JP2023038024A - Ａβ産生抑制ペプチドおよびこれを含有する医薬組成物、飲食品 - Google Patents

Abstract

【課題】β-セクレターゼおよびγ-セクレターゼを直接の標的とせず、Aβの凝集体形成に関連する新しい過程を標的として、Aβの産生・放出を阻害することができるAβ産生抑制ペプチドと、これを含む医薬組成物および飲食品を提供する。【解決手段】Aβ産生抑制ペプチドは、ある特定のアミノ酸配列からなるペプチドモチーフを２以上含む多価ペプチドである。Aβ産生抑制ペプチドは、前記ペプチドモチーフを４つ含む４価ペプチドであってよい。【選択図】なし

Description

本発明は、Aβ産生抑制ペプチドおよびこれを含有する医薬組成物、飲食品に関する。

アルツハイマー病（AD）は、記憶、学習能力の低下を主徴とする神経変性疾患である。AD発症の初期において、アミロイドβ（Aβ）が脳に蓄積した凝集体がみられることから、脳内におけるAβの凝集がアルツハイマー病（AD）発症の原因と考えられている。このため、Aβの産生、凝集を抑制することは有効なAD治療戦略となり得ると考えられている。

Aβは、アミロイド前駆蛋白（APP）からβ-セクレターゼおよびγ-セクレターゼによる連続切断により産生される。すなわち、APPがβ-セクレターゼによって切断されてC99ペプチド（C99）が産生され、このC99がγ-セクレターゼによって切断されてAβ（Aβ40ならびにAβ42）が産生される。その後、産生されたAβは小胞輸送等により細胞外へと放出され不溶性の凝集体を形成する。従って、この一連の過程のいずれかを阻害することができればAβの凝集体形成を抑制できると考えられる。

これまでに、例えば、β-セクレターゼを直接の標的とした阻害剤として、CNP520（非特許文献１）が開発されている。また、γ-セクレターゼを直接の標的とした阻害剤として、Semagacestat（非特許文献２）が開発されている。

一方で、γ-セクレターゼには直接作用せず、基質であるC99に結合することによって結果的にγ-セクレターゼによるAβ産生を阻害するペプチドが開発されている（例えば、非特許文献３）。

特許第5718574号 特許第5897178号 特許第6422046号 特許第4744443号

Alzheimers Dement, 2019, 5, 216-227. N. Engl. J. Med., 2013, 369, 341-350. Nat. Commun., 2013, 4:2529. doi: 10.1038/ncomms3529

しかしながら、β-およびγ-セクレターゼがそれぞれAPP、C99以外にも複数の分子を生理的な基質としているため、非特許文献１、２のような従来の阻害剤においては、それらの分子の切断を阻害することによる副作用の発現が問題視されている。

一方、非特許文献３のペプチドについては、アルツハイマー病（AD）の治療効果として未だ十分に確立されたレベルには至っておらず、更なる検討が必要とされている。

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、β-およびγ-セクレターゼを直接の標的とせず、Aβの凝集体形成に関連する新しい過程を標的として、Aβの産生・遊離を阻害することができるAβ産生抑制ペプチドと、これを含む医薬組成物、飲食品を提供することを課題としている。

上記の課題を解決するため、本発明のAβ産生抑制ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドモチーフを２以上含む多価ペプチドであることを特徴としている。

本発明の医薬組成物は、Aβの凝集に起因する疾患の予防または治療のための医薬組成物であって、前記Aβ産生抑制ペプチドを含むことを特徴としている。

本発明の飲食品は、Aβの凝集に起因する疾患の予防または治療のための飲食品であって、前記Aβ産生抑制ペプチドを含むことを特徴としている。

本発明のAβ産生抑制ペプチドによれば、β-およびγ-セクレターゼを直接の標的とせず、Aβの凝集体形成に関連する新しい過程を標的として、Aβの産生・遊離を阻害することができる。したがって、本発明のAβ産生抑制ペプチドは、Aβの凝集に起因する疾患（アルツハイマー病）の予防・治療のための医薬組成物などとして利用することができる。

本発明の医薬組成物および飲食品によれば、Aβの産生・遊離を阻害することにより、Aβの凝集に起因する疾患（アルツハイマー病）を予防・治療することができる。

多価型ペプチドの構造ならびにシート上に合成された多価型ペプチドの構造を示した概要図である。 １次スクリーニングの結果を示した図である。図２に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成した。本シートを10 microgram/mlのビオチン化Aβ1-28存在下、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、アビジンHRPを用いて発色させ、結合したAβ1-28を検出した。 ２次スクリーニングの結果を示した図である。図３に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、１次スクリーニングと同様の検討を行った。 ３次スクリーニングの結果を示した図である。図４に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、１次、２次スクリーニングと同様の検討を行った。 ４次スクリーニング（I系統）の結果を示した図である。図５に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、１～３次スクリーニングと同様の検討を行った。 ４次スクリーニング（II系統）の結果を示した図である。図６に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、１～３次スクリーニングと同様の検討を行った。 ５次スクリーニング（I系統）の結果を示した図である。図７に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、１～４次スクリーニングと同様の検討を行った。 ５次スクリーニング（II系統）の結果を示した図である。図８に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、１～４次スクリーニングと同様の検討を行った。 ６次スクリーニング（Ia系統）の結果を示した図である。図９に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、１～５次スクリーニングと同様の検討を行った。 ６次スクリーニング（Ib系統）の結果を示した図である。図１０に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、１～５次スクリーニングと同様の検討を行った。 ６次スクリーニング（II系統）の結果を示した図である。図１１に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、１～５次スクリーニングと同様の検討を行った。 ７次スクリーニング（Ic, Id, Ie, If, IIa, IIb系統）の結果を示した図である。図１２に示す配列を４価で有するペプチドライブラリーをシート上にスポット合成し、１～６次スクリーニングと同様の検討を行った。 ４価型ランダムペプチドシートスクリーニング法を用いた、Aβ1-28高親和性結合モチーフの同定スキーム（１～７次スクリーニング）を示した図である。ライブラリー部（XXXXXXX）のランダマイズした７アミノ酸を示す。 同定したペプチドモチーフの配列とその４価体の名称を示した図である。 細胞外に放出されるAβ量に対する４価型ペプチドの阻害効果を示した図である。a)ヒトAPPを安定発現させたCHO細胞を、各４価型ペプチド（50μM）で48時間培養後、セルライセートのC99およびAβ量、ならびに培養液中のAβ量を、ヒトAβ N末断端特異的抗体82E1を用いて検出、定量した。b) 細胞内C99量に対する４価型ペプチドの効果を示している。c) 細胞内Aβ量に対する４価型ペプチドの効果を示している。d）細胞外に放出されるAβ量に対する４価型ペプチドの効果を示している。mean ± SE (n=3), *,p<0.05 vs (-) by Dunnett test LME-tetについて、クラスター効果を発揮してAβ40ならびにAβ42に結合することを示した図である。a) LME-tet (8.3μM)またはLME-mono (33μM)をELISA用プレートに固定し、各濃度のビオチン化Aβ1-28、Aβ40またはAβ42を結合させた。ビオチン化Aβ1-28の検出にはアビジンHRPを、Aβ40またはAβ42の検出は特異的抗体を用いたELISAにより行なった。mean ± SE (n=3)b) ヒトAPPを安定発現させたCHO細胞を、各濃度のLME-monoで48時間培養後、セルライセートのC99およびAβ量、ならびに培養液中のAβ量を、特異的抗体を用いて検出、定量した。LME-monoを使用する場合、LME-tetの４倍のモル濃度を使用すれば、ペプチド鎖のモル数を同じにすることができる。 mean ± SE (n=3), vs (-) by Dunnett test 神経細胞から放出されるAβ量に対する４価型ペプチドの阻害効果を示した図である。a-d) ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞を、LME-tet（25μM）あるいはLME-mono (100μM) で48時間培養した。セルライセートのC99（b）およびAβ量（c）、ならびに培養液中のAβ量（d）を、ヒトAβ N末特異的抗体6E10を用いて免疫沈降したのち、特異的抗体82E1を用いて検出、定量した。mean ± SE (n=3), vs (-) by Dunnett test LME-tetについて、APPに結合しβ-セクレターゼ活性を阻害することを示した図である。a) β-セクレターゼによる切断部位を有する、リコンビナントFlag標識APP633-685を基質とし、ヒト精製β-セクレターゼによる切断活性を検討した。各濃度のLME-monoあるいはLME-tet存在下で37℃、4時間反応を行い、反応液中の切断産物であるAβ33-Flagを、特異的抗体82E1を用いたウエスタンブロッティング法により解析した。mean ± SE (n=3), **,p<0.01,***,p<0.001, vs (-) by Dunnett test b) リコンビナントFlag標識C99を基質とし、ヒトγ-セクレターゼを発現させたHEK293ライセートによる切断活性を検討した。各濃度のLME-tet存在下で37℃、4時間反応を行い、反応液中の切断産物であるAβを、特異的抗体82E1を用いたウエスタンブロッティング法により解析した。mean ± SE (n=3), vs (-) by Dunnett test LME-tetについて、AD モデルマウスにおいて脳内Aβの蓄積量を減少させることを示した図である。6-8週齢のAPPNLGFマウスに、PBS (n=6)あるいはN末端アセチル化LME-tet(71 mg/kg) (n=7)を腹腔内投与1週間後に脳を摘出し、大脳皮質及び嗅球を回収した。ホモゲナイズ後、特異的抗体82E1を用いたウエスタンブロッティング法によりAβ量を定量した。各量の精製Aβを同時に用いて検量線を作成し、定量を行なった。各レーンは各個体由来のサンプルを示す。mean ± SE, *,p<0.05, by Man Witney U test

本発明者らは、Aβの配列が、APPならびにC99にも共通して存在することに着目し、Aβの部分領域であるAβ1-28（膜に埋まっていないAβのアミノ末端から28番目のLysまでの領域）をプローブとして用いて一連の高親和性ペプチドを取得し、取得したペプチドの中から細胞レベルでAβの産生・放出を阻害するペプチドを同定することができれば、新たな作用機構を有するAD治療薬として確立することができるとの着想を得た。さらに、このような高親和性ペプチドの取得にあたっては、APPならびにAβが多量体を形成しやすい性質を持つことに着目し、本発明者が独自に開発した多価型ペプチドシートスクリーニング法（特許文献１－３）を用いることが有効であると考えられた。

以下、本発明のAβ産生抑制ペプチド、医薬組成物および飲食品の一実施形態について説明する。

（Aβ産生抑制ペプチド）
本発明のAβ産生抑制ペプチドは、
配列番号１：Pro-Lys-Leu-Arg-Met-Lys-Glu（PKLRMKE）
のアミノ酸配列からなるペプチドモチーフを２以上含む多価ペプチドである。すなわち、本発明のAβ産生抑制ペプチドは、例えば、配列番号１で示されるペプチドモチーフを２つ含む２価体や、４つ含む４価体などの形態が含まれる。なかでも、本発明のAβ産生抑制ペプチドは、配列番号１で示されるペプチドモチーフを４つ含む４価ペプチドであることが好ましい。

本発明のAβ産生抑制ペプチドにおいて、多価ペプチドの形態および合成方法は、特に限定されない。具体的には、例えば、ペプチドの合成に関して、縮合や保護基の除去は、従来公知の方法に従って行うことができる。例えば、ペプチド固相合成法、Fmocペプチド合成法などを採用することができ、市販のペプチド合成器によって行うこともできる。

好ましくは、本発明者が既に提案しているシート上でのペプチド合成法（特許文献１）を考慮することができる。セルロースや樹脂などのシート上のアミノ基から、２価ペプチドの合成核構造または４価ペプチドの合成核構造を形成することができる。具体的には、例えば、Fmoc-Lys、Fmoc-Hisを使用して２価、４価の合成核構造を形成することができる。他のアミノ酸との相互作用等を考慮すると、Fmoc-Lysが好ましい。Fmoc Lysを導入して分岐点を設け、分岐点からのアミノ酸合成が２価となるように設計することができる。

また、４価の合成核構造を形成する場合、Fmoc-Lysを２回連続してペプチド合成することが考慮される。合成核構造は、２価または４価ペプチドを伸長させることができる構造であればよく、具体的に限定されない。

さらに、２価ペプチドや４価ペプチドには、スペーサーを適宜導入することもできる。は、スペーサーは具体的に限定されないが、例えば、Ahx（amino hexanoic acid [NH₂-(CH₂)₅-COOH]）を例示することができる。また、合成ペプチドの切り出しには、例えばトリフルオロ酢酸などを適宜利用することができる。

また、本発明のAβ産生抑制ペプチドが４価ペプチドの形態である場合、３つのリジン（Lys）が結合して形成された以下の分子核構造（化学式１）、

の端部に位置する４つのアミノ基の各々に、配列番号１のペプチドモチーフが、直接またはスペーサーを介して結合している４価ペプチドを例示することができる。

より好ましい一実施形態としては、例えば、以下の化学式２において、３つのリジン（Lys）からなる分子核構造の端部に位置する４つのXXXX部のそれぞれに、上記（Ａ）または（Ｂ）のいずれかのペプチドが組み込まれた４価ペプチドが例示される。

なお、上記化学式２では、配列番号１のペプチドモチーフが組み込まれる位置を便宜的に「XXXX」と記載している。 また、上記化学式２では、分子核構造の端部に位置する４つのアミノ基の各々に、スペーサーが結合している形態を例示しているが、スペーサーを介さず、４つのアミノ基の各々に、直接、配列番号１のペプチドモチーフを結合させることもできる。スペーサーを結合させる場合、APPへの結合性やβ-セクレターゼ活性阻害作用を損なわないものであればよく、具体的な分子、長さは限定されず、適宜設計することができる。スペーサーとしては、例えば、末端にアミノ酸を有する炭素数４～１０程度の鎖長のものが好ましく、特に上記化学式２中で示されているamino hexanoic acid [NH₂-(CH₂)₅-COOH]（アミノカプロン酸）を好ましく例示することができる。また、スペーサーに含まれるアミノ酸としては、例えば、アラニン（Ａ）を例示することができる。

この形態のAβ産生抑制ペプチド（４価ペプチド）も、例えば、ペプチド合成装置等を利用するなどの公知の方法によって作製することができる。例えば、化学式２の「XXXX」部に組み込まれる配列番号１のペプチドモチーフは、４価の核構造に順次アミノ酸を付加することにより合成できる。

また、Aβ産生抑制ペプチドは、化学式２のXXXX部に組み込まれたペプチドモチーフの各々の末端に修飾分子を有していてもよい。ペプチドの末端にNH₂が露出するとプラス電荷になることから、電荷調節の観点からは、各々の末端に、修飾分子として、電荷がない分子、さらには、疎水性の分子を結合させることも考慮される。また、例えば、本発明のAβ産生抑制ペプチドを含有する医薬組成物を経口投与する場合、消化管内でのプロテアーゼによる分解を抑えるための安定化を目的として、末端のNH_２をアセチル基により保護することもできる。このように、ペプチドモチーフの末端の修飾分子は、所望の効果に応じて適宜選択することができ、リン酸化、メチル化、アデニリル化、糖鎖付加などの修飾が加えられていてよい。さらに、Aβ産生抑制ペプチドは、例えば、ペプチドモチーフのC末端側またはN末端側に、１以上のアミノ酸を含むこともできる。

本発明のAβ産生抑制ペプチドは、クラスター効果（多価対多価の相互作用が形成されることによって結合親和性が著しく増強する現象）を発揮して、効率よく細胞内APPに結合し、β-セクレターゼ活性を阻害することによりC99の産生を阻害し、結果的にAβの産生・遊離を抑制することができる。また、本発明のAβ産生抑制ペプチドは、Aβの凝集体形成に関連する新しい過程を標的とするものであり、β-セクレターゼおよびγ-セクレターゼを直接の標的としていないため、これらが基質とする分子の切断を阻害することによる副作用のおそれがない。したがって、本発明のAβ産生抑制ペプチドは、Aβの凝集に起因する疾患の予防または治療のための医薬組成物などに利用することができる。

（医薬組成物）
本発明の医薬組成物は、Aβの凝集に起因する疾患の予防または治療のための医薬組成物であり、上述した本発明のAβ産生抑制ペプチドを含む。したがって、本発明の医薬組成物は、上述したようにAβの産生・遊離を抑制することができ、アルツハイマー病を予防または治療することができる。

本発明の医薬組成物は、有効成分としての本発明のAβ産生抑制ペプチドをそのまま用いてもよいし、薬学的に許容できる成分を加えて製剤化してもよい。

医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては、例えば注射剤、点滴剤、軟膏剤、吸入剤、坐剤等が挙げられる。

医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。このような担体としては、例えば、公知の賦形剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、界面活性剤、緩衝剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、溶剤、増粘剤、粘液溶解剤、湿潤剤、防腐剤などを例示することができる。

医薬組成物は、添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤などを例示することができる。

医薬組成物は、上述した担体や添加剤などを適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。

医薬組成物の投与量は、患者の体重や年齢、患者の症状、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。本発明のAβ産生抑制ペプチドをヒトに投与する場合の投与量は、症状、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与間隔、有効成分の種類、製剤の種類によって異なり、特に限定されないが、例えば、100μg～1000 mgを1回または数回に分けて投与することができる。

（飲食品）
本発明の飲食品（食品および飲料）は、Aβの凝集に起因する疾患の予防または治療のための飲食品であり、上述した本発明のAβ産生抑制ペプチドを含む。したがって、本発明の飲食品は、上述したようにAβの産生・遊離を抑制することができ、アルツハイマー病を予防または治療することができる。

飲食品としては、例えば、錠菓、錠剤、チュアブル錠、錠剤、粉剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤等の形態を有する健康飲食品（サプリメント、栄養補助食品、健康補助食品、栄養調整食品等）、清涼飲料、茶飲料、ゼリー飲料、スポーツ飲料、コーヒー飲料、炭酸飲料、野菜飲料、果汁飲料、醗酵野菜飲料、醗酵果汁飲料、発酵乳飲料（ヨーグルト等）、乳酸菌飲料、乳飲料、粉末飲料、ココア飲料、アルコール飲料、菓子、ゼリー等の形態を例示することができる
さらに、本発明の「飲食品」は、食品工学の分野において通常用いられる成分を含んでいてよい。具体的には、例えば、各種油脂（例えば、大豆油、コーン油、サフラワー油、オリーブ油等の植物油、牛脂、イワシ油等の動物油脂）、生薬（例えばロイヤルゼリー、人参等）、アミノ酸（例えばグルタミン、システイン、ロイシン、アルギニン等）、多価アルコール（例えばエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、糖アルコール、例としてソルビトール、エリスリトール、キシリトール、マルチトール、マンニトール等）、天然高分子（例えばアラビアガム、寒天、水溶性コーンファイバー、ゼラチン、キサンタンガム、カゼイン、グルテン又はグルテン加水分解物、レシチン、澱粉、デキストリン等）、ビタミン（例えばビタミンＣ、ビタミンＢ群等）、ミネラル（例えばカルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄等）、食物繊維（例えばマンナン、ペクチン、ヘミセルロース等）、界面活性剤（例えばグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等）、精製水、希釈剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、湿潤剤、溶解補助剤、懸濁化剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、香料、酸化防止剤、甘味料、呈味成分、酸味料などを例示することができる。

飲食品の摂取量は、患者の体重や年齢、患者の症状、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。

本発明のAβ産生抑制ペプチドおよびこれを含有する医薬組成物、飲食品は、以上の実施形態に限定されるものではない。

以下、本発明について、実施例とともに説明するが、本発明のAβ産生抑制ペプチドおよびこれを含有する医薬組成物、飲食品は以下の実施例に何ら限定されるものではない。

（４価型ランダムペプチドシートスクリーニング法を用いた高親和性モチーフ同定技術の原理）
ニトロセルロースシート上に２価あるいは４価の多価型ペプチドライブラリーをシート合成する技術（特許文献１－３）を用い、以下に示す４価の多価型ペプチドライブラリーをシート上に合成する（図１）。
(ZXXXXXX-Ahx)₄-3Lys
ZはCysをのぞく19種類の固定アミノ酸、ＸはCysをのぞく19種類のアミノ酸のミクスチャー、Ahxはスペーサーの一例としてのカプロン酸を示す（基本構造は図１と同じ）。ここで、Ｚをposition1から7（図１）までずらしてゆくと、合計133(=19*7)種類のライブラリーをスポット合成することになる（１次ライブラリー）。このシートにビオチン標識Aβ1-28（カルボキシ末端にビオチン化Lysを導入してある）を結合させ、その結合活性を指標に最適アミノ酸とその固定位置（ここでは仮にXXXB₄XXXとする）を決定する。結合の検出にはアビジン化ペルオキシダーゼを用いた発色法を用いる。

次に、得られた情報に基づき、(ZXXB₄XXX- Ahx)₄-3Lysから構成される114(=19*6)種類をスポット合成する（２次ライブラリー）。同様の操作を行い、最適アミノ酸とその固定位置を決定する。以下同様のスクリーニングを繰り返し（Xが７個あるので７次ライブラリーまで行う）、全てのXについて最適アミノ酸を決定し、最適モチーフ、B₁B₂B₃B₄B₅B₆B₇を決定する。このスクリーニング法では、１ポジション毎に最適アミノ酸を決定してゆくため、アミノ酸シークエンス法によるモチーフ決定法（特許文献４）で問題となるリダンダンシーの問題がなく、かつ最終的に取得できる阻害モチーフを格段に増やすことができる。同定されたモチーフを多価型ペプチドライブラリーと同じ核構造に導入した４価のペプチド化合物が最終の阻害薬候補とすることができる。

＜実施例１＞４価型ランダムペプチドシートスクリーニング法を用いたAβ1-28高親和性モチーフの同定
（１次スクリーニング）
４価の１次ランダムペプチドライブラリー(ライブラリー部は、XXXXXXX-Ahx)がスポット合成されたシートを、ビオチン標識Aβ1-28でブロットすることにより、各ペプチドとの結合活性を評価した（図２、表１）。その結果、Aβ1-28への結合量は、６番目のポジションがLysの場合に最大であることを見出した。

（２次スクリーニング）
そこで、ライブラリー部にXXXXXKX-Ahxを有する、２次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った（図３、表２）。同様の解析により、Aβ1-28への結合量は、１番目のポジションがProの場合に最大であることを見出した。

（３次スクリーニング）
そこで、ライブラリー部にPXXXXKX-Ahxを有する、３次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った（図４、表３）。同様の解析により、Aβ1-28への結合量は、７番目のポジションがGluの場合に最大であることを見出した。さらに、多様性を担保するため別系統として、３番目のポジションがThrを持つものも採用した。

（４次スクリーニング）
そこで、ライブラリー部にPXXXXKE-Ahx（I系統）、PXTXXKX-Ahx（II系統）を有する、４次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った。その結果、I系統では２番目のポジションがLys（図５、表４）、II系統では２番目のポジションがLys（図６、表５）、をそれぞれ持つものが最も強く選択された。

（５次スクリーニング）
そこで、ライブラリー部にPKXXXKE-Ahx（I系統）、PKTXXKX-Ahx（II系統）を有する、５次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った。その結果、I系統では５番目のポジションがMet（図７、表６）、II系統では４番目のポジションがGlu（図８、表７）、をそれぞれ持つものが最も強く選択された。さらにI系統については多様性を担保するため別系統として、３番目のポジションがPheを持つものも採用した。

（６次スクリーニング）
そこで、ライブラリー部にPKXXMKE-Ahx（Ia系統）、PKFXXKE-Ahx（Ib系統）、PKTEXKX-Ahx（II系統）を有する、６次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った。その結果、Ia系統では3番目のポジションがLysを持つものが最も強く選択された。さらにIa系統については多様性を担保するため別系統として、４番目のポジションがArgを持つものも採用した（図９、表８）。Ib系統では４番目のポジションがLysを持つものが最も強く選択された。さらにIb系統については多様性を担保するため別系統として、４番目のポジションがArgを持つものも採用した（図１０、表９）。I I系統では５番目のポジションがLysを持つものが最も強く選択された。さらにII系統については多様性を担保するため別系統として、５番目のポジションがArgを持つものも採用した（図１１、表１０）。

（７次スクリーニング）
そこで、ライブラリー部にPKKXMKE-Ahx（Ic系統）、PKXRMKE-Ahx（Id系統）、PKFKXKE-Ahx（Ie系統）、PKFRXKE-Ahx（If系統）、PKTEKKX-Ahx（IIa系統）、PKTERKX-Ahx（IIb系統）、を有する、７次ライブラリーを作成し、同様の検討を行った。その結果、結合活性の強いもの15種を選択した（図１２、表１１、表１２）。

また、Ib系列のものはこの上位15種に含まれなかったので、別途IeならびにIf系統それぞれから上位2種を選択した。１次から７次スクリーニングの概要(図１３)ならびに最終的に選択されたモチーフ（図１４）を示す。

＜実施例２＞細胞内C99およびAβ量、ならびに細胞外Aβ量に対する各４価型ペプチドの効果
実施例１で取得した各ペプチドモチーフを図１、化学式２に示した分子核構造のライブラリー部（XXXXXXX）に組み入れた４価型ペプチドを作成した（図１４）。

ヒトAPPを安定発現させたCHO細胞を、各４価型ペプチド（50μM）で48時間培養後、セルライセートのC99およびAβ量、ならびに培養液中のAβ量を、特異的抗体を用いて検出、定量した。

その結果、いずれの４価型ペプチドも細胞内C99およびAβ量に対しては大きな影響を与えないが、細胞外に放出されるAβ量に対しては、LME-tetのみが顕著に減少させることが確認された（図１５a-d）。

図１４に示しているように、LME-tetは、３つのリジン（Lys）が結合して形成された分子核構造（図１、化学式２）のライブラリー部（XXXXXXX）に、
配列番号１：Pro-Lys-Leu-Arg-Met-Lys-Glu（PKLRMKE）
のアミノ酸配列からなるペプチドモチーフが４つ導入された４価ペプチドである。

＜実施例３＞Aβ1-28、Aβ40、Aβ42に対するLME-tetの結合性
LME-tetまたはLME-tetと同じペプチドモチーフ（PKLRMKE）を持つモノマー体(LME-mono)を用いて、Aβ1-28、Aβ40、Aβ42に対する結合活性をELISAにて測定した。

その結果、LME-tetはいずれに対しても親和性高く結合するのに対し、LME-monoはほとんど結合活性を示さないことが確認された（図１６a）。これらの結果は、LME-tetはクラスター効果を発揮してこれらの分子に高親和性で結合することを示している。さらに、LME-monoは、細胞内C99およびAβ量、細胞外に放出されるAβ量、いずれに対してもほとんど影響を与えない（図１６b）。このことから、LME-tetが細胞外へのAβ遊離を効率よく阻害するのは、多価型構造を取ることによってクラスター効果を発揮して機能しているためであることが示された。

同様の検討を神経細胞のモデルとして用いられる、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞で行なったところ、上記の結果と同様に、LME-tet処理の場合にのみ細胞外に放出されるAβが減少傾向にあることが確認された（図１７a-d）。

＜実施例４＞β-セクレターゼによるAPPの切断に対するLME-tetの阻害効果
APPがβ-セクレターゼによって切断されてC99が産生され、続いてC99がγ-セクレターゼによって切断されてAβ（Aβ40ならびにAβ42）が産生される。すなわち、APPならびにC99には、Aβ1-28、Aβ40、Aβ42の配列が含まれる。

このことから、
１）LME-tetはAPPに結合し、β-セクレターゼによる切断を阻害することによってC99の産生を抑制する可能性、あるいは、
２）LME-tetは、C99に結合し、γ-セクレターゼによる切断を阻害することによってAβの産生を抑制する可能性、
が考えられた。

そこで、β-セクレターゼによる切断部位を有する、リコンビナントFlag標識APP633-685を基質とし、ヒト精製β-セクレターゼによる切断活性に対するLME-monoあるいはLME-tetの阻害効果をインビトロで評価した。

その結果、LME-tet は効率よくβ-セクレターゼ活性を阻害すること、一方LME-monoはほとんど阻害活性を示さないことが確認された（図１８a）。そこで、リコンビナントFlag標識C99を基質とし、ヒトγ-セクレターゼを発現させたHEK293ライセートによる切断活性に対するLME-tetの効果を検討したところ、阻害活性は見られなかった（図１８b）。このことから、APP発現細胞内において、LME-tetは、クラスター効果を発揮して効率よくAPPに結合し、その後のβ-セクレターゼ活性を阻害することによりC99の産生を阻害し、結果的にAβの産生・遊離を抑制することが示された。

＜実施例５＞LME-tet によるADモデルマウスの脳内Aβ蓄積量の減少
AD モデルマウス（APPNLGFマウス）は、APPのAβ配列をヒト化し、さらに家族性AD 患者にみられる遺遺伝子変異 を導入しており、6週齢以降で脳内にAβの蓄積が観察され、2ヶ月齢で、AD 患者と同じAβ種の凝集体を形成する。6-8週齢の本マウスに、PBSあるいはLME-tet(71 mg/kg)を腹腔内投与1週間後に脳を摘出し、大脳皮質及び嗅球を回収した。ホモゲナイズ後、特異的抗体を用いたウエスタンブロッティング法によりAβ量を定量した。ここでは、LME-tetのN末端をアセチル化することでプロテアーゼによる分解を抑制し、生体内での安定性を高めたものを使用した。その結果、アセチル化LME-tet処理群では、コントロール群に比べ顕著に脳内のAβの蓄積量が減少することが確認された（図１９）。

（まとめ）
本発明者らは、４価型ランダムペプチドシートスクリーニング法を用い、Aβ1-28高親和性結合モチーフを19種同定した。さらに、同定したモチーフを４価型でもつ19種のペプチド性化合物のうち、LME-tetが強力にAβの細胞外遊離を阻害することを見出した。LME-tet はクラスター効果を発揮して効率よく細胞内APPに結合し、β-セクレターゼ活性を阻害することによりC99の産生を阻害し、結果的にAβの産生・遊離を抑制する。さらにAPPNLGFマウスにおいても、LME-tet は顕著に脳内Aβの蓄積量を減少させた。これまでAPPに結合し、β-セクレターゼ活性を阻害する分子の同定例はなく、LME-tetは、Aβ産生阻害薬、AD予防・治療薬などとしての高い独自性を有している。

Claims (7)

1. 配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドモチーフを２以上含む多価ペプチドであることを特徴とするAβ産生抑制ペプチド。
2. 前記ペプチドモチーフを４つ含む４価ペプチドであることを特徴とするAβ産生抑制ペプチド。
3. ３つのリジン（Lys）が結合して形成された、以下の化学式１で示される分子核構造：
   

   

   の端部に位置する４つのアミノ基の各々に、前記ペプチドモチーフが、直接またはスペーサーを介して結合している４価ペプチドであることを特徴とする請求項２のAβ産生抑制ペプチド。
4. 前記ペプチドモチーフのN末端に修飾分子を有することを特徴とする請求項１から３のいずれかのAβ産生抑制ペプチド。
5. Aβの凝集に起因する疾患の予防または治療のための医薬組成物であって、
   請求項１から４のいずれかのAβ産生抑制ペプチドを含むことを特徴とする医薬組成物。
6. 前記疾患が、アルツハイマー病であることを特徴とする請求項５の医薬組成物。
7. アルツハイマー病の予防または治療のための飲食品であって、
   請求項１から４のいずれかのAβ産生抑制ペプチドを含むことを特徴とする飲食品。

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