JP2022548800A - フラタキシン発現を調節し、フリードライヒ運動失調症を治療するための方法及び組成物 - Google Patents

フラタキシン発現を調節し、フリードライヒ運動失調症を治療するための方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、概して、例えば、フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）の治療を目的とする、フラタキシン（ＦＸＮ）発現を調節する方法及び組成物に関する。本開示は、一部には、フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現を調節、例えば、増大する組成物を提供する。理論に束縛されることは望まないが、以下：ＦＸＮ遺伝子内に含まれるか、若しくはそれと作動可能に連結されたゲノム配列エレメント（例えば、発現制御エレメント）と；ＦＸＮの発現を調節（例えば、増大）することができるエフェクター部分（例えば、エピジェネティック修飾部分）と、を含む調節剤が、ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大するのに有用であり得ると考えられる。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／９０４，３９１号明細書（２０１９年９月２３日に出願）に対する優先権及びそれからの利益を主張し、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）は、ＦＸＮ転写の阻害及びＦＸＮタンパク質発現の低減を招くフラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の第１イントロン内のホモ接合型ＧＡＡリピート伸長変異に主として起因する致死的常染色体劣性遺伝性神経変性疾患である。ＦＲＤＡの病理学的特徴としては、脊髄後根神経節（ＤＲＧ）中の大型感覚ニューロンの変性、脊髄の変性萎縮、肥大型心筋症、及び糖尿病が挙げられる。ＦＲＤＡ及び／又は関連症状を患う患者におけるＦＸＮの発現を調節、例えば、増大する方法及び組成物が必要とされている。
本開示は、一部には、フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現を調節、例えば、増大する組成物を提供する。理論に束縛されることは望まないが、以下：ＦＸＮ遺伝子内に含まれるか、若しくはそれと作動可能に連結されたゲノム配列エレメント（例えば、発現制御エレメント）と；ＦＸＮの発現を調節（例えば、増大）することができるエフェクター部分（例えば、エピジェネティック修飾部分）と、を含む調節剤が、ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大するのに有用であり得ると考えられる。
従って、いくつかの態様では、本開示は、フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエピジェネティック修飾部分を含むエフェクター部分と、を含む調節剤に関する。別の態様では、本開示は、一部には、フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができる第１エフェクター部分と、ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができる第２エフェクター部分と、を含む調節剤に関し、ここで、第１及び第２エフェクター部分は、異なる部分である。別の態様では、本開示は、一部には、フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分（上記ターゲティング部分は、Ｚｎフィンガー分子を含む）と、ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、を含む調節剤に関する。
別の態様では、本開示は、一部には、調節剤をコードする核酸分子に関し、調節剤は、フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエピジェネティック修飾部分を含むエフェクター部分と、を含み、ここで、核酸分子は、直鎖状で、且つ非ウイルスである。別の態様では、本開示は、一部には、本明細書に記載の調節剤をコードする核酸分子（ウイルス核酸内に含まれるか、又はそれを含む、例えば、ウイルスベクター内に含まれるか、又はそれを含む核酸分子）に関する。
別の態様では、本開示は、一部には、調節剤をコードする組換えＲＮＡに関し、調節剤は、フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、を含む。
別の態様では、本開示は、一部には、本明細書に記載の核酸又は組換えＲＮＡを含むウイルスベクターに関する。
別の態様では、本開示は、一部には、調節剤をコードする核酸、例えば、組換えＲＮＡを含むナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））に関し、調節剤は、フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、を含む。
本開示は、一部には、例えば、それを必要とする患者（例えば、ＦＲＤＡを有する患者）におけるフラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現を調節、例えば、増大する方法をさらに提供する。理論に束縛されることは望まないが、ＦＸＮ遺伝子内に含まれるか、若しくはそれと作動可能に連結したゲノム配列エレメント（例えば、発現制御エレメント）に、調節剤を向けるターゲティング部分と；ＦＸＮの発現を調節（例えば、増大）することができるエフェクター部分（例えば、エピジェネティック修飾部分を含む）と、を含む調節剤を投与することにより、それを必要とする患者におけるＦＸＮの発現を調節、例えば、増大し、且つ／又はＦＸＮタンパク質のレベルを増加し得ると考えられる。
従って、いくつかの態様では、本開示は、一部には、細胞におけるフラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現を増大する方法に関し、これは、細胞を調節剤（上記調節剤は、以下：フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と；ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、を含む）と接触させ、これにより、上記細胞におけるＦＸＮ発現を増大することを含み、ここで、ＦＸＮ発現は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０週間にわたって（及び任意選択的に、永続的に）増大する。別の態様では、本開示は、一部には、細胞におけるフラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現を増大する方法に関し、これは、細胞を調節剤（上記調節剤は、以下：フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と；ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、を含む）と接触させ、これにより、上記細胞におけるＦＸＮ発現を増大することを含み、ここで、上記細胞は、少なくとも４４コピーのＧＡＡ伸長を有するＦＸＮ対立遺伝子を含み、調節剤による治療後に、ＦＸＮ対立遺伝子は、調節剤と接触させていない類似細胞の発現レベルの１．５×（即ち、１．５倍）のレベルで発現される。別の態様では、本開示は、一部には、細胞におけるフラタキシン（ＦＸＮ）発現を増大する方法に関し、これは、本明細書に記載の調節剤と細胞を接触させることを含む。
本開示は、少なくとも４４コピーのＧＡＡ伸長を有する１つ又は２つのフラタキシン（ＦＸＮ）対立遺伝子を含むヒト細胞を提供し、ここで、ＦＸＮ対立遺伝子は、ＦＸＮ発現を調節することができる調節剤（例えば、本明細書に記載の調節剤）で処理されていない細胞でのＦＸＮ発現のレベルより高いレベルで発現される。理論に束縛されることは望まないが、本明細書に記載の調節剤で処理した細胞は、例えば、細胞中に調節剤が存在する／した時間を超える期間にわたってＦＸＮ発現の増大を呈示し得ると考えられる。一部の実施形態では、ＦＸＮ対立遺伝子は、参照レベルの少なくとも１．５×（即ち、１．５倍）、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２×、２．１×、２．２×、２．３×、２．４×、２．５×、２．６×、２．７×、２．８×、２．９×、３×、３．１×、３．２×、３．３×、３．４×、３．５×、３．６×、３．７×、３．８×、３．９×、４×、４．１×、４．２×、４．４×、４．５×、４．６×、４．７×、４．８×、４．９×、又は５×のレベルで発現され、ここで、参照レベルは、ＦＸＮ発現を調節することができる調節剤（例えば、本明細書に記載の調節剤）で処理されていない細胞でのＦＸＮ発現のレベルである。一部の実施形態では、細胞は、筋肉細胞（例えば、心臓の筋肉細胞、例えば、心筋細胞）又は神経細胞（例えば、中枢神経系の細胞、脊椎の細胞、例えば、脊髄後根神経節（ＤＲＧ）の細胞）である。一部の実施形態では、神経細胞は、グルタミン酸作動性ニューロンである。
前述した方法又は組成物のいずれかの別の特徴は、以下に列挙される実施形態の１つ又は複数を含む。
当業者であれば、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの同等物を認識するか、又は常用的な実験を用いるだけでそれらを確認することができるだろう。こうした同等物は、以下に列挙される実施形態に包含されることが意図される。
本明細書に挙げる全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献（例えば、配列データベース参照番号）は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本明細書、例えば、本明細書のいずれかの表で参照される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、及びＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により本明細書に組み込まれる。別に明示しない限り、本明細書の全ての表を含め、本明細書に記載される配列アクセッション番号は、２０１９年９月２３日現在のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子又はタンパク質が、複数の配列アクセッション番号を示す場合には、全ての配列変異体が包含される。
実施形態の列挙
１．以下：
フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエピジェネティック修飾部分を含むエフェクター部分と、
を含む調節剤。
２．以下：
フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができる第１エフェクター部分と、
ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができる第２エフェクター部分と、
を含む調節剤であって、上記第１及び第２エフェクター部分が、異なる部分である、調節剤。
３．以下：
フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分（上記ターゲティング部分は、Ｚｎフィンガー分子を含む）と、
ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、
を含む調節剤。
４．調節剤をコードする核酸分子であって、上記調節剤は、以下：
フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、を含み、ここで、上記核酸分子は、直鎖状で、且つ非ウイルスである、核酸分子。
５．実施形態１～４のいずれかに記載の調節剤をコードする核酸。
６．調節剤をコードする組換えＲＮＡであって、上記調節剤は、以下：
フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、
を含む組換えＲＮＡ。
７．調節剤をコードする核酸、例えば、組換えＲＮＡを含むナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））であって、上記調節剤は、以下：
フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、を含むナノ粒子。
８．実施形態４～６のいずれかに記載の核酸又は組換えＲＮＡ分子を含むウイルスベクター。
９．細胞におけるフラタキシン（ＦＸＮ）発現を増大する方法であって、
細胞を調節剤と接触させ、これにより、上記細胞におけるＦＸＮ発現を増大することを含み、上記調節剤は、以下：
フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、を含み、
ここで、ＦＸＮ発現は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０週間にわたって（及び任意選択的に、永続的に）増大する、方法。
１０．細胞におけるフラタキシン（ＦＸＮ）発現を増大する方法であって、
細胞を調節剤と接触させ、これにより、上記細胞におけるＦＸＮ発現を増大することを含み、上記調節剤は、以下：
フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、を含み、
ここで、上記細胞は、少なくとも４４コピーのＧＡＡ伸長を有するＦＸＮ対立遺伝子を含み、調節剤による治療後に、ＦＸＮ対立遺伝子は、調節剤と接触させていない類似細胞の発現レベルの少なくとも１．５×（即ち、１．５倍）のレベルで発現される、方法。
１１．細胞におけるフラタキシン（ＦＸＮ）発現を増大する方法であって、以下：
細胞を実施形態１～８のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターと接触させ、
これにより、上記細胞におけるＦＸＮ発現を増大すること
を含む、方法。
１２．以下：
フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分であって、上記発現制御エレメントが、ＦＸＮのプロモータ又は転写部位を含まないターゲティング部分と、
ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、
を含む、調節剤。
１３．以下：
フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントの核酸配列に結合するターゲティング部分であって、ＴＳＳに最も近い上記核酸エレメント位置が、ｉ）ＴＳＳの約１５０塩基上流；又はｉｉ）ＴＳＳの約５０塩基下流である、ターゲティング部分と；
ＦＸＮの発現を調節、例えば、増大することができるエフェクター部分と、
を含む、調節剤。
１４．以下：
少なくとも４４コピーのＧＡＡ伸長を有するフラタキシン（ＦＸＮ）対立遺伝子
を含むヒト細胞において、
上記ＦＸＮ対立遺伝子が、参照レベルの少なくとも１．５×（即ち、１．５倍）、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２×、２．１×、２．２×、２．３×、２．４×、２．５×、２．６×、２．７×、２．８×、２．９×、３×、３．１×、３．２×、３．３×、３．４×、３．５×、３．６×、３．７×、３．８×、３．９×、４×、４．１×、４．２×、４．４×、４．５×、４．６×、４．７×、４．８×、４．９×、又は５×のレベルで発現され、上記参照レベルは、ＦＸＮ発現を調節することができる調節剤（例えば、いずれかの先行する請求項に記載の調節剤）で処理されていない細胞でのＦＸＮ発現のレベルであり、
上記細胞は、筋肉細胞、神経細胞、又は脊髄後根神経節の細胞である、ヒト細胞。
１５．以下：
各々が少なくとも４４コピーのＧＡＡ伸長を有する２つのフラタキシン（ＦＸＮ）対立遺伝子
を含むヒト細胞において、
各対立遺伝子は、参照レベルの少なくとも１．５×（即ち、１．５倍）、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２×、２．１×、２．２×、２．３×、２．４×、２．５×、２．６×、２．７×、２．８×、２．９×、３×、３．１×、３．２×、３．３×、３．４×、３．５×、３．６×、３．７×、３．８×、３．９×、４×、４．１×、４．２×、４．４×、４．５×、４．６×、４．７×、４．８×、４．９×、又は５×のレベルで発現され、上記参照レベルは、ＦＸＮ発現を調節することができる調節剤（例えば、いずれかの先行する請求項に記載の調節剤）で処理されていない細胞でのＦＸＮ発現のレベルであり、
上記細胞が、筋肉細胞、神経細胞、又は脊髄後根神経節の細胞である、ヒト細胞。
１６．上記エフェクター部分が、エピジェネティック修飾部分を含む、実施形態１～１３のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
１７．上記エピジェネティック修飾部分が、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、又はそのいずれかの機能性断片若しくは変異体を含む、実施形態１～１３又は１６のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
１８．上記エフェクター部分が、ＤＮＡデメチラーゼ又はその機能性断片若しくは変異体、例えば、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、若しくはＴＤＧから選択されるタンパク質、又はそのいずれかの機能性断片若しくは変異体を含む、実施形態１～１３、１６、又は１７のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
１９．上記エフェクター部分が、ヒストンメチルトランスフェラーゼ又はその機能性断片若しくは変異体、例えば、ＤＯＴ１Ｌ、ＰＲＤＭ９、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ２、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ５、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３から選択されるタンパク質、又はそのいずれかの機能性断片若しくは変異体を含む、実施形態１～１３又は１６～１８のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
２０．上記エフェクター部分が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ又はその機能性断片若しくは変異体、例えば、ｐ３００、ＣＲＥＢ－結合タンパク質（ＣＢＰ）から選択されるタンパク質、又はそのいずれかの機能性断片若しくは変異体を含む、実施形態１～１３又は１６～１９のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
２１．上記エフェクター部分が、転写活性化因子又はその機能性断片若しくは変異体、例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、若しくはＶＰＲから選択されるタンパク質を含む、実施形態１～１３又は１６～２０のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
２２．上記エフェクター部分が、ＶＰＲ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、実施形態１～１３又は１６～２１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
２３．上記エフェクター部分が、ｐ３００又はその機能性断片若しくは変異体を含む、実施形態１～１３又は１６～２２のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
２４．上記エフェクター部分が、ｐ６５又はその機能性断片若しくは変異体を含む、実施形態１～１３又は１６～２３のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
２５．上記エフェクター部分が、ＲＴＡ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、実施形態１～１３又は１６～２４のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
２６．上記エフェクター部分が、ＤＮＡデメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、若しくは転写活性化因子、又はそのいずれかの機能性断片の１つ、２つ、又は全てを含む、実施形態１～１３又は１６～２５のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
２７．上記ターゲティング部分が、Ｃａｓ９分子を含む、実施形態１～１３又は１６～２６のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
２８．上記Ｃａｓ９分子が、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、又はＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（例えば、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、スタフィロコッカッス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィラス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、又はマリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）由来のＣａｓ９タンパク質を含む、実施形態２７に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
２９．上記Ｃａｓ９分子が、例えば、不活性ＲｕｖＣ及び／又はＨＮＨドメインを含む、実質的にヌクレアーゼ活性を欠失したＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９を含む、実施形態２７又は２８に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
３０．上記Ｃａｓ９分子が、ｇＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡを含み（例えば、それと非共有結合しており）、ここで、上記ｇＲＮＡは、発現制御エレメントに結合する、実施形態２７～２９のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
３１．上記ｇＲＮＡが、配列番号４～２６のいずれか、又は配列番号４～２６のいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有する配列から選択される核酸を含む、実施形態３０に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
３２．上記ターゲティング部分が、ＴＡＬエフェクター分子を含む、実施形態１～１３又は１６～２６のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
３３．上記ＴＡＬエフェクター分子が、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の反復可変二残基（ＲＶＤ））を含む、実施形態３２に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
３４．上記ターゲティング部分が、Ｚｎフィンガー分子を含む、実施形態１～１３、又は１６～２６のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
３５．上記発現制御エレメントが、上記ＦＸＮ遺伝子と作動可能に連結されたエンハンサー若しくはプロモータ又はその部分を含む、実施形態１～１３又は１６～３４のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
３６．上記発現制御エレメントが、完全に又は部分的に、上記ＦＸＮ遺伝子を含むアンカー配列媒介接合部と作動可能に連結したアンカー配列を含む、実施形態１～１３又は１６～３５のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
３７．上記ターゲティング部分が、上記ＦＸＮ遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）を含む核酸配列に結合する、実施形態１～１３又は１６～３６のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
３８．上記ターゲティング部分が、上記ＦＸＮ遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）から５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１ヌクレオチド以下上流又は下流（及び任意選択的に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、若しくは９０ヌクレオチド上流又は下流の核酸配列に結合する、実施形態１～１３又は１６～３７のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
３９．上記ターゲティング部分が、上記ＦＸＮ遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）から約５０～１５０、５０～７０、７０～９０、９０～１１０、１１０～１３０、又は１３０～１５０ヌクレオチド上流の核酸配列に結合する、実施形態１～１３、又は１６～３７のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
４０．上記ターゲティング部分が、２、３、４、５、又は６つのＺｎフィンガータンパク質を含有するＺｎフィンガー分子を含む、実施形態１～１３又は１６～３９のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
４１．上記ターゲティング部分が、表３のゲノムの座標により描かれる配列から選択される核酸配列に結合する、実施形態１～１３又は１６～４０のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
４２．上記ターゲティング部分が、Ｃａｓ９分子、例えば、ｄＣａｓ９分子を含み、上記エフェクター部分が、ｐ３００又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
実施形態１～１３、１６～３１、３５～３９、又は４１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
４３．上記ターゲティング部分が、Ｃａｓ９分子、例えば、ｄＣａｓ９分子を含み、上記エフェクター部分が、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
実施形態１～１３、１６～３１、３５～３９、又は４１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
４４．上記ターゲティング部分が、酵素として不活性のＣａｓヌクレアーゼ、例えば、ｄＣａｓ９分子を含み、上記エフェクター部分が、ｐ３００又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
実施形態１～１３、１６～３１、３５～３９、又は４１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
４５．上記ターゲティング部分が、酵素として不活性のＣａｓヌクレアーゼ、例えば、ｄＣａｓ９分子を含み、上記エフェクター部分が、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
実施形態１～１３、１６～３１、３５～３９、又は４１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
４６．上記ターゲティング部分が、酵素として不活性のＣａｓヌクレアーゼ、例えば、ｄＣａｓ９分子を含み、上記エフェクター部分が、ＶＰＲ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
実施形態１～１３、１６～３１、３５～３９、又は４１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
４７．上記ターゲティング部分が、酵素として不活性のＣａｓヌクレアーゼ、例えば、ｄＣａｓ９分子を含み、上記エフェクター部分が、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体、ｐ６５又はその機能性断片若しくは変異体、及びＲＴＡ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
実施形態１～１３、１６～３１、３５～３９、又は４１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
４８．上記ターゲティング部分が、ＴＡＬエフェクター分子（例えば、上記ＴＡＬエフェクター分子は、ＦＸＮ遺伝子ＴＳＳの上流、例えば、約５０～１５０ヌクレオチド上流、例えば、約１００ヌクレオチド上流に結合する）を含み、上記エフェクター部分が、ＶＰＲ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
実施形態１～１３、１６～３１、３５～３９、又は４１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
４９．上記ターゲティング部分が、ＴＡＬエフェクター分子分子（例えば、上記ＴＡＬエフェクター分子は、ＦＸＮ遺伝子ＴＳＳの上流、例えば、約５０～１５０ヌクレオチド上流、例えば、約１００ヌクレオチド上流に結合する）を含み、上記エフェクター部分が、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体、ｐ６５又はその機能性断片若しくは変異体、及びＲＴＡ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
実施形態１～１３、１６～３１、３５～３９、又は４１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
５０．上記ターゲティング部分が、Ｚｎフィンガー分子（例えば、上記Ｚｎフィンガー分子は、ＦＸＮ遺伝子ＴＳＳの上流、例えば、約５０～１５０ヌクレオチド上流、例えば、約１００ヌクレオチド上流に結合する）を含み、上記エフェクター部分が、ＶＰＲ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
実施形態１～１３、１６～３１、３５～３９、又は４１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
５１．上記ターゲティング部分が、Ｚｎフィンガー分子分子（例えば、上記Ｚｎフィンガー分子は、ＦＸＮ遺伝子ＴＳＳの上流、例えば、約５０～１５０ヌクレオチド上流、例えば、約１００ヌクレオチド上流に結合する）を含み、上記エフェクター部分が、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体、ｐ６５又はその機能性断片若しくは変異体、及びＲＴＡ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
実施形態１～１３、１６～３１、３５～３９、又は４１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
５２．上記調節剤が、融合分子を含むか、又は融合分子である、実施形態１～１３又は１６～５１のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
５３．上記調節剤が、配列番号３０４～３０９のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～１３又は１６～５２のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
５４．上記融合分子が、例えば、単一のポリペプチド鎖の一部として、例えば、ペプチド結合により共有結合されたターゲティング部分とエフェクター部分を含む、実施形態５２又は５３に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
５５．上記調節剤が、コンジュゲートを含むか、又はコンジュゲートである、実施形態１～１３又は１６～５４のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
５６．上記コンジュゲートが、例えば、非ペプチド結合により共有結合されたターゲティング部分とエフェクター部分を含む、実施形態５５に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
５７．上記調節剤が、追加部分をさらに含む、実施形態１～１３又は１６～５６のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
５８．上記追加部分が、精製タグ（例えば、調節剤の精製に役立つ部分）、生体利用可能性若しくは薬物動態部分（例えば、調節剤の生体利用可能性を増大するか、若しくは調節剤の薬物動態特性を調節する部分）、可溶性部分（例えば、上記調節剤の溶解度、例えば、生理学的溶解度を高める部分）、検出部分（例えば、調節剤の存在若しくはレベルの検出及び／又は定量を助ける部分、例えば、蛍光部分若しくは蛍光色素）、多量体化部分（例えば、調節剤の多量体化（例えば、二量体化、三量体化、若しくは四量体化）を促進する部分）、或いは会合部分（例えば、調節剤が、構造、例えば、膜又は実験室内試験装置（例えば、プレート若しくは管壁）と会合することを可能にする部分）を含む、実施形態５７に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
５９．実施形態１～３、１２、１３、又は１６～５８のいずれかに記載の調節剤と、ＦＸＮ遺伝子の発現制御配列を有する核酸配列と、を含む複合体。
６０．実施形態１～８、１２、１３、又は１６～５８のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターを含む細胞。
６１．実施形態１～３、１２、１３、又は１６～５８のいずれかに記載の調節剤をコードする核酸を含む細胞。
６２．実施形態１～８、１２、１３、又は１６～５８のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターを細胞に送達する方法であって、上記調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターと上記細胞を接触させ、これにより、上記調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターを上記細胞に送達することを含む方法。
６３．上記ＦＸＮ遺伝子、又は上記ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの発現制御エレメントに結合する１つ若しくは複数の（例えば、２若しくは３つの）ｇＲＮＡと、上記細胞を接触させるステップをさらに含む、実施形態６２に記載の方法。
６４．上記フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の転写を調節、例えば、増大する方法であって、以下：
実施形態１～８、１２、１３、又は１６～５８のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターと細胞を接触させ、
これにより、上記ＦＸＮ遺伝子の発現を調節、例えば、増大すること
を含む方法。
６５．接触が、インビボ、インビトロ、又はエクスビボで行われる、実施形態６２～６４のいずれかに記載の方法。
６６．フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）を有する患者を治療する方法であって、以下：
実施形態１～８、１２、１３、又は１６～５８のいずれかに記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターを上記患者に投与し、
これにより、上記患者を治療すること
を含む方法。
６７．投与が、静脈内又は髄腔内投与を含む、実施形態６６に記載の方法。
６８．上記方法が、血液（例えば、全血）中のＦＸＮレベルを、上記調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターの非存在下での血液（例えば、全血）中のＦＸＮレベルに比して（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ又はＯｇｌｅｓｂｅｅ ｅｔ ａｌの方法により測定して）、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、若しくは４００％増大する、実施形態６２～６７のいずれかに記載の方法。
６９．上記方法が、ＦＤＲＡの少なくとも１つの症状、例えば、以下：運動失調、構音障害、筋力低下、痙性（例えば、下肢痙縮）、脊椎側彎症、膀胱機能障害、反射障害、位置覚及び／若しくは振動感覚の消失、心筋症、又は糖尿病から選択される症状を軽減又は排除する、実施形態６２～６８のいずれかに記載の方法。
７０．血液（例えば、全血）中のＦＸＮの上記レベルを少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって増大する、実施形態６８又は６９に記載の方法。
７１．上記方法が、血液（例えば、全血）中のＦＸＮレベルを少なくとも１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、又は９６時間にわたって増大する、実施形態６２～６９のいずれかに記載の方法。
７２．細胞におけるフラタキシン（ＦＸＮ）発現を増大する方法であって、以下：
先行する実施形態のいずれかに記載の調節剤を細胞と接触させ、
これにより、上記細胞におけるＦＸＮ遺伝子の発現を増大すること
を含み、
ここで、ＦＸＮ発現が、少なくとも１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、又は９６時間にわたって（及び任意選択的に、永続的に）増大する方法。
定義
１つの（ａ）、１つの（ａ）、その（ｔｈｅ）：本明細書で用いられるとき、「１つの（ａ）」、「１つの（ａ）」、「その（ｔｈｅ）」は、文脈から明らかに別の解釈が要求されるのでない限り、複数の指示語を含む。
薬剤：本明細書で用いられるとき、用語「薬剤」は、例えば、ポリペプチド、核酸、糖、脂質、小分子、金属、又はそれらの組合せ若しくは複合体を含む、任意の化学クラスの化合物又は実体を指す。当業者には文脈から明らかになるように、一部の実施形態では、この用語は、細胞若しくは生物、又はその画分、抽出物、若しくは成分であるか、又はそれを含む実体を指すために使用される場合もある。これに代わり、又は加えて、当業者であれば文脈に照らして理解されるように、一部の実施形態では、この用語は、天然に存在する、且つ／又は天然から得られるという点で、天然の産物を指すために使用される場合もある。一部の実施形態では、やはり当業者であれば文脈に照らして理解されるように、この用語は、人為的に設計、操作、及び／若しくは生産され、且つ／又は天然には存在しないという点で、人工物である１つ若しくは複数の実体を指すこともある。一部の実施形態では、薬剤は、単離された形態又は純粋な形態で使用されてもよく；一部の実施形態では、薬剤は、未精製の形態で使用され得る。一部の実施形態では、有望な薬剤は、コレクション又はライブラリーとして提供されてもよく、例えば、それらをスクリーニングして、それらのうちの活性薬剤を同定又は特性決定してもよい。一部の実施形態では、用語「薬剤」は、ポリマーであるか、若しくはそれを含む化合物又は実体を指す場合もあり；一部の実施形態では、この用語は、１つ若しくは複数のポリマー部分を含む化合物を指す場合もある。一部の実施形態では、用語「薬剤」は、ポリマーではなく、且つ／或いは全てのポリマー及び／又は１つ若しくは複数の特定のポリマー部分を実質的に含まない化合物又は実体を指すこともある。一部の実施形態では、この用語は、全てのポリマー部分が欠失しているか、又は実質的に含まない化合物又は実体を指すこともある。
アンカー配列：本明細書で用いられるとき、用語「アンカー配列」は、接合部核形成ポリペプチド（例えば、核形成ポリペプチド）により認識される配列であって、十分に結合して、アンカー配列媒介接合部を形成する配列を指す。一部の実施形態では、アンカー配列は、１つ又は複数のＣＴＣＦ結合モチーフを含む。一部の実施形態では、アンカー配列は、遺伝子コーディング領域内に位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は、遺伝子間領域内に位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、エンハンサー又はプロモータ内のいずれにも位置しない。一部の実施形態では、アンカー配列は、任意の転写開始部位から少なくとも４００ｂｐ、少なくとも４５０ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも５５０ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも６５０ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも８５０ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも９５０ｂｐ、又は少なくとも１ｋｂ離れて位置する。一部の実施形態では、アンカー配列は、ゲノム刷り込み、単一対立遺伝子の発現、及び／又は単一対立遺伝子のエピジェネティックマークと関連しない領域内に位置する。本開示の一部の実施形態では、他のアンカー配列（例えば、別の状況での接合部核形成ポリペプチド（例えば、ＣＴＣＦ）結合モチーフを含有し得る配列）をターゲティングすることなく、特定の１つ又は複数のアンカー配列を特異的にターゲティングすることができる技術が提供され；こうした標的化アンカー配列は、「標的アンカー配列」と呼ばれることもある。一部の実施形態では、標的アンカー配列の配列及び／又は活性は調節されるが、標的化アンカー配列と同じシステム内（例えば、同じ細胞内及び／又は一部の実施形態では、同じ核酸分子、例えば、同じ染色体上）に存在し得る１つ若しくは複数の他のアンカー配列の配列及び／又は活性は調節されない。
アンカー配列媒介接合部：本明細書で用いられるとき、用語「アンカー配列媒介接合部」（またＡＳＭＣと略される）は、核形成ポリペプチドなどの１つ若しくは複数のタンパク質、又は１つ若しくは複数のタンパク質及び／又は核酸実体（例えば、ＲＮＡ若しくはＤＮＡなど）によるＤＮＡ内の少なくとも２つのアンカー配列の物理的相互作用若しくは結合によって起こる、及び／又はそれにより維持されるＤＮＡ構造を指し、これは、アンカー配列と結合して、アンカー配列同士の空間的近接及び機能的連結を可能にする。
と関連する：この用語が本明細書で用いられるとき、２つの事象又は実体は、その一方の存在、レベル、機能及び／又は形態が、他方のものと相関する場合に、互いに「関連する」。例えば、一部の実施形態では、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝物、微生物など）は、その存在、レベル、機能及び／又は形態が、特定の疾患、障害、若しくは病状の発生率及び／又はそれに対する感受性と相関する場合に、その疾患、障害、又は病状と関連すると考えられる。一部の実施形態では、２つ以上の実体は、それらが直接又は間接的に相互作用して、互いに物理的に近接し、且つ／又は物理的に近接したままであれば、互いに物理的に「関連する」。一部の実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合しており；一部の実施形態では、互いに物理的に関連する２つ以上の実体は、互いに共有結合していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁気、及びそれらの組合せにより、非共有結合している。一部の実施形態では、標的遺伝子は、アンカー配列媒介接合部の調節（例えば、妨害）が、標的遺伝子の発現（例えば、転写）の変更を引き起こす場合、アンカー配列媒介接合部と「関連する」。例えば、一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部の調節（例えば、妨害）により、増強若しくはサイレンシング／リプレッサー配列を標的遺伝子と関連させるか、又はそれと無関係にすることによって、標的遺伝子の発現を変更する。一部の実施形態では、標的遺伝子は、標的遺伝子又はその一部がＡＳＭＣ内に位置する場合、ＡＳＭＣと関連している。
ドメイン：本明細書で用いられるとき、用語「ドメイン」は、或る実体のセクション又は部分を指す。一部の実施形態では、「ドメイン」は、当該実体の特定の構造及び／又は機能的特徴と関連しており、ドメインがその親実体の残りから物理的に分離されたとき、それは、上記の特定の構造及び／又は機能的特徴を実質的に若しくは完全に保持する。これに代わり、又は加えて、一部の実施形態では、ドメインは、（親）実体から分離されて、別の（レシピエント）実体と連結されると、レシピエント実体に、親実体においてそれを特徴付けた１つ若しくは複数の構造及び／又は機能的特徴を実質的に保持し、且つ／又は付与する実体の１部分であるか、又はそれを含み得る。一部の実施形態では、ドメインは、或る分子（例えば、小分子、炭水化物、脂質、核酸、ポリペプチドなど）のセクション若しくは１部分であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ドメインは、ポリペプチドのセクションであるか、又はそれを含む。いくつかのそうした実施形態では、ドメインは、特定の構造エレメント（例えば、特定のアミノ酸配列若しくは配列モチーフ、α－ヘリックス特徴、β－シート特徴、コイルドコイル特徴、ランダムコイル特徴など）、及び／又は特定の機能的特徴（例えば、結合活性、酵素活性、フォールディング活性、シグナル伝達活性など）を特徴とする。
エフェクター部分：本明細書で用いられるとき、用語「エフェクター部分」は、細胞の核内の適切な部位に局在化すると、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現を変更することができるドメインを指す。一部の実施形態では、エフェクター部分は、転写機構の成分を動員する。一部の実施形態では、エフェクター部分は、転写因子又は発現抑制因子の成分の動員を阻害する。一部の実施形態では、エフェクター部分は、エピジェネティック修飾部分（例えば、標的ＤＮＡ配列をエピジェネティックに修飾する）を含む。
エピジェネティック修飾部分：本明細書で用いられるとき、「エピジェネティック修飾部分」は、以下：ｉ）クロマチンの構造、例えば、二次元構造；並びに／又はｉｉ）エピジェネティック修飾部分が、核酸に適切に局在化される（例えば、ターゲティング部分により）と、エピジェネティックマーカ（例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンＳＵＭＯ化、ヒストンリン酸化、及びＲＮＡ関連サイレンシングのうちの１つ若しくは複数）、を変更するドメインを指す。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、１つ若しくは複数のエピジェネティックマーカに影響を与える（例えば、そのレベルを増大若しくは低減する）酵素、又はその機能性断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＣＲＥＢ－結合タンパク質（ＣＢＰ）、又はそれらいずれかの機能性断片を含む。
発現制御配列：本明細書で用いられるとき、用語「発現制御配列」は、遺伝子の転写を増大若しくは低減する核酸配列を指し、プロモータ及びエンハンサーを含む（しかし、それらに限定されない）。「増強配列」は、発現制御配列のサブタイプを指し、これは、遺伝子転写の可能性を増大する。「サイレンシング又はリプレッサー配列」は、発現制御配列のサブタイプを指し、これは、遺伝子転写の可能性を低減する。
融合分子：本明細書で用いられるとき、用語「融合分子」は、共有結合される２つ以上の部分、例えば、ターゲティング部分とエフェクター部分を含む化合物を指す。融合分子とその部分は、ポリペプチド、核酸、グリカン、小分子、又は本明細書に記載の他の成分の任意の組合せを含んでもよい（例えば、ターゲティング部分は、核酸を含んでもよく、エフェクター部分は、ポリペプチドを含んでもよい）。一部の実施形態では、融合分子は、例えば、ペプチド結合を介して共有結合される１つ又は複数のポリペプチドドメインを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、融合分子は、ターゲティング部分とエフェクター部分を含むコンジュゲート分子であり、それらは、ペプチド結合又はリン酸ジエステル結合以外の共有結合によって連結されている（例えば、ペプチド結合又はリン酸ジエステル結合以外の共有結合によって連結された、核酸を含むターゲティング部分と、ポリペプチドを含むエフェクター部分）。一部の実施形態では、調節剤は、融合分子であるか、又はそれを含む。
ゲノム複合体：本明細書で用いられるとき、用語「ゲノム複合体」は、複数のタンパク質及び／又は他の成分（恐らく、ゲノム配列エレメントを含む）同士の相互作用によって、１つ若しくは複数の染色体上で互いに間隔をあけた２つのゲノム配列エレメントを一緒にする複合体である。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、複合体の１つ又は複数のタンパク質成分が結合するアンカー配列である。一部の実施形態では、ゲノム複合体は、アンカー配列媒介接合部（ＡＳＭＣ）であり得る。一部の実施形態では、ゲノム複合体は、１つ又は複数のＡＳＭＣを含む。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、アンカー配列（例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ）であってもよいし、又はそれを含んでもよい。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、プロモータ及び／又はエンハンサーの少なくとも１つ又はその両方を含む。一部の実施形態では、ゲノム複合体形成は、ゲノム配列エレメントにおいて、且つ／又はゲノム配列エレメントと１つ若しくは複数のタンパク質成分の結合により核形成される。当業者には理解されるように、一部の実施形態では、複合体の形成によるゲノム部位の共局在化（例えば、共役）によって、ゲノム配列エレメントにおける、又はその付近で（例えば、一部の実施形態では、配列間）のＤＮＡトポロジーが変更される。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、例えば、ＣＴＣＦ及び／又はコヒーシンなどの核形成ポリペプチドにより核形成される。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、例えば、以下：ＣＴＣＦ、コヒーシン、ノンコーディングＲＮＡ（例えば、エンハンサーＲＮＡ（ｅＲＮＡ））、転写機構タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、ＴＦＩＩＨなどからなる群から選択される１つ若しくは複数の転写因子）、転写調節因子（例えば、メディエータ（Ｍｅｄｉａｔｏｒ）、Ｐ３００、エンハンサー結合タンパク質、リプレッサー結合タンパク質、ヒストン修飾因子など）のうち１つ又は複数を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のゲノム複合体は、１つ若しくは複数のポリペプチド成分及び／又は１つ若しくは複数の核酸成分（例えば、１つ若しくは複数のＲＮＡ成分）を含み、それらは、一部の実施形態では、互いに及び／又は１つ若しくは複数のゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列、プロモータ配列、調節配列（例えば、エンハンサー配列）と相互作用することにより、ゲノムＤＮＡの１区間を、複合体が形成されなければ採用されないトポロジー立体配置中に閉じ込め得る。
部分：本明細書で用いられるとき、用語「部分」は、本明細書に記載されるように、特定の構造及び／又は活性を有する既知化学基又は実体を指す。
調節剤：本明細書で用いられるとき、用語「調節剤」は、１つ又は複数のターゲティング部分と１つ又は複数のエフェクター部分とを含み、標的遺伝子、例えば、ＦＸＮの発現を変更（例えば、増大又は低減する）ことができる薬剤を指す。
核形成ポリペプチド：本明細書で用いられるとき、用語「核形成ポリペプチド」又は「接合部核形成ポリペプチド」は、アンカー配列と直接又は間接的に結合するタンパク質を指し、これは、（アンカー配列又は別の核酸と相互作用し得る）１つ若しくは複数の接合部核形成ポリペプチドと相互作用して、互いに同じでも、同じでなくてもよい２つ以上のそうした接合部核形成ポリペプチドから成る二量体（若しくはより高次構造）を形成し得る。異なるアンカー配列と結合した接合部核形成ポリペプチドが互いに会合し、それにより、異なるアンカー配列が、互いに物理的に近接して維持されるとき、それによって生じる構造が、アンカー配列媒介接合部である。即ち、別の核形成ポリペプチド－アンカー配列と相互作用する核形成ポリペプチド－アンカー配列の密接な物理的近接によって、アンカー配列媒介接合部（いくつかのケースでは、ＤＮＡループ）が生じ、これは、アンカー配列で開始すると共に、終結する。本明細書を読む当業者には直ちに理解されるように、「核形成ポリペプチド」、「核形成分子」、「核形成タンパク質」、「接合部核形成タンパク質」といった用語は、場合によっては、接合部核形成ポリペプチドを示すために使用され得る。同様に本明細書を読む当業者には直ちに理解されるように、２つ以上の接合部核形成ポリペプチド（一部の実施形態では、同じ薬剤の複数のコピー及び／又は一部の実施形態では、複数の異なる薬剤の１つ若しくは複数を含み得る）のアセンブルコレクションは、「複合体」、「二量体」「多量体」などと呼ばれる場合もある。
作動可能に連結した：本明細書で用いられるとき、語句「作動可能に連結した」は、記載される成分が、その意図される様式でそれらを機能させることが可能な関係にある並置を指す。機能性エレメント、例えば、遺伝子と「作動可能に連結した」発現制御配列は、機能性エレメント、例えば、遺伝子の発現及び／又は活性が、発現制御配列と適合する条件下で達成されるように、結合されている。一部の実施形態では、「作動可能に連結した」発現制御配列は、目的のコーディングエレメント、例えば、遺伝子と連続的であり（例えば、共有している）；一部の実施形態では、作動可能に連結した発現制御配列は、目的の機能性エレメント、例えば、遺伝子に対してトランスで、或いはそうでなければそれから一定の距離の地点で作用する。一部の実施形態では、作動可能に連結したとは、２つの核酸配列が、同じ核酸分子上に含まれることを意味する。別の実施形態では、作動可能に連結したとは、さらに、２つの核酸配列が、同じ核酸分子上で互いに近接しており、例えば、互いに１０００、５００、１００、５０、若しくは１０塩基対内にあるか、又は互いに隣接していることを意味する場合もある。
医薬組成物：本明細書で用いられるとき、用語「医薬組成物」は、１つ又は複数の薬学的に許容できる担体と一緒に製剤化された活性薬剤（例えば、調節剤、例えば、妨害剤）を指す。一部の実施形態では、活性薬剤は、関連集団に投与されると、予定された治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンでの投与に適した単位用量で存在する。一部の実施形態では、医薬組成物は、固体又は液体形態での投与のために特別に製剤化してもよく、そうしたものとして以下：経口投与、例えば、飲薬（水性若しくは非水性溶液又は懸濁液）、錠剤、例えば、口腔、舌下、及び全身吸収を目的とするもの、ボーラス、粉末剤、顆粒剤、舌への適用のためのペースト剤；非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内若しくは硬膜外注射（例えば、滅菌溶液若しくは懸濁液として）、又は持続放出製剤；例えば、クリーム、軟膏としての局所適用、又は皮膚、肺、若しくは口腔に適用される制御放出パッチ若しくはスプレー；例えば、ペッサリー、クリーム、若しくはフォームとしての膣内若しくは直腸内；舌下；眼内；経皮；或いは鼻、肺、及び／又は他の粘膜表面のために設計されたものが挙げられる。
近接：本明細書で用いられるとき、「近接（した）」とは、第１部位での発現リプレッサーの結合及び／又は発現リプレッサードメインによる第１部位の修飾が、他方の部位の結合及び／又は修飾と同じ、若しくは実質的に同じ作用を生じるような、２つの部位、例えば、核酸部位の接近性を指す。例えば、ＤＮＡターゲティング部分は、エンハンサー（第２部位）と近接した第１部位に結合することができ、前記ＤＮＡターゲティング部分と結合したリプレッサーは、あたかも第２部位（エンハンサー配列）が結合及び／又は修飾されたのと実質的に同様に、標的遺伝子の発現に対するエンハンサーの作用が修飾されるように、第１部位をエピジェネティックに修飾することができる。一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内のエキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）に近接した、標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御配列に近接した、又はアンカー配列に近接した部位は、標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内のエキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）、転写制御配列、又はアンカー配列から５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、又は２５塩基対未満（及び任意選択的に、標的遺伝子（例えば、標的遺伝子内のエキソン、イントロン、若しくはスプライス部位）、転写制御配列、又はアンカー配列から少なくとも２０、２５、５０、１００、２００、若しくは３００塩基対の地点）にある。
特異的：本明細書で用いられるとき、用語「特異的」は、活性を有する薬剤を指し、当業者には、薬剤が、有望な標的実体又は状態を識別することを意味すると理解される。例えば、一部の実施形態では、薬剤は、１つ又は複数の競合する別の標的の存在下で、当該標的と優先的に結合すれば、その標的と「特異的に」結合すると言える。一部の実施形態では、特定の相互作用は、標的実体（例えば、エピトープ、間隙、結合部位）の特定の構造特徴の存在に依存する。特異性が絶対的である必要はないことは理解すべきである。一部の実施形態では、特異性は、１つ又は複数の有望な標的実体（例えば、競合者）に対する結合剤の特異性に対して評価される。一部の実施形態では、特異性は、参照特異的結合剤の特異性に対して評価される。一部の実施形態では、特異性は、参照非特異的結合剤の特異性に対して評価される。一部の実施形態では、薬剤又は実体は、その標的実体との結合の条件下で、別の競合標的と検出可能に結合しない。一部の実施形態では、結合剤は、別の競合標的と比較して、その標的実体に、より高い結合速度、より低い解離速度、増大した親和性、低減した解離、及び／又は増大した安定性で結合する。
実質的に：本明細書で用いられるとき、用語「実質的に」は、目的の特徴若しくは特性の全範囲若しくはほぼ全範囲又は程度を呈示する質的条件を指す。当業者には、生物学的及び化学的現象は、完了に到達する、且つ／又は完全性まで進行する、又は絶対的結果を達成若しくは回避することが、もしあるとしても、稀であるのは理解されよう。従って、用語「実質的に」は、本明細書のいくつかの実施形態において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性の欠如の可能性を捉えるために使用される場合もある。
標的：薬剤又は実体は、それらが互いに接触する条件下で、標的化薬剤又は実体と特異的に結合する場合、本開示に従って、別の薬剤又は実体を「ターゲティングする」とみなされる。一部の実施形態では、例えば、抗体（又はその抗原結合断片）は、そのコグネイトエピトープ若しくは抗原をターゲティングする。一部の実施形態では、特定の配列を有する核酸は、実質的に相補的な配列の核酸をターゲティングする。一部の実施形態では、標的との結合は、直接結合であり；一部の実施形態では、標的との結合は、間接的結合であり得る。一部の実施形態では、調節剤は、ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣを、例えば、上記ゲノム複合体、例えば、ＡＳＭＣの成分（例えば、ポリペプチド、核酸、及び／又はゲノム配列エレメント）との結合により、ターゲティングする。
標的遺伝子：本明細書で用いられるとき、用語「標的遺伝子」とは、調節、例えば、遺伝子の調節、又は上記遺伝子と結合したエピジェネティックマーカの調節のためにターゲティングされる遺伝子を意味する。一部の実施形態では、標的遺伝子は、標的化ゲノム複合体の一部（例えば、アンカー配列媒介接合部内部で、標的ゲノム複合体の一部としてそのゲノム配列の少なくとも一部を有する遺伝子）であり、このゲノム複合体は、本明細書に記載の１つ又は複数の調節剤によってターゲティングされる。一部の実施形態では、標的遺伝子は、本明細書に記載の調節剤により直接接触される標的遺伝子のゲノム配列により調節される。一部の実施形態では、標的遺伝子は、ゲノム複合体の１つ又は複数の成分により調節され、それは、本明細書に記載の調節剤により接触される部分である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、標的ゲノム複合体の外部にあり、例えば、それは、標的ゲノム複合体の成分（例えば、転写因子のサブユニット）をコードする遺伝子である。一部の実施形態では、標的遺伝子は、本明細書に記載されるゲノム複合体と関連する。
ターゲティング部分：本明細書で用いられるとき、用語「ターゲティング部分」とは、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）と近接した、及び／又は作動可能に連結したゲノム配列エレメント（例えば、発現制御配列若しくはアンカー配列）を特異的にターゲティングする、例えば、それと結合する薬剤又は実体を意味する。
治療有効量：本明細書で用いられるとき、用語「治療有効量」は、治療レジメンの一環として投与されると、所望の生物学的応答を誘発する物質（例えば、治療薬、組成物、及び／又は製剤）の量を意味する。一部の実施形態では、或る物質の治療有効量は、疾患、障害、及び／又は病状に罹患しているか、若しくは罹患しやすい対象に投与されると、疾患、障害、及び／又は病状を治療、診断、予防する、且つ／又はその発症を遅延させるのに十分な量である。当業者には理解されるように、或る物質の有効量は、所望の生物学的エンドポイント、送達しようとする物質、標的細胞又は組織などの要因に応じて変動し得る。例えば、一部の実施形態では、疾患、障害、及び／又は病状を治療するための製剤中の化合物の有効量は、疾患、障害、及び／又は病状の１つ若しくは複数の症状又は特徴を改善、緩和、軽減、阻害、予防し、その発症を遅延させ、その重症度を低減させ、且つ／又はその発生率を低下させる量である。一部の実施形態では、治療有効量は、単一用量で投与され；一部の実施形態では、治療有効量を送達するために、複数回用量が必要とされる。
本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を組む本特許又は特許出願公報のコピーは、要請及び必要費用の支払い時に特許庁から提供され得る。
図１Ａは、対照初代線維芽細胞（ＨＤＦｎ－正常）及びＦＲＤＡ患者由来の線維芽細胞（ＧＭ０４０７８）についてのＦＸＮに対するウエスタンブロットを示す。図１Ｂは、ＨＤＦｎ及びＧＭ０４０７８細胞においてＥＬＩＳＡにより測定されたＦＸＮタンパク質発現のグラフを示す。図１Ｃは、ＨＤＦｎ及びＧＭ０４０７８細胞においてアコニターゼのグラフを示す。 図２Ａは、未処理のＧＭ０４０７８細胞（Ｃｔｒｌ）、非ターゲティングｓｇＲＮＡを含む調節剤で処理したＧＭ０４０７８細胞（ＮＴ）又はＦＸＮ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡのいくつかのプールの１つを含む調節剤で４８時間処理したＧＭ０４０７８細胞におけるＨＰＲＴ１参照遺伝子に対するＦＸＮ遺伝子発現のグラフを示す。図２Ｂは、未処理のＧＭ０４０７８細胞（Ｃｔｒｌ）、非ターゲティングｓｇＲＮＡを含む調節剤で処理したＧＭ０４０７８細胞（ＮＴ）又はＦＸＮ遺伝子をターゲティングするｓｇＲＮＡのいくつかのプールの１つを含む調節剤で４８時間処理したＧＭ０４０７８細胞におけるＧＡＰＤＨ参照遺伝子に対するＦＸＮ遺伝子発現のグラフを示す。 図３Ａは、ＬＮＰトランスフェクションから４８時間後又はトランスフェクションから７２時間後の、非ターゲティングｓｇＲＮＡを含む調節剤で処理したＧＭ０４０７８細胞（ＮＴ）、又はｓｇＲＮＡのいくつかのプールの１つを含む調節剤で処理したＧＭ０４０７８細胞におけるＨＰＲＴ１に対するＦＸＮ遺伝子発現のグラフを示す。図３Ｂは、ＬＮＰトランスフェクションから４８時間後又はトランスフェクションから７２時間後の、未処理のＧＭ０４０７８細胞（Ｃｔｒｌ）、非ターゲティングｓｇＲＮＡを含む調節剤で処理したＧＭ０４０７８細胞（ＮＴ）、又はｓｇＲＮＡのいくつかのプールの１つを含む調節剤で処理したＧＭ０４０７８細胞におけるＦＸＮレベルを示す、ＦＸＮに対するウエスタンブロットを示す。 図４Ａは、ＬＮＰトランスフェクションから４８時間後に、調節剤で処理を受けたＧＭ０４０７８細胞及びＨＤＦｎ細胞株におけるＨＰＲＴ１参照遺伝子に対するＦＸＮ遺伝子発現のグラフを示す。図４Ｂは、ＬＮＰトランスフェクションから４８時間後に、調節剤で処理を受けたＧＭ０４０７８細胞及びＨＤＦｎ細胞株におけるＧＡＰＤＨ参照遺伝子に対するＦＸＮ遺伝子発現のグラフを示す。Ｃｔｒｌ：未処理（Ｃｔｒｌ）；ＮＴ：非ターゲティングｓｇＲＮＡを含む調節剤で処理；プール１又はプール４：ｓｇＲＮＡのプール１又はプール４のいずれかを含む調節剤で処理。 未処理ＧＭ０４０７８対照細胞、非ターゲティングｓｇＲＮＡを含む調節剤で処理したＧＭ０４０７８細胞（ＮＴ）、及びｓｇＲＮＡのいくつかのプールの１つ（プール１若しくはプール４）を含む調節剤で処理したＧＭ０４０７８細胞についての速度（ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）としてのアコニターゼ活性のグラフを示す。 ＦＸＮ遺伝子、反復領域、及びｓｇＲＮＡプールに含まれるｓｇＲＮＡの位置の略図を示す。 ＲＮＡ解析のための細胞の接種及びプロセシングのタイムライン（上）、及び例示的なｓｇＲＮＡのプールによりターゲティングされたゲノムＤＮＡの領域の略図（下）を示す。 例示的な融合分子（左側：ｄＣａｓ９－ＶＰＲ及び右側：ｄＣａｓ９－ｐ３００）での処理後のＷＴｉＰＳＣ由来心筋細胞（ｉ心筋細胞）及びＷＴｉＰＳＣ由来グルタミン酸作動性皮質ニューロン（ｉニューロン）におけるＦＸＮ遺伝子発現のグラフを示す。 ＴＡＬエフェクター分子又はｄＣａｓ９を含有するターゲティング分子と、ＶＰＲを含有するエフェクター分子とを含む調節剤で処理したＦＲＤＡ患者由来の線維芽細胞中のＲＮＡレベルにより測定される相対ＦＸＮ発現のグラフを示す。 ＴＡＬエフェクター分子又はｄＣａｓ９を含有するターゲティング分子と、ＶＰＲを含有するエフェクター分子とを含む調節剤で処理したＦＲＤＡ患者由来の線維芽細胞中のタンパク質レベルにより測定される相対ＦＸＮ発現のグラフを示す。 ｄＣａｓ９－ＶＰＲを含有する融合分子を含む調節剤を注射したマウスにおけるＲＮＡレベルにより測定される相対ＦＸＮ発現のグラフを注射後時点の増加量で示す。 ｄＣａｓ９－ＶＰＲを含有する融合分子を含む調節剤を注射したマウスにおけるタンパク質レベルにより測定される相対ＦＸＮ発現のグラフを注射後時点の増加量で示す。 ＦＲＤＡ患者又は正常な患者に由来する細胞中のＲＮＡレベルにより測定される相対ＦＸＮ発現のグラフを、処理後の様々な時点で示し、ここで、細胞は、ｄＣａｓ９－ＶＰＲを含有する融合分子を含む調節剤で処理した。 ＦＲＤＡ患者又は正常な患者に由来する細胞中のＲＮＡレベルにより測定される相対ＦＸＮ発現のグラフを、処理後の様々な時点で示し、ここで、細胞は、ｄＣａｓ９－ｐ３００を含有する融合分子を含む調節剤で処理した。 ｄＣａｓ９－ＶＰＲ又はｄＣａｓ９－ｐ３００のいずれかを含有する融合分子を含む調節剤で処理したＦＲＤＡ及び正常な患者に由来するｉＰＳＣ心筋細胞中のタンパク質レベルにより測定されるＦＸＮ発現のグラフを注射後時点の増加量で示す。
本明細書には、例えば、それを必要とする対象におけるフラタキシン（ＦＸＮ）発現を調節、例えば、増大するための組成物及び方法が提供される。ＦＲＤＡは、ＦＸＮタンパク質発現のレベルを低減するＦＸＮ遺伝子の常染色体ＧＡＡリピート伸長に関連する。理論に束縛されることは望まないが、ＦＲＤＡを患う対象（例えば、全体、又は１つ若しくは複数の特定の標的組織）におけるＦＸＮタンパク質のレベルの増加は、ＦＲＤＡの症状を軽減又は排除し得ると考えられる。本開示は、一部には、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）と作動可能に連結されたゲノム配列エレメント（例えば、発現制御エレメント）に結合するターゲティング部分と、ターゲティング部分により局在化されたとき標的遺伝子の発現を調節することができるエフェクター部分と、を含む調節剤を提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示される調節剤は、ターゲティング部分を介してＦＸＮ遺伝子と作動可能に連結された発現制御エレメント（例えば、プロモータ又はエンハンサー）に特異的に結合し、エフェクター部分が、ＦＸＮの発現を調節する。
本開示は、さらに、前記調節剤をコードする核酸並びに前記核酸を送達するための方法及び組成物も提供する。さらには、本明細書に記載される調節剤を用いて、細胞中のＦＸＮ発現を増大するための方法も提供される。
調節剤
本明細書に記載されるように、本開示は、本明細書に記載の調節剤と細胞を接触させることにより、標的遺伝子、例えば、ＦＸＮの発現を調節（例えば、増大）するための技術を提供する。一部の実施形態では、調節剤は、ターゲティング部分とエフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、調節剤は、ターゲティング部分と１つのエフェクター部分とを含む。一部の実施形態では、調節剤は、ターゲティング部分と、複数のエフェクター部分（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上のエフェクタードメイン（及び任意選択的に、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２未満のエフェクタードメイン））とを含む。
一般に、本明細書に記載の調節剤は、（例えば、ターゲティング部分を介して）標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）と近接した、及び／又はそれと作動可能に連結されたゲノム配列エレメントに結合する。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントと調節剤の結合によって、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現が調節される（例えば、増大する）。例えば、転写機構の成分を動員するか、又はその動員を阻害するエフェクター部分を含む調節剤と、ゲノム配列エレメントとの結合によって、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現が調節され得る（例えば、増大し得る）。別の例として、酵素活性を有するエフェクター部分（例えば、エピジェネティック修飾部分）を含む調節剤との結合により、エフェクター部分の酵素活性の局在化を介して標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現が調節され得る（例えば、増大し得る）。さらに別の例として、ゲノム配列エレメントと調節剤の結合及び調節剤の酵素活性の局在化の両方が、結果として起こる標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現の調節（例えば、増大）に寄与し得る。
一部の実施形態では、調節剤は、標的遺伝子の転写を促進することにより、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現を増大する。調節剤は、転写機構の成分を標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に動員することができる。調節剤は、転写の阻害剤と、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列の相互作用を阻害することができる。
一部の実施形態では、発現の増大は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）によりコードされるｍＲＮＡのレベルを増大することを含む。一部の実施形態では、発現の増大は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）によりコードされるタンパク質のレベルを増大することを含む。一部の実施形態では、発現の増大は、標的遺伝子によりコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルをいずれも増大することを含む。一部の実施形態では、調節剤と接触させた、又は調節剤を含む細胞における標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現は、調節剤と接触させていないか、又は調節剤を含まない類似細胞における標的遺伝子の発現のレベルより少なくとも１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、又は１００×高い。標的遺伝子の発現は、当業者には周知の方法によりアッセイすることができ、そうした方法として、ＲＴ－ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、又はウエスタンブロットが挙げられる。対象、例えば、患者、ＦＲＤＡを有する患者は、例えば、以下：Ｏｇｌｅｓｂｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．２０１３ Ｏｃｔ；５９（１０）：１４６１－９．ｄｏｉ：１０．１３７３／ｃｌｉｎｃｈｅｍ．２０１３．２０７４７２又はＤｅｕｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１４ Ｓｅｐ；８５（９）：９９４－１００２．ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｎｎｐ－２０１３－３０６７８８（その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）のいずれかの方法を用いて、ＦＸＮの血液（例えば、全血）レベルを評価することにより評価することができる。
本開示の調節剤を用いて、１細胞における標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現を一定期間にわたって増加させることができる。一部の実施形態では、調節剤と接触させた、又は調節剤を含む細胞における標的遺伝子の発現は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、若しくは１４日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）明らかに増加する。任意選択的に、調節剤と接触させた、又は調節剤を含む細胞における標的遺伝子の発現は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１年以下にわたって明らかに増加する。
調節剤は、複数のエフェクター部分を含んでもよく、ここで、各エフェクター部分は、他のエフェクター部分とは異なる機能性を有する。例えば、調節剤は、２つのエフェクター部分を含んでもよく、ここで、第１のエフェクター部分は、転写活性化因子の機能性を有し、第２のエフェクター部分は、ＤＮＡデメチラーゼ機能性を有する。一部の実施形態では、調節剤は、その機能性が、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現増大に関して、互いに相補的であるエフェクター部分を含み、例えば、その場合、機能性は発現の促進を可能にし、且つ、任意選択的に、個別に存在するとき、発現を促進しないか、又は無視できる程度にしか促進しない。一部の実施形態では、調節剤は、複数のエフェクター部分を含み、その場合、各エフェクター部分は、各々他方のエフェクター部分と補い合い、例えば、各エフェクター部分は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現を増大する。
一部の実施形態では、調節剤は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現の増大に関して、その機能性が互いに相乗効果を与えるエフェクター部分の組合せを含む。理論に束縛されることは望まないが、複数の転写活性化エピジェネティックマーカ（例えば、複数の異なるタイプのエピジェネティックマーカ及び／又は所与のタイプの大量生産）は各々が一緒になって、個別の修飾単独よりも効率的に発現を促進する（例えば、より大きな発現増大及び／又はより長い発現持続）ことから、ゲノム遺伝子座に対するエピジェネティック修飾は、累積的であると考えられる。一部の実施形態では、調節剤は、複数のエフェクター部分を含み、ここで、各エフェクター部分は、他方のエフェクター部分の各々と相乗作用をもたらし、例えば、各エフェクター部分は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現を増大する。一部の実施形態では、調節剤（互いに相乗作用をもたらす複数のエフェクター部分を含む）は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現の促進に関して、個別のエフェクター部分を含む調節剤よりも有効である。一部の実施形態では、前記複数のエフェクター部分を含む調節剤は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現の増大について、個別のエフェクター部分を含む調節剤より少なくとも１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、又は１００×有効である。
一部の実施形態では、調節剤は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連する１つ若しくは複数のエピジェネティックマーカを変更することにより、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現を調節（例えば、増大）する。一部の実施形態では、変更は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するエピジェネティックマーカのレベルを増加することを含む。一部の実施形態では、変更は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するエピジェネティックマーカのレベルを低下させることを含む。エピジェネティックマーカとして、限定されないが、ＤＮＡメチル化、ヒストンメチル化、及びヒストン脱アセチル化が挙げられる。
一部の実施形態では、エピジェネティックマーカのレベルの変更によって、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するエピジェネティックマーカのレベルを、調節剤と接触させていないか、又はそれを含まない細胞における標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するエピジェネティックマーカのレベルより少なくとも１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、若しくは１００×増加させる。一部の実施形態では、エピジェネティックマーカのレベルの変更によって、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するエピジェネティックマーカのレベルを、調節剤と接触させていないか、又はそれを含まない細胞における標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するエピジェネティックマーカのレベルより少なくとも１．０５×（即ち、１．０５倍）、１．１×、１．１５×、１．２×、１．２５×、１．３×、１．３５×、１．４×、１．４５×、１．５×、１．５５×、１．６×、１．６５×、１．７×、１．７５×、１．８×、１．８５×、１．９×、１．９５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、３０×、４０×、５０×、６０×、７０×、８０×、９０×、若しくは１００×低下させる。エピジェネティックマーカのレベルは、当業者には周知の方法により検定することができ、そうした方法として、全ゲノムバイサルファイトシーケンシング、簡約表示バイサルファイトシーケンシング、バイサルファイトアンプリコンシーケンシング、メチル化アレイ、パイロシーケンシング、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ、又はＣｈＩＰ－ｑＰＣＲが挙げられる。
本開示の調節剤を用いて、１細胞における標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するエピジェネティックマーカのレベルを一定期間にわたって変更することができる。一部の実施形態では、調節剤と接触させた、又は調節剤を含む細胞における標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するエピジェネティックマーカのレベルは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、若しくは１４日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）明らかに増加する。一部の実施形態では、調節剤と接触させた、又は調節剤を含む細胞における標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するエピジェネティックマーカのレベルは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、１０、若しくは１４日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）明らかに低下する。任意選択的に、調節剤と接触させた、又は調節剤を含む細胞における標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するエピジェネティックマーカのレベルは、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１年以下にわたって明らかに増加又は低下する。
調節剤は、融合分子であるか、又はそれを含み得る。一部の実施形態では、融合分子は、互いに、例えば、ペプチド結合により共有結合したターゲティング部分とエフェクター部分を含む。
一部の実施形態では、調節剤、例えば、融合分子のターゲティング部分は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、又は２０以下のヌクレオチド（及び任意選択的に、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０のヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、調節剤、例えば、融合分子のエフェクター部分は、２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、又は１００以下のアミノ酸（及び任意選択的に、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、又は１９００のアミノ酸）を含む。一部の実施形態では、調節剤、例えば、融合分子のエフェクター部分は、１００～２０００、１００～１９００、１００～１８００、１００～１７００、１００～１６００、１００～１５００、１００～１４００、１００～１３００、１００～１２００、１００～１１００、１００～１０００、１００～９００、１００～８００、１００～７００、１００～６００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、１００～２００、２００～２０００、２００～１９００、２００～１８００、２００～１７００、２００～１６００、２００～１５００、２００～１４００、２００～１３００、２００～１２００、２００～１１００、２００～１０００、２００～９００、２００～８００、２００～７００、２００～６００、２００～５００、２００～４００、２００～３００、３００～２０００、３００～１９００、３００～１８００、３００～１７００、３００～１６００、３００～１５００、３００～１４００、３００～１３００、３００～１２００、３００～１１００、３００～１０００、３００～９００、３００～８００、３００～７００、３００～６００、３００～５００、３００～４００、４００～２０００、４００～１９００、４００～１８００、４００～１７００、４００～１６００、４００～１５００、４００～１４００、４００～１３００、４００～１２００、４００～１１００、４００～１０００、４００～９００、４００～８００、４００～７００、４００～６００、４００～５００、５００～２０００、５００～１９００、５００～１８００、５００～１７００、５００～１６００、５００～１５００、５００～１４００、５００～１３００、５００～１２００、５００～１１００、５００～１０００、５００～９００、５００～８００、５００～７００、５００～６００、６００～２０００、６００～１９００、６００～１８００、６００～１７００、６００～１６００、６００～１５００、６００～１４００、６００～１３００、６００～１２００、６００～１１００、６００～１０００、６００～９００、６００～８００、６００～７００、７００～２０００、７００～１９００、７００～１８００、７００～１７００、７００～１６００、７００～１５００、７００～１４００、７００～１３００、７００～１２００、７００～１１００、７００～１０００、７００～９００、７００～８００、８００～２０００、８００～１９００、８００～１８００、８００～１７００、８００～１６００、８００～１５００、８００～１４００、８００～１３００、８００～１２００、８００～１１００、８００～１０００、８００～９００、９００～２０００、９００～１９００、９００～１８００、９００～１７００、９００～１６００、９００～１５００、９００～１４００、９００～１３００、９００～１２００、９００～１１００、９００～１０００、１０００～２０００、１０００～１９００、１０００～１８００、１０００～１７００、１０００～１６００、１０００～１５００、１０００～１４００、１０００～１３００、１０００～１２００、１０００～１１００、１１００～２０００、１１００～１９００、１１００～１８００、１１００～１７００、１１００～１６００、１１００～１５００、１１００～１４００、１１００～１３００、１１００～１２００、１２００～２０００、１２００～１９００、１２００～１８００、１２００～１７００、１２００～１６００、１２００～１５００、１２００～１４００、１２００～１３００、１３００～２０００、１３００～１９００、１３００～１８００、１３００～１７００、１３００～１６００、１３００～１５００、１３００～１４００、１４００～２０００、１４００～１９００、１４００～１８００、１４００～１７００、１４００～１６００、１４００～１５００、１５００～２０００、１５００～１９００、１５００～１８００、１５００～１７００、１５００～１６００、１６００～２０００、１６００～１９００、１６００～１８００、１６００～１７００、１７００～２０００、１７００～１９００、１７００～１８００、１８００～２０００、１８００～１９００、又は１９００～２０００アミノ酸を含む。
調節剤は、核酸、例えば、１つ又は複数の核酸を含み得る。用語「核酸」は、オリゴヌクレオチド鎖中に組み込まれているか、又は組み込まれ得る任意の化合物を指す。一部の実施形態では、核酸は、リン酸ジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖中に組み込まれているか、又は組み込まれ得る化合物及び／若しくは物質である。文脈から明らかになるように、一部の実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）を指し；一部の実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるか、又はそれを含み；一部の実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、核酸は、５０％未満のリボヌクレオチドであるか、又はそれを含み、本明細書では、リボ核酸（ＲＮＡ）と呼ばれる。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数の天然の核酸残基であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数の核酸アナログであるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸アナログは、それがリン酸ジエステル骨格を利用しない点で、核酸とは異なる。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数の「ペプチド核酸」であるか、それを含むか、又はそれから構成され、ペプチド核酸は、当技術分野で公知であり、骨格にリン酸ジエステル結合ではなくペプチド結合を有するものであり、これらは本発明の範囲に含まれるとみなされる。これに代わり、又は加えて、一部の実施形態では、核酸は、リン酸ジエステル結合ではなく、１つ若しくは複数のホスホロチオエート及び／又は５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数のヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、介在塩基、及びそれらの組合せ）であるか、それを含むか、又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、天然の核酸に存在するものと比較して、１つ若しくは複数の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ又はタンパク質などの機能性遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然の供給源からの単離、相補性鋳型に基づく重合による酵素合成（インビボ若しくはインビトロ）、組換え細胞若しくは系中での生殖、及び化学合成のうちの１つ又は複数により調製される。本明細書で使用されるとき、核酸を表すために用いられる場合の「組換え」は、天然に存在しない任意の核酸を指す。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００残基長又はそれ以上である。一部の実施形態では、核酸は、約２～約５０００ｎｔ、約１０～約１００ｎｔ、約５０～約１５０ｎｔ、約１００～約２００ｎｔ、約１５０～２５０ｎｔ、約２００～約３００ｎｔ、約２５０～約３５０ｎｔ、約３００～約５００ｎｔ、約１０～約１０００ｎｔ、約５０～約１０００ｎｔ、約１００～約１０００ｎｔ、約１０００～約２０００ｎｔ、約２０００～約３０００ｎｔ、約３０００～約４０００ｎｔ、約４０００～約５０００ｎｔ、又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。一部の実施形態では、核酸は、一部が、又は完全に一本鎖であり；一部の実施形態では、核酸は、一部が、又は完全に二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするか、又はポリペプチドをコードする配列の補体である少なくとも１つのエレメントを含むヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、核酸を含むか、又は核酸である。一部の実施形態では、エフェクター部分は、核酸を含むか、又は核酸である。一部の実施形態では、部分に含まれ得る核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又は人工若しくは合成核酸又は核酸アナログ若しくは模倣物であってもよいし、或いはそれを含有してもよい。例えば、一部の実施形態では、核酸は、以下：ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ若しくは他のＲＮＡｉ分子（例えば、本明細書に記載されるノンコーディングＲＮＡをターゲティングするもの、及び／又は本明細書に記載される標的化ゲノム複合体に関連する特定の遺伝子の発現産物をターゲティングするもの）などのうちの１つ若しくは複数であるか、又はそれを含み得る。調節剤に使用するのに好適な核酸配列として、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、化学修飾、例えば、骨格連結、糖分子、及び／若しくは核酸塩基を変更する修飾など）、並びに／又は人工核酸を挙げることができる。一部の実施形態では、核酸配列として、限定されないが、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）若しくはペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋核酸（ＢＮＡ）、ポリアミド、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、修飾ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ又は他のＲＮＡ若しくはＤＮＡ分子が挙げられる。一部の実施形態では、核酸は、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡ残基ではない１つ若しくは複数の残基を含んでもよく、リン酸ジエステル結合ではない１つ若しくは複数の連結（例えば、ホスホロチオエート結合などであり得る）を含んでもよく、且つ／又は例えば、２’－ＯＭｅＰといった２’Ｏ修飾などの１つ若しくは複数の修飾を含んでもよい。合成核酸を調製するのに有用な種々の核酸構造は当技術分野で公知であり（例えば、国際公開第２０１７／０６２８６２ｌ号パンフレット及び同第２０１４／０１２０８１号パンフレットを参照）、当業者は、これらが、本開示に従って使用され得ることを理解されよう。
核酸のいくつかの例として、限定されないが、内因性標的遺伝子、例えば、ＦＸＮ（例えば、本明細書の他所に記載されるｇＲＮＡ若しくはアンチセンスｓｓＤＮＡ）とハイブリダイズする核酸、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡなどの外性核酸とハイブリダイズする核酸、ＲＮＡとハイブリダイズする核酸、遺伝子転写に干渉する核酸、ＲＮＡ翻訳に干渉する核酸、ＲＮＡを安定化するか、又は分解のためのターゲティングなどによってＲＮＡを不安定化する核酸、その発現若しくはその機能の干渉によるＤＮＡ又はＲＮＡ結合因子に干渉する核酸、細胞内タンパク質若しくはタンパク質複合体と連結して、その機能を調節する核酸が挙げられる。
一部の実施形態では、調節剤は、１つ又は複数のヌクレオシドアナログを含む。一部の実施形態では、核酸配列は、１つ又は複数の天然ヌクレオシドヌクレオシドに加えて、又はそれに代わるものとして、例えば、プリン若しくはピリミジン、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミン及びウラシル、１つ若しくは複数のヌクレオシドアナログを含んでもよい。一部の実施形態では、核酸配列は、１つ又は複数のヌクレオシドアナログを含む。ヌクレオシドアナログとして、限定されないが、ヌクレオシドアナログ、例えば、５－フルオロウラシル；５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、４－メチルベンズイミダゾール、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ジヒドロウリジン、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルキューオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、２，６－ジアミノプリン、３－ニトロピロール、イノシン、チオウリジン、キューオシン、ワイオシン、ジアミノプリン、イソグアニン、イソシトシン、ジアミノピリミジン、２，４－ジフルオロトルエン、イソキノリン、ピロロ［２，３－β］ピリジン、及びプリン又はピリミジン側鎖と塩基対合することができるいずれか他のものが挙げられる。
ターゲティング部分
ターゲティング部分は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）に近接した、及び／又はそれと作動可能に連結したゲノム配列エレメント（例えば、発現制御配列若しくはアンカー配列）を特異的にターゲティングし、例えば、それに結合する薬剤又は実体を指す。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の成分をターゲティングし、例えば、それに結合する。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ＦＸＮと作動可能に連結した発現制御配列（例えば、プロモータ又はエンハンサー）をターゲティングし、例えば、それに結合する。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）又は標的遺伝子の一部をターゲティングし、例えば、それに結合する。ターゲティング部分の標的は、その標的化成分と呼ばれることもある。標的化成分は、標的遺伝子と作動可能に連結した任意のゲノム配列エレメント、又は標的遺伝子自体であってもよく、そうしたものとして、限定されないが、プロモータ、エンハンサー、アンカー配列、エキソン、イントロン、ＵＴＲコード配列、スプライス部位、又は転写開始部位が挙げられる。
一部の実施形態では、ターゲティング部分とその標的化成分との間の相互作用は、標的化成分がそうでなければ形成するであろう１つ又は複数の他の相互作用に干渉する。一部の実施形態では、ターゲティング部分と標的化成分との間の結合は、標的化成分が、別の転写因子、ゲノム複合体成分、又はゲノム配列エレメントと相互作用するのを阻止する。一部の実施形態では、ターゲティング部分と標的化成分との結合は、別の転写因子、ゲノム複合体成分、又はゲノム配列エレメントに対する標的化成分の結合親和性を低減する。一部の実施形態では、別の転写因子、ゲノム複合体成分、又はゲノム配列エレメントに対する標的化成分のＫＤは、ターゲティング部分を含む調節剤の存在下で、ターゲティング部分を含む調節剤が存在しない場合に比して、少なくとも１．０５×（即ち、１．０５ 倍）、１．１×、１．２×、１．３×、１．４×、１．５×、１．６×、１．７×、１．８×、１．９×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２０×、５０×、又は１００×（及び任意選択的に、２０×、１０×、９×、８×、７×、６×、５×、４×、３×、２×、１．９×、１．８×、１．７×、１．６×、１．５×、１．４×、１．３×、１．２×、又は１．１×以下）増加する。別の転写因子に対する標的化成分、ゲノム複合体成分、又はゲノム配列エレメントのＫＤの変化は、ＣｈＩＰ－Ｓｅｑ又はＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを用いて決定される。
一部の実施形態では、ターゲティング部分と標的化成分との結合は、標的化成分を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のレベルを変更、例えば、低減する。一部の実施形態では、標的化成分を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のレベルは、ターゲティング部分を含む調節剤の存在下で、前記調節剤が存在しない場合に比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％（及び任意選択的に、最大１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、又は２０％）低減する。一部の実施形態では、ターゲティング部分と標的化成分との結合は、ゲノム配列エレメント（例えば、標的遺伝子、又はそれと作動可能に連結した発現制御配列）において、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の占有を変更、例えば、低減する。一部の実施形態では、占有は、ターゲティング部分を含む調節剤の存在下で、前記調節剤が存在しない場合に比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％（及び任意選択的に、最大１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、又は２０％）低減する。ゲノム複合体の形成、他の複合体成分に対する標的化成分の親和性の変化、及び／又はゲノムによる影響を受けるゲノムＤＮＡのトポロジーの変化は、例えば、ＨｉＣｈＩＰ、ＣｈＩＡＰＥＴ、４Ｃ、若しくは３Ｃ、例えば、ＨｉＣｈＩＰを用いて評価され得る。
一部の実施形態では、ターゲティング部分と標的化成分との結合は、ゲノム配列エレメント（例えば、遺伝子、プロモータ、又はエンハンサー、例えば、ゲノム若しくは転写複合体に関連するもの）におけるゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の占有を変更、例えば、低減する。一部の実施形態では、ターゲティング部分と標的化成分との結合は、ゲノム配列エレメントにおけるゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の占有を、ターゲティング部分を含む調節剤の存在下で、前記調節剤の非存在下に比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％（及び任意選択的に、最大１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、又は２０％）低減する。一部の実施形態では、占有は、例えば、ＨｉＣ、ＣｈＩＰ、免疫沈降、又は当技術分野で公知の他の結合測定アッセイにより決定して、或るエレメントが別のエレメントと結合した状態で見出され得る頻度を指す。一部の実施形態では、占有は、完全性指数を用いて決定することができる（例えば、完全性指数の変化は、占有の変化に対応し得る）。
一部の実施形態では、ターゲティング部分と標的化成分との結合は、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）中／ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）での標的化成分の占有を変更、例えば、低減する。一部の実施形態では、ターゲティング部分と標的化成分との結合は、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）中／ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）での標的化成分の占有を、ターゲティング部分を含む調節剤の存在下で、前記調節剤が存在しない場合に比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％（及び任意選択的に、最大１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、又は２０％）低減する。
一部の実施形態では、ターゲティング部分と標的化成分との結合により、標的化成分に関連する及び／又はそれと作動可能に連結した標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現が変更される（例えば、増大する）。一部の実施形態では、ターゲティング部分と標的化成分との結合により、標的化成分を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）に関連する標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現が変更される（例えば、増大する）。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現は、ターゲティング部分を含む調節剤の存在下で、前記調節剤が存在しない場合に比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００％（及び任意選択的に、最大１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、又は２００％）増大する。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、同じシステム（例えば、細胞、組織など）に存在し得る他のゲノム配列に比して、それが特定のゲノム配列エレメント（例えば、前記ゲノム配列エレメントを含む特定のゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ））を特異的にターゲティングする、例えば、それに結合するように、設計及び／又は投与される。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、標的化成分、例えば、発現制御配列、アンカー配列、又は標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）と相補的な核酸配列を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、標的化成分に対して少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、若しくは１００％相補的な核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子、ＴＡＬエフェクター分子、Ｚｎフィンガー分子、又は核酸分子であるか、又はそれを含み得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子であるか、又はそれを含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子は、クラスター化した規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムに関与するタンパク質、例えば、Ｃａｓタンパク質、及び任意選択的にガイドＲＮＡ、例えば、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、細菌及び古細菌中に最初に発見された適応型防御システムである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ関連又は「Ｃａｓ」エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９若しくはＣｐｆ１）と呼ばれるＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを用いて、外来ＤＮＡを切断する。例えば、典型的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、エンドヌクレアーゼは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列をターゲティングする配列特異的、ノンコーディング「ガイドＲＮＡ」により標的ヌクレアーゼ配列（例えば、配列編集しようとするゲノム内の部位）に向けられる。３つのクラス（Ｉ～ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが同定されている。クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、単一のＣａｓエンドヌクレアーゼ（複数のＣａｓタンパク質ではなく）を使用する。１クラスのＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、及びトランス作用性ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）を含む。ｃｒＲＮＡは、「ガイドＲＮＡ」を含み、これは、典型的には約２０ヌクレオチドＲＮＡ配列であり、標的ＤＮＡ配列に対応する。ｃｒＲＮＡはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合して、部分的二本鎖構造を形成する領域を含み、この構造が、ＲＮａｓｅＩＩＩにより切断されて、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが得られる。次に、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを指令して、標的ＤＮＡ配列を認識させ、これを切断させる。標的ＤＮＡ配列は、概して、所与のＣａｓエンドヌクレアーゼに特異的な「プロトスペーサ隣接モチーフ」（「ＰＡＭ」）と隣接していなければならないが；ＰＡＭ配列は、所与のゲノム全体にわたって出現する。多様な原核生物種から同定されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、ユニークなＰＡＭ配列要件を有し；ＰＡＭ配列の例としては、５’－ＮＧＧ（化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、５’－ＮＮＡＧＡＡ（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１）、５’－ＮＧＧＮＧ（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３）、及び５’－ＮＮＮＧＡＴＴ（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ））が挙げられる。いくつかのエンドグルカナーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇ－リッチＰＡＭ部位、例えば、５’－ＮＧＧと結合し、ＰＡＭ部位から（その５’側）３ヌクレオチド上流の位置で標的ＤＮＡの平滑末端切断を実施する。別のクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９より小さいＶ型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１を含み；例として、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）由来）及びＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラ科種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．）由来）が挙げられる。Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせずに成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ；言い換えれば、Ｃｐｆ１システムは、標的ＤＮＡ配列を切断するために、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼとｃｒＲＮＡしか必要としない。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、Ｔ－リッチＰＡＭ部位、例えば、５‘－ＴＴＮと結合する。Ｃｐｆ１はまた、５’－ＣＴＡ ＰＡＭモチーフも認識する。Ｃｐｆ１は、４－若しくは５－ヌクレオチド５’オーバーハングを有するオフセット又はスタッガード二本鎖切断を導入する、例えば、コーディング鎖上のＰＡＭから（その３’側）１８ヌクレオチド下流及び相補鎖上のＰＡＭから２３ヌクレオチド下流に位置する５－ヌクレオチドオフセット又はスタッガード切断を用いて標的ＤＮＡを切断することにより、標的ＤＮＡを切断し；こうしたオフセット切断によって生じる５－ヌクレオチドオーバーハングは、平滑末端切断ＤＮＡでの挿入によるものと比較して、相同組換えによるＤＮＡ挿入によってさらに正確なゲノム編集を可能にする。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ，１６３：７５９－７７１を参照されたい。
多種多様なＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子又はタンパク質を、本開示に提供される技術で使用することができ、Ｃａｓタンパク質の選択は、本方法の特定の条件に応じて変化し得る。Ｃａｓタンパク質の具体的な例として、クラスＩＩシステムが挙げられ、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、又はＣ２Ｃ３を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、多様な原核生物種のいずれに由来するものでもよい。一部の実施形態では、特定のＣａｓタンパク質、例えば、特定のＣａｓ９タンパク質は、特定のプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識するように選択される。一部の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分として、配列ターゲティングポリペプチド、例えば、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９が挙げられる。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、細菌若しくは古細菌から取得するか、又は公知の方法を用いて合成してもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、グラム陽性菌又はグラム陰性菌に由来するものであってもよい。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、若しくはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（例えば、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、スタフィロコッカッス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィラス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、又はマリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）に由来するものであってよい。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質が結合及び／又は機能するために、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的ＤＮＡ配列中に存在するか、若しくはそれと隣接する必要がある。一部の実施形態では、ＰＡＭは、５’から３’に、ＮＧＧ、ＹＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＧＡ、ＴＹＣＶ、ＴＡＴＶ、ＮＴＴＮ、又はＮＮＮＧＡＴＴであるか、又はそれを含み、ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドを表し、Ｙは、Ｃ又はＴを表し、Ｒは、Ａ又はＧを表し、Ｖは、Ａ又はＣ又はＧを表す。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、表１に挙げるタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、そのＰＡＭを変更する１つ又は複数の突然変異を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ１３６９Ｒ、Ｅ１４４９Ｈ、及びＲ１５５６Ａ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、及びＲ１０１５Ｈ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、及びＴ１３３７Ｒ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ５４２Ｒ、Ｋ５４８Ｖ、及びＮ５５２Ｒ突然変異、又は前記位置に対応するアミノ酸への類似の置換を含む。
Figure 2022548800000002
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質を修飾して、ヌクレアーゼを不活性化する（例えば、ヌクレアーゼ欠失Ｃａｓ９）。野生型Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡがターゲティングする特定のＤＮＡ配列に二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成するのに対し、修飾された機能性を有するいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが入手可能であり、例えば：Ｃａｓ９の「ニッカーゼ」バージョンは、一本鎖切断のみを生成し；触媒として不活性のＣａｓ９（「ｄＣａｓ９」）は、標的ＤＮＡを切断しない。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列とｄＣａｓ９の結合は、立体障害により当該部位の転写に干渉する。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、触媒として不活性のＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９であるか、又はそれを含む。触媒として不活性の多くのＣａｓ９タンパク質が当技術分野で知られている。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメインに突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ突然変異を含む。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ｇＲＮＡを含むか、又はそれと（例えば、共有）結合したＣａｓ分子を含み得る。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ－タンパク質結合に必要な「スカフォールド」配列と、ゲノム標的のためのユーザ定義の約２０ヌクレオチドターゲティング配列から構成される短い合成ＲＮＡである。実際には、ガイドＲＮＡ配列は、概して１７～２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０、又は２１ヌクレオチド）の間の長さを有するように設計され、且つ標的化核酸配列に対して相補的である。カスタムｇＲＮＡジェネレータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用する目的で市販されている。遺伝子編集はまた、キメラ「単一ガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）、操作（合成）単一ＲＮＡ分子を用いても達成されており、これは、天然に存在するｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼとの結合用）と、少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のためにターゲティングされる配列にヌクレアーゼを誘導する）の両方を含有する。キメラ編集ｓｇＲＮＡはまた、Ｃａｓタンパク質と一緒に使用する上で有効であることが実証されている；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９９１を参照されたい。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的遺伝子に関連するＤＮＡ配列と相補的な核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御エレメントであるか、それを含むか、又はそれと重複する。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、表３に記載されるゲノム配列であるか、それを含むか、又はそれと重複する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、表３に記載されるゲノム配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９９、又は１００％相補的な核酸配列を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号４～２６から選択される核酸配列、又は配列番号４～２６から選択される配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と一緒に使用されるｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。
ＴＡＬエフェクター分子
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ＴＡＬエフェクター分子であるか、又はそれを含む。ＴＡＬエフェクター分子、例えば、ＤＮＡ配列に特異的に結合するＴＡＬエフェクター分子は、複数のエフェクタードメイン又はその断片と、任意選択的に天然に存在するＴＡＬエフェクター（例えば、複数のＴＡＬエフェクタードメインのＮ－及び／又はＣ－末端）の１つ若しくは複数の別の部分を含む。
ＴＡＬＥは、宿主植物における遺伝子発現を調節して、細菌のコロニー形成及び生存を促進する植物病原菌キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）などの多くの病原菌種により分泌される天然のタンパク質である。ＴＡＬエフェクターの特異的な結合は、典型的には３３又は３４アミノ酸のタンデムに配列されたほぼ同一の反復配列から成る中央リピートドメイン（リピート可変二残基、ＲＶＤドメイン）に基づく。
ＴＡＬエフェクターファミリーのメンバーは、主にそれらのリピートの数及び順序が異なる。反復配列の数は、１．５～３３．５リピートの範囲であり、Ｃ－末端リピートは、通常、長さが短く（例えば、約２０アミノ酸）、一般に「ハーフリピート」と呼ばれる。ＴＡＬエフェクターの各リピートは、異なる塩基対特異性を呈示する異なるリピートタイプとの１リピート対１塩基対相関を特徴とする（１リピートが、標的遺伝子配列上の１塩基対を認識する）。概して、リピートの数が少ないほど、タンパク質－ＤＮＡ相互作用が弱くなる。６．５リピートの数は、リポータ遺伝子の転写を活性化する上で十分であることが判明している（Ｓｃｈｏｌｚｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
リピート対リピートの変化は、主としてアミノ酸位置１２及び１３で起こり、そのため、これらは、「超可変」と呼ばれており、また、これは、例示的なリピート可変二残基（ＲＶＤ）及び核酸塩基標的とのそれらの対応を列記する表２に示すように、標的ＤＮＡプロモータ配列との相互作用の特異性の原因となる。
Figure 2022548800000003
従って、特定のＤＮＡ配列をターゲティングするように、ＴＡＬエフェクターのリピートを修飾することが可能である。さらなる研究から、ＲＶＤ ＮＫがＧをターゲティングすることができることが明らかにされている。ＴＡＬエフェクターの標的部位は、最初のリピートがターゲティングする５’塩基とフランキングするＴを含む傾向もあるが、この認識の厳密な機構は不明である。現在までに１１３を超えるＴＡＬエフェクター配列がわかっている。キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）からのＴＡＬエフェクターの非限定的な例として、Ｈａｘ２、Ｈａｘ３、Ｈａｘ４、ＡｖｒＸａ７、ＡｖｒＸａ１０及びＡｖｒＢｓ３が挙げられる。
従って、本発明のＴＡＬエフェクター分子のＴＡＬエフェクタードメインは、任意の細菌種（例えば、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種、例えば、白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．Ｏｒｙｚａｅ）のアフリカ株（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．２０１１）、アブラナ科野菜斑点細菌病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｒａｐｈａｎｉ）株７５６Ｃ及びイネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚｉｃｏｌａ）株ＢＬＳ２５６（Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ ｅｔ ａｌ．２０１１）由来のＴＡＬエフェクターから得ることができる。本明細書で使用される場合、本発明に従うＴＡＬエフェクタードメインは、ＲＶＤドメイン、並びにやはり天然に存在するＴＡＬエフェクター由来のフランキング配列（ＲＶＤのＮ－末端及び／又はＣ－末端上の配列）を含む。これは、天然に存在するＴＡＬエフェクターのＲＶＤより多いか、又は少ないリピートを含み得る。本発明のＴＡＬエフェクター分子は、前述のコード及び当技術分野で既知の他のコードに基づく所与のＤＮＡ配列をターゲティングするように設計される。ＴＡＬエフェクタードメイン（例えば、リピート（モノマー又はモジュール）の数及びそれらの配列は、所望のＤＮＡ標的配列に基づいて選択される。例えば、特定の標的配列に合わせるために、ＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートを除去又は付加してもよい。一実施形態では、本発明のＴＡＬエフェクター分子は、６．５～３３．５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートを含む。一実施形態では、本発明のＴＡＬエフェクター分子は、８～３３．５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピート、例えば、１０～２５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピート、例えば、１０～１４のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートを含む。
一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクター分子は、ＤＮＡ標的配列との完全なマッチに対応するＴＡＬエフェクタードメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的配列上のリピートと標的塩基対との間のミスマッチは、それが、発現抑制システム、例えば、ＴＡＬエフェクター分子を含む発現リプレッサーの機能を可能にする場合に限って許容される。一般に、ＴＡＬＥ結合は、ミスマッチの数と逆相関する。一部の実施形態では、本発明の発現リプレッサーのＴＡＬエフェクター分子は、標的ＤＮＡ配列に対して、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、又は１つ以下のミスマッチ、また任意選択的にゼロのミスマッチを含む。理論に束縛されることは望まないが、一般に、ＴＡＬエフェクター分子中のＴＡＬエフェクタードメインの数が少ないほど、より少数のミスマッチが許容され、これは、発現抑制システム、例えば、ＴＡＬエフェクター分子を含む発現リプレッサーの機能を依然として可能にする。結合親和性は、マッチするリピート－ＤＮＡ組合せの合計に依存すると考えられる。例えば、２５以上のＴＡＬエフェクタードメインを有するＴＡＬエフェクター分子は、最大７つのミスマッチを許容することができる。
ＴＡＬエフェクタードメインに加えて、本発明のＴＡＬエフェクター分子は、天然に存在するＴＡＬエフェクターに由来する追加の配列を含んでもよい。ＴＡＬエフェクター分子のＴＡＬエフェクタードメイン部分の両側に含まれるＣ－末端及び／又はＮ－末端配列の長さは、変動し得、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）の研究に基づいて、当業者により選択することができる。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．は、Ｈａｘ３由来のＴＡＬエフェクターベースのタンパク質中のいくつかのＣ－末端及びＮ－末端切断変異体を特性決定し、標的配列との最適な結合、従って転写の活性化に寄与する重要なエレメントを同定した。概して、転写活性は、Ｎ－末端の長さと逆相関することが判明した。Ｃ－末端に関しては、Ｈａｘ３配列の最初の６８アミノ酸内のＤＮＡ結合残基に重要なエレメントが同定された。従って、一部の実施形態では、天然に存在するＴＡＬエフェクターのＴＡＬエフェクタードメインのＣ－末端側の最初の６８アミノ酸は、本発明の発現リプレッサーのＴＡＬエフェクター分子に含まれる。従って、一実施形態では、本発明のＴＡＬエフェクター分子は、以下：１）天然に存在するＴＡＬエフェクター由来の１つ若しくは複数のＴＡＬエフェクタードメイン；２）ＴＡＬエフェクタードメインのＮ－末端側の天然に存在するＴＡＬエフェクター由来の少なくとも７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０以上のアミノ酸；及び／又は３）ＴＡＬエフェクタードメインのＣ－末端側の少なくとも６８、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０以上のアミノ酸を含む。
Ｚｎフィンガー分子
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、Ｚｎフィンガー分子であるか、又はそれを含む。Ｚｎフィンガー分子は、Ｚｎフィンガータンパク質、例えば、天然に存在するＺｎフィンガータンパク質若しくは操作Ｚｎフィンガータンパク質、又はその断片を含む。
一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、選択した標的ＤＮＡ配列に結合するように操作された非天然のＺｎフィンガータンパク質を含む。例えば、以下を参照されたい：Ｂｅｅｒｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０；Ｉｓａｌａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０；Ｓｅｇａｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７；Ｃｈｏｏ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；同第６，５３４，２６１号明細書；同第６，５９９，６９２号明細書；同第６，５０３，７１７号明細書；同第６，６８９，５５８号明細書；同第７，０３０，２１５号明細書；同第６，７９４，１３６号明細書；同第７，０６７，３１７号明細書；同第７，２６２，０５４号明細書；同第７，０７０，９３４号明細書；同第７，３６１，６３５号明細書；同第７，２５３，２７３号明細書；及び米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書；同第２００７／０２１８５２８号明細書；同第２００５／０２６７０６１号明細書（全て、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。
操作Ｚｎフィンガータンパク質は、天然に存在するＺｎフィンガータンパク質と比較して、新たな結合特異性を有し得る。操作方法として、限定されないが、合理的設計及び様々なタイプの選択が挙げられる。合理的設計は、例えば、トリプレット（クアドルプレット）ヌクレオチド配列と個別のＺｎフィンガーアミノ酸配列の使用を含み、ここで、トリプレット又はクアドルプレットヌクレオチド配列は各々、上記の特定のトリプレット又はクアドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１つ若しくは複数のアミノ酸配列と結合している。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号明細書及び同第６，５３４，２６１号明細書（それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ファージディスプレイ及びツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法が、以下：米国特許第５，７８９，５３８号明細書；同第５，９２５，５２３号明細書；同第６，００７，９８８号明細書；同第６，０１３，４５３号明細書；同第６，４１０，２４８号明細書；同第６，１４０，４６６号明細書；同第６，２００，７５９号明細書；及び同第６，２４２，５６８号明細書；並びに国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；同第９８／５３０５７号パンフレット；同第００／２７８７８号パンフレット；及び同第０１／８８１９７号パンフレット並びに英国特許第２，３３８，２３７号明細書に開示されている。加えて、ジンクフィンガータンパク質に対する結合特異性の増強が、例えば、国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
さらに、上記の参照文献及びその他の参照文献に開示されているように、ジンクフィンガードメイン及び／又はマルチフィンガージンクフィンガータンパク質は、任意の好適なリンカー配列を用いて互いに連結されていてもよく、そうしたリンカーとして例えば、長さが５アミノ酸以上のリンカーが挙げられる。また、長さが６アミノ酸以上の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；同第６，９０３，１８５号明細書；及び同第７，１５３，９４９号明細書を参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、当該タンパク質の個々のジンクフィンガー間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強については、例えば、共同所有国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築のためのＺｎフィンガータンパク質及び方法は、当業者には周知であり、以下に詳しく記載されている：米国特許第６，１４０，０８１５号明細書；同第７８９，５３８号明細書；同第６，４５３，２４２号明細書；同第６，５３４，２６１号明細書；同第５，９２５，５２３号明細書；同第６，００７，９８８号明細書；同第６，０１３，４５３号明細書；及び同第６，２００，７５９号明細書；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；同第９６／０６１６６号パンフレット；同第９８／５３０５７号パンフレット；同第９８／５４３１１号パンフレット；同第００／２７８７８号パンフレット；同第０１／６０９７０号パンフレット；同第０１／８８１９７号パンフレット；同第０２／０９９０８４号パンフレット；同第９８／５３０５８号パンフレット；同第９８／５３０５９号パンフレット；同第９８／５３０６０号パンフレット；同第０２／０１６５３６号パンフレット；及び同第０３／０１６４９６号パンフレット。
さらに、上記の、及びその他の参照文献に開示されているように、ジンクフィンガータンパク質及び／又はマルチフィンガーＺｎフィンガータンパク質は、例えば、融合タンパク質と同様に、任意の好適なリンカー配列を用いて互いに連結されていてもよく、そうしたリンカーとして例えば、長さが５アミノ酸以上のリンカーが挙げられる。また、長さが６アミノ酸以上の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；同第６，９０３，１８５号明細書；及び同第７，１５３，９４９号明細書を参照されたい。本明細書に記載されるＺｎフィンガー分子は、当該Ｚｎフィンガー分子の個々のジンクフィンガータンパク質及び／又はマルチフィンガーＺｎフィンガータンパク質の間に好適なリンカーの任意の組合せを含んでもよい。
特定の実施形態では、ＤＮＡターゲティング部分は、標的ＤＮＡ配列に（配列特異的に）結合する操作ジンクフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子を含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、１つのＺｎフィンガータンパク質又はその断片を含む。別の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、複数のＺｎフィンガータンパク質（又はその断片）、例えば、２、３、４、５、６以上のＺｎフィンガータンパク質（及び任意選択的に、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、若しくは２以下のフィンガータンパク質）を含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、少なくとも３つのＺｎフィンガータンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、４、５、又は６つのフィンガーを含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、８、９、１０、１１、又は１２のフィンガーを含む。一部の実施形態では、３つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子は、９又は１０ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。一部の実施形態では、４つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子は、１２～１４ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。一部の実施形態では、６つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子は、１８～２１ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。
一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、２枝型（ｔｗｏ ｈａｎｄｅｄ）Ｚｎフィンガータンパク質を含む。２枝型Ｚｎフィンガータンパク質は、２つのジンクフィンガードメインが２つの不連続標的部位に結合するように、ジンクフィンガータンパク質の２つのクラスターが、アミノ酸を介在することにより隔てられている、タンパク質である。２枝型のジンクフィンガー結合タンパク質の例は、ＳＩＰ１であり、この場合、４個のジンクフィンガータンパク質のクラスターが、タンパク質のアミノ末端に位置し、３個のＺｎフィンガータンパク質のクラスターが、カルボキシル末端に位置する（Ｒｅｍａｄｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、１８（１８）：５０７３－５０８４を参照）。これらのタンパク質中のジンクフィンガーの各クラスターは、ユニークな標的配列に結合することができ、２つの標的配列間のスペーシングは、多くのヌクレオチドを含むことができる。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ヌクレアーゼに由来するＤＮＡ結合ドメインであるか、又はそれを含む。例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、及びＩ－ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。米国特許第５，４２０，０３２号明細書；同第６，８３３，２５２号明細書；Ｂｅｌｆｏｒｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３７９－３３８８；Ｄｕｊｏｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８；Ｐｅｒｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：１１２５－１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８；Ｇｉｍｂｌｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０；Ａｒｇａｓｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を操作して、非天然の標的部位を結合することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５；Ｅｐｉｎａｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９；Ｐａｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６；米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号明細書を参照されたい。
標的配列
ターゲティング部分は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）に近接した、及び／又はそれと作動可能に連結したゲノム配列エレメントをターゲティングし、例えば、それに結合する。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、発現制御配列であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、アンカー配列であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ゲノム配列エレメントは、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）又は標的遺伝子の一部であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、ゲノム配列エレメントに含まれるか、又は一部含まれる標的配列に結合する。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５塩基長（及び任意選択的に、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、又は２０塩基長以下）の標的配列に結合する。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、１０～３０、１５～３０、１５～２５、１８～２４、１９～２３、２０～２３、２１～２３、又は２２～２３塩基長の標的配列に結合する。一部の実施形態では、標的配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０塩基長である。
アンカー配列
一般に、アンカー配列は、ゲノム複合体成分、例えば、核形成ポリペプチドが特異的に結合するゲノム配列エレメントである。一実施形態では、アンカー配列との結合により、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）形成が核形成される。
アンカー配列媒介接合部（ＡＳＭＣ）は、複数のアンカー配列、例えば、２つ以上のアンカー配列を含む。一部の実施形態では、アンカー配列を操作又は変更して、天然に存在するゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を調節（例えば、妨害）するか、又は新たなゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を形成する（例えば、外性若しくは変更されたアンカー配列を有する非天然ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を形成する）ことができる。こうした変更は、例えば、ＤＮＡのトポロジー構造を変化させ、例えば、それにより、標的遺伝子が、遺伝子調節及び制御因子（例えば、発現制御配列、例えば、プロモータ、エンハンサー、若しくはリプレッサー配列）と相互作用する能力を調節することによって遺伝子発現を調節することができる。
一部の実施形態では、アンカー配列内の１つ若しくは複数のヌクレオチドを置換、付加するか、又は欠失させることにより、クロマチン構造を修飾する。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部のアンカー配列内の１つ若しくは複数のヌクレオチドを置換、付加するか、又は欠失させることにより、クロマチン構造を修飾する。
一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフ、例えば、ＣＴＣＦ－結合モチーフ：
Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（Ｇ／Ａ／Ｔ）ＣＣ（Ａ／Ｔ／Ｇ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）ＡＧ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ｔ）ＧＧ（Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ａ／Ｃ）（配列番号１）（Ｎは、任意のヌクレオチドである）
を含む。
ＣＴＣＦ－結合モチーフはまた、逆配向、例えば、
（Ｇ／Ａ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ｇ／Ａ）（Ｃ／Ａ／Ｔ）ＧＧ（Ｇ／Ｔ）（Ｇ／Ａ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ／Ａ）（Ｃ／Ｇ）（Ａ／Ｔ／Ｇ）ＣＣ（Ｇ／Ａ／Ｔ）Ｎ（Ｔ／Ｃ／Ｇ）Ｎ（配列番号２）
であってもよい。
一部の実施形態では、アンカー配列は、配列番号１若しくは配列番号２又は配列番号１若しくは配列番号２のいずれかに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列を含む。
一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、少なくとも１つの第１アンカー配列と少なくとも１つの第２アンカー配列を含む。例えば、一部の実施形態では、第１アンカー配列及び第２アンカー配列は各々、核形成ポリペプチド結合モチーフを含んでもよく、例えば、各々がＣＴＣＦ結合モチーフを含む。
一部の実施形態では、第１アンカー配列及び第２アンカー配列は、異なる配列を含み、例えば、第１アンカー配列は、ＣＴＣＦ結合モチーフを含み、第２アンカー配列は、ＣＴＣＦ結合モチーフ以外のアンカー配列を含む。一実施形態では、各アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフと、核形成ポリペプチド結合モチーフの片側又は両側の１つ若しくは複数のフランキングヌクレオチドを含む。
ＡＳＭＣを形成することができる２つのＣＴＣＦ結合モチーフ（例えば、連続的若しくは非連続的ＣＴＣＦ結合モチーフ）は、任意の配向で、例えば、同じ配向（タンデム）で５’－３’（左タンデム、例えば、配列番号１を含む２つのＣＴＣＦ結合モチーフ）又は３’－５’（右タンデム、例えば、配列番号２を含む２つのＣＴＣＦ結合モチーフ）のいずれか、或いは、一方のＣＴＣＦ結合モチーフが配列番号１を含み、他方が配列番号２を含む収斂配向で、ゲノム内に存在し得る。ＣＴＣＦＢＳＤＢ ２．０：Ｄａｔａｂａｓｅ Ｆｏｒ ＣＴＣＦ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ Ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｓｕｌａｔｏｒｄｂ．ｕｔｈｓｃ．ｅｄｕ／）を用いて、標的遺伝子に関連するＣＴＣＦ結合モチーフを同定することができる。
一部の実施形態では、アンカー配列は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）に関連するＣＴＣＦ結合モチーフを含み、この場合、上記標的遺伝子は、疾患、障害及び／又は病状（例えば、ＦＲＤＡ）に関連する。
一部の実施形態では、本開示の方法は、例えば、クロマチン構造を修飾することにより、アンカー配列、例えば、核形成ポリペプチド結合モチーフ内の１つ若しくは複数のヌクレオチドを置換、付加するか、又は欠失させることにより、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を調節する、例えば、妨害することを含む。アンカー配列、例えば、核形成ポリペプチド結合モチーフ内での置換、付加又は欠失のために、１つ若しくは複数のヌクレオチドを特異的にターゲティングする、例えば、標的化変更することもできる。
一部の実施形態では、少なくとも１つの核形成ポリペプチド結合モチーフの配向を変化させることにより、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を変更することができる。一部の実施形態では、アンカー配列は、核形成ポリペプチド結合モチーフ、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフを含み、ターゲティング部分は、少なくとも１つの核形成ポリペプチド結合モチーフに変更を導入して、例えば、核形成ポリペプチドに対する結合親和性を変更する。
発現制御配列
一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）は、１つ若しくは複数の発現制御配列と関連し、且つ／又はそれと作動可能に連結している。一実施形態では、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）は、１つ又は複数の発現制御配列を含む２つ以上のゲノム配列をコロニー化する。当業者は、遺伝子と関連する多様な正（例えば、プロモータ若しくはエンハンサー）又は負（例えば、リプレッサー若しくはサイレンサー）の発現制御配列を熟知している。典型的には、コグネイト調節タンパク質がそのような発現制御配列に結合していれば、関連遺伝子からの転写が変更される（例えば、正の発現制御配列の場合には増大し；負の発現制御配列の場合には低減する）。
プロモータ配列
一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）をプロモータと結合させ、且つ／又はそれと作動可能に連結させる。一実施形態では、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）は、２つ以上のゲノム配列をコロニー化し、ここで、２つ以上のゲノム配列は、プロモータを含む。当業者は、プロモータが、典型的に、関連遺伝子の転写を開始する配列であることを認識する。プロモータは、典型的に、遺伝子の５’末端付近であり、転写開始部位から離れていない。
当業者は認識するように、真核細胞におけるタンパク質コード遺伝子の転写は、典型的に、基本転写因子（例えば、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＨなど）及びメディエータと、転写開始前複合体としてのコアプロモータ配列（ＲＮＡポリメラーゼＩＩを転写開始部位に向ける）との結合によって開始され、多くの事例では、ＲＮＡポリメラーゼエスケープ及び一次転写物の伸長が開始された後も、コアプロモータ配列に結合されたままである。
多くの実施形態では、プロモータは、ＴＡＴＡ、Ｉｎｒ、ＤＰＥ、又はＢＲＥなどの配列エレメントを含むが、当業者は、プロモータを定義するためにこうした配列が必ずしも必要ではないことは十分に認識されよう。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、標的遺伝子（標的遺伝子はＦＸＮである）と作動可能に連結したプロモータ内の標的配列をターゲティングし、例えば、それに結合する。一部の実施形態では、ＦＸＮは、ヒト染色体９上に位置する。一部の実施形態では、転写開始部位（ＴＳＳ）は、ヒトゲノム（ＧＲＣｈ３７）のｈｇ１９アノテーションの転写開始エントリーであり、これは、ＵＣＳＣ Ｔａｂｌｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ（Ｋａｒｏｌｃｈｉｋ Ｄ，Ｈｉｎｒｉｃｈｓ ＡＳ，Ｆｕｒｅｙ ＴＳ，Ｒｏｓｋｉｎ ＫＭ，Ｓｕｇｎｅｔ ＣＷ，Ｈａｕｓｓｌｅｒ Ｄ，Ｋｅｎｔ ＷＪ．Ｔｈｅ ＵＣＳＣ Ｔａｂｌｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ ｄａｔａ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ｔｏｏｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００４ Ｊａｎ １；３２（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ４９３－６）から検索される。一部の実施形態では、ＴＳＳは、染色体位置７１６５０６６７（例えば、ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｕｉｌｄ ３７（ＧＲＣｈ３７）において）にある。一部の実施形態では、ＦＸＮと作動可能に連結した発現制御配列、例えば、プロモータは、ＴＳＳの両側に約１０００塩基を包含する配列を含む。一部の実施形態では、標的部分は、ＴＳＳから少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又は５００塩基上流（及び任意選択的に、ＴＳＳから５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０塩基以下上流）の配列位置を含む標的配列に結合する。一部の実施形態では、標的部分は、ＴＳＳから少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又は５００塩基下流（及び任意選択的に、ＴＳＳから５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０塩基以下下流）の配列位置を含む標的配列に結合する。
一部の実施形態では、標的部分は、標的配列に結合し、ここで、ＴＳＳに最も近い位置は、ＴＳＳから少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又は５００塩基上流（及び任意選択的に、ＴＳＳから５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０塩基以下上流）である。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、標的配列に結合し、ここで、ＴＳＳに最も近い位置は、ＴＳＳから少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又は５００塩基下流（及び任意選択的に、ＴＳＳから５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、又は１０塩基以下下流）である。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、標的配列をターゲティングし、例えば、それに結合し、ここで、ＴＳＳに最も近い位置は、ＴＳＳから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、若しくは５００塩基上流又は下流である。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、標的配列をターゲティングし、例えば、それに結合し、ここで、ＴＳＳに最も近い位置は、約１５０（例えば、１５０）塩基上流である。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、標的配列をターゲティングし、例えば、それに結合し、ここで、ＴＳＳに最も近い位置は、約５０（例えば、５０）塩基下流である。
一部の実施形態では、ターゲティング部分は、表３から選択される例示的な標的配列（例えば、表３の上流及び下流末端の列に記載される）に結合する。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、標的配列（例えば、表３の標的配列）に対して相補的又は部分的に（例えば、１、２、３、４、５、６、７、若しくは８位置以外は全て）相補的である核酸配列、例えば、ｓｇＲＮＡを含む。例示的な標的配列に対する結合のための例示的なガイド配列（例えば、ターゲティング部分のｓｇＲＮＡに使用される）も表３に記載する。
Figure 2022548800000004
Figure 2022548800000005
Figure 2022548800000006
Figure 2022548800000007
エフェクター部分
調節剤は、細胞の核内の適切な部位に局在化される（例えば、ターゲティング部分により）と、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現を変更（例えば、増大）することができる１つ又は複数のエフェクター部分を含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、調節剤（例えば、ターゲティング部分）とゲノム配列エレメントとの結合に寄与するか、又はその作用を増強する。一部の実施形態では、エフェクター部分は、ターゲティング部分の結合とは無関係の機能性を有する。例えば、エフェクター部分は、ゲノム配列エレメント、若しくはターゲティング部分によりターゲティングされるゲノム配列エレメントに近接したゲノム複合体成分をターゲティングし、例えば、それに結合するか、又は転写因子を動員することができる。さらに別の例として、エフェクター部分は、酵素活性、例えば、遺伝子修飾機能性を含み得る。また別の例として、エフェクター部分は、エピジェネティック修飾部分であるか、又はそれを含み得る。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、ポリペプチドであるか、それを含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、核酸であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、エフェクター部分は、化学物質、例えば、シトシン（Ｃ）又はアデニン（Ａ）を調節する化学物質（例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸アンモニウム）である。一部の実施形態では、エフェクター部分は、酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、又はデアミナーゼ活性）を有する。エフェクター部分は、小分子、ペプチド、核酸、ナノ粒子、アプタマー、又は低ＰＫ／ＰＤを有する薬剤のうち１つ若しくは複数であるか、又はそれを含み得る。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、ペプチドリガンド、完全長タンパク質、タンパク質断片、抗体、抗体断片、及び／又はターゲティングアプタマーを含み得る。一部の実施形態では、タンパク質は、細胞外受容体、神経ペプチド、ホルモンペプチド、ペプチド薬剤、毒性ペプチド、ウイルス若しくは微生物ペプチド、合成ペプチド、又はアゴニスト若しくはアンタゴニストペプチドなどの受容体に結合し得る。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、抗原、抗体、抗体断片（例えば、単一ドメイン抗体、リガンドなど）、又は受容体（例えば、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、ＧＬＰ－２受容体２、コレシストキニンＢ（ＣＣＫＢ）、又はソマトスタチン受容体）、ペプチド治療薬（例えば、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）若しくはイオンチャネルのような特定の細胞表面受容体に結合するもの、天然の生物活性ペプチド由来の合成若しくはアナログペプチド、抗微生物ペプチド、孔形成ペプチド、腫瘍ターゲティング若しくは細胞傷害性ペプチドなど）、又は分解若しくは自壊ペプチド（例えば、アポトーシス誘導ペプチドシグナル又は光増感剤ペプチドなど）を含み得る。
本明細書に記載されるエフェクター部分に使用されるペプチド又はタンパク質部分は、小さな抗原結合ペプチド、例えば、抗原結合抗体又は抗体様断片、例えば、一本鎖抗体、ナノボディなども含み得る（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂｉｇ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６－１１３を参照）。こうした小分子抗原結合ペプチドは、例えば、細胞質ゾル抗原、核抗原、オルガネラ内抗原に結合し得る。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、ドミナントネガティブ成分（例えば、ドミナントネガティブ部分）、例えば、或る配列（例えば、アンカー配列、例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ）を認識して、それに結合するが、不活性（例えば、突然変異した）二量体化ドメイン、例えば、機能性アンカー配列媒介接合部を形成することができない二量体化ドメイン）を含むタンパク質、又は機能性転写因子の形成を妨げるゲノム複合体の１成分（例えば、転写因子サブユニットなど）に結合するタンパク質などを含む。例えば、ＣＴＣＦのジンクフィンガードメインは、それが、特定のアンカー配列に結合する（フランキングする核酸を認識するジンクフィンガーを付加することにより）ように、変更することができるのに対し、ホモ二量体化ドメインは、操作ＣＴＣＦと内因性形態のＣＴＣＦ同士の相互作用を妨げるように変更される。一部の実施形態では、ドミナントネガティブ成分は、標的アンカー配列媒介接合部内のアンカー配列に対して選択された結合親和性を有する合成核形成ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、結合親和性は、標的アンカー配列と結合した内因性核形成ポリペプチド（例えば、ＣＴＣＦ）の結合親和性より少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％高いか、又は低くなり得る。合成核形成ポリペプチドは、対応する内因性核形成ポリペプチドに対して３０～９０％、３０～８５％、３０～８０％、３０～７０％、５０～８０％、５０～９０％のアミノ酸同一性を有し得る。核形成ポリペプチドは、競合的結合を介して、例えば、内在性核形成ポリペプチドとそのアンカー配列の結合との競合により、調節（例えば、妨害）し得る。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、抗体又はその断片を含む。一部の実施形態では、１つ若しくは複数の抗体又はその断片であるか、又はそれを含むエフェクター部分を使用して、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）発現を変更する。一部の実施形態では、１つ若しくは複数の抗体（又はその断片）であるか、又はそれを含むエフェクター部分とｄＣａｓ９を使用して、遺伝子発現を変更する。
一部の実施形態では、エフェクター部分に使用される抗体又はその断片は、モノクローナルであってもよい。抗体は、融合物、キメラ抗体、非ヒト化抗体、部分的又は完全ヒト化抗体などであってもよい。当業者には理解されるように、使用される抗体のフォーマットは、所与の標的に応じて、同じであっても、異なっていてもよい。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、接合部核形成分子、接合部核形成分子をコードする核酸、又はその組合せを含む。接合部核形成分子は、例えば、ＣＴＣＦ、コヒーシン、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質関連因子３（ＴＡＦ３）、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、又はアンカー配列媒介接合部の形成を促進する別のポリペプチドであってもよい。接合部核形成分子は、内因性ポリペプチド又は他のタンパク質、例えば、転写因子、例えば、自己免疫調節因子（ＡＩＲＥ）、別の因子、例えば、Ｘ－不活性化特異的転写物（ＸＩＳＴ）、又は目的とする特定のＤＮＡ配列を認識するように操作された操作ポリペプチド（例えば、配列認識用のジンクフィンガー、ロイシンジッパー若しくはｂＨＬＨドメインを有する）であってもよい。接合部核形成分子は、アンカー配列媒介接合部（例えば、ターゲティング部分によりターゲティングされるゲノム配列エレメントと結合しているか、又はそれを含む）内又はその周辺のＤＮＡ相互作用を調節し得る。例えば、接合部核形成分子は、アンカー配列媒介接合部形成又は破壊を変更するアンカー配列に他の因子を動員することができる。
接合部核形成分子はさらに、ホモ又はヘテロ二量体化のために二量体化ドメインを有してもよい。１つ又は複数の接合部核形成分子（例えば、内因性及び操作された）は、相互作用して、アンカー配列媒介接合部を形成し得る。一部の実施形態では、安定化ドメイン、例えば、コヒーシン相互作用ドメインをさらに含むように、接合部核形成分子を操作して、アンカー配列媒介接合部を安定化する。一部の実施形態では、標的配列と結合するように、接合部核形成分子を操作し、例えば、標的配列結合親和性を調節する。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部内のアンカー配列に対して選択された結合親和性を有する接合部核形成分子を選択するか、又は操作する。
ＣＴＣＦの非存在下で、トポロジーが関連するドメイン、例えば、遠位ＤＮＡ領域又は遺伝子座同士のトポロジカル相互作用を調べるために、ＣＴＣＦ中の不活性化突然変異を保有する細胞、並びに染色体立体配座キャプチャー若しくは３Ｃベースの技術の使用により、接合部核形成分子及びその対応するアンカー配列を見出すことができる。また、長期にわたるＤＮＡ相互作用を明らかにすることもできる。追加の解析としては、ベイト、例えば、コヒーシン、ＹＹ１若しくはＵＳＦ１、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、及びＭＳを用いて、ベイトに関連する複合体を見出すＣｈＩＡ－ＰＥＴ解析を挙げることができる。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、タンパク質のＤＮＡ結合ドメインであるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、エフェクター部分のＤＮＡ結合ドメインは、調節剤のターゲティングの作用を増強又は変更するが、単独では調節剤による完全なターゲティングを達成しない（例えば、調節剤のターゲティングを達成するために、ターゲティング部分が必要である）。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、調節剤のターゲティングを増強する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、調節剤の効力を増強する。ＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡとの結合に重要な役割を果たす異なる構造モチーフを有し、これは、当業者には周知である。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヘリックス－ターン－ヘリックス（ＨＴＨ）モチーフ、即ち、リプレッサータンパク質中の共有ＤＮＡ認識モチーフを含む。こうしたモチーフは、２つのヘリックスを有し、その１つは、結合特異性を賦与する側鎖を備えたＤＮＡを認識するもの（別名：認識ヘリックス）である。こうしたモチーフは、一般に、発生過程に関与するタンパク質を調節するために使用される。時として、２つ以上のタンパク質は、同じ配列について競合するか、又は同じＤＮＡ断片を認識する。様々なタンパク質は、同じ配列に対するその親和性、又はＤＮＡ立体配座が、それぞれＨ－結合、塩架橋及びファンデルワールス相互作用によって異なる可能性がある。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヘリックス－ヘアピン－ヘリックス（ＨｈＨ）モチーフを含む。ＨｈＨ構造モチーフを備えるＤＮＡ結合タンパク質は、タンパク質骨格窒素とＤＮＡリン酸基との間の窒素結合の形成を介して起こる非配列特異的ＤＮＡ結合に関与し得る。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ヘリックス－ループ－ヘリックス（ＨＬＨ）モチーフを含む。ＨＬＨ構造モチーフを備えるＤＮＡ結合ドメインは、転写調節タンパク質であり、主として多様な発生過程に関連する。ＨＬＨ構造モチーフは、残基に関して、ＨＴＨ又はＨｈＨモチーフより長い。これらのタンパク質の多くは相互作用して、ホモ－及びヘテロ－二量体化を形成する。構造モチーフは、２つの長いヘリックス領域と、ＤＮＡに結合するＮ末端ヘリックスとから構成され、複合体は、タンパク質が二量体化することを可能にする。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ロイシンジッパーを含む。いくつかの転写因子の場合、ＤＮＡを含む二量体結合部位は、ロイシンジッパーを形成する。このモチーフは、２つの両親媒性ヘリックスを含み、各サブユニットからの１つが、互いに相互作用して、左巻きコイルドコイル超二次構造をもたらす。ロイシンジッパーは、隣接するヘリックスからのロイシンを含む１つのヘリックス中に規則的に間隔をあけたロイシン残基の相互篏合構造（ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｔｉｏｎ）である。主に、ロイシンジッパーに関与するヘリックスは、疎水性の残基ａ及びｄと、親水性の他の残基を備えるヘプタッド（ｈｅｐｔａｄ）配列（ａｂｃｄｅｆｇ）を呈示する。ロイシンジッパーモチーフは、ホモ－又はヘテロ二量体形成のいずれかを媒介することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｚｎ－フィンガードメインを含み、ここで、Ｚｎ＋＋イオンは、２つのＣｙｓと２つのＨｉｓ残基により配位結合されている。こうした転写因子は、化学量論ββ’αを有する三量体を含む。Ｚｎ＋＋配位結合の明らかな作用は、疎水性コア残基ではなく、小さな複合体構造の安定化である。各Ｚｎ－フィンガーは、立体配座的に同じ様式で、二重螺旋の主溝内の連続的な三重塩基対セグメントと相互作用する。タンパク質－ＤＮＡ相互作用は、２つの要因：（ｉ）α－ヘリックスとＤＮＡセグメント、主としてＡｒｇ残基とグアニン塩基の間のＨ－結合相互作用、（ｉｉ）ＤＮＡリン酸骨格、主としてＡｒｇ及びＨｉｓとのＨ－結合相互作用によって決定される。別のＺｎ－フィンガーモチーフは、６つのＣｙｓでＺｎ＋＋をキレートする。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）も含み、ＴＢＰは、クラスＩＩ開始因子ＴＦＩＩＤの成分として最初に同定された。これらの結合タンパク質は、全３つの各々でサブユニットとして作用する核ＲＮＡポリメラーゼによる転写に参加する。ＴＢＰの構造は、８９～９０アミノ酸のα／β構造ドメインを示す。ＴＢＰのＣ－末端又はコア領域は、副溝決定因子を認識して、ＤＮＡ湾曲を促進するＴＡＴＡコンセンサス配列（ＴＡＴＡａ／ｔＡａ／ｔ、配列番号３）に、高い親和性で結合する。ＴＢＰは、分子サドルと類似している。結合側は、１０鎖逆平行βシートの中央の８鎖と一列に並ぶ。上部表面は、４つのα－ヘリックスを含み、転写機構の様々な成分に結合する。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子であるか、又はそれを含む。転写因子（ＴＦ）は、塩基配列の特異的な認識を担うＤＮＡ結合ドメインと、転写を活性化又は抑制することができる１つ若しくは複数のエフェクタードメインを含む調節タンパク質であってもよい。ＴＦは、クロマチンと相互作用し、共活性化因子又は共抑制因子として役立つタンパク質複合体を動員する。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、１つ又は複数のＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）及びｄＣａｓ９を含む。１つ又は複数のＲＮＡは、ｄＣａｓ９及び標的特異的ガイドＲＮＡを介してゲノム配列エレメントをターゲティングする。当業者には理解されるように、ターゲティングのために用いられるＲＮＡは、所与の標的に応じて同じでも、又は異なっていてもよい。
エフェクター部分は、アプタマー、例えば、オリゴヌクレオチドアプタマー又はペプチドアプタマーを含み得る。アプタマー部分は、オリゴヌクレオチド又はペプチドアプタマーである。
エフェクター部分は、オリゴヌクレオチドアプタマーを含み得る。オリゴヌクレオチドアプタマーは、タンパク質及びペプチドなど、予め選択した標的に、高い親和性及び特異性で結合することができる一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ（ｓｓＤＮＡ若しくはｓｓＲＮＡ）分子である。
オリゴヌクレオチドアプタマーは、核酸種であり、これは、小分子、タンパク質、核酸、さらには、細胞、組織及び生物などの様々な分子標的に結合するように、インビトロ選択又は同様に、ＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）のラウンドを反復することによって操作することができる。アプタマーは、明確な分子認識を提供し、化学合成により生成することができる。加えて、アプタマーは、望ましい貯蔵特性を有し、治療用途において免疫原性をほとんど又は全く誘発しない。
ＤＮＡ及びＲＮＡアプタマーの両方が、様々な標的に対して頑健な結合親和性を示す。例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡアプタマーは、ｔリゾチーム、トロンビン、ヒト免疫不全ウイルストランス作用性応答エレメント（ＨＩＶ ＴＡＲ）、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ａｐｔａｍｅｒ － ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ－１０ ｈｅｍｉｎ、インターフェロンγ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ドーパミン、及び非古典的癌遺伝子、熱ショック因子（ＨＳＦ１）に対して選択されている。
アプタマーに基づく血漿タンパク質プロファイリングのための診断技術には、アプタマー血漿プロテオミクスがある。この技術は、健康な状態に対して疾患の分別診断を助けることができる将来のマルチバイオマーカータンパク質測定を可能にするであろう。
エフェクター部分は、ペプチドアプタマー部分を含み得る。ペプチドアプタマーは、低分子量、即ち、１２～１４ｋＤａを有するペプチドを含め、１つ又は複数の短い可変ペプチドを有する。ペプチドアプタマーは、細胞内部のタンパク質－タンパク質相互作用に特異的に結合して、それに干渉するように設計され得る。
ペプチドアプタマーは、特定の遺伝子分子に結合するように選択又は操作された人工タンパク質である。これらのタンパク質は、可変配列の１つ又は複数の複合体を含む。これらは典型的に、コンビナトリアルライブラリーから単離され、多くの場合、その後、指定突然変異又は複数ラウンドの可変領域突然変異誘発及び選択によって改善される。インビボで、ペプチドアプタマーは、細胞タンパク質標的と結合して、その標的化分子と他のタンパク質との正常なタンパク質相互作用の干渉を含め、生物学的作用を及ぼすことができる。特に、転写因子結合ドメインに結合した可変ペプチドアプタマーを、転写因子活性化因子に結合した標的タンパク質からスクリーニングする。この選択戦略を介したその標的に対するペプチドアプタマーのインビボ結合は、下流酵母マーカー遺伝子の発現として検出される。こうした実験によって、所与の表現型をもたらすために、アプタマーに結合された特定のタンパク質、及びアプタマーが妨害するタンパク質相互作用が見出される。加えて、適切な機能性部分と共に誘導体化したペプチドアプタマーは、その標的タンパク質の特定の翻訳後修飾を引き起こすか、又は標的の細胞内局在化を変更することができる。
ペプチドアプタマーはまた、インビトロで標的を認識することもできる。これらのペプチドアプタマーは、バイオセンサーにおける抗体の代わりに有用であることが判明し、不活性及び活性両方のタンパク質形態を含む集団からタンパク質の活性アイソフォームを検出するために使用されている。タッドポール（ｔａｄｐｏｌｅ）として知られる誘導体（ペプチドアプタマー「ヘッド」が、ユニーク配列二本鎖ＤＮＡ「テイル」に共有結合されている）は、そのＤＮＡテイルのＰＣＲ（例えば、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いる）による混合物中の稀有な標的分子の定量を可能にする。
ペプチドアプタマー選択は、様々なシステムを用いて実施することができるが、使用されているほとんどは、現時点で、酵母ツーハイブリッドシステムである。ペプチドアプタマーはまた、ファージディスプレイ、並びにｍＲＮＡディスプレイ、リボソームディスプレイ、細菌ディスプレイ及び酵母ディスプレイなどの他のディスプレイ技術により構築されるコンビナトリアルペプチドライブラリーから選択することもできる。これらの実験手順は、バイオパニングとしても知られている。バイオパニングから得られたペプチドのうち、ミモトープは、一種のペプチドアプタマーとして考えることができる。コンビナトリアルペプチドライブラリーからパニングされたペプチドは、ＭｉｍｏＤＢと称する特別なデータベースに保存されている。
例示的なエフェクター部分として、限定されないが、以下：ユビキチン、ユビキチンリガーゼ阻害剤などの二環式ペプチド、転写因子、トポイソメラーゼなどのＤＮＡ及びタンパク質修飾酵素、トポテカンなどのトポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＭＴファミリー（例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴＬ）などのＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ（例えば、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、タンパク質－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）、デアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ、ＵＧ１）、ｚｅｓｔｅホモログ２のエンハンサー（ＥＺＨ２）、ＰＲＭＴ１、ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、ユークロマチンヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、及びＧ９ａなどのヒストンメチルトランスフェラーゼ）、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２，ＨＤＡＣ３）、ＤＮＡ脱メチル化に役割を有する酵素（例えば、ＴＥＴファミリー酵素は、５－メチルシトシンから５－ヒドロキシルメチルシトシン及びより高度の酸化誘導体への酸化を触媒する）、ＫＤＭ１Ａ及びリシン特異的ヒストンデメチラーゼ１（ＬＳＤ１）などのタンパク質デメチラーゼ、ＤＨＸ９などのヘリカーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ（例えば、サーチュイン１、２、３、４、５、６、又は７）、キナーゼ、ホスファターゼ、臭化エチジウム、ＳＹＢＲグリーン及びプロフラビンなどのＤＮＡ挿入剤、フェニルアラニンアルギニルβ－ナフチルアミド若しくはキノリン誘導体のようなペプチド模倣物などの排出ポンプ阻害剤、核受容体活性化因子及び阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素に関する競合阻害剤（例えば、リソソーム蓄積症に関与するものなど）、タンパク質合成阻害剤、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、それらの１つ若しくは複数の融合物（例えば、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ、ｄＣａｓ９－ＡＰＯＢＥＣ、ｄＣａｓ９－ＵＧ１）、並びにタンパク質からの特定のドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン）を挙げることができる。
ゲノム複合体に影響を及ぼすエフェクター部分
一部の実施形態では、調節剤は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）に結合しているか、又はそれを含むゲノム複合体、例えば、アンカー配列媒介接合部のレベルを低下又は増加させるエフェクター部分を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のレベルは、エフェクター部分を含む調節剤の存在下で、前記調節剤が存在しない場合に比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００％（及び任意選択的に、最大１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、若しくは２０％）低下又は増加する。一部の実施形態では、調節剤の存在により、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）と作動可能に連結したゲノム配列エレメントにおける、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の占有を変更、例えば、増大又は低減する。一部の実施形態では、占有は、エフェクター部分を含む調節剤の存在下で、前記調節剤が存在しない場合に比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００％（及び任意選択的に、最大１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、若しくは２０％）増大又は低減する。
一部の実施形態では、調節剤は、ゲノム配列エレメントと別のゲノム配列複合体成分又は転写因子同士の相互作用を妨害するエフェクターを含む。一部の実施形態では、調節剤は、エフェクター部分が存在しない場合と比較して、存在すると、内在性核形成ポリペプチドの二量体化を低減するエフェクター部分を含む。
一部の実施形態では、エフェクター部分は、標的化成分を含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）に関連する標的遺伝子の発現を変更、例えば、低減する。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現は、エフェクター部分を含む調節剤の存在下で、前記調節剤が存在しない場合に比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％（及び任意選択的に、最大１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、又は２０％）低減する。
一部の実施形態では、調節剤は、立体障害（ｓｔｅｒｉｃ ｐｒｅｓｅｎｃｅ）（例えば、別のゲノム複合体成分又は転写因子の結合を阻害するための）を賦与するエフェクター部分を含む。エフェクター部分は、ドミナントネガティブ分子若しくはその断片（例えば、ゲノム複合体成分（例えば、ゲノム配列エレメント、例えば、アンカー配列、（例えば、ＣＴＣＦ結合モチーフ））を認識して、それに結合するが、機能性ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の形成を阻止する変更（例えば、突然変異）を有するタンパク質）、転写因子の結合若しくは機能（例えば、転写因子と、転写されるその標的配列との接触）に干渉するポリペプチド、立体障害を付与する小分子と連結した核酸配列、又は認識エレメント及び立体遮断因子のいずれか他の組合せを含み得る。
一部の実施形態では、調節剤は、ｐ６５（また、ＲＥＬＡとしても知られる）、又はその機能性変異体若しくは断片（例えば、アクセッション番号ＮＰ＿００１１３８６１０．１により指定される部分）を有するエフェクター部分を含む。一部の実施形態では、調節剤は、ＲＴＡ（エプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）ＢＲＬＦ１遺伝子産物）、又はその機能性変異体若しくは断片（例えば、アクセッション番号ＡＡＡ６６５２８．１により指定される部分）を有するエフェクター部分を含む。
遺伝子修飾部分
一部の実施形態では、調節剤は、遺伝子修飾部分（例えば、遺伝子編集システムの成分）であるか、又はそれを含むエフェクター部分を含む。一部の実施形態では、遺伝子修飾部分は、遺伝子編集システムの１つ若しくは複数の成分を含む。遺伝子修飾部分は、限定されないが、遺伝子編集を含む様々な状況で使用され得る。例えば、遺伝子修飾部分は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）又は標的遺伝子と作動可能に連結したゲノム配列エレメントの配列を変更する（例えば、突然変異、例えば、置換、挿入、若しくは欠失を導入する）ことができる。別の例として、こうした部分を用いて、例えば、エフェクター部分を含む調節剤が、標的配列、例えば、アンカー配列を物理的に修飾する、遺伝子的に修飾する、且つ／又はエピジェネティック的に修飾し得るように、前記エフェクター部分を遺伝子座に局在化させることができる。
一部の実施形態では、遺伝子修飾部分は、例えば、遺伝子編集システムを介して、或る配列の１つ又は複数のヌクレオチドをターゲティングすることができる。一部の実施形態では、遺伝子修飾部分は、ゲノム配列エレメントに結合して、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を変更する、例えば、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）及び／又は標的遺伝子と作動可能に連結したゲノム配列エレメントを含むか、若しくはそれと結合したアンカー配列媒介接合部のトポロジーを変更する。
一部の実施形態では、遺伝子修飾部分は、置換、付加又は欠失のために、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ｄＣａｓ９、オリゴヌクレオチド対合、組換え、トランスポゾンなどを介して、ゲノム複合体の成分内で若しくはその成分として（例えば、アンカー配列媒介接合部内で）、ゲノムＤＮＡの１つ若しくは複数のヌクレオチドをターゲティングする。
一部の実施形態では、遺伝子修飾部分は、ゲノムＤＮＡの１つ若しくは複数のヌクレオシド中に標的化変更を導入し、上記変更によって、例えば、ヒト細胞中の遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の転写を調節する。遺伝子修飾部分は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）に、例えば、エキソン、イントロン、スプライス部位、又は５’ＵＴＲ若しくは３’ＵＴＲをコードする配列に変更を導入することができる。遺伝子修飾部分は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）に作動可能に連結したゲノム複合体成分（例えばプロモータ又はエンハンサー）に変更を導入することができる。遺伝子修飾部分は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）及び／又は標的遺伝子と作動可能に連結したゲノム配列エレメントを含むか、若しくはそれと結合したＡＳＭＣに参加するアンカー配列に変更を導入することができる。変更は、１つ若しくは複数のヌクレオチドの置換、付加、又は欠失を含み得る。一部の実施形態では、標的とする変更は、核形成ポリペプチドの結合部位の少なくとも１つを変更し、例えば、アンカー配列媒介接合部内のアンカー配列、別のスプライシング部位、及び非翻訳ＲＮＡの結合部位に対する結合親和性を変更する。
一部の実施形態では、遺伝子修飾部分は、以下：少なくとも１つの外性アンカー配列の賦与；例えば、核形成ポリペプチドに対する結合親和性の変更による、少なくとも１つの核形成ポリペプチド結合モチーフの変更；ＣＴＣＦ結合モチーフなどの少なくとも１つの核形成ポリペプチド結合モチーフの配向の変更；及びＣＴＣＦ結合モチーフなどの少なくとも１つのアンカー配列における置換、付加又は欠失の少なくとも１つによって、ゲノム複合体の１成分（例えば、アンカー配列媒介接合部内の１配列）を編集する。
成分が遺伝子の修飾部分に使用するのに好適となり得る例示的な遺伝子編集システムとしては、クラスター化した規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（例えば、Ｚｎフィンガー分子）、及び転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられる。ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、及びＣＲＩＳＰＲに基づく方法は、例えば、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１．７（２０１３）：３９７－４０５に記載されており；遺伝子編集のＣＲＩＳＰＲ法は、例えば、Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ．ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ２０１６ Ｊｕｌｙ ３０，４６：１－８；及びＺｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｃｉｓｅ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．５７，Ｎｏ．３，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４，ｐｐ．１１５－１２４に記載されている。
例えば、一部の実施形態では、遺伝子修飾部分は、部位特異的であり、本明細書にさらに説明されるように、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）と部位特異的ガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、遺伝子修飾部分は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）及び部位特異的ガイドＲＮＡを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、本明細書にさらに説明されるように、酵素として不活性であり、例えば、ｄＣａｓ９である。
一部の実施形態では、遺伝子修飾部分は、ｇＲＮＡに連結したポリペプチド（例えば、ペプチド若しくはタンパク質部分）と、標的化ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、例えば、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａ）、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、若しくはＣ２Ｃ３、又はそのようなヌクレアーゼをコードする核酸を含み得る。ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡの選択は、標的化突然変異が、ヌクレオチドの欠失、置換、又は付加、例えば、標的化配列に対するヌクレオチドの欠失、置換、又は付加であるかどうかによって決定される。（１つ若しくは複数の）エフェクタードメイン（例えば、限定されないが、以下：ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＫＲＡＢドメイン、Ｔｅｔ１、ｐ３００、ＶＰ６４及びこれらの融合物を含むエピゲノム編集因子）の全部又は１部分とテザリングした触媒不活性エンドヌクレアーゼ、例えば、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９、例えば、Ｄ１０Ａ；Ｈ８４０Ａ）の融合物は、キメラタンパク質を生成し、このキメラタンパク質は、ポリペプチドに連結されて、１つ若しくは複数のＲＮＡ配列（例えば、限定されないが、本明細書に記載されるジンクフィンガーアレイ、ｓｇＲＮＡ、ＴＡＬアレイ、ペプチド核酸をはじめとするＤＮＡ認識エレメント）により特定のＤＮＡ部位に、提供された組成物を誘導して、１つ若しくは複数の標的核酸配列の活性及び／又は発現を調節する（例えば、ＤＮＡ配列のメチル化若しくは脱メチル化の目的で）ことができる。
本明細書で用いられるとき、「エフェクタードメインの生物活性部分」は、エフェクタードメイン（例えば、「最小」又は「コア」ドメイン）の機能を（例えば、完全に、部分的に、最小限）維持する部分である。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾剤（例えば、ＤＮＡメチラーゼ又はＤＮＡ脱メチル化に役割を有する酵素、例えば、ＤＮＭＴ３ａ、ＤＮＭＴ３ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌ、ＤＮＭＴ阻害剤、それらの組合せ、ＴＥＴファミリー酵素、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ若しくはデアセチラーゼ、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ３ａ／３Ｌ／ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９／Ｖ６４）の１つ若しくは複数のエフェクタードメインの全部又は１部分と、ｄＣａｓ９との融合物はキメラタンパク質を生成し、これは、ポリペプチドに連結され、また、本明細書に記載の方法に有用である。こうしたキメラタンパク質を含むエフェクター部分は、遺伝子修飾部分（遺伝子編集システム成分、即ち、Ｃａｓ９のその使用のために）又はエピジェネティック修飾部分（エピジェネティック修飾剤のエフェクタードメインのその使用のために）と呼ばれる。
一部の実施形態では、提供される技術は、標的遺伝子を特異的にターゲティングするｇＲＮＡを含むものとして記載される。一部の実施形態では、標的遺伝子は、癌遺伝子、腫瘍抑制因子、又はヌクレオチドリピート病関連遺伝子である。
一部の実施形態では、本明細書に提供される技術は、本明細書に記載の１つ若しくは複数の遺伝子修飾部分（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム成分）を対象、例えば、対象の細胞又は組織の核に、そうした部分を融合分子の一部としてターゲティング部分と連結することにより、送達する方法を含む。
エピジェネティック修飾部分
一部の実施形態では、エフェクター部分は、クロマチンの構造を調節するか、又はエピジェネティックマーカ（例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、ヒストンＳＵＭＯ化、ヒストンリン酸化、及びＲＮＡ関連サイレンシングのうちの１つ若しくは複数）を変更するエピジェネティック修飾部分であるか、又はそれを含む。
本開示の方法及び組成物で有用なエピジェネティック修飾部分は、例えば、ＤＮＡメチル化、ヒストンアセチル化、及びＲＮＡ関連サイレンシングに影響を与える物質を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、エピジェネティック酵素（例えば、エピジェネティックマーク、例えば、アセチル化及び／又はメチル化を生成若しくは除去する酵素）の配列特異的ターゲティング（例えば、標的配列に特異的に結合するターゲティング部分を含む調節剤による）を含む。本明細書に記載のゲノム配列エレメントをターゲティングさせることができる例示的なエピジェネティック酵素として、ＤＮＡデメチラーゼ（例えば、ＴＥＴファミリー）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストン－リシン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ（Ｓｅｔｄｂ１）、ユークロマチンヒストン－リシン－Ｎ－メチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９ａ）、ヒストン－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＵＶ３９Ｈ１）、ｚｅｓｔｅホモログ２のエンハンサー（ＥＺＨ２）、ウイルスリシンメチルトランスフェラーゼ（ｖＳＥＴ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴ２）、及びタンパク質－リシンＮ－メチルトランスフェラーゼ（ＳＭＹＤ２）などが挙げられる。こうしたエピジェネティック修飾剤の例は、例えば、ｄｅ Ｇｒｏｏｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１２）：１－１８に記載されている。
一部の実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＤＯＴ１Ｌ、ＰＲＤＭ９、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ２、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ５、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ｐ３００、ＣＲＥＢ－結合タンパク質（ＣＢＰ）、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、ＤＮＡデメチラーゼ活性（例えば、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、若しくはＴＤＧ、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、転写活性化因子活性（例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、ＶＰＲ、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される有用なエピジェネティック修飾部分は、Ｋｏｆｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７．５９（２０１５）：１－３（例えば、表１）（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている構築物を含む。例えば、一部の実施形態では、発現抑制因子は、Ｋｏｆｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．の表１に見出される構築物、例えば、表１に記載のヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化、又はＨ３Ｋ４及び／若しくはＨ３Ｋ９ヒストンデメチラーゼ（例えば、ｄＣａｓ９－ｐ３００、ＴＡＬＥ－ＴＥＴ１）を含むか、又はそうした構築物である。
一部の実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、ヒストンデメチラーゼ活性（例えば、ＫＤＭ１Ａ（即ち、ＬＳＤ１）、ＫＤＭ１Ｂ（即ち、ＬＳＤ２）、ＫＤＭ２Ａ、ＫＤＭ２Ｂ、ＫＤＭ５Ａ、ＫＤＭ５Ｂ、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＤＭ５Ｄ、ＫＤＭ４Ｂ、ＮＯ６６、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、ヒストンデアセチラーゼ活性（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９、ＨＤＡＣ１０、ＨＤＡＣ１１、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、ＳＩＲＴ７、ＳＩＲＴ８、ＳＩＲＴ９、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、ＭＱ１、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ１、ＤＮＭＴ３Ａ２、ＤＮＭＴ３Ｂ１、ＤＮＭＴ３Ｂ２、ＤＮＭＴ３Ｂ３、ＤＮＭＴ３Ｂ４、ＤＮＭＴ３Ｂ５、ＤＮＭＴ３Ｂ６、ＤＮＭＴ３Ｌ、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）を含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾部分は、転写抑制活性（例えば、ＫＲＡＢ、ＭｅＣＰ２、ＨＰ１、ＲＢＢＰ４、ＲＥＳＴ、ＦＯＧ１、ＳＵＺ１２、又はそれらいずれかの機能性変異体若しくは断片から選択されるタンパク質）を含む。
例示的な調節剤
一部の実施形態では、調節剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、例えば、ｐ３００又はその機能性断片若しくは変異体を有するエフェクター部分と、を含む。一部の実施形態では、調節剤は、酵素として不活性のＣａｓ９分子（例えば、ｄＣａｓ９）を含むターゲティング部分と、ｐ３００又はその機能性断片若しくは変異体を有するエフェクター部分と、を含む。
一部の実施形態では、調節剤は、配列番号３００の核酸配列、又は前記配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態では、調節剤は、配列番号３０８の核酸配列、又は前記配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態では、調節剤は、配列番号３０４のアミノ酸配列又は配列番号３００若しくは３０８のいずれかの核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、或いはそれらのいずれか対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｄＣａｓ９－ｐ３００例示的コード化配列１
Figure 2022548800000008
Figure 2022548800000009
Figure 2022548800000010
 ｄＣａｓ９－ｐ３００例示的コード化配列２
Figure 2022548800000011
Figure 2022548800000012
Figure 2022548800000013
Figure 2022548800000014
Figure 2022548800000015
一部の実施形態では、調節剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ分子を含むターゲティング部分と、転写活性化因子活性、例えば、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体を有するエフェクター部分と、を含む。一部の実施形態では、調節剤は、酵素として不活性のＣａｓ９分子（例えば、ｄＣａｓ９）を含むターゲティング部分と、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体を有するエフェクター部分と、を含む。
一部の実施形態では、調節剤は、配列番号３０１の核酸配列、又は前記配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態では、調節剤は、配列番号３０９の核酸配列、又は前記配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態では、調節剤は、配列番号３０５のアミノ酸配列又は配列番号３０１若しくは３０９のいずれかの核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、或いはそれらのいずれか対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ｄＣａｓ９－ＶＰＲ（ＶＰ６４－ｐ６５－ＲＴＡ）例示的配列１
Figure 2022548800000016
Figure 2022548800000017
Figure 2022548800000018
 ｄＣａｓ９－ＶＰＲ（ＶＰ６４－ｐ６５－ＲＴＡ）例示的配列２
Figure 2022548800000019
Figure 2022548800000020
Figure 2022548800000021
Figure 2022548800000022
Figure 2022548800000023
一部の実施形態では、調節剤は、Ｚｎフィンガー分子を含むターゲティング部分と、転写活性化因子活性、例えば、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体を有するエフェクター部分と、を含む。一部の実施形態では、調節剤は、６、７、８、９、若しくは１０（例えば、９）のＺｎフィンガータンパク質を有するＺｎフィンガー分子を含むターゲティング部分と、ＶＰ６４又はその機能性変異体若しくは断片を有するエフェクター部分と、を含む。
一部の実施形態では、調節剤は、配列番号３０２の核酸配列、又は前記配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態では、調節剤は、配列番号３０６のアミノ酸配列又は配列番号３０２の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、或いはそれらのいずれか対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＺＦ９－ＶＰＲ
Figure 2022548800000024
Figure 2022548800000025
Figure 2022548800000026
Figure 2022548800000027
一部の実施形態では、調節剤は、ＴＡＬエフェクター分子を含むターゲティング部分と、転写活性化因子活性、例えば、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体を有するエフェクター部分と、を含む。
一部の実施形態では、調節剤は、配列番号３０３の核酸配列、又は前記配列に対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性を有する配列によりコードされる。一部の実施形態では、調節剤は、配列番号３０７のアミノ酸配列、配列番号３０３の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列、又はそれらのいずれか対して少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＴＡＬ－ＶＰＲ
Figure 2022548800000028
Figure 2022548800000029
Figure 2022548800000030
Figure 2022548800000031
融合分子
一部の実施形態では、調節剤は、融合分子、例えば、２つ以上の部分を含む融合分子などであるか、又はそれを含み得る。一部の実施形態では、融合分子は、本明細書に記載される１つ若しくは複数の部分、例えば、ターゲティング部分及び／又はエフェクター部分を含む。一部の実施形態では、融合分子は、互いに共有結合される１つ若しくは複数の部分を含む。一部の実施形態では、融合分子の１つ若しくは複数の部分は、単一のポリペプチド鎖上に位置し、例えば、１つ若しくは複数の部分のポリペプチド部分が、単一のポリペプチド鎖上に位置する。
一部の実施形態では、例えば、融合分子は（例えば、エフェクター及び／又はターゲティング部分の一部として）、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ（例えば、同じポリペプチド鎖の一部として、順序とは関係なく、ｄＣａｓ９及びＤＮＭＴを含む）、ｄＣａｓ９－ｐ３００、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ－３ａ－３Ｌ、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ－３ａ－３ａ、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ－３ａ－３Ｌ－３ａ、ｄＣａｓ９－ＤＮＭＴ－３ａ－３Ｌ－ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９－ＫＲＡＢ、ｄＣａｓ９－ＡＰＯＢＥＣ、ＡＰＯＢＥＣ－ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９－ＡＰＯＢＥＣ－ＵＧＩ、ｄＣａｓ９－ＵＧＩ、ＵＧＩ－ｄＣａｓ９－ＡＰＯＢＥＣ、ＵＧＩ－ＡＰＯＢＥＣ－ｄＣａｓ９、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ＲｅｌＡ、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ－ＲｅｌＡ、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ｐ６５、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ－ｐ６５、ｄＣａｓ９－ＶＰ６４－ＲｅｌＡ－ｐ６５、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ－ＲｅｌＡ－ｐ６５、ＺＦＭ－ＶＰ６４－ＲｅｌＡ（ＺＦＭは、Ｚｎフィンガー分子を表す）、ＺＦＭ－ＶＰＲ－ＲｅｌＡ、ＺＦＭ－ＶＰ６４－ｐ６５、ＺＦＭ－ＶＰＲ－ｐ６５、ＺＦＭ－ＶＰ６４－ＲｅｌＡ－ｐ６５、ＺＦＭ－ＶＰＲ－ＲｅｌＡ－ｐ６５、ＴＥＭ－ＶＰ６４－ＲｅｌＡ（ＴＥＭは、Ｔａｌエフェクター分子を表す）、ＴＥＭ－ＶＰＲ－ＲｅｌＡ、ＴＥＭ－ＶＰ６４－ｐ６５、ＴＥＭ－ＶＰＲ－ｐ６５、ＴＥＭ－ＶＰ６４－ＲｅｌＡ－ｐ６５、ＴＥＭ－ＶＰＲ－ＲｅｌＡ－ｐ６５、又は本明細書に記載のタンパク質融合物の任意の変種、又は本明細書に記載のタンパク質若しくはタンパク質ドメインの他の融合物を含み得る。
本開示により提供される方法及び組成物に適応可能な例示的ｄＣａｓ９融合方法及び組成物は、公知であり、例えば、Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ｗｉｔｈ ａ Ｃａｓ９－ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２，４０１－４０３（２０１５）；並びにＭｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ ２０１６：ｄｏｉ：１０．１２４２／ｂｉｏ．０１９０６７に記載されている。当技術分野で公知の方法を用いて、ｄＣａｓ９を、本明細書に記載される様々な薬剤及び／又は分子のいずれかと融合させることができ；そのようにして得られた融合分子は、開示される方法において有用となり得る。
一部の実施形態では、融合分子は、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートであるか、又はそれを含み得る。ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ペプチド部分に共有結合した核酸部分を含むキメラ分子（例えば、ペプチド／核酸ミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ））を包含する。一部の実施形態では、ペプチド部分は、本明細書に記載される任意のペプチド又はタンパク質を含み得る。一部の実施形態では、核酸部分は、本明細書に記載される任意の核酸又はオリゴヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又は修飾ＤＮＡ若しくはＲＮＡを含み得る。
一部の実施形態では、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ペプチドアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、化学修飾骨格を有する合成オリゴヌクレオチドである。ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、配列特異的な様式で、ＤＮＡ及びＲＮＡ標的の両方に結合して、デュプレックス構造を形成することができる。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的に結合すると、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、鎖侵入によりデュプレックス内の１つのＤＮＡ鎖を置換して、トリプレックス構造を形成し、置換されたＤＮＡ鎖は、一本鎖Ｄ－ループとして存在し得る。
一部の実施形態では、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、細胞及び／又は組織特異的であり得る。一部の実施形態では、こうしたコンジュゲートを、オリゴ、ペプチド、及び／又はタンパク質と直接共役させてもよい。
一部の実施形態では、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、膜転移ポリペプチド、例えば、本明細書の他所に記載される膜転移ポリペプチドを含む。
いくつかのペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの固相合成は、例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ．，Ｃｈａｐｔｅｒ Ｕｎｉｔ ４．４１に記載されている。非常に短いペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成及び特性決定、並びに新たな固体支持体上でのペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの段階的な固相合成は、例えば、Ｂｏｎｇａｒｄｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｂ．Ｌｉｂｒ．，Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｐａｐ．，Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．，５ｔｈ，１９９９，２６７－２７０；Ａｎｔｏｐｏｌｓｋｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９９，８２，２１３０－２１４０に記載されている。
一部の実施形態では、提供される組成物は、本明細書に記載される融合分子を含む医薬組成物である。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される融合分子を含む細胞又は組織を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される融合分子を含む医薬組成物を提供する。
リンカー
一部の実施形態では、調節剤、例えば、融合分子は、１つ又は複数のリンカーを含み得る。一部の実施形態では、第１部分と第２部分を含む調節剤、例えば、融合分子は、第１部分と第２部分との間に、例えば、ターゲティング部分とエフェクター部分との間にリンカーを有する。リンカーは、化学結合、例えば、１つ若しくは複数の共有結合又は非共有結合であってもよい。一部の実施形態では、リンカーは、共有結合である。一部の実施形態では、リンカーは、非共有結合である。一部の実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。こうしたリンカーは、２～３０、５～３０、１０～３０、１５～３０、２０～３０、２５～３０、２～２５、５～２５、１０～２５、１５～２５、２０～２５、２～２０、５～２０、１０～２０、１５～２０、２～１５、５～１５、１０～１５、２～１０、５～１０、若しくは２～５アミノ酸長、又は２、５、１０、１５、２０、２５、若しくは３０アミノ酸長以上（及び任意選択的に、最大５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、若しくは５アミノ酸長）であり得る。一部の実施形態では、リンカーを用いて、第１部分と第２部分の、例えば、ターゲティング部分とエフェクター部分の間に間隔をあけることができる。一部の実施形態では、例えば、二次及び三次構造の分子柔軟性を賦与するために、例えば、ターゲティング部分とエフェクター部分の間にリンカーを配置することができる。リンカーは、本明細書に記載のフレキシブル、リジッド、及び／又は切断可能リンカーを含んでもよい。いくつかの実施形態では、柔軟性をもたらすため、リンカーは、少なくとも１つのグリシン、アラニン、及びセリンアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えば負に帯電したスルホン酸基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、又はピロリン酸ジエステル基を含む、疎水性リンカーである。いくつかの実施形態では、リンカーは、ある部分（例えばポリペプチド）を調節剤から選択的に放出するために切断可能であるが、未成熟切断を阻止するために十分に安定である。
一部の実施形態では、本明細書に記載の調節剤の１つ若しくは複数の部分は、１つ又は複数のリンカーと連結している。
当業者には周知であるように、一般に使用される柔軟なリンカーは、主としてＧｌｙ及びＳｅｒ残基の区間から構成される配列（「ＧＳ」リンカー）を有する。フレキシブルリンカーは、ある程度の運動又は相互作用を必要とするドメインを連結するのに有用であってもよく、小さい非極性（例えばＧｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）アミノ酸を含んでもよい。さらに、Ｓｅｒ又はＴｈｒを包含することで、水分子と水素結合を形成することにより、水溶液中でのリンカーの安定性が維持され得、ひいてはリンカーとタンパク質部分との間の好ましくない相互作用が低減され得る。
リジッドリンカーは、ドメイン間の固定距離を保持し、それらの独立した機能を維持するために有用である。リジッドリンカーはまた、融合における１以上の成分の安定性又は生物活性を保存するのにドメインの空間的分離がクリティカルであるとき、有用であってもよい。リジッドリンカーは、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列（ＸＰ）ｎ（ここでＸは、任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ、又はＧｌｕを指す）を有してもよい。
切断可能リンカーは、遊離機能ドメインをインビボで放出してもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、還元試薬又はプロテアーゼの存在などの特定条件下で切断されてもよい。インビボでの切断可能リンカーでは、ジスルフィド結合の可逆性が利用されてもよい。一例として、２つのＣｙｓ残基間のトロンビン感受性配列（例えばＰＲＳ）が挙げられる。ＣＰＲＳＣのインビトロでのトロンビン処理により、トロンビン感受性配列の切断がもたらされる一方で、可逆的ジスルフィド結合は、未変化のままである。かかるリンカーは、公知であり、例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１３．Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｎｋｅｒｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されている。融合中でのリンカーのインビボ切断はまた、特定の細胞若しくは組織内、特定条件下、インビボで発現される、又は特定の細胞区画内に制限されるプロテアーゼにより実施されてもよい。多数のプロテアーゼの特異性により、制限された区画内でのリンカーのより緩徐な切断がもたらされる。
連結分子の例として、疎水性リンカー、例えば負に帯電したスルホン酸基；脂質、例えばポリ（－－ＣＨ２－－）炭化水素鎖、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、その不飽和変異体、そのヒドロキシル化変異体、そのアミド化若しくはそれ以外のＮ含有変異体、非炭素リンカー；炭水化物リンカー；リン酸ジエステルリンカー、又は調節剤の２以上の成分（例えば２つのポリペプチド）に共有結合する能力がある他の分子が挙げられる。非共有結合リンカーも含まれ、例えばポリペプチドの疎水性領域又はポリペプチドの疎水性延長部、例えばロイシン、イソロイシン、バリン、又はおそらくはさらにアラニン、フェニルアラニン、又はさらにチロシン、メチオニン、グリシン又は他の疎水性残基が豊富に存在する一連の残基を通じてポリペプチドが連結される疎水性脂質小球などが挙げられる。調節剤の成分が電荷に基づく化学を用いて連結されてもよいことで、調節剤の正に帯電した成分が負に帯電した別の成分又は核酸に連結される。
一部の実施形態では、調節剤、例えば、融合分子は、投与（例えば、対象への）後に、他のポリペプチド、本明細書に記載される別の部分、例えば、エフェクター分子、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド若しくは他の分子、又は他の薬剤、例えば、細胞内分子との連結を、例えば共有結合若しくは非共有結合を介して形成する能力を有する。一部の実施形態では、調節剤のポリペプチド上の１つ若しくは複数のアミノ酸は、例えば、グアノシンとのプソイド対合を形成するアルギニン、又はヌクレオチド管リン酸結合若しくはポリマー間結合などにより、核酸と連結することができる。一部の実施形態では、核酸は、ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡ、ｔＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡである。一部の実施形態では、ポリペプチド上の１つ若しくは複数のアミノ酸は、タンパク質又はペプチドと連結することができる。
一部の実施形態では、２つ以上の実体は、それらが直接若しくは間接的に相互作用して、それらが互いに物理的に近接している、及び／又は物理的に近接したままであれば、物理的に「結合」している。一部の実施形態では、互いに物理的に結合している２つ以上の実体は、互いに共有結合しており；一部の実施形態では、互いに物理的に結合している２つ以上の実体は、互いに共有結合していないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、及びそれらの組合せによって非共有結合している。
ゲノム複合体の調節
一部の実施形態では、調節剤は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）に関連するゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の１つ若しくは複数の態様を調節（例えば、促進又は妨害）する。一部の実施形態では、調節は、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のトポロジー構造の調節であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、ゲノム複合体のトポロジー構造の調節によって、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現が変更（例えば、増大）される。一部の実施形態では、トポロジー構造の検出可能な調節は観察されないが、それでも尚、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現の変更は観察される。一部の実施形態では、調節は、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の１成分、例えば、ゲノム配列エレメントに対する結合であるか、又はそれを含む。結合によって上記成分の隔離が起こり得るが、それにより、例えば、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）において、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のレベル又は占有が変更される。
当業者は、特定の事例において、２つ以上の複合体（例えば、ＡＳＭＣ）が、特定のゲノム領域又は特定のゲノム位置（例えば、ＦＸＮ遺伝子、若しくはそれと作動可能に連結した発現制御配列）に関して、互いに競合し得ることを理解されよう。一部の実施形態では、１つの（「第１」）ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の妨害は、特定のゲノム領域又は位置に対して利用可能な代替（第１ゲノム複合体に関して）構造を提示する１つ若しくは複数の他のゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の安定化により達成され得る。一部の実施形態では、１つの（「第１」）ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の安定化は、特定のゲノム領域又は位置に対して利用可能な代替（第１ゲノム複合体に関して）構造を提示する１つ若しくは複数の他のゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の妨害により達成され得る。従って、一部の実施形態では、目的のゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の妨害又は安定化は、それぞれ安定化又は妨害のために、１つ若しくは複数のゲノム複合体をターゲティングする（任意選択的に、目的のゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を妨害又は安定化する調節剤をさらに用意することなく）ことにより達成され得る。
調節剤は、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のその標的成分に結合して、ゲノム複合体の形成を変更し得る（例えば、１つ又は複数の他の複合体成分に対する標的化成分の親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはそれ以上変更することにより）。これに代わり、又は加えて、一部の実施形態では、調節剤による結合は、ゲノム複合体により影響を及ぼされるゲノムＤＮＡのトポロジーを、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはそれ以上変更する。一部の実施形態では、調節剤は、標的化ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）に関連する遺伝子の発現を、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはそれ以上変更する。ゲノム複合体の形成の変化、他の複合体成分に対する標的化成分の親和性、及び／又はゲノム複合体により影響を及ぼされるゲノムＤＮＡのトポロジーの変化は、例えば、ＨｉＣｈＩＰ、ＣｈＩＡＰＥＴ、４Ｃ、又は３Ｃ、例えば、ＨｉＣｈＩＰにより評価され得る。
本明細書に記載される調節剤は、ターゲティング部分を含む。一部の実施形態では、ターゲティング部分は、標的ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）成分（例えば、ゲノム配列エレメント）に結合する。一部の実施形態では、ターゲティング部分とその標的化成分同士の相互作用により、そうでなければ上記標的化成分が達成したであろう１つ又は複数の他の相互作用に干渉する。一部の実施形態では、調節剤は、例えば、ターゲティング部分とその標的ゲノム複合体成分の結合を介して、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の形成及び／又は維持に物理的に干渉する。一部の実施形態では、そうでなければ上記標的化成分が達成したであろう１つ又は複数の他の相互作用は、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のポリペプチド成分、又は転写機構（例えば、転写活性化タンパク質若しくは転写抑制タンパク質）に対するものである。
一部の実施形態では、調節剤は、複合体特異的である。即ち、一部の実施形態では、ターゲティング部分は、１つ若しくは複数の標的ゲノム複合体中（例えば、１細胞内）のその標的成分、例えば、ゲノム配列エレメントに特異的に結合するが、非標的化ゲノム複合体（例えば、同じ細胞内の）には結合しない。一部の実施形態では、調節剤は、特定の細胞型にのみ、且つ／又は特定の発生段階若しくは時期にのみ存在するゲノム複合体を特異的にターゲティングする。一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）又は標的遺伝子と作動可能に連結したゲノム配列エレメントに関連するか、若しくはそれを含むゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の標的成分に対する調節剤の結合は、ゲノム複合体のポリペプチド成分と、作動可能に連結したゲノム配列エレメント同士の会合の頻度及び／又は持続期間の変化（例えば、低減）を含む。
核形成ポリペプチド
一部の実施形態では、ターゲティング部分とその標的化成分同士の相互作用、又はエフェクター部分の機能は、そうでなければ標的化成分がゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）のポリペプチド成分と達成したであろう１つ若しくは複数の他の相互作用に干渉する。一部の実施形態では、ポリペプチド成分は、核形成ポリペプチドであるか、又はそれを含む。核形成ポリペプチドは、アンカー配列媒介接合部の形成を促進し得る。本明細書に記載の調節剤によりターゲティングされ得る核形成ポリペプチドとしては、例えば、特定のゲノム配列エレメントとの結合が、本明細書に記載のゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の形成を開始し得るアンカー配列、若しくは他のタンパク質（例えば、転写因子）に特異的に結合するタンパク質（例えば、ＣＴＣＦ、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＦ３、ＺＮＦ１４３など）が挙げられる。一部の実施形態では、調節剤は、核形成ポリペプチドが標的ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）内で結合し得る１つ若しくは複数のアンカー配列又はゲノム配列エレメントをターゲティングすることができる。一部の実施形態では、調節剤は、核形成ポリペプチドをターゲティング（例えば、それに結合）することができる。
核形成ポリペプチドは、例えば、ＣＴＣＦ、コヒーシン、ＵＳＦ１、ＹＹ１、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質関連因子３（ＴＡＦ３）、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、又はアンカー配列媒介接合部の形成を促進する別のポリペプチドであってもよい。核形成ポリペプチドは、内因性ポリペプチド又は他のタンパク質、例えば、転写因子、例えば、自己免疫調節因子（ＡＩＲＥ）、別の因子、例えば、Ｘ－不活性化特異的転写物（ＸＩＳＴ）、又は目的とする特定のＤＮＡ配列を認識するように操作された操作ポリペプチド（例えば、配列認識用のジンクフィンガー、ロイシンジッパー若しくはｂＨＬＨドメインを有する）であってもよい。核形成ポリペプチドは、アンカー配列媒介接合部内又はその周辺のＤＮＡ相互作用を調節し得る。例えば、核形成ポリペプチドは、アンカー配列媒介接合部形成の変更（例えば、妨害）が起こるように、アンカー配列に他の因子を動員することができる。
核形成ポリペプチドはさらに、ホモ又はヘテロ二量体化のための二量体化ドメインを有し得る。１つ又は複数の核形成ポリペプチド（例えば、内因性及び操作された）は、相互作用して、アンカー配列媒介接合部を形成し得る。一部の実施形態では、調節剤は、この相互作用に干渉する（例えば、直接若しくは間接的に）ことにより、標的ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）を妨害する。一部の実施形態では、安定化ドメイン、例えば、コヒーシン相互作用ドメインをさらに含むように、核形成ポリペプチドを操作して、アンカー配列媒介接合部を安定化する。一部の実施形態では、標的配列と結合するように、核形成ポリペプチドを操作し、例えば、標的配列結合親和性を調節する。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部内のアンカー配列に対して選択された結合親和性を有する核形成ポリペプチドを選択するか、又は操作する。
ＣＴＣＦの非存在下で、トポロジー的に関連するドメイン、例えば、遠位ＤＮＡ領域又は遺伝子座同士のトポロジー的相互作用を調べるために、ＣＴＣＦ中に不活性化突然変異を保有する細胞、並びに染色体立体配座キャプチャー若しくは３Ｃベースの方法、例えば、Ｈｉ－Ｃ若しくはハイスループットシーケンシングの使用により、核形成ポリペプチド及びその対応するアンカー配列を見出すことができる。また、長期にわたるＤＮＡ相互作用を明らかにすることもできる。追加の解析としては、ベイト、例えば、コヒーシン、ＹＹ１若しくはＵＳＦ１、ＺＮＦ１４３結合モチーフ、及びＭＳを用いて、ベイトに関連する複合体を見出すＣｈＩＡ－ＰＥＴ解析を挙げることができる。
一部の実施形態では、核形成ポリペプチドは、参照値、例えば、変更が存在しない場合でのアンカー配列の結合親和性より高い、又は低いアンカー配列に対する結合親和性を有する。一部の実施形態では、核形成ポリペプチドは、アンカー配列媒介接合部とその相互作用、例えば、アンカー配列媒介接合部内のアンカー配列に対するその結合親和性を変更（例えば、妨害）するように調節される。
転写機構
一部の実施形態では、ターゲティング部分とその標的化成分同士の相互作用、又はエフェクター部分の機能は、そうでなければ標的化成分が細胞の転写機構の成分と達成したであろう１つ若しくは複数の他の相互作用に干渉する。当業者は、特定の遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）の転写に関与する転写機構の一部として参加するタンパク質を熟知している。例えば、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、及びＴＦＩＩＨなどの基本転写因子、メディエータ、特定の伸長因子など。
一部の実施形態では、ターゲティング部分とその標的化成分同士の相互作用、又はエフェクター部分の機能は、標的化成分（例えば、ゲノム配列エレメント、例えば、標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列）及び／又は標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）と細胞の転写機構の成分との相互作用を促進する。当業者は、特定の遺伝子（例えば、タンパク質コード遺伝子）の転写に関与する転写機構の一部として参加するタンパク質を熟知している。例えば、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）、ＴＦＩＩＡ、ＴＦＩＩＢ、ＴＦＩＩＤ、ＴＦＩＩＥ、ＴＦＩＩＦ、及びＴＦＩＩＨなどの基本転写因子、メディエータ、特定の伸長因子など。
転写調節因子
一部の実施形態では、調節剤は、転写調節タンパク質と、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）及び／又は標的遺伝子と作動可能に連結したゲノム配列エレメント（例えば、ターゲティング部分の標的成分）との相互作用を変更する。一部の実施形態では、調節剤は、転写調節タンパク質と、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）及び／又は標的遺伝子と作動可能に連結したゲノム配列エレメント（例えば、ターゲティング部分の標的成分）との相互作用を促進する。一部の実施形態では、調節剤は、例えば、転写調節タンパク質が、標的遺伝子（若しくはそれと作動可能に連結したゲノム配列エレメント）を含むか、又はそれと結合したゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の１つ若しくは複数の他の成分と相互作用するのを阻止することにより、転写調節タンパク質と、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）及び／又は標的遺伝子と作動可能に連結したゲノム配列エレメント（例えば、ターゲティング部分の標的成分）との相互作用に干渉（例えば、それを阻害）する。
当業者は、非常に多様な転写調節タンパク質を認識しており、その多くは、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ヘリックス－ループ－ヘリックスモチーフ、ＥＴＳ、フォークヘッド、ロイシンジッパー、Ｐｉｔ－Ｏｃｔ－Ｕｎｃドメイン、及び／又はジンクフィンガーなどのＤＮＡ結合ドメインを含有する）であり、その多くは、メディエータとの相互作用によってコア転写機構と相互作用する。一部の実施形態では、転写調節タンパク質は、活性化因子（例えば、エンハンサーに結合し得る）であるか、又はそれを含み得る。一部の実施形態では、転写調節タンパク質は、リプレッサー（例えば、サイレンサーに結合し得る）であるか、又はそれを含み得る。
アンカー配列媒介接合部（ＡＳＭＣ）
一部の実施形態では、本開示の調節剤により調節されるゲノム複合体は、アンカー配列媒介接合部（ＡＳＭＣ）であるか、又はそれを含む。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、核形成ポリペプチドが、ゲノム内のアンカー配列に結合すると形成され、これらのタンパク質、並びに任意選択的に、１つ若しくは複数の他の成分（例えば、ポリペプチド成分及び／又は非ゲノム核酸成分）同士及びそれらの間の相互作用によって、接合部が形成され、そこにアンカー配列が物理的に共局在化される。一部の実施形態では、１つ又は複数の遺伝子（例えば、標的遺伝子、例えば、ＦＸＮ）は、アンカー配列媒介接合部と結合している。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、１つ若しくは複数のアンカー配列、１つ若しくは複数の遺伝子、及び１つ若しくは複数の発現制御配列、例えば、増強若しくはサイレンシング配列を含む。一部の実施形態では、発現制御配列は、アンカー配列媒介接合部内部にあるか、一部が内部にあるか、又はその外部にある。
一部の実施形態では、ゲノム複合体（例えば、アンカー配列媒介接合部）は、第１アンカー配列、核酸配列（例えば、遺伝子）、発現制御配列、及び第２アンカー配列を含む。一部の実施形態では、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）は、順に：第１アンカー配列、発現制御配列、及び第２アンカー配列；又は第１アンカー配列、核酸配列（例えば、遺伝子）、及び第２アンカー配列を含む。一部の実施形態では、核酸配列（例えば、遺伝子）と発現制御配列のいずれか一方又はその両方が、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の内部又は外部に位置する。発現制御配列。一部の実施形態では、ゲノム複合体（例えば、アンカー配列媒介接合部）は、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス、ＧＣボックス、又はＣＡＰ部位を含む。
一部の実施形態では、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）は、（ｉ）その発現が、ゲノム複合体の形成若しくは妨害により調節（例えば、低減若しくは増大）される遺伝子；及び／又は（ｉｉ）上記遺伝子と作動可能に連結した１つ若しくは複数の発現制御配列の外部にあるか、その一部ではないか、その内部に含まれないか、又はそれと非連続的である２つのゲノム配列エレメント（例えば、アンカー配列）を共局在化する。
一部の実施形態では、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）は、（ｉ）その発現が、ゲノム複合体の形成若しくは妨害により調節（例えば、低減若しくは増大）される遺伝子；及び／又は（ｉｉ）上記遺伝子と作動可能に連結した１つ若しくは複数の発現制御配列の内部にあるか、その一部がその内部にあるか、又はそれと連続的である２つのゲノム配列エレメントを共局在化する。
発現制御配列。一部の実施形態では、調節剤は、ＡＳＭＣと結合した標的遺伝子の転写を調節することができる。例えば、一部の実施形態では、標的遺伝子の転写は、活性化ＡＳＭＣへのその包含又は抑制性ＡＳＭＣからの排除により、活性化され；一部の実施形態では、調節剤は、標的遺伝子が活性化ＡＳＭＣに含まれるか、又は抑制性ＡＳＭＣから排除されるようにする。一部の実施形態では、ＡＳＭＣが、調節の前に発現制御配列を含有していなかった場合、調節剤は、アンカー配列媒介接合部に、核酸配列（例えば、遺伝子）の転写を増大する発現制御配列を含有させることができる。一部の実施形態では、ＡＳＭＣが、調節の前に発現制御配列を含有していた場合、調節剤は、アンカー配列媒介接合部に、核酸配列（例えば、遺伝子）の転写を低減する発現制御配列を排除させることができる。
一部の実施形態では、標的遺伝子の転写は、抑制性ＡＳＭＣ中へのその含有、又は活性化ＡＳＭＣからの排除により抑制される。一部のそのような実施形態では、調節剤は、標的遺伝子を活性化ＡＳＭＣから排除させるか、又は抑制性ＡＳＭＣ中に含有させる。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、核酸配列（例えば、遺伝子）の転写を低減する発現制御配列を含む。一部の実施形態では、アンカー配列媒介接合部は、核酸配列（例えば、遺伝子）の転写を増大する発現制御配列を排除する。
「活性化ＡＳＭＣ」とは、活性遺伝子転写に対して開かれたＡＳＭＣ、例えば、作動可能に連結した核酸配列（例えば、遺伝子）の転写を増強する発現制御配列（例えば、プロモータ又はエンハンサー）を含むＡＳＭＣのことである。「抑制性ＡＳＭＣ」とは、活性遺伝子転写から遮られたＡＳＭＣ、例えば、作動可能に連結した核酸配列（例えば、遺伝子）の転写を抑制する発現制御配列（例えば、リプレッサー配列）を含むＡＳＭＣのことである。一部の実施形態では、ＡＳＭＣ（例えば、活性化ＡＳＭＣ）は、遺伝子と、作動可能に連結したエンハンサーとを含み、上記遺伝子は、活発に発現される。一部の実施形態では、ＡＳＭＣ（例えば、活性化ＡＳＭＣ）は、遺伝子を含み、リプレッサー配列はＡＳＭＣの外部に位置しており、この場合、上記遺伝子は、活発に発現される。一部の実施形態では、ＡＳＭＣ（例えば、抑制性ＡＳＭＣ）は、遺伝子と、ＡＳＭＣ内に位置する作動可能に連結したリプレッサー配列とを含み、上記遺伝子は、活発に発現されない。一部の実施形態では、ＡＳＭＣ（例えば、抑制性ＡＳＭＣ）は、遺伝子を含み、エンハンサーはＡＳＭＣの外部に位置しており、この場合、上記遺伝子は、活発に発現されない。一部の実施形態では、ＡＳＭＣ（例えば、活性化ＡＳＭＣ）は、遺伝子と、作動可能に連結したエンハンサーとを含み、この場合、リプレッサーはＡＳＭＣの外部に位置しており、遺伝子は、活発に発現される。一部の実施形態では、ＡＳＭＣ（例えば、抑制性ＡＳＭＣ）は、遺伝子と、作動可能に連結したリプレッサー配列とを含み、この場合、エンハンサーは、ＡＳＭＣの外部に位置しており、遺伝子は、活発に発現されない。
一部の実施形態では、標的遺伝子は、１つ又は複数の発現制御配列と不連続である。遺伝子が、その発現制御配列と不連続であるいくつかの実施形態では、遺伝子は、１つ若しくは複数の発現制御配列から約１００ｂｐ～約５００Ｍｂ、約５００ｂｐ～約２００Ｍｂ、約１ｋｂ～約１００Ｍｂ、約２５ｋｂ～約５０Ｍｂ、約５０ｋｂ～約１Ｍｂ、約１００ｋｂ～約７５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約５００ｋｂ、又は約１７５ｋｂ～約５００ｋｂの間隔を有し得る。一部の実施形態では、遺伝子は、発現制御配列から約１００ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、５０ｋｂ、５５ｋｂ、６０ｋｂ、６５ｋｂ、７０ｋｂ、７５ｋｂ、８０ｋｂ、８５ｋｂ、９０ｋｂ、９５ｋｂ、１００ｋｂ、１２５ｋｂ、１５０ｋｂ、１７５ｋｂ、２００ｋｂ、２２５ｋｂ、２５０ｋｂ、２７５ｋｂ、３００ｋｂ、３５０ｋｂ、４００ｋｂ、５００ｋｂ、６００ｋｂ、７００ｋｂ、８００ｋｂ、９００ｋｂ、１Ｍｂ、２Ｍｂ、３Ｍｂ、４Ｍｂ、５Ｍｂ、６Ｍｂ、７Ｍｂ、８Ｍｂ、９Ｍｂ、１０Ｍｂ、１５Ｍｂ、２０Ｍｂ、２５Ｍｂ、５０Ｍｂ、７５Ｍｂ、１００Ｍｂ、２００Ｍｂ、３００Ｍｂ、４００Ｍｂ、５００Ｍｂ、又はそれらの間の任意のサイズの間隔を有する。
理論に束縛されることは望まないが、一部の実施形態では、ＡＳＭＣが特定のタイプのアンカー配列媒介接合部であるか、又はそれに対応するか否かを理解（例えば、同定若しくは分類）することは、ＡＳＭＣを変更する、例えば、ＤＮＡ結合部分又はエフェクター部分の選択に影響を与えることによって遺伝子発現を調節する方法を決定する上で役立ち得ると考えられる。例えば、一部の実施形態では、いくつかのタイプのアンカー配列媒介接合部は、アンカー配列媒介接合部内に１つ又は複数の発現制御配列（例えば、エンハンサー）を含む。ＡＳＭＣを含むゲノム複合体の調節及び／又はゲノム複合体内のＡＳＭＣの存在の調節、例えば、１つ若しくは複数のアンカー配列の変更（そのような変更によってＡＳＭＣの妨害が起こる）による、こうしたＡＳＭＣの調節（例えば、妨害）は、ゲノム複合体及び／又はＡＳＭＣ内の標的遺伝子の転写を低減する可能性がある。一部の実施形態では、抑制性ＡＳＭＣ、又は上記ＡＳＭＣを含むゲノム複合体の調節（例えば、妨害）によって、遺伝子発現の増大が起こる。一部の実施形態では、活性化ＡＳＭＣ、又は上記ＡＳＭＣを含むゲノム複合体の調節（例えば、妨害）によって、遺伝子発現の低減が起こる。
組成物：製造、製剤化、送達、及び投与方法
本開示は、中でも、本明細書に記載の調節剤を含む組成物、並びに／又は調節剤を細胞、組織、器官、及び／若しくは対象に送達する組成物を提供する。一部の実施形態では、ポリペプチド（例えば、ポリペプチドであるか、又はそれを含有する部分）を含む調節剤は、ポリペプチドとして調節剤のポリペプチド若しくはポリペプチド部分を含む組成物を介して、或いは、調節剤又はそのポリペプチド部分をコードする核酸を含み、且つ目的のシステム（例えば、特定の細胞、組織、器官など）において調節剤又はそのポリペプチド部分の発現を達成するのに十分な他の配列と結合した組成物を介して、提供され得る。
一部の実施形態では、提供される組成物は、その活性成分が、本明細書に記載される調節剤を含むか、又はそれを送達する医薬組成物であってもよく、これは、１つ若しくは複数の薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせて提供され、任意選択的に、対象（例えば、細胞、組織、若しくはそれらの他の部位）への投与のために製剤化される。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む、治療薬の送達方法を提供し、ここで、ゲノム複合体調節剤は、治療薬であり、且つ／又は治療薬の送達は、治療薬が存在しない場合の遺伝子発現に比して遺伝子発現を変化させるために、完全性指数により特徴付けられるゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）をターゲティングする。
いくつかの態様では、医薬用途のためのシステムは、ゲノム複合体を妨害することによって、完全性指数により特徴付けられるゲノム複合体をターゲティングする組成物を含む。一部の実施形態では、組成物は、ゲノム複合体内のアンカー配列に結合して、アンカー配列媒介接合部の形成を変更することにより、ゲノム複合体をターゲティングし、ここで、こうした組成物は、アンカー配列媒介接合部と関連する標的遺伝子のヒト細胞における転写を調節する。
従って、一部の実施形態では、本開示は、調節剤（例えば、妨害剤）、又はその生成中間体を含む組成物を提供する。いくつかの具体的な実施形態では、本開示は、調節剤（例えば、妨害剤）又はそのポリペプチド部分をコードする核酸の組成物を提供する。いくつかのそうした実施形態では、提供される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は本明細書に記載されるいずれか他の核酸部分若しくは実体であるか、又はそれを含んでよく、本明細書に記載されるか、又はそうでなければ、当技術分野で利用可能な任意の技術（例えば、合成、クローニング、増幅、インビトロ若しくはインビボ転写など）により調製され得る。一部の実施形態では、調節剤（例えば、妨害剤）又はそのポリペプチド部分をコードする、提供される核酸は、目的のシステム、例えば、特定の細胞、組織、生物など）において提供される核酸の組込み、複製、及び／又は発現を達成するのに適した及び／又は十分な１つ若しくは複数の複製、組込み、及び／又は発現シグナルと作動可能に結合されていてもよい。
一部の実施形態では、調節剤（例えば、妨害剤）は、ベクター、例えば、ウイルスベクターであるか、又はそれを含み、それは、本明細書に記載の調節剤（例えば、妨害剤）の１つ若しくは複数の成分をコードする１つ若しくは複数の核酸を含む。
生成
本明細書に記載のような核酸又は本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸は、ベクター中に組み込まれてもよい。ベクター、例えばレンチウイルスなどのレトロウイルス由来のものは、導入遺伝子の長期の安定な組込み及び娘細胞におけるその増殖を可能にすることから、長期遺伝子導入を達成するために好適なツールである。ベクターの例として、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、種々のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに説明されている。ベクターとして有用であるウイルスとして、限定はされないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモータ配列、便宜的な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１以上の選択可能マーカーを有する。
天然又は合成核酸の発現は、典型的には目的の遺伝子をコードする核酸をプロモータに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことにより達成される。ベクターは、真核生物における複製及び組み込みに適し得る。典型的なクローニングベクターは、所望される核酸配列の発現にとって有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びにプロモータを有する。
追加的なプロモータ領域、例えば増強配列は、転写開始の頻度を調節してもよい。典型的には、これらの配列は転写開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、近年、いくつかのプロモータが同様に転写開始部位の下流に機能的要素を有することが示されている。プロモータ領域間のスペーシングはフレキシブルであることが多いことから、プロモータ機能は、領域が互いに対して反転又は移動されるとき、保存される。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータでは、プロモータ領域間のスペーシングは、活性が低下し始める前に５０ｂｐ離れるまで増加し得る。プロモータに応じて、転写を活性化するため、各領域が協同的又は非依存的に機能し得るように思われる。
好適なプロモータの一例が、最初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列である。このプロモータ配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の発現を高レベルで駆動する能力がある強力な構成的プロモータ配列である。いくつかの実施形態では、好適なプロモータが伸長成長因子－１α（ＥＦ－１α）である。しかし、他の構成的プロモータ配列、例えば限定はされないが、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモータ、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端リピート（ＬＴＲ）プロモータ、ＭｏＭｕＬＶプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタイン・バーウイルス最初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータ、並びにヒト遺伝子プロモータ、例えば限定はされないが、アクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ、及びクレアチンキナーゼプロモータも使用されてもよい。
本開示は、任意の特定のプロモータ又はプロモータのカテゴリー（例えば構成的プロモータ）の使用に限定されるように解釈されるべきではない。例えば、いくつかの実施形態では、誘導性プロモータが本開示の一部として検討される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモータの使用により、それが作動可能に連結される対象のポリヌクレオチド配列の発現を、かかる発現が所望されるときに活性化する能力がある分子スイッチが提供される。いくつかの実施形態では、誘導性プロモータの使用により、発現を、所望されないときに不活性化する能力がある分子スイッチが提供される。誘導性プロモータの例として、限定はされないが、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲステロンプロモータ、及びテトラサイクリンプロモータが挙げられる。
いくつかの実施形態では、導入されるべき発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染されることが探求された細胞の集団から細胞を発現する同定及び選択を促進するため、選択可能マーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか又は双方を有し得る。いくつかの態様では、選択可能マーカーは、ＤＮＡの分離片に対して実施され、同時トランスフェクション法において使用されてもよい。宿主細胞内での発現を可能にするため、選択可能マーカーとレポーター遺伝子の双方は、適切な発現調節配列と隣接されてもよい。有用な選択可能マーカーは、例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばｎｅｏなどを含んでもよい。
いくつかの実施形態では、潜在的にトランスフェクトされた細胞を同定するため、且つ／又は発現調節配列の機能性を評価するため、レポーター遺伝子が使用されてもよい。一般に、レポーター遺伝子は、（レポーター遺伝子の）レシピエント供給源中に存在しないか又はそれによって発現され、且ついくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性又は可視化可能な蛍光により発現が明らかにされるようなポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてからの好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼをコードする遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）を含んでもよい。好適な発現系は、周知であり、公知の技術を用いて調製されるか又は商業的に得られてもよい。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルでの発現を示す最小の５’隣接領域を有する構築物は、プロモータとして同定される。かかるプロモータ領域は、レポーター遺伝子に連結され、薬剤のプロモータ駆動転写を調節する能力について評価するため、使用されてもよい。
一部の実施形態では、調節剤は、タンパク質を含むか、又はタンパク質であり、従って、タンパク質を作製する方法により生産され得る。当業者には理解されるように、タンパク質又はポリペプチド（本明細書に記載の調節剤に含有され得る）を作製する方法は、当技術分野で常用的である。概要については、以下：Ｓｍａｌｅｓ ＆ Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ ＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。
本開示の組成物のタンパク質又はポリペプチドは、標準的な固相技術を用いて生化学的に合成することができる。こうした方法としては、排他的固相合成、部分的固相合成方法、フラグメント凝縮、古典的溶液合成が挙げられる。これらの方法は、ペプチドが比較的短い（例えば、１０ｋＤａ）場合、且つ／又はそれを組換え技術により生産することができない（即ち、核酸配列によりコードされない）ため、別の化学を必要とする場合に使用することができる。
固相合成法は、当技術分野で公知であり、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４；及びＣｏｉｎ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２：３２４７－３２５６，２００７により詳しく記載されている。
より長いペプチドの場合、組換え法を使用することができる。組換え治療用ポリペプチドを作製する方法は、当技術分野において常用的である。概要については、以下：Ｓｍａｌｅｓ ＆ Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ ＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。
治療薬用タンパク質又はポリペプチドを生産する例示的な方法は、哺乳動物細胞における発現を含むが、適切なプロモータの制御下で、昆虫細胞、酵母、細菌、又は他の細胞を用いて組換えタンパク質を生産することもできる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、好適なプロモータ、並びに他の５’又は３’フランキング非転写配列、及び５’又は３’非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、並びに終結配列を含み得る。異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝子エレメントを取得するために、ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモータ、スプライス、及びポリアデニル化部位を用いてもよい。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主と共に使用するのに適したクローニング及び発現ベクターは、以下：Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
多量のタンパク質又はポリペプチドが要望される場合には、以下：Ｂｒｉａｎ Ｂｒａｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２：５８７－５９３，２００３；及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ ４２１－４６３に記載されるような技術を用いて、それを生成することができる。
様々な哺乳動物細胞培養システムを使用して、組換えタンパク質を発現させ、製造することができる。哺乳動物発現システムの例として、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬＡ及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬生産のための宿主細胞培養のプロセスは、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ（Ｅｄｓ．），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１４）に記載されている。本明細書に記載される組成物は、組換えタンパク質をコードするベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを含有してもよい。一部の実施形態では、ベクター、例えば、ウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含み得る。
タンパク質治療薬の精製については、以下：Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。
タンパク質治療薬の製剤化については、以下：Ｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｅｒｉｅｓ（２０１２）に記載されている。
タンパク質は、１つ又は複数のアミノ酸を含む。アミノ酸は、例えば、１つ又は複数のペプチド結合を介して、ポリペプチド鎖に組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質を含む。一部の実施形態では、アミノ酸は、一般的な構造：Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸は、非天然アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に存在するペプチドに共通して存在する２０の標準Ｌ－アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、それが合成により調製されたか、又は天然供給源から得られたかにかかわらず、標準アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を指す。一部の実施形態では、ポリペプチド中のカルボキシ－及び／又はアミノ－末端アミノ酸を含め、アミノ酸は、上の一般的な構造と比較して、構造修飾を含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、アミノ酸は、一般的な構造と比較して、（例えば、アミノ基、カルボン酸基、１つ若しくは複数のプロトン、及び／又はヒドロキシル基の）メチル化、アミド化、アセチル化、ペグ化、グリコシル化、リン酸化、及び／又は置換により修飾されていてもよい。一部の実施形態では、こうした修飾は、例えば、そうでなければ同じ非修飾アミノ酸を含有するものと比較して、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの循環半減期を変更し得る。一部の実施形態では、こうした修飾は、そうでなければ同じ非修飾アミノ酸を含有するものと比較して、修飾アミノ酸を含有するポリペプチドの関連活性を有意に変更しない。文脈から明らかになるように、一部の実施形態では、用語「アミノ酸」は、遊離アミノ酸を示すために使用される場合もあり；一部の実施形態では、ポリペプチドのアミノ酸残基を示すために使用される場合もある。
送達
様々な実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、調節剤）は、医薬組成物である。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、医薬組成物）は、任意の投与経路を介して、細胞及び／又は対象に送達するために、製剤化され得る。対象への投与方法としては、注射、注入、吸入、鼻内、眼内、局所送達、カニューレ内送達、又は摂取を挙げることができる。注射としては、限定しないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、血管内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、並びに胸骨内注射及び注入が挙げられる。一部の実施形態では、投与は、例えば、噴霧法を用いたエアロゾル吸入を含む。一部の実施形態では、投与は、全身（例えば、経口、直腸、鼻内、舌下、口腔、若しくは非経口）、経腸（例えば、全身作用だが、消化管を介して送達される）、又は局所（例えば、皮膚への局所適用、硝子体内注射）である。一部の実施形態では、１つ若しくは複数の組成物は、全身投与される。一部の実施形態では、投与は注射ではなく、且つ、治療薬は非経口治療薬である。いくつかの特定の実施形態では、投与は、気管支（例えば、気管支内点滴による）、口腔、皮膚（例えば、真皮、皮内、皮内、経皮などに対する局所の１つ若しくは複数であるか、又はそれを含み得る）、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻内、腹腔内、髄腔内、静脈内、心室内、特定の器官内（例えば、肝臓内）、粘膜、鼻内、経口、皮下、舌下、局所、気管（例えば、気管内点滴により）、膣内、硝子体などであってよい。一部の実施形態では、投与は、単回用量であり得る。一部の実施形態では、投与は、間欠的（例えば、時間間隔をあけた複数回用量）及び／又は定期的（例えば、共通の時間間隔を開けた個別の用量）な投薬を含み得る。一部の実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたり連続した投薬（例えば、灌流）を含み得る。
本開示に従う医薬組成物は、治療有効量で投与され得る。正確な治療有効量は、所与の対象の治療の効力に関して最も有効な結果をもたらすと考えられる組成物の量である。この量は、様々な要因に応じて変動するが、そうした要因として、限定されないが、治療化合物の特徴（活性、薬物動態、薬力学、及び生体利用可能性など）、対象の生理学的状態（年齢、性別、疾患の種類及びステージ、健康状態全般、所与の用量に対する応答性、並びに薬剤の種類など）、製剤中の薬学的に許容できる１つ若しくは複数の担体、及び／又は投与経路が挙げられる。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を対象に投与することを含む、治療薬の送達方法を提供し、ここで、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）調節剤が治療薬であり、且つ／又は治療薬の送達は、治療薬の非存在下での遺伝子発現に比して、遺伝子発現の変化を引き起こす。
本明細書の様々な実施形態で提供される方法を、本明細書に描写されるいくつかの態様のいずれに使用してもよい。一部の実施形態では、１つ若しくは複数の組成物を特定の細胞、又は１つ若しくは複数の特定の組織に対してターゲティングさせる。
例えば、一部の実施形態では、１つ若しくは複数の組成物を、上皮、結合、筋肉、及び／又は神経組織若しくは細胞に対してターゲティングさせる。一部の実施形態では、組成物を、特定の器官系、例えば、心血管系（心臓、血管）；消化系（食道、胃、肝臓、膀胱、膵臓、腸、結腸、直腸及び肛門）；内分泌系（視床下部、下垂体、松果体若しくは松果腺、甲状腺、副甲状腺、副腎）；排出系（腎臓、尿管、膀胱）；リンパ系（リンパ、リンパ節、リンパ管、扁桃腺、アデノイド、胸腺、脾臓）；外皮系（皮膚、毛髪、爪）；筋肉系（例えば、骨格筋）；神経系（脳、脊髄、神経）；生殖系（卵巣、子宮、乳腺、精巣、精管、精嚢、前立腺）；呼吸系（咽頭、喉頭、気管、気管支、肺、横隔膜）；骨格系（骨、軟骨）；及び／又はそれらの組合せの細胞又は組織にターゲティングさせる。
一部の実施形態では、本開示の組成物は、血液脳関門、胎盤膜、又は血液精巣関門を通過する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、全身投与される。
一部の実施形態では、投与は注射によるものではなく、且つ治療薬は非経口治療薬である。
医薬組成物
本明細書で用いられる場合、用語「医薬組成物」は、１つ若しくは複数の薬学的に許容できる担体（例えば、当業者には周知の薬学的に許容できる担体）と一緒に製剤化される活性薬剤（例えば、妨害剤）を指す。一部の実施形態では、活性薬剤は、関連集団に投与すると、予定された治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンでの投与に適した単位用量で存在する。一部の実施形態では、医薬組成物は、固体又は液体形態での投与のために特別に製剤化してもよく、そうしたものとして、以下：経口投与、例えば、飲薬（水性若しくは非水性溶液又は懸濁液）、錠剤、例えば、口腔、舌下、及び全身吸収を目的とするもの、ボーラス、粉末剤、顆粒剤、舌への適用のためのペースト剤；非経口投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内若しくは硬膜外注射（例えば、滅菌溶液若しくは懸濁液など）、又は持続放出製剤；例えば、クリーム、軟膏などの局所適用、又は皮膚、肺、若しくは口腔に適用される制御放出パッチ若しくはスプレー；例えば、ペッサリー、クリーム、若しくはフォームとしての膣内若しくは直腸内；舌下；眼内；経皮；或いは鼻、肺、及び／又は他の粘膜表面のために設計されたものが挙げられる。
本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容できる」は、信頼できる医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の障害若しくは合併症を起こすことなく、ヒト及び動物の組織と接触した使用に適しており、妥当なベネフィット／リスト比に見合う化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。
本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容できる担体」とは、主題の組成物を１つの器官、若しくは身体の部分から、別の器官、若しくは身体の部分に運搬又は輸送するのに関与する液体若しくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、若しくは溶媒カプセル化材料などの薬学的に許容できる材料、組成物又はビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、且つ患者に対して有害ではないという意味で「許容される」ものでなければならない。一部の実施形態では、例えば、薬学的に許容できる担体として役立ち得る材料として、以下：ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロース、及びその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシルメチルセルロース、エチルセルロース及び酢酸セルロース；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバター及び坐剤用ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、ココナッツ油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；エチルアルコール；アルギン酸；発熱性物質除去蒸留水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール；ｐＨ緩衝液；ポリエステル、ポリカーボネート、及び／又はポリ無水物；並びに医薬製剤に使用されている他の非毒性適合性物質が挙げられる。
本明細書で用いられるとき、用語「薬学的に許容できる塩」は、医薬関連での使用に適した化合物の塩、即ち、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを起こすことなく、ヒト及び下等動物の組織と接触した使用に適しており、且つ妥当なベネフィット／リスト比に見合う塩を指す。薬学的に許容できる塩は、当技術分野で公知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．は、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９（１９７７）に薬学的に許容できる塩を記載している。一部の実施形態では、薬学的に許容できる塩として、限定されないが、非毒性酸付加塩が挙げられ、これは、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸などの無機酸、又は酢酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸若しくはマロン酸などの有機酸と共に形成されるか、或いはイオン交換などの当技術分野で使用される他の方法を用いることにより形成されるアミノ基の塩である。一部の実施形態では、薬学的に許容できる塩として、限定されないが、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアネート、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類金属塩として、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。一部の実施形態では、薬学的に許容できる塩として、適切であれば、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、並びにハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、１～６個の炭素原子を有するアルキル、スルホン酸塩及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを用いて形成されるアミンカチオンが挙げられる。
様々な実施形態では、本開示は、薬学的に許容できる賦形剤と共に、本明細書に記載の医薬組成物を提供する。薬学的に許容できる賦形剤は、一般に安全、非毒性で望ましい医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を含み、且つ動物使用と共にヒト医薬品使用にとって許容できる賦形剤を含む。こうした賦形剤は、固体、液体、半固体であってもよいし、又はエアロゾル組成物の場合には、気体であってよい。
医薬調製物は、錠剤の場合、粉砕、混合、顆粒化、及び必要に応じて圧縮；硬質ゼラチンカプセル剤形の場合、粉砕、混合及び充填を含む従来の製剤技術に従って製造することができる。液体担体を用いる場合、調製物は、シロップ、エレキシル、エマルジョン又は水性若しくは非水性溶液又は懸濁液の形態であってよい。こうした液体製剤は、直接経口投与され得る。
一部の実施形態では、本開示の組成物は、治療薬単独と比較して、ＰＫ／ＰＤの改善、例えば、増加した薬物動態又は薬物力学、例えば、ターゲティング、吸収、若しくは輸送の改善（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上の改善）を有する。一部の実施形態では、組成物は、治療薬単独と比較して、低減した望ましくない作用、例えば、低減した非標的位置への拡散、オフターゲット活性、又は毒性代謝産物（例えば、治療薬単独と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上の低減）を有する。一部の実施形態では、組成物は、治療薬単独と比較して、治療薬の効力を増大し、且つ／又は治療薬の毒性を低減する（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、若しくはそれ以上）。
本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、製剤用担体及び／又はポリマー担体、例えば、リポソーム若しくは小胞体などの担体を含め、製剤化して、公知の方法により、それを必要とする対象（例えば、ヒト又はヒト以外の農場若しくは家畜動物、例えば、畜牛、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に送達される。こうした方法としては、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオンポリマー、リン酸カルシウム）；エレクトロポレーション又は他の膜破壊（例えば、ヌクレオフェクション）及びウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）が挙げられる。さらに送達方法は、例えば、以下：Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ ２０１５，２６（７）：４４３－４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．にも記載されている。タンパク質のカチオン脂質媒介送達は、インビトロ及びインビボで効率的なタンパク質ベースのゲノム編集を可能にする。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ３０；３３（１）：７３－８０。
リポソームは、内部水性区画を囲む単層又は多重層の脂質二重層並びに比較的不透過性の外部親油性リン脂質二重層から構成された球状小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であってもよい。リポソームは、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性薬剤分子の双方を送達し、それらのカーゴを血漿酵素により分解から保護し、それらの負荷を生物学的膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を通じて輸送し得る（例えば、レビューとして、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から作成され得るが、薬物担体としてのリポソームを作成するため、リン脂質が最も一般的に使用される。小胞は、限定はされないが、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＩＭ、ＤＤＡＢを単独で含むか、又はコレステロールと一緒に含み、ＤＯＴＭＡ及びコレステロール、ＤＯＴＡＰ及びコレステロール、ＤＯＴＩＭ及びコレステロール、並びにＤＤＡＢ及びコレステロールを生成してもよい。多重膜小胞脂質を調製するための方法は、当該技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照、多重膜小胞脂質製剤に関するその教示内容は、参照により本明細書中に援用される）。脂質膜が水溶液と混合されるとき、小胞形成は自発的であり得るが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押出成形装置に使用により振盪の形態で力を加えることにより促進され得る（例えば、レビューとして、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押し出された脂質は、サイズを低減するフィルターを介して押し出すことにより調製可能であり、それはＴｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７に記載の通りである（押し出された脂質製剤に関するその教示内容は、参照により本明細書中に援用される）。
本明細書に記載される方法及び組成物は、疾患、障害及び／又は病状の症状を緩和するのに十分なレジメンにより投与される医薬組成物を含み得る。いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の組成物を投与することにより、治療薬を送達する方法を提供する。
本開示の医薬使用は、本明細書に記載の組成物（例えば、調節剤、例えば、妨害剤）を含み得る。いくつかの態様では、医薬使用のためのシステムは、以下：第１ポリペプチドドメインを含むタンパク質、例えば、Ｃａｓ又は修飾Ｃａｓタンパク質、及び第２ポリペプチドドメイン、例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を有するか、又は脱メチル化若しくはデアミナーゼ活性と関連するポリペプチドを、ｅＲＮＡなどのｎｃＲＮＡをターゲティングする少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドと組み合わせて含む。システムは、少なくとも１つのヒト細胞において、完全性指数により特徴付けられるゲノム複合体、例えば、標的アンカー配列媒介接合部を変更するのに効果的である。
いくつかの態様では、本開示の医薬組成物は、ｅＲＮＡなどのｎｃＲＮＡをターゲティングする（例えば、切断する）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はＺＦＮをコードするｍＲＮＡを含む。
いくつかの態様では、医薬使用のためのシステムは、ｎｃＲＮＡ、例えば、ｅＲＮＡに結合して、ｎｃＲＮＡ（例えば、ｅＲＮＡ）を含むゲノム複合体、例えば、アンカー配列媒介接合部（例えば、完全性指数により特徴付けられるゲノム複合体）の形成を変更し、ここで、そうした組成物は、ヒト細胞において、ゲノム複合体、例えば、アンカー配列媒介接合部に関連する標的遺伝子の転写を調節する。
いくつかの態様では、ヒト細胞において、標的遺伝子の発現を変更するためのシステムは、標的遺伝子と関連するｎｃＲＮＡ、例えば、ｅＲＮＡと結合するターゲティング部分（例えば、ｇＲＮＡ、膜転移ポリペプチド）と、ターゲティング部分と作動可能に連結したエフェクター部分（例えば、酵素、例えば、ヌクレアーゼ若しくは不活性化ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９）、メチラーゼ、デメチラーゼ、デアミナーゼ）とを含み、ここで、上記システムは、標的遺伝子の発現を変更（例えば、低減）するのに有効である。ターゲティング部分とエフェクター部分は、異なる個別の（例えば、妨害剤の異なる物理的部分に含まれる）部分であってもよい。ターゲティング部分とエフェクター部分は、例えば、リンカーにより、例えば、共有結合されてもよい。一部の実施形態では、システムは、ターゲティング部分とエフェクター部分を含む合成ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、システムは、ターゲティング部分及びエフェクター部分の少なくとも１つをコードする１つ又は複数の核酸ベクターを含む。
いくつかの態様では、医薬組成物は、アンカー配列媒介接合部のアンカー配列に結合して、アンカー配列媒介接合部の形成を変更することにより、完全性指数により特徴付けられるゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）をターゲティングする組成物を含んでもよく、ここで、上記組成物は、ヒト細胞において、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）に関連する標的遺伝子の転写を調節する。一部の実施形態では、組成物は、アンカー配列媒介接合部の形成を妨害する（例えば、接合部核形成分子に対するアンカー配列の親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはそれ以上低減する）ことにより、完全性指数により特徴付けられるゲノム複合体をターゲティングする。一部の実施形態では、形成の妨害は、接合部核形成分子に対するアンカー配列の親和性を、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはそれ以上調節することによる、完全性指数の変更を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物の投与は、組成物（例えば、薬物）の少なくとも１つの成分の少なくとも１つの薬物動態又は薬物力学パラメータ、例えば、ターゲティング、吸収、若しくは輸送を、別の部分単独と比較して改善するか、又は少なくとも１つのトキシコキネティックスパラメータ、例えば、非標的位置への拡散、オフターゲット活性、及び毒性代謝産物を、別の部分単独と比較して低減する（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくはそれ以上）。一部の実施形態では、本開示の組成物の投与は、調節剤の少なくとも１つの成分の治療範囲を（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくはそれ以上）増大する。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物の投与は、別の部分単独と比較して、最小有効用量を（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくはそれ以上）低減する。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物の投与は、調節剤単独と比較して、最大耐用量を（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくはそれ以上）増大する。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物の投与は、治療薬、例えば、非経口治療薬の注射以外の投与などの効力を増大するか、又はその毒性を低減する。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物の投与は、調節剤単独と比較して、調節剤の治療範囲を増大すると同時に毒性を低減する（例えば、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくはそれ以上）。
いくつかの態様では、本開示は、ｎｃＲＮＡ、例えば、ｅＲＮＡに結合して、ゲノム又は転写複合体、例えば、アンカー配列媒介接合部の形成を変更、例えば、低減する（例えば、複合体のレベルを少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくはそれ以上低下させる）調節剤、例えば、妨害剤を提供する。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的化ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９、例えば、野生型Ｃａｓ９、ニッカーゼＣａｓ９（例えば、Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａ）、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）、ｅＳｐＣａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、若しくはＣ２Ｃ３、又はそのようなヌクレアーゼをコードする核酸と組み合わせて投与される。ヌクレアーゼ及びｇＲＮＡの選択は、標的化突然変異が、ヌクレオチドの欠失、置換、又は付加、例えば、ｎｃＲＮＡ、例えば、ｅＲＮＡに対するヌクレオチドの欠失、置換、又は付加であるかどうかによって決定される。例えば、一部の実施形態では、１つのｇＲＮＡを投与して、例えば、ｎｃＲＮＡ、例えば、ｅＲＮＡ中の不活性化インデル突然変異を引き起こし、例えば、１つのｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ、例えば、ｗｔＣａｓ９と組み合わせて投与する。
いくつかの態様では、本開示は、それを必要とする対象に投与されると、完全性指数により特徴付けられる標的ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）又は標的ゲノム複合体の成分、例えば、ｎｃＲＮＡ、ｅＲＮＡの標的配列に、部位特異的変更（例えば、挿入、欠失（例えば、ノックアウト）、転位、反転、単一の点突然変異）を導入し、それにより、対象における遺伝子発現を調節する、核酸又は核酸の組合せを含む組成物を提供する。
使用
本開示は、さらに、本明細書に開示される調節剤の使用にも関する。中でも、一部の実施形態では、提供されるこうした技術は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）発現の調節、例えば、増大を達成し、例えば、細胞において、例えば、標的遺伝子活性、送達、及び透過の制御を可能にする。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト細胞である。一部の実施形態では、細胞は、体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、初代細胞である。例えば、一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物の体細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は、初代細胞である。一部の実施形態では、哺乳動物体細胞は、非胚性細胞である。一部の実施形態では、細胞は、筋肉細胞（例えば、心臓の筋肉細胞、例えば、心筋細胞）又は神経細胞（例えば、中枢神経系の細胞若しくは脊髄の細胞、例えば、脊髄後根神経節（ＤＲＧ）の細胞（例えば、ニューロン））である。
一部の実施形態では、提供されるこうした技術を用いて、それを必要とする対象、例えば、患者のＦＲＤＡ又はＦＲＤＡに関連する症状を治療することができる。
遺伝子発現の調節
本開示はさらに、一部には、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現を調節、例えば、増大させる方法に関し、これは、本明細書に記載の調節剤（又はそれをコードする核酸、又は前記調節剤若しくは核酸を含む医薬組成物）を用意するステップと、細胞、標的遺伝子、及び／又は作動可能に連結した発現制御エレメントを上記調節剤と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現の調節、例えば、増大は、参照値、例えば、調節剤の非存在下での標的遺伝子の転写と比較した、標的遺伝子の転写の調節を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現を調節、例えば、増大する方法は、例えば、対象、例えば、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象由来の細胞に対して、エクスビボで使用される。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現を調節、例えば、増大する方法は、例えば、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象に対して、インビボで使用される。一部の実施形態では、標的遺伝子の発現を調節、例えば、増大する方法は、例えば、本明細書に記載される細胞又は細胞株に対して、インビボで使用される。
本開示はさらに、一部には、対象における標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の低発現及び／又は病理学的に低レベルの標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）産物（例えば、ｍＲＮＡ若しくはタンパク質）に関連する病状を治療する方法にも関し、これは、本明細書に記載の調節剤（又はそれをコードする核酸、又は前記調節剤若しくは核酸を含む医薬組成物）を対象に投与するステップを含む。特定の遺伝子の低発現及び／又は病理学的に低レベルの遺伝子産物に関連する病状は、当業者には周知である。こうした病状として、限定されないが、ＦＲＤＡ（ＦＸＮの低発現及び／又は病理学的に低レベルのＦＸＮ遺伝子産物に関連する）、代謝障害、神経筋障害、癌（例えば、固形腫瘍）、繊維症、糖尿病、尿素障害、免疫障害、炎症、及び関節炎が挙げられる。
本開示はさらに、一部には、対象における標的遺伝子の発現の誤調節に関連する病状を治療する方法にも関し、これは、本明細書に記載の調節剤（又はそれをコードする核酸、又は前記調節剤若しくは核酸を含む医薬組成物）を対象に投与するステップを含む。理論に束縛されることは望まないが、調節剤を用いて、標的遺伝子の発現を調節する遺伝子をターゲティング（例えば、その発現を増大）し、このようにして調節遺伝子の発現を変更することにより、標的遺伝子の発現を変更すると考えられる。特定の遺伝子の発現の誤調節に関連する病状は、当業者には周知である。こうした病状として、限定されないが、代謝障害、神経筋障害、癌（例えば、固形腫瘍）、繊維症、糖尿病、尿素障害、免疫障害、炎症、及び関節炎が挙げられる。
本明細書に提供される方法及び組成物は、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の転写を安定的、又は一過性変更（例えば、増大）することにより、病状を治療することができる。一部の実施形態では、こうした調節は、少なくとも約１時間～約３０日、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、若しくはそれ以上又はそれらの間の任意の時間持続する。一部の実施形態では、こうした調節は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、若しくは７日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）持続する。任意選択的に、こうした調節は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１年以下にわたって持続する。
一部の実施形態では、治療される病状は、ＦＲＤＡである。ＦＲＤＡは、遺伝性、進行性、神経変性運動障害である。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法により治療を受ける対象、例えば、患者は、ＦＲＤＡを有する対象、例えば、患者である。一部の実施形態では、ＦＲＤＡは、１０～１５歳の間の典型的な発症年齢を有する。一部の実施形態では、対象、例えば、患者は、２５歳未満、例えば、１０～１５歳でＦＲＤＡを有すると診断される。一部の実施形態では、対象、例えば、患者は、２６～３９歳でＦＲＤＡを有すると診断され、例えば、対象、例えば、患者は、晩期発症型ＦＲＤＡ（ＬＯＦＡ）と診断される。一部の実施形態では、対象、例えば、患者は、４０歳以上でＦＲＤＡを有すると診断され、例えば、対象、例えば、患者は、超晩期発症型ＦＲＤＡ（ＶＬＯＦＡ）と診断される。初期症状としては、随意運動調整能力障害（運動失調症）による不安定な姿勢、頻繁な転倒、及び進行性歩行困難が挙げられる。罹患した個体は、不明瞭言語（構音障害）、特徴的な足の変形、及び／又は脊椎の異常な湾曲（脊椎側彎症）を発症し得る。ＦＲＤＡは、心筋症、即ち、心不全又は心拍リズムの不規則性（心不整脈）を引き起こし得る心筋の疾患と関連している可能性がある。ＦＲＤＡ患者の約１／３は、糖尿病を発症する。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法又は組成物は、限定されないが、以下：不安定な姿勢、頻繁な転倒、歩行困難、運動失調症、構音障害、足の変形、脊椎側彎症、心筋症、心不整脈、若しくは糖尿病から選択される、１つ若しくは複数のＦＲＤＡ関連症状を改善（例えば、その重症度を軽減）するか、又は排除する。
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、標的遺伝子と関連するゲノム複合体、例えば、アンカー配列媒介接合部を妨害することにより、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）の発現を調節、例えば、増大し得る。アンカー配列媒介接合部と関連する遺伝子は、少なくとも部分的に、接合部内（即ち、第１及び第２アンカー配列の間に配列様に位置する）にあってもよいし、又は第１及び第２アンカー配列の間に配列様に位置していないという点で接合部の外部であってもよいが、上記遺伝子は、同じ染色体上で、しかも、アンカー配列媒介接合部のトポロジーを制御することによりその発現を調節することができるように、少なくとも第１又は第２アンカー配列と十分に近接して位置する。当業者は、２つのエレメント同士（例えば、上記遺伝子とアンカー配列媒介接合部の間）の三次元空間中での距離が、一部の実施形態において、塩基対に関する距離よりも重要となり得ることは理解されよう。一部の実施形態では、外部ではあるが、関連する遺伝子は、第１又は第２アンカー配列から２Ｍｂ以内、１．９Ｍｂ以内、１．８Ｍｂ以内、１．７Ｍｂ以内、１．６Ｍ以内、１．５Ｍｂ以内、１．４Ｍｂ以内、１．３Ｍｂ以内、１．３Ｍｂ以内、１．２Ｍｂ以内、１．１Ｍｂ以内、１Ｍｂ以内、９００ｋｂ以内、８００ｋｂ以内、７００ｋｂ以内、５００ｋｂ以内、４００ｋｂ以内、３００ｋｂ以内、２００ｋｂ以内、１００ｋｂ以内、５０ｋｂ以内、２０ｋｂ以内、１０ｋｂ以内、又は５ｋｂ以内に位置する。
一部の実施形態では、遺伝子の発現の調節は、遺伝子に対する発現制御配列の到達性を変更することを含む。発現制御配列は、アンカー配列媒介接合部の内部又は外部にかかわらず、増強配列又はサイレンシング（若しくは抑制）配列であり得る。
エピジェネティック修飾
本開示はさらに、一部には、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）、標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御エレメント、又はアンカー配列（例えば、標的遺伝子に対して近位であるか、或いは標的遺伝子又は前記標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列を含むか、若しくはそれと関連するアンカー配列媒介接合部と結合しているアンカー配列）をエピジェネティック的に修飾する方法に関し、この方法は、調節剤、又は調節剤をコードする核酸、又は前記調節剤若しくは核酸を含む医薬組成物を用意するステップと；標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）、標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列、又は細胞を、調節剤、核酸、又は医薬組成物と接触させ、それにより、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列をエピジェネティック的に修飾するステップを含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列をエピジェネティック的に修飾する方法は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列のＤＮＡメチル化の増大若しくは低減を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した転写制御エレメントをエピジェネティック的に修飾する方法は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するヒストンのヒストンメチル化の増大若しくは低減を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列をエピジェネティック的に修飾する方法は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するヒストンのヒストンアセチル化の増大若しくは低減を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列をエピジェネティック的に修飾する方法は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するヒストンのヒストンＳＵＭＯ化の増大若しくは低減を含む。一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列をエピジェネティック的に修飾する方法は、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するヒストンのヒストンリン酸化の増大若しくは低減を含む。
一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列をエピジェネティック的に修飾する方法は、エピジェネティック修飾のレベルを、上記組成物と接触させていないか、又は上記方法で処理されていない細胞における当該部位でのエピジェネティック修飾のレベルに比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％（及び任意選択的に、最大１００％）低減し得る。一部の実施形態では、標的遺伝子又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列をエピジェネティック的に修飾する方法は、エピジェネティック修飾のレベルを、上記組成物と接触させていないか、又は上記方法で処理されていない細胞における当該部位でのエピジェネティック修飾のレベルに比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００％（及び任意選択的に、最大２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又は２０００％）増大し得る。一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列のエピジェネティック修飾により、例えば、本明細書に記載されるように、標的遺伝子の発現のレベルを修飾することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法により達成されるエピジェネティック修飾は、少なくとも約１時間～約３０日、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、若しくはそれ以上、又はそれらの間の任意の時間持続する。一部の実施形態では、こうした調節は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、若しくは２４時間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、若しくは７日、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって（例えば、無期限に）持続する。任意選択的に、こうした調節は、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１年以下にわたって持続する。
一部の実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列をエピジェネティック的に修飾する方法に使用される調節剤は、エピジェネティック修飾部分であるか、又はそれを含むエフェクター部分を含む。
例えば、エフェクター部分は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するエピジェネティック修飾部分であるか、又はそれを含んでもよく、それらのアセチル化を増大する（例えば、標的遺伝子若しくは発現制御配列の１部分と転写因子の相互作用を増大し、例えば、それによって標的遺伝子の転写を増大する）ように、標的遺伝子（例えば、ＦＸＮ）又は標的遺伝子と作動可能に連結した発現制御配列に関連するヒストンを変更することができる。
以下の実施例は、本開示の一部の実施形態をさらに説明するために提供されるが、本開示の範囲の限定を意図するものではなく；それらの例示的な性質から、当業者には周知の他の手順、方法、又は技術が代替的に使用され得ることは理解されよう。
実施例１．ｄＣａｓ９－ｐ３００調節剤を用いたＦＸＮ発現の増大
この実施例では、ＦＲＤＡ患者由来の線維芽細胞におけるＦＸＮ発現及びアコニターゼ活性の増大を目的とする、ｄＣａｓ９分子を有するターゲティング部分と、ｐ３００を有するエフェクター部分とを含む調節剤、例えば、融合分子の使用を実証する。
ウエスタンブロット（図１Ａ）及びＥＬＩＳＡ（図１Ｂ）により観察されるように、ＦＸＮタンパク質レベルは、対照初代線維芽細胞（ＨＤＦｎ）に比してＦＲＤＡ患者由来の線維芽細胞（ＧＭ０４０７８細胞、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で低下する。ミトコンドリアの健康に関連するアコニターゼ活性は、ＦＸＮレベル低下のために、ＦＲＤＡ患者由来の細胞で減少し、これは、アコニターゼ活性アッセイを実施することにより、確認された（Ａｂｃａｍ Ｋｉｔ ａｂ１０９７１２）（図１Ｃ）。
ｄＣａｓ９分子を有するターゲティング部分と、ｐ３００を有するエフェクター部分との融合分子を含む調節剤を、ｓｇＲＮＡと一緒に作製し、調節剤が、細胞のＦＸＮ発現又はアコニターゼ活性を増大することができたか否かＦＲＤＡ線維芽細胞を調べた。ＦＸＮ ＴＳＳ周辺で開始する配列をターゲティングするｓｇＲＮＡガイドのプールと一緒に、調節剤をコードするｍＲＮＡの形態で、ｄＣａｓ９－ｐ３００調節剤をＦＲＤＡ患者由来の線維芽細胞に送達した（図６）。調節剤によりターゲティングされる領域は、ＦＸＮ遺伝子のＴＳＳから約３００ｂｐ配列上流及び６００ｂｐ下流を含んだ。３つの異なるｓｇＲＮＡのプールにｓｇＲＮＡを使用し、リピドナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を用いて、ｄＣａｓ９－ｐ３００調節剤コード化ｍＲＮＡと一緒に共送達した（表４を参照）。さらに、これらの実験の対照として、非ターゲティングｓｇＲＮＡ及び未処理の細胞を使用した。
Figure 2022548800000032
ＦＲＤＡ患者由来の線維芽細胞（ＧＭ０４０７８細胞）を、１２又は６ウェルプレートのいずれかのα－ＭＥＭ１５％ＦＢＳ培地に接種した。翌日、２０～６０μｌ製剤中の２～６μｇのＬＮＰを細胞に添加した（細胞に添加する前に、プレート上又はチューブ内のいずれかで混合した）。２４時間後、ＬＮＰを含有する培地を新鮮な培地と交換し、ＬＮＰでの最初の処理から４８時間及び７２時間後にサンプルを採取した。
製造者のプロトコルに従って、ＲＮＡｅａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、４つの独立した実験からＲＮＡを単離した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて、ｃＤＮＡにＲＮＡサンプルを逆転写し、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＦＸＮ特異的Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブセットアッセイを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により解析した。ΔΔＣｔ法を用いたＨＰＲＴ１又はＧＡＰＤＨ参照遺伝子のいずれかの発現と比較して、ＦＸＮ発現を定量し、非ターゲティングｓｇＲＮＡサンプルを較正物質として使用した。データから、ｄＣａｓ９－ｐ３００調節剤を伴う２つの異なるｓｇＲＮＡプールの送達は、ＦＸＮ遺伝子発現を、非ターゲティングｓｇＲＮＡ対照と比較して最大約４．５倍増大したことがわかった（図２Ａ及び２Ｂ）。倍率増加は、ｓｇＲＮＡ及び使用したＬＮＰの濃度に依存した。ＦＸＮ発現の増大は、１つのｓｇＲＮＡプールによる最初のＬＮＰ処理から４８時間及び７２時間後に観察された（図３Ａ）。ｄＣａｓ９－ｐ３００調節剤を用いてＦＸＮ遺伝子発現の誘導をもたらしたｓｇＲＮＡプールは、ＦＸＮ遺伝子のＴＳＳから最大３００ｂｐ上流及び１５０ｂｐ下流に位置した。加えて、これらの調節剤はまた、正常な非罹患線維芽細胞（ＨＤＦｎ、ＡＴＣＣ）におけるＦＸＮの発現も増大する（図４Ａ及び４Ｂ）。
プロテアーゼ阻害剤を補充したＲＩＰＡバッファーを用いて、タンパク質溶解物を取得した。ＢＣＡアッセイ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いて、タンパク質を測定した。サンプルをウエスタンブロット４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上に泳動させ、抗フラタキシン及び抗β－アクチン抗体を用いてブロッティングした。結果は、ＬＮＰ送達から７２時間後に、ＦＸＮ遺伝子のＴＳＳから１５０ｂｐ下流の領域に対し、ｄＣａｓ９－ｐ３００調節剤及びｓｇＲＮＡで処理したＧＭ０４０７８線維芽細胞について増大したＦＸＮタンパク質発現を示した（図３Ｂ）。
ミトコンドリアの健康と関連するアコニターゼ活性は、ＦＸＮレベル低下のために、ＦＲＤＡ患者由来の細胞中で減少する。ＦＸＮ発現が増大すれば、アコニターゼ酵素活性が増大するはずであろうと仮定された。ＦＸＮ遺伝子のＴＳＳ周辺にターゲティングさせたｄＣａｓ９－ｐ３００調節剤のＬＮＰ送達から７２時間後に採取したサンプルについて、Ａｂｃａｍ Ｋｉｔ ａｂ１０９７１２を用いてアコニターゼ酵素活性を測定した。ＦＸＮ遺伝子のＴＳＳ周辺の領域にターゲティングさせた調節剤で処理した細胞にアコニターゼ活性の増大が観察された（図５）。
Figure 2022548800000033
実施例２．ＷＴ ｉＰＳＣにおけるＦＸＮ発現の変化
この実施例では、人工多能性幹細胞由来の心筋細胞におけるＦＸＮ発現の増大を目的とする、ｄＣａｓ９分子を有するターゲティング部分と、ＶＰＲを有するエフェクター部分とを含む調節剤、例えば、融合分子の使用を実証する。
ＷＴ ｉＰＳＣ由来の心筋細胞（ｉ心筋細胞）及びＷＴ ｉＰＳＣ由来のグルタミン酸作動性皮質ニューロン（ｉニューロン）を、ｄＣａｓ９－ｐ３００若しくはｄＣａｓ９－ＶＰＲを含む融合分子を含む調節剤をコードするｍＲＮＡで処理したが、これらは、単一のｓｇＲＮＡ又は３つのｓｇＲＮＡのプール（実施例１からのプール１）のいずれかと一緒に共送達された。ｓｇＲＮＡによりターゲティングされる領域は、ＦＸＮ遺伝子ＴＳＳから約１００ｂｐ上流である。ＲＮＡは、製造者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて送達した。さらに、これらの実験の対照として、エフェクターを含まないｄＣａｓ９、セーフハーバー（ＳＨ）ｓｇＲＮＡ、及び未処理細胞を使用した。
ｉ心筋細胞（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ［ＦＣＤＩ］ｃａｔ＃Ｒ１０１７）を、０．１％ゼラチン（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でコーティングした２４ウェルプレートに、製造者のプロトコルに従って接種し、推奨される培地中に維持した。平板培養から７日後、ＬＮＰ製剤中０．５ｕｇのｍＲＮＡを細胞に添加した。２４時間後に培地を交換し、様々な時点で（ＬＮＰで処理後２４～１２０時間後に）サンプルを採取した。
ｉニューロン（ＦＣＤＩ ｃａｔ＃Ｒ１０３４）は、天然のマウスラミニン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でコーティングした２４ウェルＰＤＬ Ｂｉｏｃｏａｔプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に接種した。Ｎ２－Ａ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｉＣｅｌｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｂ、及びｉＣｅｌｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＦＣＤＩ）を補充したＢｒａｉｎＰｈｙｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に細胞を維持した。平板培養から７日後、ＬＮＰ製剤中０．５ｕｇのｍＲＮＡを細胞に添加した。２４時間後に培地を交換し、様々な時点で（ＬＮＰで処理後２４～９６時間後に）サンプルを採取した。
ＲＮＥａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造者のプロトコルに従ってＲＮＡをサンプルから精製した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて、ＲＮＡサンプルをｃＤＮＡに逆転写した後、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＦＸＮ特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により解析した。標準曲線法を用いて、発現データを解析した。ＦＸＮ発現をＨＰＲＴ１の発現に対して正規化し、各時点のＳＨ ｓｇＲＮＡ処理対照と比較して倍率変化を算出した。倍率変化は、各サンプルの正規化ＦＸＮ ｍＲＮＡ量をＳＨ対照群の平均で割ることにより算出した。
図８の結果は、ｉ心筋細胞におけるｄＣａｓ９－ＶＰＲ調節剤コード化ＲＮＡを伴うｓｇＲＮＡプール１の送達が、２４時間後に、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ及びＳＨ対照と比較して、ＦＸＮ遺伝子発現を約３倍上方制御することを示している。ＦＸＮの増大は、ＬＮＰ送達の４８時間後にも同様に観察された。ｄＣａｓ９－ＶＰＲ調節剤コード化ｍＲＮＡを伴う単一のｓｇＲＮＡ ＧＤ－２７８９５は、ｉ心筋細胞におけるＦＸＮ発現をほんのわずかにしか増大しなかった。ｄＣａｓ９－ｐ３００を有する融合分子を含む調節剤も、プール１を用いて、ＷＴ ｉ心筋細胞におけるＦＸＮを約１．３倍と、若干上方制御した。
グルタミン酸作動性ｉニューロンでは、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ調節剤コード化ｍＲＮＡを含むｓｇＲＮＡプール１は、２４時間後、ＳＨ対照と比較して約３倍ＦＸＮ遺伝子発現を上方制御した。ＦＸＮの増大は、ＬＮＰ送達の４８時間後にも同様に観察された。ｄＣａｓ９－ＶＰＲ調節剤コード化ｍＲＮＡを伴う単一のｓｇＲＮＡ ＧＤ－２７８９５は、ＬＮＰ送達の２４時間後に、ＳＨ対照と比較して、ＦＸＮ発現を約２．５倍増大した。ｄＣａｓ９－ｐ３００を有する融合分子を含む調節剤も、ＳＨ対照と比較して、プール１ ｓｇＲＮＡ及び単一ｓｇＲＮＡ ＧＤ－２７８９５を用いて、ＷＴグルタミン酸作動性ｉニューロンにおけるＦＸＮを約１．４倍と、若干上方制御した。
これらの結果は、本明細書に記載の調節剤、特にＴＳＳの約１００ｂｐ上流をターゲティングさせたｄＣａｓ９－ＶＰＲを含む調節剤が、ＦＲＤＡに最も罹患した細胞型（心筋細胞及びニューロン）におけるＦＸＮ遺伝子発現を上方制御できることを実証する。
実施例３．ＦＸＮ発現を増大するために調節剤に用いられるＴＡＬエフェクター分子
この実施例は、ＦＲＤＡ患者由来の線維芽細胞におけるＦＸＮ発現の増大を目的とする、ＴＡＬエフェクター分子を有するターゲティング部分と、ＶＰＲを有するエフェクター部分とを含む調節剤、例えば、融合分子の使用を実証する。
ＶＰＲエフェクター部分と融合したＴＡＬエフェクター分子を有する融合分子を含む調節剤をｍＲＮＡの形態で、ＦＲＤＡ患者由来の線維芽細胞（ＧＭ０３８１６）に送達した。ＴＡＬエフェクター分子を含む調節剤は、ＦＸＮ遺伝子ＴＳＳの約１００ｂｐ上流をターゲティングするように設計されている。調節剤をＬＮＰに製剤化した後、細胞に送達した。さらに、これらの実験の対照として、ｄＣａｓ９－ＶＰＲとプール１ ｓｇＲＮＡ又はｄＣａｓ９－ＶＰＲとセーフハーバー（ＳＨ）ｓｇＲＮＡを含む調節剤で処理した細胞、並びに未処理細胞を使用した。
９６及び２４ウェルプレートにおいて１５％ＦＢＳを補充したα－ＭＥＭ培地に、ＧＭ０３８１６細胞を接種した。翌日、ウェル当たり１１２．５ｎｇ及び２２．５ｎｇのＬＮＰ（ＭＣ３）製剤をそれぞれ２４及び９６ウェルプレート内の細胞に添加した。２４時間で培地を交換し、ＬＮＰでの処理から２４及び７２時間後にサンプルを採取した。
２４時間後に採取したサンプルからのＲＮＡを、ＲＮＥａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造者のプロトコルに従って精製した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて、ＲＮＡサンプルをｃＤＮＡに逆転写した後、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＦＸＮ特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により解析した。標準曲線法を用いて、発現データを解析した。ＦＸＮ発現をＨＰＲＴ１の発現に対して正規化し、各時点のＳＨ ｓｇＲＮＡ処理対照と比較して倍率変化を算出した。倍率変化は、各サンプルの正規化ＦＸＮ ｍＲＮＡ量をＳＨ対照群の平均で割ることにより算出した。
プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＲＩＰＡバッファーを用いて、７２時間後に採取したサンプルのタンパク質溶解物を取得し、ＢＣＡ Ｒａｐｉｄ Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。ＦＸＮ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ ａｂ１７６１１２）を用い、製造者のプロトコルに従ってサンプルを解析した。
図９及び１０から、ＴＡＬ－ＶＰＲを有する融合分子を含む調節剤が、ＬＮＰ送達から２４時間後にＦＸＮ遺伝子発現を約６倍、また、７２時間後にＦＸＮタンパク質を約１．５倍増大したことがわかる。
これらの結果は、ＴＡＬベースのターゲティング部分を有する融合分子を含む調節剤が、ＴＳＳの上流の領域にエフェクター部分を送達できること、及びそれらが、ＦＸＮ遺伝子発現を上方制御し得ることを明らかにした。
実施例４．ｄＣａｓ９－ＶＰＲを注射したマウスにおけるＦＸＮ発現の変化
この実施例では、マウスモデル生物に注射したとき、ＦＸＮ発現を増大することを目的とする、ｄＣａｓ９を有するターゲティング部分と、ＶＰＲを有するエフェクター部分とを含む調節剤、例えば、融合分子の使用を実証する。
ＧＤ－２８６３３ ｓｇＲＮＡ（ＦｘｎマウスＴＳＳの約８０ｂｐ上流をターゲティングさせる）又はＳＨ ｓｇＲＮＡと共に、ｄＣａｓ９－ＶＰＲを有する融合分子を含む例示的な調節剤をコードするｍＲＮＡを含有する３ｍｇ／ｋｇのＭＣ３製剤を野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１時点につきＮ＝８匹／群）に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。加えて、ＰＢＳをｉ．ｖ．で注射したマウス（Ｎ＝５）の対照群を比較のために含めた。注射後３、４、及び５日目に肝臓組織を採取し、ＲＮＡ解析のためにＲＮＡ－ｌａｔｅｒ中に保存するか、又はタンパク質解析のために瞬間凍結した。
ＲＮＥａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造者のプロトコルに従ってＲＮＡを精製した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて、ＲＮＡサンプルをｃＤＮＡに逆転写した後、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＦｘｎ特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により解析した。標準曲線法を用いて、発現データを解析した。ＦＸＮ発現をＨＰＲＴ１の発現に対して正規化し、各時点のＳＨ ｓｇＲＮＡ処理対照と比較して倍率変化を算出した。倍率変化は、各サンプルの正規化ＦＸＮ ｍＲＮＡ量をＳＨ対照群の平均で割ることにより算出した。
プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を補充したＲＩＰＡバッファーを用いて、タンパク質溶解物を取得し、ＢＣＡ Ｒａｐｉｄ Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、タンパク質濃度を測定した。ＦＸＮ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ ａｂ１９９０７８）を用いて、製造者のプロトコルに従ってサンプルを解析した。
図１１の結果から、ＧＤ－２８６３３ ｓｇＲＮＡと共にｄＣａｓ９－ＶＰＲ調節剤を含有するＬＮＰのマウスへの静脈内注射が、注射後３及び４日目に、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ調節剤及びＳＨ対照と比較して、肝臓のＦｘｎ遺伝子発現を約２倍増大したことが判明した。図１２の結果から、ＬＮＰ注射後４日目に、ＦＸＮタンパク質レベルが、ＳＨ対照群と比較して、ＧＤ－２８６３３と共にｄＣａｓ９－ＶＰＲで処置した群で約２０％増大したことがわかった。
これらの結果は、ＦｘｎマウスＴＳＳの約８０ｂｐ上流をターゲティングさせたｓｇＲＮＡと共にｄＣａｓ９－ＶＰＲを有する融合分子を含む調節剤を含有するＬＮＰ製剤が、代用組織中のＦｘｎ遺伝子及びタンパク質レベルをインビボで増大し得ることを実証する。
実施例５．ＦＲＤＡ患者由来のｉＰＳＣにおけるＦＸＮ発現の変化
この実施例では、ＦＲＤＡ患者由来のｉＰＳＣにおけるＦＸＮ発現の増大を目的とする、ｄＣａｓ９を有するターゲティング部分と、ｐ３００又はＶＰＲのいずれかを有するエフェクター部分とを含む調節剤、例えば、融合分子の使用を実証する。
患者（ＧＭ０４０７８、ＧＭ０３８１６）及び野生型（ＧＭ０１７１７、ＧＭ０３２３４）ｉＰＳＣ由来の心筋細胞（ｉ心筋細胞）を、ｄＣａｓ９－ｐ３００若しくはｄＣａｓ９－ＶＰＲを含む融合分子を含む調節剤をコードするｍＲＮＡで処理したが、これらは、３つのｓｇＲＮＡのプール（プール１）と一緒に共送達された。ｓｇＲＮＡによりターゲティングされる領域は、ＦＸＮ遺伝子ＴＳＳから約１００ｂｐ上流である。ＲＮＡは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用い、製造者のプロトコルに従って送達した。さらに、対照として、セーフハーバー（ＳＨ）ｓｇＲＮＡ及び未処理細胞を使用した。
患者（ＧＭ０４０７８、ＧＭ０３８１６）及び野生型（ＧＭ０１７１７、ＧＭ０３２３４）ｉＰＳＣ株は、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＲｅｐｒｏＲＮＡ ＯＫＳＧＭキットを用いて、製造者のプロトコルに従って初代線維芽細胞から取得した。ＯＣＴ４、ＴＲＡ－１－６０、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、及びＮＡＮＯＧに対する免疫化学染色を用いてｉＰＳＣ同一性を確認し、ＳＴＲを用いて親株を確認した。
ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、患者ｉＰＳＣをｉ心筋細胞に分化させた。分化１５日目に、全ての細胞を解離させ、ＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ及びＳＴＥＭｄｉｆｆ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、凍結保存した。患者／ＷＴ ｉＰＳＣ由来の心筋細胞を解凍し、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＰＳＣ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔを用いて精製した後、Ｃｏｒｎｉｎｇマトリゲルをコーティングした２４ウェルプレートで平板培養した。培地は、１日置きに新鮮なＣａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ Ｍｅｄｉａ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に取り換えた。平板培養から６日後に、細胞が回復して、拍動を開始したが、その時点で、それらをＬＮＰ製剤中０．５ｕｇのｍＲＮＡで処理した。２４時間後に、培地を交換し、ＬＮＰでの処理から２４、４８及び７２時間後にサンプルを採取した。
ＲＮＥａｓｙ ＭｉｎｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造者のプロトコルに従ってＲＮＡをサンプルから精製した。ＬｕｎａＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｋｉｔ（ＮＥＢ）を用いて、ＲＮＡサンプルをｃＤＮＡに逆転写した後、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＦＸＮ特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用する定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により解析した。標準曲線法を用いて、発現データを解析した。ＦＸＮ発現をＨＰＲＴ１又はＧＡＰＤＨの発現に対して正規化し、各時点のＳＨ ｓｇＲＮＡ処理対照と比較して倍率変化を算出した。倍率変化は、各サンプルの正規化ＦＸＮ ｍＲＮＡ量をＳＨ対照群の平均で割ることにより算出した。
図１３に示す結果は、アッセイすることができた全ての細胞株において、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ調節剤コード化ｍＲＮＡとプール１ ｓｇＲＮＡによる処理から２４時間後に、ＦＸＮ遺伝子発現の２．５～３．５倍の上方制御を示す。対照細胞株ＧＭ０１７１７では、発現は、４８時間までにベースラインに戻る。しかし、患者細胞株ＧＭ０４０７８では処理の４８時間後、並びに野生型対照株ＧＭ０３２３４では４８及び７２時間後に、約１．５倍のＦＸＮの上方制御が持続される。これらのデータは、ｄＣａｓ９－ＶＰＲとプール１ ｓｇＲＮＡを有する融合分子を含む調節剤が、ＦＸＮの上方制御を誘導し、この上方制御が、いくつかの株でより持続可能となり得ることを示唆している。
図１４に示す結果は、両方の患者細胞株、ＧＭ０４０７８及びＧＭ０３８１６で、ｄＣａｓ９－ｐ３００調節剤コード化ｍＲＮＡとプール１ ｓｇＲＮＡを用いた処理後にＦＸＮ遺伝子発現の約１．５倍の上方制御を示す。ＦＸＮ発現は、２つの野生型株、ＧＭ０１７１７及びＧＭ０３２３４で約１．３倍上方制御された。入手可能なデータによれば、ｐ３００媒介によるＦＸＮの上方制御を有する融合分子を含む調節剤は、７２時間後も依然として安定していると考えられ、これは、上記調節剤が、心筋細胞のＦＸＮ遺伝子発現に対して、より持続的な作用をもたらし得ることを示唆している。
図１５に示す結果から、ｄＣａｓ９－ＶＰＲ調節剤コード化ｍＲＮＡと一緒にｓｇＲＮＡプール１を送達すると、患者及び野生型ｉ心筋細胞中のＦＸＮタンパク質レベルが７２時間まで増大することがわかる。ｄＣａｓ９－ｐ３００調節剤コード化ｍＲＮＡを伴うｓｇＲＮＡプール１もまた、患者細胞株中のＦＸＮタンパク質を若干上方制御する。
これらの結果は、とりわけｄＣａｓ９－ＶＰＲを含み、且つＴＳＳの約１００ｂｐ上流にターゲティングさせた本明細書に記載の調節剤（例えば、融合分子を含む）が、ＦＲＤＡに最も罹患した細胞型（心筋細胞）の１つでＦＸＮ遺伝子及びタンパク質発現を上方制御することができることを実証する。

Claims (44)

  1. 以下：
    フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
    ＦＸＮの発現を増大することができるエピジェネティック修飾部分を含むエフェクター部分と、
    を含む調節剤。
  2. 以下：
    フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
    ＦＸＮの発現を増大することができる第１エフェクター部分と、
    ＦＸＮの発現を増大することができる第２エフェクター部分と、
    を含む調節剤であって、
    前記第１及び第２エフェクター部分が、異なる部分である、調節剤。
  3. 以下：
    フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分であって、Ｚｎフィンガー分子を含む、ターゲティング部分と、
    ＦＸＮの発現を増大することができるエフェクター部分と、
    を含む調節剤。
  4. 請求項１～３のいずれか１項に記載の調節剤をコードする核酸。
  5. 調節剤をコードする組換えＲＮＡであって、前記調節剤が、以下：
    フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
    ＦＸＮの発現を増大することができるエフェクター部分と、
    を含む組換えＲＮＡ。
  6. 調節剤をコードする核酸、例えば、組換えＲＮＡを含むナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））であって、前記調節剤が、以下：
    フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
    ＦＸＮの発現を増大することができるエフェクター部分と、
    を含むナノ粒子。
  7. 細胞におけるフラタキシン（ＦＸＮ）発現を増大する方法であって、以下：
    細胞を調節剤と接触させ、これにより、前記細胞におけるＦＸＮ発現を増大することを含み、前記調節剤は、以下：
    フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の発現制御エレメントに結合するターゲティング部分と、
    ＦＸＮの発現を増大することができるエフェクター部分と、を含み、
    ＦＸＮ発現は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０週間にわたって（及び任意選択的に、永続的に）増大するか、或いは
    前記細胞が、少なくとも４４コピーのＧＡＡ伸長を有するＦＸＮ対立遺伝子を含み、前記調節剤による治療後に、前記ＦＸＮ対立遺伝子は、前記調節剤と接触させていない類似細胞の発現レベルの少なくとも１．５×（即ち、１．５倍）のレベルで発現される、方法。
  8. 細胞におけるフラタキシン（ＦＸＮ）発現を増大する方法であって、以下：
    細胞を請求項１～７のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターと接触させ、
    これにより、前記細胞におけるＦＸＮ発現を増大すること
    を含む、方法。
  9. 前記エフェクター部分が、エピジェネティック修飾部分を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  10. 前記エピジェネティック修飾部分が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、又はそのいずれかの機能性断片若しくは変異体を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  11. 前記エフェクター部分が、ＤＮＡデメチラーゼ又はその機能性断片若しくは変異体、例えば、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３、若しくはＴＤＧから選択されるタンパク質、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  12. 前記エフェクター部分が、ヒストンメチルトランスフェラーゼ又はその機能性断片若しくは変異体、例えば、ＤＯＴ１Ｌ、ＰＲＤＭ９、ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ２、ＰＲＭＴ３、ＰＲＭＴ４、ＰＲＭＴ５、ＮＳＤ１、ＮＳＤ２、ＮＳＤ３から選択されるタンパク質、又はそのいずれかの機能性変異体若しくは断片を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  13. 前記エフェクター部分が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ又はその機能性断片若しくは変異体、例えば、ｐ３００、ＣＲＥＢ－結合タンパク質（ＣＢＰ）から選択されるタンパク質、又はそのいずれかの機能性断片若しくは変異体を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  14. 前記エフェクター部分が、転写活性化因子又はその機能性断片若しくは変異体、例えば、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ１６０、若しくはＶＰＲから選択されるタンパク質を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  15. 前記ターゲティング部分が、Ｃａｓ９分子を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  16. 前記Ｃａｓ９分子が、レンサ球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、又はＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（例えば、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、スタフィロコッカッス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィラス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、又はマリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）由来のＣａｓ９タンパク質を含む、請求項１５に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  17. 前記Ｃａｓ９分子が、例えば、不活性ＲｕｖＣ及び／又はＨＮＨドメインを含む、実質的にヌクレアーゼ活性を欠失したＣａｓ９タンパク質、例えば、ｄＣａｓ９を含む、請求項１５又は１６に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  18. 前記Ｃａｓ９分子が、ｇＲＮＡ、例えば、ｓｇＲＮＡを含み（例えば、それと非共有結合しており）、前記ｇＲＮＡは、前記発現制御エレメントに結合する、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  19. 前記ｇＲＮＡが、配列番号４～２６のいずれか、又は配列番号４～２６のいずれかに対して少なくとも８０、８５、９０、９５、若しくは９９％同一性を有する配列から選択される核酸配列を含む、請求項１８に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  20. 前記ターゲティング部分が、ＴＡＬエフェクター分子を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  21. 前記ターゲティング部分が、Ｚｎフィンガー分子を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  22. 前記ターゲティング部分が、２、３、４、５、又は６つのＺｎフィンガータンパク質を有するＺｎフィンガー分子を含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  23. 前記発現制御エレメントが、前記ＦＸＮ遺伝子と作動可能に連結されたエンハンサー若しくはプロモータ又はその部分を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  24. 前記ターゲティング部分が、前記ＦＸＮ遺伝子の転写開始部位から５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０、３７０、３６０、３５０、３４０、３３０、３２０、３１０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１ヌクレオチド以下上流又は下流（及び任意選択的に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、若しくは９０ヌクレオチド上流又は下流）の核酸配列に結合する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  25. 前記ターゲティング部分が、表３のゲノムの座標により描かれる配列から選択される核酸配列に結合する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  26. 前記ターゲティング部分が、Ｃａｓ９分子、例えば、ｄＣａｓ９分子を含み、前記エフェクター部分が、ｐ３００又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
    請求項１～２５のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  27. 前記ターゲティング部分が、Ｃａｓ９分子、例えば、ｄＣａｓ９分子を含み、前記エフェクター部分が、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
    請求項１～２５のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  28. 前記ターゲティング部分が、酵素として不活性のＣａｓヌクレアーゼ、例えば、ｄＣａｓ９分子を含み、前記エフェクター部分が、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体、ｐ６５又はその機能性断片若しくは変異体、及びＲＴＡ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
    請求項１～２５のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  29. 前記ターゲティング部分が、ＴＡＬエフェクター分子（例えば、前記ＴＡＬエフェクター分子は、ＦＸＮ遺伝子ＴＳＳの上流、例えば、約５０～１５０ヌクレオチド上流、例えば、約１００ヌクレオチド上流に結合する）を含み、前記エフェクター部分が、ＶＰＲ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
    請求項１～２５のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  30. 前記ターゲティング部分が、ＴＡＬエフェクター分子分子（例えば、前記ＴＡＬエフェクター分子は、ＦＸＮ遺伝子ＴＳＳの上流、例えば、約５０～１５０ヌクレオチド上流、例えば、約１００ヌクレオチド上流に結合する）を含み、前記エフェクター部分が、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体、ｐ６５又はその機能性断片若しくは変異体、及びＲＴＡ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
    請求項１～２５のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  31. 前記ターゲティング部分が、Ｚｎフィンガー分子（例えば、前記Ｚｎフィンガー分子は、ＦＸＮ遺伝子ＴＳＳの上流、例えば、約５０～１５０ヌクレオチド上流、例えば、約１００ヌクレオチド上流に結合する）を含み、前記エフェクター部分が、ＶＰＲ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
    請求項１～２５のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  32. 前記ターゲティング部分が、Ｚｎフィンガー分子分子（例えば、前記Ｚｎフィンガー分子は、ＦＸＮ遺伝子ＴＳＳの上流、例えば、約５０～１５０ヌクレオチド上流、例えば、約１００ヌクレオチド上流に結合する）を含み、前記エフェクター部分が、ＶＰ６４又はその機能性断片若しくは変異体、ｐ６５又はその機能性断片若しくは変異体、及びＲＴＡ又はその機能性断片若しくは変異体を含む、
    請求項１～２５のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  33. 前記調節剤が、融合分子を含むか、又は融合分子である、請求項１～３２のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  34. 前記調節剤が、配列番号３０４～３０９のいずれかから選択されるアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２５又は３３のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、ウイルスベクター、又は方法。
  35. 請求項１～３又は９～３４のいずれか１項に記載の調節剤と、前記ＦＸＮ遺伝子の発現制御配列を有する核酸配列と、を含む複合体。
  36. 請求項１～６又は９～３４のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターを含む細胞。
  37. 請求項１～３又は９～３４のいずれか１項に記載の調節剤をコードする核酸を含む細胞。
  38. 請求項１～６又は９～３４のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターを細胞に送達する方法であって、
    前記調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターと前記細胞を接触させ、
    これにより、前記調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターを前記細胞に送達すること
    を含む方法。
  39. フラタキシン（ＦＸＮ）遺伝子の転写を調節、例えば、増大する方法であって、以下：
    請求項１～６又は９～３４のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターと細胞を接触させ、
    これにより、前記ＦＸＮ遺伝子の発現を調節、例えば、増大すること
    を含む方法。
  40. フリードライヒ運動失調症（ＦＲＤＡ）を有する患者を治療する方法であって、以下：
    請求項１～６又は９～３４のいずれか１項に記載の調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターを前記患者に投与し、
    これにより、前記患者を治療すること
    を含む方法。
  41. 前記方法が、血液（例えば、全血）中のＦＸＮレベルを、前記調節剤、核酸、組換えＲＮＡ、ナノ粒子、又はウイルスベクターの非存在下での血液（例えば、全血）中のＦＸＮレベルに比して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、３００、若しくは４００％増大する、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記方法が、ＦＤＲＡの少なくとも１つの症状、例えば、以下：運動失調、構音障害、筋力低下、痙性（例えば、下肢痙縮）、脊椎側彎症、膀胱機能障害、反射障害、位置覚及び／若しくは振動感覚の消失、心筋症、又は糖尿病から選択される症状を軽減又は排除する、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 血液（例えば、全血）中のＦＸＮの前記レベルを少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０週間、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月、又は少なくとも１、２、３、４、若しくは５年にわたって増大する、請求項４１又は４２に記載の方法。
  44. 前記方法が、血液（例えば、全血）中のＦＸＮレベルを少なくとも１２、１８、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、又は９６時間にわたって増大する、請求項３８～４３のいずれか１項に記載の方法。
JP2022543368A 2019-09-23 2020-09-23 フラタキシン発現を調節し、フリードライヒ運動失調症を治療するための方法及び組成物 Pending JP2022548800A (ja)

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