JP2022541435A - クローディン１８抗体及びがんを処置する方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、クローディン－１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）に結合する抗原結合タンパク質；ＣＬＤＮ１８．２及び第２の抗原に結合する二重特異性抗原結合タンパク質；ならびにそのコンジュゲートを提供する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメインの細胞外ループ１（ＥＬ１）に結合する。関連するポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、及びコンジュゲートが本明細書でさらに提供される。そのような実体を含むキット及び薬学的組成物がさらに提供される。また、抗原結合タンパク質を作製する方法及びがんを有する対象を処置する方法が提供される。【選択図】なし

Description

本開示は、一般に、クローディン１８．２に特異的な抗体及びがんを処置するためのその使用に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月１７日に出願された米国仮出願番号６２／８７５，４１６の利益を主張し、前記出願の内容全体がこの参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
抗体は、細胞、細菌、ウイルス、または毒素上の異なる抗原を特異的に標的とするそれらの能力により、限られた副作用を特徴とする強力な治療剤を構成する。１９８６年に、最初の治療用モノクローナル抗体であるＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３が市場に導入された。その時から、このクラスのバイオ医薬製品は大きく成長している。２０１４年の終盤において、４７種のモノクローナル抗体製品が米国または欧州においてがんならびに炎症、心臓血管、呼吸、及び感染性疾患を含む多様な疾患の処置のために承認を受けている。
１２種を超えるモノクローナル抗体が、現在、米国食品医薬品局によってがんを処置するために承認されている。これらの薬剤の中には、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を適応症とするアレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、及び乳癌を処置するために使用されるトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））がある。例えば、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））及びアド－トラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））を含む一部の抗体は化学療法薬に分類される。ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）などの他の抗体製品は、２つの異なる抗原を認識し、それに結合するように設計されている。そのような抗体製品の商業的利用可能性にもかかわらず、現在のがん発生率及びがん死亡数は高いままである。がん発生率は、年間１００，０００人の男性及び女性当たり４５０人超であり、がん死亡率は、年間１００，０００人の男性及び女性当たり１７０人強であると報告されている。
本明細書では、クローディン－１８（ＣＬＤＮ１８）に結合する抗原結合タンパク質が提供される。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８に結合し、任意にマウスＣＬＤＮ１８に結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に結合する。様々な実施形態では、本開示は、ＣＬＤＮ１８．２に対する抗原結合タンパク質を提供する。様々な例では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２のＥＣＤの細胞外ループ１（ＥＬ１）に結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＥＬ１に結合し、ＣＬＤＮ１８．２のＥＣＤの細胞外ループ２（ＥＬ２）に結合しない。様々な実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２（配列番号１）の残基２８～７４のアミノ酸配列内のエピトープに結合する。様々な実施形態では、抗原結合は、ＣＬＤＮ１８．２のＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＦＹＦＴＬ（配列番号４）、ＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＫ（配列番号５）、ＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣ（配列番号６）またはＣＲＧＹＦＴＬＬＦＬＰＡＭＬＱＡＶＲ（配列番号７）のアミノ酸配列に結合する。
様々な例では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２に結合し、クローディンファミリーの他のメンバーのいずれにも結合しない。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトがん細胞、例えば、ＨＵＰＴ４膵臓細胞によって内因的に発現するＣＬＤＮ１８．２に結合する。様々な例では、本開示の抗原結合タンパク質は、任意の他の部位が抗原結合タンパク質に結合することなく、対象、例えば、ヒトにおける腫瘍成長を阻害する。様々な例では、異質部位にコンジュゲートされていない（例えば、任意の化学療法剤、薬物または毒性部位にコンジュゲートされていない）抗原結合タンパク質は、対象、例えば、ヒトにおける腫瘍成長を阻害する。
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトがん細胞によって発現するＣＬＤＮ１８．２に結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２と参照抗ＣＬＤＮ１８．２抗体との間の結合相互作用を阻害する。特定の理論に縛られることなく、本明細書で提供される抗原結合タンパク質の阻害作用により、そのような実体は、腫瘍成長を減少させる方法及び腫瘍またはがんを有する対象を処置する方法において有用となる。本明細書でさらに論述されるように、様々な態様では、抗原結合タンパク質は、抗体、その抗原結合抗体断片、または抗体タンパク質産物である。
本開示はまた、アミノ酸配列の特定の群の少なくとも３、４、５、またはすべてのアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、本明細書に開示されるＣＬＤＮ１８．２抗体の少なくとも３、４、５、または６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。
本開示はさらに、本明細書に詳述されるアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を提供する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、本明細書にさらに記載されるように、表Ａ、表Ｂ、表Ｃ、表Ｄ、表６、表８、表９、表１０、表１１に列挙される配列番号のアミノ酸配列、またはそれらの組み合わせを含む。
本開示は、ＣＬＤＮ１８．２及び第２の抗原に結合する二重特異性抗原結合タンパク質を提供する。二重特異性抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のいずれか１つを含み得る。第２の抗原は、細胞表面タンパク質、任意に、結合が免疫反応を調節するタンパク質であり得る。二重特異性抗原結合タンパク質は、任意の構造、例えば、ダイアボディ、ＴａｎｄＡｂ（タンデムダイアボディ）、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）などをとり得る。例示的な二重特異性抗原結合タンパク質は、表１１に示される配列を含む。
本開示はまた、抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質及び異質部位（例えば、細胞傷害性薬物）を含むコンジュゲートを提供する。コンジュゲートは、切断可能なリンカーまたは切断可能ではないリンカーを含み得る。コンジュゲートは、本明細書に記載の抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質にコンジュゲートされた様々な数の異質部位（薬剤）、好ましくはタンパク質当たり１～８個の薬剤またはタンパク質当たり３～８個の薬剤を有し得る。コンジュゲートは、部位特異的コンジュゲートであり得る。コンジュゲートは、同種コンジュゲートまたは異種コンジュゲートであり得る。
関連するポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、及びコンジュゲートが本明細書でさらに提供される。そのような実体を含むキット及び薬学的組成物がさらに企図される。
また、抗原結合タンパク質を作製する方法が提供される。様々な実施形態では、方法は、抗原結合タンパク質またはポリペプチドを発現するように本明細書に記載される抗原結合タンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含む。
がんを有する対象を処置する方法が本明細書でさらに提供される。様々な実施形態では、方法は、対象におけるがんを処置するのに有効な量で本開示の薬学的組成物を対象に投与することを含む。
また、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。様々な実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがんは、ＣＬＤＮ１８．２を発現する。さらに、対象における腫瘍成長を阻害する方法であって、本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が企図される。
対象における腫瘍サイズを減少させる、または対象におけるがんの再発を予防する方法であって、本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
また、本明細書では、ＣＬＤＮ１８．２などのＣＬＤＮ１８の低過剰発現体であると診断された対象におけるがんを処置する方法であって、本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。
様々な実施形態では、投与は、腫瘍細胞、例えば、ＣＬＤＮ１８、特にＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞におけるアポトーシスを誘導する。様々な実施形態では、投与は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、腫瘍壊死及び細胞の死または枯渇、及び／または腫瘍細胞接着の妨害を誘導し、その各々は、腫瘍退縮または腫瘍成長の鈍化をもたらす。
がんタイプのパネルにおけるＣＬＤＮ１８．２発現のグラフを表している。 さらなるがんタイプにおけるＣＬＤＮ１８．２発現のグラフを表している。 ＲＮＡＳｅｑによって決定される、がん細胞株におけるＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２発現のグラフを表している。 本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ１８．２抗体が、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現するがん細胞株の表面上のＣＬＤＮ１８．２を検出する能力を示している。 Ａは、キメラ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体での処置後の時間（日数）の関数としての上部胃腸管（ＳＮＵ６０１）腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。Ｂは、同じ処置群における３０日目での腫瘍体積（ｍｍ３）の平均変化のグラフを表している。 Ａは、キメラ抗ＣＬＤＮ１８．２抗体での処置後の時間（日数）の関数としての膵臓（ＨＵＰＴ４）腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。Ｂは、同じ処置群における２８日目での腫瘍体積（ｍｍ３）の平均変化のグラフを表している。 ヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体での処置後の時間（日数）の関数としての膵臓（ＨＵＰＴ４）腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。 同じ処置群における４２日目での腫瘍体積（ｍｍ３）の平均変化のグラフを表している。 ヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体での処置後の時間（日数）の関数としての異なる投薬スケジュール後の膵臓（ＨＵＰＴ４）腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍体積の差を示している。 同じ処置群における４２日目での腫瘍体積（ｍｍ３）の平均変化のグラフを表している。 ヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）での処置後の時間（日数）の関数としての膵臓（ＨＵＰＴ４）腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。 単回用量の抗ＣＬＤＮ１８．２ＡＤＣまたは対照抗体で処置されたマウスにおける腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。 Ａは、異なる用量のヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２ＡＤＣでの処置後の時間（日数）の関数としての膵臓（ＰＡＴＵ８９８８Ｓ）腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。Ｂは、同じ処置群における３３日目での腫瘍体積（ｍｍ３）の平均変化のグラフを表している。 異なる用量のヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２ＡＤＣでの処置後の時間（日数）の関数としてのＳＮＵ６０１胃癌を保有するマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。 Ａは、異なる用量のヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）での処置後の時間（日数）の関数としての膵臓（ＨＵＰＴ４）腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。Ｂは、同じ処置群における３２日目での腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。 本明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２抗体の重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示している。 図１３－１の続き。 図１３－２の続き。 図１３－３の続き。 図１３－４の続き。 Ａは、異なる用量のヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）での処置後の時間（日数）の関数としてのＣＬＤＮ１８．２を発現する膵臓患者由来（ＰＤＸ）腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。Ｂは、同じ処置群における２７日目での腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。Ｃは、ＰＤＸモデルでのＣＬＤＮ１８．２発現を示す免疫組織化学（ＩＨＣ）を表している。 Ａは、異なる用量のヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）での処置後の時間（日数）の関数としてのＣＬＤＮ１８．２を発現しない膵臓患者由来（ＰＤＸ）腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。Ｂは、同じ処置群における１８日目での腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。Ｃは、ＰＤＸモデルでのＣＬＤＮ１８．２発現の欠如を示す免疫組織化学（ＩＨＣ）を表している。 異なる用量のヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）での処置後の時間（日数）の関数としてのＣＬＤＮ１８．２を発現しない黒色腫（Ｍ２０２）腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。 同じ処置群における２３日目での腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。 抗体３０７－４ｈ及び３５８－ｈ３ならびにさらなる配列類型についての配列を表している。これらの抗体は、潜在的製造可能性配列負担に対する追加情報を提供するために生成された。 フローサイトメトリーによって分析された場合のネイティブ陽性細胞（ＣＬＤＮ１８．２の内因性発現を有する細胞）または人工的過剰発現細胞（ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞）に対するヒト化抗体結合活性を表している。 ヒトＣＬＤＮ１８．２、ヒトＣＬＤＮ１８．１、マウスＣＬＤＮ１８．２、イヌＣＬＤＮ１８、及びラットＣＬＤＮ１８に対するヒト化抗体結合活性を表している。 ＨＵＰＴ４細胞における ＣＬＤＮ１８．２ヒト化抗体を用いた抗体内在化のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性化を示している。 Ａは、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するヒト化ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性（ＫＤ）を表している。Ｂは、様々ながん細胞株に対するＣＬＤＮ１８．２発現レベルを表している。ｐＮＫ－３０７－ｈ１Ｆ０６－４は３０７－ｈ４抗体を指し；ｐＮＫ－３５８－ｈ２ｃ１０－３は３５８－ｈ３抗体を指し；＃３０７－６ｈは３０７－６ｈ抗体を指し；＃３５８－５ｈは３５８－５ｈ抗体を指す。 Ａは、ヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２抗体（３０７－４ｈ、３０７－６ｈ、３５８－３ｈ、及び３５８－５ｈ）での処置後の時間（日数）の関数としての膵臓（ＨＵＰＴ４）腫瘍を保有するマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。Ｂは、同じ処置群における２４日目での腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。 ＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）（図２３Ａ及び図２３Ｃ）及びＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂ（図２３Ｂ及び図２３Ｃ）の配列を表している。 図２３Ａ－１の続き。 ＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）（図２３Ａ及び図２３Ｃ）及びＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂ（図２３Ｂ及び図２３Ｃ）の配列を表している。 図２３Ｂ－１の続き。 ＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）（図２３Ａ及び図２３Ｃ）及びＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂ（図２３Ｂ及び図２３Ｃ）の配列を表している。 図２３Ｃ－１の続き。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６ ＴａｎｄＡｂの結合活性を表している。結合活性はフローサイトメトリーによって分析した。 フローサイトメトリーによって分析された場合のＪｕｒｋａｔ細胞に対するＣＬＤＮ１９．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥの結合活性を表している。 ＢｉＴＥでのＪｕｒｋａｔ細胞の表面染色を示している。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞を使用したＮＦＡＴ－ＲＥレポーター及びＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥを用いたＪｕｒｋａｔ細胞を使用したＴ細胞活性化アッセイを表している。 ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞またはＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞を使用したＮＦＡＴ－ＲＥレポーター及びＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥを用いたＪｕｒｋａｔ細胞を使用したＴ細胞活性化アッセイを表している。 処置から５日後のＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥ細胞傷害アッセイの代表的図面を示している。 処置から５日後のＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥ細胞傷害アッセイの代表的図面を示している。 処置から５日後のＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥ細胞傷害アッセイの代表的図面を示している。 処置から５日後のＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥ細胞傷害アッセイの代表的図面を示している。 処置から５日後のＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥ細胞傷害アッセイの代表的図面を示している。 処置から５日後のＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥ細胞傷害アッセイの代表的図面を示している。 処置から５日後のＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥの乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性を表している。 異なる用量の抗ＣＬＤＮ１８．２ ＢｉＴＥでの処置後の時間（日数）の関数としての膵臓（ＨＵＰＴ４）腫瘍を保有し、かつヒトＰＢＭＣが注射されたマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。 異なる用量のヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２ ＢｉＴＥでの処置後の時間（日数）の関数としての膵臓（ＨＵＰＴ４）腫瘍を保有するヒト化ＢＬＴマウスにおける腫瘍の腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。 同じ処置群における２８日目での腫瘍体積（ｍｍ３）のグラフを表している。
本開示は、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがんを処置するための、例えば、ＣＬＤＮ１８．２に特異的なＣＬＤＮ１８に対する抗原結合タンパク質を記載する。抗ＣＬＤＮ１８．２抗体は、細胞－細胞接合部におけるＣＬＤＮ１８．２の機能の直接的阻害を介して及び免疫動員を介して有効となると考えられている。
クローディンファミリー
閉鎖結合または閉鎖帯としても周知の密着結合は、上皮細胞シート及び内皮細胞シートにおいて傍細胞透過性を調節し、細胞極性を維持する、２つの隣接細胞間に位置する脊椎構造である。クローディン（ＣＬＤＮ）ファミリーの遺伝子は、密着結合の重要な構成要素である膜タンパク質をコードしている。ＣＬＤＮタンパク質は、４つの膜貫通（ＴＭ）ヘリックス（ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、及びＴＭ４）及び２つの細胞外ループ（ＥＬ１及びＥＬ２）を含む。隣接細胞のＣＬＤＮタンパク質の細胞外ループ同士は、互いに相互作用して細胞シートを密閉し、内腔の空間と基底外側の空間との間の傍細胞輸送を調節する。
ＣＬＤＮタンパク質は、様々なヒトの疾患及び病態において役割を果たす。例えば、ＣＬＤＮ１遺伝子内の変異は、胆管の閉塞と共に進行性の皮膚の鱗屑をもたらすことが示されている。ＣＬＤＮ１６遺伝子の変異は、マグネシウム消耗障害を引き起こす。ＣＬＤＮ１９変異は、黄斑欠損症及び近視などの眼球病態につながる一方で、ＣＬＤＮ１４変異は、非症候群性劣性難聴につながり得る。ＣＬＤＮ３及びＣＬＤＮ４は、消化管におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓのエンテロトキシン用の表面受容体であることが知られており、ＣＬＤＮ１、ＣＬＤＮ６、及びＣＬＤＮ９は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）侵入用の共受容体である。いくつかのＣＬＤＮタンパク質は、がんにおいて異常に発現することが示されている。例えば、ＣＬＤＮ１は、乳癌及び結腸癌において下方制御される一方で、ＣＬＤＮ３及びＣＬＤＮ４は、複数のがんにおいて強く上方制御される。
クローディン－６（ＣＬＤＮ６）は、ＣＬＤＮファミリーのメンバーである。ヒトＣＬＤＮ６タンパク質をコードする遺伝子は、ヒト１６番染色体のｐ腕上の１６ｐ１３．３に位置しており、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、及びカエルにおいて保存されている。ＣＬＤＮ６は通常、ヒトにおいて２２０アミノ酸前駆体タンパク質として発現しており、その最初の２１アミノ酸はシグナルペプチドを構成している。
クローディン－１８（ＣＬＤＮ１８）は、非生殖系列成人組織ではほとんど存在しない密着結合タンパク質である。ＣＬＤＮ１８．２は、非幹細胞と比べて幹細胞において上昇している。ヒトＣＬＤＮ１８遺伝子は、２つの代替第１エクソンを有し、第１の細胞外ループを含むＮ末端６９アミノ酸が異なる２つのタンパク質アイソフォーム（ＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２）を生じさせる（Ｎｉｉｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００１；２１：７３８０－９０）。２つのバリアントは、第１の細胞外ドメインにおいて８／５１アミノ酸で異なり、それらの第２の細胞外ループの配列は同一である。ＣＬＤＮ１８．２は、正常な胃組織にのみ存在する。ＣＬＤＮ１８．２は、膵臓癌、食道癌及び肺癌において過剰発現する。高い腫瘍－正常発現差及び腫瘍生物学におけるその推定的役割は、ＣＬＤＮ１８．２を非常に魅力的な治療標的とする。ＣＬＤＮ１８．２前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトでＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１００２０２６として公共に利用可能であり、本明細書で配列番号１として提供されている。細胞外ループ１は、配列番号１のアミノ酸２８～８０に及び、ＥＬ２は、配列番号１のアミノ酸１４４～１７４である。クローディン－１８．２に結合する抗体は、米国特許番号１０，１３７，１９５に記載されている。
抗原結合タンパク質
本明細書では、クローディン－１８（ＣＬＤＮ１８）に結合する抗原結合タンパク質が提供される。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、アイソフォームＣＬＤＮ１８．２に結合する。本開示の抗原結合タンパク質は、当該技術分野で知られている抗原結合タンパク質の多くの形態のいずれか１つをとり得る。様々な実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、抗体、または抗原結合抗体断片、または抗体タンパク質産物の形態をとる。
本開示の様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体を含み、抗体から本質的になり、または抗体からなる。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、重鎖及び軽鎖を含み、かつ可変及び定常領域を含む従来の免疫グロブリン形式を有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対の「Ｙ型」構造であるＩｇＧであり得、各対は、１つの「軽」（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）及び１つの「重」鎖（典型的には約５０～７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。抗体は、可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧ形式では、可変領域は通常、約１００～１１０またはそれ以上のアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識を担い、異なる抗原に結合する他の抗体間で実質的に異なる。定常領域により、抗体は、免疫系の細胞及び分子を動員することが可能となる。可変領域は、各軽鎖及び重鎖のＮ末端領域から構成されるのに対し、定常領域は、重鎖及び軽鎖の各々のＣ末端部分から構成される。（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９））。
抗体のＣＤＲの一般的な構造及び特性は、当該技術分野において記載されている。簡潔には、抗体骨格において、ＣＤＲは、それらが概ね抗原結合及び抗原認識を担う領域を構成する重鎖及び軽鎖可変領域のフレームワーク内に組み込まれている。可変領域は典型的には、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１により、フレームワーク領域１～４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と指定されている；上記Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７も参照）内において、少なくとも３つの重鎖または軽鎖ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３も参照）を含む。関連する実施形態では、フレームワークの残基は変更される。変更され得る重鎖フレームワーク領域は、Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３及びＨ－ＦＲ４と指定された領域内にあり、これは、重鎖ＣＤＲ残基を取り囲んでおり、変更され得る軽鎖フレームワーク領域の残基は、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３及びＬ－ＦＲ４と指定された領域内にあり、これは、軽鎖ＣＤＲ残基を取り囲んでいる。フレームワーク領域内のアミノ酸は、例えば、ヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークにおいて特定された任意の好適なアミノ酸で置き換えられ得る。
抗体は、当該技術分野で知られている任意の定常領域を含み得る。ヒト軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖として分類されている。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類されており、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むがこれらに限定されないサブクラスを有する。本開示の実施形態には、抗体のすべてのそのようなクラスまたはアイソタイプが含まれる。軽鎖定常領域は、例えば、カッパまたはラムダ型軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ型軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー型重鎖定常領域、例えば、ヒトアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、またはミュー型重鎖定常領域であり得る。したがって、様々な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のいずれか１つを含む、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭの抗体である。様々な態様では、抗体は、半減期／安定性を向上させるまたは抗体を発現／製造可能性にとってより好適とするために、天然の同等物と比べて１つ以上のアミノ酸改変を含む定常領域を含む。様々な例では、抗体は、天然の同等物に存在するＣ末端のＬｙｓ残基が除去または切断されている定常領域を含む。
抗体は、モノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどによって生成された自然に発生する抗体と実質的に類似する配列を含む。この点に関して、抗体は、哺乳動物抗体、例えば、マウス抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ヒト抗体などとして考えられ得る。所定の態様では、抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、ヒト抗体である。所定の態様では、抗原結合タンパク質は、キメラ抗体またはヒト化抗体である。用語「キメラ抗体」は、２つ以上の異なる抗体からのドメインを含有する抗体を指す。キメラ抗体は、例えば、１つの種からの定常ドメイン及び第２の種からの可変ドメインを含有し得、またはより一般的には、少なくとも２つの種からのアミノ酸配列のストレッチを含有し得る。キメラ抗体はまた、同じ種内の２つ以上の異なる抗体のドメインを含有し得る。用語「ヒト化」は、抗体に関して使用される場合、元の供給源の抗体と比べて純粋なヒト抗体により類似する構造及び免疫学的機能を有するように操作された、非ヒト源からのＣＤＲ領域を少なくとも有する抗体を指す。例えば、ヒト化は、マウス抗体などの非ヒト抗体からのＣＤＲをヒト抗体に移植することを含み得る。ヒト化はまた、アミノ酸置換を選択してヒト配列により類似する非ヒト配列を作製することを含み得る。ヒト抗体の重鎖及び軽鎖定常領域の配列情報を含む情報は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースならびに抗体操作及び生成の分野の当業者によく知られている他のデータベースを介して公共に利用可能である。例えば、ＩｇＧ２定常領域は、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースからＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１８５９（参照により本明細書に組み込まれる）として利用可能である。
抗体は、例えば、パパイン及びペプシンなどの酵素によって断片へと切断され得る。パパインは、抗体を切断して２つのＦａｂ断片及び単一のＦｃ断片を生成する。ペプシンは、抗体を切断してＦ（ａｂ’）２断片及びｐＦｃ’断片を生成する。本開示の様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、抗体の抗原結合断片（抗原結合抗体断片、抗原結合断片、抗原結合部分としても知られている）である。様々な例では、抗原結合抗体断片は、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片である。
抗体の構造を利用して、少なくとも約１２～１５０ｋＤａの分子量範囲にわたり、単量体（ｎ＝１）から、二量体（ｎ＝２）、三量体（ｎ＝３）、四量体（ｎ＝４）、及び場合によってより多量体までの範囲の価数（ｎ）を有するますます広い範囲の代替抗体形式が作製されてきた；そのような代替抗体形式は、本明細書では「抗体タンパク質産物」と称される。抗体タンパク質産物には、完全な抗体構造に基づくもの及び完全な抗原結合能を保持する抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨ／ＶＨ（以下で論述される）を模倣するものが含まれる。その完全な抗原結合部位を保持する最も小さな抗原結合断片は、専ら可変（Ｖ）領域からなるＦｖ断片である。分子の安定化のために、可溶性でフレキシブルなアミノ酸ペプチドリンカーが使用されてＶ領域がｓｃＦｖ（一本鎖可変断片）断片に連結され、または定常（Ｃ）ドメインがＶ領域に付加されてＦａｂ断片［断片、抗原結合］が生成される。ｓｃＦｖ及びＦａｂ断片の両方は、宿主細胞、例えば、原核生物宿主細胞内において容易に生成され得る。他の抗体タンパク質産物には、ジスルフィド結合で安定化したｓｃＦｖ（ｄｓ－ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）に加え、オリゴマー化ドメインに連結されたｓｃＦｖからなる異なるフォーマットを含むダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディ、またはミニボディ（ｍｉｎｉＡｂ）のような二量体及び多量体の抗体形式が含まれる。最小の断片は、ラクダ科重鎖ＡｂのＶＨＨ／ＶＨ及びシングルドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）である。新規抗体形式を作成するために最も頻繁に使用される構築ブロックは、約１５アミノ酸残基のペプチドリンカーによって連結された重鎖及び軽鎖（ＶＨ及びＶＬドメイン）からのＶドメインを含む一本鎖可変（Ｖ）ドメイン抗体断片（ｓｃＦｖ）である。ペプチボディまたはペプチド－Ｆｃ融合体は、さらに別の抗体タンパク質産物である。ペプチボディの構造は、Ｆｃドメイン上に移植された生物学的に活性なペプチドからなる。ペプチボディは、当該技術分野でよく記載されている。例えば、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４（５）：５８６－５９１（２０１２）を参照されたい。
他の抗体タンパク質産物には、一本鎖抗体（ＳＣＡ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性抗体または三重特異的抗体などが含まれる。二重特異性抗体は、５つの主要なクラス：ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）断片、二重特異性融合タンパク質、及びＢｓＡｂコンジュゲートに分けられ得る。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２）Ｐａｒｔ Ａ：９７－１０６（２０１５）を参照されたい。
様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、これらの抗体タンパク質産物のいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ ＶＨＨ／ＶＨ、Ｆｖ断片、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、二量体抗体、多量体抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）、ｍｉｎｉＡｂ、ラクダ科重鎖抗体のペプチボディＶＨＨ／ＶＨ、ｓｄＡｂ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重特異性抗体または三重特異性抗体、ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質、及びＢｓＡｂコンジュゲートのうちのいずれか１つを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
様々な例では、本開示の抗原結合タンパク質は、単量体形態、またはポリマー、オリゴマー、もしくは多量体形態の抗体タンパク質産物である。抗体が２つ以上の異なる抗原結合領域断片を含む所定の実施形態では、抗体は、抗体によって認識及び結合される異なるエピトープの数に応じて、二重特異性、三重特異性、もしくは多重特異性、または二価、三価もしくは多価とみなされる。
様々な実施形態では、抗ＣＬＤＮ１８．２抗体またはその抗体バリアントは、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体断片、一本鎖抗体、単量体抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂ断片、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、及びＩｇＧ４抗体からなる群から選択される。
様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、治療剤に連結される。以下に記載されるように、治療剤は、化学療法剤、サイトカイン及び成長因子、細胞傷害剤などを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意のものであり得る。以下の「コンジュゲート」を参照されたい。
二重特異性形式
例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、二重特異性であり、よって、２つの異なる及び区別できる抗原に結合することが可能である。例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質は、二重特異性であり、ＣＬＤＮ１８．２及び第２の抗原に結合する。
例示的な例では、第２の抗原は、Ｔ細胞によって発現した細胞表面タンパク質である。例示的な態様では、細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素、例えば、ＣＤ３である。例示的な例では、第２の抗原は、Ｔ細胞活性化を補助する共刺激分子、例えば、ＣＤ４０または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。例示的な態様では、第２の抗原は、Ｆｃ受容体である。様々な態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃ－アルファ受容体、Ｆｃ－イプシロン受容体である。例示的な態様では、Ｆｃ受容体は、ＣＤ６４（Ｆｃ－ガンマＲＩ）、ＣＤ３２（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＡ）、ＣＤ１６Ａ（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＩＡ）、ＣＤ１６ｂ（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ２３（Ｆｃ－イプシロンＲＩＩ）、ＣＤ８９（Ｆｃ－イプシロンＲＩ）、Ｆｃα／μＲ、またはＦｃＲｎである。例示的な態様では、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６Ａである。例示的な例では、第２の抗原は、免疫チェックポイント分子、例えば、免疫チェックポイント経路に関与するタンパク質である。免疫チェックポイント経路及びそれにおいて機能する分子またはタンパク質は当該技術分野で知られている。例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １２（４）：２５２－２６４（２０１２）を参照されたい。例示的な例では、免疫チェックポイント分子は、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、またはＳＩＧＬＥＣ７である。任意に、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＣＴＬＡ４である。
二重特異性抗原結合タンパク質の５０種を超える形式が当該技術分野で知られており、その一部は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２０（７）：８３８－８４７（２０１５）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ６：１２（２０１７）；Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．；６７（２ Ｐｔ Ａ）：９５－１０６（２０１５）に記載されている。例示的な態様では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、化学的操作、遺伝子操作、またはクアドローマ技術を介して作製される。
例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、抗体の定常ドメインの一部またはすべてを伴って構築される。例示的な態様では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｆｃポリペプチドを含み、Ｆｃ媒介エフェクター機能を保持する。様々な例では、二重特異性抗原結合タンパク質は、例えば、２つのモノクローナル抗体（ｍａｂ）の化学的架橋によって、またはノブ・ホールド技術によって形成された二重特異性モノクローナル抗体である。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、２つのＣＨ３ドメインに異なる変異を導入して非対称抗体をもたらすことによってＨ鎖ヘテロ二量体化が押し進められる「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）」技術を介して作製される。「ノブ」変異が一方のＨＣに生成され、「ホール」変異が他方のＨＣに生成されてヘテロ二量体化が促進される。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、所望の特異性を有するモノクローナル抗体を生成する２つの異なるハイブリドーマ細胞の体細胞融合に基づくクアドローマ技術によって生成される二重特異性抗体である。上記Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ｃｒｏｓｓＭａｂ、オルト－Ｆａｂ ＩｇＧ、ＤＶＤ－Ｉｇ、ツーインワンＩｇＧ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ２－Ｆｃ（上記Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，２０１５）である。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、２つの異なる抗原に対して４価性を有する融合タンパク質をもたらす全長ＩｇＧに新たな抗原結合部位が付加されたＩｇ－ｓｃＦｖ融合体、例えば、ＩｇＧ Ｃ末端ｓｃＦｖ融合体及びＩｇＧ Ｎ末端ｓｃＦｖ融合体である。例示的な例では、二重特異性抗原結合タンパク質は、二重－可変－ドメイン－ＩｇＧ（ＤＶＤ－ＩｇＧ）であり、ある抗原に特異的なＩｇＧのＬＣ及びＨＣ可変領域がリンカーを介して第２の抗原に特異的なＩｇＧのＮ末端ＬＣ及びＨＣ可変領域に融合されてＤＶＤ－ＩｇＧが形成される。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＩｇＧのＦａｂ断片の二重特異性ダイアボディでの置換を含むダイアボディ－Ｆｃ融合体である。
代替的な例では、本開示の二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｆｃポリペプチドを含まない。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、各親モノクローナル抗体の可変ドメインを含み、リンカーは、クローニング及び連結されて一本鎖二重特異性抗体が形成される。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ形式、一本鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、ドックアンドロック（ＤＮＬ）、及びナノボディ（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．２０１５；８：１３０）である。様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、二重特異性Ｆ（ｍａｂ１）２、ｓｃＦｖ、二重特異性ダイアボディ（ＢｓＤｂ）、一本鎖二重特異性ダイアボディ（ｓｃＢｓＤｂ）、一本鎖二重特異性タンデム可変ドメイン（ｓｃＢｓＴａＦｖ）、ドックアンドロック三価Ｆａｂ（ＤＮＬ－（Ｆａｂ）３）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、または二重特異性シングルドメイン抗体（ＢｓｓｄＡｂ）である。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、余剰ペプチドリンカー、例えば、グリシン－セリンリピートモチーフによって連結された２つのｓｃＦｖ断片を含むタンデムｓｃＦｖである。任意に、タンデムｓｃＦｖは、構造：ＶＬＡ－リンカー１－ＶＨＡ－リンカー２－ＶＨＢ－リンカー３－ＶＬＢ（ＶＬ及びＶＨは、一本鎖抗体断片に由来する；Ａ及びＢは、親モノクローナル抗体Ａ及びＢを表す）を含む。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、単一のポリペプチド鎖で接続されたＶＬ及びＶＨドメインの２つの対を含有するＴａｎｄＡｂである（Ｒｅｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１５；７（３）：５８４－６０４）。２つのポリペプチド産物は、発現時に頭部－尾部様式で二量体化し、高分子量（約１０５ｋＤａ）を有するホモ二量体を形成する。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＰＮＡＳ １０８（２７）：１１１８７－９２（２０１１）に記載されているｃｒｏｓｓＭａｂ技術を使用して生成されるものである。ＣｒｏｓｓＭａｂは、任意の化学的リンカーまたは接続体を有さず、二重特異性ヘテロ二量体ＩｇＧ抗体において正確な軽鎖会合を押し進める方法によって生成される。例示的な態様では、ＣｒｏｓｓＭａｂは、二（１＋１）、三（２＋１）及び四（２＋２）価二重特異性ｃｒｏｓｓＭａｂであり、または非Ｆｃタンデム抗原結合断片（Ｆａｂ）ベースのｃｒｏｓｓＭａｂである。例示的な例では、ｃｒｏｓｓＭａｂは、ｃｒｏｓｓＭａｂＦａｂ、ｃｒｏｓｓＭａｂＶＨ－ＶＬ、またはｃｒｏｓｓＭａｂＣＨ１－ＣＬである。
例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、単一の単量体可変抗体ドメインを含む、シングルドメイン抗体、またはナノボディを含む。任意に、可変ドメインは、重鎖可変ドメインに基づく。代替的な態様では、可変ドメインは、軽鎖可変ドメインに基づく。
例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーまたはＢｉＴＥ（登録商標）である。ＢｉＴＥは、フレキシブルペプチドリンカーによって接続されたｓｃＦｖの形態の抗体の可変領域のみを含む二価小分子である。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本開示のＣＬＤＮ１８．２抗体のＬＣ及びＨＣ可変領域ならびに第２の抗原に特異的な第２の抗体のＬＣ及びＨＣ可変領域を含むｓｃＦＶを含む。いくつかの実施形態では、ＢｉＴＥは、ＣＤ３に特異的な第２の抗体のＬＣ及びＨＣ可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３は、ＣＤ３Ｅである。
例示的な例では、二重特異性抗原結合タンパク質は、二重親和性再標的化（ＤＡＲＴ）であり、これはＢｉＴＥ（登録商標）とは異なり、ＤＡＲＴの２つの鎖間の共有結合が抗原結合部位の自由を制限する。そのため、ＤＡＲＴは、構造的にコンパクトであり、標的とエフェクター細胞との間の安定な接触を形成し得る。ＤＡＲＴは、それら自体のＶＨが他方のもののＶＨと交換された２つの操作されたＦｖ断片を含む。相互交換されたＦｖドメインは有利には、短い連結ペプチドによるコンフォメーション的拘束からバリアント断片を開放する。
例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、改変されたＨＳＡに融合した２つのｓｃＦｖを含むＨＳＡＢｏｄｙである。ＨＳＡＢｏｄｙは、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１２；１１（３）：５８２－９３に記載されている。
したがって、例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本開示のＣＬＤＮ１８．２抗体のいずれかの抗原結合断片を含む。例示的な態様では、抗原結合断片は、Ｆａｂである。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本開示のＣＬＤＮ１８．２抗体のいずれかのＦ（ａｂ）２’を含む。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本開示のＣＬＤＮ１８．２抗体のいずれかのＬＣ及びＨＣ可変領域を含むｓｃＦｖを含む。例示的な態様では、ｓｃＦｖは、配列番号５１４または５１５のアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合断片は、重鎖可変領域に基づき、他の態様では、抗原結合断片は、軽鎖可変領域に基づく。例示的な態様では、抗原結合断片は、少なくともＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域の両方の部分を含む。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本開示のＣＬＤＮ１８．２抗体のＬＣまたはＨＣ可変領域の少なくとも１つ、そうでない場合は両方、ならびに第２の抗原に特異的な第２の抗体のＬＣ及びＨＣ可変領域の少なくとも１つ、そうでない場合は両方を含む。例示的な例では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本開示のＣＬＤＮ１８．２抗体のＬＣ及びＨＣ可変領域ならびに第２の抗原に特異的な第２の抗体のＬＣ及びＨＣ可変領域を含むｓｃＦＶを含む。
ＣＬＤＮ１８及びエピトープ
本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する。様々な態様では、ＣＬＤＮ１８．２は、アミノ酸配列：
ＭＡＶＴＡＣＱＧＬＧＦＶＶＳＬＩＧＩＡＧＩＩＡＡＴＣＭＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＬＧＬＰＡＭＬＱＡＶＲＡＬＭＩＶＧＩＶＬＧＡＩＧＬＬＶＳＩＦＡＬＫＣＩＲＩＧＳＭＥＤＳＡＫＡＮＭＴＬＴＳＧＩＭＦＩＶＳＧＬＣＡＩＡＧＶＳＶＦＡＮＭＬＶＴＮＦＷＭＳＴＡＮＭＹＴＧＭＧＧＭＶＱＴＶＱＴＲＹＴＦＧＡＡＬＦＶＧＷＶＡＧＧＬＴＬＩＧＧＶＭＭＣＩＡＣＲＧＬＡＰＥＥＴＮＹＫＡＶＳＹＨＡＳＧＨＳＶＡＹＫＰＧＧＦＫＡＳＴＧＦＧＳＮＴＫＮＫＫＩＹＤＧＧＡＲＴＥＤＥＶＱＳＹＰＳＫＨＤＹＶ（配列番号１）
を有するヒトＣＬＤＮ１８．２アイソフォームである。
様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸配列内のエピトープに結合する。様々な態様では、ＣＬＤＮ１８．２はヒトＣＬＤＮ１８．２であり、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸配列、例えば、配列番号１内のエピトープに結合する。「エピトープ」は、抗原結合タンパク質によって結合されるＣＬＤＮ１８．２の、またはその中の領域を意味する。いくつかの実施形態では、エピトープは、線状エピトープである。「線状エピトープ」は、抗原結合タンパク質によって結合されるＣＬＤＮ１８．２の、またはその中の領域であって、その領域がＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸配列の連続アミノ酸から構成されるものを指す。線状エピトープのアミノ酸は、ＣＬＤＮ１８．２の主要構造において互いに隣接している。したがって、線状エピトープは、抗原、すなわち、ＣＬＤＮ１８．２のアミノ酸配列の断片または一部である。他の様々な実施形態では、エピトープは、コンフォメーションまたは構造エピトープを指す。「コンフォメーションエピトープ」または「構造エピトープ」は、ＣＬＤＮ１８．２がその適正に折り畳まれた状態にある場合にのみ、互いに近接して配置されているアミノ酸から構成されるエピトープを意味する。線状エピトープとは異なり、コンフォメーションまたは構造エピトープのアミノ酸は、ＣＬＤＮ１８．２の主要構造（すなわち、アミノ酸配列）に互いに隣接していない。コンフォメーションまたは構造エピトープは、抗原（ＣＬＤＮ１８．２）のアミノ酸配列の連続アミノ酸から構成されない。
様々な態様では、エピトープは、ＣＬＤＮ１８．２、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内に位置する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１の残基２８～８０のアミノ酸配列を有するＣＬＤＮ１８．２のＥＣＤの細胞外ループ１（ＥＬ１）に結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質が結合するエピトープは、ＣＬＤＮ１８．２のＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＦＹＦＴＬ（配列番号４）、ＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＫ（配列番号５）、ＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣ（配列番号６）またはＣＲＧＹＦＴＬＬＦＬＰＡＭＬＱＡＶＲ（配列番号７）内にある。様々な例では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２のＥＬ１に結合するが、細胞外ループ２（ＥＬ２）に結合しない。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質が結合するエピトープ（複数可）は、配列番号５８の配列を含む軽鎖可変領域及び配列番号５９の配列を含む重鎖可変領域を含むまたは配列番号６０の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号６１によってコードされる重鎖可変配列、または配列番号６２の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号６３によってコードされる重鎖可変配列を含む抗ＣＬＤＮ１８．２抗体によって結合されるエピトープとは異なる。
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２及び非ヒトＣＬＤＮ１８．２に結合する。様々な例では、非ヒトＣＬＤＮ１８．２は、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、またはカエルのＣＬＤＮ１８．２である。様々な例では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２及びマウスＣＬＤＮ１８．２に結合する。
親和性及びアビディティ
本明細書で提供される抗原結合タンパク質は、非共有結合性及び可逆性様式でＣＬＤＮ１８．２に結合する。様々な実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に対する抗原結合タンパク質の結合強度は、抗原結合タンパク質の結合部位とエピトープとの間の相互作用の強度の指標であるその親和性の観点から記載され得る。様々な態様では、本明細書で提供される抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２に対して高親和性を有し、よって、低親和性抗原結合タンパク質よりも短い期間でより多くの量のＣＬＤＮ１８．２に結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、少なくとも１０５ｍｏｌ－１、少なくとも１０６ｍｏｌ－１、少なくとも１０７ｍｏｌ－１、少なくとも１０８ｍｏｌ－１、少なくとも１０９ｍｏｌ－１、または少なくとも１０１０ｍｏｌ－１または少なくとも１０１０ｍｏｌ－１少なくとも１０１０ｍｏｌ－１の平衡会合定数ＫＡを有する。当業者によって理解されるように、ＫＡは、ｐＨ、温度及び緩衝液組成を含む要素によって影響を受け得る。
様々な実施形態では、ＣＬＤＮ１８．２に対する抗原結合タンパク質の結合強度は、その感受性の観点から記載され得る。ＫＤは、抗原結合タンパク質とＣＬＤＮ１８．２との間のｋｏｆｆ／ｋｏｎの比である平衡解離定数である。ＫＤ及びＫＡは逆相関する。ＫＤ値は、抗原結合タンパク質の濃度（特定の実験に必要とされる抗原結合タンパク質の量）に関係し、そのため、ＫＤ値が低いほど（濃度が低いほど）抗原結合タンパク質の親和性が高くなる。様々な態様では、ＣＬＤＮ１８．２に対する抗原結合タンパク質の結合強度は、ＫＤの観点から記載され得る。様々な態様では、本明細書で提供される抗原結合タンパク質のＫＤは、約１０－１、約１０－２、約１０－３、約１０－４、約１０－５、約１０－６またはそれ以下である。様々な態様では、本明細書で提供される抗原結合タンパク質のＫＤは、マイクロモル濃度、ナノモル濃度、ピコモル濃度またはフェムトモル濃度である。様々な態様では、本明細書で提供される抗原結合タンパク質のＫＤは、約１０－４～１０－６または１０－７～１０－９または１０－１０～１０－１２または１０－１３～１０－１５または１０－９～１０－１２または１０－９～１０－１５の範囲内である。様々な態様では、本明細書で提供される抗原結合タンパク質のＫＤは、約１．０×１０－１２Ｍ～約１．０×１０－８Ｍの範囲内である。様々な態様では、抗原結合タンパク質のＫＤは、約１．０×１０－１１Ｍ～約１．０×１０－９Ｍの範囲内である。
様々な態様では、抗原結合タンパク質の親和性は、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）ベースのアッセイを使用して測定またはランク付けされる。フローサイトメトリーベースの結合アッセイは、当該技術分野で知られている。例えば、Ｃｅｄｅｎｏ－Ａｒｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｐｈａｒｍ ７９（３）：５６９－５８１（２０１１）；Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３７３：５２－６０（２００８）；及びＧｅｕｉｊｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３０２（１－２）：６８－７７（２００５）を参照されたい。様々な態様では、抗原結合タンパク質の親和性は、Ｔｒｉｋｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１０：３２６－３３５（２００４）及びＴａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８（１１）：１０８５－１０９１（１９９８）ならびに以下に記載される競合アッセイを使用して測定またはランク付けされ得る。以下の「競合アッセイ」というタイトルのセクションを参照されたい。Ｔｒｉｋｈ ｅｔ ａｌ．では、抗原を発現する細胞がラジオアッセイで使用された。細胞表面抗原に対する１２５Ｉ標識抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の結合は、浮遊した細胞を用いて測定される。様々な態様では、ＣＬＤＮ１８．２抗体の相対親和性は、異なる濃度の、蛍光体がコンジュゲートされたＣＬＤＮ１８．２抗体をＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞と共にインキュベーションし、放出された蛍光（抗体－抗原結合の直接的指標である）を決定するＦＡＣＳベースのアッセイを介して決定される。各用量または濃度についての蛍光をプロットした曲線が作成される。最大値は、結合飽和が生じるときである、蛍光がプラトーに達するまたは最高に達する最低濃度である。最大値の半分はＥＣ５０またはＩＣ５０とみなされ、最低ＥＣ５０／ＩＣ５０を有する抗体は、同一方法で試験した他の抗体と比べて最も高い親和性を有するとみなされる。そのようなアッセイは、実施例５に記載されている。
様々な態様では、ＩＣ５０値は、競合結合阻害アッセイで決定される場合、抗原結合タンパク質のＫＤに近似する。様々な例では、以下に論述されるように、競合アッセイは、参照抗体、蛍光体がコンジュゲートされた二次抗体、及びＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を用いて行われるＦＡＣＳベースのアッセイである。様々な態様では、細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように遺伝子操作される。いくつかの態様では、細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を発現するようにウイルスベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。代替的な態様では、細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する。ＦＡＣＳベースのアッセイが行われる前に、いくつかの態様では、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞は、低いＣＬＤＮ１８．２発現細胞または高いＣＬＤＮ１８．２発現細胞として事前決定される。いくつかの態様では、細胞は、がんまたは腫瘍細胞である。様々な態様では、細胞は、細胞株、例えば、卵巣細胞株、子宮内膜細胞株、膀胱細胞株、肺細胞株、胃腸（ＧＩ）細胞株、肝臓細胞株、肺細胞株などからの細胞である。様々な態様では、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞は、ＨＵＰＴ４膵臓細胞、ＵＭＵＣ－４膀胱細胞、ＭＫＮ７、ＫＡＴＯ ＩＩＩ、ＳＮＵ６０１、ＮＵＧＣ４、ＮＵＧＣ３、ＳＮＵ６２０ ＳＮＵ５２０及びＯＥ１９上部ＧＩ細胞からなる群から選択される。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、細胞によって発現したヒトＣＬＤＮ１８．２と参照抗体との間の結合相互作用を阻害し、参照抗体は、ＣＬＤＮ１８．２に結合することが知られているが、本開示の抗原結合タンパク質ではない。様々な例では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に対する結合について参照抗体と競合し、それによりｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイによって決定される場合に参照抗体に結合したヒトＣＬＤＮ１８．２の量を減少させる。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２と参照抗体との間の結合相互作用を阻害し、阻害は、ＩＣ５０によって特性化される。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２と参照抗体との間の結合相互作用を阻害するための約２５００ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、約２０００ｎＭ未満、約１５００ｎＭ未満、約１０００ｎＭ未満、約９００ｎｍ未満、約８００ｎｍ未満、約７００ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または約１００ｎｍ未満のＩＣ５０を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。様々な例では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２に対する結合についてＣＬＤＮ１８．２に結合することが知られている参照抗体に対して競合する（参照抗体は、本開示の抗原結合タンパク質のいずれとも異なる）。競合アッセイ下のさらなる説明を参照されたい。
アビディティは、抗体－抗原複合体の全体的強度の指標を提供する。それは、３つの主要なパラメータ：抗原結合タンパク質のエピトープへの親和性、抗原結合タンパク質とＣＬＤＮ１８．２の両方の価数、ならびに相互作用する部分の構造的配置に依存する。抗原結合タンパク質の価数（抗原結合部位の数）が多いほど、それが結合し得る抗原（ＣＬＤＮ１８．２）の量が増加する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２に対して強力なアビディティを有する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、多価である。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、二価である。様々な例では、抗原抗原結合タンパク質は、一価である。
交差反応性
様々な実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２に結合し、ＣＬＤＮファミリーの他のいずれのメンバーにも結合せず、例えば、ＣＬＤＮファミリーの他のメンバーのいずれとも交差反応しない。様々な例では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２特異的である。様々な実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．１、または別のＣＬＤＮタンパク質に対する抗原結合タンパク質の選択性よりも少なくとも１０倍、５倍、４倍、３倍、２倍高いＣＬＤＮ１８．２に対する選択性を有する。様々な実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．１、または任意の他のＣＬＤＮタンパク質の各々に対する抗原結合タンパク質の選択性よりも少なくとも１０倍、５倍、４倍、３倍、２倍高いＣＬＤＮ１８．２に対する選択性を有する。選択性は、ＣＬＤＮ１８．２、またはＣＬＤＮファミリーメンバーに対して抗原結合タンパク質によって示されるＫＤをベースとし得、ＫＤは、当該技術分野で知られている技術、例えば、表面プラズモン共鳴、ＦＡＣＳベースの親和性アッセイによって決定され得る。
競合アッセイ
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２と参照抗体との間の結合相互作用を阻害し、参照抗体は、ＣＬＤＮ１８．２に結合することが知られているが、本開示の抗原結合タンパク質ではない。様々な例では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に対する結合について参照抗体と競合し、それによりｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイによって決定される場合に参照抗体に結合したヒトＣＬＤＮ１８．２の量を減少させる。様々な実施形態では、参照抗体は、ヒトＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメインのアミノ酸配列内の、任意に、ＥＬ２またはＥＬ１内のエピトープに結合する。様々な態様では、参照抗体は、配列番号５８によってコードされる軽鎖可変配列、及び配列番号５９によってコードされる重鎖可変配列を含み、または配列番号６０の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号６１によってコードされる重鎖可変配列、または配列番号６２の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号６３によってコードされる重鎖可変配列を含む。様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２と参照抗体との間の結合相互作用を阻害し、阻害は、ＩＣ５０によって特性化される。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２と参照抗体との間の結合相互作用を阻害するための約２５００ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、約２０００ｎＭ未満、約１５００ｎＭ未満、約１０００ｎＭ未満、約９００ｎｍ未満、約８００ｎｍ未満、約７００ｎｍ未満、約６００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または約１００ｎｍ未満のＩＣ５０を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、約９０ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。
様々な例では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２に対する結合について参照抗体と競合し、それによりｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイによって決定される場合に参照抗体に結合したヒトＣＬＤＮ１８．２の量を減少させる。様々な態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ競合結合アッセイは、参照抗体のＦｃに結合する蛍光体がコンジュゲートされた二次抗体の蛍光が、特定の量の本開示の抗原結合タンパク質の非存在または存在下で測定されるＦＡＣＳベースのアッセイである。そのようなＦＡＣＳベースのアッセイは、実施例に記載されている。様々な態様では、ＦＡＣＳベースのアッセイは、参照抗体、蛍光体がコンジュゲートされた二次抗体及びＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を用いて行われる。様々な態様では、細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように遺伝子操作される。いくつかの態様では、細胞は、ＣＬＤＮ１８．２を発現するようにウイルスベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。代替的な態様では、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する。ＦＡＣＳベースのアッセイが行われる前に、いくつかの態様では、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞は、低いＣＬＤＮ１８．２発現細胞または高いＣＬＤＮ１８．２発現細胞として事前決定される。いくつかの態様では、細胞は、がんまたは腫瘍細胞である。様々な態様では、細胞は、細胞株、例えば、卵巣細胞株、子宮内膜細胞株、膀胱細胞株、肺細胞株、胃腸（ＧＩ）細胞株、肝臓細胞株、肺細胞株などからの細胞である。様々な態様では、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞は、ＨＵＰＴ４膵臓細胞、ＵＭＵＣ－４膀胱細胞、ＭＫＮ７、ＫＡＴＯ ＩＩＩ、ＳＮＵ６０１、ＮＵＧＣ４、ＮＵＧＣ３、ＳＮＵ６２０ ＳＮＵ５２０及びＯＥ１９上部ＧＩ細胞からなる群から選択される。様々な例では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞の１つ以上によって内因的に発現したＣＬＤＮ１８．２と高い親和性で結合する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載のＨＵＰＴ４、ＵＭＵＣ－４、ＭＫＮ７、ＫＡＴＯ ＩＩＩ、ＳＮＵ６０１、ＮＵＧＣ４、ＮＵＧＣ３、ＳＮＵ６２０ ＳＮＵ５２０及びＯＥ１９細胞のうちの１つ以上を使用してＦＡＣＳベースの競合結合阻害アッセイで決定した場合に約３０００ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＨＵＰＴ４、ＵＭＵＣ－４、ＭＫＮ７、ＫＡＴＯ ＩＩＩ、ＳＮＵ６０１、ＮＵＧＣ４、ＮＵＧＣ３、ＳＮＵ６２０ ＳＮＵ５２０及びＯＥ１９細胞のうちの１つ以上を使用してＦＡＣＳベースの競合結合阻害アッセイで決定した場合、約２５００ｎＭ未満、約２０００ｎＭ未満、約１７５０ｎＭ未満、約１５００ｎＭ未満、約１２５０ｎＭ未満、約１０００ｎＭ未満、約７５０ｎＭ未満、または約５００ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＨＵＰＴ４、ＵＭＵＣ－４、ＭＫＮ７、ＫＡＴＯ ＩＩＩ、ＳＮＵ６０１、ＮＵＧＣ４、ＮＵＧＣ３、ＳＮＵ６２０ ＳＮＵ５２０及びＯＥ１９細胞のうちの１つ以上を使用してＦＡＣＳベースの競合結合阻害アッセイで決定した場合、約４００ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、または約１０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。
他の結合アッセイ、例えば、抗原に対する、またはそのエピトープに対する結合について第２の抗体と競合する抗体の能力を試験する競合結合アッセイまたは競合アッセイが当該技術分野で知られている。例えば、Ｔｒｉｋｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１０：３２６－３３５（２００４）；Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８（１１）：１０８５－１０９１（１９９８）．米国特許出願公開番号ＵＳ２０１４０１７８９０５、Ｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４６：１６８－１７１（２０１７）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５２５：８９－９１（２０１７）；及びＧｏｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２９（２）：２５０－２５３（２０１７）を参照されたい。また、２つの抗体を比較する他の方法が当該技術分野で知られており、これには、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が含まれる。ＳＰＲは、抗体及び第２の抗体の結合定数を決定するために使用され得、２つの結合定数が比較され得る。
抗体生成方法及び関連方法
抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗原結合抗体断片、及び抗体タンパク質産物）を作製する好適な方法は、当該技術分野で知られている。例えば、抗体を生成するための標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、及びＣＡ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１））に記載されている。本開示のＣＬＤＮ１８．２モノクローナル抗体を調製する様々な方法は、実施例において本明細書で提供される。
宿主種に応じて、免疫反応を増加させ、宿主によるより多い抗体生成をもたらすために様々なアジュバントが使用され得る。そのようなアジュバントには、フロイントアジュバント、鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、ならびに界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノールが含まれるがこれらに限定されない。ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍは、潜在的に有用なヒトアジュバントである。
抗体生成の他の方法が表１にまとめられている。
Figure 2022541435000001
どのように抗体が生成されるかに関係なく抗体がＣＬＤＮ１８．２のエピトープに結合する能力について試験する方法は、当該技術分野で知られており、これには、任意の抗体－抗原結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、ＳＰＲ、及び競合阻害アッセイ（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，ｉｎｆｒａ、及び米国特許出願公開番号２００２／０１９７２６６、及び競合アッセイに関する上記セクションを参照されたい）が含まれる。
配列／構造
本明細書では、（ａ）表Ａに示される重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列または配列番号６４、８８、６９、８９、７２、７５、９１、９４、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０６、１０９からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｂ）表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号６５、６７、７０、９０、７３、７６、９２、７３、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０７、１１０からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｃ）表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号６６、６８、７１、７７、７４、７７、９３、７４、１０５、１０８、１１１からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｄ）表Ａに示される軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列または配列番号７８、８１、８２、８６、１１４、１２０、１２３、１２６からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｅ）表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号７９、１１２、７９、８４、１１６、１１８、１１９、１２９、１２１、１２４、１２７からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｆ）表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号８０、８３、１１３、８５、８７、１１５、１１７、１２２、１２５、１２８からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｇ）（ａ）～（ｆ）の任意の２つ以上の組み合わせを含む抗原結合タンパク質が提供される。
Figure 2022541435000002
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも１または２つを含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも１または２つを含む。
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａの単一の行における配列番号によって指定されるアミノ酸配列のうちの少なくとも３、４、または５つを含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａの単一の行の配列番号によって指定されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列の各々及び表Ａの単一の行における配列番号によって指定されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも１または２つを含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａの単一の行の配列番号によって指定されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列の各々及び表Ａの単一の行の配列番号によって指定されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも１または２つを含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａの単一の行の配列番号によって指定されるＣＤＲアミノ酸配列の６つすべてを含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号７８、７９、８０、６４、６５、６６；（ｂ）配列番号８１、１１２、８０、８８、６５、６６；（ｃ）配列番号８１、７９、８０、６４、６７、６８；（ｄ）配列番号８２、７９、８３、３９、７０、７１；（ｅ）配列番号８１、７９、１１３、８９、９０、７７；（ｆ）配列番号８１、８４、８５、７２、７３、７４；（ｇ）配列番号８６、７９、８７、７５、７６、７７；（ｈ）配列番号１１４、７９、１１５、９１、９２、９３；（ｉ）配列番号８１、１１６、１１７、９４、７３、７４；（ｊ）配列番号８１、１１８、１１７、９５、９６、７４；（ｋ）配列番号８１、１１９、１１７、９７、９８、７４；（ｌ）配列番号８１、１１８、８５、９９、１００、７４；（ｍ）配列番号８１、１２９、１１７、１０１、１０２、７４；（ｎ）配列番号１２０、１２１、１２２、１０３、１０４、１０５；（ｏ）配列番号１２３、１２４、１２５、１０６、１０７、１０８；及び（ｐ）配列番号１２６、１２７、１２８、１０９、１１０、１１１からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む。
また、表Ａにおいて特定された任意のＨＣＤＲまたはＬＣＤＲアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸変化（例えば、置換、挿入または欠失）を含有するアミノ酸配列を含む本明細書に開示されるＨＣＤＲ及び／またはＬＣＤＲ配列が企図される。好ましい置換には、表Ａの別のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２またはＬＣＤＲ３内の対応する位置におけるアミノ酸に対する置換が含まれる。代替的には、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３及び／またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２またはＬＣＤＲ３配列は、本明細書に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２またはＬＣＤＲ３のコンセンサスアミノ酸配列を含み得る。
様々な例では、表Ａのアミノ酸配列は、少なくとも１つまたはそれ以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の介在アミノ酸（複数可）によって分離されている。様々な例では、ＬＣ ＣＤＲ１及びＬＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１０～約２０アミノ酸及びＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３の配列の間に約２５～約４０アミノ酸が存在する。様々な例では、ＬＣ ＣＤＲ１及びＬＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１４～約１６アミノ酸及びＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３の配列の間に約３０～約３５アミノ酸が存在する。様々な例では、ＨＣ ＣＤＲ１及びＨＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１０～約２０アミノ酸及びＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３の配列の間に約２５～約４０アミノ酸が存在する。様々な例では、ＨＣ ＣＤＲ１及びＨＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１４～約１６アミノ酸及びＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３の配列の間に約３０～約３５アミノ酸が存在する。
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ｂに示される重鎖可変領域アミノ酸配列または配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、２、３４、３６、３８及び４０からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｂ）表Ｂに示される軽鎖可変領域アミノ酸配列または配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含む。
Figure 2022541435000003
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号１０及び１１；（ｂ）配列番号１２及び１３；（ｃ）配列番号１４及び１５；（ｄ）配列番号１６及び１７；（ｅ）配列番号１８及び１９；（ｆ）配列番号２０及び２１；（ｇ）配列番号２２及び２３；（ｈ）配列番号２４及び２５；（ｉ）配列番号２６及び２７；（ｊ）配列番号２８及び２９；（ｋ）配列番号３０及び３１；（ｌ）配列番号３２及び３３；（ｍ）配列番号３４及び３５；（ｎ）配列番号３６及び３７；（ｏ）配列番号３８及び３９；（ｐ）配列番号４０及び４１からなる群から選択されるアミノ酸配列の対を含む。
また、表Ｂにおいて特定された任意のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸変化（例えば、置換、挿入または欠失）を含有するアミノ酸配列を含む本明細書に開示されるＶＨ及び／またはＶＬ配列が企図される。好ましい置換には、表Ｂの別のＶＨまたはＶＬ内の対応する位置におけるアミノ酸に対する置換が含まれる。代替的には、ＶＨまたはＶＬ配列は、本明細書に記載のＶＨまたはＶＬのコンセンサスアミノ酸配列を含み得る。例えば、ＣＤＲまたはＶＨもしくはＶＬは、図１３に示される親配列とは異なるものとして特定されたアミノ酸配列で置換され得る。ヒト化配列におけるアミノ酸置換が強調されている。本明細書では、本明細書に記載のヒト化ＶＨまたはＶＬ配列のコンセンサス配列が企図される。
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号５８及び５９の配列によってコードされるアミノ酸配列の対を含まない。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号６０及び６１のアミノ酸配列の対を含まない。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号６２及び６３のアミノ酸配列の対を含まない。
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、上記のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を含むが、抗原結合タンパク質は、その生物学的機能、例えば、ヒトＣＬＤＮ１８．２に結合し、腫瘍成長を減少させ、がんを処置するその能力を実質的に保持する。
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、上記アミノ酸配列（複数可）に対して、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のアミノ酸のみ異なるアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、上記配列のバリアント配列を含み、そのバリアント配列は、上記配列に対して、１または２つのアミノ酸のみ異なる。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＤＲの外で生じる１つ以上のアミノ酸置換を含み、例えば、１つ以上のアミノ酸置換が重鎖または軽鎖のフレームワーク領域（複数可）内で生じる。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換を含むが、抗原結合タンパク質は、６つのＣＤＲのアミノ酸配列を保持する。様々な態様では、上記アミノ酸配列（複数可）に対して、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の保存的アミノ酸置換のみを有するアミノ酸配列を含む。本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸の、類似する特性、例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／または芳香族性を有する別のアミノ酸での置換を指し、これには以下の５つの群のうちの１つの中の交換が含まれる：
Ｉ．小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負に荷電した残基ならびにそれらのアミド及びエステル：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸及びホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性の正に荷電した残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大型脂肪族非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大型芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン
様々な態様では、保存的アミノ酸置換は、以下のアミノ酸の群のうちの１つの中での交換である：
Figure 2022541435000004
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、上記アミノ酸配列と３０％超もしくは約３０％、５０％超もしくは約５０％、または７０％超もしくは約７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、上記アミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または９０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、上記アミノ酸配列の全長に沿って少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または９０％超の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、上記アミノ酸配列の全長に沿って少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、上記配列のバリアント配列を含み、バリアント配列は、上記配列に対して、少なくともまたは約７０％の配列同一性を有する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、上記配列のバリアント配列を含み、バリアント配列は、上記配列に対して、少なくともまたは約８０％の配列同一性を有する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、上記配列のバリアント配列を含み、バリアント配列は、上記配列に対して、少なくともまたは約９０％の配列同一性を有する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、上記配列のバリアント配列を含み、バリアント配列は、上記配列に対して、少なくともまたは約９５％の配列同一性を有する。
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、表Ａの単一の行における配列番号のうちの１、２、３、４、または５つの配列及び配列番号６４～１２９のいずれかと少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する少なくとも１つのバリアント配列を含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号７８、７９、８０、６４、６５、６６；（ｂ）配列番号８１、１１２、８０、８８、６５、６６；（ｃ）配列番号８１、７９、８０、６４、６７、６８；（ｄ）配列番号８２、７９、８３、３９、７０、７１；（ｅ）配列番号８１、７９、１１３、８９、９０、７７；（ｆ）配列番号８１、８４、８５、７２、７３、７４；（ｇ）配列番号８６、７９、８７、７５、７６、７７；（ｈ）配列番号１１４、７９、１１５、９１、９２、９３；（ｉ）配列番号８１、１１６、１１７、９４、７３、７４；（ｊ）配列番号８１、１１８、１１７、９５、９６、７４；（ｋ）配列番号８１、１１９、１１７、９７、９８、７４；（ｌ）配列番号８１、１１８、８５、９９、１００、７４；（ｍ）配列番号８１、１２９、１１７、１０１、１０２、７４；（ｎ）配列番号１２０、１２１、１２２、１０３、１０４、１０５；（ｏ）配列番号１２３、１２４、１２５、１０６、１０７、１０８；及び（ｐ）配列番号１２６、１２７、１２８、１０９、１１０、１１１から選択される配列のセットのうちの１、２、３、４、または５つの配列を含み、抗原結合タンパク質は、そのセット配列の配列のうちの少なくとも１つと少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する少なくとも１つのバリアント配列をさらに含む。
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０～４１のいずれかと少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するバリアント配列の対を含む。様々な例では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号１０及び１１；（ｂ）配列番号１２及び１３；（ｃ）配列番号１４及び１５；（ｄ）配列番号１６及び１７；（ｅ）配列番号１８及び１９；（ｆ）配列番号２０及び２１；（ｇ）配列番号２２及び２３；（ｈ）配列番号２４及び２５；（ｉ）配列番号２６及び２７；（ｊ）配列番号２８及び２９；（ｋ）配列番号３０及び３１；（ｌ）配列番号３２及び３３；（ｍ）配列番号３４及び３５；（ｎ）配列番号３６及び３７；（ｏ）配列番号３８及び３９；ならびに（ｐ）配列番号４０及び４１と少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するバリアント配列の対を含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列の対：表Ｂのうちの１つの配列及び配列番号１０～４１のいずれかと少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するバリアント配列である別の配列を含む。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列の対：（ａ）配列番号１０及び１１；（ｂ）配列番号１２及び１３；（ｃ）配列番号１４及び１５；（ｄ）配列番号１６及び１７；（ｅ）配列番号１８及び１９；（ｆ）配列番号２０及び２１；（ｇ）配列番号２２及び２３；（ｈ）配列番号２４及び２５；（ｉ）配列番号２６及び２７；（ｊ）配列番号２８及び２９；（ｋ）配列番号３０及び３１；（ｌ）配列番号３２及び３３；（ｍ）配列番号３４及び３５；（ｎ）配列番号３６及び３７；（ｏ）配列番号３８及び３９；（ｐ）配列番号４０及び４１から選択される１つの配列、ならびに（ａ）～（ｐ）の配列と少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するバリアント配列である別の配列を含む。例えば、様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号１０の配列を含み、抗原結合タンパク質は、配列番号１１と少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するバリアント配列をさらに含む。
様々な例では、抗原結合タンパク質は、不要な側鎖反応を減少または防止するために反応性アミノ酸を減少または排除するための１つ以上のアミノ酸置換を有する上記アミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。例えば、抗原結合タンパク質は、１つ以上の（ｉ）Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、またはＰｈｅで置換されたＴｒｐ残基；（ｉｉ）Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＡｓｐで置換されたＡｓｎ残基；（ｉｉｉ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕで置換されたＰｒｏ残基の直前に存在するＡｓｐ残基、（ｉｖ）Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、またはＡｌａで置換されたＡｓｎ残基；及び／または（ｖ）Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌａで置換されたＣｙｓ残基を有する上記アミノ酸配列のアミノ酸配列含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、ＳＨＭ事象に基づいてまたは多数の他の同様の抗体配列の統計的分析に基づいて、より高い結合親和性、より高い安定性、または他の陽性属性を有することが予測されるアミノ酸置換を有する上記アミノ酸配列のアミノ酸配列を含む。
ヒト化抗体
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表Ａまたは表Ｂに記載の抗原結合タンパク質のヒト化バージョンである。
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、図１３に示される位置で重鎖または軽鎖可変領域において１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５）のアミノ酸置換を有する表Ｂに示される抗体のヒト化バージョン、またはそのコンセンサス配列である。
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ｃに示される重鎖可変領域アミノ酸配列または４２、４６、４９、５２、５５、５６、５７、及び１３１からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｂ）表Ｃに示される軽鎖可変領域アミノ酸配列または４３～４５、４７～４８、５０～５１、５３～５４、１４９、及び１５０からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、または約９５％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含む。
Figure 2022541435000005
様々な実施形態では、ヒト化抗原結合タンパク質は、表Ｄに示されるアミノ酸配列の対を含む。
Figure 2022541435000006
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、バリアント配列の対を含み、各々は、表Ｃに列挙される配列番号と少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有する。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列の対：表Ｃに列挙される配列番号から選択される１つの配列及び表Ｄに列挙される配列番号を有する配列表Ｃに列挙される配列番号を有する配列と少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するバリアント配列である別の配列を含む。
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列の対：表Ｄに列挙される配列番号から選択される１つの配列、及び表Ｄに列挙される配列番号を有する配列と少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するバリアント配列である別の配列を含む。例えば、様々な態様では、抗原結合タンパク質は、配列番号４２の配列を含み、抗原結合タンパク質は、配列番号４３と少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するバリアント配列をさらに含む。
非フコシル化抗体
多くの分泌タンパク質は、糖部位（例えば、グリカン、サッカライド）がタンパク質の特定のアミノ酸に共有結合されるプロセスである翻訳後グリコシル化を受ける。真核細胞では、２つのタイプのグリコシル化反応が生じる：（１）グリカンが認識配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ（「Ｘ」はプロリン以外の任意のアミノ酸である）のアスパラギンに結合されるＮ－連結グリコシル化、及び（２）グリカンがセリンまたはトレオニンに結合されるＯ－連結グリコシル化。グリコシル化タイプ（Ｎ－連結またはＯ－連結）にかかわらず、タンパク質グリコフォームの微小不均一性が、各部位（ＯまたはＮ）に関連するグリカン構造の範囲が広いため生じる。
すべてのＮ－グリカンは、共通のコア糖配列：Ｍａｎα１－６（Ｍａｎα１－３）Ｍａｎβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－４ＧｌｃＮＡｃβ１－Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２Ａｓｎ）を有し、３つのタイプ：（Ａ）２つのＮ－アセチルグルコサミン（ＧａｌＮＡｃ）部位及び多数（例えば、５、６、７、８または９）のマンノース（Ｍａｎ）残基からなる、高マンノース（ＨＭ）またはオリゴマンノース（ＯＭ）タイプ、（Ｂ）２つを超えるＧｌｃＮＡｃ部位及びあらゆる数の他の糖タイプを含む複合タイプ、または（Ｃ）分岐の一方の鎖にＭａｎ残基及び複合分岐の基部にＧｌｃＮＡｃを含むハイブリッドタイプ、のうちの１つに分類される。図１Ａ（Ｓｔａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ８：Ｎ－Ｇｌｙｃａｎｓ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２００９から取得）は、Ｎ－グリカンの３つのタイプを示している。
Ｎ－連結グリカンは典型的には、ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトサミン（ＧａｌＮ）、グルコース（ＧＬｃ）、Ｎ－アセチルグルアコサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏａｓａｍｉｎｅ）（ＣｌｃＮＡｃ）、グルコアサミン（ｇｌｕｃｏａｓａｍｉｎｅ）（ＧｌｃＮ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ－アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）、マンノサミン（ＭａｎＮ）、キシロース（Ｘｙｌ）、Ｎ０アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）、Ｎ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）、２－ケト－３－ドキシノノン酸（ｄｏｘｙｎｏｎｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｋｄｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、グルクロン酸（ＧＬｃＡ）、イズロン酸（ＩｄｏＡ）、ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）、マンヌロン酸（ＭａｎＡ）のうちの１つ以上の単糖を含む。そのようなサッカライドのために一般的に使用されている記号が図２９Ａに示されている。
Ｎ－連結グリコシル化は、小胞体（ＥＲ）において開始し、ここで複雑な一連の反応が、２つのＧｌｃＮＡｃ残基及び３つのＭａｎ残基から本質的に構成されるコアグリカン構造の結合をもたらす。ＥＲにおいて形成されたグリカン複合体は、ゴルジ装置において酵素の作用によって改変される。サッカライドが酵素に比較的アクセスしにくい場合、それは典型的には元のＨＭ形態で留まる。酵素がサッカライドにアクセスできる場合、次いでＭａｎ残基の多くは切断され、サッカライドはさらに改変され、複合タイプのＮ－グリカン構造をもたらす。例えば、シス－ゴルジに位置するマンノシダーゼ－１は、ＨＭグリカンを切断または加水分解し得、一方でメディアル－ゴルジに位置するフコシルトランスフェラーゼＦＵＴ－８はグリカンをフコシル化する（Ｈａｎｒｕｅ Ｉｍａｉ－ Ｎｉｓｈｉｙａ（２００７），ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７：８４）。
したがって、グリカン構造の糖組成及び構造立体配置は、とりわけ、ＥＲ及びゴルジ装置におけるグリコシル化機序、その機序の酵素のグリカン構造へのアクセス性、各酵素の作用の順序及びタンパク質がグリコシル化機序から放出される段階に依存して変動する。
本開示の例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ｆｃポリペプチドを含む。用語「Ｆｃポリペプチド」には、本明細書で使用される場合、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドのネイティブ及び変異タンパク質形態が含まれる。例示的な態様では、本開示の抗原結合タンパク質のＦｃポリペプチドは、グリカンを含む。様々な例では、グリカンは、フコースを欠き、または非フコシル化されている。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、非フコシル化グリカンを含む。本明細書で使用される場合、用語「非フコシル化グリカン」または「非フコグリカン」または「非フコシル化グリコフォーム」または「非フコ」は、コアフコース、例えば、Ｎ－グリコシル化部位のＡｓｎとともにアミド結合に関与するＧｌｃＮＡｃ残基上のα１，６－結合型フコースを欠くグリコフォームを指す。非フコシル化グリコフォームには、Ａ１Ｇ０、Ａ２Ｇ０、Ａ２Ｇ１ａ、Ａ２Ｇ１ｂ、Ａ２Ｇ２、及びＡ１Ｇ１Ｍ５が含まれるがこれらに限定されない。さらなる非フコシル化グリカンには、例えば、Ａ１Ｇ１ａ、Ｇ０［Ｈ３Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ４Ｎ４］、Ｇ０［Ｈ５Ｎ４］、ＦＯ－Ｎ［Ｈ３Ｎ３］が含まれる。例えば、Ｒｅｕｓｃｈ ａｎｄ Ｔｅｊａｄａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２５（１２）：１３２５－１３３４（２０１５）を参照されたい。
本開示はまた、非フコシル化グリカンを含むＦｃポリペプチドを含む抗原結合タンパク質を含む組成物、例えば、薬学的組成物を提供する。例示的な態様では、組成物に存在する抗原結合タンパク質の少なくともまたは約２５％は、非フコシル化グリカンを含むＦｃポリペプチドを含む抗原結合タンパク質である。例示的な態様では、組成物に存在する抗原結合タンパク質の少なくともまたは約２５％は、非フコシル化されている。任意に、組成物に存在する抗原結合タンパク質の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは９０％またはそれ以上は、非フコシル化されている。特定の糖プロファイルの抗原結合タンパク質を含む組成物を生成する方法は、当該技術分野で知られている。例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質は、デノボ経路またはサルベージ経路の酵素の活性を変化させるように遺伝子改変された細胞において組換え生成される。これらのフコース代謝の２つの経路は図２９Ｂに示されている。例示的な実施形態では、細胞は、フコシル－トランスフェラーゼ（ＦＵＴ、例えば、ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９）、フコースキナーゼ、ＧＤＰ－フコースピロホスホリラーゼ、ＧＤＰ－Ｄ－マンノース－４，６－デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、及びＧＤＰ－ケト－６－デオキシマンノース－３，５－エピメラーゼ、４－レダクターゼ（ＦＸ）のうちの任意の１つ以上の活性を変化させるように遺伝子改変される。例示的な実施形態では、細胞は、ＦＸをコードする遺伝子をノックアウトするように遺伝子改変される。例えば、国際特許公開番号ＷＯ２０１７／０７９１６５Ａ１；Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １３０，２００７，３００－３１０，Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｕｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７，２００４，６１４－６２２，Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０６，２０１０，７７４－７８３を参照されたい。
核酸
本開示はさらに、本開示の抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。「核酸」は、本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、通常は、ＤＮＡもしくはＲＮＡのポリマー、またはその改変形態であって、一本鎖または二本鎖であり得、天然源から合成または取得（例えば、単離及び／または精製）され得、天然、非天然または変化したヌクレオチドを含有し得、未改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりに、天然、非天然または変化したヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロアミデート結合またはホスホロチオエート結合を含有し得る、ＤＮＡもしくはＲＮＡのポリマー、またはその改変形態を意味する。核酸は、本開示の抗原結合タンパク質のいずれかをコードする任意のヌクレオチド配列を含み得る。様々な態様では、核酸は、（ａ）表Ａに示される重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列または 配列番号６４、８８、６９、８９、７２、７５、９１、９４、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０６、１０９からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｂ）表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列または 配列番号６５、６７、７０、９０、７３、７６、９２、７３、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０７、１１０からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｃ）表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列または 配列番号６６、６８、７１、７７、７４、７７、９３、７４、１０５、１０８、１１１からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｄ）表Ａに示される軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列または配列番号７８、８１、８２、８６、１１４、１２０、１２３、１２６からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｅ）表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号７９、１１２、７９、８４、１１６、１１８、１１９、１２９、１２１、１２４、１２７からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｆ）表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号８０、８３、１１３、８５、８７、１１５、１１７、１２２、１２５、１２８からなる群から選択される配列または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｇ）（ａ）～（ｆ）の任意の２つ以上の組み合わせを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様では、核酸は、表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも１または２つを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様では、核酸は、表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも１または２つを含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、核酸は、（ａ）表Ａの単一の行における配列番号によって指定されるアミノ酸配列のうちの少なくとも３、４、または５つ、（ｂ）表Ａの単一の行の配列番号によって指定されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列の各々及び表Ａの単一の行における配列番号によって指定されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも１または２つ、（ｃ）表Ａの単一の行の配列番号によって指定されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列の各々及び表Ａの単一の行の配列番号によって指定されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のうちの少なくとも１または２つ、（ｄ）表Ａの単一の行の配列番号によって指定されるＣＤＲアミノ酸配列の６つすべて、及び／または（ｅ）（ａ）配列番号７８、７９、８０、６４、６５、６６；（ｂ）配列番号８１、１１２、８０、８８、６５、６６；（ｃ）配列番号８１、７９、８０、６４、６７、６８；（ｄ）配列番号８２、７９、８３、３９、７０、７１；（ｅ）配列番号８１、７９、１１３、８９、９０、７７；（ｆ）配列番号８１、８４、８５、７２、７３、７４；（ｇ）配列番号８６、７９、８７、７５、７６、７７；（ｈ）配列番号１１４、７９、１１５、９１、９２、９３；（ｉ）配列番号８１、１１６、１１７、９４、７３、７４；（ｊ）配列番号８１、１１８、１１７、９５、９６、７４；（ｋ）配列番号８１、１１９、１１７、９７、９８、７４；（ｌ）配列番号８１、１１８、８５、９９、１００、７４；（ｍ）配列番号８１、１２９、１１７、１０１、１０２、７４；（ｎ）配列番号１２０、１２１、１２２、１０３、１０４、１０５；（ｏ）配列番号１２３、１２４、１２５、１０６、１０７、１０８；及び（ｐ）配列番号１２６、１２７、１２８、１０９、１１０、１１１からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
様々な実施形態では、核酸は、（ａ）表Ｂに示される重鎖可変領域アミノ酸配列または配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、または４０からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｂ）表Ｂに示される軽鎖可変領域アミノ酸配列または配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９または４１からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、核酸は、（ａ）配列番号１０及び１１；（ｂ）配列番号１２及び１３；（ｃ）配列番号１４及び１５；（ｄ）配列番号１６及び１７；（ｅ）配列番号１８及び１９；（ｆ）配列番号２０及び２１；（ｇ）配列番号２２及び２３；（ｈ）配列番号２４及び２５；（ｉ）配列番号２６及び２７；（ｊ）配列番号２８及び２９；（ｋ）配列番号３０及び３１；（ｌ）配列番号３２及び３３；（ｍ）配列番号３４及び３５；（ｎ）配列番号３６及び３７；（ｏ）配列番号３８及び３９；（ｐ）配列番号４０及び４１からなる群から選択されるアミノ酸配列の対を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な実施形態では、核酸は、表Ｄに列挙される対からなる群から選択されるアミノ酸配列の対を含む抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様では、核酸は、配列番号４２～５７のうちの任意の１つ以上に示されるアミノ酸をコードする配列を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、いかなる挿入、欠失、逆位、及び／または置換も含まない。他の実施形態では、核酸は、１つ以上の挿入、欠失、逆位、及び／または置換を含む。
いくつかの態様では、本開示の核酸は、組換え型である。本明細書で使用される場合、用語「組換え」は、（ｉ）天然もしくは合成核酸セグメントを生細胞内で複製し得る核酸分子に結合させることによって生細胞外で構築された分子、または（ｉｉ）上記（ｉ）に記載の分子の複製に起因する分子を指す。本明細書における目的のため、複製は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複製またはｉｎ ｖｉｖｏ複製であり得る。
いくつかの態様における核酸は、当該技術分野で知られている手順を使用して化学的合成及び／または酵素ライゲーション反応に基づいて構築される。例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，；及び上記Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，を参照されたい。例えば、核酸は、天然ヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を向上させるようにまたはハイブリダイゼーションにより形成された二本鎖の物理的安定性を向上させるように設計された多様に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学的に合成され得る。核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例には、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルクエオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンが含まれるがこれらに限定されない。代替的には、本開示の核酸のうちの１つ以上は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）などの会社から購入することができる。
ベクター
いくつかの態様における本開示の核酸は、ベクターに組み込まれる。この点に関して、本開示は、本開示の核酸のいずれかを含むベクターを提供する。様々な態様では、ベクターは、組換え発現ベクターである。本明細書における目的のため、用語「組換え発現ベクター」は、コンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、ベクターが、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現させるのに十分な条件下で細胞と接触させられる場合に、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能とする遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドコンストラクトを意味する。本開示のベクターは、全体として天然ではない。しかしながら、ベクターの一部は、天然であり得る。本開示のベクターは、一本鎖または二本鎖であり得、天然源から部分的に合成または取得され得、かつ天然、非天然または変化したヌクレオチドを含有し得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むがこれらに限定されない任意のタイプのヌクレオチドを含み得る。ベクターは、天然もしくは非天然のヌクレオチド結合、または両方のタイプの結合を含み得る。いくつかの態様では、変化したヌクレオチドまたは非天然のヌクレオチド間結合は、ベクターの転写または複製を妨げない。
本開示のベクターは、任意の好適なベクターであり得、任意の好適な宿主を形質導入、形質転換またはトランスフェクションするために使用され得る。好適なベクターには、伝播及び増殖のためまたは発現のために設計されたものまたはその両方、例えば、プラスミド及びウイルスが含まれる。ベクターは、プラスミドベースの発現ベクターであり得る。様々な態様では、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏＩＩａ，ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）からなる群から選択される。バクテリオファージベクター、例えば、λＧＴＩＯ、λＧＴｌ１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭｌ１４９も使用され得る。植物発現ベクターの例には、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。動物発現ベクターの例には、ｐＥＵＫ－Ｃｌ，ｐＭＡＭ ａｎｄｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が含まれる。いくつかの態様では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターである。様々な態様では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ）ベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターである。例えば、Ｈｏｗａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２６（１）：１－２０（２０１０）を参照されたい。様々な態様では、ベクターは、節足動物、例えば、昆虫を感染させるバキュロウイルスベクターである。様々な態様では、バキュロウイルスベクターは、オートグラファカリフォルニア多核ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）またはカイコ核多角体病（ＢｍＮＰＶ）である。例えば、Ｋｈａｎ，Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ３（２）：２５７－２６３（２０１３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １１（４）：９１－９６（１９８９）；Ａｔｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｓｔｉｃ Ｓｃｉ ２８：２１５－２２４（１９９０）を参照されたい。
本開示のベクターは、例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．及び上記Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．に記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。環状または線状である発現ベクターのコンストラクトは、真核生物または真核宿主細胞において機能性の複製システムを含有するように調製され得る。複製システムは、例えば、ＣｏＩＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどに由来し得る。
いくつかの態様では、ベクターは、必要に応じて、ベクターがＤＮＡベースであるかまたはＲＮＡベースであるかを考慮して、ベクターが導入される宿主（例えば、細菌、真菌、植物、または動物）のタイプに特異的な転写及び翻訳の開始コドン及び終止コドンなどの調節配列を含む。
ベクターは、形質転換またはトランスフェクションされた宿主の選択を可能とする１つ以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における相補性を含む。本開示の発現ベクターに好適なマーカー遺伝子には、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
ベクターは、ポリペプチド（その機能性部位または機能性バリアントを含む）をコードするヌクレオチド配列、またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して相補的なまたはそれにハイブリダイズするヌクレオチド配列に機能可能に連結されたネイティブまたは非ネイティブのプロモーターを含み得る。プロモーター（例えば、強い、弱い、誘導性の、組織特異的及び発達特異的な）の選択は、当業者の通常の技術の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列をプロモーターと組み合わせることも当業者の技術の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びマウス幹細胞ウイルスの長い末端リピートに見られるプロモーターであり得る。
宿主細胞
本明細書では、本開示の核酸またはベクターを含む宿主細胞が提供される。本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、本開示のベクターを含有し得、かつ核酸（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質）によってコードされる発現産物を生成することが可能な任意のタイプの細胞を指す。いくつかの態様における宿主細胞は、接着細胞または浮遊細胞、すなわち、浮遊して成長する細胞である。様々な態様における宿主細胞は、培養細胞または初代細胞、すなわち、生物、例えば、ヒトから直接的に単離されたものである。宿主細胞は、任意の細胞タイプのものであり得、任意のタイプの組織に由来し得、任意の発達段階のものであり得る。
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、グリコシル化タンパク質であり、宿主細胞は、グリコシル化－コンピテントセルである。様々な態様では、グリコシル化－コンピテントセルは、酵母細胞、糸状菌細胞、原生動物細胞、藻細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない真核細胞である。そのような宿主細胞は、当該技術分野に記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：２１７（２０１３）を参照されたい。様々な態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞である。様々な態様では、哺乳動物細胞は、非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの態様では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びその誘導体（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ－３）、マウス骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０、ＧＳ－ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）活性を欠損するように操作された細胞（例えば、ＤＵＫＸ－Ｘ１１、ＤＧ４４）、ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞またはその誘導体（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨｅＬａ）、ヒト骨骨肉腫上皮細胞Ｕ２－ＯＳ、腺癌性ヒト肺胞基底上皮細胞Ａ５４９、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、マウス脳腫瘍細胞ＣＡＤ、胚性癌細胞Ｐ１９、マウス胚線維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３、マウス線維芽細胞Ｌ９２９、マウス神経芽細胞腫細胞Ｎ２ａ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ－７、網膜芽細胞腫細胞Ｙ７９、ヒト網膜芽細胞腫細胞ＳＯ－Ｒｂ５０、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２、マウスＢ骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌ、または仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（Ｇａｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｋｈａｎ，Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ３（２）：２５７－２６３（２０１３））である。
ベクターを増幅または複製する目的のため、宿主細胞は、いくつかの態様では、原核細胞、例えば、細菌細胞である。
また、本明細書に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団が本開示によって提供される。いくつかの態様における細胞の集団は、記載されるベクターを含む宿主細胞を、いずれのベクターも含まない少なくとも１つの他の細胞に加えて含む異種集団である。代替的には、いくつかの態様では、細胞の集団は、集団がベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、本質的にそれからなる）実質的に均質な集団である。いくつかの態様における集団は、集団の全細胞がベクターを含む単一宿主細胞のクローンであることで集団の全細胞がベクターを含む、細胞のクローン集団である。本開示の様々な実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載されるベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
製造方法
また、本明細書では、ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗原結合タンパク質を生成する方法が提供される。様々な実施形態では、方法は、細胞培地において本明細書に記載される抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び細胞培地から抗原結合タンパク質を収穫することを含む。宿主細胞は、本明細書に記載の宿主細胞のいずれかであり得る。様々な態様では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、及びＢＨＫ細胞からなる群から選択される。様々な態様では、宿主細胞を培養する工程は、宿主細胞の成長及び増殖を補助するための成長培地において宿主細胞を培養することを含む。様々な態様では、成長培地は、細胞密度、培養物物生存性、及び生産性を適時に向上させる。様々な態様では、成長培地は、成長因子、ホルモン、及び付属因子の供給源としてアミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコース、及び血清を含む。様々な態様では、成長培地は、アミノ酸、ビタミン、微量元素、無機塩、脂質及びインスリンまたはインスリン様成長因子からなる完全に化学的に規定された培地である。栄養素に加えて、成長培地はまた、ｐＨ及びオスモル濃度を維持するのに役立つ。いくつかの成長培地は市販されており、当該技術分野に記載されている。例えば、Ａｒｏｒａ，“Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ” ＭＡＴＥＲ ＭＥＴＨＯＤＳ ３：１７５（２０１３）を参照されたい。
様々な態様では、方法は、フィード培地において宿主細胞を培養することを含む。様々な態様では、方法は、フィード培地において流加様式で培養することを含む。組換えタンパク質生成の方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ” ＭＡｂｓ ２（５）：４６６－４７７（２０１０）を参照されたい。
抗原結合タンパク質を作製する方法は、細胞培養物またはその上清からタンパク質を精製し、好ましくは精製されたタンパク質を回収するための１つ以上の工程を含み得る。様々な態様では、方法は、１つ以上のクロマトグラフィー工程、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。様々な態様では、方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂を使用してタンパク質を精製することを含む。
様々な実施形態では、方法は、精製されたタンパク質などを製剤化し、それにより、精製されたタンパク質を含む製剤を得る工程をさらに含む。そのような工程は、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ｅｄｓ．Ｊａｍｅｅｌ ａｎｄ Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ），２０１０に記載されている。
様々な態様では、ポリペプチドに連結された抗原結合タンパク質及び抗原結合タンパク質は、融合タンパク質の一部である。よって、本開示はさらに、ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を生成する方法を提供する。様々な実施形態では、方法は、細胞培地において本明細書に記載される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び細胞培地から融合タンパク質を収穫することを含む。
コンジュゲート
本開示はまた、第２の部位（例えば、異質部位、コンジュゲート部位）に結合、連結またはコンジュゲートされた抗原結合タンパク質を提供する。したがって、本開示は、抗原結合タンパク質及び異質部位を含むコンジュゲートを提供する。本明細書で使用される場合、用語「異質部位」は、「コンジュゲート部位」と同義であり、本開示の抗原結合タンパク質とは異なる任意の分子（化学的または生化学的、天然または非コード）を指す。様々な異質部位には、ポリマー、炭水化物、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、治療剤、（例えば、細胞傷害剤、サイトカイン）、または診断剤が含まれるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、異質部位は、ポリマーである。ポリマーは、分岐状または非分岐状であり得る。ポリマーは、任意の分子量のものであり得る。いくつかの実施形態におけるポリマーは約２ｋＤａ～約１００ｋＤａの間の平均分子量を有する（用語「約」は、水可溶性ポリマーの調製物において、一部の分子が記述された分子量よりも多い、いくらか少ない重量があることを示す）。ポリマーの平均分子量は、いくつかの態様では、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約１２ｋＤａ～約４０ｋＤａまたは約２０ｋＤａ～約３５ｋＤａの間である。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、重合度が制御され得るように、単一の反応性基、例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドを有するように改変される。いくつかの実施形態におけるポリマーは、それが結合したタンパク質が生理的環境などの水性環境において沈殿しないように水溶性である。いくつかの実施形態では、例えば、組成物が治療的用途のために使用される場合、ポリマーは、薬学的に許容可能である。また、いくつかの態様では、ポリマーは、ポリマーの混合物、例えば、コポリマー、ブロックコポリマーである。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリアルキレンテレフタレートを含むポリアルキレン及びその誘導体、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、及びポリ（オクタデシルアクリレート）を含むアクリル酸及びメタクリル酸エステルのポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハライド、ポリ（酢酸ビニル）、及びポリビニルピロリドンを含むポリビニルポリマー、ポリグリコリド、ポリシロキサン、ポリウレタン及びそれらのコポリマー、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシ－プロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、セルロースアセテート、セルロースプロピオネート、セルロースアセテートブチレート、セルロースアセテートフタレート、カルボキシルエチルセルロース、セルローストリアセテート、及びセルローススルフェートナトリウム塩を含むセルロース、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、及びポリ（エチレンテレフタレート）を含むポリエチレン、ならびにポリスチレンからなる群から選択される。
本明細書における使用のために特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書で使用される場合、ポリエチレングリコールは、他のタンパク質を誘導体化するために使用され得るＰＥＧの形態のいずれか、例えば、モノ－（Ｃ１－Ｃ１０）アルコキシ－またはアリールオキシ－ポリエチレングリコールを包含することを意味する。ＰＥＧは、広範囲の分子量で利用可能な線状または分岐状中性ポリエーテルであり、水及びほとんどの有機溶媒に可溶性である。
いくつかの実施形態では、異質部位は、炭水化物である。いくつかの実施形態では、炭水化物は、単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース）、二糖（例えば、スクロース、ラクトース、マルトース）、オリゴ糖（例えば、ラフィノース、スタキオース）、多糖（デンプン、アミラーゼ、アミロペクチン、セルロース、キチン、カロース、ラミナリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナンである。
いくつかの実施形態では、異質部位は、脂質である。脂質は、いくつかの実施形態では、脂肪酸、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン、Ｎ－アシルエタノールアミン）、グリセロ脂質（例えば、一、二、三置換グリセロール）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン）、スフィンゴリピド（例えば、スフィンゴシン、セラミド）、ステロール脂質（例えば、ステロイド、コレステロール）、プレノール脂質、糖脂質、またはポリケチド、油、ワックス、コレステロール、ステロール、脂溶性ビタミン、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質である。
いくつかの実施形態では、異質部位は、治療剤である。治療剤は、当該技術分野で知られているもののいずれかであり得る。本明細書で企図される治療剤の例には、天然酵素、天然源に由来するタンパク質、組換えタンパク質、天然ペプチド、合成ペプチド、環状ペプチド、抗体、受容体アゴニスト、細胞傷害剤、イムノグロビン、ベータ－アドレナリン遮断剤、カルシウムチャネルブロッカー、冠拡張剤、強心配糖体、抗不整脈剤、心臓交感神経様作用剤、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、利尿剤、循環作動剤、コレステロール及びトリグリセリド減少剤、胆汁酸抑制剤、フィブラート、３－ヒドロキシ－３－メチルグルテリル（ＨＭＧ）－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ナイアシン誘導体、抗アドレナリン作動剤、アルファ－アドレナリン遮断剤、中枢作用性抗アドレナリン作動剤、血管拡張剤、カリウム保持剤、チアジド及び関連する薬剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、末梢血管拡張剤、抗アンドロゲン剤、エストロゲン、抗生物質、レチノイド、インスリン及びアナログ、アルファ－グルコシダーゼ阻害剤、ビグアニド、メグリチニド、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、アンドロゲン、プロゲストゲン、骨代謝調節剤、下垂体前葉ホルモン、視床下部ホルモン、下垂体後葉ホルモン、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモンアンタゴニスト、排卵刺激剤、選択的エストロゲン受容体調節剤、抗甲状腺剤、甲状腺ホルモン、膨張性剤、下剤、逆蠕動剤、微生物叢改変剤、腸吸着剤、腸抗感染剤、抗拒食症剤、抗悪液質剤、抗過食症剤、食欲抑制剤、抗肥満剤、制酸剤、上部胃腸管剤、抗コリン剤、アミノサリチル酸誘導体、生物学的反応改変剤、コルチコステロイド、鎮痙剤、５－ＨＴ４部分的アゴニスト、抗ヒスタミン剤、カンナビノイド、ドーパミンアンタゴニスト、セロトニンアンタゴニスト、細胞保護剤、ヒスタミンＨ２－受容体アンタゴニスト、粘膜保護剤、プロトンポンプ阻害剤、Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ根絶療法、赤血球生成刺激剤、造血剤、貧血剤、ヘパリン、抗線維素溶解剤、止血剤、血液凝固因子、アデノシン二リン酸阻害剤、糖タンパク質受容体阻害剤、フィブリノゲン－血小板結合阻害剤、トロンボキサン－Ａ２阻害剤、プラスミノーゲン活性化因子、抗血栓剤、グルココルチコイド、鉱質コルチコイド、コルチコステロイド、選択的免疫抑制剤、抗真菌剤、予防療法、ＡＩＤＳ関連感染症、サイトメガロウイルスに関与する薬物、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、貧血、カポジ肉腫、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、リンコサミド、マクロライド、オキサゾリジノン、ペニシリン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、トリメトプリム及び誘導体、テトラサイクリン、駆虫剤、抗アメーバ剤、ビグアニド、キナアルカロイド、葉酸アンタゴニスト、キノリン誘導体、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ療法、ヒドラジド、イミダゾール、トリアゾール、ニトロイミダゾール、環状アミン、ノイラミニダーゼ阻害剤、ヌクレオシド、ホスフェート結合剤、コリンエステラーゼ阻害剤、補助療法、バルビツール酸及び誘導体、ベンゾジアゼピン、ガンマアミノ酪酸誘導体、ヒダントイン誘導体、イミノスチルベン誘導体、スクシンイミド誘導体、抗痙攣剤、麦角アルカロイド、抗片頭痛調製物、生物学的反応改変剤、カルバミン酸エステル、三環式誘導体、脱分極剤、非脱分極剤、神経筋麻痺剤、ＣＮＳ刺激剤、ドーパミン作動薬、モノアミンオキシダーゼ阻害剤、ＣＯＭＴ阻害剤、アルキルスルホネート、エチレンイミン、イミダゾテトラジン、ナイトロジェンマスタードアナログ、ニトロソウレア、白金含有化合物、代謝拮抗剤、プリンアナログ、ピリミジンアナログ、尿素誘導体、アントラサイクリン、アクチノマイシン、カンプトテシン誘導体、エピポドフィロトキシン、タキサン、ビンカアルカロイド及びアナログ、抗アンドロゲン剤、抗エストロゲン剤、非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤抗新生物剤、アザスピロデカンジオン誘導体、抗不安剤、刺激剤、モノアミン再取り込み阻害剤、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、抗鬱剤、ベンズイソオキサゾール誘導体、ブチロフェノン誘導体、ジベンゾジアゼピン誘導体、ジベンゾチアゼピン誘導体、ジフェニルブチルピペリジン誘導体、フェノチアジン、チエノベンゾジアゼピン誘導体、チオキサンテン誘導体、アレルゲンエキス、非ステロイド剤、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、キサンチン、エンドセリン受容体アンタゴニスト、プロスタグランジン、肺界面活性剤、粘液溶解剤、抗有糸分裂剤、尿酸排泄剤、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、メテアミン塩、ニトロフラン誘導体、キノロン、平滑筋弛緩剤、副交感神経作用剤、ハロゲン化炭化水素、アミノ安息香酸のエステル、アミド（例えば、リドカイン、アルチカイン塩酸塩、ブピバカイン塩酸塩）、解熱剤、催眠剤及び鎮静剤、シクロピロロン、ピラゾロピリミジン、非ステロイド性抗炎症薬、オピオイド、パラ－アミノフェノール誘導体、アルコールデヒドロゲナーゼ阻害剤、ヘパリンアンタゴニスト、吸着剤、催吐剤、オポイドアンタゴニスト、コリンエステラーゼ再活性化剤、ニコチン代替薬療法、ビタミンＡアナログ及びアンタゴニスト、ビタミンＢアナログ及びアンタゴニスト、ビタミンＣアナログ及びアンタゴニスト、ビタミンＤアナログ及びアンタゴニスト、ビタミンＥアナログ及びアンタゴニスト、ビタミンＫアナログ及びアンタゴニストが含まれるがこれらに限定されない。
本開示の抗原結合タンパク質は、腫瘍転移を阻害するのに有効である１つ以上のサイトカイン及び成長因子にコンジュゲートされ得、サイトカインまたは成長因子は、少なくとも１つの細胞集団に対して抗増殖効果を有することが示されている。そのようなサイトカイン、リンホカイン、成長因子、または他の造血因子には、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＦＮ、ＴＮＦα、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ－ＣＳＦ、Ｍｅｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、トロンボポエチン、幹細胞因子、及びエリスロポエチンが含まれるがこれらに限定されない。本明細書において使用するためのさらなる成長因子には、アンギオジェニン、骨形態形成タンパク質－１、骨形態形成タンパク質－２、骨形態形成タンパク質－３、骨形態形成タンパク質－４、骨形態形成タンパク質－５、骨形態形成タンパク質－６、骨形態形成タンパク質－７、骨形態形成タンパク質－８、骨形態形成タンパク質－９、骨形態形成タンパク質－１０、骨形態形成タンパク質－１１、骨形態形成タンパク質－１２、骨形態形成タンパク質－１３、骨形態形成タンパク質－１４、骨形態形成タンパク質－１５、骨形態形成タンパク質受容体ＩＡ、骨形態形成タンパク質受容体ＩＢ、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、毛様体神経栄養因子受容体α、サイトカイン誘導好中球走化因子１、サイトカイン誘導好中球走化因子２α、サイトカイン誘導好中球走化因子２β、β内皮細胞成長因子、エンドセリン１、上皮由来好中球誘引因子、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α１、グリア細胞株由来神経栄養因子受容体α２、成長関連タンパク質、成長関連タンパク質α、成長関連タンパク質β、成長関連タンパク質γ、ヘパリン結合性上皮成長因子、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子受容体、インスリン様成長因子Ｉ、インスリン様成長因子受容体、インスリン様成長因子ＩＩ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ケラチノサイト成長因子、白血病阻害因子、白血病阻害因子受容体α、神経成長因子神経成長因子受容体、ニューロトロフィン－３、ニューロトロフィン－４、プレＢ細胞成長刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受容体、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β１．２、形質転換成長因子β２、形質転換成長因子β３、形質転換成長因子β５、潜在性形質転換成長因子β１、形質転換成長因子β結合タンパク質Ｉ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩ、形質転換成長因子β結合タンパク質ＩＩＩ、腫瘍壊死因子受容体Ｉ型、腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体、及びキメラタンパク質ならびにそれらの生物学的にまたは免疫学的に活性な断片が含まれる。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、本明細書に記載される抗原結合タンパク質及び細胞傷害剤を含む。細胞傷害剤は、細胞に対して毒性である任意の分子（化学的または生化学的）である。いくつかの態様では、細胞傷害剤が本開示の抗原結合タンパク質にコンジュゲートされる場合、得られる結果は相乗的である。すなわち、抗原結合タンパク質及び細胞傷害剤の併用療法の有効性は、相乗的である、すなわち、有効性は、各々の付加的な個々の効果から予測される有効性よりも高い。そのため、細胞傷害剤の投薬量は低減され、よって、毒性問題及び他の副作用のリスクが同時に低減され得る。いくつかの実施形態では、細胞傷害剤は、化学療法剤である。化学療法剤は、当該技術分野で知られており、これには米国特許第６，６３０，１２４号に記載される白金配位化合物、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生物質、抗有糸分裂性アルカロイド及びジフルオロヌクレオシドが含まれるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、白金配位化合物である。用語「白金配位化合物」は、イオンの形態の白金を提供する任意の腫瘍細胞増殖阻害白金配位化合物を指す。
いくつかの実施形態では、白金配位化合物は、シス－ジアンミンジアクオ白金（ＩＩ）－イオン；クロロ（ジエチレントリアミン）－白金（ＩＩ）塩化物；ジクロロ（エチレンジアミン）－白金（ＩＩ）、ジアンミン（１，１－シクロブタンジカルボキシラト）白金（ＩＩ）（カルボプラチン）；スピロプラチン；イプロプラチン；ジアンミン（２－ジエチルマロナト）－白金（ＩＩ）；エチレンジアミンマロナト白金（ＩＩ）；アクア（１，２－ジアミノジシクロヘキサン）－スルファト白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）マロナト白金（ＩＩ）；（４－カルボキシフタラト）（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）－（イソシトラト）白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）シス（ピルバト）白金（ＩＩ）；（１，２－ジアミノシクロヘキサン）オキサラト白金（ＩＩ）；オルマプラチン；及びテトラプラチンである。
いくつかの実施形態では、シスプラチンは、本開示の組成物及び方法に用いられる白金配位化合物である。シスプラチンは、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ－Ｓｑｕｉｂｂ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからＰＬＡＴＩＮＯＬ（商標）という名称で市販されており、水、滅菌生理食塩水または他の好適なビヒクルでの再構成のために粉末として利用可能である。本発明において使用するのに好適な他の白金配位化合物が知られており、市販されており、及び／または従来の技術によって調製され得る。シスプラチン、またはシス－ジクロロジアンミン白金ＩＩは、様々なヒト固形悪性腫瘍の処置において化学療法剤として長年成功裏に使用されてきた。より最近では、他のジアミノ－白金錯体もまた、様々なヒト固形悪性腫瘍の処置における化学療法剤としての有効性が示されている。そのようなジアミノ－白金錯体には、スピロ白金及びカルボ白金が含まれるがこれらに限定されない。シスプラチン及び他のジアミノ－白金錯体は、ヒトにおいて化学療法剤として広く使用されてきたが、それらは、腎臓損傷などの毒性問題につながり得る高投薬量レベルで送達されなければならなかった。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼは、真核細胞においてＤＮＡトポロジーを変化させることが可能な酵素である。それらは、細胞機能及び細胞増殖にとって肝要である。通常、真核細胞において２つのクラスのトポイソメラーゼ、すなわち、タイプＩ及びＩＩ型が存在する。トポイソメラーゼＩは、およそ１００，０００分子量の単量体酵素である。酵素は、ＤＮＡに結合し、一過性一本鎖破断を導入し、二重らせんをほどき（またはほどくことを可能にし）、その後、破断を再封止してからＤＮＡ鎖から解離する。様々なトポイソメラーゼ阻害剤が、最近、卵巣癌、食道癌または非小細胞肺癌に罹患したヒトの処置において臨床的有効性が示されている。
いくつかの態様では、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシンまたはカンプトテシンアナログである。カンプトテシンは、中国に自生するＣａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｃｕｍｉｎａｔａの木及びインドに自生するＮｏｔｈａｐｏｄｙｔｅｓ ｆｏｅｔｉｄａの木によって生成される水不溶性の細胞傷害性アルカロイドである。カンプトテシンは、多数の腫瘍細胞に対して腫瘍細胞増殖阻害活性を示す。カンプトテシンアナログクラスの化合物は典型的には、ＤＮＡトポイソメラーゼＩの特異的な阻害剤である。用語「トポイソメラーゼの阻害剤」は、カンプトテシンに構造的に関係する任意の腫瘍細胞増殖阻害化合物を意味する。カンプトテシンアナログクラスの化合物には、トポテカン、イリノテカン及び９－アミノ－カンプトテシンが含まれるがこれらに限定されない。
追加の実施形態では、細胞傷害剤は、１９９１年４月２日に発行された米国特許番号５，００４，７５８及び１９８９年６月２１日に２０’公開番号ＥＰ０３２１１２２として公開された欧州特許出願番号８８３１１３６６．４；１９８６年８月５日に発行された米国特許番号４，６０４，４６３及び１９８５年４月１７日に公開された欧州特許出願公開番号ＥＰ０１３７１４５；１９８４年９月２５日に発行された米国特許番号４，４７３，６９２号及び１９８３年３月１６日に公開された欧州特許出願公開番号ＥＰ００７４２５６；１９８５年１０月８日に発行された米国特許番号４，５４５，８８０及び１９８３年３月１６日に公開された欧州特許出願公開番号ＥＰ００７４２５６；１９８３年９月１４日に公開された欧州特許出願公開番号ＥＰ００８８６４２；Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２９，２３５８－２３６３（１９８６）；Ｎｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．１４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｋｙｏｔｏ，１９８５，Ｔｏｋｙｏ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｓｅｃｔｉｏｎ １，ｐ．２８－３０（特にＣＰＴ－１１と称される化合物）において請求または記載されている任意の腫瘍細胞成長阻害カンプトテシンアナログである。ＣＰＴ－１１は、１０－ヒドロキシ－７－エチルカンプトテシンのＣ－１０でカルバメート結合を介して接続された４－（ピペリジノ）－ピペリジン側鎖を有するカンプトテシンアナログである。ＣＰＴ－１１は現在、ヒト臨床試験を受けており、イリノテカンとも称される；Ｗａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２３，５５４（１９８０）；Ｗａｎｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０，１７７４（１９８７）；１９８２年８月３日に発行された米国特許番号４，３４２，７７６；１９９０年９月１３日に出願された米国特許出願整理番号５８１，９１６及び１９９１年３月２０日に公開された欧州特許出願公開番号ＥＰ４１８０９９；１９８５年４月２３日に発行された米国特許番号４，５１３，１３８及び１９８３年３月２３日に公開された欧州特許出願公開番号ＥＰ００７４７７０；１９８３年８月１６日に発行された米国特許番号４，３９９，２７６及び１９８２年７月２８日に公開された欧州特許出願公開番号００５６６９２；（各々の開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）。カンプトテシンアナログクラスの上記の化合物のすべてが市販されており、及び／または上記の参考文献に記載されているものを含む従来の技術によって調製され得る。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポテカン、イリノテカン及び９－アミノカンプトテシンからなる群から選択され得る。
いくつかの実施形態では、カンプトテシンアナログは、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）の活性代謝産物である。いくつかのそのような実施形態では、カンプトテシンアナログは、７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ－３８）である。代謝産物として、ＳＮ－３８は、カルボキシルエステラーゼによるイリノテカンの加水分解によって形成される。いくつかの実施形態では、ＳＮ－３８は、以下の構造のうちの１つを有する：
Figure 2022541435000007
 ＳＮ－３８は、米国特許出願整理番号７，９９９，０８３；米国特許出願整理番号８，０８０，２５０；米国特許出願整理番号８，７５９，４９６；米国特許出願整理番号８，９９９，３４４；米国特許出願整理番号１０，１９５，２８８；及び米国特許出願整理番号９，８０８，５３７に記載されている。
いくつかの実施形態では、カンプトテシンアナログは、エキサテカンメタンスルホネートである。エキサテカンメタンメタンスルホネートは、他のＣＰＴアナログよりも強力なトポイソメラーゼＩ阻害活性及び抗腫瘍活性を示す水溶性カンプトテシン（ＣＰＴ）である。また、エキサテカンは、ｐ－糖タンパク質（Ｐ－ｇｐ）媒介多剤薬物耐性細胞に対して有効である。
いくつかの実施形態では、カンプトテシンアナログは、エキサテカンの強力な誘導体であるデルクステカン（Ｄｘｄ）であり、これはＳＮ－３８よりも１０倍高いトポイソメラーゼＩ阻害効力を有する。いくつかの実施形態では、Ｄｘｄは、以下の構造を有する：
Figure 2022541435000008
 Ｄｘｄは、米国特許出願整理番号６，４０７，１１５；米国特許出願整理番号１０，１９５，２８８；米国特許出願整理番号９，８０８，５３７；及び米国特許出願整理番号６，４０７，１１５に記載されている。
カンプトテシンアナログクラスの多数の化合物（その薬学的に許容可能な塩、水和物及び溶媒和物を含む）ならびにカンプトテシンアナログクラスのそのような化合物及び不活性の薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む経口及び非経口薬学的組成物の調製は、１９９１年４月２日に発行された米国特許番号５，００４，７５８及び公開番号ＥＰ０３２１１２２として１９８９年６月２１日に公開された欧州特許出願番号８８３１１３６６．４に広範に記載されており、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明のさらなる他の実施形態では、化学療法剤は、抗生物質化合物である。好適な抗生物質には、ドキソルビシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン及びストレプトゾシンが含まれるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、化学療法剤は、抗有糸分裂アルカロイドである。通常、抗有糸分裂アルカロイドは、Ｃａｎｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓから抽出され得、抗がん化学療法剤として有効であることが示されている。非常に多数の半合成誘導体が化学的に及び薬理学的に研究されてきた（Ｏ．Ｖａｎ Ｔｅｌｌｉｎｇｅｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，１６９９－１７１６（１９９２）参照）。本発明の抗有糸分裂アルカロイドには、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール及びビノレルビンが含まれるがこれらに限定されない。後者の２つの抗有糸分裂アルカロイドは、それぞれＥｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ及びＰｉｅｒｒｅ Ｆａｂｒｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている（米国特許番号５，６２０，９８５参照）。一実施形態では、抗有糸分裂アルカロイドは、ビノレルビンである。
本発明の他の実施形態では、化学療法剤は、ジフルオロヌクレオシドである。２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロヌクレオシドは、抗ウイルス活性を有するものとして当該技術分野で知られている。そのような化合物は、米国特許番号４，５２６，９８８及び４，８０８６１４で開示及び教示されている。欧州特許出願公開１８４，３６５は、これらの同じジフルオロヌクレオシドが腫瘍溶解活性を有することを開示している。所定の態様では、本発明の組成物及び方法において使用される２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロヌクレオシドは、ゲムシタビン塩酸塩としても知られている２’－デオキシ－２’，２’－ジフルオロシチジン塩酸塩である。ゲムシタビンは市販されており、または米国特許番号４，５２６，９８８、４，８０８，６１４及び５，２２３，６０８（参照により本明細書に組み込まれる）で開示及び教示されているように多工程プロセスで合成され得る。
様々な態様では、化学療法剤は、チューブリン重合を阻止することによって、微小管を脱安定化することによって、または微小管動態を変化させることによって細胞分裂を阻害する抗有糸分裂剤、例えば、メイタンシノイドまたはその誘導体（例えば、ＤＭ１またはＤＭ４）、アウリスタチンまたはその誘導体である。様々な例では、化学療法剤は、アウリスタチンである。例えば、アウリスタチンは、いくつかの態様では、ドラスタチン、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、またはＰＦ－０６３８０１０１である。アウリスタチンは当該技術分野で記載されている。例えば、Ｍａｄｅｒｎａ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １２（６）：１７９８－１８１２（２０１５）を参照されたい。様々な態様では、コンジュゲートは、ＭＭＡＥと組み合わせて本開示の抗体を含む。任意に、コンジュゲートは、リンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、切断可能な連結部位を含む。様々な例では、コンジュゲートは、カテプシンで切断可能なリンカーに連結された付加基に連結された本開示の抗体を含み、これは今度はＭＭＡＥに連結されたスペーサーに連結される。態様では、付加基は、抗体のＦｃ領域のＣｙｓ残基を介して抗体に結合されている。例示的な態様では、付加基は、式Ｉ：
Figure 2022541435000009
 の構造を含む。
例示的な態様では、カテプシンで切断可能なリンカーは、式ＩＩ：
Figure 2022541435000010
 の構造を含む。
例示的な態様では、スペーサーは、式ＩＩＩ：
Figure 2022541435000011
 の構造を含む。
いくつかの実施形態では、ＭＭＡＥは、以下の構造を有する：
Figure 2022541435000012
本開示はまた、コンジュゲートが融合タンパク質となるようにポリペプチドに連結された本開示の抗原結合タンパク質を含むコンジュゲートを提供する。そのため、本開示は、ポリペプチドに連結された本開示の抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。様々な実施形態では、ポリペプチドは、診断標識、例えば、緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質、または他のタグ、例えば、Ｍｙｃタグである。様々な態様では、ポリペプチドは、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、または上で列挙した他の造血因子のうちの１つである。
リンカー
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、異質部位に直接的に連結される。代替的な実施形態では、コンジュゲートは、本開示の化合物を異質部位に結合させるリンカーを含む。いくつかの態様では、リンカーは、１～約６０個の原子、または１～３０個の原子またはそれ以上、２～５個の原子、２～１０個の原子、５～１０個の原子、または１０～２０個の原子の長さの鎖を含む。いくつかの実施形態では、鎖原子はすべて炭素原子である。いくつかの実施形態では、リンカーの骨格における鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される。鎖原子及びリンカーは、より可溶性のコンジュゲートを提供するようにそれらの予期される溶解性（親水性）に応じて選択され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、標的組織または器官または細胞に見られる酵素もしくは他の触媒または加水分解条件による切断に供される官能基を提供する。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、立体障害の潜在性を低下させるのに十分な長さである。いくつかの実施形態では、リンカーは、アミノ酸またはペプチジルリンカーである。そのようなペプチジルリンカーは、任意の長さであり得る。様々なリンカーは、長さが約１～５０アミノ酸、長さが５～５０、３～５、５～１０、５～１５、または１０～３０アミノ酸である。
多様な好適なリンカーは、当該技術分野で知られている。リンカーは、例えば、生理的条件下で、例えば、リンカーの切断が細胞内環境で薬物を放出するような細胞内条件下で切断可能（切断可能なリンカー）であり得る。代替的には、リンカーは、リンカーの切断が腫瘍細胞の内部で優先的に浸透する薬物を放出するように、細胞外条件下で、例えば、腫瘍細胞外でまたは腫瘍腫瘤の近くで切断可能であり得る。他の実施形態では、リンカーは、切断可能ではなく（切断可能ではないリンカー）、薬物は、抗体分解によって放出される。
リンカーは、抗体部位上の化学的反応性基に、例えば、遊離アミノ、イミノ、ヒドロキシル、チオール、またはカルボキシル基（例えば、ＮまたはＣ末端に、１つ以上のリジン残基のイプシロンアミノ基に、１つ以上のグルタミン酸またはアスパラギン酸残基の遊離カルボン酸基に、１つ以上のシステイニル残基のスルフヒドリル基に、または１つ以上のセリンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基に）結合され得る。リンカーが結合する部位は、抗体部位のアミノ酸配列における天然残基であり得、またはそれは、抗体部位内に、例えば、ＤＮＡ組換え技術によって（例えば、アミノ酸配列においてシステインまたはプロテアーゼ切断部位を導入することによって）またはタンパク質生化学（例えば、還元、ｐＨ調整、またはタンパク質分解）によって導入され得る。リンカーが結合する部位はまた、非天然アミノ酸であり得る。リンカーが結合する部位はまた、抗体上のグリカンであり得る。
典型的には、リンカーは、それが接続している２つの基が連結されている条件下で実質的に不活性である。用語「二官能性架橋剤」、「二官能性リンカー」または「架橋剤」は、リンカーの各末端に２つの反応性基を有することで、１つの反応性基が最初に細胞傷害性化合物と反応して、リンカー部位及び第２の反応性基を保有する化合物が提供され、次いでこれが抗体と反応し得る改変剤を指す。代替的には、二官能性架橋剤の一方の末端を最初に抗体と反応させて、リンカー部位及び第２の反応性基を保有する抗体を提供し得、次いでこれが細胞傷害性化合物と反応し得る。連結部位は、特定の部位で細胞傷害性部位の放出を可能とする化学的結合を含有し得る。好適な化学的結合は、当該技術分野でよく知られており、これには、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、酸不安定性結合、光不安定性結合、プロテアーゼ／ペプチダーゼ不安定性結合、及びエステラーゼ不安定性結合が含まれる。例えば、米国特許番号５，２０８，０２０；５，４７５，０９２；６，４４１，１６３；６，７１６，８２１；６，９１３，７４８；７，２７６，４９７；７，２７６，４９９；７，３６８，５６５；７，３８８，０２６及び７，４１４，０７３を参照されたい。いくつかの実施形態では、結合は、ジスルフィド結合、チオエーテル、及び／またはプロテアーゼ／ペプチダーゼ不安定結合である。本発明において使用され得る他のリンカーには、切断可能ではないリンカー、例えば、ＵＳ２００５０１６９９３３に記載されているもの、荷電リンカー、または親水性リンカー、例えば、ＵＳ２００９／０２７４７１３、ＵＳ２０１０／０１２９３１４、及びＷＯ２００９／１３４９７６に記載されているものが含まれ、これらの各々は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、リンカーは、コンジュゲートに親水性を付与する親水性リンカーである。いくつかの実施形態では、親水性リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態では、親水性リンカーは、ＣＬＡ２である。いくつかの実施形態では、ＣＬＡ２リンカーは、以下の構造を有する：
Figure 2022541435000013
 ＣＬＡ２は、米国特許番号８，０８０，２５０；８，７５９，４９６；及び１０，１９５，２８８に記載されている。
いくつかの実施形態では、親水性リンカーは、ＣＬ２Ｅである。いくつかの実施形態では、ＣＬ２Ｅは、以下の構造を有する：
Figure 2022541435000014
 ＣＬ２Ｅは、米国特許番号８，０８０，２５０；８，７５９，４９６；及び１０，１９５，２８８に記載されている。
いくつかの実施形態では、リンカーは、細胞内環境（例えば、リソソームまたはエンドソームまたはカベオラ内）に存在する切断因子によって切断可能である。リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内または細胞外ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５アミノ酸長を含む。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、バリン及びシトルリン残基を含むＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢである。いくつかの実施形態では、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢリンカーは、以下の構造を有する：
Figure 2022541435000015
 ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢは、米国特許番号７，６５９，２４１；７，８２９，５３１；６，８８４，８６９；６，２１４，３４５；及び６，２１４，３４５に記載されている。
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、マレイミドカプロイルグリシン－グリシン－フェニルアラニン－グリシン（ＭＣ－ＧＧＦＧ）である。いくつかの実施形態では、ＭＣ－ＧＧＦＧリンカーは、以下の構造を有する：
Figure 2022541435000016
 ＭＣ－ＧＧＦＧは、米国特許番号９，８０８，５３７及び１０，１９５，２８８に記載されている。
他の実施形態では、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、すなわち、所定のｐＨ値での加水分解に感受性である。いくつかの実施形態では、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソームにおいて加水分解可能な酸に不安定なリンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス－アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）が使用され得る（例えば、米国特許番号５，１２２，３６８；５，８２４，８０５；５，６２２，９２９；Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，１９９９，Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８３：６７－１２３；Ｎｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ，１９８９，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３－１４６６１参照）。そのようなリンカーは、血液におけるものなどの中性のｐＨ条件下では比較的安定であるが、リソソームのおおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定である。所定の実施形態では、加水分解可能なリンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合されたチオエーテルなどである（例えば、米国特許番号５，６２２，９２９参照）。
他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。ジスルフィド結合を介して抗体と細胞傷害性化合物との連結を可能にする二官能性架橋剤には、Ｎ－スクシンイミジル－４－（４－ニトロピリジル－２－ジチオ）ブタノエート、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルジチオ）－２－スルホブタノエート（スルホ－ＳＰＤＢ）が含まれるがこれらに限定されない。スルホ－ＳＰＤＢは、例えば、米国特許８，２３６，３１９（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。代替的には、２－イミノチオラン、ホモシステインチオラクトン、またはＳ－アセチルコハク酸無水物などの、チオール基を導入する架橋剤が使用され得る。他の実施形態では、リンカーは、前述したペプチドリンカー、ｐＨ感受性リンカー、またはジスルフィドリンカーのうちの１つ以上の組み合わせを含有し得る。
「ヘテロ二官能性架橋剤」は、２つの異なる反応性基を有する二官能性架橋剤である。アミン反応性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）及びカルボニル反応性ヒドラジン基の両方を含有するヘテロ二官能性架橋剤もまた、細胞傷害性化合物を抗体と連結させるために使用され得る。そのような市販のヘテロ二官能性架橋剤の例には、スクシンイミジル６－ヒドラジノニコチンアミドアセトンヒドラゾン（ＳＡＮＨ）、スクシンイミジル４－ヒドラジドテレフタレート塩酸塩（ＳＨＴＨ）及びスクシンイミジルヒドラジニウムニコチネート塩酸塩（ＳＨＮＨ）が含まれる。酸不安定性結合を保有するコンジュゲートも、本発明のヒドラジン保有ベンゾジアゼピン誘導体を使用して調製され得る。使用され得る二官能性架橋剤の例には、スクシンイミジル－ｐ－ホルミルベンゾエート（ＳＦＢ）及びスクシンイミジル－ｐ－ホルミルフェノキシアセテート（ＳＦＰＡ）が含まれる。
本明細書に記載のリンカーは、本明細書に記載の異質部位と任意の組み合わせで使用され得る。本明細書に記載の上記リンカー及び異質部位のすべてが市販されており、及び／または上記の参考文献に記載されているものを含む従来の技術によって調製され得る。
コンジュゲーション
異質部位対抗原結合タンパク質比（ＨＡＲ）は、抗原結合分子当たりの連結された異質部位の数を表す。いくつかの実施形態では、ＨＡＲは、１～１５、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、または１～２の範囲である。いくつかの実施形態では、ＨＡＲは、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４または２～３の範囲である。他の実施形態では、ＨＡＲは、約２、約２．５、約３、約４、約５、または約６である。いくつかの実施形態では、ＨＡＲは、約２～約４の範囲である。ＨＡＲは、質量分析、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法、ＥＬＩＳＡアッセイ、及び／またはＨＰＬＣなどの従来の手段によって特性化され得る。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、抗原結合タンパク質が異なる数の異質部位にコンジュゲートされている異種コンジュゲート（「従来の」とも称される）である。いくつかの実施形態では、異種コンジュゲートは、コンジュゲートのガウス分布または準ガウス分布に従い、この場合、分布は、平均超でコンジュゲートされたいくつかの抗原結合タンパク質及び平均未満でコンジュゲートされたいくつかの抗原結合タンパク質を伴う平均異質部位負荷値を中心とする。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、相当な割合の抗原結合タンパク質が、定義された数の異質部位にコンジュゲートされた同種コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、同種コンジュゲートは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のＨＡＲを含む。いくつかの実施形態では、同種コンジュゲートは、２、４、６、または８のＨＡＲを含む。好ましい実施形態では、同種コンジュゲートは、４のＨＡＲを含む。好ましい実施形態では、同種コンジュゲートは、２のＨＡＲを含む。いくつかの実施形態では、同種コンジュゲートは、定義されたＨＡＲを有する７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９以上の、または１００パーセントのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、同種コンジュゲートは、定義されたＨＡＲを有する約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、同種コンジュゲートは、定義されたＨＡＲを有する少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントのコンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、同種コンジュゲートは、ガウスまたは準ガウス分布ではないＨＡＲ分布を含む。いくつかの実施形態では、同種コンジュゲートの均一性は、クロマトグラム、例えば、ＨＰＬＣまたは任意の好適なクロマトグラフィーによって決定される。いくつかの実施形態では、クロマトグラムは、ＨＩＣクロマトグラムである。同種コンジュゲートは、部位特異的コンジュゲーションによって生成され得る。
いくつかの実施形態では、異質部位は、部位特異的様式で抗原結合タンパク質（例えば、抗体）にコンジュゲートされる。様々な部位特異的コンジュゲーション法、例えば、チオマブ（ｔｈｉｏｍａｂ）もしくはＴＤＣまたは不対システイン残基でのコンジュゲーション（Ｊｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：９２５－９３２；Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１４：１５０１－１５１６；Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：１８４－９）；チオール橋リンカー（Ｂｅｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１２：３９８６－９８）；トランスグルタミナーゼを使用するグルタミンでのコンジュゲーション（Ｄｅｎｎｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．１０４５：２０５－１５；Ｄｅｎｎｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２５：５６９－７８）；操作された非天然アミノ酸残基でのコンジュゲーション（Ａｘｕｐ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４－１６１０１－６；Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１：１７６６－７１；ＶａｎＢｒｕｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２６：２２４９－６０；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２５：３５１－６１）；セレノシステインコンジュゲーション（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｃｅｌｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２４：４３３－４４２）；グリカン媒介コンジュゲーション（Ｏｋｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２４：１６５０－５）；ガラクトースまたはＧａｌＮＡｃアナログでのコンジュゲーション（Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ ａｎｄ Ｑａｓｂａ（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：２０８３３－９；ｖａｎ Ｇｅｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２６：２２３３－４２）；グリカン操作を介するもの（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２５：５１０－２０；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １２：１７０２－１７２１）；短いペプチドタグを介するもの、例えば、グルタミンタグの操作またはソルターゼ－Ａ媒介ペプチド転移（Ｓｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０：１６１－７；Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １０：ｅ０１３１１７７）；及びアルデヒドタグを介するもの（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６：３０００－５）が当該技術分野で知られている。
コンジュゲート（例えば、ＡＤＣ）の予測不可能性
抗体プロファイル、または薬物ペイロードプロファイルに単に基づいて、どの抗体－薬物コンジュゲートが臨床適用にとって十分に安全で有効となるかを事前に予測することはできない。例えば、特定の薬物ペイロードは、１つの標的に仕向けられた抗体にコンジュゲートされた場合は完全に良好に機能し得るが、異なる標的に仕向けられた抗体にコンジュゲートされた場合、またはさらに同じ標的に仕向けられた異なる抗体にコンジュゲートされた場合、ほぼ同様には機能しない場合がある。なぜ異なる抗体－薬物コンジュゲートがｉｎ ｖｉｖｏで異なる抗腫瘍活性を示すのかは、新たな抗体－薬物コンジュゲートの設計において正確な予測を可能にするほど十分にはよく理解されていない。多くの要因の予測不能な相互作用が、役割を果たすと推測される。これらの要因には、例えば、標的抗原に対する抗体－薬物コンジュゲートの結合親和性、コンジュゲートが固形腫瘍に浸透する能力、及び毒性を引き起こさない腫瘍への適切な曝露のための循環中の半減期が含まれ得る。
複雑性及び予測不可能性は、抗体親和性だけで十分に実証される。高い親和性を有する抗体または抗体－薬物コンジュゲートは、より良好な細胞取り込みを伴い、これは、細胞内で放出されるより高いレベルの細胞傷害性ペイロードをもたらす。親和性が高いほど、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増強することも知られている。これらのすべての属性は、抗体－薬物コンジュゲートの細胞死滅特性に有利である。しかしながら、抗体または抗体－薬物コンジュゲートの高親和性は、「抗原バリア効果」を介して効率的な腫瘍浸透を妨げ得ることも知られており、ｉｎ ｖｉｖｏで強力な抗腫瘍活性を達成するために、抗体－薬物コンジュゲートの親和性は、高すぎずまたは低すぎず、ちょうど適正でなければならないことを示唆している。現在のところ、抗体－薬物コンジュゲートにとってどのくらいの親和性のレベルが最も有効なのかまたは有効なのかを予測する方法は知られていない。
また、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性は、リンカー及びペイロード単独のメカニズムによって予測することはできない。例えば、Ｏ．Ａｂ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１４（＆）：１６０５－１６１３（２０１５）は、前臨床がんモデルで試験した場合、異なるリンカーを介して同じ抗チューブリン毒素にコンジュゲートされた同じ抗体が劇的に異なる抗腫瘍活性を示したことを実証した。この例は、２つのリンカーの化学構造が非常に類似しているので特に驚くべきことである。その上、優れたコンジュゲートに存在するリンカーは、親水性部位を含有していた。親水性代謝産物は通常、膜透過性がより低く、リソソーム（コンジュゲート分解の部位）からの流出がより遅く、放出されるペイロードの抗チューブリン活性の遅延をもたらすと考えられている。この知見は、ペイロード送達の「理想的な」動態を主張しているが、今日まで、そのような動態を構成するものについての洞察はない。この複雑性に加わるのは、たとえ特定の細胞タイプについて定義されていても、ペイロード送達の理想的な動態がすべての細胞タイプに適用されるかどうかという未解決の問題である。よって、単にリンカーまたはペイロードの化学的組成から最も有効なｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を予測することは不可能である。
組成物、薬学的組成物及び製剤
本開示の抗原結合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、またはコンジュゲートを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの態様における組成物は、単離された及び／または精製された形態の抗原結合タンパク質を含む。いくつかの態様では、組成物は、本開示の抗原結合タンパク質の単一のタイプ（例えば、構造）を含み、または本開示の２つ以上の抗原結合タンパク質の組み合わせを含み、その組み合わせは、異なるタイプ（例えば、構造）の２つ以上の抗原結合タンパク質を含む。
いくつかの態様では、組成物は、例えば、所定の温度、例えば、室温で抗原結合タンパク質を安定化させること、有効期間を延長すること、分解、例えば、酸化プロテアーゼ介在性分解を減少させること、抗原結合タンパク質の半減期を延長することなどにより、抗原結合タンパク質の化学－物理特性を向上させる薬剤を含む。いくつかの態様では、組成物は、任意に本開示の抗原結合タンパク質と混合してまたは抗原結合タンパク質にコンジュゲートして、本明細書で開示される薬剤のいずれかを異質部位またはコンジュゲート部分として含む。
本開示の様々な態様では、組成物はさらに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、またはコンジュゲート（以下、「活性剤」と称される）は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と共に活性剤を含む薬学的組成物に製剤化される。この点に関して、本開示はさらに、対象、例えば、哺乳動物への投与のために意図された活性剤を含む薬学的組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、活性剤は、患者への投与に好適な純度レベルで薬学的組成物に存在する。いくつかの実施形態では、活性剤は、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の純度レベル、及び薬学的に許容可能な希釈剤、担体または賦形剤を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００１～約３０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で活性剤を含有する。
様々な態様では、薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルション、例えば、油／水または水／油エマルション、及び様々なタイプの湿潤剤のいずれかを含む。その用語はまた、米国連邦政府の規制当局によって承認された、またはヒトを含む動物における使用のための米国薬局方に列挙された薬剤のいずれかを包含する。
薬学的組成物は、例えば、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル推進剤、排気剤、アルカリ化剤、固化防止剤、抗凝固剤、抗菌防腐剤、抗酸化剤、防腐剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗浄剤、希釈剤、殺菌剤、崩壊剤、分散剤、溶解向上剤、色素、皮膚軟化剤、乳化剤、エマルション安定化剤、充填剤、フィルム形成剤、風味増強剤、風味剤、流動性向上剤、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、滑沢剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性ビヒクル、有機基剤、トローチ基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、防腐剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、座剤基剤、表面活性剤、界面活性剤、懸濁剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、張性剤、毒性剤、粘度上昇剤、吸水剤、水混和性共溶媒、硬水軟化剤、または湿潤剤を含む任意の薬学的に許容可能な成分を含み得る。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）（その全体が参照により組み込まれる）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）（その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
様々な態様では、薬学的組成物は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性である製剤化物質を含む。特定の実施形態では、薬学的組成物は、活性剤及び１つ以上の薬学的に許容可能な塩；ポリオール；界面活性剤；浸透圧バランス調整剤；張性剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；増量剤；凍結乾燥保護剤；消泡剤；キレート剤；防腐剤；着色剤；鎮痛剤；またはさらなる薬学的薬剤を含む。様々な態様では、薬学的組成物は、任意に、薬学的に許容可能な塩；浸透圧バランス調整剤（張性剤）；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；増量剤；凍結乾燥保護剤；消泡剤；キレート剤；防腐剤；着色剤；及び鎮痛剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の賦形剤に加えて、１つ以上のポリオール及び／または１つ以上の界面活性剤を含む。
所定の実施形態では、薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、芳香、滅菌状態、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または浸透を調節、維持または保持するための製剤化物質を含有し得る。そのような実施形態では、好適な製剤化物質には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖；及び他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トライトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）；安定性向上剤（スクロースまたはソルビトールなど）；張力向上剤（アルカリ金属ハライド、好ましくは塩化ナトリウムまたはカリウム、マンニトールソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／または薬学的アジュバントが含まれるがこれらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８″ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
薬学的組成物は、生理的に適合性のｐＨを達成するように製剤化され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物のｐＨは、例えば、約４もしくは約５～約８．０または約４．５～約７．５または約５．０～約７．５の間であり得る。様々な実施形態では、薬学的組成物のｐＨは、５．５～７．５の間である。
本開示は、薬学的組成物を生成する方法を提供する。様々な態様では、方法は、抗原結合タンパク質、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、またはそれらの組み合わせを薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせることを含む。
投与経路
本開示に関して、活性剤、またはそれを含む薬学的組成物は、任意の好適な投与経路を介して対象に投与され得る。例えば、活性剤は、非経口、鼻、経口、肺、局所、膣、または直腸投与を介して対象に投与され得る。投与経路に関する以下の論述は、単に様々な実施形態を説明するために提供され、いかなる様式においても範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張無菌注射液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。用語「非経口」は、消化管を介してではなく、皮下、筋肉内、髄腔内、または静脈内などのいくつかの他の経路によることを意味する。本開示の活性剤は、薬学的に許容可能な界面活性剤、例えば、石鹸または洗浄剤、懸濁剤、例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルロース、または乳化剤及び他の薬学的アジュバントを添加したまたは添加していない水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、アルコール、例えば、エタノールまたはヘキサデシルアルコール、グリコール、例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ケタール、例えば、２，２－ジメチル－ｌ５３－ジオキソラン－４－メタノール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、またはアセチル化脂肪酸グリセリドを含む、滅菌液体または液体の混合物などの薬学的担体中の生理的に許容可能な希釈剤と共に投与され得る。
非経口製剤において使用され得る油には、石油、動物、植物、または合成油が含まれる。油の具体的な例には、ピーナツ、大豆、ゴマ、綿実、トウモロコシ、オリーブ、ペトロラタム、及び鉱物が含まれる。非経口製剤において使用するための好適な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。
非経口製剤において使用するための好適な石鹸には、脂肪アルカリ金属、アンモニウム、及びトリエタノールアミン塩が含まれ、好適な洗浄剤には、（ａ）例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、及びアルキルピリジニウムハライドなどのカチオン性洗浄剤、（ｂ）例えば、アルキル、アリール、及びオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセリドスルフェート、及びスルホスクシネートなどのアニオン性洗浄剤、（ｃ）例えば、脂肪アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマーなどの非イオン性洗浄剤、（ｄ）例えば、アルキル－β－アミノプロピオネート、及び２－アルキル－イミダゾリン第４級アンモニウム塩などの両性洗浄剤、ならびに（ｅ）それらの混合物が含まれる。
非経口製剤は、いくつかの実施形態では、溶液中に約０．５％～約２５重量％の本開示の活性剤を含有する。防腐剤及び緩衝液が使用され得る。注射部位での刺激を最小化または排除するために、そのような組成物は、約１２～約１７の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上の非イオン性界面活性剤を含有し得る。そのような製剤における界面活性剤の量は典型的には、約５～約１５重量％の範囲である。好適な界面活性剤には、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、例えば、モノオレイン酸ソルビタン及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される、疎水性ベースとエチレンオキシドとの高分子量付加物が含まれる。いくつかの態様における非経口製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量または複数用量の密封容器で提供され、注射のために、使用直前に、滅菌液体賦形剤、例えば、水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。いくつかの態様における用時調製の注射溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製される。
注射用製剤は本開示に従う。注射用組成物のための有効な薬学的担体の要件は、当業者によく知られている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８－２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６）参照）。
投薬量
本開示の活性剤は、腫瘍成長を阻害する方法、ならびにがんを処置または予防する方法を含む、本明細書にさらに記載される他の方法において有用であると考えられる。本開示の目的のため、投与される活性剤の量または用量は、合理的な時間枠にわたって対象または動物において、例えば、治療的または予防的反応をもたらすのに十分であるべきである。例えば、本開示の活性剤の用量は、投与時から約１～４分、１～４時間または１～４週またはそれ以上、例えば、５～２０週またはそれ以上の期間、本明細書に記載されるがんを処置するのに十分であるべきである。所定の実施形態では、時間は、さらに長い可能性がある。用量は、特定の活性剤の有効性及び動物（例えば、ヒト）の状態、ならびに処置される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
投与用量を決定するための多くのアッセイが当該技術分野において知られている。本明細書における目的のため、所与の用量の本開示の活性剤の哺乳動物への投与によりがんが処置される程度を、哺乳動物のセットの中の哺乳動物と比較することを含むアッセイ（その各々のセットには異なる用量の活性剤が与えられる）が、哺乳動物に投与される開始用量を決定するために使用され得る。所定の用量の投与によりがんが処置される程度は、例えば、マウス異種移植モデルにおいて活性剤で達成される腫瘍退縮の程度によって表され得る。腫瘍退縮をアッセイする方法は、当該技術分野で知られており、本明細書において実施例で記載されている。
本開示の活性剤の用量はまた、本開示の特定の活性剤の投与に付随し得る任意の有害な副作用の存在、特質及び程度によって決定される。典型的には、担当医は、年齢、体重、全般的健康状態、食餌、性別、投与される本開示の活性剤、投与経路、及び処置されている病態の重症度などの多様な要素を考慮して、各々の個々の患者を処置するために本開示の活性剤の投薬量を決定する。例として及び本開示を限定することを意図しておらず、本開示の活性剤の用量は、約０．０００１～約１ｇ／処置されている対象の体重ｋｇ／日、約０．０００１～約０．００１ｇ／体重ｋｇ／日、または約０．０１ｍｇ～約１ｇ／体重ｋｇ／日であり得る。
制御放出製剤
いくつかの実施形態では、投与される体内に本開示の活性剤が放出される様式が時間及び体内の位置に応じて制御されるように、本明細書に記載の活性剤はデポ形態に改変され得る（例えば、米国特許番号４，４５０，１５０参照）。本開示の活性剤のデポ形態は、例えば、活性剤及び多孔性物質または非多孔性物質、例えば、ポリマーを含む埋込可能な組成物であり得、その活性剤は、その物質に内包されているまたはその全体に拡散している、及び／または非多孔性物質の分解により拡散している。次いでデポ剤は、対象の体内の所望の位置に埋め込まれ、活性剤は、既定の速度で埋込物から放出される。
所定の態様における活性剤を含む薬学的組成物は、任意のタイプのｉｎ ｖｉｖｏ放出プロファイルを有するように改変される。いくつかの態様では、薬学的組成物は、即時放出、制御放出、持続放出、延長放出、遅延放出、または二相性放出製剤である。制御放出のためにペプチドを製剤化する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ ３７４：４６－５２（２００９）ならびに国際特許出願公開番号ＷＯ２００８／１３０１５８、ＷＯ２００４／０３３０３６；ＷＯ２０００／０３２２１８；及びＷＯ１９９９／０４０９４２を参照されたい。
本組成物は、例えば、ミセルもしくはリポソーム、またはいくつかの他の内包形態をさらに含み得、または長期貯法及び／または送達効果を提供するために延長放出形態で投与され得る。
使用
本開示の抗原結合タンパク質は、腫瘍成長を阻害するのに有用である。特定の理論に縛られることなく、本明細書で提供される抗原結合タンパク質の阻害作用により、そのような実体は、がんを処置する方法において有用となる。
したがって、本明細書では、対象における腫瘍成長を阻害する方法及び対象における腫瘍サイズを減少させる方法が提供される。様々な実施形態では、方法は、対象において腫瘍成長を阻害するまたは腫瘍サイズを減少させるのに有効な量で本開示の薬学的組成物を対象に投与することを含む。様々な態様では、卵巣腫瘍、黒色腫腫瘍、膀胱腫瘍、または子宮内膜腫瘍の成長が阻害される。様々な態様では、卵巣腫瘍、黒色腫腫瘍、膀胱腫瘍、または子宮内膜腫瘍のサイズが減少する。
本明細書で使用される場合、用語「阻害する」または「減少させる」及びそれらから派生する単語は、１００％または完全な阻害または減少ではない場合がある。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有すると認識する阻害または減少の程度は様々である。この点に関して、本開示の抗原結合タンパク質は、任意の量またはレベルまで腫瘍成長を阻害しまたは腫瘍サイズを減少させ得る。様々な実施形態では、本開示の方法によって提供される阻害は、少なくともまたは約１０％の阻害（例えば、少なくともまたは約２０％の阻害、少なくともまたは約３０％の阻害、少なくともまたは約４０％の阻害、少なくともまたは約５０％の阻害、少なくともまたは約６０％の阻害、少なくともまたは約７０％の阻害、少なくともまたは約８０％の阻害、少なくともまたは約９０％の阻害、少なくともまたは約９５％の阻害、少なくともまたは約９８％の阻害）である。様々な実施形態では、本開示の方法によって提供される減少は、少なくともまたは約１０％の減少（例えば、少なくともまたは約２０％の減少、少なくともまたは約３０％の減少、少なくともまたは約４０％の減少、少なくともまたは約５０％の減少、少なくともまたは約６０％の減少、少なくともまたは約７０％の減少、少なくともまたは約８０％の減少、少なくともまたは約９０％の減少、少なくともまたは約９５％の減少、少なくともまたは約９８％の減少）である。
また、本明細書では、がん、例えば、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがんを有する対象を処置する方法が提供される。様々な実施形態では、方法は、対象におけるがんを処置するのに有効な量で本開示の薬学的組成物を対象に投与することを含む。
本明細書における目的のため、本明細書に開示される方法のがんは、任意のがん、例えば、リンパ系または血流を介して身体の別の部位に広がり得る異常で無秩序な細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性成長または腫瘍であり得る。いくつかの態様におけるがんは、急性リンパ球性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨癌、脳癌、乳癌、肛門、肛門管、または肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢、または胸膜の癌、鼻、鼻腔、または中耳の癌、口腔の癌、外陰の癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性癌、結腸癌、食道癌、子宮頸癌、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、網、及び腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌（例えば、腎細胞癌（ＲＣＣ））、小腸癌、軟部組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、及び膀胱癌からなる群から選択されるものである。特定の態様では、がんは、頭頸部、卵巣、子宮頸部、膀胱及び食道癌、膵臓、胃腸癌、胃、乳房、子宮内膜及び大腸癌、肝細胞癌、膠芽腫、膀胱、肺癌、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、細気管支肺胞上皮癌からなる群から選択される。様々な態様では、がんは、膵臓癌、胃腸癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、子宮内膜癌である。様々な態様では、がんは、ＣＬＤＮ１８．２の中程度から高い発現を特徴とする任意のがんである。例えば、図１～図２を参照されたい。様々な態様では、がんは、急性骨髄性白血病、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胃癌、前立腺癌、黒色腫、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、子宮頸癌、肝臓癌、乳癌、腎臓明細胞癌、頭頸部癌、肉腫、腎臓嫌色素性癌、低悪性度神経膠腫、副腎皮質癌、膠芽腫、腎臓乳頭状細胞癌、肺扁平上皮癌、甲状腺癌、肺腺癌、膵臓癌、類内膜癌、子宮癌肉腫、または卵巣癌である。様々な態様では、がんは、膵臓癌、胃腸癌、膀胱癌、結腸癌、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、類内膜癌、子宮癌、肺癌、胃癌、乳癌頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）癌、及び子宮頸癌から選択される。
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、及びそれに関連する単語は、必ずしも１００％または完全な処置を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有すると認識する処置の程度は様々である。この点に関して、本開示のがんを処置する方法は、任意の量または任意のレベルの処置を提供し得る。さらに、本開示の方法によって提供される処置は、処置されているがんの１つ以上の状態または症状または兆候の処置を含み得る。また、本開示の方法によって提供される処置は、がんの進行を遅らせることを包含し得る。例えば、方法は、がんに対するＴ細胞活性または免疫反応を向上させること、腫瘍またはがんの成長を減少させること、腫瘍細胞の転移を減少させること、腫瘍またはがん細胞の細胞死を増加させることなどにより、がんを処置し得る。様々な態様では、方法は、少なくとも１日間、２日間、４日間、６日間、８日間、１０日間、１５日間、３０日間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、またはそれ以上、がんの発症または再発を遅延させる目的で処置する。様々な態様では、対象の生存期間を延長させる目的で処置する。
本開示の抗原結合タンパク質はまた、サンプルにおけるＣＬＤＮ１８．２を検出するためにまたはＣＬＤＮ１８．２陽性癌を診断するために使用され得る。そのため、本開示は、サンプルにおけるＣＬＤＮ１８．２を検出する方法を提供する。様々な実施形態では、方法は、サンプルを本明細書に記載される抗原結合タンパク質、コンジュゲート、または融合タンパク質と接触させること、及びＣＬＤＮ１８．２に結合した抗原結合タンパク質、コンジュゲートまたは融合タンパク質を含む免疫複合体についてアッセイすることを含む。本開示はまた、対象におけるＣＬＤＮ１８．２陽性癌を診断する方法を提供する。様々な実施形態では、方法は、対象から得られた細胞または組織を含む生物学的サンプルを本明細書に記載される抗原結合タンパク質、コンジュゲート、または融合タンパク質と接触させること、及びＣＬＤＮ１８．２に結合した抗原結合タンパク質、コンジュゲートまたは融合タンパク質を含む免疫複合体についてアッセイすることを含む。
対象
本開示のいくつかの実施形態では、対象は、マウス及びハムスターなどのＲｏｄｅｎｔｉａ目の哺乳動物、ならびにウサギなどのＬｏｇｏｍｏｒｐｈａ目の哺乳動物、ネコ（猫）及びイヌ（犬）を含むＣａｒｎｉｖｏｒａ目の哺乳動物、ウシ（牛）及びブタ（豚）を含むＡｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ目の哺乳動物、またはウマ（馬）を含むＰｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ目の哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物である。いくつかの態様では、哺乳動物は、Ｐｒｉｍａｔｅｓ目、Ｃｅｂｏｉｄｓ目、またはＳｉｍｏｉｄｓ目（サル）のものまたはＡｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ目（ヒト及び類人猿）のものである。いくつかの態様では、哺乳動物は、ヒトである。
キット
いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、キットで提供される。様々な態様では、キットは、抗原結合タンパク質（複数可）を単位用量として含む。本明細書の目的のため「単位用量」は、好適な担体に分散した個別の量を指す。様々な態様では、単位用量は、対象に所望の効果、例えば、腫瘍成長の阻害、腫瘍サイズの減少、がんの処置を提供するのに十分な量である。したがって、本明細書では、任意に単位用量で提供される本開示の抗原結合タンパク質を含むキットが提供される。様々な態様では、キットは、いくつかの単位用量、例えば、１週間または１ヶ月供給の単位用量を含み、任意に、その各々は、個別に包装されているか、またはそうでなければ他の単位用量から分離されている。いくつかの実施形態では、キット／単位用量の構成要素は、患者への投与のための指示書と共に包装される。いくつかの実施形態では、キットは、患者への投与のための１つ以上のデバイス、例えば、針及びシリンジなどを含む。いくつかの態様では、本開示の抗原結合タンパク質、その薬学的に許容可能な塩、抗原結合タンパク質を含むコンジュゲート、または抗原結合タンパク質を含む多量体もしくは二量体は、すぐに使用できる形態、例えば、シリンジ、静脈内袋などに予め包装される。いくつかの態様では、キットは、本明細書に記載されるもののいずれかを含む、他の治療剤もしくは診断剤または薬学的に許容可能な担体（例えば、溶媒、緩衝液、希釈剤など）をさらに含む。特定の態様では、キットは、化学療法または放射線療法で使用される薬剤、例えば、治療剤と共に本開示の抗原結合タンパク質を含む。
様々な実施形態
本開示の様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＬＤＮ１８．２タンパク質（配列番号１）に結合し、（ａ）抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の細胞外ループ１（ＥＬ１）に結合し、ＣＬＤＮ１８．２のＥＣＤの細胞外ループ２（ＥＬ２）には結合しない；または（ｂ）クローディン１８．１（ＣＬＤＮ１８．１）、または任意の他のクローディンタンパク質には結合せず、参照抗体のものよりも１．５倍高い親和性でＨＵＰＴ４細胞によって内因的に発現したＣＬＤＮ１８．２に結合する；または（ｃ）それらの組み合わせである。様々な実施形態では、本明細書における抗原結合タンパク質は、参照抗体よりも少なくとも１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０倍高いまたはそれ以上の親和性でＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞（例えば、ＨＵＰＴ４または他の細胞）に結合する。
様々な例では、抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２のＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＦＹＦＴＬ（配列番号４）、ＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＫ（配列番号５）、ＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣ（配列番号６）またはＣＲＧＹＦＴＬＬＦＬＰＡＭＬＱＡＶＲ（配列番号７）のアミノ酸配列内のエピトープに結合する。
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ａに示される重鎖（ＣＤＲ）１アミノ酸配列または配列番号６４、８８、６９、８９、７２、７５、９１、９４、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０６、１０９からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｂ）表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号６５、６７、７０、９０、７３、７６、９２、７３、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０７、１１０からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｃ）表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号６６、６８、７１、７７、７４、７７、９３、７４、１０５、１０８、１１１からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｄ）表Ａに示される軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列または配列番号７８、８１、８２、８６、１１４、１２０、１２３、１２６からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｅ）表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号７９、１１２、７９、８４、１１６、１１８、１１９、１２９、１２１、１２４、１２７からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｆ）表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号８０、８３、１１３、８５、８７、１１５、１１７、１２２、１２５、１２８からなる群から選択される配列または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約９０％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｇ）（ａ）～（ｆ）の任意の２つ以上の組み合わせを含む。
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表Ａに示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに表Ａに示される重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１または２つを含む。いくつかの例では、抗原結合タンパク質は、表Ａに示される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに表Ａに示される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１または２つを含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号７８、７９、８０、６４、６５、６６；（ｂ）配列番号８１、１１２、８０、８８、６５、６６；（ｃ）配列番号８１、７９、８０、６４、６７、６８；（ｄ）配列番号８２、７９、８３、３９、７０、７１；（ｅ）配列番号８１、７９、１１３、８９、９０、７７；（ｆ）配列番号８１、８４、８５、７２、７３、７４；（ｇ）配列番号８６、７９、８７、７５、７６、７７；（ｈ）配列番号１１４、７９、１１５、９１、９２、９３；（ｉ）配列番号８１、１１６、１１７、９４、７３、７４；（ｊ）配列番号８１、１１８、１１７、９５、９６、７４；（ｋ）配列番号８１、１１９、１１７、９７、９８、７４；（ｌ）配列番号８１、１１８、８５、９９、１００、７４；（ｍ）配列番号８１、１２９、１１７、１０１、１０２、７４；（ｎ）配列番号１２０、１２１、１２２、１０３、１０４、１０５；（ｏ）配列番号１２３、１２４、１２５、１０６、１０７、１０８；及び（ｐ）配列番号１２６、１２７、１２８、１０９、１１０、１１１からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む。
様々な態様では、抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ｂに示される重鎖可変領域アミノ酸配列または配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、２、３４、３６、３８及び４０からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約９０％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｂ）表Ｂに示される軽鎖可変領域アミノ酸配列または配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約９０％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ａ）及び（ｂ）の両方を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号１０及び１１；（ｂ）配列番号１２及び１３；（ｃ）配列番号１４及び１５；（ｄ）配列番号１６及び１７；（ｅ）配列番号１８及び１９；（ｆ）配列番号２０及び２１；（ｇ）配列番号２２及び２３；（ｈ）配列番号２４及び２５；（ｉ）配列番号２６及び２７；（ｊ）配列番号２８及び２９；（ｋ）配列番号３０及び３１；（ｌ）配列番号３２及び３３；（ｍ）配列番号３４及び３５；（ｎ）配列番号３６及び３７；（ｏ）配列番号３８及び３９；（ｐ）配列番号４０及び４１からなる群から選択されるアミノ酸配列の対を含む。
様々な実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ｃ、表Ｄ、表６、表８、表９、表１０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号４２、４６、４９、５２、５５、５６、５７、及び１３１からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｂ）表Ｃ、表Ｄ、表６、表８、表９、表１０に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号４３～４５、４７～４８、５０～５１、５３～５４、１３０、１３２、１４７、１４９、及び１５０からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含む。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、表Ｄに列挙されるアミノ酸配列の対を含む。
様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号４２及び４３；（ｂ）配列番号４２及び４４；（ｃ）配列番号４２及び４５；（ｄ）配列番号４６及び４７；（ｅ）配列番号４６及び４８；（ｆ）配列番号１３１及び１４９；（ｇ）配列番号１３１及び１５０；（ｈ）配列番号５２及び５３；（ｉ）配列番号５２及び５４；（ｊ）配列番号５５及び５３；（ｋ）配列番号５５及び５４；（ｌ）配列番号５６及び５３；（ｍ）配列番号５６及び５４；（ｎ）配列番号５７及び５０；（ｏ）配列番号５７及び５１；（ｐ）配列番号４９及び５０；（ｑ）配列番号４９及び５１；（ｒ）配列番号４２及び１３０；（ｓ）配列番号１３１及び１４７；及び（ｔ）配列番号１３１及び１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列の対を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ｆｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、非フコシル化グリカンを含むＦｃポリペプチドを含む。
様々な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、抗体、例えば、モノクローナル抗体である。様々な例では、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧである。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、軟寒天３Ｄ増殖アッセイにおいて少なくとも約５０％のコロニー成長を阻害し、またはヒトがん細胞が注射された異種移植マウスにおいて腫瘍成長を阻害する。様々な態様では、抗原結合タンパク質は、卵巣癌細胞、黒色腫癌細胞、膀胱癌細胞、または子宮内膜癌細胞が注射された異種移植マウスにおいて腫瘍成長を阻害する。様々な例では、抗原結合タンパク質は、卵巣癌細胞、膀胱癌細胞、または子宮内膜癌細胞が注射された異種移植マウスにおいて少なくとも５０％の腫瘍成長を阻害する。
本開示は、ＣＬＤＮ１８．２及び第２の抗原に結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のいずれか１つである、二重特異性抗原結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、（ａ）表Ｂ、表Ｃ、表Ｄ、表６、表８、表９、表１０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ、表Ｄ、表６、表８、表９、表１０に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含む。いくつかの実施形態では、バリアント配列は、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、Ｆｃポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、非フコシル化グリカンを含むＦｃポリペプチドを含む。
様々な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２及び第２の抗原に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、第２の抗原に特異的な抗体の抗原結合断片を含む。様々な実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞によって発現される細胞表面タンパク質、任意にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素、例えば、ＣＤ３である。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３である。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３Ｅである。
様々な実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞活性化を補助する共刺激分子、例えば、ＣＤ４０または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。様々な実施形態では、第２の抗原は、Ｆｃ受容体、任意に、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃ－アルファ受容体、またはＦｃ－イプシロン受容体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＣＤ６４（Ｆｃ－ガンマＲＩ）、ＣＤ３２（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＡ）、ＣＤ１６Ａ（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＩＡ）、ＣＤ１６ｂ（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ２３（Ｆｃ－イプシロンＲＩＩ）、ＣＤ８９（Ｆｃ－イプシロンＲＩ）、Ｆｃα／μＲ、またはＦｃＲｎである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６Ａである。
様々な実施形態では、第２の抗原は、免疫チェックポイント分子、例えば、免疫チェックポイント経路に関与するタンパク質、任意に、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、またはＳＩＧＬＥＣ７である。いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＣＴＬＡ４である。様々な実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本開示のＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、表Ｂ、表Ｃ、表Ｄ、表６、表８、図１３、または図１７）のいずれかのｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ）２’を含む。
様々な実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、表１１または配列番号１４３、１４４、１４５、または１４６に示される配列、または１～５つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列を含む抗原結合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、バリアント配列は、少なくともまたは約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。様々な実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、ナノボディ、ダイアボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、またはＨＳＡｂｏｄｙの構造を含む。本開示は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質及び異質部位を含むコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号４２及び配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、細胞傷害剤または化学療法剤を含む。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、チューブリン重合を阻害することによって細胞分裂を阻害する抗有糸分裂剤である。いくつかの実施形態では、抗有糸分裂剤は、アウリスタチンである。いくつかの実施形態では、アウリスタチンは、ＭＭＡＥである。
様々な実施形態では、本開示のコンジュゲートは、切断可能なリンカーを介して抗原結合タンパク質にコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢである。
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、モノクローナル抗体である抗原結合タンパク質を含み、任意にモノクローナル抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。
様々な実施形態では、本開示のコンジュゲートは、１～８の範囲の抗原結合タンパク質当たりのコンジュゲートされた薬剤の単位の平均数を有し、好ましくは抗原結合タンパク質当たりのコンジュゲートされた薬剤の単位の平均数は、３～８の範囲内である。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、異種コンジュゲートである。他の実施形態では、コンジュゲートは、同種コンジュゲートである。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、異質部位または薬剤を含み、薬剤は、抗原結合タンパク質の特定の部位でコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、特定の部位は、不対システイン残基である。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥにコンジュゲートされた配列番号４２及び配列番号４５に示されるアミノ酸を含むポリペプチドを含む。
本開示はまた、本明細書に記載の抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を提供する。本開示はさらに、本開示の抗原結合タンパク質、二重特異性抗原結合タンパク質、コンジュゲート、または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、本開示の抗原結合タンパク質、コンジュゲート、または融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターを提供する。本開示はさらに、本開示の核酸またはベクターを含む宿主細胞を提供する。
本開示は、クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に結合する抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法であって、（ｉ）細胞培地において本開示の宿主細胞を培養することであって、宿主細胞は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、培養すること、及び（ｉｉ）細胞培地から抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質を収穫することを含む、方法を提供する。また、クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に結合する抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を生成する方法であって、（ｉ）細胞培地において本開示の宿主細胞を培養することであって、宿主細胞は、本開示の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、培養すること、及び（ｉｉ）細胞培地から融合タンパク質を収穫することを含む、方法が提供される。
本開示はさらに、薬学的組成物を生成する方法であって、本開示の抗原結合タンパク質、二重特異性抗原結合タンパク質、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、またはそれらの組み合わせ、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を組み合わせることを含む、方法を提供する。また、本開示の抗原結合タンパク質、二重特異性抗原結合タンパク質、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞、またはそれらの組み合わせ、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。
本明細書では、ＣＬＤＮ１８．２を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、がんを処置するのに有効な量で本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。また、対象における腫瘍成長を阻害する方法であって、腫瘍成長を阻害するのに有効な量で本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。本開示は、対象における腫瘍サイズを減少させる方法であって、腫瘍サイズを減少させるのに有効な量で本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。さらに、対象におけるがんの再発を予防する方法であって、がんの再発を予防するのに有効な量で本明細書に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法が提供される。
本開示は、サンプルにおけるクローディン１８．２（ＣＬＤ１８．２）を検出する方法であって、サンプルを本開示の抗原結合タンパク質、二重特異性抗原結合タンパク質、コンジュゲート、または融合タンパク質と接触させること、及びＣＬＤ１８．２に結合した抗原結合タンパク質、コンジュゲートまたは融合タンパク質を含む免疫複合体についてアッセイすることを含む、方法を提供する。また、本明細書では、対象におけるクローディン１８．２（ＣＬＤ１８．２）陽性癌を診断する方法であって、対象から得られた細胞または組織を含む生物学的サンプルを本開示の抗原結合タンパク質、二重特異性抗原結合タンパク質、コンジュゲート、または融合タンパク質と接触させること、及びＣＬＤ１８．２に結合した抗原結合タンパク質、コンジュゲートまたは融合タンパク質を含む免疫複合体についてアッセイすることを含む、方法が提供される。
本開示はまた、ＣＬＤＮ１８．２の低過剰発現体と診断された対象におけるがんを処置する方法を提供する。様々な実施形態では、方法は、がんの再発を予防するのに有効な量で本開示の薬学的組成物を対象に投与することを含む。いくつかの態様では、投与は、腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導し、任意に、投与は、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞におけるアポトーシスを誘導する。様々な態様では、対象は腫瘍を有し、腫瘍は、４つの群：高発現体、中発現体、低発現体、及び非発現体のうちの１つに半定量的に分類される。様々な例では、高発現体は、１２ｌｏｇ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ（ＦＰＫＭ）超のＣＬＤＮ８．２ ＲＮＡとして定義され、その場合、ＣＬＤＮ８．２ ＲＮＡはＲＮＡＳｅｑによって測定され、またはＣＬＤＮ１８．２タンパク質レベルは、免疫組織化学（ＩＨＣ）で測定した場合に３＋超である。様々な例では、中発現体は、１０ｌｏｇ ＦＰＫＭ超のＣＬＤＮ８．２ ＲＮＡとして定義され、その場合、ＣＬＤＮ１８．２ ＲＮＡはＲＮＡＳｅｑによって測定され、またはＣＬＤＮ１８．２タンパク質レベルは、ＩＨＣで測定した場合に２＋超である。様々な例では、低発現体は、６ｌｏｇ ＦＰＫＭ超のＣＬＤＮ１８．２ ＲＮＡとして定義され、その場合、ＣＬＤＮ８．２ ＲＮＡはＲＮＡＳｅｑによって測定され、またはＣＬＤＮ１８．２タンパク質レベルは、ＩＨＣで測定した場合に１＋超である。様々な例では、非発現体は、６ｌｏｇ ＦＰＫＭ未満のＣＬＤＮ８．２ ＲＮＡとして定義され、その場合、ＣＬＤＮ１８．２ ＲＮＡはＲＮＡＳｅｑによって測定され、またはＣＬＤＮ１８．２タンパク質レベルは、ＩＨＣ検出限度未満である。様々な態様では、前記腫瘍を有する対象も同様に、ＣＬＤＮ１８．２の高発現体、中発現体、低発現体、または、非発現体として記載される。
本開示を単に例示するために以下の実施例を提供するが、いかなる様式においてもその範囲を限定するものではない。
実施例１
この例は、異なる細胞及び組織源におけるＣＬＤＮ１８．２のＲＮＡレベルの分析を実証する。
異なる供給源物質におけるＣＬＤＮ１８．２の発現についてのベースラインを確立するために、患者サンプル及びＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＴＯＲＬ）によって作製された細胞株におけるＣＬＤＮ１８．２発現の発現レベルをアッセイした。
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）によって管理されているＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースに含まれる情報を利用して患者サンプルにおけるＣＬＤＮ８．２ ＲＮＡのレベルを測定した。コモンファンドによって維持されているＧｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥＸ）データベースにおける情報を使用して正常な組織におけるＣＬＤＮ１８．２レベルを測定した。ＧＴＥＸデータベースからの組織の分析は、ＣＬＤＮ１８．２が、他の組織の中でも、肺、胃、前立腺、結腸、膵臓、及び乳房を含む、様々な部位において検出可能であることを示している。
Ａｇｉｌｅｎｔ ４４Ｋマイクロアレイ（４ｘ４４Ｋアレイチップ，Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）及びＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）アッセイを使用してＴＯＲＬがん細胞株においてＣＬＤＮ１８．２発現レベルを測定した。ＢＧＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によってそれらの「定量用ＲＮＡＳｅｑ」サービスを使用してＲＮＡＳｅｑが実施された。図１及び図２に示されているように、上部胃腸（ＧＩ）、膵臓及び結腸癌細胞は、最高レベルのＣＬＤＮ１８．２を発現したが、ＣＬＤＮ１８．２発現レベルは、頭頸部、黒色腫、乳房、肺、前立腺、肉腫及びリンパ腫がん細胞において検出可能であった。
図３は、ＣＬＤＮ１８．２高発現体であるそれらの細胞は、ＣＬＤＮ１８．１を発現しないことを示している。図４は、ＣＬＤＮ１８．２を発現するネイティブ細胞株の分布を示しており、ＣＬＤＮ１８．２ ＲＮＡ陽性細胞が陽性フローシグナルを有することを実証している。
実施例２
この例は、ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作された細胞の生成を実証する。
ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作されたモデルを生成した。これらのモデルを使用して本明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２抗体の有効性を決定した。簡潔には、ＣＬＤＮ１８．２をコードするヌクレオチド配列を、ＣＭＶプロモーター及び脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）の減弱化内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有するレンチウイルスベクターに操作導入した。ＩＲＥＳは、対象となる遺伝子（ＧＯＩ）のｃＤＮＡ（ＣＬＤＮ１８．２）とピューロマイシンｃＤＮＡとの間に配置した。ウッドチャック転写後制御要素（ＷＰＲＥ）をピューロマイシンｃＤＮＡの下流に配置した。ベクターはまた、ＧＦＰマーカー配列またはＭｙｃＤＤＫタグのいずれかを発現した。
発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞（スクリーニング目的のため）及びＮＩＨ３Ｔ３細胞（免疫付与のため）にウイルス的に形質導入した。陽性形質導入細胞を、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有する培地における生存に基づいて選択した。陽性細胞をサブクローニングして、ＣＬＤＮ１８．２過剰発現細胞の安定で均一なクローン集団を得た。
サブクローンＣＬＤＮ１８．２発現を、ＧＦＰタグを使用して蛍光顕微鏡法によって確認してＣＬＤＮ１８．２の過剰発現を確認した。
実施例３
この例は、参照抗体及び対照抗体の生成を実証する。
ベンチマーク（参照）ＣＬＤＮ１８．２特異的抗体及び対照抗体を、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域をＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）にクローニングして組換えマウスＩｇＧ２Ａキメラ抗体を生成することによって作製した。これらの抗体を、実施例５に記載の新たに生成されたＣＬＤＮ１８．２特異的抗体と並行して試験した。
簡潔には、対照及びベンチマーク抗体配列を含有するプラスミドを、製造業者のプロトコルに従ってＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現系（カタログ番号：Ａ２９１３３，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用してトランスフェクションした。細胞を、キットで提供された培地においてトランスフェクション後に１日目は３７℃及び８％ＣＯ２で、次いで３２℃及び５％ＣＯ２で培養した。ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）培地を１，０００ｇで１０分間、続いて５，０００ｇで３０分間の遠心分離によって清浄化することによって抗体を精製した。次いで上清を０．４５μｍフィルター、続いて０．２２μｍフィルターを使用して濾過した。その後、プロテインＡ／Ｇ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；カタログ＃２０４２４）を使用して製造業者のプロトコルに従って上清をアフィニティー精製に供した。ＥＬＩＳＡ精製の前に、培地における抗体価を大まかに決定して、ロードされた培地の量が樹脂結合容量の８０％未満を占めることを確認した。インキュベーション後、樹脂をＰＢＳで洗浄し、溶離緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ＃ ２１００４）で溶出させた。溶出画分を直ちにトリス緩衝液、ｐＨ８．０を添加することによって生理的ｐＨに調整した。その後、精製された抗体を、ＰＢＳ緩衝液中でＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｕｎｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ＃ＵＦＣ９００３２４）を使用して緩衝液交換及びタンパク質濃縮に供した。抗体濃度をＢＣＡタンパク質アッセイによって決定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクマシー染色を実施して抗体純度を試験した。精製されたタンパク質を分注し、－８０℃で長時間保存のために保存し、またはすぐに使用するために４℃で維持した。
抗体の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥとそれに続くクマシー染色によって非還元条件対還元条件下で検証した；非還元条件では、１５０ｋＤａ付近に１つの優勢なバンドが観察された一方で、還元条件下では、５０ｋＤａ及び２５ｋＤａの２つのバンドが観察された。
実施例４
この例は、高い内因性ＣＬＤＮ１８．２発現を有する細胞株の特性化を実証する。
がん細胞株のパネルを、ＦＡＣＳによってＣＬＤＮ１８．２のそれらの内因性発現について分析した。簡潔には、ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する細胞（例えば、実施例２に記載のＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、及び実施例１に記載されるように高レベルまたは低レベルでＣＬＤＮ１８．２を内因的に発現する細胞株を使用してＦＡＣＳによって標的に対する抗体の結合を検証した。ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞を参照または対照抗体（実施例３に記載されている）と共に氷上で３０分間インキュベーションし、洗浄後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７がコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ（最小ｘ反応性）抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃４０５３２２と共に氷上で３０分間インキュベーションした。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーター（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって蛍光を読み取った。
過剰発現した株を使用して対照抗体及び参照抗体を検証し、検証後、対照抗体及び参照抗体を使用して内因性細胞株を特性化した。ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する細胞は、これらのアッセイにおいて陽性対照として含まれていた。
ＦＡＣＳアッセイは、４つの上部ＧＩ癌細胞株、ならびに膵臓、結腸及び膀胱癌細胞株が高レベルで表面上にＣＬＤＮ１８．２を発現することを示した。試験されたがん細胞株によるＣＬＤＮ１８．２の内因性発現レベルが表２にまとめられている。図４も参照されたい。
Figure 2022541435000017
実施例５
この例は、ＣＬＤＮ１８．２特異的抗体の生成のためのマウスの免疫付与を記載する。
Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒの技術に従ってＢａｌｂ／ｃ及びＣＤ１マウスを６つの異なるペプチド免疫原の混合物で免疫することによってＣＬＤＮ１８．２特異的抗体を生成した。ペプチドは、ＣＬＤＮ１８．２細胞外ドメインにおける第１または第２のループ（すなわち、ＥＬ１またはＥＬ２）のいずれかに及んでいた。ペプチドには、ＥＬ１の全長、ＥＬ１の最初の（Ｎ末端の）半分にわたるペプチド、及びＥＬ１のもう一つの（Ｃ末端の）半分にわたるペプチドが含まれる。表３は、ペプチドの配列を提供する。
Figure 2022541435000018
マウスをまた、ヒトＣＬＤＮ１８．２－ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ベクターを含むプラスミドを使用して全長ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現する３Ｔ３細胞で免疫した。
免疫したマウスから脾細胞を採取し、ＢＴＸ Ｅｌｅｃｔｒｏｆｕｓｉｏｎ（ＢＴＸ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）によって骨髄腫株と融合してハイブリドーマを生成した。７０００の初代ハイブリドーマ培養物を生成し、３８４ウェルプレートにおいて培養した。３つの異なるペプチド標的を発現するビーズを使用してビーズアレイによって抗体がペプチドに結合する能力を評価した。およそ２０００の潜在的陽性抗体を９６ウェルプレートに再アレイ化し、さらに内因性及び人工細胞株モデルに対してフローサイトメトリーによってスクリーニングした。
次いで陽性ハイブリドーマ上清を、標的領域に対する配列類似性を有するタンパク質（例えば、他のＣＬＤＮタンパク質）の内因性モデル及び人工モデルに対してフローサイトメトリーによってカウンタースクリーニングした。二次スクリーン及びカウンタースクリーンから、およそ２０種のＣＬＤＮ１８．２特異的抗体をさらなる研究のために選択した。これらの抗体をサブクローニングし、重鎖及び軽鎖配列を決定した。表Ｂ及び配列表を参照されたい。
ＣＬＤＮ１８．２抗体をＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現を使用して全長ＩｇＧ抗体として形式化した。抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を、ｐｃＤＮＡ（商標）３．４－ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（カタログ番号：Ａ１４６９７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ））に基づいて実験室で操作された抗体発現ベクターにクローニングし、ＣＨＯ細胞にトランスフェクションした（キット（ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号：Ａ２９１３３，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で提供されるプロトコルに従った）。抗体を精製し、ＣＬＤＮ１８．２に対する抗体の細胞表面結合及び抗体ＩＣ５０を、ＣＬＤＮ１８．２抗体がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（スクシンイミジルエステル）、Ｃａｔ＃Ａ２０１０６（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に直接コンジュゲートされたＦＡＣＳによって製造業者のプロトコルに従って決定した。１５０，０００細胞系を有する５０μｌの体積中でＣＬＤＮ１８．２抗体を０．３２ｎＭから１０００ｎＭまで（連続希釈１：５、６点）試験した。
ＣＬＤＮ１８．２発現細胞をＦＡＣＳアッセイにおいて使用して、ＣＬＤＮ１８．２抗体が細胞の表面上のＣＬＤＮ１８．２に結合する能力及び他のＣＬＤＮファミリーメンバーと交差反応する能力を決定した。ＧＦＰに融合されたヒトＣＬＤＮ１８．２、ＧＦＰに融合されたマウスＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ１８．１－ＧＦＰ、またはＧＦＰ単独（ＣＬＤＮ１８．２なし）を発現するように操作されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＣＬＤＮ１８．２発現の人工モデルとして使用した。ＨＵＰＴ４、ＳＮＵ６０１、及びＰＡＴＵ８９８８Ｓ細胞をＣＬＤＮ１８．２発現の内因性モデルとして使用した。
各タイプの試験細胞のため及び各ｍＡｂのため、細胞表面タンパク質を保護するためにヴェルセン（トリプシンの代わり）によって培養フラスコの表面から細胞を剥離した。次いで剥離した細胞をＡｄｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）標識ＣＬＤＮ１８．２ｍＡｂと共に既定の濃度で氷上で暗所で３０分間インキュベーションした。ＣＬＤＮ１８．２ｍＡｂは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（スクシンイミジルエステル）で直接的に標識した。洗浄後、細胞をＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｆｌｏｗ ＣｙｔｏｍｅｔｅｒＣ６によって読み取ってチャンネルＦＬ４Ｈにおける抗体－抗原タンパク質結合を検出した。各抗体を様々な濃度で試験して用量－蛍光曲線を確立した。生物学的用量－反応データをプロットし、曲線タイプに当てはめしてＥＣ５０／ＩＣ５０を得ることが可能なオンラインで利用可能な極めて簡便なＩＣ５０ツールキットを使用して、ＦＬ４Ｈ（生シングレット細胞にゲーティングした）の値に基づいて抗体のＥＣ５０／ＩＣ５０（最大値の半分における抗体の濃度）を算出した。最大値は、蛍光が最大になる抗体の最低濃度であった。抗体を他のＣＬＤＮ１８アイソフォームＣＬＤＮ１８．１と交差反応するそれらの能力についてスクリーニングした。これらの値を使用して、試験された抗体のセットの中で各抗体の相対親和性を決定した。交差反応性データは、同様の方法論を使用して得られた。
この手法で決定された相対親和性データが表４に示されている。
Figure 2022541435000019
実施例６
この例は、キメラマウスＩｇＧ ｍＡｂの特性化を実証する。
ヒトがん細胞株が注射された異種移植マウスにおいてｉｎ ｖｉｖｏ結合研究を行った。簡潔には、ヒトがん細胞株の異種移植モデルを６週齢ＣＤ－１無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で確立した。各細胞株の皮下注射のため以下の条件に従った：ＨＵＰＴ４ １．０×１０７細胞、ＳＮＵ６０１ １．０×１０７細胞（５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を有する）。処置アーム当たり８匹のマウスを達成するように十分な数のマウスに注射した。腫瘍が１５０～３００ｍｍ３の平均サイズに達したとき、マウスを処置群に無作為化した。処置のため、各治療抗体（Ａｂ３８４、Ａｂ４００、参照Ａｂ１、参照Ａｂ２、及び非標的化ＩｇＧ２対照を滅菌生理食塩水に希釈して、静脈内尾静脈（ＩＶ）注射のための１ｍｇ／ｍｌの機能濃度とした。腫瘍異種移植片をキャリパーを用いて１週当たり３回測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）を高さ×幅×長さを乗じることによって決定した。マウスを２～５週間処置した。研究の最後に、動物を安楽死させ、腫瘍組織を摘出し、バイオマーカー分析のために簡易冷却したまたはホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織として保存するために分割した。すべての動物実験は、ＩＡＣＵＣ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコル下で行った。ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）製のＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアを使用してデータを分析した。結果は、各群についての平均体積として提供されている。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥ）を表す。
異種移植アッセイの結果が図５～図６に示されている。図５Ａ及び図５Ｂに示されているように、Ａｂ３８４及びＡｂ４００の各々は、胃腸腫瘍を保有するマウスにおいて、対照ＩｇＧ２抗体と比べて、３０日目で腫瘍体積の実質的な平均変化を引き起こした。図６Ａ及び図６Ｂに示されているように、クローンＡｂ３８４、Ａｂ３７６、Ａｂ３０７、及びＡｂ４３２は、膵臓腫瘍を保有するマウスにおいて、対照ＩｇＧ２抗体と比べて、２８日目で腫瘍体積の実質的な平均変化を引き起こした。
実施例７
この例は、本開示の抗体のヒト化を実証する。
表Ａ／表Ｂに列挙される抗体のサブセットをヒト化分析のために選択した。Ａｂ３０７、Ａｂ３７６、Ａｂ３５８、Ａｂ３６０及びＡｂ４３２抗体の重鎖可変（ＶＨ）及び軽鎖可変（ＶＬ）配列をヒトＶＨ遺伝子及びヒトＶＬカッパ遺伝子からの既知のヒト生殖系列配列のライブラリ（ＩＭＧＴ（登録商標）ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ；設立者及び理事長：Ｍａｒｉｅ－Ｐａｕｌｅ Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）と比較した；使用されたデータベースは、ＩＭＧＴヒトＶＨ遺伝子（Ｆ＋ＯＲＦ，２７３生殖系列配列）及びＩＭＧＴヒトＶＬカッパ遺伝子（Ｆ＋ＯＲＦ，７４生殖系列配列）であった。アクセプターヒト生殖系列を親抗体に配列が最も近いものから選択した。
ＣＤＲをＡｂＭ定義に従って定義した（ＣＤＲ定義を比較する表についてのＤｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎのウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／参照）。
ヒト生殖系列フレームワーク（すなわち、ＶＨ及びＶＬにおける非ＣＤＲ残基）位置の、対応する親マウス動物配列への変更が、ヒト化抗体の結合を最適化するために必要とされ得る。ヒト化抗体のバージョンの配列は、配列番号４２～５７として提供されている。
表６は、ヒト化ＶＨ及びＶＬを組み合わせるためのスキームを示している。ヒト化バージョンのいずれもがキメラｍＡｂと同等ではない場合。
Figure 2022541435000020
表６に記載のヒト化抗体を実施例５に本質的に記載されているように構築し、発現させた。ＦＡＣＳアッセイを行って、示されたがん細胞株によって発現するＣＬＤＮ１８．２に結合するヒト化抗体（１．５μｇまたは０．３μｇのいずれか）の相対抗原結合強度を決定した。アッセイの結果が表７に提供されている。ゾルベツキシマブ、１６３Ｅ１２及び１７５Ｄ１０を参照抗体として使用した。対応する親抗体（ヒト化の前の抗体）を対照として使用し、「ｃｈｉｍ」と指定した。
Figure 2022541435000021
ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原結合データに基づいて、５つのヒト化抗体をさらなる試験及び開発のために選択した。抗体は、Ａｂ３０７、Ａｂ３７６、Ａｂ３５８、Ａｂ３６０、及びＡｂ４３２から誘導した。
Ａｂ３０７、Ａｂ３７６、Ａｂ３５８、Ａｂ３６０、及びＡｂ４３２のヒト化バージョンのｉｎ ｖｉｖｏ結合研究を、実施例６において本質的に記載されているように、膵臓癌細胞株ＨＵＰＴ４が注射された異種移植マウスで行った。簡潔には、ＨＵＰＴ４の異種移植モデルを６週齢のＣＤ－１無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で確立した。腫瘍が１５０～３００ｍｍ３の平均サイズに達した後、マウスを処置群に無作為化した。ヒト化抗体を静脈内尾静脈（ＩＶ）注射のための１ｍｇ／ｍｌの機能濃度まで滅菌生理食塩水に希釈した。腫瘍異種移植片をキャリパーを用いて１週当たり３回測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）を高さ×幅×長さを乗じることによって決定した。マウスを２～７週間処置した。研究の最後に、動物を安楽死させ、腫瘍組織を摘出し、バイオマーカー分析のために簡易冷却したまたはホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織として保存するために分割した。
異種移植アッセイの結果が図７～図１２に示されている。図７Ａ～図７Ｂは、抗体が５週間週１回投与された、ヒト化Ａｂ３０７、Ａｂ３７６、Ａｂ３５８、Ａｂ３６０、Ａｂ４３２についての異種移植アッセイの結果を示している。対照は、ビヒクル対照（ＰＢＳ）、ヒトＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ Ｑ４Ｄ）、及び３０７のマウスバージョン（１０ｍｇ／ｋｇ Ｑ４Ｄ）を含んでいた。図７に示されているように、ヒト化Ａｂ３０７（ＨｕＡｂ３０７）及びＨｕＡｂ３５８で処置された動物は、４２日の処置期間にわたって腫瘍体積の最大減少を実証したのに対し、ＨｕＡｂ３６０及びＨｕＡｂ４３２処置は、腫瘍体積の中程度の減少を誘導した。
図８Ａ～図８Ｂは、様々な用量のＨｕＡｂ３０７抗体、例えば、４日毎（ｑ４ｄ）、１週毎（ｑｗ）、３週毎（ｑ３ｗ）に与えられた１０ｍｇ／ｋｇまたは４日毎に与えられた２．５ｍｇ／ｋｇでのＨＵＰＴ４膵臓癌の処置についての異種移植アッセイの結果を示している。１週毎または４日毎の処置は、処置後の４２日目までに、３週毎に与えられた抗体と比較してより良好な結果を示した。
実施例８
抗体を、細胞傷害性ペイロードを保有するそれらの能力についても試験した。ＭＭＡＥを保有するヒト化抗体を様々な用量及び用量スケジュールで試験して、膵臓癌または膀胱癌のためのモデルにおいて抗体が細胞傷害性を媒介する能力を評価した。
簡潔には、ＣＤ－１ヌードマウス（１群当たり８匹のマウス）にＨＵＰＴ４またはＰＡＴＵ８９８８Ｓ膵臓細胞、またはＳＮＵ６０１膀胱細胞を右脇腹に皮下注射した。腫瘍が１５０～３００ｍｍ３の平均サイズに達したとき、マウスを処置群に無作為化した。処置のため、ヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２ＭＭＡＥ抗体、またはヒトＩｇＧ対照抗体のいずれかを尾静脈注射によってマウスに週１回投与した。腫瘍異種移植片をキャリパーを用いて１週当たり３回測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）を高さ×幅×長さを乗じることによって決定した。マウスを２０～４２日間処置した。研究の最後に、動物を安楽死させ、腫瘍組織を摘出し、バイオマーカー分析のために簡易冷却したまたはホルマリン固定したパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織として保存するために分割した。すべての動物実験は、ＩＡＣＵＣ及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｅｓ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコル下で行った。ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）製のＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアを使用してデータを分析した。結果は、各群についての平均体積として提供されている。エラーバーは、平均の標準誤差（ＳＥ）を表す。
図９Ａ～図９Ｂは、抗体ＨｕＡｂ３０７－ＭＭＡＥ及びＨｕＡｂ３５８－ＭＭＡＥが５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇで週１回３週間投与された膵臓腫瘍モデルにおける処置の結果を示している。抗ＣＬＤＮ１８．２－ＡＤＣは、ペイロード単独よりも腫瘍体積を減少させるのに有効であった。５ｍｇ／ｋｇでのＨｕＡｂ３０７の単回用量は、４０日目まで腫瘍細胞を殺傷するのにも有効であった。
１０ｍｇ／ｋｇで投与された抗体ＨｕＡｂ３０７、ＨｕＡｂ３６８、ＨｕＡｂ３６０及びＨｕＡｂ４３２の有効性をＭＭＡＥにコンジュゲートされたＨｕＡｂ３０７及びＨｕＡｂ３５８－ＡＤＣと比較し、５ｍｇ／ｋｇで週１回膵臓癌細胞モデルに投与した。抗体単独では、腫瘍体積サイズを減少させたが、抗ＣＬＤＮ１８．２－ＡＤＣは、４８日まで改善された腫瘍殺傷を示した（図１０Ａ～図１０Ｂ）。同様の結果は、胃癌モデルにおいて観察された（図１１）。
追加の実験では、Ａｂ３０７及びＡｂ３５８－ＡＤＣコンジュゲートを異なる用量で静脈内投与した。結果は、静脈内処置が用量依存的であることを示している（図１２Ａ～図１２Ｂ）。
これらの結果は、抗体が、細胞傷害剤にとって固形腫瘍への有用な送達システムであることを示している。
本明細書で引用された刊行物、特許出願、及び特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が個別かつ具体的に参考文献によって組み込まれることが示され、その全体が本明細書に示される場合と同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
本開示を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈に明らかに矛盾するものでない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する」は、別段記述されない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「含むがこれらに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。
本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書で別段示されない限り、単に、範囲及び各端点内に収まる各々の別個の値を個別に指す省略方法としての役割を果たすことが意図され、各々の別個の値及び端点は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載のすべての方法は、本明細書で別段示されない限りまたは別段文脈によって明らかに矛盾しない限り任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるあらゆる例または様々な言語（例えば、「などの」）の使用は、単に本開示をより良好に例示することを意図しており、別段の主張がない限り、本開示の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる言葉も、本開示の実施にとって必須として任意の請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
本開示を実施するために発明者に知られている最良の形態を含む本開示の好ましい実施形態が本明細書に説明される。これらの好ましい実施形態の変形は、前述の説明を読む際に、当業者に明らかになり得る。発明者らは、そのような変形を必要に応じて採用する当業者を予期し、発明者らは、本開示が特に本明細書で説明される以外に実施されることを意図している。したがって、本開示は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題のすべての修正形態及び均等物を含む。さらに、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈に明らかに矛盾するものでない限り、上記要素のすべての考え得る変形形態での上記要素の任意の組み合わせが本開示に包含される。
実施例９
この例は、膵臓癌患者由来異種移植片（ＰＤＸ）におけるヒト化抗ＣＬＤＮ１８．２－３０７抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）のｉｎ ｖｉｖｏ活性を実証する。
方法：ＣＬＤＮ１８．２指向性ＡＤＣ（ＣＬＤＮ１８．２－３０７－ＡＤＣ（ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥにコンジュゲートされている））、及びＣＬＤＮ１８．２指向性ｍＡｂ ＣＬＤＮ１８．２－３０７の抗腫瘍活性を膵臓癌の２つの患者由来の異種移植片において評価した。各ＰＤＸは、ＩＨＣによってＣＬＤＮ１８．２タンパク質について陽性（ＸＷＲ６）または陰性（ＸＷＲ１８７）であることが既に示されている（図１４Ｃ及び図１５Ｃ）。６週齢のＣＤ－１無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において動物の右後脇腹に腫瘍片を皮下に埋め込むことよってマウスにおける腫瘍組織のｉｎ ｖｉｖｏ継代を介して患者由来異種移植片を確立した。十分な数の異種移植腫瘍保有マウスが達成され、腫瘍体積が２００～３００ｍｍ３の範囲になった後、マウスを、３回の繰り返し投薬のための非標的化ＩｇＧ２Ａ対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ ＩＶ）、ヒト化ｍＡｂ ＣＬＤＮ１８．２－３０７（１０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ ＩＶ）またはＣＬＤＮ１８．２－３０７－ＡＤＣ（５ｍｇ／ｋｇ ＱＷ ＩＶ）のいずれかを摂取する処置群に無作為化した。すべての実験のため、腫瘍異種移植片をキャリパーを用いて１週当たり３回測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）を高さ×幅×長さを乗じることによって決定した。すべての動物実験は、ＩＡＣＵＣ及びｔｈｅ ＵＣＬＡ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコル下で行った。ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）製のＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアを使用してデータを分析した。
簡潔な概要：ＣＬＤＮ１８．２陽性ＸＷＲ６モデルにおいて、ｍＡｂ ＣＬＤＮ１８．２－３０７での処置は、非標的化対照と比べてＰＤＸの進行の平均速度を遅らせたが、３０７－ＡＤＣは、その群における４匹のマウスの各々で異種移植腫瘍負荷の完全退縮を誘導した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。ＣＬＤＮ１８．２陽性モデルとは対照的に、ＣＬＤＮ１８．２－３０７－ＡＤＣまたはｍＡｂ ＣＬＤＮ１８．２－３０７は、ＣＬＤＮ１８．２陰性ＰＤＸ、ＸＷＲ１８７において異種移植腫瘍進行に対する影響を示さなかった（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。
実施例１０
この例は、標的陰性がん細胞株異種移植片におけるヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ｍＡｂ及びヒト化ＣＬＤＮ１８．２ ＡＤＣの活性の評価を実証する。
方法：２つのＣＬＤＮ１８．２ ＡＤＣ（ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥにコンジュゲートされている）及び２つのＣＬＤＮ１８．２ ｍＡｂの標的選択的活性を、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質に対して陰性である（すなわち、ＣＬＤＮ１８．２タンパク質の発現を欠く）ことが事前に明らかにされたヒト黒色腫（Ｍ２０２）の細胞株異種移植モデルにおいて評価した。６週齢のＣＤ－１無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において動物の右後脇腹に５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を有する１．０×１０７細胞を注射することよってがん細胞株異種移植片を確立した。腫瘍が２５０ｍｍ３～３００ｍｍ３の平均サイズに達したとき、マウスを、３回の繰り返し投薬のための非標的化ヒト化ＩｇＧ１対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ ＩＶ）、ｍＡｂ ＣＬＤＮ１８．２－３０７（１０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ ＩＶ）、ｍＡｂ ＣＬＤＮ１８．２－３５８（１０ｍｇ／ｋｇ ＱＷ ＩＶ）、ＣＬＤＮ１８．２－３０７－ＡＤＣ（５ｍｇ／ｋｇ ＱＷ ＩＶ）またはＣＬＤＮ１８．２－３３８－ＡＤＣ（５ｍｇ／ｋｇ ＱＷ ＩＶ）での処置群に無作為化した。すべての実験のため、腫瘍異種移植片をキャリパーを用いて１週当たり３回測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）を高さ×幅×長さを乗じることによって決定した。すべての動物実験は、ＩＡＣＵＣ及びｔｈｅ ＵＣＬＡ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコル下で行った。ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）製のＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアを使用してデータを分析した。
簡潔な概要：このＣＬＤＮ１８．２陰性モデルでは、これらのｍＡｂｓまたはＡＤＣのいずれでも有意な抗腫瘍活性は観察されなかった（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。これらのデータは、これらの分子が極めて少ないオフターゲット活性を有することを示している。
実施例１１
この例は、フローサイトメトリーによって分析された場合のネイティブ陽性細胞（ＣＬＤＮ１８．２の内因性発現を有する細胞）または人工的過剰発現細胞（ＣＬＤＮ１８．２を過剰発現するように操作 された細胞）に対するヒト化抗体結合活性を実証する。
方法：３つの異なる濃度でヒト化抗体を５０μｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で４℃で３０分間１５０，０００細胞と共にインキュベーションし、続いて２％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した；次いでＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（４０９３２０）と共に４℃で３０分間インキュベーションした。次いでサンプルをＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（登録商標）ｉＱｕｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍによって測定した。
簡潔な概要：ＣＬＤＮ１８．２に対する３０７に基づいて改変された８種のヒト化抗体（ｈ１Ｆ０６）及び３５８に基づいて改変された８種のヒト化抗体は、ネイティブＣＬＤＮ１８．２発現ＨＵＰＴ４細胞において、または人工ＣＬＤＮ１８．２過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてそれらの親抗体と比較してフローサイトメトリーによって様々な結合親和性を示すのに対し、陰性対照Ｍ２０２細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ親細胞に対しては活性を示さない（図１８）。
実施例１２
以下の表８は、さらなるヒト化抗体及び配列を示している。
Figure 2022541435000022
実施例１３
この例は、ＣＬＤＮ１８．１及びＣＬＤＮ１８．２の種オルソログを過剰発現するように操作された細胞上のオルソログに対するヒト化抗体結合活性を実証する。結合活性をフローサイトメトリーによって分析した。
方法：３つの異なる濃度で４つのヒト化抗体を５０μｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で４℃で３０分間１５０，０００細胞と共にインキュベーションし、続いて２％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した；次いでＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（４０９３２０）と共に４℃で３０分間インキュベーションした。次いでサンプルをＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ（登録商標）ｉＱｕｅ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍによって測定した。
簡潔な概要：３０７及び３５８に基づいて改変された４つのヒト化抗体は、フローサイトメトリーによってヒトＣＬＤＮ１８．２、ヒトＣＬＤＮ１８．１、マウスＣＬＤＮ１８．２、イヌＣＬＤＮ１８、及びラットＣＬＤＮ１８と有意に異なる結合親和性を示す（図１９）。ループ１及びループ２はいずれとも、ヒトとＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイマカク）（カニクイザル）との間で同一であるため、サルＣＬＤＮ１８．２ ＯＥ株はこのアッセイに含めなかった。
実施例１４
この例は、ＨＵＰＴ４細胞におけるＣＬＤＮ１８．２ヒト化抗体を用いた抗体内在化のｉｎ ｖｉｔｒｏ特性化を実証する。
方法：核をＤＮＡ色素Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で１ｕｇ／ｍｌの培地中で３７℃で一晩染色した。リソソームをＣｅｌｌＬｉｇｈｔ（商標）Ｌｙｓｏｓｏｍｅｓ－ＧＦＰ，ＢａｃＭａｍ ２．０（Ｃ１０５０７）で染色し、３７℃、２ｕｌ／１０ｋ細胞で一晩トランスフェクションした。ＣＬＤＮ１８．２抗体をＡＦ６４７で一次標識する。ＨＵＰＴ４細胞を８ｕｇ抗体／３００ｕｌ成長培地で４℃で３０分間染色する。
簡潔な概要：試験された４種すべての抗体（０２－０３０７－ｈ４、０２－０３０７－ｈ６、０２－０３５８－ｈ３及び０２－０３５８－ｈ５）は、染色後の２４～４８時間の間で完全に内在化した（図２０）。内在化後、抗体（赤色）がリソソーム（緑色）と統合し、核（青色）の周りの黄色のスポットを形成した（図２０）。
実施例１５
この例は、ヒト化ＣＬＤＮ１８．２抗体の結合親和性（ＫＤ）、及び様々ながん細胞株の表面上のＣＬＤＮ１８．２発現レベルを実証する。
方法：細胞ベースの抗体親和性ＫＤをＳａｐｉｄｙｅ製のＫｉｎＥｘＡ ４０００によって測定した（図２１Ａ）。各ＫＤ測定のため、通常、継代間の発現レベルの変化を避けるために同じ細胞バッチ（同じ継代）を使用して少なくとも２つの抗体濃度曲線を準備した。簡潔には、ＨＥＫ２９３Ｔ ＣＬＤＮ１８．２－ｍＧＦＰ Ｃ１２細胞（操作された過剰発現細胞株）またはＨＵＰＴ４細胞（ネイティブ陽性細胞株）のいずれかをヴェルセンを使用して剥離した。次いで細胞を異なる濃度の抗体溶液中でそれぞれ２％ＦＢＳ／ＤＭＥＭまたは２％ＦＢＳ／ＲＰＭＩにおいて４℃で一晩平衡化した。細胞濃度は１．８×１０７細胞／ｍｌから開始し、２倍の連続希釈を１０点まで実施した。また、抗体溶液のみ（シグナル１００％）及び非特異的結合（ＮＳＢ）緩衝液のみが各曲線に含まれていた。翌日、細胞を１５００ｒｐｍで１０分間遠沈し、測定のために上清を保存した。ＰＭＭＡビーズ（Ｓａｐｉｄｙｅ，４４０１７６）をヤギ－抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，１０９－００５－００３）で３０μｇ／ｍｌでプレコーティングし、続いて１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ／ＰＢＳと共に室温で１時間インキュベーションした。Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，１０９－６０５－０８８）を１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で０．５μｇ／ｍｌで希釈した。ｎ－曲線分析によって分析された２つの抗体曲線を使用してＫＤ及び抗原発現レベルを算出した。
細胞表面抗原発現レベルを、Ｑｕａｎｔｕｍ ＭＥＳＦキット（様々な量のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７，Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，カタログ＃６４７で標識された４つの蛍光マイクロスフィア集団）及びＱｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ（４つの標準、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ，カタログ＃８１６）またはＳｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｋｉｔ（１つの標準、カタログ＃８１２）の組み合わせを使用することによって定量フローサイトメトリー測定（図２１Ｂ）を介して実施した。簡潔には、細胞を、ヴェルセン溶液を使用して剥離し；細胞及びＱＳＣビーズをＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７色素で一次標識されたＣＬＤＮ１８．２抗体で４℃で３０分間染色し；２％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した後、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６でシングレット集団の周囲でゲーティングする同一設定で細胞、ＭＥＳＦ、及びＱＳＣビーズを分析する。各キットが備えるＱｕｉｃｋＣａｌ分析テンプレートを使用して、ＭＥＳＦキットを使用して標準曲線を生成し、蛍光を定量した；次いで細胞サンプルを、発現の決定のための曲線に対して読み取る。また、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ ＣｅｌｌｕｌａｒまたはＳｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｋｉｔを使用して蛍光体：タンパク質（Ｆ／Ｐ）比を定量した。ＱｕｉｃｋＣａｌ分析テンプレートを使用して。その後、結果をＦ／Ｐ比を使用してＭＥＳＦからＡＢＣ単位に変換する。最後に、算出された一価ＡＢＣに２を乗じると、二価結合でのＡＢＣ値となる。
簡潔な概要：４つのヒト化ＣＬＤＮ１８．２抗体は、ＣＬＤＮ１８．２陽性細胞株に対する異なる結合親和性；ＣＬＤＮ１８．２過剰発現人工細胞と比較して高いネイティブＣＬＤＮ１８．２陽性細胞に対する結合親和性を示した（図２１Ａ）。細胞表面上のＣＬＤＮ１８．２の発現レベルは、異なる組織間で内因性細胞株において変化した（図２１Ｂ）。
実施例１６
この例は、ＣＬＤＮ１８．２＋膵臓癌細胞株（ＨＵＰＴ４）異種移植片におけるＣＬＤＮ１８．２ヒト化ｍＡｂの有効性を実証する。
方法：４つのＣＬＤ１８．２指向性抗体の抗腫瘍活性をヒト膵臓癌のＨＵＰＴ４細胞株異種移植モデルにおいて比較した。６週齢のＣＤ－１無胸腺ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において動物の右後脇腹に５０％マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を有する１．０×１０７細胞を注射することよってがん細胞株異種移植片を確立した。腫瘍が２００ｍｍ３の平均サイズに達したとき、マウスを処置群に無作為化した。マウスを非標的化ヒト化ＩｇＧ１対照抗体、ＣＬＤＮ１８．２抗体クローン＃３０７－４、＃０２－３０７－６ｈ、＃３５８－３または＃０２－３５８－５ｈのいずれかを１０ｍｇ／ｋｇで静脈内（ＩＶ）注射することによって週１回（ＱＷ）処置した。すべての実験のため、腫瘍異種移植片をキャリパーを用いて１週当たり３回測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）を高さ×幅×長さを乗じることによって決定した。すべての動物実験は、ＩＡＣＵＣ及びｔｈｅ ＵＣＬＡ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたプロトコル下で行った。ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）製のＳｔｕｄｙＬｏｇソフトウェアを使用してデータを分析した。
簡潔な概要：各抗体での処置は、投薬から２４日にわたって異種移植腫瘍進行の完全な阻止を誘導した。試験された４つのＣＬＤＮ１８．２ｍＡｂのうち、クローン＃３０７－４は、他の３つのクローンよりも少し改善された有効性を示した（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。
実施例１７
この例は、フローサイトメトリーによってネイティブ陽性細胞または人工的過剰発現細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３－二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）結合活性を実証する。
方法：＃３０７－ＣＤ３Ｅ－ＢｉＴＥ（２バッチ）及び３５８－ＣＤ３Ｅ－ＢｉＴＥを５０μｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で４℃で３０分間１５０，０００細胞と共にインキュベーションし、続いて２％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した；次いで抗ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃６５２５１３）と共に４℃で３０分間インキュベーションした。次いでサンプルをＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒによって測定した。
簡潔な概要：ＣＬＤＮ１８．２ ＢｉＴＥ［＃３０７－ＣＤ３Ｅ－ＢｉＴＥ（２バッチ）及び３５８－ＣＤ３Ｅ－ＢｉＴＥ］は、ネイティブＣＬＤＮ１８．２発現ＨＵＰＴ４細胞、及び人工ＣＬＤＮ１８．２過剰発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とフローアッセイによって良好な結合親和性を示したのに対し、陰性対照ＡＲＫ２細胞に対する活性を示さなかった（図２４Ａ～図２４Ｅ）。しかしながら、抗ｈｉｓ－ＡＦ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃６５２５１３）は、ＨＥＫ２９３Ｔ親細胞では非常に高いバックグラウンド／非特異的結合を有する。
実施例１８
この例は、フローサイトメトリーによってネイティブ陽性細胞または人工的過剰発現細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６－ＴａｎｄＡｂ（タンデムダイアボディ）結合活性を実証する。
方法：ＣＤ１６ＡまたはＣＬＤＮ１８．２にそれぞれ結合する抗原結合部位を含むＴａｎｄＡｂを３０７または３５８抗体の抗原結合タンパク質を使用して構築した。本明細書に記載のＴａｎｄＡｂの構造は、ＣＤ１６Ａ ＶＨ－（Ｇ２Ｓ）３－ＣＬＤＮ１８．２ＡｂＶＬ－（Ｇ２Ｓ）３－ＣＬＤＮ１８．２ＡｂＶＨ－（Ｇ２Ｓ）３－ＣＤ１６Ａ ＶＬ－Ｈｉｓタグであった（図２３Ａ～図２３Ｃ）。ＴａｎｄＡｂ３０７－ＣＤ１６Ａ及びＴａｎｄＡｂ３５８－ＣＤ１６ＡならびにＡＦＭ１３を５０μｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で４℃で３０分間１５０，０００細胞と共にインキュベーションし、続いて２％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した；次いで抗ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃６５２５１３）と共に４℃で３０分間インキュベーションした。次いでサンプルをＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒによって測定した。
簡潔な概要：ＴａｎｄＡｂ３０７－ＣＤ１６Ａ及びＴａｎｄＡｂ３５８－ＣＤ１６Ａは、ネイティブＣＬＤＮ１８．２発現ＨＵＰＴ４細胞とフローアッセイによって良好な結合親和性を示したのに対し、陰性対照ＡＲＫ２細胞に対してより低い活性を示した。しかしながら、抗ｈｉｓ－ＡＦ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃６５２５１３）は、非常に高いバックグラウンド／非特異的結合を有する。ＡＦＭ１３抗体（ＣＤ１６Ａ及びＣＤ３０に二重特異的）をＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ－ＮＦＡＴ－ＣＤ１６Ａ細胞におけるＣＤ１６Ａに結合する陽性対照として使用した。このフローアッセイにおける結果は、３０７－ＣＤ１６Ａ及び３５８－ＣＤ１６ＡのＴａｎｄＡｂがＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ１６Ａの両方に成功裏に結合することを実証した（図２５Ａ～図２５Ｅ）。
実施例１９
この例は、フローサイトメトリーによってネイティブ陽性細胞または人工的過剰発現細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ１６－ＴａｎｄＡｂ結合活性を実証する。
方法：Ｔａｎｄａｂ３０７－ＣＤ１６Ａ及びＴａｎｄａｂ３５８－ＣＤ１６ＡならびにＡＦＭ１３を５０μｌの２％ＦＢＳ／ＰＢＳ中で４℃で３０分間１５０，０００細胞と共にインキュベーションし、続いて２％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄した；次いで抗ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃６５２５１３）と共に４℃で３０分間インキュベーションした。次いでサンプルをＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒによって測定した。
簡潔な概要：Ｔａｎｄａｂ３０７－ＣＤ１６Ａ及びＴａｎｄａｂ３５８－ＣＤ１６Ａは、ネイティブＣＬＤＮ１８．２発現ＨＵＰＴ４細胞と良好な結合親和性を示したのに対し、ＣＬＤＮ１８．２陰性ＡＲＫ２細胞に対してより低い活性を示した（図２６Ａ～図２６Ｅ）。しかしながら、抗ｈｉｓ－ＡＦ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃６５２５１３）は、高いバックグラウンド／非特異的結合を有する。ＡＦＭ１３抗体（ＣＤ１６Ａ及びＣＤ３０に二重特異的）を、Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ－ＮＦＡＴ－ＣＤ１６Ａ細胞におけるＣＤ１６Ａに結合する陽性対照として使用した。このフローアッセイにおける結果は、Ｔａｎｄａｂ３０７－ＣＤ１６Ａ及びＴａｎｄａｂ３５８－ＣＤ１６ＡがＣＬＤＮ１８．２及びＣＤ１６Ａの両方に成功裏に結合することを実証した（図２６Ａ～図２６Ｅ）。
実施例２０
この例は、フローサイトメトリーによるＪｕｒｋａｔ細胞に対するＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥ結合活性を示している。
方法：ＣＤ３について内因的に陽性であるＪｕｒｋａｔ細胞を１ｕｇの対象となる各ＢｉＴＥ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ－Ｈｉｓタグ、ｐ３０７ ＢｉＴＥ－Ｈｉｓタグ、ｐ３５８ ＢｉＴＥ－Ｈｉｓタグ）と共にインキュベーションし、４℃で少なくとも３０分間インキュベーションし、洗浄し、０．５ｕｇの抗Ｈｉｓ二次抗体と共にインキュベーションした。同じ日にサンプルを洗浄し、フローサイトメトリーを実行した。陰性対照のため、Ｊｕｒｋａｔ細胞を抗Ｈｉｓ二次抗体と共にのみインキュベーションした。
簡潔な概要：フローの結果は、ベンチマーク抗体（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）ならびに我々のＣＬＤＮ１８．２ ＢｉＴＥ ｐ３０７及びｐ３５８の抗ＣＤ３結合能力を示している（図２７Ａに示されているように）。４０Ｘ Ｋｅｙｅｎｃｅ画像は、一貫した表面染色を示している（図２７Ｂ）。
実施例２１
この例は、ネイティブまたは人工的過剰発現細胞を使用したＮＦＡＴ－ＲＥレポーター及びＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥを用いたＪｕｒｋａｔ細胞を使用したＴ細胞活性化アッセイを示している。
方法：アッセイをＰｒｏｍｅｇａのＴ細胞活性化バイオアッセイキット（ＮＦＡＴ－ＲＥ Ｊ１６２１）を使用して実行した。標的細胞を白色の９６ウェルプレートのウェルにおいて４０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃で一晩インキュベーションし、その後、アッセイキットに含まれる解凍使用型（ｔｈａｗ－ａｎｄ－ｕｓｅ）ＪｕｒｋａｔＴ細胞（活性化した場合に発光するように操作されている）を、ＢｉＴＥ処置と共に播種した細胞に添加した（１：１の細胞比）。ＢｉＴＥ処置は、１０ｎＭの開始濃度で９つの１：４の連続希釈物で与えた。処置されたプレートを３７℃で６時間の期間にわたってインキュベーションし、その後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬（キットに含まれる）を添加し、Ｖｉｃｔｏｒ ３Ｖ照度計で１秒当たりのカウントの単位（ＣＰＳ）で直ちに読み取った。
簡潔な概要：発光データは、ｐ３０７ ＢｉＴＥがＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞のＣＬＤＮ１８．２特異的活性化を誘導することを実証している（図２８）。すなわち、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）について陽性の細胞は、ＢｉＴＥが相対的レベルの活性化を誘導するために存在することが必要である。
実施例２２
この例は、人工的過剰発現細胞及び内因性細胞株を使用したＮＦＡＴ－ＲＥレポーター及びＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥを用いたＪｕｒｋａｔ細胞を使用したＴ細胞活性化アッセイを実証する。
方法：（両方のＣＬＤＮ１８．２ ＢｉＴＥを用いたこと以外は図２８と同じ）アッセイをＰｒｏｍｅｇａのＴ細胞活性化バイオアッセイキット（ＮＦＡＴ－ＲＥ Ｊ１６２１）を使用して実行した。標的細胞を白色の９６ウェルプレートのウェルにおいて４０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃で一晩インキュベーションし、その後、アッセイキットに含まれる解凍使用型ＪｕｒｋａｔＴ細胞（活性化した場合に発光するように操作されている）を、ＢｉＴＥ処置と共に播種した細胞に添加した（１：１の細胞比）。ＢｉＴＥ処置は、１０ｎＭの開始濃度で９つの１：４の連続希釈物で与えた。処置されたプレートを３７℃で６時間の期間にわたってインキュベーションし、その後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬（キットに含まれる）を添加し、Ｖｉｃｔｏｒ ３Ｖ照度計で１秒当たりのカウントの単位（ＣＰＳ）で直ちに読み取った。
簡潔な概要：発光データは、ｐ３０７及びｐ３５８ ＢｉＴＥがＣＤ３＋Ｊｕｒｋａｔ細胞のＣＬＤＮ１８．２特異的活性化を誘導することを実証している（図２９）。すなわち、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）について陽性の細胞は、ＢｉＴＥが相対的レベルの活性化を誘導するために必要とされる。
実施例２３
この例は、処置から５日後のＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３二重特異性細胞傷害アッセイの代表的画像を示している。
方法：９６ウェルプレートにおいて、ｐａｎ ＣＤ３＋ヒトＰＢＭＣ（ＨｕｍａｎＣｅｌｌｓ Ｂｉｏから購入した）をＨＵＰＴ４、Ｃｌｄｎ１８．２＋細胞株と共に異なるエフェクター：標的比で共培養し、ｐ３０７ ＣＬＤＮ１８．２ ＢｉＴＥまたは陰性対照Ｂｌｉｎｃｙｔｏのいずれかで処置した。処置の濃度は１２５ｎｇ／ｍＬで開始し、１：１０の比で連続希釈した。処置から５日後に、プレートをＣｅｌｌａｖｉｓｔａ画像化システムで画像化して、共培養及び処置がＨＵＰＴ４細胞に対する細胞傷害効果を誘導するかどうか及びその程度を決定した。
簡潔な概要：Ｃｅｌｌａｖｉｓｔａ画像は、ｐ３０７ ＣＬＤＮ１８．２ ＢｉＴＥがＨＵＰＴ４細胞に対して細胞傷害効果を誘導することを実証している。対照的に、ＣＤ１９に特異的でＣＬＤＮ１８．２に特異的ではない陰性対照Ｂｌｉｎｃｙｔｏは、同じ濃度でＨＵＰＴ４細胞に影響を及ぼさなかった（図３０Ａ～図３０Ｆ）。
実施例２４
この例は、処置から５日後のＣＬＤＮ１８．２－ＣＤ３ ＢｉＴＥのＬＤＨ活性を実証する。
方法：実施例２２で詳述された実験からの培地を収集し、１４，５００ｒｐｍで１０分間遠沈してＬＤＨアッセイ（Ｓｉｇｍａ：ＭＡＫ０６６）のための準備をした。各ウェルからの６μｌの培地をＬＤＨ活性アッセイのために使用した。１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩを陰性対照として使用した。アッセイを３７℃で実施し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して３０秒の間隔で１５分毎にＯＤ４５０ｎＭを測定した。
簡潔な概要：ＬＤＨ比色アッセイを簡便な方法として使用して細胞傷害性の相対的レベルを決定した。結果は、標的特異的細胞傷害性及び用量依存的反応を実証している；ＣＤ３＋ヒトＰＢＭＣと共培養され、ｐ３０７ ＢｉＴＥで処置されたＨＵＰＴ４細胞は、陰性対照ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ）で処置された細胞と比較して著しく高いレベルのＬＤＨを放出した。エフェクター細胞対標的細胞の比に依存する反応も観察され、ＣＤ３＋細胞が細胞傷害効果に必要とされることを示している（図３１）。
実施例２５
この例は、ヒトＰＢＭＣが注射されたマウスのＣＬＤＮ１８．２陽性ＨＵＰＴ４膵臓癌細胞株異種移植片におけるＣＬＤＮ１８．２指向性ＢｉＴＥ（ＣＤ３）のｉｎ ｖｉｖｏ活性を実証する。
方法：ヒトＰＢＭＣ注射が追加された免疫不全マウスを使用して細胞株異種移植研究においてＣＬＤＮ１８．２指向性ＢｉＴＥの抗腫瘍活性を評価した。免疫不全（ＮＳＧ）マウスに１．０×１０７ＨＵＰＴ４膵臓癌細胞を注射し、その１２日後に、ＩＬ－２で刺激された１．０×１０７ヒトドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のいずれかを腹腔内注射した。ＰＢＭＣの注射の翌日、マウスを平均腫瘍体積（１５０～２００ｍｍ３）に基づいて無作為化し、１ｍｇ／ｋｇのＢｌｉｎｃｙｔｏ（非標的化対照）、１ｍｇ／ｋｇのＣＬＤＮ１８．２－ＢｉＴＥ－３０７または１ｍｇ／ｋｇのＣＬＤＮ１８．２－ＢｉＴＥ－３５８のいずれかで毎日静脈内（ＩＶ）注射することで７日間連続で処置した。さらなる対照群も非標的化ヒトＩｇＧ１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ ＱＷ）、ＣＬＤＮ１８．２－ｍＡｂ－３０７（１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ ＱＷ）またはＣＬＤＮ１８．２－ｍＡｂ－３５８（１０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ ＱＷ）で処置した。
簡潔な概要：ＣＬＤＮ１８．２陽性ＨＵＰＴ４異種移植片の有意な腫瘍退縮が、ＣＬＤＮ１８．２－ＢｉＴＥ－３０７またはＣＬＤＮ１８．２－ＢｉＴＥ－３５８で処置されたマウスでのみ観察された（図３２）。ＣＤ１９指向性ＢｉＴＥ、Ｂｌｉｎｃｙｔｏでの処置に反応する抗腫瘍活性は観察されなかった。ＨＵＰＴ４細胞はＣＤ１９タンパク質を発現しない。ＣＬＤＮ１８．２に対して仕向けられたｍＡｂもこのモデルにおいて活性を有さなかった（図３２）。これらのデータは、ＣＬＤＮ１８．２ ＢｉＴＥの強力な活性及びＢｉＴＥ技術を使用してＣＬＮＤ１８．２を標的化する際の利点を示している。
実施例２６
この例は、ヒト化ＢＬＴマウスにおけるＣＬＤＮ１８．２陽性ＨＵＰＴ４膵臓癌細胞株異種移植片におけるＣＬＤＮ１８．２指向性ＢｉＴＥ（ＣＤ３）のｉｎ ｖｉｖｏ活性を実証する。
方法：完全ヒト化免疫系を生成するために胎児ドナーＣＤ３８＋幹細胞ならびにドナー肝臓及び胸腺の断片が埋め込まれた免疫不全（ＮＳＧ）マウスを使用して細胞株異種移植研究においてＣＬＤＮ１８．２指向性ＢｉＴＥの抗腫瘍活性を評価した。ヒト免疫細胞の再構成をこれらのＢＬＴ（骨髄肝臓胸腺）マウスにおいて確認してから１．０×１０７ＨＵＰＴ４膵臓癌細胞を注射した。腫瘍が２００ｍｍ３の平均体積に達した後、マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＨｕ－ＩｇＧ１対照ＩＶ ＱＷまたは１ｍｇ／ｋｇのＣＬＤＮ１８．２－ＢｉＴＥ－３０７ ＩＶのいずれかで５日間連続で処置した。
簡潔な概要：ＣＬＤＮ１８．２－ＢｉＴＥ－３０７で処置されたマウスにおいて有意なｔ腫瘍退縮が観察された（図３３Ａ及び図３３Ｂ）。これらのデータは、本明細書に記載のＣＬＤＮ１８．２標的化ＢｉＴＥが、ＣＬＤＮ１８．２陽性癌細胞株異種移植片を保有するヒト化マウスにおいて有意な抗腫瘍活性を誘導することを実証している。
以下の表９～１１は、ＣＬＤＮ１８．２に結合する様々な抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質を表している。
Figure 2022541435000023
Figure 2022541435000024
Figure 2022541435000025
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Figure 2022541435000030
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Figure 2022541435000032
Figure 2022541435000033
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表１０における抗体は、抗体３０７－４ｈ及び３５８－ｈ３ならびにさらなる配列類型についての配列を表している。これらの抗体は、潜在的製造可能性配列負担に対する追加情報を提供するために生成された。
Figure 2022541435000035
Figure 2022541435000036

Claims (84)

  1. ヒトクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質（配列番号１）に結合する抗原結合タンパク質であって、
    ａ．前記抗原結合タンパク質は、ＣＬＤＮ１８．２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の細胞外ループ１（ＥＬ１）に結合し、ＣＬＤＮ１８．２の前記ＥＣＤの細胞外ループ２（ＥＬ２）に結合せず、または
    ｂ．クローディン１８．１（ＣＬＤＮ１８．１）に結合せず、ＨＵＰＴ４細胞によって内因的に発現したＣＬＤＮ１８．２に参照抗体よりも１．５倍超高い親和性で結合し、または
    ｃ．それらの組み合わせである、
    前記抗原結合タンパク質。
  2. ＣＬＤＮ１８．２（配列番号１）の残基２８～７４のアミノ酸配列内のエピトープに結合する、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
  3. ＣＬＤＮ１８．２のＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＦＹＦＴＬ（配列番号４）、ＱＧＬＷＲＳＣＶＲＥＳＳＧＦＴＥＣＲＧＹＦＴＬＫ（配列番号５）、ＤＱＷＳＴＱＤＬＹＮＮＰＶＴＡＶＦＮＹＱＧＬＷＲＳＣ（配列番号６）またはＣＲＧＹＦＴＬＬＦＬＰＡＭＬＱＡＶＲ（配列番号７）のアミノ酸配列に結合する、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
  4. 前記参照抗体は、配列番号５８の軽鎖可変配列及び配列番号５９の重鎖可変配列、配列番号６０の軽鎖可変配列及び配列番号６１の重鎖可変配列、または配列番号６２の軽鎖可変配列及び配列番号６３の重鎖可変配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  5. ａ．表Ａに示される重鎖（ＣＤＲ）１アミノ酸配列または配列番号６４、８８、６９、８９、７２、７５、９１、９４、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０６、１０９からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；
    ｂ．表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号６５、６７、７０、９０、７３、７６、９２、７３、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０７、１１０からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；
    ｃ．表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号６６、６８、７１、７７、７４、７７、９３、７４、１０５、１０８、１１１からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；
    ｄ．表Ａに示される軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列または配列番号７８、８１、８２、８６、１１４、１２０、１２３、１２６からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；
    ｅ．表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号７９、１１２、７９、８４、１１６、１１８、１１９、１２９、１２１、１２４、１２７からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％）の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；
    ｆ．表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号８０、８３、１１３、８５、８７、１１５、１１７、１２２、１２５、１２８からなる群から選択される配列；ならびに
    ｇ．（ａ）～（ｆ）の任意の２つ以上の組み合わせ
    を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  6. 前記バリアント配列は、少なくとも約８０％または少なくともまたは約８５％の配列同一性を有する、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
  7. 前記バリアント配列は、少なくとも約９０％の配列同一性または少なくともまたは約９５％の配列同一性を有する、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
  8. 表Ａに示される軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに表Ａに示される重鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１または２つを含む、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
  9. 表Ａに示される重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列、重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列ならびに表Ａに示される軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列のうちの１または２つを含む、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
  10. ａ．配列番号７８、７９、８０、６４、６５、６６；
    ｂ．配列番号８１、１１２、８０、８８、６５、６６；
    ｃ．配列番号８１、７９、８０、６４、６７、６８；
    ｄ．配列番号８２、７９、８３、３９、７０、７１；
    ｅ．配列番号８１、７９、１１３、８９、９０、７７；
    ｆ．配列番号８１、８４、８５、７２、７３、７４；
    ｇ．配列番号８６、７９、８７、７５、７６、７７；
    ｈ．配列番号１１４、７９、１１５、９１、９２、９３；
    ｉ．配列番号８１、１１６、１１７、９４、７３、７４；
    ｊ．配列番号８１、１１８、１１７、９５、９６、７４；
    ｋ．配列番号８１、１１９、１１７、９７、９８、７４；
    ｌ．配列番号８１、１１８、８５、９９、１００、７４；
    ｍ．配列番号８１、１２９、１１７、１０１、１０２、７４；
    ｎ．配列番号１２０、１２１、１２２、１０３、１０４、１０５；
    ｏ．配列番号１２３、１２４、１２５、１０６、１０７、１０８；及び
    ｐ．配列番号１２６、１２７、１２８、１０９、１１０、１１１
    からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項５～９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  11. ａ．表Ｂに示される重鎖可変領域アミノ酸配列または１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、２、３４、３６、３８及び４０からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または
    ｂ．表Ｂに示される軽鎖可変領域アミノ酸配列または１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または
    ｃ．（ａ）及び（ｂ）の両方
    を含む、請求項５～１０のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  12. 前記バリアント配列は、少なくとも約８０％または少なくとも約８５％の配列同一性を有する、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
  13. 前記バリアント配列は、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の配列同一性を有する、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
  14. ａ．配列番号１０及び１１；
    ｂ．配列番号１２及び１３；
    ｃ．配列番号１４及び１５；
    ｄ．配列番号１６及び１７；
    ｅ．配列番号１８及び１９；
    ｆ．配列番号２０及び２１；
    ｇ．配列番号２２及び２３；
    ｈ．配列番号２４及び２５；
    ｉ．配列番号２６及び２７；
    ｊ．配列番号２８及び２９；
    ｋ．配列番号３０及び３１；
    ｌ．配列番号３２及び３３；
    ｍ．配列番号３４及び３５；
    ｎ．配列番号３６及び３７；
    ｏ．配列番号３８及び３９；及び
    ｐ．配列番号４０及び４１
    からなる群から選択されるアミノ酸配列の対を含む、請求項１１に記載の抗原結合タンパク質。
  15. 抗体である、先行請求項のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  16. モノクローナル抗体である、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質。
  17. ＩｇＧ抗体である、請求項１５または１６に記載の抗原結合タンパク質。
  18. 軟寒天３Ｄ増殖アッセイにおいて少なくとも約５０％のコロニー成長を阻害する、先行請求項のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  19. ヒトがん細胞が注射された異種移植マウスにおいて腫瘍成長を阻害する、先行請求項のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  20. 膵臓癌細胞、胃腸癌細胞、膀胱癌細胞、または結腸癌細胞が注射された異種移植マウスにおいて腫瘍成長を阻害する、請求項１９に記載の抗原結合タンパク質。
  21. 膵臓癌細胞、胃腸癌細胞、膀胱癌細胞、または結腸癌細胞が注射された異種移植マウスにおいて少なくとも５０％の腫瘍成長を阻害する、請求項２０に記載の抗原結合タンパク質。
  22. （ａ）表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列または配列番号６４、８８、６９、８９、７２、７５、９１、９４、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０６、１０９からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｂ）表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号６５、６７、７０、９０、７３、７６、９２、７３、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０７、１１０からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｃ）表Ａに示されるＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号６６、６８、７１、７７、７４、７７、９３、７４、１０５、１０８、１１１からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｄ）表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列または配列番号７８、８１、８２、８６、１１４、１２０、１２３、１２６からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｅ）表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列または配列番号７９、１１２、７９、８４、１１６、１１８、１１９、１２９、１２１、１２４、１２７からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；（ｆ）表Ａに示されるＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列または配列番号８０、８３、１１３、８５、８７、１１５、１１７、１２２、１２５、１２８からなる群から選択される配列；または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または（ｇ）（ａ）～（ｆ）のうちの任意の２つ以上の組み合わせを含む、抗原結合タンパク質。
  23. ａ．配列番号７８、７９、８０、６４、６５、６６；
    ｂ．配列番号８１、１１２、８０、８８、６５、６６；
    ｃ．配列番号８１、７９、８０、６４、６７、６８；
    ｄ．配列番号８２、７９、８３、３９、７０、７１；
    ｅ．配列番号８１、７９、１１３、８９、９０、７７；
    ｆ．配列番号８１、８４、８５、７２、７３、７４；
    ｇ．配列番号８６、７９、８７、７５、７６、７７；
    ｈ．配列番号１１４、７９、１１５、９１、９２、９３；
    ｉ．配列番号８１、１１６、１１７、９４、７３、７４；
    ｊ．配列番号８１、１１８、１１７、９５、９６、７４；
    ｋ．配列番号８１、１１９、１１７、９７、９８、７４；
    ｌ．配列番号８１、１１８、８５、９９、１００、７４；
    ｍ．配列番号８１、１２９、１１７、１０１、１０２、７４；
    ｎ．配列番号１２０、１２１、１２２、１０３、１０４、１０５；
    ｏ．配列番号１２３、１２４、１２５、１０６、１０７、１０８；及び
    ｐ．配列番号１２６、１２７、１２８、１０９、１１０、１１１
    からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む、抗原結合タンパク質。
  24. ａ．表Ｂに示される重鎖可変領域アミノ酸配列または配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、２、３４、３６、３８及び４０からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または
    ｂ．表Ｂに示される軽鎖可変領域アミノ酸配列または配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９及び４１からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または
    ｃ．（ａ）及び（ｂ）の両方
    を含む、抗原結合タンパク質。
  25. 前記バリアント配列は、少なくとも約８５％の配列同一性または約９０％もしくは約９５％の配列同一性を有する、請求項２４に記載の抗原結合タンパク質。
  26. ａ．配列番号１０及び１１；
    ｂ．配列番号１２及び１３；
    ｃ．配列番号１４及び１５；
    ｄ．配列番号１６及び１７；
    ｅ．配列番号１８及び１９；
    ｆ．配列番号２０及び２１；
    ｇ．配列番号２２及び２３；
    ｈ．配列番号２４及び２５；
    ｉ．配列番号２６及び２７；
    ｊ．配列番号２８及び２９；
    ｋ．配列番号３０及び３１；
    ｌ．配列番号３２及び３３；
    ｍ．配列番号３４及び３５；
    ｎ．配列番号３６及び３７；
    ｏ．配列番号３８及び３９；及び
    ｐ．配列番号４０及び４１
    からなる群から選択されるアミノ酸配列の対を含む、抗原結合タンパク質。
  27. ａ．表Ｃ、表Ｄ、表６、表８、表９、表１０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号４２、４６、４９、５２、５５、５６、５７、及び１３１からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または
    ｂ．表Ｃ、表Ｄ、表６、表８、表９、表１０に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、または配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５３、５４、１３０、１３２、１４７、１４９、及び１５０からなる群から選択される配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；または
    ｃ．（ａ）及び（ｂ）の両方
    を含む、抗原結合タンパク質。
  28. 前記バリアント配列は、少なくとも約８５％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗原結合タンパク質。
  29. 前記バリアント配列は、少なくとも約９０％または約９５％の配列同一性を有する、請求項２７に記載の抗原結合タンパク質。
  30. ａ．配列番号４２及び４３；
    ｂ．配列番号４２及び４４；
    ｃ．配列番号４２及び４５；
    ｄ．配列番号４６及び４７；
    ｅ．配列番号４６及び４８；
    ｆ．配列番号１３１及び１４９；
    ｇ．配列番号１３１及び１５０；
    ｈ．配列番号５２及び５３；
    ｉ．配列番号５２及び５４；
    ｊ．配列番号５５及び５３；
    ｋ．配列番号５５及び５４；
    ｌ．配列番号５６及び５３；
    ｍ．配列番号５６及び５４；
    ｎ．配列番号５７及び５０；
    ｏ．配列番号５７及び５１；
    ｐ．配列番号４９及び５０；
    ｑ．配列番号４９及び５１；
    ｒ．配列番号４２及び１３０；
    ｓ．配列番号１３１及び１４７；及び
    ｔ．配列番号１３１及び１３２
    からなる群から選択されるアミノ酸配列の対を含む、抗原結合タンパク質。
  31. 非フコシル化グリカンを含むＦｃポリペプチドを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
  32. ＣＬＤＮ１８．２及び第２の抗原に結合する二重特異性抗原結合タンパク質であって、前記ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗原結合タンパク質は、先行請求項のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質または本明細書に記載のものである、前記二重特異性抗原結合タンパク質。
  33. 前記ＣＬＤＮ１８．２に結合する抗原結合タンパク質は、
    ａ．表Ｂ、表Ｃ、表Ｄ、表６、表８、表９、表１０に示される重鎖可変領域アミノ酸配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；
    ｂ．表Ｂ、表Ｃ、表Ｄ、表６、表８、表９、表１０に示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、または１または２つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列；
    ｃ．（ａ）及び（ｂ）の両方
    を含む、請求項３２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  34. 前記バリアント配列は、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項３３に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  35. Ｆｃポリペプチドを含む、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  36. 非フコシル化グリカンを含むＦｃポリペプチドを含む、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  37. 前記第２の抗原に特異的な抗体の抗原結合断片を含む、請求項３２～３６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  38. 前記第２の抗原は、Ｔ細胞によって発現される細胞表面タンパク質、任意にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の構成要素、例えば、ＣＤ３である、請求項３２～３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  39. 前記第２の抗原は、ＣＤ３である、請求項３２～３８のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  40. 前記第２の抗原は、ＣＤ３Ｅである、請求項３２～３９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  41. 前記第２の抗原は、Ｔ細胞活性化を補助する共刺激分子、例えば、ＣＤ４０または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）である、請求項３２～４０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  42. 前記第２の抗原は、Ｆｃ受容体、任意に、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃ－アルファ受容体、またはＦｃ－イプシロン受容体である、請求項３２～３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  43. 前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ６４（Ｆｃ－ガンマＲＩ）、ＣＤ３２（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＡ）、ＣＤ１６Ａ（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＩＡ）、ＣＤ１６ｂ（Ｆｃ－ガンマＲＩＩＩｂ）、ＦｃεＲＩ、ＣＤ２３（Ｆｃ－イプシロンＲＩＩ）、ＣＤ８９（Ｆｃ－イプシロンＲＩ）、Ｆｃα／μＲ、またはＦｃＲｎである、請求項４２に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  44. 前記Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６Ａである、請求項４３に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  45. 前記第２の抗原は、免疫チェックポイント分子、例えば、免疫チェックポイント経路に関与するタンパク質、任意に、Ａ２ＡＲ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、またはＳＩＧＬＥＣ７である、請求項３２～３７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  46. 前記免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＣＴＬＡ４である、請求項４５に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  47. 本開示のＣＬＤＮ１８．２抗体（例えば、表Ｂ、表Ｃ、表Ｄ、表６、表８、表９、または表１０）のいずれかのｓｃＦｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ）２’を含む、請求項３２～４６のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  48. 表１１または配列番号１４３、１４４、１４５、または１４６に示される配列、または１～５つのアミノ酸だけ異なるまたは少なくともまたは約７０％の配列同一性を有するそれらのバリアント配列を含む抗原結合タンパク質を含む、請求項３２～４７のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  49. 前記バリアント配列は、少なくともまたは約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項４８に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  50. ナノボディ、ダイアボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ＣｒｏｓｓＭａｂ、またはＨＳＡｂｏｄｙの構造を含む、請求項３２～４９のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質。
  51. 先行請求項のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質もしくは二重特異性抗原結合タンパク質または本明細書に記載のものを含むコンジュゲート。
  52. 前記抗原結合タンパク質は、配列番号４２及び配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項５１に記載のコンジュゲート。
  53. 細胞傷害剤または化学療法剤を含む、請求項５１または５２に記載のコンジュゲート。
  54. 前記化学療法剤は、チューブリン重合を阻害することによって細胞分裂を阻害する抗有糸分裂剤である、請求項５３に記載のコンジュゲート。
  55. 前記抗有糸分裂剤は、アウリスタチンである、請求項５４に記載のコンジュゲート。
  56. 前記アウリスタチンは、ＭＭＡＥである、請求項５５に記載のコンジュゲート。
  57. 前記剤は、切断可能なリンカーを介して前記抗原結合タンパク質にコンジュゲートされている、請求項５１～５６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  58. 前記切断可能なリンカーは、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢである、請求項５７に記載のコンジュゲート。
  59. 前記抗原結合タンパク質は、抗体である、請求項５１～５８のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  60. 前記抗体は、モノクローナル抗体であり、任意に前記モノクローナル抗体は、ＩｇＧ抗体である、請求項５９に記載のコンジュゲート。
  61. 前記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項５９または６０に記載のコンジュゲート。
  62. 抗原結合タンパク質当たりのコンジュゲートされた前記剤の単位の平均数は、１～８の範囲内であり、好ましくは抗原結合タンパク質当たりのコンジュゲートされた前記剤の単位の前記平均数は、３～８の範囲内である、請求項５１～６１のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  63. 前記コンジュゲートは、異種コンジュゲートである、請求項５１～６２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  64. 前記コンジュゲートは、同種コンジュゲートである、請求項５１～６２のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  65. 前記剤は、前記抗原結合タンパク質の特定の部位でコンジュゲートされている、請求項５１～６２及び６４のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  66. 前記特定の部位は、不対システイン残基である、請求項６５に記載のコンジュゲート。
  67. 前記コンジュゲートは、ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ－ＭＭＡＥにコンジュゲートされた配列番号４２及び配列番号４５に示されるアミノ酸を含むポリペプチドを含む、請求項５１～６６のいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  68. 先行請求項のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質もしくは二重特異性抗原結合タンパク質または本明細書に記載のものを含む融合タンパク質。
  69. １～３１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、請求項３２～５０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、請求項５１～６７のいずれか１項に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
  70. 請求項６９に記載の核酸を含むベクター。
  71. 請求項６９に記載の核酸または請求項７０に記載のベクターを含む宿主細胞。
  72. クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に結合する抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質を生成する方法であって、（ｉ）細胞培地において請求項７１に記載の宿主細胞を培養することであって、前記宿主細胞は、先行請求項のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、前記培養すること、及び（ｉｉ）前記細胞培地から前記抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質を収穫することを含む、前記方法。
  73. クローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）タンパク質に結合する抗原結合タンパク質または二重特異性抗原結合タンパク質を含む融合タンパク質を生成する方法であって、（ｉ）細胞培地において請求項７１に記載の宿主細胞を培養することであって、前記宿主細胞は、請求項６９に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、前記培養すること、及び（ｉｉ）前記細胞培地から前記融合タンパク質を収穫することを含む、前記方法。
  74. 薬学的組成物を生成する方法であって、請求項１～３１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、請求項３２～５０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、請求項５１～６７のいずれか１項に記載のコンジュゲート、請求項６８に記載の融合タンパク質、請求項６９に記載の核酸、請求項７０に記載のベクター、請求項７１に記載の宿主細胞、またはそれらの組み合わせ、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を組み合わせることを含む、前記方法。
  75. 請求項１～３１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、請求項３２～５０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、請求項５１～６７のいずれか１項に記載のコンジュゲート、請求項６８に記載の融合タンパク質、請求項６９に記載の核酸、請求項７０に記載のベクター、請求項７１に記載の宿主細胞、またはそれらの組み合わせ、及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物。
  76. ＣＬＤＮ１８．２を発現するがんを有する対象を処置する方法であって、前記がんを処置するのに有効な量で請求項７５に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  77. 対象における腫瘍成長を阻害する方法であって、腫瘍成長を阻害するのに有効な量で請求項７５に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  78. 対象における腫瘍サイズを減少させる方法であって、腫瘍サイズを減少させるのに有効な量で請求項７５に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  79. 対象におけるがんの再発を予防する方法であって、がんの再発を予防するのに有効な量で請求項７５に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  80. ＣＬＤＮ１８．２の低過剰発現体であると診断された対象におけるがんを処置する方法であって、がんの再発を予防するのに有効な量で請求項７５に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
  81. 前記投与することは、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項７６～８１のいずれか１項に記載の方法。
  82. 前記投与することは、ＣＬＤＮ１８．２を発現する細胞においてアポトーシスを誘導する、請求項７６～８２のいずれか１項に記載の方法。
  83. サンプルにおけるクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）を検出する方法であって、前記サンプルを請求項１～３１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、請求項３２～５０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、請求項５１～６７のいずれか１項に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の融合タンパク質と接触させること、及びＣＬＤＮ１８．２に結合した前記抗原結合タンパク質、コンジュゲートまたは融合タンパク質を含む免疫複合体についてアッセイすることを含む、前記方法。
  84. 対象におけるクローディン１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）陽性癌を診断する方法であって、前記対象から得られた細胞または組織を含む生物学的サンプルを請求項１～３１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、請求項３２～５０のいずれか１項に記載の二重特異性抗原結合タンパク質、請求項５１～６７のいずれか１項に記載のコンジュゲート、または請求項６８に記載の融合タンパク質と接触させること、及びＣＬＤＮ１８．２に結合した前記抗原結合タンパク質、コンジュゲートまたは融合タンパク質を含む免疫複合体についてアッセイすることを含む、前記方法。
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