WO2024095906A1 - 神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物 - Google Patents

神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物 Download PDF

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WO2024095906A1
WO2024095906A1 PCT/JP2023/038829 JP2023038829W WO2024095906A1 WO 2024095906 A1 WO2024095906 A1 WO 2024095906A1 JP 2023038829 W JP2023038829 W JP 2023038829W WO 2024095906 A1 WO2024095906 A1 WO 2024095906A1
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composition
salt
cyclo
nervous system
cells
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PCT/JP2023/038829
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Inventor
シャンメイ ヨン
シャージャン リン
チンチン ヤオ
ダニエル チュンシン タン
寛之 加藤
義 古元
翔太 野中
Original Assignee
サントリーホールディングス株式会社
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or suppressing inflammation in nervous system cells.
  • Amyloid beta (A ⁇ ) is a type of protein produced in the brain. When amyloid beta aggregates and becomes oligomerized or fibrillated, it exhibits neurotoxicity. It is believed that the accumulation of such aggregated amyloid beta without being excreted from the brain triggers the onset of Alzheimer's disease. It is known that one of the mechanisms of onset of Alzheimer's disease is that amyloid ⁇ stimulates neural cells, promotes the production of inflammatory cytokines, and causes inflammation. Therefore, preventing or suppressing inflammation of nervous system cells is thought to be effective in preventing Alzheimer's disease or suppressing the progression of Alzheimer's disease, for example.
  • Patent Document 1 describes an agent that contains Cyclo(Gly-Pro) and that inhibits and/or improves cognitive decline.
  • the present invention aims to provide a composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells.
  • the present invention relates to the following compositions for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells, although the present invention is not limited thereto.
  • a composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells comprising Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof, and Cyclo(Leu-Lys) or a salt thereof as active ingredients.
  • composition according to any one of [1] to [3] above which inhibits activation of NF- ⁇ B induced by amyloid ⁇ .
  • composition according to any one of [1] to [4] above which prevents or ameliorates damage to nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • composition according to any one of [1] to [5] above, wherein the composition is for oral administration.
  • composition according to any one of [1] to [6] above, wherein the composition is a food, drink or pharmaceutical product.
  • composition according to any one of [1] to [7] above, which is labeled with one or more functions selected from the group consisting of "enhancing cognitive function,””suppressing cognitive decline,””maintaining good cognitive function,””enhancingmemory,””suppressing memory decline,””maintaining good memory,””enhancing memory accuracy,””preventing memory impairment,””improving memory impairment,””maintaining memory, which is part of cognitive function,””function suitable for those concerned about memory decline,””improving memory accuracy and judgment accuracy, which are part of cognitive function,””improving memory retention or integration,””maintaining enhanced cognitive function,””improving executive function,””promoting attention and concentration,””improving learning ability,””maintaining and improving orientation,””delaying cognitive decline associated with aging,””strengthening short-term and long-term memory,” and “promoting verbal and visuospatial memory.” [9] Use of Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof, and Cyclo(Leu-Lys
  • a composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells can be provided.
  • the composition of the present invention can be used as a food or drink, medicine, etc. for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells.
  • 1 is a graph showing GSH content and CAT and SOD activities in HT22 cells treated with 0.000504 mg/mL Cyclo(Val-Pro) or in the absence of Cyclo(Val-Pro) for 24 hours under stimulation of A ⁇ , where (a) shows GSH content, (b) shows CAT activity, and (c) shows SOD activity.
  • 2 is a graph showing the concentrations of IL-6, TNF- ⁇ , and IL-1 ⁇ in the culture medium of HT22 cells, where (a) shows the concentration of IL-6, (b) shows the concentration of TNF- ⁇ , and (c) shows the concentration of IL-1 ⁇ .
  • 4 is a graph showing the quantitative results of iNOS, ⁇ -actin, p-p65 NF- ⁇ B, p65 NF- ⁇ B, p-p38 MAPK, and p38 MAPK proteins in HT22 cells.
  • Fig. 4(a) shows the relative intensity of p-p65 NF- ⁇ B to p65 NF- ⁇ B
  • Fig. 4(b) shows the relative intensity of iNOS to ⁇ -actin
  • FIG. 13 is a heat map of KEGG pathway analysis performed to investigate pathways enriched upon A ⁇ treatment in HT22 cells. 1 shows photographs depicting the results of Western blot analysis of PI3K, p-PI3K, Akt, p-Akt, p-AMPK, and AMPK in HT22 cells.
  • FIG. 7 is a graph showing the quantitative results of p-PI3K, PI3K, p-Akt, Akt, p-AMPK, and AMPK proteins in HT22 cells, in which (a) shows the relative intensity of p-PI3K to PI3K, (b) shows the relative intensity of p-AMPK to AMPK, and (c) shows the relative intensity of p-Akt to Akt, all of which are expressed as values when the relative intensity in the control group is taken as 1.
  • 1 is a graph showing the quantification results (fluorescence intensity) of TUNEL-positive areas in HT22 cells. 1 shows micrographs showing the results of TUNEL fluorescent staining of HT22 cells.
  • 1 is a graph showing mRNA expression of BDNF, PSD-95, NCAM and Tr ⁇ B in HT22 cells. 1 shows photographs depicting the results of Western blot analysis of p-CREB, CREB, BDNF, and ⁇ -actin in HT22 cells. 12 is a graph showing the quantitative results of p-CREB, CREB, BDNF, and ⁇ -actin proteins in HT22 cells, in which (a) shows the relative intensity of p-CREB to CREB, and (b) shows the relative intensity of BDNF to ⁇ -actin, with the relative intensity in the control group taken as 1. 1 shows micrographs showing the results of MAP-2 fluorescent staining of HT22 cells (scale bar: 10 ⁇ m).
  • FIG. 14 is a graph showing quantification data of MAP-2 fluorescent staining in HT22 cells, with (a) showing the expression level (fluorescence intensity) of MAP-2 and (b) showing the average axon length. Photographs showing the results of Western blot analysis of p-PI3K, PI3K, p-Akt, Akt, cleaved caspase-3, caspase-3, p-CREB, CREB, BDNF, and ⁇ -actin in HT22 cells treated with the PI3K inhibitor LY294002 for 24 hours.
  • FIG. 16 is a graph showing the quantitative results of p-PI3K, PI3K, p-Akt, Akt, Cleaved caspase-3, caspase-3, p-CREB, CREB, BDNF, and ⁇ -actin proteins in HT22 cells treated for 24 hours with the PI3K inhibitor LY294002.
  • Fig. 16(a) shows the relative intensity of p-PI3K to PI3K
  • Fig. 16(b) shows the relative intensity of p-Akt to Akt
  • Fig. 16(c) shows the relative intensity of Cleaved caspase-3 to caspase-3
  • Fig. 16(d) shows the relative intensity of p-CREB to CREB
  • Fig. 16(a) shows the relative intensity of p-PI3K to PI3K
  • Fig. 16(b) shows the relative intensity of p-Akt to Akt
  • Fig. 16(c) shows the relative intensity of Cleaved caspase
  • 16(e) shows the relative intensity of BDNF to ⁇ -actin, all of which are expressed as values relative to the relative intensity in the control group taken as 1.
  • 13 is a photograph showing the results of Western blot analysis of p-AMPK, AMPK, cleaved caspase-3, caspase-3, p-CREB, CREB, BDNF, and ⁇ -actin in HT22 cells treated with the AMPK inhibitor BML-275 for 24 hours.
  • FIG. 18 is a graph showing the quantitative results of p-AMPK, AMPK, cleaved caspase-3, caspase-3, p-CREB, CREB, BDNF, and ⁇ -actin proteins in HT22 cells treated with the AMPK inhibitor BML-275 for 24 hours.
  • Fig. 18(a) shows the relative intensity of p-AMPK to AMPK
  • Fig. 18(b) shows the relative intensity of cleaved caspase-3 to caspase-3
  • Fig. 18(c) shows the relative intensity of p-CREB to CREB
  • Fig. 18(d) shows the relative intensity of BDNF to ⁇ -actin, all of which are expressed as values when the relative intensity in the control group is taken as 1.
  • FIG. 13 is a micrograph showing the results of TUNEL fluorescent staining of HT22 cells treated for 24 hours under stimulation with A ⁇ in the presence or absence of Cyclo(Val-Pro), Cyclo(Val-Pro) and a PI3K inhibitor, Cyclo(Val-Pro) and an AMPK inhibitor.
  • FIG. 13 is a graph showing the quantification results (fluorescence intensity) of TUNEL-positive areas in HT22 cells treated for 24 hours under stimulation with A ⁇ in the presence or absence of Cyclo(Val-Pro), Cyclo(Val-Pro) and a PI3K inhibitor, Cyclo(Val-Pro) and an AMPK inhibitor.
  • the composition for preventing or suppressing inflammation in nervous system cells of the present invention contains Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof, and Cyclo(Leu-Lys) or a salt thereof.
  • the composition for preventing or suppressing inflammation in nervous system cells of the present invention contains Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof, and Cyclo(Leu-Lys) or a salt thereof as active ingredients.
  • the composition for preventing or suppressing inflammation in nervous system cells of the present invention is sometimes referred to as the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention is used to prevent inflammation in nervous system cells and/or suppress inflammation in nervous system cells.
  • Cyclo(Phe-Phe) (cyclophenylalanylphenylalanine) is a cyclic dipeptide having a structure in which two molecules of phenylalanine are condensed and bonded
  • Cyclo(Leu-Lys) (cycloleucyllysine) is a cyclic dipeptide having a structure in which leucine and lysine are condensed and bonded.
  • Cyclo(Phe-Phe) and Cyclo(Leu-Lys) may be referred to as CFF and CLK, respectively.
  • cyclic dipeptide refers to a compound that is characterized by having amino acids as constituent units and has a diketopiperazine structure formed by dehydration condensation of the amino group of the N-terminal amino acid and the carboxyl group of the C-terminal amino acid. Note that as long as the amino acid composition of the cyclic dipeptide is the same, the order in which they are described does not matter; for example, Cyclo(Leu-Lys) and Cyclo(Lys-Leu) (cyclolysylleucine) represent the same cyclic dipeptide.
  • composition of the present invention may further contain at least one selected from the group consisting of Cyclo(Leu-Phe) (cycloleucylphenylalanine), Cyclo(Leu-Gln) (cycloleucylglutamine), Cyclo(Pro-Gly) (cycloprolylglycine), Cyclo(Val-Pro) (cyclovalinylproline), Cyclo(His-Pro) (cyclohistidylproline), and salts thereof, within a range that does not impair the preventive or suppressive effect of Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof, and Cyclo(Leu-Lys) or a salt thereof on inflammation of nervous system cells.
  • Cyclo(Leu-Phe) cycloleucylphenylalanine
  • Cyclo(Leu-Gln) cycloleucylglutamine
  • Cyclo(Pro-Gly) cycloprolylglycine
  • Cyclo(Val-Pro)
  • Cyclo(Leu-Phe), Cyclo(Leu-Gln), Cyclo(Pro-Gly), Cyclo(Val-Pro), and Cyclo(His-Pro) are cyclic dipeptides having a structure in which leucine and phenylalanine, leucine and glutamine, proline and glycine, valine and proline, and histidine and proline are condensed together, respectively.
  • Cyclo(Leu-Phe), Cyclo(Leu-Gln), Cyclo(Pro-Gly), Cyclo(Val-Pro), and Cyclo(His-Pro) may be referred to as CLF, CLQ, CPG, CVP, and CHP, respectively.
  • the composition of the present invention preferably further comprises Cyclo(Leu-Phe) (cycloleucylphenylalanine) or a salt thereof as an active ingredient.
  • the composition of the present invention preferably further comprises Cyclo(Leu-Gln) (cycloleucylglutamine) or a salt thereof as an active ingredient.
  • the composition of the present invention may contain CFF or a salt thereof, CLK or a salt thereof, and CLF or a salt thereof as active ingredients.
  • the composition of the present invention may contain, as active ingredients, CFF or a salt thereof, CLK or a salt thereof, and CLQ or a salt thereof.
  • a preferred embodiment of the present invention is a composition comprising at least one member selected from the group consisting of Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof, Cyclo(Leu-Lys) or a salt thereof, and Cyclo(Leu-Phe), Cyclo(Leu-Gln), and salts thereof.
  • the composition of the present invention is more preferably in a form containing CFF or a salt thereof, CLK or a salt thereof, CLF or a salt thereof, and CLQ or a salt thereof as active ingredients.
  • composition of the present invention further preferably contains, as active ingredients, CFF or a salt thereof, CLK or a salt thereof, CLF or a salt thereof, CLQ or a salt thereof, and further CPG or a salt thereof, CVP or a salt thereof, and CHP or a salt thereof.
  • a form in which the composition of the present invention contains these cyclic dipeptides or salts thereof is one of the preferred embodiments of the present invention.
  • the salt of a cyclic dipeptide such as CFF or CLK is not particularly limited as long as it is a pharmacologically acceptable salt or a salt acceptable for food or beverage, and may be either an acidic salt or a basic salt.
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate, and phosphate; organic acid salts such as acetate, citrate, maleate, malate, oxalate, lactate, succinate, fumarate, and propionate; and the like.
  • Examples of basic salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; and alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt.
  • the salt of a cyclic dipeptide can be easily prepared by a person skilled in the art by any method known in the art.
  • CFF, CLK, CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP and their salts are not particularly limited.
  • These cyclic dipeptides and their salts can be produced according to known methods.
  • These cyclic dipeptides and their salts may be derived from natural products, may be artificially synthesized, may be produced by an enzymatic method or a microbial fermentation method, or may be synthesized by dehydrating and cyclizing a linear dipeptide.
  • a peptide heat-treated product rich in cyclic dipeptides such as CFF, CLK, CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP, etc. can be obtained by heating a protein hydrolyzate such as collagen hydrolyzate.
  • CFF, CLK, CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP and their salts may be incorporated into the composition using a protein hydrolysate or its heat-treated product containing them, or a concentrate, dry powder or a product with a high degree of purification of the protein hydrolysate or its heat-treated product may be incorporated into the composition.
  • the composition of the present invention may contain, for example, a protein hydrolysate or its heat-treated product, and CFF, CLK, CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP and their salts may be part of the protein hydrolysate or its heat-treated product.
  • Commercially available products may also be used for CFF, CLK, CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP and their salts.
  • Amyloid ⁇ is a peptide that may also be called amyloid ⁇ protein, amyloid ⁇ peptide, or ⁇ amyloid.
  • Amyloid ⁇ is usually a peptide consisting of about 40 amino acids, and examples of such amyloid ⁇ include amyloid ⁇ 1-42 and amyloid ⁇ 1-40 .
  • the non-associated amyloid ⁇ may be called amyloid ⁇ monomer.
  • the amyloid ⁇ may form an aggregate of two or more amyloid ⁇ .
  • the amyloid ⁇ may form, for example, a soluble aggregate (amyloid ⁇ oligomer) in which two or more amyloid ⁇ molecules (for example, 2 to 50 amyloid ⁇ molecules) are aggregated.
  • amyloid ⁇ oligomer examples include amyloid ⁇ 1-42 oligomer and amyloid ⁇ 1-40 oligomer.
  • the amyloid ⁇ includes amyloid ⁇ in a non-associated state and amyloid ⁇ that has formed an aggregate such as an oligomer.
  • Amyloid ⁇ stimulates nervous system cells and activates NF- ⁇ B in those cells.
  • NF- ⁇ B is a transcription factor for genes that code for various inflammatory cytokines. Activation of NF- ⁇ B promotes the production of inflammatory cytokines, causing inflammation in nervous system cells. This causes damage to nervous system cells. Therefore, by inhibiting the activation of NF- ⁇ B induced by amyloid ⁇ in nervous system cells, the production of inflammatory cytokines can be suppressed, and inflammation of nervous system cells can be prevented or suppressed. Furthermore, by preventing or suppressing inflammation of nervous system cells, damage to nervous system cells can be prevented or ameliorated.
  • the composition of the present invention is preferably a composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • the composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells caused by amyloid beta may further contain at least one active ingredient selected from the group consisting of CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP, and salts thereof.
  • composition of the present invention comprising CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof has an inhibitory effect on NF- ⁇ B activation induced by amyloid ⁇ .
  • the compositions of the present invention can be used to prevent or suppress inflammation in nervous system cells by inhibiting activation of NF- ⁇ B.
  • the composition of the present invention can be used to prevent or ameliorate damage to nervous system cells caused by amyloid ⁇ by inhibiting the activation of NF- ⁇ B.
  • the present invention also encompasses a composition for inhibiting amyloid ⁇ -induced NF- ⁇ B activation, which comprises CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof.
  • the present invention also encompasses a composition for preventing or ameliorating damage to nervous system cells caused by amyloid ⁇ , comprising CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof.
  • the composition for inhibiting NF- ⁇ B activation induced by amyloid ⁇ , or the composition for preventing or ameliorating damage to nervous system cells caused by amyloid ⁇ may further comprise at least one selected from the group consisting of CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP, and salts thereof as an active ingredient.
  • the term "nervous system cells” refers to cells that constitute the nervous system, and refers to cells of ectoderm-derived tissues other than epidermal cells.
  • the above-mentioned nervous system cells are not particularly limited, but are preferably brain nervous system cells.
  • Examples of brain nervous system cells include glial cells such as microglia, oligodendrocytes, astrocytes, and ependymal cells, cerebellar Purkinje cells, raphe nucleus neurons, cerebral cortical neurons, hypothalamic neurons, thalamic neurons, brainstem neurons, and hippocampal neurons. Among these, glial cells are preferred, and microglia are more preferred.
  • the composition of the present invention can be used for the prevention or amelioration of a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells, preferably a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ , more preferably a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ in the brain.
  • a condition or disease can be a condition or disease caused by inflammation of nervous system cells.
  • Conditions or diseases caused by inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ in the brain can be, for example, neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (including Alzheimer's dementia), some mild cognitive impairment, etc.
  • composition of the present invention can be used to prevent or improve the above-mentioned conditions or diseases, and can be suitably used for the prevention of the above-mentioned conditions or diseases.
  • prevention of a condition or disease includes preventing onset, delaying onset, reducing the incidence, reducing the risk of onset, etc.
  • Amelioration of a condition or disease includes recovering a subject from a condition or disease, alleviating the symptoms of a condition or disease, ameliorating the symptoms of a condition or disease, delaying or preventing the progression of a condition or disease, etc.
  • Cognitive function is known to decline in Alzheimer's disease and mild cognitive impairment.
  • Symptoms of cognitive decline in Alzheimer's disease and mild cognitive impairment include, for example, memory decline, memory impairment (forgetfulness), aphasia (difficulty naming things), apraxia, agnosia (getting lost in a place that should be familiar, etc.), decline in orientation (ability to correctly recognize the situation in which one is placed, such as place, time, and people's names), decline in verbal and non-verbal learning ability, decline in auditory and visual processing, decline in executive function, executive dysfunction (inability to plan and carry out things), decline in concentration, decline in attention, decline in judgment, decline in spatial awareness, decline in cognitive flexibility, decline in information processing speed, etc.
  • the prevention of cognitive decline or improvement of cognitive function for example, the prevention or improvement of the above symptoms, can be obtained.
  • compositions of the present invention can be applied in either therapeutic (medical) or non-therapeutic (non-medical) applications, the latter being a concept that does not include medical procedures, i.e., surgery, treatment or diagnosis of humans.
  • the composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells of the present invention can be provided in the form of an agent, for example, but is not limited to this form.
  • the agent can be provided as a composition as it is, or as a composition containing the agent.
  • the composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells of the present invention can also be called an agent for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells.
  • the composition of the present invention is preferably an agent for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • composition for inhibiting NF- ⁇ B activation induced by amyloid ⁇ can also be referred to as an inhibitor of NF- ⁇ B activation induced by amyloid ⁇ .
  • composition for preventing or ameliorating damage to nervous system cells of the present invention can also be referred to as an agent for preventing or ameliorating damage to nervous system cells.
  • the composition of the present invention is preferably an agent for preventing or ameliorating damage to nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • the composition of the present invention may be for oral or parenteral use.
  • the composition of the present invention is preferably an oral composition.
  • the composition of the present invention may be in the form of, for example, a food or drink, a medicine, a quasi-drug, feed, etc., and is preferably a food or drink or a medicine.
  • the composition of the present invention may also be used by adding it to a food or drink, a medicine, a quasi-drug, feed, etc.
  • the form of the composition of the present invention is not particularly limited, and may be any of a solid form (for example, a powder, a granule, a tablet, etc.), a liquid form, a paste form, etc.
  • composition of the present invention contains CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof, and may further contain various diluents, acidulants, antioxidants, stabilizers, preservatives, flavorings, emulsifiers, colorants, seasonings, pH adjusters, nutritional enhancers, etc. that are permitted as additives to foods, beverages, medicines, etc.
  • various foods and drinks can be made by blending the above-mentioned cyclic dipeptide or its salt used as an active ingredient with ingredients that can be used in foods and drinks (e.g., food materials, food additives used as necessary, etc.).
  • the foods and drinks are not particularly limited, and examples include general foods and drinks, health foods, functional foods, foods for specified health uses, dietary supplements, foods for the sick, etc.
  • the above-mentioned health foods, functional foods, foods for specified health uses, dietary supplements, foods for the sick, etc. can be used in various formulation forms, such as liquids, fine granules, tablets, granules, powders, capsules, chewable agents, dry syrups, liquid diets, etc.
  • the above-mentioned cyclic dipeptide or its salt can be mixed with a pharmacologically acceptable carrier, additives added as necessary, etc. to produce a drug or quasi-drug in various dosage forms.
  • a pharmacologically acceptable carrier such as any pharmacologically acceptable carriers that can be used in drugs or quasi-drugs, and examples of such carriers, additives, etc. include one or more of excipients, binders, disintegrants, lubricants, antioxidants, colorants, etc.
  • Examples of the administration (ingestion) form of a drug or quasi-drug include oral or non-oral (transdermal, transmucosal, enteral, injection, etc.) administration forms.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is used as a drug or quasi-drug, it is preferable to use an oral drug or oral quasi-drug.
  • dosage forms for oral administration include liquids, tablets, powders, fine granules, granules, sugar-coated tablets, capsules, suspensions, emulsions, chewables, etc.
  • dosage forms for parenteral administration include, for example, injections, drops, ointments, lotions, patches, suppositories, nasal preparations, and pulmonary preparations (inhalants).
  • the pharmaceutical product may be a pharmaceutical product for non-human animals.
  • Feed also includes feed additives.
  • feed include livestock feed for cows, pigs, chickens, sheep, horses, etc.; small animal feed for rabbits, rats, mice, etc.; and pet food for dogs, cats, small birds, etc.
  • the method for producing it is not particularly limited, and it can be produced by a general method using the cyclic dipeptide or a salt thereof used as the active ingredient described above.
  • the composition of the present invention is preferably a liquid composition, and more preferably a beverage.
  • the beverage may be, for example, a functional beverage.
  • the form of the beverage is not particularly limited, and may be a packaged beverage.
  • the container for the packaged beverage is not particularly limited, and any container of any form and material may be used, and any commonly used container may be used, for example, metal containers such as aluminum cans and steel cans; resin containers such as PET bottles; paper containers such as paper cartons; glass containers such as glass bottles; and wooden containers such as barrels.
  • a packaged beverage is obtained by filling and sealing such a container with the beverage.
  • the total content (in terms of cyclic dipeptide) of CFF, CLK and salts thereof contained in the composition of the present invention is not particularly limited and can be set depending on the form, etc.
  • the total content of CFF, CLK, and salts thereof in the composition of the present invention may be, for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 6 % by weight or more, preferably 2 ⁇ 10 ⁇ 6 % by weight or more, more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 5 % by weight or more, even more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 4 % by weight or more, and particularly preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 3 % by weight or more.
  • the content is preferably 90% by weight or less, more preferably 50% by weight or less, even more preferably 10% by weight or less, even more preferably 1% by weight or less, even more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 1 % by weight or less, and particularly preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 2 % by weight or less.
  • the total content of CFF, CLK and salts thereof (in terms of cyclic dipeptide) in the composition of the present invention may be, for example, 1 ⁇ 10 -6 to 90 wt %, preferably 2 ⁇ 10 -6 to 90 wt %, more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 50 wt %, even more preferably 1 ⁇ 10 -4 to 10 wt %, and particularly preferably 1 ⁇ 10 -3 to 1 wt %.
  • the total content of CFF, CLK and salts thereof (in terms of cyclic dipeptide) in the composition of the present invention may be 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -1 wt%, preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, more preferably 2 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, and even more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -2 wt%.
  • the total content of CFF, CLK and salts thereof (in terms of cyclic dipeptide) in the composition of the present invention is preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -1 wt%, more preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, even more preferably 2 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, and particularly preferably 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -2 wt%.
  • CFF, CLK and salts thereof can be quantified by known methods, for example, liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS).
  • the amount in terms of cyclic dipeptide or an expression similar thereto means, in the case of a cyclic dipeptide such as CFF or CLK, the amount of the cyclic dipeptide, and in the case of a salt of a cyclic dipeptide, means the value obtained by multiplying the number of moles of the salt by the molecular weight of the corresponding cyclic dipeptide.
  • the amount converted into CFF can be calculated by multiplying the number of moles of the salt by the molecular weight of CFF.
  • the total content of CFF and its salts in the composition of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, 1 ⁇ 10 -6 to 45% by weight, preferably 1 ⁇ 10 -5 to 20% by weight, more preferably 1 ⁇ 10 -4 to 10% by weight, and even more preferably 1 ⁇ 10 -3 to 1% by weight.
  • the total content of CFF and salts thereof (CFF equivalent) in the composition of the present invention may be 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -1 wt%, preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, and more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -2 wt%.
  • the total content of CFF and salts thereof (CFF equivalent) in the composition of the present invention is preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -1 wt%, more preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, and even more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -2 wt%.
  • the total content of CLK and its salts in the composition of the present invention is not particularly limited, but may be, for example, 1 ⁇ 10 -6 to 45% by weight, preferably 1 ⁇ 10 -5 to 20% by weight, more preferably 1 ⁇ 10 -4 to 10% by weight, and even more preferably 1 ⁇ 10 -3 to 1% by weight.
  • the total content of CLK and salts thereof (as CLK) in the composition of the present invention may be 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -1 wt%, preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, and more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -2 wt%.
  • the total content of CLK and salts thereof (as CLK) in the composition of the present invention is preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -1 wt%, more preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, and even more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -2 wt%.
  • the composition of the present invention further contains at least one selected from the group consisting of CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP, and salts thereof
  • the total content of CFF, CLK, CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP, and salts thereof (in terms of cyclic dipeptide) in the composition of the present invention may be, for example, 1 ⁇ 10 -6 to 90 wt %, preferably 2 ⁇ 10 -6 to 90 wt %, more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 50 wt %, even more preferably 1 ⁇ 10 -4 to 10 wt %, and particularly preferably 1 ⁇ 10 -3 to 1 wt %.
  • the total content of CFF, CLK, CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP and salts thereof (in terms of cyclic dipeptide) in the composition of the present invention may be 1 ⁇ 10 ⁇ 6 to 1 ⁇ 10 ⁇ 1 wt %, preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 6 to 1 ⁇ 10 ⁇ 2 wt %, more preferably 2 ⁇ 10 ⁇ 6 to 1 ⁇ 10 ⁇ 2 wt %, and even more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 5 to 1 ⁇ 10 ⁇ 2 wt %.
  • the total content of CFF, CLK, CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP and salts thereof (converted into cyclic dipeptide) in the composition of the present invention is preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -1 wt %, more preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt %, even more preferably 2 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt %, and particularly preferably 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -2 wt %.
  • the total content of CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP and their salts in the composition of the present invention is preferably 0 to 20% by weight, more preferably 1 ⁇ 10 -6 to 15% by weight, even more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 10% by weight, still more preferably 1 ⁇ 10 -4 to 5% by weight, and particularly preferably 1 ⁇ 10 -3 to 1% by weight.
  • the total content of CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP and salts thereof (in terms of cyclic dipeptides) in the composition of the present invention may be 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -1 wt%, preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, and more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -2 wt%.
  • the composition of the present invention when the composition of the present invention is a liquid composition such as a beverage, the total content of CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP and salts thereof (in terms of cyclic dipeptides) in the composition of the present invention is preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -1 wt%, more preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, and even more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -2 wt%.
  • each cyclic dipeptide is not particularly limited, and each cyclic dipeptide may be contained in the same proportion or in different proportions.
  • the total content of CFF, CLK and their salts (in cyclic dipeptide equivalent) contained in the composition of the present invention is 5 to 85 wt%, more preferably 10 to 85 wt%, based on 100 wt% of the total content of the cyclic dipeptide and its salt (in cyclic dipeptide equivalent).
  • the total content of CFF and salts thereof (in terms of CFF) contained in the composition of the present invention is preferably 5 to 85% by weight, more preferably 5 to 80% by weight, based on the total content of cyclic dipeptides and salts thereof (in terms of cyclic dipeptides) of 100% by weight.
  • the total content of cyclic dipeptides and salts thereof contained in the composition of the present invention is taken as 100% by weight, and the total content of CLK and salts thereof (in terms of CLK) is preferably 5 to 85% by weight, and more preferably 5 to 80% by weight.
  • the composition of the present invention is preferably taken orally (administered orally).
  • the dosage (which can also be referred to as the intake amount) of the composition of the present invention is not particularly limited.
  • the dosage of the composition of the present invention may be any amount that provides a preventive or suppressive effect on inflammation of nervous system cells, and may be set appropriately depending on the dosage form, administration method, subject weight, etc.
  • the dosage of the composition of the present invention is preferably an amount that provides an inhibitory effect on NF- ⁇ B activation induced by amyloid ⁇ .
  • the dosage when the composition of the present invention is ingested or administered to a human (adult), the dosage is, in terms of the total dosage (in terms of cyclic dipeptide) of CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof, preferably 1 ⁇ g or more, more preferably 10 ⁇ g or more, even more preferably 150 ⁇ g or more, and preferably 1000 ⁇ g or less, more preferably 500 ⁇ g or less, even more preferably 300 ⁇ g or less per day.
  • the total dosage (in terms of cyclic dipeptide) of CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof is preferably 1 to 1000 ⁇ g, more preferably 10 to 500 ⁇ g, even more preferably 150 to 300 ⁇ g per day.
  • the composition of the present invention further comprises at least one selected from the group consisting of CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP, and salts thereof
  • the total dose (in cyclic dipeptide equivalent) of CFF, CLK, CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP, and salts thereof is preferably within the above range.
  • the total dose (in cyclic dipeptide equivalent) of CFF, CLK, CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP, and salts thereof is preferably 5 to 1000 ⁇ g, more preferably 20 to 500 ⁇ g, and even more preferably 160 to 300 ⁇ g per day for humans (adults). It is preferable to ingest or administer the above amount once or more times a day, for example, once or several times (for example, 2 to 3 times) a day. In one aspect, it is preferable to orally ingest or administer the above amounts of CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof.
  • the composition of the present invention may be an oral composition for ingesting or administering the above amounts of CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof per 60 kg of body weight per day to a human.
  • the composition of the present invention is preferably one that is continuously ingested or administered. By continuously ingesting or administering CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof, it is expected that a higher effect can be obtained.
  • the composition of the present invention is preferably continuously ingested or administered for preferably one week or more, more preferably four weeks or more, and even more preferably eight weeks or more. Cyclic dipeptides such as CFF and CLK and their salts can be ingested as foods and drinks, and from the standpoint of safety, it is believed that there are few problems with long-term intake, for example.
  • the subject to which the composition of the present invention is ingested or administered is not particularly limited, and is preferably a human or a non-human mammal, more preferably a human.
  • the subject of administration of the composition of the present invention includes a subject who needs or desires to prevent or suppress inflammation of nervous system cells, a subject who needs or desires to prevent or improve a condition or disease related to inflammation of nervous system cells, etc.
  • the subject of administration in the present invention includes middle-aged and elderly people. Middle-aged and elderly people include elderly people. Middle-aged and elderly people may be, for example, humans aged 40 years or older. In one embodiment, among middle-aged and elderly people, elderly people are preferred as the subject.
  • Elderly people may be, for example, humans aged 60 years or older or 65 years or older.
  • the subject of administration of the composition of the present invention may be a healthy person.
  • it can also be used for healthy people for the purpose of preventing inflammation of nervous system cells caused by amyloid beta in the brain, preventing Alzheimer's disease or mild cognitive impairment, etc.
  • composition of the present invention may be labeled with a function exhibited by preventing or suppressing inflammation of nervous system cells.
  • a label is also called a functional label.
  • the above label is not particularly limited. Examples of such labels include "enhancing cognitive function,”"suppressing cognitive function decline,”"maintaining good cognitive function,””enhancingmemory,””suppressing memory decline,””maintaining good memory,””enhancing memory accuracy,””preventing memory impairment,””improving memory impairment,””maintaining memory, which is part of cognitive function,””function suitable for those concerned about memory decline,””improving memory accuracy and judgment accuracy, which are part of cognitive function,””improving memory retention or integration,””maintaining cognitive function enhancement,””improving executive function,””promoting attention and concentration,””improving learning ability,””maintaining and improving orientation,””delaying cognitive decline associated with aging,””strengthening short-term and long-term memory,” and “promoting verbal and visuospatial memory,” as well as labels or functional labels that
  • the composition of the present invention is preferably a food or drink to which one or more of the above-mentioned indications are attached.
  • the above-mentioned indication may be an indication that the above-mentioned composition is used to obtain the above-mentioned function.
  • the indication may be attached to the composition itself, or to a container or packaging of the composition.
  • the present invention also encompasses the following methods and uses.
  • a method for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells comprising administering Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof, and Cyclo(Leu-Lys) or a salt thereof.
  • a method for inhibiting amyloid ⁇ -induced NF- ⁇ B activation which comprises administering Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof, and Cyclo(Leu-Lys) or a salt thereof.
  • a method for preventing or ameliorating damage to nervous system cells comprising administering Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof, and Cyclo(Leu-Lys) or a salt thereof.
  • Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof Use of Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof, and Cyclo(Leu-Lys) or a salt thereof for preventing or suppressing inflammation in nervous system cells.
  • the method may be a therapeutic or non-therapeutic method.
  • the use may be a therapeutic or non-therapeutic use.
  • Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof and Cyclo(Leu-Lys) or a salt thereof can be used to prevent and/or inhibit inflammation of nervous system cells.
  • Cyclo(Phe-Phe) or a salt thereof, and Cyclo(Leu-Lys) or a salt thereof can be used to prevent and/or suppress inflammation of nervous system cells by inhibiting amyloid ⁇ -induced NF- ⁇ B activation.
  • At least one selected from the group consisting of CLF, CLQ, CPG, CVP, CHP and salts thereof may be administered or used.
  • CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof at least once a day, for example, once to several times a day (for example, 2 to 3 times a day).
  • the above-mentioned use is preferably for use in humans or non-human mammals, more preferably in humans.
  • CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof can be used to prevent or ameliorate a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells by inhibiting activation of NF- ⁇ B induced by amyloid ⁇ .
  • the present invention also encompasses a method for preventing or ameliorating a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells, which comprises administering CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof.
  • CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof may be used in an amount (which may be referred to as an effective amount) that provides a preventive or suppressive effect on inflammation of nervous system cells.
  • the above-mentioned effective amount is preferably an amount that provides a preventive or suppressive effect on inflammation of nervous system cells.
  • the preferred dosage, administration method, and administration subjects of CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof are the same as those of the composition of the present invention described above.
  • CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof may be ingested or administered as is, or may be ingested or administered as a composition containing them.
  • the composition of the present invention may be ingested or administered.
  • CFF or a salt thereof, and CLK or a salt thereof can be used for the production of foods and beverages, pharmaceuticals, quasi-drugs, feeds, etc., which are used for preventing or suppressing inflammation in nervous system cells.
  • the present invention also includes the use of CFF or a salt thereof, and CLK or a salt thereof in the production of a composition for preventing or suppressing inflammation in nervous system cells.
  • the present invention also includes the use of CFF or a salt thereof, and CLK or a salt thereof in the production of a composition for inhibiting NF- ⁇ B activation induced by amyloid ⁇ .
  • CFF or a salt thereof and CLK or a salt thereof can be used for the manufacture of a composition for preventing or ameliorating a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells.
  • a composition for neuroprotection comprising Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof as an active ingredient.
  • a composition described in [A1] above which is a composition for preventing or ameliorating damage to nervous system cells caused by amyloid beta.
  • A3 The composition according to [A1] or [A2] above, wherein the composition is for oral administration.
  • A4 The composition according to any one of [A1] to [A3] above, wherein the composition is a food, drink, or pharmaceutical product.
  • the present inventors have found that the cyclic dipeptide cyclovalinylproline (Cyclo(Val-Pro)) or a salt thereof is effective in protecting nerves. This makes it possible to provide a composition for neuroprotection, etc.
  • the composition for neuroprotection disclosed herein can be used as a food or drink, medicine, etc. for protecting nerves.
  • the neuroprotective composition of the present disclosure contains Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof.
  • the neuroprotective composition contains Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof as an active ingredient.
  • the neuroprotective composition is used for protecting nerves.
  • Cyclo(Val-Pro) (cyclovalinylproline) is a cyclic dipeptide having a structure in which valine and proline are condensed. Cyclo(Val-Pro) is also referred to as CVP.
  • the term "cyclic dipeptide” refers to a compound that is characterized by having amino acids as constituent units and has a diketopiperazine structure formed by dehydration condensation of the amino group of the N-terminal amino acid and the carboxyl group of the C-terminal amino acid.
  • the salt of CVP is not particularly limited as long as it is a pharmacologically acceptable salt or a salt acceptable for food and beverages, and may be either an acidic salt or a basic salt.
  • acidic salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate, nitrate, and phosphate; organic acid salts such as acetate, citrate, maleate, malate, oxalate, lactate, succinate, fumarate, and propionate.
  • Examples of basic salts include alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt; and alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt. Salts of CVP can be easily prepared by those skilled in the art by any method known in the art.
  • CVP and its salts can be produced according to known methods.
  • CVP and its salts may be derived from natural products, may be artificially synthesized, may be produced by an enzymatic method or a microbial fermentation method, or may be synthesized by dehydrating and cyclizing a linear dipeptide.
  • a peptide heat-treated product rich in CVP can be obtained by heating a protein hydrolysate such as a collagen hydrolysate.
  • CVP and its salts may be incorporated into the neuroprotective composition using a protein hydrolysate or heat-treated product thereof containing CVP and its salts, or a concentrate, dry powder, or a product with a high degree of purification of the protein hydrolysate or heat-treated product thereof.
  • the neuroprotective composition may contain, for example, a protein hydrolysate or heat-treated product thereof, and CVP and its salts may be a part of the protein hydrolysate or heat-treated product thereof. Commercially available CVP and its salts may also be used.
  • the neuroprotective composition of the present disclosure can be used to protect nervous system cells.
  • Neuroprotection includes prevention or amelioration of nervous system cell injury, suppression of nervous system cell death (apoptosis or necrosis), and the like.
  • the neuroprotective composition can be used for protecting nerves from nervous system cell injury, nervous system cell death, and conditions or diseases involving nervous system cell injury or cell death, and the like. Preventing or ameliorating nervous system cell injury also contributes to suppressing nervous system cell degeneration.
  • the neuroprotective composition is a composition for protecting nervous system cells.
  • the neuroprotective composition is also a composition for preventing or ameliorating nervous system cell injury.
  • the composition for preventing or ameliorating nervous system cell injury is used to prevent nervous system cell injury and/or ameliorate nervous system cell injury.
  • the neuroprotective composition is also a composition for preventing or ameliorating nervous system cell injury caused by amyloid beta.
  • the composition for preventing or ameliorating nervous system cell injury caused by amyloid beta is used to prevent nervous system cell injury caused by amyloid beta and/or ameliorate nervous system cell injury caused by amyloid beta.
  • the neuroprotective composition is also a composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells.
  • the composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells is used for preventing inflammation of nervous system cells and/or suppressing inflammation of nervous system cells.
  • the neuroprotective composition is also a composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • the composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ is used for preventing inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ and/or suppressing inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • the neuroprotective composition is preferably a composition for preventing or ameliorating damage to nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • Amyloid ⁇ is a peptide that may also be called amyloid ⁇ protein, amyloid ⁇ peptide, or ⁇ amyloid.
  • Amyloid ⁇ is usually a peptide consisting of about 40 amino acids, and examples of such amyloid ⁇ include amyloid ⁇ 1-42 and amyloid ⁇ 1-40 .
  • the non-associated amyloid ⁇ may be called amyloid ⁇ monomer.
  • the amyloid ⁇ may form an aggregate of two or more amyloid ⁇ .
  • the amyloid ⁇ may form, for example, a soluble aggregate (amyloid ⁇ oligomer) in which two or more amyloid ⁇ molecules (for example, 2 to 50 amyloid ⁇ molecules) are aggregated.
  • amyloid ⁇ oligomer examples include amyloid ⁇ 1-42 oligomer and amyloid ⁇ 1-40 oligomer.
  • the amyloid ⁇ includes amyloid ⁇ in a non-associated state and amyloid ⁇ that has formed an aggregate such as an oligomer.
  • Amyloid ⁇ stimulates nervous system cells and changes gene expression related to AMPK signaling and/or PI3K-Akt signaling in the cells.
  • AMPK signaling is a major signaling pathway that regulates cellular energy homeostasis.
  • PI3K-Akt signaling is an important signaling pathway involved in the control of various cellular processes such as cell growth, proliferation, survival, and metabolism.
  • gene expression related to pathways related to AMPK signaling and/or PI3K-Akt signaling is changed, the production of inflammatory cytokines is promoted, causing inflammation in nervous system cells. This causes damage to nervous system cells.
  • CVP or a salt thereof can exert a neuroprotective effect via a pathway related to AMPK signaling and/or PI3K-Akt signaling.
  • CVP or a salt thereof can suppress the production of inflammatory cytokines and prevent or suppress inflammation of nervous system cells, for example, via a pathway related to AMPK signaling and/or PI3K-Akt signaling.
  • damage to nervous system cells can be prevented or ameliorated.
  • nerves can be protected by preventing or suppressing inflammation of nervous system cells and preventing or ameliorating damage to nervous system cells.
  • amyloid beta induces apoptosis in nervous system cells, which causes damage to the nervous system cells. Therefore, by inhibiting apoptosis of nervous system cells caused by amyloid beta, damage to nervous system cells can be prevented or ameliorated. Furthermore, by preventing or ameliorating damage to nervous system cells, nerves can be protected.
  • a neuroprotective composition containing CVP or a salt thereof has a neuroprotective effect, for example, via pathways related to AMPK signaling and/or PI3K-Akt signaling.
  • the neuroprotective composition can be used to prevent or suppress amyloid- ⁇ -induced inflammation of nervous system cells, for example, via pathways related to AMPK signaling and/or PI3K-Akt signaling.
  • the neuroprotective composition can be used to prevent or ameliorate damage to nervous system cells caused by amyloid ⁇ , for example, via pathways related to AMPK signaling and/or PI3K-Akt signaling.
  • a neuroprotective composition containing CVP or a salt thereof has the effect of suppressing apoptosis of nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • the neuroprotective composition can be used to prevent or ameliorate damage to nervous system cells caused by amyloid ⁇ by suppressing apoptosis of nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • a composition for inhibiting apoptosis of nervous system cells, comprising CVP or a salt thereof, is also disclosed in the present specification.
  • Nervous system refers to the central nervous system.
  • the term “nervous system cells” refers to cells that constitute the nervous system, and refers to cells of ectoderm-derived tissues other than epidermal cells.
  • Nervous system cells include nerve cells.
  • the above-mentioned nervous system cells are not particularly limited, but are preferably brain nervous system cells.
  • Examples of brain nervous system cells include glial cells such as microglia, oligodendrocytes, astrocytes, and ependymal cells, cerebellar Purkinje cells, raphe nucleus neurons, cerebral cortical neurons, hypothalamic neurons, thalamic neurons, brainstem neurons, and hippocampal neurons, etc.
  • preferred are neurons such as raphe nucleus neurons, cerebral cortical neurons, hypothalamic neurons, thalamic neurons, brainstem neurons, and hippocampal neurons, and more preferred are hippocampal neurons.
  • the neuroprotective composition can be used for the prevention or amelioration of a condition or disease associated with injury to nervous system cells, or a condition or disease associated with cell death of nervous system cells.
  • the neuroprotective composition can be used for the prevention or amelioration of a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells, preferably a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ , more preferably a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ in the brain.
  • a condition or disease can be a condition or disease caused by inflammation of nervous system cells.
  • Examples of a condition or disease caused by inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ in the brain include neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (including Alzheimer's dementia), some mild cognitive impairment, and the like.
  • the neuroprotective composition can be used to prevent or ameliorate the above-mentioned conditions or diseases, and can be suitably used for preventing the above-mentioned conditions or diseases.
  • prevention of a condition or disease includes preventing onset, delaying onset, reducing the incidence, reducing the risk of onset, etc.
  • Amelioration of a condition or disease includes recovering a subject from a condition or disease, alleviating the symptoms of a condition or disease, ameliorating the symptoms of a condition or disease, delaying or preventing the progression of a condition or disease, etc.
  • Symptoms of cognitive decline in Alzheimer's disease and mild cognitive impairment include, for example, memory decline, memory impairment (forgetfulness), aphasia (difficulty naming things), apraxia, agnosia (getting lost in a place that should be familiar, etc.), decline in orientation (ability to correctly recognize the situation in which one is placed, such as place, time, and people's names), decline in verbal and non-verbal learning ability, decline in auditory and visual processing, decline in executive function, executive dysfunction (inability to plan and carry out things), decline in concentration, decline in attention, decline in judgment, decline in spatial awareness, decline in cognitive flexibility, decline in information processing speed, etc.
  • the prevention of cognitive decline or improvement of cognitive function for example, the prevention or improvement of the above symptoms, can be obtained.
  • the neuroprotective composition may be applied in either therapeutic (medical) or non-therapeutic (non-medical) applications, the latter being a concept that does not include medical procedures, i.e., surgery, treatment or diagnosis of humans.
  • the neuroprotective composition can be provided in the form of an agent, for example, but is not limited to this form.
  • the agent can be provided as a composition as it is, or as a composition containing the agent.
  • the neuroprotective composition can also be referred to as a neuroprotective agent.
  • the composition for preventing or ameliorating damage to nervous system cells can also be referred to as an agent for preventing or ameliorating damage to nervous system cells.
  • the composition for preventing or suppressing inflammation in nervous system cells can also be referred to as an agent for preventing or suppressing inflammation in nervous system cells.
  • the neuroprotective composition may be for oral or parenteral use.
  • the neuroprotective composition is preferably an oral composition.
  • the neuroprotective composition may be in the form of, for example, a food or drink, a medicine, a quasi-drug, feed, etc., and is preferably a food or drink or a medicine.
  • the neuroprotective composition may also be added to a food or drink, a medicine, a quasi-drug, feed, etc.
  • the form of the neuroprotective composition is not particularly limited, and may be any of a solid form (for example, a powder, a granule, a tablet, etc.), a liquid form, a paste form, etc.
  • the neuroprotective composition contains CVP or a salt thereof, and may further contain various diluents, acidulants, antioxidants, stabilizers, preservatives, flavorings, emulsifiers, colorants, seasonings, pH adjusters, nutritional enhancers, etc. that are permitted as additives to foods, beverages, medicines, etc.
  • various foods and drinks can be made by blending CVP or a salt thereof used as the active ingredient with ingredients that can be used in foods and drinks (e.g., food materials, food additives used as necessary, etc.).
  • the foods and drinks are not particularly limited, and examples include general foods and drinks, health foods, functional foods, foods for specified health uses, dietary supplements, foods for the sick, etc.
  • the above health foods, functional foods, foods for specified health uses, dietary supplements, foods for the sick, etc. can be used in various formulation forms, such as liquids, fine granules, tablets, granules, powders, capsules, chewables, dry syrups, liquid diets, etc.
  • CVP or a salt thereof can be mixed with a pharmacologically acceptable carrier and additives added as necessary to produce a drug or quasi-drug in various dosage forms.
  • Such carriers, additives, etc. may be any pharmacologically acceptable carriers that can be used in drugs or quasi-drugs, and examples of such carriers, additives, etc. include one or more of excipients, binders, disintegrants, lubricants, antioxidants, colorants, etc.
  • Examples of the administration (ingestion) form of the drug or quasi-drug include oral or non-oral (transdermal, transmucosal, enteral, injection, etc.) administration forms.
  • dosage forms for oral administration include liquids, tablets, powders, fine granules, granules, sugar-coated tablets, capsules, suspensions, emulsions, chewables, etc.
  • dosage forms for parenteral administration include, for example, injections, drops, ointments, lotions, patches, suppositories, nasal preparations, and pulmonary preparations (inhalants).
  • the pharmaceutical product may be a pharmaceutical product for non-human animals.
  • CVP or a salt thereof may be blended into the feed.
  • Feed also includes feed additives. Examples of feed include livestock feed for cows, pigs, chickens, sheep, horses, etc.; small animal feed for rabbits, rats, mice, etc.; and pet food for dogs, cats, small birds, etc.
  • the manufacturing method is not particularly limited, and it can be manufactured by a general method using CVP or a salt thereof used as an active ingredient.
  • the neuroprotective composition is preferably a liquid composition, and more preferably a beverage.
  • the beverage may be, for example, a functional beverage.
  • the form of the beverage is not particularly limited, and may be a packaged beverage.
  • the container for the packaged beverage is not particularly limited, and any container of any form and material may be used, and any commonly used container may be used, for example, metal containers such as aluminum cans and steel cans; resin containers such as PET bottles; paper containers such as paper cartons; glass containers such as glass bottles; and wooden containers such as barrels.
  • a packaged beverage is obtained by filling and sealing such a container with the beverage.
  • the total content of CVP and its salts (in terms of CVP) contained in the neuroprotective composition is not particularly limited and can be set depending on the form, etc., and may be, for example, 1 ⁇ 10 -6 to 45% by weight, preferably 1 ⁇ 10 -5 to 20% by weight, more preferably 1 ⁇ 10 -4 to 10% by weight, and even more preferably 1 ⁇ 10 -3 to 1% by weight.
  • the total content of CVP and its salts (CVP equivalent) in the neuroprotective composition may be 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -1 wt%, preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, and more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -2 wt%.
  • the total content of CVP and its salts (CVP equivalent) in the neuroprotective composition is preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -1 wt%, more preferably 1 ⁇ 10 -6 to 1 ⁇ 10 -2 wt%, and even more preferably 1 ⁇ 10 -5 to 1 ⁇ 10 -2 wt%.
  • CVP and its salts can be quantified by known methods, for example, liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS).
  • amount converted into CVP or a similar expression means, in the case of CVP, the amount of CVP, and in the case of a salt of CVP, means a value obtained by multiplying the number of moles of the salt by the molecular weight of CVP.
  • the neuroprotective composition may contain other cyclic dipeptides as long as it contains CVP or a salt thereof.
  • the proportion of each cyclic dipeptide is not particularly limited, and each cyclic dipeptide may be contained in the same proportion or in different proportions.
  • the total content of CVP and its salt (CVP equivalent) contained in the neuroprotective composition is 5 to 85% by weight, more preferably 5 to 80% by weight, with the total content of the cyclic dipeptide and its salt (in cyclic dipeptide equivalent) being 100% by weight.
  • the neuroprotective composition is preferably taken orally (administered orally).
  • the dosage (which can also be referred to as the intake amount) of the neuroprotective composition is not particularly limited.
  • the dosage of the neuroprotective composition may be an amount that provides a neuroprotective effect, and may be appropriately set depending on the dosage form, administration method, subject weight, etc.
  • the dosage of the neuroprotective composition is preferably an amount that provides a recovery effect on the pathways related to AMPK signaling and/or PI3K-Akt signaling concentrated by amyloid beta.
  • the dosage of the neuroprotective composition is preferably an amount that provides an inhibitory effect on apoptosis of nervous system cells caused by amyloid beta.
  • the dosage when the neuroprotective composition is ingested or administered to a human (adult), the dosage is, in terms of the dosage of CVP or a salt thereof (CVP equivalent), preferably 1 ⁇ g or more, more preferably 10 ⁇ g or more, even more preferably 150 ⁇ g or more, and preferably 1000 ⁇ g or less, more preferably 500 ⁇ g or less, and even more preferably 300 ⁇ g or less per day.
  • the total dosage of CVP or a salt thereof (CVP equivalent) is preferably 1 to 1000 ⁇ g, more preferably 10 to 500 ⁇ g, and even more preferably 150 to 300 ⁇ g per day.
  • the composition for neuroprotection may be an oral composition for ingesting or administering the above amount of CVP or a salt thereof per 60 kg of body weight per day to a human.
  • the neuroprotective composition is preferably one that is continuously ingested or administered. By continuously ingesting or administering CVP or a salt thereof, it is expected that a higher effect can be obtained.
  • the neuroprotective composition is preferably continuously ingested or administered for preferably one week or more, more preferably four weeks or more, and even more preferably eight weeks or more.
  • CVP and its salts can be ingested as foods, beverages, etc., and from the standpoint of safety, it is believed that there are few problems with long-term intake, for example.
  • the subject to which the neuroprotective composition is ingested or administered is not particularly limited, and is preferably a human or a non-human mammal, more preferably a human.
  • the subject of administration of the neuroprotective composition may be a subject who needs or desires to prevent or improve damage to nervous system cells, a subject who needs or desires to prevent or inhibit inflammation of nervous system cells, a subject who needs or desires to prevent or improve a condition or disease accompanied by damage to nervous system cells, a subject who needs or desires to prevent or improve a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells, etc.
  • the subject of administration of the neuroprotective composition may be a middle-aged or elderly person. The middle-aged or elderly person includes elderly people.
  • the middle-aged or elderly person may be, for example, a human aged 40 years or older. In one embodiment, among the middle-aged or elderly people, elderly people are preferred as the subject.
  • the elderly person may be, for example, a human aged 60 years or older or 65 years or older.
  • the subject of administration of the neuroprotective composition may be a healthy person. For example, it may be used for a healthy person for the purpose of preventing damage to nervous system cells in the brain caused by amyloid beta, preventing inflammation of nervous system cells caused by amyloid beta, preventing Alzheimer's disease or mild cognitive impairment, etc.
  • the neuroprotective composition may be labeled with a function exhibited by neuroprotection.
  • a label is also called a functional label.
  • the above label is not particularly limited. Examples of such labels include one or more functions selected from the group consisting of "enhancing cognitive function,”"suppressing cognitive function decline,”"maintaining good cognitive function,””enhancingmemory,””suppressing memory decline,””maintaining good memory,””enhancing memory accuracy,””preventing memory impairment,””improving memory impairment,””maintaining memory, which is part of cognitive function,””function suitable for those concerned about memory decline,””improving memory accuracy and judgment accuracy, which are part of cognitive function,””improving memory retention or integration,””maintaining cognitive function enhancement,””improving executive function,””promoting attention and concentration,””improving learning ability,””maintaining and improving orientation,””delaying cognitive decline associated with aging,””strengthening short-term and long-term memory,” and “promoting verbal and visuospatial memory,” as well as
  • the neuroprotective composition is preferably a food or drink to which one or more of the above-mentioned indications are attached.
  • the above-mentioned indication may be an indication that the above-mentioned composition is used to obtain the above-mentioned function.
  • the indication may be attached to the composition itself, or to a container or packaging of the composition.
  • a method for neuroprotection comprising administering Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof.
  • a method for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells comprising administering Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof.
  • a method for preventing or ameliorating damage to nervous system cells comprising administering Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof.
  • Use of Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof for neuroprotection Use of Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof for preventing or suppressing inflammation in nervous system cells.
  • the method may be a therapeutic or non-therapeutic method.
  • the use may be a therapeutic or non-therapeutic use.
  • Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof can be used to prevent damage to nervous system cells caused by amyloid ⁇ and/or to ameliorate damage to nervous system cells caused by amyloid ⁇ . In one embodiment, Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof can be used to prevent and/or suppress inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ . In one aspect, Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof can be used to prevent injury to nervous system cells and/or ameliorate injury to nervous system cells via pathways related to AMPK signaling and/or PI3K-Akt signaling.
  • Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof can be used to prevent and/or suppress inflammation of nervous system cells via pathways related to AMPK signaling and/or PI3K-Akt signaling. In one embodiment, Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof can be used to prevent and/or ameliorate damage to nervous system cells by suppressing apoptosis of nervous system cells.
  • cyclic dipeptides or salts thereof may be administered or used in addition to CVP or a salt thereof.
  • CVP or a salt thereof can be used to prevent or ameliorate a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells via a pathway related to AMPK signaling and/or PI3K-Akt signaling.
  • a method for preventing or ameliorating a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells, which comprises administering CVP or a salt thereof, is also disclosed herein.
  • CVP or a salt thereof may be used in an amount (which may be referred to as an effective amount) that provides a neuroprotective effect.
  • the above-mentioned effective amount is preferably an amount that provides a neuroprotective effect.
  • the preferred dosage, administration method, and administration subjects of CVP or a salt thereof are the same as those of the neuroprotective composition of the present disclosure described above.
  • CVP or a salt thereof may be ingested or administered as it is, or may be ingested or administered as a composition containing it.
  • the above-mentioned neuroprotective composition may be ingested or administered.
  • CVP or a salt thereof can be used for the production of foods and beverages, pharmaceuticals, quasi-drugs, feeds, etc. used for neuroprotection.
  • the present specification also discloses the use of Cyclo(Val-Pro) or a salt thereof in the production of a composition for neuroprotection; and the use of CVP or a salt thereof in the production of a composition for preventing or ameliorating damage to nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • the present specification also discloses the use of CVP or a salt thereof in the production of a composition for preventing or suppressing inflammation of nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • the present specification also discloses the use of CVP or a salt thereof in the production of a composition for suppressing apoptosis of nervous system cells caused by amyloid ⁇ .
  • CVP or a salt thereof can be used for the manufacture of a composition for preventing or ameliorating a condition or disease associated with inflammation of nervous system cells.
  • a numerical range expressed by a lower limit and an upper limit includes the lower limit and the upper limit.
  • a range expressed by "1 to 2" means 1 to 2, including 1 and 2.
  • the upper and lower limits may be in any combination.
  • BV-2 mouse microglial cells (RRID: CVCL_0182, hereinafter also referred to as BV-2 microglia) were cultured in DMEM/F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum (very low endotoxin ( ⁇ 0.05 EU/mL)) and 1% penicillin-streptomycin. The culture was performed at 37°C in a humidified atmosphere of 5% CO2 and 95% air, and subculture was performed when the cell density reached 80% confluence (approximately every 2-3 days).
  • a ⁇ 42 Oligomers (A ⁇ 42 O) A ⁇ 1-42 peptide was dissolved in hexafluoroisopropanol (HFIP) at a concentration of 1 mM and incubated at room temperature for 30 min. The resulting A ⁇ 42 -HFIP solution was evaporated overnight and dried without heating to remove residual traces of HFIP and water, yielding A ⁇ 42 membranes. The A ⁇ 42 membranes were then reconstituted in DMSO to a concentration of 5 mM, vortexed for 30 s, and sonicated for 10 min using a bath sonicator. The resulting A ⁇ 42 -DMSO solution was diluted with ice-cold growth medium and stored at 4°C for 24 h before use.
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • BV-2 mouse microglial cells were seeded in a 96-well culture plate at a density of 25,000 cells/well and cultured with 100 ⁇ L/well of growth medium. 16 hours after seeding, a NanoLuc® reporter vector with an NF- ⁇ B response element was introduced using Lipofectamine® 3000 transfection reagent. 48 hours after transfection, A ⁇ 42 O and test compounds were added to prepare a growth medium and subjected to culture. The A ⁇ 42 O concentration in the growth medium was 20 ⁇ M, and the concentrations of the test compounds in Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 3 are as shown in Table 1.
  • Example 5 The test compounds and their concentrations in Example 5 were the same as those in Example 4, and the test compounds and their concentrations in Example 6 were CFF: 4.4 ⁇ g/mL, CLK: 34.4 ⁇ g/mL, CLF: 19 ⁇ g/mL, CLQ: 20.6 ⁇ g/mL, CPG: 15 ⁇ g/mL, CVP: 7.6 ⁇ g/mL, and CHP: 6.2 ⁇ g/mL. After 24 hours of incubation, the cells were lysed. NF- ⁇ B-driven luciferase activity was detected using the Nano-Glo® Luciferase Assay System.
  • the luciferase activities shown in Tables 2 and 3 are relative values of the luciferase activity when a test compound is used (fluorescence intensity of a reaction mixture containing a cell lysate treated with a test compound) when the control luciferase activity (fluorescence intensity of a control reaction mixture) is taken as 100.
  • HT22 cells (mouse hippocampal neuronal cell line) (Chuanqiu Biotechnology Co., Ltd.) were cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) containing 10% (vol/vol) fetal bovine serum (Chuanqiu Biotechnology Co., Ltd.) supplemented with 1% penicillin/streptomycin solution (Gibco) under a humidified atmosphere (5% CO 2 , 95% air, 37°C).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • fetal bovine serum Chuanqiu Biotechnology Co., Ltd.
  • penicillin/streptomycin solution Gibco
  • HT22 cells were treated with A ⁇ (10 ⁇ mol/L, Adooq BioScience) for 24 hours (A ⁇ treatment group).
  • a ⁇ treatment cells were cultured in a medium supplemented with A ⁇ .
  • Cyclo(Val-Pro) treatment group HT22 cells were treated with a combination of A ⁇ (10 ⁇ mol/L) and Cyclo(Val-Pro) (Bachem) for 24 hours.
  • cells in the Cyclo(Val-Pro) treatment group were cultured in a medium supplemented with A ⁇ and Cyclo(Val-Pro) (Cyclo(Val-Pro) concentration: 0.000504 mg/mL).
  • Cyclo(Val-Pro) concentration 0.000504 mg/mL
  • Cells in the control group were untreated with both A ⁇ and Cyclo(Val-Pro).
  • HT22 cells were treated with a combination of 10 ⁇ mol/L A ⁇ and 0.000504 mg/mL Cyclo(Val-Pro) in the presence of 20 ⁇ M PI3K inhibitor LY294002 (Adooq BioScience) or 10 ⁇ M AMPK inhibitor BML-275 (Adooq BioScience) for 24 hours.
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • ELISA and enzyme activity assays The activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and the amount of reduced glutathione (GSH) in HT22 cells were measured with the corresponding kits (Jiancheng Institute of Biotechnology Co., Ltd.). Cytokines in the culture medium, such as tumor necrosis factor ⁇ (TNF- ⁇ ), interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ) and IL-6, were measured with commercially available ELISA kits according to the manufacturer's instructions (Multi Sciences (Lianke) Biotech, Co., Ltd.).
  • HT22 cells were cultured on cover slips (size: 10 mm ⁇ 10 mm; thickness: 0.13-0.17 mm) in 24-well culture plates until they reached 70-80% confluence. The cells were fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) for 10 min at RT, permeabilized with 0.5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), and blocked with 5% FBS/PBS. Primary antibody against microtubule-associated protein-2 (MAP-2, HUABIO) was then added to the cells and incubated overnight at 4°C in a humid box.
  • PFA paraformaldehyde
  • MAP-2 microtubule-associated protein-2
  • Appropriate secondary antibodies (Alexa Fluor 488 and Alexa Fluor 594, Thermo Fisher Scientific) were applied to washed cells and incubated for 1 h at RT.
  • TUNEL staining coverslips were incubated in terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) reaction buffer for 10 min and further incubated in TdT reaction mixture for 1-2 h at 37-40°C in a humidified chamber. Coverslips were rinsed with stopwash buffer for 10 min and PBS-Tween 20 for 6 min.
  • coverslips were incubated with streptavidin-HRP in PBS for 20 min at room temperature, followed by incubation with 3,3'-diaminobenzidine (DAB) for 2 min.
  • DAB 3,3'-diaminobenzidine
  • Figure 1 is a graph showing the GSH content and CAT and SOD activities in HT22 cells treated with 0.000504 mg/mL Cyclo(Val-Pro) or in the absence of Cyclo(Val-Pro) for 24 hours under stimulation with A ⁇ .
  • Figure 1(a) shows the GSH content
  • Figure 1(b) shows the CAT activity
  • Figure 1(c) shows the SOD activity, respectively.
  • Antioxidant enzyme activities decreased by amyloid ⁇ (A ⁇ ) treatment were restored by Cyclo(Val-Pro) treatment ( Figure 1).
  • Figure 2 is a graph showing the concentrations of IL-6, TNF- ⁇ , and IL-1 ⁇ in the medium of HT22 cells.
  • Figure 2(a) shows the concentration of IL-6
  • Figure 2(b) shows the concentration of TNF- ⁇
  • Figure 2(c) shows the concentration of IL-1 ⁇ .
  • ELISA results showed that the concentrations of secreted IL-6, TNF- ⁇ , and IL-1 ⁇ cytokines were all increased by A ⁇ treatment but decreased by Cyclo(Val-Pro) treatment ( Figure 2).
  • Figure 3 is a photograph showing the results of Western blot analysis of inducible nitric oxide synthase (iNOS), ⁇ -actin, p65 NF- ⁇ B, p-p65 NF- ⁇ B (phosphorylated p65 NF- ⁇ B), p38 MAP kinase (MAPK), and p-p38 MAPK (phosphorylated p38 MAPK) in HT22 cells.
  • iNOS inducible nitric oxide synthase
  • ⁇ -actin ⁇ -actin
  • p65 NF- ⁇ B p-p65 NF- ⁇ B
  • p-p65 NF- ⁇ B phosphorylated p65 NF- ⁇ B
  • MAPK p38 MAP kinase
  • p-p38 MAPK phosphorylated p38 MAPK
  • Figure 4 is a graph showing the quantitative results of iNOS, ⁇ -actin, p-p65 NF- ⁇ B, p65 NF- ⁇ B, p-p38 MAPK, and p38 MAPK proteins in HT22 cells.
  • the quantitative results are shown as the relative intensity of p-p65 NF- ⁇ B to p65 NF- ⁇ B (ratio of signal intensity (protein amount) of bands in Western blot), the relative intensity of p-p38 MAPK to p38 MAPK, and the relative intensity of iNOS to ⁇ -actin.
  • Figure 4(a) shows the relative intensity of p-p65 NF- ⁇ B to p65 NF- ⁇ B
  • Figure 4(b) shows the relative intensity of iNOS to ⁇ -actin
  • Figure 4(c) shows the relative intensity of p-p38 MAPK to p38 MAPK, with the relative intensity in the control group taken as 1.
  • a ⁇ treatment significantly activated the phosphorylation of p65 NF- ⁇ B and p38 MAPK, and the amount of iNOS increased significantly, but all of these were attenuated by Cyclo(Val-Pro) treatment ( Figures 3 and 4).
  • Figure 5 shows the results of KEGG pathway analysis on the effects of Cyclo(Val-Pro).
  • Figure 5 is a heat map of KEGG pathway analysis performed to investigate pathways enriched by A ⁇ treatment in HT22 cells.
  • KEGG pathway analysis of these normally regulated genes revealed that A ⁇ treatment enriched pathways related to MAPK signaling, apoptosis, AMPK signaling, PI3K-Akt signaling, and NF- ⁇ B signaling, while Cyclo(Val-Pro) treatment significantly altered AMPK and PI3K-Akt signaling pathways (Figure 5).
  • the numerical values in Fig. 5 indicate the Enrichment Score (-Log10 (p value)). The Enrichment Score ranges from 0 to 32, and the higher the numerical value, the more the pathway is related to the effects of A ⁇ treatment and Cyclo(Val-Pro) treatment.
  • Figure 6 is a photograph showing the results of Western blot analysis of PI3K, p-PI3K (phosphorylated PI3K), Akt, p-Akt (phosphorylated Akt), p-AMPK and AMPK in HT22 cells.
  • Figure 7 is a graph showing the results of quantification of p-PI3K, PI3K, p-Akt, Akt, p-AMPK and AMPK proteins in HT22 cells.
  • the quantitative results are shown as the relative intensity of p-PI3K to PI3K (ratio of signal intensity (protein amount) of bands in Western blot), the relative intensity of p-Akt to Akt, and the relative intensity of p-AMPK to AMPK, respectively.
  • Figure 7(a) shows the relative intensity of p-PI3K to PI3K
  • Figure 7(b) shows the relative intensity of p-AMPK to AMPK
  • Figure 7(c) shows the relative intensity of p-Akt to Akt, with the relative intensity in the control group taken as 1.
  • a ⁇ treatment attenuated the phosphorylation of PI3K, Akt, and AMPK, but these changes were reversed by promoting the phosphorylation of these proteins with Cyclo(Val-Pro) ( Figures 6 and 7).
  • Figure 8 is a graph showing the quantification results (fluorescence intensity) of TUNEL-positive areas in HT22 cells.
  • Figure 9 is a micrograph showing the results of TUNEL fluorescent staining of HT22 cells. The nuclei of TUNEL-positive (apoptotic) cells appeared green. TUNEL staining revealed that the apoptotic cells increased by A ⁇ were reduced by Cyclo(Val-Pro) ( Figures 8 and 9). The results shown in Figure 8 are shown as relative intensity, with the fluorescence intensity of the control group set at 1.
  • FIG. 10 is a graph showing mRNA expression (relative mRNA amount) of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), postsynaptic density protein 95 (PSD-95), neural cell adhesion molecule (NCAM), and tropomyosin receptor kinase B (Tr ⁇ B) in HT22 cells.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • PSD-95 postsynaptic density protein 95
  • NCAM neural cell adhesion molecule
  • Tr ⁇ B tropomyosin receptor kinase B
  • FIG 11 is a photograph showing the results of Western blot analysis of cAMP response element binding protein (CREB), p-CREB (phosphorylated CREB), BDNF and ⁇ -actin in HT22 cells.
  • Figure 12 is a graph showing the results of quantification of p-CREB, CREB, BDNF and ⁇ -actin proteins in HT22 cells.
  • the quantitative results are shown as the relative intensity of p-CREB to CREB (ratio of signal intensity (protein amount) of bands in Western blot) and the relative intensity of BDNF to ⁇ -actin, respectively.
  • Figure 12(a) shows the relative intensity of p-CREB to CREB
  • Figure 12(b) shows the relative intensity of BDNF to ⁇ -actin, each expressed as a value when the relative intensity in the control group is set to 1.
  • CREB phosphorylation and BDNF protein levels were also decreased by A ⁇ treatment, but increased by Cyclo(Val-Pro) treatment ( Figures 11 and 12).
  • Figure 13 is a photomicrograph showing the results of microtubule-associated protein 2 (MAP-2) fluorescent staining of HT22 cells (scale bar: 10 ⁇ m).
  • Figure 14 is a graph showing the quantification data of MAP-2 fluorescent staining in HT22 cells.
  • Figure 14(a) shows the expression level (fluorescence intensity) of MAP-2
  • Figure 14(b) shows the average axon length. Fluorescent immunostaining of MAP-2 revealed that A ⁇ treatment significantly reduced MAP-2 expression and average axon length, but both were increased by Cyclo(Val-Pro) treatment ( Figures 13 and 14).
  • DAPI represents a micrograph of cells stained with DAPI
  • MAP-2 represents a fluorescent immunostained photograph of MAP-2
  • Merge represents an image in which DAPI and MAP-2 are superimposed.
  • Figure 15 is a photograph showing the results of Western blot analysis of p-PI3K, PI3K, p-Akt, Akt, cleaved caspase-3, caspase-3, p-CREB, CREB, BDNF, and ⁇ -actin in HT22 cells treated for 24 hours with the PI3K inhibitor LY294002.
  • Figure 16 is a graph showing the quantitative results of p-PI3K, PI3K, p-Akt, Akt, cleaved caspase-3, caspase-3, p-CREB, CREB, BDNF, and ⁇ -actin proteins in HT22 cells treated for 24 hours with the PI3K inhibitor LY294002.
  • FIG. 16(a) shows the relative intensity of p-PI3K to PI3K
  • FIG. 16(b) shows the relative intensity of p-Akt to Akt
  • FIG. 16(c) shows the relative intensity of cleaved caspase-3 to caspase-3
  • FIG. 16(a) shows the relative intensity of p-PI3K to PI3K
  • FIG. 16(b) shows the relative intensity of p-Akt to Akt
  • FIG. 16(c) shows the relative intensity of cleaved caspase-3 to caspase-3
  • FIG. 16(d) shows the relative intensity of p-CREB to CREB
  • FIG. 16(e) shows the relative intensity of BDNF to ⁇ -actin, each of which is expressed as a value when the relative intensity in the control group is set to 1.
  • Treatment with a PI3K inhibitor not only inhibited the phosphorylation of PI3K/Akt by Cyclo(Val-Pro), but also eliminated the promotion of CREB phosphorylation and the decrease in cleaved caspase-3 by Cyclo(Val-Pro), and significantly reduced the induction of BDNF levels by Cyclo(Val-Pro) ( Figures 15 and 16).
  • Figure 17 is a photograph showing the results of Western blot analysis of p-AMPK, AMPK, cleaved caspase-3, caspase-3, p-CREB, CREB, BDNF and ⁇ -actin in HT22 cells treated for 24 hours with the AMPK inhibitor BML-275.
  • Figure 18 is a graph showing the quantitative results of p-AMPK, AMPK, cleaved caspase-3, caspase-3, p-CREB, CREB, BDNF and ⁇ -actin proteins in HT22 cells treated for 24 hours with the AMPK inhibitor BML-275.
  • FIG. 18(a) shows the relative intensity of p-AMPK to AMPK
  • FIG. 18(b) shows the relative intensity of cleaved caspase-3 to caspase-3
  • FIG. 18(c) shows the relative intensity of p-CREB to CREB
  • FIG. 18(a) shows the relative intensity of p-AMPK to AMPK
  • FIG. 18(b) shows the relative intensity of cleaved caspase-3 to caspase-3
  • FIG. 18(c) shows the relative intensity of p-CREB to CREB
  • PI3K-INH represents a PI3K inhibitor
  • CVP+PI3K-INH represents a CVP+PI3K-INH treatment group (treated with A ⁇ , Cyclo(Val-Pro) and a PI3K inhibitor).
  • AMPK-INH represents an AMPK inhibitor
  • CVP+AMPK-INH represents a CVP+AMPK-INH treatment group (treated with A ⁇ , Cyclo(Val-Pro) and an AMPK inhibitor).
  • Figure 19 is a photomicrograph showing the results of TUNEL fluorescent staining of HT22 cells treated for 24 hours with Cyclo(Val-Pro), Cyclo(Val-Pro) and a PI3K inhibitor, Cyclo(Val-Pro) and an AMPK inhibitor, or in the absence of these, under stimulation with A ⁇ .
  • the nuclei of TUNEL-positive (apoptotic) cells appeared green.
  • Figure 20 is a graph showing the quantitative results (fluorescence intensity) of the TUNEL-positive area in HT22 cells treated for 24 hours with Cyclo(Val-Pro), Cyclo(Val-Pro) and a PI3K inhibitor, Cyclo(Val-Pro) and an AMPK inhibitor, or in the absence of these, under stimulation with A ⁇ .
  • the anti-apoptotic effect of Cyclo(Val-Pro) was also reduced when PI3K/Akt or AMPK signaling was inhibited ( Figures 19 and 20).
  • PI3K-INH represents a PI3K inhibitor
  • AMPK-INH represents an AMPK inhibitor
  • CVP+PI3K-INH represents a CVP+PI3K-INH treatment group (treated with A ⁇ , Cyclo(Val-Pro) and a PI3K inhibitor)
  • CVP+AMPK-INH represents a CVP+AMPK-INH treatment group (treated with A ⁇ , Cyclo(Val-Pro) and an AMPK inhibitor).

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Abstract

本発明は、神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物等を提供することを目的とする。 本発明は、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩を有効成分として含む、神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物に関する。

Description

神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物
本発明は、神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物等に関する。
アミロイドβ（Ａβ）は、脳内で産生されるタンパク質の一種である。アミロイドβが凝集してオリゴマー化又は線維化すると、神経細胞毒性を示す。このような凝集したアミロイドβが脳から排出されずに蓄積することが、アルツハイマー病発症の引き金になると考えられている。
アルツハイマー病の発症のメカニズムの一つとして、アミロイドβが神経系細胞（Ｎｅｕｒａｌ　ｃｅｌｌ）を刺激し、炎症性サイトカインの産生を促進して炎症を引き起こすことが知られている。
従って、神経系細胞の炎症を予防又は抑制することは、例えば、アルツハイマー病の予防又はアルツハイマー病の進行の抑制に有効であると考えられる。
一方、環状ジペプチドが脳機能に影響を与えることが報告されている。特許文献１には、Ｃｙｃｌｏ（Ｇｌｙ－Ｐｒｏ）を含有する、認知機能の低下抑制及び／又は改善剤が記載されている。
特開２０２０－１９６６８６号公報
本発明は、神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物等を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究した結果、環状ジペプチドであるシクロフェニルアラニルフェニルアラニン（Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ））と、シクロロイシルリジン（Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ））との組み合わせが、神経系細胞の炎症の予防又は抑制に有効であることを見出した。
すなわち、本発明は、これに限定されるものではないが、以下の神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物等に関する。
〔１〕Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩を有効成分として含む、神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物。
〔２〕前記組成物は、更にＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｈｅ）又はその塩を有効成分として含む、上記〔１〕に記載の組成物。
〔３〕前記組成物は、更にＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｇｌｎ）又はその塩を有効成分として含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化を阻害する、上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の組成物。
〔５〕アミロイドβによる神経系細胞の傷害を予防又は改善する、上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の組成物。
〔６〕前記組成物は、経口用である、上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の組成物。
〔７〕前記組成物は、飲食品又は医薬品である、上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載の組成物。
〔８〕前記組成物は、「認知機能を高める」、「認知機能の低下を抑える」、「認知機能を良好に保つ」、「記憶力を高める」、「記憶力の低下を抑える」、「記憶力を良好に保つ」、「記憶の精度を高める」、「記憶障害を予防する」、「記憶障害を改善する」、「認知機能の一部である記憶力を維持する」、「記憶力の低下が気になる方に適した機能」、「認知機能の一部である記憶力の精度や判断の正確さを向上させる」、「記憶の保持又は統合を改善する」、「認知機能の強化を維持する」、「遂行機能を改善する」、「注意力と集中力を促進する」、「学習能力を改善する」、「見当識を維持・改善する」「加齢に伴う認知機能低下を遅延する」、「短期及び長期記憶を強化する」及び「言語的及び視空間記憶を促進する」からなる群より選択される１又は２以上の機能の表示を付されたものである、上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載の組成物。
〔９〕神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物の製造における、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩の使用。
本発明によれば、神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物等を提供することができる。本発明の組成物は、神経系細胞の炎症の予防又は抑制のための飲食品、医薬品等として使用することができる。
Ａβの刺激下において、０．０００５０４ｍｇ／ｍＬのＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）で、又は、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の不存在下で、２４時間処理したＨＴ２２細胞における、ＧＳＨの含有量並びにＣＡＴ及びＳＯＤの活性を示すグラフである。図１（ａ）はＧＳＨ含有量を、図１（ｂ）はＣＡＴ活性を、図１（ｃ）はＳＯＤ活性を、それぞれ示す。 ＨＴ２２細胞の培地におけるＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βの濃度を示すグラフである。図２（ａ）はＩＬ－６の濃度を、図２（ｂ）はＴＮＦ－αの濃度を、図２（ｃ）はＩＬ－１βの濃度を、それぞれ示す。 ＨＴ２２細胞中の、ｉＮＯＳ、β－アクチン、ｐ６５　ＮＦ－κＢ、ｐ－ｐ６５　ＮＦ－κＢ、ｐ３８　ＭＡＰＫ及びｐ－ｐ３８　ＭＡＰＫのウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。 ＨＴ２２細胞中の、ｉＮＯＳ、β－アクチン、ｐ－ｐ６５　ＮＦ－κＢ、ｐ６５　ＮＦ－κＢ、ｐ－ｐ３８　ＭＡＰＫ及びｐ３８　ＭＡＰＫのタンパク質の定量結果を示すグラフである。図４（ａ）は、ｐ６５　ＮＦ－κＢに対するｐ－ｐ６５　ＮＦ－κＢの相対強度を、図４（ｂ）は、β－アクチンに対するｉＮＯＳの相対強度を、図４（ｃ）は、ｐ３８　ＭＡＰＫに対するｐ－ｐ３８　ＭＡＰＫの相対強度を、コントロール群における相対強度を１とした場合の値として、それぞれ示す。 ＨＴ２２細胞において、Ａβ処理により濃縮された経路を調べるために行ったＫＥＧＧパスウェイ解析のヒートマップである。 ＨＴ２２細胞におけるＰＩ３Ｋ、ｐ－ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、ｐ－Ａｋｔ、ｐ－ＡＭＰＫ及びＡＭＰＫのウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。 ＨＴ２２細胞におけるｐ－ＰＩ３Ｋ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－Ａｋｔ、Ａｋｔ、ｐ－ＡＭＰＫ及びＡＭＰＫのタンパク質の定量結果を示すグラフである。図７（ａ）は、ＰＩ３Ｋに対するｐ－ＰＩ３Ｋの相対強度を、図７（ｂ）は、ＡＭＰＫに対するｐ－ＡＭＰＫの相対強度を、図７（ｃ）は、Ａｋｔに対するｐ－Ａｋｔの相対強度を、コントロール群における相対強度を１とした場合の値として、それぞれ示す。 ＨＴ２２細胞におけるＴＵＮＥＬ陽性領域の定量結果（蛍光強度）を示すグラフである。 ＨＴ２２細胞のＴＵＮＥＬ蛍光染色の結果を示す顕微鏡写真である。 ＨＴ２２細胞中のＢＤＮＦ、ＰＳＤ－９５、ＮＣＡＭ及びＴｒκＢのｍＲＮＡ発現を示すグラフである。 ＨＴ２２細胞中のｐ－ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。 ＨＴ２２細胞中のｐ－ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのタンパク質の定量結果を示すグラフである。図１２（ａ）は、ＣＲＥＢに対するｐ－ＣＲＥＢの相対強度を、図１２（ｂ）は、β－アクチンに対するＢＤＮＦの相対強度を、コントロール群における相対強度を１とした場合の値として、それぞれ示す。 ＨＴ２２細胞のＭＡＰ－２蛍光染色の結果を示す顕微鏡写真である（スケールバー：１０μｍ）。 ＨＴ２２細胞中のＭＡＰ－２蛍光染色の定量化データを示すグラフである。図１４（ａ）は、ＭＡＰ－２の発現量（蛍光強度）を、図１４（ｂ）は、平均軸索長を、それぞれ示す。 ＰＩ３Ｋ阻害剤のＬＹ２９４００２で２４時間処理したＨＴ２２細胞中のｐ－ＰＩ３Ｋ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－Ａｋｔ、Ａｋｔ、Ｃｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３、カスパーゼ－３、ｐ－ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。 ＰＩ３Ｋ阻害剤のＬＹ２９４００２で２４時間処理したＨＴ２２細胞中のｐ－ＰＩ３Ｋ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－Ａｋｔ、Ａｋｔ、Ｃｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３、カスパーゼ－３、ｐ－ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのタンパク質の定量結果を示すグラフである。図１６（ａ）は、ＰＩ３Ｋに対するｐ－ＰＩ３Ｋの相対強度を、図１６（ｂ）は、Ａｋｔに対するｐ－Ａｋｔの相対強度を、図１６（ｃ）は、カスパーゼ－３に対するＣｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３の相対強度を、図１６（ｄ）は、ＣＲＥＢに対するｐ－ＣＲＥＢの相対強度を、図１６（ｅ）は、β－アクチンに対するＢＤＮＦの相対強度を、コントロール群における相対強度を１とした場合の値として、それぞれ示す。 ＡＭＰＫ阻害剤のＢＭＬ－２７５で２４時間処理したＨＴ２２細胞中のｐ－ＡＭＰＫ、ＡＭＰＫ、Ｃｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３、カスパーゼ－３、ｐ－ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。 ＡＭＰＫ阻害剤のＢＭＬ－２７５で２４時間処理したＨＴ２２細胞中のｐ－ＡＭＰＫ、ＡＭＰＫ、Ｃｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３、カスパーゼ－３、ｐ－ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのタンパク質の定量結果を示すグラフである。図１８（ａ）は、ＡＭＰＫに対するｐ－ＡＭＰＫの相対強度を、図１８（ｂ）は、カスパーゼ－３に対するＣｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３の相対強度を、図１８（ｃ）は、ＣＲＥＢに対するｐ－ＣＲＥＢの相対強度を、図１８（ｄ）は、β－アクチンに対するＢＤＮＦの相対強度を、コントロール群における相対強度を１とした場合の値として、それぞれ示す。 Ａβの刺激下において、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＡＭＰＫ阻害剤の存在下、又はこれらの不存在下で、２４時間処理したＨＴ２２細胞の、ＴＵＮＥＬ蛍光染色の結果を示す顕微鏡写真である。 Ａβの刺激下において、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＡＭＰＫ阻害剤の存在下、又はこれらの不存在下で、２４時間処理したＨＴ２２細胞中の、ＴＵＮＥＬ陽性領域の定量結果（蛍光強度）を示すグラフである。
本発明の神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物は、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩を含む。本発明の神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物は、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩を有効成分として含む。本明細書中、本発明の神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物を、本発明の組成物ということもある。本発明の組成物は、神経系細胞の炎症を予防するため、及び／又は、神経系細胞の炎症を抑制するために使用されるものである。
Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）（シクロフェニルアラニルフェニルアラニン）は、フェニルアラニン２分子が縮合結合した構造を有する環状ジペプチドであり、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）（シクロロイシルリジン）は、ロイシン及びリジンが縮合結合した構造を有する環状ジペプチドである。本明細書中、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）を、それぞれ、ＣＦＦ、ＣＬＫと記載することもある。
本明細書において「環状ジペプチド」とは、アミノ酸を構成単位とすることを特徴とし、Ｎ末端側アミノ酸のアミノ基とＣ末端側アミノ酸のカルボキシル基とが脱水縮合することにより生成したジケトピペラジン構造を有する化合物をいう。なお、環状ジペプチドのアミノ酸構成が同じであれば、それらの記載順序はいずれが先でも構わなく、例えば、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）とＣｙｃｌｏ（Ｌｙｓ－Ｌｅｕ）（シクロリジルロイシン）とは同じ環状ジペプチドを表す。
本発明の組成物は、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩による神経系細胞の炎症の予防又は抑制効果を損なわない範囲において、更にＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｈｅ）（シクロロイシルフェニルアラニン）、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｇｌｎ）（シクロロイシルグルタミン）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）（シクロプロリルグリシン）、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）（シクロバリニルプロリン）、Ｃｙｃｌｏ（Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）（シクロヒスチジルプロリン）及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてもよい。
上記Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｈｅ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｇｌｎ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）は、それぞれ、ロイシン及びフェニルアラニン、ロイシン及びグルタミン、プロリン及びグリシン、バリン及びプロリン、ヒスチジン及びプロリンが縮合結合した構造を有する環状ジペプチドである。
本明細書中、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｈｅ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｇｌｎ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｇｌｙ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｈｉｓ－Ｐｒｏ）を、それぞれ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰと記載することもある。
本発明の組成物は、更にＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｈｅ）（シクロロイシルフェニルアラニン）又はその塩を有効成分として含むことが好ましい。
本発明の組成物はまた、更にＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｇｌｎ）（シクロロイシルグルタミン）又はその塩を有効成分として含むことが好ましい。
一態様において、本発明の組成物は、ＣＦＦ又はその塩、ＣＬＫ又はその塩、及び、ＣＬＦ又はその塩を有効成分として含むものであってよい。
また、別の一態様において、本発明の組成物は、ＣＦＦ又はその塩、ＣＬＫ又はその塩、及び、ＣＬＱ又はその塩を有効成分として含むものであってよい。
本発明の組成物が、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩、並びに、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｈｅ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｇｌｎ）及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含む形態は、本発明の好ましい実施形態の１つである。
本発明の組成物としてより好ましくは、ＣＦＦ又はその塩、ＣＬＫ又はその塩、ＣＬＦ又はその塩、及び、ＣＬＱ又はその塩を有効成分として含む形態である。
本発明の組成物はまた、ＣＦＦ又はその塩、ＣＬＫ又はその塩、ＣＬＦ又はその塩、ＣＬＱ又はその塩と、更にＣＰＧ又はその塩と、ＣＶＰ又はその塩と、ＣＨＰ又はその塩とを有効成分として含むことが更に好ましい。本発明の組成物がこれらの環状ジペプチド又はその塩を含む形態は、本発明の好ましい実施形態の１つである。
ＣＦＦ、ＣＬＫ等の環状ジペプチドの塩としては、薬理学的に許容される塩又は飲食品に許容される塩であれば特に限定されず、酸性塩及び塩基性塩のいずれであってもよい。酸性塩として、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。塩基性塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。環状ジペプチドの塩は、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に調製され得る。
ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩の由来及び製造方法は特に制限されない。これらの環状ジペプチド及びこれらの塩は、公知の方法に従って製造することができる。これらの環状ジペプチド及びこれらの塩は、天然物由来のものであってもよく、人工的に合成したものであってもよく、酵素法又は微生物発酵法により製造されてもよく、直鎖状ジペプチドを脱水及び環化させることによって合成されてもよい。例えば、コラーゲン加水分解物などのタンパク質加水分解物を加熱して、ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ等の環状ジペプチドを豊富に含むペプチド熱処理物を得ることができる。
ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩は、これを含むタンパク質加水分解物又はその熱処理物を使用して組成物に配合してもよいし、タンパク質加水分解物又はその熱処理物の濃縮物、乾燥粉末又は精製度を高めたものを使用して組成物に配合してもよい。本発明の組成物は、例えば、タンパク質加水分解物又はその熱処理物を含有し、ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩は、タンパク質加水分解物又はその熱処理物の一部であってもよい。ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩は、市販品を使用することもできる。
アミロイドβは、アミロイドβタンパク質、アミロイドβペプチド又はβアミロイドと呼ばれることもあるペプチドである。アミロイドβは、通常、４０個前後のアミノ酸からなるペプチドであり、アミロイドβ１－４２、アミロイドβ１－４０等が挙げられる。
非会合状態のアミロイドβは、アミロイドβモノマーと呼ばれることもある。アミロイドβは、２個以上で凝集体を形成していてもよい。アミロイドβは、例えば、アミロイドβが２個以上（例えば２～５０個）凝集した可溶性凝集体（アミロイドβオリゴマー）を形成していてもよい。アミロイドβオリゴマーとして、アミロイドβ１－４２オリゴマー、アミロイドβ１－４０オリゴマー等が挙げられる。アミロイドβには、非会合状態のアミロイドβ、及び、オリゴマー等の凝集体を形成しているアミロイドβが含まれる。
アミロイドβは神経系細胞を刺激し、当該細胞において、ＮＦ－κＢを活性化する。ＮＦ－κＢは、種々の炎症性サイトカインをコードする遺伝子の転写因子である。ＮＦ－κＢが活性化されることにより、炎症性サイトカインの産生が促進され、神経系細胞において炎症を引き起こす。これにより神経系細胞に傷害が生じる。
このため、神経系細胞において、アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化を阻害することにより、炎症性サイトカインの産生を抑制し、神経系細胞の炎症を予防又は抑制することができる。また、神経系細胞の炎症を予防又は抑制することにより、神経系細胞の傷害を予防又は改善することができる。
一態様において、本発明の組成物は、アミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物であることが好ましい。
一態様において、上記アミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物が、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として更に含むものであってよい。
ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩を含む本発明の組成物は、アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化の阻害作用を有する。
本発明の組成物は、ＮＦ－κＢの活性化を阻害することにより、神経系細胞の炎症を予防又は抑制するために使用することができる。
本発明の組成物は、ＮＦ－κＢの活性化を阻害することにより、アミロイドβにより生じる神経系細胞の傷害を予防又は改善するために使用することができる。
ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩を含む、アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化阻害用組成物も本発明に包含される。
ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩を含む、アミロイドβによる神経系細胞の傷害の予防又は改善用組成物も本発明に包含される。
一態様において、上記アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化阻害用組成物、又は、上記アミロイドβによる神経系細胞の傷害の予防又は改善用組成物が、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として更に含むものであってよい。
本発明において、「神経系細胞」とは、神経系を構成する細胞であり、外胚葉由来組織のうち表皮系細胞以外の細胞を表す。
上記神経系細胞としては特に限定されないが、脳神経系細胞であることが好ましい。
脳神経系細胞としては例えば、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞等のグリア細胞；小脳プルキンエ細胞、縫線核ニューロン、大脳皮質ニューロン、視床下部ニューロン、視床ニューロン、脳幹ニューロン及び海馬ニューロン等が挙げられる。中でも好ましくはグリア細胞であり、より好ましくはミクログリアである。
一態様において、本発明の組成物は、神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患、好ましくは、アミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患、より好ましくは、脳におけるアミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患の予防又は改善のために使用することができる。このような状態又は疾患として、神経系細胞の炎症に起因する状態又は疾患が挙げられる。脳におけるアミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症に起因する状態又は疾患として、例えば、アルツハイマー病（アルツハイマー型認知症を含む）等の神経変性疾患、一部の軽度認知障害等が挙げられる。
本発明の組成物は、上記の状態又は疾患を予防又は改善するために使用することができ、上記の状態又は疾患の予防に好適に使用することができる。
本明細書において、状態又は疾患の予防は、発症を防止すること、発症を遅延させること、発症率を低下させること、発症のリスクを軽減すること等を包含する。状態又は疾患の改善は、対象を状態又は疾患から回復させること、状態又は疾患の症状を軽減すること、状態又は疾患の症状を好転させること、状態又は疾患の進行を遅延させること、防止すること等を包含する。
アルツハイマー病及び軽度認知障害では、認知機能が低下することが知られている。アルツハイマー病、軽度認知障害における認知機能低下の症状として、例えば、記憶力低下、記憶障害（物忘れ）、失語（ものの名前が出にくくなる）、失行、失認（よく知っているはずの場所で道に迷う等）、見当識（場所、時間、人の名前など、自分が置かれた状況を正しく認識する能力）の低下、言語及び非言語学習能力の低下、聴覚及び視覚処理の低下、遂行機能低下、遂行機能障害（計画を立てて物事を行うことができなくなる）、集中力低下、注意力低下、判断力低下、空間認識力低下、認知柔軟性低下、情報処理速度低下等が挙げられる。神経系細胞の炎症を予防又は抑制することによって、認知機能低下の予防又は認知機能の改善効果、例えば、上記の症状の予防又は改善効果が得られることが期待できる。
本発明の組成物は、治療的用途（医療用途）又は非治療的用途（非医療用途）のいずれにも適用することができる。非治療的とは、医療行為、すなわち人間の手術、治療又は診断を含まない概念である。
本発明の神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物は、一例として、剤の形態で提供することができるが、本形態に限定されるものではない。当該剤をそのまま組成物として、又は、当該剤を含む組成物として提供することもできる。一態様において、本発明の神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物は、神経系細胞の炎症予防又は抑制剤ということもできる。一態様において、本発明の組成物は、アミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症予防又は抑制剤であることが好ましい。
アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化阻害用組成物は、アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化阻害剤ということもできる。一態様において、本発明の神経系細胞の傷害の予防又は改善用組成物は、神経系細胞の傷害の予防又は改善剤ということもできる。一態様において、本発明の組成物は、アミロイドβにより生じる神経系細胞の傷害の予防又は改善剤であることが好ましい。
本発明の組成物は、経口用又は非経口用のいずれであってもよい。本発明の組成物は、好ましくは経口用組成物である。本発明の組成物は、例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の形態とすることができ、飲食品又は医薬品が好ましい。本発明の組成物は、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等に添加して使用することもできる。本発明の組成物の形態は特に限定されず、固体状（例えば、粉末状、顆粒状、タブレット状等）、液状、ペースト状等のいずれであってもよい。
本発明の組成物は、ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩を含み、更に飲食品又は医薬品等への添加物として許容されている各種の希釈剤、酸味料、抗酸化剤、安定剤、保存料、香料、乳化剤、色素類、調味料、ｐＨ調整剤、栄養強化剤等が添加されていてもよい。
例えば、本発明の組成物を飲食品とする場合、有効成分として使用される上記環状ジペプチド又はその塩に、飲食品に使用可能な成分（例えば、食品素材、必要に応じて使用される食品添加物等）を配合して、種々の飲食品とすることができる。飲食品は特に限定されず、例えば、一般的な飲食品、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品、病者用食品等が挙げられる。上記健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品、病者用食品等は、例えば、液剤、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、ドライシロップ剤、流動食等の各種製剤形態として使用することができる。
本発明の組成物を医薬品又は医薬部外品とする場合、上記環状ジペプチド又はその塩に、薬理学的に許容される担体、必要に応じて添加される添加剤等を配合して、各種剤形の医薬品又は医薬部外品とすることができる。そのような担体、添加剤等は、医薬品又は医薬部外品に使用可能な、薬理学的に許容されるものであればよく、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤等の１又は２以上が挙げられる。医薬品又は医薬部外品の投与（摂取）形態としては、経口又は非経口（経皮、経粘膜、経腸、注射等）投与の形態が挙げられる。本発明の組成物を医薬品又は医薬部外品とする場合、経口用医薬品又は経口用医薬部外品とすることが好ましい。経口投与のための剤形としては、例えば、液剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、糖衣錠、カプセル剤、懸濁液、乳剤、チュアブル剤等が挙げられる。非経口投与のための剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）等が挙げられる。医薬品は、非ヒト動物用医薬であってもよい。
本発明の組成物を飼料とする場合には、上記環状ジペプチド又はその塩を飼料に配合すればよい。飼料には飼料添加剤も含まれる。飼料としては、例えば、牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料；ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料；犬、猫、小鳥等に用いるペットフードなどが挙げられる。
本発明の組成物を、例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等とする場合、その製造方法は特に限定されず、上記の有効成分として使用される環状ジペプチド又はその塩を用いて、一般的な方法により製造することができる。
一態様において、本発明の組成物は、液状組成物であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。飲料は、例えば、機能性飲料であってよい。飲料の形態は特に限定されず、容器詰飲料であってよい。容器詰飲料の容器は特に限定されず、いずれの形態及び材質の容器を用いてもよく、例えば、アルミ缶、スチール缶等の金属製容器；ペットボトル等の樹脂製容器；紙パック等の紙容器；ガラス瓶等のガラス製容器；樽等の木製容器等の通常用いられる容器のいずれも用いることができる。このような容器に飲料を充填及び密閉することにより、容器詰飲料が得られる。
本発明の組成物に含まれるＣＦＦ、ＣＬＫ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）は特に限定されず、その形態等に応じて設定することができる。
一態様において、本発明の組成物におけるＣＦＦ、ＣＬＫ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）は、例えば、１×１０－６重量％以上であってよく、２×１０－６重量％以上であることが好ましく、１×１０－５重量％以上であることがより好ましい。更に好ましくは１×１０－４重量％以上であり、特に好ましくは１×１０－３重量％以上である。また、上記含有量（環状ジペプチド換算）としては９０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましく、１０重量％以下が更に好ましく、１重量％以下が更により好ましく、１×１０－１重量％以下が一層好ましく、１×１０－２重量％以下が特に好ましい。一態様において、ＣＦＦ、ＣＬＫ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）は、例えば、本発明の組成物中に１×１０－６～９０重量％であってよく、２×１０－６～９０重量％が好ましく、１×１０－５～５０重量％がより好ましく、１×１０－４～１０重量％が更に好ましく、１×１０－３～１重量％が特に好ましい。
一態様において、ＣＦＦ、ＣＬＫ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）は、本発明の組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％であってよく、１×１０－６～１×１０－２重量％が好ましく、２×１０－６～１×１０－２重量％がより好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％が更に好ましい。一態様において、本発明の組成物が飲料等の液体組成物の場合は、ＣＦＦ、ＣＬＫ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）は、本発明の組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％が好ましく、１×１０－６～１×１０－２重量％がより好ましく、２×１０－６～１×１０－２重量％が更に好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％が特に好ましい。
ＣＦＦ、ＣＬＫ及びこれらの塩は、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）により公知の方法で定量することが可能である。
環状ジペプチド換算の量、又はこれに類する表現は、ＣＦＦ、ＣＬＫ等の環状ジペプチドの場合は、当該環状ジペプチドの量を意味し、環状ジペプチドの塩の場合は、当該塩のモル数に、対応する環状ジペプチドの分子量を乗じて得られる値を意味する。
例えば、ＣＦＦの塩の場合、ＣＦＦ換算の量は、当該塩のモル数にＣＦＦの分子量を乗じて求められる。
本発明の組成物中のＣＦＦ及びその塩の合計の含有量（ＣＦＦ換算）は特に制限されないが、例えば、１×１０－６～４５重量％であってよく、１×１０－５～２０重量％であることが好ましい。より好ましくは１×１０－４～１０重量％であり、更に好ましくは１×１０－３～１重量％である。
一態様において、ＣＦＦ及びその塩の合計の含有量（ＣＦＦ換算）は、本発明の組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％であってよく、１×１０－６～１×１０－２重量％が好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％がより好ましい。一態様において、本発明の組成物が飲料等の液体組成物の場合は、ＣＦＦ及びその塩の合計の含有量（ＣＦＦ換算）は、本発明の組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％が好ましく、１×１０－６～１×１０－２重量％がより好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％が更に好ましい。
本発明の組成物中のＣＬＫ及びその塩の合計の含有量（ＣＬＫ換算）は特に制限されないが、例えば、１×１０－６～４５重量％であってよく、１×１０－５～２０重量％であることが好ましい。より好ましくは１×１０－４～１０重量％であり、更に好ましくは１×１０－３～１重量％である。
一態様において、ＣＬＫ及びその塩の合計の含有量（ＣＬＫ換算）は、本発明の組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％であってよく、１×１０－６～１×１０－２重量％が好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％がより好ましい。一態様において、本発明の組成物が飲料等の液体組成物の場合は、ＣＬＫ及びその塩の合計の含有量（ＣＬＫ換算）は、本発明の組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％が好ましく、１×１０－６～１×１０－２重量％がより好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％が更に好ましい。
本発明の組成物が更にＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含む場合、ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）は、例えば、本発明の組成物中に、１×１０－６～９０重量％であってよく、２×１０－６～９０重量％であることが好ましく、１×１０－５～５０重量％であることがより好ましく、１×１０－４～１０重量％が更に好ましく、１×１０－３～１重量％が特に好ましい。
一態様において、ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）は、本発明の組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％であってよく、１×１０－６～１×１０－２重量％が好ましく、２×１０－６～１×１０－２重量％がより好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％が更に好ましい。一態様において、本発明の組成物が飲料等の液体組成物の場合は、ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）は、本発明の組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％が好ましく、１×１０－６～１×１０－２重量％がより好ましく、２×１０－６～１×１０－２重量％が更に好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％が特に好ましい。
本発明の組成物中のＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）としては０～２０重量％であることが好ましく、１×１０－６～１５重量％がより好ましく、１×１０－５～１０重量％が更に好ましく、１×１０－４～５重量％が一層好ましく、１×１０－３～１重量％が特に好ましい。
一態様において、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）は、本発明の組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％であってよく、１×１０－６～１×１０－２重量％が好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％がより好ましい。一態様において、本発明の組成物が飲料等の液体組成物の場合は、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）は、本発明の組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％が好ましく、１×１０－６～１×１０－２重量％がより好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％が更に好ましい。
本発明の組成物は、ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩が含まれる限り、各環状ジペプチドの割合は特に限定されず、各環状ジペプチドが同じ割合で含まれていてもよいし、異なる割合で含まれていてもよい。好ましくは、本発明の組成物に含まれる環状ジペプチド及びその塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）を１００重量％として、ＣＦＦ、ＣＬＫ及びこれらの塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）が５～８５重量％であり、より好ましくは、１０～８５重量％である。
一態様において、本発明の組成物に含まれる環状ジペプチド及びその塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）を１００重量％として、ＣＦＦ及びこれらの塩の合計の含有量（ＣＦＦ換算）が５～８５重量％であることが好ましく、５～８０重量％であることがより好ましい。
一態様において、本発明の組成物に含まれる環状ジペプチド及びその塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）を１００重量％として、ＣＬＫ及びこれらの塩の合計の含有量（ＣＬＫ換算）が５～８５重量％であることが好ましく、５～８０重量％であることがより好ましい。
本発明の組成物は、経口で摂取（経口投与）されることが好ましい。本発明の組成物の投与量（摂取量ということもできる）は特に限定されない。本発明の組成物の投与量は、神経系細胞の炎症の予防又は抑制効果が得られるような量であればよく、投与形態、投与方法、対象の体重等に応じて適宜設定すればよい。本発明の組成物の投与量は、アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化阻害効果が得られるような量であることが好ましい。
一態様において、本発明の組成物をヒト（成人）を対象に摂取させる又は投与する場合、その投与量は、ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩の合計の投与量（環状ジペプチド換算）として、１日あたり、好ましくは１μｇ以上、より好ましくは１０μｇ以上、更に好ましくは１５０μｇ以上、また、好ましくは１０００μｇ以下、より好ましくは５００μｇ以下、更に好ましくは３００μｇ以下である。一態様において、本発明の組成物をヒト（成人）に摂取させる又は投与する場合、ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩の合計の投与量（環状ジペプチド換算）として、１日あたり、好ましくは１～１０００μｇ、より好ましくは１０～５００μｇ、更に好ましくは１５０～３００μｇである。
本発明の組成物が更にＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を含む場合、ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩の合計投与量（環状ジペプチド換算）が上記範囲であることが好ましい。ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩の合計投与量（環状ジペプチド換算）は、ヒト（成人）の場合、１日あたり、好ましくは５～１０００μｇ、より好ましくは２０～５００μｇ、更に好ましくは１６０～３００μｇである。
上記量を、１日１回以上、例えば、１日１回又は数回（例えば２～３回）に分けて、摂取又は投与することが好ましい。一態様においては、上記量のＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩を、経口で摂取させる又は投与することが好ましい。ヒト（成人）の場合、１日当たり体重６０ｋｇ当たり上記量のＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩を摂取させる又は投与することが好ましい。一態様において、本発明の組成物は、ヒトに、体重６０ｋｇあたり、１日あたり上記量のＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩を摂取させる又は投与するための経口用組成物であってよい。
本発明の組成物は、継続して摂取又は投与されるものであることが好ましい。ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩を継続的に摂取させる又は投与することによって、より高い効果が得られることが期待される。一態様において、本発明の組成物は、好ましくは１週間以上、より好ましくは４週間以上、更に好ましくは８週間以上継続して摂取又は投与されることが好ましい。
ＣＦＦ、ＣＬＫ等の環状ジペプチド及びこれらの塩は、飲食品などとして摂取可能であり、安全性の観点から、例えば長期摂取することにも問題が少ないと考えられる。
本発明の組成物を摂取させる又は投与する対象（投与対象ということもできる）は、特に限定されない。好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
一態様において、本発明の組成物の投与対象として、神経系細胞の炎症の予防又は抑制を必要とする又は希望する対象、神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患の予防又は改善を必要とする又は希望する対象等が挙げられる。一態様において、本発明における投与対象として、中高年者が挙げられる。中高年者は、高齢者を含む。中高年者は、例えば、４０歳以上のヒトであってよい。一態様において中高年者の中でも、対象として高齢者が好ましい。高齢者は、例えば、６０歳以上又は６５歳以上のヒトであってよい。一態様において、本発明の組成物の投与対象は、健常者であってよい。例えば、脳内におけるアミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症予防、アルツハイマー病又は軽度認知障害の予防等を目的として、健常者に対して使用することもできる。
本発明の組成物には、神経系細胞の炎症の予防又は抑制により発揮される機能の表示が付されていてもよい。このような表示は機能性表示ともいう。上記表示は、特に限定されない。このような表示として、例えば、「認知機能を高める」、「認知機能の低下を抑える」、「認知機能を良好に保つ」、「記憶力を高める」、「記憶力の低下を抑える」、「記憶力を良好に保つ」、「記憶の精度を高める」、「記憶障害を予防する」、「記憶障害を改善する」、「認知機能の一部である記憶力を維持する」、「記憶力の低下が気になる方に適した機能」、「認知機能の一部である記憶力の精度や判断の正確さを向上させる」、「記憶の保持又は統合を改善する」、「認知機能の強化を維持する」、「遂行機能を改善する」、「注意力と集中力を促進する」、「学習能力を改善する」、「見当識を維持・改善する」、「加齢に伴う認知機能低下を遅延する」、「短期及び長期記憶を強化する」及び「言語的及び視空間記憶を促進する」からなる群より選択される１又は２以上の機能の表示、並びに、これらと同視できる表示又は機能性表示が挙げられる。
本発明の一態様において、本発明の組成物は、上記の表示が１又は２以上付された飲食品であることが好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために上記組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、組成物自体に付されてもよいし、組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
本発明は、以下の方法及び使用も包含する。
Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩を投与する、神経系細胞の炎症の予防又は抑制方法。
Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩を投与する、アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化阻害方法。
Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩を投与する、神経系細胞の傷害の予防又は改善方法。
神経系細胞の炎症の予防又は抑制のための、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩の使用。
アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化を阻害するための、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩の使用。
上記方法は、治療的な方法であってもよく、非治療的な方法であってもよい。上記使用は、治療的な使用であってもよく、非治療的な使用であってもよい。
一態様において、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩は、神経系細胞の炎症を予防するため、及び／又は、神経系細胞の炎症を抑制するために使用することができる。
一態様において、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩は、アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化阻害によって、神経系細胞の炎症を予防するため、及び／又は、神経系細胞の炎症を抑制するために使用することができる。
上記方法及び使用において、上記ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩に加えて、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ、ＣＨＰ及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種を投与又は使用してもよい。
上記方法及び使用においては、１日に１回以上、例えば、１日１回～数回（例えば２～３回）、ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩を対象に摂取させる又は投与することが好ましい。上記の使用は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物、より好ましくはヒトにおける使用である。一態様において、ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩は、アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化阻害によって、神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患を予防又は改善するために使用することができる。ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩を投与する、神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患の予防又は改善方法も本発明に包含される。
上記方法及び使用においては、神経系細胞の炎症の予防又は抑制効果が得られる量（有効量ということもできる）のＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩を使用すればよい。上記有効量は、神経系細胞の炎症の予防又は抑制効果が得られるような量であることが好ましい。ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩の好ましい投与量、投与方法、投与対象等は上述した本発明の組成物と同じである。ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩は、そのまま摂取又は投与してもよく、これを含む組成物として摂取又は投与してもよい。例えば、本発明の組成物を摂取又は投与してもよい。
ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩は、神経系細胞の炎症の予防又は抑制のために使用される飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の製造のために使用することができる。一態様において、本発明は、神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物の製造における、ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩の使用、も包含する。本発明は、アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化阻害用組成物の製造における、ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩の使用、も包含する。
ＣＦＦ又はその塩及びＣＬＫ又はその塩は、神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患の予防又は改善用組成物の製造のために使用することができる。
本明細書は、以下の神経保護用組成物等も開示する。
〔Ａ１〕Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩を有効成分として含む、神経保護用組成物。
〔Ａ２〕前記組成物は、アミロイドβによる神経系細胞の傷害を予防又は改善するための組成物である、上記〔Ａ１〕に記載の組成物。
〔Ａ３〕前記組成物は、経口用である、上記〔Ａ１〕又は〔Ａ２〕に記載の組成物。
〔Ａ４〕前記組成物は、飲食品又は医薬品である、上記〔Ａ１〕～〔Ａ３〕のいずれかに記載の組成物。
〔Ａ５〕前記組成物は、「認知機能を高める」、「認知機能の低下を抑える」、「認知機能を良好に保つ」、「記憶力を高める」、「記憶力の低下を抑える」、「記憶力を良好に保つ」、「記憶の精度を高める」、「記憶障害を予防する」、「記憶障害を改善する」、「認知機能の一部である記憶力を維持する」、「記憶力の低下が気になる方に適した機能」、「認知機能の一部である記憶力の精度や判断の正確さを向上させる」、「記憶の保持又は統合を改善する」、「認知機能の強化を維持する」、「遂行機能を改善する」、「注意力と集中力を促進する」、「学習能力を改善する」、「見当識を維持・改善する」、「加齢に伴う認知機能低下を遅延する」、「短期及び長期記憶を強化する」及び「言語的及び視空間記憶を促進する」からなる群より選択される１又は２以上の機能の表示を付されたものである、上記〔Ａ１〕～〔Ａ４〕のいずれかに記載の組成物。
〔Ａ６〕神経保護用組成物の製造における、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩の使用。
〔Ａ７〕Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩を投与する、神経を保護する方法。
本発明者らは、環状ジペプチドであるシクロバリニルプロリン（Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ））又はその塩が、神経の保護に有効であることを見出した。これにより、神経保護用組成物等を提供することができる。本開示の神経保護用組成物は、神経を保護するための飲食品、医薬品等として使用することができる。
本開示の神経保護用組成物は、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩を含む。神経保護用組成物は、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩を有効成分として含む。神経保護用組成物は、神経を保護するために使用されるものである。
Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）（シクロバリニルプロリン）は、バリン及びプロリンが縮合結合した構造を有する環状ジペプチドである。Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）を、ＣＶＰと記載することもある。
本明細書において「環状ジペプチド」とは、アミノ酸を構成単位とすることを特徴とし、Ｎ末端側アミノ酸のアミノ基とＣ末端側アミノ酸のカルボキシル基とが脱水縮合することにより生成したジケトピペラジン構造を有する化合物をいう。なお、環状ジペプチドのアミノ酸構成が同じであれば、それらの記載順序はいずれが先でも構わなく、例えば、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）とＣｙｃｌｏ（Ｐｒｏ－Ｖａｌ）（シクロプロリルバリン）とは同じ環状ジペプチドを表す。
ＣＶＰの塩としては、薬理学的に許容される塩又は飲食品に許容される塩であれば特に限定されず、酸性塩及び塩基性塩のいずれであってもよい。酸性塩として、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩等の有機酸塩等が挙げられる。塩基性塩として、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。ＣＶＰの塩は、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に調製され得る。
ＣＶＰ及びその塩の由来及び製造方法は特に制限されない。ＣＶＰ及びこれらの塩は、公知の方法に従って製造することができる。ＣＶＰ及びその塩は、天然物由来のものであってもよく、人工的に合成したものであってもよく、酵素法又は微生物発酵法により製造されてもよく、直鎖状ジペプチドを脱水及び環化させることによって合成されてもよい。例えば、コラーゲン加水分解物などのタンパク質加水分解物を加熱して、ＣＶＰを豊富に含むペプチド熱処理物を得ることができる。
ＣＶＰ及びその塩は、これを含むタンパク質加水分解物又はその熱処理物を使用して神経保護用組成物に配合してもよいし、タンパク質加水分解物又はその熱処理物の濃縮物、乾燥粉末又は精製度を高めたものを使用して神経保護用組成物に配合してもよい。神経保護用組成物は、例えば、タンパク質加水分解物又はその熱処理物を含有し、ＣＶＰ及びその塩は、タンパク質加水分解物又はその熱処理物の一部であってもよい。ＣＶＰ及びその塩は、市販品を使用することもできる。
本開示の神経保護用組成物は、神経系細胞を保護するために使用することができる。神経保護には、神経系細胞の傷害の予防又は改善、神経系細胞死（アポトーシス又はネクローシス）の抑制等が含まれる。神経保護用組成物は、神経系細胞の傷害、神経系細胞死、神経系細胞の傷害又は細胞死を伴う状態又は疾患から神経を保護するため等に使用することができる。神経系細胞の傷害を予防又は改善することは、神経系細胞の変性の抑制にも寄与する。一態様において、神経保護用組成物は、神経系細胞保護用組成物である。一態様において、神経保護用組成物は、神経系細胞の傷害を予防又は改善するための組成物でもある。神経系細胞の傷害を予防又は改善するための組成物は、神経系細胞の傷害を予防するため、及び／又は、神経系細胞の傷害を改善するために使用される。更に一態様において、神経保護用組成物は、アミロイドβによる神経系細胞の傷害を予防又は改善するための組成物でもある。アミロイドβによる神経系細胞の傷害を予防又は改善するための組成物は、アミロイドβによる神経系細胞の傷害を予防するため、及び／又は、アミロイドβによる神経系細胞の傷害を改善するために使用される。
また、一態様において、神経保護用組成物は、神経系細胞の炎症を予防又は抑制するための組成物でもある。神経系細胞の炎症を予防又は抑制するための組成物は、神経系細胞の炎症を予防するため、及び／又は、神経系細胞の炎症を抑制するために使用される。更に一態様において、神経保護用組成物は、アミロイドβによる神経系細胞の炎症を予防又は抑制するための組成物でもある。アミロイドβによる神経系細胞の炎症を予防又は抑制するための組成物は、アミロイドβによる神経系細胞の炎症を予防するため、及び／又は、アミロイドβによる神経系細胞の炎症を抑制するために使用される。
一態様において、神経保護用組成物は、アミロイドβによる神経系細胞の傷害の予防又は改善するための組成物であることが好ましい。
アミロイドβは、アミロイドβタンパク質、アミロイドβペプチド又はβアミロイドと呼ばれることもあるペプチドである。アミロイドβは、通常、４０個前後のアミノ酸からなるペプチドであり、アミロイドβ１－４２、アミロイドβ１－４０等が挙げられる。
非会合状態のアミロイドβは、アミロイドβモノマーと呼ばれることもある。アミロイドβは、２個以上で凝集体を形成していてもよい。アミロイドβは、例えば、アミロイドβが２個以上（例えば２～５０個）凝集した可溶性凝集体（アミロイドβオリゴマー）を形成していてもよい。アミロイドβオリゴマーとして、アミロイドβ１－４２オリゴマー、アミロイドβ１－４０オリゴマー等が挙げられる。アミロイドβには、非会合状態のアミロイドβ、及び、オリゴマー等の凝集体を形成しているアミロイドβが含まれる。
アミロイドβは神経系細胞を刺激し、当該細胞において、ＡＭＰＫシグナル伝達及び／又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達に関する遺伝子発現を変化させる。ＡＭＰＫシグナル伝達は、細胞のエネルギー恒常性を調節する主要なシグナル伝達経路である。ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達は、細胞成長、増殖、生存、代謝などの様々な細胞プロセスの制御に関与する重要なシグナル伝達経路である。ＡＭＰＫシグナル伝達及び／又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達に関する経路に関する遺伝子発現が変化すると、炎症性サイトカインの産生が促進され、神経系細胞において炎症を引き起こす。これにより神経系細胞に傷害が生じる。
後記の試験例に示されるように、ＣＶＰ又はその塩は、ＡＭＰＫシグナル伝達及び／又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達に関する経路を介して神経保護作用を発揮することができる。ＣＶＰ又はその塩は、例えば、ＡＭＰＫシグナル伝達及び／又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達に関する経路を介して、炎症性サイトカインの産生を抑制し、神経系細胞の炎症を予防又は抑制することができる。また、神経系細胞の炎症を予防又は抑制することにより、神経系細胞の傷害を予防又は改善することができる。更に、神経系細胞の炎症の予防又は抑制や、神経系細胞の傷害の予防又は改善により、神経を保護することができる。
また、アミロイドβは神経系細胞のアポトーシスを誘導し、これにより神経系細胞に傷害が生じる。このため、アミロイドβによる神経系細胞のアポトーシスを抑制することにより、神経系細胞の傷害を予防又は改善することができる。更に、神経系細胞の傷害の予防又は改善により、神経を保護することができる。
ＣＶＰ又はその塩を含む神経保護用組成物は、例えば、ＡＭＰＫシグナル伝達及び／又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達に関する経路を介して、神経を保護する作用を有する。
神経保護用組成物は、例えば、ＡＭＰＫシグナル伝達及び／又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達に関する経路を介して、アミロイドβによる神経系細胞の炎症を予防又は抑制するために使用することができる。
神経保護用組成物は、例えば、ＡＭＰＫシグナル伝達及び／又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達に関する経路を介して、アミロイドβによる神経系細胞の傷害を予防又は改善するために使用することができる。
ＣＶＰ又はその塩を含む神経保護用組成物は、アミロイドβによる神経系細胞のアポトーシスを抑制する作用を有する。
神経保護用組成物は、アミロイドβによる神経系細胞のアポトーシスを抑制することにより、アミロイドβによる神経系細胞の傷害を予防又は改善するために使用することができる。
ＣＶＰ又はその塩を含む、神経系細胞のアポトーシス抑制用組成物も本明細書に開示される。
「神経（神経系）」とは、中枢神経系を表す。
「神経系細胞」とは、神経系を構成する細胞であり、外胚葉由来組織のうち表皮系細胞以外の細胞を表す。神経系細胞は、神経細胞を含む。
上記神経系細胞としては特に限定されないが、脳神経系細胞であることが好ましい。
脳神経系細胞としては例えば、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、上衣細胞等のグリア細胞；小脳プルキンエ細胞、縫線核ニューロン、大脳皮質ニューロン、視床下部ニューロン、視床ニューロン、脳幹ニューロン及び海馬ニューロン等が挙げられる。中でも好ましくは縫線核ニューロン、大脳皮質ニューロン、視床下部ニューロン、視床ニューロン、脳幹ニューロン及び海馬ニューロン等のニューロンであり、より好ましくは海馬ニューロンである。
一態様において、神経保護用組成物は、神経系細胞の傷害を伴う状態又は疾患、神経系細胞の細胞死を伴う状態又は疾患の予防又は改善のために使用することができる。一態様において、神経保護用組成物は、神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患、好ましくは、アミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患、より好ましくは、脳におけるアミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患の予防又は改善のために使用することができる。このような状態又は疾患として、神経系細胞の炎症に起因する状態又は疾患が挙げられる。脳におけるアミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症に起因する状態又は疾患として、例えば、アルツハイマー病（アルツハイマー型認知症を含む）等の神経変性疾患、一部の軽度認知障害等が挙げられる。
神経保護用組成物は、上記の状態又は疾患を予防又は改善するために使用することができ、上記の状態又は疾患の予防に好適に使用することができる。
本明細書において、状態又は疾患の予防は、発症を防止すること、発症を遅延させること、発症率を低下させること、発症のリスクを軽減すること等を包含する。状態又は疾患の改善は、対象を状態又は疾患から回復させること、状態又は疾患の症状を軽減すること、状態又は疾患の症状を好転させること、状態又は疾患の進行を遅延させること、防止すること等を包含する。
アルツハイマー病及び軽度認知障害では、認知機能が低下することが知られている。アルツハイマー病、軽度認知障害における認知機能低下の症状として、例えば、記憶力低下、記憶障害（物忘れ）、失語（ものの名前が出にくくなる）、失行、失認（よく知っているはずの場所で道に迷う等）、見当識（場所、時間、人の名前など、自分が置かれた状況を正しく認識する能力）の低下、言語及び非言語学習能力の低下、聴覚及び視覚処理の低下、遂行機能低下、遂行機能障害（計画を立てて物事を行うことができなくなる）、集中力低下、注意力低下、判断力低下、空間認識力低下、認知柔軟性低下、情報処理速度低下等が挙げられる。神経系細胞の傷害を予防又は改善することによって、又は、神経系細胞の炎症を予防又は抑制することによって、認知機能低下の予防又は認知機能の改善効果、例えば、上記の症状の予防又は改善効果が得られることが期待できる。
神経保護用組成物は、治療的用途（医療用途）又は非治療的用途（非医療用途）のいずれにも適用することができる。非治療的とは、医療行為、すなわち人間の手術、治療又は診断を含まない概念である。
神経保護用組成物は、一例として、剤の形態で提供することができるが、本形態に限定されるものではない。当該剤をそのまま組成物として、又は、当該剤を含む組成物として提供することもできる。一態様において、神経保護用組成物は、神経保護剤ということもできる。
一態様において、神経系細胞の傷害の予防又は改善用組成物は、神経系細胞の傷害の予防又は改善剤ということもできる。一態様において、神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物は、神経系細胞の炎症の予防又抑制剤ということもできる。
神経保護用組成物は、経口用又は非経口用のいずれであってもよい。神経保護用組成物は、好ましくは経口用組成物である。神経保護用組成物は、例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の形態とすることができ、飲食品又は医薬品が好ましい。神経保護用組成物は、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等に添加して使用することもできる。神経保護用組成物の形態は特に限定されず、固体状（例えば、粉末状、顆粒状、タブレット状等）、液状、ペースト状等のいずれであってもよい。
神経保護用組成物は、ＣＶＰ又はその塩を含み、更に飲食品又は医薬品等への添加物として許容されている各種の希釈剤、酸味料、抗酸化剤、安定剤、保存料、香料、乳化剤、色素類、調味料、ｐＨ調整剤、栄養強化剤等が添加されていてもよい。
例えば、神経保護用組成物を飲食品とする場合、有効成分として使用されるＣＶＰ又はその塩に、飲食品に使用可能な成分（例えば、食品素材、必要に応じて使用される食品添加物等）を配合して、種々の飲食品とすることができる。飲食品は特に限定されず、例えば、一般的な飲食品、健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品、病者用食品等が挙げられる。上記健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、健康補助食品、病者用食品等は、例えば、液剤、細粒剤、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、チュアブル剤、ドライシロップ剤、流動食等の各種製剤形態として使用することができる。
神経保護用組成物を医薬品又は医薬部外品とする場合、ＣＶＰ又はその塩に、薬理学的に許容される担体、必要に応じて添加される添加剤等を配合して、各種剤形の医薬品又は医薬部外品とすることができる。そのような担体、添加剤等は、医薬品又は医薬部外品に使用可能な、薬理学的に許容されるものであればよく、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、抗酸化剤、着色剤等の１又は２以上が挙げられる。医薬品又は医薬部外品の投与（摂取）形態としては、経口又は非経口（経皮、経粘膜、経腸、注射等）投与の形態が挙げられる。神経保護用組成物を医薬品又は医薬部外品とする場合、経口用医薬品又は経口用医薬部外品とすることが好ましい。経口投与のための剤形としては、例えば、液剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、糖衣錠、カプセル剤、懸濁液、乳剤、チュアブル剤等が挙げられる。非経口投与のための剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）等が挙げられる。医薬品は、非ヒト動物用医薬であってもよい。
神経保護用組成物を飼料とする場合には、ＣＶＰ又はその塩を飼料に配合すればよい。飼料には飼料添加剤も含まれる。飼料としては、例えば、牛、豚、鶏、羊、馬等に用いる家畜用飼料；ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料；犬、猫、小鳥等に用いるペットフードなどが挙げられる。
神経保護用組成物を、例えば、飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等とする場合、その製造方法は特に限定されず、有効成分として使用されるＣＶＰ又はその塩を用いて、一般的な方法により製造することができる。
一態様において、神経保護用組成物は、液状組成物であることが好ましく、飲料であることがより好ましい。飲料は、例えば、機能性飲料であってよい。飲料の形態は特に限定されず、容器詰飲料であってよい。容器詰飲料の容器は特に限定されず、いずれの形態及び材質の容器を用いてもよく、例えば、アルミ缶、スチール缶等の金属製容器；ペットボトル等の樹脂製容器；紙パック等の紙容器；ガラス瓶等のガラス製容器；樽等の木製容器等の通常用いられる容器のいずれも用いることができる。このような容器に飲料を充填及び密閉することにより、容器詰飲料が得られる。
神経保護用組成物に含まれるＣＶＰ及びその塩の合計の含有量（ＣＶＰ換算）は特に限定されず、その形態等に応じて設定することができ、例えば、１×１０－６～４５重量％であってよく、１×１０－５～２０重量％であることが好ましい。より好ましくは１×１０－４～１０重量％であり、更に好ましくは１×１０－３～１重量％である。
一態様において、ＣＶＰ及びその塩の合計の含有量（ＣＶＰ換算）は、神経保護用組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％であってよく、１×１０－６～１×１０－２重量％が好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％がより好ましい。一態様において、神経保護用組成物が飲料等の液体組成物の場合は、ＣＶＰ及びその塩の合計の含有量（ＣＶＰ換算）は、神経保護用組成物中に、１×１０－６～１×１０－１重量％が好ましく、１×１０－６～１×１０－２重量％がより好ましく、１×１０－５～１×１０－２重量％が更に好ましい。
ＣＶＰ及びその塩は、例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）により公知の方法で定量することが可能である。
ＣＶＰ換算の量、又はこれに類する表現は、ＣＶＰの場合はＣＶＰの量を意味し、ＣＶＰの塩の場合は、当該塩のモル数に、ＣＶＰの分子量を乗じて得られる値を意味する。
神経保護用組成物は、ＣＶＰ又はその塩が含まれる限り、他の環状ジペプチドが含まれていても良い。他の環状ジペプチドを２種以上含む場合、各環状ジペプチドの割合は特に限定されず、各環状ジペプチドが同じ割合で含まれていてもよいし、異なる割合で含まれていてもよい。好ましくは、神経保護用組成物に含まれる環状ジペプチド及びその塩の合計の含有量（環状ジペプチド換算）を１００重量％として、ＣＶＰ及びその塩の合計の含有量（ＣＶＰ換算）が５～８５重量％であり、より好ましくは、５～８０重量％である。
神経保護用組成物は、経口で摂取（経口投与）されることが好ましい。神経保護用組成物の投与量（摂取量ということもできる）は特に限定されない。神経保護用組成物の投与量は、神経の保護効果が得られるような量であればよく、投与形態、投与方法、対象の体重等に応じて適宜設定すればよい。神経保護用組成物の投与量は、アミロイドβにより濃縮されたＡＭＰＫシグナル伝達及び／又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達に関する経路の回復効果が得られるような量であることが好ましい。また、神経保護用組成物の投与量は、アミロイドβによる神経系細胞のアポトーシスの抑制効果が得られるような量であることが好ましい。
一態様において、神経保護用組成物をヒト（成人）を対象に摂取させる又は投与する場合、その投与量は、ＣＶＰ又はその塩の投与量（ＣＶＰ換算）として、１日あたり、好ましくは１μｇ以上、より好ましくは１０μｇ以上、更に好ましくは１５０μｇ以上、また、好ましくは１０００μｇ以下、より好ましくは５００μｇ以下、更に好ましくは３００μｇ以下である。一態様において、神経保護用組成物をヒト（成人）に摂取させる又は投与する場合、ＣＶＰ又はその塩の合計の投与量（ＣＶＰ換算）として、１日あたり、好ましくは１～１０００μｇ、より好ましくは１０～５００μｇ、更に好ましくは１５０～３００μｇである。
上記量を、１日１回以上、例えば、１日１回又は数回（例えば２～３回）に分けて、摂取させる又は投与することが好ましい。一態様においては、上記量のＣＶＰ又はその塩を、経口で摂取させる又は投与することが好ましい。ヒト（成人）の場合、１日当たり体重６０ｋｇ当たり上記量のＣＶＰ又はその塩を摂取させる又は投与することが好ましい。一態様において、神経保護用組成物は、ヒトに、体重６０ｋｇあたり、１日あたり上記量のＣＶＰ又はその塩を摂取させる又は投与するための経口用組成物であってよい。
神経保護用組成物は、継続して摂取又は投与されるものであることが好ましい。ＣＶＰ又はその塩を継続的に摂取させる又は投与することによって、より高い効果が得られることが期待される。一態様において、神経保護用組成物は、好ましくは１週間以上、より好ましくは４週間以上、更に好ましくは８週間以上継続して摂取又は投与されることが好ましい。
ＣＶＰ及びその塩は、飲食品などとして摂取可能であり、安全性の観点から、例えば長期摂取することにも問題が少ないと考えられる。
神経保護用組成物を摂取させる又は投与する対象（投与対象ということもできる）は、特に限定されない。好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。
一態様において、神経保護用組成物の投与対象として、神経系細胞の傷害の予防又は改善を必要とする又は希望する対象、神経系細胞の炎症の予防又は抑制を必要とする又は希望する対象、神経系細胞の傷害を伴う状態又は疾患の予防又は改善を必要とする又は希望する対象、神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患の予防又は改善を必要とする又は希望する対象等が挙げられる。一態様において、神経保護用組成物の投与対象として、中高年者が挙げられる。中高年者は、高齢者を含む。中高年者は、例えば、４０歳以上のヒトであってよい。一態様において中高年者の中でも、対象として高齢者が好ましい。高齢者は、例えば、６０歳以上又は６５歳以上のヒトであってよい。一態様において、神経保護用組成物の投与対象は、健常者であってよい。例えば、脳内におけるアミロイドβによる神経系細胞の傷害予防、アミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症予防、アルツハイマー病又は軽度認知障害の予防等を目的として、健常者に対して使用することもできる。
神経保護用組成物には、神経の保護により発揮される機能の表示が付されていてもよい。このような表示は機能性表示ともいう。上記表示は、特に限定されない。このような表示として、例えば、「認知機能を高める」、「認知機能の低下を抑える」、「認知機能を良好に保つ」、「記憶力を高める」、「記憶力の低下を抑える」、「記憶力を良好に保つ」、「記憶の精度を高める」、「記憶障害を予防する」、「記憶障害を改善する」、「認知機能の一部である記憶力を維持する」、「記憶力の低下が気になる方に適した機能」、「認知機能の一部である記憶力の精度や判断の正確さを向上させる」、「記憶の保持又は統合を改善する」、「認知機能の強化を維持する」、「遂行機能を改善する」、「注意力と集中力を促進する」、「学習能力を改善する」、「見当識を維持・改善する」、「加齢に伴う認知機能低下を遅延する」、「短期及び長期記憶を強化する」及び「言語的及び視空間記憶を促進する」からなる群より選択される１又は２以上の機能の表示、並びに、これらと同視できる表示又は機能性表示が挙げられる。
一態様において、神経保護用組成物は、上記の表示が１又は２以上付された飲食品であることが好ましい。また上記の表示は、上記の機能を得るために上記組成物を用いる旨の表示であってもよい。当該表示は、組成物自体に付されてもよいし、組成物の容器又は包装に付されていてもよい。
本明細書は、以下の方法及び使用も開示する。
Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩を投与する、神経を保護する方法。
Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩を投与する、神経系細胞の炎症の予防又は抑制方法。
Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩を投与する、神経系細胞の傷害の予防又は改善方法。
神経を保護するための、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩の使用。
神経系細胞の炎症の予防又は抑制のための、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩の使用。
神経系細胞の傷害の予防又は改善のための、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩の使用。
上記方法は、治療的な方法であってもよく、非治療的な方法であってもよい。上記使用は、治療的な使用であってもよく、非治療的な使用であってもよい。
一態様において、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩は、アミロイドβにより生じる神経系細胞の傷害を予防するため、及び／又は、アミロイドβにより生じる神経系細胞の傷害を改善するために使用することができる。
一態様において、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩は、アミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症を予防するため、及び／又は、アミロイドβにより生じる神経系細胞の炎症を抑制するために使用することができる。
一態様において、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩は、ＡＭＰＫシグナル伝達及び／又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達に関する経路を介して、神経系細胞の傷害を予防するため、及び／又は、神経系細胞の傷害を改善するために使用することができる。
一態様において、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩は、ＡＭＰＫシグナル伝達及び／又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達に関する経路を介して、神経系細胞の炎症を予防するため、及び／又は、神経系細胞の炎症を抑制するために使用することができる。
一態様において、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩は、神経系細胞のアポトーシスを抑制することによって、神経系細胞の傷害を予防するため、及び／又は、神経系細胞の傷害を改善するために使用することができる。
上記方法及び使用において、ＣＶＰ又はその塩に加えて、他の環状ジペプチド又はその塩を投与又は使用してもよい。
上記方法及び使用においては、１日に１回以上、例えば、１日１回～数回（例えば２～３回）、ＣＶＰ又はその塩を対象に摂取させる又は投与することが好ましい。上記の使用は、好ましくはヒト又は非ヒト哺乳動物、より好ましくはヒトにおける使用である。一態様において、ＣＶＰ又はその塩は、ＡＭＰＫシグナル伝達及び／又はＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達に関する経路を介して、神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患を予防又は改善するために使用することができる。ＣＶＰ又はその塩を投与する、神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患の予防又は改善方法も本明細書に開示される。
上記方法及び使用においては、神経の保護効果が得られる量（有効量ということもできる）のＣＶＰ又はその塩を使用すればよい。上記有効量は、神経の保護効果が得られるような量であることが好ましい。ＣＶＰ又はその塩の好ましい投与量、投与方法、投与対象等は上述した本開示の神経保護用組成物と同じである。ＣＶＰ又はその塩は、そのまま摂取又は投与してもよく、これを含む組成物として摂取又は投与してもよい。例えば、上述した神経保護用組成物を摂取又は投与してもよい。
ＣＶＰ又はその塩は、神経の保護のために使用される飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の製造のために使用することができる。一態様において、本明細書は、神経保護用組成物の製造における、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）又はその塩の使用；アミロイドβによる神経系細胞の傷害の予防又は改善用組成物の製造における、ＣＶＰ又はその塩の使用、も開示する。一態様において、本明細書は、アミロイドβによる神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物の製造における、ＣＶＰ又はその塩の使用、も開示する。一態様において、本明細書は、アミロイドβによる神経系細胞のアポトーシスの抑制用組成物の製造における、ＣＶＰ又はその塩の使用、も開示する。
ＣＶＰ又はその塩は、神経系細胞の炎症に関連する状態又は疾患の予防又は改善用組成物の製造のために使用することができる。
本明細書において下限値と上限値によって表されている数値範囲、即ち「下限値～上限値」は、それら下限値及び上限値を含む。例えば、「１～２」により表される範囲は、１以上２以下を意味し、１及び２を含む。本明細書において、上限及び下限は、いずれの組み合わせによる範囲としてもよい。
以下、本発明を実施例により更に詳しく説明するが、これにより本発明の範囲を限定するものではない。
＜実施例１～６及び比較例１～３＞
（アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性評価）
Ａ．試薬
被験化合物としての環状ジペプチドは、バッケム社及びペプチド研究所から購入した。
Ａβ１－４２ペプチドは、ｒＰｅｐｔｉｄｅ社から購入した。
ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、Ｓｉｇｍａ　Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ペニシリン－ストレプトマイシン、リポフェクタミン（登録商標）３０００トランスフェクション試薬（０．３μＬ／ウェル）は、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。
牛胎児血清は、Ｍｅｒｃｋ―Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から購入した。
ＮＦ－κＢ応答エレメントを有するＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーターベクター（１００ｎｇ／ウェル）及びＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（１００μｇ／ウェル）は、Ｐｒｏｍｅｇａ社から購入した。
Ｂ．細胞培養
ＢＶ－２マウスミクログリア細胞（ＲＲＩＤ：ＣＶＣＬ＿０１８２、以下、ＢＶ－２ミクログリアともいう）を、１０％牛胎児血清（極低エンドトキシン（＜０．０５ＥＵ／ｍＬ））及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において、培養を実施した。培養は、５％ＣＯ２と９５％空気の加湿雰囲気下で３７℃で行い、細胞密度が８０％コンフルエンスに達した時点で（約２－３日おきに）継代培養を行った。
Ｃ．Ａβ４２オリゴマー（Ａβ４２Ｏ）の調製
Ａβ１－４２ペプチドをヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）に１ｍＭの濃度で溶かし、室温で３０分間インキュベートした。得られたＡβ４２－ＨＦＩＰ溶液を一晩蒸発させ、加熱せずに乾燥させて、残存する微量のＨＦＩＰと水分を除去し、Ａβ４２膜を得た。次に、Ａβ４２膜を５ｍＭの濃度となるようにＤＭＳＯで再構成し、３０秒間ボルテックスし、バスソニケーターを用いて１０分間超音波処理した。得られたＡβ４２－ＤＭＳＯ溶液を、氷冷した成長培地で希釈し、４℃で２４時間保存してから使用した。
Ｄ．プラスミドＤＮＡのトランスフェクション、細胞処理、及びＮＦ－κＢ駆動ルシフェラーゼ活性の測定
ＢＶ－２マウスミクログリア細胞を９６ウェル培養プレートに２５，０００個／ウェルの密度で播種し、１００μＬ／ウェルの増殖培地を用いて培養した。播種から１６時間後に、リポフェクタミン（登録商標）３０００トランスフェクション試薬を用いて、ＮＦ－κＢ応答エレメントを有するＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）レポーターベクターを導入した。トランスフェクションから４８時間後に、Ａβ４２Ｏと被験化合物を添加して増殖培地を調製し、培養に供した。増殖培地におけるＡβ４２Ｏ濃度は２０μＭであり、実施例１～４及び比較例１～３における被験化合物の濃度は表１のとおりである。実施例５の被験化合物及びそれらの濃度は、実施例４と同様であり、実施例６の被験化合物及びそれらの濃度は、ＣＦＦ：４．４μｇ／ｍＬ、ＣＬＫ：３４．４μｇ／ｍＬ、ＣＬＦ：１９μｇ／ｍＬ、ＣＬＱ：２０．６μｇ／ｍＬ、ＣＰＧ：１５μｇ／ｍＬ、ＣＶＰ：７．６μｇ／ｍＬ、ＣＨＰ：６．２μｇ／ｍＬである。
２４時間のインキュベーション後、細胞を溶解した。ＮＦ－κＢ駆動ルシフェラーゼ活性は、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを用いて検出された。細胞溶解液と検出試薬からなる反応混合物を９６ウェルホワイト／クリアボトムプレート（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に移し、マルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ社）で蛍光強度を測定した。ｎ＝８で試験を行い、反応混合物の蛍光強度の平均値を測定値とした。この系では蛍光強度が強いほどＮＦ－κＢが活性化されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Ｅ．統計分析
統計分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖｅｒｓｉｏｎ　７．０ａ、ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して行った。結果は全て、平均±標準偏差として示す。独立した２群間の差の分析には、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔによって実施した。Ｐ値がｐ＜０．０５の場合、データを有意であるとみなした。３つ以上の独立したグループ間の差異を分析するために、一元配置分散分析に続いて、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定の多重比較を使用した。
（結果）
結果を表２及び表３に示した。結果は、平均±標準偏差（ｎ＝８）で示した。＊は、コントロール（Ａβ４２Ｏ及び被験化合物のいずれも未処理）に対して、ｐ＜０．０５で、＊＊はｐ＜０．０１で、＊＊＊はｐ＜０．００１で、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１で有意差があったことを示す。
♯は、Ａβ４２Ｏ処理群（被験化合物未処理）に対して、ｐ＜０．０５で、♯♯はｐ＜０．０１で、♯♯♯はｐ＜０．００１で、♯♯♯♯はｐ＜０．０００１で有意差があったことを示す。
表２及び表３に示すルシフェラーゼ活性は、Ｃｏｎｔｒｏｌのルシフェラーゼ活性（Ｃｏｎｔｒｏｌの反応混合物の蛍光強度）を１００とした場合の、被験化合物を用いた場合のルシフェラーゼ活性（被験化合物で処理した細胞溶解液を含む反応混合物の蛍光強度）の相対値である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
表２の結果より、ＣＦＦとＣＬＫとを組み合わせることにより、被験化合物未処理の場合と比較して、有意にＮＦ－κＢ活性化を阻害することが明らかとなった。
更に、表３の結果より、ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ、ＣＬＱ、ＣＰＧ、ＣＶＰ及びＣＨＰを組み合わせた場合（７ＤＫＰ）、ＣＦＦ、ＣＬＫ、ＣＬＦ及びＣＬＱを組み合わせた場合（４ＤＫＰ）よりも、ＮＦ－κＢ活性化の阻害効果がより大きいことが確認された。
＜試験例１＞
（Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の神経系細胞保護効果の評価）
Ａ．細胞培養と処理
ＨＴ２２細胞（マウス海馬神経細胞株）（Ｃｈｕａｎｑｉｕ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．）を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）を添加した１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清（Ｃｈｕａｎｑｉｕ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）中で、加湿雰囲気（５％ＣＯ２、９５％空気、３７℃）下で培養した。アミロイドβ（Ａβ）処理のために、ＨＴ２２細胞を、Ａβ（１０μｍｏｌ／Ｌ、Ａｄｏｏｑ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）で２４時間処理した（Ａβ処理群）。Ａβ処理においては、Ａβを添加した培地で細胞を培養した。Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理群では、ＨＴ２２細胞を、Ａβ（１０μｍｏｌ／Ｌ）及びＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）（バッケム社）を併用して２４時間処理した。具体的には、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理群の細胞は、Ａβ及びＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）を添加した培地で培養した（Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の濃度は０．０００５０４ｍｇ／ｍＬ）。コントロール群の細胞は、Ａβ及びＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）のいずれも未処理である。コントロール群の細胞は、Ａβ及びＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）をいずれも添加しない培地で培養した。
Ａβ処理群、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理群及びコントロール群の細胞について、下記の評価を行った。
また、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の作用メカニズムを調べる試験では、下記の方法で処理した細胞も評価に使用した。
ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ）及びＡＭＰＫ（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ）を阻害するために、２０μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２（Ａｄｏｏｑ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）又は１０μＭのＡＭＰＫ阻害剤ＢＭＬ－２７５（Ａｄｏｏｑ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）の存在下で、ＨＴ２２細胞を、１０μｍｏｌ／ＬのＡβ及び０．０００５０４ｍｇ／ｍＬのＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）を併用して２４時間処理した。
Ｂ．ＥＬＩＳＡ法と酵素活性測定法
ＨＴ２２細胞におけるスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）の活性及び還元型グルタチオン（ＧＳＨ）の量は、対応するキット（Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．）で測定された。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インターロイキン－１β（ＩＬ－１β）、ＩＬ－６などの培養液中のサイトカインは、市販のＥＬＩＳＡキットで、製造業者（Ｍｕｌｔｉ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　（Ｌｉａｎｋｅ）　Ｂｉｏｔｅｃｈ，　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．）の使用説明書に従って測定された。
Ｃ．ＲＴ－ｑＰＣＲ
Ｂｉｏｚｏｌ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖａｚｙｍｅ社）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出し、Ｎａｎｏ－３０００　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｏｓｅｎｓ社）を用いてＲＮＡ濃度を評価した。ｃＤＮＡは、ｈｉｇｈ－ｃａｐａｃｉｔｙ　ｃＤＮＡ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ｋｉｔ（Ｔｓｉｎｇｋｅ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．）を用いて合成し、ｑＰＣＲは、Ｍａ　ｅｔ　ａｌ．（Ｇｕｔ　Ｍｉｃｒｏｂｅｓ，２０２０，１２（１），１８３２８５７）に記載の方法で、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ｔｓｉｎｇｋｅ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．）を用いて、ＣＦＸ　Ｃｏｎｎｅｃｔ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）で行った。β－アクチンの転写を、データ標準化のためのハウスキーピング遺伝子として使用した。
Ｄ．ウエスタンブロット
ＨＴ２２細胞をＲＩＰＡ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ）で溶解し、ＢＣＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｋｉｔ（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ社）を用いて、製造業者の使用説明書に従ってタンパク質濃度を測定した。３０μｇのタンパク質を含む細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写し、ＫＰＬ　ＤｅｔｅｃｔｏｒＴＭ　Ｂｌｏｃｋ（ＳｅｒａＣａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で室温（ＲＴ）で１時間ブロックした後、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。トリス緩衝生理食塩水で充分に洗浄した後、膜を適切なＨＲＰ標識二次抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）と更にインキュベートした。バンドを、発光イメージングワークステーション（Ｔａｎｏｎ社）によって可視化し、ＩｍａｇｅＪによって定量した。
Ｅ．免疫蛍光及びＴＵＮＥＬ染色
ＨＴ２２細胞を２４ウェル培養プレートのカバースリップ（サイズ：１０ｍｍ×１０ｍｍ；厚み：０．１３～０．１７ｍｍ）上で７０～８０％のコンフルエンスに達するまで培養した。細胞を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）でＲＴで１０分間固定し、０．５％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）で透過処理し、５％　ＦＢＳ／ＰＢＳでブロックした。次に、微小管結合タンパク質２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ－２：ＭＡＰ－２、ＨＵＡＢＩＯ社）に対する一次抗体を細胞に添加し、湿った箱の中で４℃で一晩インキュベートした。洗浄後の細胞に適切な二次抗体（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８及びＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５９４、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を適用し、ＲＴで１時間インキュベートした。ＴＵＮＥＬ染色では、カバースリップをターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）反応バッファー中で１０分間インキュベートし、更に３７～４０℃の加湿チャンバー内で、ＴｄＴ反応混合液中で１～２時間インキュベートした。カバースリップを、ストップウォッシュバッファーで１０分間、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ　２０で６分間すすいだ。検出のために、カバースリップをＰＢＳ中のストレプトアビジン－ＨＲＰと室温で２０分間インキュベートし、続いて３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）と２分間インキュベートした。
Ｆ．トランスクリプトーム解析
ＨＴ２２細胞から全ＲＮＡを分離し、ＮａｎｏＤｒｏｐＴＭ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて濃度、品質及び完全性を測定した。シーケンスライブラリの構築はＮｏｖｏｇｅｎｅ社により行われ、ライブラリはＡｇｉｌｅｎｔ２１００　バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）によって検証され、紫外分光法によってＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ定量試薬（Ｙｅａｓｅｎ社）を用いて定量された。トランスクリプトームシーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ　Ｎｏｖａｓｅｑ　６０００　Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＣ－Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．）で、２×１５０ｂｐのペアエンドシーケンシング（ＰＥ　１５０）によって実施された。遺伝子発現を測定するために、Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｐｅｒ　ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　ｍｉｌｌｉｏｎ　ｍａｐｐｅｄ　ｒｅａｄｓ（ＦＰＫＭ）値を使用し、ｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ＞２又はｆｏｌｄ　ｃｈａｎｇｅ＜０．５、かつＰ値＜０．０５のｍＲＮＡを、ＲパッケージＤＥＳｅｑ　２によって選択した。遺伝子ヒートマップとＫｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔを更に解析した。Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｈｅａｔｍａｐの可視化は、Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｈｅａｔｍａｐ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ＣｏｍｐｌｅｘＨｅａｔｍａｐ／）の使用説明書に従って行った。
Ｇ．統計解析
全てのデータは平均±標準誤差（ＳＥＭ）で示した。異なるグループ間の比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）とそれに続くチューキー・クレーマー検定（Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ　ｔｅｓｔ）によって分析された。Ｐ値＜０．０５又は＜０．０１を統計的に有意とみなした。
Ｈ．結果
１．抗炎症作用及び抗酸化作用を有するＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）のスクリーニング
Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の抗炎症作用及び抗酸化作用を調査するため、抗酸化酵素活性及び分泌されたサイトカインの濃度を測定した。図１～図４に、ＨＴ２２細胞における炎症及び酸化ストレスに対するＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の作用を示す。
図１は、Ａβの刺激下において、０．０００５０４ｍｇ／ｍＬのＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）で、又は、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の不存在下で、２４時間処理したＨＴ２２細胞における、ＧＳＨの含有量並びにＣＡＴ及びＳＯＤの活性を示すグラフである。図１（ａ）はＧＳＨ含有量を、図１（ｂ）はＣＡＴ活性を、図１（ｃ）はＳＯＤ活性を、それぞれ示す。アミロイドβ（Ａβ）処理により減少した抗酸化酵素活性はＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理により回復した（図１）。
図２は、ＨＴ２２細胞の培地におけるＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βの濃度を示すグラフである。図２（ａ）はＩＬ－６の濃度を、図２（ｂ）はＴＮＦ－αの濃度を、図２（ｃ）はＩＬ－１βの濃度を、それぞれ示す。ＥＬＩＳＡの結果によると、分泌されたＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＬ－１βのサイトカインの濃度はすべて、Ａβ処理により増加したが、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理により減少した（図２）。
次に、炎症及び酸化ストレス経路に対するＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の影響を免疫ブロットにより検証した。図３は、ＨＴ２２細胞中の、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、β－アクチン、ｐ６５　ＮＦ－κＢ、ｐ－ｐ６５　ＮＦ－κＢ（リン酸化ｐ６５　ＮＦ－κＢ）、ｐ３８　ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）及びｐ－ｐ３８　ＭＡＰＫ（リン酸化ｐ３８　ＭＡＰＫ）のウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。図４は、ＨＴ２２細胞中の、ｉＮＯＳ、β－アクチン、ｐ－ｐ６５　ＮＦ－κＢ、ｐ６５　ＮＦ－κＢ、ｐ－ｐ３８　ＭＡＰＫ及びｐ３８　ＭＡＰＫのタンパク質の定量結果を示すグラフである。ここで、定量結果は、それぞれ、ｐ６５　ＮＦ－κＢに対するｐ－ｐ６５　ＮＦ－κＢの相対強度（ウェスタンブロットのバンドのシグナル強度（タンパク質量）の比）、ｐ３８　ＭＡＰＫに対するｐ－ｐ３８　ＭＡＰＫの相対強度、β－アクチンに対するｉＮＯＳの相対強度で示した。図４（ａ）は、ｐ６５　ＮＦ－κＢに対するｐ－ｐ６５　ＮＦ－κＢの相対強度を、図４（ｂ）は、β－アクチンに対するｉＮＯＳの相対強度を、図４（ｃ）は、ｐ３８　ＭＡＰＫに対するｐ－ｐ３８　ＭＡＰＫの相対強度を、コントロール群における相対強度を１とした場合の値として、それぞれ示す。その結果、Ａβ処理により、ｐ６５　ＮＦ－κＢ及びｐ３８　ＭＡＰＫのリン酸化が顕著に活性化されたとともに、ｉＮＯＳの量が顕著に上昇したが、これらはすべてＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理により減弱された（図３及び図４）。
図１、図２及び図４において、データは、平均±標準誤差で示す（Ｎ＝６）。＊は、コントロール群（Ａβ及びＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）のいずれも未処理）に対してｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１であることを示す。♯は、Ａβ処理群（Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）未処理）に対して、ｐ＜０．０５、♯♯はｐ＜０．０１であることを示す。
また、本明細書の図面において、Ｃｏｎはコントロール群を、ＡβはＡβ処理群を、ＣＶＰはＣＶＰ処理群（Ａβ及びＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）で処理）をそれぞれ表す。
２．ＨＴ２２細胞における遺伝子プロファイル及び制御された異なるシグナル伝達経路に対するＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の作用
ＨＴ２２細胞においてＡβにより誘発される炎症に対するＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）のメカニズムを更に調査するため、トランスクリプトーム分析を行った。図５にＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の作用に対するＫＥＧＧパスウェイ分析の結果を示す。図５は、ＨＴ２２細胞において、Ａβ処理により濃縮された経路を調べるために行ったＫＥＧＧパスウェイ解析のヒートマップである。これらの通常は制御されている遺伝子のＫＥＧＧパスウェイ分析では、Ａβ処理により、ＭＡＰＫシグナル伝達、アポトーシス、ＡＭＰＫシグナル伝達、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達及びＮＦ－κＢシグナル伝達に関連する経路が濃縮される一方で、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理により、ＡＭＰＫ及びＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路が有意に変化することが分かった（図５）。ここで、図５中の数値は、Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔスコア（－Ｌｏｇ１０（ｐ値））を示す。Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔスコアは０～３２の値をとり、数値が大きいほど、その経路はＡβ処理及びＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理の効果とより関連していることを意味する。
ＡＭＰＫシグナル伝達経路及びＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路に対するＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の作用を検証するため、これらの経路に含まれる特定のマーカーに対するウェスタンブロット分析を行った。図６～図９に、これらの経路に対するＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の作用を示す。
図６は、ＨＴ２２細胞におけるＰＩ３Ｋ、ｐ－ＰＩ３Ｋ（リン酸化ＰＩ３Ｋ）、Ａｋｔ、ｐ－Ａｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）、ｐ－ＡＭＰＫ及びＡＭＰＫのウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。図７は、ＨＴ２２細胞におけるｐ－ＰＩ３Ｋ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－Ａｋｔ、Ａｋｔ、ｐ－ＡＭＰＫ及びＡＭＰＫのタンパク質の定量結果を示すグラフである。ここで、定量結果は、それぞれ、ＰＩ３Ｋに対するｐ－ＰＩ３Ｋの相対強度（ウェスタンブロットのバンドのシグナル強度（タンパク質量）の比）、Ａｋｔに対するｐ－Ａｋｔの相対強度、ＡＭＰＫに対するｐ－ＡＭＰＫの相対強度で示した。図７（ａ）は、ＰＩ３Ｋに対するｐ－ＰＩ３Ｋの相対強度を、図７（ｂ）は、ＡＭＰＫに対するｐ－ＡＭＰＫの相対強度を、図７（ｃ）は、Ａｋｔに対するｐ－Ａｋｔの相対強度を、コントロール群における相対強度を１とした場合の値として、それぞれ示す。その結果、Ａβ処理によりＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ及びＡＭＰＫのリン酸化が減弱されたが、これらの変化は、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）によりこれらのタンパク質のリン酸化が促進されて逆転した（図６及び図７）。
図８は、ＨＴ２２細胞におけるＴＵＮＥＬ陽性領域の定量結果（蛍光強度）を示すグラフである。図９は、ＨＴ２２細胞のＴＵＮＥＬ蛍光染色の結果を示す顕微鏡写真である。ＴＵＮＥＬ陽性（アポトーシス）細胞の核は緑色に見えた。ＴＵＮＥＬ染色により、Ａβにより増加したアポトーシス細胞が、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）により減少したことが分かった（図８及び図９）。図８に示す結果は、コントロール群の蛍光強度を１とした相対強度で示した。
図７及び図８において、データは、平均±標準誤差（Ｎ＝４）で示す。＊は、コントロール群（Ａβ及びＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）のいずれも未処理）に対してｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１であることを示す。♯は、Ａβ処理群（Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）未処理）に対してｐ＜０．０５、♯♯はｐ＜０．０１であることを示す。
また、図９において、ＭｅｒｇｅはＤＡＰＩで核染色した細胞とＴＵＮＥＬ染色した細胞を重ね合わせた画像を表す。
３．Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）による、Ａβ誘導ＨＴ２２細胞における神経機能の保護作用
次に、神経機能に対するＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の作用を調査した。図１０～図１４に、ＨＴ２２細胞の神経機能に対するＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の作用を示す。
図１０は、ＨＴ２２細胞中の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、シナプス後肥厚部タンパク質９５（ＰＳＤ－９５）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）及びトロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴｒκＢ）のｍＲＮＡ発現（相対ｍＲＮＡ量）を示すグラフである。図１０に示す結果は、コントロール群のｍＲＮＡ発現量を１とした相対ｍＲＮＡ量で示した。神経変性疾患関連遺伝子であるＢＤＮＦ、ＰＳＤ－９５、ＮＣＡＭ及びＴｒκＢのｑＰＣＲ解析により、Ａβ処理により調節不全となったこれらの遺伝子の発現は、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理によりほぼ回復することが分かった（図１０）。
図１１は、ＨＴ２２細胞中のｃＡＭＰ応答因子結合タンパク質（ＣＲＥＢ）、ｐ－ＣＲＥＢ（リン酸化ＣＲＥＢ）、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。図１２は、ＨＴ２２細胞中のｐ－ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのタンパク質の定量結果を示すグラフである。ここで、定量結果は、それぞれ、ＣＲＥＢに対するｐ－ＣＲＥＢの相対強度（ウェスタンブロットのバンドのシグナル強度（タンパク質量）の比）、β－アクチンに対するＢＤＮＦの相対強度で示した。図１２（ａ）は、ＣＲＥＢに対するｐ－ＣＲＥＢの相対強度を、図１２（ｂ）は、β－アクチンに対するＢＤＮＦの相対強度を、コントロール群における相対強度を１とした場合の値として、それぞれ示す。ＣＲＥＢのリン酸化及びＢＤＮＦのタンパク質量もＡβ処理により減少したが、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理により増加した（図１１及び図１２）。
図１３は、ＨＴ２２細胞の微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ－２）蛍光染色の結果を示す顕微鏡写真である（スケールバー：１０μｍ）。図１４は、ＨＴ２２細胞中のＭＡＰ－２蛍光染色の定量化データを示すグラフである。図１４（ａ）は、ＭＡＰ－２の発現量（蛍光強度）を、図１４（ｂ）は、平均軸索長を、それぞれ示す。ＭＡＰ－２の蛍光免疫染色により、Ａβ処理はＭＡＰ－２の発現及び平均軸索長を有意に減少させるが、これらはいずれもＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理により増加することが分かった（図１３及び図１４）。
図１０、図１２及び図１４において、データは、平均±標準誤差（Ｎ＝３）で示す。＊は、コントロール群（Ａβ及びＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）のいずれも未処理）に対してｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１であることを示す。♯は、Ａβ処理群（Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）未処理）に対してｐ＜０．０５、♯♯はｐ＜０．０１であることを示す。
また、図１３において、ＤＡＰＩはＤＡＰＩで染色した細胞の顕微鏡写真を、ＭＡＰ－２はＭＡＰ－２の蛍光免疫染色写真を、ＭｅｒｇｅはＤＡＰＩとＭＡＰ－２を重ねた画像を表す。
４．Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ及びＡＭＰＫ経路を介した神経保護作用及び抗アポトーシス作用
神経機能及びアポトーシスにおけるＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の根底のメカニズムを更に明らかにするため、ＰＩ３Ｋ阻害剤（ＬＹ２９４００２）及びＡＭＰＫ阻害剤（ＢＭＬ－２７５）を用いた。図１５～図１８に示すように、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）はＡＭＰＫ及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を介して神経保護作用及び抗アポトーシス作用を発揮した。また、図１９～図２０に示すように、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の抗アポトーシス作用は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ又はＡＭＰＫシグナル伝達を阻害することで減少した。
図１５は、ＰＩ３Ｋ阻害剤のＬＹ２９４００２で２４時間処理したＨＴ２２細胞中のｐ－ＰＩ３Ｋ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－Ａｋｔ、Ａｋｔ、Ｃｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３、カスパーゼ－３、ｐ－ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。図１６は、ＰＩ３Ｋ阻害剤のＬＹ２９４００２で２４時間処理したＨＴ２２細胞中のｐ－ＰＩ３Ｋ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－Ａｋｔ、Ａｋｔ、Ｃｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３、カスパーゼ－３、ｐ－ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのタンパク質の定量結果を示すグラフである。ここで、定量結果は、それぞれ、ＰＩ３Ｋに対するｐ－ＰＩ３Ｋの相対強度（ウェスタンブロットのバンドのシグナル強度（タンパク質量）の比）、Ａｋｔに対するｐ－Ａｋｔの相対強度、カスパーゼ－３に対するＣｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３の相対強度、ＣＲＥＢに対するｐ－ＣＲＥＢの相対強度、β－アクチンに対するＢＤＮＦの相対強度で示した。図１６（ａ）は、ＰＩ３Ｋに対するｐ－ＰＩ３Ｋの相対強度を、図１６（ｂ）は、Ａｋｔに対するｐ－Ａｋｔの相対強度を、図１６（ｃ）は、カスパーゼ－３に対するＣｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３の相対強度を、図１６（ｄ）は、ＣＲＥＢに対するｐ－ＣＲＥＢの相対強度を、図１６（ｅ）は、β－アクチンに対するＢＤＮＦの相対強度を、コントロール群における相対強度を１とした場合の値として、それぞれ示す。ＰＩ３Ｋ阻害剤処理により、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）によるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔのリン酸化が阻害されただけでなく、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）によるＣＲＥＢのリン酸化の促進及びＣｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３の減少が消失し、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）によるＢＤＮＦ量の誘導が有意に減少した（図１５及び図１６）。
図１７は、ＡＭＰＫ阻害剤のＢＭＬ－２７５で２４時間処理したＨＴ２２細胞中のｐ－ＡＭＰＫ、ＡＭＰＫ、Ｃｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３、カスパーゼ－３、ｐ－ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのウェスタンブロット分析の結果を示す写真である。図１８は、ＡＭＰＫ阻害剤のＢＭＬ－２７５で２４時間処理したＨＴ２２細胞中のｐ－ＡＭＰＫ、ＡＭＰＫ、Ｃｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３、カスパーゼ－３、ｐ－ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ、ＢＤＮＦ及びβ－アクチンのタンパク質の定量結果を示すグラフである。ここで、定量結果は、それぞれ、ＡＭＰＫに対するｐ－ＡＭＰＫの相対強度（ウェスタンブロットのバンドのシグナル強度（タンパク質量）の比）、カスパーゼ－３に対するＣｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３の相対強度、ＣＲＥＢに対するｐ－ＣＲＥＢの相対強度、β－アクチンに対するＢＤＮＦの相対強度で示した。図１８（ａ）は、ＡＭＰＫに対するｐ－ＡＭＰＫの相対強度を、図１８（ｂ）は、カスパーゼ－３に対するＣｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３の相対強度を、図１８（ｃ）は、ＣＲＥＢに対するｐ－ＣＲＥＢの相対強度を、図１８（ｄ）は、β－アクチンに対するＢＤＮＦの相対強度を、コントロール群における相対強度を１とした場合の値として、それぞれ示す。上記と同様に、ＡＭＰＫ阻害剤によりＡＭＰＫシグナル伝達を阻害することにより、Ｃｌｅａｖｅｄカスパーゼ－３及びＣＲＥＢのリン酸化に対するＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の作用を打ち消し、ＢＤＮＦ量に対するＣｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の影響を軽減した（図１７及び図１８）。
図１６及び図１８において、データは、平均±標準誤差（Ｎ＝３）で示す。＊は、コントロール群（Ａβ、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及び阻害剤のいずれも未処理）に対してｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１であることを示す。♯は、Ａβ処理群（Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及び阻害剤のいずれも未処理）に対してｐ＜０．０５、♯♯はｐ＜０．０１であることを示す。＋は、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理群（阻害剤未処理）に対してｐ＜０．０５、＋＋はｐ＜０．０１であることを示す。また、ｎｓは有意差がなかったことを表す。
図１５及び図１６において、ＰＩ３Ｋ－ＩＮＨはＰＩ３Ｋ阻害剤を、ＣＶＰ＋ＰＩ３Ｋ－ＩＮＨはＣＶＰ＋ＰＩ３Ｋ－ＩＮＨ処理群（Ａβ、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤で処理）をそれぞれ表す。
図１７及び図１８において、ＡＭＰＫ－ＩＮＨはＡＭＰＫ阻害剤を、ＣＶＰ＋ＡＭＰＫ－ＩＮＨはＣＶＰ＋ＡＭＰＫ－ＩＮＨ処理群（Ａβ、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＡＭＰＫ阻害剤で処理）をそれぞれ表す。
図１９は、Ａβの刺激下において、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＡＭＰＫ阻害剤、又はこれらの不存在下で、２４時間処理したＨＴ２２細胞の、ＴＵＮＥＬ蛍光染色の結果を示す顕微鏡写真である。ＴＵＮＥＬ陽性（アポトーシス）細胞の核は緑色に見えた。図２０は、Ａβの刺激下において、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＡＭＰＫ阻害剤、又はこれらの不存在下で、２４時間処理したＨＴ２２細胞中の、ＴＵＮＥＬ陽性領域の定量結果（蛍光強度）を示すグラフである。ＴＵＮＥＬ染色で評価したように、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ又はＡＭＰＫシグナル伝達を阻害した場合、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）による抗アポトーシス作用も減少した（図１９及び図２０）。
図１９において、ＭｅｒｇｅはＤＡＰＩで核染色した細胞とＴＵＮＥＬ染色した細胞を重ね合わせた画像を表す。図２０において、データは、平均±標準誤差（Ｎ＝３）で示す。＊は、コントロール群（Ａβ、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及び阻害剤のいずれも未処理）に対してｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１であることを示す。♯は、Ａβ処理群（Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及び阻害剤のいずれも未処理）に対してｐ＜０．０５、♯♯はｐ＜０．０１であることを示す。＋は、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）処理群（阻害剤未処理）に対してｐ＜０．０５であることを示す。また、ＰＩ３Ｋ－ＩＮＨはＰＩ３Ｋ阻害剤を、ＡＭＰＫ－ＩＮＨはＡＭＰＫ阻害剤を、ＣＶＰ＋ＰＩ３Ｋ－ＩＮＨはＣＶＰ＋ＰＩ３Ｋ－ＩＮＨ処理群（Ａβ、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＰＩ３Ｋ阻害剤で処理）を、ＣＶＰ＋ＡＭＰＫ－ＩＮＨはＣＶＰ＋ＡＭＰＫ－ＩＮＨ処理群（Ａβ、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）及びＡＭＰＫ阻害剤で処理）をそれぞれ表す。
Ｉ．結論
以上のすべてのｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験に基づき、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）がＨＴ２２細胞において抗炎症作用、抗酸化ストレス作用及び抗アポトーシス作用を発揮することを初めて見出した。ＫＥＧＧパスウェイ及びウェスタンブロット分析による更なる分析により、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の作用は異なる経路を介して発揮される可能性があることが分かった。更に、Ｃｙｃｌｏ（Ｖａｌ－Ｐｒｏ）の神経保護作用及び抗アポトーシス作用は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ及びＡＭＰＫ経路により部分的に制御される可能性がある。

Claims (9)

  1. Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩を有効成分として含む、神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物。
  2. 前記組成物は、更にＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｐｈｅ）又はその塩を有効成分として含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記組成物は、更にＣｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｇｌｎ）又はその塩を有効成分として含む、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. アミロイドβにより誘発されるＮＦ－κＢの活性化を阻害する、請求項１又は２に記載の組成物。
  5. アミロイドβによる神経系細胞の傷害を予防又は改善する、請求項１又は２に記載の組成物。
  6. 前記組成物は、経口用である、請求項１又は２に記載の組成物。
  7. 前記組成物は、飲食品又は医薬品である、請求項１又は２に記載の組成物。
  8. 前記組成物は、「認知機能を高める」、「認知機能の低下を抑える」、「認知機能を良好に保つ」、「記憶力を高める」、「記憶力の低下を抑える」、「記憶力を良好に保つ」、「記憶の精度を高める」、「記憶障害を予防する」、「記憶障害を改善する」、「認知機能の一部である記憶力を維持する」、「記憶力の低下が気になる方に適した機能」、「認知機能の一部である記憶力の精度や判断の正確さを向上させる」、「記憶の保持又は統合を改善する」、「認知機能の強化を維持する」、「遂行機能を改善する」、「注意力と集中力を促進する」、「学習能力を改善する」、「見当識を維持・改善する」、「加齢に伴う認知機能低下を遅延する」、「短期及び長期記憶を強化する」及び「言語的及び視空間記憶を促進する」からなる群より選択される１又は２以上の機能の表示を付されたものである、請求項１又は２に記載の組成物。
  9. 神経系細胞の炎症の予防又は抑制用組成物の製造における、Ｃｙｃｌｏ（Ｐｈｅ－Ｐｈｅ）又はその塩、及び、Ｃｙｃｌｏ（Ｌｅｕ－Ｌｙｓ）又はその塩の使用。
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