JP2023002102A - カフェイン分解能を有する微生物 - Google Patents
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Abstract
【課題】カフェイン分解能を有する微生物の提供。また、カフェイン分解剤、カフェイン含有量が低減された飲食品、該飲食品の製造方法、カフェインの分解方法の提供。【解決手段】カフェイン分解能を有し、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物。【選択図】図１
Description
本発明は、カフェイン分解能を有する微生物に関する。本発明は、カフェイン分解剤、飲食品、該飲食品の製造方法、およびカフェインの分解方法にも関する。
コーヒー、緑茶、紅茶、ココア、コーラ等の飲料には、カフェインが含まれている。カフェインには覚醒作用や血管拡張作用、胃液分泌促進作用、利尿作用等の生理的作用があることが知られており、健康上の理由等からカフェインの摂取またはその過剰な摂取を控える消費者が存在する。カフェインが除去または低減された飲食品は、一般に、「デカフェ」や「カフェインレス」などと称される。例えばコーヒー飲料の場合、脱カフェイン処理を施したものは、「デカフェ・コーヒー（decaffeinated coffee）」や「カフェインレス・コーヒー（caffein-less coffee）」として親しまれている。
従来、飲食品からカフェインを除去または低減する方法として、例えばコーヒーの場合、有機溶媒を使用してカフェインを抽出・除去する有機溶媒法、コーヒー豆を水に浸して得た抽出液からカフェインを取り除いた後にカフェイン以外の成分をコーヒー豆に戻す水抽出法、超臨界流体の状態にした二酸化炭素を用いてカフェインを抽出・除去する超臨界二酸化炭素抽出法、高分子樹脂や活性炭等の吸着剤を用いてカフェインを除去する方法、遺伝子工学的に初めからカフェインを含まないコーヒーノキを育種する方法等が知られている。また、カフェイン分解能を有する微生物を用いてカフェインを分解する方法も知られている（例えば、特許文献１～３、非特許文献１～１０）。
Zhou, B., Ma, C., Xia, T. et al. Isolation, characterization and application of theophylline-degrading Aspergillus fungi. Microb Cell Fact 19, 72 (2020).
Frometa, Rosa A. Rodriguez et al. "Evaluation of coffee pulp as substrate for polygalacturonase production in solid state fermentation." Emirates Journal of Food and Agriculture (2020): 117-124.
Zhou, B., Ma, C., Ren, X. et al. Production of theophylline via aerobic fermentation of pu-erh tea using tea-derived fungi. BMC Microbiol 19, 261 (2019).
Zhou, B., Ma, C., Wang, H. et al. Biodegradation of caffeine by whole cells of tea-derived fungi Aspergillus sydowii, Aspergillus niger and optimization for caffeine degradation. BMC Microbiol 18, 53 (2018).
Oduro-Mensah, D., Ocloo, A., Lowor, S.T. et al. Bio-detheobromination of cocoa pod husks: reduction of ochratoxin A content without change in nutrient profile. Microb Cell Fact 17, 79 (2018).
Sri Rachmania Juliastuti, Tri Widjaja, Ali Altway, Vivi Alvionita Sari, Dessy Arista, Toto Iswanto. The effects of microorganism on coffee pulp pretreatment as a source of biogas production. MATEC Web Conf. 156 03010 (2018).
Hou CW, Jeng KC, Chen YS. Enhancement of fermentation process in Pu-erh tea by tea-leaf extract. J Food Sci. 2010 Jan-Feb;75(1):H44-8.
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伊奈和夫，カフェインの生化学的研究，農化 第４５巻，第８号，ｐ．３７８－３８０，１９７１
Summers, Ryan Michael. "Metabolism, enzymology, and genetic characterization of caffeine degradation by pseudomonas putida CBB5." PhD (Doctor of Philosophy) thesis, University of Iowa, 2011.
本発明は、カフェイン分解能を有する微生物を提供する。また、本発明は、カフェイン分解剤、カフェイン含有量が低減された飲食品、該飲食品の製造方法、およびカフェインの分解方法も提供する。
本発明には以下の態様の発明が含まれる。
［１］カフェイン分解能を有し、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物（但し、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）MTCC5215株、ペニシリウム・マンギニイ（Penicillium manginii）CBS253.31株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）NCBT110A株、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowii）NRRL250株、アスペルギルス・パリドフルブス（Aspergillus pallidofulvus）NRRL4789株、アスペルギルス・セサミコラ（Aspergillus sesamicola）CBS137324株、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus ustus）NRRL275株、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）NRRL20818株、アスペルギルス・ニガー・ヴァン・ティゲム（Aspergillus niger van Thiegem）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AnTD株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）LPBx株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AN-5株を除く）。
［２］前記微生物が、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Penicillium brevicompactum）、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）、コレトトリカム・ボニネンセ（Colletotrichum boninense）、ペスタロチア・エラスチカ（Pestalotia elasticae）、ペスタロチア・ロサエ（Pestalotia rosae）、ペスタロチオプシス・カメリア（Pestalotiopsis camelliae）、ゲラシノスポラ・サンティ－フロリ（Gelasinospora santi-florii）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に属する微生物である、上記［１］に記載の微生物。
［３］カフェイン分解能を有する微生物であって、前記微生物が、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Penicillium brevicompactum）CBS 110070株、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株、コレトトリカム・ボニネンセ（Colletotrichum boninense）CBS125468株、ペスタロチア・エラスチカ（Pestalotia elasticae）CBS273.29株、ペスタロチア・ロサエ（Pestalotia rosae）CBS563.76株、ペスタロチオプシス・カメリア（Pestalotiopsis camelliae）CBS443.62株、ゲラシノスポラ・サンティ－フロリ（Gelasinospora santi-florii）CBS534.76株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS117.48株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS120166株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS123.48株またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS554.65株である、微生物。
［４］上記［１］～［３］の何れか１項に記載の１種以上の微生物、またはその微生物由来の菌体破砕液、粗酵素液もしくは精製酵素を含む、カフェイン分解剤。
［５］補酵素を含む、上記［４］に記載のカフェイン分解剤。
［６］上記［４］または［５］に記載のカフェイン分解剤と、カフェイン含有溶液とを接触させた処理液を含む、飲食品。
［７］カフェイン含有量が低減された、上記［６］に記載の飲食品。
［８］飲料または飲料濃縮物である、上記［６］または［７］に記載の飲食品。
［９］上記［４］または［５］に記載のカフェイン分解剤をカフェイン含有溶液と接触させることと、前記接触後の処理液を殺菌すること、を含む、飲食品の製造方法。
［１０］カフェイン分解能を有し、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物を、カフェイン含有溶液と接触させることを含む、カフェインの分解方法（但し、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）MTCC5215株、ペニシリウム・マンギニイ（Penicillium manginii）CBS253.31株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）NCBT110A株、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowii）NRRL250株、アスペルギルス・パリドフルブス（Aspergillus pallidofulvus）NRRL4789株、アスペルギルス・セサミコラ（Aspergillus sesamicola）CBS137324株、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus ustus）NRRL275株、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）NRRL20818株、アスペルギルス・ニガー・ヴァン・ティゲム（Aspergillus niger van Thiegem）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AnTD株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）LPBx株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AN-5株を除く）。
［１］カフェイン分解能を有し、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物（但し、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）MTCC5215株、ペニシリウム・マンギニイ（Penicillium manginii）CBS253.31株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）NCBT110A株、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowii）NRRL250株、アスペルギルス・パリドフルブス（Aspergillus pallidofulvus）NRRL4789株、アスペルギルス・セサミコラ（Aspergillus sesamicola）CBS137324株、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus ustus）NRRL275株、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）NRRL20818株、アスペルギルス・ニガー・ヴァン・ティゲム（Aspergillus niger van Thiegem）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AnTD株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）LPBx株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AN-5株を除く）。
［２］前記微生物が、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Penicillium brevicompactum）、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）、コレトトリカム・ボニネンセ（Colletotrichum boninense）、ペスタロチア・エラスチカ（Pestalotia elasticae）、ペスタロチア・ロサエ（Pestalotia rosae）、ペスタロチオプシス・カメリア（Pestalotiopsis camelliae）、ゲラシノスポラ・サンティ－フロリ（Gelasinospora santi-florii）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に属する微生物である、上記［１］に記載の微生物。
［３］カフェイン分解能を有する微生物であって、前記微生物が、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Penicillium brevicompactum）CBS 110070株、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株、コレトトリカム・ボニネンセ（Colletotrichum boninense）CBS125468株、ペスタロチア・エラスチカ（Pestalotia elasticae）CBS273.29株、ペスタロチア・ロサエ（Pestalotia rosae）CBS563.76株、ペスタロチオプシス・カメリア（Pestalotiopsis camelliae）CBS443.62株、ゲラシノスポラ・サンティ－フロリ（Gelasinospora santi-florii）CBS534.76株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS117.48株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS120166株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS123.48株またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS554.65株である、微生物。
［４］上記［１］～［３］の何れか１項に記載の１種以上の微生物、またはその微生物由来の菌体破砕液、粗酵素液もしくは精製酵素を含む、カフェイン分解剤。
［５］補酵素を含む、上記［４］に記載のカフェイン分解剤。
［６］上記［４］または［５］に記載のカフェイン分解剤と、カフェイン含有溶液とを接触させた処理液を含む、飲食品。
［７］カフェイン含有量が低減された、上記［６］に記載の飲食品。
［８］飲料または飲料濃縮物である、上記［６］または［７］に記載の飲食品。
［９］上記［４］または［５］に記載のカフェイン分解剤をカフェイン含有溶液と接触させることと、前記接触後の処理液を殺菌すること、を含む、飲食品の製造方法。
［１０］カフェイン分解能を有し、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物を、カフェイン含有溶液と接触させることを含む、カフェインの分解方法（但し、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）MTCC5215株、ペニシリウム・マンギニイ（Penicillium manginii）CBS253.31株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）NCBT110A株、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowii）NRRL250株、アスペルギルス・パリドフルブス（Aspergillus pallidofulvus）NRRL4789株、アスペルギルス・セサミコラ（Aspergillus sesamicola）CBS137324株、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus ustus）NRRL275株、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）NRRL20818株、アスペルギルス・ニガー・ヴァン・ティゲム（Aspergillus niger van Thiegem）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AnTD株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）LPBx株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AN-5株を除く）。
本発明は、カフェイン分解能を有する微生物を提供する。また、本発明は、カフェイン分解剤、カフェイン含有量が低減された飲食品、該飲食品の製造方法、およびカフェインの分解方法も提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
１．カフェイン分解能を有する微生物
本発明は、カフェイン分解能を有する微生物に関する。「カフェイン分解能」とは、カフェインを炭素源として他の物質に変換する能力を意味する。前記微生物は、カフェインを炭素源として分解できるものであれば特に限定されず、例えば、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属等に属する微生物を含む。
但し、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）MTCC5215株、ペニシリウム・マンギニイ（Penicillium manginii）CBS253.31株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）NCBT110A株、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowii）NRRL250株、アスペルギルス・パリドフルブス（Aspergillus pallidofulvus）NRRL4789株、アスペルギルス・セサミコラ（Aspergillus sesamicola）CBS137324株、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus ustus）NRRL275株、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）NRRL20818株、アスペルギルス・ニガー・ヴァン・ティゲム（Aspergillus niger van Thiegem）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AnTD株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）LPBx株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AN-5株を含まない。
本発明は、カフェイン分解能を有する微生物に関する。「カフェイン分解能」とは、カフェインを炭素源として他の物質に変換する能力を意味する。前記微生物は、カフェインを炭素源として分解できるものであれば特に限定されず、例えば、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属等に属する微生物を含む。
但し、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）MTCC5215株、ペニシリウム・マンギニイ（Penicillium manginii）CBS253.31株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）NCBT110A株、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowii）NRRL250株、アスペルギルス・パリドフルブス（Aspergillus pallidofulvus）NRRL4789株、アスペルギルス・セサミコラ（Aspergillus sesamicola）CBS137324株、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus ustus）NRRL275株、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）NRRL20818株、アスペルギルス・ニガー・ヴァン・ティゲム（Aspergillus niger van Thiegem）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AnTD株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）LPBx株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AN-5株を含まない。
前記微生物は、上記の属に属するものを制限なく使用することができる。前記微生物は、具体的には、例えば、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Penicillium brevicompactum）、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）、コレトトリカム・ボニネンセ（Colletotrichum boninense）、ペスタロチア・エラスチカ（Pestalotia elasticae）、ペスタロチア・ロサエ（Pestalotia rosae）、ペスタロチオプシス・カメリア（Pestalotiopsis camelliae）、ゲラシノスポラ・サンティ－フロリ（Gelasinospora santi-florii）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等に属する微生物を含む。
本発明の一態様において、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に属する微生物を含む。本発明の別の態様において、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）またはコレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）に属する微生物を含む。
カフェイン分解能を有する微生物は、より具体的には、例えば、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Penicillium brevicompactum）CBS 110070株、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株、コレトトリカム・ボニネンセ（Colletotrichum boninense）CBS125468株、ペスタロチア・エラスチカ（Pestalotia elasticae）CBS273.29株、ペスタロチア・ロサエ（Pestalotia rosae）CBS563.76株、ペスタロチオプシス・カメリア（Pestalotiopsis camelliae）CBS443.62株、ゲラシノスポラ・サンティ－フロリ（Gelasinospora santi-florii）CBS534.76株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS117.48株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS120166株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS123.48株またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS554.65株等を含む。
本発明の一態様において、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS120166株を含む。本発明の別の態様において、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株またはコレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株を含む。
上記の微生物のうち、ＣＢＳ番号が付与されているものは、オランダ微生物株保存センター（Centraalbureau voor Schimmelcultures：CBS）に保存されているものを入手して使用することができる。また、カフェイン分解能を有する微生物は、例えば、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属等に属する公知の菌株を用い、カフェイン分解能を指標にスクリーニングして得てもよい。スクリーニングは、公知の方法により行うことができる。
本発明の一態様において、「カフェイン分解能を有する微生物」は、例えば、カフェインをパラキサンチン、テオフィリンまたはテオブロミンのいずれかに代謝する能力を有する微生物である。これらのカフェイン代謝産物の産生の有無は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の公知の方法で、代謝産物の検出の有無を直接評価してもよいし、カフェインのピーク面積またはピーク強度の経時的変化に基づき評価してもよいし、これらを組み合わせて評価してもよい。
カフェイン分解能を有する微生物は、野生株（自然界から単離した菌株であって、ＵＶ照射等の突然変異処理または遺伝子工学的手法による遺伝子改変処理が施されていないもの）、およびＵＶ照射や適応進化（adaptive evolution）等により得られた変異株を含む。変異株は、例えば、寄託菌株を親株として、上記の突然変異処理を施すことによって得ることができる。
微生物の培養法および培養条件は、使用する微生物に適した方法および条件に基づいて適宜設定することができる。微生物の培養法および培養条件は、例えば、Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (2nd Edition)，Garrity et al，2001，Springer-Verlag New York、食品衛生検査指針 微生物編 改訂第２版 ２０１８（公益財団法人日本食品衛生協会）等の記載を参照して適宜設定することができる。なお、本発明の一態様におけるカフェイン分解能を有する微生物は、カフェインを唯一の炭素源として、または唯一の炭素源および窒素源として生育することができる。
培地に添加される炭素源は、例えば、カフェインの他にグルコース、マルトース、サッカロース、セロビオース、デンプン加水分解液等の糖類、クエン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタール酸等の有機酸を含む。また、窒素源は、例えば、カフェインの他に硝酸塩、アンモニウム塩等の無機態窒素、尿素、アミノ酸等の有機態窒素を含む。また、リン源は、例えば、リン酸カリウム等のリン酸塩を含む。また、無機塩は、例えば、カリウム、ナトリウム、カルシウム等の金属塩を含む。また、培地は、必要に応じて、鉄、マンガン、マグネシウム、コバルト、銅、ニッケル等の微量成分、各種ビタミン、アミノ酸等を含む。なお、これら炭素源、窒素源、リン源、無機塩などを含む肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物等を使用してもよい。
また、培地濃度は成分によって異なり得るが、炭素源の濃度は、例えば、０．１～１０重量％、０．１～５重量％であり得る。窒素源の濃度は、例えば、０．０１～５重量％、０．１～５重量％であり得る。培地中のカフェインの濃度は、例えば、０．１～５重量％、０．１～３重量％、０．１～１重量％、０．２～５重量％、０．２～３重量％または０．２～１重量％等であり得る。
培養温度および培養液のｐＨは、微生物の種類によって至適範囲が異なるが、培養温度は、概ね５～５０℃、２０～４０℃が好ましい。培養液のｐＨは、概ねｐＨ４～９、ｐＨ５～８が好ましい。培養時間は、培地成分、濃度、培養温度、ｐＨ等の要素により異なり得るが、１～１０日、１～７日が好ましい。液体培地を使用する場合、回分式、半連続式、連続式のいずれの方法でもよく、振とう培養、静置培養または通気撹拌培養等により培養することができる。
２．カフェイン分解剤
本発明は、上記「１．カフェイン分解能を有する微生物」に記載の１種以上の微生物、またはその微生物由来の菌体破砕液、粗酵素液もしくは精製酵素を含む、カフェイン分解剤に関する。本発明の一態様において、カフェイン分解剤に含まれる微生物、またはその微生物由来の菌体破砕液、粗酵素液もしくは精製酵素は、微生物同士および微生物由来成分の相互作用によりカフェイン分解能に支障をきたさない限り、上記「１．カフェイン分解能を有する微生物」に記載の複数の微生物由来のものを組み合わせてもよい。
本発明は、上記「１．カフェイン分解能を有する微生物」に記載の１種以上の微生物、またはその微生物由来の菌体破砕液、粗酵素液もしくは精製酵素を含む、カフェイン分解剤に関する。本発明の一態様において、カフェイン分解剤に含まれる微生物、またはその微生物由来の菌体破砕液、粗酵素液もしくは精製酵素は、微生物同士および微生物由来成分の相互作用によりカフェイン分解能に支障をきたさない限り、上記「１．カフェイン分解能を有する微生物」に記載の複数の微生物由来のものを組み合わせてもよい。
ここで、本明細書において、「微生物由来」には、前記微生物を培養または抽出することによって得られた培養物または抽出物や、当該培養物または抽出物を分離または精製することによって得られた微生物の生産物または菌体自体が含まれ得る。
本発明の一態様における「菌体破砕液」は、上記微生物の培養液に超音波処理、溶解剤の添加による化学的処理等を施すことによって得られたものであって、遠心分離やマイクロフィルター等により菌体を分離していない状態のものであり得る。
本発明の一態様における「粗酵素液」は、遠心分離や０．２２μｍ径マイクロフィルター等を用いて前記菌体破砕液から菌体等を除去したものであって、限外ろ過等によりタンパク質の精製を行っていない状態のものであり得る。
本発明の一態様における「精製酵素」は、分子量３０ｋＤａまたは５０ｋＤａ等の限外ろ過膜等により粗酵素液からタンパク質を精製したものであって、クロマトグラフィーや電気泳動等によりタンパク質を高純度に精製しておらず、当該タンパク質を構成するアミノ酸配列が未決定の状態のものであり得る。
本発明の一態様における「菌体破砕液」は、上記微生物の培養液に超音波処理、溶解剤の添加による化学的処理等を施すことによって得られたものであって、遠心分離やマイクロフィルター等により菌体を分離していない状態のものであり得る。
本発明の一態様における「粗酵素液」は、遠心分離や０．２２μｍ径マイクロフィルター等を用いて前記菌体破砕液から菌体等を除去したものであって、限外ろ過等によりタンパク質の精製を行っていない状態のものであり得る。
本発明の一態様における「精製酵素」は、分子量３０ｋＤａまたは５０ｋＤａ等の限外ろ過膜等により粗酵素液からタンパク質を精製したものであって、クロマトグラフィーや電気泳動等によりタンパク質を高純度に精製しておらず、当該タンパク質を構成するアミノ酸配列が未決定の状態のものであり得る。
本発明の一態様において、カフェイン分解剤は、上述したカフェイン分解能を有する微生物そのものであり得る。この場合、カフェイン分解剤は、カフェイン分解微生物を再活性化できる方法により保存された形態であることが好ましい。具体的には、例えば、凍結保存、凍結乾燥、Ｌ－乾燥法等により保存された形態とすることが挙げられる。これらの保存形態は、それぞれ公知の方法で行うことができる。また、必要に応じて、添加剤を用いてもよい。添加剤としては、凍結保存の場合、例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシド等を例示することができ、凍結乾燥の場合、例えば、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム等を例示することができ、Ｌ－乾燥法の場合、例えば、グルタミン酸ナトリウム、リン酸緩衝液等を例示することができる。また、カフェイン分解剤は、カフェイン分解微生物の再活性化を促進するため、糖類、有機酸、ビタミン、アミノ酸等を含んでいてもよい。本発明の一態様におけるカフェイン分解剤は、上述したカフェイン分解微生物を、上記「１．カフェイン分解能を有する微生物」で説明した培養方法で、例えば１～７日間、３～７日間培養した後の菌体を含むものであり得る。
本発明の一態様において、カフェイン分解剤は、上述したカフェイン分解微生物由来の菌体破砕液、粗酵素液または精製酵素を含むものであり得る。この場合、カフェイン分解剤は、液体状であってもよいし、固体状（粉末状を含む）であってもよい。固体状の形態とする場合、凍結乾燥、スプレードライ等の公知の方法を適用することができる。本発明の一態様におけるカフェイン分解剤は、上述したカフェイン分解微生物を、上記「１．カフェイン分解能を有する微生物」で説明した培養方法で、例えば１～７日間、３～７日間培養した後の菌体破砕液、粗酵素液または精製酵素を含むものであり得る。
本発明の一態様において、カフェイン分解剤は、補酵素を含んでいてもよい。補酵素の種類は特に限定されないが、例えば、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、トパキノン（ＴＰＱ）、トリプトファン－トリプトフィルキノン（ＴＴＱ）、リシンチロシルキノン（ＬＴＱ）、システニル－トリプトファンキノン（ＣＴＱ）等のキノン補酵素、チアミン二リン酸（ＴＰＰ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、ピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、補酵素Ａ、補酵素Ｆ、補酵素Ｑ、補酵素Ｒ、補酵素Ｂ１２等のビタミン補酵素、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰＧ）等が挙げられる。これらの補酵素を１種単独で含んでいてもよいし、２種以上を組み合わせて含んでいてもよい。本発明の一態様において、補酵素は、ビタミン補酵素であり得る。本発明の別の態様において、補酵素は、ＴＰＰ、ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＰＬＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、補酵素Ａ、補酵素Ｆ、補酵素Ｑ、補酵素Ｒおよび補酵素Ｂ１２からなる群から選ばれる１種以上であり得る。本発明の好ましい態様において、補酵素は、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨであり得る。本発明の別の好ましい態様において、補酵素は、ＮＡＤＨであり得る。
本発明の一態様において、補酵素は、例えば、培養液中の終濃度が０．１～１０ｍＭ、好ましくは１．０～５．０ｍＭ、より好ましくは１．５～３．０ｍＭとなるように加えることができる。本発明の別の態様において、補酵素がＮＡＤＨである場合、ＮＡＤＨは、例えば、培養液中の終濃度が０．１～１０ｍＭ、好ましくは１．０～５．０ｍＭ、より好ましくは１．５～３．０ｍＭとなるように加えることができる。
本発明の一態様において、カフェイン分解剤は、カフェイン分解微生物、カフェイン分解微生物由来の菌体破砕液、粗酵素液または精製酵素の他、賦形剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、防腐剤等の成分を任意に含んでいてもよい。賦形剤としては、例えば、デンプン、デキストリン、グルコース、マルトース、トレハロース等を例示することができる。緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を例示することができる。安定剤としては、例えば、プロピレングリコール、アスコルビン酸等を例示することができる。保存剤としては、例えば、フェノール、ベンジルアルコール、メチルパラベン等を例示することができる。防腐剤としては、エタノール、クロロブタノール、パラオキシ安息香酸等を例示することができる。これらの任意成分は、それぞれ、１種単独で含んでいてもよいし、複数種を組み合わせて含んでいてもよい。
３．飲食品
本発明は、上記「２．カフェイン分解剤」の欄で説明したカフェイン分解剤と、カフェイン含有溶液とを接触させた処理液を含む、飲食品に関する。本発明の好ましい態様において、前記飲食品は、カフェイン含有量が低減されたものである。本発明の一態様において、カフェイン含有溶液と接触させるカフェイン分解剤の量は、飲食品の種類やカフェイン含有量に応じて適宜設定することができる。
本発明は、上記「２．カフェイン分解剤」の欄で説明したカフェイン分解剤と、カフェイン含有溶液とを接触させた処理液を含む、飲食品に関する。本発明の好ましい態様において、前記飲食品は、カフェイン含有量が低減されたものである。本発明の一態様において、カフェイン含有溶液と接触させるカフェイン分解剤の量は、飲食品の種類やカフェイン含有量に応じて適宜設定することができる。
本発明の一態様において、「接触」は、カフェイン分解剤をカフェイン含有溶液に添加もしくは混合すること、またはカフェイン含有溶液に、担体上に固定化したカフェイン分解剤を浸漬することであり得る。
本発明の一態様において、「処理液」は、上記の接触処理を経て得た処理物であり得る。
本発明の一態様において、「処理液」は、上記の接触処理を経て得た処理物であり得る。
本明細書において、「カフェイン含有量が低減された」とは、カフェイン含有量がゼロになること、カフェイン含有量がある特定の量以下になることを意味するものではない。本発明の一態様において、「カフェイン含有量が低減された」は、カフェイン分解剤を接触させていないカフェイン含有溶液と比較して、カフェイン分解剤を接触させたカフェイン含有溶液中のカフェイン含有量が、例えば、０．１％以上、１％以上、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上減少することであり得る。本発明の別の態様において、「カフェイン含有量が低減された」は、カフェイン分解剤およびカフェイン含有溶液の接触処理から１日後のカフェイン含有溶液と比較して、３日後または７日後のカフェイン含有溶液中のカフェイン含有量が減少することであり得る。
飲食品は、カフェインを含有するものであって、前記処理液を含むものであれば特に制限されない。本発明の一態様において、飲食品は、食品、動物用飼料、飲料または飲料濃縮物を含む。本発明の別の態様において、飲食品は、飲料または飲料濃縮物を含む。本発明の一態様において、前記処理液は、最終的な飲食品の種類に応じて、液体状のままであってもよいし、固体状（粉末状を含む）に加工してもよい。処理液を固体状とする場合、濃縮、乾燥、造粒等の公知の方法を適用することができる。また、処理液は、殺菌したものであってもよい。
カフェインを含有する飲食品として代表的なものは、例えば、コーヒー、インスタントコーヒー、ココア、玉露、紅茶、煎茶、ウーロン茶、エナジードリンク、コーラ等の清涼飲料水、チョコレート等が挙げられる。
食品としては、上記のカフェインを含有する飲食品を含む菓子類、冷菓、サプリメント等が挙げられる。菓子類としては、例えば、キャラメル、グミ、キャンディー、チューインガム、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、ゼリー、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
動物用飼料は、カフェインを含有する原料を使用したものが挙げられる。そのような原料としては、例えば、コーヒー、茶、マテ、ガラナ、カカオ、およびそれらの粕等が挙げられる。また、そのような原料に、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦等の穀類、ふすま、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類、コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類、脱脂粉乳、ホエー、魚粉、骨粉等の動物性飼料類、ビール酵母等の酵母類、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料、油脂類、アミノ酸類、糖類等の他の原料を混合して利用してもよい。
飲料としては、上記のカフェインを含有する飲食品を含むコーヒー飲料、茶飲料、ココア飲料、栄養飲料、炭酸飲料、ゼリー飲料、スポーツドリンク、フレーバーウォーター、果汁飲料、アルコール飲料、非アルコール飲料、ビールやノンアルコールビール等のビールテイスト飲料、機能性飲料等が挙げられる。
飲料濃縮物としては、前記飲料を２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍もしくは７０倍等に希釈して使用することができるエキス、シロップまたは飲料原液等が挙げられる。
飲食品には、各種の添加剤を配合することができる。そのような添加剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料、ビタミン類、色素類、酸化防止剤、乳化剤、保存料、調味料、エキス類、ｐＨ調整剤、品質安定剤等が挙げられる。
４．飲食品の製造方法
本発明は、上記「２．カフェイン分解剤」の欄で説明したカフェイン分解剤をカフェイン含有溶液と接触させることと、前記接触後の処理液を殺菌すること、を含む、飲食品の製造方法に関する。「接触」および「処理液」は、上記「３．飲食品」の欄で説明したとおりである。また、飲食品の種類も、上記「３．飲食品」の欄で説明したものと同じである。
本発明は、上記「２．カフェイン分解剤」の欄で説明したカフェイン分解剤をカフェイン含有溶液と接触させることと、前記接触後の処理液を殺菌すること、を含む、飲食品の製造方法に関する。「接触」および「処理液」は、上記「３．飲食品」の欄で説明したとおりである。また、飲食品の種類も、上記「３．飲食品」の欄で説明したものと同じである。
本発明の一態様における製造方法は、カフェインを含有する原料（例えば、コーヒー豆、茶葉またはカカオ豆）を溶媒で抽出することにより、カフェイン含有溶液を調製することを含み得る。溶媒は、水道水、イオン交換水、軟水、蒸留水のほか、これらの水を脱気処理した脱気水などが挙げられる。また、カフェインを含有する原料は、抽出する前に焙煎してもよい。抽出および焙煎の方法は特に限定されず、原料の種類に応じて、公知の方法により行うことができる。また、カフェイン含有溶液は、上記の方法で得られた抽出液をそのまま使用することもできるし、例えば、減圧濃縮等を行った濃縮物を使用してもよいし、凍結乾燥等を行った粉末状等の乾燥形態のものを上記の溶媒に可溶化させたものを使用することもできる。
本発明の一態様において、カフェイン分解剤をカフェイン含有溶液と接触させることは、特に限定されず、例えば、飲食品の各種材料を混合する際に、カフェイン含有溶液にカフェイン分解剤を添加することができる。カフェイン分解剤の添加は、１回、２回または３回等に分けて行ってもよい。本発明の別の態様において、カフェイン分解剤をカフェイン含有溶液と接触させることは、例えば、適当な担体にカフェイン分解能を有する微生物を固定化し、これをカフェイン含有溶液と接触させることもできる。本発明のさらに別の態様において、カフェイン分解剤をカフェイン含有溶液と接触させることは、例えば、活性炭を濾材として、その表面に前記微生物を担持させることでカフェインの分解および吸着を同時に行うこともできる。本発明の一態様における製造方法は、カフェイン分解剤をカフェイン含有溶液と接触させた後、カフェイン含有溶液を撹拌することを含んでいてもよい。撹拌の方法は特に限定されず、公知の方法により行うことができる。
微生物を固定化または担持する材料としては、例えば、セルロース、キトサン、セライト、シリカゲル、ポリウレタン、綿などの天然繊維、レーヨンなどの再生繊維、セラミック、木炭、貝殻、ガラス、シリコン、ゼオライト、層状化合物等の多孔性材料、アルギン酸、カラギーナン、寒天、アガロース、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリ（β－ヒドロキシ酪酸）、ポリ（β－ヒドロキシ酪酸）関連の共重合物、ポリ（ブチレンサクシネート）、ポリ（ブチレンサクシネート・アジペート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリビニルアルコール、セルロースアセテート、デンプン、デンプン脂肪酸エステル、木炭、ゼオライト、珪藻土焼成粒、バーミキュライト、ベントナイト、パーライト、桂鉱石、石灰石等が挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
本発明の一態様において、前記接触後の処理液を殺菌することは、特に限定されず、例えば、加熱殺菌等の方法により行うことができる。加熱殺菌を行う場合、例えば、ＵＨＴ殺菌およびレトルト殺菌等の通常の手法を用いて行うことができる。ＵＨＴ殺菌法の場合、通常１２０～１５０℃で１～１２０秒間程度、好ましくは１３０～１４５℃で３０～１２０秒間程度の条件であり、レトルト殺菌法の場合、通常１１０～１３０℃で１０～３０分程度、好ましくは１２０～１２５℃で１０～２０分間程度の条件である。
５．カフェインの分解方法
本発明は、カフェイン分解能を有し、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物を、カフェイン含有溶液と接触させることを含む、カフェインの分解方法に関する。
但し、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）MTCC5215株、ペニシリウム・マンギニイ（Penicillium manginii）CBS253.31株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）NCBT110A株、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowii）NRRL250株、アスペルギルス・パリドフルブス（Aspergillus pallidofulvus）NRRL4789株、アスペルギルス・セサミコラ（Aspergillus sesamicola）CBS137324株、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus ustus）NRRL275株、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）NRRL20818株、アスペルギルス・ニガー・ヴァン・ティゲム（Aspergillus niger van Thiegem）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AnTD株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）LPBx株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AN-5株を含まない。「接触」は、上記「３．飲食品」の欄で説明したとおりである。
本発明は、カフェイン分解能を有し、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物を、カフェイン含有溶液と接触させることを含む、カフェインの分解方法に関する。
但し、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）MTCC5215株、ペニシリウム・マンギニイ（Penicillium manginii）CBS253.31株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）NCBT110A株、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowii）NRRL250株、アスペルギルス・パリドフルブス（Aspergillus pallidofulvus）NRRL4789株、アスペルギルス・セサミコラ（Aspergillus sesamicola）CBS137324株、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus ustus）NRRL275株、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）NRRL20818株、アスペルギルス・ニガー・ヴァン・ティゲム（Aspergillus niger van Thiegem）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AnTD株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）LPBx株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AN-5株を含まない。「接触」は、上記「３．飲食品」の欄で説明したとおりである。
前記微生物は、上記の属に属するものを制限なく使用することができる。前記微生物は、具体的には、例えば、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Penicillium brevicompactum）、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）、コレトトリカム・ボニネンセ（Colletotrichum boninense）、ペスタロチア・エラスチカ（Pestalotia elasticae）、ペスタロチア・ロサエ（Pestalotia rosae）、ペスタロチオプシス・カメリア（Pestalotiopsis camelliae）、ゲラシノスポラ・サンティ－フロリ（Gelasinospora santi-florii）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）等に属する微生物を含む。
本発明の一態様において、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に属する微生物であり得る。本発明の別の態様において、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）またはコレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）に属する微生物を含む。
カフェイン分解能を有する微生物は、より具体的には、例えば、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Penicillium brevicompactum）CBS 110070株、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株、コレトトリカム・ボニネンセ（Colletotrichum boninense）CBS125468株、ペスタロチア・エラスチカ（Pestalotia elasticae）CBS273.29株、ペスタロチア・ロサエ（Pestalotia rosae）CBS563.76株、ペスタロチオプシス・カメリア（Pestalotiopsis camelliae）CBS443.62株、ゲラシノスポラ・サンティ－フロリ（Gelasinospora santi-florii）CBS534.76株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS117.48株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS120166株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS123.48株またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS554.65株等を含む。
本発明の一態様において、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS120166株を含む。本発明の別の態様において、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株またはコレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株を含む。
カフェイン分解能を有する微生物の入手方法や培養方法等は、上記「１．カフェイン分解能を有する微生物」の欄で説明した内容と同じである。また、カフェイン分解能を有する微生物をカフェイン含有溶液と接触させることは、上記「４．飲食品の製造方法」の欄で説明した内容と同じである。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の内容がこれにより限定されるものではない。
［実施例１］カフェイン分解菌を用いたカフェインの分解
オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ）から入手した下記表１に示す１３株をカフェイン分解菌として選抜した。
オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ）から入手した下記表１に示す１３株をカフェイン分解菌として選抜した。
上記１３株を下記表２に示す組成の液体培地に接種し、上記表１に示す温度に設定したシェーカーを用いて、２５０ｒｐｍで７日間好気的に培養した。なお、菌株は、条件Ａ～Ｃのすべてに接種した。また、C.coffeanum CBS396.67株のみ光照射下で培養し、それ以外の１２株は暗室で培養した。
培養開始時を０時間とし、１、３および７日目に培養液から１ｍＬを回収し、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得られた上清２００μＬと純水８００μＬの混合液をフィルター（ROTILABO、Carl Roth社製）処理したものをＨＰＬＣ分析用のサンプルとした。その後、下記表３に示す分析条件で、ＨＰＬＣを用いてカフェインの分解およびカフェイン代謝産物の有無を評価した。ＨＰＬＣによる分析結果を図１～５並びに表４－１～４－３に示した。なお、図１～５並びに表４－１～４－３は、各菌株について、条件Ａ～Ｃのサンプルを２個ずつ実験した結果である。
培養開始時を０時間とし、１、３および７日目に培養液から１ｍＬを回収し、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得られた上清２００μＬと純水８００μＬの混合液をフィルター（ROTILABO、Carl Roth社製）処理したものをＨＰＬＣ分析用のサンプルとした。その後、下記表３に示す分析条件で、ＨＰＬＣを用いてカフェインの分解およびカフェイン代謝産物の有無を評価した。ＨＰＬＣによる分析結果を図１～５並びに表４－１～４－３に示した。なお、図１～５並びに表４－１～４－３は、各菌株について、条件Ａ～Ｃのサンプルを２個ずつ実験した結果である。
図１～５に示すように、特定した１３の候補菌株は、条件Ａ～Ｃのいずれであっても、概ね培養３日目～７日目において優れたカフェイン分解能を示した。特に、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株およびコレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株は、７日間の培養で最大２００μｇ／ｍＬのカフェインを分解したことが確認された。また、菌株によっては、条件Ｂおよび／または条件Ｃのサンプルが、条件Ａのものよりカフェインの分解が促進された。
また、ＨＰＬＣ分析の結果、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS120166株については、培養１、３および７日目に少量のテオフィリンの産生が確認された（データは省略する）。この結果から、カフェインは微生物の菌体内で分解されること、またはテオフィリン等の代謝産物が更に下流の代謝産物にまで分解されることが示唆された。
［実施例２］カフェイン分解菌由来の粗酵素液および精製酵素を用いたカフェインの分解
実施例１の結果を踏まえ、カフェイン分解能が特に高いと予想されるペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS120166株の４株を使用し、菌体を含まない粗酵素液または精製酵素によるカフェイン分解能を評価した。
実施例１の結果を踏まえ、カフェイン分解能が特に高いと予想されるペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS120166株の４株を使用し、菌体を含まない粗酵素液または精製酵素によるカフェイン分解能を評価した。
まず、カフェイン非含有最小培地で前培養した上記４株（それぞれ、１０９胞子／ｍＬ）を、カフェイン含有最小培地（ｐＨ６、１％グリセロールを含む）２５０ｍＬに接種し、２５℃、２５０ｒｐｍで２日間培養した。 C.coffeanum CBS396.67株のみ光照射下で培養し、それ以外の３株は暗室で培養した。その後、回収した菌糸体を下記表５に示す組成の培地Ａまたは培地Ｂに移し、２５℃、２５０ｒｐｍで１日間または３日間さらに培養した。１日間または３日間培養した菌糸体を回収し、アルミホイルで覆った後、液体窒素を用いて凍結させた。
次に、TissueLyser AdapterおよびTissueLyser II（ともにQuiagen社製）を用いて菌体を破砕し、そこに溶解剤（YeastBuster Protein Extraction Reagent、Novagen社製）を添加し、４℃で１５分間緩やかに振とうした。その後、遠心分離機を用いて４℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上清を０．２２μｍフィルター（ROTILABO、Carl Roth社製）でろ過し、その一部を粗酵素液として使用した。
そして、上清をさらに限外ろ過膜（Vivaspin 20（分画分子量５０ｋＤａ）、Sartorius社製）を用いてろ過し、ろ液をＰＢＳで３回洗浄して低分子物質等の不純物を除去したものを、精製酵素として使用した。粗酵素液および精製酵素は、下記表６に示す反応系で、４０℃、２００ｒｐｍで１時間または２時間酵素反応させ、その後９０℃で１０分間加熱処理し、酵素反応を停止させた。２００μＬの反応液を８００μＬの純水に加え、フィルター（ROTILABO、Carl Roth社製）処理したものをＨＰＬＣ分析用のサンプルとした。ＨＰＬＣによる分析結果を図６～９に示した。下記表７に、実施例２における各種条件を整理した。ＨＰＬＣの分析条件は実施例１と同じである。
次に、TissueLyser AdapterおよびTissueLyser II（ともにQuiagen社製）を用いて菌体を破砕し、そこに溶解剤（YeastBuster Protein Extraction Reagent、Novagen社製）を添加し、４℃で１５分間緩やかに振とうした。その後、遠心分離機を用いて４℃、１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、得られた上清を０．２２μｍフィルター（ROTILABO、Carl Roth社製）でろ過し、その一部を粗酵素液として使用した。
そして、上清をさらに限外ろ過膜（Vivaspin 20（分画分子量５０ｋＤａ）、Sartorius社製）を用いてろ過し、ろ液をＰＢＳで３回洗浄して低分子物質等の不純物を除去したものを、精製酵素として使用した。粗酵素液および精製酵素は、下記表６に示す反応系で、４０℃、２００ｒｐｍで１時間または２時間酵素反応させ、その後９０℃で１０分間加熱処理し、酵素反応を停止させた。２００μＬの反応液を８００μＬの純水に加え、フィルター（ROTILABO、Carl Roth社製）処理したものをＨＰＬＣ分析用のサンプルとした。ＨＰＬＣによる分析結果を図６～９に示した。下記表７に、実施例２における各種条件を整理した。ＨＰＬＣの分析条件は実施例１と同じである。
図６～９に示すように、粗酵素液および精製酵素ともに、ＮＡＤＨを含まない反応系ではカフェイン分解率が約２０～約３０％だったのに対し、ＮＡＤＨを含む反応系では、カフェイン分解率が約５０～約６０％であった。また、菌株の培養期間（１日または３日）および反応時間（１時間または２時間）はこの結果に大きく影響しなかった。
Claims (10)
- カフェイン分解能を有し、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物（但し、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）MTCC5215株、ペニシリウム・マンギニイ（Penicillium manginii）CBS253.31株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）NCBT110A株、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowii）NRRL250株、アスペルギルス・パリドフルブス（Aspergillus pallidofulvus）NRRL4789株、アスペルギルス・セサミコラ（Aspergillus sesamicola）CBS137324株、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus ustus）NRRL275株、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）NRRL20818株、アスペルギルス・ニガー・ヴァン・ティゲム（Aspergillus niger van Thiegem）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AnTD株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）LPBx株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AN-5株を除く）。
- 前記微生物が、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Penicillium brevicompactum）、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）、コレトトリカム・ボニネンセ（Colletotrichum boninense）、ペスタロチア・エラスチカ（Pestalotia elasticae）、ペスタロチア・ロサエ（Pestalotia rosae）、ペスタロチオプシス・カメリア（Pestalotiopsis camelliae）、ゲラシノスポラ・サンティ－フロリ（Gelasinospora santi-florii）またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）に属する微生物である、請求項１に記載の微生物。
- カフェイン分解能を有する微生物であって、前記微生物が、ペニシリウム・ブレビコンパクツム（Penicillium brevicompactum）CBS 110070株、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）CBS122452株、ペニシリウム・サラミ（Penicillium salamii）CBS135402株、コレトトリカム・コフェアヌム（Colletotrichum coffeanum）CBS396.67株、コレトトリカム・ボニネンセ（Colletotrichum boninense）CBS125468株、ペスタロチア・エラスチカ（Pestalotia elasticae）CBS273.29株、ペスタロチア・ロサエ（Pestalotia rosae）CBS563.76株、ペスタロチオプシス・カメリア（Pestalotiopsis camelliae）CBS443.62株、ゲラシノスポラ・サンティ－フロリ（Gelasinospora santi-florii）CBS534.76株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS117.48株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS120166株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS123.48株またはアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）CBS554.65株である、微生物。
- 請求項１～３の何れか１項に記載の１種以上の微生物、またはその微生物由来の菌体破砕液、粗酵素液もしくは精製酵素を含む、カフェイン分解剤。
- 補酵素を含む、請求項４に記載のカフェイン分解剤。
- 請求項４または５に記載のカフェイン分解剤と、カフェイン含有溶液とを接触させた処理液を含む、飲食品。
- カフェイン含有量が低減された、請求項６に記載の飲食品。
- 飲料または飲料濃縮物である、請求項６または７に記載の飲食品。
- 請求項４または５に記載のカフェイン分解剤をカフェイン含有溶液と接触させることと、
前記接触後の処理液を殺菌すること、を含む、飲食品の製造方法。 - カフェイン分解能を有し、ペニシリウム（Penicillium）属、コレトトリカム（Colletotrichum）属、ペスタロチア（Pestalotia）属、ペスタロチオプシス（Pestalotiopsis）属、ゲラシノスポラ（Gelasinospora）属またはアスペルギルス（Aspergillus）属に属する微生物を、カフェイン含有溶液と接触させることを含む、カフェインの分解方法（但し、前記微生物は、ペニシリウム・シトリヌム（Penicillium citrinum）MTCC5215株、ペニシリウム・マンギニイ（Penicillium manginii）CBS253.31株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）NCBT110A株、アスペルギルス・シドウィ（Aspergillus sydowii）NRRL250株、アスペルギルス・パリドフルブス（Aspergillus pallidofulvus）NRRL4789株、アスペルギルス・セサミコラ（Aspergillus sesamicola）CBS137324株、アスペルギルス・ウスタス（Aspergillus ustus）NRRL275株、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）NRRL20818株、アスペルギルス・ニガー・ヴァン・ティゲム（Aspergillus niger van Thiegem）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AnTD株、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）LPBx株およびアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）AN-5株を除く）。
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