JP2022539738A - トランスフェラーゼ酵素 - Google Patents

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Abstract

本発明は、一般に、キラヤ酸のＣ－３位で連続的にグリコシル化することができる酵素を含む、宿主細胞においてキラヤ酸をグリコシル化するのに有用である遺伝子及びポリペプチドに関する。本発明はさらに、これらの遺伝子及びポリペプチドを使用するシステム、方法、及び生成物に関する。

Description

技術分野
本発明は、一般に、宿主細胞においてキラヤ酸を修飾するのに有用である遺伝子及びポリペプチドに関する。本発明はさらに、これらの遺伝子及びポリペプチドを使用するシステム、方法、及び生成物に関する。
発明の背景
植物は、メバロン酸経路の主要な生成物であるステロール及びトリテルペノイドなどの多種多様な環状トリテルペンを生成する。
ＱＳ－２１は、チリの木であるキラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）（マメ目）によって合成される複雑なトリテルペノイドサポニンである（図１）。ＱＳ－２１は、抗体反応を促進し、特定のＴ細胞反応を増強することができる強力な免疫刺激剤であり、重要なアジュバントの可能性がある［１、２］。ＡＳ０１アジュバントは、ＱＳ－２１及び３－Ｏ－デスアシル－４’－モノホスホリルリピドＡのリポソーム製剤であり、現在、帯状疱疹に対するGlaxoSmithKline「Shingrix」ワクチン及びマラリアに対する「Mosquirix」の一部として認可されている［１、３］。これらは、ＱＳ－２１を利用する最初に認可されたヒトワクチンであるため、この分子の需要が、今後数年間で大幅に増加すると予想される。
現在、ＱＳ－２１は自然由来となっている。異種宿主でのＱＳ－２１（又は半合成に適した中間体）の工学的生産は、現在の生産方法に代わる、又は追加する方法を提供することになるであろう。しかしながら、現在、このＱＳ－２１の生合成についてはほとんど知られておらず、これが、この目的を実現するための重要な障壁となる。
生化学的には、ＱＳ－２１は、キラヤ酸として知られるＣ－３０トリテルペノイド骨格からなる。この骨格は、Ｃ－３位の分岐三糖及びＣ－２８位の線状四糖で修飾されている。四糖の末端の糖は、β－Ｄ－アピオース又はβ－Ｄ－キシロースのいずれかであり得る。最後に、四糖内のβ－Ｄ－フコース糖は、アラビノース糖でグリコシル化されたＣ－１８アシル鎖も特徴としている（図１）。
キラヤ酸の生合成は、酸化スクアレンシクラーゼ（ＯＳＣ）によるユニバーサル線状前駆体２，３－オキシドスクアレン（ＯＳ）の環化によって合成されるβ－アミリンから生じる（図２）。β－アミリン骨格は、Ｃ－２８位、Ｃ－１６α位、及びＣ－２３位それぞれで、カルボン酸、アルコール、及びアルデヒドでさらに酸化されてキラヤ酸（ＱＡ）を形成する。こその生合成経路を図２に提案する。
先に出願された未公開の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６４３０号（後に国際公開第２０１９／１２２２５９号として公開されている）は、ＱＡの生成に関与する酵素の同定について説明している。候補酵素は、葉のｃＤＮＡからクローニングされた。酵素は、β－アミリンの合成及びキラヤ酸への酸化に必要な１つのＯＳＣ及び３つのシトクロムＰ４５０（Ｐ４５０）の同定を可能にする、ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）での一過性の共発現によって試験された（図２）。これらの酵素は、本明細書では、ＱｓｂＡＳ（β－アミリンシンターゼ）、及びＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－２８、ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α、及びＱｓＣＹＰ７１４－Ｃ－２３オキシダーゼと呼ばれ得る。
キラヤ酸を３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐ）にグリコシル化するための提案されたスキームが図３に示されている。
トリテルペンをグリコシル化できると報告されているいくつかの酵素は、甘草由来のＣ－３グルクロン酸（ＧｌｃＡ）トランスフェラーゼ［Xu, G., et al., A novel glucuronosyltransferase has an unprecedented ability to catalyse continuous two-step glucuronosylation of glycyrrhetinic acid to yield glycyrrhizin. New Phytologist, 2016. 212(1): p. 123-135.］及び大豆由来のＣ－３－ＧｌｃＡガラクトシルトランスフェラーゼ［Shibuya, M., et al., Identification and characterization of glycosyltransferases involved in the biosynthesis of soyasaponin I in Glycine max. FEBS Lett, 2010. 584(11): p. 2258-64］を含む、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）以外の植物から以前に得られた。
米国特許出願公開第２０１９００５９３１４号及び国際公開第２０２０／０４９５７２号は、調節遺伝子及び酵素をコードする遺伝子を含む、ステロイドアルカロイド及びサポニンの生合成に有用であると報告されている遺伝子、及び植物中のステロイド（グリコ）アルカロイド又はフィトステロールの含有量を変更するためのそれらの使用に関する。米国特許出願公開第２０１９００５９３１４号は、これに関連してセルロースシンターゼ様タンパク質をコードする遺伝子の使用について論じている。
しかしながら、ＱＡのＣ－３位でのグリコシル化又は連続的なグリコシル化に関与するグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）はこれまで報告されていない。上記に照らして、そのようなＧＴの提供は、当技術分野に貢献するであろうことが分かる。
本発明の開示
本発明は、ＱＡのＣ－３位での連続的なグリコシル化に関与するグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）の同定に関する。
図３に示されているように、ＱＳ－２１のＣ－３位における分岐三糖鎖は、ＱＡの３－Ｏ位に付着したβ－Ｄ－グルクロン酸（ＧｌｃｐＡ）残基で開始される。次いで、ＧｌｃｐＡ残基は、β－１→２結合を介してＤ－ガラクトース（Ｇａｌｐ）に結合され、β－１，３結合を介してＤ－キシロース（Ｘｙｌｐ）に結合される。
これらの後者の２つのステップ（ＧｌｃｐＡへのＧａｌｐ及びＸｙｌｐ結合）は、簡単にするために図３では線形に示されているが、どちらの順序でも起こり得ることに留意されたい。
加えて、以下で説明されるように、β－Ｄ－Ｘｙｌｐ残基は、特定の状況ではα－Ｌ－ラムノース残基で置換され得る。
具体的には、本発明者らは、キラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）から、２つのグルクロノシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、及びラムノシル、キシロシル、並びに３－Ｏ分岐三糖内のそれぞれの糖でのＱＡの３－Ｏ位のグリコシル化を可能にする二重ラムノシル／キシロシルトランスフェラーゼを特徴付けた。したがって、本発明の意味では、「３－Ｏ分岐三糖」という用語における数字の「３」は、（図２に示されているように）ＱＡのＣ－３位として理解されるべきである。
本発明者らは、これらの酵素を、表５に示されているように、「ＱｓＣＳＬ１」、及び「ＱｓＣＳＬＧ２」（グルクロノシルトランスフェラーゼ）、「Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ」（ガラクトシルトランスフェラーゼ）、「Ｑｓ＿０２８３８５０」、「ＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８」、「Ｑｓ＿０２８３８７０」、及び「Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ」（ラムノシル及び／又はキシロシルトランスフェラーゼ）」と命名した。
驚くべきことに、グルクロノシルトランスフェラーゼ酵素は、「セルロースシンターゼ様」酵素である。セルロースシンターゼは、一般に、細胞壁生合成に関連し、ほとんどのメンバーの機能は不明である［１３］。
したがって、本開示は、ＱＡ－グリコシル化におけるそのような酵素の新規な使用（インビボ又はインビトロ）を提供する。本明細書で使用される「ＱＡ－グリコシル化」などの用語は、広く使用され、既にグリコシル化されているＱＡの連続的なグリコシル化も含む。
ガラクトシルトランスフェラーゼ及びラムノシル／キシロシルトランスフェラーゼ酵素は、ファミリー１ ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。このクラスの酵素は、植物に特化したグリコシル化に関与していることが以前に確認されているが、他の酵素クラスが植物に特化した代謝物の生合成に役割を果たすことが分かっている［８～１２］。
酵素の協働による動作を図９に示す（簡単にするために、ここでも線形に示されている）。
したがって、本発明は、宿主細胞又は生物（例えば、植物又は微生物）が、グリコシル化ＱＡ、例えば、３－Ｏ分岐三糖キラヤ酸（ＱＡ）誘導体（「ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ」）の生合成を行えるようにする工学的技術を提供する。別法では、酵素をインビトロで使用して、表５に報告されているそれぞれの活性を発揮することができる。
これらの酵素を、この目的のために相互参照によりその全開示が本明細書に組み込まれる先に出願された未公開の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６４３０号（後に国際公開第２０１９／１２２２５９号として公開されている）で特徴付けられたような、ＯＳからのＱＡの合成を可能にする酵素と組み合わせて有利に使用することができる。このような酵素（「ＱＡポリペプチド」として定義される）の例が表８に示されている。
したがって、本発明の一態様では、宿主が、３－Ｏ分岐三糖キラヤ酸（「ＱＡ」）誘導体（「ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ」）の生合成を行うことができない表現型から、ＱＡの３－Ｏ位のグリコシル化によって宿主が前記ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳの生合成を行うことができる表現型に宿主を変換する方法が提供され、ここで、
ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳは、
３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐ）又は（３β－｛［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸）（ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ）であり、
この方法は、宿主内又はその１つ又は複数の細胞内で異種核酸を発現させるステップ、及びこのステップの前の、その核酸を宿主又は祖先のいずれかに導入する最初のステップを含み、
この異種核酸は、組み合わせられると前記ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳの生合成活性を有するポリペプチドをそれぞれコードする複数のヌクレオチド配列を含む。
例として、図３の例示的なスキームを使用すると、コードされたポリペプチド（酵素）は：
（ｉ）キラヤ酸の３－Ｏ位のＤ－グルクロン酸（「ＧｌｃｐＡ」）を転移させて３β－｛［β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ」）を形成することができるＱＡ ３－Ｏグルクロノシルトランスフェラーゼ（「ＱＡ－ＧｌｃＡＴ」）；
（ｉｉ）β－１→２結合を介してＤ－ガラクトース（「Ｇａｌｐ」）をＱＡ－ＧｌｃｐＡに転移させて３β－｛［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ」）を形成することができるＱＡ－ＧｌｃｐＡガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＱＡ－ＧａｌＴ」）；
（ｉｉｉ）１→３結合を介してＬ－ラムノース（「Ｒｈａｐ」）及び／又はＤ－キシロース（「Ｘｙｌｐ」）をそれぞれＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐに転移させて、（３β－｛［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸）（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ」）及び／又は３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐ」）を形成することができるＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐラムノシル／キシロシルトランスフェラーゼ（「ＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ」）のタイプのポリペプチドのいずれか１つ又は複数を含み得る。
一実施形態では、ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐラムノシル／キシロシルトランスフェラーゼは、二重ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐラムノシル／キシロシルトランスフェラーゼであり得る。
ポリペプチド又はヌクレオチド配列のそれぞれは、任意選択により、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）から得られるか又はＱ．サポナリア（Q. saponaria）に由来する。
非限定的な例として、ＱＡ－ＧｌｃＡＴ、ＱＡ－ＧａｌＴ、及びＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴは、表５若しくは表６のそれぞれの酵素から選択されるか、又は表５若しくは表６の前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片である。
核酸は、表５又は表６のそれぞれの酵素をコードするポリヌクレオチド配列、又は前記ポリヌクレオチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片を含み得る。
表５のＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ酵素に関しては、以下の実施例で説明されるように、Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴは、二重ラムノシル／キシロシルトランスフェラーゼであると考えられている。
Ｑｓ＿０２８３８５０及びＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８はどちらも、主にラムノシルトランスフェラーゼであると考えられているが、Ｑｓ＿０２８３８７０は、主にキシロシルトランスフェラーゼであると考えられている。しかしながら、ある程度の交差活性が存在し得ることを理解されたい。簡潔にするために、これらすべてのタイプの酵素は、本明細書では、Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ酵素、又はＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ活性を有する酵素と呼ばれ得る。
好ましくは、３つすべてのタイプの酵素（ＱＡ－ＧｌｃＡＴ、ＱＡ－ＧａｌＴ、及びＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ）が、本発明の方法の一部として提供される。
ＱＡ－ＧｌｃＡＴ、ＱＡ－ＧａｌＴ、ＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ活性に関連して本発明の実施に使用するための好ましい遺伝子又はポリペプチドは、本明細書の表５又は表６（及び添付の配列）に示されるものであるか、又は必要な生物学的活性を有する、又は保持する、又はコードする実質的に相同なこれらの配列の変異体若しくは断片である。
例えば、ＱＡ－ＧａｌＴ活性は、Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴによって、又は別法では、その活性を共有することが本明細書で実証されているＧｍＵＧＴ７３Ｐ２によって、又はその生物学的活性を保持している、これらの配列のいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片によって提供され得る。
好ましい実施形態では、１つ、２つ、又は３つのポリペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉｉｉ）が、表５に列挙されたそれぞれのアミノ酸配列から選択される。
一実施形態では、それぞれのポリペプチドは：
（ｉ）配列番号２又は２６、最も好ましくは配列番号２に示されるＱＡ－ＧｌｃＡＴ；
（ｉｉ）配列番号４に示されるＱＡ－ＧａｌＴ；
（ｉｉｉ）配列番号６、２８、３０、又は３２、最も好ましくは配列番号６に示されるＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ；
又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同な変異体又若しくは断片からなるリストから選択される。
簡潔にするために、本発明の文脈において、特に本明細書に記載の方法及び使用において、表５及び表６のいずれかのポリペプチド又はヌクレオチド配列は、本明細書において「ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成配列」又は「ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ配列」、例えば、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子及びＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチドと呼ばれることがある。
変異体
これらのＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子（及びポリペプチド）の使用に加えて、本発明は、これらの遺伝子（及びポリペプチド）の変異体の使用を包含する。
「変異体」ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸又はＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチド分子は、本明細書で論じられるＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子又はポリペプチド配列の全部又は一部と相同性を共有するか、又は同一である。
変異体ポリペプチドは、天然ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチドの関連する生物学的活性を共有する。変異体核酸は、関連する変異体ポリペプチドをコードする。
この文脈において、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチドの「生物学的活性」は、図３に示され、上に記載されたそれぞれの反応を触媒する能力、及び／又はそれぞれの表、例えば、表５又は表６に示される活性である。関連する生物学的活性は、インビトロで表５に示されている反応に基づいてアッセイすることができる。別法では、これらの活性は、実施例に記載されるインビボでの活性によって、即ち、ＬＣ－ＭＳなどによってアッセイすることができる、それぞれの生成物を生成するための複数の異種構築物の宿主への導入によってアッセイすることができる。
Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴの変異体は、Ｄ－キシロース（Ｘｙｌｐ）又はＬ－ラムノース（Ｒｈａｐ）を優先的に触媒するものを含み得る。
相同性を評価するためのアラインメントは、例えば、Clustal Omega（https://www.ebi.ac.ukでアクセスできるバージョン１．２．４；例えば、Sievers F, et al. (2011) Fast, scalable generation of high‐quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology 7(1):539を参照）を使用して得ることができる。
本明細書に開示される配列の変異体は、好ましくは、参照ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、又は７０％、又は８０％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を共有する。そのような変異体は、本明細書では「実質的に相同」と呼ばれることがある。好ましい変異体は、少なくとも８０％の同一性を共有する。
好ましい変異体は、以下の通りであり得る：
（ｉ）対立遺伝子（１つ又は複数の塩基における多型又は突然変異を含む）又は偽対立遺伝子（本発明のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子に密接に関連する遺伝子座で起こり得る）などの天然に存在する核酸。また、パラログ、アイソゲネス、又は本発明のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子と同じファミリーに属する、例えば、クレード又はサブクレードを共有する他の相同遺伝子も含まれる。また、他の植物種からの相同分子種又は相同体も含まれる。
相同性は、以下で議論されるように、ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列レベルであり得る。
（ｉｉ）本開示に照らして当業者が調製することができる人工核酸。そのような誘導体は、例えば、部位特異的若しくはランダム突然変異誘発によって、又は直接合成によって調製することができる。好ましくは、変異体核酸は、本発明のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子の配列の全部又は一部を有する元の核酸から直接的又は間接的に（例えば、１つ又は複数の増幅又は複製ステップを介して）作製される。
また、上記の核酸に対応するが、３’又は５’末端で伸長された核酸も含まれる。
本明細書で使用される「ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ変異体核酸」という用語は、これらの可能性のすべてを包含する。ポリペプチド又はタンパク質の文脈で使用される場合、この用語は、変異体核酸のコードされた発現産物を示す。
いずれの場合も、好ましいＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾核酸は、配列番号１、３、５、又は２５、２７、２９又は３１のいずれか、又はそれらの実質的に相同な変異体である。（この、又はこれらの配列に関する本発明の他の態様の）一実施形態では、これらは、配列番号１、３、５のいずれか、又はそれらの実質的に相同な変異体である。
好ましいＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾ポリペプチドは、配列番号２、４、６、２６、２８、３０、又は３２のいずれか、又はそれらの実質的に相同な変異体である。（この、又はこれらの配列に関する本発明の他の態様の）一実施形態では、これらは、配列番号２、４、６のいずれか、又はそれらの実質的に相同な変異体である。
本発明で使用するための他の好ましいＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾核酸は、配列番号１９、又はその実質的に相同な変異体若しくは断片である。他の好ましいＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾ポリペプチドは、これらの配列又は変異体若しくは断片のいずれかによってコードされるポリペプチド、例えば、配列番号２０である。
追加の遺伝子
本発明の実施形態では、本明細書に記載の本発明のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子及び変異体核酸に加えて、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生成の流れに影響を及ぼし得る追加の遺伝子を導入することが好ましい場合がある。
先に出願された未公開の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６４３０号（後に国際公開第２０１９／１２２２５９号として公開されている）で説明されているように、ＱＳ－２１のコアアグリコン（即ち、ＱＡ）は、β－アミリンである単純なトリテルペンの誘導体であり、酸化スクアレンシクラーゼ（ＯＳＣ）によるユニバーサル線状前駆体２，３－オキシドスクアレン（ＯＳ）の環化によって合成される。
β－アミリン骨格は、Ｃ－１６α位、Ｃ－２３位、及びＣ－２８位それぞれで、アルコール、アルデヒド、及びカルボン酸でさらに酸化されてキラヤ酸を形成する。
したがって、ＯＳからのＱＡの生合成には、少なくとも４つの異なる酵素ステップが含まれる。関与する酵素には：
・オキシドスクアレンシクラーゼ；
・β－アミリン又はその酸化誘導体をＣ－２８位でカルボン酸に酸化することができる酵素；
・β－アミリン又はオレアノール酸などのその酸化された誘導体をＣ－１６α位でアルコールに酸化することができる酵素；
・β－アミリン又はエキノシスチン酸などのその酸化誘導体をＣ－２３位でアルデヒドに酸化することができる酵素が含まれる。
例えば：
（ｉ）２，３－オキシドスクアレン（ＯＳ）をトリテルペンに環化するためのβ－アミリンシンターゼ（ｂＡＳ）；
（ｉｉ）β－アミリン又はその酸化誘導体をＣ－２８位でカルボン酸に酸化することができる酵素（「Ｃ－２８オキシダーゼ」）；
（ｉｉｉ）β－アミリン又はその酸化誘導体をＣ－１６α位でアルコールに酸化することができる酵素（「Ｃ－１６αオキシダーゼ」）；及び
（ｉｖ）β－アミリン又はその酸化誘導体をＣ－２３位でアルデヒドに酸化することができる酵素（「Ｃ－２３オキシダーゼ」）。
簡潔にするために、これらの酵素は、本明細書ではそれぞれ、「ｂＡＳ」、「Ｃ－２８オキシダーゼ」、「Ｃ－１６αオキシダーゼ」、及び「Ｃ－２３オキシダーゼ」と呼ばれることがある。
さらに簡潔にするために、これらの酵素を、本明細書では総称して「ＱＡポリペプチド」と呼ぶことがある。
本発明は、これらのＱＡポリペプチド及びコード核酸と共に有利に適用することができる。
したがって、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチド及び遺伝子と併せた前述のＱＡポリペプチド及び遺伝子の使用が、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳの生合成の材料又は方法に関連する本発明の任意の態様に関連して明確に想定されることを理解されたい。
一実施形態では：
Ｃ－２８オキシダーゼは、ＣＹＰ７１６であり、
Ｃ－１６αは、ＣＹＰ７１６又はＣＹＰ８７であり、
Ｃ－２３オキシダーゼは、ＣＹＰ７１４、ＣＹＰ７２、又はＣＹＰ９４である。
好ましいＱＡ遺伝子又はＱＡポリペプチドは、表８に示されているもの、又はこれらの生物学的に活性な断片若しくは変異体である。変異体は、上記のようにＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子又はポリペプチドに関連して論じられるように、相同体、対立遺伝子、又は人工誘導体などであり得る。
例えば、ＱＡポリペプチドは：
（ｉ）配列番号１２に示されるβ－アミリンシンターゼ（ｂＡＳ）；
（ｉｉ）配列番号１４に示されるＣ－２８オキシダーゼ；
（ｉｉｉ）配列番号１６に示されるＣ－１６αオキシダーゼ；
（ｉｖ）配列番号１８に示されるＣ－２３オキシダーゼ；
又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片のいずれか１つ又は複数（好ましくはすべて）であり得る。
メバロン酸（ＭＶＡ）は、トリテルペノイド合成の重要な中間体である。したがって、ＱＡの収量を最大化するために、律速ＭＶＡ経路遺伝子を宿主に発現させることが望ましいであろう。
ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）は、ＭＶＡ経路における律速酵素であると考えられている。
ＨＭＧＲの組換えフィードバック非感受性切断型（recombinant feedback-insensitive truncated form）（ｔＨＭＧＲ）の使用は、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）における一過性発現時にトリテルペン（ｂ－アミリン）含有量を増加させることが実証されている［１９］。
したがって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子と共に、異種ＨＭＧＲ（例えば、フィードバック非感受性ＨＭＧＲ）の使用を含む。ＨＭＧＲをコードする配列又はポリペプチド配列の例には、配列番号７～１０又はこれらの変異体若しくは断片が含まれる。変異体は、上記のようにＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子又はポリペプチドに関連して論じられるように、相同体、対立遺伝子、又は人工誘導体などであり得る。例えば、利用されている宿主に固有のＨＭＧＲが好ましい場合がある－例えば、酵母宿主における酵母ＨＭＧＲなど。ＨＭＧＲ遺伝子は、当技術分野で公知であり、本開示に照らして適切に選択することができる。
また、スクアレンシンターゼ（ＳＱＳ）が潜在的な律速段階であることも報告されている［１９］。
したがって、本発明の一実施形態は、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子及び任意選択による本明細書に記載のＨＭＧＲと共に異種ＳＱＳの使用を含む。
ＳＱＳをコードする配列又はポリペプチド配列の例には、配列番号２１～２２又はこれらの変異体若しくは断片が含まれる。変異体は、上記のようにＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子又はポリペプチドに関連して論じられるように、相同体、対立遺伝子、又は人工誘導体などであり得る。例えば、利用されている宿主に固有のＳＱＳが好ましい場合がある－例えば、酵母宿主中の酵母ＳＱＳなど。ＳＱＳ遺伝子は当技術分野で公知であり、本開示に照らして適切に選択することができる。
特定の宿主（例えば、酵母）を使用する場合、ＱＡ生成の流れを改善するために追加の遺伝子を導入することが望ましいであろう。この例には、導入されたＰ４５０のレドックスパートナーとして機能する１つ又は複数の植物シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）が含まれ得る。したがって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載のＱＡポリペプチド及びＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子と共に、ＡｔＡＴＲ２（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）シトクロムＰ４５０レダクターゼ２）などの異種シトクロムＰ４５０レダクターゼの使用を含む。ＡｔＡＴＲ２をコードする配列又はポリペプチド配列の例には、配列番号２３～２４又はこれらの変異体若しくは断片が含まれる。変異体は、上記のようにＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子又はポリペプチドに関連して論じられるように、相同体、対立遺伝子、又は人工誘導体などであり得る。
したがって、一実施形態では、本発明で利用される核酸は：
（ｉ）ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）；
（ｉｉ）スクアレンシンターゼ（ＳＱＳ）のポリペプチドのうちの１つ又は複数をさらにコードし、
ＨＭＧＲ又はＳＱＳは、表７のそれぞれのポリペプチド又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片から任意選択により選択されるか、又は表７のそれぞれのポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片によってコードされる。
本開示に照らして、当業者は、追加の活性を提供するため、及び／又は発現若しくは活性を改善するために、本発明の実施において追加の遺伝子を利用できることを理解されよう。これらには、補因子又はヘルパータンパク質、又は他の因子を発現するものが含まれる。
簡潔にするために、文脈上特段の要求がない限り、これらの核酸配列（「本発明のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子」、及びＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ合成に影響を与える他の遺伝子、又はＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳの二次修飾）のいずれも、本明細書では「ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾核酸」と呼ばれることがある。同様に、コードされるポリペプチドは、本明細書では「ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾ポリペプチド」と呼ばれることがある。
これらの総称が任意の態様又は実施形態に関連して使用される場合、その意味又は開示は、必要な変更を加えてこれらの配列のいずれかに個別に適用するために採用されることを理解されたい。
ベクター
本発明の一態様として、上記の生合成経路におけるその協調的発現のために、それぞれが上記のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸の１つ又は複数を有する複数のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株の共インフィルトレーションを使用する方法が開示される。
いくつかの実施形態では、少なくとも２つ又は３つの異なるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株が、例えば、それぞれＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸を保有するように共インフィルトレーションされる。
遺伝子は、一過性発現ベクターに存在してもよい。
好ましい発現系は、その開示がＣＰＭＶ－ＨＴ系、例えばｐＥＡＱ－ＨＴ発現プラスミドに基づくベクターを使用する実施形態を支持するために本明細書に具体的に組み込まれる国際公開第２００９／０８７３９１号に記載されている、いわゆる「高翻訳性（Hyper-Translatable）」カウピーモザイクウイルス（「ＣＰＭＶ－ＨＴ」）系を利用する。
したがって、本発明で使用するためのベクター（典型的には、バイナリーベクター）は、典型的には：
（ｉ）以下に動作可能に連結されたプロモーター
（ｉｉ）ＲＮＡ－２ゲノムセグメントの標的開始部位が変異している、二分割ＲＮＡウイルスのＲＮＡ－２ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列；
（ｉｉｉ）上記のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸配列；
（ｉｖ）ターミネーター配列；及び任意選択により
（ｖ）前記ターミネーター配列の上流に位置する３’ＵＴＲを含む発現カセットを含む。
本発明の実施に有用なベクター及び発現系のさらなる例は、以下により詳細に記載される。
宿主
本発明の態様では、宿主は、ＯＳからの効果的なＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成を行うことができない表現型から、前記ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成を行うことができ、そのためＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳを宿主から回収する、又はインビボで利用して下流の生成物を合成することができる表現型に変換され得る。
上で説明されたように、ＱＡ生合成は、先に出願された未公開の国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６４３０号（後に国際公開第２０１９／１２２２５９号として公開されている）の開示に基づいて植物に工学的に組み込まれ得る。ＱＡ前駆体（２，３－オキシドスクアレン）は、ステロール生合成におけるその役割により高等植物に遍在するため、本発明は、植物宿主において広く適用可能である。本明細書で論じられるように、本発明を微生物で実施する際に追加の活性を使用することができる。
宿主の例には、ニコチアナ・ベンサミアナなどの植物及び酵母などの微生物が含まれる。これらについては、以下により詳細に説明される。
本発明は、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸を、ベクターを介して宿主細胞に導入して、ベクターと宿主細胞ゲノムとの間の組換えを引き起こす、又はそれを可能にして、本発明による核酸をゲノムに導入することにより、上記のように異種核酸で宿主を形質転換することを含み得る。
本発明の別の態様では、組み合わせられると前記ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成活性を有するポリペプチドをそれぞれコードする複数のヌクレオチド配列を含む異種核酸で形質転換された宿主細胞が提供され、前記核酸の発現は、形質転換された宿主に、ＯＳからＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成を行う能力を付与する、又は宿主における前記能力を改善する。
本発明は、上記のように核酸又はベクター（例えば、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾ヌクレオチド配列を含む）で形質転換された宿主細胞、特に植物又は微生物細胞をさらに包含する。トランスジェニック宿主細胞（即ち、本核酸のトランスジェニック）において、導入遺伝子は、ゲノム外ベクター上にあるか、又は好ましくは安定してゲノムに組み込まれ得る。１倍体ゲノムごとに２つ以上の異種ヌクレオチド配列が存在し得る。
本明細書に記載の方法及び材料は、とりわけ、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳを蓄積する安定した作物の作製に使用することができる。植物の例には、ヒマワリ、ジャガイモ、キャノーラ、乾燥豆、さやえんどう、亜麻、ベニバナ、ソバ、綿、トウモロコシ、大豆、及びテンサイなどの条植え作物が含まれる。トウモロコシ、小麦、ナタネ、及びコメなどの主要な作物も好ましい宿主であり得る。
本発明による植物細胞を含む植物も提供される。
生成物の生成
上記の方法を使用して、異種宿主において、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳなどのグリコシル化ＱＡを生成することができる。ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳなどのグリコシル化ＱＡは、一般に、それらが導入される種では天然に存在しない。
本発明の植物又は方法からのＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳなどのグリコシル化ＱＡは、単離して商業的に利用することができる。
上記の方法は、宿主においてＱＳ－２１などの下流生成物を生成する方法の一部、場合によって１つのステップを構成し得る。この方法は、宿主を培養する（宿主が微生物である場合）又は宿主を成長させる（宿主が植物である場合）ステップ、次いでそれを収穫するステップ、及びＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳなどのグリコシル化ＱＡ、又は下流の生成物若しくはその誘導体（例えば、ＱＳ－２１）生成物を精製するステップを含み得る。このように生成された生成物は、本発明のさらなる態様を形成する。ＱＳ－２１の有用性は上で説明されている。
別法では、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳなどのグリコシル化ＱＡを回収して、下流の化合物のさらなる化学合成を可能にすることができる。
本発明の新規遺伝子
本発明を支持して、本発明者らは、グリコシル化化合物の合成に関与すると考えられるＱ．サポナリア（Q. saponaria）からの配列を新たに特徴付けた、又は同定した（配列番号１～６；また２５～３２を参照）。
（この、又はこれらの配列に関する本発明の他の態様の）一実施形態では、配列は、配列番号１～６のいずれかから選択される。
好ましい実施形態では、本発明の方法は、任意選択により当技術分野で公知のＱＡ生合成に影響を与える他の遺伝子の操作と組み合わせた、本発明のこれらの新たに特徴付けられたＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸のうちの１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、又は３つのそのようなＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸）の使用を含む。
Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）由来のこれらの新たに特徴付けられたＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ配列（配列番号１～６、また２５～３２）は、これらの配列の誘導された変異体及び材料がそうであるように、それ自体で本発明の態様及びそれらを使用する方法を構成する。
次に、本発明のいくつかの態様及び実施形態がより詳細に説明される。
図面
図１：ＱＳ－２１。キラヤ酸トリテルペンアグリコン、Ｃ－３の分岐三糖、Ｃ－２８の線状四糖、及びＣ－２８のβ－Ｄ－フコースに付着したアラビノシル化１８炭素アシル鎖を含む、主な構造的特徴が強調表示されている。 図２：β－アミリンを介した２，３－オキシドスクアレンからのキラヤ酸の生成。本明細書で言及される重要なβ－アミリン炭素の番号付けは、赤色でラベル付けされている。β－アミリンからの経路は、３つの位置（Ｃ－２８、Ｃ－２３、及びＣ－１６α）での酸化を必要とする。これらの酸化ステップは、簡単にするために直線的に示されているが、任意の順序で起こり得る。 図３：キラヤ酸からのキラヤ酸三糖誘導体（ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ）の生成。この経路（簡単にするために線状の連続した形で示されている）は、Ｄ－グルクロン酸（ＧｌｃｐＡ）で始まるキラヤ酸のＣ－３での３段階のグリコシル化を伴う。ＧｌｃｐＡは、β－１，２－Ｄ－ガラクトース（Ｇａｌｐ）及びβ－１，３－Ｄ－キシロース（Ｘｙｌｐ）で、どちらかの順序でさらにグリコシル化されている。 図４：候補ＱＳ－２１ ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）のマイニング。他の植物種からの特徴付けられたＵＧＴ（黒色）を含むキラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）ＵＧＴ候補（赤色）の系統樹（表３に列挙）。機能的に特徴付けられたトリテルペンＵＧＴは青色で示されている。遺伝子が生合成遺伝子クラスター（ＢＣＧ）内にあると予測されるＱ．サポナリア（Q. saponaria）ＵＧＴはアスタリスクで示されている。ＵＧＴ系統発生群（群Ａ～Ｐ）は、Ross, J., Li, Y., Lim, E., and Bowles, D. J. (2001).“Higher plant glycosyltransferases”. Genome Biol., 2:REVIEWS3004、及びCaputi, L., Malnoy, M., Goremykin, V., Nikiforova, S., and Martens, S. (2012).“A genome-wide phylogenetic reconstruction of family 1 UDP-glycosyltransferases revealed the expansion of the family during the adaptation of plants to life on land”. Plant J., 69:1030-42]に記載されているようにラベル付けされている。系統樹は、１０００回のブートストラップ複製による近隣結合法を使用して構築された（分岐点のサポート率が示されている）。スケールバーは、アミノ酸レベルでの部位ごとに０．１の置換を示す。１ＫＰのデータベースのＱ．サポナリア（Q. saponaria）コンティグは、４文字のコード（ＯＱＨＺ）とそれに続く７桁の数字から構成され；この７桁のコードは、候補ＵＧＴ遺伝子の名称に含まれている。 図５：ＱｓＣＳＬＩによるキラヤ酸の変換。ＱｓｂＡＳ及びＣ－２８／Ｃ－２３／Ｃ－１６αオキシダーゼを発現する葉でキラヤ酸の蓄積が検出された。Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）セルロースシンターゼ様（ＱｓＣＳＬＩ）の添加は、キラヤ酸のレベルの低下、及びグルクロニド残基が添加されたキラヤ酸の質量を有する新しいピークの蓄積をもたらした［ｍ／ｚ＝６６１、保持時間＝１３．９分］。ＩＳ＝内部標準（ジギトキシン）。 図６：大豆（Glycine max）由来のＧｍＵＧＴ７３Ｐ２（アクセッション番号：ＢＡＩ９９５８４）は、β－１，２－結合を有するソヤサポゲノールＢモノグルクロニドへのＤ－ガラクトースの付加を触媒して、大豆サポニンＩＩＩを形成する（Shibuya et al., 2010）。 図７：Ｑｓ＿２０７３８８６＿Ｄ６（Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ）によるＱＡ－ＧｌｃｐＡの変換。Ｑｓ＿２０７３８８６＿Ｄ６と推定ＱＡ－ＧｌｃｐＡの生成に必要な遺伝子（ｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６－Ｃ－２８／ＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α／ＣＹＰ７１４－Ｃ２３／ＱｓＣＳＬ１）との共発現は、ヘキソースが添加されたＱＡ－ＧｌｃｐＡの予想質量を有する極性の高いピークの出現をもたらした［ｍ／ｚ＝８２３、保持時間＝１２．６分］。このピークの平均マススペクトルが示されている。推定ＱＡ－ＧｌｃｐＡの生成に必要な遺伝子とＧｍＵＧＴ７３Ｐ２との共発現は、Ｑｓ＿２０７３８８６＿Ｄ６生成物と同じ保持時間の新しいピークをもたらした。ＩＳ＝内部標準（ジギトキシン）。 図８：Ｑｓ＿２０１５８７９＿Ｄ７と推定ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐの生成に必要な遺伝子（ｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６－Ｃ－２８／ＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α／ＣＹＰ７１４－Ｃ２３／ＱｓＣＳＬ１／Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ）との共発現は、推定ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐピークと同様の保持時間で共溶出された２つのピークの出現をもたらした。極性の高いピークは、デオキシヘキソースが添加されたＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐの予想質量を有し［ｍ／ｚ＝８６９、保持時間＝１２．５分］、極性の低いピークは、ペントースが添加されたＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐの予想質量を有していた［ｍ／ｚ＝８５５、保持時間＝１２．７５分］。各ピークの平均マススペクトル及び予測される構造が示されている。Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ遺伝子を含まない組み合わせの共発現は、新しいピークを一切もたらさず、Ｑｓ＿２０１５８７９＿Ｄ７がＱｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ活性に依存していることを示唆している。ＩＳ＝内部標準（ジギトキシン）。 図９：本明細書で特徴付けられた酵素を用いたキラヤ酸からのＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ及びＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐの提案された生合成。 図１０：単離された化合物１及び２の構造。 図１１：化合物１及び２について報告された完全な１３Ｃ ＮＭＲ割り当て及びキーＨＭＢＣ（Ｈ→Ｃ）。 図１２：Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）の葉の物質から三糖を分離するための概略図。 図１３：化合物１及び２を精製するためのセミ分取ＨＰＬＣクロマトグラム。 図１４：以前に特徴付けられたＱＳ－２１生合成遺伝子の発現プロファイルを示すヒートマップ。 図１５：オリザ・サティバ（Oryza sativa）及びシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来のセルロースシンターゼスーパーファミリータンパク質を含むキラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）セルロースシンターゼスーパーファミリータンパク質（太字）の系統樹。系統樹は、１０００回のブートストラップ複製による近隣結合法を使用して構築された（分岐点のサポート率が示されている）。ゲノムデータベースのＱ．サポナリア（Q. saponaria）遺伝子は、コード（ＱＵＩＳＡ３２２４４＿ＥＩｖ１＿）とそれに続く７桁の数字で構成され；この７桁のコードは、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）タンパク質の名称に含まれ；ＣＳＬ１と同じサブファミリー（ＣｓＩＧ）のＱ．サポナリア（Q. saponaria）タンパク質はＣｓｌＧ２－６と改名された。 図１６：以前に特徴付けられたＱＳ－２１生合成遺伝子及びＣｓｌＧ２－ＣｓｌＧ６の発現プロファイルを示すヒートマップ。 図１７：ＣｓｌＧ２とキラヤ酸の生成に使用される遺伝子（ｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６－Ｃ－２８／ＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α／ＣＹＰ７１４－Ｃ２３）との共発現は、キラヤ酸ピークの低下［ｍ／ｚ＝４８５、保持時間＝１９．６分］、並びにグルクロニド残基が添加されたキラヤ酸の予想質量及びＣＳＬ１生成物と同じ保持時間を有する極性の高いピークの出現をもたらした［ｍ／ｚ＝６６１、保持時間＝１４．０分］。ＩＳ＝内部標準（ジギトキシン）。 図１８：Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴは、キラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）ゲノムの２つの隣接する遺伝子Ｑｓ＿０２８３８６０とＱｓ＿０２８３８７０との間のキメラである。ゲノムデータベースのＱ．サポナリア（Q. saponaria）遺伝子は、コード（ＱＵＩＳＡ３２２４４＿ＥＩｖ１）とそれに続く７桁の数字で構成され；この７桁のコードは、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）遺伝子の名称に含まれている。 図１９：Ｑｓ＿０２８３８５０、ＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８、及びＱｓ＿０２８３８７０によるＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐの変換。二重機能Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴとＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐの生成に使用される遺伝子（ｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６－Ｃ－２８／ＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α／ＣＹＰ７１４－Ｃ２３／ＱｓＣＳＬ１／Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ）との共発現は、ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ（保持時間＝１２．６分、ＭＷ＝８２４）のＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ（保持時間＝１２．５分、ＭＷ＝９７０）及びＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐ（保持時間＝１２．７５分、ＭＷ＝９５６）への変換をもたらす。Ｑｓ＿０２８３８５０又はＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８とＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐの生成に必要な遺伝子との共発現は、１２．６分でのＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐピークの低下、並びにＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐと同じ保持時間（１２．５分）及び分子量（ＭＷ＝９７０）の新たな単一ピークの出現をもたらした。Ｑｓ＿０２８３８７０とＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐの生成に必要な遺伝子との共発現は、１２．６分でのＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐピークの低下、並びにＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐと同じ保持時間（１２．７５分）及び分子量（ＭＷ＝９５６）の新たな単一ピークの蓄積をもたらした。
発明の詳細な説明
本発明者らは、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）を用いた様々なゲノム及びトランスクリプトームアプローチを利用して、ＱＡのグリコシル化に関連する生合成経路の解明を開始した。ニコチアナ・ベンサミアナにおける一過性発現による候補遺伝子の機能的特徴付けにより、ＱＡからのＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳの生合成が可能なＱ．サポナリア（Q. saponaria）由来の３つの酵素が同定された。
異なる実施形態では、本発明は、微生物又は植物などの宿主細胞におけるグリコシル化ＱＡの総レベルを操作するための手段を提供する。
本発明の一態様では、上記のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ修飾核酸は、組換え体の形態であり、好ましくは複製可能なベクターである。
「ベクター」は、とりわけ、二本鎖又は一本鎖の線状又は環状形態の任意のプラスミド、コスミド、ファージ、又はアグロバクテリウムバイナリーベクターを含むと定義され、これらは、自己伝播性又は可動性であってもなくてもよく、細胞ゲノムへの組み込みにより原核生物宿主又は真核生物宿主を形質転換し得る、又は染色体外に存在し得る（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）。
当業者に周知であるように、「バイナリーベクター」系は、（ａ）所望のヌクレオチド配列の植物細胞ゲノムへの移入を可能にする境界配列；（ｂ）所望のヌクレオチド配列自体を含み、且つ、一般に、（ｉ）植物活性プロモーター並びに（ｉｉ）標的配列及び／又はエンハンサーを含む発現カセットを含み、この植物活性プロモーターは、必要に応じて標的配列及び／又はエンハンサーに動作可能に連結される。所望のヌクレオチド配列は、境界配列間に位置し、適切な条件下で植物ゲノムに挿入することができる。バイナリーベクター系は、一般に、統合を行うために他の配列（Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）に由来）を必要とする。一般に、これは、アグロバクテリウムによる一過性の形質転換を使用する、いわゆる「アグロインフィルトレーション」を使用することによって達成することができる。簡単に述べると、この技術は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のＤＮＡの一部（「Ｔ－ＤＮＡ」）を宿主細胞に移し、宿主細胞で核ＤＮＡに組み込まれ得るというアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の特性に基づいている。Ｔ－ＤＮＡは、約２１～２３ヌクレオチド長の左右の境界配列によって定義される。このフィルトレーションは、例えば、シリンジ（葉の中）又は真空（植物全体）によって達成することができる。本発明では、境界配列は、一般に、所望のヌクレオチド配列（Ｔ－ＤＮＡ）の周囲に含まれ、１つ又は複数のベクターが、アグロインフィルトレーションによって植物材料に導入される。
一般的に言えば、当業者は、組換え遺伝子発現のため（例えば、宿主内又は宿主の１つ又は複数の細胞内で異種核酸を発現させるため）のベクターを構築し、プロトコルを十分に設計することができる。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含む、適切なベクターを選択又は構築することができる。さらなる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press or Current Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992を参照。
具体的には、放線菌及び関連種、細菌、及び真核生物（例えば、高等植物、苔、酵母、又は真菌細胞）から選択され得る２つの異なる宿主生物において自然に又は設計により複製することができるＤＮＡビヒクルを意味するシャトルベクターが含まれる。
本発明による核酸を含むベクターは、特にベクターを使用してゲノム組換えのために核酸を細胞に導入する場合、プロモーター又は他の調節配列を含む必要はない。
好ましくは、ベクターの核酸は、微生物、例えば酵母及び細菌、又は植物細胞などの宿主細胞における転写のための適切なプロモーター又は他の調節エレメントの制御下にあり、且つそれらに動作可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主で機能する二機能性発現ベクターであり得る。ゲノムＤＮＡの場合、ベクターは、それ自体のプロモーター又は他の調節エレメント（任意選択により、以下の実施例で論じられる３５Ｓエンハンサーなどの異種エンハンサーと組み合わせられる）を含み得る。ネイティブプロモーターを使用する利点は、ネイティブプロモーターが、多面的応答を回避し得ることである。ｃＤＮＡの場合、ネイティブプロモーターは、宿主細胞における発現のための適切なプロモーター又は他の調節エレメントの制御下にあり得る。
「プロモーター」とは、下流に（即ち、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖上の３’方向に）動作可能に連結されたＤＮＡの転写が開始され得るヌクレオチドの配列を意味する。
「動作可能に連結された」とは、同じ核酸分子の一部として結合され、プロモーターから開始される転写のために適切に配置及び配向されていることを意味する。プロモーターに動作可能に連結されているＤＮＡは、プロモーターの「転写開始調節下」にある。
好ましい実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターである。
プロモーターに適用される「誘導性」という用語は、当業者にはよく理解されている。本質的に、誘導性プロモーターの制御下での発現は、加えられる刺激に応答して「スイッチオン」又は増加される。刺激の性質は、プロモーターによって異なる。一部の誘導性プロモーターは、適切な刺激が存在しないと、ほとんど又は検出できないレベルの発現しか引き起こさない（又は発現を引き起こさない）。他の誘導性プロモーターは、刺激が存在しないと、検出可能な構成的発現を引き起こす。刺激の非存在下での発現レベルがどうであれ、適切な刺激の存在下では、誘導性プロモーターからの発現が増加する。
したがって、本発明による核酸を外部誘導性遺伝子プロモーターの制御下に置いて、発現（異種配列を発現する）を使用者の制御下に置くことができる。異種遺伝子を植物細胞に導入する利点は、特に細胞が植物に含まれる場合、遺伝子発現、従って好みに応じてＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成に影響を与えることができるようにするために、選択したプロモーターの制御下に遺伝子の発現を置く能力である。さらに、例えば野生型よりも高い又は低い活性を有する野生型遺伝子の変異体及び誘導体を、内因性遺伝子の代わりに使用することができる。
したがって、本発明のこの態様は、最も好ましくは本明細書に記載されるＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸の１つ又はその誘導体である、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾遺伝子などの本発明によって提供されるヌクレオチド配列に動作可能に連結されたプロモーター（任意選択により、誘導性）を含む遺伝子構築物、好ましくは複製可能なベクターを提供する。
本文脈において特に興味深いのは、植物ベクターとして機能する核酸構築物である。植物で以前に使用されて広く成功している特定の手順及びベクターは、Guerineau and Mullineaux (1993)（Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed.) Oxford, BIOS Scientific Publishers, pp 121-148）によって説明されている。適切なベクターには、植物ウイルス由来ベクターが含まれ得る（例えば、欧州特許出願公開第１９４８０９号を参照）。
好ましくは、植物で使用するための本発明のベクターは、発現カセットの植物ゲノムへの移入及び組み込みを可能にする境界配列を含む。好ましくは、構築物は、植物バイナリーベクターである。好ましくは、バイナリー形質転換ベクターは、ｐＰＺＰに基づいている（Hajdukiewicz, et al. 1994）。他の構築物の例には、ｐＢｉｎ１９が含まれる（Frisch, D. A., L. W. Harris-Haller, et al. (1995).“Complete Sequence of the binary vector Bin 19.”Plant Molecular Biology 27: 405-409を参照）。
植物で機能する適切なプロモーターには、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ３５Ｓ）が含まれる。他の例は、pg. 120 of Lindsey & Jones (1989)“Plant Biotechnology in Agriculture”Pub. OU Press, Milton Keynes, UKに開示されている。プロモーターは、発現の発生的及び／又は組織特異的調節制御を与える１つ又は複数の配列モチーフ又はエレメントを含むように選択され得る。誘導性植物プロモーターには、Caddick et al (1998) Nature Biotechnology 16: 177-180のエタノール誘導性プロモーターが含まれる。
必要に応じて、選択可能な遺伝子マーカー、例えば、抗生物質又は除草剤（例えば、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノトリシン、クロルスルフロン、メトトレキサート、ゲンタマイシン、スペクチノマイシン、イミダゾリノン、及びグリホサート）に対する耐性などの選択可能な表現型を与えるものを構築物に含めることができる。Haldrup et al. 1998 Plant molecular Biology 37, 287-296に記載されているようなポジティブ選択系を使用して、抗生物質に依存しない構築物を作製することができる。
上で説明したように、好ましいベクターは、国際公開第２００９／０８７３９１号に記載されている「ＣＰＭＶ－ＨＴ」ベクターである。以下の実施例は、これらのｐＥＡＱ－ＨＴ発現プラスミドの使用を実証する。
本発明で使用するためのこれらのベクター（典型的には、バイナリーベクター）は、典型的には：
（ｉ）以下に動作可能に連結されたプロモーター
（ｉｉ）ＲＮＡ－２ゲノムセグメントの標的開始部位が変異している、二分割ＲＮＡウイルスのＲＮＡ－２ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列；
（ｉｉｉ）上記のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸配列；
（ｉｖ）ターミネーター配列；及び任意選択により
（ｖ）前記ターミネーター配列の上流に位置する３’ＵＴＲを含む発現カセットを含む。
本明細書で言及される「エンハンサー」配列（又はエンハンサーエレメント）は、標的開始部位が変異している、コモウイルスなどの二分割ＲＮＡウイルスのＲＮＡ－２ゲノムセグメントに由来する（又はそれと相同性を共有する）配列である。そのような配列は、それらが付着している異種ＯＲＦの下流の発現を増強することができる。限定されることなく、そのような配列は、転写されたＲＮＡに存在する場合、それらが付着している異種ＯＲＦの翻訳を増強することができると考えられている。
本明細書で言及される「標的開始部位」は、本エンハンサー配列が由来する二分割ウイルス（例えば、コモウイルス）の野生型ＲＮＡ－２ゲノムセグメントにおける開始部位（開始コドン）であり、これは、野生型ＲＮＡ－２ゲノムセグメントによってコードされる２つのカルボキシ共末端タンパク質の長い方の産生（翻訳）の開始部位として機能する。
典型的には、ＲＮＡウイルスは、前述のようにコモウイルスである。
最も好ましいベクターは、遺伝子サイレンシングのサプレッサー及びＮＰＴＩＩカセットも含むＴ－ＤＮＡ上に配置され、本発明の翻訳エンハンサーを含む発現カセットの５’リーダーと３’ＵＴＲとの間のポリリンカーの使用による直接クローニングバージョンを可能にする、国際公開第２００９／０８７３９１号のｐＥＡＱベクターである。
そのような遺伝子発現系における遺伝子サイレンシングのサプレッサーの存在が好ましいが、必須ではない。遺伝子サイレンシングのサプレッサーは、当技術分野で公知であり、国際公開第２００７／１３５４８０号に記載されている。このようなサプレッサーには、ジャガイモＹウイルスのＨｃＰｒｏ、ＴＥＶのＨｅ－Ｐｒｏ、ＴＢＳＶのＰ１９、ｒｇｓＣａｍ、ＦＨＶのＢ２タンパク質、ＣＰＭＶのスモールコートタンパク質、及びＴＣＶのコートタンパク質が含まれる。安定したトランスジェニック植物を生産する際に好ましいサプレッサーは、Ｒ４３Ｗ突然変異を組み込んだＰ１９サプレッサーである。
本発明はまた、植物細胞又は微生物（例えば、細菌、酵母、又は真菌）細胞へのそのような構築物の導入、及び／又は適切な刺激、例えば効果的な外因性インデューサーを加えることによる植物細胞内での構築物の発現の誘導を含む方法も提供する。
微生物の代替として、コケのヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）も含む、操作されたグリコシル化ＱＡ生成植物種の細胞浮遊培養を発酵タンクで培養することができる（例えば、Grotewold et al. (Engineering Secondary Metabolites in Maize Cells by Ectopic Expression of Transcription Factors, Plant Cell, 10, 721-740, 1998)を参照）。
本発明のさらなる態様では、本発明による異種構築物を含む宿主細胞、特に植物又は微生物細胞が開示される。
異種生物におけるＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成の再構成に関連する上記の宿主細胞の議論は、本明細書では必要な変更を加えて適用される。
したがって、本発明のさらなる態様は、上記のような構築物の植物細胞への導入を伴い、ベクターと植物細胞ゲノムとの間の組換えを引き起こす又は可能にして本発明による核酸をゲノムに導入する植物細胞を形質転換する方法を提供する。
本発明は、本発明による核酸又はベクター（例えば、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾ヌクレオチド配列を含む）で形質転換された宿主細胞、特に植物又は微生物細胞をさらに包含する。トランスジェニック植物細胞（即ち、この核酸のトランスジェニック）において、導入遺伝子は、ゲノム外ベクター上にあってもよいし、又は好ましくは安定してゲノムに組み込まれてもよい。１倍体ゲノムごとに２つ以上の異種ヌクレオチド配列が存在し得る。
酵母は、トリテルペン生成宿主として広く使用されているため、ＱＡ、従ってＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成に潜在的に十分に適している。
したがって、一実施形態では、宿主は酵母である。このような宿主の場合、ＱＡの流れ、従って上記のようにＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳの生成を改善するために追加の遺伝子を導入することが望ましいであろう。例には、導入されたＰ４５０のレドックスパートナーとして機能する１つ又は複数の植物シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）、及びＨＭＧＲが含まれ得る。同様に、ＱＡの他の要素に寄与するため、又はＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ経路を改善するために、追加の遺伝子を導入することが望ましいであろう。これらには、ＵＤＰ糖供与体などを提供する酵素が含まれ得る（例えば、Ohashi T, Hasegawa Y, Misaki R, Fujiyama K (2016)“Substrate preference of citrus naringenin rhamnosyltransferases and their application to flavonoid glycoside production in fission yeast”.(2016). Applied Microbiology and Biotechnology. 100(2): 687-696.)；Oka T, Jigami Y. (2006).“Reconstruction of de novo pathway for synthesis of UDP-glucuronic acid and UDP-xylose from intrinsic UDP-glucose in Saccharomyces cerevisiae”. FEBS J.273(12):2645-57を参照）。本開示に照らして、当業者は、必要に応じてそのような補助的な活性を提供することができる。
上記のように形質転換された植物細胞を含む植物は、本発明のさらなる態様を形成する。
必要に応じて、植物細胞の形質転換に続いて、植物を、当技術分野で標準的であるように、例えば単一細胞、カルス組織、又は葉片から再生することができる。ほとんどすべての植物は、植物の細胞、組織、及び器官から完全に再生することができる。利用可能な技術は、Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984、及びWeissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989で再考察されている。
再生された植物に加えて、本発明は、そのような植物のクローン、種子、自家受粉又は雑種の子孫、及び子孫（例えば、Ｆ１及びＦ２の子孫）のすべてを包含する。本発明はまた、そのような植物からの植物繁殖体、即ち、挿し木及び種子などを含む、有性又は無性の生殖又は繁殖に使用できるあらゆる部分を提供する。すべての場合において、これらの植物又は部分には、例えば祖先植物に導入されたような、上記の植物細胞又は異種ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾ＤＮＡが含まれる。
本発明はまた、すべての場合において、上記の植物細胞又は異種ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾ＤＮＡを含む、これらの植物のあらゆる部分（例えば、葉、茎、乾燥物又は粉砕物、食用部分など）を提供する。
本発明はまた、開示されるコードＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾核酸配列のいずれかの発現産物と、従って、適切な宿主細胞内であり得る、適切な条件下でコード核酸からの発現によって発現産物を作製する方法も包含する。
以下に説明されるように、上記のような植物の背景は、例えば、グリコシル化ＱＡ、例えばＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成に関連する、又は他の方法でその表現型若しくは形質に影響を与える１つ又は複数の他の遺伝子について、天然又はトランスジェニックであり得る。
宿主の表現型の改変において、本明細書に記載のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸を、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳの割合若しくは収量、又はその修飾、又はその他の表現型の形質若しくは望ましい特性に影響を与える導入遺伝子などの他の遺伝子と組み合わせて使用することができる。
遺伝子の組み合わせの使用により、植物又は微生物（例えば、細菌、酵母、又は真菌）を調整して、望ましい前駆体の産生を増強する、又は望ましくない代謝を低減することができる。
代替法として、例えば、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳの収量に影響を与える可能性のある望ましくない代謝又はフラックスを低減するために、宿主における遺伝子のダウンレギュレーションが望ましいであろう。
そのようなダウンレギュレーションは、例えばアンチセンス技術を使用して、当技術分野で公知の方法によって達成することができる。
アンチセンス遺伝子又は部分遺伝子配列を使用して遺伝子発現をダウンレギュレートする場合、転写が標的遺伝子の「センス」鎖から転写された正常なｍＲＮＡに相補的なＲＮＡを生成するように、ヌクレオチド配列を、「逆方向」におけるプロモーターの制御下に置く。例えば、Rothstein et al, 1987；Smith et al,(1988) Nature 334, 724-726；Zhang et al,(1992) The Plant Cell 4, 1575-1588, English et al., (1996) The Plant Cell 8, 179-188.を参照。アンチセンス技術もまた、Bourque, (1995), Plant Science 105, 125-149, and Flavell, (1994) PNAS USA 91, 3490-3496で再考察されている。
アンチセンスの代替法は、標的遺伝子と同じ向きである、センスに挿入された標的遺伝子の全部又は一部のコピーを使用して、共抑制による標的遺伝子の発現の減少を達成することである。例えば、van der Krol et al., (1990) The Plant Cell 2, 291-299；Napoli et al., (1990) The Plant Cell 2, 279-289；Zhang et al., (1992) The Plant Cell 4, 1575-1588、及び米国特許第Ａ－５，２３１，０２０号を参照。遺伝子サイレンシングのさらなる改良又は共抑制技術は、国際公開第９５／３４６６８号（Biosource）；Angell & Baulcombe (1997) The EMBO Journal 16,12:3675-3684；及びVoinnet & Baulcombe (1997) Nature 389: pg 553で確認することができる。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、センス鎖のみ又はアンチセンス鎖のみのいずれよりも遺伝子サイレンシングにより効果的であることが分かっている（Fire A. et al Nature, Vol 391, (1998)）。ｄｓＲＮＡを介したサイレンシングは、遺伝子特異的であり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とよく呼ばれる（また、Fire (1999) Trends Genet. 15: 358-363、Sharp (2001) Genes Dev. 15: 485-490、Hammond et al. (2001) Nature Rev. Genes 2: 1110-1119及びTuschl (2001) Chem. Biochem. 2: 239-245を参照）。
ＲＮＡ干渉は、２段階のプロセスである。まず、ｄｓＲＮＡが、細胞内で切断されて、５’末端のリン酸及び３’の短いオーバーハング（約２ｎｔ）を有する約２１～２３ｎｔ長の短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が生成される。ｓｉＲＮＡは、対応するｍＲＮＡ配列を破壊のために特異的に標的とする（Zamore P.D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750, (2001)）。
標的配列のダウンレギュレーションのための当技術分野で公知の別の方法は、例えば、Schwab et al 2006, Plant Cell 18, 1121-1133によって説明されているような「マイクロＲＮＡ」（ｍｉＲＮＡ）の使用である。この技術は、適切なオリゴヌクレオチド配列を組み込んだステムループ前駆体によってコードされ得る人工ｍｉＲＮＡを使用し、この配列は、本明細書の開示に照らして明確に定義された規則を使用して作製することができる。
したがって、一態様では、本発明は、宿主におけるグリコシル化ＱＡ生合成に影響を与える又は作用する方法を提供し、この方法は：
（ｉ）アンチセンスメカニズムによってそれぞれのコードされたポリペプチド活性を低下させるような、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳヌクレオチド配列の相補配列を含む核酸からの転写を引き起こす又は可能にするステップ；
（ｉｉ）ｍｉＲＮＡメカニズムによってそれぞれのコードされたポリペプチド活性を低下させるような、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳヌクレオチド配列の２０～２５ヌクレオチド（任意選択により、１つ又は複数のミスマッチを含む）を含むステムループ前駆体をコードする核酸からの転写を引き起こす又は可能にするステップ；
（ｉｉｉ）ｓｉＲＮＡメカニズムによってそれぞれのコードされたポリペプチド活性を低下させるような、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳヌクレオチド配列の２０～２５ヌクレオチド（任意選択により、１つ又は複数のミスマッチを含む）に対応する二本鎖ＲＮＡをコードする核酸からの転写を引き起こす又は可能にするステップのいずれかを含む。
本発明の方法は、１つ又は複数のグリコシル化ＱＡのインビトロ及びインビボでの両方の生成又は操作を包含する。例えば、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチドは、例えば、大腸菌（E. coli）、酵母、及び糸状菌などの微生物における発現を介した発酵において使用することができる。一実施形態では、本発明の１つ又は複数の新たに特徴付けられたＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ配列を、１つ又は複数の他の生合成遺伝子と組み合わせてこれらの生物で使用することができる。
インビボ法は、上で詳細に説明されており、一般に、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチドをコードする組換え核酸分子の転写及びそれに続く翻訳を引き起こす又はそれを可能にするステップを含む。
本発明の他の態様では、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチド（酵素）は、インビトロで、例えば、単離された、精製された、又は半精製された形態で使用することができる。任意選択により、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチドは、組換え核酸分子の発現の産物であり得る。
新たに特徴付けられたＱ．サポナリア（Q. saponaria）由来の配列
上記のように、本発明を支持して、本発明者らは、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成に影響を与えるポリペプチドをコードすると考えられるＱ．サポナリア（Q. saponaria）の遺伝子を同定した（表５の配列番号１～６及び２５～３２を参照）。
したがって、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）由来の上記の新たに特徴付けられたＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成遺伝子は、それ自体で本発明の態様を形成する。
本発明のさらなる態様では、上記のＱ．サポナリア（Q. saponaria）に由来するＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸の変異体である核酸が開示される。
そのような変異体は、本明細書で論じられる天然遺伝子と同様に、本明細書に開示される方法によって評価される、植物のグリコシル化ＱＡ（例えば、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ）含有量を変更するために使用することができる。例えば、変異体核酸は、上記のように、天然ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチドの関連する生物学的活性を共有する変異体ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチドをコードする配列を含み得る。例には、配列番号２、４、６、２６、２８、３０、又は３２のいずれかの変異体が含まれる。
誘導体
上に開示された本発明のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子のいずれか、特にＱ．サポナリア（Q. saponaria）のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ配列を改変するステップを含む誘導体核酸を生成する方法が、本明細書に記載される。
変更は、いくつかの理由で望ましい場合がある。例えば、変更は、制限エンドヌクレアーゼ部位を導入若しくは除去する、又はコドン使用を変更し得る。これは、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子が代替宿主、例えば酵母などの微生物宿主で発現される場合に特に望ましいであろう。この目的のためのコドン最適化遺伝子の方法は、当技術分野で公知である（例えば、Elena, Claudia, et al.“Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.”Frontiers in microbiology 5 (2014)を参照）。したがって、酵母の発現を最大化するためのコドン修飾を含む本明細書に記載の配列は、本発明の特定の実施形態を表す。
別法では、配列の変更は、コードされたポリペプチドに１つ又は複数の（例えば、いくつかの）アミノ酸の付加、挿入、欠失、又は置換をもたらす、核酸中の１つ又は複数のヌクレオチドの１つ又は複数（例えば、いくつか）の付加、挿入、欠失、又は置換によって誘導体を生成することができる。
そのような変更は、コードされたポリペプチドの切断部位などの翻訳後修飾に必要な部位；リン酸化などのためのコードされたポリペプチドのモチーフを修飾することができる。発現されたタンパク質を微生物系から単離することが望ましい場合、リーダー配列又は他の標的配列（例えば、膜又はゴルジの位置を特定する配列）を発現されたタンパク質に加えて、発現後にその位置を決定することができる。
他の望ましい突然変異は、コードされたポリペプチドの活性（例えば、特異性）又は安定性を変更するためのランダム又は部位特異的突然変異誘発であり得る。変化は、保存的な変化、即ち、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンなどの１つの疎水性残基の別の疎水性残基での置換、又はある極性残基の別の極性残基での置換（アルギニンをリジン、グルタミン酸をアスパラギン酸、又はグルタミンをアスパラギンで置換など）によるものであり得る。当業者には周知のように、保存的置換によってポリペプチドの一次構造を変更することは、配列に挿入されるアミノ酸の側鎖が置換されたアミノ酸の側鎖と同様の結合と接触を形成することが可能であり得るため、そのペプチドの活性を有意に変更しないであろう。したがって、これは、ペプチドのコンフォメーションを決定する上で重要な領域に置換がある場合でも同様である。非保守的な置換を持つ変異体も含まれる。当業者には周知のように、そのコンフォメーションを決定する上で重要ではないペプチドの領域の置換は、ペプチドの三次元構造を大きくは変更しないため、その活性に大きく影響しないであろう。ペプチドのコンフォメーション又は活性を決定する上で重要な領域では、そのような変化は、ポリペプチドに有利な特性を与え得る。実際、上記のような変化は、ペプチドにわずかに有利な特性を与え得る、例えば、安定性又は特異性を変化させ得る。
断片
本発明は、上で開示された本発明のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチド、特にＱ．サポナリア（Q. saponaria）からのＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ配列をコードする遺伝子の断片を利用することができる。
したがって、本発明は、本明細書に開示される本発明の完全長ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチドの断片、特にその活性部分の生成及び使用を提供する。ポリペプチドの「活性部分」は、前記完全長ポリペプチドよりも短いが、例えば、ＱＡのグリコシル化に関してその必須の生物学的活性を保持するペプチドを意味する（例えば、表５を参照）。
ポリペプチドの「断片」とは、少なくとも約５～７個の連続するアミノ酸、多くの場合少なくとも約７～９個の連続するアミノ酸、典型的には少なくとも約９～１３個の連続するアミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも約２０～３０個以上の連続するアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチを意味する。ポリペプチドの断片は、本明細書に開示されるアミノ酸配列のいずれかの一部に対する抗体を産生させるのに有用な１つ又は複数のエピトープを含み得る。好ましいエピトープは、他のポリペプチドの少なくとも約１０００倍である親和性で本発明のポリペプチド又はその断片に結合すると見なすことができる、抗体が特異的に結合することができるエピトープである。
簡潔にするために、及びこれらのＱ．サポナリア（Q. saponaria）からのＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ配列、又は変異体（例えば、その断片などの誘導体）は、「Ｑｓ ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ配列（又は核酸、又はポリペプチド）」と呼ぶことがある。これらのＱｓ ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明の一態様を形成する。
この用語が一般的に使用される場合、この用語は、これらの配列のいずれにも個別に適用されることを理解されたい。
したがって、本発明の一態様では、これらのポリペプチド（２、４、６、２６、２８、３０、又は３２）のいずれかをコードする単離された核酸が開示される。好ましくは、この核酸は、１、３、５、２５、２７、２９、又は３１の配列を有し得る。本発明の他の核酸には、これらと縮重的に等価であるもの、又はこれらの相同変異体（例えば、誘導体）が含まれる。
本発明の態様は、以下で論じられる配列のいずれかに相補的である配列を含む単離された核酸をさらに包含する。
そのそれぞれの生物学的活性（例えば図３又は図９又は表５に示されるようなＱＡ－グリコシル化）を触媒するためのＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ配列のインビトロ又はインビボでの使用は、本発明の別の態様を形成する。
したがって、本発明は、植物などの宿主におけるグリコシル化ＱＡ（例えば、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ）生合成に影響を与える又は作用する方法をさらに提供し、この方法は、植物の細胞内での上で論じたような異種Ｑｓ ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸の転写を引き起こす又は可能にすることを含む。このステップの前に、ＱｓＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ核酸を植物の細胞又はその祖先に導入する最初のステップがあってもよい。
このような方法は、通常は、植物などの宿主でグリコシル化されたＱＡ（例えば、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ）を生成する方法の一部、場合によってはこの方法の１つのステップを形成する。好ましくは、この方法は、本発明のＱｓ ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチド（例えば、表５の）又は上記のようなその誘導体、又はいずれかをコードする核酸を使用する。
さらなる実施形態では、本発明のＱｓ ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳポリペプチド又はペプチドに対して産生される抗体が提供される。
ここで、上で論じた生合成経路の異種再構成に関連する本発明のいくつかの態様をより詳細に論じる。
本発明による「核酸」は、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び修飾された核酸又は核酸類似体（例えば、ペプチド核酸）を含み得る。ＤＮＡ配列が、例えば図を参照して指定される場合、文脈上特段の必要がない限り、置換が起きている位置でＵがＴで置換されているＲＮＡ同等物が包含される。核酸は、２つ以上の核酸分子を含み得る。本発明による核酸分子は、実質的に純粋若しくは均質な形態で、又は起源の種の他の核酸を含まない若しくは実質的に含まず、二本鎖又は一本鎖で、それらの自然環境から単離及び／又は精製して提供することができる。本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、これらの可能性のすべてを包含する。核酸分子は、全体的又は部分的に合成することができる。特に、核酸分子は、自然界で一緒に見出されない（連続して伸びていない）核酸配列がライゲーションされるか、さもなければ人工的に組み合わせられるという点で組換えであり得る。核酸は、以下に論じられる配列のいずれかを含むか、それからなるか、又は本質的にそれからなり得る。
本明細書に記載の核酸の「相補体」とは、核酸の相補配列又は核酸に含まれるヌクレオチド配列を意味する。任意選択により、相補配列は、参照ヌクレオチド配列に対して完全長である。
「異種」という用語は、本明細書では、本ヌクレオチド（例えば、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾ポリペプチドをコードする）の遺伝子／配列が、遺伝子工学を使用して、即ち人間の介入によって宿主又はその祖先の前記細胞に導入されたことを示すために広く使用される。宿主細胞と異種の核酸は、そのタイプ、種類、又は種の細胞には天然に存在しない。したがって、異種核酸は、異なるタイプ若しくは種若しくは種類の植物の植物細胞の文脈内に含まれる、特定のタイプ若しくは種若しくは種類の植物の植物細胞のコード配列を含み得る、又はそれに由来し得る。さらなる可能性は、核酸配列又は相同体が自然に見られる細胞内に核酸配列を配置することであるが、この核酸配列は、発現を制御するために、プロモーター配列などの１つ又は複数の調節配列に動作可能に連結されるように、細胞、又は植物のそのタイプ若しくは種若しくは種類の細胞内に自然に存在しない核酸に連結され、及び／又は隣接している。
この文脈における「形質転換」とは、異種核酸のヌクレオチド配列が、細胞の特徴の１つ又は複数を変更し、従って、例えば、グリコシル化ＱＡ、例えば、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成に関して表現型を変更することを意味する。このような形質変換は、一過性又は安定であり得る。
「ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成を行うことができない」とは、宿主が、変換前には、その宿主の通常の代謝環境下で検出可能又は回収可能なレベルのＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳを自然に生成しない、又は生成するとは考えられないことを意味する。本発明の適用後は、宿主が、検出可能又は回収可能なレベルのＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳを生成することができる。
本明細書で提供されるヌクレオチド配列情報を使用して、プロービング又は増幅のためのプローブ及びプライマーを設計することができる。プロービング又はＰＣＲで使用するためのオリゴヌクレオチドは、長さが約３０ヌクレオチド以下（例えば、１８、２１、又は２４）であり得る。一般に、特異的なプライマーは、１４ヌクレオチドを超える長さである。最適な特異性及びコスト効率のために、１６～２４ヌクレオチド長のプライマーが好ましいであろう。当業者は、ＰＣＲなどのプロセスで使用するためのプライマーの設計に精通している。必要に応じて、プロービングは、数百又は数千のヌクレオチド長であり得る、本明細書に開示される遺伝子の制限断片全体を用いて行うことができる。必要に応じて、「コンセンサス」又は「縮重」プライマーを生成するために、小さな変化を配列に導入することができる。
プロービングは、標準的なサザンブロッティング技術を使用することができる。例えば、ＤＮＡは、細胞から抽出し、様々な制限酵素で消化することができる。次いで、制限断片を、変性及びニトロセルロースフィルターへの転移の前に、アガロースゲルでの電気泳動によって分離することができる。標識されたプローブは、フィルター上の一本鎖ＤＮＡ断片にハイブリダイズし、結合を決定することができる。プロービング用のＤＮＡは、細胞からのＲＮＡ調製物から調製することができる。プロービングは、任意選択により、いわゆる「核酸チップ」を使用して行うことができる（考察については、Marshall & Hodgson (1998) Nature Biotechnology 16: 27-31を参照）。
一実施形態では、本発明によるＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成修飾ポリペプチドをコードする変異体は、以下を含む方法によって得ることができる：
（ａ）例えば植物細胞からの核酸の調製物を提供すること。この試験核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＲＮＡ、又はこれらのいずれかの混合物、好ましくはこれらの混合物として、好ましくは適切なベクターのライブラリーとして細胞から提供することができる。ゲノムＤＮＡが使用される場合、プローブは、以下に記載されるような、遺伝子の非転写領域（例えば、プロモーターなど）を同定するために使用することができる。
（ｂ）上で論じられたようなプローブ又はプライマーである核酸分子を提供すること、
（ｃ）前記調製物中の核酸を、前記調製物中の任意の前記遺伝子又は相同体への前記核酸分子のハイブリダイゼーションのための条件下で、前記核酸分子と接触させること、及び、
（ｄ）前記遺伝子又は相同体を、前記核酸分子とのそのハイブリダイゼーションによって存在する場合に同定すること。プローブの標的核酸（例えば、ＤＮＡ）への結合は、当業者が自由に使える様々な技術のいずれかを使用して測定することができる。例えば、プローブは、放射標識、蛍光標識、又は酵素標識することができる。プローブの標識を使用しない他の方法には、ＰＣＲを使用した増幅（以下を参照）、ＲＮＡ分解酵素による切断、及び対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロービングが含まれる。ハイブリダイゼーションの同定の成功の後に、ハイブリダイズした核酸の単離を行い、これには、適切な宿主におけるベクターのＰＣＲ又は増幅の１つ又は複数のステップが含まれ得る。
予備実験を、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせることによって行うことができる。プロービングの場合、好ましい条件は、さらに調べることができる陽性として識別されたハイブリダイゼーションが少数である単純なパターンとなるのに十分にストリンジェントな条件である。
例えば、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ（「ＳＳＣ」＝０．１５Ｍ 塩化ナトリウム；０．１５Ｍ クエン酸ナトリウム；ｐＨ７）、５×デンハルト試薬、０．５～１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性された断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、最大５０％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を使用するSambrookらの方法（以下）に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションは、３７～４２℃で少なくとも６時間行う。ハイブリダイゼーション後、フィルターを次のように洗浄する：（１）２×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳで、室温で５分間；（２）２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳで、室温で１５分間；（３）１×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳで、３７℃で３０分～１時間；（４）１×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳで、４２～６５℃で２時間、３０分ごとに溶液を交換する。
特定の配列相同性の核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要なストリンジェンシー条件を計算するための１つの一般的な式は次のとおりである（Sambrook et al., 1989）：Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－０．６３（％ホルムアミド）－６００／＃ｂｐ（２連）
上の式の例示として、４２％のＧＣ含量及び２００個の塩基の平均プローブサイズで、［Ｎａ＋］＝［０．３６８］及び５０％ホルムアミドを用いると、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、相同性が１％低下するごとに１～１．５℃低下する。したがって、約７５％を超える配列同一性を有する標的は、４２℃のハイブリダイゼーション温度を使用して観察されるであろう。そのような配列は、本発明の核酸配列に実質的に相同であると見なされるであろう。
ごくわずかな陽性クローンのみが残るまで、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを徐々に高めることは当技術分野で周知である。他の適切な条件は、例えば、約８０～９０％同一である配列の検出では、０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中、４２℃での一晩のハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５５℃での最終洗浄を含む。約９０％を超える同一性である配列を検出する場合、適切な条件は、０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２、６．５％ＳＤＳ、１０％硫酸デキストラン中、６５℃での一晩のハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃での最終洗浄を含む。
さらなる実施形態では、変異体への核酸分子のハイブリダイゼーションは、例えば、核酸増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、間接的に決定又は確認することができる。ＰＣＲは、標的核酸を特異的に増幅するために２つのプライマーの使用を必要とするため、好ましくは、本発明のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子に特徴的な配列を有する２つの核酸分子が使用される。ＲＡＣＥ ＰＣＲを使用すると、そのようなプライマーが１つだけ必要であり得る（“PCR protocols; A Guide to Methods and Applications”, Eds. Innis et al, Academic Press, New York, (1990)を参照）。
したがって、本発明による核酸を得るためのＰＣＲの使用を含む方法は：
（ａ）例えば種子又は他の適切な組織又は器官からの植物核酸の調製物を提供すること、
（ｂ）ＰＣＲに有用な（即ち、適切な）核酸分子プライマーの対を提供すること（前記プライマーの少なくとも一方が上で論じられたような本発明によるプライマーである）、
（ｃ）ＰＣＲを行う条件下で、前記調製物中の核酸を前記プライマーと接触させること、
（ｄ）ＰＣＲを行って、増幅されたＰＣＲ産物の有無を判断することを含み得る。増幅されたＰＣＲ産物の存在は、変異体の同定を示し得る。
上記のすべての場合において、必要に応じて、調査で同定されたクローン又は断片を伸長させることができる。例えば、それらが不完全であると疑われる場合、元のＤＮＡ源（例えば、クローンライブラリー、ｍＲＮＡ調製物など）を修正して、欠落部分を、例えば、重複する配列を含む他のクローンを特定するために既に得られた、その部分に基づいた配列、プローブ、又はプライマーを用いて分離することができる。
例えばそれをコードする核酸からの発現によって組換え的に作製された、精製されたタンパク質（ポリペプチド、酵素）、又はその断片、突然変異体、誘導体、又は変異体は、本発明の一態様を形成する。
そのような精製されたポリペプチドを使用して、当技術分野で標準的な技術を使用して抗体を産生させることができる。抗体の抗原結合断片を含む抗体及びポリペプチドは、以下でさらに議論されるように他の種からの相同体を同定する際に使用することができる。
抗体を産生させる方法は、タンパク質又はその断片で哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、又はサル）を免疫化することを含む。抗体は、当技術分野で公知の様々な技術のいずれかを使用して免疫化された動物から得ることができ、好ましくは目的の抗原への抗体の結合を使用して、スクリーニングしてもよい。例えば、ウエスタンブロッティング技術又は免疫沈降を使用することができる（Armitage et al, 1992, Nature 357: 80-82）。抗体は、ポリクローナルであってもよいし、又はモノクローナルであってもよい。
哺乳動物を免疫する代わり又は補足として、適切な結合特異性を有する抗体を、例えばそれらの表面に機能的な免疫グロブリン結合ドメインを表示するラムダバクテリオファージ又は糸状バクテリオファージを使用して、発現された免疫グロブリン可変ドメインの組換え的に作製されたライブラリーから得ることができる；例えば、国際公開第９２／０１０４７号を参照。
ポリペプチド又はペプチドに対して産生された抗体は、相同ポリペプチドの同定及び／又は単離、次いでコード遺伝子に使用することができる。
抗体は、いくつかの方法で修飾することができる。実際、「抗体」という用語は、必要な特異性を持つ結合ドメインを有する任意の特異的結合物質を包含すると解釈されるべきである。したがって、この用語は、天然又は合成を問わず、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体の抗体断片、誘導体、機能的同等物、及び相同体を包含する。
本発明及び本発明が属する最新技術をより完全に説明及び開示するために、本明細書ではいくつかの特許及び刊行物が引用される。これらの参考文献のそれぞれは、個々の参考文献が具体的且つ個別に示されて参照によって組み込まれる場合と同じ程度に、参照によりその全体が本開示に組み込まれる。
以下の特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈上特段の必要がない限り、「含む（comprise）」という語、及び「含む（comprises）」や「含む（comprising）」などの変形は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含むが、他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外しないことを意味すると理解されたい。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、及び「その（the）」は、文脈が明らかにそうではないと示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２つ以上のそのような担体の混合物などを含む。
範囲は、本明細書では、「約」の付くある特定の値から、及び／又は「約」の付く別の特定の値までとして表されることが多い。そのような範囲が表される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行する「約」を使用することにより、特定の値が別の実施形態を形成することを理解されよう。
本明細書に記載のサブタイトルは、便宜上含まれているだけであり、決して開示を制限するものと解釈されるべきではない。
次に、以下の非限定的な図面及び実施例を参照して本発明がさらに説明される。当業者は、これらに照らして本発明の他の実施形態を思い付くであろう。
略語
化合物１：３β－｛［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸
化合物２：３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸
Ｇａｌｐ：Ｄ－ガラクトピラノース
ＧｌｃｐＡ：Ｄ－グルクロン酸（追加の数字は、特定の炭素、即ちＧｌｃＡ－１を示す）
ＧｍＳＧＴ２／ＧｍＵＧＴ７３Ｐ２： Glycine max（大豆）大豆サポニンβ－Ｄ－ガラクトシルトランスフェラーゼ
ＧＴ：グリコシルトランスフェラーゼ
ＱＡ：キラヤ酸
ＱＡ－ＧｌｃｐＡ：３β－｛［β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸
ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ：３β－｛［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸
ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ：３β－｛［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸
ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐ：３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸
ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ：ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ又はＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐのいずれかである分岐三糖で３－Ｏ位においてグリコシル化されたＱＡ
ＯＳ：２，３－オキシドスクアレン
ＱＡ－ＧｌｃＡＴ：ＱＡ３－Ｏグルクロノシルトランスフェラーゼ
ＱＡ－ＧａｌＴ：ＱＡ－ＧｌｃｐＡガラクトシルトランスフェラーゼ
ＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ：ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐラムノシル及び／又はキシロシルトランスフェラーゼ
ＱｓｂＡＳ：Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）β－アミリンシンターゼ
Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ：Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡβ－１，２－Ｄ－ガラクトシルトランスフェラーゼ
ＱｓＣＳＬ１：Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）セルロースシンターゼ様酵素（キラヤ酸３－Ｏ－グルクロノシルトランスフェラーゼ）
ＱｓＣｓｌＧ２：Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）セルロースシンターゼ様酵素（キラヤ酸３－Ｏ－グルクロノシルトランスフェラーゼ）
Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ：Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ二重β－１，３－Ｄ－キシロシルトランスフェラーゼ／α－１，３－Ｌ－ラムノシルトランスフェラーゼ
Ｑｓ＿０２８３８５０：Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐα－１，３－Ｌ－ラムノシルトランスフェラーゼ
ＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８：Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐα－１，３－Ｌ－ラムノシルトランスフェラーゼ
Ｑｓ ０２８３８７０：Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐβ－１，３－Ｄ－キシロシルトランスフェラーゼ
ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－２８：Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）キラヤ酸Ｃ－２８オキシダーゼ
ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α：Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）キラヤ酸Ｃ－１６αオキシダーゼ
ＱｓＣＹＰ７１４－Ｃ－２３：Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）キラヤ酸Ｃ－２３オキシダーゼ
Ｒｈａｐ：Ｌ－ラムノピラノース
ｔＨＭＧＲ：アウェナストリゴサ（Avena strigosa）（二倍体オーツ麦）切断型３－ヒドロキシ，３－メチルブチリル－ＣｏＡレダクターゼ
Ｆａｍｉｌｙ １ＵＧＴ：ファミリー１ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ
Ｘｙｌｐ：Ｄ－キシロピラノース
Ｑｓ＿２０７３８８６＿Ｄ６：Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴと同義
Ｑｓ＿２０１５８７９＿Ｄ７：Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴと同義
実施例
実施例１－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）からのグリコシルトランスフェラーゼの同定及びクローニング
公的に利用可能なトランスクリプトームを増加させるために、本発明者らは、ゲノム配列データを生成した（PacBio sequencing performed by the Earlham Institute, Norwich, Norfolk）。ゲノム配列は、公的に入手可能なデータ（Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）からの「１ＫＲ」葉トランスクリプトームデータを含む［４］）及びフィトゾーム（Phytozome）の関連植物種からのタンパク質を使用して注釈を付けた。
このデータから、推定ファミリー１ ＵＤＰ依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）として注釈が付けられた一連の配列を候補に選んだ。これらの配列は、トリテルペンを含む多くの植物天然生成物の生合成に関与することが公知である重要なクラスの酵素である［５、６］。本発明者らは、最初のリスト（約２００の配列を含む）を、元のＱＡ生合成酵素が見つかった１ＫＰデータベースにも表示されている配列に絞り込んだ。Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）コンティグは、４文字のコード（ＯＱＨＺ）とそれに続く７桁の数字で構成される。可能な場合、この７桁のコードは、以下のすべての候補遺伝子に含められる。本発明者らは、このリストをさらに改善するために、他の植物種からの一連の特徴付けられたＧＴを使用して系統発生分析を行った（表３）。これにより、本発明者らは、他の植物種からの現在特徴付けられているトリテルペンＵＧＴ（群Ａ、Ｄ、及びＬ）及び関連する糖供与体特異性を持つＵＧＴ（群Ｂ）と同じ系統発生群に分類される酵素に優先順位を付けることができた。
最後に、近年、いくつかの化学的に多様な植物天然生成物を、物理的に共局在する遺伝子によってコードされる酵素によって合成することが提案されている。これらのいわゆる「生合成遺伝子クラスター」（ＢＣＧ）は、追加の候補遺伝子の同定を容易にし得る。したがって、本発明者らは、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ゲノム内の可能なＢＣＧを予測するために、「PlantiSMASH」ゲノムマイニングツール［７］を開発した。このアプローチの組み合わせにより、３０の候補Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＵＧＴ（図４）と１つの他の非ＵＧＴ候補遺伝子の最終リストが得られた。
上記のように、キラヤ酸生合成のための遺伝子は、葉組織で発現しているようであり、以前は葉のｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅されていた。したがって、同じアプローチがＧＴ候補の増幅に利用された。Gateway（登録商標）クローニングを可能にするために、標的配列の上流に５’ａｔｔＢ部位を組み込んだ一連のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。このことから、遺伝子は正常に増幅され、ｐＤＯＮＲ２０７にクローニングされた。クローンは、植物発現ベクターｐＥＡＱ－ＨＴ－ＤＥＳＴ１に導入する前に配列決定した［１４］。最後に、発現構築物を、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）で一過性発現させるために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（ＬＢＡ４４０４）に個別に形質転換した。
３１の候補ＧＴのスクリーニングは、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）の一過性発現を使用して行った。すべてのインフィルトレーションには、ＱＡ生合成用の構築物（ＱｓｂＡＳ及びＣ－２８／Ｃ－２３／Ｃ－１６αオキシダーゼ）を有する４つのＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株と、トリテルペン生成の重要な収量向上酵素であるｔＨＭＧＲを有する株が含まれていた。
実施例２－キラヤ酸３－Ｏグルクロノシルトランスフェラーゼの同定
サンプルのＬＣ－ＭＳ分析に続いて、予期せぬことに、１つの候補である予測「セルロースシンターゼ様」（ＣＳＬ）酵素（本明細書ではＱｓＣＳＬ１と命名）がキラヤ酸に対して活性であることが見出された。この酵素とＱＡ生成のための５つのＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株との共発現は、１９．２分におけるＱＡピークの大幅な減少をもたらし、１３．９分における新しいピークの出現を伴った（図５）。ピークの保持時間のシフトは、糖の添加によって予想され得るように極性が大幅に高くなることを示唆した。さらに、ピークのＭＳ分析では、キラヤ酸グルクロノシドの予測分子量と一致する６６２の質量が示唆された（図５）。本発明者らは、以前に説明されたように［１９］、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）の大規模なインフィルトレーションを行って十分な量（６８．１ｇ）の化合物を精製し、ＮＭＲによってその構造を割り当てた。これにより、３β－｛［β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（ＱＡ－ＧｌｃｐＡ）であることが確認された（表１１）。
実施例３－ＱＡ－ＧｌｃｐＡガラクトシルトランスフェラーゼの同定
推定グルクロノシルトランスフェラーゼの同定に続いて、次の提案されたステップは、β－Ｄ－ガラクトース残基の付加であった。
トリテルペン３－Ｏ－グルクロノシド－β－１，２－ガラクトシルトランスフェラーゼであるＧｍＵＧＴ７３Ｐ２は、以前に大豆（Glycine max）で同定されている（Shibuya et al, 2010）。この酵素は、ソヤサポゲノールＢモノグルクロニドへのＤ－ガラクトースの付加を触媒して、大豆サポニンＩＩＩを形成する（図６）。
興味深いことに、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＵＧＴ酵素の系統発生分析では、１つの候補であるＱｓ＿２０７３８８６＿Ｄ６がＧｍＵＧＴ７３Ｐ２と密接に関連していることが示された（図４）。この候補の予測タンパク質配列の分析はまた、この予想タンパク質配列がガラクトシルトランスフェラーゼ又はアラビノシルトランスフェラーゼの特徴的なヒスチジン残基を有することを明らかにした（表４）（Kubo et al., 2004；Han et al., 2014；Louveau et al., 2018）。したがって、Ｑｓ＿２０７３８８６＿Ｄ６は、ガラクトシルトランスフェラーゼの可能性があるとして優先された。
Ｑｓ＿２０７３８８６＿Ｄ６は、推定ＱＡ－ＧｌｃｐＡの生成に必要な６つの遺伝子（ｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６－Ｃ－２８／ＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α／ＣＹＰ７１４－Ｃ２３／ＱｓＣＳＬ１）と共発現した。ＨＰＬＣ－ＭＳ分析により、Ｑｓ＿２０７３８８６＿Ｄ６が、１２．６分で推定ＱＡ－ＧｌｃｐＡ生成物を新しいより極性の高い生成物に変換するようであることが明らかになった（図７、上）。この生成物のＭＳ分析では、ガラクトースなどのヘキソースの添加と一致する８２４の質量が示唆された（図７、下）。
新しい生成物の同一性のさらなる証拠を確立するために、本発明者らは、大豆（Glycine max）トリテルペン３－Ｏ－グルクロノシド－β－１，２－ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素であるＧｍＵＧＴ７３Ｐ２を利用した。この酵素は、推定ＱＡ－ＧｌｃｐＡ生成物に対して同様のガラクトシルトランスフェラーゼ活性を示し得ると考えられた。したがって、インフィルトレーションを、推定ＱＡ－ＧｌｃｐＡ及びＧｍＵＧＴ７３Ｐ２の合成に必要な６つの酵素の共発現でも行った。インフィルトレーションした葉抽出物のＬＣ－ＭＳ分析により、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ガラクトシルトランスフェラーゼ発現サンプルで１２．６分に見られた生成物と一致する保持時間及び質量スペクトルを有するＧｍＳＧＴ２発現サンプルでピークが実際に観察され得ることが明らかになった（図７、上）。これは、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）酵素がキラヤ酸二糖ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐを形成するためにトリテルペン３－Ｏ－グルクロノシド－β－１，２－ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するという実質的な証拠を提供する。したがって、この酵素は、本明細書ではＱｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴと命名する。Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴとＧｍＵＧＴ７３Ｐ２は、ヌクレオチドレベルで６８％、タンパク質レベルで５７％の配列同一性を共有する。本発明者らは、以前に説明されたように［１９］、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）のｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６－Ｃ－２８／ＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α／ＣＹＰ７１４－Ｃ２３／ＱｓＣＳＬ１／Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴの大規模なインフィルトレーションをさらに行ってこの化合物（３２．１ｇ）を精製し、ＮＭＲによってその構造を割り当てた。これにより、３β－｛［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ）であることが確認された（表１３）。
実施例４－ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ二重ラムノシル／キシロシルトランスフェラーゼの同定
次に、本発明者らは、残りのＧＴ候補をＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ生成物に対してスクリーニングするプロセスを繰り返した。前述同様に、ＧＴ候補を、ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐの生成に必要な７つの遺伝子（ｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６－Ｃ－２８／ＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α／ＣＹＰ７１４－Ｃ２３／ＱｓＣＳＬ１／Ｇｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ）との共発現によってスクリーニングした。この戦略により、本発明者らは、ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ生成物の枯渇をもたらすＵＧＴ酵素を特定した。しかしながら、単一の新たな生成物ではなく、本発明者らは、以前のＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐに非常に近い保持時間を有する２つの新たな生成物の出現を観察した（図８）。これらの各生成物の質量スペクトルは、一意であり、１番目（保持時間１２．５０分、図８の左下）は９７０の質量を示し、２番目（保持時間１２．８分、図８の右下）は９５６の質量を示した。ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ生成物（ＭＷ＝８２４）と比較すると、ピーク１及び２はそれぞれ、デオキシヘキソース及びペントースの追加と一致することになる。
Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）は、１００を超える異なるサポニンを生成することが公知である［１６］。これらのサポニンの中で、ＱＡの３－Ｏ－ＧｌｃｐＡ－β－１，２－Ｄ－Ｇａｌｐ二糖は十分に保存されているが［１７］、ＱＡ分岐三糖内のＧｌｃｐＡのＣ３位に結合した末端糖が変化している。この変化は、α－Ｌ－ラムノース（Ｒｈａｐ－デオキシヘキソース）又はβ－Ｄ－キシロース（Ｘｙｌｐ－ペントース）の追加であり［１７］、後者は、ＱＳ－２１で観察された（図１）。したがって、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）で観察された新たな化合物は、ＱＡ－Ｇｌｃｐ－Ｇａｌｐ二糖のＧｌｃＡ ３－Ｏ位でのＲｈａｐ又はＸｙｌｐのいずれかの追加と一致している。これらの化合物は、ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ（３β－｛［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸）及びＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐ（３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸）という名称である。これらの化合物の単離及び構造確認を以下に説明する。糖転移酵素は、Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴと呼ばれ、２つの三糖ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ及びＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐの生合成の概略図を図９に示す。
以前に、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）の木の化学的プロファイリングは、ＧｌｃｐＡ－３－Ｏに付着したＲｈａｐ又はＸｙｌｐのいずれかを含むサポニンを生成する能力が様々である異なる「化学種」の存在を実証した（国際公開第２０１８／０５７０３１号を参照）。これらの観察結果の１つの説明は、大豆について以前実証されたように、糖特異性が異なる末端糖トランスフェラーゼの２つの異なる対立遺伝子の存在である［１８］。これにもかかわらず、本開示は、同じ位置での２つの異なる糖の付加を触媒することができる酵素を提供する。
実施例５－Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）で生成された三糖の精製及びＮＭＲ検証
化合物１及び２（図１０）の構造を検証するために、本発明者らは、前述のようにＮ．ベンサミアナ（N. benthamiana）植物の大規模なインフィルトレーションを行った［１９］。植物に、２つの三糖の生成用の８つのｐＥＡＱ－ＨＴ－ＤＥＳＴ１構築物（ｔＨＭＧＲ、ＱｓｂＡＳ、ＣＹＰ７１６－Ｃ－２８、ＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α、ＣＹＰ７１４－Ｃ－２３、ＱｓＣＳＬ１、Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ、及びＱｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ）を有するＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株をインフィルトレーションした。化合物の回収及びそれに続く分離後、本発明者らは、精製された１．８ｍｇの化合物１と０．９ｍｇの化合物２を得ることに成功した。それに続く１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲ分析を行い、化合物１（３β－｛［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシ－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸）及び（３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸）（図１０）としての化合物２の同一性を検証した。ＮＭＲの割り当てを表１及び図１１に示す。
実施例６－安定して形質転換された植物の作製のための、任意選択によりＱＡ遺伝子と組み合わせられる、ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子の使用
トリテルペンは、以前は、エンジニアリングされたトランスジェニック植物系統（例えば、シロイヌナズナ、コムギ）を使用して生産されてきた。複数遺伝子ベクターの構築を可能にし、且つ経路全体を単一の遺伝子座に統合することを可能にする一連のGolden Gate［２３］ベクターが報告されている。これらは、本明細書の開示に照らして、本発明と同様に適用することができる。
したがって、本明細書に記載のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ遺伝子は、任意選択により、以前に出願された未公開の国際公開第ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／０８６４３０号（後に国際公開第２０１９／１２２２５９号として公開される）のＱＡ遺伝子と共に、既知のトランスジェニック技術と組み合わせた本開示に照らして、安定なトランスジェニック植物を作製するために使用することができる。
実施例７－キラヤ酸３－ＯグルクロノシルトランスフェラーゼＣＳＬＧ２（ＱｓＣＳＬＧ２）の同定
前の実施例で説明したように、「１ＫＰ」Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）の葉のトランスクリプトームを使用して、キラヤ酸の生合成に関与する遺伝子（ＱｓｂＡＳ、ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α、ＱｓＣＹＰ７１４－Ｃ－２３、及びＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－２８）及びＱＳ－２１のＣ－３位の三糖の生合成に関与する遺伝子（ＱｓＣＳＬ１、Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ、及びＱｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ）を同定した。
トリテルペングリコシドの生合成に関与する遺伝子は、典型的には共発現される［２５］。複数の組織にわたる特徴付けられれたＱＳ－２１生合成遺伝子の発現パターンを調べるために、６つのＱ．サポナリア（Q. saponaria）組織（原基、成長している葉、成熟した葉、古い葉、緑の茎、及び根）のＲＮＡ－ｓｅｑデータを生成した。ＱｓｂＡＳ、ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α、ＱｓＣＹＰ７１４－Ｃ－２３、ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－２８、及びＱｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴの遺伝子発現プロファイルは、古い葉では低発現のパターン、原基では高発現のパターンを示し、根、成長している葉、緑の茎、及び成熟した葉の発現レベルにある程度のばらつきがあった（図１４）。対照的に、ＱｓＣＳＬ１の発現プロファイルは、古い葉で最も高い発現レベルを有していた（図１４）。Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴは、この分析には含まれていなかった（以下の実施例８を参照）。
ＱｓＣＳＬ１の発現プロファイルは、他の特徴付けられたＱＳ－２１遺伝子に見られる一般的なパターンに従わなかったため、ＱＳ－２１遺伝子発現パターンを有し、従ってＱＳ－２１生合成に関与する可能性があるＱｓＣＳＬ１に関連する遺伝子が存在し得るかどうかを調べた。ＱｓＣＳＬ１をＢＬＡＳＴｐ検索で使用して、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）注釈付きゲノムのセルロースシンターゼ様遺伝子を同定した。これにより、３９個の追加のセルロースシンターゼスーパーファミリー遺伝子が同定され、そのうち５個（ＣｓｌＧ２～ＣｓｌＧ６と命名した）は、ＱｓＣＳＬ１と同じサブファミリーに属していた（図１５）。
これらの遺伝子の発現プロファイルの分析は、ＣｓｌＧ３－ＣｓｌＧ６が古い葉又は根で最も高度に発現していることを示している（図１６）。興味深いことに、１つの遺伝子ＣｓｌＧ２は、他のＱＳ－２１生合成遺伝子と同じ発現プロファイルを共有し、原基での相対的発現が高く、古い葉での相対的発現が低い（図１６）。この遺伝子は、ＱｓＣＳＬ１と７８％のＤＮＡ配列同一性及び７０％のタンパク質配列同一性を共有している。
潜在的なキラヤ酸グルクロノシルトランスフェラーゼ活性を調べるために、ＣｓｌＧ２を、葉のｃＤＮＡから増幅し、植物発現ベクターｐＥＡＱ－ＨＴ－ＤＥＳＴ１にクローニングし、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）で一過性発現させるためにＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）に形質転換した。ＱｓｂＡＳ、ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α、ＱｓＣＹＰ７１４－Ｃ－２３、ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－２８、及びＣｓｌＧ２をＮ．ベンサミアナ（N. benthamiana）で一過性に共発現させた。これにより、ＣｓｌＧ２が、ＣＳＬ１と同じ活性（キラヤ酸ピークの低下及びグルクロニド残基が添加されたキラヤ酸の質量を有する極性の高いピークの形成）を有することが明らかになった（図１７）。本発明者らは、以前に記載されているように［１９］、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）の大規模なインフィルトレーションを行い、２．１ｍｇの標的分子を精製した。この標的分子は、ＮＭＲによって３β－｛［β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（ＱＡ－ＧｌｃｐＡ）であることが確認された（表１２）。
実施例８－ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐキシロシルトランスフェラーゼ及びラムノシルトランスフェラーゼの同定
実施例４で説明したように、二重グリコシルトランスフェラーゼＱｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴのＤＮＡ配列は、キラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）ゲノムデータセットでは同定されなかった。代わりに、この遺伝子は、２つの隣接する遺伝子であるＱｓ＿０２８３８６０（偽遺伝子）とＱｓ＿０２８３８７０との間のキメラであるように見えた（図１８）。Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ配列に組み込まれているＱｓ＿０２８３８６０偽遺伝子のセクションは、さらに隣接する遺伝子Ｑｓ＿０２８３８５０と高い配列類似性を有する（図１８、表９）。
理論的には、ゲノムＱ．サポナリア（Q. saponaria）データセットに示されていないこれらの遺伝子の対立遺伝子が存在するか、又はこの領域が誤って分解された可能性がある。代替データベースとして、新規トランスクリプトームアセンブリが、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）原基のＲＮＡ－ｓｅｑリードから生成された［２６］。３つのゲノム遺伝子及びクエリとしてのＱｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴを使用するＢＬＡＳＴｎ検索により、２つの完全長転写産物：この遺伝子の配列を裏付ける、Ｑｓ＿０２８３８７０の配列と同一である、ＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ６；並びにＱｓ＿０２８３８６０偽遺伝子に対して９９％のＤＮＡ配列同一性及びＱｓ＿０２８３８５０に対して９８％のＤＮＡ配列同一性を有するＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８を同定した（表９）。
本発明者らは、これらの遺伝子の存在及び機能を調べるために、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）の葉のｃＤＮＡからの配列の増幅を試みた。Ｑｓ＿０２８３８５０及びＱｓ＿０２８３８７０は正常に増幅された。偽遺伝子Ｑｓ＿０２８３８６０を増幅するように設計されたプライマーは、新規トランスクリプトームＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８によって予測される遺伝子のコード領域で１００％の配列同一性を有する完全長配列を増幅した。この増幅された配列は、以降、ＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８と呼ぶことにする。これらの３つの増幅された遺伝子（Ｑｓ＿０２８３８５０、Ｑｓ＿０２８３８７０、及びＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８）を、植物発現ベクターｐＥＡＱ－ＨＴ－ＤＥＳＴ１にクローニングし、Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）で一過性発現させるためにＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）に形質転換した。
上記のように、Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴと、ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐを作製できる７つの遺伝子（ｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６－Ｃ－２８／ＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α／ＣＹＰ７１４－Ｃ２３／ＱｓＣＳＬ１／Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ）との共発現は、三糖ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ（保持時間＝１２．５分、ＭＷ＝９７０）及びＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐ（保持時間＝１２．７５分、ＭＷ＝９５６）の出現をもたらし、これらは、前のＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌ（保持時間＝１２．６分、ＭＷ＝８２４）に非常に近い保持時間を有する（図１９）。
同様に、Ｑｓ＿０２８３８５０、Ｑｓ＿０２８３８７０、又はＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８のいずれかと、ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐの作製に必要な遺伝子との共発現は、３つの酵素すべてをＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐに変換することができたが、それぞれ１つの新たな生成物を生成したことを明らかにした（図１９）。Ｑｓ＿０２８３８５０とＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８は同じ活性を共有し、ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐピークを低下させ、ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐと同じ保持時間（１２．５分）及び分子量（ＭＷ＝９７０）を有する極性の高いピークが蓄積した（図１９）。これは、Ｑｓ＿０２８３８５０及びＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８がラムノシルトランスフェラーゼ活性を有し、且つＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐを生成せずに単一の生成物としてＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐを生成できることを示唆している。ＱｓｂＡＳ、ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α、ＱｓＣＹＰ７１４－Ｃ－２３、ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－２８、ＣｓｌＧ２、Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ、及びＱｓ＿０２８３８５０を一過性に発現させるためのＮ．ベンサミアナ（N. benthamiana）の大規模なインフィルトレーション［１９］を行った。生成物（４３．３ｍｇ）の精製及びＮＭＲによる構造分析により、その構造が３β－｛［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ）であることが確認された（表１４）。
ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐを作製するために必要な遺伝子とＱｓ＿０２８３８７０との共発現もまた、ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐピークを低下させたが、ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐと同じ保持時間（１２．７５分）及び分子量（ＭＷ＝９５６）を有する極性の低い化合物が蓄積した（図６）。ｔＨＭＧＲ／ＱｓｂＡＳ／ＣＹＰ７１６－Ｃ－２８／ＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α／ＣＹＰ７１４－Ｃ２３／ＱｓＣｓｋＧ２／Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ／Ｑｓ＿０２８３８７０を共発現させるためのＮ．ベンサミアナ（N. benthamiana）植物の大規模インフィルトレーション［１９］を行った。得られた化合物（２１．６ｍｇ）の精製及びＮＭＲによる構造分析により、その構造が３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐ）であることが確認された（表１５）。
これは、Ｑｓ＿０２８３８７０が主にキシロシルトランスフェラーゼであり、大量のＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐを生成することなくＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐを生成できることを示唆している。
材料及び方法
ＵＧＴ候補の系統発生分析
アミノ酸配列を、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＵＧＴの予測される全長コード配列から推定した。他の植物種からの特徴付けられたグリコシルトランスフェラーゼファミリー１ ＵＧＴの代表的なアミノ酸配列（表３）を、ＮＣＢＩデータベースから得て、系統発生分析に組み込んだ。ＭＡＦＦＴ（https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/）を使用してタンパク質配列をアラインメントした。無根系統樹を、１０００回のブートストラップ複製を使用した近隣結合法によってＭＥＧＡ７で構築した［２０、２１］。
プライマー及びクローニング
本明細書に記載の酵素をコードする遺伝子（ＱｓＣＳＬ１、Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ、Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ、ＱｓＣｓｌＧ２、Ｑｓ＿０２８３８５０、ＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８、及びＱｓ＿０２８３８７０）を、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）の葉組織に由来するｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲを、表２及び表１０に詳述されているプライマーを使用して、製造業者の推奨に従ってサーマルサイクリングを用いてｉＰｒｏｏｆポリメラーゼを用いて行った。得られたＰＣＲ産物を精製し（Qiagen ＰＣＲクリーンアップキット）、製造業者の指示に従ってＢＰクロナーゼを使用してｐＤＯＮＲ２０７ベクターにそれぞれクローニングした。ＢＰ反応物を大腸菌（E. coli）に形質転換し、得られた形質転換体を培養し、プラスミドをミニプレップ（Qiagen）によって単離した。単離されたプラスミドを配列決定して（Eurofins）、正しい遺伝子の存在を検証した。次に、ＬＲクロナーゼを使用して、３つの遺伝子のそれぞれをｐＥＡＱ－ＨＴ－ＤＥＳＴ１発現ベクターにさらにサブクローニングした。得られたベクターを使用して、液体Ｎ２中で凍結フラッシュによってＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ＬＢＡ４４０４を形質転換した。
Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）の葉のアグロインフィルトレーション
アグロインフィルトレーションを、前述のように無針シリンジを使用して行った［１９］。上記のように、すべての遺伝子を、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）ＬＢＡ４４０４のｐＥＡＱ－ＨＴ－ＤＥＳＴ１バイナリー発現ベクター［１４］から発現させた。細菌の培養及び植物の栽培は、［１９］に記載されている通りである。
ＬＣ－ＭＳ分析用のＮ．ベンサミアナ（N. benthamiana）の葉の抽出物の調製
アグロインフィルトレーションの５日後に葉を収集し、凍結乾燥させた。凍結乾燥した葉の物質（サンプル当たり１０ｍｇ）を１０００ｒｐｍで１分間粉砕した（Geno/Grinder 2010, Spex SamplePrep）。抽出は、２０μｇ／ｍＬのジギトキシン（内部標準；Sigma）を含む５５０μＬの８０％メタノールで、１４００ｒｐｍ（Thermomixer Comfort, Eppendorf）で振とうしながら４０℃で２０分間行った。サンプルを４００μＬのヘキサンで２回分配した。水相を４０℃で真空乾燥させた（EZ-2 Series Evaporator, Genevac）。乾燥した物質を７５μＬの１００％メタノールに再懸濁し、１２，５００ｇで３０秒間ろ過した（０．２μｍ、Spin-X, Costar）。ろ過したサンプルをガラスバイアルに移し、以下に詳述するように分析した。
Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）の葉の抽出物のＬＣ－ＭＳ分析
シングル四重極質量分析計ＬＣＭＳ－２０２０（Shimadzu）及びCorona Veo RS 帯電エアロゾル検出器（CAD）（Dionex）を備えたProminenceHPLCシステムを使用して分析を行った。検出：ＭＳ（二重ＥＳＩ／ＡＰＣＩイオン化、ＤＬ温度２５０℃、ｎｅｂガス流１５Ｌ／分、ヒートブロック温度４００℃、スプレー陽電圧４．５ｋＶ、負電圧－３．５ｋＶ）ＣＡＤ：データ回収率１０Ｈｚ、フィルター定数３．６ｓ、９２５エバポレーター温度３５℃、イオントラップ電圧２０．５Ｖ。方法：溶媒Ａ：［Ｈ２Ｏ＋０．１％ギ酸］溶媒Ｂ：［アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）＋０．１％ギ酸。注入量：１０μＬ。勾配：０～１．５分で１５％［Ｂ］、１．５～２６分で１５％～６０％［Ｂ］、２６～２６．５分で６０％～１００％［Ｂ］、２６．５～２８．５分で１００％［Ｂ］、２８．５～２９分で１００％～１５％［Ｂ］、２９～３０分で３５％［Ｂ］。方法は、０．３ｍＬ／分の流量及びKinetexカラム２．６μｍ ＸＢ－Ｃ１８ １００Å、５０×２．１ｍｍ（Phenomenex）を使用して行った。分析は、LabSolutionsソフトウェア（Shimadzu）を使用して行った。
Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）の大規模な真空インフィルトレーション
合計１９８の植物に、前述のように［１９、２２］、ｔＨＭＧＲ、ＧｓｂＡＳ、ＣＹＰ７１６－Ｃ－２８、ＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α、ＣＹＰ７１４－Ｃ－２３、ＱｓＣＳＬ１、Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ、及びＱｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴのためのｐＥＡＱ－ＨＴ－ＤＥＳＴ１構築物を有するＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）株を用いて真空インフィルトレーションを行った。植物は、４日後に収集し、凍結乾燥させ、合計１７５．２５ｇの乾燥葉物質を得た。
Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）の大規模なインフィルトレーションによる化合物の精製
一般的な手順
抽出及びフラッシュクロマトグラフィーに使用される有機溶媒は、試薬グレードであり、さらに蒸留することなく直接使用した。ＨＰＬＣ移動相を、ＨＰＬＣグレードの溶媒を使用して調製した。ＬＣ－ＭＳスペクトルデータを、Kinetex- XB-C18（５０×１０ｍｍ ｉ．ｄ．；２．６μｍ；USA）、（JIC, UK）を使用して、SHIMADZU-2020、シングルクワッドで記録した。１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲスペクトルは、BBFO Plus Smartプローブ及び三重共鳴ＴＣＩクライオプローブをそれぞれ備えたBruker Avance 600 MHz分光計（JIC, UK）で記録した。化学シフトは、残留溶媒信号（ＭｅＯＨ－ｄ４：δＨ ３．３１；δＣ ４９．１５）に対するものである。分取ＨＰＬＣ実験を、Luna C18カラム（２５０×１０ｍｍ ｉ．ｄ．；５μｍ；USA）を使用してUltimate 3000で行った。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＦＣＣ）を、SNAP Ultra 50gカラムを使用してIsolera One（Biotage）で行った。分析ＴＬＣ実験を、シリカゲルプレコートアルミニウムプレート（F254、２０×２０ｃｍ、Merck KGaA, Germany）で行った。ＴＬＣプレートをＵＶ光（２５４ｎｍ）下で可視化し、続いてｐ－アニスアルデヒド（２％ｖ／ｖ ｐ－アニスアルデヒド、２％ｖ／ｖ、濃度、Ｈ２ＳＯ４）で染色した。
抽出及び分離
乾燥Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）粉末を石英砂（０．３～０．９ｍｍ）と混合した。この混合物を、１２０ｍＬの抽出セル内で深さ３ｃｍの石英砂（０．３～０．９ｍｍ）の最下層の上に積層した。抽出は、Speed Extractor E-914（Buchi）を使用して、１００℃、１３０バールの圧力で３サイクル行った。サイクル１の保持時間は０で、サイクル２と３の保持時間は５分であった。この回は、１分間の溶剤洗浄及び１２分間のＮ２フラッシュで終了した。乾燥した葉を、最初に脱脂のためにヘキサンで抽出し、続いてメタノールを使用して完全に抽出した。有機層を一緒に組み合わせ、減圧下で蒸発させた。粗メタノール抽出物を最小量のメタノールに溶解し、等量の水で希釈し、次いで、分液漏斗を使用してヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、及びｎ－ブタノールに対して正常に分配した。ブタノール層を再収集し、無水ＮａＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させ、３０分間のＤＣＭ／ＭｅＯＨ［１００／０～０／１００］の長い勾配を使用して、順相シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（３５～７０μｍ）にかけた。カラムを、酢酸エチル／アセトン／水／ギ酸（５／３／０．５／０．５）でさらに洗浄した。すべての画分を、異なる溶離液系を使用してＴＬＣでモニタリングし、極性に応じて組み合わせた。ＬＣ－ＭＳプロファイリング及び１Ｈ ＮＭＲに基づいて、有望な画分を、０．１％のギ酸を含む溶離系水／アセトニトリルを使用して、逆相（分取／セミ分取Ｃ１８－ＨＰＬＣ）によってさらに分取クロマトグラフィー精製（reparative chromatographic purifications）のために導入して、最終的に純粋なサポニンを得た。化合物１及び２の精製のための単離された化合物の詳細な単離スキーム（実施例４及び５を参照）及びそれらの量が示されている（図１２）。同じ方法を使用して、実施例８に記載の三糖化合物を精製した。実施例２、３、及び７に記載の単糖及び二糖化合物について、以下の変更を加えて、抽出及び単離を上記のように実施した：酢酸エチルに対して液液分配を行い、有機層を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、続いてサポニン画分を逆相Ｃ１８ＨＰＬＣで精製した。
ＮＭＲ分析
ＮＭＲスペクトルを、特段の記載がない限り、重メタノール中で、１Ｈ ＮＭＲの場合は６００ＭＨｚ、１３Ｃ ＮＭＲの場合は１５０ＭＨｚの公称周波数でフーリエ変換モードで記録した。Ｎ．ベンサミアナ（N. benthamiana）の葉のｎ－ブタノール画分の化学的調査（実施例４及び５）により、以前に報告された２つのトリテルペンサポニン、即ち３β－｛［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（１）及び３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（２）を単離することができた（図１０）。それらの構造は、２Ｄ－ＮＭＲ、質量分析、及び報告された文献［２３］の広範囲なフルセットを含むスペクトルツールの組み合わせに基づいて解明された（表１及び図１１）。
ＲＮＡ配列のアラインメント及びヒートマップ
ＲＮＡ－ｓｅｑデータ（Illumina配列リード）を、ＳＴＡＲパッケージ（バージョン２．５）［２７］を使用してＱ．サポナリア（Q. saponaria）ゲノムにアラインメントし、featureCountsプログラム（http://subread.sourceforge.net/、バージョン１．６．０）を使用して定量した。ヒートマップは、heatmap.2、https://CRAN.R-project.org/package=gplotsを使用してＲで描いた。
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配列
配列番号１－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）キラヤ酸３－Ｏ－グルコシルトランスフェラーゼ（セルロースシンターゼ様酵素ＱｓＣＳＬ１）コード配列（２１４２ ｂｐ）
Figure 2022539738000029
 配列番号２－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）キラヤ酸３－Ｏ－グルコシルトランスフェラーゼ（セルロースシンターゼ様酵素ＱｓＣＳＬ１）翻訳ヌクレオチド配列（７１３ ａａ）：
Figure 2022539738000030
 配列番号３－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ β－１，２－ｄ－ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ）コード配列 （１４７９ ｂｐ）
Figure 2022539738000031
 配列番号４－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ β－１，２－ｄ－ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｑｓ－３－Ｏ－ＧａｌＴ）翻訳ヌクレオチド配列（４９２ ａａ）：
Figure 2022539738000032
 配列番号５－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ ｄｕａｌ β－１，３－ｄ－キシロシルトランスフェラーゼ／α－１，３－ｌ－ラムノシルトランスフェラーゼ（Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ）コード配列（１５１５ ｂｐ）
Figure 2022539738000033
 配列番号６－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ ｄｕａｌ β－１，３－ｄ－キシロシルトランスフェラーゼ／α－１，３－ｌ－ラムノシルトランスフェラーゼ（Ｑｓ－３－Ｏ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ）翻訳ヌクレオチド配列（５０４ ａａ）：
Figure 2022539738000034
パート２－他の生合成酵素：
配列番号７－ＡｓＨＭＧＲ（アウェナ・ストリゴザ（Avena strigosa）ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ）コード配列（１６８９ｂｐ）：
完全長ＨＭＧＲ配列を以下に示す。５’領域（下線）を除去して切断型フィードバック非感受性形態（ｔＨＭＧＲ）を作製することができる。ｔＨＭＧＲの配列も、以下に個別に示す。
Figure 2022539738000035
 配列番号８－ＡｓＨＭＧＲ（アウェナ・ストリゴザ（Avena strigosa）ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ）翻訳ヌクレオチド配列（５６２ａａ）：
Figure 2022539738000036
 配列番号９－ＡｓｔＨＭＧＲ（アウェナ・ストリゴザ（Avena strigosa）切断型ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ）コード配列（１２７５ｂｐ）：
Figure 2022539738000037
 配列番号１０－ＡｓｔＨＭＧＲ（アウェナ・ストリゴザ（Avena strigosa）切断型ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ）翻訳ヌクレオチド配列（４２４ａａ）：
Figure 2022539738000038
 配列番号１１－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）β－アミリンシンターゼ、ＱｓｂＡＳ（ＯＱＨＺ－２０７４３２１）コード配列（２２７７ｂｐ）：
Figure 2022539738000039
 配列番号１２－ＱｓｂＡＳ（ＯＱＨＺ－２０７４３２１）翻訳ヌクレオチド配列（７５８ａａ）：
Figure 2022539738000040
 配列番号１３－ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－２８（ＯＱＨＺ－２０７３９３２）（Ｃ－２８オキシダーゼ、以前はＣＹＰ７１６Ａ２２４という名称［２４］）コード配列（１４４３ｂｐ）：
Figure 2022539738000041
 配列番号１４－ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－２８（ＯＱＨＺ－２０７３９３２）翻訳ヌクレオチド配列（４８０ａａ）：
Figure 2022539738000042
 配列番号１５－ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α（ＯＱＨＺ－２０１２０９０）（Ｃ－１６αオキシダーゼ）コード配列（１５０６ｂｐ／１４４３ｂｐ）：
本明細書に記載の長いアイソフォームと短いアイソフォームは、以下の配列で下線が引かれている最初の６３個のヌクレオチドの存在によって区別される（２１アミノ酸）。
Figure 2022539738000043
 配列番号１６－ＱｓＣＹＰ７１６－Ｃ－１６α翻訳ヌクレオチド配列（５０１ａａ／４８０ａａ）：
Figure 2022539738000044
 配列番号１７－ＱｓＣＹＰ７１４－Ｃ－２３（Ｃ－２３オキシダーゼ）コード配列（１５２４ｂｐ）：
Figure 2022539738000045
 配列番号１８－ＱｓＣＹＰ７１４－Ｃ－２３翻訳ヌクレオチド配列（５０７ａａ）：
Figure 2022539738000046
 配列番号１９－ＧｍＳＧＴ２（ＧｍＵＧＴ７３Ｐ２）（大豆（Glycine max）β－ｄ－ガラクトシルトランスフェラーゼ）コード配列（１４８８ｂｐ）：
Figure 2022539738000047
 配列番号２０－ＧｍＳＧＴ２（ＧｍＵＧＴ７３Ｐ２）（大豆(Glycine max）β－ｄ－ガラクトシルトランスフェラーゼ）翻訳ヌクレオチド配列（４９５ａａ）：
Figure 2022539738000048
 配列番号２１－ＡｓＳＱＳ（アウェナ・ストリゴザ（Avena strigosa）スクアレンシンターゼ）コード配列（１２１２ｂｐ）：
Figure 2022539738000049
 配列番号２２－ＡｓＳＱＳ（アウェナ・ストリゴザ（Avena strigosa）スクアレンシンターゼ）翻訳ヌクレオチド配列（４０３ａａ）：
Figure 2022539738000050
 配列番号２３－ＡｔＡＴＲ２（シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana）シトクロムＰ４５０レダクターゼ２）コード配列（２３２５ｂｐ）：
Figure 2022539738000051
 配列番号２４－ＡｔＡＴＲ２（シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana）シトクロムＰ４５０レダクターゼ２）翻訳ヌクレオチド配列（７７４ａａ）：
Figure 2022539738000052
 配列番号２５－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）キラヤ酸３－Ｏ－グルコシルトランスフェラーゼ（セルロースシンターゼ様酵素ＱｓＣｓｌＧ２）コード配列（２１２４ ｂｐ）：
Figure 2022539738000053
 配列番号２６－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）キラヤ酸３－Ｏ－グルコシルトランスフェラーゼ（セルロースシンターゼ様酵素ＱｓＣｓｌＧ２）翻訳ヌクレオチド配列（７０７ ａａ）：
Figure 2022539738000054
 配列番号２７－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ α－１，３－ｌ－ラムノシルトランスフェラーゼ（Ｑｓ＿０２８３８５０）コード配列（１４８５ ｂｐ）：
Figure 2022539738000055
 配列番号２８－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ α－１，３－ｌ－ラムノシルトランスフェラーゼ（Ｑｓ＿０２８３８５０）翻訳ヌクレオチド配列（４９４ ａａ）：
Figure 2022539738000056
 配列番号２９－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ α－１，３－ｌ－ラムノシルトランスフェラーゼ（ＴＲＩＮＩＴＹ＿ＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８）コード配列（１４９１ ｂｐ）：
Figure 2022539738000057
 配列番号３０－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ α－１，３－ｌ－ラムノシルトランスフェラーゼ（ＴＲＩＮＩＴＹ＿ＤＮ２０５２９＿ｃ０＿ｇ２＿ｉ８）翻訳ヌクレオチド配列（４９６ ａａ）：
Figure 2022539738000058
 配列番号３１－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ β－１，３－ｄ－キシロシルトランスフェラーゼ（Ｑｓ＿０２８３８７０）コード配列（１５１５ ｂｐ）：
Figure 2022539738000059
 配列番号３２－Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ β－１，３－ｄ－キシロシルトランスフェラーゼ（Ｑｓ＿０２８３８７０）翻訳ヌクレオチド配列（５０４ ａａ）：
Figure 2022539738000060

Claims (62)

  1. 宿主が、３－Ｏ分岐三糖キラヤ酸（「ＱＡ」）誘導体（「ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ」）の生合成を行うことができない表現型から、前記宿主を変換する方法であって、
    ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳが、
    ３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐ）又は（３β－｛［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸）（ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ）であり、
    前記方法が、前記宿主又はその１つ又は複数の細胞内で異種核酸を発現させるステップ、及びこのステップの前の、前記核酸を前記宿主又は祖先のいずれかに導入するステップを含み、
    前記異種核酸が、組み合わせられると前記ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳの生合成活性を有するポリペプチドをそれぞれコードする複数のヌクレオチド配列を含む、方法。
  2. 前記異種核酸が：以下のタイプのポリペプチド（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）
    （ｉ）キラヤ酸の３－Ｏ位のＤ－グルクロン酸（「ＧｌｃｐＡ」）を転移させて３β－｛［β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ」）を形成することができるＱＡ ３－Ｏグルクロノシルトランスフェラーゼ（「ＱＡ－ＧｌｃＡＴ」）；
    （ｉｉ）β－１→２結合を介してＤ－ガラクトース（「Ｇａｌｐ」）をＱＡ－ＧｌｃｐＡに転移させて３β－｛［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ」）を形成することができるＱＡ－ＧｌｃｐＡガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＱＡ－ＧａｌＴ」）；
    （ｉｉｉ）１，３結合を介してＬ－ラムノース（「Ｒｈａｐ」）及び／又はＤ－キシロース（「Ｘｙｌｐ」）をそれぞれＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐに転移させて、（３β－｛［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸）（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ」）及び／又は３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐ」）を形成することができるＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐラムノシル／キシロシルトランスフェラーゼ（「ＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ」）
    のうちの２つ又は３つをコードし；
    前記ポリペプチドのそれぞれが、任意選択によりキラヤ・サポナリア（Quillajasaponaria）に由来する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記異種核酸が、３つすべてのタイプのポリペプチドをコードする、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ヌクレオチド配列が、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）に由来する、請求項２又は３に記載の方法。
  5. （ｉ）前記ポリペプチドが、表５若しくは表６のＱＡ－ＧｌｃＡＴ、ＱＡ－ＧａｌＴ、及びＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ酵素から、又は表５若しくは表６の前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片から選択され、及び／又は
    （ｉｉ）前記ヌクレオチド配列が、表５若しくは表６のＱＡ－ＧｌｃＡＴ、ＱＡ－ＧａｌＴ、及びＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴヌクレオチド配列から、又は表５若しくは表６の前記ヌクレオチド配列のいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片から選択される、請求項３に記載の方法。
  6. 前記それぞれのポリペプチドが：
    （ｉ）配列番号２若しくは２６に示されるＱＡ－ＧｌｃＡＴ；
    （ｉｉ）配列番号４に示されるＱＡ－ＧａｌＴ；
    （ｉｉｉ）配列番号６、２８、３０、若しくは３２に示されるＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴからなるリストから選択されるか；
    又は、前記それぞれのポリペプチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片である、請求項４に記載の方法。
  7. 前記異種核酸が、組み合わせられるとＱＡ生合成活性を有するポリペプチド（「ＱＡポリペプチド」）をそれぞれコードする複数のヌクレオチド配列をさらに含み、前記核酸が、以下のＱＡポリペプチド：
    （ｉ）２，３－オキシドスクアレン（ＯＳ）をトリテルペンに環化するためのβ－アミリンシンターゼ（ｂＡＳ）；
    （ｉｉ）β－アミリン又はその酸化誘導体をＣ－２８位でカルボン酸に酸化することができる酵素（「Ｃ－２８オキシダーゼ」）；
    （ｉｉｉ）β－アミリン又はその酸化誘導体をＣ－１６α位でアルコールに酸化することができる酵素（「Ｃ－１６αオキシダーゼ」）；及び
    （ｉｖ）β－アミリン又はその酸化誘導体をＣ－２３位でアルデヒドに酸化することができる酵素（「Ｃ－２３オキシダーゼ」）のすべてをコードし、
    前記ポリペプチドのそれぞれが、任意選択によりＱ．サポナリア（Q. saponaria）に由来する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記Ｃ－２８オキシダーゼ、前記Ｃ－１６αオキシダーゼ、及び前記Ｃ－２３オキシダーゼがすべてＣＹＰ４５０酵素である、請求項７に記載の方法。
  9. （ｉ）前記Ｃ－２８オキシダーゼがＣＹＰ７１６であり；
    （ｉｉ）前記Ｃ－１６αオキシダーゼが、ＣＹＰ７１６又はＣＹＰ８７であり；
    （ｉｉｉ）前記Ｃ－２３オキシダーゼが、ＣＹＰ７１４、ＣＹＰ７２、又はＣＹＰ９４である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記ＱＡポリペプチドが：
    配列番号１２に示される前記β－アミリンシンターゼ（ｂＡＳ）；
    配列番号１４に示される前記Ｃ－２８オキシダーゼ；
    配列番号１６に示される前記Ｃ－１６αオキシダーゼ；
    配列番号１８に示される前記Ｃ－２３オキシダーゼ；
    又は前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片からなるリストから選択される、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記核酸が：
    （ｉ）ＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）；
    （ｉｉ）スクアレンシンターゼ（ＳＱＳ）
    のポリペプチドのうちの１つ又は複数をコードする複数のヌクレオチド配列をさらに含み、
    前記ＨＭＧＲ若しくは前記ＳＱＳが、表７のそれぞれのポリペプチド若しくは前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片から任意選択により選択されるか、又は表７の前記それぞれのポリヌクレオチドによってコードされるか、又は前記ポリヌクレオチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ヌクレオチド配列が、２つ以上の異なる核酸分子上に存在する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記宿主が植物であり、前記核酸分子が、それぞれが１つ又は複数の前記核酸分子を有する複数のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株との共インフィルトレーションによって導入される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記核酸分子が、一過性発現ベクターである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記一過性発現ベクターのそれぞれが：
    （ｉ）以下に動作可能に連結されたプロモーター
    （ｉｉ）二分割ＲＮＡウイルスのＲＮＡ－２ゲノムセグメントの標的開始部位が変異している前記ＲＮＡ－２ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列；
    （ｉｉｉ）組み合わせられると前記ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成活性を有する前記ポリペプチドの１つをコードするヌクレオチド配列；
    （ｉｖ）ターミネーター配列；及び、任意選択により
    （ｖ）前記ターミネーター配列の上流に位置する３’ＵＴＲ
    を含む発現カセットを含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記宿主が、変更されたＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ含有量を有するように変換された植物である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 組み合わせられるとＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成活性を有するポリペプチドをそれぞれコードする複数のヌクレオチド配列を含む異種核酸を含むか又はそれで形質転換された宿主細胞であって、
    前記核酸の発現が、前記形質転換された宿主がＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成を行う能力に影響を与え、
    前記宿主細胞が、任意選択により、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能である、宿主細胞。
  18. 請求項７～１０のいずれかで定義されたように組み合わせられるとＱＡ生合成活性を有するポリペプチドをそれぞれコードする複数のヌクレオチド配列をさらに含む異種核酸を含むか、又はそれで形質転換された請求項１７に記載の宿主細胞。
  19. 前記核酸を含む複数の組換え構築物をその一過性発現のために細胞に共インフィルトレーションすることによって請求項１７又は１８に記載の宿主細胞を作製するためのプロセス。
  20. ベクターを介して異種核酸を細胞に導入し、前記ベクターと前記細胞のゲノムとの間の組換えを引き起こす、又はそれを可能にして前記核酸を前記ゲノムに導入することによって、前記細胞を前記核酸で形質転換することによって請求項１７又は１８に記載の宿主細胞を作製するプロセス。
  21. トランスジェニック植物を作製するための方法であって：
    （ａ）請求項２０に記載のプロセスを行うステップであって、前記宿主細胞が植物細胞である、ステップ、及び
    （ｂ）前記形質転換された植物細胞から植物を再生するステップを含む、方法。
  22. 請求項２１に記載の方法によって得ることが可能であるトランスジェニック植物、又は前記トランスジェニック植物のクローン、若しくは自家受粉若しくはハイブリッド子孫若しくは他の子孫であるトランスジェニック植物であって、
    前記異種核酸の発現が、その他の点は前記トランスジェニック植物に一致する野生型植物と比較してＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ合成を行う高い能力を与える、トランスジェニック植物。
  23. 以下のタイプのポリペプチド（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）：
    （ｉ）キラヤ酸の３－Ｏ位のＤ－グルクロン酸（「ＧｌｃｐＡ」）を転移させて３β－｛［β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ」）を形成することができるＱＡ ３－Ｏグルクロノシルトランスフェラーゼ（「ＱＡ－ＧｌｃＡＴ」）；
    （ｉｉ）β－１→２結合を介してＤ－ガラクトース（「Ｇａｌｐ」）をＱＡ－ＧｌｃｐＡに転移させて３β－｛［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐ」）を形成することができるＱＡ－ＧｌｃｐＡガラクトシルトランスフェラーゼ（「ＱＡ－ＧａｌＴ」）；
    （ｉｉｉ）１→３結合を介してＬ－ラムノース（「Ｒｈａｐ」）及び／又はＤ－キシロース（「Ｘｙｌｐ」）をそれぞれＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐに転移させて、（３β－｛［α－Ｌ－ラムノピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸）（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｒｈａｐ」）及び／又は３β－｛［β－Ｄ－キシロピラノシル－（１→３）－［β－Ｄ－ガラクトピラノシル－（１→２）］－β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸（「ＱＡ－ＧｌｃｐＡ－［Ｇａｌｐ］－Ｘｙｌｐ」）を形成することができるＱＡ－ＧｌｃｐＡ－Ｇａｌｐラムノシル／キシロシルトランスフェラーゼ（「ＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ」）をコードする核酸を含むトランスジェニック植物であって、
    少なくとも１つの前記核酸が、異種核酸であり、
    且つ、任意選択により、以下：
    （ｉｖ）２，３－オキシドスクアレンをトリテルペンに環化するためのβ－アミリンシンターゼ；
    （ｖ）β－アミリン又はその酸化誘導体をＣ－２８位でカルボン酸に酸化することができる酵素；
    （ｖｉ）β－アミリン又はその酸化誘導体をＣ－１６α位でアルコールに酸化することができる酵素；及び
    （ｖｉｉ）β－アミリン又はその酸化誘導体をＣ－２３位でアルデヒドに酸化することができる酵素
    のタイプのポリペプチドをコードする核酸を含み、
    少なくとも１つの前記核酸が異種核酸であり、
    且つ、任意選択により、前記ポリペプチドのそれぞれが、キラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）に由来する、トランスジェニック植物。
  24. キラヤ酸の３－Ｏ位におけるＤ－グルクロン酸を転移させて３β－｛［β－Ｄ－グルコピラノシデュロン酸］オキシ｝－キラヤ酸を形成するインビボ又はインビトロ法であって、前記キラヤ酸を、任意選択により配列番号２、配列番号２６、又はこれらのいずれかの相同変異体から選択される、セルロースシンターゼ酵素に接触させることを含む、方法。
  25. ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成ヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、
    前記ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成ヌクレオチド配列が：
    （ｉ）ポリペプチド配列番号２、４、６、２６、２８、３０、又は３２の全部又は一部をコードし、又は
    （ｉｉ）これらの配列番号と少なくとも約６０％の同一性を共有する、前記配列番号のいずれかの相同変異体である変異体ポリペプチドをコードし、前記変異体ポリペプチドが、いずれの場合も、表５に示されている前記配列番号のそれぞれの活性を有する、核酸分子。
  26. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、３、５、２５、２７、２９、又は３１、又はそのゲノム同等物から選択される、請求項２５に記載の核酸。
  27. 前記ヌクレオチド配列が、請求項２６に記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子又は他の相同若しくはオーソロガス変異体からなる、請求項２５に記載の核酸。
  28. 前記ヌクレオチド配列が、Ｑ．サポナリア（Q. saponaria）に由来するか、又はＱ．サポナリア（Q. saponaria）から得られる、請求項２５に記載の核酸。
  29. 前記ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成ヌクレオチド配列が、１つ又は複数のアミノ酸が付加、挿入、欠失、又は置換された配列番号２、４、６、２６、２８、３０、又は３２に示されるアミノ酸配列の誘導体をコードする、請求項２８に記載の核酸。
  30. 請求項２６～２８のいずれか一項に記載の核酸を修飾するステップを含む、請求項２９に記載の核酸を作製するためのプロセス。
  31. 請求項２７又は請求項２８に記載の核酸を同定又はクローニングするための方法であって、請求項２６に記載の核酸又はその相補体の全部又は一部を使用する、方法。
  32. （ａ）植物細胞からの核酸の調製物を提供するステップ；
    （ｂ）プローブである核酸分子を提供するステップであって、前記核酸分子が、請求項２６に記載のヌクレオチド配列又はその相補配列に存在する配列を有する、ステップ；
    （ｃ）前記調製物中の核酸を、ハイブリダイゼーションの条件下で前記核酸分子と接触させるステップ；及び、
    （ｄ）前記核酸分子とハイブリダイズする前記調製物中の核酸を同定するステップを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. （ａ）植物細胞からの核酸の調製物を提供するステップ；
    （ｂ）ＰＣＲに適した一対の核酸分子プライマーを提供するステップであって、前記プライマーの少なくとも１つが、少なくとも約１６～２４ヌクレオチド長の配列であり、前記配列が、請求項２６に記載のヌクレオチド配列又はその相補配列に存在する、ステップ；
    （ｃ）前記調製物中の核酸を、ＰＣＲを実施するための条件下で前記プライマーと接触させるステップ；及び、
    （ｄ）ＰＣＲを行って、増幅されたＰＣＲ産物の有無を判断するステップ、を含む請求項３２に記載の方法。
  34. 植物のゲノム配列のデータベースに問い合わせるためのクエリ配列として請求項２６に記載のヌクレオチド配列又はその相補配列の全部又は一部を使用して、配列類似性及びＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳＩ－生合成ヌクレオチド配列との請求項２７又は２８に記載の標的核酸のクラスター化又は共発現に基づいて前記標的核酸を同定する、請求項２７又は２８に記載の核酸を同定するための方法。
  35. 請求項２５～２９のいずれか一項に記載の核酸を含む組換えベクター。
  36. 前記核酸が、宿主細胞における転写のためのプロモーターに動作可能に連結され、前記プロモーターが、任意選択により誘導性プロモーターである、請求項３５に記載のベクター。
  37. 植物ベクター又は微生物ベクターである、請求項３５又は請求項３６に記載のベクター。
  38. （ｉ）以下に動作可能に連結されたプロモーター
    （ｉｉ）二分割ＲＮＡウイルスのＲＮＡ－２ゲノムセグメントの標的開始部位が変異している前記ＲＮＡ－２ゲノムセグメントに由来するエンハンサー配列；
    （ｉｉｉ）請求項２５～２９のいずれか一項に記載の核酸；
    （ｉｖ）ターミネーター配列；及び、任意選択により
    （ｖ）前記ターミネーター配列の上流に位置する３’ＵＴＲ
    を含む発現カセットを含む、請求項３７に記載のベクター。
  39. 請求項３５～３８のいずれか一項に記載の１つ又は複数の異なるベクターを宿主細胞に導入し、且つ、任意選択により、前記宿主細胞を形質転換するように前記ベクターと前記宿主細胞のゲノムとの間の組換えを引き起こす又は可能にするステップを含む方法。
  40. 前記１つ又は複数の異なるベクターが：
    （ｉ）配列番号２又は２６に示されるＱＡ－ＧｌｃＡＴ又はその実質的に相同な変異体若しくは断片；
    （ｉｉ）配列番号４に示されるＱＡ－ＧａｌＴ又はその実質的に相同な変異体若しくは断片；
    （ｉｉｉ）配列番号６、２８、３０、又は３２に示されるＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ又はその実質的に相同な変異体若しくは断片
    をまとめてコードし；
    いずれの場合も、前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片が、表５に示される前記配列番号のそれぞれの活性を有する、請求項３９に記載の方法。
  41. 請求項３５～３８のいずれか一項に記載のベクターを含むか、又は前記ベクターで形質転換された宿主細胞。
  42. 微生物細胞、任意選択により酵母細胞である、請求項４１に記載の宿主細胞。
  43. 任意選択により配列番号２３に示されるＣＰＲである植物シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）であるポリペプチド又は前記ポリペプチドの実質的に相同な変異体若しくは断片をそれぞれコードする１つ又は複数のヌクレオチド配列を含む異種核酸をさらに含むか、又はそれで形質転換される、請求項４２に記載の宿主細胞。
  44. その染色体内に請求項２５～２９のいずれか一項に記載の異種核酸を有する植物細胞である宿主細胞。
  45. （ｉ）配列番号２又は２６に示されるＱＡ－ＧｌｃＡＴ又はその実質的に相同な変異体若しくは断片；及び／又は
    （ｉｉ）配列番号４に示されるＱＡ－ＧａｌＴ又はその実質的に相同な変異体若しくは断片；及び／又は
    （ｉｉｉ）配列番号６、２８、３０、又は３２に示されるＱＡ－ＲｈａＴ／ＸｙｌＴ又はその実質的に相同な変異体若しくは断片である異種核酸を有する植物細胞であり；及び／又は、
    いずれの場合も、前記ポリペプチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片が、表５に示される前記配列番号のそれぞれの活性を有する、請求項４４に記載の宿主細胞。
  46. トランスジェニック植物を作製するための方法であって：
    （ａ）請求項３９に記載の方法を行うステップであって、宿主細胞が植物細胞である、ステップ、及び
    （ｂ）形質転換された植物細胞から植物を再生するステップを含む、方法。
  47. 請求項４１～４５のいずれか一項に記載の宿主細胞を含むか、又は請求項４６に記載の方法によって得ることが可能であるトランスジェニック植物、又は前記トランスジェニック植物のクローン、若しくは自家受粉若しくはハイブリッド子孫若しくは他の子孫であるトランスジェニック植物であって、いずれの場合も、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の異種核酸を含む、トランスジェニック植物。
  48. １つ又は複数のその細胞において請求項２５～２９のいずれか一項に記載の異種核酸又は請求項３５～３８のいずれか一項に記載のベクターを有する植物。
  49. いずれの場合も、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の異種核酸を含む、請求項２２、２３、４７、又は４８に記載の植物の葉、茎、又は食用部分又は繁殖体。
  50. （ｉ）配列番号１１に示されるβ－アミリンシンターゼ；
    （ｉｉ）配列番号１３に示されるＣ－２８オキシダーゼ；
    （ｉｉｉ）配列番号１５に示されるＣ－１６αオキシダーゼ；
    （ｉｖ）配列番号１６に示されるＣ－２３オキシダーゼ；
    又は前記ポリヌクレオチドのいずれかの実質的に相同な変異体若しくは断片
    のすべてからなる異種核酸をさらに含む、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の宿主細胞、又は請求項３６若しく４７若しくは請求項４８に記載の植物、又は請求項４９に記載の葉、茎、若しくは食用部分若しくは繁殖体。
  51. 請求項２５～２８のいずれか一項に記載のＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳ生合成ヌクレオチド配列によってコードされる、単離され、且つ任意選択により組換えられたポリペプチド。
  52. 任意選択により表５に示される生物学的活性に従って、ＱＡ－グリコシル化を触媒するための請求項５１に記載のポリペプチドの使用。
  53. ＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳを合成する方法における請求項５１に記載のポリペプチドの使用。
  54. 宿主細胞において、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の核酸からポリペプチドを発現させるステップを含む、請求項５１に記載のポリペプチドを作製する方法。
  55. 宿主におけるＱＡ－グリコシル化に影響を与える又は作用するための方法であって：
    （ｉ）前記宿主の細胞内で請求項２５～２８のいずれか一項に記載の異種核酸の発現を引き起こす又は可能にするステップ、及びこのステップの前の、前記宿主又はその祖先の細胞に前記核酸を導入する最初のステップ、又は
    （ｉｉ）前記宿主細胞又はその祖先に、請求項２６又は２７に記載のヌクレオチド配列の発現をサイレンシングすることができるサイレンシング剤を導入するステップを含む、方法。
  56. 任意選択により植物である宿主において、任意選択によりＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳであるグリコシル化ＱＡである生成物又はその下流生成物を生成する方法であって、請求項１～１６、２４、３９、４０、又は５５のいずれか一項に記載の方法を行うこと、及び、任意選択により前記生成物を前記宿主から単離することを含む、方法。
  57. 異種宿主において、任意選択によりＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳであるグリコシル化ＱＡである生成物又はその下流生成物を生成する方法であって、請求項１７～１８、４１～４５、又は５０のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記宿主細胞から前記生成物を精製することを含む、方法。
  58. 異種植物において、任意選択によりＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳであるグリコシル化ＱＡである生成物又はその誘導体を生成する方法であって、請求項２３、４７、又は４８のいずれか一項に記載の植物を成長させること、次にグリコシル化ＱＡを回収し、前記グリコシル化ＱＡから生成物を精製することを含む、方法。
  59. アジュバントの調製における、請求項５５～５８のいずれか一項に記載の方法によって得られる、任意選択によりＱＡ－３－Ｏ－ＴｒｉＳであるグリコシル化ＱＡ又はその誘導体の使用。
  60. 作物又は苔である、請求項１６、２２、２３、３２～３４、３７、４３～５０、５６～５８のいずれか一項に記載されている方法、植物、ベクター、宿主細胞、葉、茎、又は食用部分又は繁殖体。
  61. 任意選択により２０～２５ｂｐｓからなるｓｉＲＮＡ二本鎖である、請求項２６に記載のヌクレオチド配列の一部と同等のＲＮＡ配列を含む二本鎖ＲＮＡ。
  62. 請求項５１に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
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