KR20240044467A - Cldn18.2-표적화 항체, 이중특이적 항체, 및 이들의 용도 - Google Patents

Cldn18.2-표적화 항체, 이중특이적 항체, 및 이들의 용도 Download PDF

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윤 장
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Abstract

본 발명은 CLDN18.2-표적화 항체, 이중특이적 항체, 및 이들의 용도를 개시한다. CLDN18.2-표적화 항체는 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 종양 세포에 대해 높은 친화성을 가지며 높은 세포내이입 활성을 유도할 수 있는 단일도메인 중쇄 항체이다. 이중특이적 항체는 CLDN18.2 및 CD3를 표적화할 수 있고 FcRn에 대한 Fc의 결합 효과를 유지하며; 한편, FcgR에 대한 결합을 감소시켜 FcgR의 가교로 인한 비특이적 T 세포의 활성화를 감소시키기 위해서는 돌연변이 Fc가 바람직하다. CD3-말단 활성은 IL6 및 TNFα와 같은, CRS의 일반적인 사이토카인의 방출이 감소될 수 있도록 최적화된다.

Description

CLDN18.2-표적화 항체, 이중특이적 항체, 및 이들의 용도
본 발명은 바이오의약 분야, 특히 CLDN18.2-표적화 항체, 이중특이적 항체, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
암은 오늘날 인간에게 가장 치명적인 질병 중 하나이다. 세계보건기구(WHO)의 2018년 보고서에 따르면 매년 약 1,807만 건의 새로운 암 사례가 발생하고 있다. 매년 약 955만 명이 암으로 사망한다. WHO 추정에 따르면, 위암은 세계에서 가장 흔히 진단되는 암 중 5위를 차지하고 있다. 위암은 암 관련 사망 원인 중 3위(남성) 및 4위(여성)를 차지하고 있다. 매년 전 세계적으로 100만 건의 새로운 위암 사례가 발생하고 있다. 미국에서 위암으로 1차 진단을 받는 환자의 약 35%는 전이성 위암 환자이다. 진행성 위암으로 진단받은 사람의 5년 생존율은 5%이며, 중위 생존기간은 약 6개월이다. 전이성/재발성 위암 환자 치료를 위한 1차 약물은 다음의 두 가지 경우로 나뉜다: (1) HER2-neu 양성 환자의 경우, 트라스투주맙을 화학요법 약물과 병용하여 사용한다; (2) HER2-neu 음성 환자의 경우, 치료는 화학요법 약물로 제한되지만, 치료 결과는 좋지 않다(Front Pharmacol. 2018 Sep 13; 9: 404).
CLDN18(클라우딘18) 분자의 스플라이스 변이체 1(CLD18A1, 즉 CLDN18.1, Genbank 수탁번호 NP_057453, NM016369) 및 스플라이스 변이체 2(CLD18A2, 즉 CLDN18.2, Genbank 수탁번호 NM_001002026, NP_001002026)는 약 27.9/27.72 kD의 분자량을 갖는 필수 막관통 단백질이다. 클라우딘은 상피와 내피의 밀착 연접부에 위치한 필수 막 단백질이다. 밀착 연접 계열의 다른 두 가지 주요 단백질은 오클루딘과 연접 접착 분자(JAM)이다. 클라우딘은 밀착 연접부의 필수 구성요소로, 상피 세포의 극성을 유지하고 세포간 확산을 제어하며 세포의 성장과 분화를 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 클라우딘은 잘 구성된 상피에서는 항체 근처에 거의 접근할 수 없지만 종양 세포에서는 노출되는 것으로 추측된다. 클라우딘 분자는 N-말단과 C-말단이 모두 세포질에 존재하면서 세포막을 4번 가로지른다. 인간 CLDN18.2(클라우딘 18.2) 단백질은 전장 261개 아미노산을 갖는 막관통 단백질이며, 그중 1~23개가 신호 펩티드를 형성하고; 신호 펩티드 다음에 2개의 막외 영역,즉 약 55개 아미노산의 세포외 루프 1(ECL1)과 약 23개 아미노산의 ECL2를 가지고 있다. CLDN18.1(클라우딘 18.1)과 CLDN18.2는 첫 번째 TM과 루프 1(즉, ECL1)을 포함하여 N-말단의 처음 21개 아미노산이 디르지만, C-말단에 동일한 1차 단백질 서열을 가지고 있다. 인간 CLDN18.2와 인간 CLDN18.1의 ECL1 영역은 매우 유사하며, 인간 CLDN18.2와 인간 CLDN18.1의 ECL2 영역은 동일하다. 따라서, 인간 CLDN18.2 단백질 표적에 대한 항체 개발은 ECL1 영역 또는 인간 CLDN18.2 단백질의 공간 구조에서 표적화된 항체에 대한 검색을 필요로 한다. 이는 이러한 측면의 작업을 더 어렵게 만든다. CLDN18.1은 정상 폐와 위의 상피에서 선택적으로 발현된다(Mol Cell Biol. 2001 Nov; 21(21): 7380-90). 정상 조직에서 CLDN18.2의 발현은 위 상피의 분화된 세포로 매우 제한되어 있고, 위 줄기 세포 영역에는 없다. 그러나, 이는 위, 식도, 췌장, 및 폐 종양뿐만 아니라 인간 암 세포주를 포함한 여러 유형의 암에서 높게 발현된다. 단백질의 분자량은 일부 암 및 인접 정상 조직에 따라 다르다. 건강한 조직에서 관찰되는 고분자량 단백질은 조직 용해물을 탈글리코실화 화합물 PNGaseF로 처리함으로써 암에서 관찰되는 것과 동일한 분자량을 갖는 단백질로 전환될 수 있다. 이는 정상 조직 대응물에 비해 암에서 클라우딘의 N-글리코실화 수준이 더 낮다는 것을 시사한다. 이러한 구조적 차이로 인해 변경된 에피토프가 발생할 가능성이 있다. 전형적인 N-글리코실화 모티프는 분자의 루프 D3 도메인 내 116번 위치의 아미노산에 있다. (CN103509110B).
현재 CLDN18.2에 대한 단일클론 항체에 관한 연구는 클라우딕시맙(IMAB362) 항체의 II상 및 III상 임상 시험으로 제한되어 있다(WO 2014/146672 참조). IMAB362는 ADCC(항체 의존성 세포 매개 세포독성) 및 CDC(보체 의존성 세포독성) 효과를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 종양 사멸을 매개할 수 있다. IMAB362는 진행성 위식도암 치료를 위한 I상 및 II상 임상 시험에서 고무적인 효과를 나타냈다(Eur J Cancer. 2018 Sep; 100: 17-26). 그러나, IMAB362는 인간 또는 뮤린의 키메라 항체이므로, 면역원성 위험이 수반되고, 친화성이 높지 않다. 다수의 악성 종양에 대한 의학적 요구가 충족되지 않음으로 인해, 보다 바람직한 약학적 특성을 갖는 다른 CLDN18.2 항체가 필요하다. 따라서, 인간 CLDN18.2 단백질을 표적화하는 효과적인 항체, 특히 완전 인간 단일클론 항체뿐만 아니라 더 나은 세포 결합 활성을 갖는 단일클론 항체가 업계에 부족하다.
현재 임상 개발 중인 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체는 Amgen의 AMG910을 포함한다. AMG910은 TDCC(T-세포 의존성 세포매개 세포독성) 효과를 유도하여 종양 사멸을 매개할 수 있다. 그러나, 종래 기술의 항체는 반감기가 짧고, 약효가 좋지 않고, 사이토카인 방출 증후군(CRS)을 유발하는 등의 문제가 있을 수 있다. 따라서, 인간 CLDN18.2와 CD3를 둘 다 표적화하고 시노몰구스 CLDN18.2와 CD3에 결합할 수 있는 보다 안전하고 더 효과적인 이중특이적 항체를 개발하는 것이 시급히 필요하다.
인간 CLDN18.2를 표적화하는 안전하고 효과적인 단일클론 항체 및 인간 CLDN18.2와 CD3를 둘 다 표적화하고 시노몰구스 CLDN18.2와 CD3에 결합할 수 있는 이중 특이적 항체가 부족한 종래 기술의 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명은 CLDN18.2-표적화 단일클론 항체, CLDN18.2 및 CD3-표적화 이중특이적 항체, 및 이들의 용도를 제공한다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제1 양태는 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 CLDN18.2-표적화 항체로서, HCDR1은 서열번호 16 내지 18 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 42 내지 46 및 서열번호 48 내지 54 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 77 내지 82 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 42, 및 서열번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 43, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 44, 및 서열번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 17, 서열번호 45, 및 서열번호 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 18, 서열번호 43, 및 서열번호 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 18, 서열번호 43, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 43, 및 서열번호 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 46, 및 서열번호 82에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 48, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 49, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 50, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 51, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 52, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 53, 및 서열번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 54, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3에 대한 아미노산 서열의 상기 조합은 아래 표 a에 상세히 제시되어 있다.
[표 a]
본 발명의 바람직한 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 프레임 영역을 추가로 포함하고, 그중 HFR1은 서열번호 6 또는 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR2는 서열번호 28 내지 34 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR3은 서열번호 63 내지 68 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR4는 서열번호 84 및 86 내지 89 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 150 내지 157 및 서열번호 159 내지 165 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 자세한 내용은 표 b 참조.
[표 b]
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 더 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 hIgG1, hIgG2, hIgG3, 및 hIgG4 및 이들의 변이체로부터 선택된다. 더욱 더 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 hIgG1이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 항체는 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 중쇄 항체, 또는 단일도메인 항체, 또는 상기 항체들로부터 제조된 단일클론 또는 다중클론 항체이다.
본 발명의 더욱 더 바람직한 구현예에서, 항체는 서열번호 182 내지 189 및 서열번호 191 내지 197 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일도메인 항체이다. 자세한 내용은 표 c 참조.
[표 c]
본 발명에서, "Fab 단편"은 하나의 경쇄 및, 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 이황화 결합을 형성할 수 없다. "Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2개의 중쇄 단편을 포함한다. 2개의 중쇄 단편은 2개 이상의 이황화 결합 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 결합되어 있다. "Fab' 단편"은 하나의 경쇄 및, VH 도메인 및 CH1 도메인 및 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이의 영역을 포함하는 하나의 중쇄의 일부를 포함하므로, 2개의 Fab' 단편의 2개의 중쇄 사이에 쇄간 이황화 결합이 형성되어 F(ab')2 분자를 제공할 수 있다. "F(ab')2 단편"은 2개의 경쇄 및, 2개의 중쇄 사이에 쇄간 이황화 결합이 형성되도록 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이에 불변 영역의 일부를 포함하는 2개의 중쇄를 포함한다. 따라서, F(ab')2 단편은 2개의 중쇄 사이에 이황화 결합에 의해 함께 결합된 2개의 Fab' 단편으로 구성된다. "Fv"라는 용어는 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성되지만 불변 영역이 없는 항체 단편을 의미한다.
본 발명에서, scFv(단일쇄 항체 단편)는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 및 15~20개 아미노산의 짧은 펩티드를 포함하는, 당업계의 통상적인 단일쇄 항체일 수 있다. scFv에서, VL 및 VH 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄를 생성하게 할 수 있는 링커를 통해 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한다(예를 들어, 문헌[Bird et al, Science 242:423-426 (1988) 및 Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)] 참조). 이러한 scFv 분자는 NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH의 일반 구조를 가질 수 있다. 종래 기술의 적절한 링커는 반복된 G4S 아미노산 서열 또는 이의 변이체로 구성된다. 예를 들어, 아미노산 서열 (G4S)4 또는 (G4S)3을 갖는 링커가 사용될 수 있으나, 이의 변이체가 사용될 수도 있다.
"다중특이적 항체"라는 용어는 다중 에피토프 특이성을 갖는 항체를 포함하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 이러한 다중특이적 항체는, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고 VH-VL 단위가 다중 에피토프 특이성을 갖는 항체; 2개 이상의 VL 및 VH 영역을 갖고 각 VH-VL 단위가 상이한 표적에 결합하거나 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합하는 항체; 2개 이상의 단일 가변 영역을 갖고 각 단일 가변 영역이 상이한 표적에 결합하거나 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합하는 항체; 전장 항체, 항체 단편, 이중특이적 항체, 트리아바디, 공유결합 또는 비공유결합으로 함께 연결된 항체 단편 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체를 포함한다. 본 발명의 단일클론 항체 또는 mAb 또는 Ab는 진핵, 원핵, 또는 파지 클론 세포주에 국한되지 않는 단일클론 세포주로부터 얻은 항체를 의미한다.
본 발명에서, HCAb라고도 지칭되는 "중쇄 항체"는 단 하나의 중쇄 가변 영역(VHH)과 2개의 통상적인 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 항체를 의미한다.
본 발명에서, "나노바디"라고도 지칭되는 "단일도메인 항체"는 중쇄 항체로부터 클로닝된 VHH 구조를 의미한다. 이는 표적 항원에 결합할 수 있는 것으로 알려진 가장 작은 단위이다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제2 양태는 CD3를 표적화하는 제1 단백질 기능 영역 및 CLDN18.2를 표적화하는 제2 단백질 기능 영역을 포함하는 이중특이적 항체를 제공하며;
제1 단백질 기능 영역은 Fab 형태이고 제2 단백질 기능 영역은 VH 형태로 바람직하게는 2 또는 3개의 VH를 포함하고; 제2 단백질 기능 영역이 직렬 연결된 3개의 VH를 포함하는 경우, 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역은 각각 Fc의 이중 가닥에 연결되고; 제2 단백질 기능 영역이 직렬 연결된 2개의 VH를 포함하는 경우, 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역은 각각 Fc의 이중 가닥에 연결되고; 제2 단백질 기능 영역이 3개의 VH를 포함하고 3개의 VH 중 하나가 제1 단백질 기능 영역에 연결되는 경우, 나머지 2개의 VH는 직렬 연결되고, 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역의 직렬 연결된 2개의 VH는 각각 Fc의 이중 가닥에 연결되거나;
대안적으로, 제1 단백질 기능 영역은 Fab 형태이고 제2 단백질 기능 영역은 HCAb 형태이거나;
대안적으로, 제1 단백질 기능 영역은 Fab 형태이고 제2 단백질 기능 영역은 VH-HCAb 형태이고 제2 단백질 기능 영역은 바람직하게는 총 4개의 VH를 포함한다.
본 발명에서, 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역에서의 "제1" 및 "제2"는 실질적인 의미를 갖지 않으며, 단지 서로 다른 표적에 대한 항원 결합 도메인을 구별하기 위해 사용된다. 하나의 단백질 기능 영역은 동일한 형태 또는 상이한 형태의 복수의 항원 결합 도메인을 포함하며; 상이한 단백질 기능 영역의 항원 결합 도메인은 함께 작동 가능하게 연결될 수 있고, 동일한 단백질 기능 영역의 상이한 항원 결합 도메인은 서로 연결되지 않을 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서, 제1 단백질 기능 영역은 CD3-표적화 항원 결합 도메인일 수 있고, 제2 단백질 기능 영역은 CLDN18.2-표적화 항원 결합 도메인일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 제2 단백질 기능 영역은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, HCDR1은 서열번호 16 내지 18 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 42 내지 46 및 서열번호 48 내지 54 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 77 내지 82 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
더 바람직하게는, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 42, 및 서열번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 43, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 44, 및 서열번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 48, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 49, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 50, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 51, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 52, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 53, 및 서열번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 54, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함한다. 자세한 내용은 표 d 참조.
[표 d]
더욱 더 바람직하게는, 중쇄 가변 영역은 서열번호 150 내지 152 및 서열번호 159 내지 165 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하며, 이들 모두는 표 b에 나열되어 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 제1 단백질 기능 영역은 서열번호 101, 서열번호 116, 및 서열번호 131에 각각 제시된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 11, 서열번호 38, 및 서열번호 72에 각각 제시된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
바람직하게는, 중쇄 가변 영역은 서열번호 149 또는 서열번호 144에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄는 서열번호 168에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 제1 단백질 기능 영역의 아미노산 서열은 아래 표 e에 제시되어 있다.
[표 e]
바람직하게는, 이중특이적 항체는 하기 형태의 3개의 폴리펩티드 쇄를 포함하며:
Fc의 2개의 N-말단이 각각 Fab 및 VH에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3 또는 VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCD3-CH1-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나;
대안적으로, HCAb의 하나의 C-말단이 Fab의 VH 또는 VL에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-VHCD3-CH1로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나; 대안적으로 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-VLCD3-CL로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VHCD3-CH1로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나; 대안적으로, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-VHCD3-CH1로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나; 대안적으로, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-VLCD3-CL로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VHCD3-CH1로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나;
대안적으로, Fab의 중쇄의 N-말단이 하나의 VHCLDN18.2에 연결되고, 중쇄의 C-말단이 Fc의 하나의 N-말단에 연결되고, 직렬 연결된 VH의 C-말단이 Fc의 다른 N-말단에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-VHCD3-CH1-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖는다.
더 바람직하게는, VH, CH2-CH3, 및 VL과 같은 서로 다른 기능 단위는 바람직하게는 서열번호 244 내지 248 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 바람직하게는 서열번호 246에 제시된 서열을 포함하는 링커 펩티드에 의해 작동 가능하게 연결된다. 자세한 내용은 표 f 참조.
[표 f]
본 발명의 일 구현예에서, Fc의 2개의 N-말단이 각각 Fab 및 VH에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3 또는 VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCD3-CH1-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나(구체적인 예는 도 4의 구조 (1) 및 (7) 참조);
대안적으로, HCAb의 하나의 C-말단이 Fab의 VH 또는 VL에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-링커 펩티드-VHCD3-CH1로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나; 대안적으로, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-링커 펩티드-VLCD3-CL로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VHCD3-CH1로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나(구체적인 예는 도 4의 구조 (2) 및 (3) 참조);
대안적으로, VH-HCAb의 하나의 C-말단이 Fab의 VH 또는 VL에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-링커 펩티드-VHCD3-CH1로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나; 대안적으로, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-링커 펩티드-VLCD3-CL로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VHCD3-CH1로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나(구체적인 예는 도 4의 구조 (4) 및 (5) 참조);
대안적으로, Fab의 중쇄의 N-말단이 하나의 VHCLDN18.2에 연결되고, 중쇄의 C-말단이 Fc의 하나의 N-말단에 연결되고, 직렬 연결된 VH의 C-말단이 Fc의 다른 N-말단에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCD3-CH1-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖는다(구체적인 예는 도 4의 구조 (6) 참조).
본 발명의 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 214에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 220에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 221에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 222에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 223에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 225에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 228에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 230에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 229에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 231에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 232에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 229에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 233에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 234에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 209에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 221에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 209에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 236에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 236에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 237에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 238에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 239에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 240에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 241에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 242에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 243에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 특정 구현예의 서열에 대한 정보는 아래 표 g에 제시되어 있다.
[표 g]
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제3 양태는 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다.
핵산의 제조 방법은 당업계의 통상적인 제조 방법이며, 바람직하게는 다음의 단계를 포함한다: 유전자 클로닝 기술을 통해 상기 항체를 암호화하는 핵산 분자를 얻는 단계, 또는 인공적인 완전 서열 합성을 통해 상기 항체를 암호화하는 핵산 분자를 얻는 단계.
상기 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열에 치환, 결실, 변경, 삽입, 또는 부가를 적절하게 도입하여 폴리뉴클레오티드 상동체를 제공할 수 있다는 것은 당업자에게 알려져 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 상동체는 항체의 활성이 유지되는 범위 내에서 항체 서열을 암호화하는 유전자의 하나 이상의 염기를 치환하거나, 결실시키거나, 또는 부가함으로써 생성될 수 있다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제4 양태는 본 발명의 제3 양태에 따른 단리된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 재조합 발현 벡터는 당업계의 통상적인 방법을 사용하여, 즉 본 발명의 핵산 분자를 다양한 발현 벡터에 연결함으로써 얻을 수 있다. 발현 벡터는 상기 핵산 분자를 운반할 수 있다면 당업계의 임의의 통상적인 벡터이다.
바람직하게는, 재조합 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지, 또는 바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터는 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 아데노-관련 바이러스 벡터이다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제5 양태는 본 발명의 제4 양태에 따른 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 포함하는 형질전환체를 제공하며; 바람직하게는, 숙주 세포는 대장균 TG1, BL21 세포, 또는 CHO-K1 세포이다.
재조합 발현 형질전환체는 당업계의 통상적인 방법을 사용하여, 즉 상기 재조합 발현 벡터를 숙주 세포 내에 형질전환시킴으로써 제조될 수 있다. 숙주 세포는 상기 재조합 발현 벡터의 안정적인 복제를 가능하게 할 수 있고 운반되는 핵산이 효율적으로 발현될 수 있다면 당업계의 임의의 통상적인 숙주 세포이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 대장균 TG1 또는 BL21 세포(단일쇄 항체 또는 Fab 항체 발현 세포), 또는 CHO-K1 세포(전장 IgG 항체 발현 세포)이다. 본 발명의 바람직한 재조합 발현 형질전환체는 상기 재조합 발현 플라스미드를 숙주 세포 내에 형질전환시킴으로써 얻을 수 있다. 형질전환 방법은 당업계의 통상적인 형질전환 방법이며, 바람직하게는 화학적 형질전환 방법, 열충격 방법, 또는 전기적 형질전환 방법이다.
본 발명에서, CLDN18.2-표적화 항체는 키메라 항원 수용체(CAR) 등을 T 세포 또는 NK 세포와 같은 세포에 변형시키도록 제조하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 제6 양태는 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다.
예를 들어, 키메라 항원 수용체는 다음의 구조: (a) CLDN18.2를 특이적으로 인식하는 세포외 결합 도메인 scFv; (b) 힌지 도메인; (c) 막관통 도메인; (d) 공동자극 세포내 도메인; 및 (e) 신호전달 도메인을 포함할 수 있으며, 세포외 결합 도메인은 본 발명의 제1 양태에 따른 CLDN18.2-표적화 항체를 포함한다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제7 양태는 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 유전자 변형 세포를 제공한다. 바람직하게는, 유전자 변형 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 단리된 인간 세포, 더 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 세포이다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제8 양태는 본 발명의 제5 양태에 따른 형질전환체를 배양하는 단계, 및 배양물로부터 항체 또는 이중특이적 항체를 얻는 단계를 포함하는 이중특이적 항체 제조 방법을 제공한다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제9 양태는 세포독성제, 및 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 항체-약물 접합체(ADC)를 제공하며; 바람직하게는, 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE이다.
항체-약물 접합체의 제조 방법은 당업계의 통상적인 방법, 바람직하게는 문헌[Doronina, 2006, Bioconjugate Chem. 17, 114-124]에 기술된 제조 방법일 수 있다. 바람직하게는, 제조 방법은 10% 미만의 최소한의 낮은 접합 분율(LCF)을 갖는 항체-약물 접합체를 생성한다.
항체-약물 접합체는 당업계에 알려진 임의의 물리적 형태로 존재할 수 있고, 바람직하게는 투명한 용액으로 존재할 수 있다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제10 양태는 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 약학적 조성물은 호르몬제, 소분자 표적제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양용해 약물, 세포독성제, 사이토카인, 보조자극 분자의 활성화제, 억제 분자 억제제, 및 백신으로 이루어진 군의 하나 이상을 추가로 포함한다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제11 양태는 CD3 및/또는 CLDN18.2-관련 질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조에 있어서 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 항체 또는 본 발명의 제10 양태에 따른 약학적 조성물의 용도를 제공하며;
질환은 바람직하게는 암이고, 암은 바람직하게는 유방암, 난소암, 자궁내막암, 신장암, 흑색종, 폐암, 위암, 간암, 식도암, 자궁경부암, 두경부 종양, 담관암종, 담낭암, 방광암, 육종, 또는 결장직장암이고; 바람직하게는, 암은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 신장암, 또는 담관암종이고; 더 바람직하게는, 암은 유방암이다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제12 양태는 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 항체, 본 발명의 제6 양태에 따른 키메라 항원 수용체, 본 발명의 제7 양태에 따른 유전자 변형 세포, 또는 본 발명의 제9 양태에 따른 항체-약물 접합체 또는 본 발명의 제10 양태에 따른 약학적 조성물을 포함하는 키트를 제공하며;
바람직하게는,키트는 (i) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항체-약물 접합체 또는 약학적 조성물을 투여하기 위한 장치; 및/또는 (ii) 설명서를 추가로 포함한다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제13 양태는 키트 A 및 키트 B를 포함하는 부품 키트로서,
키트 A는 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 항체, 본 발명의 제6 양태에 따른 키메라 항원 수용체, 본 발명의 제7 양태에 따른 유전자 변형 세포, 본 발명의 제9 양태에 따른 항체-약물 접합체 및/또는 본 발명의 제10 양태에 따른 약학적 조성물을 포함하고;
키트 B는 다른 항종양 항체를 포함하거나, 또는 다른 항종양 항체, 및/또는 호르몬제, 소분자 표적제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양용해 약물, 세포독성제, 사이토카인, 보조자극 분자의 활성화제, 억제 분자 억제제, 및 백신으로 이루어진 군의 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는, 부품 키트를 제공한다.
키트 A와 키트 B는 동시에 사용될 수 있거나, 키트 B의 사용 전에 키트 A가 사용될 수 있거나, 키트 A의 사용 전에 키트 B가 사용될 수 있다. 사용 순서는 구체적인 용도에서의 실제 요구 사항에 따라 결정될 수 있다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제14 양태는 CLDN18.2-매개 질환 또는 장애를 진단, 치료, 및/또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 항체, 본 발명의 제6 양태에 따른 키메라 항원 수용체, 본 발명의 제9 양태에 따른 항체-약물 접합체 또는 본 발명의 제10 양태에 따른 약학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계, 또는 이를 필요로 하는 환자를 본 발명의 제13 양태에 따른 부품 키트를 사용하여 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 질환 또는 장애는 종양, 바람직하게는 CLDN18.2 양성 종양, 더 바람직하게는 위암, 식도암, 폐암, 난소암, 흑색종, 신장암, 유방암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 방광암, 두경부암, 기관지 암종, 신경교종, 및/또는 백혈병이다.
본 발명에서 사용되는 "CLDN18.2 양성"은 CLDN18.2 단백질, 예를 들어 CLDN18.2-양성 세포 NUGC4_D8 세포주의 과발현을 의미하며; 그렇지 않을 경우 "CLDN18.2 음성"이라고 한다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제15 양태는 CLDN18.2의 면역검출 또는 결정 방법으로서, 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 항체, 본 발명의 제6 양태에 따른 키메라 항원 수용체, 본 발명의 제9 양태에 따른 항체-약물 접합체, 또는 본 발명의 제10 양태에 따른 약학적 조성물을 사용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 검출은 비진단 및/또는 치료 목적을 위한 것이다.
상기 기술적 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 제16 양태는 병용 요법으로서, 이를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 제1 양태에 따른 항체 또는 본 발명의 제2 양태에 따른 이중특이적 항체, 본 발명의 제6 양태에 따른 키메라 항원 수용체, 본 발명의 제9 양태에 따른 항체-약물 접합체 또는 본 발명의 제10 양태에 따른 약학적 조성물, 및 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 병용 요법을 제공하며, 제2 치료제는 바람직하게는 다른 항종양 항체를 포함하거나, 또는 다른 항종양 항체, 및/또는 호르몬제, 소분자 표적제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양용해 약물, 세포독성제, 사이토카인, 보조자극 분자의 활성화제, 억제 분자 억제제, 및 백신으로 이루어진 군의 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.
본 출원에서, 나열된 CDR의 아미노산 서열은 모두 Chothia 방식에 따라 표시된다(본 발명의 청구범위에 있는 서열도 Chothia 방식에 따라 표시됨). 그러나, 서열 가변성을 기반으로 하는 Kabat 방식(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institutes of Health (U.S.), Bethesda, Maryland (1991)] 참조) 및 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 하는 Chothia 방식(문헌[J Mol Biol 273: 927-48, 1997] 참조)과 같은 다양한 방법을 사용하여 당업계에서 항체의 CDR을 정의할 수 있다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 출원에서, Kabat 방식 및 Chothia 방식을 포함하는 조합 방식을 사용하여 가변 도메인 서열의 아미노산 잔기를 결정할 수도 있다. 조합 방식은 Kabat 방식과 Chothia 방식을 조합하여 더 넓은 범위를 얻는다. 자세한 내용은 표 1 참조. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 주어진 항체 또는 이의 영역(예를 들어, 가변 영역)의 "CDR" 및 "상보성 결정 영역"이라는 용어는 본원에 기술된 상기 공지된 방식 중 어느 하나에 의해 정의된 상보성 결정 영역을 포괄하는 것으로 해석된다. 본 발명의 청구범위에 청구된 범위는 Chothia 방식에 기초하여 표시된 서열이지만, 다른 CDR-정의 방식에 해당하는 아미노산 서열도 본 발명의 범위에 속한다.
[표 1]
Chothia 방식에서, Laa-Lbb는 항체의 경쇄의 N-말단에서 시작하여 aa 위치에서 bb 위치까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있으며; Haa-Hbb는 항체의 중쇄의 N-말단에서 시작하여 aa 위치에서 bb 위치까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들어, L24-L34는 항체의 경쇄의 N-말단에서 시작하여 Chothia 방식에 따른 24번 위치에서 34번 위치까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있으며; H26-H32는 항체의 중쇄의 N-말단에서 시작하여 Chothia 방식에 따른 26번 위치에서 32번 위치까지의 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. Chothia 방식을 사용하여 CDR 넘버링함에 있어서 삽입 부위가 존재하는 위치가 있다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명에서, 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 또한, 본원에 사용된 세포 배양, 분자 유전학, 핵산 화학, 및 면역학의 실험실 작업은 해당 분야에서 널리 사용되는 통상적인 절차이다. 한편, 본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 관련 용어의 정의 및 설명이 아래에 제공된다.
본 발명에 사용된 아미노산에 대한 3문자 코드 및 단일문자 코드는 당업자에게 알려져 있거나, 문헌[J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)]에 기술되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "포함한다/포함하는"이라는 용어는 조성물 및 방법이 설명된 요소를 포함하나 다른 요소를 배제하지 않음을 의미하고자 하는 것이지만; 문맥에 따라 "구성된다/구성되는"의 경우도 포함된다.
"CLDN18.2"라는 용어는 이소형, 포유류(예를 들어, 인간) CLDN18.2, 인간 CLDN18.2의 종 동족체, 및 CLDN18.2와 적어도 하나의 공통의 에피토프를 포함하는 유사체를 포함한다. CLDN18.2(예를 들어, 인간 CLDN18.2)의 아미노산 서열은 NCBI 데이터베이스에 나타난 바와 같이 당업계에 알려져 있다.
"CLDN18.1"이라는 용어는 이소형, 포유류(예를 들어, 인간) CLDN18.1, 인간 CLDN18.1의 종 동족체, 및 CLDN18.1와 적어도 하나의 공통의 에피토프를 포함하는 유사체를 포함한다. CLDN18.1(예를 들어, 인간 CLDN18.1)의 아미노산 서열은 NCBI 데이터베이스에 나타난 바와 같이 당업계에 알려져 있다.
"에피토프"라는 용어는 항체 분자와 특이적으로 상호작용하는 항원(예를 들어, 인간 CLDN18.2)의 부분을 의미한다. 본 발명에서 "경쟁적"이라는 용어는 표적(예를 들어, 인간 CLDN18.2)에 대한 항-CLDN18.2 항체 분자의 결합을 방해하는 항체 분자의 능력을 의미한다. 결합에 대한 방해는 직접적이거나 간접적(예를 들어, 항체 분자 또는 표적의 알로스테릭 조절을 통해)일 수 있다. 항체 분자가 표적에 대한 다른 항체 분자의 결합을 어느 정도 방해할 수 있는지 결정하기 위해 경쟁적 결합 분석(예를 들어, FACS 분석, ELISA, 또는 BIACORE 분석)을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "항체"라는 용어는 2개의 동일한 중쇄와 2개의 동일한 경쇄 사이에 쇄간 이황화 결합에 의해 연결되어 형성된 테트라펩티드 쇄 구조인 면역글로불린을 포함한다. 면역글로불린은 아미노산 조성과 중쇄 불변 영역의 배열이 다르므로 항원성이 다르다. 따라서, 면역글로불린은 5가지 클래스 또는 이소형의 면역글로불린, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 분류될 수 있으며, 이들의 상응하는 중쇄는 각각 μ, δ, γ, α, 및 ε 쇄이다. 동일한 클래스의 Ig는 힌지 영역의 아미노산 조성의 차이와 중쇄의 이황화 결합 수 및 위치에 따라 서로 다른 하위 클래스로 나눌 수 있다. 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 나눌 수 있다. 경쇄는 불변 영역의 차이에 따라 κ 또는 λ 쇄로 분류된다. Ig의 5가지 클래스 각각은 κ 쇄 또는 λ 쇄를 가질 수 있다.
본 발명에서, 본 발명의 항체의 경쇄 가변 영역은 인간 κ 또는 λ 쇄 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서, 본 발명의 항체의 중쇄 가변 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
N-말단 근처의 항체 중쇄 및 경쇄의 약 110개 아미노산의 서열은 상당히 다양하므로 가변 영역(V 영역)이라고 하며; C-말단 근처의 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정하므로 불변 영역(C 영역)이라고 한다. 가변 영역은 3개의 초가변 영역(HVR) 및 상대적으로 보존적인 서열을 갖는 4개의 프레임워크 영역(FWR)을 포함한다. 3개의 초가변 영역은 항체의 특이성을 결정하므로 상보성 결정 영역(CDR)으로도 알려져 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(VL) 또는 중쇄 가변 영역(VH)은 아미노-말단에서 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR 영역과 4개의 FWR 영역으로 구성된다: FWR1, CDR1, FWR2, CDR2, FWR3, CDR3, 및 FWR4. 경쇄의 3개의 CDR 영역은 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 지칭하고; 중쇄의 3개의 CDR 영역은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 지칭한다.
경쇄 및 중쇄에서, 가변 영역과 불변 영역은 약 12개 이상 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 약 3개 이상 아미노산의 "D" 영역을 추가로 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인CH1, CH2, 및 CH3)으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. 항체의 불변 영역은 전형적인 보체계의 제1 성분(C1q)에 대한 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포)의 결합을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 초가변 영역(상보성 결정 영역(CDR)이라고 함)으로 더 세분화될 수 있고, 그 사이에는 프레임워크 영역(FWR)이라고 하는 보존 영역이 분포되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FWR로 구성된다: FWR1, CDR1, FWR2, CDR2, FWR3, CDR3, 및 FWR4. 각 중쇄/경쇄의 상응하는 가변 영역(VH 및 VL)은 각각 항체 결합 부위를 형성한다. 특히, 중쇄는 3개 이상의 CDR, 예컨대 6개, 9개, 또는 12개의 CDR을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 이중특이적 항체에서, 중쇄는 IgG 항체 중쇄의 N-말단이 또 다른 항체에 연결된 ScFv일 수 있고, 이 경우, 중쇄는 9개의 CDR을 포함한다.
"인간 항체"라는 용어는 인간 생식계열 면역글로불린의 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, "인간 항체"라는 용어에는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체(즉, "인간화 항체")는 포함되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 항체에 대해 "특이적"이라는 용어는 항체가 특정 항원을 인식하지만 샘플 내 다른 분자에 대한 인식이나 결합이 실질적으로 없음을 의미한다. 예를 들어, 하나의 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 하나 이상의 종으로부터의 항원에 결합할 수도 있다. 그러나, 이러한 종간 교차 반응성 자체가 특이성에 따른 항체 분류를 변경하지는 않는다. 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 상이한 대립유전자 형태로 항원에 결합할 수도 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성 자체가 특이성에 따른 항체 분류를 변경하지는 않는다. 일부 경우에, "특이성" 또는 "특이적 결합"이라는 용어는 항체, 단백질, 또는 펩티드와 제2 화학물질의 상호작용을 나타내기 위해 사용될 수 있으며, 이는 화학물질의 특정 구조(예를 들어, 항원 결정자 또는 에피토프)의 존재에 따라 상호작용이 달라진다는 것; 예를 들어, 항체가단백질이 아닌 특정 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다는 것을 의미한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적이면, 표지된 "A"와 항체를 포함하는 반응에서, 에피토프 A(또는 유리, 표지되지 않은 A)를 함유하는 분자의 존재는 항체에 결합되는 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본원에서 사용되는 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"이라는 용어는 세포질 신호를 도메인(즉, 세포내 신호 도메인)에 전달하는 항원 및 폴리펩티드에 결합할 수 있는 세포외 도메인(세포외 결합 도메인), 힌지 도메인, 막관통 도메인(막관통 영역)을 포함한다. 힌지 도메인은 세포외 항원 결합 영역에 유연성을 제공하는 부분으로 간주될 수 있다. 세포내 신호 도메인은 세포의 활성을 조절하도록 제2 전달자를 생성하여 결정된 신호전달 경로를 통해 세포 내로 정보를 전달하는 단백질, 또는 이러한 전달자에 대응하여 이펙터로서 기능하는 단백질을 의미한다. 이는 CAR의 세포(예를 들어, CART 세포)의 면역 이펙터 기능을 촉진할 수 있는 신호를 생성한다. 세포내 신호 도메인은 신호전달 도메인을 포함하며, 공동자극 분자로부터 유래된 공동자극 세포내 도메인을 또한 포함할 수 있다.
"상동성", "변이체 서열", 또는 "돌연변이"는 두 폴리뉴클레오티드 서열 간 또는 두 폴리펩티드 서열 간의 서열 유사성을 나타낸다. 비교된 두 서열에서의 위치가 모두 동일 염기 또는 아미노산 단량체 하위 단위에 의해 점유된 경우, 예를 들어 두 DNA 분자 각각에서의 위치가 아데닌에 의해 점유된다면, 분자는 해당 위치에서 상동성이다. 두 서열 간의 동일성 백분율은 두 서열이 공유하는 일치하거나 상동성인 위치의 수를 비교된 위치의 수로 나눈 값 × 100%의 함수이다. 예를 들어, 서열이 최적으로 정렬된 경우, 두 서열에서 10개 위치 중 6개가 일치하거나 상동성인 경우, 두 서열은 60% 상동성이다. 일반적으로, 비교는 두 정렬된 서열의 동일성 백분율이 가장 클 때 이루어진다. "최적화"는 항원에 대한 항체의 결합을 유지 또는 개선하는 돌연변이를 의미한다. 본 발명에서, 이는 CLDN18.2에 대한 결합을 유지, 보존, 또는 개선하는 돌연변이를 의미한다.
"폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"(단일가닥인 경우)이라는 용어는 본 발명에서 상호교환적으로 사용된다. "핵산", "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열" 또는 "폴리뉴클레오티드 서열", 및 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.
"돌연변이"라는 용어는 아미노산 또는 뉴클레오티드의 치환, 부가, 및/또는 결실을 포함한다. "아미노산 치환" 및 "보존적 아미노산 치환"은 각각, 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 대체하는 것과, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체하는 것이다.
본원에서 사용되는 "렌티바이러스"는 레트로바이러스과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 레트로바이러스 중에서 독특하며, 비분열 세포를 감염시킬 수 있고; 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있어, 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 생체내 유의한 수평적 유전자 전달을 달성하는 수단을 제공한다.
본원에서 사용되는 "벡터"라는 용어는, 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는 데 유용한 조성물이다. 많은 벡터가 당업계에 알려져 있다. 여기에는 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 및 바이러스가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 따라서, "벡터"라는 용어는 자가 복제 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 이 용어는 또한 핵산을 세포 내로 전달하는 것을 용이하게 하는 비플라스미드 및 비바이러스 화합물, 예컨대 폴리라이신 화합물 및 리포솜을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다
본 발명에서 사용되는 "세포" 및 "세포주"라는 표현은 상호교환적으로 사용되며, 이러한 모든 명칭에는 자손이 포함된다. "숙주 세포"라는 용어는 벡터가 도입될 수 있는 세포를 의미하며, 대장균과 같은 원핵 세포, 효모 세포와 같은 진균 세포, 또는 섬유아세포, CHO 세포, COS 세포, NSO 세포, HeLa 세포, BHK 세포, HEK 293 세포, 또는 인간 세포와 같은 동물 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
"형질감염"이라는 용어는 외인성 핵산을 진핵 세포에 도입하는 것을 의미한다. 형질감염은 인산칼슘-DNA 공침전, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 폴리브렌 매개 형질감염, 전기천공, 미세주입, 리포솜 융합, 리포펙션, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염, 및 유전자총을 포함한, 당업계에 알려진 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다.
"면역 세포"라는 용어는 면역반응을 유도할 수 있는 세포를 의미한다. "면역 세포" 및 이의 다른 문법적 변형은 임의의 기원의 면역 세포를 지칭할 수 있다. "면역 세포"는 예를 들어, 골수에서 생성되는 조혈모세포(HSC)로부터 유래되는 백혈구(white blood cells/leukocytes)와 림프구(T 세포, B 세포, 및 자연살해(NK) 세포), 및 골수-유래 세포(호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포)를 포함한다. "면역 세포"라는 용어는 또한 인간 또는 비인간 면역 세포를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "T 세포"라는 용어는 흉선에서 성숙되는 림프구 부류를 의미한다. T 세포는 세포 매개 면역에서 중요한 역할을 하며, T 세포 수용체가 세포 표면에 존재한다는 점에서 다른 림프구(예를 들어, B 세포)와 다르다. "T 세포"는 T 헬퍼 세포(CD4+ 세포), 세포독성 T 세포(CD8+ 세포), 자연살해 T 세포, T 조절 세포(Treg), 및 γ-δT 세포를 포함하여, CD3를 발현하는 모든 유형의 면역 세포를 포함한다. "세포독성 세포"는 세포독성 반응을 매개할 수 있는 CD8+ T 세포, 자연살해(NK) 세포, 및 호중구를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "NK 세포"라는 용어는, 골수에서 유래하고 선천성 면역계에서 중요한 역할을 하는 림프구 부류를 의미한다. NK 세포는 세포 표면에 항체와 주요 조직적합성 복합체가 없는 경우에도, 바이러스 감염 세포, 종양 세포, 또는 기타 스트레스를 받은 세포에 대한 신속한 면역 반응을 제공한다.
예를 들어, 면역 세포는 자가 T 세포, 동종이계 T 세포, 자가 NK 세포, 및 동종이계 NK 세포와 같이 혈액으로부터 유래되거나, EBV 바이러스 감염에 의해 제조된 NK 세포주, 배아줄기세포 및 iPSC의 유도 분화에 의해 얻은 NK 세포, 및 NK92 세포주와 같이 세포주로부터 유래될 수 있다.
"임의적", "임의로", "임의의", 또는 "어느 하나"라는 용어는 이후에 설명되는 사건 또는 상황이 반드시 그런 것은 아니지만 발생할 수 있음을 의미하며, 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우가 설명에 포함됨을 의미한다. 예를 들어, "1개의 항체 중쇄 가변 영역을 임의로 포함함"은 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 반드시 그런 것은 아니지만 존재할 수 있음을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 본 발명에 사용되는 단수 형태는 하나 이상의 해당 대상물을 나타낸다. 본 발명에서 "또는"이라는 용어는 내용에서 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, "및/또는"이라는 용어의 의미로 사용되며, 이와 상호교환적으로 사용된다. "약" 및 "대략"은 일반적으로 측정의 성격이나 정확성을 고려하여 측정된 양에서 허용되는 오차의 정도를 의미한다. 예시적인 오차의 정도는 일반적으로 10% 이내, 더 일반적으로는 5% 이내이다. 본 발명에 개시된 방법 및 조성물은 명시된 서열, 변이체 서열, 또는 이와 실질적으로 동일하거나 유사한 서열, 예를 들어 명시된 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상 동일한 서열을 갖는 폴리펩티드 및 핵산을 포괄한다. 아미노산 서열과 관련하여, 본 발명에서 "실질적으로 동일한"이라는 용어는 첫 번째 아미노산 서열을 지칭하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, EC50이라는 용어는 최대 효과의 50%에 대한 농도, 즉 최대 효과의 50%를 유발할 수 있는 농도를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체-약물 접합체" 및 "ADC"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다.
오리스타틴(Auristatin)은 물리적 특성 및 약효성을 최적화하기 위해 화학 구조식이 비교적 쉽게 변형되는 완전 합성 약물이다. 항체와의 접합에 사용되는 오리스타틴 유도체는 주로 모노메틸 오리스타틴 E(MMAE) 및 모노메틸 오리스타틴 F(MMAF)를 포함하며, 전자는 천연 튜불린 중합효소 억제제인 돌라스타틴-10으로부터 유래된 합성 펜타펩티드의 C-말단에 2-아미노-1-페닐프로필-1-올을 부가하여 합성된다. 다양한 인간 종양 세포주에 대한 MMAE의 억제 활성은 1 나노몰 미만이다. MMAE의 세포독성 활성을 감소시키기 위해, MMAF의 돌라스타틴-10의 C-말단에 페닐알라닌이 부가된다. MMAF의 세포막 이동성은 구조에 도입된 카복실기의 경우 좋지 않다. 따라서, 항체와 접합 후 세포에 대한 생체활성은 현저히 감소하지만, 세포에 대한 억제 활성은 크게 향상된다(US7750116).
일부 구현예에서, 항체-세포독성 약물 접합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 하나 이상의 메이탄시노이드 분자와 접합된 본 발명의 항체를 포함한다. 메이탄시노이드는 튜불린의 중합을 억제하여 튜불린을 비활성화하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 원래 동아프리카 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 단리되었다(미국 특허 3,896,111호). 이후 특정 미생물도 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 비니거와 같은 메이탄시노이드를 생성한다는 것이 발견되었다(미국 특허 4,151,042호). 메이탄시노이드 약물 모듈은 (i) 발효를 통해 또는 발효물의 화학적 변형이나 유도체화를 통해 비교적 제조하기 용이하고; (ii) 비-이황화물 링커를 통한 항체 접합에 적합한 작용기로 쉽게 유도체화되고; (iii) 혈장에서 안정적이며; (iv) 다양한 종양 세포주에 효과적이라는 점에서 항체-약물 접합체에서 관심을 끄는 약물 모듈이다. 메이탄시노이드 약물 모듈로 사용하기에 적합한 메이탄신 화합물은 당업계에 잘 알려져 있으며, 공지된 방법에 따라 천연 자원으로부터 단리되거나 유전 공학 기술을 사용하여 제조될 수 있다(문헌[Yu et al. (2002) PNAS 99: 7968-7973] 참조). 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체도 공지된 방법에 따라 합성적으로 제조될 수 있다. 메이탄시노이드 약물 모듈의 예시적인 구현예는 본원에 개시된 바와 같은 DM1, DM3, 및 DM4를 포함한다.
본 발명의 방법, 조성물, 및 병용 요법은 다른 활성제 또는 치료 방식과 조합될 수 있으며, 상기 방법은 본 발명의 항-CLDN18.2 항체 분자를 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, CTLA-4, Tim-3 항체 중 하나 이상의 억제제(면역요법) 또는 기타 종양 치료 항체, Her-2, EGFR, VEGF, VEGFR 항체 등, 및 ADC(예를 들어, T-DM1), 이중특이적 항체, 화학요법제 등과 임의로 조합하여, 질환(예를 들어, 암)을 치료 또는 예방하는 데 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 단독으로(예를 들어, 단독요법으로서) 사용될 때의 각 활성제에 대한 양 또는 용량 이상 또는 이하의 양 또는 용량으로 항-CLDN18.2 항체 분자, 추가 활성제, 또는 모두를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 투여되는 항-CLDN18.2 항체, 추가 활성제, 또는 모두의 양 또는 용량은 예를 들어, 단독으로(예를 들어, 단독요법으로서) 사용될 때의 각 활성제에 대한 양 또는 용량보다 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 더 낮다.
또한, 본 발명의 실시예에 설명된 바와 같이, 항-CLDN18.2 항체 및 CLDN18.2 항체의 약물 접합체는 CLDN18.2에 결합하여 표적 세포(종양 세포)의 아폽토시스를 유도하고, 종양 세포의 성장을 억제하고, 생체내 종양 세포에 대한 이펙터 세포의 ADCC 및 CDC 사멸 효과를 증가시킴으로써, 암 환자 치료 목적을 달성할 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명에 기술된 항-CLDN18.2 항체 및 CLDN18.2 항체의 약물 접합체는 본 발명의 항체의 항종양 효과뿐만 아니라, 이러한 메커니즘을 통해, 본 발명의 항-CLDN18.2 항체 및 CLDN18.2 항체의 약물 접합체의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 종양 세포 성장 억제 방법을 나타낸다. 이 방법은 암의 생체내 치료에 적합하다. 표적화된 특정 치료 효과를 달성하기 위해, 항-CLDN18.2 항체 분자는 다른 항체와 함께 투여될 수 있다. CLDN18.2 항체 및 CLDN18.2 항체의 약물 접합체를 하나 이상의 활성제와 조합하여 투여할 때, 조합물은 일종의 암이 있는 환자, 특히 CLDN18.2 발현이 높은 종양 환자에게 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 대상체의 과다증식 증상 또는 질환(예를 들어, 암)의 치료(예를 들어, 감소 또는 완화)가 제공된다. 상기 방법은 본 발명의 하나 이상의 항-CLDN18.2 항체 또는 CLDN18.2 항체의 약물 접합체를 단독으로 또는 다른 활성제 또는 치료 방식과 조합하여 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
단독의 또는 다른 면역조절제(예를 들어,항-LAG-3, 항-Tim-3, 항-PD-L 또는 항-PD-L1, 및 항-CTLA-4 항체 분자)와 조합된 항-CLDN18.2 항체 분자는 위암, 췌장암, 폐암, 식도암, 난소암 등을 치료하는 데 사용된다. 항-CLDN18.2 항체 분자는 면역 기반 전략, 표적 약물(예를 들어, VEGF에 대한 단일클론 항체와 같은 VEGF 억제제); 수니티닙, 소라페닙, 및 아파티닙과 같은 VEGF 티로신 키나제 억제제; RNAi 억제제 또는 VEGF 신호전달의 하류 매개체 억제제, 예를 들어 라파마이신 포유류 표적(mTOR) 억제제 중 하나 이상과 조합하여 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "암", "암 환자"라는 용어는 조직병리학적 유형 또는 침습 단계와 무관하게, 모든 유형의 암성 성장 또는 종양발생 과정, 전이성 조직 또는 악성 변형 세포, 조직 또는 기관을 포함하는 의미이다. 예로는 고형 종양, 혈액암, 연조직 종양, 및 전이성 병변을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 개시된 CLDN18.2-표적화 항체를 사용하여 적합하게 치료될 수 있는 암의 비제한적인 예는 위암, 식도암, 폐암, 흑색종, 신장암, 유방암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 방광암, 신경교종, 및/또는 백혈병 등, 또는 이들의 전이성 병변을 포함한다.
상기 바람직한 조건들은 당업계의 일반적인 지식에 기초하여 본 발명의 바람직한 구현예를 얻기 위해 임의로 조합될 수 있다.
본 발명에 사용되는 시약 및 출발 물질은 상업적으로 입수 가능하다.
본 발명의 유익한 효과는 다음과 같다:
1. 본 발명은 친화성, 특이성, 및 세포내이입 활성이 우수한 항-CLDN18.2 HCAb 항체를 기술한다. 이 항체는 기존 IgG 항체의 약 절반에 불과한 분자량을 갖는 "중쇄"만을 포함하는 완전히 새로운 완전 인간 항체이다. 이 항체는 경쇄가 없기 때문에 이중특이적 항체의 개발에 사용될 수 있으며, 이중특이적 항체의 개발에서 흔히 발생하는 경쇄 불일치 및 이종이량체화 문제를 피할 수 있다. ADC로 개발될 가능성도 있다. 바람직한 특정 구현예에서, HCAb 항체는 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 종양 세포에 대해 큰 친화성을 가지며, IMAB362 유사체에 비해 큰 세포내이입 활성을 유도할 수 있다.
2. 본 발명은 또한, 시험관내 TDCC 활성 및 생체내 약물 효과가 우수한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체를 기술한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 활성을 가지며, Amgen의 특허 이중특이적 항체 유사체보다 종양 세포에 대한 사멸 효과가 더 우수하다. 바람직한 특정 구현예에서, 이중특이적 항체는 Fc 단편을 갖고, 따라서 FcRn에 대한 Fc의 결합 효과를 유지하며; 한편, FcgR에 대한 결합을 감소시켜 FcgR의 가교로 인한 비특이적 T 세포의 활성화를 감소시키기 위해서는 돌연변이 Fc가 바람직하다. CD3-말단 활성은 IL6 및 TNFα와 같은, CRS의 일반적인 사이토카인의 방출이 감소될 수 있도록 최적화된다. CLDN18.2 말단은 직렬로 연결된 VHH 형태로 되어 있어, 경쇄와 중쇄의 불일치라는 일반적인 문제를 방지하고, 우수한 친수성을 유지하고, CLDN18.2 발현이 높은 종양 세포에 대한 선택성을 향상시킨다. 이 항체는 생체내 안정성이 우수하고 생체내 반감기가 길며, 뛰어난 생체내 항종양 활성을 나타낸다.
도 1a 내지 1f는 (1a 및 1b) NUGC4_D8, (1c) SNU601, (1d) HEK293/hCLDN18.2, 및 (1e 및 1f) HEK293/hCLDN18.1 세포에 대한 HCAB 항체의 결합 친화도를 보여준다.
도 2a 및 2b는 HEK293/hCLDN18.2 세포의 경우 (2a) PR000400 및 (2b) PR004549에 대한 HCAB 항체의 경쟁적 결합 활성을 보여준다.
도 3a 및 3b는 시험 항체 및 MMAF-결합 항-인간 IgG 항체와 공동 배양시 표적 세포의 생존력을 보여준다.
도 4a 내지 4h는 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 구조를 보여준다.
도 5a 내지 5s는 (5a 내지 5c) HEK293/hCLDN18.2, (5d 내지 5i) NUGC4_D8, (5j 내지 5o) Jurkat, 및 (5p 내지 5s) HEK293/hCLDN18.1 세포에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 결합 친화도를 보여준다.
도 6a 내지 6w는 (6a) IM95 세포에 의한 CLDN18.2의 발현 수율, 및 (6b 내지 6k) NUGC4_D8, (6l 내지 6o) IM95, (6p 내지 6s) HEK293/hCLDN18.1, 및 (6t 내지 6w) SNU620 세포에 대한 이중특이적 항체의 TDCC 활성을 보여준다.
도 7은 인간 CLDN18.2 파라로그 계열 단백질 CLDN1, CLDN2, CLDN3, CLDN4, CLDN6, 및 CLDN9을 과발현하는 세포에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 결합 친화도를 보여준다.
도 8a 내지 8c는 (8a) HEK293/cynoCLDN18.1, (8b) HEK293/cynoCLDN18.2, 및 (8c) 시노몰구스 CD3+ T 세포에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 결합 친화도를 보여준다.
도 9는 cyno T 세포에 의한 HEK293/cynoCLDN18.2 세포에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 TDCC 활성을 보여준다.
도 10a 및 10b는 시험관 내에서 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체에 의해 유도된 사이토카인 방출을 보여준다. (10a) TNFα, 및 (10b) IL-6.
도 11a 및 11b는 (11a) Jurkat 및 (11b) NUGC4_D8 세포에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 ADCC 활성을 보여준다.
도 12a 및 12b는 (12a) HEK293/hCLDN18.2 및 (12b) Jurkat 세포에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 CDC 활성을 보여준다.
도 13a 및 13b는 HEK293/hCLDN18.2 세포의 경우 (13a) PR000400 및 (13b) PR004549에 대한CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 경쟁적 결합 활성을 보여준다.
도 14는 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 약동학을 보여준다.
도 15a 내지 15e는 (15a 및 15b) NUGC4_D8 PBMC, (15c) SNU620 PBMC, 및 (15d) HuP-T4 PBMC 종양 모델의 생체내 약력학 연구, 및 (15e) CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체에 대한 생체내 사이토카인 폭풍 연구를 보여준다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 하기 실시예에서 조건이 명시되지 않은 실험 절차는 통상적인 절차 및 조건에 따라 수행되거나 지침에 따라 수행된다.
실시예 1: 발현 벡터 및 안정적으로 형질감염된 세포주의 제조 및 마우스 면역화
1.1. 마우스 면역화용 발현 벡터의 제조
완전히 인간화된 유전자이식 마우스를 면역화하기 위한 인간 CLDN18.2 발현 벡터를 다음과 같이 제조하였다: 인간 CLDN18.2(Uniprot ID P56856-iso2)를 암호화하는 cDNA 서열을 합성하고, 인간 CLDN18.2 유전자의 암호화 서열을 효소 분해를 통해 pCAGGS 플라스미드(YOUBIO, VT1076)에 클로닝하였다.
1.2. 안정적으로 형질감염된 세포주의 제조
인간 CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 안정적으로 발현하는 HEK293(ATCC, Cat#: CRL-1573) 세포주를 다음과 같이 구성하였다: 인간 CLDN18.1(GenScript, OHu29174D) 또는 CLDN18.2(GenScript, OHu03374D)를 암호화하는 플라스미드를 HEK293 세포에 형질감염시켜, 인간 CLDN18.1 또는 CLDN18.2를 과발현하는 안정적인 세포주를 생성하였다. CLDN18.1 및 CLDN18.2의 발현은 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 검출하였다. 구체적으로, 20,000개의 형질감염된 세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅한 후, 상업적으로 입수 가능한 토끼 항-인간 CLDN18 항체를 첨가하였다(LifeSpan Bio, LS-C168812-400). 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 PBS로 2회 세척한 다음, AF-680-접합 2차 염소 항-토끼 IgG 항체(Invitrogen, A21109)를 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, FACS 기기(IntelliCytiQue Plus BR)를 사용하여 세포의 형광 강도를 모니터링하였다.
1.3. 마우스의 면역화
완전히 인간화된 유전자이식 마우스(Harbour BioMed에서 구입한 상업적으로 입수 가능한 Harbour HCAB 1.0 마우스)를 상기 제조한 인간 CLDN18.2 발현 벡터와 CLDN18.2-발현 HEK293 세포(HEK293/hCLDN18.2 세포)로 면역화하였다. 인간 CLDN18.2 발현 벡터와 금 분말을 사용하여 유전자 총 탄환을 준비하였다. 유전자 총을 사용하여 복부 여러 부위에서 마우스를 면역화하였다. 마우스를 2주 간격으로 발현 벡터 DNA(매회 50 μg)로 면역화하였다. 3회 면역화 후, 마우스를 2주 간격으로 HEK293/hCLDN18.2 세포로 면역화하였고, 각 면역화에 대해 마우스당 4×106개 세포를 사용하였다. 2회 면역화 후, 역가 측정을 위해 채혈하였다. 인간 CLDN18.2-발현 CHOK1 세포(kyinno, KC-1180)를 사용하여 FACS로 마우스 혈청의 결합 친화도를 분석하였다. HCAB 단일클론 항체의 스크리닝을 위해 역가 측정 결과에 따라 마우스를 선택하였다. 면역원으로 HEK293/hCLDN18.2 세포(마우스당 4×106개 세포)를 사용하여 스크리닝 3일 전에 마우스의 추가 면역화를 실시하였다.
실시예 2: 항-CLDN18.2 HCAB 단일도메인 항체의 생성 및 스크리닝
실시예 1에서 얻은 항-CLDN18.2 항체 혈청 역가가 높은 마우스를 선택하였다. 이들 마우스의 비장을 수집하고, B 세포를 단리시켰다. BD FACS AriaIII 세포 분류기를 사용하여 CD138(BD, 558626) 양성 혈장 세포를 분류하고, 자기 비드(Thermofisher, 11206D)를 사용하여 CLDN18.2(CHOK1/hCLDN18.2, kyinno, KC-1180) 양성 B 세포 집단을 농축하였다. B 세포의 RNA를 추출하여 cDNA로 역전사시키고(SuperScript IV First-Strand 합성 시스템, Invitrogen, 18091200), 특정 프라이머를 사용하여 PCR로 인간 VH 유전자를 증폭시켰다. PCR 프라이머:
5'-GGTGTCCAGTGTSAGGTGCAGCTG-3'(서열번호 249)
5'-AATCCCTGGGCACTGAAGAGACGGTGACC-3'(서열번호 250)
증폭된 VH 유전자 단편을 인간 IgG1 항체의 중쇄 Fc 도메인의 서열을 암호화하는 포유류 세포 발현 플라스미드 pCAG 벡터로 구성하였다.
구성된 플라스미드를 HEK293 포유류 숙주 세포(ATCC, CRL-1573)에 형질감염시켜 HCAb 항체의 발현 상청액을 얻었다. 인간 CLDN18.2를 발현하는 CHOK1/hCLDN18.2를 사용하여 Mirrorball에 의해 1차 스크리닝을 수행하였다. 2차 스크리닝을 위해 양성 클론을 선택하였다. HEK293/hCLDN18.1 및 HEK293/hCLDN18.2 세포를 사용하여 2차 스크리닝을 수행하였다.
인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 295개의 단일클론 항체를 얻은 한편, 항체 분자의 가변 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 통상적인 서열분석 수단을 사용하여 얻었다. 반복된 서열을 제거한 후, 독특한 서열을 가지며 인간 CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 211개의 완전 인간 CLDN18.2 HCAb 단일클론 항체를 얻었다. 1차 스크리닝 결과와 2차 스크리닝 결과에 따라 종합 순위가 높은 54개 항체를 재조합 발현을 위해 선택하였다. 정제된 단일클론 항체를 유세포 분석을 통해 인간 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 종양 세포에 대한 결합 능력에 대해 추가로 스크리닝하고, 표 3에 나타낸 바와 같이, 종합 순위가 높은 8개의 항체 서열을 후보 분자로 선택하였다.
서열 가변성을 기반으로 하는 Kabat 방식(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institutes of Health (U.S.), Bethesda, Maryland (1991)] 참조) 및 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 하는 Chothia 방식(문헌[J Mol Biol 273: 927-48, 1997] 참조)과 같은 다양한 방법을 사용하여 당업계에서 항체의 CDR을 정의할 수 있다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 출원에서, Kabat 방식 및 Chothia 방식을 포함하는 조합 방식을 사용하여 가변 도메인 서열의 아미노산 잔기를 결정할 수도 있다. 조합 방식은 Kabat 방식과 Chothia 방식을 조합하여 더 넓은 범위를 얻었고, 이는 발명의 내용 표 1에 상세히 제시되어 있다. 본 실시예로부터 서열분석한 후 얻은 생식계열 유전자 분석 및 PTM 부위 분석은 아래 표 2에 제시되어 있다. 항원 결합 단백질의 서열번호는 아래 표 3에 제시되어 있다.
[표 2]
[표 3]
실시예 3: 항-CLDN18.2 HCAB 항체의 번역후 변형 부위의 제거
PR004533 및 PR004536은 둘 다 중쇄의 CDR2 영역에 이성질체화 부위 및 탈아미드화 부위를 가지고 있다. CDR2 영역의 번역후 변형 부위의 경우, NS와 DG의 4개 아미노산을 PCR을 통해 무작위로 돌연변이시켰다. PCR 산물을 대장균에 전기적으로 형질감염시켜 4개의 아미노산 부위의 무작위 돌연변이 라이브러리를 확립하였다. CHOK1/hCLDN18.1 및 CHOK1/hCLDN18.2 세포를 사용하여 Mirrorball에 의해 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하고, CLDN18.2에 특이적으로 결합하는 양성 분자를 서열분석을 위해 선택하였다. 해당 분자의 서열번호는 아래 표 4에 제시되어 있다.
[표 4]
실시예 4: 전장 항-CLDN18.2 HCAb 단일도메인 항체의 제조 및 특성화
4.1. 재조합 HCAb 단일도메인 항체의 제조
HCAb 단일도메인 항체 분자를 암호화하는 중쇄 가변 도메인의 서열을 얻은 후, 중쇄 가변 도메인의 서열을 인간 항체 중쇄 불변 도메인의 상응하는 서열과 융합하고 통상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 발현시켜 재조합 HCAb 단일도메인 항체 분자를 얻을 수 있다. 본 실시예에서, 항체의 중쇄 가변 도메인(VH)의 서열을 유전적으로 합성하고, 인간 IgG1 항체의 중쇄 불변 도메인의 서열을 암호화하는 포유류 세포 발현 플라스미드 벡터에 클로닝하여 HCAb 단일도메인 항체를 생성하는 전장 서열을 암호화하였다. 본 실시예에서, 면역화된 Harbour HCAb 마우스로부터 얻은 단일클론 항체 분자의 가변 도메인의 서열은 인간 항체 서열이었으므로, 완전 인간 항-CLDN18.2 재조합 HCAb 항체도 본 실시예로부터 얻었다.
재조합 HCAb 단일도메인 항체를 암호화하는 플라스미드를 포유류 숙주 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포)에 형질감염시켰으며, 상응하는 정제된 재조합 항체는 통상적인 재조합 단백질 발현 및 정제 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 구체적으로, ExpiCHO-S™ 세포(Gibco, A29127)를 ExpiCHO™ 발현 배지(Gibco, A2910001)에서 증식시켰다. 일시적인 형질감염 전에, 세포를 3 × 106 내지 4 × 106개 세포/mL의 농도로 조정하고, 37℃의 8% CO2 쉐이커에서 24시간 동안 배양하여 7 × 106 내지 10 × 106개 세포/mL의 세포 농도가 되도록 했다. 이어서, 세포를 6 × 106개 세포/mL로 희석하고, 배양된 세포 10 mL를 준비하였다. HCAb 단일도메인 항체를 암호화하는 상기 플라스미드 8 μg(플라스미드 대 세포의 비는 0.8 μg : 1 mL)을 0.4 mL의 OptiPRO™ SFM 배지(Gibco, 12309019)에 용해시켰다. 생성된 혼합물을 0.22 μm 필터를 통해 여과하여 멸균하였다. 이어서, 32 μL의 ExpiFectamine™ CHO 시약(Gibco, A29129)을 0.37 mL의 OptiPRO™ SFM 배지(Gibco, 12309019)에 첨가하였다. ExpiFectamine™ CHO 시약 용액을 즉시 플라스미드 용액에 천천히 첨가하였다. 혼합물을 뒤집어서 잘 섞이도록 하였다. 플라스미드와 형질감염 시약의 혼합 용액을 플라스크를 흔들면서 천천히 적가하였다. 세포를 37℃의 8% CO2 쉐이커에서 8~9일 동안 배양하였다. 8일 후에 세포 생존력을 관찰하였다.
배양물을 모아 3,300 g로 10분 동안 원심분리한 후, 상청액을 모아 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하였다. MabSelect™(GE Healthcare Life Science, 71-5020-91 AE)를 함유하는 중력 컬럼(Bio-Rad, #7311550)을 PBS(pH 7.4)로 평형화하고 2~5 컬럼 부피의 PBS로 헹구었다. 상청액 샘플을 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 5~10 컬럼 부피의 PBS로 헹구었다. 표적 단백질을 0.1 M 글리신(pH 3.5)으로 용리하였다. Tris-HCl(pH 8.0)을 사용하여 용리액을 중성으로 조정하고, 농축하고, 한외여과 튜브(Millipore, UFC901024)를 사용하여 PBS 완충액으로 완충액 교환하여 정제된 항체 용액을 얻었다. 이어서, 정제된 항체 용액을 NanoDrop(Thermo Scientific™ NanoDrop™ One)을 사용하여 농도 측정하고, 나중에 사용하기 위해 서브패키지로 만들어 보관하였다.
4.2. SEC-HPLC, HIC-HPLC, 및 DSF에 의한 항체 특성화
순도 측정을 위해 상기 정제된 샘플의 적정량을 분석용 SEC 컬럼 TSKgel G3000SWxl(HPLC 시스템 모델: Agilent 1260 Infinity II)에 로딩하였다. 이 방법에서는 다음의 매개변수 및 조건이 사용되었다: 이동상: 1×PBS, pH 7.4(Sangon, E607016); 실온; 유량: 1.0 mL/분; 샘플 농도: 1 mg/mL; 주입량: 20 μL; 검출 파장: 280 nm. 기록 후, ChemStation 소프트웨어를 사용하여 크로마토그램을 적분하고 관련 데이터를 계산하였다. 샘플의 다양한 성분에 대해 보고된 머무름 시간을 사용하여 분석을 생성하였다.
순도 및 소수성 측정을 위해 상기 정제된 샘플의 적정량을 분석용 HIC 컬럼 TSKge1 Buty1-NPR 4.6*35(HPLC 시스템 모델: Agilent 1260 Infinity II)에 로딩하였다. 이 방법은 16분 이내에 100% 이동상 A(20 mM PB, 1.8 M (NH4)2SO4, pH 6.0)에서 100% 이동상 B(20 mM PB, pH 6.0)까지의 선형 구배로 구성되었다. 유량은 0.7 mL/분으로 설정되었고, 샘플 농도는 1 mg/mL였고, 주입량은 20 μL였고, 검출 파장은 280 nm였다. 기록 후, ChemStation 소프트웨어를 사용하여 크로마토그램을 적분하고 관련 데이터를 계산하였다. 샘플의 다양한 성분에 대해 보고된 머무름 시간을 사용하여 분석을 생성하였다.
본 실시예에서는 시차 주사 형광측정법(DSF)을 통해 단백질 분자의 열변성 온도(Tm)를 측정하였다. 10 μg의 단백질을 96웰 PCR 플레이트(Thermo, AB-0700/W)에 첨가한 후, 100배 희석된 염료 SYPROTM(Invitrogen, 2008138) 2 μL를 첨가한 다음, 완충액을 첨가하여 웰당 40 μL의 최종 부피가 되도록 했다. PCR 플레이트를 밀봉하고, 실시간 형광 정량 PCR 기기(Bio-Rad CFX96 PCR System)에 넣고, 25℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 25℃에서 95℃까지 0.2℃/0.2분의 구배로 서서히 가온시키고, 시험 종료시 25℃까지 냉각하였다. FRET 스캐닝 모드를 사용하였고, Bio-Rad CFX Maestro 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하여 샘플의 Tm을 계산하였다. 상기 특성화 결과는 아래 표 5에 제시되어 있다.
[표 5]
실시예 5: 세포에 대한 항-CLDN18.2 HCAB 항체의 결합 친화도
인간 CLDN18.1-발현 HEK293 세포, 인간 CLDN18.2-발현 HEK293 세포, NUGC4_D8 세포, 및 인간 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 SNU601 세포(Cobioer, CBP60507)를 사용하여 FACS로 항체의 결합 친화도를 검출하였다. 서브클로닝된 NUGC4_D8 세포를 NUGC4 세포(JCRB, JCRB0834)를 사용하여 희석을 제한함으로써 스크리닝하였다. 결합 친화도는 다음과 같이 결정되었다: 세포를 300 g로 5분 동안 원심분리한 후, FACS 완충액(2% FBS 함유 PBS)에 재현탁시켰다. 세포 밀도를 106개 세포/mL로 조정하고, 50 μL의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. FACS 완충액을 사용하여 항체를 다양한 농도로 희석하고, 50 μL의 항체 희석액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 이어서, APC-접합 염소 항-인간 IgG 2차 항체(Jackson, 109-605-098)를 함유하는 FACS 완충액을 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정액에 재현탁시킨 후, FACS 기기(ACEA NovoCyte)를 사용하여 세포의 형광을 모니터링하였다. IMAB362 유사체인 PR000400(자체 제조, WO 2014/146672 참조, IMAB362와 동일한 가변 영역을 가지며, 불변 영역의 몇 가지 아미노산만 IMAB362와 상이함)을 CLDN18.2 결합에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. CL-1xI2C scFc 유사체인 PR004549(자체 제조, WO 2020025792A1 참조, CL-1xI2C scFc와 동일한 가변 영역을 가지며, 불변 영역의 몇 가지 아미노산만 CL-1xI2C scFc와 상이함)을 CLDN18.2 결합에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. PR002725 항체를 CLDN18.1 결합에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. CN2020/118650(표 6, 표 7, 및 표 8) 참조. Iso hIgG1(CrownBio, C0001-4) 항체를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 1a, 도 1b, 표 9, 및 표 10은 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8 세포에 대한 항체의 결합 친화도를 나타낸다. 시험 항체는 용량 의존적 방식으로 NUGC4_D8 세포에 결합할 수 있었다. 결과는 PR004533, PR004949, PR004950, PR004952, PR004953, PR007242, PR007243, PR007244, PR007245, PR007246, 및 PR007248 항체가 PR000400보다 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8 세포에 대해 더 높은 친화도를 나타냄을 보여준다. 도 1c 및 표 11은 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 SNU601 세포에 대한 항체의 결합 친화도를 나타낸다. 시험 항체는 용량 의존적 방식으로 SNU601 세포에 결합할 수 있었다. 결과는 PR004227, PR004533, PR004536, PR004540, PR004949, PR004950, 및 PR004952 항체가 PR000400보다 CLDN18.2를 내인적으로 발현하는 SNU601 세포에 대해 더 높은 친화도를 나타냄을 보여준다. 도 1d 및 표 12는 인간 CLDN18.2를 과발현하는 HEK293 세포(HEK293/hCLDN18.2)에 대한 항체의 결합 친화도를 나타낸다. 도 1e 및 도 1f는 인간 CLDN18.1을 과발현하는 HEK293 세포(HEK293/hCLDN18.1)에 대한 항체의 결합 친화도를 나타낸다. 시험 항체는 HEK293/hCLDN18.1 세포에 대해 낮은 결합 친화도를 갖는다. 상기 결과로부터, 시험 항체는 ECL2가 아닌 ECL1(세포외 루프 1)에서 인간 CLDN18.2 단백질에 결합하는 것으로 추론할 수 있다.
[표 6]
[표 7]
[표 8]
[표 9]
[표 10]
[표 11]
[표 12]
실시예 6: 항-CLDN18.2 HCAb 항체의 경쟁적 결합 활성
본 실시예는 인간 CLDN18.2 항원의 에피토프 영역에 대한 항-인간 CLDN18.2 HCAb 단일클론 항체의 결합을 연구하기 위한 것이다. 인간 CLDN18.2를 과발현하는 HEK293/hCLDN18.2 세포를 사용하여 세포 수준에서 경쟁적 결합 실험을 수행하였다. 간략하게, 지침에 따라 비오티닐화 키트(ThermoFisher, A35358)를 사용하여 항-인간 CLDN18.2 항체 PR000400 및 PR004549를 비오티닐화하였다. 50 μL의 비오티닐화된 항-인간 CLDN18.2 항체 PR000400 또는 PR004549를 각각 96웰 V-바닥 플레이트(Corning, 3894)에서 상응하는 연속 희석된 비오티닐화되지 않은 항-인간 CLDN18.2 항체 50 μL와 잘 혼합하였다. 이어서, 인간 CLDN18.2를 과발현하는 HEK293/hCLDN18.2 세포의 현탁액을 3×106개 세포/mL로 조정하고, 50 μL/웰로 시딩하였다. 세포를 4℃에서 2시간 동안 공동 인큐베이션하였다. 각 웰의 세포를 200 μL의 사전 냉각된 FACS 완충액(PBS 중 2% FBS)으로 2회 세척하고, 4℃에서 500 g로 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버렸다. 2회 세척 후, 형광 2차 항체(BD, 554060, 최종 농도 1 μg/mL)를 첨가하고, 4℃의 암실에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰의 세포를 200 μL의 사전 냉각된 FACS 완충액(PBS 중 2% FBS)으로 2회 세척하고, 4℃에서 500 g로 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버렸다. 마지막으로, 각 웰의 세포를 200 μL의 사전 냉각된 FACS 완충액에 재현탁시키고, BD FACS CANTOII를 사용하여 형광 신호 값을 판독하였다. 다음 식을 사용하여 억제율을 계산하였다: 억제율(%) = (A - B)/A × 100 (참고: A: 비오티닐화된 항체와 ISO hIgG1(Crownbio, C0001-4)의 상호작용 후 형광 신호; B: 비오티닐화된 항체와 비오티닐화되지 않은 항체의 상호작용 후 형광 신호).
도 2a, 도 2b, 및 표 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항-CLDN18.2 HCAb 항체는 모두 인간 CLDN18.2에 대한 PR000400 또는 PR004549의 결합을 차단할 수 있고, 항체의 검출된 차단 능력은 양의 상관관계 방식으로 항체 농도에 따라 증가하고; 억제율은 80%보다 높게 도달할 수 있으며, 이는 시험 HCAb가 PR000400 및 PR004549의 에피토프와 매우 유사한 에피토프를 갖는다는 것을 나타낸다. 시험 항체는 HEK293/hCLDN18.1 세포에 대해 낮은 결합 친화도를 갖는다. 상기 결과로부터, 시험 항체는 ECL2가 아닌 ECL1(세포외 루프 1)에서 인간 CLDN18.2 단백질에 결합하는 것으로 추론할 수 있다.
[표 13]
실시예 7: 항-CLDN18.2 HCAB 항체의 세포내이입 활성
CellTiter-Glo 발광 세포 생존력 분석 키트(Promega, G7573)를 사용하여 MMAF-접합 항-인간 IgG 항체(Moradec, Cat#: AH-102-AF)와 공동 배양할 때 NUGC4_D8 세포에 대한 항체의 세포독성 사멸을 유도하는 능력을 분석하였다. NUGC4_D8 세포를 300 g로 5분 동안 원심분리한 후, 배양 배지(RPMI1640 + 10% FBS)에 재현탁시켜 세포의 밀도를 2 × 104개 세포/mL로 조정하였다. 50 μL의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 배지를 사용하여 항체를 다양한 농도로 희석하고, 25 μL의 항체 희석액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. MMAF-접합 항-인간 IgG 항체를 배지를 사용하여 희석하고, 25 μL의 항체 희석액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하여 6.6 nM의 최종 농도가 되도록 했다. 세포를 37℃에서 3일 동안 항체와 함께 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 실온에 30분 동안 방치하고, 100 μL의 CellTiter-Glo 발색 용액을 실온에서 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 실온의 암실에서 10분 동안 인큐베이션하였다. PE Enspire를 사용하여 플레이트를 판독하였다. 세포 생존력(%) = [(발광 샘플)/(발광 모의 대조군)] × 100. PR000400(IMAB362 유사체)을 양성 대조군으로 사용하고 Iso hIgG1(CrownBio, C0001-4) 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 3a 및 도 3b는 표적 세포의 생존력을 나타낸다. MMAF-접합 항-인간 IgG 항체와 공동 배양된 경우, 시험 항체는 PR000400에 비해 용량 의존적 방식으로 NUGC4_D8 세포에 대해 더 나은 세포독성 효과를 나타낸다.
실시예 8: CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 구조 및 설계
선택된 항-CLDN8.2 및 항-CD3 항체를 사용하여 이중특이적 항체를 제조하였다. 제조된 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체는 2개의 표적에 동시에 결합할 수 있으며, 한쪽 말단은 종양 세포 표면에 특이적으로 발현된 CLDN18.2를 인식할 수 있고, 다른 쪽 말단은 T 세포 상의 CD3 분자에 결합할 수 있다. 종양 세포 표면에 결합한 후, CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체 분자는 종양 세포 주위에 T 세포를 보충하고 활성화하여 종양 세포를 사멸시킬 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 구조 (1)은 "2+1" Fab-Fc-이중 VH 비대칭 구조를 갖는 분자이고; "2+1" 비대칭 구조를 갖는 분자의 경우, 구조는 상응하는 항-CD3 항체의 중쇄 및 경쇄와 항-CLDN18.2 항체의 이중 VH 폴리펩티드 쇄를 각각 포함하는 3개의 단백질 쇄를 포함하며; 구조 (2) 및 (3)은 상응하는 항-CD3 항체의 중쇄 및 경쇄와 항-CLDN18.2 항체의 HCAb 폴리펩티드 쇄를 각각 포함하는 3개의 단백질 쇄를 포함하는 "2+1" HCAb-Fc-Fab 비대칭 구조를 갖는 분자이다.
구조 (4)는 상응하는 항-CD3 항체의 중쇄 및 경쇄와 항-CLDN18.2 항체의 4가 VH 폴리펩티드 쇄를 각각 포함하는 3개의 단백질 쇄를 포함하는 "4+1" VH-VH_HC-Fab 비대칭 구조를 갖는 분자이다.
구조 (5)는 상응하는 항-CD3 항체의 중쇄 및 경쇄와 항-CLDN18.2 항체의 4가 VH 폴리펩티드 쇄를 각각 포함하는 3개의 단백질 쇄를 포함하는 "4+1" VH-VH_LC-Fab 비대칭 구조를 갖는 분자이다.
구조 (6)은 항-CLDN18.2 항체의 1가 VH에 연결된 상응하는 N-말단을 갖는 항-CD3 항체의 중쇄 및 경쇄와 항-CLDN18.2 항체의 2가 VH 폴리펩티드 쇄를 각각 포함하는 3개의 단백질 쇄를 포함하는 "3+1" VH_HC-Fab-Fc-이중 VH 비대칭 구조를 갖는 분자이다.
구조 (7)은 상응하는 항-CD3 항체의 중쇄 및 경쇄와 항-CLDN18.2 항체의 3가 VH 폴리펩티드 쇄를 각각 포함하는 3개의 단백질 쇄를 포함하는 "3+1" Fab-Fc-VH-VH-VH 비대칭 구조를 갖는 분자이다.
구조 (8)은 상응하는 항-CD3 항체의 중쇄 및 경쇄와 항-리소자임 또는 항-CLDN18.1 항체의 scFv 폴리펩티드 쇄를 각각 포함하는 2개의 단백질 쇄를 포함하는 "1+1" Fab-Fc-scFv 비대칭 구조를 갖는 분자이다.
불일치 중쇄(예를 들어, 항-CD3 항체의 2개 중쇄의 불일치)를 갖는 부산물의 형성을 최소화하기 위해, 돌연변이 이종이량체 Fc 영역을 사용하였다. 이는 WO 2009080251 및 WO 2009080252에 기술된 바와 같이, "노브-홀" 돌연변이 및 변형된 이황화 결합을 보유한다. CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체는 IgG1의 Fc를 가지며, Fc의 CH3 상에 L234A, L235A 또는 L234A, L235A, 및 G237A(EU 인덱스에 따라 넘버링됨) 돌연변이를 보유한다. 다음을 암호화하는 3개 또는 4개의 서로 다른 포유류 발현 벡터를 동시에 공동 형질감염시킴으로써 각각의 이중특이적 항체를 생성하였다: 1) Fc의 CH3에 L234A, L235A 또는 L234A, L235A, 및 G237A 돌연변이를 보유하는 이종이량체 항체를 생성하기 위해 Fc 영역에 "홀" 돌연변이를 보유하는 상응하는 항-CLDN18.2 항체의 중쇄; 2) Fc의 CH3에 L234A, L235A 또는 L234A, L235A, 및 G237A 돌연변이를 보유하는 이종이량체 항체를 생성하기 위해 Fc 영역에 "노브" 돌연변이를 보유하는 상응하는 항-CD3 항체의 중쇄; 및 3) 상응하는 항-CD3 항체의 경쇄. 인간 IgG1의 Fc 영역의 "노브" 돌연변이는 T366W로 구성되고, "홀" 돌연변이는 T366S, L368A, 및 Y407V로 구성된다. 또한, "노브" Fc 영역의 S354C 및 "홀" Y349C가 포함될 수 있으며; 이들은 한 쌍의 이황화 결합을 형성하여 이종이량체 항체의 안정성과 수율을 증가시킨다.
본 발명에서 구성된 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체에 대한 구체적인 정보는 표 14, 15, 및 16에 제시되어 있다.
[표 14]
[표 15]
[표 16]
실시예 9: CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 제조 및 설계
9.1. 재조합 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 제조
재조합 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체를 암호화하는 복수의 플라스미드를 특정 비율에 따라 포유류 숙주 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포)에 형질감염시켰으며, 상응하는 정제된 재조합 항체는 통상적인 재조합 단백질 발현 및 정제 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 구체적으로, ExpiCHO-S™ 세포(Gibco, A29127)를 ExpiCHO™ 발현 배지(Gibco, A2910001)에서 증식시켰다. 일시적인 형질감염 전에, 세포를 3 × 106 내지 4 × 106개 세포/mL의 농도로 조정하고, 37℃의 8% CO2 쉐이커에서 24시간 동안 배양하여 7 × 106 내지 10 × 106개 세포/mL의 세포 농도가 되도록 했다. 이어서, 세포를 6 × 106개 세포/mL로 희석하고, 배양된 세포 10 mL를 준비하였다. CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체를 암호화하는 상기 플라스미드 총 8 μg(플라스미드 대 세포의 비는 0.8 μg : 1 mL)을 0.4 mL의 OptiPRO™ SFM 배지(Gibco, 12309019)에 용해시켰다. 생성된 혼합물을 0.22 μm 필터를 통해 여과하여 멸균하였다. 이어서, 32 μL의 ExpiFectamine™ CHO 시약(Gibco, A29129)을 0.37 mL의 OptiPRO™ SFM 배지(Gibco, 12309019)에 첨가하였다. ExpiFectamine™ CHO 시약 용액을 즉시 플라스미드 용액에 천천히 첨가하였다. 혼합물을 뒤집어서 잘 섞이도록 하였다. 플라스미드와 형질감염 시약의 혼합 용액을 플라스크를 흔들면서 천천히 적가하였다. 세포를 37℃의 8% CO2 쉐이커에서 8~9일 동안 배양하였다. 8일 후에 세포 생존력을 관찰하였다.
배양물을 모아 3300 g로 10분 동안 원심분리한 후, 상청액을 모아 고속으로 원심분리하여 불순물을 제거하였다. MabSelect™(GE Healthcare Life Science, 71-5020-91 AE)를 함유하는 중력 컬럼(Bio-Rad, 7311550)을 PBS(pH 7.4)로 평형화하고 2~5 컬럼 부피의 PBS로 헹구었다. 상청액 샘플을 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 5~10 컬럼 부피의 PBS로 헹구었다. 표적 단백질을 0.1 M 글리신(pH 3.5)으로 용리하였다. Tris-HCl(pH 8.0)을 사용하여 용리액을 중성으로 조정하고, 농축하고, 한외여과 튜브(Millipore, UFC901024)를 사용하여 PBS 완충액으로 완충액 교환하여 정제된 항체 용액을 얻었다. 이어서, 정제된 항체 용액을 NanoDrop(Thermo Scientific™ NanoDrop™ One)을 사용하여 농도 측정하고, 나중에 사용하기 위해 서브패키지로 만들어 보관하였다.
9.2. SEC-HPLC, HIC-HPLC, 및 DSF에 의한 항체 특성화
순도 측정을 위해 상기 정제된 샘플의 적정량을 분석용 SEC 컬럼 TSKgel G3000SWxl(HPLC 시스템 모델: Agilent 1260 Infinity II)에 로딩하였다. 이 방법에서는 다음의 매개변수 및 조건이 사용되었다: 이동상: 1×PBS, pH 7.4(Sangon, E607016); 실온; 유량: 1.0 mL/분; 샘플 농도: 1 mg/mL; 주입량: 20 μL; 검출 파장: 280 nm. 기록 후, ChemStation 소프트웨어를 사용하여 크로마토그램을 적분하고 관련 데이터를 계산하였다. 샘플의 다양한 성분에 대해 보고된 머무름 시간을 사용하여 분석을 생성하였다.
순도 및 소수성 측정을 위해 상기 정제된 샘플의 적정량을 분석용 HIC 컬럼 TSKge1 Buty1-NPR 4.6*35(HPLC 시스템 모델: Agilent 1260 Infinity II)에 로딩하였다. 이 방법은 16분 이내에 100% 이동상 A(20 mM PB, 1.8 M (NH4)2SO4, pH 6.0)에서 100% 이동상 B(20 mM PB, pH 6.0)까지의 선형 구배로 구성되었다. 유량은 0.7 mL/분으로 설정되었고, 샘플 농도는 1 mg/mL였고, 주입량은 20 μL였고, 검출 파장은 280 nm였다. 기록 후, ChemStation 소프트웨어를 사용하여 크로마토그램을 적분하고 관련 데이터를 계산하였다. 샘플의 다양한 성분에 대해 보고된 머무름 시간을 사용하여 분석을 생성하였다.
본 실시예에서는 시차 주사 형광측정법(DSF)을 통해 단백질 분자의 열변성 온도(Tm)를 측정하였다. 10 μg의 단백질을 96웰 PCR 플레이트(Thermo, AB-0700/W)에 첨가한 후, 100배 희석된 염료 SYPROTM(Invitrogen, 2008138) 2 μL를 첨가한 다음, 완충액을 첨가하여 웰당 40 μL의 최종 부피가 되도록 했다. PCR 플레이트를 밀봉하고, 실시간 형광 정량 PCR 기기(Bio-Rad CFX96 PCR System)에 넣고, 25℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 25℃에서 95℃까지 0.2℃/0.2분의 구배로 서서히 가온시키고, 시험 종료시 25℃까지 냉각하였다. FRET 스캐닝 모드를 사용하였고, Bio-Rad CFX Maestro 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하여 샘플의 Tm을 계산하였다. 상기 특성화 결과는 아래 표 17에 제시되어 있다.
[표 17]
실시예 10: 세포에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 결합 친화도
FACS로 항체의 결합 친화도를 분석하였다. 시험 세포는 HEK293/hCLDN18.2, HEK293/hCLDN18.1, NUGC4_D8, 및 Jurkat 세포를 포함한다. 결합 친화도는 다음과 같이 결정되었다: 세포를 300 g로 5분 동안 원심분리한 후, FACS 완충액(2% FBS 함유 PBS)에 재현탁시켰다. 세포 밀도를 106개 세포/mL로 조정하고, 50 μL의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. FACS 완충액을 사용하여 항체를 다양한 농도로 희석하고, 50 μL의 항체 희석액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 이어서, APC-접합 염소 항-인간 IgG 2차 항체(최종 농도 1.5 μg/mL, Jackson, 109-605-098)를 함유하는 FACS 완충액을 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정액에 재현탁시킨 후, FACS 기기(ACEA NovoCyte)를 사용하여 세포의 형광을 모니터링하였다. 도 5 및 표 18은 세포에 대한 항체의 결합 친화도를 나타낸다. 모든 시험 항체는 CLDN18.2 및 CD3-발현 세포에 결합할 수 있고, CLDN18.1-발현 세포에는 결합하지 않는다.
[표 18]
실시예 11: CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 TDCC 활성
CytoTox 96® 비방사성 세포독성 분석 키트(Promega, G1780)를 사용하여 NUGC4_D4, SNU620, IM95, 및 HEK293/hCLDN 18.1 세포에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 TDCC 효능을 분석하였다. 인간 전체 T 세포 단리 키트(Miltenyi, 130-096-535)를 사용하여 인간 PBMC로부터 T 세포를 단리시켰다. 인간 T 세포 및 표적 세포를 배지(RPMI1640 + 5% FBS)에 재현탁시켰다. 표적 세포 밀도를 3 × 105개 세포/mL로 조정하고, T 세포 밀도를 1.2 × 106/mL로 조정하였다. 각 유형의 세포 50 μL를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다(이펙터 대 표적 비 4:1). 배지(RPMI1640+5% FBS)를 사용하여 시험 항체를 다양한 농도로 희석하고, 50 μL를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 10× Triton-X 100 용해물(RPMI1640 + 5% FBS + 10% Triton-X 100)을 표적 세포 최대 LDH 방출 대조군 웰 및 부피 보정 대조군 웰에 첨가하였다. 혼합물을 잘 혼합하고 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 400 g로 4분 동안 원심분리하였다. 50 μL의 상청액을 취한 후, LDH 발색 용액을 50 μL/웰의 농도로 첨가하였다. 혼합물을 빛이 없는 상태에서 실온에 20분 동안 방치한 후, MD StakMax(OD490)에서 플레이트를 판독하였다. PR004549를 CLDN18.2 표적 세포에 대한 양성 대조군으로 사용하고, PR004313을 CLDN18.1 표적 세포에 대한 양성 대조군으로 사용하고, PR004312 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 결과 계산을 위해, 보정된 판독값을 먼저 계산하였다. 배지 백그라운드 대조군 웰의 판독값을 실험 웰, 표적 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰, 및 이펙터 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 판독값에서 감한 후, 부피 보정 대조군 웰의 판독값을 표적 세포 최대 LDH 방출 대조군 웰의 판독값에서 감했다. TDCC 활성(%) = (실험 웰의 보정된 판독값 - 이펙터 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 보정된 판독값 - 표적 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 보정된 판독값)/(표적 세포 최대 LDH 방출 대조군 웰의 보정된 판독값 - 표적 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 보정된 판독값) × 100. 도 6은 시험 항체의 TDCC 활성을 나타내며, 값은 표 19에 자세히 표시되어 있다. CLDN18.2를 매우 내인적으로 발현하는 NUGC4_D8 세포에서, 시험 항체는 PR004549와 비교하여 더 높거나 비슷한 TDCC 활성을 유도할 수 있다. 반면, CLDN18.2를 낮게 발현하는 IM95 세포에서, 시험 항체는 PR004549에 비해 더 낮은 TDCC 활성을 유도한다. SNU620 세포는 CLDN18.2의 149번 아미노산에 메티오닌에서 류신으로의 돌연변이를 가지며, 이는 CLDN18.2 돌연변이가 있는 위암 환자의 하위 집합을 대표하고, 시험 항체는 PR004549와 비교하여 더 높거나 비슷한 TDCC 활성을 유도할 수 있다. 시험 항체는 HEK293/hCLDN 18.1 세포에 대한 TDCC 효과를 유도하지 못했다.
[표 19]
실시예 12: BLI 방법에 의한 인간 Fc 수용체 단백질에 대한 항체의 결합 친화도
단백질과 항체 간의 결합 동역학은 Octet Red 96e(Fortebio) 시스템을 사용하는 생물층 간섭계(BLI) 기술로 분석하였다. 시스템의 회전 속도를 1000 rpm으로 설정하였다. 10× 동역학 완충액(ForteBio, Cat#18-1105)을 친화도 분석 및 샘플 희석을 위해 1× 동역학 완충액으로 희석하였다. 일렬로 배열된 FAB2G 센서(Fortebio, 18-5125)를 시험 완충액에서 10분 동안 평형화한 후, 1 nm의 캡처 높이에서 항체(PR002725, PR005397, PR006384, PR005411, PR006292, PR006023, 및 PR006293)를 캡처하는 데 사용했다. 완충액에서 120초 동안 평형화한 후, FAB2G 센서를 2배 연속 희석된 인간 Fc 수용체 단백질에 결합시켰다. 단백질 농도와 결합 및 해리 시간은 표 20에 제시되어 있다. 마지막으로, FAB2G 센서를 pH 1.5의 10 mM 글리신-염산 용액에 담가서 재생시켜, 센서에 결합된 단백질을 용리시켰다. FcRn에 대한 항체의 친화도 분석은 pH 6.0 완충액과 pH 7.4 완충액의 두 조건 모두에서 수행하였다. PR004549의 경우, 캡처 센서는 ProL(Fortebio, 18-5085)이다. Octet 데이터 분석 소프트웨어(Fortebio, version 11.0)를 사용하여 데이터 분석을 수행한 경우, 0 nM을 기준 홀로 사용하고 기준 감산을 수행하였으며; 데이터 피팅을 위해 "1:1 글로벌 피팅" 방법을 선택하고, 항체에 대한 단백질 결합의 동역학 매개변수를 계산하여 kon(1/Ms) 값, kdis(1/s) 값, 및 KD(M) 값을 얻었다. 빠른 결합과 빠른 해리의 상호작용을 위해, "정상 상태" 방법을 선택하여 데이터를 피팅해 KD(M) 값을 얻었다. 인간 Fc 수용체 단백질에 대한 항체의 결합 친화도는 표 21에 제시되어 있다.
[표 20]
[표 21]
실시예 13: BLI 방법에 의한 다양한 종의 CD3 단백질에 대한 항체의 결합 친화도
단백질과 항체 간의 결합 동역학은 Octet Red 96e(Fortebio) 시스템을 사용하는 생물층 간섭계(BLI) 기술로 분석하였다. 인간 CD3E(Acro, CDE-H5223), 시노몰구스 CD3E(Acro, CDE-C5226), 및 뮤린 CD3E(Acro, CDE-M5256)를 1:3의 몰비로 비오틴(Thermo Scientific, A39257)과 혼합하였다. 혼합물을 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 과잉의 비오틴을 제거하여 비오티닐화된 CD3E를 얻었다. 시스템의 회전 속도를 1000 rpm으로 설정하였다. 10× 동역학 완충액(ForteBio, Cat#18-1105)을 친화도 분석 및 샘플 희석을 위해 1× 동역학 완충액으로 희석하였다. 일렬로 배열된 SA 센서(Fortebio, 18-5019)를 시험 완충액에서 10분 동안 평형화한 후, 비오틴 표지가 있는 CD3 또는 비오티닐화된 CD3을 0.2 nm의 캡처 높이에서 캡처하는 데 사용했다. 완충액에서 120초 동안 평형화한 후, CD3이 캡처된 SA 센서를 2배 연속 희석된 항체에 결합시켰다. 항체 농도는 표 22에 제시되어 있으며, 결합 및 해리 시간은 180초 및 300초로 설정되었다. 마지막으로, SA 센서를 pH 1.5의 10 mM 글리신-염산 용액에 담가서 재생시켜, 센서에 결합된 항체를 용리시켰다. 항체 항-CD3e 48-2B(santa cruz biotechnology, SC-1174)는 뮤린 양성 항체이다. Octet 데이터 분석 소프트웨어(Fortebio, version 11.0)를 사용하여 데이터 분석을 수행한 경우, 0 nM을 기준 홀로 사용하고 기준 감산을 수행하였으며; 데이터 피팅을 위해 "1:1 글로벌 피팅" 방법을 선택하고, 항체에 대한 단백질 결합의 동역학 매개변수를 계산하여 kon(1/Ms) 값, kdis(1/s) 값, 및 KD(M) 값을 얻었다. 빠른 결합과 빠른 해리의 상호작용을 위해, "정상 상태" 방법을 선택하여 데이터를 피팅해 KD(M) 값을 얻었다. 다양한 종의 CD3 단백질에 대한 항체의 결합 친화도는 표 23에 제시되어 있다. PR002199는 Teneobio의 특허 WO 2018052503의 항-BCMA(TNB308902)×CD3(TNB_F2B) 이중특이적 항체로부터 유래되었다. PR004931은 Roche의 특허 WO 2017055389A1의 항-CEA×CD3 이중특이적 항체로부터 유래되었다.
[표 22]
[표 23]
실시예 14: 인간 CLDN18.2 파라로그 단백질에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 결합 친화도
FACS(ACEA NovoCyte)로 인간 CLDN18.2 파라로그 단백질에 대한 항체의 결합 친화도를 분석하였다. 인간 CLDN18.2 파라로그 계열의 CLDN1, CLDN2, CLDN3, CLDN4, CLDN6, 및 CLDN9 유전자를 HEK293 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 플라스미드에 대한 정보는 표 24에 제시되어 있다. 결합 친화도는 다음과 같이 결정되었다: 세포를 300 g로 5분 동안 원심분리한 후, FACS 완충액(2% FBS 함유 PBS)에 재현탁시켰다. 세포 밀도를 106개 세포/mL로 조정하고, 50 μL의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. FACS 완충액을 사용하여 항체를 60 nM로 희석하고, 50 μL의 항체 희석액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 이어서, 2차 항체가 포함된 FACS 완충액을 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정액에 재현탁시키고 FACS를 실행시켰다. 양성 대조군 항체, 음성 대조군 항체, 및 2차 항체에 대한 정보는 표 25에 제시되어 있다. PR005080은 CLDN2 결합에 대한 양성 대조군으로 사용된 클론 1A2 항체(자체 제조, EP3567053A1 참조)였다. FACS 결과는 도 7에 도시되어 있고, 인간 CLDN18.2 파라로그 계열 단백질의 CLDN1, CLDN2, CLDN3, CLDN4, CLDN6, 및 CLDN9에 대한 PR006384 및 PR006292의 비특이적 결합이 없었음을 보여준다.
[표 24]
[표 25]
실시예 15: 시노몰구스 표적 단백질에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 결합 친화도
FACS로 항체의 결합 친화도를 분석하였다. 시험 세포는 시노몰구스 CLDN18.2-발현 HEK293 세포(HEK293/cynoCLDN18.2), 시노몰구스 CLDN18.1-과발현 HEK293 세포(HEK293/cynoCLDN18.1), 및 시노몰구스 CD3 양성 T 세포를 포함한다. 비인간 영장류 CD3 세포 단리 키트(Miltenyi, 130-092-012)를 사용하여 시노몰구스 PBMC로부터 CD3 양성 T 세포를 단리시켰다. 결합 친화도는 다음과 같이 결정되었다: 세포를 300 g로 5분 동안 원심분리한 후, FACS 완충액(2% FBS 함유 PBS)에 재현탁시켰다. 세포 밀도를 106개 세포/mL로 조정하고, 50 μL의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. FACS 완충액을 사용하여 항체를 다양한 농도로 희석하고, 50 μL의 항체 희석액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 이어서, APC-접합 염소 항-인간 IgG 2차 항체(최종 농도 1.5 μg/mL, Jackson, 109-605-098)를 함유하는 FACS 완충액을 첨가하였다. 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 세포를 고정액에 재현탁시키고 FACS(ACEA NovoCyte)를 실행시켰다. 도 8 및 표 26은 시노몰구스 PBMC에서 시노몰구스 CLDN18.1 및 CLDN18.2를 과발현하는 HEK293 세포와 CD3 양성 T 세포에 대한 항체의 결합 친화도를 나타낸다. 모든 시험 항체는 CLDN18.2 및 CD3-발현 세포에 결합할 수 있고, CLDN18.1-발현 세포에는 결합하지 않는다.
[표 26]
실시예 16: 시노몰구스 CLDN18.2-발현 세포에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 TDCC 활성
CytoTox 96® 비방사성 세포독성 분석 키트(Promega, G1780)를 사용하여 HEK293/cynoCLDN18.2에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 TDCC 효과를 유도하는 활성을 분석하였다. 비인간 영장류 CD3 세포 단리 키트(Miltenyi, 130-092-012)를 사용하여 시노몰구스 PBMC로부터 CD3 양성 T 세포를 단리시켰다. 시노몰구스 T 세포 및 표적 세포를 배지(RPMI1640 + 5% FBS)에 재현탁시켰다. 표적 세포 밀도를 3 × 105개 세포/mL로 조정하고, T 세포 밀도를 1.2 × 106/mL로 조정하였다. 각 유형의 세포 50 μL를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다(이펙터 대 표적 비 4:1). 배지(RPMI1640+5% FBS)를 사용하여 시험 항체를 다양한 농도로 희석하고, 50 μL를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 10× Triton-X 100 용해물(RPMI1640 + 5% FBS + 10% Triton-X 100)을 표적 세포 최대 LDH 방출 대조군 웰 및 부피 보정 대조군 웰에 첨가하였다. 혼합물을 잘 혼합하고 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 400 g로 4분 동안 원심분리하였다. 50 μL의 상청액을 취한 후, LDH 발색 용액을 50 μL/웰의 농도로 첨가하였다. 혼합물을 빛이 없는 상태에서 실온에 20분 동안 방치한 후, MD StakMax(OD490)에서 플레이트를 판독하였다. 결과 계산을 위해, 보정된 판독값을 먼저 계산하였다. 배지 백그라운드 대조군 웰의 판독값을 실험 웰, 표적 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰, 및 이펙터 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 판독값에서 감한 후, 부피 보정 대조군 웰의 판독값을 표적 세포 최대 LDH 방출 대조군 웰의 판독값에서 감했다. TDCC 활성(%) = (실험 웰의 보정된 판독값 - 이펙터 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 보정된 판독값 - 표적 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 보정된 판독값)/(표적 세포 최대 LDH 방출 대조군 웰의 보정된 판독값 - 표적 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 보정된 판독값) × 100. 도 9는 HEK293/cynoCLDN18.2에 대한 항체에 의해 유도된 TDCC 활성을 나타낸다. 구체적인 값은 표 27에 제시되어 있다.
[표 27]
실시예 17: 시험관내 사이토카인 방출 분석
항체의 안전성을 예측하기 위해, 인간 PBMC를 사용하여 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 시험관내 유도된 사이토카인 방출에 대해 분석하였다. PBMC를 HEK293/hCLDN18.1 세포의 존재 또는 부재하에 항체와 함께 인큐베이션하였다. PBMC와 HEK293/hCLDN18.1을 배지(RPMI1640 + 10% FBS)에 재현탁시켰다. HEK293/hCLDN18.1 세포의 밀도를 1.5 × 106개 세포/mL로 조정하고, PBMC의 세포 밀도를 2 × 106/mL로 조정하였다. 100 μL의 HEK293/hCLDN18.1 세포 및 200 μL의 PBMC를 48웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 배지(RPMI1640+10% FBS)를 사용하여 시험 항체를 다양한 농도로 희석하고, 100 μL를 48웰 플레이트의 웰에 첨가하여 400 μL의 최종 부피가 되도록 했다. LPS(Sigma, L6529)를 양성 대조군으로 사용하였다. Iso hIgG1(CrownBio, C0001-4) 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 샘플을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 300 g로 10분 동안 원심분리하고, 300 μL의 상청액을 채취하였다. 상청액 중 IL-6(Invitrogen, 88-7066) 및 TNF-α(Invitrogen, 88-7346)의 농도를 ELISA로 정량화하였다. 도 10은 시험관내 항체에 의해 유도된 사이토카인 방출을 나타낸다. PR004549에 의해 유도된 IL-6 및 TNF-α의 방출은 CLDN18.2 표적 세포의 부재시 PR006292에 의해 유도된 것보다 더 높으며, 이는 PR006292의 더 나은 안전성 프로파일을 나타낸다.
실시예 18: CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 ADCC 활성
CytoTox 96® 비방사성 세포독성 분석 키트(Promega, G1780)를 사용하여 Jurkat 세포 및 HEK293/hCLDN 18.2에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 ADCC 효과를 유도하는 활성을 분석하였다. 인간 PBMC를 300 g로 10분 동안 원심분리하고, 배지(RPMI1640 + 10% FBS)에서 밤새 배양하였다. 인간 NK 세포 단리 키트(Miltenyi, 130-092-657)를 사용하여 인간 PBMC로부터 NK 세포를 단리시켰다. Jurkat 세포를 300 g로 5분 동안 원심분리하고, 인간 NK 세포를 300 g로 10분 동안 원심분리하였다. 이어서, 세포를 배지(RPMI1640 + 5% FBS)에 재현탁시켰다. 표적 세포 밀도를 3 × 105개 세포/mL로 조정하고, NK 세포 밀도를 1.8 × 106/mL로 조정하였다. 각 유형의 세포 50 μL를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다(이펙터 대 표적 비 6:1). 배지(RPMI1640+5% FBS)를 사용하여 시험 항체를 다양한 농도로 희석하고, 50 μL를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션한 후, 10× Triton-X 100 용해물(RPMI1640 + 5% FBS + 10% Triton-X 100)을 표적 세포 최대 LDH 방출 대조군 웰 및 부피 보정 대조군 웰에 첨가하였다. 혼합물을 잘 혼합하고 37℃에서 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 300 g로 5분 동안 원심분리하였다. 50 μL의 상청액을 취한 후, LDH 발색 용액을 50 μL/웰의 농도로 첨가하였다. 혼합물을 빛이 없는 상태에서 실온에 20분 동안 방치한 후, MD StakMax(OD490)에서 플레이트를 판독하였다. PR003767을 양성 대조군으로 사용하고 Iso hIgG1(CrownBio, C0001-4) 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 결과 계산을 위해, 보정된 판독값을 먼저 계산하였다. 배지 백그라운드 대조군 웰의 판독값을 실험 웰, 표적 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰, 및 이펙터 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 판독값에서 감한 후, 부피 보정 대조군 웰의 판독값을 표적 세포 최대 LDH 방출 대조군 웰의 판독값에서 감했다. ADCC 활성(%) = (실험 웰의 보정된 판독값 - 이펙터 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 보정된 판독값 - 표적 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 보정된 판독값)/(표적 세포 최대 LDH 방출 대조군 웰의 보정된 판독값 - 표적 세포 자연 방출 LDH 대조군 웰의 보정된 판독값) × 100. 도 11a는 Jurkat 세포에 대한 항체의 ADCC 활성을 나타낸다. PR006292 및 PR004549는 Jurkat 세포에 대해 ADCC 효과를 유도할 수 없었다.
NK92/CD16a 세포를 사용하여 NUGC4_D8에 대한 CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 ADCC 효과를 유도하는 활성을 분석하였다. NUGC4_D8 및 NK92/CD16a를 배지(RPMI1640 + 5% FBS)에 재현탁시켰다. 표적 세포 밀도를 3 × 105개 세포/mL로 조정하고, NK92/CD16a 세포 밀도를 1.8 × 106/mL로 조정하였다. 각 유형의 세포 50 μL를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다(이펙터 대 표적 비 6:1). 배지(RPMI1640+5% FBS)를 사용하여 시험 항체를 다양한 농도로 희석하고, 50 μL를 96웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 샘플을 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. PR003197을 양성 대조군으로 사용하였다. 도 11b는 NUGC4_D8에 대한 항체의 ADCC 활성을 나타낸다. PR006292 및 PR004549는 NUGC4_D8 세포에 대해 ADCC 효과를 유도할 수 없었다.
실시예 19: CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 CDC 활성
CellTiter-Glo 발광 세포 생존력 분석 키트(Promega, G7573)를 사용하여 HEK293/hCLDN18.2 및 Jurkat 세포에 대한 CLDN18.2 항체의 CDC 효과를 분석하였다. 표적 세포를 300 g로 5분 동안 원심분리한 후, RPMI1640 무혈청 배지에 재현탁시켰다. 표적 세포 밀도를 2 × 105개 세포/mL로 조정하고, 25 μL의 세포 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 무혈청 배지를 사용하여 항체를 다양한 농도로 희석하고, 25 μL의 항체 희석액을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 50 μL의 정상 인간 혈청(Access cell culture, 515)을 50%의 최종 농도가 되도록 첨가하고, 생성된 혼합물을 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 96웰 플레이트를 실온에 30분 동안 방치하고, 100 μL의 CellTiter-Glo 발색 용액을 실온에서 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 빛이 없는 상태의 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. PE Enspire를 사용하여 플레이트를 판독하였다. CDC 활성(%) = [1 - (발광 샘플)/(발광 모의 대조군)] × 100. IMAB362 유사체를 양성 대조군으로 사용하고 Iso hIgG1(CrownBio, C0001-4) 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 12는 Jurkat 세포 및 인간 CLDN18.2-과발현 HEK293 세포에 대한 PR006292 항체의 CDC 활성을 나타낸다. PR006292는 HEK293/hCLDN18.2에서 PR004549에 의해 유도된 것보다 더 큰 CDC 효과를 유도한 반면, Jurkat 세포에서는 CDC 활성이 관찰되지 않았다. CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 CDC 활성은 표 28에 구체적으로 제시되어 있다.
[표 28]
실시예 20: CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체의 경쟁적 결합 활성
본 실시예는 인간 CLDN18.2 항원의 에피토프 영역에 대한 항-인간 CLDN18.2 이중특이적 항체의 결합을 연구하기 위한 것이다. 인간 CLDN18.2-과발현 HEK293/hCLDN18.2 세포를 사용하여 세포 수준에서 경쟁적 결합 실험을 수행하였다. 간략하게, 지침에 따라 비오티닐화 키트(ThermoFisher, A35358)를 사용하여 항-인간 CLDN18.2 항체 PR000400 및 PR004549를 비오티닐화하였다. 96웰 V-바닥 플레이트(Corning, 3894)에 2 × 106개 세포/mL의 세포 및 50 μL/웰의 인간 CLDN18.2-과발현 HEK293T/hCLDN18.2 세포 현탁액을 첨가한 후, 비오티닐화된 항-인간 CLDN18.2 항체 PR000400 또는 PR004549 25 μL를 첨가하였다. 혼합물을 잘 혼합하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 상응하는 연속 희석된 비오티닐화되지 않은 항-인간 CLDN18.2 항체 25 μL를 첨가하였다. 혼합물을 잘 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰의 세포를 200 μL의 사전 냉각된 FACS 완충액(DPBS 중 2% BSA)으로 2회 세척하고, 4℃에서 500 g로 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버렸다. 형광 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, 016-540-084, 1:500)를 첨가하였다. 혼합물을 빛이 없는 상태의 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰의 세포를 200 μL의 사전 냉각된 FACS 완충액(DPBS 중 2% BSA)으로 2회 세척하고, 4℃에서 500 g로 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 버렸다. 마지막으로, 각 웰의 세포를 200 μL의 사전 냉각된 FACS 완충액에 재현탁시키고, ACEA_NovoCyte를 사용하여 형광 신호 값을 판독하였다. 다음 식을 사용하여 억제율을 계산하였다: 억제율(%) = (A - B)/A × 100 (참고: A: 비오티닐화된 항체와 ISO(hIgG1)(Crownbio, c0001-4)의 상호작용 후 형광 신호; B: 비오티닐화된 항체와 비오티닐화되지 않은 항체의 상호작용 후 형광 신호).
도 13 및 표 29에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항-CLDN18.2 이중특이적 항체는 모두 인간 CLDN18.2에 대한 PR000400 또는 PR004549의 결합을 차단할 수 있고, 항체의 검출된 차단 능력은 양의 상관관계 방식으로 항체 농도에 따라 증가하며, 이는 이들 항체가 PR000400 및 PR004549의 에피토프와 매우 유사한 에피토프를 갖는다는 것을 나타낸다. 시험 항체는 HEK293/hCLDN18.1 세포에 대해 낮은 결합 친화도를 갖는다. 상기 결과로부터, 시험 항체는 ECL2가 아닌 ECL1(세포외 루프 1)에서 인간 CLDN18.2 단백질에 결합하는 것으로 추론할 수 있다.
[표 29]
실시예 21: CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체에 대한 약동학 연구
BALB/c 누드 마우스를 사용하여 다음과 같이 약동학 연구를 수행하였다. 체중이 18~22 g인 암컷 BALB/c 누드 마우스 6마리를 선택하고 5 mg/kg의 용량으로 정맥 주사를 통해 항체를 투여했다. 투여 전 및 투여 15분 후, 24시간(1일) 후, 4일 후, 및 10일 후에 한 그룹의 마우스 3마리의 전혈을 채취하고, 투여 전 및 투여 5시간 후, 2일 후, 7일 후, 및 14일 후에 다른 그룹의 마우스 3마리의 전혈을 채취하였다. 전혈을 30분간 방치하여 응고시킨 후 원심분리하였다. 단리된 혈청 샘플은 분석에 사용될 때까지 -80℃에서 동결보존하였다. 마우스 혈청 내 약물 농도는 ELISA로 정량화했다. 전체 ELISA(전체 방법)는 염소 항-인간 Fc 다중클론 항체를 사용하여 마우스 혈청에서 인간 Fc-함유 항체를 캡처하여 수행되었고, HRP 표지된 염소 항-인간 Fc 2차 항체에 의해 검출되었다. CLDN18.2 결합 도메인 ELISA(Free X 방법)는 CLDN18.2 단백질을 사용하여 마우스 혈청에서 CLDN18.2 결합 도메인-함유 항체를 캡처하여 수행되었고, HRP 표지된 염소 항-인간 Fc 2차 항체에 의해 검출되었다. 비구획 분석(NCA)에 의해 Phoenix WinNonlin 소프트웨어(버전 8.2)를 사용하여 혈장 농도 데이터를 분석하여 약동학적 매개변수를 평가하였다.
PR006292, PR006384, 및 PR004549의 약동학은 도 14에 도시되어 있으며, 약동학적 매개변수는 표 30에 제시되어 있다. PR006292와 PR006384는 마우스에서의 안정성이 PR004549보다 우수하며, 마우스에서 긴 반감기와 높은 약물 노출량을 갖는다.
[표 30]
실시예 22: CLDN18.2×CD3 이중특이적 항체에 대한 생체내 약동학 연구
NUGC4_D8 종양 모델
인간 PBMC 면역계의 NUGC4_D8 종양 모델을 재확립하기 위해 NCG 마우스를 사용하여 생체내 약동학 연구를 수행하였다. 방법은 구체적으로 다음과 같다. 세포 접종 당일에, 각 NCG 마우스에 NUGC4_D8 세포와 PBMC를 피하 접종하였다. 각 마우스 그룹의 평균 종양 부피가 90 mm3에 도달하면, 마우스를 그룹으로 나누어 총 1회의 투여를 꼬리 정맥을 통해 실시하였다. 투여 시작 후, 체중 및 종양 부피를 주 2회 측정하였다. 종양 부피는 다음과 같이 계산하였다: 종양 부피(mm3) = 0.5 × 종양의 긴 직경 × 종양의 짧은 직경2. 데이터는 t-검정을 사용하여 분석하였다.
PR005397, PR005411, 및 PR004549의 생체내 항종양 효과는 도 15a에 도시되어 있다. 구체적으로, 접종 후 25일째 Iso hIgG1 대조군 마우스의 평균 종양 부피는 1897 mm3이었다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR004549(0.2 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 104 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 < 0.0001), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 94.48%였다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR004549(0.04 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 538 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 < 0.0001), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 71.61%였다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR005411(0.2 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 30 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 < 0.0001), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 98.39%였다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR005411(0.04 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 263 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 < 0.0001), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 86.1%였다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR005397(0.04 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 327 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 < 0.0001), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 82.75%였다. 치료 전반에 걸쳐, 동물은 약물에 양호한 내약성을 나타냈으며, 큰 체중 감소나 동물의 사망은 발생하지 않았다. PR005397 및 PR005411의 생체내 항종양 효과는 PR004549보다 더 우수하다.
PR006292, PR006293, PR006384, 및 PR004549의 생체내 항종양 효과는 도 15b에 도시되어 있다. 구체적으로, 접종 후 25일째 Iso hIgG1 대조군 마우스의 평균 종양 부피는 1355 mm3이었다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR004549(0.2 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 408 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 = 0.0001), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 69.83%였다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR004549(0.04 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 743 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 = 0.0037), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 45.15%였다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR006293(0.2 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 39 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 < 0.0001), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 97.06%였다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR006293(0.04 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 190 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 < 0.0001), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 85.96%였다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR006384(0.2 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 81 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 < 0.0001), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 94%였다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR006384(0.04 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 752 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 = 0.0071), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 44.47%였다. 접종 후 25일째 시험 약물 PR006292(0.04 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 580 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 = 0.0006), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 57.15%였다. 치료 전반에 걸쳐, 동물은 약물에 양호한 내약성을 나타냈으며, 큰 체중 감소나 동물의 사망은 발생하지 않았다. PR006292, PR006293, 및 PR006384의 생체내 항종양 효과는 PR004549보다 더 우수하다.
SNU620 PBMC 종양 모델
인간 PBMC 면역계의 SNU620 종양 모델을 재확립하기 위해 NCG 마우스를 사용하여 생체내 약동학 연구를 수행하였다. 방법은 구체적으로 다음과 같다. 세포 접종 당일에, 각 NCG 마우스에 SNU620 종양 세포를 피하 접종하였다. 각 마우스 그룹의 평균 종양 부피가 70 mm3에 도달하면, 마우스를 그룹으로 나누어 총 4회의 투여를 꼬리 정맥을 통해 실시하였다. 투여 시작 후, 체중 및 종양 부피를 주 2회 측정하였다. 종양 부피는 다음과 같이 계산하였다: 종양 부피(mm3) = 0.5 × 종양의 긴 직경 × 종양의 짧은 직경2. 데이터는 t-검정을 사용하여 분석하였다.
PR006292 및 PR004549의 생체내 항종양 효과는 도 15c에 도시되어 있다. 구체적으로, 접종 후 36일째 Iso hIgG1 대조군 마우스의 평균 종양 부피는 847 mm3이었다. 접종 후 36일째 시험 약물 PR006292(0.2 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 131 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 = 0.0076), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 84.53%였다. 접종 후 36일째 시험 약물 PR006292(0.04 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 505 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타내지 않았고(p 값 = 0.3856), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 40.36%였다. 접종 후 36일째 시험 약물 PR004549(0.2 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 858 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 > 0.9999), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 -1.28%였다. 접종 후 36일째 시험 약물 PR004549(0.04 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 844 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 > 0.9999), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 0.39%였다. 치료 전반에 걸쳐, 동물은 약물에 양호한 내약성을 나타냈으며, 큰 체중 감소나 동물의 사망은 발생하지 않았다.
HuP-T4 PBMC 종양 모델
인간 PBMC 면역계의 HuP-T4 종양 모델을 재확립하기 위해 NCG 마우스를 사용하여 생체내 약동학 연구를 수행하였다. 방법은 구체적으로 다음과 같다. 세포 접종 당일에, 각 NCG 마우스에 HuP-T4 종양 세포를 피하 접종하였다. 각 마우스 그룹의 평균 종양 부피가 130 mm3에 도달하면, 마우스를 그룹으로 나누어 총 4회의 투여를 꼬리 정맥을 통해 실시하였다. 투여 시작 후, 체중 및 종양 부피를 주 2회 측정하였다. 종양 부피는 다음과 같이 계산하였다: 종양 부피(mm3) = 0.5 × 종양의 긴 직경 × 종양의 짧은 직경2. 데이터는 t-검정을 사용하여 분석하였다.
PR006292의 생체내 항종양 효과는 도 15d에 도시되어 있다. 구체적으로, 접종 후 36일째 Iso hIgG1 대조군 마우스의 평균 종양 부피는 1059 mm3이었다. 접종 후 36일째 시험 약물 PR006292(0.5 mg/kg) 치료군의 평균 종양 부피는 129 mm3로 Iso hIgG1 대조군의 값과 유의한 차이를 나타냈고(p 값 = 0.0022), 종양 성장 억제율 TGI(%)는 87.75%였다. 치료 전반에 걸쳐, 동물은 약물에 양호한 내약성을 나타냈으며, 큰 체중 감소나 동물의 사망은 발생하지 않았다.
마우스에서의 생체내 사이토카인 방출 시험
인간 PBMC 면역계를 재확립하기 위해 NCG 마우스를 사용하여 생체내 사이토카인 폭풍 연구를 수행하였다. 방법은 구체적으로 다음과 같다. 각 NSG 마우스에 2x107개 인간 PBMC를 정맥내 주사하고, 다음날 PR006292, PR004549, 및 대조군 IgG1 항체를 정맥내 투여했다. 투여 0시간(투여 전), 4시간, 및 24시간 후에 혈액을 채취하여 혈청을 수집하였다. IFN-γ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, 및 TNF-α를 비롯한, 혈청 내 다수의 사이토카인의 수준을 검출하기 위해 MSD 방법을 사용하였다. 데이터는 t-검정을 사용하여 분석하였다.
도 15e는 항체 주사 4시간 후 마우스 혈청에서 검출 가능한 사이토카인 일부의 발현을 나타낸다. 결과는 PR006292가 대조군 항체 PR004549에 비해 IFN-γ, IL-2, 및 TNF-α와 같은 사이토카인의 더 낮은 방출을 유도했고 더 나은 안전성을 나타냄을 보여주었다.

Claims (27)

  1. HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 CLDN18.2-표적화 항체로서, HCDR1은 서열번호 16 내지 18 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 42 내지 46 및 서열번호 48 내지 54 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 77 내지 82 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  2. 제1항에 있어서, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 42, 및 서열번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 43, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 44, 및 서열번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 17, 서열번호 45, 및 서열번호 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 18, 서열번호 43, 및 서열번호 80에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 18, 서열번호 43, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 43, 및 서열번호 81에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 46, 및 서열번호 82에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 48, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 49, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 50, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 51, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 52, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 53, 및 서열번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 54, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  3. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 프레임 영역을 추가로 포함하고, 그중 HFR1은 서열번호 6 또는 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR2는 서열번호 28 내지 34 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR3은 서열번호 63 내지 68 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HFR4는 서열번호 84 및 86 내지 89 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  4. 제3항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 서열번호 150 내지 157 및 서열번호 159 내지 165 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 항체.
  5. 제1항에 있어서, 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하고; 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 hIgG1, hIgG2, hIgG3, 및 hIgG4 및 이들의 변이체로부터 선택되고; 더 바람직하게는, 중쇄 불변 영역은 hIgG1인, 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 중쇄 항체, 또는 단일도메인 항체, 또는 상기 항체들로부터 제조된 단일클론 또는 다중클론 항체인 항체.
  7. 제6항에 있어서, 서열번호 182 내지 189 및 서열번호 191 내지 197 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단일도메인 항체인 항체.
  8. CD3를 표적화하는 제1 단백질 기능 영역 및 CLDN18.2를 표적화하는 제2 단백질 기능 영역을 포함하는 이중특이적 항체로서,
    제1 단백질 기능 영역은 Fab 형태이고 제2 단백질 기능 영역은 VH 형태로 바람직하게는 2 또는 3개의 VH를 포함하고; 제2 단백질 기능 영역이 직렬 연결된 3개의 VH를 포함하는 경우, 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역은 각각 Fc의 이중 가닥에 연결되고; 제2 단백질 기능 영역이 직렬 연결된 2개의 VH를 포함하는 경우, 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역은 각각 Fc의 이중 가닥에 연결되고; 제2 단백질 기능 영역이 3개의 VH를 포함하고 3개의 VH 중 하나가 제1 단백질 기능 영역에 연결되는 경우, 나머지 2개의 VH는 직렬 연결되고, 제1 단백질 기능 영역 및 제2 단백질 기능 영역의 직렬 연결된 2개의 VH는 각각 Fc의 이중 가닥에 연결되거나;
    대안적으로, 제1 단백질 기능 영역은 Fab 형태이고 제2 단백질 기능 영역은 HCAb 형태이거나;
    대안적으로, 제1 단백질 기능 영역은 Fab 형태이고 제2 단백질 기능 영역은 VH-HCAb 형태이고 제2 단백질 기능 영역은 바람직하게는 총 4개의 VH를 포함하는, 이중특이적 항체.
  9. 제8항에 있어서, 제2 단백질 기능 영역은 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, HCDR1은 서열번호 16 내지 18 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 42 내지 46 및 서열번호 48 내지 54 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 77 내지 82 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    바람직하게는, HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 42, 및 서열번호 77에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 43, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 44, 및 서열번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 48, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 49, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 50, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 51, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 52, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 53, 및 서열번호 79에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나; HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 54, 및 서열번호 78에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    더 바람직하게는, 중쇄 가변 영역은 서열번호 150 내지 152 및 서열번호 159 내지 165 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 제1 단백질 기능 영역은 서열번호 101, 서열번호 116, 및 서열번호 131에 각각 제시된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 11, 서열번호 38, 및 서열번호 72에 각각 제시된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고;
    바람직하게는, 중쇄 가변 영역은 서열번호 149 또는 서열번호 144에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열번호 168에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    이중특이적 항체는 하기 형태의 3개의 폴리펩티드 쇄를 포함하며:
    Fc의 2개의 N-말단이 각각 Fab 및 VH에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3 또는 VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCD3-CH1-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나;
    대안적으로, HCAb의 하나의 C-말단이 Fab의 VH 또는 VL에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-VHCD3-CH1로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나; 대안적으로 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-VLCD3-CL로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VHCD3-CH1로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나; 대안적으로, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-VHCD3-CH1로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나; 대안적으로, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-VLCD3-CL로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VHCD3-CH1로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나;
    대안적으로, Fab의 중쇄의 N-말단이 하나의 VHCLDN18.2에 연결되고, 중쇄의 C-말단이 Fc의 하나의 N-말단에 연결되고, 직렬 연결된 VH의 C-말단이 Fc의 다른 N-말단에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-VHCD3-CH1-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖고;
    더 바람직하게는, VH, CH2-CH3, 및 VL과 같은 서로 다른 기능 단위는 바람직하게는 서열번호 244 내지 248 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열, 바람직하게는 서열번호 246에 제시된 서열을 포함하는 링커 펩티드에 의해 작동 가능하게 연결되고;
    더 바람직하게는, Fc의 2개의 N-말단이 각각 Fab 및 VH에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3 또는 VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCD3-CH1-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나;
    대안적으로, HCAb의 하나의 C-말단이 Fab의 VH 또는 VL에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-링커 펩티드-VHCD3-CH1로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나; 대안적으로, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-링커 펩티드-VLCD3-CL로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VHCD3-CH1로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나;
    대안적으로, VH-HCAb의 하나의 C-말단이 Fab의 VH 또는 VL에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-링커 펩티드-VHCD3-CH1로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나; 대안적으로, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3-링커 펩티드-VLCD3-CL로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VHCD3-CH1로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖거나;
    대안적으로, Fab의 중쇄의 N-말단이 하나의 VHCLDN18.2에 연결되고, 중쇄의 C-말단이 Fc의 하나의 N-말단에 연결되고, 직렬 연결된 VH의 C-말단이 Fc의 다른 N-말단에 연결되고; 바람직하게는, 이중특이적 항체는 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCLDN18.2-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제1 폴리펩티드 쇄, 식: VHCLDN18.2-링커 펩티드-VHCD3-CH1-힌지-CH2-CH3로 표시되는 제2 폴리펩티드 쇄, 및 식: VLCD3-CL로 표시되는 제3 폴리펩티드 쇄를 갖는, 이중특이적 항체.
  12. 제11항에 있어서, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 214에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 220에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 221에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 222에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 223에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 224에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 225에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 226에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 228에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 227에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 230에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 229에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 231에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 232에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 229에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 233에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 234에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 213에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 219에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 209에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 221에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 209에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 236에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 236에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 237에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 238에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 239에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 240에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 241에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 242에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나;
    대안적으로, 제1 폴리펩티드 쇄는 서열번호 243에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드 쇄는 서열번호 235에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 제3 폴리펩티드 쇄는 서열번호 200에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 이중특이적 항체.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 암호화하는 단리된 핵산.
  14. 제13항에 따른 단리된 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터로서, 바람직하게는, 재조합 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지, 또는 바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터는 바람직하게는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 아데노-관련 바이러스 벡터인, 재조합 발현 벡터.
  15. 제14항에 따른 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 포함하는 형질전환체로서, 바람직하게는, 숙주 세포는 대장균 TG1, BL21 세포, 또는 CHO-K1 세포인, 형질전환체.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 키메라 항원 수용체.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 유전자 변형 세포로서, 바람직하게는, 진핵 세포, 바람직하게는 단리된 인간 세포, 더 바람직하게는 T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 세포인 유전자 변형 세포.
  18. 이중특이적 항체를 제조하는 방법으로서, 제15항에 따른 형질전환체를 배양하는 단계, 및 배양물로부터 항체 또는 이중특이적 항체를 얻는 단계를 포함하는 방법.
  19. 세포독성제, 및 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 항체-약물 접합체로서, 바람직하게는, 세포독성제는 MMAF 또는 MMAE인, 항체-약물 접합체.
  20. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물로서,
    바람직하게는, 호르몬제, 소분자 표적제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양용해 약물, 세포독성제, 사이토카인, 보조자극 분자의 활성화제, 억제 분자 억제제, 및 백신으로 이루어진 군의 하나 이상을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  21. CD3 및/또는 CLDN18.2-관련 질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체 또는 제20항에 따른 약학적 조성물의 용도로서,
    질환은 바람직하게는 암이고, 암은 바람직하게는 유방암, 난소암, 자궁내막암, 신장암, 흑색종, 폐암, 위암, 간암, 식도암, 자궁경부암, 두경부 종양, 담관암종, 담낭암, 방광암, 육종, 또는 결장직장암이고; 바람직하게는, 암은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 신장암, 또는 담관암종이고; 더 바람직하게는, 암은 유방암인, 용도.
  22. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 제16항에 따른 키메라 항원 수용체, 제17항에 따른 유전자 변형 세포, 또는 제19항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 제20항에 따른 약학적 조성물을 포함하는 키트로서,
    바람직하게는, (i) 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 항체-약물 접합체 또는 약학적 조성물을 투여하기 위한 장치; 및/또는 (ii) 설명서를 추가로 포함하는 키트.
  23. 키트 A 및 키트 B를 포함하는 부품 키트로서,
    키트 A는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 제16항에 따른 키메라 항원 수용체, 제17항에 따른 유전자 변형 세포, 제19항에 따른 항체-약물 접합체, 및/또는 제20항에 따른 약학적 조성물을 포함하고;
    키트 B는 다른 항종양 항체를 포함하거나, 또는 다른 항종양 항체, 및/또는 호르몬제, 소분자 표적제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양용해 약물, 세포독성제, 사이토카인, 보조자극 분자의 활성화제, 억제 분자 억제제, 및 백신으로 이루어진 군의 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는, 부품 키트.
  24. CLDN18.2-매개 질환 또는 장애를 진단, 치료, 및/또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 제16항에 따른 키메라 항원 수용체, 제19항에 따른 항체-약물 접합체 또는 제20항에 따른 약학적 조성물의 치료 유효량을 투여하는 단계, 또는 이를 필요로 하는 환자를 제23항에 따른 부품 키트로 치료하는 단계를 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 질환 또는 장애는 종양, 바람직하게는 CLDN18.2 양성 종양, 더 바람직하게는 위암, 식도암, 폐암, 난소암, 흑색종, 신장암, 유방암, 결장직장암, 간암, 췌장암, 방광암, 두경부암, 기관지 암종, 신경교종, 및/또는 백혈병인, 방법.
  26. CLDN18.2의 면역검출 또는 결정을 위한 방법으로서, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 제16항에 따른 키메라 항원 수용체, 제19항에 따른 항체-약물 접합체 또는 제20항에 따른 약학적 조성물을 사용하는 단계를 포함하고, 바람직하게는, 검출은 비진단 및/또는 치료 목적을 위한 것인, 방법.
  27. 병용 요법으로서, 이를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체, 제16항에 따른 키메라 항원 수용체, 제19항에 따른 항체-약물 접합체 또는 제20항에 따른 약학적 조성물, 및 제2 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 제2 치료제는 바람직하게는 다른 항종양 항체를 포함하거나, 또는 다른 항종양 항체, 및/또는 호르몬제, 소분자 표적제, 프로테아좀 억제제, 영상화제, 진단제, 화학요법제, 종양용해 약물, 세포독성제, 사이토카인, 보조자극 분자의 활성화제, 억제 분자 억제제, 및 백신으로 이루어진 군의 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 포함하는, 병용 요법.
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