜７＞ 以下のいずれかのアミノ酸配列を含む、＜１＞～＜６＞のいずれか１項に記載のタンパク質。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列；又は
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異を有するアミノ酸配列。
＜８＞ ＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
＜９＞ ＜８＞に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
＜１０＞ ＜９＞に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
＜１１＞ ＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、ポリエチレンテレフタレート分解用組成物。
＜１２＞ ＜１＞～＜７＞のいずれか１項に記載のタンパク質によりポリエチレンテレフタレートを分解することを含む、リサイクル品の製造方法。

本開示によれば、耐熱性及びＰＥＴ加水分解活性に優れる新規のタンパク質、前記タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、前記組換えベクターを含む形質転換体、前記タンパク質を含むポリエチレンテレフタレート分解用組成物、及び前記タンパク質を用いたリサイクル品の製造方法が提供される。

ＰＥＴ加水分解酵素によるＰＥＴ加水分解の概要、並びにＰＥＴ及びその加水分解産物の概要を示す図である。ＰＥＴは水不溶性の合成ポリマーであり結晶性領域及び非晶性領域を有する。ＰＥＴ加水分解酵素はＰＥＴ表面に結合し非晶性領域の可動域において分子鎖を捕捉して活性部位に取り込む。ＰＥＴ鎖はビス（ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＢＨＥＴ）、（ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＭＨＥＴ）、テレフタル酸（ＴＰＡ）、及びエチレングリコール（ＥＧ）に加水分解される。 ＰＥＴ２野生型の評価を示す。図２Ａは残存活性から調べた熱安定性を表す。ｐＨ７．０において４０～９０℃の各温度で１時間処理後、１ｍＭのＢＨＥＴを０．１μＭの酵素で６０℃、１０分間、ｐＨ７．０で加水分解した。生産されたＭＨＥＴ濃度（μＭ）を定量し、酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（６００秒）で除算して活性を算出した。 ＰＥＴ２野生型の評価を示す。図２Ｂは６０℃、１０分間のＢＨＥＴ加水分解活性のｐＨ依存性を示す。生産されたＭＨＥＴ濃度（μＭ）を定量し、酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（６００秒）で除算して活性を算出した。ＰＥＴ２の非存在下で産生されたＭＨＥＴ濃度はバックグランドとして差し引いた。 ＰＥＴ２野生型の評価を示す。図２Ｃは２０℃（実線）及び９５℃（破線）における、１０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）内でのＰＥＴ２野生型のＣＤスペクトルを示す。２３０ｎｍでのシグナルを融解温度（Ｔｍ）解析に用いた。 ＰＥＴ２野生型の評価を示す。図２Ｄは昇温中の２３０ｎｍでのシグナル変化を示す。 ＰＥＴ２の各変異体のＴｍと非晶性ＰＥＴ加水分解活性を示す。図３ＡはＰＥＴ２野生型のホモロジーモデリング構造を示す。変異の位置は棒状に表示されている。 ＰＥＴ２の各変異体のＴｍと非晶性ＰＥＴ加水分解活性を示す。図３Ｂは単一変異及びジスルフィド結合形成のためのシステイン対の概要を表す。ＩｓＰＥＴａｓｅの野生型又は変異体に基づく変異（◆）、プロリン変異（●）、アラニン変異（▲）、システイン対変異（▼）を野生型（ＷＴ）（■）と共にプロットしている。非晶性ＰＥＴディスク（０．３２ｃｍ^２、４．０ｍｇ）を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、６０℃で６０分、０．１μＭの酵素と共にインキュベートした。生産されたＴＰＡ、ＭＨＥＴ，ＢＨＥＴを合計した。活性値は、生成物の総濃度（μＭ）を酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（６０分）で除算して算出した。 ＰＥＴ２の各変異体のＴｍと非晶性ＰＥＴ加水分解活性を示す。図３Ｃは変異の統合の概要を表す。変異の順序は矢印で示されている。活性分析条件は図３Ｂで示したものと同じである。 ＰＥＴ２変異体のＸ線結晶構造を示す。 （Ａ）ＰＥＴ２（２Ｍ）のＸ線結晶構造。非対称ユニットのＢ鎖分子が示されている。触媒トライアド（Ｓ１７５、Ｄ２２１、及びＨ２５３）及び変異を受けるアミノ酸残基が示されている。 （Ｂ）ＰＥＴ２（７Ｍ）のＸ線結晶構造。触媒トライアド（Ｓ１７５、Ｄ２２１、及びＨ２５３）及び変異したアミノ酸残基が示されている。 （Ｃ）ｐＨ７．０でのＰＥＴ２野生型、ＰＥＴ２（７Ｍ）、及びＩｓＰＥＴａｓｅの表面電荷。ＰＥＴ２野生型構造は、ＰＥＴ２（２Ｍ）変異構造の逆変異によって再構築した。各構造において、触媒ポケットは破線の円で示されている。 ＰＥＴ薄膜上のＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の結合及び解離の単一分子蛍光イメージングを示す。図５ＡはＰＥＴ薄膜の明視野像を示す。スケール＝２μｍ。 ＰＥＴ薄膜上のＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の結合及び解離の単一分子蛍光イメージングを示す。図５Ｂは５０ｐＭでのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５標識ＰＥＴ２（７Ｍ）の結合及び解離の例を示す。シグナル強度の経時変化から推定される結合時間は０．６秒である。 ＰＥＴ薄膜上のＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の結合及び解離の単一分子蛍光イメージングを示す。図５Ｃは１０ｎＭのＰＥＴ２（７Ｍ）で染色されたＰＥＴ薄膜の蛍光画像を示す。図５Ａと同じ視野を観察した。スケール＝２μｍ。 ＰＥＴ薄膜上のＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の結合及び解離の単一分子蛍光イメージングを示す。図５Ｄは結合分子の累積数の経時変化を示す。ＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の各動画の個々の軌跡が示されている。１００分子の結合に要する時間から結合速度定数を算出した。 ＰＥＴ薄膜上のＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の結合及び解離の単一分子蛍光イメージングを示す。図５Ｅは二重指数関数的減衰関数によりフィッティングしたＰＥＴ２野生型の結合時間の分布を示す。フィッティング曲線の面積から遅い解離イベントと速い解離イベントの割合を算出した。 ＰＥＴ薄膜上のＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の結合及び解離の単一分子蛍光イメージングを示す。図５Ｆは、二重指数関数的減衰関数によりフィッティングしたＰＥＴ２（７Ｍ）の結合時間の分布を示す。野生型と同様の方法により遅い解離イベントと速い解離イベントの割合を算出した。 活性の温度依存性と経時変化を示す。図６Ａは非晶性ＰＥＴ加水分解活性の温度依存性を示す。ＰＥＴ２野生型（■）、ＰＥＴ２（４Ｍ）（●）、ＰＥＴ２（５Ｍ）（▲）、ＰＥＴ２（７Ｍ）（▼）の温度依存性が示されている。ＴＰＡ、ＭＨＥＴ及びＢＨＥＴの濃度を合計し、生成物の合計として示している。活性は、生成物（μＭ）の合計を酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（６０分）で除算して算出した。６８℃でのＰＥＴ２（７Ｍ）の最大活性は６０℃での野生型の最大活性の６．８倍であった。プロットは３回の測定の平均と標準偏差を示す。 活性の温度依存性と経時変化を示す。図６Ｂは非晶性ＰＥＴ加水分解活性の経時変化を示す。ＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）は、それぞれ６０℃、６８℃で反応させた。プロットは３回の測定の平均と標準偏差を示す。 活性の温度依存性と経時変化を示す。図６ＣはＰＥＴ２野生型（左）及びＰＥＴ２（７Ｍ）（右）により非晶性ＰＥＴフィルムから生成したＴＰＡ、ＭＨＥＴ、及びＢＨＥＴのプロットを塗りつぶしたものを表す。生成物の合計量は図６Ｂと合致する。

以下、本開示の実施形態を実施するための形態について詳細に説明する。但し、本開示の実施形態は以下の実施形態に限定されるものではない。以下の実施形態において、その構成要素（要素ステップ等も含む）は、特に明示した場合を除き、必須ではない。数値及びその範囲についても同様であり、本開示の実施形態を制限するものではない。

本開示において「工程」との語及びこれに準ずる語には、他の工程から独立した工程に加え、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の目的が達成されれば、当該工程も含まれる。
本開示において「～」を用いて示された数値範囲には、「～」の前後に記載される数値がそれぞれ最小値及び最大値として含まれる。
本開示中に段階的に記載されている数値範囲において、一つの数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示中に記載されている数値範囲において、その数値範囲の上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。

本開示において、アミノ酸配列の「同一性」とは、比較する２つのアミノ酸配列を、アミノ酸残基の一致数が最大となるように、必要に応じて一方又は双方に適宜ギャップを挿入してアラインメントしたときの、全アミノ酸残基数における一致アミノ酸残基数の割合をいう。アラインメントは、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ等の周知のアラインメントツールを用いて行うことができる。例えば、アラインメントは、ＢＬＡＳＴのデフォルトパラメータで評価することができる。

本開示において、基準とするアミノ酸配列と「Ｘ％以上の配列同一性を有する」とは、比較対象のアミノ酸配列の全長又は一部分が、基準とするアミノ酸配列の全長に対してＸ％以上の配列同一性を有することを意味する。

本開示において、アミノ酸残基は以下の括弧内の一文字表記又は三文字表記で示すことがある。
アラニン（Ａ、Ａｌａ）、アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）、アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）、システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）、リシン（Ｋ、Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）、セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）、バリン（Ｖ、Ｖａｌ）。

本開示において、ペプチド又はタンパク質のアミノ酸変異は、変異前のアミノ酸の一文字表記、Ｎ末端からのアミノ酸位置番号、変異後のアミノ酸の一文字表記、の順に並べて表記することがある。例えば、「配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃの変異を有する」とは、配列番号１のＮ末端から数えて２０番目のアルギニンがシステインに置換されていることを意味する。

本開示において、「Ｘのアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、当該タンパク質のアミノ酸配列の全部又は一部がＸのアミノ酸配列であることを意味する。すなわち、当該タンパク質は、Ｘのアミノ酸配列のみからなってもよく、Ｘのアミノ酸配列に加えて、Ｘのアミノ酸のＮ末端及びＣ末端の一方又は両方に付加配列（例えばタンパク質発現及び回収のための配列、例えばシグナル配列、タグ配列等）を有していてもよい。かかるシグナル配列、タグ配列等の付加配列は当業者に周知である。塩基配列についても同様であり、例えば「Ｙの塩基配列を含むポリヌクレオチド」とは、当該ポリヌクレオチドの塩基配列の全部又は一部がＹの塩基配列であることを意味する。

本開示において、タンパク質の「ＰＥＴ加水分解活性」は、測定対象のタンパク質とＰＥＴを所定の反応条件下に置いた後、ＨＰＬＣで分解産物濃度を分析し、分解産物濃度の合計をタンパク質濃度及び反応時間で除算して得られる値とする。本開示におけるＰＥＴ加水分解活性は、別段の指定がない場合、ｐＨ７．０における活性を表す。
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ Ｃ１８ （２）
溶離液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）からメタノールまでの勾配
流量 ：１ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：２５℃
検出 ：２１０ｎｍ
注入量：１０μＬ

ＰＥＴの加水分解による分解産物としては、図１に示すように、ビス（ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＢＨＥＴ）、（ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＭＨＥＴ）、テレフタル酸（ＴＰＡ）、及びエチレングリコール（ＥＧ）が挙げられる。本開示のタンパク質によるＰＥＴの分解産物は、これらすべてであってもよく、これらのうち一部であってもよく、これらが連結した部分分解産物であってもよい。

＜タンパク質＞
本開示のタンパク質は、ポリエチレンテレフタレート加水分解活性を有する、以下のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質である。
（Ａ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列；
（Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｒ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列；
（Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列；
（Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｒ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列；
（Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異を有するアミノ酸配列；又は
（Ｃ１）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｒ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異を有するアミノ酸配列。

以下、便宜上、上記（Ａ）のアミノ酸配列（配列番号２）を「アミノ酸配列Ａ」とも称し、上記（Ａ１）のアミノ酸配列（アミノ酸配列Ａを除く）を「アミノ酸配列Ａ１」とも称し、上記（Ｂ）のアミノ酸配列（配列番号３）を「アミノ酸配列Ｂ」とも称し、上記（Ｂ１）のアミノ酸配列（アミノ酸配列Ｂを除く）を「アミノ酸配列Ｂ１」とも称し、上記（Ｃ）のアミノ酸配列（配列番号４）を「アミノ酸配列Ｃ」とも称し、上記（Ｃ１）のアミノ酸配列（アミノ酸配列Ｃを除く）を「アミノ酸配列Ｃ１」とも称する。

配列番号１は、ＰＥＴ２野生型の有するアミノ酸配列を示す。以下、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をＰＥＴ２野生型とも称する。発明者らは、ＰＥＴ２野生型に対して少なくともＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有する上記タンパク質が、優れた耐熱性及びＰＥＴ加水分解活性を有することを見出した。
アミノ酸配列Ａは、ＰＥＴ２野生型に対してＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を少なくとも有する。Ｒ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異はＰＥＴ２の活性部位とは離れた位置に存在するが、驚くべきことに、これらの変異により耐熱性及び活性をいずれも向上できることが見出された。理論に拘束されないが、Ｒ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異は、システイン残基対によりジスルフィド結合を形成し、タンパク質自体の安定性を向上させると推測される。
アミノ酸配列Ｂは、ＰＥＴ２野生型に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を少なくとも有する。理論に拘束されないが、Ｓ１２９Ｐ及びＴ２７０Ｐにより、タンパク質の可動域（不安定部位）に環状のプロリン残基が導入されることによって、タンパク質構造が安定化されると推測される。
アミノ酸配列Ｃは、ＰＥＴ２野生型に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ及びＦ７８Ｒの変異を少なくとも有する。理論に拘束されないが、Ｇ１５３Ａの変異は、ＰＥＴ２のα－ヘリックス内のグリシンをアラニンに置換することにより、構造の安定化に寄与していると推測される。Ｆ７８Ｒの変異は、表面電荷を改変することにより、ＰＥＴ加水分解活性を増強すると推測される。また、Ｅ８３Ｋの変異により、耐熱性が向上するが、この機序は明らかではない。

以下に、配列番号１のアミノ酸配列（ＰＥＴ２野生型のアミノ酸配列）及びアミノ酸配列Ａ～Ｃを示す。囲み文字は変異部位を表す。

本開示のタンパク質は、アミノ酸配列Ａ～Ｃの配列を含むか、又はアミノ酸配列Ａ～Ｃのいずれか１つと９０％以上の配列同一性を有し、好ましくは、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ上述した特定の変異を有する。本開示のタンパク質は、アミノ酸配列Ａに対して９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。本開示のタンパク質は、上記アミノ酸配列を含み、かつＰＥＴ加水分解活性を有するタンパク質である。前記ＰＥＴ加水分解活性は、ｐＨ７．０においてＰＥＴ２野生型のＰＥＴ加水分解活性よりも高いことが好ましい。この場合のＰＥＴ加水分解活性の比較は、後述の方法により行う。

例えば、本開示のタンパク質は、ＰＥＴ加水分解活性を有する範囲で、上記アミノ酸配列同一性を維持し、かつアミノ酸配列Ａ～Ｃのいずれかに対して１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列を含むものであってもよく、かつ上述した特定の変異を有する。この場合、欠失、置換、又は付加されるアミノ酸の個数は、タンパク質がＰＥＴ加水分解活性を有する限り制限されず、例えば、１～２８個、１～２５個、１～２０個、１～１９個、１～１８個、１～１７個、１～１６個、１～１５個、１～１４個、１～１３個、１～１２個、１～１１個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、又は１～２個であってもよい。欠失、置換、又は付加されるアミノ酸の位置は、例えば配列番号１のＮ末端から１～１４７番目、１４９～１９３番目、１９５～２２５番目、及び２２７～２８１番目に相当する範囲から選択されてもよい。

一態様において、アミノ酸Ａ１は、配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｒ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有し、かつＳ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒからなる群より選択される少なくとも１つの変異をさらに有してもよい。
一態様において、アミノ酸Ｂ１は、配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｒ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有し、かつＧ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒからなる群より選択される少なくとも１つの変異を有してもよい。

一態様において、本開示のタンパク質は、ＰＥＴ加水分解を有し、アミノ酸配列Ｂ、Ｂ１、Ｃ、又はＣ１のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質であることが好ましく、アミノ酸配列Ｃ又はＣ１のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質であることがより好ましい。

一態様において、本開示のタンパク質は、ＰＥＴ加水分解活性を有し、アミノ酸配列Ａ～Ｃのいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質であることが好ましく、アミノ酸配列Ｂ又はＣのいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質であることがより好ましく、アミノ酸配列Ｃのアミノ酸配列を含むタンパク質であることがさらに好ましい。

本開示のタンパク質は、ＰＥＴ加水分解活性を損なわない範囲で、Ｎ末端又はＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有していてもよい。付加的なアミノ酸配列としては、本開示のタンパク質を組み換え技術により作製するための付加配列が挙げられる。かかる付加配列としては、タンパク質の合成開始点となるアミノ酸（Ｎ末端のメチオニン残基等）、Ｎ末端のシグナル配列（例えば、大腸菌におけるタンパク質分泌のためのシグナル配列）、タグ配列（例えば、ヒスチジンタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ等）、プロテアーゼ認識配列（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列）等が挙げられる。一態様において、付加的なアミノ酸配列は、Ｎ末端に付加される配列番号６のアミノ酸配列であってもよく、Ｃ末端に付加される配列番号７のアミノ酸配列と配列番号７のＣ末端にさらに付加される配列番号８のアミノ酸配列との組み合わせであってもよく、これらの組み合わせであってもよい。配列番号６～８は実施例の項に記載する。
付加的なアミノ酸配列のアミノ酸の個数は、タンパク質がＰＥＴ加水分解活性を有する限り制限されず、例えば、１末端当たり１～５０個、１～４５個、１～４０個、１～３５個、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、又は１～５個であってもよい。
例えば、本開示のタンパク質は、ＰＥＴ加水分解活性を損なわない範囲で、アミノ酸配列Ａ、Ａ１、Ｂ、Ｂ１、Ｃ、又はＣ１の配列のいずれかからなる配列のＮ末端又はＣ末端に、上記付加的なアミノ酸配列が付加されたものであってもよい。付加的なアミノ酸配列の詳細は上記のとおりである。

Ｒ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異の箇所の２つのシステイン残基は、ジスルフィド結合を形成していることが好ましい。ジスルフィド結合の形成の有無はＸ線結晶構造解析により確認できる。

本開示のタンパク質のＰＥＴ加水分解活性の至適ｐＨ（最も活性が高いｐＨ）は特に制限されず、中性付近であることが実用上好ましい。例えば、至適ｐＨはｐＨ５．０～９．５であることが好ましく、ｐＨ５．５～９．０であることがより好ましく、ｐＨ６．０～８．０であってもよい。

ＰＥＴは７０℃付近にガラス転移温度を有し、ＰＥＴの分解を高温で行うと分解効率が高まることが期待されることから、本開示のタンパク質のＰＥＴ加水分解活性の至適温度（最も活性が高い温度）は、ＰＥＴ２野生型のＰＥＴ加水分解活性の至適温度より高いことが好ましい。かかる観点から、本開示のタンパク質のＰＥＴ加水分解活性の至適温度は、ｐＨ７．０において、６０．０℃超であることが好ましく、６５.０℃以上であることがより好ましい。また、ＰＥＴの分解が促進される範囲で、低エネルギーで分解を行う観点からは、本開示のタンパク質のＰＥＴ加水分解活性の至適温度は９０．０℃以下であってもよく、８５．０℃以下であってもよく、８０．０℃以下であってもよい。
上記至適温度は以下のように測定する。２枚の非晶性ＰＥＴディスク（厚さ０．２５ｍｍ、表面積合計０．３２ｃｍ^２、質量合計４．０ｍｇ）に、５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の２５０μＬの０．１μＭタンパク質を添加し、各温度で６０分間インキュベートする。ＨＰＬＣで分解産物濃度を分析し、分解産物濃度の合計をタンパク質濃度及び反応時間で除算して、活性値を得る。

同様の観点から、本開示のタンパク質の融解温度（Ｔｍ）は、ＰＥＴ２野生型のＴｍよりも高いことが好ましい。本開示のタンパク質のＴｍは７０．０℃以上であることが好ましく、７２．０℃以上であることがより好ましく、７４．０℃以上であることがさらに好ましい。ＰＥＴの分解が促進される範囲で、低エネルギーで分解を行うことが望ましいため、本開示のタンパク質の融解温度（Ｔｍ）は、１００．０℃以下であってもよく、９５．０℃以下であってもよく、９０．０℃以下であってもよい。
本開示において、タンパク質の融解温度（Ｔｍ）は以下の手順で円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルにより測定される。１０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の１３μＭのタンパク質溶液を調製する。２０℃で２５０～２００ｎｍにおけるタンパク質のＣＤスペクトルを測定する。タンパク質を２０℃から１℃／分の速度で加熱しながら、２３０ｎｍにおけるタンパク質のシグナルを追跡する。９５℃で、２５０～２００ｎｍにおける変性タンパク質のＣＤスペクトルを測定する。２３０ｎｍにおけるシグナルの温度依存性のカーブフィッティングにより、タンパク質のＴｍを推定する。

本開示のタンパク質をリサイクル用途に用いる場合の便宜性の観点から、タンパク質のＰＥＴ加水分解活性はカルシウムイオン非依存性であることが好ましい。
本開示において、タンパク質のＰＥＴ加水分解活性が「カルシウムイオン非依存性」であることは以下の手順で確認する。０、１０、１００、及び３００ｍＭのＣａＣｌ_２を含むｂｉｓ－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の０．１μＭのタンパク質溶液の２５０μＬを２枚の非晶性ＰＥＴフィルム（厚さ０．２５ｍｍ、表面積合計０．３２ｃｍ^２、質量合計４．０ｍｇ）と共に６０℃で６０分間インキュベートする。インキュベーション後、上清を２００μＬ回収し、６０μＬの超純水又はＣａＣｌ_２溶液と混合し、ＣａＣl_２濃度を２３１ｍＭに調整する。混合物をさらに６８．６μＬの１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と混合し、リン酸カルシウムを沈殿させる。０．２２μｍスピンカラムフィルターを用いて１５，０００ｇで３分間処理して沈殿物を除去する。ＨＰＬＣで分解産物濃度を分析し、分解産物濃度の合計をタンパク質濃度及び反応時間で除算して、活性値を得る。ＰＥＴ加水分解活性が、ＣａＣｌ_２濃度が０ｍＭである場合と比べて、１０、１００、及び３００ｍＭである場合のいずれにおいても、ＰＥＴ加水分解活性が５０％以上変化しない場合に、ＰＥＴ加水分解活性がカルシウム非依存性であると判断する。

本開示のタンパク質のｐＨ７．０におけるＰＥＴ加水分解活性は、ＰＥＴ２野生型のｐＨ７．０における加水分解活性より高いことが好ましく、例えばＰＥＴ２野生型のｐＨ７．０における加水分解活性より２．０倍以上高いことが好ましく、３．０倍以上高いことがより好ましく、４．０倍以上高いことがさらに好ましく、５．０倍以上高いことが特に好ましい。
ＰＥＴ２野生型と変異体のＰＥＴ加水分解活性の比較は、それぞれのタンパク質の至適温度での活性の比較により行う。この場合の反応条件は以下の条件とする。２枚の非晶性ＰＥＴディスク（厚さ０．２５ｍｍ、表面積合計０．３２ｃｍ^２、質量合計４．０ｍｇ）に、５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の２５０μＬの０．１μＭタンパク質を添加し、至適温度で６０分間インキュベートする。ＨＰＬＣで分解産物濃度を分析し、分解産物濃度の合計をタンパク質濃度及び反応時間で除算して、活性値を得る。

本開示のタンパク質は、ポリヌクレオチドを利用して、公知の遺伝子工学的手法で製造することができる。例えば、対象となるタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製し、これを発現ベクターに組み込んで組換えベクターを取得し、これを宿主に導入して形質転換体を得る。得られた形質転換体を培養することにより、目的のタンパク質を産生させる。得られたタンパク質を常法により回収することにより、本開示のタンパク質を得ることができる。

本開示のタンパク質の用途は特に制限されず、例えば、ＰＥＴを分解してリサイクルするために用いることができる。また、本開示のタンパク質による分解産物をさらにＭＨＥＴａｓｅといった分解酵素と作用させることで、テレフタル酸やエチレングリコールの製造に用いることもできる。

＜ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体＞
本開示のポリヌクレオチドは、本開示のタンパク質をコードする塩基配列を含む。
本開示の組換えベクターは、前記ポリヌクレオチドを含む。
本開示の形質転換体は、前記組換えベクターを含む。

ポリヌクレオチドは、本開示のタンパク質をコードする任意のポリヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドの核酸配列は、コドンの縮重の範囲内で変化させることができる。組換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得て、タンパク質を発現させる場合、宿主において使用頻度の高いコドンを採用することが好ましい。一態様において、大腸菌を宿主とする発現系を用いる場合、Ｒ２０Ｃ及びＧ６２Ｃのシステイン残基にＴＧＣコドン、Ｓ１２９Ｐ及びＴ２７０Ｐのプロリン残基にＣＣＧコドン、Ｇ１５３Ａのアラニン残基にＧＣＧコドン、Ｅ８３Ｋのリシン残基にＡＡＡコドン、Ｆ７８Ｒのアルギニン残基にＣＧＣコドンを用いてもよい。

組換えベクターは、本開示のタンパク質を発現可能な任意の組換えベクターであってよい。好ましい組換えベクターとしては、プラスミド、ファージ等が挙げられる。発現ベクターは、発現に必要なプロモーターを有し、ターミネーター、選択マーカー（薬剤耐性遺伝子等）などの他の構成要素を有してもよい。
宿主は、本開示のタンパク質を発現可能であれば特に制限されず、用いる組換えベクターと併せて選択される。宿主として、微生物細胞を用いることが簡便であり、例えば、原核生物（例えば、大腸菌）、真核生物（例えば、酵母）等を用いてもよい。
発現ベクター及び宿主を用いてタンパク質の作製を行う際の、形質転換、発現、及び回収における条件は、当業者に周知の方法を採用できる。

＜ポリエチレンテレフタレート分解用組成物＞
本開示のＰＥＴ分解用組成物は、本開示のタンパク質を含む。本開示のタンパク質は、未精製の状態（例えば、タンパク質を発現する宿主を含む状態、又はタンパク質を発現する宿主から分泌された粗タンパク質液を含む状態）、又は精製された状態で組成物に含まれていてもよく、好ましくは精製された状態で組成物に含まれる。

ＰＥＴ分解用組成物は、本開示のタンパク質の他に、タンパク質の安定化に適する緩衝液等を含んでもよい。緩衝液としては、溶液を中性付近に維持する緩衝液が好ましく、例えば、リン酸緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ＨＥＰＥＳ等が挙げられる。

ＰＥＴ分解用組成物は、カルシウム塩等の塩を含んでもよいが、リサイクル用途を考慮すると、塩の含有率は可能な限り低いことが好ましい。ＰＥＴ分解用組成物において、塩濃度は、５０ｍＭ以下であることが好ましく、３０ｍＭ以下であることがより好ましく、２０ｍＭ以下であることがさらに好ましい。

ＰＥＴ分解用組成物は、本開示のタンパク質及び緩衝液の他、安定化剤等の添加剤を含んでもよい。

＜リサイクル品の製造方法＞
本開示のリサイクル品の製造方法は、本開示のタンパク質によりＰＥＴを分解することを含む。ＰＥＴの分解は、ＰＥＴと本開示のタンパク質を接触させることにより行うことができる。例えば、前述のＰＥＴ分解用組成物を用いてＰＥＴの分解を行ってもよい。
ＰＥＴとしては、例えば廃ＰＥＴを利用することができる。
分解反応は、前述の至適ｐＨ及び至適温度に近い条件で行うことが好ましい。例えば、分解反応は、好ましくはｐＨ５．０～９．５、より好ましくはｐＨ５．５～９．０の範囲で行われ、ｐＨ６．０～８．０の範囲で行ってもよい。分解反応は、上記ｐＨを維持するための適切な緩衝液内で行われることが好ましい。緩衝液としては、上述した緩衝液が挙げられる。また、分解反応は、好ましくは６０.０℃超、より好ましくは６５.０℃以上の温度で行われる。分解反応の温度の上限は、好ましくは１００．０℃未満、より好ましくは９５．０℃未満、さらに好ましくは９０．０℃未満の温度で行われる。
分解のための反応時間は、リサイクル品の製造に十分な分解が可能であれば、特に制限されない。本開示のタンパク質を用いれば効率的なＰＥＴ加水分解が可能であるため、反応時間の短縮が期待される。例えば、反応時間は、３日以内でもよく、２日以内でもよく、２４時間以内でもよく、１８時間以内でもよく、１２時間以内でもよく、６時間以内でもよく、３時間以内でもよく、２時間以内でもよく、１時間以内でもよい。十分に分解を行う観点からは、反応時間は１０分以上でもよく、３０分以上でもよい。反応産物は、十分に再重合可能な状態まで（例えば、基質となるＰＥＴの７０質量％以上、８０質量％以上、又は９０質量％以上が分解されるまで）分解されていることが好ましい。

一態様において、ＰＥＴの分解後、分解産物を回収する。回収方法は特に制限されず、公知の方法で行い得る。回収後、分離、抽出、吸着、濃縮、ろ過等の公知の方法により精製してもよい。
分解産物を、再重合によりポリマーを合成するために再利用することによって、リサイクル品を製造できる。分解産物は、ＰＥＴの製造のために再利用されてもよく、その他のポリマーの製造のために再利用されてもよい。

次に本開示の実施形態を実施例により具体的に説明するが、本開示の実施形態はこれらの実施例に限定されない。

以下の実施例では、ＰＥＴ２変異体を、大腸菌で発現及び分泌させるためのシグナル配列（２７アミノ酸）を用いているため、Ｎ末端からのアミノ酸位置番号は、シグナル配列を含むＮ末端からの位置番号で表されている。例えば、上述の本開示のタンパク質における、配列番号１に対するＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異は、以下の実施例では、それぞれ、ＰＥＴ２野生型に対するＲ４７Ｃ、Ｇ８９Ｃ、Ｓ１５６Ｐ、Ｔ２９７Ｐ、Ｇ１８０Ａ、Ｅ１１０Ｋ、及びＦ１０５Ｒの変異に対応する。実施例で用いられたＰＥＴ２（７Ｍ）のアミノ酸配列（配列番号５）（Ｎ末端のシグナル配列、並びにＣ末端のプロテアーゼ認識部位及びヒスチジンタグを含む）、並びにこれに含まれるシグナル配列（配列番号６；配列番号５の１～２７番目）、プロテアーゼ認識配列（配列番号７；配列番号５の３０９～３１５番目）及びヒスチジンタグ（配列番号８：配列番号５の３１６～３２１番目）を以下に示す。配列番号５における囲み文字は変異部位を表し、網掛け文字はＮ末端側からそれぞれシグナル配列、並びにプロテアーゼ認識部位及びヒスチジンタグを含むタグ配列を表す。実施例で用いられたＰＥＴ２（２Ｍ）は、配列番号５に表示される変異のうち、Ｆ１０５Ｒ及びＥ１１０Ｋのみを有するものである。実施例で用いられたＰＥＴ２（４Ｍ）は、配列番号５に表示される変異のうち、Ｆ１０５Ｒ、Ｅ１１０Ｋ、Ｓ１５６Ｐ及びＴ２９７Ｐのみを有するものである。実施例で用いられたＰＥＴ２（５Ｍ）は、配列番号５に表示される変異のうち、Ｆ１０５Ｒ、Ｅ１１０Ｋ、Ｓ１５６Ｐ、Ｔ２９７Ｐ、及びＧ１８０Ａのみを有するものである。

以下に、配列番号５に対応するＰＥＴ２（７Ｍ）の塩基配列（配列番号９）（終止コドンを含む）を示す。

１．緒論
合成ポリマーで構成されるプラスチックは比較的安価で加工性に優れ、現代社会で広く扱われている^（１）。しかしながら、持続可能性の観点から、これらによる環境汚染が深刻な問題となっている。特に、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）は大量に生産され、飲料ボトル、衣類、包装材等に広く用いられている^（２）。ＰＥＴは物理的及び化学的に安定な結晶構造を形成でき^（３）、エンジニアリングプラスチックに分類される。この安定性により、ＰＥＴは環境中に長期間残留すると考えられる^（４）。

ＰＥＴは生分解に対して高い耐性を有するが、その分子鎖はテレフタル酸（ＴＰＡ）とエチレングリコール（ＥＧ）のカルボン酸エステルにより構成される。したがって、エステラーゼはＰＥＴを加水分解により分解する能力を有するはずである。効率的なＰＥＴ加水分解酵素として最初に報告された酵素はＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａに由来するクチナーゼ（ＴｆＨ）である^（５）。クチナーゼ（ＥＣ３．１．１．７４）は一般的には植物のワックス層（クチン）の加水分解酵素として登録されているが、Ｍｕｌｌｅｒらは、ＴｆＨがＰＥＴ加水分解活性を有することも見出している。２０１６年には、ＰＥＴを炭素源とし、ＰＥＴ加水分解酵素（ＩｓＰＥＴａｓｅ）を産生する細菌であるＩｄｅｏｎｅｌｌａ ｓａｋａｉｅｎｓｉｓ ２０１－Ｆ６が発見された^（６）。以来、ＩｓＰＥＴａｓｅの構造決定、反応メカニズムなど、ＩｓＰＥＴａｓｅに関する多くの研究が活発に行われてきた^{（７－１０）}。ＩｓＰＥＴａｓｅはＰＥＴ加水分解酵素（ＥＣ３．１．１．１０１）に分類されるが、熱安定性が低く産業的利用が困難であるため、熱安定性を向上した様々な変異体が報告されている^{（９、１１）}。かかる観点からは、いくつかのクチナーゼのほうがＩｓＰＥＴａｓｅよりも熱安定性が高く、熱安定ＰＥＴ加水分解酵素の構築に適したテンプレートであるといえる。最も期待されるＰＥＴ加水分解酵素として、枝葉コンポスト由来クチナーゼ（ｌｅａｆ－ｂｒａｎｃｈ ｃｏｍｐｏｓｔ ｃｕｔｉｎａｓｅ、ＬＣＣ）が挙げられる^（１２）。また、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ ｆｕｓｃａ由来のクチナーゼ（ＴｆＣｕｔ２）は高い熱安定性及び活性を有し^（１３）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ ｖｉｒｉｄｉｓ由来のクチナーゼ（Ｃｕｔ１９０）も熱安定性及び活性を改良したものとして作製されている^{（１４、１５）}。さらに、リパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）もカルボン酸エステル加水分解酵素の一部であり、ＰＥＴ^（１６）、ポリ（テトラメチレンサクシネート）^（１７）、ポリ（ω－ヒドロキシアルカン酸）^（１８）などのポリエステルに対する加水分解活性を有するものがある。最近、ゼラチン分解リアクターのメタゲノムライブラリーからリパーゼとしてクローン化された酵素^（１９）が、ＰＥＴ加水分解酵素であるＰＥＴ２として再発見された^（２０）。ＰＥＴ２は、人工的な高温環境から得られた遺伝子ライブラリーから見出された熱安定性酵素であり、耐熱性ＰＥＴ加水分解酵素の候補の１つである。

ＰＥＴは水不溶性の合成ポリマーであり、その酵素分解は固液界面で発生する不均一反応である（図１参照）。さらに、ＰＥＴは分解されやすい非晶性領域と分解されにくい結晶性領域とを有するため、ＰＥＴ加水分解酵素は、ＰＥＴの非晶性領域の特に可動域を優先的に加水分解すると予想される^{（１２、１３、２１）}。天然ポリマーのなかでは、植物細胞壁の主要構成要素であるセルロースや甲殻類及び菌類の細胞壁の成分であるキチンも水不溶性の結晶性多糖類である^{（２２、２３）}。これらの水不溶性ポリマーの効率的な分解のためには、固相表面への酵素の結合が重要である。そのため、結晶性セルロースや結晶性キチンに高い分解活性を有するセルラーゼやキチナーゼは、結晶性ポリマー表面に高い親和性で結合するためのドメイン構造を有する^（２４）。この知見と一致して、ＩｓＰＥＴａｓｅは他のカルボキシエステラーゼと比較して酵素表面により多くの塩基性アミノ酸残基を有し、これらの正に帯電した残基がＰＥＴ分解活性に寄与することが報告されている^（２５）。

固体基質への結合親和性は、通常、生化学的吸着測定により得られる解離定数（又は結合定数）を使用して定量的に比較される。しかしながら、この定数は、結合速度定数に対する解離速度定数の比率であるため、生化学的測定のみに基づいて、いずれの速度定数が解離定数の変化の原因であるかを明確に特定することは困難である。したがって、セルラーゼ及びキチナーゼの分析では、単一分子蛍光イメージングを使用して、結合速度定数及び解離速度定数が直接測定されてきた^{（２６-２８）}。単一分子分析により、結合に重要なアミノ酸残基、及び、細菌由来のセルラーゼと糸状菌由来のセルラーゼとの間でセルロースへの結合に対する各ドメインの寄与についての相違を特定することが可能となった。

本研究では、最初に、水溶性モデル基質としてビス（２－ヒドロキシエチル）テレフタレート（ＢＨＥＴ）を使用して、ＰＥＴ２野生型（ＷＴ）の反応の熱安定性と至適ｐＨを調査した。次に、単一変異のスクリーニング及び単一変異の組み合わせに基づき、ＰＥＴ２野生型に７つまでの変異を導入した。その結果、熱安定性とＰＥＴ加水分解活性が大幅に向上したＰＥＴ２変異体を特定することに成功した。Ｘ線結晶構造解析により変異酵素の構造を決定し、熱安定性及び吸着特性に寄与する変異に起因する構造変化を検証した。分解活性が増強されるメカニズムを解明するために、単一分子蛍光イメージングを使用して、ＰＥＴ薄膜上で、最も良い結果を示した変異体と野生型との吸着特性を比較した。最後に、変異酵素の分解活性の温度依存性を評価し、２４時間までの分解実験により長期熱安定性を試験した。

２．材料及び方法
２．１ 変異位置の選択のためのＰＥＴ２野生型構造のホモロジーモデリング
ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬサーバー^（２９）を用いて、ＩｓＰＥＴａｓｅ（ＰＤＢ ＩＤ：６ＥＱＥ）の結晶構造をテンプレートとして、ＰＥＴ２野生型のホモロジーモデリング構造を構築した。次に、ＩｓＰＥＴａｓｅの結晶構造とＰＥＴ２野生型のモデリング構造をＰｙｍｏｌでアラインメントし、ＩｓＰＥＴａｓｅの特有の塩基性残基と有効な変異の位置に対応するＰＥＴ２の変異位置を選択した。

２．２ プラスミド構築と酵素精製
アルカリ耐熱性リパーゼｌｉｐＩＡＦ５－２として登録され（ＵｎｉＰｒｏｔ： Ｃ３ＲＹＬ０）^（１９）、最近ＰＥＴ加水分解活性を有することからＰＥＴ２に改名された酵素の遺伝子^（２０）を、Ｃ末端でＴＥＶプロテアーゼ認識配列（ＥＮＬＹＦＱＧ）及びヒスチジン－６タグの配列と融合した遺伝子を合成した。この遺伝子をｐＥＴ２７ｂプラスミドにＮｄｅＩ－ＮｏｔＩ部位でライゲーションした。ｐＥＴ２７ｂのｐｅｌＢリーダー配列に代えて、ｌｉｐＩＡＦ５－２のシグナル配列を使用した。ＯｖｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ４１（ＤＥ３）（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）をこのプラスミドで形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレートに播種した。コロニーを２０ｍＬのｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ培地（２．５ｗ／ｖ％トリプトン、１．５ｗ／ｖ％酵母エキス、０．５ｗ／ｖ％塩化ナトリウム）に回収し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む７００ｍＬのｓｕｐｅｒ ｂｒｏｔｈ培地に接種した。フラスコを１４０ｒｐｍ、３７℃で３時間振とうし、その後３０分間氷冷した。７００μＬの１Ｍ ＩＰＴＧをフラスコに添加し、１６℃、１４０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。３０００ｇ、２０分間の遠心分離により細胞を回収した。

回収した細胞を、１ｇ／ｍＬ濃度の１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。超音波処理により細胞を破壊し、懸濁液を２０，０００ｇで２０分間遠心分離した。上清を、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）にロードした。未結合画分を５０ｍＬの同じ緩衝液で洗浄し、５０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＬの同じ緩衝液で混入物質を洗浄した。精製酵素を、１００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液で溶出した。この酵素をＶｉｖａｓｐｉｎ２０（分子量カットオフ＝１０Ｋ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）により８０００ｇで５００μＬに濃縮し、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＮＡＰ１０カラム（Ｃｙｔｉｖａ社）にロードした。４００μＭの酵素１ｍＬあたり、１００μＬの５ｍｇ／ｍＬ ＴＥＶプロテアーゼを添加し、１６℃で１６時間インキュベートした。酵素／ＴＥＶプロテアーゼ混合溶液を、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１ｍＬのＮｉ－ＮＴＡアガロースにロードし、未結合酵素を同じ緩衝液で溶出した。溶出した酵素をＶｉｖａｓｐｉｎ２０（分子量カットオフ＝１０Ｋ）により８０００ｇで５００μＬに濃縮し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ社）にロードした。各画分の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認し、純粋な酵素を高濃度で含む３画分をガラスバイアルに収集した。２８０ｎｍと３４０ｎｍの吸光度の差から酵素濃度を計算した。野生型の分子吸光係数はε_２８０＝５２，４２０Ｍ^－１ｃｍ^－１であった。

ＰＥＴ２変異体の遺伝子をＰＣＲにより構築した。変異を含むプライマーペアを使用し、生成物を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）により製造元の指示に従ってライゲーションした。ライゲーションしたプラスミドをＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に形質転換し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした後、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートに播種した。単一コロニーを１０ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃、１４０ｒｐｍで１６時間インキュベートした。細胞からプラスミドを精製し、コード領域の配列を確認した。変異酵素を、野生型と同じ手順で精製した。Ｒ４７Ｃ－Ｇ８９Ｃ又はＬ２６５Ｃ－Ａ２９５Ｃを含む変異体の分子吸光係数はε_２８０＝５２，５４０Ｍ^－１ｃｍ^－１であり、Ｙ２６２Ｃ－Ｌ２９８Ｃを含む変異体の分子吸光係数はε_２８０＝５１，２８０Ｍ^－１ｃｍ^－１であり、Ｗ１７４Ｈ又はＱ１３４Ｙを含む変異体の分子吸光係数はそれぞれε_２８０＝４６，７３０Ｍ^－１ｃｍ^－１又はε_２８０＝５３，６００Ｍ^－１ｃｍ^－１であった。

結晶化用の酵素は、若干異なる手順で精製した。ヒスチジン－６タグでアフィニティー精製を行った後、酵素溶液を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）でＮＡＰ１０から溶出し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した５ｍＬのＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ－６５０にロードした。未結合酵素を同じ緩衝液で溶出し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（分子量カットオフ＝１０Ｋ）により８０００ｇで濃縮した。５００μＬの酵素溶液を、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｉｎｃｒｅａｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ社）にロードした。溶出した酵素をＶｉｖａｓｐｉｎ２０（分子量カットオフ＝１０Ｋ）により８０００ｇで濃縮した。

単一分子蛍光イメージングでは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５マレイミドによる標識のために、ＰＥＴ２野生型及びＰＥＴ２（７Ｍ）（Ｒ４７Ｃ－Ｇ８９Ｃ－Ｆ１０５Ｒ－Ｅ１１０Ｋ－Ｓ１５６Ｐ－Ｇ１８０Ａ－Ｔ２９７Ｐ）のＣ末端にシステイン残基（Ｃｙｓ３０９）を追加した。この酵素を、活性測定と同じ手順で精製した。精製した酵素を１ｍＭ ＤＴＴを用いて２５℃で１時間還元し、反応混合物を１０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）で平衡化したＮＡＰ５カラムにロードした。ＤＭＳＯに溶解させたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５マレイミドを、２５℃で１時間酵素と混合した。酵素とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５の混合比は１：３（モル比）とした。ＶＩＶＡｓｐｉｎ２０により８０００ｇで濃縮し、続いて１０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）で平衡化されたＮＡＰ１０カラムにより未反応色素を除去した。６５０ｎｍ～２５０ｎｍの範囲で吸収スペクトルを測定した後、標識酵素は４℃で保存した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５の分子吸光係数はε_５５６＝１５８，０００Ｍ^－１ｃｍ^－１であった。吸収スペクトルから、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５の２８０ｎｍでの吸光度は５５６ｎｍでの吸光度の５．５％と算出された。補正後のＰＥＴ２野生型－Ｃ３０９とＰＥＴ２（７Ｍ）－Ｃ３０９の標識率はそれぞれ１０９％と１２２％であった。対照実験として、Ｃ３０９を有しないＰＥＴ２野生型及びＰＥＴ２（７Ｍ）に対する標識反応を併せて行ったところ、ＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の標識率はそれぞれ３．４％と７．１％であり、主にＣ３０９がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５マレイミドと反応したことが確認された。

２．３ モデル基質を使用した熱安定性と至適ｐＨの測定
１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）に溶解した１μＭのＰＥＴ２野生型を、様々な温度（４０～９０℃）で１時間インキュベートした後、氷冷した。続いてこの酵素を２００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）で２００ｎＭに希釈した。２５μＬの酵素溶液を、同体積の超純水中の２ｍＭ ＢＨＥＴと混合し、６０℃で１０分間インキュベートした。１０μＬの反応混合物をＬＵＮＡ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）にインジェクションし、テレフタル酸（ＴＰＡ）、モノ－２－ヒドロキシエチルテレフタレート（ＭＨＥＴ）、及びＢＨＥＴを、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）からメタノールまでの勾配で分離した。各化合物を２１０ｎｍの吸光度で検出した。ＴＰＡとＢＨＥＴは東京化成工業株式会社から購入し、ＭＨＥＴはＡｃｔｉｖａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。活性値は、生成物の総濃度（μＭ）を酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（６００秒）で除算して算出した。

ＰＥＴ２野生型のＢＨＥＴ加水分解活性を、ｐＨの異なる各種緩衝液でも測定した（ｐＨ３．０の場合はクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０及びｐＨ５．０の場合は酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０及びｐＨ７．０の場合はリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０の場合はＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．０の場合はグリシン－ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．０の場合はホウ酸－ＮａＯＨ緩衝液）。２００ｍＭ緩衝液中の２００ｎＭ酵素２５μＬを、同体積の超純水中の２ｍＭ ＢＨＥＴと混合し、６０℃で１０分間インキュベートした。酵素の非存在下におけるＢＨＥＴの自然分解をバックグラウンドとして差し引いた。生成物の分離及び検出の手順は上記と同様とした。活性値は、生成物の総濃度（μＭ）を酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（６００秒）で除算して算出した。

２．４ ＰＥＴフィルム分解活性
非晶性ＰＥＴフィルム（厚さ＝０．２５ｍｍ、コードＥＳ３０１４４５）及び二軸配向（結晶性）ＰＥＴフィルム（厚さ＝０．２５ｍｍ、コードＥＳ３０１４５０）はＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ社から購入した。このＰＥＴフィルムを打ち抜いて、円形ディスク（直径３ｍｍ、表面積０．１６ｃｍ^２／ディスク、２．０ｍｇ／非晶性ディスク、２．３ｍｇ／結晶性ディスク）を作製した。次に、ＰＥＴディスクを２０体積％エタノールに浸漬して洗浄し、２５℃、２０ｒｐｍで１時間インキュベートした。洗浄したディスクを室温で乾燥させ、ガラスバイアルに保管した。

２枚のＰＥＴディスク（０．３２ｃｍ^２、非晶性ディスク４．０ｍｇ）をガラスバイアルに挿入し、５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中に溶解させた２５０μＬの０．１μＭ酵素を添加して分解を開始させた。反応混合物を６０℃で６０分間インキュベートした。上清を収集し、ＢＨＥＴ加水分解の分析と同じ手順によりＨＰＬＣで生成物濃度を分析した。活性値は生成物の濃度（μＭ）の合計を酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（６０分）で除算して算出した。

上記と同じ手順で、６０℃～８０℃の範囲で反応至適温度を評価した。活性値は生成物の濃度（μＭ）の合計を酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（６０分）で除算して算出した。また、同様の手順で中程度の温度（３０℃）での活性測定を９６０分間（１６時間）行った。活性値は生成物の濃度（μＭ）の合計を酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（９６０分）で除算して算出した。長期分解アッセイのため、２枚のＰＥＴディスク（０．３２ｃｍ^２、非晶性ディスク４．０ｍｇ又は結晶性ディスク４．６ｍｇ）を、５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の０．１μＭ ＰＥＴ２野生型２５０μＬと合わせて６０℃の条件で、及び５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の０．１μＭ ＰＥＴ２（７Ｍ）と合わせて６８℃の条件で、１、２、４、８、１６、及び２４時間インキュベートした。

２．５ ＣＤスペクトルによる熱安定性測定
石英セルに１０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の１３μＭ酵素４００μＬを入れ、ペルチェ恒温セルホルダー（日本分光株式会社（ＪＡＳＣＯ））を備えたＪ－１５００ＫＳを使用して、２０℃で２５０～２００ｎｍにおける酵素のＣＤスペクトルを測定した。酵素を２０℃から９５℃に１℃／分の速度で加熱しながら、２３０ｎｍにおけるシグナルを追跡した。２５０～２００ｎｍにおける変性酵素のＣＤスペクトルを９５℃で測定した。変性タンパク質解析ソフトウェア（日本分光株式会社（ＪＡＳＣＯ））を使用して、２３０ｎｍにおけるシグナルの温度依存性のカーブフィッティングにより、酵素の融解温度（Ｔｍ）を推定した。

２．６ Ｘ線結晶構造解析
１μＬの精製ＰＥＴ２（２Ｍ）（Ｆ１０５Ｒ－Ｅ１１０Ｋ変異体）（４０ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１Ｍ硫酸アンモニウム１μＬと混合し、２０℃でインキュベートした。１μＬの精製ＰＥＴ２（７Ｍ）（８０ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の１０ｗ／ｖ％ＰＥＧ３３５０の１μＬと混合し、２０℃でインキュベートした。回折測定の直前に、３０体積％エチレングリコールを含むリザーバーに両結晶を浸漬した。ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬサーバー^（２９）で構築されたＰＥＴ２野生型のホモロジーモデリング構造を用いて、ｐｈａｓｅｒによる分子置換によって位相を決定した。Ｐｈｅｎｉｘ ｒｅｆｉｎｅプログラム^（３０）を使用してモデル構造を精密化し、Ｃｏｏｔ^（３１）で改善した。ＰＤＢ２ＰＱＲ^（３２）を使用してｐＨ７．０での酵素のプロトン化状態を算出し、ＡＰＢＳ^（３３）を用いて表面電荷を算出し、Ｐｙｍｏｌで描画した。

２．７ 結合及び解離の単一分子蛍光イメージング
作製した全反射蛍光顕微鏡を使用して２５℃での観察を行った。細かく切断した非晶性ＰＥＴフィルム５０ｍｇを１ｍＬのヘキサフルオロ－２－プロパノールに溶解し、２０ｍＬのアセトンで沈殿させて、ＰＥＴフィルム上の自家蛍光性の混入物質を除去した。２０，０００ｇ、５分間の遠心分離後、上清を除去し、沈殿物を５ｍＬのアセトンに懸濁した。２０，０００ｇ、５分間の遠心分離後、上清を除去し、７０℃で１時間、沈殿物を完全に乾燥させ、１ｍＬのヘキサフルオロ－２－プロパノールに溶解した。ＰＥＴ溶液をヘキサフルオロ－２－プロパノールで５ｍｇ／ｍＬとなるように希釈し、希釈したＰＥＴ溶液５０μＬを、１０Ｍ ＫＯＨで一晩インキュベートして洗浄したカバーガラス上に、３０００ｒｐｍで１０秒間スピンコートし、その後、超純水で十分に洗浄した。ＰＥＴでスピンコートされたカバーガラスを室温で一晩乾燥させた。カバーガラス上に形成されたＰＥＴ薄膜を明視野像として観察した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５で標識した酵素を５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）で５０ｐＭに希釈し、カバーガラス上のＰＥＴ薄膜に滴下した後、トップコート壁でカバーして酵素溶液を保持した。電力密度０．２５μＷ／μｍ^２のレーザーにより５３２ｎｍで試料面の色素を励起させ、蛍光画像を５フレーム／秒で１０００秒間記録した。単一分子観察後、ＰＥＴ薄膜を１０ｎＭの色素標識酵素溶液で染色し、ＰＥＴで覆われた面積を算出した。結合速度定数解析では、各動画において時間の関数として結合分子の累積個数をカウントし、酵素分子１００個の結合に要した時間を測定した。その後１００（分子）を所要時間で除算し、得られた値をさらに視野内のＰＥＴ薄膜の面積及び溶液中の酵素濃度で除算することにより結合速度定数を推定した。したがって結合速度定数の単位はｓ^－１μｍ^－２Ｍ^－１である。視野内のＰＥＴ薄膜の平均面積は、ＰＥＴ２野生型及びＰＥＴ２（７Ｍ）においてそれぞれ１６３±３１μｍ^２及び１６９±１９μｍ^２であった。解離速度定数は、個々の分子の結合時間の分布を二重指数関数的減衰関数の合計でフィッティングすることにより得た。フィッティング曲線の面積から、遅い解離イベントと速い解離イベントの比率を推定した。

Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５の光退色時間を確認するため、５０μＬの１００ｐＭ ＰＥＴ２－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５をカバーガラスに３０００ｒｐｍで１０秒間直接スピンコーティングした。結合及び解離の単一分子イメージングと同条件で、２０μＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）を滴下した後、カバーガラスに強固に結合した酵素分子を観察した。各スポットの光退色時間の分布を単一指数関数的減衰関数によりフィッティングし、時定数を３８．１秒と推定した。

２．８ 単一分子イメージングに使用したＰＥＴ薄膜の分解アッセイ
単一分子イメージングの場合と同じ方法でＰＥＴ薄膜を作製した。５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中の０．１μＭ ＰＥＴ２野生型又はＰＥＴ２（７Ｍ）の５０μＬをフィルムに滴下し、室温（約２６℃）で６０分間インキュベートした。液滴の蒸発を防ぐため、ＰＥＴ薄膜でコーティングしたカバーガラスをペトリ皿で覆った。インキュベーション後、液滴を回収し、生成物濃度をＨＰＬＣにより分析した。活性値は、生成物濃度（μＭ）の合計を酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（６０分）で除算して算出した。

２．９ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５標識酵素の活性測定
５０ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５で標識した、又は標識しない、０．１μＭ ＰＥＴ２野生型又はＰＥＴ２（７Ｍ）の２５０μＬを、２枚の非晶性ＰＥＴフィルムのディスク（０．３２ｃｍ^２、４．０ｍｇ）と共に６０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、上清を回収し、ＨＰＬＣにより生成物濃度を分析した。活性値は、生成物濃度（μＭ）の合計を酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（６０分）で除算して算出した。

２．１０ ＰＥＴ２野生型によるＰＥＴ分解活性のＣａ^２＋依存性
０、１０、１００、及び３００ｍＭのＣａＣｌ_２を含むｂｉｓ－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の０．１μＭ ＰＥＴ２野生型の２５０μＬを２枚の非晶性ＰＥＴフィルムのディスク（０．３２ｃｍ^２、４．０ｍｇ）と合わせて６０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、上清を２００μＬ回収し、６０μＬの超純水又はＣａＣｌ_２溶液と混合し、ＣａＣｌ_２濃度を２３１ｍＭに調整した。混合物をさらに６８．６μＬの１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と混合し、リン酸カルシウムを沈殿させた。０．２２μｍスピンカラムフィルターを用いて１５，０００ｇで３分間処理して沈殿物を除去し、１０μＬのフロースルーをＨＰＬＣにインジェクションした。活性値は、生成物濃度（μＭ）の合計を酵素濃度（０．１μＭ）及び反応時間（６０分）で除算して算出した。

２．１１ 示差走査熱量測定（ＤＳＣ）及びＸ線回折（ＸＲＤ）によるＰＥＴフィルムの結晶化度評価
非晶性ＰＥＴフィルム及び二軸配向結晶性ＰＥＴフィルムを直径５ｍｍに打ち抜き、分解活性測定と同じ手順で洗浄した。１枚のディスクをアルミ皿に入れ、示差走査熱量計（ＤＳＣ）（モデルＤＳＣ－６０、株式会社島津製作所）で熱流を測定した。ディスクは３０℃から２９０℃まで１０℃／分で加熱した。ヘキサフルオロ－２－プロパノール溶液からの再生ＰＥＴの測定のため、単一分子イメージングで使用した５０ｍｇ／μＬ ＰＥＴ溶液の５０μＬをアルミ皿に滴下し、室温で２時間乾燥させる操作を２回行った。両ＰＥＴフィルムに対して同じ手順で熱流を測定した。ピーク面積から熱結晶化と熱融解を推定し、当該結晶化熱及び融解熱の差から吸熱量（ΔＨ）を算出した。完全結晶ＰＥＴの融解熱（ΔＨ_０）は１４０．１Ｊ／ｇであり、ΔＨとΔＨ_０から両ＰＥＴフィルムの結晶化度を算出した^（３４）。本研究で用いた非晶性ＰＥＴ、結晶性ＰＥＴ、及び再生ＰＥＴの結晶化度の推定値はそれぞれ０．０２％、５９．３％、及び５．８９％であった。

ＰＥＴフィルムのＸ線回折（ＸＲＤ）は、ＲＩＮＴ－ＵｌｔｉｍａＩＩＩ（株式会社リガク）を用いて行った。ＰＥＴフィルムをステージに固定し、２５℃で、銅ターゲットからのＸ線回折（４０ｍＡ、４０ｋＶ）を回折角３°～９０°で測定した。非晶性ＰＥＴはピークを示さず、結晶性ＰＥＴは［１００］結晶面に相当する強いピークを示した。

３．結果
３．１ ＰＥＴ２野生型の熱安定性と至適ｐＨ
ＰＥＴ２野生型を、中程度に水溶性のＰＥＴ構成ブロックであるＢＨＥＴと共にインキュベートし、産生されたＭＨＥＴをＨＰＬＣで定量した（本試験条件ではＴＰＡは検出されなかった）。ｐＨ７．０で、４０～９０℃の間の各温度での１時間処理後の残留活性を調べることによりＰＥＴ２野生型の熱安定性を評価した。６５℃までは、１．３ｓ^－１の分解活性が維持されていた。一方７０℃を超える温度では、活性はほぼ検出されなかった（図２Ａ）。分解活性は６０℃、ｐＨ３．０～ｐＨ１０．０の条件でも測定し、ｐＨ６．０、６０℃にて最も高い活性が見られた（図２Ｂ）。このため、６０℃、ｐＨ７．０を標準反応条件とした。

次に、ｐＨ７．０でＰＥＴ２野生型のＣＤスペクトルを２０℃及び９５℃で比較した（図２Ｃ）。２０℃でのＰＥＴ２野生型のＣＤスペクトルは、α－ヘリックスとβ－シートの混合を示し、さらに約２３０ｎｍで下向きのピークが観察された。９５℃でのＣＤスペクトルは、短波長範囲ではランダムコイルのように見えたが、二次構造由来のシグナルも残っていた。α－ヘリックスとβ－シートにそれぞれ対応する２２２ｎｍ、２１５ｎｍでのシグナル差が２０℃と９５℃の間であまり大きくなかったため、ＰＥＴ２野生型のＴｍはトリプトファン残基に基づく２３０ｎｍのシグナル変化に基づいて算出した^（３５）。その結果、ＰＥＴ２野生型のＴｍは６９．０℃と推定され（図２Ｄ）、この値は熱処理後の分解活性と整合するものであった（図２Ａ）。

クチナーゼＬＣＣ、ＴｆＣｕｔ２、及びＣｕｔ１９０の熱安定性及びＰＥＴ分解活性はＣａ^２＋存在下で増強されることが報告されているため^{（３６－３８）}、ＰＥＴ２野生型のＰＥＴ分解活性のＣａ^２＋依存性を試験した。ＰＥＴ２野生型では、生産物の産生濃度は、１０ｍＭ及び１００ｍＭのＣａ^２＋存在下において、Ｃａ^２＋非存在下に比べて１．１倍となるにすぎなかった。３００ｍＭのＣａＣｌ_２でも、ＰＥＴ分解活性はＣａ^２＋非存在下と同程度であった。これらの結果から、以下の実験では、ＣａＣｌ_２の非存在下でＰＥＴ２変異体のＰＥＴ分解活性を測定している。

３．２ 単一変異のスクリーニング
ＰＥＴ２の熱安定性と活性を改善するために、ホモロジーモデル構造に基づいて単一の変異を導入し（図３Ａ）、変異による影響を調べた。野生型酵素及び変異酵素のＴｍ及び非晶性ＰＥＴの分解活性を測定し、各値をプロットした（図３Ｂ）。まずＩｓＰＥＴａｓｅに特徴的な塩基性アミノ酸残基^（１１）、及びＩｓＰＥＴａｓｅで活性を増強させることが報告されている単一変異^（３９）を導入した（図３Ｂ、◆）。その結果、Ｆ１０５Ｒ及びＥ１１０Ｋの変異は、野生型に比べてＴｍをそれぞれ１℃超上昇させ、ＰＥＴ分解活性をそれぞれ１．５倍、１．４倍増強させた。Ｆ１０５Ｒ及びＥ１１０Ｋと同一面上に位置するがＩｓＰＥＴａｓｅには存在しないＬ２９８Ｒ変異は、Ｔｍ及び活性を減少させた。改変ＩｓＰＥＴａｓｅの変異に基づく変異のうち^（３９）、Ｑ１８３Ｒ及びＱ１３４Ｙは活性を増強させた。しかしながら、Ｑ１８３Ｒ変異はＴｍを低下させ、またＱ１３４Ｙ変異は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）中の溶出時間が大幅に延長し、精製後の収率が大きく低下した。また、Ｓ２０２Ｑ及びＳ１５５Ｄの変異は、Ｔｍを上昇させたものの、活性を低下させた。

ホモロジーモデリング構造に基づき、プロリンの二面角に適合するアミノ酸残基を検索し、プロリン変異を導入した（図３Ｂ、●）。Ｓ１５６Ｐ及びＴ２９７Ｐ変異のＴｍ値は野生型よりも１～２℃高かったのに対し、Ｄ５３Ｐ及びＡ１９２Ｐ変異のＴｍ値は野生型よりも低かった。これらの変異体の活性は、野生型の半分未満の活性しかみられなかったＡ１９２Ｐを除き、野生型と大きく変わらなかった。

多くのＰＥＴ分解酵素では、４つの連続するグリシン残基が触媒トライアドのセリン残基（ＰＥＴ２ではＳｅｒ１７５）近傍にα－ヘリックスを形成し、ＰＥＴ２もこれに相当するグリシン残基（Ｇｌｙ１７７～Ｇｌｙ１８０）を有する。このＧｌｙ１７７～Ｇｌｙ１８０を１つずつアラニンに変異させた（図３Ｂ、▲）。Ｇ１８０Ａ変異は最も効果のあった変異の１つであり、Ｔｍ（＋２．６℃）及び活性（１．５倍）を大幅に改善させた。一方、他の３つの変異はＴｍ又は活性を野生型よりも低下させた。

さらに、ＰＥＴ２のＮ末端又はＣ末端付近における４対のシステイン変異を試験した（図３Ｂ、▼）。Ｒ４７Ｃ－Ｇ８９Ｃの変異対のＴｍは７２．０℃であり、野生型のＴｍよりと３℃高かった。Ｃ末端のシステイン変異対（Ｙ２６２Ｃ－Ｌ２９８Ｃ及びＬ２６５Ｃ－Ａ２９５Ｃ）も野生型のＴｍよりも１～２℃高いＴｍを示したが、これらの変異対の活性は野生型の約半分に低下した。Ｔ６４Ｃ－Ｔ８６Ｃの変異も試みたが、精製収率が非常に低く、特性評価に十分な量の試料が得られなかった。

３．３ 変異の組み合わせ
野生型よりも高いＴｍ又は活性を示した単一変異を統合した（図３Ｃ）。ＰＥＴ２ Ｆ１０５Ｒ－Ｅ１１０Ｋ変異体（ＰＥＴ２（２Ｍ））は７０．７℃のＴｍを示し、非晶性ＰＥＴを０．７１ｍｉｎ^－１で加水分解した。これらの値はそれぞれの単一変異のものよりも高い。ＰＥＴ２ Ｆ１０５Ｒ－Ｅ１１０Ｋ－Ｓ１５６Ｐ－Ｔ２９７Ｐ変異体（ＰＥＴ２（４Ｍ））は上記２変異導入体よりも１．６℃高いＴｍを示したが、活性は０．１３ｍｉｎ^－１の改善にとどまった（０．７１ｍｉｎ^－１から０．８４ｍｉｎ^－１へ変化）。さらにＧ１８０Ａを導入すると（ＰＥＴ２（５Ｍ））、活性が顕著に向上したが（ＰＥＴ２（４Ｍ）の１．４倍）、Ｔｍはわずかに上昇したのみであった。さらに、追加のジスルフィド結合はＴｍを３．１℃上昇させ、活性もやや増加させた。得られたＲ４７Ｃ－Ｇ８９Ｃ－Ｆ１０５Ｒ－Ｅ１１０Ｋ－Ｓ１５６Ｐ－Ｇ１８０Ａ－Ｔ２９７Ｐ変異体（ＰＥＴ２（７Ｍ））は、６０℃で野生型よりも６．７℃高いＴｍ及び３倍高い活性を示した。なかでも、Ｒ４７Ｃ－Ｇ８９Ｃの変異に基づくジスルフィド結合はＴｍを大幅に上昇させ、また、このジスルフィド結合は活性部位から離れた位置に存在するにもかかわらず、活性も向上させたことから、最も有効な変異のひとつと考えられた。

３．４ ＰＥＴ２変異体のＸ線結晶構造
ＰＥＴ２（２Ｍ）及びＰＥＴ２（７Ｍ）のＸ線結晶構造をそれぞれ１．３Å及び１．８Åの分解能で解析した。ＰＥＴ２野生型の結晶は得られなかった。このため、ＰｙｍｏｌでＰＥＴ２（２Ｍ）の逆変異によりＰＥＴ２野生型構造を再構築した。ＰＥＴ２（７Ｍ）とＰＥＴ２（２Ｍ）の間の全体構造の二乗平均平方根偏差（ＲＭＳＤ）は０．２４１Åであり、これらの構造は非常に類似していた。ＰＥＴ２変異体の電子密度マップは変異した残基の側鎖を認識するのに十分であった（図４Ａ及び図４Ｂ）。２つのプロリン変異（Ｓ１５６Ｐ及びＴ２９７Ｐ）の導入によりループ構造は変化しなかったため、これらの位置は予想通りプロリンの二面角に適していると考えられた。Ｇｌｙ１８０のアラニンへの変異は、このＡｌａ１８０を含むα－ヘリックス構造自体は変化させなかったが、隣接するα－ヘリックスがより安定化しているように見受けられた（図４Ａ及び図４Ｂ、右）。ＰＥＴ２野生型は配列中に６つのシステイン残基を有し、ＰＥＴ２（２Ｍ）構造では２つの天然ジスルフィド結合（Ｃｙｓ２１８－Ｃｙｓ２５５及びＣｙｓ２８９－Ｃｙｓ３０６）が観察された。もう１つのシステイン残基対（Ｃｙｓ４３及びＣｙｓ３９）は、Ｎ末端の無秩序領域（Ａｌａ２８からＡｓｎ４４）に存在し、観察できなかった。ＰＥＴ２（７Ｍ）構造では、Ｎ末端に導入されたシステイン残基対（Ｒ４７Ｃ－Ｇ８９Ｃ）が明らかにジスルフィド結合を形成していた（図４Ｂ）。これらの変異は、２ループ構造にわずかなシフトを引き起こし（図４Ａ及び図４Ｂ、左）、Ｔｙｒ４５の電子密度は観察できなかった。Ｎ末端残基（Ａｌａ２８からＡｓｎ４４）は、ＰＥＴ２（２Ｍ）及びＰＥＴ２（７Ｍ）のいずれにおいても、電子密度マップが不明確でモデル化できず、ＰＥＴ２ではＮ末端残基が無秩序であると考えられた。

次に、ＰＥＴ２野生型構造をＰＥＴ２（２Ｍ）構造の逆変異により再構築し、ｐＨ７．０での表面電荷をＰＥＴ２（７Ｍ）及びＩｓＰＥＴａｓｅの表面電荷と比較した（図４Ｃ）。ＰＥＴ２野生型では、Ｐｈｅ１０５とＧｌｕ１１０の周辺に中性から負の電荷が観察された（図４Ｃ、左）。一方、ＰＥＴ２（７Ｍ）（図４Ｃ、中央）では、ＰＥＴ２野生型よりも正電荷領域が大きくなり、ＩｓＰＥＴａｓｅの正電荷領域と同程度となっていた（図４Ｃ、右）。

ＰＥＴ２は当初リパーゼとして発見されたため^（１９）、ＰＥＴ２（２Ｍ）の触媒トライアド周辺の構造をリパーゼとも比較した。Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅのリパーゼは触媒トライアドを覆うｌｉｄ（蓋）ドメインを有するが^（４７）、ＰＥＴ２（２Ｍ）の触媒トライアドはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのＬｉｐＡのように溶媒に曝されていた。ＰＥＴ２（２Ｍ）のＩｓＰＥＴａｓｅ（ＰＤＢ ＩＤ：６ＡＮＥ）に対する全体的なＲＭＳＤは０．５５２Åであり、ＬｉｐＡ（ＰＤＢ ＩＤ：１Ｉ６Ｗ）に対する全体的なＲＭＳＤは１５．４Åであった。したがって、構造的観点からは、ＰＥＴ２はリパーゼではなく、ＰＥＴ加水分解酵素である。

ＰＥＴ２のＰＥＴ分解活性のカルシウム非依存性を説明するため、Ｃｕｔ１９０^（１５）のカルシウム結合部位に対応する位置を、ＬＣＣ、ＩｓＰＥＴａｓｅ、及びＰＥＴ２（２Ｍ）間で比較した。結合部位１は基本的に主鎖のカルボニル基により構築され、Ｃａ^２＋はＬＣＣとＰＥＴ２に結合できる。結合部位２では、Ｃｕｔ１９０のアスパラギン酸（Ａｓｐ２５０）と２つのグルタミン酸（Ｇｌｕ２２０及びＧｌｕ２９６）が、ＰＥＴ２ではスレオニン、グルタミン、セリンにそれぞれ変化している。そのため、Ｃａ^２＋への親和性はＣｕｔ１９０よりもＰＥＴ２の方が低くなる。また、Ｃｕｔ１９０の結合部位３は、ＰＥＴ２では完全にループに占められている。このため、構造的観点から、ＰＥＴ２のＰＥＴ分解活性のカルシウム非依存性は合理的である。

３．５ 単一分子蛍光イメージングによるＰＥＴ２の結合及び解離の特性評価
単一分子蛍光イメージングを使用して、ＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の結合速度定数及び解離速度定数を比較した。フリーのシステイン残基（Ｃｙｓ３０９）を酵素のＣ末端とＴＥＶプロテアーゼ認識部位の間に挿入し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５マレイミドで標識した。ＰＥＴ２野生型－Ｃ３０９とＰＥＴ２（７Ｍ）－Ｃ３０９の標識率はそれぞれ１０９％、１２２％であった。ＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２野生型－Ｃ３０９－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、又はＰＥＴ２（７Ｍ）とＰＥＴ２（７Ｍ）－Ｃ３０９－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５のＰＥＴ分解活性は互いに類似しており、色素標識は活性に影響を与えないと考えられた。また、Ｃｙｓ３０９を有しないＰＥＴ２野生型及びＰＥＴ２（７Ｍ）の標識率はそれぞれ３．４％、７．１％にすぎず、本標識条件では色素は主にＣｙｓ３０９と反応すると考えられた。元のＰＥＴフィルムは自己蛍光が強く、色素標識ＰＥＴ２酵素の単一分子イメージングが難しいことがわかった。自己蛍光の理由は定かではないが、ＰＥＴをヘキサフルオロ－２－プロパノールに溶解し、アセトンで沈殿させることで自己蛍光を低減できた。

色素標識ＰＥＴ２酵素の単一分子イメージングのため、アセトンで沈殿させたＰＥＴをヘキサフルオロ－２－プロパノールに再溶解し、カバーガラスにスピンコートし、完全に乾燥させて、一部未形成部分を残したＰＥＴ薄膜を形成した。カバーガラス上のＰＥＴ薄膜から、室温において、ＰＥＴ２（７Ｍ）はＰＥＴ２野生型の２．６倍の濃度の生成物を生成した。このとき、ＰＥＴ薄膜の外観は元の非晶性ＰＥＴフィルムとは大きく異なっていた（図５Ａ）。ＰＥＴ薄膜に対するＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の活性の違いは、６０℃で非晶性ＰＥＴフィルムを用いて試験した場合と同様であった。そのため、カバーガラス上のＰＥＴ薄膜は、ＰＥＴ２の結合及び解離の単一分子イメージングのモデル基質に使用できると考えた。低濃度（５０ｐＭ）の色素標識したＰＥＴ２野生型及びＰＥＴ２（７Ｍ）で、個々の分子からの蛍光シグナルが明確に観察された（図５Ｂ）。単一分子観察後、ＰＥＴ薄膜を高濃度（１０ｎＭ）の色素標識酵素で染色し（図５Ｃ）、この画像にＰＥＴ２の単一分子動画を重ねてＰＥＴ薄膜の位置を特定した。色素標識酵素はＰＥＴ薄膜にのみ結合し、カバーガラスには結合しない。次に、ＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の結合速度定数と結合時間（解離速度定数）を解析して比較した。結合速度定数を計算するために、各動画で時間の関数として結合分子の累積数をカウントし、１００個の酵素分子の結合に必要な時間を測定した（図５Ｄ）。次いで、１００（分子）を所要時間（秒）で除算し、得られた値をさらに視野内のＰＥＴ薄膜の面積（μｍ^２）及び溶液中の酵素濃度（Ｍ）で除算することにより結合速度定数を推定した。その結果、ＰＥＴ２野生型の結合速度定数は（２．８±１．６）×１０^８ｓ^－１μｍ^－２Ｍ^－１であり、ＰＥＴ２（７Ｍ）の結合速度定数は（７．５±３．０）×１０^８ｓ^－１μｍ^－２Ｍ^－１であった（表１）。したがって、ＰＥＴ２（７Ｍ）の結合速度定数は野生型の２．７倍であった。

一方、解離速度定数は、ＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）との間で大きな差がなかった。ＰＥＴ２野生型の結合時間の分布は、単一指数関数的減衰関数よりも二重指数関数的減衰関数の合計によくフィットし、少なくとも２つのＰＥＴ結合状態が存在すると考えられた（図５Ｅ、表１）。速い解離の速度定数は４．３ｓ^－１であり、遅い解離の速度定数は０．７１ｓ^－１であった。フィッティング式の面積から、速い解離と遅い解離の割合はそれぞれ６９．３％、３０．７％と算出された。ＰＥＴ２（７Ｍ）の結合時間の分布も二重指数関数的減衰関数によく適合し、速い解離及び遅い解離の速度定数（割合）はそれぞれ５．０ｓ^－１（８５．２％）、０．５４ｓ^－１（１４．８％）であった（図５Ｆ、表１）。ＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）のいずれにおいても、これらの解離速度定数は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５の光退色の速度定数（０．０２６ｓ^－１）よりもはるかに大きかった。したがってＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５の光退色は速い成分と遅い成分の原因ではない。

表１注：
ａ：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５標識のためＣｙｓ３０９をＣ末端に追加導入した。
ｂ：結合速度定数は、１００個の酵素分子の結合に要する時間から算出し、視野内のＰＥＴで被覆された面積と溶液中の酵素濃度でさらに正規化した。
ｃ：解離速度定数は、個々の分子の結合時間の分布を２つの指数関数的減衰関数の合計でフィッティングすることにより算出した。
ｄ：速い解離イベントと遅い解離イベントの割合は、フィッティング式の面積から算出した。
ｅ：値は５つの独立した動画からの平均±ＳＤとした。

３．６ 活性の温度依存性と長期安定性
野生型及び変異体における非晶性ＰＥＴ分解活性の温度依存性を測定し、最も高い活性が観察される至適温度を決定した。ＰＥＴ２野生型では６０℃で０．４ｍｉｎ^－１の最高活性が観察され、より高温側では活性が減少した(図６Ａ）。一方、変異数の増加に伴い、至適温度は６０℃より高温側にシフトした。ＰＥＴ２（７Ｍ）は６８℃で２．７ｍｉｎ^－１の最高活性を示し、これは６０℃における活性よりも２倍高かった（図６Ａ）。また、ＰＥＴ２（７Ｍ）は８０℃でも検出可能な活性を保持していたが、野生型及び他の２つの変異体（４Ｍ及び５Ｍ）は失活した。この結果は、ＰＥＴ２（７Ｍ）のＲ４７Ｃ－Ｇ８９Ｃ変異が最終的な変異体の熱安定性に大きく寄与することを示している。また、ＰＥＴ２（５Ｍ）とＰＥＴ２（７Ｍ）との活性の比較により、Ｒ４７Ｃ－Ｇ８９Ｃの変異が各温度において活性も向上させていることが明らかになった。さらに、中程度の温度での活性の差を確認するため、３０℃でもＰＥＴ２野生型及びＰＥＴ２（７Ｍ）による非晶性ＰＥＴディスクの加水分解活性を測定した。ＰＥＴ２野生型及びＰＥＴ２（７Ｍ）の加水分解活性は３０℃では非常に低かったが、ＰＥＴ２（７Ｍ）の活性値は野生型の活性値の３倍であった。したがって、その差は６０℃で観察された場合と同様であった。

次に、ＰＥＴ２野生型及びＰＥＴ２（７Ｍ）によるＰＥＴ分解を、それぞれの至適温度である６０℃及び６８℃で、最大２４時間のインキュベーション時間で比較した。非晶性ＰＥＴ分解では、ＰＥＴ２（７Ｍ）により生成した生成物量は、ＰＥＴ２野生型により生成した生成物の３倍超を常に維持していた（図６Ｂ）。さらに、重要なことに、ＰＥＴ２（７Ｍ）は１～２４時間の間ほぼ一定の分解速度を維持しており、このことは、至適温度である６８℃での長期熱安定性を示唆している。さらに、結晶性ＰＥＴの分解についても調べた。ＰＥＴ２（７Ｍ）はＰＥＴ２野生型の２倍の活性を常に維持していた。この場合も、ＰＥＴ２（７Ｍ）は、１～２４時間の間ほぼ一定の分解速度を維持していた。しかし、０．１μＭのＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）では、結晶性ＰＥＴから、２４時間反応後にそれぞれ１．７μＭ、４．５μＭの生成物しか生成しなかった。これらの結果は、ＰＥＴ２酵素がＰＥＴの非晶性領域の可動部分を優先的に加水分解することを示唆しており、他のＰＥＴ加水分解酵素の以前の研究と整合している^{（４、１２、１３、４８）}。

４．考察
残存活性から推定されたＰＥＴ２野生型の反応上限温度（６５℃）（図２Ａ）は、２３０ｎｍでのＣＤシグナルの変化から推定されたＴｍ（６９．０℃）（図２Ｄ）とよく一致した。さらに、以前の研究で、ＰＥＴ２野生型のリパーゼ活性は６０℃であり、より高温では活性が低下することがわかっている（リパーゼとしての当初の名称はＬｉｐＩＡＦ５．２であるが、ここでは便宜上ＰＥＴ２の名称を用いている）^（１９）。これらの結果は、２３０ｎｍにおけるトリプトファン残基のシグナルがＰＥＴ２野生型の触媒活性と非常によく相関することを示唆している。我々はＰＥＴ２ Ｗ１７４Ｈ変異体の２３０ｎｍにおけるシグナルが野生型よりも非常に微弱であることを見出した。そのため、ＰＥＴ２の２３０ｎｍにおける特徴的なシグナルは、触媒トライアドのＳｅｒ１７５残基の隣に位置するＴｒｐ１７４に起因している可能性があり、これは上述の相関関係と整合する。一方、ＰＥＴ２によるＢＨＥＴ加水分解の至適ｐＨは、本研究では約７であった（図２Ｂ）。以前の研究では、ｐ－ニトロフェニルミリステート加水分解では至適ｐＨは１０．５であった。ＢＨＥＴは高ｐＨではＰＥＴ２の非存在下でもＭＨＥＴに自然分解することから、この違いは基質安定性の差異に起因するものと推測される。

興味深いことに、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）や１％Ｔｗｅｅｎ８０ではＰＥＴ２のリパーゼ活性は３０％しか阻害されないが、１ｍＭエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）又は１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００によりＰＥＴ２は完全にリパーゼ活性を失う^（１９）。ＥＧＴＡとＥＤＴＡとでは２対の酢酸基を連結する連結基の構造に違いがある。ＥＧＴＡのエチレングリコール構造はＰＥＴ２の活性部位近傍に結合し基質の結合を妨げる可能性がある。また、試験された界面活性剤のなかで、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００のみが構造中に芳香環を有する。これらの結果は、ＰＥＴ２がエチレングリコール及び芳香環に結合親和性を有することを示唆している。本研究ではＰＥＴ２野生型においてＰＥＴ分解活性にＣａ^２＋濃度依存性は観察されなかった。ＰＥＴ２（２Ｍ）構造ではＣｕｔ１９０の部位１に相当する潜在的Ｃａ^２＋結合部位しか存在しないことに鑑みると、この結果は妥当である。そのため、ＥＧＴＡ及びＥＤＴＡのイオンキレート能はＰＥＴ２のリパーゼ活性の変化とは無関係である。

ＰＥＴ２の単一変異に関する結果は、ＩｓＰＥＴａｓｅの熱安定性と活性を増加させた変異がＰＥＴ２に対してはあまり効果的ではないことを示唆している。特に、Ｗ１７４Ｈ変異は野生型に比べ、Ｔｍは５℃高かったものの、活性は４分の１に低下した（図３Ｂ）。対照的に、ＩｓＰＥＴａｓｅの表面電荷改変に倣うＰＥＴ２の表面電荷における変異（Ｆ１０５Ｒ及びＥ１１０Ｋ）は活性を増強させた。興味深いことに、これらの変異はＰＥＴ２のＴｍも上昇させた。Ｆ１０５Ｒ変異は、酵素表面の疎水性残基を正電荷を有する残基に置換する。類似の変異がアセチルコリンエステラーゼの熱安定性を高めることが報告されている^（４９）。一方、Ｅ１１０Ｋ変異がＰＥＴ２を熱安定化する理由は明らかではない。Ｇ１８０ＡはＰＥＴ２のＴｍ及び活性をいずれも向上させた最も効果的な変異の１つである。ＰＥＴ２（２Ｍ）とＰＥＴ２（７Ｍ）の間で、Ｇｌｙ１８０とＡｌａ１８０に隣接するα－ヘリックス構造は微妙に異なっている（図４Ａ及び図４Ｂ、右）。ＰＥＴ２（７Ｍ）ではＡｒｇ１３８とＡｒｇ１３９の主鎖はわずかにシフトして理想的なα－ヘリックスを形成している。これが熱安定性と活性の向上に寄与している可能性がある。一方、Ｇ１７７Ａ及びＧ１７９Ａの変異はＴｍ及び活性を低下させた。これは、ＰＥＴ２（２Ｍ）の結晶構造から確認されるように、これらのアラニン残基の側鎖がＰｒｏ１００及びＴｒｐ１９９の主鎖カルボニル酸素原子と近接しすぎていることに起因すると推測される（図４Ａ）。Ｒ４７Ｃ－Ｇ８９Ｃ変異はジスルフィド結合を形成し、Ｙ２６２Ｃ－Ｌ２９８ＣやＬ２６５Ｃ－Ａ２９５ＣよりもさらにＴｍを上昇させた（図３Ｂ）。結晶構造では、ペプチド鎖の電子密度が不明確でありＮ末端残基（Ａｌａ２８～Ａｓｎ４４）はモデル化されなかった。これらの結果は、ＰＥＴ２のＮ末端領域がＣ末端領域よりもフレキシブルであることを示唆している。したがって、Ｎ末端領域でのジスルフィド結合の形成は、Ｃ末端領域でのジスルフィド結合よりも効果的な熱安定化をもたらすと考えられる。ＬＣＣ及びＣｕｔ１９０の場合、Ｃａ^２＋結合部位２でのジスルフィド結合の形成が安定性を向上させた^{（１２、１５）}。ＰＥＴ２及びＩｓＰＥＴａｓｅはこの近傍に既にジスルフィド結合を有しているため、本研究では、同部位に新たなジスルフィド結合の導入は試みなかった。

単一分子蛍光イメージングにより、ＰＥＴ２（７Ｍ）の結合速度定数はＰＥＴ２野生型の２．７倍であることがわかった（図５Ｄ、表１）。一方、いずれの酵素も、解離速度定数において速い成分及び遅い成分を有し、両酵素においてこれらの値及び割合は同様であった（図５Ｅ、図５Ｆ、表１）。我々は当初、変異体における活性増強は、変異体表面のリシン又はアルギニン残基とＰＥＴの芳香環との間での強力なカチオン－π相互作用により得られたと予測した^（５０）。しかしながら、本研究の結果は、ＰＥＴ２（７Ｍ）のＰＥＴ結合状態は表面電荷変異により安定化しているのではないことを示唆している。速い解離成分及び遅い解離成分の割合に基づき、我々は次にこれらの成分の結合速度定数を算出した（表１）。その結果、ＰＥＴ２野生型では、速い成分及び遅い成分での値はそれぞれ１．９×１０^８ｓ^－１μｍ^－２Ｍ^－１及び０．８６×１０^８ｓ^－１μｍ^－２Ｍ^－１であった。また、ＰＥＴ２（７Ｍ）では、速い成分及び遅い成分での値はそれぞれ６．４×１０^８ｓ^－１μｍ^－２Ｍ^－１、１．１×１０^８ｓ^－１μｍ^－２Ｍ^－１であった。我々はさらに、速い成分と遅い成分の結合速度定数と解離速度定数との比に基づき、これらの解離定数を算出した（表１）。ＰＥＴ２野生型では、値は速い成分及び遅い成分でそれぞれ２．３×１０^－８μｍ^２Ｍ、０．８３×１０^－８μｍ^２Ｍであった。ＰＥＴ２（７Ｍ）では、値は速い成分及び遅い成分でそれぞれ０．７８×１０^－８μｍ^２Ｍ、０．４９×１０^－８μｍ^２Ｍであった。したがって、ＰＥＴ２（７Ｍ）の速い成分の結合速度定数はＰＥＴ２野生型と比べて３．４倍高く、解離定数はＰＥＴ２野生型と比べて２．９倍低い。興味深いことに、６０℃におけるＰＥＴ２（７Ｍ）の非晶性ＰＥＴフィルムに対する活性はＰＥＴ２野生型と比べて３．２倍高く（図６Ａ）、室温でのＰＥＴ薄膜に対する活性は２．６倍高かった。ＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）の活性の差は、速い成分の結合速度定数と解離定数の差と同程度であった。したがって、変異体はｐＨ７．０でＰＥＴ２野生型よりも多くの正電荷を有し（図４Ｃ）、ＰＥＴ表面は負電荷を有するため^（５１）、１つの妥当な説明として、ＰＥＴ２（７Ｍ）が静電的に引き付けられてＰＥＴ表面近くの局所酵素濃度が増加し、速い結合が促進されると説明することができる。Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅのリパーゼは脂肪族ポリマー（ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンアジペート、ポリ乳酸）に効率的に結合するが、ＰＥＴには結合しないことが報告されている^（５２）。上記結果は、ＰＥＴへの結合が異なる相互作用を要することを示唆している。ＰＥＴ２の結合速度定数をさらに高めるには、ＰＥＴ表面に適合するように酵素の表面形状を改変する必要がある可能性がある。例えば、セルロース結合ドメイン（ＣＢＭ）は、結晶セルロースの平面に適合するように、細かく調整された平面を有する^（５３）。興味深いことに、ＣＢＭとＰＥＴ表面とは強く相互作用することが過去に報告されている^（５４）。例えば、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｉｍｉのＣＢＭ－Ｗ６８Ｙ変異体と融合したＴ．ｆｕｓｃａのクチナーゼは、２４時間のインキュベーション後に１．５倍高い生成物濃度を示した^（５５）。また、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓのポリヒドロキシ酪酸デポリメラーゼの結合ドメインと融合したＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｃｅｌｌｕｌｌｏｓｙｌｉｔｉｃａのクチナーゼは、結合ドメインを有しないものと比べて３倍高い生成物濃度を示した^（５６）。ＰＥＴ表面への結合親和性を改善するための別のアプローチとして、ハイドロフォビンとクチナーゼの融合タンパク質が報告されている^（５７）。速い成分と遅い成分のメカニズムはまだ明らかではないが、遅い成分の結合速度定数と解離定数はいずれもＰＥＴ２野生型とＰＥＴ２（７Ｍ）との間に大きな違いはなかったため、遅い成分はＰＥＴ分解に寄与していないと考えられる（表１）。

本研究では、ＰＥＴ２（７Ｍ）は長期熱安定性を示し、０．１μＭの酵素により、非晶性ＰＥＴフィルム（１．３ｃｍ^２／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ）から６８℃、２４時間のインキュベーションで１２９μＭの生成物が生産された（図６Ｂ）。ここで、本ＰＥＴ２変異体と、過去に報告されている他のＰＥＴ加水分解酵素とを比較する。合理的に改変された０．５μＭのＩｓＰＥＴａｓｅ変異体（Ｓ１２１Ｅ－Ｄ１８６Ｈ－Ｒ２８０Ａ）は、我々の用いた非晶性ＰＥＴと同様のＤＳＣプロファイルを示す２．０ｃｍ^２／ｍＬの非晶性ＰＥＴから、４０℃、１日間のインキュベーションにより約７０μＭの生成物を生産した^（５８）。したがって、ＰＥＴ２（７Ｍ）はこのＩｓＰＥＴａｓｅ変異体よりも大量の生成物を生産したといえる。同様に、ＩＩａ型ＰＥＴ加水分解酵素に属する新規酵素ＰＥ－Ｈ（Ｙ２５０Ｓ）変異体^（５９）は非晶性ＰＥＴに対してＰＥＴ２（７Ｍ）に比べて非常に少量しか生成物を生産していない。一方、２μＭのＣｕｔ１９０変異体（Ｑ１３８Ａ－Ｄ２５０Ｃ－Ｅ２９６Ｃ－Ｑ１２３Ｈ－Ｎ２０２Ｈ）は、我々の研究で使用したものと同じ非晶性ＰＥＴから、７０℃、３日間のインキュベーションにおいて、１７．５ｍＭの生成物を生成した^（１５）。この量は我々のものよりもはるかに多く、同じ生産量に達するにはＰＥＴ２（７Ｍ）の活性を２倍に増強させる必要がある。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓで発現した１．５ｎｍｏｌのＴｆＣｕｔ２は、７０℃、２４時間（速度２３．５ｍｉｎ^－１）後に９．９ｍｇの非晶性ＰＥＴチップを分解し、１２０時間後にはチップはほぼ完全に分解された^（１３）。ＰＥＴ２（７Ｍ）の活性をさらに改善するため、以下の戦略が有効であろう。ＰＥＴ２野生型及びＰＥＴ２（７Ｍ）による非晶性ＰＥＴフィルムの分解中、比較的大量のＭＨＥＴが生成物として溶液中に残留していた（図６Ｃ）。ＩｓＰＥＴａｓｅとＭＨＥＴａｓｅの融合酵素はＰＥＴ分解に相乗的効果を示したことから^（６０）、ＭＨＥＴをＴＰＡに完全に分解するには、ＭＨＥＴａｓｅとの融合酵素の作製が効果的であろう。基質に関しては、接触可能な表面積を増やして分解を促進する効果的な方法として、ＰＥＴの粉砕が挙げられる。実際、ＴｆＣｕｔ２のＰＥＴナノ粒子（＜１００ｎｍ）に対する解離定数は低く、等温滴定熱量測定により０．０４３ｍｇ／ｍＬ^－１と決定された^（６１）。さらに、アガロースゲル（平均直径＝１６４ｎｍ）に固定化したＰＥＴナノ粒子に対する比濁分析による解離定数は０．０３１ｍｇ／ｍＬ^－１であった^（６２）。基質の接触可能な表面を増加させることは酵素の結合を改善するための有望な手段である。さらに、Ｔｏｕｒｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．は天然ＬＣＣを用いて２ｍｇ／ｍＬの非晶性ＰＥＴ粉末懸濁液（５００μｍメッシュよりも小さい）から１時間、ｍｇ酵素当たり９３．２ｍｇのＴＰＡ等量の生成物を生産した（約２７０ｍｉｎ^－１に相当）^（１２）。彼らはまた、２０ｋｇの廃棄ＰＥＴ粉末の９０％を１０時間未満で加水分解する熱安定性ＬＣＣ変異体（Ｆ２４３Ｉ－Ｄ２３８Ｃ－Ｓ２８３Ｃ－Ｙ１２７Ｇ）の作製にも成功している^（１２）。

酵素の観点からは、酵素あたりの活性をさらに向上させるためには、酵素がポリマー基質から解離することなく触媒サイクルを繰り返す、いわゆる「プロセッシブな触媒作用」が望ましい。例えば、ポリカプロラクトンの場合、樹脂に埋め込まれた酵素によるプロセッシブな分解を利用することで、１日でほぼ完全な分解が達成されている^（６３）。ポリマー鎖間に強い疎水性相互作用を有するＰＥＴのプロセッシブな分解のために、ＰＥＴ加水分解酵素はＰＥＴのガラス転移温度よりも高い温度での熱安定性を獲得することが望ましい。さらに、ＰＥＴ加水分解酵素は、プロセッシブなセルラーゼやキチナーゼと同様に、解離せずに単一のポリマー鎖に沿って一方向に移動する能力も獲得することが望ましい^（６４）。

結論として、ＰＥＴ加水分解酵素であるＰＥＴ２の熱安定化と表面電荷修飾により、ＰＥＴ加水分解活性の向上に成功した。Ｘ線結晶構造解析により、プロリン変異は元のループ構造を維持し、システイン残基変異対はＰＥＴ２のＮ末端でジスルフィド結合を形成することが明らかになった。ＩｓＰＥＴａｓｅの活性を増加させる変異に対応する変異のなかにはＰＥＴ２に効果がないものもあったが、単一分子イメージング分析により、ＩｓＰＥＴａｓｅを参照として行った表面電荷修飾によりＰＥＴ２の結合速度定数が増加し、活性の向上に寄与したことが明らかになった。なかでも、Ｒ４７ＣとＧ８９Ｃの２つのシステイン残基の導入はＴｍの大幅な上昇をもたらし、ＰＥＴ２の活性も向上させることから、最も有用な変異のひとつであることが明らかになった。７つの変異の組み合わせによりＰＥＴ２のＴｍが６．７℃上昇し、反応至適温度は８℃上昇した。ＰＥＴ２（７Ｍ）はさらに効率的なＰＥＴ加水分解酵素の構築のテンプレートの１つとなりうる。

アクセッションコード
ＰＥＴ２（２Ｍ）（Ｆ１０５Ｒ－Ｅ１１０Ｋ）及びＰＥＴ２（７Ｍ）（Ｒ４７ＣＧ８９Ｃ－Ｆ１０５Ｒ－Ｅ１１０Ｋ－Ｓ１５６Ｐ－Ｇ１８０Ａ－Ｔ２９７Ｐ）のＰＤＢ ＩＤはそれぞれ７ＥＣ８、７ＥＣＢである。

参照文献
(1) Karbalaei, S.; Hanachi, P.; Walker, T. R.; Cole, M. Occurrence, Sources, Human Health Impacts and Mitigation of Microplastic Pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 2018, 25, 36046-36063.
(2) Koshti, R.; Mehta, L.; Samarth, N. Biological Recycling of Polyethylene Terephthalate: A Mini-Review. J. Polym. Environ. 2018, 26, 3520-3529.
(3) Campanelli, J. R.; Kamal, M. R.; Cooper, D. G. A Kinetic Study of the Hydrolytic Degradation of Polyethylene Terephthalate at High Temperatures. J. Appl. Polym. Sci. 1993, 48, 443-451.
(4) Taniguchi, I.; Yoshida, S.; Hiraga, K.; Miyamoto, K.; Kimura, Y.; Oda, K. Biodegradation of Pet: Current Status and Application Aspects. ACS Catal. 2019, 9, 4089-4105.
(5) Muller, R.-J.; Schrader, H.; Profe, J.; Dresler, K.; Deckwer, W.-D. Enzymatic Degradation of Poly(Ethylene Terephthalate): Rapid Hydrolyse Using a Hydrolase Fromt. Fusca. Macromol. Rapid Commun. 2005, 26, 1400-1405.
(6) Yoshida, S.; Hiraga, K.; Takehana, T.; Taniguchi, I.; Yamaji, H.; Maeda, Y.; Toyohara, K.; Miyamoto, K.; Kimura, Y.; Oda, K. A Bacterium That Degrades and Assimilates Poly(Ethylene Terephthalate). Science 2016, 351, 1196-9.
(7) Han, X.; Liu, W.; Huang, J. W.; Ma, J.; Zheng, Y.; Ko, T. P.; Xu, L.; Cheng, Y. S.; Chen, C. C.; Guo, R. T. Structural Insight into Catalytic Mechanism of Pet Hydrolase. Nat. Commun. 2017, 8, 2106.
(8) Fecker, T.; Galaz-Davison, P.; Engelberger, F.; Narui, Y.; Sotomayor, M.; Parra, L. P.; Ramirez-Sarmiento, C. A. Active Site Flexibility as a Hallmark for Efficient Pet Degradation by I. Sakaiensis Petase. Biophys. J. 2018, 114, 1302-1312.
(9) Joo, S.; Cho, I. J.; Seo, H.; Son, H. F.; Sagong, H. Y.; Shin, T. J.; Choi, S. Y.; Lee, S. Y.; Kim, K. J. Structural Insight into Molecular Mechanism of Poly(Ethylene Terephthalate) Degradation. Nat. Commun. 2018, 9, 382.
(10) Wei, R.; Song, C.; Grasing, D.; Schneider, T.; Bielytskyi, P.; Bottcher, D.; Matysik, J.; Bornscheuer, U. T.; Zimmermann, W. Conformational Fitting of a Flexible Oligomeric Substrate Does Not Explain the Enzymatic Pet Degradation. Nat. Commun. 2019, 10, 5581.

(11) Austin, H. P.; Allen, M. D.; Donohoe, B. S.; Rorrer, N. A.; Kearns, F. L.; Silveira, R. L.; Pollard, B. C.; Dominick, G.; Duman, R.; El Omari, K.; Mykhaylyk, V.; Wagner, A.; Michener, W. E.; Amore, A.; Skaf, M. S.; Crowley, M. F.; Thorne, A. W.; Johnson, C. W.; Woodcock, H. L.; McGeehan, J. E.; Beckham, G. T. Characterization and Engineering of a Plastic-Degrading Aromatic Polyesterase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2018, 115, E4350-E4357.
(12) Tournier, V.; Topham, C. M.; Gilles, A.; David, B.; Folgoas, C.; Moya-Leclair, E.; Kamionka, E.; Desrousseaux, M. L.; Texier, H.; Gavalda, S.; Cot, M.; Guemard, E.; Dalibey, M.; Nomme, J.; Cioci, G.; Barbe, S.; Chateau, M.; Andre, I.; Duquesne, S.; Marty, A. An Engineered Pet Depolymerase to Break Down and Recycle Plastic Bottles. Nature 2020, 580, 216-219.
(13) Wei, R.; Breite, D.; Song, C.; Grasing, D.; Ploss, T.; Hille, P.; Schwerdtfeger, R.; Matysik, J.; Schulze, A.; Zimmermann, W. Biocatalytic Degradation Efficiency of Postconsumer Polyethylene Terephthalate Packaging Determined by Their Polymer Microstructures. Adv. Sci. (Weinh) 2019, 6, 1900491.
(14) Inaba, S.; Kamiya, N.; Bekker, G.-J.; Kawai, F.; Oda, M. Folding Thermodynamics of Pet-Hydrolyzing Enzyme Cut190 Depending on Ca2+ Concentration. J. Therm. Anal. Calorim. 2019, 135, 2655-2663.
(15) Oda, M.; Yamagami, Y.; Inaba, S.; Oida, T.; Yamamoto, M.; Kitajima, S.; Kawai, F. Enzymatic Hydrolysis of Pet: Functional Roles of Three Ca(2+) Ions Bound to a Cutinase-Like Enzyme, Cut190*, and Its Engineering for Improved Activity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018, 102, 10067-10077.
(16) Tokiwa, Y.; Suzuki, T. Hydrolysis of Copolyesters Containing Aromatic and Aliphatic Ester Blocks by Lipase. J. Appl. Polym. Sci. 1981, 26, 441-448.
(17) Uchida, H.; Shigeno-Akutsu, Y.; Nomura, N.; Nakahara, T.; Nakajima-Kambe, T. Cloning and Sequence Analysis of Poly- (Tetramethylene Succinate) Depolymerase from Acidovorax Delafieldii Strain Bs-3. J. Biosci. Bioeng. 2002, 93, 245-7.
(18) Jaeger, K. E.; Steinbuchel, A.; Jendrossek, D. Substrate Specificities of Bacterial Polyhydroxyalkanoate Depolymerases and Lipases: Bacterial Lipases Hydrolyze Poly(Omega-Hydroxyalkanoates). Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61, 3113-3118.
(19) Meilleur, C.; Hupe, J. F.; Juteau, P.; Shareck, F. Isolation and Characterization of a New Alkali-Thermostable Lipase Cloned from a Metagenomic Library. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2009, 36, 853-61.
(20) Danso, D.; Schmeisser, C.; Chow, J.; Zimmermann, W.; Wei, R.; Leggewie, C.; Li, X.; Hazen, T.; Streit, W. R. New Insights into the Function and Global Distribution of Polyethylene Terephthalate (Pet)- Degrading Bacteria and Enzymes in Marine and Terrestrial Metagenomes. Appl. Environ. Microbiol. 2018, 84, No. e02773-17.

(21) Kawai, F.; Kawabata, T.; Oda, M. Current Knowledge on Enzymatic Pet Degradation and Its Possible Application to Waste Stream Management and Other Fields. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019, 103, 4253-4268.
(22) Chundawat, S. P.; Beckham, G. T.; Himmel, M. E.; Dale, B. E. Deconstruction of Lignocellulosic Biomass to Fuels and Chemicals. Annu. Rev. Chem. Biomol. Eng. 2011, 2, 121-45.
(23) Lopes, C.; Antelo, L. T.; Franco-Uria, A.; Alonso, A. A.; Perez- Martin, R. Chitin Production from Crustacean Biomass: Sustainability Assessment of Chemical and Enzymatic Processes. J. Cleaner Prod. 2018, 172, 4140-4151.
(24) Payne, C. M.; Knott, B. C.; Mayes, H. B.; Hansson, H.; Himmel, M. E.; Sandgren, M.; Stahlberg, J.; Beckham, G. T. Fungal Cellulases. Chem. Rev. 2015, 115, 1308-448.
(25) Furukawa, M.; Kawakami, N.; Oda, K.; Miyamoto, K. Acceleration of Enzymatic Degradation of Poly(Ethylene Terephthalate) by Surface Coating with Anionic Surfactants. ChemSusChem 2018, 11, 4018-4025.
(26) Nakamura, A.; Ishiwata, D.; Visootsat, A.; Uchiyama, T.; Mizutani, K.; Kaneko, S.; Murata, T.; Igarashi, K.; Iino, R. Domain Architecture Divergence Leads to Functional Divergence in Binding and Catalytic Domains of Bacterial and Fungal Cellobiohydrolases. J. Biol. Chem. 2020, 295, 14606-14617.
(27) Nakamura, A.; Tasaki, T.; Ishiwata, D.; Yamamoto, M.; Okuni, Y.; Visootsat, A.; Maximilien, M.; Noji, H.; Uchiyama, T.; Samejima, M.; Igarashi, K.; Iino, R. Single-Molecule Imaging Analysis of Binding, Processive Movement, and Dissociation of Cellobiohydrolase Trichoderma Reesei Cel6a and Its Domains on Crystalline Cellulose. J. Biol. Chem. 2016, 291, 22404-22413.
(28) Nakamura, A.; Tasaki, T.; Okuni, Y.; Song, C.; Murata, K.; Kozai, T.; Hara, M.; Sugimoto, H.; Suzuki, K.; Watanabe, T.; Uchihashi, T.; Noji, H.; Iino, R. Rate Constants, Processivity, and Productive Binding Ratio of Chitinase a Revealed by Single-Molecule Analysis. Phys. Chem. Chem. Phys. 2018, 20, 3010-3018.
(29) Waterhouse, A.; Bertoni, M.; Bienert, S.; Studer, G.; Tauriello, G.; Gumienny, R.; Heer, F. T.; de Beer, T. A. P.; Rempfer, C.; Bordoli, L.; Lepore, R.; Schwede, T. Swiss-Model: Homology Modelling of Protein Structures and Complexes. Nucleic Acids Res. 2018, 46, W296- W303.
(30) Liebschner, D.; Afonine, P. V.; Baker, M. L.; Bunkoczi, G.; Chen, V. B.; Croll, T. I.; Hintze, B.; Hung, L. W.; Jain, S.; McCoy, A. J.; Moriarty, N. W.; Oeffner, R. D.; Poon, B. K.; Prisant, M. G.; Read, R. J.; Richardson, J. S.; Richardson, D. C.; Sammito, M. D.; Sobolev, O. V.; Stockwell, D. H.; Terwilliger, T. C.; Urzhumtsev, A. G.; Videau, L. L.; Williams, C. J.; Adams, P. D. Macromolecular Structure Determination Using X-Rays, Neutrons and Electrons: Recent Developments in Phenix. Acta Crystallogr. D Struct. Biol. 2019, 75, 861-877.

(31) Emsley, P.; Cowtan, K. Coot: Model-Building Tools for Molecular Graphics. Acta Crystallogr., Sect. D: Biol. Crystallogr. 2004, 60, 2126-32.
(32) Dolinsky, T. J.; Nielsen, J. E.; McCammon, J. A.; Baker, N. A. Pdb2pqr: An Automated Pipeline for the Setup of Poisson-Boltzmann Electrostatics Calculations. Nucleic Acids Res. 2004, 32, W665-7.
(33) Jurrus, E.; Engel, D.; Star, K.; Monson, K.; Brandi, J.; Felberg, L. E.; Brookes, D. H.; Wilson, L.; Chen, J.; Liles, K.; Chun, M.; Li, P.; Gohara, D. W.; Dolinsky, T.; Konecny, R.; Koes, D. R.; Nielsen, J. E.; Head-Gordon, T.; Geng, W.; Krasny, R.; Wei, G. W.; Holst, M. J.; McCammon, J. A.; Baker, N. A. Improvements to the Apbs Biomolecular Solvation Software Suite. Protein Sci. 2018, 27, 112-128.
(34) Zhang, J. M.; Hua, Q.; Reynolds, C. T.; Zhao, Y.; Dai, Z.; Bilotti, E.; Tang, J.; Peijs, T. Preparation of High Modulus Poly(Ethylene Terephthalate): Influence of Molecular Weight, Extrusion, and Drawing Parameters. Int. J. Polym. Sci. 2017, 2017, 1-10.
(35) Woody, R. W. Contributions of Tryptophan Side Chains to the Far-Ultraviolet Circular Dichroism of Proteins. Eur. Biophys. J. 1994, 23, 253-62.
(36) Kawai, F.; Oda, M.; Tamashiro, T.; Waku, T.; Tanaka, N.; Yamamoto, M.; Mizushima, H.; Miyakawa, T.; Tanokura, M. A Novel Ca(2)(+)-Activated, Thermostabilized Polyesterase Capable of Hydrolyzing Polyethylene Terephthalate from Saccharomonospora Viridis Ahk190. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98, 10053-64.
(37) Sulaiman, S.; You, D. J.; Kanaya, E.; Koga, Y.; Kanaya, S. Crystal Structure and Thermodynamic and Kinetic Stability of Metagenome- Derived Lc-Cutinase. Biochemistry 2014, 53, 1858-69.
(38) Then, J.; Wei, R.; Oeser, T.; Gerdts, A.; Schmidt, J.; Barth, M.; Zimmermann, W. A Disulfide Bridge in the Calcium Binding Site of a Polyester Hydrolase Increases Its Thermal Stability and Activity against Polyethylene Terephthalate. FEBS Open Bio 2016, 6, 425-32.
(39) Cui, Y.; Chen, Y.; Liu, X.; Dong, S.; Tian, Y. e.; Qiao, Y.; Mitra, R.; Han, J.; Li, C.; Han, X.; Liu, W.; Chen, Q.; Wei, W.; Wang, X.; Du, W.; Tang, S.; Xiang, H.; Liu, H.; Liang, Y.; Houk, K. N.; Wu, B. Computational Redesign of a Petase for Plastic Biodegradation under Ambient Condition by the Grape Strategy. ACS Catal. 2021, 11, 1340- 1350.
(40) Igarashi, K.; Ozawa, T.; Ikawa-Kitayama, K.; Hayashi, Y.; Araki, H.; Endo, K.; Hagihara, H.; Ozaki, K.; Kawai, S.; Ito, S. Thermostabilization by Proline Substitution in an Alkaline, Liquefying Alpha- Amylase from Bacillus Sp. Strain Ksm-1378. Biosci., Biotechnol., Biochem. 1999, 63, 1535-40.

(41) Wang, K.; Luo, H.; Tian, J.; Turunen, O.; Huang, H.; Shi, P.; Hua, H.; Wang, C.; Wang, S.; Yao, B. Thermostability Improvement of a Streptomyces Xylanase by Introducing Proline and Glutamic Acid Residues. Appl. Environ. Microbiol. 2014, 80, 2158-65.
(42) Goihberg, E.; Dym, O.; Tel-Or, S.; Levin, I.; Peretz, M.; Burstein, Y. A Single Proline Substitution Is Critical for the Thermostabilization of Clostridium Beijerinckii Alcohol Dehydrogenase. Proteins: Struct., Funct., Genet. 2007, 66, 196-204.
(43) Watanabe, K.; Suzuki, Y. Protein Thermostabilization by Proline Substitutions. J. Mol. Catal. B: Enzym. 1998, 4, 167-180.
(44) Lopez-Llano, J.; Campos, L. A.; Sancho, J. Alpha-Helix Stabilization by Alanine Relative to Glycine: Roles of Polar and Apolar Solvent Exposures and of Backbone Entropy. Proteins: Struct., Funct., Genet. 2006, 64, 769-78.
(45) Yamaguchi, S.; Takeuchi, K.; Mase, T.; Oikawa, K.; McMullen, T.; Derewenda, U.; McElhaney, R. N.; Kay, C. M.; Derewenda, Z. S. The Consequences of Engineering an Extra Disulfide Bond in the Penicillium Camembertii Mono- and Diglyceride Specific Lipase. Protein Eng., Des. Sel. 1996, 9, 789-95.
(46) Zabetakis, D.; Olson, M. A.; Anderson, G. P.; Legler, P. M.; Goldman, E. R. Evaluation of Disulfide Bond Position to Enhance the Thermal Stability of a Highly Stable Single Domain Antibody. PLoS One 2014, 9, e115405.
(47) Khan, F. I.; Lan, D.; Durrani, R.; Huan, W.; Zhao, Z.; Wang, Y. The Lid Domain in Lipases: Structural and Functional Determinant of Enzymatic Properties. Front. Bioeng. Biotechnol. 2017, 5, 16.
(48) Donelli, I.; Freddi, G.; Nierstrasz, V. A.; Taddei, P. Surface Structure and Properties of Poly-(Ethylene Terephthalate) Hydrolyzed by Alkali and Cutinase. Polym. Degrad. Stab. 2010, 95, 1542-1550.
(49) Strub, C.; Alies, C.; Lougarre, A.; Ladurantie, C.; Czaplicki, J.; Fournier, D. Mutation of Exposed Hydrophobic Amino Acids to Arginine to Increase Protein Stability. BMC Biochem. 2004, 5, 9.
(50) Kumar, K.; Woo, S. M.; Siu, T.; Cortopassi, W. A.; Duarte, F.; Paton, R. S. Cation-Pi Interactions in Protein-Ligand Binding: Theory and Data-Mining Reveal Different Roles for Lysine and Arginine. Chem. Sci. 2018, 9, 2655-2665.

(51) Elinson, V. M.; Shchur, P. A.; Kukushkin, D. Y. Surface Charge of Polymer Materials Modified by Nanostructured Fluorocarbon Coatings. J. Phys.: Conf. Ser. 2020, 1713, 012016.
(52) Zumstein, M. T.; Kohler, H. P.; McNeill, K.; Sander, M. Enzymatic Hydrolysis of Polyester Thin Films: Real-Time Analysis of Film Mass Changes and Dissipation Dynamics. Environ. Sci. Technol. 2016, 50, 197-206.
(53) Boraston, A. B.; Bolam, D. N.; Gilbert, H. J.; Davies, G. J. Carbohydrate-Binding Modules: Fine-Tuning Polysaccharide Recognition. Biochem. J. 2004, 382, 769-81.
(54) Weber, J.; Petrovic, D.; Strodel, B.; Smits, S. H. J.; Kolkenbrock, S.; Leggewie, C.; Jaeger, K. E. Interaction of Carbohydrate-Binding Modules with Poly(Ethylene Terephthalate). Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019, 103, 4801-4812.
(55) Zhang, Y.; Wang, L.; Chen, J.; Wu, J. Enhanced Activity toward Pet by Site-Directed Mutagenesis of Thermobifida Fusca Cutinase- Cbm Fusion Protein. Carbohydr. Polym. 2013, 97, 124-9.
(56) Ribitsch, D.; Yebra, A. O.; Zitzenbacher, S.; Wu, J.; Nowitsch, S.; Steinkellner, G.; Greimel, K.; Doliska, A.; Oberdorfer, G.; Gruber, C. C.; Gruber, K.; Schwab, H.; Stana-Kleinschek, K.; Acero, E. H.; Guebitz, G. M. Fusion of Binding Domains to Thermobifida Cellulosilytica Cutinase to Tune Sorption Characteristics and Enhancing Pet Hydrolysis. Biomacromolecules 2013, 14, 1769-76.
(57) Ribitsch, D.; Herrero Acero, E.; Przylucka, A.; Zitzenbacher, S.; Marold, A.; Gamerith, C.; Tscheliessnig, R.; Jungbauer, A.; Rennhofer, H.; Lichtenegger, H.; Amenitsch, H.; Bonazza, K.; Kubicek, C. P.; Druzhinina, I. S.; Guebitz, G. M. Enhanced Cutinase-Catalyzed Hydrolysis of Polyethylene Terephthalate by Covalent Fusion to Hydrophobins. Appl. Environ. Microbiol. 2015, 81, 3586-92.
(58) Son, H. F.; Cho, I. J.; Joo, S.; Seo, H.; Sagong, H.-Y.; Choi, S. Y.; Lee, S. Y.; Kim, K.-J. Rational Protein Engineering of Thermo-Stable Petase from Ideonella Sakaiensis for Highly Efficient Pet Degradation. ACS Catal. 2019, 9, 3519-3526.
(59) Bollinger, A.; Thies, S.; Knieps-Grunhagen, E.; Gertzen, C.; Kobus, S.; Hoppner, A.; Ferrer, M.; Gohlke, H.; Smits, S. H. J.; Jaeger, K. E. A Novel Polyester Hydrolase from the Marine Bacterium Pseudomonas Aestusnigri - Structural and Functional Insights. Front. Microbiol. 2020, 11, 114.
(60) Knott, B. C.; Erickson, E.; Allen, M. D.; Gado, J. E.; Graham, R.; Kearns, F. L.; Pardo, I.; Topuzlu, E.; Anderson, J. J.; Austin, H. P.; Dominick, G.; Johnson, C. W.; Rorrer, N. A.; Szostkiewicz, C. J.; Copie, V.; Payne, C. M.; Woodcock, H. L.; Donohoe, B. S.; Beckham, G. T.; McGeehan, J. E. Characterization and Engineering of a Two-Enzyme System for Plastics Depolymerization. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2020, 117, 25476-25485.

(61) Vogel, K.; Wei, R.; Pfaff, L.; Breite, D.; Al-Fathi, H.; Ortmann, C.; Estrela-Lopis, I.; Venus, T.; Schulze, A.; Harms, H.; Bornscheuer, U. T.; Maskow, T. Enzymatic Degradation of Polyethylene Terephthalate Nanoplastics Analyzed in Real Time by Isothermal Titration Calorimetry. Sci. Total Environ. 2021, 773, 145111.
(62) Wei, R.; Oeser, T.; Barth, M.; Weigl, N.; Lubs, A.; Schulz- Siegmund, M.; Hacker, M. C.; Zimmermann, W. Turbidimetric Analysis of the Enzymatic Hydrolysis of Polyethylene Terephthalate Nanoparticles. J. Mol. Catal. B: Enzym. 2014, 103, 72-78.
(63) DelRe, C.; Jiang, Y.; Kang, P.; Kwon, J.; Hall, A.; Jayapurna, I.; Ruan, Z.; Ma, L.; Zolkin, K.; Li, T.; Scown, C. D.; Ritchie, R. O.; Russell, T. P.; Xu, T. Near-Complete Depolymerization of Polyesters with Nano-Dispersed Enzymes. Nature 2021, 592, 558-563.
(64) Nakamura, A.; Okazaki, K. I.; Furuta, T.; Sakurai, M.; Iino, R. Processive Chitinase Is Brownian Monorail Operated by Fast Catalysis after Peeling Rail from Crystalline Chitin. Nat. Commun. 2018, 9, 3814.

Claims (12)

1. ポリエチレンテレフタレート加水分解活性を有する、以下のいずれかのアミノ酸配列を含むタンパク質。
   （Ａ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列；
   （Ａ１）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｒ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列；
   （Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列；
   （Ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｒ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列；
   （Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異を有するアミノ酸配列；又は
   （Ｃ１）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異を有するアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ前記Ｒ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異を有するアミノ酸配列。
2. 前記ポリエチレンテレフタレート加水分解活性のｐＨ７．０における至適温度が６０．０℃超である、請求項１に記載のタンパク質。
3. 融解温度が７０．０℃以上である、請求項１又は２に記載のタンパク質。
4. 前記ポリエチレンテレフタレート加水分解活性が、カルシウムイオン非依存性である、請求項１～３のいずれか１項に記載のタンパク質。
5. ｐＨ７．０において、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質よりも高いポリエチレンテレフタレート加水分解活性を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のタンパク質。
6. 前記Ｒ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異の箇所の２つのシステイン残基がジスルフィド結合を形成する、請求項１～５のいずれか１項に記載のタンパク質。
7. 以下のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のタンパク質。
   （Ａ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ及びＧ６２Ｃの変異を有するアミノ酸配列；
   （Ｂ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、及びＴ２７０Ｐの変異を有するアミノ酸配列；又は
   （Ｃ）配列番号１のアミノ酸配列に対してＲ２０Ｃ、Ｇ６２Ｃ、Ｓ１２９Ｐ、Ｔ２７０Ｐ、Ｇ１５３Ａ、Ｅ８３Ｋ、及びＦ７８Ｒの変異を有するアミノ酸配列。
8. 請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
9. 請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
10. 請求項９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
11. 請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、ポリエチレンテレフタレート分解用組成物。
12. 請求項１～７のいずれか１項に記載のタンパク質によりポリエチレンテレフタレートを分解することを含む、リサイクル品の製造方法。

Images