JP2022550463A - トリプタミン発現を調整する真菌の遺伝子操作 - Google Patents

トリプタミン発現を調整する真菌の遺伝子操作 Download PDF

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Abstract

本明細書で提供されるのは、真菌または他の生物のプシロシビン生合成経路を調整する方法である。また、プシロシビン及びプシロシンの発現の誘導及び／または増加を伴う遺伝子改変された真菌及び生物、ならびに提供される方法によって生成されたプシロシビン及び／またはプシロシン組成物も提供される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１日に出願された米国仮特許出願第６２／９０９，１５９号に基づく利益を主張し、同仮特許出願の全体を参照により援用するものである。
真菌におけるプシロシビン及びプシロシンなどのトリプタミン由来物質は、既知の幻覚発動性及び他の薬用効果を有する天然薬物である。薬理学的効果は修飾トリプタミンによって引き起こされ、プシロシビンがこれらの真菌の主要な化学的構成成分である。このプロドラッグ様天然産物は、経口摂取後に急速に脱リン酸化されて、同じく真菌によって少量産生される実際の向精神剤であるプシロシンをもたらす。トリプタミン由来物質は、進行期がん患者の実存的不安及びニコチン中毒の治療において好ましい傾向が臨床試験で示されているため、薬学的に注目を集めている。最近では、抑うつの治療のためのプシロシビンの使用を調査する研究が進行中である。改変された治療用成分（複数可）のプロファイルを有する真菌は、トリプタミン由来物質の生産において有用であり得、及び／または所望の薬物プロファイルをもたらす遺伝子改変された真菌の生産においても有用であり得る。
本明細書では、遺伝子改変を含む遺伝子改変生物またはその細胞もしくは組織であって、遺伝子改変は、遺伝子改変がない同等の対照生物における、
Figure 2022550463000002
 それらの誘導体または類似体から選択される化合物の産生と比較して、同じ化合物の産生の増加をもたらす、遺伝子改変生物またはその細胞もしくは組織が提供される。本明細書では、エンドヌクレアーゼ媒介性遺伝子改変を含む遺伝子改変生物であって、遺伝子改変は、遺伝子改変がない同等の対照生物における化合物
Figure 2022550463000003
 その誘導体または類似体の量と比較して、同じ化合物の量を増加させる、遺伝子改変生物も提供される。場合によっては、生物は、真菌、酵母、細菌、動物、または昆虫である。本明細書に記載される実施形態において、式Ｉの化合物はジメチルトリプタミン（ＤＭＴ）であり、式ＩＩの化合物はプシロシビンであり、式ＩＩＩの化合物はプシロシンであり、式ＩＶの化合物はトリプタミンである。
本明細書では、生物における、
Figure 2022550463000004
 またはそれらの誘導体もしくは類似体の産生を増加させる方法が提供され、前記方法は、前記生物に遺伝子改変を導入することを含み、前記遺伝子改変は、前記改変がない同等の対照生物と比較して、同じ化合物の産生の増加をもたらす。本明細書では、生物における、


Figure 2022550463000005
 またはそれらの誘導体もしくは類似体の産生を増加させる方法が提供され、前記方法は、前記生物の遺伝子改変を導入することを含み、前記遺伝子改変は、前記改変がない同等の対照生物と比較して、同じ化合物の産生の増加をもたらし、前記生物は真菌であり、真菌は担子菌門のものである。
場合によっては、本明細書に記載される遺伝子改変生物は植物である。場合によっては、本明細書に記載される遺伝子改変生物は細菌である。場合によっては、細菌はアグロバクテリウムである。場合によっては、本明細書で提供される遺伝子改変生物は真菌である。場合によっては、真菌は担子菌である。場合によっては、担子菌は、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ、Ｃｏｎｏｃｙｂｅ、Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ、Ｐｌｕｔｅｕｓ、及びＳｔｒｏｐｈａｒｉａからなる群から選択され得る。場合によっては、真菌は、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｃｙａｎｅｓｃｅｃｅｎｓである。場合によっては、真菌は、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｃｕｂｅｎｓｉｓである。場合によっては、真菌は、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｎｅｂｒｏｄｅｎｓｉｓである。
ある態様において、本明細書に記載される遺伝子改変生物は、遺伝子または遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサー内にあるかまたはそれに隣接する変化である遺伝子改変を含み、遺伝子は、ＰＬＰ非依存性ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＴＤＣ）、５－メチルチオンリボースファミリー小分子キナーゼ、４－ヒドロキシトリプタミンキナーゼ、クラスＩメチルトランスフェラーゼ、ファシリテーター型トランスポーターＰｓｉＴ１、またはファシリテーター型トランスポーターＰｓｉＴ２をコードする。
ある態様において、本明細書に記載される生物における遺伝子改変は、遺伝子改変生物において、遺伝子改変がない同等の対照生物と比較して、（ａ）トリプトファン脱炭酸の増加、（ｂ）トリプタミン４－ヒドロキシル化の増加、（ｃ）４－ヒドロキシトリプタインＯ－リン酸化の増加、及び（ｄ）プシロシン中間体の発現低減を伴う連続的Ｎ－メチル化を介したプシロシビンの増加のうちの少なくとも１つをもたらす。場合によっては、遺伝子改変は、遺伝子改変生物において、遺伝子改変がない同等の対照生物と比較して、（ｉ）トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連ヒドロキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連Ｎ－メチルトランスフェラーゼ遺伝子、もしくはプシロシビン関連ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現の上方調節、（ｉｉ）プシロシビンではないトリプタミンの合成の低減、または（ｉｉｉ）トリプトファンの産生の増加をもたらす。
ある態様において、遺伝子改変は、目的の遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサー領域内にあるか、または目的の遺伝子に関連していてもよい。場合によっては、遺伝子改変は、遺伝子の発現の上方調節をもたらす。ある態様において、本明細書に記載される目的の遺伝子は、ＰＬＰ非依存性ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＴＤＣ）、５－メチルチオンリボースファミリー小分子キナーゼ、４－ヒドロキシトリプタミンキナーゼ、またはクラスＩメチルトランスフェラーゼをコードする。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、クラスＩメチルトランスフェラーゼをコードする。場合によっては、クラスＩメチルトランスフェラーゼは、ロスマンフォールドを含む。場合によっては、クラスＩメチルトランスフェラーゼは、ノルバエオシスチンメチルトランスフェラーゼであり得る。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号１３に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。場合によっては、本明細書に記載される目的の遺伝子は、配列番号１４に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む。
場合によっては、遺伝子は、ＰｓｉＤ遺伝子、ＰｓｉＭ遺伝子、ＰｓｉＨ遺伝子、ＰｓｉＫ遺伝子、ＰｓｉＲ遺伝子、ＰｓｉＴ１遺伝子、もしくはＰｓｉＴ２遺伝子、またはそれらの任意の部分であり得る。場合によっては、遺伝子の発現は、遺伝子改変生物において、遺伝子改変がない同等の対照生物と比較して、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも３．５、少なくとも４、または少なくとも５倍上方調節される。場合によっては、本明細書に記載される遺伝子改変生物における遺伝子改変は、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、及びＴｒｐＭからなる群から選択される遺伝子における変化を含む。場合によっては、遺伝子改変は、遺伝子のコード領域内にあってもよい。場合によっては、遺伝子改変は、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ、３－デヒドロキナ酸シンターゼ、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、３－ホスホシキミ酸１－カルボキシビニルトランスフェラーゼ、シキミ酸キナーゼ１、シキミ酸キナーゼ２、コリスミ酸シンターゼ、トリプトファンシンターゼアルファ鎖、トリプトファンシンターゼベータ鎖、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びアントラニル酸シンターゼからなる群から選択される遺伝子における変化を含む。
ある態様において、遺伝子改変は、遺伝子のプロモーター領域内にあってもよい。場合によっては、遺伝子改変生物は、遺伝子改変がない同等の対照生物と比較して、乾燥重量で測定した場合、２５％多くの
Figure 2022550463000006
 を含む。場合によっては、遺伝子改変生物は、遺伝子改変がない同等の対照生物と比較して、乾燥重量で測定した場合、２５％多くのプシロシビンを含む。場合によっては、遺伝子改変生物は、遺伝子改変がない同等の対照生物と比較して、乾燥重量で測定した場合、１０％多くのプシロシンを含む。
場合によっては、遺伝子改変は、生物の細胞をエンドヌクレアーゼ系と接触させることによって実施され得る。ある態様において、エンドヌクレアーゼ系は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ、トランスポゾンベースのヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、アルゴノート、Ｍｅｇａ－ＴＡＬまたはＤＮＡガイド型ヌクレアーゼを含む。ある態様において、ＤＮＡガイド型ヌクレアーゼは、アルゴノートを含む。場合によっては、エンドヌクレアーゼ系は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と、遺伝子またはそれと関連するプロモーターもしくはエンハンサー内にあるかまたはそれに隣接する標的配列にハイブリダイズするガイドポリヌクレオチドとを含む。場合によっては、標的配列は、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、または少なくとも２２ヌクレオチドの長さであり得る。場合によっては、標的配列は、最大で１７ヌクレオチドの長さである。場合によっては、標的配列は、配列番号１～１４のうちの少なくとも１つまたはその相補的な配列にハイブリダイズすることができる。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよい。ある態様において、ガイドポリヌクレオチドは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。ある態様において、ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むキメラシングルガイドであり得る。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは、配列番号１～１４のうちの少なくとも１つまたはその相補体にハイブリダイズすることができる。
場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓタンパク質またはそのバリアントもしくは誘導体であり得る。場合によっては、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、Ｃｐｆ１、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらの相同体、またはそれらの改変版を含む。場合によっては、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９であり得る。場合によっては、Ｃａｓ９は、カノニカルなＰＡＭに結合する改変されたＣａｓ９である。場合によっては、Ｃａｓ９は、非カノニカルなＰＡＭを認識する。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは、ＰＡＭから３～１０ヌクレオチド離れた標的配列と結合する。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドとカップリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＰとして遺伝子改変生物へと送達されてもよい。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドとカップリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素及びガイドポリヌクレオチドをコードするｍＲＮＡによって遺伝子改変生物へと送達されてもよい。
場合によっては、ガイドポリヌクレオチドとカップリングされたＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＣＲＩＳＰＲ酵素及びガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を含むベクターによって遺伝子改変生物へと送達されてもよい。ある態様において、ベクターは、バイナリーベクターまたはＴｉプラスミドであり得る。ある態様において、ベクターは、選択マーカーまたはレポーター遺伝子をさらに含む。場合によっては、ＲＮＰ、複合体、またはベクターは、電気穿孔、微量注入、細胞の機械的変形、脂質ナノ粒子、ＡＡＶ、レンチウイルス、アグロバクテリウム媒介性形質転換、バイオリスティック粒子照射、またはプロトプラスト形質転換を介して送達されてもよい。場合によっては、ＲＮＰ、ｍＲＮＡ、またはベクターは、ドナーポリヌクレオチドまたはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸をさらに含む。ある態様において、ドナーポリヌクレオチドは、標的配列にフランキングする配列との相同性を含む。ある態様において、ドナーポリヌクレオチドは、バーコード、レポーター遺伝子、または選択マーカーをさらに含む。
別の態様において、遺伝子改変生物は、外来性ヌクレオチドを含む。場合によっては、外来性ヌクレオチドは、シス作用性プロモーター配列を含む。場合によっては、外来性ヌクレオチドは、前記遺伝子改変生物において、前記外来性ヌクレオチドがない同等の対照生物と比較して、トリプトファン脱炭酸、トリプタミン４－ヒドロキシル化、４－ヒドロキシトリプタインＯ－リン酸化、またはプシロシン中間体を伴わない連続的Ｎ－メチル化を介したプシロシビン産生の増加をもたらす。場合によっては、外来性ヌクレオチドは、前記遺伝子改変生物において、前記外来性ヌクレオチドがない同等の対照生物と比較して、（ｉ）トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連ヒドロキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連Ｎ－メチルトランスフェラーゼ遺伝子、もしくはプシロシビン関連ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現の上方調節、（ｉｉ）プシロシビンではないトリプタミンの合成の低減、または（ｉｉｉ）トリプトファンの産生の増加をもたらす。場合によっては、外来性ヌクレオチドは、ＰＬＰ非依存性ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＴＤＣ）、推定モノオキシゲナーゼ、５－メチルチオンリボースファミリー小分子キナーゼ、または４－ヒドロキシトリプタミンキナーゼをコードする。
場合によっては、ヌクレオチドは、プラスミドに組み込まれている。場合によっては、プラスミドは、ｐＧＷＢ５またはｐＧＨＧＷＹである。場合によっては、プラスミドは、電気穿孔、微量注入、細胞の機械的変形、脂質ナノ粒子、ＡＡＶ、レンチウイルス、アグロバクテリウム媒介性形質転換、バイオリスティック粒子照射、またはプロトプラスト形質転換を介して前記遺伝子改変生物へと送達される。場合によっては、プラスミドは、バーコード、レポーター遺伝子、または選択マーカーをさらに含む。場合によっては、プラスミドは、プロモーターをさらに含む。場合によっては、プロモーターは、３５Ｓ、ＧＰＤ、ＥＦ１ａ、アクチン、またはＣｃＤＥＤ１である。
本明細書に記載される実施形態において、遺伝子改変生物は、多細胞生物であっても単細胞生物であってもよい。特定の実施形態では、生物は、単一の植物または真菌細胞であり得る。本明細書に記載される実施形態には、細胞集団、例えば本明細書に記載される真菌種の細胞集団も含まれる。
本明細書では、本明細書で提供される組成物を含む、ゲノム編集のためのキットが提供される。本明細書では、本明細書で提供される組成物を含む細胞も提供される。細胞は、植物細胞であり得る。場合によっては、細胞は、真菌細胞である。場合によっては、細胞は、細菌細胞である。場合によっては、細胞は、動物細胞である。場合によっては、細胞は、昆虫細胞である。本明細書では、遺伝子改変生物の抽出物、遺伝子改変細胞、組成物、または細胞を含む、医薬組成物が提供される。ある態様において、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、またはキャリアをさらに含む。場合によっては、薬学的に許容される賦形剤は脂質である。
本明細書では、遺伝子改変生物の抽出物、遺伝子改変細胞、組成物、または細胞を含む、栄養補給組成物が提供される。本明細書では、遺伝子改変生物の抽出物、遺伝子改変細胞、組成物、または細胞を含む、栄養補助食品組成物が提供される。ある態様において、栄養補給組成物または栄養補助食品は、経口形態、経皮形態、油製剤、食用品、食品基質、水性分散液、エマルション、溶液、懸濁液、エリキシル剤、ゲル、シロップ、エアロゾル、ミスト、粉末、錠剤、舐剤、ゲル、ローション、ペースト、製剤スティック、バーム、クリーム、または軟膏であり得る。
本明細書では、医薬組成物、栄養補給組成物、または栄養補助食品を対象に投与することを含む、疾患または状態を治療する方法が提供される。ある態様において、疾患または状態は、抑うつ、不安、外傷後ストレス障害、耽溺、または中断に関連する副作用、心理的苦痛、ならびに精神的障害及び状態からなる群から選択される。
特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変生物は、真菌、酵母、植物、動物、細菌であり得る。場合によっては、真菌はキノコである。場合によっては、キノコは、ジメチルトリプタミン（ＤＭＴ）、プシロシビン、プシロシン、及び／またはそれらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを産生し得る。
参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個の刊行物、特許、または特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
本発明の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲で詳細に記述されている。本発明の特徴及び利点のさらなる理解は、本発明の原理が利用される説明的実施形態を記述する以下の詳細な説明と、添付の図面とを参照することによって得られるであろう。
Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓ（Ｉ）及びＰ．ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓ（ＩＩ）における生合成のためのシンテニック遺伝子座（Ｐｓｉ）の概略を示す。酵素合成に関与する遺伝子は太字フォントで標識されている。クラスターには、キナーゼ（ＰｓｉＫ）、メチルトランスフェラーゼ（ＰｓｉＭ）、トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＰｓｉＤ）、及びＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＰｓｉＨ）の遺伝子が含まれる。さらに、２つのファシリテーター型トランスポーター（ＰｓｉＴ１及びＰｓｉＴ２）及び推定転写調節因子（ＰｓｉＲ）がコードされ、示されている。仮定上の遺伝子は薄灰色で示されている。イントロンは示されていない。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの代表的なプシロシビン生合成経路を示す。 ３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉ遺伝子を過剰発現する、本明細書に記載される遺伝子改変生物及び細胞のための代表的なベクター構築物を示す。３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＤ遺伝子を過剰発現する代表的なベクターを示す。 ３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉ遺伝子を過剰発現する、本明細書に記載される遺伝子改変生物及び細胞のための代表的なベクター構築物を示す。３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＨ遺伝子を過剰発現する代表的なベクターを示す。 ３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉ遺伝子を過剰発現する、本明細書に記載される遺伝子改変生物及び細胞のための代表的なベクター構築物を示す。３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＫ遺伝子を過剰発現する代表的なベクターを示す。 ３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉ遺伝子を過剰発現する、本明細書に記載される遺伝子改変生物及び細胞のための代表的なベクター構築物を示す。３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＭ遺伝子を過剰発現する代表的なベクターを示す。 真菌特異的過剰発現プロモーターの制御下で遺伝子を過剰発現する、本明細書に記載される遺伝子改変生物及び細胞のための代表的なベクター構築物を示す。ＣｃＤＥＤ１プロモーターを有する代表的なベクターを示す。 真菌特異的過剰発現プロモーターの制御下で遺伝子を過剰発現する、本明細書に記載される遺伝子改変生物及び細胞のための代表的なベクター構築物を示す。ＧＰＤプロモーターを有する代表的なベクターを示す。 Ｐｓｌｉｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓにおけるＰｓｉ遺伝子過剰発現の方式及びワークフローを示す。強度の異なる様々なプロモーターを有する発現ベクターのパネルを示す。 Ｐｓｌｉｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓにおけるＰｓｉ遺伝子過剰発現の方式及びワークフローを示す。単離されたプロトプラスト及び抽出物のひだ組織を示す。 Ｐｓｌｉｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓにおけるＰｓｉ遺伝子過剰発現の方式及びワークフローを示す。プラスミドＤＮＡまたはアグロバクテリウムが組み込まれた形質転換の選択を示す。 Ｐｓｌｉｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓにおけるＰｓｉ遺伝子過剰発現の方式及びワークフローを示す。成体キノコの再生を示す。 Ｐｓｌｉｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓにおけるＰｓｉ遺伝子過剰発現の方式及びワークフローを示す。遺伝子改変キノコのプシロシビン含有量の解析を示す。 組織抽出及び形質転換のためのＰｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓの増殖を示す。Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓをＰＤＡ寒天中（Ａ及びＢ）で、またオオムギ－パーライトの堆肥中（Ｃ）で、室温で７日間増殖させた。
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明記されていない限り、複数の参照対象を含む。例えば、「キメラ膜貫通受容体ポリペプチド」という用語は、複数のキメラ膜貫通受容体ポリペプチドを含む。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、その値がどのように測定または決定され得るか、すなわち測定系の限界に部分的に依存し得る。例えば、「約」は、当分野における慣例により、１または１を超える標準偏差以内を意味し得る。代替的に、「約」は、所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。代替的に、特に、生物学的なシステムまたはプロセスに関しては、この用語は、値の、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の桁以内を意味し得る。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、特記しない限り、「約」という用語は特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味することが想定されるべきである。
本明細書で使用される場合、「細胞」は、概して、生物学的な細胞を指し得る。細胞は、生物の基本的な構造的単位、機能的単位、及び／または生物学的単位であり得る。細胞は、１つまたは複数の細胞を有する任意の生物を起源とし得る。いくつかの非限定的な例は、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生動物細胞、植物の細胞、藻類細胞、海藻、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、哺乳動物の細胞などを含む。場合により、細胞は天然生物を起源としない（例えば、細胞は、合成的に作製されてもよく、人工細胞と呼ばれることがある）。
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、ＲＮＡ転写物をコードするのに関与し得る核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡなどのＤＮＡ）及びその対応するヌクレオチド配列を指す。ゲノムＤＮＡに関して本明細書で使用されるこの用語は、介在する非コード領域ならびに調節領域を含み、５’末端及び３’末端を含み得る。いくつかの用法では、この用語は、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲ）、エクソンならびにイントロンを含む、転写配列を包含する。いくつかの遺伝子において、転写領域は、ポリペプチドをコードする「オープンリーディングフレーム」を含み得る。この用語のいくつかの用法では、「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするのに必要なコード配列（例えば、「オープンリーディングフレーム」または「コード領域」）のみを含む。場合によっては、遺伝子、例えば、リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＲＮＡ）及びトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）遺伝子は、ポリペプチドをコードしない。場合によっては、「遺伝子」という用語は、転写配列を含むだけでなく、さらに、上流及び下流の調節領域、エンハンサーならびにプロモーターなどの非転写領域も含む。遺伝子は、「内在性遺伝子」、すなわち生物のゲノム中でその自然な位置にある天然遺伝子を指し得る。遺伝子は、「外来性遺伝子」または非天然遺伝子を指し得る。非天然遺伝子は、宿主生物には通常見出されないが遺伝子移入によって宿主生物に導入され得る遺伝子を指し得る。非天然遺伝子は、生物のゲノム中でその自然な位置にない遺伝子を指す場合もある。非天然遺伝子は、変異、挿入、及び／または欠失を含む天然起源の核酸またはポリペプチド配列（例えば、非天然配列）を指す場合もある。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語は、概して、塩基－糖－リン酸の組み合わせを指す。ヌクレオチドは合成ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは合成ヌクレオチド類似体を含み得る。ヌクレオチドは、核酸配列の単量体単位（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ））であり得る。ヌクレオチドという用語は、リボヌクレオシド三リン酸のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、シトシン三リン酸（ＣＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、及びｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰなどのデオキシリボヌクレオシド三リン酸、またはそれらの誘導体を含み得る。そのような誘導体は、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７－デアザ－ｄＧＴＰ及び７－デアザ－ｄＡＴＰ、ならびにそれらを含む核酸分子にヌクレアーゼ抵抗性を付与するヌクレオチド誘導体を含み得る。本明細書で使用されるヌクレオチドという用語は、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）及びその誘導体を指し得る。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の説明的例は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、及びｄｄＴＴＰを含み得るが、これらに限定されない。ヌクレオチドは、標識されていなくてもよく、または周知の技法によって検出可能に標識されていてもよい。標識は、量子ドットを用いて行うこともできる。検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、及び酵素標識を含み得る。ヌクレオチドの蛍光標識は、フルオレセイン、５－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’７’－ジメトキシ－４’５－ジクロロ－６－カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６－カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－６－カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、４－（４’ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレッド、シアニン、及び５－（２’－アミノエチル）アミノナフタレン－１－スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含み得るが、これらに限定されない。蛍光標識されたヌクレオチドの具体例は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆから入手可能な［Ｒ６Ｇ］ｄＵＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＵＴＰ、［Ｒ１１０］ｄＣＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄＣＴＰ、［ＪＯＥ］ｄｄＡＴＰ、［Ｒ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ＦＡＭ］ｄｄＣＴＰ、［Ｒ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、［ＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ、［ｄＲ６Ｇ］ｄｄＡＴＰ、［ｄＲ１１０］ｄｄＣＴＰ、［ｄＴＡＭＲＡ］ｄｄＧＴＰ、及び［ｄＲＯＸ］ｄｄＴＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．から入手可能なＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋデオキシヌクレオチド、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｆｌｕｏｒ Ｘ－ｄＣＴＰ、ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３－ｄＵＴＰ、及びＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ５－ｄＵＴＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．から入手可能なフルオレセイン－１５－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、テトラメチル－ローダミン－６－ｄＵＴＰ、ＩＲ７７０－９－ｄＡＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、及びフルオレセイン－１５－２’－ｄＡＴＰ；ならびにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇから入手可能な染色体標識ヌクレオチド、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ－４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ－１４－ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ－１４－ｄＵＴＰ、カスケードブルー－７－ＵＴＰ、カスケードブルー－７－ｄＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ＵＴＰ、フルオレセイン－１２－ｄＵＴＰ、オレゴングリーン４８８－５－ｄＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ＵＴＰ、ローダミングリーン－５－ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ＵＴＰ、テトラメチルローダミン－６－ｄＵＴＰ、テキサスレッド－５－ＵＴＰ、テキサスレッド－５－ｄＵＴＰ、及びテキサスレッド－１２－ｄＵＴＰを含み得る。ヌクレオチドは、化学修飾によって標識またはマーキングすることもできる。化学修飾された単一のヌクレオチドは、ビオチン－ｄＮＴＰであり得る。ビオチン化ｄＮＴＰのいくつかの非限定的な例は、ビオチン－ｄＡＴＰ（例えば、ビオ－Ｎ６－ｄｄＡＴＰ、ビオチン－１４－ｄＡＴＰ）、ビオチン－ｄＣＴＰ（例えば、ビオチン－１１－ｄＣＴＰ、ビオチン－１４－ｄＣＴＰ）、及びビオチン－ｄＵＴＰ（例えばビオチン－１１－ｄＵＴＰ、ビオチン－１６－ｄＵＴＰ、ビオチン－２０－ｄＵＴＰ）を含み得る。
２つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、２つの配列の比較において、アラインされたとき、そのパーセンテージのヌクレオチドが同じであることを意味する。このアラインメント及び相同性または配列同一性のパーセントは、当分野で知られているソフトウェアプログラム、例えばＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０（参照により援用される）のセクション７．７．１８に記載されているものを使用して、決定することができる。好ましいアラインメントは、ギャップオープンペナルティ１２及びギャップ伸長ペナルティ２、ＢＬＯＳＵＭ行列６２を用いるアフィンギャップ検索を使用したＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２－４８９で開示されている（参照により援用される）。
本明細書で使用される場合、「植物」という用語は、植物全体、及び植物のあらゆる子孫、細胞、組織、または一部を含む。本開示で使用され得る植物のクラスは、概して、被子植物（単子葉類及び双子葉類の植物）、裸子植物、シダ類及び多細胞藻類を含め、変異誘発に適した高等植物及び下等植物のクラスのように広範であり得る。よって、「植物」には双子葉植物及び単子葉植物が含まれる。「植物部分」という用語は、植物の任意の部分（複数可）を含み、例えば、種子（成熟種子及び未熟種子を含む）、植物切片、植物細胞；植物細胞培養物；植物器官（例えば、花粉、胚、花、果実、苗条、葉、根、茎、及び外植体）を含むが、これらに限定されない。植物組織または植物器官は、種子、プロトプラスト、カルス、または構造的もしくは機能的な単位にまとめることができる任意の他の植物細胞群であり得る。植物細胞または組織培養物は、細胞または組織が得られた植物の生理学的及び形態学的な特性を有する植物を再生すること、ならびに植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することが可能であり得る。対照的に、いくつかの植物細胞は、再生して植物を作り出すことができない。植物細胞または組織培養物中の再生可能な細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、根、根端、シルク、花、穀粒、穂、穂軸、殻、または柄であり得る。
本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」という用語は、宿主ゲノムに組み込まれているか、または宿主細胞における自律複製が可能であり、かつ１つまたは複数のコード配列の発現を引き起こすことが可能であるＤＮＡのセグメントを指す。例示的な導入遺伝子は、宿主細胞、またはそれから再生された植物に、対応する非形質転換細胞または植物と比して新規の表現型をもたらす。導入遺伝子は、遺伝子形質転換によって植物に直接導入される場合もあれば、ＤＮＡセグメントで形質転換されたいずれかの前世代の植物から遺伝する場合もある。場合によっては、導入遺伝子は、バーコードであり得る。場合によっては、導入遺伝子は、マーカーであり得る。
本明細書で使用される場合、トランスジェニック生物とは、概して、生物のゲノム内の所望のＤＮＡ配列または遺伝子座がヌクレオチド配列の挿入、欠失、置換、または他の操作によって改変されている組換え生物を指す。
本明細書で使用される場合、「トランスジェニック植物」という用語は、植物またはそれに由来する後続世代の後代植物で、植物またはその後代のＤＮＡが、同じ系統の非トランスジェニック植物に天然に存在しない導入された外来性ＤＮＡセグメントを含むものを指す。トランスジェニック植物は、形質転換されている植物に固有の配列をさらに含むが、遺伝子の発現のレベルまたはパターンを変化させるために、例えば、１つまたは複数の異種調節性エレメントまたは他のエレメントの使用により、「外来性」遺伝子が変化していてもよい。
ベクターは、遺伝物質を細胞内に人工的に運び、その複製及び／または発現を可能にする媒介物として使用されるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。いくつかの態様では、ベクターは、バイナリーベクターまたはＴｉプラスミドである。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、プラスミド、ＹＡＣ、コスミド、ファージミド、ＢＡＣ、ウイルス、もしくは線状ＤＮＡ（例えば、線状ＰＣＲ産物）、またはポリヌクレオチド配列を別の細胞に移入するのに有用な任意の他のタイプの構築物の形態であり得る。ベクター（またはその一部）は、標的細胞において、一過性に（すなわち、ゲノムに組み込まれずに）存在することも、安定に（すなわち、ゲノムに組み込まれて）存在することもできる。いくつかの態様では、ベクターは、選択マーカーまたはレポーターをさらに含み得る。
本明細書で開示されるいくつかの方法の実践には、特記しない限り、当分野の技術の範囲内にある、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学、及び組換えＤＮＡの従来技法が用いられる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）、シリーズＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）、シリーズＭｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．），ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（２０１０））を参照のこと。
本開示は、増加した量のプシロシビン及びプシロシンなどのトリプタミン由来物質を産生する遺伝子改変生物、ならびにそれを作り出すための発現カセット、ベクター、組成物、ならびに材料及び方法を提供する。本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）、アルゴノート、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮまたは他のヌクレアーゼベースの技術、及び遺伝子改変生物を生成するための試薬を利用して、遺伝子改変生物を作製する方法も提供される。本明細書で提供される組成物及び方法は、トリプタミン由来物質の産生が増加している真菌または植物の生成のために利用され得る。本明細書で提供される組成物は、治療的使用、予防的使用、緩和的使用、及び娯楽的使用を含むがこれらに限定されない様々な使用のために利用され得る。
Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅキノコは、微量（０．１～１．７％）のプシロシビンを含む（表１）。プシロシビンの産生は、キノコにおける希少性及び高価な合成生産プロセスに起因して高価である。プシロシビンの研究費は、１グラム当たり＄７，０００～＄１０，０００である。
Figure 2022550463000007
プシロシビンの構造は６０年にわたって知られてきたが、最近になってやっと、プシロシビン生合成酵素が同定された。これにより、現在、キノコにおけるこの向精神性化合物の産生を強化して、プシロシビンの医療用途への研究を進展させる機会が促されている。プシロシビン産生の収量、効力、及び有効性は、最先端の植物ＣＲＩＳＰＲ操作プラットフォームによって改良され得る。実証された、キノコにおけるプシロシビン産生の１から１０％（乾燥菌糸体質量に対する％）への１０倍の増加は、当産業にとって著しく有益であろう。
遺伝子改変生物
本明細書では、生物における生合成経路を改変して前記生物におけるプシロシビン及びプシロシンの産生を増加させる方法及び組成物が提供される。本明細書で提供される実施形態では、遺伝子編集を使用して、トリプタミン及びジメチルトリプタミンなどのトリプタミン誘導体といった初期、中間、及び／または後期の前駆体化合物の産生を増加させて、プシロシビン及びプシロシンなどの所望の最終生成物を生成する。
さらに、トリプタミン及び／またはプシロシビン及びプシロシンなどのトリプタミン関連物質の発現レベルが上昇した遺伝子改変生物を生成するために、遺伝子編集を使用してトリプトファン消費の特定の経路をスイッチオフするための方法及び組成物が提供される。
本明細書に記載される遺伝子改変生物は、植物、動物、細菌、酵母、または真菌であり得る。場合によっては、真菌はキノコである。Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ属、Ｃｏｎｏｃｙｂｅ属、Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ属、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ属、Ｐｌｕｔｅｕｓ属、及びＳｔｒｏｐｈａｒｉａ属の特定のキノコは、向精神活性のあるトリプタミン由来物質、例えば本明細書に記載されるプシロシビンまたはプシロシンを産生し、その産生は、本明細書に記載される遺伝子改変によって強化される。場合によっては、本明細書に記載される遺伝子改変生物は、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｃｙａｎｅｓｃｅｃｅｎｓ、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｃｕｂｅｎｓｉｓ、及びＰｌｅｕｒｏｔｕｓ ｎｅｂｒｏｄｅｎｓｉｓから選択されるキノコである。
本明細書に記載される実施形態において、Ｌ－トリプトファンまたは４－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファンからトリプタミンへの変換を強化する遺伝子改変細胞または生物である。場合によっては、遺伝子改変細胞または生物は、４－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファンまたはトリプトファンのいずれかの消費の代替的な経路を抑制するかまたは最小限に抑えることにより、トリプタミンならびに任意選択でプシロシビン及びプシロシンなどのトリプタミンの下流誘導体の形成を強化する、遺伝子改変を含む。場合によっては、この強化は、トリプトファンデカルボキシラーゼＰｓｉＤの発現または活性に関連する遺伝子を導入または上方調節することによって達成される。
場合によっては、プシロシンまたはプシロシビンの産生の強化が、トリプタミンから４－ヒドロキシトリプタミンへの変換に関連する遺伝子、例えばＰ４５０モノオキシゲナーゼＰｓｉＨを導入または上方調節することによって達成されている、遺伝子改変細胞または生物である。場合によっては、トリプタミン、トリプトファン、または４－ヒドロキシトリプタミンからノルバエオシスチンへの変換に関連する遺伝子の上方調節により、ノルバエオシスチンの産生が強化されている遺伝子改変細胞または生物である。場合によっては、そのような上方調節は、遺伝子に関連するプロモーターもしくはエンハンサー配列を改変すること、または遺伝子を細胞もしくは生物にノックインすることによる、４－ヒドロキシトリプタミンキナーゼ、ＰｓｉＫの上方調節または導入によって達成される。
場合によっては、プシロシンまたはプシロシビンの産生の強化が、ノルバエオシスチンからバエオシスチンへの変換に関連する遺伝子を導入もしくは上方調節すること、またはバエオシスチンの産生を増加させることによって達成されている、遺伝子改変細胞または生物である。場合によっては、上方調節は、遺伝子に関連するプロモーターもしくはエンハンサー配列を改変すること、または遺伝子を細胞もしくは生物にノックインすることによる、ノルバエオシスチンメチルトランスフェラーゼ遺伝子の合成を増加させることによって達成される。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるトリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子は、ＰｓｉＤ（代表的なｍＲＮＡ配列は表３に提供されている）であり得る。場合によっては、トリプトファンデカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、配列番号１に対して、約５０％から、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大約１００％の配列同一性を含み得る。酵素ＰｓｉＤは、４９．６ｋＤａ酵素であり得、ＰＬＰ非依存性ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼファミリーに属する。特定の実施形態では、ＰｓｉＤは、細胞または生物において、遺伝子内にあるまたは遺伝子に関連するプロモーターまたはエンハンサー配列を遺伝子編集することによって上方調節される。特定の実施形態では、ＰｓｉＤは、遺伝子改変細胞または生物において、本明細書に記載される遺伝子編集技法の使用によって、ＰｓｉＤ遺伝子を前記細胞または生物に導入することにより、上方調節または合成される。
場合によっては、本明細書に記載される遺伝子改変細胞または生物は、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼＰｓｉＨ遺伝子（代表的なｍＲＮＡ配列は表３に提供されている）の発現の上方調節を含む。場合によっては、モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、配列番号２に対して、約５０％から、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大約１００％の配列同一性を含み得る。特定の実施形態では、ＰｓｉＨは、細胞または生物において、遺伝子内にあるまたは遺伝子に関連するプロモーターまたはエンハンサー配列を遺伝子編集することによって上方調節される。特定の実施形態では、ＰｓｉＨは、遺伝子改変細胞または生物において、本明細書に記載される遺伝子編集技法の使用によって、ＰｓｉＨ遺伝子を前記細胞または生物に導入することにより、上方調節または合成される。
場合によっては、本明細書に記載される遺伝子改変細胞または生物は、４－ヒドロキシトリプタミンキナーゼＰｓｉＫ遺伝子（代表的なｍＲＮＡ配列は表３に提供されている）の発現の上方調節を含む。場合によっては、４－ヒドロキシトリプタミンキナーゼをコードする遺伝子は、配列番号３に対して、約５０％から、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大約１００％の配列同一性を含み得る。特定の実施形態では、ＰｓｉＫは、細胞または生物において、遺伝子内にあるまたは遺伝子に関連するプロモーターまたはエンハンサー配列を遺伝子編集することによって上方調節される。特定の実施形態では、ＰｓｉＫは、遺伝子改変細胞または生物において、本明細書に記載される遺伝子編集技法の使用によって、ＰｓｉＫ遺伝子、例えば配列番号３の遺伝子を前記細胞または生物に導入することにより、上方調節または合成される。
場合によっては、本明細書に記載される遺伝子改変細胞または生物は、ノルバエオシスチンメチルトランスフェラーゼＰｓｉＭ遺伝子（代表的なｍＲＮＡ配列は表３に提供されている）の発現の上方調節を含む。場合によっては、メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、配列番号４のいずれか１つに対して、約５０％から、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大約１００％の配列同一性を含み得る。特定の実施形態では、ＰｓｉＭは、細胞または生物において、遺伝子内にあるまたは遺伝子に関連するプロモーターまたはエンハンサー配列を遺伝子編集することによって上方調節される。特定の実施形態では、ＰｓｉＭは、遺伝子改変細胞または生物において、本明細書に記載される遺伝子編集技法の使用によって、ＰｓｉＭ遺伝子、例えば配列番号４の遺伝子を前記細胞または生物に導入することにより、上方調節または合成される。特定の場合において、アミノ配列ＧＶＤＩＧＴＧＡＳを有する、ロスマンフォールドを含むクラスＩメチルトランスフェラーゼ遺伝子またはその誘導体が、プシロシビン産生を増加させるために、細胞または生物に導入される。
真菌または他の生物において産生されるプシロシビンの産生及び蓄積に影響する他の推定転写調節因子及びトランスポーターが、本明細書に記載される生物及び細胞において改変されてもよい。場合によっては、推定転写調節因子は、本明細書に記載される、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、モノオキシゲナーゼ、キナーゼ、またはデカルボキシラーゼ、例えばＰｓｉＤ、ＰｓｉＨ、ＰｓｉＫ、またはＰｓｉＭの転写または翻訳を促進し得る。場合によっては、推定転写調節因子は、本明細書に記載される、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、モノオキシゲナーゼ、キナーゼ、またはデカルボキシラーゼなどの酵素、例えばＰｓｉＤ、ＰｓｉＨ、ＰｓｉＫ、またはＰｓｉＭの転写または翻訳の下方調節を促進することができる。
特定の実施形態では、本明細書で開示される遺伝子改変技術を使用して、遺伝子内にあるまたは遺伝子に関連するプロモーターまたはエンハンサー配列を遺伝子編集すること、あるいは１つまたは複数の前記遺伝子またはその相同体の追加のコピーを導入することにより、ファシリテーターファミリートランスポーター（ＰｓｉＴ１及びＰｓｉＴ２、またはヘリックス・ループ・ヘリックス（ＨＬＨ）ドメイン転写調節因子（ＰｓｉＲ）の発現を強化することができる。これは、合成されたプシロシビンが真菌及び他の生物において正しく輸送されて局在化することを確実にすることにも関与し得る。特定の実施形態では、ＰｓｉＲ、ＰｓｉＴ１、またはＰｓｉＴ２は、細胞または生物において、遺伝子内にあるまたは遺伝子に関連するプロモーターまたはエンハンサー配列を遺伝子編集することによって上方調節される。特定の実施形態では、ＰｓｉＲ、ＰｓｉＴ１、またはＰｓｉＴ２は、遺伝子改変細胞または生物において、本明細書に記載される遺伝子編集技法の使用によって、ＰｓｉＲ、ＰｓｉＴ１、またはＰｓｉＴ２遺伝子、例えば配列番号５の遺伝子を前記細胞または生物に導入することにより、上方調節または合成される。
ＰｓｉＴ２をコードする遺伝子の代表的な配列は、表３に列記されている。場合によっては、ＰｓｉＴ２をコードする遺伝子は、配列番号５のいずれか１つに対して、約５０％から、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大約１００％の配列同一性を含み得る。
本明細書で開示される遺伝子改変技術によって上述の遺伝子を改変して、プシロシビン生合成経路に関与する酵素、推定調節因子、及び推定トランスポーターの産生を増加させること、またはそのような酵素、調節因子、及びトランスポーターを本明細書に記載される遺伝子改変細胞もしくは生物においてｄｅ ｎｏｖｏ産生することができる。例えば、プシロシビン生合成経路に沿った特定の酵素の発現レベルを上昇させて、トリプタミン、４－ヒドロキシトリプタミン、バエオシスチン、ノルバエオシスチン、及びプシロシビンのうちの１つまたは複数の産生を増加させることができる。場合によっては、遺伝子改変は、本明細書に記載される１つまたは複数の遺伝子の、またはそれに関連する、プロモーターまたはエンハンサー領域内にある。
特定の実施形態では、トリプトファン及び／または４－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファンを同じく利用する経路に関連する遺伝子は、これらの遺伝子を下方調節またはノックアウトすることにより、これらの経路によるトリプトファン消費及び／または４－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファン消費を低減させるよう、本明細書に記載される遺伝子改変技術によって改変される。下方調節またはノックアウトされる遺伝子は、例えばインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、及びＴｒｐＭを含み得る。ＴｒｐＭは、トリプトファンに対するモノメチル化及びジメチル化活性を有するが、プシロシビン生合成経路の一部ではないメチルトランスフェラーゼである。本明細書に記載される遺伝子改変生物または細胞におけるＩＤＯ、ＴＤＯ、ＴｒｐＭなどの遺伝子の下方調節またはノックアウトは、プシロシビン産生のためのトリプトファン及び／または４－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファンの利用可能性を増加させる。
特定の実施形態では、トリプトファン及び／または４－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファンの産生増加をもたらす改変を含む遺伝子改変細胞または生物である。これらの改変は、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ、３－デヒドロキナ酸シンターゼ、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、３－ホスホシキミ酸１－カルボキシビニルトランスフェラーゼ、シキミ酸キナーゼ１、シキミ酸キナーゼ２、コリスミ酸シンターゼ、トリプトファンシンターゼアルファ鎖、トリプトファンシンターゼベータ鎖、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、またはアントラニル酸シンターゼ成分をコードする遺伝子の上方調節を含む。これらの遺伝子の上方調節は、遺伝子内にあるかまたはそれに関連するプロモーターまたはエンハンサーを改変すること、あるいは生物または細胞における前記遺伝子のコピー数を増加させることにより、遺伝子の産生を増加させることによって達成される。
これらの酵素の発現を増加させることにより、基質であるトリプトファン及び／または４－ヒドロキシ－Ｌ－トリプトファンがより多く産生され、プシロシビン及び／またはプシロシンの産生の増加につながる。
本明細書では、プシロシビン生合成経路及び酵素を特徴付ける方法及び組成物が提供される。本明細書で提供される実施形態では、候補プシロシビン遺伝子が、３つの多様なプシロシビン陽性（ＰＳ＋）キノコ同核共存体ゲノム：Ｐｓ．ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓ、Ｐａ．（＝Ｃｏｐｅｌａｎｄｉａ）ｃｙａｎｅｓｃｅｎｓ、及びＧｙ．Ｄｉｌｅｐｉｓをシーケンシングすることによって同定される。特定の実施形態では、全てＰＳ＋ゲノムにおいて、５つの遺伝子：トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＰｓｉＤ）；プシロシビン関連Ｎ‐メチルトランスフェラーゼ（ＰｓｉＭ）；プシロシビン関連ヒドロキシラーゼ（ＰｓｉＨ）；プシロシビン関連ホスホトランスフェラーゼ（ＰｓｉＫ）；プシロシビン関連トランスポーター（ＰｓｉＴ）がクラスター化された。特定の実施形態では、反応における最初の関与段階であり、薬物に予定される（ｄｒｕｇ‐ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ）化合物を唯一産生しないＰｓｉＤは、トリプトファンに対する特異的なデカルボキシラーゼ活性を有し、トリプタミンを産生させる。特定の実施形態では、クラスター間での遺伝子重複は、遺伝子改変の代替経路または網状経路に関連する。
本明細書に記載される実施形態において、ＰＳ＋クラスター内の遺伝子のコード配列は、いくつかのキノコから同定されており、本明細書で提供されるとおりである。特定の実施形態では、これらの遺伝子のイントロンまたはエクソンの構成についての情報も存在する（遺伝子の代表的リストを表２に提供する）。
Figure 2022550463000008

Figure 2022550463000009
Figure 2022550463000010
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Figure 2022550463000012
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Figure 2022550463000021
場合によっては、本明細書に記載の核酸送達プラットフォームのいずれかによる、真菌、または細胞を含むがこれに限定されない任意の他の生物のゲノム破壊の効率は、核酸またはタンパク質解析により測定した場合、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または最大約１００％の、遺伝子またはその一部の破壊をもたらし得る。
場合によっては、遺伝子改変された真菌及び他の生物は、遺伝子改変がない同等の対照と比較して、真菌の乾燥重量で測定して、約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、及び最大４００％パーセント多くの、式Ｉ～ＩＶのうちのいずれか１つの化合物を含む。
場合によっては、遺伝子改変された真菌及び他の生物は、遺伝子改変がない同等の対照と比較して、真菌の乾燥重量で測定して、約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、及び最大４００％パーセント多くのジメチルトリプタミン（ＤＭＴ）を含む。
場合によっては、遺伝子改変された真菌及び他の生物は、遺伝子改変がない同等の対照と比較して、真菌の乾燥重量で測定して、約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、及び最大４００％パーセント多くのプシロシビンを含む。
場合によっては、遺伝子改変された真菌及び他の生物は、遺伝子改変がない同等の対照と比較して、真菌の乾燥重量で測定して、約１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、及び最大４００％パーセント多くのプシロシンを含む。
様々な方法を利用して、プシロシビン及び／またはプシロシン生合成経路における遺伝子編集の潜在的な標的を同定することができる。場合によっては、バイオインフォマティクス、ｇＲＮＡの設計、ＣＲＩＳＰＲ試薬の構築、植物の形質転換、植物の再生、及び／または遺伝子型判定のうちのいずれか１つを利用することができる。バイオインフォマティクスは、遺伝子マッピング、遺伝子のアラインメント及びコピー数解析、ならびに遺伝子アノテーションを含み得る。ｇＲＮＡの設計は、大麻ゲノム内の標的遺伝子特異性及びオフターゲットに基づいて、ガイドの意図される機能、ランク、及び選択のためのガイドのクラスターを設計するためのｇＲＮＡのグループ化を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ試薬の構築は、大麻コドンが最適化されたＣａｓ９とｇＲＮＡとを同時送達するための、感染準備済みの（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ－ｒｅａｄｙ）ＡＧＲＯ試薬の生成を含み得る。植物の形質転換及び再生は、植物組織をＣＲＩＳＰＲ ＡＧＲＯに感染させること（例えばカルス）、大麻プロトプラストを単離し、ＲＮＰ試薬を形質転換させる技法、及び／または形質転換組織から生育中の小植物を得るための技法の開発を含み得る。遺伝子型判定は、植物ＤＮＡを単離し、標的配列を解析することを含み得る。機能解析は、植物組織中のカンナビノイド含有量を解析し、関連性のあるカンナビノイドを数量化することを含み得る。
上記で開示された遺伝子改変の様々な手法を、異なる植物、Ｅ ｃｏｌｉ及び他の好適な細菌、または酵母といった他の生物に使用して、プシロシビン及び／またはプシロシンの最終生成物を産生させてもよい。本開示の遺伝子操作された真菌及び他の生物において、プシロシビン及び／またはプシロシンの量は、かかる本開示の遺伝子改変がない同等の対照真菌または生物と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、３００％、または最大４００％多く増加する。
遺伝子操作
本明細書では、ゲノム操作のシステムが提供され得る。ゲノム操作のシステムは、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）酵素、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）－ヌクレアーゼ、トランスポゾンベースのヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、アルゴノート、またはＭｅｇａ－ＴＡＬのうちのいずれか１つを含み得る。いくつかの態様では、ゲノム編集システムは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含むガイディングポリ核酸を利用し得る。場合によっては、ガイドは、ガイドＤＮＡまたはガイドＲＮＡであり得る。
Ｉ． ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）
場合によっては、遺伝子操作は、ＣＲＩＳＰＲシステムまたはその一部を使用して行うことができる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ガイドポリヌクレオチドまたはガイドポリヌクレオチドをコードする核酸と、ＣＲＩＳＰＲ酵素またはＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする核酸とを含む多成分系であり得る。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ成分またはＣＲＩＳＰＲ成分のいずれかの任意の部分の任意の改変を含んでいてもよい。
本明細書に記載の方法は、ＣＲＩＳＰＲシステムを利用することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムには少なくとも５つのタイプがあり、その全てに、ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質ならびにコードするポリ核酸が組み込まれている。ＣＲＩＳＰＲシステムの一般的機構及び最近の進歩は、Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）、Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１，８２２－８２６（２０１３）、Ｃｈｕ，ＶＴ ｅｔ ａｌ． “Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３３，５４３－５４８（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｌａｓｓ ２ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０，１－１３（２０１５）、Ｍａｋａｒｏｖａ，ＫＳ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎ ｕｐｄａｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，”，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３，１－１５（２０１５）に記述されている。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対形成相補性（プロトスペーサーとも呼ばれる）と、２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される、標的ＤＮＡ内の短いモチーフの両方により決定される位置で起こる。ＰＡＭは、カノニカルなＰＡＭであっても、非カノニカルなＰＡＭであってもよい。例えば、操作された、植物細胞などの細胞は、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して生成され得る。本明細書で開示される方法において使用されるＣａｓ酵素は、ＤＮＡ切断を触媒するＣａｓ９であり得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するＣａｓ９または任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用は、ガイド配列の約２０のヌクレオチドにハイブリダイズする標的部位配列であって、標的配列の約２０のヌクレオチドの後にプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有する標的部位配列において、二本鎖切断を生成することができる。いくつかの態様では、２０未満のヌクレオチドがハイブリダイズされ得る。いくつかの態様では、２０超のヌクレオチドがハイブリダイズされ得る。本明細書では、少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、または少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼをコードする核酸を、大麻及び／またはアサ植物あるいはそれらの細胞に導入することを含む、ＴＨＣＡシンターゼの活性のゲノム破壊が提供され得、少なくとも１つのガイディング核酸は、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする。いくつかの態様では、改変された植物またはその一部が培養され得る。
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）酵素
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ酵素を含んでもよく、またはＣａｓ酵素であってもよい。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質またはその一部をコードする核酸が、本明細書で提供される実施形態において利用され得る。Ｃａｓ酵素の非限定的な例は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、Ｃｐｆ１、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらの相同体、またはそれらの改変版を含み得る。場合によっては、触媒不活性のＣａｓタンパク質、例えばｄＣａｓ９が使用され得る。未改変のＣＲＩＳＰＲ酵素、例えばＣａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有し得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列における、例えば標的配列内及び／または標的配列の相補体内での、一方または両方の鎖の切断を誘導することができる。いくつかの態様では、標的配列は、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、または少なくとも２２ヌクレオチドの長さである。場合によっては、標的配列は、最大で１７ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、標的は、配列番号１～配列番号７のうちのいずれか１つとの、約５０％から、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または最大約１００％の相同性を含む配列から選択され得る。
いくつかの態様では、標的配列は、遺伝子のイントロンまたはエクソン内で見出され得る。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲシステムは、カンナビノイド生合成経路に関与する遺伝子のエクソンを標的とすることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列内、または標的配列の最初もしくは最後のヌクレオチドから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、もしくはそれより多くの塩基対の距離以内で、一方または両方の鎖の切断を誘導し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＰＡＭ配列内、またはＰＡＭ配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、もしくはそれより多くの塩基対の距離以内で、一方または両方の鎖の切断を誘導し得る。場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは、ＰＡＭから３～１０ヌクレオチド離れた標的配列と結合する。変異型ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方または両方の鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に対して変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターを使用することができる。Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９ＨｉＦｉなどの高忠実度Ｃａｓタンパク質であり得る。場合によっては、Ｃａｓタンパク質は改変されていてもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質の改変は、Ｎ７－メチル－Ｇｐｐｐ（２’－Ｏ－メチル－Ａ）を含み得る。
Ｃａｓ９は、野生型の例示的なＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）に対して、少なくとも、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性及び／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。Ｃａｓ９は、野生型の例示的なＣａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来）に対して、最大で、または最大で約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の配列同一性及び／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。Ｃａｓ９は、野生型か、または欠失、挿入、置換、バリアント、変異、融合、キメラ、もしくはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含み得る改変形態のＣａｓ９タンパク質を指し得る。場合によっては、ＣａｓなどのＣＲＩＳＰＲ酵素は、植物での発現のためにコドン最適化され得る。
エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質）をコードするポリヌクレオチドは、植物細胞などの特定の細胞における発現のためにコドン最適化され得る。このタイプの最適化は、同じタンパク質をコードしながら、意図される宿主生物または細胞のコドン選択性を模倣する、外来（例えば、組換え）ＤＮＡの変異を伴い得る。
エンドヌクレアーゼは、野生型の例示的な部位指向性ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）のヌクレアーゼドメインに対して、少なくとも、または少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を含み得る。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）が、ゲノム操作のためのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼとして使用され得る。場合によっては、異なるエンドヌクレアーゼを使用して、特定のゲノム標的を標的としてもよい。場合によっては、非ＮＧＧ ＰＡＭ配列を含む合成ＳｐＣａｓ９由来バリアントを使用してもよい。さらに、様々な種に由来する他のＣａｓ９オルソログが同定されており、これらの「非ＳｐＣａｓ９」は、同様に本発明で有用であり得る種々のＰＡＭ配列と結合する。例えば、ＳｐＣａｓ９の比較的大きなサイズ（およそ４ｋｂのコード配列）は、ＳｐＣａｓ９ ｃＤＮＡを有するプラスミドが細胞で効率的に発現されない場合があることを意味する。逆に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）のコード配列は、ＳｐＣａｓ９よりおよそ１キロベース短く、細胞で効率的に発現される可能性がある。
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９の代替物は、Ｃｐｆ１ファミリーのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを含み得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは異なり、Ｃｐｆ１媒介性ＤＮＡ切断の結果は、短い３’オーバーハングを伴う二本鎖切断である。Ｃｐｆ１の交互切断パターンは、遺伝子編集の効率を増加させ得る、従来の制限酵素クローニングと類似した、指向性遺伝子移入の可能性を開き得る。上述のＣａｓ９バリアント及びオルソログと同様に、Ｃｐｆ１もまた、ＳｐＣａｓ９が優先するＮＧＧ ＰＡＭ部位を欠くＡＴリッチ領域またはＡＴリッチゲノムへとＣＲＩＳＰＲによって標的とされ得る部位の数を増大させ得る。
いくつかの態様では、Ｃａｓ配列は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含み得る。核局在化配列は、ＳＶ４０に由来し得る。ＮＬＳは、ＳＶ４０、ヌクレオプラスミン、インポーチンアルファ、Ｃ－ｍｙｃ、ＥＧＬ－１３、ＴＵＳ、ｈｎＲＮＰＡ１、Ｍａｔａ２、またはＰＹ－ＮＬＳのうちの少なくとも１つに由来し得る。ＮＬＳは、Ｃａｓタンパク質のＣ末端にあってもＮ末端にあってもよい。場合によっては、Ｃａｓタンパク質は、１～５つのＮＬＳ配列を含み得る。Ｃａｓタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大１０個のＮＬＳ配列を含むことができる。Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質は、２つのＮＬＳ配列を含み得る。Ｃａｓタンパク質は、ＳＶ４０及びヌクレオプラスミンＮＬＳ配列を含み得る。Ｃａｓタンパク質は、少なくとも１つの非翻訳領域を含んでもよい。
いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクターは、核局在化配列（ＮＬＳ）配列を含み得る。場合によっては、ベクターは、１つまたは複数のＮＬＳを含み得る。場合によっては、ベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＮＬＳを含み得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端もしくはその付近に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を超える、もしくはおよそその数を超えるＮＬＳを含むか、カルボキシル末端もしくはその付近に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を超える、もしくはおよそその数を超えるＮＬＳを含むか、またはこれらの任意の組み合わせ（例えば、アミノ末端の１つまたは複数のＮＬＳ及びカルボキシル末端の１つまたは複数のＮＬＳ）を含むことができる。１つより多くのＮＬＳが存在する場合、各々は、単一のＮＬＳが、１つより多くのコピーに、及び／または、１つもしくは複数のコピーに存在する１つもしくは複数の他のＮＬＳと組み合わせて存在し得るように、その他から独立して選択され得る。
ＮＬＳは、単節型であっても双節型であってもよい。場合によっては、双節型ＮＬＳは、単節型ＮＬＳとは異なり、スペーサー配列を有し得る。ＮＬＳは、ＳＶ４０、ヌクレオプラスミン、インポーチンアルファ、Ｃ－ｍｙｃ、ＥＧＬ－１３、ＴＵＳ、ｈｎＲＮＰＡ１、Ｍａｔａ２、またはＰＹ－ＮＬＳのうちの少なくとも１つに由来し得る。ＮＬＳは、ポリペプチド鎖内の任意の場所、例えば、Ｎ末端またはＣ末端付近に位置し得る。例えば、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端から、ポリペプチド鎖に沿って１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０アミノ酸以内、またはおよそその距離以内に存在し得る。場合により、ＮＬＳは、Ｎ末端またはＣ末端から、５０アミノ酸以上、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００アミノ酸以内、またはおよそその距離以内に存在し得る。
任意の機能的濃度のＣａｓタンパク質が細胞に導入され得る。例えば、１５マイクログラムのＣａｓ ｍＲＮＡが細胞に導入されてもよい。他の場合では、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、０．５マイクログラム～１００マイクログラム導入されてもよい。Ｃａｓ ｍＲＮＡは、０．５から、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００マイクログラム導入されてもよい。
場合によっては、二本鎖切断またはゲノム切断を導入するために、二重ニッカーゼ手法が使用され得る。Ｃａｓタンパク質を、いずれかのヌクレアーゼドメイン内の既知のアミノ酸で変異させ、これにより、１つのヌクレアーゼドメインの活性を欠失させ、一本鎖切断を生成することが可能なニッカーゼＣａｓタンパク質を生成することができる。向かい合った鎖を標的とする２つの特異なガイドＲＮＡと共にニッカーゼを利用すると、標的部位内に二本鎖切断（ＤＳＢ）が生成され得る（多くの場合、「二重ニック」または「二重ニッカーゼ」ＣＲＩＳＰＲシステムと称される）。２つのオフターゲットニックがＤＳＢを引き起こすほど近接して生成される可能性は低いため、この手法は、標的特異性を劇的に増加させ得る。
Ｃａｓ９などのヌクレアーゼは、使用前に識別及び効力について試験され得る。例えば、識別及び効力は、分光光度解析、ＲＮＡアガロースゲル解析、ＬＣ－ＭＳ、エンドトキシン解析、及び無菌検査のうちの少なくとも１つを使用して決定され得る。場合によっては、Ｃａｓ９配列などのヌクレアーゼ配列は、その識別を確認するためにシーケンシングされ得る。場合によっては、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質は、臨床的または治療的な使用の前にシーケンシングされ得る。例えば、精製されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価することで、臨床用生成物中に、Ｃａｓ９以外の他のｍＲＮＡ種が存在しない、または他のｍＲＮＡ種が実質的に存在しないことを検証することができる。さらに、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質をコードする精製されたｍＲＮＡを、逆転写による妥当性確認にかけ、その後、ヌクレオチドレベルで同一性を検証するシーケンシングステップを行ってもよい。精製されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって評価することで、ｍＲＮＡがＣａｓ９について予想されるサイズであり、臨床用または治療用の生成物中に他のｍＲＮＡ種が実質的に存在しないことを検証することができる。
場合によっては、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼのエンドトキシンレベルが決定され得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、２ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、１ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、０．５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。
場合によっては、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼを無菌検査にかけてもよい。無菌検査の臨床的／治療的に許容されるレベルは、０であるか、または培養物における増殖がないことによって表され得る。無菌検査の臨床的／治療的に許容されるレベルは、０．５％、０．３％、０．１％、または０．０５％未満の増殖であり得る。
ガイディングポリ核酸
ガイディングポリ核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ガイディングポリ核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。場合によっては、ガイディングポリ核酸は、一本鎖域及び二本鎖域の領域を含み得る。ガイディングポリ核酸は、二次構造を形成することもできる。本明細書で使用される場合、「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」という用語、及びその文法的均等物は、標的ＤＮＡに特異的であり得、かつＣａｓタンパク質と複合体を形成することのできる、ＲＮＡを指し得る。ガイドＲＮＡは、ガイド配列、またはスペーサー配列を含むことができ、この配列は、標的部位を特定し、切断のために特定された標的ＤＮＡにＲＮＡ／Ｃａｓ複合体を導く。例えば、ガイドＲＮＡは、標的遺伝子またはその一部をＣＲＩＳＰＲ複合体の標的とさせ、標的化された二本鎖切断を行うことができる。標的ＤＮＡの部位特異的切断は、１）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対形成相補性（プロトスペーサーとも呼ばれる）と、２）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される、標的ＤＮＡ内の短いモチーフの両方により決定される位置で起こる。場合によっては、ｇＲＮＡは、一般的に発現される転写物における初期エクソンに位置するｇＲＮＡを同定することができるアルゴリズムを使用して設計され得る。
場合によっては、ガイドポリヌクレオチドは、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、モノオキシゲナーゼ、キナーゼ、デカルボキシラーゼ、転写調節因子、トランスポーター、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、トリプトファン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、ＴｒｐＭ、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ、３－デヒドロキナ酸シンターゼ、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、３－ホスホシキミ酸１－カルボキシビニルトランスフェラーゼ、シキミ酸キナーゼ１、シキミ酸キナーゼ２、コリスミ酸シンターゼ、トリプトファンシンターゼアルファ鎖、トリプトファンシンターゼベータ鎖、アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びアントラニル酸シンターゼ成分をコードする遺伝子の標的配列に相補的であり得る。場合によっては、ｇＲＮＡまたはｇＤＮＡは、配列番号１～５または上述の遺伝子のいずれかと相同または相補的な標的配列と結合することができる。
機能性遺伝子コピー、遺伝子バリアント、及び偽遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ設計のための配列鋳型を作り出すためにマッピングされ、アラインされる。場合によっては、ＴＨＣＡシンターゼのアラインされたコピー全体で保存された配列を標的とする複数のガイドＲＮＡが、初期コード配列を破壊し、コード配列にフレームシフト変異インデルなどの変異を導入するように設計される。場合によっては、大麻及びアサのゲノム内の他の場所におけるオフターゲット部位の発生率が低いガイドＲＮＡが選択され得る。
ある態様において、ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡライブラリーが生成され、ＤＮＡ解析によるバリアント植物のスクリーニングのために利用され得る。マルチプレックスＣＲＩＳＰＲ操作により、新規のカンナビノイド産生大麻植物の多様な遺伝子型を生成することができる。場合によっては、これらの植物は、微量の、希少な、及び／または十分に研究されていないカンナビノイドを、上昇したレベルで産生する。
場合によっては、ｇＲＮＡは、カンナビノイド生合成経路に関与する遺伝子のエクソンを標的とするよう設計され得る。場合によっては、ｇＲＮＡは、初期コード配列を破壊するよう設計され得る。ある態様において、対象ガイドＲＮＡは、２つのカテゴリー、すなわち、これらの遺伝子内に初期位置を有するコード配列を標的として、フレームシフト変異インデルを導入することにより、機能性タンパク質の産生を破壊することを目的とするもの（ＫＯガイド）と、遺伝子調節領域内に広がる配列を標的とするもの（発現調整性ガイド）とにクラスター化することができる。さらに、大麻及びアサのゲノム内の他の場所におけるオフターゲット部位の発生率が最も低いガイドＲＮＡが選択され得る。
場合によっては、ｇＲＮＡは、それが標的遺伝子に挿入するインデルのパターンに基づいて選択され得る。候補ｇＲＮＡは、（ａ）ｇＲＮＡ配列と、厳密にマッチする任意のゲノム配列との間のミスマッチの総数、（ｂ）ＰＡＭ部位の近くにあるミスマッチの活性に対する負の影響と相関する、ＰＡＭ部位に対するミスマッチ位置（複数可）、（ｃ）ガイド－ＤＮＡ相互作用の破壊における隣接するミスマッチの累積的効果の原因となるミスマッチ間の距離；及びこれらの任意の組み合わせを考慮することができるスコア付けシステムを使用して、オフターゲット可能性によってランク付けすることができる。場合によっては、ｇＲＮＡとゲノム標的部位との間のミスマッチの数が多いほど、その部位のＣＲＩＳＰＲ媒介性切断の可能性が低くなり得る。場合によっては、ミスマッチ位置は、ＰＡＭ部位に直接隣接している。他の場合では、ミスマッチ位置は、ＰＡＭ部位から、１ヌクレオチド～最大１００キロベース離れていてもよい。ミスマッチを含む候補ｇＲＮＡは、場合によっては、ＰＡＭに隣接していなくてもよい。他の場合では、ミスマッチを含む少なくとも２つの候補ｇＲＮＡは、互いから１ヌクレオチド～最大１００キロベース離れてゲノムに結合し得る。ミスマッチは、ヌクレオチドの置換であり得る。例えば、場合によっては、ＧがＴに置換される。ｇＲＮＡとゲノムとの間のミスマッチは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集の忠実度の低減を可能にし得る。場合によっては、正のスコアをもつｇＲＮＡは、約１１０ヌクレオチドの長さであり得、相補的ゲノム配列とのミスマッチを含まない場合がある。他の場合では、正のスコアをもつｇＲＮＡは、約１１０ヌクレオチドの長さであり得、相補的ゲノム配列とのミスマッチを最大３個含んでもよい。他の場合では、正のスコアをもつｇＲＮＡは、約１１０ヌクレオチドの長さであり得、相補的ゲノム配列とのミスマッチを最大２０個含んでもよい。場合によっては、ガイディングポリ核酸は、ホスホロチオエートであり得るヌクレオチド間結合を含むことができる。任意の数のホスホロチオエートが存在し得る。例えば、１～約１００個のホスホロチオエートが、ガイディングポリ核酸配列に存在してよい。場合によっては、１～１０個のホスホロチオエートが存在する。場合によっては、８個のホスホロチオエートが、ガイディングポリ核酸配列に存在する。
場合によっては、上位のスコアをもつｇＲＮＡを設計して選択してもよく、各々のオンターゲット編集効率を植物細胞で実験的に評価してもよい。場合によっては、ＴｉＤＥ解析によって決定される編集効率は、少なくとも約２０％を超え得る。他の場合では、編集効率は、約２０％～約５０％、約５０％～約８０％、約８０％～約１００％であり得る。場合によっては、インデルのパーセントを、試験的なＧＭＰランで決定することができる。例えば、最終的な細胞産物を、Ｓａｎｇｅｒシーケンシング及びＴＩＤＥ解析により、オンターゲットインデル形成について解析することができる。対照と実験的試料の両方で、約１×１０６個の細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、カンナビノイド生合成経路に関与する遺伝子のような、破壊されている遺伝子にフランキングするプライマーを使用したＰＣＲに供してもよい。Ｓａｎｇｅｒシーケンシングクロマトグラムは、対照とノックアウト試料の比較により、インデルの頻度及びインデルのサイズ分布を数量化することのできるＴＩＤＥソフトウェアプログラムを使用して解析され得る。
本明細書で開示される方法は、少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは核酸、例えば、少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、細胞または植物胚に導入することを含んでもよい。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼと相互作用して、エンドヌクレアーゼを特定の標的部位に指向することができ、この部位で、ガイドＲＮＡの５’末端が、染色体配列中の特定のプロトスペーサー配列と塩基対を形成する。
ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡは、場合により、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの一部（例えば、機能性部分）の融合により形成されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡであってもよい。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡを含み、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠いていてもよい。さらに、ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡまたはプロトスペーサー配列とハイブリダイズすることができる。
上述のように、ガイドＲＮＡは発現産物であり得る。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、ガイドＲＮＡをコードする配列を含むベクターであり得る。ガイドＲＮＡは、単離されたガイドＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ及びプロモーターをコードする配列を含むプラスミドＤＮＡを細胞または植物胚にトランスフェクトすることにより、細胞または生物に移入することができる。いくつかの態様では、プロモーターは、葉特異的プロモーター、花特異的プロモーター、ＴＨＣＡシンターゼプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＦＭＶ３５Ｓプロモーター、及びｔＣＵＰプロモーターからなる群から選択され得る。ガイドＲＮＡは、粒子照射の使用といった他の方法で細胞または植物胚に移入することもできる。
ガイドＲＮＡは単離されていてもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、単離されたＲＮＡの形態で細胞または植物胚にトランスフェクトされてもよい。ガイドＲＮＡは、任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写システムを使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製され得る。ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡのコード配列を含むプラスミドの形態ではなく、単離されたＲＮＡの形態で細胞に移入されてもよい。
ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含み得る。ＤＮＡ標的化セグメント（またはＤＮＡ標的化配列、またはスペーサー配列）は、標的ＤＮＡ内の特定の配列（例えば、プロトスペーサー）に相補的であり得るヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合セグメント（またはタンパク質結合配列）は、部位指向性改変ポリペプチド、例えばＣａｓタンパク質などのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼと相互作用することができる。「セグメント」とは、分子のセグメント／セクション／領域、例えば、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続的区間を意味する。セグメントは、セグメントが１つより多くの分子の領域を含み得るように、複合体の領域／セクションを意味する場合もある。例えば、場合によっては、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、１つのＲＮＡ分子であり、したがって、タンパク質結合セグメントは、そのＲＮＡ分子の領域を含む。他の場合では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、相補性領域に沿ってハイブリダイズされた２つの別個の分子を含む。
ガイドＲＮＡは、２つの別個のＲＮＡ分子または単一のＲＮＡ分子を含み得る。例示的な単分子ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメントとタンパク質結合セグメントの両方を含む。
例示的な２分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子と、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「アクチベーターＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子とを含み得る。第１のＲＮＡ分子は、ＤＮＡ標的化セグメント（例えば、スペーサー）と、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二重鎖の半分を形成することができるヌクレオチドの区間とを含み得る、ｃｒＲＮＡ様分子（ターゲッターＲＮＡ）であり得る。第２のＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖のもう半分を形成することができるヌクレオチドの区間を含み得る、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（アクチベーターＲＮＡ）であり得る。換言すれば、ｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドの区間は、ｔｒａｃｒＲＮＡ様分子ヌクレオチドの区間に相補的であり得、これとハイブリダイズして、ガイドＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成することができる。したがって、各ｃｒＲＮＡ様分子は、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を有するということができる。ｃｒＲＮＡ様分子はさらに、一本鎖ＤＮＡ標的化セグメント、またはスペーサー配列をもたらし得る。よって、ｃｒＲＮＡ様分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は（対応するペアとして）ハイブリダイズして、ガイドＲＮＡを形成することができる。対象の２分子ガイドＲＮＡは、任意の対応するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのペアを含み得る。
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントまたはスペーサー配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが標的部位またはプロトスペーサーと塩基対を形成できるように、染色体配列内の標的部位の配列、例えば、プロトスペーサー配列と相補的であり得る。場合によっては、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、１０またはおよそその数のヌクレオチドから、２５またはおよそその数、またはそれ以上の数のヌクレオチドを含み得る。例えば、ガイドＲＮＡの第１の領域と染色体配列内の標的部位との間の塩基対形成の領域は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、もしくは２５を超えるヌクレオチドの長さであってもよく、またはおよそその長さであってもよい。場合により、ガイドＲＮＡの第１の領域は、１９、２０、または２１ヌクレオチドの長さであってもよく、またはおよそその長さであってもよい。
ガイドＲＮＡは、２０またはおよそその数のヌクレオチドの核酸配列を標的とし得る。標的核酸は、２０未満またはおよそその数未満のヌクレオチドであり得る。標的核酸は、少なくとも、または少なくとも約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。標的核酸は、最大で、または最大で約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドであり得る。標的核酸配列は、ＰＡＭにおける第１のヌクレオチドの５’のすぐ近くの２０塩基であってもよく、またはおよそその数の塩基であってもよい。ガイドＲＮＡは、カンナビノイド生合成経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子の核酸配列を標的とし得る。場合によっては、ＲＮＡなどのガイディングポリ核酸は、ＰＡＭから約１塩基対～約２０塩基対離れたゲノム領域に結合することができる。ガイドは、ＰＡＭから約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または最大約２０塩基対離れたゲノム領域に結合することができる。
ガイド核酸、例えば、ガイドＲＮＡは、別の核酸、例えば、細胞のゲノム内の標的核酸またはプロトスペーサーにハイブリダイズし得る核酸を指し得る。ガイド核酸はＲＮＡであってもよい。ガイド核酸はＤＮＡであってもよい。ガイド核酸は、核酸の配列に部位特異的に結合するようプログラムまたは設計することができる。ガイド核酸は、ポリヌクレオチド鎖を含むことができ、シングルガイド核酸と呼ばれ得る。ガイド核酸は、２つのポリヌクレオチド鎖を含むことができ、ダブルガイド核酸と呼ばれ得る。
ガイド核酸は、新たなまたは強化された特徴を有する核酸をもたらす１つまたは複数の改変を含み得る。ガイド核酸は、核酸親和性タグを含み得る。ガイド核酸は、合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、及び／または改変されたヌクレオチドを含み得る。ガイド核酸は、標的核酸中の配列（例えば、プロトスペーサー）にハイブリダイズし得るヌクレオチド配列（例えば、スペーサー）を、例えば、５’末端もしくは３’末端またはその付近に含み得る。ガイド核酸のスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）により、配列特異的様式で、標的核酸と相互作用することができる。スペーサー配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’または３’に位置する標的核酸にハイブリダイズすることができる。スペーサー配列の長さは、少なくとも、または少なくとも約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０以上のヌクレオチドであり得る。スペーサー配列の長さは、最大で、または最大で約５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０以上のヌクレオチドであり得る。
ガイドＲＮＡは、二次構造を形成するｄｓＲＮＡ二重鎖領域を含んでもよい。例えば、ガイドＲＮＡにより形成される二次構造は、ステム（またはヘアピン）及びループを含み得る。ループ及びステムの長さは様々であり得る。例えば、ループは、約３～約１０ヌクレオチドの範囲の長さであり得、ステムは、約６～約２０塩基対の範囲の長さであり得る。ステムは、１～約１０ヌクレオチドのバルジを１つまたは複数含み得る。第２の領域の全長は、約１６～約６０ヌクレオチドの範囲の長さであり得る。例えば、ループは、４ヌクレオチドまたはおよそその長さであってもよく、ステムは、１２塩基対またはおよそその長さであってもよい。ｄｓＲＮＡ二重鎖領域は、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓタンパク質など、ＲＮＡ結合タンパク質と複合体を形成することができる、タンパク質結合セグメントを含み得る。
ガイドＲＮＡは、本質的に一本鎖であり得る５’末端または３’末端のテール領域を含んでもよい。例えば、テール領域は、目的の細胞におけるいずれの染色体配列とも相補性でない場合があり、ガイドＲＮＡの残部と相補性でない場合がある。さらに、テール領域の長さは様々であり得る。テール領域は、４を超える、またはおよそその数を超えるヌクレオチドの長さであってもよい。例えば、テール領域の長さは、約５～約６０ヌクレオチドの範囲の長さであり得る。
ガイドＲＮＡは、細胞または胚にＲＮＡ分子として導入され得る。例えば、ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されてもよく、及び／または化学的に合成されてもよい。次いで、ガイドＲＮＡは、細胞または胚にＲＮＡ分子として導入され得る。ガイドＲＮＡは、非ＲＮＡ核酸分子、例えば、ＤＮＡ分子の形態で細胞または胚に導入されてもよい。例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、目的の細胞または胚におけるガイドＲＮＡの発現のために、プロモーター制御配列に作動可能に連結していてもよい。ＲＮＡコード配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されるプロモーター配列に作動可能に連結していてもよい。
ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、線状であってもよい。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子は、環状であってもよい。ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、ベクターの一部であってもよい。ベクターのいくつかの例には、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン、及びウイルスベクターが含まれ得る。例えば、ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡは、プラスミドベクター内に存在する。好適なプラスミドベクターの他の非限定的な例には、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びそれらのバリアントが含まれる。さらに、ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択可能マーカー配列（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）、複製起点などを含み得る。
ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼとガイドＲＮＡの両方がＤＮＡ分子として細胞に導入される場合、各々が別個の分子の一部であってもよく（例えば、融合タンパク質コード配列を含む１つのベクター、及びガイドＲＮＡコード配列を含む第２のベクター）、または両方が同じ分子の一部であってもよい（例えば、融合タンパク質とガイドＲＮＡの両方のコード（及び調節）配列を含む１つのベクター）。
Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質またはその任意の誘導体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するよう、ガイドＲＮＡと予め複合体化されていてもよい。ＲＮＰ複合体は、植物細胞に導入されてもよい。ＲＮＰ複合体の導入は、時限的であり得る。細胞は、細胞周期のＧ１、Ｓ、及び／またはＭ期で他の細胞と同期され得る。ＲＮＰ複合体は、ＨＤＲが強化されるような細胞周期で送達され得る。ＲＮＰ複合体は、相同組換え修復を促進し得る。
ガイドＲＮＡは改変されていてもよい。改変は、化学的変化、合成的改変、ヌクレオチドの付加、及び／またはヌクレオチドの減算を含み得る。改変は、ＣＲＩＳＰＲゲノム操作を強化することもできる。改変は、ｇＲＮＡのキラリティーを変化させ得る。場合によっては、キラリティーは、改変後に均一または立体化学的に純粋（ｓｔｅｒｅｏｐｕｒｅ）であり得る。ガイドＲＮＡは合成され得る。合成されたガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲゲノム操作を強化し得る。ガイドＲＮＡはトランケートされていてもよい。トランケーションを使用すると、望まれないオフターゲット変異誘発を低減させることができる。トランケーションは、任意の数のヌクレオチド欠失を含み得る。例えば、トランケーションは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。ガイドＲＮＡは、任意の長さの標的相補性領域を含み得る。例えば、標的相補性領域は、２０ヌクレオチド未満の長さであり得る。標的相補性領域は、２０ヌクレオチド超の長さであってもよい。標的相補性領域は、ＰＡＭ配列に直接隣接する約５ｂｐ～約２０ｂｐを標的とし得る。標的相補性領域は、ＰＡＭ配列に直接隣接する約１３ｂｐを標的とし得る。本明細書に記載のポリ核酸は、改変されていてもよい。改変は、ポリ核酸の任意の位置で行われ得る。１つより多くの改変が単一のポリ核酸に行われ得る。改変後にポリ核酸を品質管理にかけてもよい。場合によっては、品質管理は、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＳ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。改変は、置換、挿入、欠失、化学修飾、物理的改変、安定化、精製、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ポリ核酸は、５’アデニル酸、５’グアノシン－三リン酸キャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン－三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸、３’チオリン酸、５’リン酸、５’チオリン酸、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジン二量体、三量体、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９、３’－３’改変、５’－５’改変、脱塩基、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、二重ビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシド類似体プリン、２’デオキシリボヌクレオシド類似体ピリミジン、リボヌクレオシド類似体、２’－０－メチルリボヌクレオシド類似体、糖修飾類似体、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、シュードウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、またはそれらの任意の組み合わせによっても改変され得る。場合によっては、改変は恒久的であり得る。他の場合では、改変は一過的であり得る。場合によっては、複数の改変がポリ核酸に行われる。ポリ核酸の改変は、ヌクレオチドの生理化学的特性、例えばそれらの高次構造、極性、疎水性、化学反応性、塩基対形成相互作用、またはそれらの任意の組み合わせを変化させ得る。いくつかの態様では、ｇＲＮＡが改変され得る。場合によっては、改変は、５’末端、３’末端、５’末端から３’末端まで、一塩基改変、２’－リボース改変、またはそれらの任意の組み合わせである。改変は、塩基置換、挿入、欠失、化学修飾、物理的改変、安定化、精製、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。場合によっては、改変は化学修飾である。
場合によっては、改変は、「ｍ」と表される、２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエートの付加である。ホスホチオエート骨格は、「（ｐｓ）」と表され得る。２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエートの付加は、１塩基～１５０塩基に行われ得る。２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエートの付加は、１塩基～４塩基に行われ得る。２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエートの付加は、２塩基に行われ得る。２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエートの付加は、４塩基に行われ得る。改変はトランケーションであってもよい。トランケーションは、５塩基のトランケーションであり得る。場合によっては、改変は、Ｃ末端及びＮ末端のヌクレオチドにあり得る。
改変は、ホスホロチオエート置換であってもよい。場合によっては、天然のホスホジエステル結合は、細胞ヌクレアーゼによる急速な分解を受けやすい場合があり、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合置換を使用したヌクレオチド間結合の改変は、細胞分解による加水分解に対して、より安定であり得る。改変は、ポリ核酸における安定性を増加させ得る。改変は、生物学的活性を強化することもできる。場合によっては、ホスホロチオエートで強化されたＲＮＡポリ核酸は、ＲＮａｓｅ Ａ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、仔ウシ血清ヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを阻害し得る。これらの特性は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでヌクレアーゼへの曝露の確率が高い用途において使用されるＰＳ－ＲＮＡポリ核酸の使用を可能にし得る。例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を、ポリ核酸の５’末端または３’末端の最後の３～５ヌクレオチドの間に導入することができ、これにより、エキソヌクレアーゼ分解が阻害され得る。場合によっては、ホスホロチオエート結合をポリ核酸全体に付加して、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減させることができる。
別の実施形態において、真菌を遺伝子改変することは、ジメチルトリプタミン、プシロシビン、もしくはプシロシンなどのトリプタミン由来物質を増加させるために、真菌、またはその細胞に、（ｉ）少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼ、または少なくとも１つの核局在化シグナルを含む少なくとも１つのＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼをコードする核酸、（ｉｉ）少なくとも１つのガイドＲＮＡまたは少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、及び、任意選択で、（ｉｉｉ）バーコードなどの少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを導入することと、真菌またはその細胞を培養することであって、各ガイドＲＮＡがＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼを染色体配列内の標的化部位に指向し、ここでＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼが二本鎖切断を標的化部位に導入し、染色体配列が改変されるように二本鎖切断がＤＮＡ修復プロセスによって修復されるようにする、培養することとを含み、ここで、標的化部位は、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ、モノオキシゲナーゼ、キナーゼ、デカルボキシラーゼ、推定転写調節因子、及び推定トランスポーターをコードする遺伝子のいずれかに位置し、染色体改変は、前記遺伝子の転写及び／または翻訳を中断または妨害する。
場合によっては、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ解析を行って、操作されたガイドＲＮＡの特異性を決定することができる。ＣＲＩＳＰＲシステムヌクレアーゼによるオフターゲット切断のＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑプロファイリングの一般的機構及びプロトコールは、Ｔｓａｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，“ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ ｅｎａｂｌｅｓ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ，３３：１８７－１９７（２０１５）に記述されている。オフターゲット頻度を次世代シーケンシングによって評価するには、細胞にＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイディングＲＮＡをトランスフェクトすることができる。トランスフェクションの約７２時間後、トランスフェクトされた細胞からゲノムＤＮＡを単離し、潜在的なオフターゲット部位でＰＣＲ増幅することができる。潜在的なオフターゲット部位は、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇデータベース（ＷＧＥ）アルゴリズムを使用して予測することができる。候補オフターゲット部位は、オンターゲット部位との配列相同性に基づいて選定され得る。場合によっては、ｇＲＮＡとゲノム部位との間に約４個以下のミスマッチがある部位を利用することができる。各候補オフターゲット部位について、２つのプライマーペアを設計することができる。ＰＣＲアンプリコンは、未処理（対照）とＣａｓ９／ｇＲＮＡ処理された細胞の両方から得ることができる。ＰＣＲアンプリコンはプールされ得る。ＮＧＳライブラリーは、ＴｒｕＳｅｑ Ｎａｎｏ ＤＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して調製することができる。２５０ｂｐペアエンドワークフローを使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ機で試料を解析することができる。場合によっては、ｇＲＮＡライブラリー１つ当たり約４０００万のマッピング可能なＮＧＳリードが取得され得る。これは、ｇＲＮＡの各候補オフターゲット部位につき約４５０，０００リードの平均数に等しいとみなすことができる。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ媒介性破壊の検出は、あらゆるゲノム遺伝子座で０．１％と同じ低さの頻度であり得る。
コンピュータによる予測を使用すると、標的とされる遺伝子として最も安全な選択肢である可能性が高い候補ｇＲＮＡを選択することができる。次いで、潜在的なオフターゲット部位のコンピュータによる予測によって進められる集中的な手法を使用して、候補ｇＲＮＡを経験的に試験することができる。場合によっては、ｇＲＮＡオフターゲット安全性の評価は、各ｇＲＮＡについてＣＲＩＳＰＲ設計ツールによって予測された潜在的なオフターゲット部位を解析するために、次世代ディープシーケンシング手法を用い得る。場合によっては、ゲノム内の任意の配列（完全にマッチする意図される標的を除く）とのミスマッチが３個未満であるｇＲＮＡが選択され得る。場合によっては、ゲノム内の任意の配列とのミスマッチ（複数可）が５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、または１個未満であるｇＲＮＡが選択され得る。場合によっては、低いオフターゲット可能性の予測と共に候補ｇＲＮＡの推奨を提供する、コンピュータシステムまたはソフトウェアが利用され得る。
場合によっては、潜在的なオフターゲット部位は、ＧＵＩＤＥ－Ｓｅｑ及び標的化ＰＣＲ増幅、ならびに次世代シーケンシングのうちの少なくとも１つによって同定され得る。さらに、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡで処理された細胞などの改変細胞を核型分析に供して、染色体の再編または転座を同定することができる。
ｇＲＮＡは、任意の機能的濃度で導入され得る。例えば、ｇＲＮＡは、１０マイクログラムで細胞に導入され得る。他の場合では、ｇＲＮＡは、０．５マイクログラム～１００マイクログラムで導入されてもよい。ｇＲＮＡは、０．５から、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００マイクログラム導入されてもよい。
ガイディングポリ核酸は、任意の塩基頻度を有し得る。例えば、ガイディングポリ核酸は、２９個のＡ、１７個のＣ、２３個のＧ、２３個のＵ、３個のｍＧ、１個のｍＣ、及び４個のｍＵを有し得る。ガイディングポリ核酸は、約１～約１００ヌクレオチドを有し得る。ガイディングポリ核酸は、約１～３０の単一ポリヌクレオチドを有し得る。ガイディングポリ核酸は、約１～１０、１０～２０、または２０～３０の単一ヌクレオチドを有し得る。
ガイディングポリ核酸は、使用前に同一性及び効力について試験され得る。例えば、同一性及び効力は、分光光度解析、ＲＮＡアガロースゲル解析、ＬＣ－ＭＳ、エンドトキシン解析、及び無菌検査のうちの少なくとも１つを使用して決定され得る。場合によっては、同一性試験は、臨床的／治療的使用に許容されるレベルを決定することができる。例えば、許容される分光光度解析結果は、５．０±０．５ｍｇ／ｍＬで１４±２μＬ／バイアルであり得る。許容される分光光度解析結果は、５．０±０．５ｍｇ／ｍＬで約１０～２０±２μＬ／バイアルまたは約３．０～７．０±０．５ｍｇ／ｍＬで約１０～２０±２μＬ／バイアルであってもよい。ガイディングポリ核酸の許容される臨床的／治療的なサイズは、約１００塩基であり得る。ガイディングポリ核酸の臨床的／治療的なサイズは、約５塩基～約１５０塩基であり得る。ガイディングポリ核酸の臨床的／治療的なサイズは、約２０塩基～約１５０塩基であり得る。ガイディングポリ核酸の臨床的／治療的なサイズは、約４０塩基～約１５０塩基であり得る。ガイディングポリ核酸の臨床的／治療的なサイズは、約６０塩基～約１５０塩基であり得る。ガイディングポリ核酸の臨床的／治療的なサイズは、約８０塩基～約１５０塩基であり得る。ガイディングポリ核酸の臨床的／治療的なサイズは、約１００塩基～約１５０塩基であり得る。ガイディングポリ核酸の臨床的／治療的なサイズは、約１１０塩基～約１５０塩基であり得る。ガイディングポリ核酸の臨床的／治療的なサイズは、約１２０塩基～約１５０塩基であり得る。
場合によっては、ガイディングポリ核酸の質量が決定され得る。質量は、ＬＣ－ＭＳアッセイによって決定することができる。質量は、約３２，４６１．０ａｍｕであり得る。ガイディングポリ核酸は、約３０，０００ａｍｕ～約５０，０００ａｍｕの質量を有し得る。ガイディングポリ核酸は、約３０，０００ａｍｕ～４０，０００ａｍｕ、約４０，０００ａｍｕ～約５０，０００ａｍｕの質量を有し得る。質量は、ガイディングポリ核酸のナトリウム塩のものであってもよい。
場合によっては、ガイディングポリ核酸のエンドトキシンレベルが決定され得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、２ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、１ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床的／治療的に許容されるレベルは、０．５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。
場合によっては、ガイディングポリ核酸に無菌検査を行ってもよい。無菌検査の臨床的／治療的に許容されるレベルは、０であるか、または培養物における増殖がないことによって表され得る。無菌検査の臨床的／治療的に許容されるレベルは、０．５％未満の増殖であり得る。
ガイディングポリ核酸は、種々の方法によって、例えば、自動化された固相合成によってアセンブルされ得る。ポリ核酸は、標準的な固相ＤＮＡ／ＲＮＡ合成を使用して構築することができる。ポリ核酸は、合成手順を使用して構築することもできる。ポリ核酸は、手作業か、または完全に自動化された様式のいずれかで合成することもできる。場合によっては、合成手順は、５’－ヒドロキシルオリゴヌクレオチドを最初に対応する５’－Ｈ－ホスホネートモノエステルに変換してよく、その後にイミダゾールの存在下で酸化して活性化５’－ホスホルイミダゾリデートにし、最後に固体支持体上のピロリン酸と反応させることを含み得る。この手順は、合成の後に、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＳ、またはそれらの任意の組み合わせなどの精製ステップを含んでもよい。
ドナー配列
場合によっては、ドナー配列が、真菌、酵母、植物、またはそれらの一部のゲノムに導入され得る。場合によっては、ドナーは、ゲノム切断に挿入される。いくつかの態様では、ドナーは、標的配列にフランキングする配列との相同性を含む。ドナー配列を導入する方法は、当業者には公知であるが、相同性アームの使用を含み得る。例えば、ドナー配列は、ゲノム切断を含むゲノムの少なくとも一部との相同性アームを含み得る。場合によっては、ドナー配列は、大麻のゲノムまたはアサ植物細胞ゲノムにランダムに挿入される。
場合によっては、ドナー配列は、相同組換えを使用して部位指向性様式で導入され得る。相同組換えは、内在性遺伝子の部位特異的改変を可能にし、したがって、遺伝または獲得された変異が補正され得、及び／または新規の変化がゲノムへと操作され得る。植物における相同組換え及び部位指向性組込みは、例えば、米国特許第５，４５１，５１３号、同第５，５０１，９６７号、及び同第５，５２７，６９５号で考察されている。
いくつかの態様では、ドナー配列は、プロモーター配列を含む。設計された遺伝子産物の発現増加は、プロモーター領域を調整すること、または所望の遺伝子配列の上流により強力なプロモーターを挿入することにより、発現を合成的に増加させることによって達成され得る。いくつかの態様では、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ及び他の植物において高度に機能的な３５ｓ及びＵｂｉ１０などのプロモーターが導入され得る。場合によっては、大麻及び／またはアサにおいて高度に機能的なプロモーターが導入される。
場合によっては、バーコードは、非天然配列を含み得る。いくつかの態様では、バーコードは、天然配列を含む。いくつかの態様では、バーコードは、遺伝子型判定を介したトランスジェニック生物の同定を可能にするために利用され得る。いくつかの態様では、ドナー配列は、マーカーであり得る。選択可能マーカー遺伝子は、例えば、光合成（ａｔｐＢ、ｔｓｃＡ、ｐｓａＡ／Ｂ、ｐｅｔＢ、ｐｅｔＡ、ｙｃｆ３、ｒｐｏＡ、ｒｂｃＬ）、抗生物質抵抗性（ｒｒｎＳ、ｒｒｎＬ、ａａｄＡ、ｎｐｔＩＩ、ａｐｈＡ－６）、除草剤抵抗性（ｐｓｂＡ、ｂａｒ、ＡＨＡＳ（ＡＬＳ）、ＥＰＳＰＳ、ＨＰＰＤ、ｓｕｌ）及び代謝（ＢＡＤＨ、ｃｏｄＡ、ＡＲＧ８、ＡＳＡ２）の各遺伝子を含み得る。細菌のｓｕｌ遺伝子は、除草性スルホンアミド非感受性ジヒドロプテロイン酸シンターゼ活性を有し、タンパク質産物が植物ミトコンドリアに対して標的化される場合の選択可能マーカーとして使用され得る（米国特許第６１２１５１３号）。いくつかの実施形態では、マーカーをコードする配列は、遺伝子改変細胞または生物、例えば本明細書に記載される真菌、酵母、または植物に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、マーカーをコードする組み込まれた配列は、その後、形質転換されたゲノムから除去され得る。マーカーをコードする配列の除去は、マーカーをコードする領域の前及び後のダイレクトリピートの存在によって容易になり得る。マーカーをコードする配列の除去は、オルガネラの内在性相同組換え系を介して、またはｃｒｅ－ｌｏｘもしくはＦＬＰ／ＦＲＴなどの部位特異的リコンビナーゼ系の使用によって起こり得る。
場合によっては、マーカーは、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、または酵素など、検出が可能な標識を指し得る。検出可能マーカーの例は、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）を含むが、これらに限定されない。
選択可能マーカーまたは検出可能マーカーは、通常、細胞、または目的の細胞内部の「タグ」でマーキングされた分子が、多くの場合、特定の条件下で同定されることを可能にする、ＤＮＡセグメントを含む。そのようなマーカーは、ＲＮＡ、ペプチド、もしくはタンパク質の産生から選択されるがこれらに限定されない活性をコードしてもよく、またはマーカーは、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機及び有機化合物もしくは複合体などの結合部位をもたらしてもよい。例として、選択可能マーカーは、制限酵素切断点を含むＤＮＡセグメント、蛍光プローブを含むＤＮＡセグメント、抗生物質、例えばスペクチノマイシン、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、ＢＡＳＴＡ、ネオマイシン－ホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びハイグロマイシン－ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）を含む、さもなければ有毒な化合物に対する抵抗性をもたらす産物をコードするＤＮＡセグメント、目的の植物標的細胞が天然条件下では有しない産物、例えばｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカーなどをコードするＤＮＡセグメント、容易に同定され得る産物、特に光学的に観察可能なマーカー、例えば表現型マーカー、例えば、－ガラクトシダーゼ、ＧＵＳ、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び他の蛍光タンパク質、例えば青色（ＣＦＰ）、黄色（ＹＦＰ）または赤色（ＲＦＰ）蛍光タンパク質、及び表面タンパク質をコードするＤＮＡセグメント（ここで、単一の細胞の代わりに、多数のタイプの組織または細胞を含む複雑な植物標的構造または植物材料または植物が解析され得る場合、高い蛍光強度を呈する蛍光タンパク質は、より深い組織層でも同定され得るので、これらのタンパク質が特に関心対象となる）、ＰＣＲのための新たなプライマー部位、制限エンドヌクレアーゼまたは他のＤＮＡ改変酵素またはエフェクタードメインにより本開示に従って改変することのできないＤＮＡ配列の記録、特定の改変、例えばエピジェネティック改変、例えばメチル化のために使用されるＤＮＡ配列、ならびに本開示に従って好適なＣＲＩＳＰＲシステムによって同定され得るＰＡＭモチーフを有するＤＮＡ配列、ならびにまた内在性植物ゲノム配列に天然に存在し得るようなＰＡＭモチーフを有しないＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されることはない。
一実施形態において、ドナーは、選択可能、スクリーニング可能、もしくはスコア付け可能なマーカー遺伝子、またはその一部を含む。場合によっては、マーカーは、再生可能な遺伝子改変生物において機能して、さもなければ有毒な化合物に対する抵抗性を前記生物の組織に付与する化合物を産生させ得る、選択またはスクリーニングデバイスとして働く。選択可能、スクリーニング可能、またはスコア付け可能なマーカーとして使用される目的の遺伝子は、とりわけ、ｇｕｓ、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｘ）、カナマイシン（Ｄｅｋｅｙｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８９）もしくはスペクチノマイシン（例えばスペクチノマイシンアミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）のような抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子、グリホセート（例えば５－エノールピルビルシキミ酸－３－ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）；グリホセートオキシドレダクターゼ（ＧＯＸ）；グリホセートデカルボキシラーゼ；またはグリホセートＮ－アセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）、ダラポン（例えば、２，２－ジクロロプロピオン酸に対する耐性を付与する２，２－ジクロロプロピオン酸デハロゲナーゼをコードするｄｅｈＩ、ブロモキシニル（ブロモキシニルに対する耐性を付与するハロアリールニトリラーゼ（Ｂｘｎ）、スルホニル系除草剤（例えば、スルホニル尿素、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジルオキシ安息香酸及びフタリドなどのアセト乳酸シンターゼ阻害剤に対する耐性を付与するアセトヒドロキシ酸シンターゼまたはアセト乳酸シンターゼ；ＡＬＳ、ＧＳＴ－ＩＩをコードする）、ビアラホスもしくはホスフィノトリシンもしくは誘導体（例えばホスフィノトリシンもしくはグルホシネートに対する耐性を付与するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒ）、アトラジン（ＧＳＴ－ＩＩＩをコードする）、ジカンバ（ジカンバモノオキシゲナーゼ）、またはセトキシジム（シクロヘキサンジオン（セトキシジム）及びアリールオキシフェノキシプロピオネート（ハロキシホップ）に対する耐性を付与する改変されたアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼのような、除草剤に対する耐性を与える酵素をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。正の選択機構（例えば、マンノースの存在下での生育を可能にするＥ．ｃｏｌｉのｍａｎＡ遺伝子の使用）、及び二重選択（例えば、７５～１００ｐｐｍのスペクチノマイシン及び３～１０ｐｐｍのグルホシネート、または７５ｐｐｍのスペクチノマイシン及び０．２～０．２５ｐｐｍのジカンバの同時使用）を含め、他の選択手順を実施することもできる。約２５～１０００ｐｐｍ、例えば約１５０ｐｐｍの濃度でのスペクチノマイシンの使用も想定され得る。ある実施形態において、検出可能マーカーは、潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームによって結合され得る。
場合によっては、ドナーポリヌクレオチドは、標的配列にフランキングする配列との相同性を含む。場合によっては、ドナーポリヌクレオチドは、例えば、プシロシビンではないトリプタミンの合成を遮断するよう、本明細書で提供される遺伝子に終止コドンを導入する。場合によっては、ドナーポリヌクレオチドは、バーコード、レポーター、または選択マーカーを含む。
形質転換
適切な形質転換技法は、真菌プロトプラストの電気穿孔、リポソーム媒介性形質転換、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介性形質転換、ウイルスを使用した形質転換、細胞の微量注入、細胞の微粒子銃照射、減圧浸潤、及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆｉｃｉｅｎｓ媒介性形質転換を含み得るが、これらに限定されない。形質転換は、配列の安定発現または一過性発現を引き起こす様式でヌクレオチド配列を細胞に導入することを意味する。
形質転換後、真菌または他の生物は、形質転換ベクターに組み込まれた優性の選択可能マーカーを使用して選択され得る。ある特定の実施形態では、そのようなマーカーは、形質転換した真菌または他の生物に抗生物質または除草剤への抵抗性を付与し、形質転換体の選択は、適切な濃度の抗生物質または除草剤に真菌及び他の生物を曝露することによって達成され得る。形質転換した真菌または他の生物を選択し、成熟するまで生育した後、改変された形質を示す真菌及び他の生物が同定される。改変される形質は、上述の形質のいずれであってもよい。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルまたは活性は、ノーザンブロット、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡ ｓｅｑもしくはマイクロアレイを使用したｍＲＮＡ発現の解析、またはイムノブロットもしくはウエスタンブロットもしくはゲルシフトアッセイを使用したタンパク質発現の解析によって決定することができる。
本発明で使用するための真菌または他の細胞の形質転換のために好適な方法は、プロトプラストのＰＥＧ媒介性形質転換、乾燥／阻害媒介性ＤＮＡ取り込み、電気穿孔、炭化ケイ素繊維との撹拌、アグロバクテリウム媒介性形質転換、及びＤＮＡ被覆粒子の加速などによるＤＮＡの直接送達のような、ＤＮＡを細胞に導入することのできる実質的にあらゆる方法を含むと考えられる。これらのような技法の適用により、実質的にあらゆる真菌種の細胞を安定に形質転換させ、これらの細胞をトランスジェニック真菌へと発達させることができる。
アグロバクテリウム媒介性形質転換
アグロバクテリウム媒介性移入は、ＤＮＡを真菌組織全体に導入することにより、プロトプラストからインタクトな真菌を再生する必要を回避することができるため、遺伝子を真菌細胞に導入するために広く適用可能なシステムである。例えばＣＲＩＳＰＲシステムまたはドナー配列を含む、ＤＮＡを真菌細胞に導入するための、アグロバクテリウム媒介性真菌組込みベクターの使用は、当分野において周知である。
さらに、アグロバクテリウム媒介性形質転換は、双子葉類植物といった他の生物において効率的であり得、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、タバコ、トマト、アルファルファ、及びジャガイモを含む双子葉類の形質転換に使用することができる。実際、アグロバクテリウム媒介性形質転換は、双子葉類植物において、常法として長年使用されている。場合によっては、アグロバクテリウム媒介性形質転換は、単子葉類植物において使用され得る。例えば、アグロバクテリウム媒介性形質転換技法は、現在、イネ、コムギ、オオムギ、アルファルファ、及びトウモロコシに適用されている。
現代のアグロバクテリウム形質転換ベクターは、アグロバクテリウムだけでなくＥ．ｃｏｌｉにおける複製も可能であり、前述のように簡便な操作を可能にする。さらに、アグロバクテリウム媒介性遺伝子移入のためのベクターにおける最近の技術的進歩により、ベクター中の遺伝子及び制限部位の配置が改良され、様々なポリペプチドコード遺伝子を発現することが可能なベクターの構築が容易になっている。いくつかの態様では、ベクターは、挿入されたポリペプチドコード遺伝子の直接発現のための、プロモーター及びポリアデニル化部位にフランキングされた簡便なマルチリンカー領域を有することができ、本明細書に記載の目的に好適である。さらに、武装型（ａｒｍｅｄ）と非武装型（ｄｉｓａｒｍｅｄ）の両方のＴｉ遺伝子を含むアグロバクテリウムを形質転換のために使用することができる。
電気穿孔
いくつかの態様では、真菌、酵母、植物、またはそれらの細胞は、電気穿孔を使用して改変され得る。電気穿孔によって形質転換を行うためには、細胞もしくは胚形成カルスの懸濁培養物などの脆弱な組織を用いてもよく、または代替的に、未熟胚もしくは他の器質化組織を直接形質転換してもよい。この技法では、選定された細胞の細胞壁を、ペクチン分解酵素（ペクトリアーゼ）に曝露すること、または制御された様式で機械的に傷つけることにより、部分的に分解する。
任意のトランスフェクションシステムを利用することができる。場合によっては、Ｎｅｏｎトランスフェクションシステムが利用され得る。Ｎｅｏｎシステムは、中央制御モジュールと、長さ３フィートの電気コードによって中央制御モジュールに接続され得る電気穿孔チャンバと、専用ピペットとを備える、３コンポーネント電気穿孔装置であり得る。場合によっては、専用ピペットは、交換可能及び／または使い捨ての滅菌チップを備えていてもよい。場合によっては、電気穿孔チャンバは、交換可能／使い捨ての滅菌電気穿孔キュベットを備えていてもよい。場合によっては、Ｎｅｏｎシステムなどのシステムの製造元により供給される標準的な電気穿孔緩衝液を、ＧＭＰ認定済みの溶液及び緩衝液に置き換えてもよい。場合によっては、標準的な電気穿孔緩衝液を、ＧＭＰグレードのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に置き換えてもよい。試料の電気穿孔の開始前に、制御モジュールに自己診断システムのチェックを行って、Ｎｅｏｎシステムが適切に機能していることを確かめることができる。場合によっては、トランスフェクションは、ｃＧＭＰ施設において、クラス１０，０００クリーンルーム内のクラス１，０００バイオセーフティキャビネットで行われ得る。場合によっては、電気穿孔パルス電圧を変更して、トランスフェクション効率及び／または細胞生存率を最適化することができる。場合によっては、電気穿孔パルス幅を変更して、トランスフェクション効率及び／または細胞生存率を最適化することができる。場合によっては、電気穿孔パルス数を変更して、トランスフェクション効率及び／または細胞生存率を最適化することができる。場合によっては、電気穿孔は、単一のパルスを含み得る。場合によっては、電気穿孔は、１つより多くのパルスを含み得る。場合によっては、電気穿孔は、２パルス、３パルス、４パルス、５パルス６パルス、７パルス、８パルス、９パルス、または１０以上のパルスを含み得る。
いくつかの態様では、真菌及び／または植物のプロトプラストが電気穿孔形質転換に使用され得る。
微粒子銃照射
本発明に従って形質転換ＤＮＡセグメントを真菌細胞及び他の生物に由来する細胞に送達する別の方法は、微粒子銃照射である。この方法では、粒子が核酸で被覆され、推進力によって細胞内に送達され得る。例示的な粒子は、タングステン、白金、そして好ましくは金からなるものを含む。いくつかの事例では、微粒子銃照射を使用してレシピエント細胞にＤＮＡを送達するために、金属粒子へのＤＮＡ沈着は必要ないことが想定される。しかしながら、粒子は、ＤＮＡで被覆されるのではなく、ＤＮＡを含んでもよいことが想定される。いくつかの態様では、ＤＮＡ被覆粒子は、粒子照射を介したＤＮＡ送達のレベルを上昇させ得る。照射のためには、懸濁液中の細胞を、フィルタまたは固体培養培地上で濃縮する。代替的に、未熟胚または他の標的細胞を固体培養培地上に配置してもよい。照射される細胞は、マクロプロジェクタイル停止プレートの下方に適切な距離で位置付けられる。
加速によってＤＮＡを真菌細胞内に送達する方法の説明的実施形態は、バイオリスティック粒子送達システムであり、これは、ＤＮＡまたは細胞で被覆された粒子を、ステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーンなどのスクリーンに通し、懸濁培養した単子葉植物細胞で覆われたフィルタ表面まで推進することができる。スクリーンは、粒子が大きな凝集体としてレシピエント細胞に送達されないように、粒子を分散させる。
他の形質転換法
さらなる形質転換法は、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、電気穿孔、及びこれらの処理の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
プロトプラストから首尾よく再生できない真菌を形質転換するには、インタクトな細胞または組織にＤＮＡを導入する他の方法を利用することができる。例えば、未熟胚または外植体からの植物の再生は、前述のように行うことができる。また、炭化ケイ素繊維媒介性形質転換は、プロトプラスティングありまたはなしで使用され得る。この技法を用いる形質転換は、ＤＮＡ溶液中で細胞と一緒に炭化ケイ素繊維を撹拌することによって達成され得る。細胞が穿刺されると、ＤＮＡが受動的に進入する。
場合によっては、ゲノム編集のための開始時の細胞密度を変更して、編集効率及び／または細胞生存率を最適化することができる。場合によっては、ゲノム編集のための開始時の細胞密度は、約１×１０５細胞未満であり得る。場合によっては、電気穿孔のための開始時の細胞密度は、少なくとも約１×１０５細胞、少なくとも約２×１０５細胞、少なくとも約３×１０５細胞、少なくとも約４×１０５細胞、少なくとも約５×１０５細胞、少なくとも約６×１０５細胞、少なくとも約７×１０５細胞、少なくとも約８×１０５細胞、少なくとも約９×１０５細胞、少なくとも約１×１０６細胞、少なくとも約１．５×１０６細胞、少なくとも約２×１０６細胞、少なくとも約２．５×１０６細胞、少なくとも約３×１０６細胞、少なくとも約３．５×１０６細胞、少なくとも約４×１０６細胞、少なくとも約４．５×１０６細胞、少なくとも約５×１０６細胞、少なくとも約５．５×１０６細胞、少なくとも約６×１０６細胞、少なくとも約６．５×１０６細胞、少なくとも約７×１０６細胞、少なくとも約７．５×１０６細胞、少なくとも約８×１０６細胞、少なくとも約８．５×１０６細胞、少なくとも約９×１０６細胞、少なくとも約９．５×１０６細胞、少なくとも約１×１０７細胞、少なくとも約１．２×１０７細胞、少なくとも約１．４×１０７細胞、少なくとも約１．６×１０７細胞、少なくとも約１．８×１０７細胞、少なくとも約２×１０７細胞、少なくとも約２．２×１０７細胞、少なくとも約２．４×１０７細胞、少なくとも約２．６×１０７細胞、少なくとも約２．８×１０７細胞、少なくとも約３×１０７細胞、少なくとも約３．２×１０７細胞、少なくとも約３．４×１０７細胞、少なくとも約３．６×１０７細胞、少なくとも約３．８×１０７細胞、少なくとも約４×１０７細胞、少なくとも約４．２×１０７細胞、少なくとも約４．４×１０７細胞、少なくとも約４．６×１０７細胞、少なくとも約４．８×１０７細胞、または少なくとも約５×１０７細胞であり得る。
本明細書に記載の核酸送達プラットフォームのいずれかによる、植物、またはその細胞を含むがこれに限定されない任意の部分のゲノム破壊の効率は、核酸またはタンパク質解析により測定した場合、約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、または最大約１００％の、遺伝子またはその一部の破壊をもたらし得る。
生物の育種
いくつかの実施形態では、本開示の真菌、酵母、または植物は、新たな植物変種を作り出すために使用され得る。いくつかの実施形態では、植物は、所望の表現型を有する、新たな、独特の、かつ優れた変種またはハイブリッドを発生させるために使用される。いくつかの実施形態では、選択方法、例えば、分子マーカー支援選択を、育種方法と組み合わせて、プロセスを加速させることができる。いくつかの実施形態では、方法は、（ｉ）ドナーとして発現カセットを含む本明細書で提供される任意の生物を、レシピエント生物系と交雑して、ＦＩ集団を作出することと、（ｉｉ）発現カセットを有する子孫を選択することとを含む。任意選択で、子孫は、目的の遺伝子の発現を試験することにより、さらに選択され得る。いくつかの実施形態では、ドナー生物の完全な染色体が伝達される。例えば、発現カセットを有するトランスジェニック生物は、他花受粉において雄親または雌親として働き、ドナーから導入遺伝子を受けて子孫を作り出すことができ、これにより、発現カセットを有する子孫が生成される。発現カセットを有する生物を作り出す方法では、プロトプラスト融合を使用して、ドナーからレシピエントへと導入遺伝子を移入することもできる。プロトプラスト融合とは、２つ以上のプロトプラスト（細胞壁が酵素処理によって除去されている細胞）が、体細胞ハイブリダイゼーションなどの誘導性または自発性の結合により、単一の二核性または多核性細胞を作り出すことである。天然には異種交配できない種でも得ることのできる融合細胞は、形質の望ましい組み合わせを呈するハイブリッド生物へと組織培養される。より具体的には、発現カセットを有する生物から、第１のプロトプラストを得ることができる。第２のプロトプラストは、例えば、疾患抵抗性、昆虫抵抗性などだがこれらに限定されない、商業的に望ましい特性を含む、第２の生物から、任意選択で別の種もしくは変種から、または同じ種もしくは変種から、得ることができる。プロトプラストは次いで、交雑種を作り出すことが当分野で知られている従来のプロトプラスト融合手順を使用して融合される。代替的に、胚救出を用いて、発現カセットをドナーからレシピエントへと伝達してもよい。胚救出は、胚を単離し、それを組織培養する手順として使用され得る。
場合によっては、集団改良法が利用され得る。集団改良法は、通常は集団選択と呼ばれる、純粋に表現型選択に基づくものと、後代検定による選択に基づくものとの２つの群に必然的に分類される。集団間改良は、遺伝子を１つの集団から別の集団に伝達させる開放型育種集団の概念を利用する。選択を適用して、両方の起源からの望ましい形質を含む植物を単離することにより、１つ（または場合により両方）の集団（複数可）を改良することができる。
別の態様において、集団選択が利用され得る。集団選択では、望ましい個々の植物を選定し、採取し、後代検定なしで種子を複合させて、次の世代を作り出す。選択は母親のみに基づき、受粉は制御されないため、集団選択は、要するに選択を伴う任意交配の一形態である。本明細書に記載のとおり、集団選択の目的は、集団内の優れた遺伝子型の割合を増加させることである。集団選択が使用される場合はあるが、後代検定は、運用が単純であり、その目的、すなわち合成における全体的な複合能力の活用との関連性が明らかであるため、多交雑では一般的に好まれる。
いくつかの実施形態では、育種は、分子マーカーを利用し得る。分子マーカーは、本出願の植物のゲノムに基づいて設計及び作製される。いくつかの実施形態では、分子マーカーは、アイソザイム電気泳動、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ－ＰＣＲ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）、配列特性増幅領域（ＳＣＡＲ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）、及びマイクロサテライトとも称される単純反復配列（ＳＳＲ）などから選択される。分子マーカーの開発方法及びそれらの用途は、Ａｖｉｓｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ，ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ，ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，２００４，ＩＳＢＮ ０８７８９３０４１８，９７８０８７８９３０４１８）、Ｓｎｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００４，ＩＳＢＮ１４０２０１９１１４，９７８１４０２０１９１１１）、及びＶｉｅｎｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００３）によって説明されており、これらは各々、あらゆる目的のために、参照により全体として本明細書に援用される。分子マーカーは、分子マーカー支援育種において使用することができる。本明細書では、トランスジェニック真菌を生成する方法も提供され得る。いくつかの態様では、本明細書で提供される方法は、（ａ）エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリペプチドと真菌細胞を接触させることを含み得る。場合によっては、エンドヌクレアーゼは、真菌細胞のゲノムに遺伝子改変を導入し、遺伝子改変がない同等の対照における、式Ｉ～ＩＶ、それらの誘導体または類似体のうちの１つの量と比較して、同じ化合物の量を増加させる。いくつかの態様では、方法は、先述のように遺伝子改変されている真菌細胞を培養して、トランスジェニック真菌を生成することをさらに含み得る。トランスジェニック真菌を作製する方法は、電気穿孔、アグロバクテリウム媒介性形質転換、バイオリスティック粒子照射、またはプロトプラスト形質転換を含み得る。いくつかの態様では、方法は、真菌細胞を培養して、真菌を生成することをさらに含み得る。
いくつかの態様では、本明細書では、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリペプチドと植物細胞を接触させることを含む、トランスジェニック植物を生成する方法も提供され得る。エンドヌクレアーゼは、遺伝子改変のない同等の対照におけるプシロシビン、プシロシン、もしくはジメチルトリプタミン（ＤＭＴ）、それらの誘導体、または類似体の量と比較して、同じ化合物の量を増加させる遺伝子改変を導入し得る。
いくつかの態様では、本明細書では、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリペプチドと動物細胞を接触させることを含む、トランスジェニック動物を生成する方法も提供され得る。エンドヌクレアーゼは、遺伝子改変のない同等の対照におけるプシロシビン、プシロシン、もしくはジメチルトリプタミン（ＤＭＴ）、それらの誘導体、または類似体の量と比較して、同じ化合物の量を増加させる遺伝子改変を導入し得る。
いくつかの態様では、本明細書では、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリペプチドと昆虫細胞を接触させることを含む、トランスジェニック昆虫を生成する方法も提供され得る。エンドヌクレアーゼは、遺伝子改変のない同等の対照におけるプシロシビン、プシロシン、もしくはジメチルトリプタミン（ＤＭＴ）、それらの誘導体、または類似体の量と比較して、同じ化合物の量を増加させる遺伝子改変を導入し得る。
いくつかの態様では、本明細書では、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリペプチドと酵母細胞を接触させることを含む、トランスジェニック酵母を生成する方法も提供され得る。エンドヌクレアーゼは、遺伝子改変のない同等の対照におけるプシロシビン、プシロシン、もしくはジメチルトリプタミン（ＤＭＴ）、それらの誘導体、または類似体の量と比較して、同じ化合物の量を増加させる遺伝子改変を導入し得る。
いくつかの態様では、本明細書では、エンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼをコードするポリペプチドとＥ．ｃｏｌｉ細胞を接触させることを含む、トランスジェニックＥ．ｃｏｌｉを生成する方法も提供され得る。エンドヌクレアーゼは、遺伝子改変のない同等の対照におけるプシロシビン、プシロシン、もしくはジメチルトリプタミン（ＤＭＴ）、それらの誘導体、または類似体の量と比較して、同じ化合物の量を増加させる遺伝子改変を導入し得る。
真菌細胞ゲノムの改変を含む方法は、ゲノム改変がない同等の対照と比較して、トランスジェニック真菌中の乾燥重量で測定した場合、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または最大約８０％多くの
Figure 2022550463000022
 をもたらし得る。さらに、改変を含む方法は、改変がない同等の対照と比較して、トランスジェニック中の乾燥重量で測定した場合、約１％から、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、１００％、または最大約２００％多くの
Figure 2022550463000023
 をもたらすこともできる。さらに、改変を含む方法は、改変がない同等の対照と比較して、トランスジェニック中の乾燥重量で測定した場合、約１％から、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、８０％、９０％、１００％、または最大約２００％多くのプシロシビンまたはプシロシンをもたらすこともできる。
本明細書では、遺伝子の破壊を含む遺伝子改変細胞であって、遺伝子の破壊は、前記遺伝子改変がない同等の対照細胞における化合物
Figure 2022550463000024
 その誘導体または類似体の量と比較して、同じ化合物の量を増加させる、遺伝子改変細胞も提供され得る。さらに、本明細書では、遺伝子の破壊を含む遺伝子改変細胞であって、遺伝子の破壊は、前記遺伝子改変がない同等の対照細胞における化合物
Figure 2022550463000025
 その誘導体または類似体の量と比較して、同じ化合物の量を増加させる、遺伝子改変細胞も提供され得る。さらに、本明細書では、遺伝子の破壊を含む遺伝子改変細胞であって、遺伝子の破壊は、前記遺伝子改変がない同等の対照細胞におけるプシロシビン及び／またはプシロシン、その誘導体または類似体の量と比較して、同じ化合物の量を増加させる、遺伝子改変細胞も提供され得る。代替的に、遺伝子改変細胞は、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、動物細胞、または昆虫細胞である。
さらに、本明細書では、遺伝子改変を導入することが可能なエンドヌクレアーゼまたは前記エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記遺伝子改変は、前記遺伝子改変がない同等の対照細胞と比較して、プシロシビンもしくはプシロシン、それらの誘導体または類似体の量を増加させる、組成物が提供され得る。
プシロシビン合成遺伝子導入遺伝子方法及び組成物
本明細書では、プシロシビン合成遺伝子でキノコを形質転換する方法が提供され得る。いくつかの実施形態では、４つの主要なプシロシビン合成遺伝子のコード配列が合成され、３５Ｓプロモーターの制御下の過剰発現ベクター系ｐＧＷＢ５にクローニングされる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子の発現を駆動する異なるプロモーターを含む追加のベクターも作り出される（Ｇｐｄ、ＥＦ１ａ、及びアクチンを含む）。
場合によっては、ｐＧＷＢ５を使用して担子菌を形質転換し、形質転換効率を試験し、プロトコールを策定する。場合によっては、形質転換は、プシロシビン産生の増加の可能性を観察するために、異なるＰｓｉ遺伝子を個別に、かつ組み合わせて含む。場合によっては、ポリシストロニックベクター内でタンデム状態の４つのＰｓｉ遺伝子のオールインワン発現ベクターを生成し、試験する。
いくつかの実施形態では、異なる基質でＰｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓの繁殖及び増殖を可能にして、成熟したキノコの子実体と菌糸体の両方を生成する。いくつかの実施形態では、キノコのひだから組織を抽出し、アグロバクテリウム媒介性形質転換によってＰｓｉ遺伝子の形質転換を行う。いくつかの実施形態では、プロトプラストを菌糸体から生成し、菌糸体のアグロバクテリウム媒介性形質転換と共に、Ｐｓｉ遺伝子のＰＥＧ媒介性形質転換を行う。いくつかの実施形態では、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓを、ＰＤＡ寒天中またはオオムギ－パーライトの堆肥中で、室温で７日間増殖させる。場合によっては、菌糸体及び子実体を採取し、形質転換の前に組織抽出及び細胞単離を行う。
いくつかの実施形態では、Ｐｓｉ遺伝子過剰発現は、広く使用されている植物過剰発現プロモーターである３５Ｓプロモーターと、２つの真菌特異的過剰発現プロモーターであるＧＰＤ及びＣｃＤＥＤ１という、２種類の特異なプロモーターの制御下にある（表４、図３、図４）。
Figure 2022550463000026
いくつかの実施形態では、ＰｓｉＤ遺伝子過剰発現は、３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＤ遺伝子を発現するベクターを含む（表５：配列番号１８、１７，６４７ｂｐ；図３Ａ）。いくつかの実施形態では、ＰｓｉＨ遺伝子過剰発現は、３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＨ遺伝子を発現するベクターを含む（表５：配列番号１７、１８，４９４ｂｐ；図３Ｂ）。いくつかの実施形態では、ＰｓｉＫ遺伝子過剰発現は、３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＫ遺伝子を発現するベクターを含む（表５：配列番号１６、１７，４２０ｂｐ；図３Ｃ）。いくつかの実施形態では、ＰｓｉＭ遺伝子過剰発現は、３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＭ遺伝子を発現するベクターを含む（表５：配列番号１５、１７，２６７ｂｐ；図３Ｄ）。
いくつかの実施形態では、Ｐｓｉ遺伝子過剰発現は、ＧｃＤＥＤ１プロモーターの制御下でＰｓｉ遺伝子を発現するベクターを含む（表５：配列番号１９、９，４６２ｂｐ；図４Ａ）。いくつかの実施形態では、Ｐｓｉ遺伝子過剰発現は、ＧＰＤプロモーターの制御下でＰｓｉ遺伝子を発現するベクターを含む（表５：配列番号２０、８，０６７ｂｐ；図４Ｂ）。
医薬組成物及び栄養補給組成物ならびに方法
本明細書では、本明細書に記載される遺伝子改変細胞、生物、真菌、もしくは植物、またはそれらの抽出物、誘導体、もしくは生成物を含む医薬組成物または栄養補給組成物が提供され得る。本明細書では、薬学的または栄養補給的試薬、それを使用する方法、及び本明細書に記載される遺伝子改変細胞、生物、真菌、もしくは植物、またはそれらの抽出物もしくは生成物を含む医薬組成物または栄養補給組成物を作製する方法も提供され得る。本明細書では、本明細書に記載される、医薬及び栄養補給に好適な細胞、生物、もしくは植物、またはそれらの抽出物、誘導体、もしくは生成物も提供される。
場合によっては、本明細書に記載される遺伝子改変細胞、生物、真菌、もしくは植物、またはそれらの抽出物もしくは生成物は、医薬品または栄養補給剤として使用され得る。場合によっては、かかる医薬品または栄養補給剤を含む組成物は、抑うつ、不安、外傷後ストレス、耽溺、または喫煙中断などの中断に関連する副作用、及びがんに関連する心理的苦痛を含む心理的苦痛などの状態または状態に関連する症状を治療または安定化するために使用され得る。本明細書に記載される特異的に遺伝子改変された細胞、生物、真菌、もしくは植物、またはそれらの抽出物、誘導体、もしくは生成物は、精神的障害及び状態に関連する様々な症状を軽減するために使用され得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞、生物、もしくは植物、またはそれらの抽出物もしくは生成物は、特定の症状を治療するために使用され得る。例えば、疼痛、悪心、体重減少、消耗、多発性硬化症、アレルギー、感染、血管収縮神経、抑うつ、片頭痛、高血圧、卒中後の神経保護、ならびに腫瘍成長の阻害、血管新生の阻害、ならびに転移、抗酸化剤、及び神経保護薬の阻害。いくつかの態様では、本明細書に記載される細胞、生物、もしくは植物、またはそれらの抽出物もしくは生成物は、さらなる症状を治療するために使用され得る。例えば、多発性硬化症に特徴的なものを含む持続性筋痙攣、重度関節炎、末梢性ニューロパチー、難治性疼痛、片頭痛、終末期介護を必要とする末期疾患、難治性頭痛を伴う水頭症、難治性頭痛症候群、神経障害性顔面痛、帯状疱疹、慢性非悪性疼痛、灼熱痛、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、膀胱痛、ミオクローヌス、脳振盪後症候群、残存肢痛、閉塞性睡眠時無呼吸、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）、眼圧亢進、オピオイドもしくはオピエート退薬症状、及び／または食欲喪失。
場合によっては、本明細書に記載される細胞、生物、もしくは植物、またはそれらの抽出物もしくは生成物は、フラボノイド、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、及びフィトステロール（例えば、アピゲニン、ケルセチン、カンフラビンＡ、ベータ－シトステロールなど）を含む、他の薬学的または栄養補給的に関連性のある化合物及び抽出物も含み得る。
場合によっては、その抽出物または生成物は、プシロシベン、ジメチルトリプタミン、またはプシロセンを保存する抽出を含む方法に供され得る。本開示の抽出物は、吸入（燃焼、気化、及び噴霧を介する）、口内での口腔吸収、経口投与、及び局所適用送達方法を介する、ヒトまたは動物による摂取のための生成物を作り出すよう設計されている。本開示は、乾燥している採取後の植物または真菌が、５、１０、または１５％の水分重量に達した時点で抽出することにより、目的の化合物を抽出する最適化された方法を教示する。茎は、通常、依然として「冷たく」、蒸発の発生から「ゴム状」である。この時間枠は（またはプロセス中のこの時点で凍結された場合）、抽出器が蒸発による活性薬剤の損失を最小限に抑えることを可能にする。冷涼／緩徐、乾燥と、エッセンシャルオイルの保存とは、直接相関している。よって、乾燥する速度が速すぎる、または暑すぎる条件、または単純に乾燥しすぎる（１０％未満のＨ２Ｏ）花におけるＥＯ損失と直接相関している。本明細書に記載される細胞、生物、もしくは植物、またはそれらの抽出物もしくは生成物の化学的抽出は、様々な段階で、異なる圧力及び温度で極性及び非極性溶剤を用いて達成することができ、生成物の製剤において個別にまたは組み合わせて使用される、香味、芳香、または薬理学的価値のある他の化合物が選択的または包括的に抽出される。抽出物を成形して、単一用量または複数用量のパッケージ、例えば、ダブ、ペレット、及びロードへと形成することができる。本発明者らの品種の選択的抽出に用いられる溶剤は、水、二酸化炭素、１，１，１，２－テトラフルオロエタン、ブタン、プロパン、エタノール、イソプロピルアルコール、ヘキサン、及びリモネンの組み合わせまたは系列を含み得る。本開示の抽出物を、抽出物に対する目的の純粋化合物、例えばカンナビノイドまたはテルペンと組み合わせて、結果として得られる製剤の芳香、香味、または薬理をさらに向上または改変させることもできる。いくつかの実施形態では、抽出物にテルペンまたはカンナビノイドを補って、抽出プロセス中のこれらの化合物の損失を補正する。
いくつかの態様では、本開示の遺伝子改変生物、誘導体、または抽出物は、気化、電子タバコ用のｅジュースもしくはチンキの生産、または食用品、バーム、もしくは局所塗布剤といった他の摂取可能な生成物の生産のために使用され得る。ある態様において、本明細書で提供される改変された組成物は、サプリメント、例えば栄養補助食品として使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞、生物、もしくは植物、またはそれらの抽出物もしくは生成物は、食用品を作製するために使用され得る。食用レシピは、カンナビノイド及びテルペンの抽出から始めることができ、これらを次いで様々な食用品レシピの成分として使用する。食用品のための抽出方法は、料理油、乳汁、クリーム、バーム、小麦粉、及びバターへの抽出を含む。脂質が豊富な抽出媒体／食用品は、血流への吸収を促進すると考えられている。脂質は、本明細書で提供される様々な組成物と組み合わせて賦形剤として利用され得る。他の態様では、本明細書で提供される組成物は、経口形態、経皮形態、油製剤、食用品、もしくは食品基質、水性分散液、エマルション、溶液、懸濁液、エリキシル剤、ゲル、シロップ、エアロゾル、ミスト、粉末、錠剤、舐剤、ゲル、ローション、ペースト、製剤スティック、バーム、クリーム、または軟膏を含み得る。
本明細書では、本明細書で提供される組成物を含むキットも提供される。キットは、パッケージング、説明書、及び本明細書で提供される様々な組成物を含み得る。いくつかの態様では、キットは、鉢、土壌、肥料、水、及び培養ツールなど、本明細書で提供される様々な植物及び植物の一部を生成するために使用される追加の組成物を含むこともできる。
本開示の好ましい実施形態を示し、本明細書に記載しているが、そのような実施形態が、例示として提供されるにすぎないことは当業者に明らかである。そして、当業者は、本開示から逸脱せずに、数多くの変形、変更、及び置換を思いつくであろう。本開示を実施する際には、本明細書に記載されている本開示の実施形態に対する様々な代替態様を用いてよいことを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの均等物がそれにより包含されることが意図されている。
実施例１：Ｐｓｌｉｏｃｙｂｅ ＣｕｂｅｎｓｉｓにおいてＰｓｉ遺伝子を過剰発現させる方式
ステップ１．プシロシビン経路発現ベクターを構築する。
強度の異なる様々なプロモーターを有する発現ベクターのパネルを構築する。いくつかのプロモーターは、キノコに特異的であり、他のプロモーターは、高発現植物系などに由来する（図５Ａ）。次いで、これらの発現ベクターからアグロバクテリウムを生成する。
ステップ２．形質転換のためのキノコ材料を調製する。
実施例３～７に示すように、形質転換するために、プロトプラスト、分生子、ひだ組織、及び菌糸体を単離した。適切なプロトコールの選択は、形質転換させるキノコに応じる。ここでは、実施例３～５及び図５Ｂに例示するように、プロトプラスト及び抽出物のひだ組織を単離した。プロトプラストは実施例４に示すように菌糸体から抽出した。アグロバクテリウム共培養を使用するひだ組織の形質転換の方法は、実施例６に示す。
ステップ３．形質転換。
様々なプロトコールを使用し、ステップ２の培養したプロトプラストに、ステップ１のプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。実施例３～５を参照されたい。さらに、様々なプロトコールを使用し、ステップ２のひだ組織を、ステップ１のアグロバクテリウムで形質転換した。実施例６～７を参照されたい。図５Ｃに示すように、プラスミドＤＮＡまたはアグロバクテリウムが組み込まれた形質転換体を選択する。
ステップ４．再生。
図５Ｄに示すように、ステップ３の形質転換体から成体キノコを再生する。
ステップ５．プシロシビン解析。
遺伝子改変キノコのプシロシビン含有量を、図５Ｅに示すように、ガスクロマトグラフィー／質量分析によって解析する。プシロシビンは、未改変のＰ．Ｃｕｂｅｎｓｉｓの乾燥重量の０．６３％を占める。遺伝子操作の目的は、プシロシビンの量を６％超に増加させることである。
実施例２：Ｐｓｉ遺伝子を過剰発現するベクター構築物
４つの主要なプシロシビン合成遺伝子（ｐｓｉＤ／ｐｓｉＨ／ｐｓｉＫ／ｐｓｉＭ）のコード配列を合成し、３５Ｓプロモーターの制御下の過剰発現ベクター系（ｐＧＷＢ５）にクローニングした。３５Ｓプロモーターは、広く使用されている植物過剰発現プロモーターである。表４を参照されたい。例えば、ＰｓｉＤ遺伝子は、３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＤ遺伝子を発現するベクター（表５：配列番号１８、１７，６４７ｂｐ；図３Ａ）にクローニングし、ＰｓｉＨ遺伝子は、３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＨ遺伝子を発現するベクター（表５：配列番号１７、１８，４９４ｂｐ；図３Ｂ）にクローニングし、ＰｓｉＫ遺伝子は、３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＫ遺伝子を発現するベクター（表５：配列番号１６、１７，４２０ｂｐ；図３Ｃ）にクローニングし、ＰｓｉＭ遺伝子は、３５Ｓプロモーターの制御下でＰｓｉＭ遺伝子を発現するベクター（表５：配列番号１５、１７，２６７ｂｐ；図３Ｄ）にクローニングした。
さらに、ポリシストロニックベクター内でタンデム状態の４つのＰｓｉ遺伝子のオールインワン発現ベクターも生成し、そして試験する。
異なるプロモーター（ＧＰＤ、ＥＦ１ａ、及びアクチン）を有する他のベクターを作り出した。４つの主要なプシロシビン合成遺伝子（ｐｓｉＤ／ｐｓｉＨ／ｐｓｉＫ／ｐｓｉＭ）をこれらのベクターにクローニングする。例えば、ＧＰＤ及びＣｃＤＥＤ１プロモーターは、２つの真菌特異的過剰発現プロモーターである。表４を参照されたい。Ｐｓｉ遺伝子は、ＧｃＤＥＤ１プロモーターの制御下でＰｓｉ遺伝子を発現するベクター（ベクター骨格表５：配列番号１９、９，４６２ｂｐ；図４Ａ）にクローニングするか、またはＧＰＤプロモーターの制御下でＰｓｉ遺伝子を発現するベクター（表５：配列番号２０、８，０６７ｂｐ；図４Ｂ）にクローニングする。
実施例３：プロトプラストのベクター媒介性トランスフェクション：プロトコールＡ
材料
Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｎｅｂｒｏｄｅｎｓｉｓ株を、２５℃で、ＰＤＳＡ培地（２０％ジャガイモ、２％デキストロース、０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１５％ ＭｇＳＯ４、０．０００５％ビタミンＢ１、２％寒天）で増殖させ、４℃に保った。
菌糸体の栄養培養を、ＰＤＳＢ培地（寒天なしのＰＤＳＡ培地）中、２５℃で１週間にわたって実施した。
プロトプラストの抽出。
ＰＤＳＢ培地で７日間増殖した１ｇｒの菌糸体をナイロンメッシュに浸透させて収集した。
０．６ＭのＭｇＳＯ４で２回洗浄した。
１．５％のｌｙｗａｌｌｚｙｍｅ（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ－ｂｉｏｌｏｇｙ）及び０．６ＭのＭｇＳＯ４を含む３ｍｌの溶解緩衝液に再懸濁し、次いでプロトプラストを放出させるために穏やかに振盪しながら３２℃で２．５時間インキュベートした。
１ｍｍの緩く吸収性のある綿の層を用いたガラス注射器での濾過によってプロトプラストを精製し、２０００ｇで２０分間、４℃での遠心分離によって収集した。
０．５Ｍマンニトール及び５０ｍＭマレイン酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む３ｍｌのＭＭ緩衝液で２回洗浄した。
２～３ｍｌのＭＭＣ緩衝液（０．５Ｍマンニトール、ｐＨ５．５の５０ｍＭマレイン酸緩衝液、５ｍＭ ＣａＣｌ２）に再懸濁し、１０８～１０９プロトプラストｍｌ－１の濃度とした。
プロトプラストの形質転換
３ｕｇの所望のプラスミド、１２．５ｕｌのＰＴＣ緩衝液（２５％ＰＥＧ４０００、ｐＨ７．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２５ｍＭ ＣａＣｌ２）を、５０ｕｌの冷やしたプロトプラスト懸濁液に加え、よく混合した。
混合物を氷上に２０分間保った。
０．５ｍｌのＰＴＣ緩衝液を混合物に加え、穏やかに混合し、その後５分間室温でインキュベートした。
プロトプラスト混合物を再生及びスクリーニング用の培地に播種する準備ができた。
プロトプラストの再生
プロトプラスト混合物を１ｍｌのＳＴＣ緩衝液（１８．２％ソルビトール、ｐＨ７．５の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２５ｍＭ ＣａＣｌ２）で希釈し、再生培地（ＰＤＳＡと１．０Ｍソルビトール）に２４時間２５℃で播種した。
２４時間２５℃での再生培養後、各プレートに２０ｍｌのスクリーニング培地（ＰＤＳＡと０．８Ｍソルビトール、８０ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ、０．８％寒天）を加え、２５℃の暗所で２週間インキュベートした。
スクリーニング培地上に現れた推定形質転換体を、８０ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むＰＤＳＡ培地上でさらに５回の継代培養に供し、安定形質転換体のスクリーニングを行った。再生するプロトプラストの一部は、直径１～２ｍｍで増殖を止める。直径１～２ｍｍのサイズを超えるものだけを、さらなる選択段階に移した。
平均形質転換効率は、プラスミドｐＡＮ７－１ ＤＮＡ １マイクログラム当たり形質転換体約３つである。
ＤＮＡの抽出及び解析
推定上の安定形質転換体の菌糸体及びＰ．ｎｅｂｒｏｄｅｎｓｉｓの非形質転換対照から、真菌ＤＮＡ抽出（ＦＤＥ）法によってゲノムＤＮＡを単離した。１グラムの菌糸体を液体窒素中で破砕して粉末にし、１０ｍｌのＴＥＳＮ緩衝液（ｐＨ７．５の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０の１００ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、ｐＨ５．２の３００ｍＭ ＮａＯＡｃ）中、６８℃で１時間にわたって消化した。３．５ｍｌの３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）を加え、氷上で２０分間インキュベートした後、消化混合物を８０００ｇで２０分間、４℃で遠心分離した。上清中のＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出法によって抽出した。
実施例４：プロトプラストのベクター媒介性トランスフェクション：プロトコールＢ
プロトプラストの抽出及び収集：
ステップ１：一核菌糸体の小さなブロックをＣＹＭ培地（１％マルトース、２％グルコース、０．２％酵母抽出物、０．２％トリプトン、０．０５％ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、０．４６％ ＫＨ２ＰＯ４）に接種し、２５℃で５日間、２３０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。
ステップ２：菌糸体を遠心分離によって採取し、０．７Ｍ ＮａＣｌで２回洗浄し、２５℃で２．０～２．５時間、酵素溶液（１Ｍ ＭｇＳＯ４及び０．６Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ６．０において、５０ｍｇ／ｍｌのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ由来の溶解酵素［Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ］）で処理した。
ステップ３：インキュベーション後、滅菌したＭｉｒａｃｌｏｔｈを通した濾過により、プロトプラストを菌糸残骸から分離し、３，０００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。
ステップ４：プロトプラストを１Ｍソルビトールで２回洗浄し、それでプロトプラスト密度を１０８／ｍｌに調整した。
ＰＥＧ媒介性形質転換：
ステップ１：５０マイクロリットルのプロトプラスト（１０８／ｍｌ）を、１０μｇの各プラスミドＤＮＡ及び１２．５μｌのＰＥＧ溶液（４０％ ＰＥＧ ４０００、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＣａＣｌ２；濾過滅菌済み）と混合した。
ステップ２：プロトプラストを氷上で２０分間インキュベートした。
ステップ３：５００マイクロリットルのＰＥＧ溶液を加え、穏やかに混合し、５分間室温でインキュベートした。
ステップ４：１ミリリットルの氷冷ＳＴＣ緩衝液（１Ｍソルビトール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ ＣａＣｌ２）を加え、次いでこの混合物を、２０ｍｌのＰＤＡＳ再生寒天培地（ＰＤＡと０．６Ｍスクロース、ｐＨ６．５）を含むプレート上に広げた。
ステップ５：プレートを２５℃で４８時間インキュベートし、次いで、６００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（Ｄｕｃｈｅｆａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、６００μｇ／ｍｌのフレオマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、または６０μｇ／ｍｌのカルボキシン（Ｄｕｃｈｅｆａ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を含む５ｍｌのＰＤＡＳ培地をオーバーレイとして加え、形質転換体が現れるまで（５～７日）プレートを２５℃でさらにインキュベートした。
プロトプラストの再生：
ステップ１：５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン、５０μｇ／ｍｌのフレオマイシン、または５μｇ／ｍｌのカルボキシンを含む新しいＰＤＡプレート上に、形質転換体を個々に継代培養した。
ステップ２：２５℃で２０～２２日間にわたり、ＭＭＰ培地（１％麦芽抽出物、０．５％菌類学的ペプトン、１．５％寒天）上でそれぞれの選択剤と共に培養した後、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓの成熟子実体を得た。
実施例５：プロトプラストのアグロバクテリウム媒介性形質転換。
材料：ひだ組織
Ｐ．ｅｒｙｎｇｉｉの子実体からベールを切断し、露出したひだ組織を無菌的に切除し、１．０×０．５ｃｍの小片に分けた。
アグロバクテリウムの調製
目的のプラスミドベクターを有するＧＶ３１０１を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補った５０ｍｌのＬＢ培地中、２８℃で２日間増殖させて、６００ｎｍでの光学密度を１．６とした。４，０００ｇで３０分間の遠心分離によって細菌を収集し、次いで、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１００μＭアセトシリンゴンを含む５０ｍｌの洗浄液で１回洗浄した。４，０００ｇでさらに３０分間遠心分離した後、細菌のペレットを洗浄液に再懸濁して、６００ｎｍでの光学密度を１．０とした。
形質転換（この暗培養法は、菌糸体を増殖させ、アグロバクテリウムを排除するのに非常に効果的である）。
これらの小片（＃＃から）に、アグロバクテリウム懸濁培養液中で１０分間の減圧浸潤を２回行った。
吸い出した組織を三回蒸留水で洗浄し、滅菌したＷｈａｔｍａｎ濾紙上で、無菌条件下で１０分間乾燥させた。
次いで、培地を含まない滅菌したペトリ皿に組織を移し、７～１４日間にわたって２５℃の暗所でインキュベートした。
選択のために、暗培養した活性のある組織を、５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン及び１００μｇ／ｍｌのセフォタキシムを含むＰＤＡ（ジャガイモデキストロース寒天）培地（２０％ジャガイモ抽出物、２％デキストロース、及び１．５％寒天）に移し、２５℃の暗所で２～３週間インキュベートした。
次いで、推定形質転換体を２５℃で１週間にわたり、暗所でＰＤＡ培地上に継代培養する。最後に、２５℃及び１３０ｇの振盪インキュベータ内で２週間にわたり、ＰＤＢ（寒天なしのＰＤＡ）を含む液体培地上で菌糸体を培養する。
次いで、Ｗｈａｔｍａｎ濾紙を通した濾過によって菌糸体を分離し、さらなる処理のために使用する。
ＤＮＡ抽出：推定上のトランスジェニックキノコ及び非形質転換キノコから菌糸体を収集し、予め冷やした乳鉢及び乳棒を使用して液体窒素中で粉砕する。臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）後の菌糸体からＤＮＡを単離する。
実施例６：菌糸体のアグロバクテリウム媒介性形質転換。
Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓ菌糸体を常法によりジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）上で２５℃に維持した。２５℃で２０～２２日間にわたり、ＭＭＰ培地（１％麦芽抽出物、０．５％菌類学的ペプトン、１．５％寒天）上で培養した後、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓの成熟子実体を得た。
所望の発現ベクターを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ１を、適切な抗生物質を補ったＬＢ培地中で２４時間増殖させた。
その後、細菌培養液を、６６０ｎｍでの光学密度が０．１５となるまで、２００μＭアセトシリンゴンの存在下で、アグロバクテリウム誘導培地（ＡＩＭ）（誘導培地（ＩＭ）［０．５％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．２ｍＭアセトシリンゴン（ＡＳ）、４０ｍＭ ２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含むＭＭ、ｐＨ５．３］）で希釈し、さらに５～６時間増殖させた。
汎用増殖培地から得られた５日齢のＰｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓ菌糸体をＵｌｔｒａ－Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーの使用によりホモジナイズし、菌糸断片を新鮮な汎用増殖培地に移し、２４時間増殖させて、均一な菌糸体のスラリーとした。
１００μｌの菌糸体懸濁液を１００μｌの細菌培養液と混合し、次いでセロファンディスク上に広げ、ＡＩＭ寒天プレートに重ね、２５℃で４８時間インキュベートした。
共培養後、残留するアグロバクテリウム細胞を殺滅するための２００μｇ／ｍｌのチメンチンと、真菌形質転換体を選択するための１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンとを含むＰＤＡ培地に、セロファンディスクを移した。
これらをハイグロマイシン抵抗性コロニーが現れるまで２５℃でインキュベートした。その後、５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＰＤＡ培地に個々のコロニーを移した。
２５℃で２０～２２日間にわたり、ＭＭＰ培地（１％麦芽抽出物、０．５％菌類学的ペプトン、１．５％寒天）上でそれぞれの選択剤と共に培養した後、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓの成熟子実体を得た。
実施例７：子実体のアグロバクテリウム媒介性形質転換。
Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓを常法によりジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）上で２５℃に維持した。２５℃で２０～２２日間にわたり、ＭＭＰ培地（１％麦芽抽出物、０．５％菌類学的ペプトン、１．５％寒天）上で培養した後、Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓの成熟子実体を得た。
所望の発現ベクターを含むＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＡＧＬ－１を、適切な抗生物質を補ったＬＢ培地中で２４時間増殖させた。
その後、細菌培養液を、６６０ｎｍでの光学密度が０．１５となるまで、２００μＭアセトシリンゴンの存在下で、アグロバクテリウム誘導培地（ＡＩＭ）で希釈し、さらに５～６時間増殖させた。
メスを使用して、成熟子実体（成熟しているが、ひだが露出する前）をＭＭＰプレートから切除し、小切片に切り分けた。
子実体のひだ組織小片を誘導後のＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ培養物と混合し、気泡が出てこなくなるまで減圧浸潤した。
浸潤後のひだ小片を、ＡＩＭ寒天プレートに重ねたセルロースディスクに移した。形質転換体の共培養及び選択を実施例６に記載したように行った。
共培養後、残留するアグロバクテリウム細胞を殺滅するための２００μｇ／ｍｌのチメンチンと、真菌形質転換体を選択するための１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンとを含むＰＤＡ培地に、セロファンディスクを移した。
これらをハイグロマイシン抵抗性コロニーが現れるまで２５℃でインキュベートした。その後、５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＰＤＡ培地に個々のコロニーを移した。
２５℃で２０～２２日間にわたり、ＭＭＰ培地（１％麦芽抽出物、０．５％菌類学的ペプトン、１．５％寒天）上でそれぞれの選択剤と共に培養した後、Ｐ．ｃｕｂｅｎｓｉｓの成熟子実体を得た。
実施例８：形質転換、トランスフェクション、及び再生
図６に示すように、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓを異なる基質上で繁殖及び増殖させて、成熟したキノコの子実体と菌糸体の両方を生成した。Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ ｃｕｂｅｎｓｉｓは、ＰＤＡ寒天中（図６Ａ及び図６Ｂ）、またオオムギ－パーライトの堆肥中（図６Ｃ）で、室温で７日間増殖させた。
実施例２に記載したｐＧＷＢ５ベクターを使用し、実施例３～７に記載した形質転換またはトランスフェクションプロトコールを用いて、担子菌を形質転換する。形質転換は、異なるＰｓｉ遺伝子を個別に、かつ組み合わせて含む（複数の異なるベクター、または複数のＰｓｉ遺伝子を含むベクターを使用する）。
例えば、キノコのひだから組織を抽出し、実施例３～７に記載したアグロバクテリウム媒介性形質転換によってＰｓｉ遺伝子の形質転換を行った。
プロトプラストを菌糸体から生成し、ＰＥＧ媒介性トランスフェクションによってＰｓｉ遺伝子の形質転換を行った。菌糸体をアグロバクテリウム媒介性形質転換によって形質転換した。
複数の形質転換真菌の再生の後、ポリヌクレオチド解析を行って、遺伝子の組込みを確認し、ＲＮＡ発現レベルを決定する。さらに、破壊された遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルを決定する。植物組織における、テルペンまたはカンナビノイドのような、１つまたは複数の生物活性代謝産物の含有量も決定する。例えば、プシロシビン及び／またはプシロシンのうちの１つまたは複数の含有量は、当業者に知られている手順を用いて決定される。

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Claims (107)

  1. 遺伝子改変を含む遺伝子改変生物であって、前記遺伝子改変は、前記遺伝子改変がない同等の対照生物における、
    Figure 2022550463000065
     及びそれらの誘導体または類似体から選択される化合物の産生と比較して、同じ化合物の産生の増加をもたらす、前記遺伝子改変生物。
  2. 遺伝子改変を含む遺伝子改変生物であって、前記遺伝子改変は、前記遺伝子改変がない同等の対照生物における、
    Figure 2022550463000066
     及びそれらの誘導体または類似体から選択される化合物の産生と比較して、同じ化合物の産生の増加をもたらし、前記遺伝子改変生物は真菌であり、前記真菌は担子菌門のものである、前記遺伝子改変生物。
  3. 前記生物は真菌である、請求項１に記載の遺伝子改変生物。
  4. 前記真菌は、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ、Ｃｏｎｏｃｙｂｅ、Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ、Ｐｌｕｔｅｕｓ、及びＳｔｒｏｐｈａｒｉａからなる群から選択される、請求項２または３に記載の遺伝子改変生物。
  5. 前記真菌は、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｃｙａｎｅｓｃｅｃｅｎｓである、請求項４に記載の遺伝子改変生物。
  6. 前記真菌は、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｃｕｂｅｎｓｉｓである、請求項４に記載の遺伝子改変生物。
  7. 前記真菌は、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｎｅｂｒｏｄｅｎｓｉｓである、請求項４に記載の遺伝子改変生物。
  8. 前記遺伝子改変は、
    ａ．トリプトファン脱炭酸の増加、
    ｂ．トリプタミン４－ヒドロキシル化の増加、
    ｃ．４－ヒドロキシトリプタインＯ－リン酸化の増加、及び
    ｄ．連続的Ｎ－メチル化を介したプシロシビン産生の増加
    のうちの少なくとも１つをもたらす、請求項１または２に記載の遺伝子改変生物。
  9. 前記遺伝子改変は、遺伝子の発現の上方調節をもたらす、請求項８に記載の遺伝子改変生物。
  10. 前記遺伝子は、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連ヒドロキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連Ｎ－メチルトランスフェラーゼ遺伝子、またはプシロシビン関連ホスホトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  11. 前記遺伝子は、ＰｓｉＤ、ＰｓｉＭ、ＰｓｉＨ、またはＰｓｉＫである、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  12. 前記遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  13. 前記遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  14. 前記遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  15. 前記遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  16. 前記遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  17. 前記遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  18. 前記遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  19. 前記遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  20. 前記遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  21. 前記遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  22. 前記遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  23. 前記遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  24. 前記遺伝子は、配列番号１３に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  25. 前記遺伝子は、配列番号１４に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項９に記載の遺伝子改変生物。
  26. 前記遺伝子の発現は、前記遺伝子改変生物において、前記遺伝子改変がない同等の対照生物と比較して、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも３．５、少なくとも４、または少なくとも５倍上方調節される、請求項９～２５のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  27. 前記遺伝子改変生物は、外来性ヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の遺伝子改変生物。
  28. 前記外来性ヌクレオチドは、シス作用性プロモーター配列を含む、請求項２７に記載の遺伝子改変生物。
  29. 前記外来性ヌクレオチドは、前記遺伝子改変生物において、前記外来性ヌクレオチドがない同等の対照生物と比較して、トリプトファン脱炭酸、トリプタミン４－ヒドロキシル化、４－ヒドロキシトリプタインＯ－リン酸化、またはプシロシン中間体を伴わない連続的Ｎ－メチル化を介したプシロシビン産生の増加をもたらす、請求項２７に記載の遺伝子改変生物。
  30. 前記外来性ヌクレオチドは、前記遺伝子改変生物において、前記外来性ヌクレオチドがない同等の対照生物と比較して、（ｉ）トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連ヒドロキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連Ｎ－メチルトランスフェラーゼ遺伝子、もしくはプシロシビン関連ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現の上方調節、（ｉｉ）プシロシビンではないトリプタミンの合成の低減、または（ｉｉｉ）トリプトファンの産生の増加をもたらす、請求項２７に記載の遺伝子改変生物。
  31. 前記外来性ヌクレオチドは、ＰＬＰ非依存性ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＴＤＣ）、推定モノオキシゲナーゼ、５－メチルチオンリボースファミリー小分子キナーゼ、または４－ヒドロキシトリプタミンキナーゼをコードする、請求項２７に記載の遺伝子改変生物。
  32. 前記ヌクレオチドは、プラスミドに組み込まれている、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  33. 前記プラスミドは、ｐＧＷＢ５またはｐＧＨＧＷＹである、請求項３２に記載の遺伝子改変生物。
  34. 前記プラスミドは、電気穿孔、微量注入、細胞の機械的変形、脂質ナノ粒子、ＡＡＶ、レンチウイルス、アグロバクテリウム媒介性形質転換、バイオリスティック粒子照射、またはプロトプラスト形質転換を介して前記遺伝子改変生物へと送達されている、請求項３２に記載の遺伝子改変生物。
  35. 前記プラスミドは、バーコード、レポーター遺伝子、または選択マーカーをさらに含む、請求項３２に記載の遺伝子改変生物。
  36. 前記プラスミドは、プロモーターをさらに含む、請求項３２に記載の遺伝子改変生物。
  37. 前記プロモーターは、３５Ｓ、ＧＰＤ、ＥＦ１ａ、アクチン、またはＣｃＤＥＤ１である、請求項３６に記載の遺伝子改変生物。
  38. 請求項１～３７のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物の抽出物を含む医薬組成物。
  39. 薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、またはキャリアをさらに含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
  40. 請求項１～３７のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物の抽出物を含む栄養補給組成物。
  41. 請求項１～３７のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物の抽出物を含む栄養補助食品組成物。
  42. 生物における、
    Figure 2022550463000067
     またはそれらの誘導体もしくは類似体の産生を増加させる方法であって、前記方法は、前記生物に遺伝子改変を導入することを含み、前記遺伝子改変は、前記改変がない同等の対照生物と比較して、同じ化合物の産生の増加をもたらす、前記方法。
  43. 生物における、
    Figure 2022550463000068
     またはそれらの誘導体もしくは類似体の産生を増加させる方法であって、前記方法は、前記生物の遺伝子改変を導入することを含み、前記遺伝子改変は、前記改変がない同等の対照生物と比較して、同じ化合物の産生の増加をもたらし、前記生物は真菌であり、前記真菌は担子菌門のものである、前記方法。
  44. 前記生物は真菌である、請求項４２に記載の方法。
  45. 前記真菌は、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ、Ｃｏｎｏｃｙｂｅ、Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ、Ｐｌｕｔｅｕｓ、及びＳｔｒｏｐｈａｒｉａからなる群から選択される、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. 前記真菌は、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｃｙａｎｅｓｃｅｃｅｎｓである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記真菌は、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ ｃｕｂｅｎｓｉｓである、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記真菌は、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｎｅｂｒｏｄｅｎｓｉｓである、請求項４５に記載の方法。
  49. 前記遺伝子改変は、
    ａ．トリプトファン脱炭酸の増加、
    ｂ．トリプタミン４－ヒドロキシル化の増加、
    ｃ．４－ヒドロキシトリプタインＯ－リン酸化の増加、及び
    ｄ．連続的Ｎ－メチル化を介したプシロシビン産生の増加
    のうちの少なくとも１つをもたらす、請求項４２または４３に記載の方法。
  50. 前記遺伝子改変は、遺伝子の発現の上方調節をもたらす、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記遺伝子は、トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連ヒドロキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連Ｎ－メチルトランスフェラーゼ遺伝子、またはプシロシビン関連ホスホトランスフェラーゼ遺伝子である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記遺伝子は、ＰｓｉＤ、ＰｓｉＭ、ＰｓｉＨ、またはＰｓｉＫである、請求項５０に記載の方法。
  53. 前記遺伝子は、配列番号１に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  54. 前記遺伝子は、配列番号２に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  55. 前記遺伝子は、配列番号３に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  56. 前記遺伝子は、配列番号４に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  57. 前記遺伝子は、配列番号５に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  58. 前記遺伝子は、配列番号６に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  59. 前記遺伝子は、配列番号７に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  60. 前記遺伝子は、配列番号８に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  61. 前記遺伝子は、配列番号９に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  62. 前記遺伝子は、配列番号１０に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  63. 前記遺伝子は、配列番号１１に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  64. 前記遺伝子は、配列番号１２に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  65. 前記遺伝子は、配列番号１３に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  66. 前記遺伝子は、配列番号１４に対して少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
  67. 前記遺伝子の発現は、前記遺伝子改変生物において、前記遺伝子改変がない同等の対照生物と比較して、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．５、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも３．５、少なくとも４、または少なくとも５倍上方調節される、請求項５０～６６のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記遺伝子改変の前記導入は、外来性ヌクレオチドを導入することを含む、請求項４２または４３に記載の方法。
  69. 前記外来性ヌクレオチドは、シス作用性プロモーター配列を含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記外来性ヌクレオチドは、前記遺伝子改変生物において、前記外来性ヌクレオチドがない同等の対照生物と比較して、トリプトファン脱炭酸、トリプタミン４－ヒドロキシル化、４－ヒドロキシトリプタインＯ－リン酸化、またはプシロシン中間体を伴わない連続的Ｎ－メチル化を介したプシロシビン産生の増加をもたらす、請求項６８に記載の方法。
  71. 前記外来性ヌクレオチドは、前記遺伝子改変生物において、前記外来性ヌクレオチドがない同等の対照生物と比較して、（ｉ）トリプトファンデカルボキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連ヒドロキシラーゼ遺伝子、プシロシビン関連Ｎ－メチルトランスフェラーゼ遺伝子、もしくはプシロシビン関連ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現の上方調節、（ｉｉ）プシロシビンではないトリプタミンの合成の低減、または（ｉｉｉ）トリプトファンの産生の増加をもたらす、請求項６８に記載の方法。
  72. 前記外来性ヌクレオチドは、ＰＬＰ非依存性ホスファチジルセリンデカルボキシラーゼ、トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＴＤＣ）、推定モノオキシゲナーゼ、５－メチルチオンリボースファミリー小分子キナーゼ、または４－ヒドロキシトリプタミンキナーゼをコードする、請求項６８に記載の方法。
  73. 前記ヌクレオチドは、プラスミドへと組み込まれる、請求項６８～７２のいずれか１項に記載の方法。
  74. 前記プラスミドは、ｐＧＷＢ５またはｐＧＨＧＷＹである、請求項７３に記載の方法。
  75. 前記プラスミドは、電気穿孔、微量注入、細胞の機械的変形、脂質ナノ粒子、ＡＡＶ、レンチウイルス、アグロバクテリウム媒介性形質転換、バイオリスティック粒子照射、またはプロトプラスト形質転換を介して前記遺伝子改変生物へと送達される、請求項７３に記載の方法。
  76. 前記プラスミドは、バーコード、レポーター遺伝子、または選択マーカーをさらに含む、請求項７３に記載の方法。
  77. 前記プラスミドは、プロモーターをさらに含む、請求項７３に記載の方法。
  78. 前記プロモーターは、３５Ｓ、ＧＰＤ、ＥＦ１ａ、アクチン、またはＣｃＤＥＤ１である、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記遺伝子改変は、前記生物の細胞をエンドヌクレアーゼ系と接触させることによって実施されている、請求項１～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  80. 前記エンドヌクレアーゼ系は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ＴＡＬＥ－ヌクレアーゼ、トランスポゾンベースのヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、Ｍｅｇａ－ＴＡＬまたはＤＮＡガイド型ヌクレアーゼを含む、請求項７９に記載の遺伝子改変生物。
  81. 前記ＤＮＡガイド型ヌクレアーゼは、アルゴノートを含む、請求項８０に記載の遺伝子改変生物。
  82. 前記エンドヌクレアーゼ系は、ＣＲＩＳＰＲ酵素と、前記遺伝子またはそれと関連する前記プロモーターもしくはエンハンサー内にあるかまたはそれに隣接する標的配列にハイブリダイズするガイドポリヌクレオチドとを含む、請求項７９に記載の遺伝子改変生物。
  83. 前記標的配列は、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、または少なくとも２２ヌクレオチドの長さである、請求項８２に記載の遺伝子改変生物。
  84. 前記標的配列は、最大で１７ヌクレオチドの長さである、請求項８２に記載の遺伝子改変生物。
  85. 前記標的配列は、配列番号１～１４のうちの少なくとも１つまたはその相補的な配列にハイブリダイズすることができる、請求項８２～８４のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  86. 前記ガイドポリヌクレオチドは、化学修飾されている、請求項８２～８５のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  87. 前記ガイドポリヌクレオチドは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項８２～８５のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  88. 前記ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むキメラシングルガイドである、請求項８２～８５のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  89. 前記ガイドポリヌクレオチドは、配列番号１～１４のうちの少なくとも１つまたはその相補的な配列にハイブリダイズすることができる、請求項８２～８５のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  90. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓタンパク質またはそのバリアントもしくは誘導体である、請求項８２～９０のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  91. 前記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、Ｃｐｆ１、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、それらの相同体、またはそれらの改変版を含む、請求項９０に記載の遺伝子改変生物。
  92. 前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９である、請求項９０または９１に記載の遺伝子改変生物。
  93. 前記Ｃａｓ９は、カノニカルなＰＡＭに結合する改変されたＣａｓ９である、請求項９２に記載の遺伝子改変生物。
  94. 前記Ｃａｓ９は、非カノニカルなＰＡＭを認識する、請求項９２に記載の遺伝子改変生物。
  95. 前記ガイドポリヌクレオチドは、ＰＡＭから３～１０ヌクレオチド離れた前記標的配列と結合する、請求項８２～９４のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  96. 前記ガイドポリヌクレオチドとカップリングされた前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＲＮＰによって前記遺伝子改変生物へと送達されている、請求項９５に記載の遺伝子改変生物。
  97. 前記ガイドポリヌクレオチドとカップリングされた前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素及び前記ガイドポリヌクレオチドをコードするｍＲＮＡによって前記遺伝子改変生物へと送達されている、請求項９５に記載の遺伝子改変生物。
  98. 前記ガイドポリヌクレオチドとカップリングされた前記ＣＲＩＳＰＲ酵素は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素及び前記ガイドポリヌクレオチドをコードする核酸を含むベクターによって前記遺伝子改変生物へと送達されている、請求項９５に記載の遺伝子改変生物。
  99. 前記ベクターは、バイナリーベクターまたはＴｉプラスミドである、請求項９８に記載の遺伝子改変生物。
  100. 前記ベクターは、選択マーカーまたはレポーター遺伝子をさらに含む、請求項９８に記載の遺伝子改変生物。
  101. 前記ＲＮＰ、複合体、またはベクターは、電気穿孔、微量注入、細胞の機械的変形、脂質ナノ粒子、ＡＡＶ、レンチウイルス、アグロバクテリウム媒介性形質転換、バイオリスティック粒子照射、またはプロトプラスト形質転換を介して送達されている、請求項９６～１００のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  102. 前記ＲＮＰ、ｍＲＮＡ、またはベクターは、ドナーポリヌクレオチドまたは前記ドナーポリヌクレオチドをコードする核酸をさらに含む、請求項９６～１００のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物。
  103. 前記ドナーポリヌクレオチドは、前記標的配列にフランキングする配列との相同性を含む、請求項１０２に記載の遺伝子改変生物。
  104. 前記ドナーポリヌクレオチドは、バーコード、レポーター遺伝子、または選択マーカーをさらに含む、請求項１０２または１０３に記載の遺伝子改変生物。
  105. 請求項１～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変生物に由来する単離細胞であって、前記遺伝子改変生物は多細胞生物である、前記単離細胞。
  106. 遺伝子改変を含む遺伝子改変担子菌細胞であって、前記遺伝子改変は、前記遺伝子改変がない同等の対照担子菌細胞における、
    Figure 2022550463000069
     ならびにそれらの誘導体または類似体から選択される化合物の産生と比較して、同じ化合物の産生の増加をもたらす、前記遺伝子改変担子菌細胞。
  107. 前記細胞は、Ｐｓｉｌｏｃｙｂｅ、Ｃｏｎｏｃｙｂｅ、Ｇｙｍｎｏｐｉｌｕｓ、Ｐａｎａｅｏｌｕｓ、Ｐｌｕｔｅｕｓ、及びＳｔｒｏｐｈａｒｉａからなる群から選択される真菌のものである、請求項１０６に記載の遺伝子改変担子菌細胞。
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