JP2023010555A - コラーゲンゲル収縮促進作用を有するオリゴペプチド及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【課題】 コラーゲンゲル収縮促進作用を有するオリゴペプチド及びその誘導体、並びにオリゴペプチド及びその誘導体を有効成分とする肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤を提供する。【解決手段】 ＴＡＶのアミノ酸配列からなるトリペプチドを含む、肌におけるコラーゲン収縮促進剤。ＴＡＶのアミノ酸配列からなるトリペプチドを含む、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤。これらの剤は、外用組成物又は食品組成物とすることができる。【選択図】なし
Description
本発明は、コラーゲンゲル収縮促進作用又は線維芽細胞活性化作用を有するオリゴペプチド及びその誘導体に関する。また、本発明は、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤、コラーゲンゲル収縮促進剤、及び線維芽細胞活性化剤に関する。
近年、年代や性別に限らず、美容に関心を持つ人が増えている。特にアンチエイジングのために、肌（以下、「皮膚」とも呼称する）のシワ、たるみ、ハリのなさを改善して肌質又は肌理を滑らかにする外科的治療、外用薬、機能性成分を配合した化粧品が人気を集めている。
外科的治療としては、極細の吸収糸を皮下筋膜層に挿入して皮膚および筋肉のリフトアップを図る治療が用いられているが、対症療法であるにも拘わらず、侵襲的な治療であり、また医師の管理下で行われるため、患者の負担が大きい。
また、保湿剤によって目じりの小ジワを一時的に目立たなくする化粧品も市販されているが、その使用を止めると時間が経つにつれて再び小ジワが目立つようになる。このため、日々の使用により長期にわたり肌のシワ、たるみ、ハリのなさを改善できる外用薬、機能性化粧品、又は美容のための食品組成物が強く要望されている。
皮膚には水分保持や粘性に関与する細胞外マトリックスの１つとしてヒアルロン酸が存在している。ヒアルロン酸には保水作用があり、肌に塗布すると長時間角層の水分量を増加させて肌のハリを改善するため、ヒアルロン酸を含む外用薬や、ヒアルロン酸を含む化粧品が用いられてきた。しかし、ヒアルロン酸は代謝が非常に早く、皮膚中では１日に約半分のヒアルロン酸が分解されていると言われている。そのため、毎日ヒアルロン酸を肌に塗布しても、常に代謝されてしまい、肌のハリ改善を十分には実感できない。
また、皮膚に塗布することで、ヒアルロン酸やコラーゲンなどの細胞外マトリックスの生成を促進する成分や、細胞外マトリックスであるエラスチンの分解を抑制する成分を、肌のハリ改善のために外用剤に配合することが知られているが、これらの成分は炎症を惹起したり、皮膚を刺激したりする難点がある。
また、皮膚に塗布することで、ヒアルロン酸やコラーゲンなどの細胞外マトリックスの生成を促進する成分や、細胞外マトリックスであるエラスチンの分解を抑制する成分を、肌のハリ改善のために外用剤に配合することが知られているが、これらの成分は炎症を惹起したり、皮膚を刺激したりする難点がある。
一方、ペプチドは、代謝が比較的遅く、また皮膚刺激がないことから、外用剤の有効成分として望ましい。肌のハリ改善作用が期待されるペプチドとして、ウシラクトフェリンとその部分ペプチドが知られている。
例えば、非特許文献１は、ウシラクトフェリンが、線維芽細胞のミオシン軽鎖のリン酸化を亢進させ、そのコラーゲンゲル収縮活性を上昇させることを報告している。
ラクトフェリンは、母乳、涙、汗、唾液などの外分泌液中に含まれる鉄結合性の糖タンパク質で、１９３９年に牛乳中に含まれる「赤色タンパク質 （レッド・プロテイン）」として初めて報告された。その後、１９６０年にヒトとウシの乳より精製され、アミノ酸配列が決定され、ウシの場合６８９個のアミノ酸、ヒトの場合６９２個のアミノ酸からなっており、それぞれＮローブ、Ｃローブと呼ばれる球状の２つのドメインが一本のポリペプチドで連結された構造を持ち、各ローブは1個の鉄イオンと強力に結合することが判明した。ラクトフェリンは、コラーゲンゲル収縮促進作用の他に、抗炎症作用、抗酸化作用、抗菌作用、細胞増殖の調節作用などの様々な機能を有することが明らかにされている。
ラクトフェリンは、母乳、涙、汗、唾液などの外分泌液中に含まれる鉄結合性の糖タンパク質で、１９３９年に牛乳中に含まれる「赤色タンパク質 （レッド・プロテイン）」として初めて報告された。その後、１９６０年にヒトとウシの乳より精製され、アミノ酸配列が決定され、ウシの場合６８９個のアミノ酸、ヒトの場合６９２個のアミノ酸からなっており、それぞれＮローブ、Ｃローブと呼ばれる球状の２つのドメインが一本のポリペプチドで連結された構造を持ち、各ローブは1個の鉄イオンと強力に結合することが判明した。ラクトフェリンは、コラーゲンゲル収縮促進作用の他に、抗炎症作用、抗酸化作用、抗菌作用、細胞増殖の調節作用などの様々な機能を有することが明らかにされている。
また、非特許文献２は、ウシラクトフェリンをモル比１／２００のトリプシンで４５分間、３７℃で分解して得られるＣ末端断片が、ラクトフェリン全長よりも顕著に強いコラーゲンゲル収縮促進活性、及び線維芽細胞のミオシン軽鎖のリン酸化促進活性を有することを報告している。このウシラクトフェリンＣ末端断片のうち、ｐ４４断片はウシラクトフェリンの３４１～６８９番目のアミノ酸からなる部分に相当し、ｐ３６断片はウシラクトフェリンの１～２８４番目のアミノ酸からなる部分に相当し、ｐ５１断片はウシラクトフェリンの２８５～６８９番目のアミノ酸からなる部分に相当し、それらの断片の分子量は、それぞれ４４，０００、３６，０００、５１，０００である。
皮膚は表皮、真皮、皮下組織に分けられ、そのうち真皮は、皮膚構造の維持に極めて重要なコラーゲン線維がその７０％以上を占めており、柔軟で弾力性のある真皮組織を形成している。コラーゲンなどの線維を構成するタンパク質は、線維芽細胞が産生しており、線維芽細胞がコラーゲン線維と相互作用することで柔軟で弾力性のある真皮組織を形成している。
コラーゲンゲル収縮は、線維芽細胞がコラーゲン線維を引っ張り、収縮する現象である。組織から抽出したコラーゲンを、３７℃、中性かつ生理的イオン強度の下におくとコラーゲン線維が再構成される。これをコラーゲンゲルというが、コラーゲンゲル内で線維芽細胞を培養すると、線維芽細胞がコラーゲン線維を引っ張って収縮することで、コラーゲン線維を配向させ、再構成コラーゲンゲルは柔軟性、弾力性、強度が増して、真皮類似構造をとる。従って、線維芽細胞のコラーゲンゲル収縮により得られる収縮ゲルは真皮組織のモデルとされている（非特許文献３）
コラーゲンゲル収縮は、線維芽細胞がコラーゲン線維を引っ張り、収縮する現象である。組織から抽出したコラーゲンを、３７℃、中性かつ生理的イオン強度の下におくとコラーゲン線維が再構成される。これをコラーゲンゲルというが、コラーゲンゲル内で線維芽細胞を培養すると、線維芽細胞がコラーゲン線維を引っ張って収縮することで、コラーゲン線維を配向させ、再構成コラーゲンゲルは柔軟性、弾力性、強度が増して、真皮類似構造をとる。従って、線維芽細胞のコラーゲンゲル収縮により得られる収縮ゲルは真皮組織のモデルとされている（非特許文献３）
老齢者由来の線維芽細胞は若年者由来の線維芽細胞よりコラーゲンゲルの収縮活性が低下していることが報告されており、老化によって線維芽細胞のゲル収縮活性が低下すると考えられている（非特許文献４）。このことより、老化によってコラーゲンゲルの収縮活性が低下すると、若いときのように真皮組織を収縮させて、引き締まった状態に維持できなくなることが示唆されている（特許文献１）。
すなわち、老化に伴う肌のシワ、たるみ、ハリのなさは、真皮線維芽細胞の組織収縮力が低下し、柔軟性、弾力性、強度を失うことで生じるため、真皮線維芽細胞のコラーゲン線維収縮活性を高めることで、皮膚のシワ、たるみ、ハリのなさを改善することが期待できると報告されている（特許文献２）
すなわち、老化に伴う肌のシワ、たるみ、ハリのなさは、真皮線維芽細胞の組織収縮力が低下し、柔軟性、弾力性、強度を失うことで生じるため、真皮線維芽細胞のコラーゲン線維収縮活性を高めることで、皮膚のシワ、たるみ、ハリのなさを改善することが期待できると報告されている（特許文献２）
しかし、非特許文献１が教えるウシラクトフェリン、非特許文献２が教えるウシラクトフェリンの部分ペプチドは、何れも分子量が大きいため経皮吸収され難く、また免疫原性が強いためアレルギーを引き起こす恐れがある。従って、外用剤の成分としては、分子量が小さいオリゴペプチドであって、コラーゲンゲル収縮作用又は線維芽細胞活性化作用を有するものが望まれる。
Takayama Y, Mizumachi K. Effects of lactoferrin on collagen gel contractile activity and myosin light chain phosphorylation in human fibroblasts. FEBS lett. 2001, 508 (1) : 111-116.
Takayama Y, Mizumachi K, Takezawa T. The bovine lactoferrin region responsible for promoting the collagen gel contractile activity of human fibroblasts. Biochem Biophys Res Comn. 2002, 299 (5) : 813-817.
Bell E, Sher S, Hull B et al. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 1983, 81 : 2s-10s.
Yamato M, Yamamoto K, Hayashi T. Age-related changes in collagen gel contraction by cultured human lung fibroblasts resulting in cross-over of contraction curves between young and aged cells. Mech Ageing Dev. 1993, 67(1-2): 149-158.
本発明は、コラーゲンゲル収縮促進作用を有するオリゴペプチド及びその誘導体、並びにオリゴペプチド及びその誘導体を有効成分とする肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために、ラクトフェリンに着目し、ウシラクトフェリンをトリプシンで限定分解して、その限定分解物を分取型ＯＤＳカラムで分画し、コラーゲンゲル収縮促進活性を有する画分をさらにゲルろ過で分画し、コラーゲンゲル収縮促進作用を有する８アミノ酸からなる２つのオリゴペプチドと５アミノ酸からなる１つのオリゴペプチドを見出した。
また、これらのオリゴペプチドのＮ末又はＣ末から一つずつアミノ酸残基を除いたペプチドを合成して、それらの合成ペプチドのコラーゲンゲル収縮促進作用を確認することにより、ＡＶ、ＤＧの各ジペプチドが、コラーゲンゲル収縮促進作用を奏する核となるアミノ酸配列であることを見出した。また、これにより、ＡＶ又はＤＧのアミノ酸配列を含む限り８アミノ酸までのオリゴペプチドであればコラーゲンゲル収縮促進作用を有することが示唆されたが、中でも、ＡＶを含むＮｏ．２～１０の各オリゴペプチド、及びＤＧを含むＮｏ．１２～２４の各ペプチドがコラーゲンゲル収縮促進作用を有することを確認した。各番号のオリゴペプチドは、「発明を実施するための形態」の「オリゴペプチド」の項目に示した通りである。
さらに、これらのオリゴペプチドはエステル体などの修飾体としても、コラーゲンゲル収縮促進作用が消失しないことを見出した。
また、これらのオリゴペプチドのＮ末又はＣ末から一つずつアミノ酸残基を除いたペプチドを合成して、それらの合成ペプチドのコラーゲンゲル収縮促進作用を確認することにより、ＡＶ、ＤＧの各ジペプチドが、コラーゲンゲル収縮促進作用を奏する核となるアミノ酸配列であることを見出した。また、これにより、ＡＶ又はＤＧのアミノ酸配列を含む限り８アミノ酸までのオリゴペプチドであればコラーゲンゲル収縮促進作用を有することが示唆されたが、中でも、ＡＶを含むＮｏ．２～１０の各オリゴペプチド、及びＤＧを含むＮｏ．１２～２４の各ペプチドがコラーゲンゲル収縮促進作用を有することを確認した。各番号のオリゴペプチドは、「発明を実施するための形態」の「オリゴペプチド」の項目に示した通りである。
さらに、これらのオリゴペプチドはエステル体などの修飾体としても、コラーゲンゲル収縮促進作用が消失しないことを見出した。
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、下記〔１〕～〔２９〕を提供する。
〔１〕 下記(a)、(b)、(c)、及び(d)の何れかのオリゴペプチド又はその誘導体。
(a)ＡＶ、ＳＣＨＴＡＶＤＲ、ＣＨＴＡＶＤＲ、ＣＨＴＡＶＤ、ＨＴＡＶＤ、ＣＨＴＡＶ、ＴＡＶＤ、ＨＴＡＶ、ＴＡＶ、又はＡＶＤのアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
(b)ＡＶ、ＳＣＨＴＡＶＤＲ、ＣＨＴＡＶＤＲ、ＣＨＴＡＶＤ、ＨＴＡＶＤ、ＣＨＴＡＶ、ＴＡＶＤ、ＨＴＡＶ、ＴＡＶ、又はＡＶＤにおいて１アミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり（但し、ＡＶを含む）、かつコラーゲン収縮促進作用を有するオリゴペプチド。
(c)ＤＧ、ＬＬＣＬＤＧＴＲ、ＬＣＬＤＧＴＲ、ＣＬＤＧＴＲ、ＬＤＧＴＲ、ＬＤＧＴ、ＤＧＴＲ、ＬＤＧ、ＤＧＴ、ＳＶＤＧＫ、ＳＶＤＧ、ＶＤＧＫ、ＤＧＫ、又はＶＤＧのアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
(d)ＤＧ、ＬＬＣＬＤＧＴＲ、ＬＣＬＤＧＴＲ、ＣＬＤＧＴＲ、ＬＤＧＴＲ、ＬＤＧＴ、ＤＧＴＲ、ＬＤＧ、ＤＧＴ、ＳＶＤＧＫ、ＳＶＤＧ、ＶＤＧＫ、ＤＧＫ、又はＶＤＧにおいて１アミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり（但し、ＤＧを含む）、かつコラーゲン収縮促進作用を有するオリゴペプチド
〔２〕 誘導体がオリゴペプチドのＮ末端の修飾体である、〔１〕に記載のオリゴペプチド又はその誘導体。
〔３〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種を含む、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤。
〔４〕 外用組成物又は食品組成物である、〔３〕に記載の肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤。
〔５〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種を含む、コラーゲンゲル収縮促進剤。
〔６〕 外用組成物又は食品組成物である、〔５〕に記載のコラーゲンゲル収縮促進剤。
〔７〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種を含む、線維芽細胞活性化剤。
〔８〕 外用組成物又は食品組成物である、〔７〕に記載の線維芽細胞活性化剤。
〔１〕 下記(a)、(b)、(c)、及び(d)の何れかのオリゴペプチド又はその誘導体。
(a)ＡＶ、ＳＣＨＴＡＶＤＲ、ＣＨＴＡＶＤＲ、ＣＨＴＡＶＤ、ＨＴＡＶＤ、ＣＨＴＡＶ、ＴＡＶＤ、ＨＴＡＶ、ＴＡＶ、又はＡＶＤのアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
(b)ＡＶ、ＳＣＨＴＡＶＤＲ、ＣＨＴＡＶＤＲ、ＣＨＴＡＶＤ、ＨＴＡＶＤ、ＣＨＴＡＶ、ＴＡＶＤ、ＨＴＡＶ、ＴＡＶ、又はＡＶＤにおいて１アミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり（但し、ＡＶを含む）、かつコラーゲン収縮促進作用を有するオリゴペプチド。
(c)ＤＧ、ＬＬＣＬＤＧＴＲ、ＬＣＬＤＧＴＲ、ＣＬＤＧＴＲ、ＬＤＧＴＲ、ＬＤＧＴ、ＤＧＴＲ、ＬＤＧ、ＤＧＴ、ＳＶＤＧＫ、ＳＶＤＧ、ＶＤＧＫ、ＤＧＫ、又はＶＤＧのアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
(d)ＤＧ、ＬＬＣＬＤＧＴＲ、ＬＣＬＤＧＴＲ、ＣＬＤＧＴＲ、ＬＤＧＴＲ、ＬＤＧＴ、ＤＧＴＲ、ＬＤＧ、ＤＧＴ、ＳＶＤＧＫ、ＳＶＤＧ、ＶＤＧＫ、ＤＧＫ、又はＶＤＧにおいて１アミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり（但し、ＤＧを含む）、かつコラーゲン収縮促進作用を有するオリゴペプチド
〔２〕 誘導体がオリゴペプチドのＮ末端の修飾体である、〔１〕に記載のオリゴペプチド又はその誘導体。
〔３〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種を含む、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤。
〔４〕 外用組成物又は食品組成物である、〔３〕に記載の肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤。
〔５〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種を含む、コラーゲンゲル収縮促進剤。
〔６〕 外用組成物又は食品組成物である、〔５〕に記載のコラーゲンゲル収縮促進剤。
〔７〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種を含む、線維芽細胞活性化剤。
〔８〕 外用組成物又は食品組成物である、〔７〕に記載の線維芽細胞活性化剤。
〔９〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種の、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤の製造のための使用。
〔１０〕 肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤が外用組成物又は食品組成物である、〔９〕に記載の使用。
〔１１〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種の、コラーゲンゲル収縮促進剤の製造のための使用。
〔１２〕 コラーゲンゲル収縮促進剤が外用組成物又は食品組成物である、〔１１〕に記載の使用。
〔１３〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種の、線維芽細胞活性化剤の製造のための使用。
〔１４〕 線維芽細胞活性化剤が外用組成物又は食品組成物である、〔１３〕に記載の使用。
〔１０〕 肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤が外用組成物又は食品組成物である、〔９〕に記載の使用。
〔１１〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種の、コラーゲンゲル収縮促進剤の製造のための使用。
〔１２〕 コラーゲンゲル収縮促進剤が外用組成物又は食品組成物である、〔１１〕に記載の使用。
〔１３〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種の、線維芽細胞活性化剤の製造のための使用。
〔１４〕 線維芽細胞活性化剤が外用組成物又は食品組成物である、〔１３〕に記載の使用。
〔１５〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種を含む組成物の、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤としての非治療的使用。
〔１６〕 上記組成物が外用組成物又は食品組成物である、〔１５〕に記載の使用。
〔１７〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種を含む組成物の、コラーゲンゲル収縮促進剤としての非治療的使用。
〔１８〕 コラーゲンゲル収縮促進剤が外用組成物又は食品組成物である、〔１７〕に記載の使用。
〔１９〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種を含む組成物の、線維芽細胞活性化剤としての非治療的使用。
〔２０〕 上記組成物が外用組成物又は食品組成物である、〔１９〕に記載の使用。
〔１６〕 上記組成物が外用組成物又は食品組成物である、〔１５〕に記載の使用。
〔１７〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種を含む組成物の、コラーゲンゲル収縮促進剤としての非治療的使用。
〔１８〕 コラーゲンゲル収縮促進剤が外用組成物又は食品組成物である、〔１７〕に記載の使用。
〔１９〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種を含む組成物の、線維芽細胞活性化剤としての非治療的使用。
〔２０〕 上記組成物が外用組成物又は食品組成物である、〔１９〕に記載の使用。
〔２１〕 肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善における使用のための、〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド又はその誘導体。
〔２２〕 コラーゲンゲル収縮促進における使用のための、〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド又はその誘導体。
〔２３〕 線維芽細胞活性化における使用のための、〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド又はその誘導体。
〔２２〕 コラーゲンゲル収縮促進における使用のための、〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド又はその誘導体。
〔２３〕 線維芽細胞活性化における使用のための、〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド又はその誘導体。
〔２４〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種の有効量をヒトに適用する工程を含む、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善方法。
〔２５〕 適用が皮膚への塗布、塗擦、噴霧、若しくは貼付、又は経口投与である、〔２４〕に記載の方法。
〔２６〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種の有効量をヒトに適用する工程を含む、皮膚のコラーゲン収縮促進方法。
〔２７〕 適用が皮膚への塗布、塗擦、噴霧、若しくは貼付、又は経口投与である、〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種の有効量をヒトに適用する工程を含む、皮膚の線維芽細胞活性化方法。
〔２９〕 適用が皮膚への塗布、塗擦、噴霧、若しくは貼付、又は経口投与である、〔２８〕に記載の方法。
〔２５〕 適用が皮膚への塗布、塗擦、噴霧、若しくは貼付、又は経口投与である、〔２４〕に記載の方法。
〔２６〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種の有効量をヒトに適用する工程を含む、皮膚のコラーゲン収縮促進方法。
〔２７〕 適用が皮膚への塗布、塗擦、噴霧、若しくは貼付、又は経口投与である、〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕 〔１〕又は〔２〕に記載のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種の有効量をヒトに適用する工程を含む、皮膚の線維芽細胞活性化方法。
〔２９〕 適用が皮膚への塗布、塗擦、噴霧、若しくは貼付、又は経口投与である、〔２８〕に記載の方法。
本発明のオリゴペプチド及びその誘導体は、コラーゲンゲル収縮促進作用又は線維芽細胞活性化作用を有する。真皮中では、線維芽細胞がコラーゲン線維を収縮させて、引き締まった状態を保っているため、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体は、ヒトの肌に適用した場合に真皮中で線維芽細胞によるコラーゲン収縮を促進することにより、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下を予防又は改善できると考えられる。
また、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体は、タンパク質と異なり分子量が小さいため、経皮吸収され易く、経口投与した場合は消化管から吸収され易い。ヒトラクトフェリン及びウシラクトフェリンの分子量は、それぞれ約８３，０００であり、肌に塗布しても皮表に留まり、角層を通過して表皮及び真皮まで浸透することはなく、また経口投与した場合も吸収効率が低いが、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体は、ヒトラクトフェリン及びウシラクトフェリンと比べて、表皮及び真皮への浸透並びに消化管からの吸収効率が格段に高い。
また、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体は、タンパク質と異なり、免疫原性が小さいため、アレルギーを引き起こし難い点でも優れている。
さらに、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカンといった細胞外マトリックス自体を皮膚に塗布する場合と異なり、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体を皮膚に塗布、塗擦、噴霧、若しくは貼付する場合は、皮膚に吸収された後に代謝消失し難い。また、従来の成分と異なり、皮膚刺激性がない又は小さい。本発明のオリゴペプチドは、これらの点でも、肌のシワ改善又はハリ改善のために用いられている従来の成分より優れている。
また、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体は、タンパク質と異なり分子量が小さいため、経皮吸収され易く、経口投与した場合は消化管から吸収され易い。ヒトラクトフェリン及びウシラクトフェリンの分子量は、それぞれ約８３，０００であり、肌に塗布しても皮表に留まり、角層を通過して表皮及び真皮まで浸透することはなく、また経口投与した場合も吸収効率が低いが、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体は、ヒトラクトフェリン及びウシラクトフェリンと比べて、表皮及び真皮への浸透並びに消化管からの吸収効率が格段に高い。
また、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体は、タンパク質と異なり、免疫原性が小さいため、アレルギーを引き起こし難い点でも優れている。
さらに、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、グリコサミノグリカンといった細胞外マトリックス自体を皮膚に塗布する場合と異なり、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体を皮膚に塗布、塗擦、噴霧、若しくは貼付する場合は、皮膚に吸収された後に代謝消失し難い。また、従来の成分と異なり、皮膚刺激性がない又は小さい。本発明のオリゴペプチドは、これらの点でも、肌のシワ改善又はハリ改善のために用いられている従来の成分より優れている。
以下、本発明を詳細に説明する。
オリゴペプチド
本発明のオリゴペプチドは、下記(a)、(b)、(c)、及び(d)の何れかのオリゴペプチドである。
(a)Ｎｏ．１～１０のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
(b)Ｎｏ．２～１０のアミノ酸配列において１アミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり（但し、ＡＶを含む）、かつコラーゲン収縮促進作用を有するオリゴペプチド。
(c)Ｎｏ．１１～２４のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
(d)Ｎｏ．１２～２４のアミノ酸配列において１アミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり（但し、ＤＧを含む）、かつコラーゲン収縮促進作用を有するオリゴペプチド
オリゴペプチド
本発明のオリゴペプチドは、下記(a)、(b)、(c)、及び(d)の何れかのオリゴペプチドである。
(a)Ｎｏ．１～１０のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
(b)Ｎｏ．２～１０のアミノ酸配列において１アミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり（但し、ＡＶを含む）、かつコラーゲン収縮促進作用を有するオリゴペプチド。
(c)Ｎｏ．１１～２４のアミノ酸配列からなるオリゴペプチド
(d)Ｎｏ．１２～２４のアミノ酸配列において１アミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなり（但し、ＤＧを含む）、かつコラーゲン収縮促進作用を有するオリゴペプチド
(b)及び(d)のオリゴペプチドがコラーゲン収縮促進作用を有することは、実施例１に記載の方法で確認し、コントロールに比べてコラーゲンゲル面積が小さい場合にコラーゲン収縮促進作用を有すると判定する。
本発明のオリゴペプチドの番号を以下に示す。
Ｎｏ．１：ＡＶ
Ｎｏ．２：ＳＣＨＴＡＶＤＲ（配列番号１）
Ｎｏ．３：ＣＨＴＡＶＤＲ（配列番号２）
Ｎｏ．４：ＣＨＴＡＶＤ（配列番号３）
Ｎｏ．５：ＨＴＡＶＤ（配列番号４）
Ｎｏ．６：ＣＨＴＡＶ（配列番号５）
Ｎｏ．７：ＴＡＶＤ（配列番号６）
Ｎｏ．８：ＨＴＡＶ（配列番号７）
Ｎｏ．９：ＴＡＶ
Ｎｏ．１０：ＡＶＤ
Ｎｏ．１１：ＤＧ
Ｎｏ．１２：ＬＬＣＬＤＧＴＲ（配列番号８）
Ｎｏ．１３：ＬＣＬＤＧＴＲ（配列番号９）
Ｎｏ．１４：ＣＬＤＧＴＲ（配列番号１０）
Ｎｏ．１５：ＬＤＧＴＲ（配列番号１１）
Ｎｏ．１６：ＬＤＧＴ（配列番号１２）
Ｎｏ．１７：ＤＧＴＲ（配列番号１３）
Ｎｏ．１８：ＬＤＧ
Ｎｏ．１９：ＤＧＴ
Ｎｏ．２０：ＳＶＤＧＫ（配列番号１４）
Ｎｏ．２１：ＳＶＤＧ（配列番号１５）
Ｎｏ．２２：ＶＤＧＫ（配列番号１６）
Ｎｏ．２３：ＤＧＫ
Ｎｏ．２４：ＶＤＧ
Ｎｏ．１：ＡＶ
Ｎｏ．２：ＳＣＨＴＡＶＤＲ（配列番号１）
Ｎｏ．３：ＣＨＴＡＶＤＲ（配列番号２）
Ｎｏ．４：ＣＨＴＡＶＤ（配列番号３）
Ｎｏ．５：ＨＴＡＶＤ（配列番号４）
Ｎｏ．６：ＣＨＴＡＶ（配列番号５）
Ｎｏ．７：ＴＡＶＤ（配列番号６）
Ｎｏ．８：ＨＴＡＶ（配列番号７）
Ｎｏ．９：ＴＡＶ
Ｎｏ．１０：ＡＶＤ
Ｎｏ．１１：ＤＧ
Ｎｏ．１２：ＬＬＣＬＤＧＴＲ（配列番号８）
Ｎｏ．１３：ＬＣＬＤＧＴＲ（配列番号９）
Ｎｏ．１４：ＣＬＤＧＴＲ（配列番号１０）
Ｎｏ．１５：ＬＤＧＴＲ（配列番号１１）
Ｎｏ．１６：ＬＤＧＴ（配列番号１２）
Ｎｏ．１７：ＤＧＴＲ（配列番号１３）
Ｎｏ．１８：ＬＤＧ
Ｎｏ．１９：ＤＧＴ
Ｎｏ．２０：ＳＶＤＧＫ（配列番号１４）
Ｎｏ．２１：ＳＶＤＧ（配列番号１５）
Ｎｏ．２２：ＶＤＧＫ（配列番号１６）
Ｎｏ．２３：ＤＧＫ
Ｎｏ．２４：ＶＤＧ
Ｎｏ．２～１０、１２～２４のオリゴペプチドのアミノ酸置換は、類似の構造又は性質を有するアミノ酸の間で行うことができ、置換してもコラーゲンゲル収縮促進作用を有することが合理的に予測される。
互いに置換可能なアミノ酸としては、酸性アミノ酸であるＥ（Ｇｌｕ）とＤ（Ａｓｐ）、塩基性アミノ酸であるＲ（Ａｒｇ）とＫ（Ｌｙｓ）とＨ（Ｈｉｓ）、中性アミノ酸では、アルキル鎖を有するＧ（Ｇｌｙ）とＡ（Ａｌａ）とＶ（Ｖａｌ）とＬ（Ｌｅｕ）とＩ（Ｉｌｅ）（中でも、直鎖アルキル鎖を有するＧ（Ｇｌｙ）とＡ（Ａｌａ）、分岐アルキル鎖を有するＶ（Ｖａｌ）とＬ（Ｌｅｕ）とＩ（Ｉｌｅ））、ヒドロキシ基を有するＳ（Ｓｅｒ）とＴ（Ｔｈｒ）、硫黄原子を有するＣ（Ｃｙｓ）とＭ（Ｍｅｔ）、アミド基を有するＮ（Ａｓｎ）とＱ（Ｇｌｎ）、芳香族環を有するＦ（Ｐｈｅ）とＹ（Ｔｙｒ）とＷ（Ｔｒｐ）が挙げられる。
例えば、ＨＴＡＶがコラーゲンゲル収縮促進作用を有することが実証されていることから、ＨＴＡＬも同様にコラーゲンゲル収縮促進作用を有することが合理的に予測される。
互いに置換可能なアミノ酸としては、酸性アミノ酸であるＥ（Ｇｌｕ）とＤ（Ａｓｐ）、塩基性アミノ酸であるＲ（Ａｒｇ）とＫ（Ｌｙｓ）とＨ（Ｈｉｓ）、中性アミノ酸では、アルキル鎖を有するＧ（Ｇｌｙ）とＡ（Ａｌａ）とＶ（Ｖａｌ）とＬ（Ｌｅｕ）とＩ（Ｉｌｅ）（中でも、直鎖アルキル鎖を有するＧ（Ｇｌｙ）とＡ（Ａｌａ）、分岐アルキル鎖を有するＶ（Ｖａｌ）とＬ（Ｌｅｕ）とＩ（Ｉｌｅ））、ヒドロキシ基を有するＳ（Ｓｅｒ）とＴ（Ｔｈｒ）、硫黄原子を有するＣ（Ｃｙｓ）とＭ（Ｍｅｔ）、アミド基を有するＮ（Ａｓｎ）とＱ（Ｇｌｎ）、芳香族環を有するＦ（Ｐｈｅ）とＹ（Ｔｙｒ）とＷ（Ｔｒｐ）が挙げられる。
例えば、ＨＴＡＶがコラーゲンゲル収縮促進作用を有することが実証されていることから、ＨＴＡＬも同様にコラーゲンゲル収縮促進作用を有することが合理的に予測される。
実施例の項目に示す通り、本発明のオリゴペプチドは、ウシラクトフェリンの部分アミノ酸配列に基づき見出されたものであるが、ＡＶを含むＳＣＨＴＡＶＤＲのアミノ酸配列（Ｎｏ．２）は、ウシラクトフェリンの４７５～４８２番目に存在する他、ヒトラクトフェリンの４５８～４６５番目にも存在することが確認された。即ち、Ｎｏ．１～１０は、ウシラクトフェリンとヒトラクトフェリンに存在するアミノ酸配列である。
また、ＤＧを含むＬＬＣＬＤＧＴＲのアミノ酸配列（Ｎｏ．１２）は、ウシラクトフェリンの５９０～５９７番目には存在するが、ヒトラクトフェリンには存在しないことが確認された。即ち、Ｎｏ．１１～１９は、ウシラクトフェリンに存在するアミノ酸配列である。
また、ＤＧを含むＳＶＤＧＫのアミノ酸配列（Ｎｏ．２０）は、ウシラクトフェリンに存在するが、ヒトラクトフェリンには存在しないことが確認された。即ち、Ｎｏ．２０～２４は、ウシラクトフェリンに存在するアミノ酸配列である。
従って、本発明のオリゴペプチドのうちヒト又はウシラクトフェリンに存在するアミノ酸配列からなるものは、ヒト又はウシラクトフェリンをトリプシン消化することにより調製できる。ラクトフェリンは乳清(ホエイ)に多く含まれることから、ウシラクトフェリンに存在するアミノ酸配列からなるオリゴペプチドは、牛乳、チーズ、ヨーグルトをトリプシン消化して得ても良いし、ミルクホエイ、チーズホエイ、ヨーグルトホエイ等のホエイをトリプシン消化して得ても良い。
また、本発明の各オリゴペプチドは合成によっても調製できる。
また、ＤＧを含むＬＬＣＬＤＧＴＲのアミノ酸配列（Ｎｏ．１２）は、ウシラクトフェリンの５９０～５９７番目には存在するが、ヒトラクトフェリンには存在しないことが確認された。即ち、Ｎｏ．１１～１９は、ウシラクトフェリンに存在するアミノ酸配列である。
また、ＤＧを含むＳＶＤＧＫのアミノ酸配列（Ｎｏ．２０）は、ウシラクトフェリンに存在するが、ヒトラクトフェリンには存在しないことが確認された。即ち、Ｎｏ．２０～２４は、ウシラクトフェリンに存在するアミノ酸配列である。
従って、本発明のオリゴペプチドのうちヒト又はウシラクトフェリンに存在するアミノ酸配列からなるものは、ヒト又はウシラクトフェリンをトリプシン消化することにより調製できる。ラクトフェリンは乳清(ホエイ)に多く含まれることから、ウシラクトフェリンに存在するアミノ酸配列からなるオリゴペプチドは、牛乳、チーズ、ヨーグルトをトリプシン消化して得ても良いし、ミルクホエイ、チーズホエイ、ヨーグルトホエイ等のホエイをトリプシン消化して得ても良い。
また、本発明の各オリゴペプチドは合成によっても調製できる。
オリゴペプチドの誘導体
本発明のオリゴペプチドは、塩などの誘導体（修飾体）であってもよい。
塩としては、ナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウムのようなアルカリ土類金属との塩、亜鉛、アルミニウムのような金属との塩、アンモニウム塩、塩基性アミノ酸塩、トリエタノールアミンのようなアミンの塩などが挙げられる。
また、無機酸又は有機酸との塩であってもよい。
無機酸塩としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などの塩が挙げられる。
有機酸塩としては、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸（酪酸）、イソブタン酸、６－ヘプタン酸、ヘキサン酸（カプロン酸）、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、オクタン酸（カプリル酸）、デカン酸（カプリン酸）のような脂肪族モノカルボン酸の塩（脂肪酸塩）、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、マロン酸のような脂肪族多価カルボン酸の塩、乳酸、酒石酸、クエン酸のような脂肪族オキシカルボン酸の塩、ニコチン酸のような芳香族カルボン酸の塩、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トシル酸、ナパジシル酸のような有機スルホン酸の塩などが挙げられる。
誘導体は、本発明のオリゴペプチドのＮ末端、Ｃ末端、側鎖の何れが修飾されたものであってもよく、或いはこれらの２以上が修飾されたものであってもよい。何れの部分が修飾されていてもコラーゲンゲル収縮促進活性を有するが、経皮吸収性が良い点で、Ｎ末端の修飾体が好ましい。
本発明のオリゴペプチドは、塩などの誘導体（修飾体）であってもよい。
塩としては、ナトリウム、カリウムのようなアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウムのようなアルカリ土類金属との塩、亜鉛、アルミニウムのような金属との塩、アンモニウム塩、塩基性アミノ酸塩、トリエタノールアミンのようなアミンの塩などが挙げられる。
また、無機酸又は有機酸との塩であってもよい。
無機酸塩としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などの塩が挙げられる。
有機酸塩としては、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸（酪酸）、イソブタン酸、６－ヘプタン酸、ヘキサン酸（カプロン酸）、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、オクタン酸（カプリル酸）、デカン酸（カプリン酸）のような脂肪族モノカルボン酸の塩（脂肪酸塩）、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、マロン酸のような脂肪族多価カルボン酸の塩、乳酸、酒石酸、クエン酸のような脂肪族オキシカルボン酸の塩、ニコチン酸のような芳香族カルボン酸の塩、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トシル酸、ナパジシル酸のような有機スルホン酸の塩などが挙げられる。
誘導体は、本発明のオリゴペプチドのＮ末端、Ｃ末端、側鎖の何れが修飾されたものであってもよく、或いはこれらの２以上が修飾されたものであってもよい。何れの部分が修飾されていてもコラーゲンゲル収縮促進活性を有するが、経皮吸収性が良い点で、Ｎ末端の修飾体が好ましい。
組成物
本発明のオリゴペプチド及びその誘導体は、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤、コラーゲンゲル収縮促進剤、又は線維芽細胞活性化剤（以下、「本発明の剤」と略称することもある。）の有効成分とすることができる。
これらの剤は、外用組成物（化粧品組成物、医薬部外品組成物）、又は食品組成物とすることができる。組成物は、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種と、必要に応じて配合される添加物やその他の生理活性又は薬理活性成分とを混合して調製することができる。
本発明のオリゴペプチド及びその誘導体は、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤、コラーゲンゲル収縮促進剤、又は線維芽細胞活性化剤（以下、「本発明の剤」と略称することもある。）の有効成分とすることができる。
これらの剤は、外用組成物（化粧品組成物、医薬部外品組成物）、又は食品組成物とすることができる。組成物は、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体の少なくとも１種と、必要に応じて配合される添加物やその他の生理活性又は薬理活性成分とを混合して調製することができる。
組成物中の本発明のオリゴペプチド及び／又はその誘導体の濃度は、組成物の全量に対して、０．００００１重量％以上、０．０００１重量％以上、０．００１重量％以上、０．０１重量％以上、又は０．１重量％以上とすることができ、また１０重量％以下、１重量％以下、０．１重量％以下、又は０．０１重量％以下とすることができる。この範囲であれば、コラーゲンゲル収縮促進作用が十分に得られる。
外用組成物
外用組成物は、特に皮膚外用組成物であり得る。皮膚には頭皮も含まれる。また、本発明では粘膜も皮膚に含まれる。
外用組成物の性状は、固形状、液状の何れであってもよい。固形状には、力を加えることにより変形する塑性を有する性状や凍結乾燥状も含まれる。液状には、流動状などの粘性を有する性状も含まれる。
剤型としては、ローション剤、クリーム剤、乳剤、ゲル剤、軟膏剤、液剤、溶液剤、懸濁液剤、スプレー剤又は噴霧剤、フォーム剤、これらを基材に含浸させた又は塗布した貼付剤、粉剤、粉末を固めた剤形などが挙げられる。クリーム剤、乳剤などの乳化組成物は、Ｏ／Ｗ型、Ｗ／Ｏ型、Ｗ／Ｏ／Ｗ型、Ｏ／Ｗ／Ｏ型などであり得る。
外用組成物が化粧品である場合は、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、美容液、日焼け止め用化粧料、パック、マスク、ハンドクリーム、ボディローション、ボディークリームといった基礎化粧品の他に、ファンデーション、口紅、頬紅といったメークアップ化粧品とすることもできる。
外用組成物は、特に皮膚外用組成物であり得る。皮膚には頭皮も含まれる。また、本発明では粘膜も皮膚に含まれる。
外用組成物の性状は、固形状、液状の何れであってもよい。固形状には、力を加えることにより変形する塑性を有する性状や凍結乾燥状も含まれる。液状には、流動状などの粘性を有する性状も含まれる。
剤型としては、ローション剤、クリーム剤、乳剤、ゲル剤、軟膏剤、液剤、溶液剤、懸濁液剤、スプレー剤又は噴霧剤、フォーム剤、これらを基材に含浸させた又は塗布した貼付剤、粉剤、粉末を固めた剤形などが挙げられる。クリーム剤、乳剤などの乳化組成物は、Ｏ／Ｗ型、Ｗ／Ｏ型、Ｗ／Ｏ／Ｗ型、Ｏ／Ｗ／Ｏ型などであり得る。
外用組成物が化粧品である場合は、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、美容液、日焼け止め用化粧料、パック、マスク、ハンドクリーム、ボディローション、ボディークリームといった基礎化粧品の他に、ファンデーション、口紅、頬紅といったメークアップ化粧品とすることもできる。
外用組成物の添加物としては、基剤、界面活性剤、増粘剤、防腐剤又は保存剤、ｐＨ調整剤、安定化剤又はキレート剤、紫外線吸収剤又は紫外線散乱剤、酸化防止剤、刺激緩和剤、着色剤、香料などが挙げられる。添加物は、1種又は２種以上を配合できる。
また、その他の生理活性又は薬理活性成分としては、本発明のオリゴペプチド又はその誘導体以外の、皮膚のハリを改善する成分を好ましく配合できる。
皮膚のハリを改善する成分としては、コラーゲンゲル収縮促進作用を有する成分の他、細胞外マトリックス（ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、グルコサミノグリカンなど）の生成促進作用を有する成分、細胞外マトリックスの分解抑制作用を有する成分、線維維芽細胞増殖促進作用を有する成分、角化細胞のターンオーバー促進作用を有する成分などが挙げられる。
このような作用を有する成分として、ラクトフェリン、アーチチョーク、アルガニアスピノザ、アロエベラ、イラクサ、ウコン、ウチワサボテン、オクラ、オタネニンジン、カッコン、カバノアナタケ、キイチゴ、キンギンカ、クズ、クチナシ、クワ、クロレラ、ゲットウ、ゴレンシ、サクラ、ザクロ、サンショウ、シコン、シャクヤク、シラカバ、スターフルーツ、セージ、ダイズ、タイソウ、チョウジ、ツボクサ、トウキ、トウモロコシ、トチュウ、ナツメ、ニンジン、パッションフルーツ、ハトムギ、ヒオウギ、ビルベリー、ビワ、ブドウ、ブナ、ボタン、ボタンボウフウ、ホップ、マグワ、ムラサキ、メマツヨイグサ、モモ、ヤグルマギク、ユーカリ、ユズ、ヨーロッパブナ、レンゲソウ、ローズマリー、ローマカミツレ、ワレモコウのような植物の抽出物、真珠タンパク質加水分解物、加水分解コンキオリン、γ-オリザノール、米ぬか油、ヘマトコッカスプルビアリスエキス、グリシルグリシン、アスタキサンチン、グリチルリチン酸ジカリウム、β-シトステロール、幹細胞培養上清、加水分解卵殻膜、サイタイエキス、セラミド、ヒドロキシプロリン、アセチルヒドロキシプロリン、メバロノラクトン、γ-アミノ酪酸、エクトイン、アセチルグルコサミン、トリペプチド－１銅などが挙げられる。
また、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、グルコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン類似物質、プロテオグリカンや、これらの分解物、誘導体、塩を配合することもでき、これらも皮膚のハリを改善することができる。
皮膚のハリを改善する成分としては、コラーゲンゲル収縮促進作用を有する成分の他、細胞外マトリックス（ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、グルコサミノグリカンなど）の生成促進作用を有する成分、細胞外マトリックスの分解抑制作用を有する成分、線維維芽細胞増殖促進作用を有する成分、角化細胞のターンオーバー促進作用を有する成分などが挙げられる。
このような作用を有する成分として、ラクトフェリン、アーチチョーク、アルガニアスピノザ、アロエベラ、イラクサ、ウコン、ウチワサボテン、オクラ、オタネニンジン、カッコン、カバノアナタケ、キイチゴ、キンギンカ、クズ、クチナシ、クワ、クロレラ、ゲットウ、ゴレンシ、サクラ、ザクロ、サンショウ、シコン、シャクヤク、シラカバ、スターフルーツ、セージ、ダイズ、タイソウ、チョウジ、ツボクサ、トウキ、トウモロコシ、トチュウ、ナツメ、ニンジン、パッションフルーツ、ハトムギ、ヒオウギ、ビルベリー、ビワ、ブドウ、ブナ、ボタン、ボタンボウフウ、ホップ、マグワ、ムラサキ、メマツヨイグサ、モモ、ヤグルマギク、ユーカリ、ユズ、ヨーロッパブナ、レンゲソウ、ローズマリー、ローマカミツレ、ワレモコウのような植物の抽出物、真珠タンパク質加水分解物、加水分解コンキオリン、γ-オリザノール、米ぬか油、ヘマトコッカスプルビアリスエキス、グリシルグリシン、アスタキサンチン、グリチルリチン酸ジカリウム、β-シトステロール、幹細胞培養上清、加水分解卵殻膜、サイタイエキス、セラミド、ヒドロキシプロリン、アセチルヒドロキシプロリン、メバロノラクトン、γ-アミノ酪酸、エクトイン、アセチルグルコサミン、トリペプチド－１銅などが挙げられる。
また、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、グルコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン類似物質、プロテオグリカンや、これらの分解物、誘導体、塩を配合することもでき、これらも皮膚のハリを改善することができる。
また、生理活性又は薬理活性成分として、美白成分、免疫賦活剤、収斂剤、抗酸化剤、血行促進剤、抗菌剤、温感剤、ビタミン類、アミノ酸、創傷治癒促進剤、細胞賦活剤、酵素なども挙げられる。
このような成分として、レチノール、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＣ及びその誘導体、サリチル酸及びその誘導体、レゾルシノール及びその誘導体、フォスファチジルセリン、フォスファチジン酸、環状フォスファチジン酸のようなリン脂質、トラネキサム酸及びその誘導体、ナイアシンアミド、ヒドロキノン及びその誘導体、トレハロース、トレハロース硫酸塩などが挙げられる。
本発明のオリゴペプチド又はその誘導体以外の生理活性又は薬理活性成分は、１種又は２種以上を配合できる。
このような成分として、レチノール、ビタミンＡ及びその誘導体、ビタミンＣ及びその誘導体、サリチル酸及びその誘導体、レゾルシノール及びその誘導体、フォスファチジルセリン、フォスファチジン酸、環状フォスファチジン酸のようなリン脂質、トラネキサム酸及びその誘導体、ナイアシンアミド、ヒドロキノン及びその誘導体、トレハロース、トレハロース硫酸塩などが挙げられる。
本発明のオリゴペプチド又はその誘導体以外の生理活性又は薬理活性成分は、１種又は２種以上を配合できる。
食品組成物
食品組成物は、いわゆるサプリメントと称される経口投与製剤とすることができる。
固形状の経口投与製剤としては、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）などが挙げられる。固形製剤には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、着色剤、矯味剤、甘味剤、香料、保存剤又は防腐剤などの添加物の１種又は２種以上を配合することができる。
液体状の経口投与製剤としては、液剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、リモナーデ剤、シロップ剤などが挙げられる。液体製剤には、ｐＨ調整剤、緩衝剤、増粘剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤、着色剤、香料などの添加物の１種又は２種以上を配合することができる。
また、経口投与製剤には、本発明のオリゴペプチド又はその誘導体以外の生理活性又は薬理活性成分の１種又は２種以上を配合できる。このような生理活性又は薬理活性成分としては、外用組成物について例示したものが挙げられる。
食品組成物は、いわゆるサプリメントと称される経口投与製剤とすることができる。
固形状の経口投与製剤としては、錠剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）などが挙げられる。固形製剤には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、着色剤、矯味剤、甘味剤、香料、保存剤又は防腐剤などの添加物の１種又は２種以上を配合することができる。
液体状の経口投与製剤としては、液剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、リモナーデ剤、シロップ剤などが挙げられる。液体製剤には、ｐＨ調整剤、緩衝剤、増粘剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤、着色剤、香料などの添加物の１種又は２種以上を配合することができる。
また、経口投与製剤には、本発明のオリゴペプチド又はその誘導体以外の生理活性又は薬理活性成分の１種又は２種以上を配合できる。このような生理活性又は薬理活性成分としては、外用組成物について例示したものが挙げられる。
また、食品組成物は、一般食品に本発明のオリゴペプチド及び／又はその誘導体を配合した組成物であってもよい。例えば、ゼリー、寒天菓子、ガム、飴、焼き菓子（クッキー、ビスケットなど）のような固形食品や、ドリンク剤、茶飲料、コーヒー飲料、乳飲料、果物や野菜などのジュース、清涼飲料のような液体食品に本発明のオリゴペプチド及び／又はその誘導体を配合したものとすることができ、これらは本発明のオリゴペプチド及び／又はその誘導体を気軽に摂取できるものである。
食品組成物は、栄養補助食品、健康補助食品、栄養調整食品、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品などとして使用してもよい。
使用方法
本発明は、上記説明した本発明のオリゴペプチド及び／又はその誘導体の有効量をヒトに適用する工程を含む、(i)肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善方法、(ii)皮膚のコラーゲン収縮促進方法、及び(iii)皮膚の線維芽細胞活性化方法をそれぞれ提供する。
有効量は、(i)肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、若しくは弾力性低下の予防又は改善、(ii)皮膚のコラーゲン収縮促進、及び(iii)皮膚の線維芽細胞活性化のそれぞれに有効な量である。
本発明は、上記説明した本発明のオリゴペプチド及び／又はその誘導体の有効量をヒトに適用する工程を含む、(i)肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善方法、(ii)皮膚のコラーゲン収縮促進方法、及び(iii)皮膚の線維芽細胞活性化方法をそれぞれ提供する。
有効量は、(i)肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、若しくは弾力性低下の予防又は改善、(ii)皮膚のコラーゲン収縮促進、及び(iii)皮膚の線維芽細胞活性化のそれぞれに有効な量である。
本発明のオリゴペプチド及び／又はその誘導体は、上記説明した本発明の剤（外用組成物又は食品組成物）としてヒトに適用すればよい。「適用」は、外用組成物では、剤型に応じて、皮膚への塗布、塗擦、噴霧、又は貼付とすることができる。対象となる皮膚は、顔、首、腕、手指、足、足指、胴体部などとすることができ、これらの中でもシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、及び／又は弾力性低下が生じている部分やその前段階にある部分とすることができる。また、「適用」は、食品組成物では、経口投与又は摂取である。
本発明の剤の適用対象となるヒトは、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、及び／又は弾力性低下を有するヒト、その前段階にあるヒト、健常な肌を有するヒトの何れであってもよい。ここでの肌は、顔、首、腕、手指、足、足指、胴体部の何れも含むが、特に、顔及び／又は首の肌にシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、及び／又は弾力性低下を有するヒト、及びその前段階にあるヒトが好適である。
本発明の剤が外用組成物である場合、本発明のオリゴペプチド及び／又はその誘導体の１日、皮膚１ｃｍ２当たりの適用量が、０．０００１ｍｇ以上、０．００１ｍｇ以上、０．０１ｍｇ以上、０．１ｍｇ以上、又は１ｍｇ以上で、１００ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、１ｍｇ以下、又は０．１ｍｇ以下となるように、外用組成物を皮膚に適用することができる。
本発明の剤が食品組成物である場合、本発明のオリゴペプチド及び／又はその誘導体の１日投与又は摂取量が、０．０５ｍｇ以上、０．５ｍｇ以上、５ｍｇ以上、５０ｍｇ以上、又は５００ｍｇ以上で、５００００ｍｇ以下、５０００ｍｇ以下、５００ｍｇ以下、又は５０ｍｇ以下となるように、食品組成物を投与又は摂取することができる。
上記の皮膚への１日適用量、及び１日投与量又は摂取量は、(i)肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、若しくは弾力性低下の予防又は改善、(ii)皮膚のコラーゲン収縮促進、及び(iii)皮膚の線維芽細胞活性化のそれぞれに有効な量である。
また、１日の適用回数は、１～５回、１～４回、１～３回、１～２回、又は１回とすることができる。
本発明の剤が食品組成物である場合、本発明のオリゴペプチド及び／又はその誘導体の１日投与又は摂取量が、０．０５ｍｇ以上、０．５ｍｇ以上、５ｍｇ以上、５０ｍｇ以上、又は５００ｍｇ以上で、５００００ｍｇ以下、５０００ｍｇ以下、５００ｍｇ以下、又は５０ｍｇ以下となるように、食品組成物を投与又は摂取することができる。
上記の皮膚への１日適用量、及び１日投与量又は摂取量は、(i)肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、若しくは弾力性低下の予防又は改善、(ii)皮膚のコラーゲン収縮促進、及び(iii)皮膚の線維芽細胞活性化のそれぞれに有効な量である。
また、１日の適用回数は、１～５回、１～４回、１～３回、１～２回、又は１回とすることができる。
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
実施例１（オリゴペプチドの調製・コラーゲンゲル収縮促進活性の評価）
（ウシラクトフェリンのトリプシン限定分解物の作製）
ウシラクトフェリン１ｇとトリプシン０．０１ ｇをｐＨ８．０の緩衝液２０ ｍＬに溶解し、５０ ℃で１６時間静置させ限定分解した。この分解産物を１００℃で２０分間加熱して酵素を失活させ、ウシラクトフェリン分解物液を得た。ウシラクトフェリン分解物液をＯＤＳカラムで４０分画し、凍結乾燥した。各分画の凍結乾燥物の濃度５ ｍｇ／ｍＬのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）溶液を調製し、コラーゲンゲル収縮促進活性を評価した結果、Ｎｏ．３６とＮｏ．３７の分画にコラーゲンゲル収縮促進活性が認められたので、これらをゲルろ過カラムで分画して、おおよその分子量を推定した。その結果、４つの候補配列（ＳＣＨＴＡＶＤＲ（Ｎｏ．２）、ＬＬＣＬＤＧＴＲ（Ｎｏ．１２）、ＳＶＤＧＫ（Ｎｏ．２０）、ＤＬＬＦＫ（Ｎｏ．２５）（配列番号１７））が考えられたので、これらのペプチドを合成して、溶媒（ＤＭＳＯ：ＰＢＳ＝１：１）を用いて、濃度５ ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。これらの溶液のコラーゲンゲル収縮促進活性を評価した結果、ＳＣＨＴＡＶＤＲ（Ｎｏ．２）、ＬＬＣＬＤＧＴＲ（Ｎｏ．１２）、ＳＶＤＧＫ（Ｎｏ．２０）の各ペプチドにコラーゲンゲル収縮促進活性が認められたので、さらにそれらのペプチドのＮ末又はＣ末から一つずつアミノ酸を除いたペプチドを合成して、それらのコラーゲンゲル収縮促進活性を評価した。
実施例１（オリゴペプチドの調製・コラーゲンゲル収縮促進活性の評価）
（ウシラクトフェリンのトリプシン限定分解物の作製）
ウシラクトフェリン１ｇとトリプシン０．０１ ｇをｐＨ８．０の緩衝液２０ ｍＬに溶解し、５０ ℃で１６時間静置させ限定分解した。この分解産物を１００℃で２０分間加熱して酵素を失活させ、ウシラクトフェリン分解物液を得た。ウシラクトフェリン分解物液をＯＤＳカラムで４０分画し、凍結乾燥した。各分画の凍結乾燥物の濃度５ ｍｇ／ｍＬのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）溶液を調製し、コラーゲンゲル収縮促進活性を評価した結果、Ｎｏ．３６とＮｏ．３７の分画にコラーゲンゲル収縮促進活性が認められたので、これらをゲルろ過カラムで分画して、おおよその分子量を推定した。その結果、４つの候補配列（ＳＣＨＴＡＶＤＲ（Ｎｏ．２）、ＬＬＣＬＤＧＴＲ（Ｎｏ．１２）、ＳＶＤＧＫ（Ｎｏ．２０）、ＤＬＬＦＫ（Ｎｏ．２５）（配列番号１７））が考えられたので、これらのペプチドを合成して、溶媒（ＤＭＳＯ：ＰＢＳ＝１：１）を用いて、濃度５ ｍｇ／ｍＬの溶液を調製した。これらの溶液のコラーゲンゲル収縮促進活性を評価した結果、ＳＣＨＴＡＶＤＲ（Ｎｏ．２）、ＬＬＣＬＤＧＴＲ（Ｎｏ．１２）、ＳＶＤＧＫ（Ｎｏ．２０）の各ペプチドにコラーゲンゲル収縮促進活性が認められたので、さらにそれらのペプチドのＮ末又はＣ末から一つずつアミノ酸を除いたペプチドを合成して、それらのコラーゲンゲル収縮促進活性を評価した。
（コラーゲンゲル収縮促進活性の評価）
２４ウェルプレートの各ウェルに、メーカー既定濃度の５倍濃度の培地｛純水にＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）０．９４ｇ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ ５００ μＬ、Ｌ－グルタミン ２９．２ ｍｇ、ウシ血清１ ｍＬを加えて２０ ｍＬに調製｝１００ μＬ、５ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプル２．５ μＬ、Ｉ型コラーゲン（ＩＡＣ－３０）３６５ μＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ １２．５ μＬ、ヒト線維芽細胞（２５０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）２０ μＬを、この順に添加した。次いでウェルプレートを３７℃で１時間培養してコラーゲンゲルを作製した。ウェルプレートの壁に付着しているゲルを剥がしてウェル内に置き、ゲルの上から５ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプルを含む１％ＦＢＳ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ's Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を５００ μＬずつ添加した。さらにこれを３７℃で培養し、培養開始３日後のゲルの面積を、デジタルノギスでゲルの直径を測定することで計測した。
２４ウェルプレートの各ウェルに、メーカー既定濃度の５倍濃度の培地｛純水にＭｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）０．９４ｇ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ ５００ μＬ、Ｌ－グルタミン ２９．２ ｍｇ、ウシ血清１ ｍＬを加えて２０ ｍＬに調製｝１００ μＬ、５ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプル２．５ μＬ、Ｉ型コラーゲン（ＩＡＣ－３０）３６５ μＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ １２．５ μＬ、ヒト線維芽細胞（２５０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）２０ μＬを、この順に添加した。次いでウェルプレートを３７℃で１時間培養してコラーゲンゲルを作製した。ウェルプレートの壁に付着しているゲルを剥がしてウェル内に置き、ゲルの上から５ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプルを含む１％ＦＢＳ含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏ's Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を５００ μＬずつ添加した。さらにこれを３７℃で培養し、培養開始３日後のゲルの面積を、デジタルノギスでゲルの直径を測定することで計測した。
コントロールサンプルとして、被検サンプルに代えて、被検サンプルの調製に用いた溶媒を用いた他は、上記と同様にして培養および観察を行った。
陽性対照サンプルとして、ウシラクトフェリンを用いた。
各サンプルについて３つのゲルを調製、培養し（ｎ＝３）、ゲル面積を計測し、平均値と標準偏差を求めた。
被検サンプルのゲル面積がコントロールより小さければ、その被検サンプルに培養ヒト線維芽細胞のコラーゲンゲル収縮促進活性があることが分かる。従って、上記方法でゲル面積を計測することで、被検サンプルが肌のシワ、たるみ、ハリのなさの改善作用を有するか否かを評価できる。
陽性対照サンプルとして、ウシラクトフェリンを用いた。
各サンプルについて３つのゲルを調製、培養し（ｎ＝３）、ゲル面積を計測し、平均値と標準偏差を求めた。
被検サンプルのゲル面積がコントロールより小さければ、その被検サンプルに培養ヒト線維芽細胞のコラーゲンゲル収縮促進活性があることが分かる。従って、上記方法でゲル面積を計測することで、被検サンプルが肌のシワ、たるみ、ハリのなさの改善作用を有するか否かを評価できる。
結果を表１に示す。表１中のコラーゲンゲル面積比は、コントロールのコラーゲンゲル面積を１としたときの相対値である。
ＳＣＨＴＡＶＤＲ（Ｎｏ．２）又はＬＬＣＬＤＧＴＲ（Ｎｏ．１２）のオリゴペプチドを添加することにより、コントロールに比べて、有意にコラーゲンゲルの面積の減少、すなわちコラーゲンゲルの収縮促進が確認されたため、これらのオリゴペプチドに肌のシワ、たるみ、ハリのなさの改善効果があることが確認された。陽性対照のウシラクトフェリンもコントロールに比べて有意にコラーゲンゲルの収縮を促進した。また、Ｎｏ．２及びＮｏ．１２の各オリゴペプチドのコラーゲンゲルの収縮促進活性とウシラクトフェリンのコラーゲンゲルの収縮促進活性との間に有意差は認められなかった。
Ｎｏ．２、Ｎｏ．１２の各オリゴペプチドのＮ末端又はＣ末端から１アミノ酸ずつ除くことにより得られたアミノ酸配列を有するオリゴペプチドの多くはコントロールに比べて有意にコラーゲンゲルの収縮を促進したが、有意なコラーゲンゲル収縮促進活性を有さないものもあった。
Ｎｏ．２、Ｎｏ．１２の各オリゴペプチドのＮ末端又はＣ末端から１アミノ酸ずつ除くことにより得られたアミノ酸配列を有するオリゴペプチドの多くはコントロールに比べて有意にコラーゲンゲルの収縮を促進したが、有意なコラーゲンゲル収縮促進活性を有さないものもあった。
ＳＶＤＧＫ（Ｎｏ．２０）のオリゴペプチドは、コラーゲンゲルの収縮を促進した。また、Ｎｏ．２０のオリゴペプチドのＮ末端又はＣ末端から１アミノ酸ずつ除くことにより得られたアミノ酸配列を有するオリゴペプチドはコントロールに比べて有意にコラーゲンゲルの収縮を促進した。
ウシラクトフェリンの３１６～３２０番目のアミノ酸配列からなるＤＬＬＦＫ（Ｎｏ．２５）には、コラーゲンゲルの収縮促進活性は確認されなかった。
ウシラクトフェリンの３１６～３２０番目のアミノ酸配列からなるＤＬＬＦＫ（Ｎｏ．２５）には、コラーゲンゲルの収縮促進活性は確認されなかった。
実施例２（オリゴペプチドのコラーゲンゲル収縮促進活性の有効濃度）
２４ウェルプレートの各ウェルに、メーカー既定濃度の５倍濃度の培地｛純水にＭＥＭ ０．９４ｇ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ ５００ μＬ、Ｌ－グルタミン ２９．２ ｍｇ、ウシ血清１ ｍＬを加えて２０ ｍＬに調製｝１００ μＬ、各濃度に調製したＴＡＶ（Ｎｏ．９）のオリゴペプチド２．５ μＬ、Ｉ型コラーゲン（ＩＡＣ－３０）３６５ μＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ １２．５ μＬ、ヒト線維芽細胞（２５０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）２０ μＬを、この順に添加した。次いでウェルプレートを３７℃で１時間培養してコラーゲンゲルを作製した。ウェルプレートの壁に付着しているゲルを剥がしてウェル内に置き、ゲルの上から各濃度に調製したＴＡＶのオリゴペプチドを含む１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを５００ μＬずつ添加した。さらにこれを３７℃で培養し、培養開始３日後のゲルの面積を、デジタルノギスでゲルの直径を測定することで計測した。
２４ウェルプレートの各ウェルに、メーカー既定濃度の５倍濃度の培地｛純水にＭＥＭ ０．９４ｇ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ ５００ μＬ、Ｌ－グルタミン ２９．２ ｍｇ、ウシ血清１ ｍＬを加えて２０ ｍＬに調製｝１００ μＬ、各濃度に調製したＴＡＶ（Ｎｏ．９）のオリゴペプチド２．５ μＬ、Ｉ型コラーゲン（ＩＡＣ－３０）３６５ μＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ １２．５ μＬ、ヒト線維芽細胞（２５０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）２０ μＬを、この順に添加した。次いでウェルプレートを３７℃で１時間培養してコラーゲンゲルを作製した。ウェルプレートの壁に付着しているゲルを剥がしてウェル内に置き、ゲルの上から各濃度に調製したＴＡＶのオリゴペプチドを含む１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを５００ μＬずつ添加した。さらにこれを３７℃で培養し、培養開始３日後のゲルの面積を、デジタルノギスでゲルの直径を測定することで計測した。
コントロールサンプルとして、被検サンプルに代えて、被検サンプルの調製に用いた溶媒を用いた他は、上記と同様にして培養および観察を行った。
陽性対照サンプルとして、ウシラクトフェリンを用いた。
各サンプルについて３つのゲルを調製、培養し（ｎ＝３）、ゲル面積を計測し、平均値と標準偏差を求めた。
陽性対照サンプルとして、ウシラクトフェリンを用いた。
各サンプルについて３つのゲルを調製、培養し（ｎ＝３）、ゲル面積を計測し、平均値と標準偏差を求めた。
結果を表２に示す。表２中のオリゴペプチド濃度は、ウェル内の培養液の最終濃度である。
０．１ μｇ／ｍＬ、１ μｇ／ｍＬ、１０ μｇ／ｍＬ、２５ μｇ／ｍＬ、５０ μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬのＴＡＶのオリゴペプチドをそれぞれ添加することにより、コントロールに比べて、有意なコラーゲンゲルの面積の減少、すなわちコラーゲンゲルの収縮促進効果が認められた。このオリゴペプチドを０．１～１００μｇ／ｍＬの濃度範囲で含む組成物は、肌のシワ、たるみ、ハリのなさの改善効果があることが確認された。
０．１ μｇ／ｍＬ、１ μｇ／ｍＬ、１０ μｇ／ｍＬ、２５ μｇ／ｍＬ、５０ μｇ／ｍＬ、及び１００μｇ／ｍＬのＴＡＶのオリゴペプチドをそれぞれ添加することにより、コントロールに比べて、有意なコラーゲンゲルの面積の減少、すなわちコラーゲンゲルの収縮促進効果が認められた。このオリゴペプチドを０．１～１００μｇ／ｍＬの濃度範囲で含む組成物は、肌のシワ、たるみ、ハリのなさの改善効果があることが確認された。
実施例３（オリゴペプチドの修飾体のコラーゲンゲル収縮促進活性の評価）
ＣＨＴＡＶＤＲ（Ｎｏ．３）のオリゴペプチドのＮ末端アセチル修飾体、Ｎ末端スクシニル修飾体、及びＮ末端パルミトイル修飾体（それぞれ、株式会社バイオロジカ）のコラーゲンゲル収縮促進活性を評価した。
２４ウェルプレートの各ウェルに、メーカー規定濃度の５倍濃度の培地｛純水にＭＥＭ ０．９４ｇ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ ５００ μＬ、Ｌ－グルタミン ２９．２ ｍｇ、ウシ血清１ ｍＬを加えて２０ ｍＬに調製｝１００ μＬ、２０ ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプル２．５ μＬ、Ｉ型コラーゲン（ＩＡＣ－３０）３６５ μＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ １２．５ μＬ、ヒト線維芽細胞（２５０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）２０ μＬをこの順に添加した。次いでウェルプレートを３７℃で１時間培養してコラーゲンゲルを作製した。ウェルプレートの壁に付着しているゲルを剥がしてウェル内に置き、ゲルの上から２０ ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプルを含む１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを５００ μＬずつ添加した。さらにこれを３７℃で培養し、培養開始３日後のゲルの面積を、デジタルノギスでゲルの直径を測定することで計測した。
ＣＨＴＡＶＤＲ（Ｎｏ．３）のオリゴペプチドのＮ末端アセチル修飾体、Ｎ末端スクシニル修飾体、及びＮ末端パルミトイル修飾体（それぞれ、株式会社バイオロジカ）のコラーゲンゲル収縮促進活性を評価した。
２４ウェルプレートの各ウェルに、メーカー規定濃度の５倍濃度の培地｛純水にＭＥＭ ０．９４ｇ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ ５００ μＬ、Ｌ－グルタミン ２９．２ ｍｇ、ウシ血清１ ｍＬを加えて２０ ｍＬに調製｝１００ μＬ、２０ ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプル２．５ μＬ、Ｉ型コラーゲン（ＩＡＣ－３０）３６５ μＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ １２．５ μＬ、ヒト線維芽細胞（２５０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）２０ μＬをこの順に添加した。次いでウェルプレートを３７℃で１時間培養してコラーゲンゲルを作製した。ウェルプレートの壁に付着しているゲルを剥がしてウェル内に置き、ゲルの上から２０ ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプルを含む１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを５００ μＬずつ添加した。さらにこれを３７℃で培養し、培養開始３日後のゲルの面積を、デジタルノギスでゲルの直径を測定することで計測した。
コントロールサンプルとして、被検サンプルに代えて、被検サンプルの調製に用いた溶媒を用いた他は、上記と同様にして培養および観察を行った。
各サンプルについて３つのゲルを調製、培養し（ｎ＝３）、ゲル面積を計測し、平均値と標準偏差を求めた。
各サンプルについて３つのゲルを調製、培養し（ｎ＝３）、ゲル面積を計測し、平均値と標準偏差を求めた。
結果を表３に示す。
ＣＨＴＡＶＤＲのオリゴペプチドのＮ末端アセチル修飾体、Ｎ末端スクシニル修飾体、及びＮ末端パルミトイル修飾体を、最終濃度１００ μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加することにより、コントロールに比べて有意なコラーゲンゲルの面積の減少、すなわちコラーゲンゲルの収縮促進が確認されたため、これらの修飾体に肌のシワ、たるみ、ハリのなさの改善効果があることが確認された。
ＣＨＴＡＶＤＲのオリゴペプチドのＮ末端アセチル修飾体、Ｎ末端スクシニル修飾体、及びＮ末端パルミトイル修飾体を、最終濃度１００ μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加することにより、コントロールに比べて有意なコラーゲンゲルの面積の減少、すなわちコラーゲンゲルの収縮促進が確認されたため、これらの修飾体に肌のシワ、たるみ、ハリのなさの改善効果があることが確認された。
実施例４（他のシワ、たるみ、ハリ改善剤とのコラーゲンゲル収縮促進活性の比較）
シワ改善効果が既に確認されているナイアシンアミド（シグマ アルドリッチ社）とパルミトイルトリペプチド－５「（Ｐａｌ）－Ｌｙｓ-Ｖａｌ－Ｌｙｓ－［ＯＨ］」（株式会社ピーエイチジャパン）のコラーゲンゲル収縮促進活性とＡＶＤ（Ｎｏ．１０）のオリゴペプチドのコラーゲンゲル収縮促進活性を比較した。
２４ウェルプレートの各ウェルに、メーカー既定濃度の５倍濃度の培地｛純水にＭＥＭ ０．９４ｇ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ ５００ μＬ、Ｌ－グルタミン ２９．２ ｍｇ、ウシ血清１ ｍＬを加えて２０ ｍＬに調製｝１００ μＬ、２０ ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプル２．５ μＬ、Ｉ型コラーゲン（ＩＡＣ－３０）３６５ μＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ １２．５ μＬ、ヒト線維芽細胞（２５０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）２０ μＬをこの順に添加した。次いでウェルプレートを３７℃で１時間培養してコラーゲンゲルを作製した。ウェルプレートの壁に付着しているゲルを剥がしてウェル内に置き、ゲルの上から２０ ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプルを含む１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを５００ μＬずつ添加した。さらにこれを３７℃で培養し、培養開始３日後のゲルの面積を、デジタルノギスでゲルの直径を測定することで計測した。
シワ改善効果が既に確認されているナイアシンアミド（シグマ アルドリッチ社）とパルミトイルトリペプチド－５「（Ｐａｌ）－Ｌｙｓ-Ｖａｌ－Ｌｙｓ－［ＯＨ］」（株式会社ピーエイチジャパン）のコラーゲンゲル収縮促進活性とＡＶＤ（Ｎｏ．１０）のオリゴペプチドのコラーゲンゲル収縮促進活性を比較した。
２４ウェルプレートの各ウェルに、メーカー既定濃度の５倍濃度の培地｛純水にＭＥＭ ０．９４ｇ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ ５００ μＬ、Ｌ－グルタミン ２９．２ ｍｇ、ウシ血清１ ｍＬを加えて２０ ｍＬに調製｝１００ μＬ、２０ ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプル２．５ μＬ、Ｉ型コラーゲン（ＩＡＣ－３０）３６５ μＬ、１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ３ １２．５ μＬ、ヒト線維芽細胞（２５０万ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）２０ μＬをこの順に添加した。次いでウェルプレートを３７℃で１時間培養してコラーゲンゲルを作製した。ウェルプレートの壁に付着しているゲルを剥がしてウェル内に置き、ゲルの上から２０ ｍｇ／ｍＬに調製した被検サンプルを含む１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを５００ μＬずつ添加した。さらにこれを３７℃で培養し、培養開始３日後のゲルの面積を、デジタルノギスでゲルの直径を測定することで計測した。
コントロールサンプルとして、被検サンプルに代えて、被検サンプルの調製に用いた溶媒を用いた他は、上記と同様にして培養および観察を行った。
陽性対照サンプルとして、ウシラクトフェリンを用いた。
各サンプルについて３つのゲルを調製、培養し（ｎ＝３）、ゲル面積を計測し、平均値と標準偏差を求めた。
陽性対照サンプルとして、ウシラクトフェリンを用いた。
各サンプルについて３つのゲルを調製、培養し（ｎ＝３）、ゲル面積を計測し、平均値と標準偏差を求めた。
結果を表４に示す。
最終濃度１００ μｇ／ｍＬのＡＶＤのオリゴペプチド、最終濃度１００ μｇ／ｍＬのナイアシンアミドの添加により、コントロールに比べて有意なコラーゲンゲルの面積の減少、すなわちコラーゲンゲルの収縮促進が確認されたため、これらには肌のシワ、たるみ、ハリのなさの改善効果があることが確認された。また、ＡＶＤのオリゴペプチドによるコラーゲンゲルの面積の減少変化とナイアシンアミドによるコラーゲンゲルの面積の減少変化との間には有意差があり、ＡＶＤのオリゴペプチドによるコラーゲンゲルの収縮促進効果はナイアシンアミドによるコラーゲンゲルの収縮促進効果よりも有意に大きいことが確認された。一方、最終濃度１００ μｇ／ｍＬのパルミトイルトリペプチド－５にコラーゲンゲルの収縮促進効果は認められなかった。
最終濃度１００ μｇ／ｍＬのＡＶＤのオリゴペプチド、最終濃度１００ μｇ／ｍＬのナイアシンアミドの添加により、コントロールに比べて有意なコラーゲンゲルの面積の減少、すなわちコラーゲンゲルの収縮促進が確認されたため、これらには肌のシワ、たるみ、ハリのなさの改善効果があることが確認された。また、ＡＶＤのオリゴペプチドによるコラーゲンゲルの面積の減少変化とナイアシンアミドによるコラーゲンゲルの面積の減少変化との間には有意差があり、ＡＶＤのオリゴペプチドによるコラーゲンゲルの収縮促進効果はナイアシンアミドによるコラーゲンゲルの収縮促進効果よりも有意に大きいことが確認された。一方、最終濃度１００ μｇ／ｍＬのパルミトイルトリペプチド－５にコラーゲンゲルの収縮促進効果は認められなかった。
以上の結果より、本発明のオリゴペプチド及びその誘導体をヒトに適用することによって、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリの低下、弾力性の低下の改善効果が得られることが示唆された。
以上に開示された実施の形態と実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考慮されるべきである。
本発明のオリゴペプチド及びその誘導体は、経皮吸収性に優れ、また皮膚刺激が少ない成分でありながら、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリの低下、弾力性の低下を効果的に改善できる点で、非常に有用なものである。
Claims (4)
- ＴＡＶのアミノ酸配列からなるトリペプチドを含む、肌におけるコラーゲン収縮促進剤。
- 外用組成物又は食品組成物である、請求項１に記載の肌におけるコラーゲン収縮促進剤。
- ＴＡＶのアミノ酸配列からなるトリペプチドを含む、肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤。
- 外用組成物又は食品組成物である、請求項３に記載の肌のシワ、下がり、たるみ、ハリ低下、又は弾力性低下の予防又は改善剤。
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