JP2023016981A - 細胞および他の複雑な生物学的材料のクロマトグラフィーによる単離 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2012年2月23日に米国特許商標庁に出願された米国特許仮出願第61/602,150号"Chromatographic Isolation Of Cells And Other Complex Biological Materials"に対する優先権を主張するものであり、その内容は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、特にカラムクロマトグラフィー、例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたはゲル浸透クロマトグラフィーによる、標的細胞または異なる(複雑な)生物学的材料のクロマトグラフィーによる単離に関する。本発明は、標的細胞の表面上に位置するレセプター分子に結合するレセプター結合試薬を使用する。本明細書において開示される方法は、(痕跡を残さない(traceless))細胞アフィニティークロマトグラフィー技術(CATCH)としても説明され得る。本発明は、概して、生物材料、例えば、細胞、細胞小器官、ウイルスなどを、痕跡を残さずに単離するための新規方法を提供する。本発明は、細胞および他の複雑な生物学的材料を単離するための装置にも関する。
所望の細胞型の純粋かつ機能的な細胞集団の単離は、種々の治療的、診断的、および生物工学的な用途において欠くことができない。
本発明は、表面上に公知のレセプター分子を有する所望の細胞を単離するための、方法、キット、配置、試薬の組み合わせ、およびクロマトグラフィー固定相の使用を提供し、表面上にそのようなレセプターを欠く他の細胞からのそのような細胞の分離を含む。
標的細胞を含むサンプルを提供する工程、
結合部位Bおよび結合パートナーCを含むレセプター結合試薬を提供する工程であって、
レセプター結合試薬に含まれる結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に特異的に結合することができ、結合部位Bを介したレセプター結合試薬とレセプター分子との結合に対する解離定数(KD)は、低親和性であるか、または結合部位Bを介したレセプター結合試薬とレセプター分子との結合に対する解離速度定数(koff)は、約3×10-5sec-1以上の値を有し、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、親和性試薬の結合部位Zに可逆的に結合することができる、工程、および
サンプルを好適な固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、前記固定相上には親和性試薬が固定化されており、前記親和性試薬は、結合部位Zを含み、前記結合部位Zは、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCと可逆的結合を形成し、前記レセプター結合試薬の結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に結合し、それにより、標的細胞が固定相上に可逆的に固定化される、工程
を含む。
サンプルを提供する工程であって、前記サンプルは、標的細胞およびレセプター結合試薬を含み、前記レセプター結合試薬は、結合部位Bおよび結合パートナーCを含み、レセプター結合試薬に含まれる結合部位Bは、レセプター分子に特異的に結合することができる、工程、および
サンプルを好適な固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、前記固定相は、ゲル濾過マトリックスおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであり、前記ゲル濾過および/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、親和性試薬を含み、前記親和性試薬は、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに特異的に結合する結合部位Zを含み、それにより、標的細胞が単離される、工程
を含む。
標的細胞を含むサンプルを提供する工程、
結合部位Bおよび結合パートナーCを含むレセプター結合試薬を提供する工程であって、
レセプター結合試薬に含まれる結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に特異的に結合することができ、
レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、親和性試薬の結合部位Zに可逆的に結合することができる、工程、および
サンプルを好適な固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、前記固定相上には親和性試薬が固定化されており、
前記親和性試薬は、結合部位Zを含み、前記結合部位Zは、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCと可逆的結合を形成し、レセプター結合試薬の結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に結合し、それにより、標的細胞が固定相上に可逆的に固定化される、工程、
親和性試薬の結合部位Zに特異的に結合する結合部位を含む競合試薬を提供する工程;
競合試薬を第1固定相上にロードする工程であって、それにより、(複数の)レセプター結合試薬とレセプター分子と親和性試薬との間に形成された非共有結合的な可逆的複合体が破壊される、工程;
第1固定相の溶出液から溶出サンプルを回収する工程であって、前記溶出サンプルは、標的細胞を含む、工程;
溶出サンプルを好適な第2固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、前記第2固定相は、ゲル濾過マトリックスおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであり、前記ゲル濾過および/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに特異的に結合する結合部位Zを有する親和性試薬を含む、工程、ならびに
溶出サンプルを第2クロマトグラフィーカラムに通す工程
を含む。
第1固定相は、細胞分離に適しており、第1固定相は、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスによって定義され、前記アフィニティークロマトグラフィーマトリックス上には親和性試薬が固定化されており、前記親和性試薬は、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合することができる少なくとも一つの結合部位Zを有し、
第2固定相は、他の成分からの標的細胞の分離に適しており、第2固定相は、ゲル濾過マトリックスおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであり、前記アフィニティークロマトグラフィーマトリックスまたはゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、レセプター結合試薬に含まれる前記結合パートナーCに特異的に結合する結合部位Zを有する親和性試薬を含む。いくつかの態様において、第1固定相および第2固定相に含まれる/第1固定相および第2固定相上に固定化される親和性試薬は、同一である。いくつかの態様において、第1固定相および第2固定相に含まれる/第1固定相および第2固定相上に固定化される親和性試薬は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン、またはアビジンムテインである。
(a)結合部位Bおよび結合パートナーCを含むレセプター結合試薬であって、前記レセプター結合試薬に含まれる結合部位Bは、標的細胞表面のレセプター分子に特異的に結合することができ、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、多量体化試薬上の結合部位Zに可逆的に結合することができる、レセプター結合試薬;および
(b)細胞分離に適した固定相であって、前記固定相は、ゲル濾過マトリックスおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスによって定義され、前記アフィニティークロマトグラフィーマトリックスまたはゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合することができる結合部位Zを有する親和性試薬を含む、固定相
を備える。
標的細胞を含むサンプルを提供する工程、
一価の結合部位Bおよび結合パートナーCを含むレセプター結合試薬を提供する工程であって、前記レセプター結合試薬は、一価の抗体断片、免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子、アプタマー、およびMHC分子の群から選択され、
レセプター結合試薬に含まれる一価の結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に特異的に結合することができ、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、親和性試薬の結合部位Zに可逆的に結合することができる、工程、および
サンプルを好適な固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、前記固定相上には親和性試薬が固定化されており、前記親和性試薬は、結合部位Zを含み、前記結合部位Zは、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCと可逆的結合を形成し、レセプター結合試薬の結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に結合し、それにより、標的細胞が固定相上に可逆的に固定化される、工程
を含む。
サンプルを提供する工程であって、前記サンプルは、所望の標的レセプターの組換え発現の可能性がある標的細胞を含む、工程、
結合部位Bおよび結合パートナーCを含むレセプター結合試薬を提供する工程であって、
レセプター結合試薬に含まれる結合部位Bは、標的細胞表面上の所望のレセプター分子に特異的に結合することができ、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、親和性試薬の結合部位Zに可逆的に結合することができる、工程、および
サンプルを好適な固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、前記固定相上には親和性試薬が固定化されており、前記親和性試薬は、結合部位Zを含み、前記結合部位Zは、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCと可逆的結合を形成し、レセプター結合試薬の結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に結合し、それにより、標的細胞が固定相上に可逆的に固定化される、工程
を含む。
[本発明1001]
標的細胞を単離する方法であって、該標的細胞は、標的細胞表面上にレセプター分子を有し、該方法は、
該標的細胞を含むサンプルを提供する工程、
結合部位Bおよび結合パートナーCを含むレセプター結合試薬を提供する工程であって、
該レセプター結合試薬に含まれる結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に特異的に結合することができ、該結合部位Bを介したレセプター結合試薬と該レセプター分子との結合に対する解離定数(KD)は、低親和性であるか、または該結合部位Bを介したレセプター結合試薬と該レセプター分子との結合に対する解離速度定数(koff)は、約3×10-5sec-1以上の値を有し、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、親和性試薬の結合部位Zに可逆的に結合することができる、工程、および
該サンプルを好適な固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、該固定相上には親和性試薬が固定化されており、
該親和性試薬は、結合部位Zを含み、該結合部位Zは、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCと可逆的結合を形成し、かつ該レセプター結合試薬の結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に結合し、それにより、固定相上に該標的細胞が可逆的に固定化される、工程
を含む、方法。
[本発明1002]
親和性試薬が、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合することができる2つ以上の結合部位Zを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
固定相上に競合試薬をロードする工程をさらに含み、競合作用物質は、レセプター結合試薬のパートナーCと親和性試薬の結合部位Zとの結合を破壊することができ、それにより、レセプター結合作用物質に取って代わる、本発明1001の方法。
[本発明1004]
競合試薬が、親和性試薬の結合部位Zに競合的に結合することができる、本発明1003の方法。
[本発明1005]
標的細胞を含むサンプルを固定相に適用する前に、レセプター結合試薬が、固定相上に固定化される、本発明1001~1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
サンプルが、標的細胞とさらなる細胞との混合物を含み、該さらなる細胞は、その細胞表面上に前記レセプター分子を欠き、かつ、該方法は、該さらなる細胞から該標的細胞を分離する工程を含む、本発明1001~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
レセプター結合試薬とレセプター分子との低親和性の相互作用が、約10-3~約10-7Mの範囲内のKDを有する、本発明1001~1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
標的細胞を単離する方法であって、該標的細胞は、標的細胞表面上にレセプター分子を有し、該方法は、
サンプルを提供する工程であって、該サンプルは、標的細胞およびレセプター結合試薬を含み、
該レセプター結合試薬は、結合部位Bおよび結合パートナーCを含み、該レセプター結合試薬に含まれる結合部位Bは、該レセプター分子に特異的に結合することができる、工程、および
該サンプルを好適な固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、該固定相は、ゲル濾過マトリックスおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであり、該ゲル濾過および/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、親和性試薬を含み、該親和性試薬は、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに特異的に結合する結合部位Zを含み、それにより、該標的細胞が単離される、工程
を含む、方法。
[本発明1009]
クロマトグラフィーが、カラムクロマトグラフィーまたは平面クロマトグラフィーである、本発明1001~1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
サンプルをクロマトグラフィーにかける工程が、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCが、それに特異的に結合する固定相の親和性試薬の結合部位Zと複合体を形成することを可能にし、それにより、該レセプター結合試薬が該固定相上に固定化されることを含む、本発明1008の方法。
[本発明1011]
レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCが、親和性試薬の結合部位Zに特異的に結合することができ、該親和性試薬は、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに特異的に結合することができる2つ以上の結合部位Zを含む、本発明1008または1010の方法。
[本発明1012]
アフィニティークロマトグラフィーマトリックスおよび/またはゲル濾過マトリックス上に親和性試薬が共有結合的に固定化されている、本発明1010または1011の方法。
[本発明1013]
サンプルが、競合試薬をさらに含み、該競合試薬は、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに特異的に結合する親和性試薬の結合部位Zに結合し、それにより、固定相上に該競合試薬が固定化される、本発明1008~1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
サンプルを形成する工程をさらに含み、
該サンプルを形成する工程は、
標的細胞を含む供給源サンプルを提供すること、および
該供給源サンプルにレセプター結合試薬を加えること
を含む、本発明1001~1004のいずれかの方法。
[本発明1015]
供給源サンプルが、複数の標的細胞を含むと予想され、かつ該供給源サンプルは、複数のレセプター結合試薬と接触され、予想される数の標的細胞に対して過剰量のレセプター結合試薬が提供される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
サンプルが、流体であるかまたは流体を含む、本発明1001~1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
サンプルが、体液を含む、本発明1001~1016のいずれかの方法。
[本発明1018]
体液が、血液または血液成分である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
サンプルをクロマトグラフィーにかける工程が、該サンプルをクロマトグラフィーカラムの固定相に通させることおよび該固定相を流体移動相で洗浄することを含み、該流体移動相は、レセプター結合試薬を少なくとも本質的に欠く、本発明1001~1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
サンプルをクロマトグラフィーにかける工程が、クロマトグラフィーマトリックスから標的細胞を溶出することを含む、本発明1001~1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
標的細胞を回収する工程をさらに含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
サンプルから標的細胞をクロマトグラフィー的に単離する方法であって、該標的細胞は、標的細胞表面上にレセプター分子を有し、該方法は、
該標的細胞を含むサンプルを提供する工程、
結合部位Bおよび結合パートナーCを含むレセプター結合試薬を提供する工程であって、
該レセプター結合試薬に含まれる結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に特異的に結合することができ、
該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、親和性試薬の結合部位Zに可逆的に結合することができる、工程、および
該サンプルを好適な固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、該固定相上には親和性試薬が固定化されており、
該親和性試薬は、結合部位Zを含み、該結合部位Zは、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCと可逆的結合を形成し、かつ該レセプター結合試薬の結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に結合し、それにより、該標的細胞が該固定相上に可逆的に固定化される、工程、
該親和性試薬の結合部位Zに特異的に結合する結合部位を含む競合試薬を提供する工程;
該競合試薬を第1固定相上にロードする工程であって、
それにより、(複数の)レセプター結合試薬と該レセプター分子と該親和性試薬との間に形成される非共有結合的な可逆的複合体が破壊される、工程;
該第1固定相の溶出液から溶出サンプルを回収する工程であって、該溶出サンプルは、該標的細胞を含む、工程;
該溶出サンプルを好適な第2固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、該第2固定相は、ゲル濾過マトリックスおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであり、該ゲル濾過および/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに特異的に結合する結合部位Zを有する親和性試薬を含む、工程、ならびに
該溶出サンプルを第2クロマトグラフィーカラムに通す工程
を含む、方法。
[本発明1023]
第2固定相であるアフィニティークロマトグラフィーマトリックスおよび/またはゲル濾過マトリックス上に親和性試薬が固定化されている、本発明1022の方法。
[本発明1024]
溶出サンプルを第2固定相に通す工程が、競合試薬が親和性試薬の結合部位Zと複合体を形成することを可能にすることにより、該競合試薬が第2クロマトグラフィーカラムの固定相上に固定化される工程を含む、本発明1022または1023の方法。
[本発明1025]
第1および第2固定相の各々が、カラムに含まれているか、または平面固定相である、本発明1022~1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
レセプター結合試薬の結合部位Bとレセプター分子との結合が、約10-2M~約10-10Mの範囲内の解離定数(KD)を有する、本発明1022~1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
結合部位Bを介したレセプター結合試薬とレセプター分子との結合に対する解離定数(KD)が、低親和性であるか、または結合部位Bを介したレセプター結合試薬とレセプター分子との結合に対する解離速度定数(koff)が、約3×10-5sec-1以上の値を有する、本発明1026の方法。
[本発明1028]
レセプター結合試薬の結合パートナーCと親和性試薬の結合部位Zとの可逆的結合が、約10-2~約10-13Mの範囲内の解離定数(KD)を有する、本発明1001~1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
固定相が、非磁性材料または非磁化性材料である、本発明1001~1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
固定相が、セルロース膜、プラスチック膜、多糖ゲル、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、多糖グラフトシリカ、ポリビニルピロリドングラフトシリカ、ポリエチレンオキシドグラフトシリカ、ポリ(2-ヒドロキシエチルアスパルトアミド)シリカ、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)グラフトシリカ、スチレン-ジビニルベンゼンゲル、アクリレートまたはアクリルアミドとジオールとのコポリマー、多糖とN,N'-メチレンビスアクリルアミドとのコポリマー、およびそれらのいずれか2つ以上の組み合わせのうちの一つを含むかまたはそれらのうちの一つからなる、本発明1029の方法。
[本発明1031]
アフィニティークロマトグラフィーマトリックスおよび/またはゲル濾過マトリックスが、モノリシックなマトリックス、粒状のマトリックス、または平面のマトリックスを含むかまたはそれらのいずれかからなる、本発明1001~1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
粒状のマトリックスが、約5μm~約200μmまたは約5μm~600μmまたは約5μm~1500μmの平均粒径を有する、本発明1031の方法。
[本発明1033]
アフィニティークロマトグラフィーマトリックスおよび/またはゲル濾過マトリックスが、0~約500nmの平均ポアサイズを有する、本発明1001~1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
レセプター結合試薬が、免疫グロブリン、免疫グロブリンの機能的断片、免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子、アプタマー、およびMHC分子の群から選択される、本発明1001~1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCが、ビオチン、ビオチンアナログ、ストレプトアビジン結合ペプチド、およびアビジン結合ペプチドのうちの一つを含み、かつ親和性試薬が、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン、アビジンムテイン、またはそれらの混合物を含む、本発明1001~1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
標的細胞が、哺乳動物細胞である、本発明1001~1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
標的細胞が、細胞核を有する細胞である、本発明1001~1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
標的細胞が、白血球または幹細胞である、本発明1037の方法。
[本発明1039]
白血球が、リンパ球である、本発明1038の方法。
[本発明1040]
固定相を使用するクロマトグラフィーを介して標的細胞を単離するためのレセプター結合試薬および/または親和性試薬の使用であって、該標的細胞は、標的細胞表面上にレセプター分子を有し、該レセプター結合試薬は、結合部位Bおよび結合パートナーCを含み、該レセプター結合試薬の結合部位は、該標的細胞のレセプター分子に特異的に結合することができ、該結合部位Bを介したレセプター結合試薬と該レセプター分子との結合に対する解離定数(KD)は、低親和性であるか、または該結合部位Bを介したレセプター結合試薬と該レセプター分子との結合に対する解離速度定数(koff)は、約3×10-5sec-1以上の値を有し、かつ該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、該親和性試薬の結合部位Zに可逆的に結合することができる、使用。
[本発明1041]
親和性試薬が、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合する2つ以上の結合部位Zを含む、本発明1040の使用。
[本発明1042]
レセプター結合試薬が、免疫グロブリン、免疫グロブリンの機能的断片、免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子、アプタマー、およびMHC分子のうちの一つである、本発明1040または1041の使用。
[本発明1043]
レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーが、ビオチン、ビオチンアナログ、ストレプトアビジン結合ペプチド、およびアビジン結合ペプチドのうちの一つを含み、かつ親和性試薬が、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンアナログ、アビジン、およびアビジンアナログのうちの一つを含む、本発明1040~1042のいずれかの使用。
[本発明1044]
クロマトグラフィーを介して標的細胞を単離するためのストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン、アビジンムテイン、またはそれらの混合物の使用であって、該クロマトグラフィーは、ゲル濾過クロマトグラフィーである、使用。
[本発明1045]
クロマトグラフィーが、カラムクロマトグラフィーまたは平面クロマトグラフィーである、本発明1044の使用。
[本発明1046]
ゲル濾過クロマトグラフィーが、その上にストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、アビジン、アビジンムテイン、またはそれらの混合物が固定化されている固定相で行われる、本発明1044または1045の使用。
[本発明1047]
標的細胞が、細胞核を有する細胞である、本発明1044~1046のいずれかの使用。
[本発明1048]
細胞核を有する細胞が、リンパ球である、本発明1047の使用。
[本発明1049]
細胞核を含む細胞を分離するための、セルロース膜、プラスチック膜、多糖ゲル、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、多糖グラフトシリカ、ポリビニルピロリドングラフトシリカ、ポリエチレンオキシドグラフトシリカ、ポリ(2-ヒドロキシエチルアスパルトアミド)シリカ、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)グラフトシリカ、スチレン-ジビニルベンゼンゲル、アクリレートまたはアクリルアミドとジオールとのコポリマー、多糖とN,N'-メチレンビスアクリルアミドとのコポリマー、およびそれらのいずれか2つ以上の組み合わせのうちの一つのクロマトグラフィーマトリックスの使用。
[本発明1050]
細胞核を含む細胞が、リンパ球である、本発明1049の使用。
[本発明1051]
多糖とN,N'-メチレンビスアクリルアミドとのコポリマーが、Sephacryl(登録商標)である、本発明1049または1050の使用。
[本発明1052]
多糖ゲルが、Sepharose(登録商標)である、本発明1049または1050の使用。
[本発明1053]
アガロースゲルが、Sephadex(登録商標)などの架橋デキストランゲルである、本発明1049または1050の使用。
[本発明1054]
アクリレートとジオールとのコポリマーが、Toyopearl(登録商標)である、本発明1049または1050の使用。
[本発明1055]
ポリアクリルアミドゲルが、Fractogel(登録商標)およびBio-Gel(登録商標)のうちの一つである、本発明1049または1050の使用。
[本発明1056]
クロマトグラフィーゲルが、カラムに含まれている、本発明1049~1055のいずれかの使用。
[本発明1057]
カラムが、カートリッジである、本発明1056の使用。
[本発明1058]
クロマトグラフィー用の第1および第2固定相の配置であって、該第1固定相は、細胞分離に適しており、該第1固定相は、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスによって定義され、該アフィニティークロマトグラフィーマトリックス上には親和性試薬が固定化されており、
該親和性試薬は、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合することができる少なくとも一つの結合部位Zを有し、
該第2固定相は、細胞分離に適しており、該第2固定相は、ゲル濾過マトリックスおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスであり、該アフィニティークロマトグラフィーマトリックスまたは該ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに特異的に結合する結合部位Zを有する親和性試薬を含む、配置。
[本発明1059]
少なくとも、第1固定相のアフィニティークロマトグラフィーマトリックス上に固定化された親和性試薬が、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合することができる2つ以上の結合部位Zを含む、本発明1058の配置。
[本発明1060]
第1および第2固定相の各々が、クロマトグラフィーカラムに含まれるか、または平面固定相である、本発明1058または1059の配置。
[本発明1061]
複数の第1および第2固定相を含む、本発明1058~1060のいずれかの配置。
[本発明1062]
標的細胞を単離するための部品のキットであって、該標的細胞は、標的細胞表面上にレセプター分子を有し、該キットは、
(a)結合部位Bおよび結合パートナーCを含むレセプター結合試薬であって、該レセプター結合試薬に含まれる結合部位Bは、標的細胞表面のレセプター分子に特異的に結合することができ、かつ該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、多量体化試薬上の結合部位Zに可逆的に結合することができる、レセプター結合試薬;および
(b)細胞分離に適した固定相であって、該固定相は、ゲル濾過マトリックスおよび/またはアフィニティークロマトグラフィーマトリックスによって定義され、該アフィニティークロマトグラフィーマトリックスまたは該ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィーマトリックスは、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに可逆的に結合することができる結合部位Zを有する親和性試薬を含む、固定相
を備える、キット。
[本発明1063]
固定相が、クロマトグラフィーカラムに含まれるか、または平面固定相である、本発明1062の部品のキット。
[本発明1064]
サンプル中の他の成分からの細胞分離/標的細胞分離に適した第2固定相を備え、該第2固定相は、アフィニティークロマトグラフィーマトリックスによって定義され、該アフィニティークロマトグラフィーマトリックス上には親和性試薬が固定化されており、該親和性試薬は、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCに特異的に結合することができる結合部位Zを含む、本発明1062または1063の部品のキット。
[本発明1065]
第2固定相が、クロマトグラフィーカラムに含まれるか、または平面固定相である、本発明1064の部品のキット。
[本発明1066]
標的細胞を単離する方法であって、該標的細胞は、標的細胞表面上にレセプター分子を有し、該方法は、
該標的細胞を含むサンプルを提供する工程、
一価の結合部位Bおよび結合パートナーCを含むレセプター結合試薬を提供する工程であって、該レセプター結合試薬は、一価の抗体断片、免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子、アプタマー、およびMHC分子の群から選択され、
該レセプター結合試薬に含まれる一価の結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に特異的に結合することができ、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、親和性試薬の結合部位Zに可逆的に結合することができる、工程、および
該サンプルを好適な固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、該固定相上には親和性試薬が固定化されており、該親和性試薬は、結合部位Zを含み、該結合部位Zは、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCと可逆的結合を形成し、かつ該レセプター結合試薬の結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に結合し、それにより、該固定相上に該標的細胞が可逆的に固定化される、工程
を含む、方法。
[本発明1067]
一価の抗体断片が、Fab断片、Fv断片、または一本鎖Fv断片である、本発明1066の方法。
[本発明1068]
免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子が、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、アンキリン骨格に基づくタンパク質、結晶骨格に基づくタンパク質、アドネクチン、およびアビマーからなる群より選択される、本発明1066の方法。
[本発明1069]
固定相を使用するクロマトグラフィーを介して標的細胞を単離するためのレセプター結合試薬および/または親和性試薬の使用であって、該標的細胞は、標的細胞表面上にレセプター分子を有し、
該レセプター結合試薬は、一価の抗体断片、免疫グロブリン様機能を有するタンパク質性結合分子、アプタマー、およびMHC分子の群から選択され、
該レセプター結合試薬は、結合部位Bおよび結合パートナーCを含み、該レセプター結合試薬の結合部位は、該標的細胞のレセプター分子に特異的に結合することができ、
該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、該親和性試薬の結合部位Zに可逆的に結合することができる、使用。
[本発明1070]
標的細胞を精製するための装置であって、本発明1058~1061において定義されたクロマトグラフィー用の第1および第2固定相の少なくとも一つの配置を備える、装置。
[本発明1071]
直列で流体連結されている第1および第2固定相の複数の配置をさらに備える、本発明1070の装置。
[本発明1072]
クロマトグラフィー用の第1および第2固定相の第1配置の第1固定相に流体連結されているサンプル入口を備える、本発明1071の装置。
[本発明1073]
精製された標的細胞用のサンプル出口を備え、該サンプル出口は、クロマトグラフィー用の第1および第2固定相の少なくとも一つの配置の最後の配置の第2固定相に流体連結されている、本発明1072の装置。
[本発明1074]
クロマトグラフィー用の第1および第2固定相の配置の第1固定相の少なくとも一つに流体連結されている競合試薬容器を備える、本発明1070~1073のいずれかの装置。
[本発明1075]
標的細胞表面上の所望のレセプター分子の組換え発現についての標的細胞のスクリーニング方法であって、ここで該所望のレセプター分子は、標的細胞表面上に発現され、該方法は、
サンプルを提供する工程であって、該サンプルは、該所望の標的レセプターの組換え発現の可能性がある標的細胞を含む、工程、
結合部位Bおよび結合パートナーCを含むレセプター結合試薬を提供する工程であって、
該レセプター結合試薬に含まれる結合部位Bは、標的細胞表面上の該所望のレセプター分子に特異的に結合することができ、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCは、親和性試薬の結合部位Zに可逆的に結合することができる、工程、および
該サンプルを好適な固定相でのクロマトグラフィーにかける工程であって、該固定相上には親和性試薬が固定化されており、
該親和性試薬は、結合部位Zを含み、該結合部位Zは、該レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCと可逆的結合を形成し、かつ該レセプター結合試薬の結合部位Bは、標的細胞表面上のレセプター分子に結合し、それにより、固定相上に該標的細胞が可逆的に固定化される、工程
を含む、方法。
[本発明1076]
所望のレセプター分子が、標的細胞にとって内因性または外来性である、本発明1075のスクリーニング方法。
[本発明1077]
標的細胞が、所望のレセプター分子をコードする核酸でトランスフェクトされている、本発明1075または1076のスクリーニング方法。
本発明は、細胞および他の生物学的実体、例えば、細胞小器官、ウイルス、リポソームなどの流体クロマトグラフィー分離を行う方法および装置を提供する(ゆえに、以下における標的細胞に対する言及には、他のすべての生物学的実体に対する言及も含まれる)。標的細胞または標的細胞の集団は、例えば、種々の異なる細胞または細胞集団を含み得るサンプルから単離される。表面上に少なくとも一つの共通のレセプター分子を有する実質的に任意の前記標的細胞は、サンプルに含まれる他の成分から分離され得る。本明細書において記載されるようなアフィニティークロマトグラフィーに対して下記で論じられるようなアビディティー効果を達成するために、レセプター分子は、典型的には、標的細胞の表面上に2コピー以上で存在する。本明細書において使用される用語「(標的)細胞」は、膜(脂質二重層も含み得る)がその内部と外部環境(周囲の環境)とを隔て、生物学的実体/小胞の表面上に1種または複数種の特定のレセプター分子を含む、すべての生物学的実体/小胞を包含する。これは、標的細胞/生物学的実体/小胞または標的細胞の集団が、その表面上に少なくとも一つの共通の特定のレセプター分子が存在していることによって定義されることを意味している。本明細書において使用される「単離」は、標的細胞が、標的細胞を単離するためのサンプルの含有率(濃度)と比べて、本発明の方法の結果として得られるサンプル中で濃縮されていることを意味する。これは、標的細胞が、例えば、サンプル中の全細胞量の約0.1%というおおよその含有率から、本発明の方法によって回収されたサンプル中の約10%以上または20%以上、30%以上、40%以上にまで、サンプル中で濃縮され得ることを意味している。「単離された」は、得られたサンプルが、本質的に唯一の種類の細胞(細胞集団)として標的細胞を含むこと、例えば、標的細胞が、サンプル中に存在する細胞の75%超または80%超または85%超または90%超または95%超または97%超または99%超であることも意味する。「単離された」は、標的細胞を含むサンプルが、本発明の単離/精製方法が行われた後に、反応体(例えば、本明細書において定義されるようなレセプター結合試薬または競合試薬)を欠くことも含む。用語「単離」は、サンプル中の標的細胞の不存在の存在の検出も含む。したがって、標的細胞の単離は、分析的または調製的な目的で(例えば、標的細胞集団の存在の検出のためだけでなく、サンプル中に存在する細胞の定量または細胞ベースの治療に向けた大規模な細胞の単離のためにも)使用され得る。分析的な目的には、診断的用途、ならびに、例えば、特定のレセプター分子、例えば、Gタンパク質共役レセプター(GPCR)または他の任意の生理的に関連性のあるレセプター(例えば、インスリンレセプター)が、選択された宿主細胞において組換え的に発現されているか否かのスクリーニング目的で本発明の単離方法が使用される基礎研究における用途が含まれる(下記も参照のこと)。
と記述される二状態プロセスによって記載され得る。このプロセスの対応する解離Kd定数は、
として定義される。これらの式において、[A]、[B]、および[AB]は、所与の温度および所与の圧力における、レセプター、レセプター結合試薬(リガンド)、およびそれぞれの複合体の平衡モル濃度である。解離Kd定数はまた、会合速度定数とも呼ばれる複合体の会合/形成の速さについての会合速度の定数(kon)と、解離速度定数とも呼ばれる複合体の解離についての解離速度の定数(koff)との比として
で表現され得る。この点において、解離定数Kdは、平衡に達した状態を定義することに注意する。しかしながら、平衡は、クロマトグラフィー分離の条件下において生じない可能性がある。これは、いくつかの態様において、可逆的結合が、本発明の文脈において3×10-5sec-1以上であり得る、すなわち、助数詞(sec-1)で少なくとも3×10-5sec-1と等しいあり得ると判定し得るのが、解離定数Kdではなく解離速度の定数(koff)である理由を説明し得る。
本実施例では、細胞表面マーカーに対する組換え的に生成されたFab断片を、レセプター結合試薬として使用する。そのFab断片は、大腸菌(E.coli)または他の宿主において組換え的に発現され、結合パートナーCとしてストレプトアビジン結合ペプチドを含む。四量体ストレプトアビジンまたは四量体ストレプトアビジンムテインが、一つまたは複数の結合部位Zを提供する。Fab断片は、ストレプトアビジンに結合され、そのストレプトアビジン自体は、ビーズに共有結合的に連結されている。これらのビーズを、そのFab断片が結合できる細胞外タンパク質(レセプター分子)を有する細胞の亜集団を含む細胞懸濁液のアフィニティーカラムクロマトグラフィーのために使用する。結合しなかった細胞は、この「選択カートリッジ」において洗い流される一方で、結合した細胞は、続いて、Fab断片(レセプター結合試薬として作用する)のストレプトアビジン結合ペプチドとストレプトアビジンムテインとの結合を破壊するビオチン含有緩衝液によって溶出される。結果として、細胞と結合したFab断片が、カラムから放出され、アビディティー効果がなくなることに起因して、Fab断片は標的細胞から解離する。ここで、その懸濁液は、ストレプトアビジンと共有結合的に結合した別のゲル(クロマトグラフィー)マトリックスを使用する第2のカラムクロマトグラフィー(除去カートリッジ)によって、残留Fab断片およびビオチンから精製され得、それにより、細胞は空隙容量に溶出し、Fab断片およびビオチンはクロマトグラフィーマトリックス上に定量的に結合する。ここで、それらの細胞は、同様の方法で、異なるFab断片または他の任意のレセプター結合試薬を使用するさらなる精製サイクルにかけられ得る。Fab断片を有するカラム(選択カートリッジ)ならびにFabおよびビオチン除去用のその後のカラム(除去カートリッジ)は、カラムを次々と直線的に単純に並べることによって連続した様式で組み合わされ得る。そうすることによって、磁気ビーズを欠くかまたはいかなる手作業による中断(manual interference)もない、標的細胞の迅速かつ容易なコスト効率の高い精製を可能にする、図6に示されているような自動化された細胞精製システムが、本発明によって提供され得る。
材料および方法
標準的な手順でPCMBを単離するためにヒト血液を使用した。
Sephadex G50(Sigma)を、固定相として使用し、CNBr法を用いてStrep-tactin(登録商標)(組換えストレプトアビジン変種, IBA GmbH, Germany)と共有結合的に結合した。Sephadex G50の50%懸濁液は、共有結合的に結合した70マイクログラムのStrep-tactin(登録商標)/mlビーズ懸濁液を含んだ。Strep-tactin(登録商標)は、レセプター結合試薬および標的細胞を含むサンプルを加える前に親和性マトリックスに固定化された親和性試薬として働いた。重鎖がカルボキシ末端で2つのストレプトアビジン結合モジュールの連続配置(SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK,),IBA GmbH, Gottingen, Germanyから商業的に入手可能(カタログ番号:6-8003))と融合されたCD8+結合Fab断片を、(一価の)レセプター結合試薬として使用し、ストレプトアビジン結合ペプチドは、結合パートナーCとして働いた。
ビオチン溶出後の細胞(6 mlの緩衝液)を、Strep-Tactin(登録商標)(IBA GmbH, Gottingen, Germany)が300 nmolビオチン/mlの結合能で共有結合的に付着されたSuperflow(商標)Sepharose(登録商標)ビーズのカラム(6 mlの床体積)に直接通したことを除いては上に記載されたように、CD8+細胞を単離した。そのSuperflow(商標)Sepharose(登録商標)ビーズは、標的細胞を単離/濃縮するためのゲル浸透マトリックスとして働く一方で、そのビーズ上に固定化されたStrep-Tactin(登録商標)は、ストレプトアビジン結合ペプチドを備えるCD8+Fab断片とビオチンの両方に対して結合親和性を有する。したがって、Strep-Tactin(登録商標)は、ビオチンおよびCD8+Fab断片に対する親和性/除去試薬として働いた。Superflowビーズで満たされたこの第2カラム(除去カートリッジとして作用した)の溶出液(6 ml)を回収した。
実験2に記載されたような最終的な画分は、ビオチンおよびFab(この両方ともが、Strep-Tactin(登録商標)上のFab結合部位を遮断することによって、その後の精製手順を妨げ得る)を含まなかったので、精製されたCD8+細胞は、例えば、CD25+Fab断片(または単離されたCD8+標的細胞の表面上に存在する他の任意のレセプター分子)を使用する、別の精製サイクルに進むことができる。そのようなT細胞の連続精製は、例えば、図6aまたは図6bに描かれている装置を使用して行うことができる。
この実験では、実施例1および2において細胞を精製するために使用された(「3次元」)カラムクロマトグラフィーマトリックス(Strep-Tactin(登録商標)でコーティングされたビーズ)を、Strep-Tactin(登録商標)でコーティングされた平面マトリックスで置き換えた。
実験手順:
1)ニトロセルロース膜へのStrep-Tactin(登録商標)の非共有結合的付着およびCD8+T細胞の精製
その膜へのStrep-Tactin(登録商標)の非共有結合的付着のために、ニトロセルロース膜片(24cm2, Whatman, UK)をペトリ皿に置き、10 mlのPBS中の4mgのStrep-tactin(登録商標)(IBA GmbH)とともに10分間インキュベートし、次いで、20 mlのPBSで5回洗浄した。次いで、5マイクログラムのCD8+Fab断片(カタログ番号:6-8003-005, IBA GmbH, Gottingen, 前出)を5 mlのPBSに加え、4℃で5分間インキュベートした。次いで、FACS緩衝液(PBS pH7.4中の0.5%BSA(w/v))中の500万個の細胞(PBMC)を加え、4℃で10分間インキュベートした。次いで、その膜を、10 mlのFACS緩衝液で5回洗浄し、洗浄画分をFACS解析のために回収した。次いで、その膜を、1 mmolのビオチンを含む10 mlのFACS緩衝液中で5分間インキュベートした。得られた画分を、FACS解析のために回収した。
3 mlのSuperflow Strep-Tactin(登録商標)(300ナノモルのビオチン結合, IBA GmbH, Gottingen, Germany))をミニカラム(Mobitec, Gottingen, Germany)上にロードした。そのカラムを緩衝液(PBS+0.5%ウシ血清アルブミン,「FACS緩衝液」)で平衡化し、次いで、CD8に対する12マイクログラムのFab(カタログ番号:6-8003, IBA GmbH, Gottingen)とともに予めインキュベートしておいたヒト血液由来のPBMC(0.2 mlのFACS緩衝液中1000万個の細胞)をロードした(上で述べたように、このFab断片の重鎖は、カルボキシ末端で、2つのストレプトアビジン結合モジュール
の連続配置と融合された。このカラムは、本明細書において定義されるような選択カートリッジとして作用する。このカラムを、重力流により12 mlのFACS緩衝液で洗浄し、次いで、1 mMビオチンを含む12 mlのFACS緩衝液を用いて溶出を行った。
10μgの抗CD8Fab断片(カタログ番号:6-8003, IBA GmbH, Gottingen)で機能付与された500μlのStrep-Tactin(登録商標)-アガロース(Superflow(商標)Agaroseと比べて排除サイズが小さい架橋アガロースをAgarose Beads Technologies, Madrid, Spainから入手した)ビーズ樹脂から調製されたカラムを使用することによって、ヒトCD8+細胞を、密度勾配(Ficoll)精製されたPBMCから単離した。この目的のために、2つのストレプトアビジン結合モジュール
の連続配置を重鎖のC末端に有するFab断片を、細胞精製の前に、1000μlのFab含有洗浄緩衝液(PBS+0.5%ウシ血清アルブミン)をカラムの上に300μl/分の速度でポンピングすることによって、Strep-Tactin(登録商標)-アガロースマトリックス上にロード(固定化)した。標的細胞を精製するために、1×108個の調製されたばかりのPBMC(2 mlの洗浄緩衝液中)を、300μl/分の流速で蠕動ポンプを用いてカラム上に自動的にロードした。続いて、合計7 mlの洗浄緩衝液による2 ml/分の速度での反復洗浄サイクル(4×)によって、未結合(CD8陰性)の細胞をカラムから除去した。最後に、5 mlの100μM D-ビオチン溶液を加え(V=600μl/分)、5 mlの洗浄緩衝液によって2 ml/分で溶出することによって、結合した細胞を親和性マトリックスから除去することによってカラムからCD8+標的細胞を溶出した。得られたCD8陽性および陰性画分をフローサイトメトリーによって解析した。CD8+標的細胞は、80%の収率および88%の純度で精製された。開始画分、陰性画分、および陽性画分のそれぞれのドットプロット、ならびに代表的な選択の対応する純度および収率を図7に示す。
30μgの抗CD8Fab断片(カタログ番号: 6-8003, IBA GmbH, Gottingen)で機能付与された1200μlのStrep-Tactin(登録商標)-アガロース(Superflow(商標)アガロースと比べて排除サイズが小さい架橋アガロースをAgarose Beads Technologies Madrid, Spainから入手した)ビーズ樹脂から調製されたカラムを使用することによって、ヒトCD8+細胞を全血から精製した。この目的のために、2つのストレプトアビジン結合モジュール
の連続配置を重鎖のC末端に有するFab断片を、細胞精製の前に、1500μlのFab断片含有洗浄緩衝液(PBS+0.5%ウシ血清アルブミン)をカラムの上に300μl/分の速度でポンピングすることによって、Strep-Tactin(登録商標)-アガロースマトリックス上に固定化した。標的細胞を精製するために、10 mlの採取したばかりの全血(洗浄緩衝液で1:1希釈したもの)を、300μl/分の流速で蠕動ポンプを用いてカラム上に自動的にロードした。続いて、合計13 mlの洗浄緩衝液による2 ml/分の速度での反復洗浄サイクル(4×)によって、未結合(CD8陰性)の細胞をカラムから除去した。最後に、10 mlの100μM D-ビオチン溶液を加え(V=600μl/分)、10 mlの洗浄緩衝液によって2 ml/分で溶出することによって、結合した細胞を親和性マトリックスから除去することによってカラムからCD8+標的細胞を溶出した。得られたCD8陽性および陰性画分をフローサイトメトリーによって解析した。CD8+標的細胞は、80%の収率および88%の純度で精製された。開始画分、陰性画分、および陽性画分のそれぞれのドットプロット、ならびに代表的な選択の対応する純度および収率を図8に示す。
2μgの抗CD4Fab断片で機能付与された80μlのStrep-Tactin(登録商標)-アガロースビーズ樹脂(Superflow(商標)アガロースと比べて排除サイズが小さい架橋アガロースをAgarose Beads Technologies, Madrid, Spainから入手した)をロードされたピペットチップを使用することによって、CD4+細胞を、脾細胞から単離した。そのピペットチップは、Phynexus Inc., USAによって、アガロース材料で満たされた。2つのストレプトアビジン結合モジュール
の連続配置を重鎖のC末端に有する使用されたFab断片は、CD4結合抗体GK1.5(Dialynas DP et al., Immunol Rev. 1983;74:29-56, GenBank Entryカッパー軽鎖:M84148.1GenBank Entry重鎖:M84149.1)の野生型可変ドメインを含んだ。細胞精製の前に、Streptactin(登録商標)-アガロースマトリックス上へのFab断片のロード/固定化が、手持ち式の電子ピペットを用いて400μlのFab断片含有洗浄緩衝液(PBS+0.5%ウシ血清アルブミン)を300μl/分の速度でアガロースクロマトグラフィーマトリックス上にピペッティングすることによって、行われた。標的細胞を精製するために、1×107個のマウス脾細胞(0.5 mlの洗浄緩衝液中)を、300μl/分の速度でピペットを使用して3回繰り返されるサンプルの上下サイクルによって、チップ内に存在するクロマトグラフィーマトリックス上に適用した。細胞を含む緩衝液を上下に動かすこの「バッチ様」クロマトグラフィー手順は、クロマトグラフィーマトリックス上に細胞を固定化するために流動ベースの方法を使用する手順と等価である。続いて、1 mlの洗浄緩衝液によって2 ml/分の速度で3回繰り返し洗浄することによって(洗浄緩衝液を上下にピペッティングすることによって)未結合(CD4陰性)の細胞をチップから除去した。最後に、1 mlの100μM D-ビオチン溶液を加え(V=600μl/分)、2 ml(2×1 ml)の洗浄緩衝液によって流速2 ml/分で溶出することによって、結合した細胞を親和性マトリックスから除去することによってチップからCD4+標的細胞を溶出した。得られたCD4陽性および陰性画分をフローサイトメトリーによって解析した。CD8+標的細胞は、95%の収率および85%の純度で精製された。開始画分、陰性画分、および陽性画分のそれぞれのドットプロット、ならびに代表的な選択の対応する純度および収率を図9に示す。
2μgの抗CD4Fab断片で機能付与された80μlのStrep-Tactin(登録商標)-アガロース(Superflow(商標)Agaroseと比べて排除サイズが小さい架橋アガロースをAgarose Beads Technologies, Madrid, Spainから入手した)ビーズ樹脂をロードされたピペットチップを使用することによって、ヒトCD4+細胞を、密度勾配(Ficoll)精製されたPBMCから単離した。使用されたCD4Fab断片は、米国特許第7,482,000号およびBes, C, et al. J Biol Chem 278, 14265-14273(2003))に記載されている13B8.2Fab断片の変異体だった。「m13B8.2」と呼ばれる変異体Fab断片は、米国特許第7,482,000号に記載されているように、CD4結合マウス抗体13B8.2の可変ドメイン、ならびに重鎖に対してはガンマ1タイプ(type gamma1)の定常ヒトCH1ドメインおよびカッパータイプの定常ヒト軽鎖ドメインからなる定常ドメインを有する。m13B8.2における13B8.2Fab断片の可変ドメインと比べて、軽鎖の91位のHis残基(SEQ ID NO: 2における93位)は、Alaに変異しており、重鎖の53位のArg残基(SEQ ID NO: 1における55位)は、Alaに変異している。さらに、Fab断片m13B8.2は、2つのストレプトアビジン結合モジュール
の連続配置を重鎖のC末端に有する。そのFab断片を、細胞精製の前に手持ち式の電子ピペットを用いて200μlのFab断片含有洗浄緩衝液を300μl/分の速度でピペッティングすることによって、Strep-Tactin(登録商標)-アガロースマトリックス上に固定化した。標的細胞を選択するために、1×107個の調製したばかりのPBMC(0.5 mlの洗浄緩衝液中)(PBS+0.5%ウシ血清アルブミン)を、300μl/分の速度でピペットを使用して3回繰り返されるサンプルの上下サイクルによって、チップ内に存在するクロマトグラフィーマトリックス上に自動的に適用した。続いて、1 mlの洗浄緩衝液によって2 ml/分の速度で3回繰り返し洗浄することによって(洗浄緩衝液を上下にピペッティングすることによって)、未結合(CD4陰性)の細胞をチップから除去した。最後に、1 mlの100μM D-ビオチン溶液を加え(V=600μl/分)、2 ml(2×1 ml)の洗浄緩衝液によって2 ml/分の流速で溶出することによって、結合した細胞を親和性マトリックスから除去することによってチップからCD4+標的細胞を溶出した。得られたCD4陽性および陰性画分をフローサイトメトリーによって解析した。CD4+標的細胞は、90%の収率および99%の純度で精製された。開始画分、陰性画分、および陽性画分のそれぞれのドットプロット、ならびに代表的な選択の対応する純度および収率を図10に示す。
0.5μgの抗CD4Fab断片で機能付与された80μlのStrep-Tactin(登録商標)-アガロース(Superflow(商標)Agaroseと比べて排除サイズが小さい架橋アガロースをAgarose Beads Technologies, Madrid, Spainから入手した)ビーズ樹脂をロードされたピペットチップを使用することによって、CD4+細胞を全血から単離した。実施例9において使用されたCD4結合Fab断片m13B8.2を、実施例10でも使用した。そのFab断片を、細胞単離の前に手持ち式の電子ピペットを用いて200μlのFab含有洗浄緩衝液を300μl/分の速度でピペッティングすることによって、Strep-Tactin(登録商標)-アガロースマトリックス上に固定化した。標的細胞を単離するために、2 mlの採取したばかりの全血(洗浄緩衝液で1:1希釈したもの)(PBS+0.5%ウシ血清アルブミン)を、300μl/分の速度でピペットを使用して3回繰り返される上下サイクルによって、チップ内に存在するクロマトグラフィーマトリックス上に自動的に適用した。続いて、1 mlの洗浄緩衝液によって2 ml/分の速度で5回繰り返し洗浄することによって(上下にピペッティングすることによって)未結合(CD4陰性)の細胞をチップから除去した。最後に、1 mlの100μM D-ビオチン溶液を加え(V=600μl/分)、2 ml(2×1 ml)の洗浄緩衝液によって2 ml/分で溶出することによって、結合した細胞を親和性マトリックスから除去することによってチップからCD4+標的細胞を溶出した。得られたCD4陽性および陰性画分をフローサイトメトリーによって解析した。CD4+標的細胞は、88%の収率および70%の純度で精製された。開始画分、陰性画分、および陽性画分のそれぞれのドットプロット、ならびに代表的な選択の対応する純度および収率を図11に示す。
SEQUENCE LISTING
<110> JUNO THERAPEUTICS GMBH
<120> Chromatographic isolation of cells and other complex biological
materials
<150> US 61/602,150
<151> 2012-02-23
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 253
<212> PRT
<213> human
<220>
<223> Heavy Chain of Fab Fragment m13B8.2
<400> 1
Ala Met Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr
20 25 30
Thr Phe Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Val Ile Trp Ala Ser Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Val Pro
50 55 60
Phe Met Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val
65 70 75 80
Phe Phe Lys Leu Asn Ser Leu Gln Pro Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Lys Asn Asp Pro Gly Thr Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser
210 215 220
Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
245 250
<210> 2
<211> 218
<212> PRT
<213> human
<220>
<223> Light Chain of Fab Fragment m13B8.2
<400> 2
Ala Met Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Gly Glu Thr Val Thr Phe Thr Cys Arg Ala Ser Glu Met Ile Tyr
20 25 30
Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu
35 40 45
Leu Val His Asp Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Thr Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala His Tyr Gly Asn
85 90 95
Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ile
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Ser
210 215
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> streptavidin-binding peptide
<400> 3
Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HA-tag
<400> 4
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> VSV-G.tag
<400> 5
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> HSV-tag
<400> 6
Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp
1 5 10
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> T7 epitope
<400> 7
Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> myc-epitope
<400> 8
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> V5-tag
<400> 9
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> MAT-tag
<400> 10
His Asn His Arg His Lys His Gly Gly Gly Cys
1 5 10
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> streptavidin mutein
<400> 11
Val Thr Ala Arg
1
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> streptavidin mutein analog
<400> 12
Ile Gly Ala Arg
1
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> streptavidin binding module
<400> 13
Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys
20 25 30
Claims (52)
- T細胞を単離する方法であって、該T細胞は、T細胞表面上にレセプター分子を有し、該方法は、
一つまたは複数のT細胞を含むサンプルを提供する工程、
(i)一価の結合部位Bを含む一価の抗体断片と(ii)ストレプトアビジン結合ペプチドを含む結合パートナーCとを含むレセプター結合試薬を提供する工程であって、該一価の結合部位Bは、約10-3~約10-7Mの範囲内にある解離定数(KD)で、または、約3×10-5sec-1以上の解離速度定数(koff)で、該レセプター分子に特異的に結合することができる、工程、
非磁性または非磁化性の固定相でのクロマトグラフィーに該サンプルをかける工程であって、
該固定相は、その上に固定化されているストレプトアビジンムテインを含む親和性試薬を有しており、
該ストレプトアビジンムテインは、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列に基づいて、44位にGluの代わりに疎水性脂肪族アミノ酸、45位に任意のアミノ酸、46位に疎水性脂肪族アミノ酸、および47位にValの代わりに塩基性アミノ酸を含み、
該ストレプトアビジンムテインは、該結合パートナーCと可逆的に結合するビオチン結合部位Zを含み、かつ
該一価の結合部位Bは、該T細胞表面上のレセプター分子に結合し、それにより、該一つまたは複数のT細胞が該固定相上に可逆的に固定化される、工程、および
該固定相から該一つまたは複数のT細胞を溶出し、それにより、結合したレセプター結合試薬から遊離の少なくとも一つのT細胞を分離する工程
を含む、方法。 - 溶出する前に、固定相上に競合試薬をロードする工程をさらに含み、競合試薬は、ビオチン結合部位Zに競合的に結合して、結合パートナーCとビオチン結合部位Zとの結合を破壊し、それにより、ストレプトアビジンムテインからレセプター結合試薬を除去し、かつ、レセプター分子からレセプター結合試薬を除去する、請求項1記載の方法。
- 固定相から溶出した一つまたは複数のT細胞を回収する工程を含む、請求項1または2記載の方法。
- サンプルを固定相に適用する前に、レセプター結合試薬が、固定相上に固定化される、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。
- 結合していないレセプター結合試薬と競合試薬とを含むサンプルからT細胞を単離する方法であって、該方法は、
クロマトグラフィーカラムに含まれる非磁性または非磁化性の固定相でのクロマトグラフィーに該サンプルをかける工程であって、
該サンプルは、一つまたは複数のT細胞、競合試薬、および結合していないレセプター結合試薬を含み、該レセプター結合試薬は、(i)該T細胞表面上のレセプター分子に特異的に結合する一価の結合部位Bを含む一価の抗体断片と(ii)ストレプトアビジン結合ペプチドを含む結合パートナーCとを含み、かつ、
該固定相は、その上に固定化されているストレプトアビジンムテインを含む親和性試薬を含み、
該ストレプトアビジンムテインは、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列に基づいて、44位にGluの代わりに疎水性脂肪族アミノ酸、45位に任意のアミノ酸、46位に疎水性脂肪族アミノ酸、および47位にValの代わりに塩基性アミノ酸を含み、
該ストレプトアビジンムテインは、該結合パートナーCおよび該競合試薬に特異的に結合するビオチン結合部位Zを含む、工程、
該親和性試薬と該結合パートナーCおよび該競合試薬との結合を可能にする条件下で該サンプルを該固定相とインキュベートする工程、および、
結合したレセプター結合試薬および該競合試薬から遊離の少なくとも一つのT細胞を、該固定相から溶出する工程
を含む、方法。 - 固定相が、その上に固定化されている親和性試薬を有するゲル濾過マトリックスを含む、請求項5記載の方法。
- サンプルからT細胞をクロマトグラフィー的に単離する方法であって、該T細胞は、T細胞の表面上にレセプター分子を有し、該方法は、
一つまたは複数のT細胞を含むサンプルおよびレセプター結合試薬を提供する工程であって、該レセプター結合試薬が、(i)約10-3~約10-7Mの範囲内にある解離定数(KD)で、または約3×10-5sec-1以上の解離速度定数(koff)で、該T細胞表面上のレセプター分子に特異的に結合する一価の結合部位Bを含む一価の抗体断片と(ii)ストレプトアビジン結合ペプチドを含む結合パートナーCとを含む、工程、
第1クロマトグラフィーカラムに含まれる非磁性または非磁化性の第1固定相でのクロマトグラフィーに該サンプルをかける工程であって、
該第1固定相は、その上に固定化されているストレプトアビジンムテインを含む第1親和性試薬を有し、
該ストレプトアビジンムテインは、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列に基づいて、44位にGluの代わりに疎水性脂肪族アミノ酸、45位に任意のアミノ酸、46位に疎水性脂肪族アミノ酸、および47位にValの代わりに塩基性アミノ酸を含み、
該ストレプトアビジンムテインは、該結合パートナーCと可逆的に結合する第1ビオチン結合部位Zを含み、かつ
該一価の結合部位Bは、該T細胞表面上のレセプター分子に結合し、それにより、該一つまたは複数のT細胞が該固定相上に可逆的に固定化される、工程、
競合試薬を該第1固定相上にロードする工程であって、該競合試薬は、該第1ビオチン結合部位Zに競合的に結合し、該第1ビオチン結合部位Zに対する該結合パートナーCの結合を破壊し、それにより、ストレプトアビジンムテインからレセプター結合試薬を除去し、かつ、レセプター分子からレセプター結合試薬を除去する、工程、
該第1固定相から溶出サンプルを回収する工程であって、該溶出サンプルは、該一つまたは複数のT細胞、該競合試薬、および、結合していないレセプター結合試薬を含む、工程、
第2クロマトグラフィーカラムに含まれる非磁性または非磁化性の第2固定相でのクロマトグラフィーに該溶出サンプルをかける工程であって、該第2固定相は、その上に固定化されているストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインを含む第2親和性試薬を有し、該ストレプトアビジンまたは該ストレプトアビジンムテインは、該結合パートナーCおよび該競合試薬に特異的に結合する第2ビオチン結合部位Zを含む、工程、ならびに
該第2親和性試薬が該結合パートナーCおよび該競合試薬と結合するのに十分な条件下で、該溶出サンプルを第2固定相に通し、それにより、結合したレセプター結合試薬および該競合試薬から遊離の少なくとも一つのT細胞を含むサンプルを得る工程
を含む、方法。 - 第2親和性試薬がストレプトアビジンムテインを含む、請求項7記載の方法。
- 第2固定相が、その上に固定化されている親和性試薬を有するゲル濾過マトリックスを含む、請求項7または8記載の方法。
- koff速度が、約3×10-5sec-1以上の場合、結合部位Bとレセプター分子との結合が、約1×10-4sec-1以上、約2.0×10-4sec-1以上、約3×10-4sec-1以上、約4×10-4sec-1以上、約5×10-4sec-1以上、約1×10-3sec-1以上、約5×10-3sec-1以上、約1×10-2sec-1以上、約5×10-2sec-1以上、約1×10-1sec-1以上、または約5×10-1sec-1以上のkoff速度を有する、請求項1~4および7~9のいずれか一項記載の方法。
- koff速度が、約3×10-5sec-1以上の場合、結合部位Bとレセプター分子との結合が、約1×10-2sec-1以上、約5×10-2sec-1以上、約1×10-1sec-1以上、または約5×10-1sec-1以上のkoff速度を有する、請求項1~4および7~10のいずれか一項記載の方法。
- 結合パートナーCとビオチン結合部位Zとの結合が、約10-2~約10-13Mの範囲内の解離定数(KD)を有する、請求項1~6、10、および11のいずれか一項記載の方法。
- 結合パートナーCと第1および/または第2ビオチン結合部位Zとの結合が、約10-2~約10-13Mの範囲内の解離定数(KD)を有する、請求項7~11のいずれか一項記載の方法。
- 結合パートナーCとビオチン結合部位Zとの結合が、ビオチン結合部位Zと競合試薬との結合よりも低親和性を有する、請求項1~6および10~12のいずれか一項記載の方法。
- 結合パートナーCと第1および/または第2ビオチン結合部位Zとの結合が、第1および/または第2ビオチン結合部位Zと競合試薬との結合よりも低親和性を有する、請求項7~11および13のいずれか一項記載の方法。
- ストレプトアビジンムテインが、野生型ストレプトアビジンの配列44~47位にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47を含む、または野生型ストレプトアビジンの配列44~47位にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47を含む、請求項1~15のいずれか一項記載の方法。
- ストレプトアビジンムテインが、野生型ストレプトアビジンアミノ酸配列のアミノ酸10~16の領域にあるアミノ酸から開始するN末端アミノ酸残基、および野生型ストレプトアビジンアミノ酸配列のアミノ酸133~142の領域で終結するC末端アミノ酸残基を含む、請求項1~16のいずれか一項記載の方法。
- ストレプトアビジン結合ペプチドが、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO:3)を含む、請求項1~17のいずれか一項記載の方法。
- ストレプトアビジン結合ペプチドが、SEQ ID NO:3に記載されている配列を各々が含む2つ以上の個別の結合モジュールを含む、請求項1~18のいずれか一項記載の方法。
- ストレプトアビジン結合ペプチドが、配列SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO:13)を含む、請求項1~19のいずれか一項記載の方法。
- 競合試薬が、ビオチンまたはビオチンアナログである、請求項2~20のいずれか一項記載の方法。
- 固定相が、セルロース膜、プラスチック膜、多糖ゲル、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、多糖グラフトシリカ、ポリビニルピロリドングラフトシリカ、ポリエチレンオキシドグラフトシリカ、ポリ(2-ヒドロキシエチルアスパルトアミド)シリカ、ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)グラフトシリカ、スチレン-ジビニルベンゼンゲル、アクリレートまたはアクリルアミドとジオールとのコポリマー、多糖とN,N'-メチレンビスアクリルアミドとのコポリマー、もしくは、それらのいずれか2つ以上の組み合わせを含むかまたはそれらのいずれかからなる、請求項1~6および10~21のいずれか一項記載の方法。
- 固定相が、モノリシックなマトリックスまたは粒状のマトリックスを含むかまたはそれらのいずれかからなる、請求項1~6および10~22のいずれか一項記載の方法。
- 粒状のマトリックスが、約5μm~約200μmまたは約5μm~約600μmまたは約5μm~約1500μmの平均粒径を有する、請求項23記載の方法。
- 固定相が、0~約500nmの平均ポアサイズを有する、請求項1~6および10~24のいずれか一項記載の方法。
- 一価の抗体断片が、Fab断片、Fv断片、および一本鎖Fv断片からなる群より選択される、請求項1~25のいずれか一項記載の方法。
- サンプルが体液であるかまたは体液を含む、請求項1~26のいずれか一項記載の方法。
- サンプルが血液または血液成分である、請求項1~27のいずれか一項記載の方法。
- レセプター分子がCD4またはCD8である、請求項1~28のいずれか一項記載の方法。
- T細胞を単離するための部品のキットであって、該T細胞は、T細胞表面上にレセプター分子を有し、該キットは、
(a)(i)一価の結合部位Bを含む一価の抗体断片と(ii)ストレプトアビジン結合ペプチドとを含む結合パートナーCを含むレセプター結合試薬であって、該一価の結合部位Bは、約10-3~約10-7Mの範囲内にある解離定数(KD)で、または、約3×10-5sec-1以上の解離速度定数(koff)で、T細胞表面のレセプター分子に特異的に結合する、レセプター結合試薬、および
(b)クロマトグラフィーカラムに含まれ、細胞分離に適した非磁性または非磁化性の固定相であって、
該固定相は、その上に固定化されているストレプトアビジンムテインを含む親和性試薬を有し、
該ストレプトアビジンムテインは、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列に基づいて、44位にGluの代わりに疎水性脂肪族アミノ酸、45位に任意のアミノ酸、46位に疎水性脂肪族アミノ酸、および47位にValの代わりに塩基性アミノ酸を含み、
該ストレプトアビジンムテインは、該結合パートナーCと可逆的に結合するビオチン結合部位Zを含む、固定相
を備える、キット。 - レセプター結合試薬が、結合部位Zに対する結合パートナーCの結合を介して、固定相上に固定化されている、請求項30記載の部品のキット。
- クロマトグラフィーカラムに含まれ、サンプル中の他の成分からの細胞分離に適した非磁性または非磁化性の第2固定相を備え、該第2固定相は、その上に固定化されているストレプトアビジンまたはストレプトアビジンムテインを含む第2親和性試薬を有し、該ストレプトアビジンまたは該ストレプトアビジンムテインは、結合パートナーCに特異的に結合する第2ビオチン結合部位Zを含む、請求項30または31記載の部品のキット。
- koff速度が、約3×10-5sec-1以上の場合、結合部位Bとレセプター分子との結合が、約1×10-4sec-1以上、約2.0×10-4sec-1以上、約3×10-4sec-1以上、約4×10-4sec-1以上、約5×10-4sec-1以上、約1×10-3sec-1以上、約5×10-3sec-1以上、約1×10-2sec-1以上、約5×10-2sec-1以上、約1×10-1sec-1以上、または約5×10-1sec-1以上のkoff速度を有する、請求項30~32のいずれか一項記載の部品のキット。
- koff速度が、約3×10-5sec-1以上の場合、結合部位Bとレセプター分子との結合が、約1×10-2sec-1以上、約5×10-2sec-1以上、約1×10-1sec-1以上、または約5×10-1sec-1以上のkoff速度を有する、請求項30~33のいずれか一項記載の部品のキット。
- 一価の抗体断片が、Fab断片、Fv断片、および一本鎖Fv断片からなる群より選択される、請求項30~34のいずれか一項記載の部品のキット。
- ストレプトアビジンムテインが、野生型ストレプトアビジンの配列44~47位にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47を含む、または野生型ストレプトアビジンの配列44~47位にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47を含む、請求項30~35のいずれか一項記載の部品のキット。
- ストレプトアビジンムテインが、野生型ストレプトアビジンアミノ酸配列のアミノ酸10~16の領域にあるアミノ酸から開始するN末端アミノ酸残基、および野生型ストレプトアビジンアミノ酸配列のアミノ酸133~142の領域で終結するC末端アミノ酸残基を含む、請求項30~36のいずれか一項記載の部品のキット。
- ストレプトアビジン結合ペプチドが、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO:3)を含む、請求項30~37のいずれか一項記載の部品のキット。
- ストレプトアビジン結合ペプチドが、SEQ ID NO:3に記載されている配列を各々が含む2つ以上の個別の結合モジュールを含む、請求項30~38のいずれか一項記載の部品のキット。
- ストレプトアビジン結合ペプチドが、配列SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO:13)を含む、請求項30~39のいずれか一項記載の部品のキット。
- レセプター分子がCD4またはCD8である、請求項30~40のいずれか一項記載の部品のキット。
- T細胞を精製するための装置であって、
該装置は、クロマトグラフィー用で、直列で流体連結されている第1および第2固定相の配置を備えており、
該第1固定相は、細胞分離に適しており、非磁性または非磁化性であり、第1クロマトグラフィーカラムに含まれ、その上に固定化されているストレプトアビジンムテインを含む第1親和性試薬を有し、
該ストレプトアビジンムテインは、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列に基づいて、44位にGluの代わりに疎水性脂肪族アミノ酸、45位に任意のアミノ酸、46位に疎水性脂肪族アミノ酸、および47位にValの代わりに塩基性アミノ酸を含み、
該ストレプトアビジンムテインは、レセプター結合試薬に含まれる結合パートナーCと可逆的に結合する第1ビオチン結合部位Zを含み、
該レセプター結合試薬は、該第1ビオチン結合部位Zに対する該結合パートナーCの結合を介して、該第1親和性試薬に固定化されており、
該レセプター結合試薬は、(i)約10-3~約10-7Mの範囲内にある解離定数(KD)で、または約3×10-5sec-1以上の解離速度定数(koff)で、該T細胞表面上のレセプター分子に特異的に結合する一価の結合部位Bを含む一価の抗体断片と(ii)ストレプトアビジン結合ペプチドを含む結合パートナーCとを含み、
該第2固定相は、細胞分離に適しており、非磁性または非磁化性であり、第2クロマトグラフィーカラムに含まれ、その上に固定化されているストレプトアビジンまたは該ストレプトアビジンムテインを含む第2親和性試薬を有し、該ストレプトアビジンまたは該ストレプトアビジンムテインは、該結合パートナーCに特異的に結合する第2ビオチン結合部位Zを含む、装置。 - 第1固定相に流体連結されているサンプル入口を備える、請求項42記載の装置。
- 精製されたT細胞用のサンプル出口を備え、該サンプル出口は、第2固定相に流体連結されている、請求項42または43記載の装置。
- 第1固定相に流体連結されている競合試薬容器を備える、請求項42~44のいずれか一項記載の装置。
- 競合試薬容器が、ビオチンまたはビオチンアナログである競合試薬を含む、請求項45記載の装置。
- ストレプトアビジンムテインが、野生型ストレプトアビジンの配列44~47位にアミノ酸配列Va144-Thr45-Ala46-Arg47を含む、または野生型ストレプトアビジンの配列44~47位にアミノ酸配列lle44-Gly45-Ala46-Arg47を含む、請求項42~46のいずれか一項記載の装置。
- ストレプトアビジンムテインが、野生型ストレプトアビジンアミノ酸配列のアミノ酸10~16の領域にあるアミノ酸から開始するN末端アミノ酸残基、および野生型ストレプトアビジンアミノ酸配列のアミノ酸133~142の領域で終結するC末端アミノ酸残基を含む、請求項42~47のいずれか一項記載の装置。
- ストレプトアビジン結合ペプチドが、配列Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO:3)を含む、請求項42~48のいずれか一項記載の装置。
- ストレプトアビジン結合ペプチドが、SEQ ID NO:3に記載されている配列を各々が含む2つ以上の個別の結合モジュールを含む、請求項42~49のいずれか一項記載の装置。
- ストレプトアビジン結合ペプチドが、配列SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO:13)を含む、請求項42~50のいずれか一項記載の装置。
- レセプター分子がCD4またはCD8である、請求項42~51のいずれか一項記載の装置。
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