JP2022535045A - 細胞間近接相互作用の検出および免疫療法用の腫瘍特異的抗原反応性ｔ細胞の単離のための化学酵素的方法 - Google Patents

細胞間近接相互作用の検出および免疫療法用の腫瘍特異的抗原反応性ｔ細胞の単離のための化学酵素的方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2022535045A
JP2022535045A JP2021571590A JP2021571590A JP2022535045A JP 2022535045 A JP2022535045 A JP 2022535045A JP 2021571590 A JP2021571590 A JP 2021571590A JP 2021571590 A JP2021571590 A JP 2021571590A JP 2022535045 A JP2022535045 A JP 2022535045A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
cell
composition
tsa
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021571590A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020247510A5 (ja
Inventor
ウー，ペン
リウ，ジレイ
リー，ジエ
テイジャロ，ジョン
Original Assignee
ザ スクリプス リサーチ インスティテュート
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ スクリプス リサーチ インスティテュート filed Critical ザ スクリプス リサーチ インスティテュート
Publication of JP2022535045A publication Critical patent/JP2022535045A/ja
Publication of JPWO2020247510A5 publication Critical patent/JPWO2020247510A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01152—4-Galactosyl-N-acetylglucosaminide 3-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.152)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C12N2502/1114—T cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/521—Chemokines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/38—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本開示は、細胞間（「細胞－細胞」）相互作用をインビトロ、エクスビボおよびインビボでモニターするための組成物および方法を提供する。幾つかの実施形態においては、本開示は、（ｉ）腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または循環Ｔ細胞から腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を特定し富化するための、（ｉｉ）特定の自己免疫疾患における自己抗原を認識するＴ細胞を特定し富化するための、および／または（ｉｉｉ）自己免疫疾患の治療に利用される可能性を有する抗原特異的制御性Ｔ細胞を特定し富化するための、これらの組成物および方法の使用を提供する。幾つかの実施形態においては、本開示は、本方法により単離されたそのようなＴＳＡ反応性Ｔ細胞を使用する、疾患、例えば癌の治療方法も提供する。

Description

本発明は細胞間近接相互作用の検出および免疫療法用の腫瘍特異的抗原反応性Ｔ細胞の単離のための化学酵素的方法に関する。
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１９年６月３日付出願の米国仮特許出願第６２／８５６，５５１号および２０２０年３月１６日付出願の米国仮特許出願第６２／９９０，３８３号に基づく優先権を主張するものであり、これらの出願のそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、それを参照により本明細書に組み入れることとする。配列表を含むテキストファイルの名称はＴＳＲＩ＿０１２＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは３４ＫＢであり、２０２０年６月１日付で作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出される。
米国政府の権利に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により授与された助成金番号Ｒ０１ ＡＩ１４３８８４およびＲ０１ ＧＭ０９３２８２としての米国政府の援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
背景
細胞間（細胞－細胞）相互作用は、免疫応答１、胚発生２およびニューロンシグナル伝達３を含む多数の生物学的プロセスに不可欠である。研究者がこれらの生物学的プロセスをよりよく理解するためには、細胞間相互作用のダイナミクスをモニターするための技術が必要である。現在のところ、インビトロおよびインビボで細胞間相互作用をモニターする方法は限られている。例えば、Ｐａｒｋｅｒらは２００８年に、免疫細胞相互作用のダイナミクスを検出するために、生体顕微鏡検査を用いた４。最近、Ｖｉｃｔｏｒｉａは、インビトロおよびインビボにおける免疫パートナーシップを研究するためのソルタギング（ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ）（ソルターゼ酵素を使用）を含む方法を報告した５。しかし、これらの方法は、特別な装置または或る細胞型の複雑な遺伝的修飾を要する。細胞間相互作用を検出するための一般化可能で頑強で費用効果的な方法が必要とされている。
細胞表面上に提示された分子は、細胞がそのパートナーおよび環境とどのように相互作用するかを決定する。この理由により、細胞表面の景観を操作するための方法は細胞間コミュニケーション５－６および下流シグナル伝達７の研究に役立つ。最も実践的な細胞工学的アプローチとしての遺伝子工学は、技術的な複雑さおよび安全性の懸念、例えば、初代細胞のウイルス形質導入抵抗性、不均一な発現レベルおよび内因性遺伝子破壊の可能性により制限される８－１０。これらの問題に対処するために、ケミカルバイオロジー手段を用いて「外部」から細胞表面を操作することが、補完的で一般に適用可能なアプローチとして出現している１１－１２。グリコシル化酵素によるインサイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）グリカン編集は、糖衣を修飾するための単一工程法である。その適用の最も注目すべき例は、ＧＤＰ－フコース（ＧＤＰ－Ｆｕｃ）ドナーおよび組換えヒトα（１，３）－フコシルトランスフェラーゼＶＩを使用する間葉系幹細胞および制御性Ｔ細胞のエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）フコシル化である１３－１４。現在、幾つかの臨床試験が行われており、この方法は養子移入細胞の接着、ホーミングおよび生着を改善する。
これらの研究に着想を得て、本発明者らは、グリカン編集酵素で細胞表面を機能化する方法を開発することを目的とする。この酵素機能化細胞は、プローブ（例えば、ビオチン、タグ、蛍光分子）を隣接細胞に相互作用依存的に転移させる「検出器」として機能する。この目的を達成するためには、（１）酵素を細胞表面に転移させる簡便かつ効率的な方法を要し、（２）酵素が、優れた触媒能（高い反応速度、高い選択性および宿主細胞に対する良好な安全性）を示すことを要し、（３）細胞間相互作用が動的スイッチとして機能すること、すなわち、相互作用が生じない場合には酵素触媒標識は生じず、相互作用が生じたら標識が迅速に生じることを要する。
本発明は、とりわけ、１）ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）α１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）または他の酵素を細胞表面に結合させるためのワンポット法、（２）ＦＴ機能化細胞を使用して、免疫細胞間相互作用をインビトロ、エクスビボおよびインビボでモニターするプロトコル、ならびに（３）ＦＴ機能化未熟樹状細胞（ｉＤＣ）を使用して、がん（以下、癌と表記される）免疫療法または他の免疫療法用途のために、抗原特異的Ｔ細胞、特に腫瘍特異的Ｔ細胞を腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から特定し単離する技術を提供する。
実施形態の概要
本開示は、とりわけ、細胞間（「細胞－細胞」）相互作用をインビトロ、エクスビボおよびインビボでモニターするための組成物および方法を提供する。幾つかの実施形態においては、本開示は、（ｉ）腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または循環Ｔ細胞から腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を特定し富化（濃縮）するための、（ｉｉ）特定の自己免疫疾患における自己抗原を認識するＴ細胞を特定し富化するための、および／または（ｉｉｉ）自己免疫疾患の治療に利用される可能性を有する抗原特異的制御性Ｔ細胞を特定し富化するための、これらの組成物および方法の使用を提供する。
幾つかの実施形態においては、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または循環Ｔ細胞から腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を特定するための方法を提供し、該方法は、（ａ）標識に結合したドナー糖ヌクレオチドの存在下、Ｔ細胞の集団を修飾樹状細胞と接触させ、ここで、（ｉ）修飾樹状細胞は、その細胞表面上に、ドナー糖ヌクレオチドを使用してＴ細胞上の細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒しうる活性グリコシルトランスフェラーゼを含むように操作されており、（ｉ）修飾樹状細胞は１以上の腫瘍抗原でプライミングされており、（ｂ）接触後、Ｔ細胞の集団の細胞表面を分析して、標識が存在するかどうかを決定することを含み、ここで、Ｔ細胞の細胞表面上の標識の存在は、Ｔ細胞が、前記の１以上の腫瘍抗原のうちの少なくとも１つに対する特異性を有するＴＳＡ反応性Ｔ細胞であることを示す。幾つかの実施形態においては、分析は、標識を含む細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって富化することを含む。幾つかの実施形態においては、分析は、標識を含む細胞が、ＴＳＡ反応性を示す他のマーカーを更に含むかどうかを決定することを更に含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、ＴＳＡ反応性を示す他のマーカーを含む細胞をＦＡＣＳによって富化することを更に含む。幾つかの実施形態においては、他のマーカーは、ＰＤ－１発現、ＣＤ１３４発現およびＣＤ１３７発現の１以上を含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、他のマーカー、例えばＣＸＣＲ５発現および／またはＴＩＭ３発現に関する発現プロファイルに基づいて、タグ付きＴＳＡ反応性Ｔ細胞を富化することを含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、標識とＰＤ－１発現との両方を含む細胞を富化することを含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋発現を含む細胞を富化することを更に含む。幾つかの実施形態においては、標識を含み、ＣＤ８＋発現とＰＤ－１＋発現との両方を示す任意の細胞は、ＴＳＡ反応性細胞傷害性Ｔ細胞である。幾つかの実施形態においては、標識を含み、ＣＤ４＋発現とＰＤ－１＋発現との両方を示す任意の細胞は、ＴＳＡ反応性ヘルパーＴ細胞である。幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞上に存在する標識の規模は、Ｔ細胞の表面上で発現されるＴ細胞受容体の、ＴＳＡに対する結合アフィニティを示す。幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞上に存在する標識の規模は、ＴＳＡを発現する他の細胞を殺傷する富化Ｔ細胞の能力および／またはＴＳＡの存在下で活性化される富化Ｔ細胞の能力を示す。幾つかの実施形態においては、該方法は、細胞により発現されるＴＳＡ特異的ＴＣＲを特定するために、単一細胞Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列決定により、細胞表面上に標識を有する細胞を配列決定することを更に含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、患者特異的免疫細胞療法のために富化細胞を増殖させることを更に含む。幾つかの実施形態においては、修飾樹状細胞は、腫瘍抗原を含有する腫瘍ライセートでプライミングされている。幾つかの実施形態においては、腫瘍ライセートは、新生抗原を産生する腫瘍に由来する。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡは、黒色腫腫瘍、乳癌腫瘍から選択される腫瘍、ならびに毛様細胞性星状細胞腫、ＡＭＬ、ＡＬＬ、甲状腺、腎臓嫌色素、ＣＬＬ、髄芽腫、神経芽細胞腫、低悪性度神経膠腫、膠芽腫、前立腺、卵巣、骨髄腫、膵臓、腎乳頭、Ｂ細胞リンパ腫、腎明細胞、頭頸部、肝臓、子宮頸、子宮、膀胱、結腸直腸、肺小細胞、食道、胃、肺腺および肺扁平上皮の腫瘍からなる群から選択される腫瘍に由来する。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼはフコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼはヘリコバクターピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、ドナー糖ヌクレオチドはＧＤＰ－フコースである。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、ドナー糖ヌクレオチドはＣＭＰ－シアル酸である。幾つかの実施形態においては、標識は、小分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、化学的または生物学的なマーカーおよび／またはプローブから選択される。幾つかの実施形態においては、化学的または生物学的部分はビオチン、ビオチンプローブ、蛍光分子、蛍光分子を含むプローブ、色素、色素を含むプローブ、色素標識一本鎖ＤＮＡ、ＦＬＡＧタグまたはＳｔｒｅｐタグである。幾つかの実施形態においては、色素はＦＡＭまたはシアニン色素である。幾つかの実施形態においては、蛍光分子はＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５またはＣｙ７である。幾つかの実施形態においては、色素はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素またはＪａｎｅｌｉａ Ｆｌｕｏｒ色素である。幾つかの実施形態においては、細胞表面グリカンは、Ｇａｌ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリルＬａｃＮＡｃから選択される。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは第２ベイト（ｂａｉｔ）細胞に固有ではない。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは第２細胞の細胞表面に結合している。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは第２細胞の細胞表面に共有結合している。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは、第２細胞の表面上に存在する第２細胞表面グリカンに共有結合している。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼおよび第２細胞表面グリカンはグリコシル化反応により共有結合している。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは、リンカー部分を介して第２ドナー糖ヌクレオチドに結合している。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは第２ベイト細胞の細胞表面上で組換え的に発現される。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼの発現は条件的活性化プロモーターにより駆動される。幾つかの実施形態においては、条件的活性化プロモーターは外因性化合物の存在下で活性化される。幾つかの実施形態においては、外因性化合物は小分子またはポリペプチドである。幾つかの実施形態においては、該方法は完了に２週間未満を要する。幾つかの実施形態においては、該方法は、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞を富化する前にＴＳＡ候補を特定することを含まない。幾つかの実施形態においては、該方法は、富化Ｔ細胞からバイスタンダーＴ細胞を排除することを含む。
幾つかの実施形態においては、本開示は、第１プレイ（ｐｒｅｙ）細胞を標識でタグ付けするための方法を提供し、該方法は、標識に結合しているドナー糖ヌクレオチドの存在下、第１プレイ細胞を第２ベイト細胞と接触させることを含み、ここで、（ｉ）第１プレイ細胞は第１細胞表面グリカンを含み、第２ベイト細胞は、その細胞表面上に、ドナー糖ヌクレオチドを使用して第１細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒しうる活性グリコシルトランスフェラーゼを含み、（ｉｉ）第２ベイト細胞は、第１プレイ細胞と接触すると、ドナー糖ヌクレオチドを使用して第１細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒し、それにより、標識を第１プレイ細胞に結合させる。幾つかの実施形態においては、本開示は、細胞間相互作用を検出するための方法を提供し、該方法は、（ａ）標識に結合しているドナー糖ヌクレオチドの存在下、第１プレイ細胞を第２ベイト細胞と接触させ、ここで、第１プレイ細胞は第１細胞表面グリカンを含み、第２ベイト細胞は、その細胞表面上に、ドナー糖ヌクレオチドを使用して第１細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒しうる活性グリコシルトランスフェラーゼを含み、（ｂ）接触後、第１プレイ細胞を分析して、標識が第１プレイ細胞の細胞表面上に存在するかどうかを決定することを含み、ここで、第１プレイ細胞の細胞表面上の標識の存在は、第１プレイ細胞および第２ベイトが細胞間相互作用を受けたことを示す。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼはフコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼはヘリコバクターピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、ドナー糖ヌクレオチドはＧＤＰ－フコースである。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、ドナー糖はＣＭＰ－シアル酸である。幾つかの実施形態においては、標識は、小分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体から選択される。幾つかの実施形態においては、標識は化学的または生物学的なマーカーおよび／またはプローブである。幾つかの実施形態においては、化学的または生物学的部分はビオチンプローブ、蛍光分子、蛍光分子を含むプローブ、色素、色素を含むプローブ、色素標識一本鎖ＤＮＡ、ＦＬＡＧタグまたはＳｔｒｅｐタグである。幾つかの実施形態においては、色素はＦＡＭまたはシアニン色素である。幾つかの実施形態においては、標識はＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５またはＣｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素またはＪａｎｅｌｉａ Ｆｌｕｏｒ色素である。幾つかの実施形態においては、細胞表面グリカンは、Ｇａｌ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリルＬａｃＮＡｃから選択される。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは第２ベイト細胞に固有ではない。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは第２細胞の細胞表面に結合している。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは第２細胞の細胞表面に共有結合している。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは、第２細胞の表面上に存在する第２細胞表面グリカンに共有結合している。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼおよび第２細胞表面グリカンはグリコシル化反応により共有結合している。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼはリンカー部分を介して第２ドナー糖ヌクレオチドに結合している。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼは第２ベイト細胞の細胞表面上で組換え的に発現される。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼの発現は条件的活性化プロモーターにより駆動される。幾つかの実施形態においては、条件的活性化プロモーターは外因性化合物の存在下で活性化される。幾つかの実施形態においては、外因性化合物は小分子である。幾つかの実施形態においては、第１プレイ細胞はＴ細胞である。幾つかの実施形態においては、第１プレイ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である。幾つかの実施形態においては、第１ベイト細胞は未熟樹状細胞である。幾つかの実施形態においては、第１ベイト細胞はＢ細胞である。
幾つかの実施形態においては、本開示は、本明細書に開示されている方法により特定されるＴＳＡ特異的ＴＣＲまたはＴＣＲの抗原結合性部分を含む、ＴＣＲが操作された（以下、「ＴＣＲ操作」とも称されうる）Ｔ細胞を提供する。幾つかの実施形態においては、本開示は、癌の治療を要する患者にそのようなＴＣＲ操作Ｔ細胞を投与することを含む、癌の治療方法を提供する。
幾つかの実施形態においては、本開示は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を特定するための方法を提供し、該方法は、本明細書に開示されている方法によりＴＳＡ反応性Ｔ細胞を特定し、単一細胞Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列決定によりＴＳＡ特異的Ｔ細胞を配列決定して、該細胞により発現されるＴＳＡ特異的ＴＣＲを特定することを含む、
幾つかの実施形態においては、本開示は、本明細書に開示されている方法により特定または富化されたＴＳＡ反応性Ｔ細胞を、癌の治療を要する患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。
幾つかの実施形態においては、本開示は、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴと１以上の未熟樹状細胞（ｉＤＣ）とを含む組成物を提供する。
幾つかの実施形態においては、本開示は、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ－シアリルトランスフェラーゼと１以上の未熟樹状細胞（ｉＤＣ）とを含む組成物を提供する。
幾つかの実施形態においては、本開示は、細胞表面に結合したフコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを有するように操作された未熟樹状細胞を含む組成物を提供する。幾つかの実施形態においては、樹状細胞は抗原でプライミングされている。幾つかの実施形態においては、樹状細胞は腫瘍抗原でプライミングされている。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼは、未熟樹状細胞をそのような組成物と接触させることを含む方法により、未熟樹状細胞の細胞表面に結合される。
幾つかの実施形態においては、本開示は、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞を増殖させるための方法を提供し、該方法は、本明細書に開示されている接触誘発性相互作用依存的標識法を行うこと；標識細胞をＦＡＣＳ選別して、標識と１以上のＰＤ－１、ＣＤ１３４またはＣＤ１３７マーカーとを共発現する細胞を富化すること；ならびに照射同種異系フィーダー細胞、ＩＬ－２およびＯＫＴ３抗体の存在下、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）条件で低濃度で該細胞を培養することにより、該細胞を増殖させることを含む。
幾つかの実施形態においては、本開示は、ＴＣＲが操作されたＴ細胞（ＴＣＲ－Ｔ）の構築のための方法を提供し、該方法は、本明細書に開示されている接触誘発性相互作用依存的標識法を行うことによりＴＳＡ反応性Ｔ細胞を特定すること；ＴＳＡ反応性Ｔ細胞を単離すること；およびＴＳＡ反応性Ｔ細胞をインビトロで１以上のサイトカインと接触させてＴＳＡ反応性Ｔ細胞の増殖を促進させることを含み、ここで、所望により、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）条件を利用することにより該増殖を誘導してもよく、ここで、照射同種異系フィーダー細胞、３，０００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２および抗ＣＤ３ε（ＯＫＴ３）の存在下、選別Ｔ細胞を９６ウェルプレート内で３細胞／ウェルで培養する。幾つかの実施形態においては、単離はＦＡＣＳによるものである。
幾つかの実施形態においては、本開示は、組織浸潤リンパ球（ＴｉＩＬ）または循環Ｔ細胞から抗原反応性Ｔ細胞を特定するための方法を提供し、該方法は、（ａ）ＴｉＩＬまたは循環Ｔ細胞から得られたＴ細胞の集団を、標識に結合したドナー糖ヌクレオチドの存在下、修飾樹状細胞と接触させ、ここで、（ｉ）修飾樹状細胞は、その細胞表面上に、ドナー糖ヌクレオチドを使用してＴ細胞上の細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒しうる活性グリコシルトランスフェラーゼを含むように操作されており、（ｉｉ）修飾樹状細胞は１以上の抗原でプライミングされており、（ｂ）接触後、Ｔ細胞の集団の細胞表面を分析して、標識が存在するかどうかを決定することを含み、ここで、Ｔ細胞の集団におけるＴ細胞の細胞表面上の標識の存在は、Ｔ細胞が、樹状細胞をプライミングするのに使用した抗原の１以上のうちの少なくとも１つに対する特異性を有する抗原反応性Ｔ細胞であることを示す。幾つかの実施形態においては、抗原は病原体に由来する。幾つかの実施形態においては、抗原はウイルス抗原または細菌抗原である。
幾つかの実施形態においては、本開示は、第１ Ｔ細胞および１以上の第２ Ｔ細胞上で発現されるそれぞれ第１ ＴＣＲおよび１以上の第２ ＴＣＲの抗原に対する相対的結合アフィニティを決定するための方法を提供し、該方法は、（ｉ）本明細書に開示されている接触誘発性相互作用依存的標識法を行い、（ｉｉ）第１ Ｔ細胞および各第２ Ｔ細胞に転移された標識のレベルを定量し、転移された標識のレベルにより細胞のアフィニティをランク付けすることを含み、ここで、最も多い標識を含有するＴ細胞は、該抗原に対する最も高いアフィニティを有するＴ細胞であり、最も少ない標識を含有するＴ細胞は、抗原に対する最も低いアフィニティを有するＴ細胞であり、中間レベルの標識を有するＴ細胞は、該抗原に対する対応する中間レベルのアフィニティを有する。幾つかの実施形態においては、標識はビオチンである。幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞のそれぞれにおける標識の相対量は、抗原を発現する細胞を殺傷するＴ細胞の有効性に対応する。幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞のそれぞれにおける標識の相対量は、抗原への曝露に応答してＩＦＮγを産生するＴ細胞の有効性に対応する。
幾つかの実施形態においては、本開示は、組織浸潤リンパ球（ＴｉＩＬ）または循環Ｔ細胞の集団に存在する自己反応性Ｔ細胞を特定し富化するための方法を提供し、該方法は、樹状細胞を準備すること；樹状細胞を１以上の自己抗原または１以上の自己抗原の供給源と共にインキュベートして、樹状細胞を１以上の自己抗原でプライミングすること；樹状細胞を、その細胞表面上で、プレイ細胞上の相互作用依存的標識反応を触媒するための適切な酵素と結合させること；ベイト細胞をＴｉＩＬの集団と接触させること（ここで、該集団は少なくとも１つの自己反応性Ｔ細胞を含み、接触を酵素のタグ付き基質の存在下で行う）を含む。幾つかの実施形態においては、本開示は、組織浸潤リンパ球（ＴｉＩＬ）または循環Ｔ細胞の集団に存在する自己反応性Ｔ細胞を特定し富化するための方法を提供し、該方法は、プレイ細胞上の相互作用依存的標識反応を触媒するための適切な酵素が樹状細胞表面上に結合している樹状細胞を準備すること；樹状細胞を１以上の自己抗原または１以上の自己抗原の供給源と共にインキュベートして、樹状細胞を１以上の自己抗原でプライミングすること；ベイト細胞をＴｉＩＬの集団と接触させること（ここで、該集団は少なくとも１つの自己反応性Ｔ細胞を含み、該接触を酵素のタグ付き基質の存在下で行う）を含む。幾つかの実施形態においては、１以上の自己抗原の供給源は、自己免疫疾患を有する対象からの罹患組織生検から調製された細胞ライセートである。幾つかの実施形態においては、細胞の集団に含まれるＴ細胞は、自己免疫疾患を有する対象からの罹患組織生検から、または患者から採取された自己ＰＢＭＣから得られる。幾つかの実施形態においては、酵素は、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼから選択される。幾つかの実施形態においては、酵素はα１，３フコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、酵素はヘリコバクターピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼである。
幾つかの実施形態においては、本開示は、組織浸潤リンパ球（ＴｉＩＬ）または循環Ｔ細胞の集団に存在する抗原反応性Ｔ細胞を特定するための方法を提供し、該方法は、（ａ）樹状細胞を準備すること；（ｂ）樹状細胞を１以上の抗原または１以上の抗原の供給源と共にインキュベートして、樹状細胞を該抗原の１以上でプライミングすること；（ｃ）樹状細胞を、その細胞表面上で、プレイ細胞上の相互作用依存的標識反応を触媒するための適切な酵素と結合させること（ここで、該結合はインキュベーション工程（ｂ）の前または後に行われる）；（ｄ）結合工程（ｃ）の後、樹状細胞をＴｉＩＬまたは循環Ｔ細胞の集団と接触させること（ここで、該集団は少なくとも１つの抗原反応性Ｔ細胞を含み、該接触を該酵素の基質の存在下で行い、該基質は、検出可能なタグを含む）；（ｅ）タグを含む細胞を検出し、それにより、抗原反応性Ｔ細胞を特定することを含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、タグを含む細胞を富化することを含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、タグを含む単一細胞を単離することを含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、タグを含む細胞を増殖させることを含む。幾つかの実施形態においては、酵素はソルターゼであり、基質は、ソルターゼ認識配列とタグとを含むペプチドである。幾つかの実施形態においては、酵素は、ソルターゼＡ：（５Ｍ）およびｍｇＳｒｔＡから選択されるソルターゼである。幾つかの実施形態においては、酵素はソルターゼＡであり、基質は、ソルターゼ認識配列とタグとを含むペプチドである。幾つかの実施形態においては、ソルターゼ認識配列は、ＬＰＸＴＸ（配列番号４）（ここで、Ｘの各存在は、独立して、任意のアミノ酸残基を表す）、ＬＰＫＴＧ（配列番号８）、ＬＰＡＴＧ（配列番号９）、ＬＰＮＴＧ（配列番号１０）、ＬＰＥＴＧ（配列番号５）、ＬＰＸＡＧ（配列番号１１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す）、ＬＰＮＡＧ（配列番号１２）、ＬＰＸＴＡ（配列番号１３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す）、ＬＰＮＴＡ（配列番号１４）、ＬＧＸＴＧ（配列番号１５）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す）、ＬＧＡＴＧ（配列番号１６）、ＩＰＸＴＧ（配列番号１７）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す）、ＩＰＮＴＧ（配列番号１８）およびＩＰＥＴＧ（配列番号１９）から選択される。幾つかの実施形態においては、酵素は無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ビオチンリガーゼであり、基質はビオチンである。幾つかの実施形態においては、無差別ビオチンリガーゼは、ＴｕｒｂｏＩＤ、ｍｉｎｉＴｕｒｂｏ、ＢｉｏＩＤおよびＢｉｏＩＤ２から選択される。幾つかの実施形態においては、酵素はグリコシルトランスフェラーゼであり、基質は標識ドナー糖ヌクレオチドである。幾つかの実施形態においては、酵素はフコシルトランスフェラーゼであり、基質はタグ付きＧＤＰ－フコースである。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、酵素はシアリルトランスフェラーゼであり、基質はタグ付きＣＭＰ－ＮｅｕＡｃである。幾つかの実施形態においては、該方法は、タグを含む細胞が、ＴＳＡ反応性を示す他のマーカーを更に含むかどうかを決定することを更に含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、ＴＳＡ反応性を示す他のマーカーが存在する場合には該マーカーを含む細胞をＦＡＣＳによって富化することを更に含む。幾つかの実施形態においては、他のマーカーはＰＤ－１発現、ＣＤ１３４発現およびＣＤ１３７発現の１以上を含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、タグとＰＤ－１発現との両方を含む細胞を富化することを含む。幾つかの実施形態においては、該方法は、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋発現を含む細胞を富化することを更に含む。幾つかの実施形態においては、タグは、ビオチン、蛍光分子、色素、ＦＡＭ色素、シアニン色素、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素およびＪａｎｅｌｉａ Ｆｌｕｏｒ色素から選択される。
幾つかの実施形態においては、本開示は、野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαとＶβとを含む操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、ＶαおよびＶβのそれぞれは相補性決定領域１（ＣＤＲ－１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ－２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ－３）を含み、ここで、Ｖα ＣＤＲ－３は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Figure 2022535045000002
幾つかの実施形態においては、本開示は、前段落に開示されているＴＣＲまたはその抗原結合性フラグメントを発現するＴ細胞を提供する。幾つかの実施形態においては、本開示は、前段落に開示されているＴＣＲまたはその抗原結合性フラグメントを発現するＴ細胞を含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は１以上の担体、塩、ビヒクルおよび／または賦形剤を更に含む。
幾つかの実施形態においては、本開示は、野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαとＶβとを含むＴＳＡ特異的ＴＣＲを含む単鎖Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供し、ここで、ＶαおよびＶβのそれぞれは相補性決定領域１（ＣＤＲ－１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ－２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ－３）を含み、ここで、Ｖα ＣＤＲ－３は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Figure 2022535045000003
幾つかの実施形態においては、本開示は、前段落に開示されている単鎖ＴＣＲを含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は１以上の担体、塩、ビヒクルおよび／または賦形剤を更に含む。
幾つかの実施形態においては、本開示は、野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαとＶβとを含む操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、ＶαおよびＶβのそれぞれは相補性決定領域１（ＣＤＲ－１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ－２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ－３）を含み、ここで、Ｖα ＣＤＲ－３は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Figure 2022535045000004
幾つかの実施形態においては、本開示は、野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαとＶβとを含むＴＳＡ特異的ＴＣＲを含む二重特異性ＴＣＲを提供し、ここで、ＶαおよびＶβのそれぞれは相補性決定領域１（ＣＤＲ－１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ－２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ－３）を含み、ここで、Ｖα ＣＤＲ－３は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Figure 2022535045000005
幾つかの実施形態においては、本開示は、前段落に開示されている二重特異性を含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施形態においては、医薬組成物は１以上の担体、塩、ビヒクルおよび／または賦形剤を更に含む。
幾つかの実施形態においては、本開示は、ドナー糖ヌクレオチドを介して間接的に細胞表面に結合した標識を含む１以上の腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を含む組成物を提供する。幾つかの実施形態においては、ドナー糖ヌクレオチドはグリコシル化によりＴＳＡ反応性Ｔ細胞に結合している。幾つかの実施形態においては、グリコシル化はグリコシルトランスフェラーゼによりもたらされた。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼはフコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼはα１，３フコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼはヘリコバクターピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、ドナー糖ヌクレオチドはＧＤＰ－フコースである。幾つかの実施形態においては、グリコシルトランスフェラーゼはシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、ドナー糖ヌクレオチドはＣＭＰ－シアル酸である。幾つかの実施形態においては、標識は、小分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、化学的または生物学的なマーカーおよび／またはプローブから選択される。幾つかの実施形態においては、化学的または生物学的部分はビオチン、ビオチンプローブ、蛍光分子、蛍光分子を含むプローブ、色素、色素を含むプローブ、色素標識一本鎖ＤＮＡ、ＦＬＡＧタグまたはＳｔｒｅｐタグである。幾つかの実施形態においては、色素はＦＡＭまたはシアニン色素である。幾つかの実施形態においては、蛍光分子はＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５またはＣｙ７である。幾つかの実施形態においては、色素はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素またはＪａｎｅｌｉａ Ｆｌｕｏｒ色素である。幾つかの実施形態においては、標識はＴＳＡ反応性Ｔ細胞上の細胞表面グリカンに結合している。幾つかの実施形態においては、細胞表面グリカンは、Ｇａｌ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリルＬａｃＮＡｃから選択される。幾つかの実施形態においては、本開示は、前記またはここに記載されている標識を含む１以上の腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を含む任意のそのような組成物の組成物からインビトロで増殖されたＴＳＡ反応性Ｔ細胞の集団を含む組成物を提供する。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は、１以上のサイトカインの存在下で該Ｔ細胞を培養することによりインビトロで増殖された。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は、１以上のサイトカインの存在下で該Ｔ細胞を培養することによりインビトロで増殖される。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は、以下を含む方法により増殖された：
ａ．標識に結合したドナー糖ヌクレオチドの存在下、Ｔ細胞の集団を修飾樹状細胞と接触させる；
ｉ．ここで、修飾樹状細胞は、その細胞表面上に、ドナー糖ヌクレオチドを使用してＴ細胞上の細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒しうる活性グリコシルトランスフェラーゼを含むように操作されており、
ｉｉ．ここで、修飾樹状細胞は１以上の腫瘍抗原でプライミングされている；ならびに
ｂ．接触後、Ｔ細胞の集団の細胞表面をＦＡＣＳにより分析して、標識が存在するかどうかを決定する；
ｃ．標識細胞を選別して、標識と１以上のＰＤ－１、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＸＣＲ５またはＴＩＭ３マーカーとを共発現する細胞を富化する；ならびに
ｄ．該細胞を、照射同種異系フィーダー細胞、ＩＬ－２およびＯＫＴ３抗体の存在下、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）条件で低濃度で培養することにより、該細胞を増殖させる。
幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は、以下を含む方法により増殖される：
ｅ．標識に結合したドナー糖ヌクレオチドの存在下、Ｔ細胞の集団を修飾樹状細胞と接触させる；
ｉ．ここで、修飾樹状細胞は、その細胞表面上に、ドナー糖ヌクレオチドを使用してＴ細胞上の細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒しうる活性グリコシルトランスフェラーゼを含むように操作されており、
ｉｉ．ここで、修飾樹状細胞は１以上の腫瘍抗原でプライミングされている；ならびに
ｆ．接触後、Ｔ細胞の集団の細胞表面を分析して、標識が存在するかどうかを決定する；
ここで、Ｔ細胞の細胞表面上の標識の存在は、Ｔ細胞が、該腫瘍抗原の１以上のうちの少なくとも１つに対する特異性を有するＴＳＡ反応性Ｔ細胞であることを示す；１以上のＴＳＡ反応性Ｔ細胞を単離する；およびＴＳＡ反応性Ｔ細胞をインビトロで１以上のサイトカインと接触させてＴＳＡ反応性Ｔ細胞の増殖を促進させる；ここで、所望により、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）条件を利用することにより該増殖を誘導してもよく、ここで、照射同種異系フィーダー細胞、３，０００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２および抗ＣＤ３ε（ＯＫＴ３）の存在下、選別Ｔ細胞を９６ウェルプレート内で３細胞／ウェルで培養する。幾つかの実施形態においては、単離はＦＡＣＳによるものである。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞またはＴ細胞組成物は患者特異的免疫細胞療法に使用するためのものである。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は癌の治療に使用するためのものである。幾つかの実施形態においては、癌は、黒色腫、乳癌および毛様細胞性星状細胞腫、ＡＭＬ、ＡＬＬ、甲状腺癌、腎臓嫌色素、ＣＬＬ、髄芽腫、神経芽細胞腫、低悪性度神経膠腫、膠芽腫、前立腺癌、卵巣癌、骨髄腫、膵臓癌、腎乳頭癌、リンパ腫、Ｂ細胞癌、腎明細胞癌、頭頸部癌、肝臓癌、子宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、結腸直腸癌、肺小細胞癌、食道癌、胃癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌から選択される。
図１は、フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）媒介性グリカン編集によって例示された、グリコシルトランスフェラーゼ媒介性細胞表面操作の適用を示す。図１Ａは、ヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼを使用する細胞表面グリカン操作を示す。図１Ｂは、ＦＴ機能化細胞Ａによる細胞間近接標識の方法を示す。 図２は細胞表面上のＦＴの結合を示す。図２Ａはフコシル化による細胞表面上のＦＴの結合のためのスキームを示す。ＸおよびＹは、カップリング化学、例えば共有結合相互作用（例えば、クリックケミストリー）によって互いに化学的に結合しうる任意の２つの部分を表す。図２Ｂの左パネルは、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）で室温で３０分間処理されたＣＨＯ細胞の細胞表面上にＦＴが存在することのフローサイトメトリーによる確認を示す。抗Ｈｉｓ－ＰＥ抗体を使用して細胞をプローブした（ＦＴはＨｉｓタグを有する）。対照は、未処理ＣＨＯ細胞、遊離ＦＴで処理されたＣＨＯ細胞、およびＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴで処理されたＬｅｃ８細胞（これは膜ＬａｃＮＡｃを発現しない）を含み、これらの全てはバックグラウンドシグナルしか生成しない。図２Ｂの右パネルは、種々の濃度のＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴでＣＨＯ細胞を処理した後のＣＨＯ細胞表面上に存在するＦＴの定量を示す。０．２０ｍｇ／ｍＬを飽和濃度と決定した。図２Ｃは、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞および樹状細胞（ＤＣ）を含む種々の細胞にＦＴが頑強に結合しうることを示す。図２Ｄの左パネルはＦＴ標識細胞の蛍光ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析を示す。１つの細胞表面に結合したＦＴ分子の数を定量するための実験において、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で修飾されたＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴ分子を使用した。図２Ｄの右パネルは左パネルからのゲルのクーマシーブルー染色を示す。 図３Ａおよび３Ｂは細胞表面上のＦＴの減衰を示し、ＦＴ修飾が細胞増殖／生存率に影響を及ぼさないことを示す。図３Ａは種々の時点における細胞表面上のＦＴの減衰を示す。図３Ｂは、修飾ＣＤ８＋ Ｔ－ＦＴ細胞の生存率（右パネル）が未修飾ＣＤ８＋ Ｔ細胞の生存率（左パネル）と同じであることを、フローサイトメトリー分析により示している。活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ－ＦＴ結合体を６時間インキュベートし、ＤＡＰＩで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。Ｙ軸：ＤＡＰＩシグナル。Ｘ軸：前方散乱光（ＦＳＣ）シグナル。図３Ｃは未熟ＤＣ（ｉＤＣ）およびＦＴ修飾未熟ＤＣ（ｉＤＣ－ＦＴ）の抗原提示能力の比較を示す。フローサイトメトリー分析のために、細胞混合物を抗ｍＣＤ４５．１－ＦＩＣＴ、抗ｍＣＤ８ａ－ＰＢおよび抗ｍＣＤ６９－ＰＥで染色した。これは、ｉＤＣのＦＴ機能化がＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＤ６９のｉＤＣ媒介性アップレギュレーションに影響を及ぼさなかったことを示している。３つの重複実験からの代表的なフローサイトメトリーの図が示されている。 図４は、ＦＴ機能化ＣＨＯ細胞が接触細胞を標識しうることを示す。図４Ａは実験方法の例示図を示す。図４Ｂ：顕微鏡イメージングは以下のことを明らかに示している：（１）全ての細胞Ｂ（例１および２のそれぞれにおける緑色の右上の細胞）は膜（赤）上に頑強に標識された；（２）細胞Ｂと接触していない細胞Ａ（例１および２のそれぞれにおける左下の細胞）は標識されなかったが（例２）、細胞Ｂと接触している細胞Ａは細胞間接触領域において選択的に標識された（例１）。対照的に、遊離ＦＴの処理は全ての細胞の非選択的標識をもたらした（データは示していない）。 図５は、エクスビボでＤＣ－ＣＤ８＋ Ｔ細胞相互作用を検出するためのプローブとしてＦＴ結合樹状細胞（ＤＣ）を使用するための方法を示す。図５Ａは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ Ｎ４ペプチド（ＯＶＡ２５７－２６４）（配列番号６９）でパルスされたＦＴ修飾ＤＣが、その抗原に特異的なトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞を特異的に標識するためにどのように使用されうるのかの例示図を示す。一方、異なる抗原［ＧＰ３３－４１；ペプチドＫＡＶＹＮＦＡＴＭ（配列番号７５）；これはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）糖タンパク質に由来する］でパルスされたＦＴ修飾ＤＣは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ Ｎ４ペプチド（配列番号６９）に特異的なＴＣＲを発現するナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞を標識しない。図５Ｂは、ＦＴの基質であるビオチン化ＧＤＰ－フコースを使用してＤＣ－ＣＤ８＋ Ｔ細胞相互作用を検出する実験的方法を示す。図５Ｃは、図５Ａおよび５Ｂに記載されている方法に従い作製されたＦＴ結合ＤＣにビオチン化ＧＤＰ－フコースの存在下で接触したＣＤ８＋ Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。Ｔ細胞上に存在するビオチン標識に結合するＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７－ストレプトアビジンでＴ細胞を染色した。図５Ｄは、図５Ｃに示されているのに類似した実験のフローサイトメトリー分析を示す。ただし、この場合には、元のＯＴ－Ｉ Ｎ４リガンドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号６９）に由来する２つの追加的な改変ペプチドリガンド（ＡＰＬ）であるＳＡＩＮＦＥＫＬ（Ａ２）（配列番号７０）およびＳＩＩＴＦＥＫＬ（Ｔ４）（配列番号７１）もＦＴ結合ＤＣのプライミングに使用した。これらのＡＰＬは、Ｎ４と同様にＭＨＣ－Ｉ Ｈ－２Ｋｂに良好に結合するが、トランスジェニックＴＣＲと相互作用するそれらの能力において異なる（結合強度：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｎ４）（配列番号６９）＞ＳＡＩＮＦＥＫＬ（Ａ２）（配列番号７０）＞ＳＩＩＴＦＥＫＬ（Ｔ４）（配列番号７１））。図５Ｅは、図５Ｄに示されているフローサイトメトリーの結果の定量を示す。図５Ｆは、図５Ｂに示されているのと同じ実験のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ただし、この場合には、図５Ｂにおいて使用したＯＴ－１マウス脾細胞の代わりにＯＴ－ＩＩマウス脾細胞を使用した。ＯＴ－ＩＩマウスからのＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＯＶＡ３２３－３３９ペプチドに特異的なＴＣＲを発現するが、ＬＣＭＶ Ｇｐ６１－８０ペプチドＧＬＮＧＰＤＩＹＫＧＶＹＱＦＫＳＶＥＦＤ（配列番号７２）に特異的なＴＣＲを発現しない。図５Ｇは、ＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１またはＯＶＡ２５７－２６４でプライミングされたｉＤＣ－ＦＴと共にインキュベートした場合の、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＰ１４ ＣＤ８＋ Ｔ細胞との混合物における抗原特異的Ｆｕｃビオチン化のフローサイトメトリー分析を示す。全ての図において、平均±ＳＤ（ｎ＝３）；ｎｓ、Ｐ＞０．０５；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析およびそれに続くテューキー（Ｔｕｋｅｙ）の多重比較検定；二元配置分散分析およびそれに続くシダック（Ｓｉｄａｋ）の多重比較検定。図５Ｈは図５Ａからの結果の定量を示す。図５Ｉは、種々のｉＤＣ／Ｔ細胞比におけるＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の抗原特異的Ｆｕｃ－ビオチン化を示すフローサイトメトリー分析を示す。３つの独立した実験からの代表的な図。図５Ｊ～５ＬはｉＤＣ－ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ共培養系におけるＦｕｃｏＩＤ条件の最適化を示す。図５Ｊは、種々の量のＦＴで固着（アンカー）されたｉＤＣによるＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の抗原特異的フコシルビオチン化の代表的フローサイトメトリー分析、および該フローサイトメトリー分析の棒グラフ定量を示す。フローサイトメトリー分析のために、細胞を抗ｍＣＤ４５．１－ＦＩＴＣ、抗ｍＣＤ８ａ－ＰＢおよびストレプトアビジン－ＡＰＣで染色した。図５Ｋは、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチンを添加する前の種々の共培養時間でのｉＤＣ－ＦＴによるＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の抗原特異的ビオチン化の代表的フローサイトメトリー分析、および該フローサイトメトリー分析の棒グラフ定量を示す。フローサイトメトリー分析のために、細胞を抗ｍＣＤ４５．１－ＦＩＴＣ、抗ｍＣＤ８ａ－ＰＢおよびストレプトアビジン－ＡＰＣで染色した。図５Ｌは、ｉＤＣ－ＦＴによるＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞のビオチン化の抗原用量依存的曲線のフローサイトメトリー分析、ならびにＯＶＡ２５７－２６４の示されている各濃度におけるビオチン＋およびＣＤ８＋であった細胞の割合と、試験濃度におけるビオチン標識の総ＭＦＩとを示す、フローサイトメトリー分析の折れ線グラフ定量を示す。実験手順は、示されている量のＯＶＡ２５７－２６４でｉＤＣ－ＦＴをパルスしたこと以外は、図５Ｂに示されている。全ての図において、平均±ＳＤ（ｎ＝３）；ｎｓ、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；二元配置分散分析およびそれに続くシダックの多重比較検定。 図６は、ＤＣとＴ細胞との間の特異的ビオチン化がトロゴサイトーシス（結合中の提示細胞とリンパ球と間の細胞膜断片の双方向転移）により引き起こされないことを示す。図６Ａは、ＦＴ（ＦＴはＨｉｓ６タグ付き組換えタンパク質として発現された）またはＦｕｃ－Ｂｉｏがトロゴサイトーシスにより転移されるかどうかを決定するための実験計画を示す。図６Ｂは、近接に基づく（以下、「近接ベース」と称される）ビオチン化（左）またはトロゴサイトーシス［Ｆｕｃ－Ｂｉｏ転移（中）、またはＦＴ－Ｈｉｓの転移（右）］により標識されたＴ細胞のヒストグラムを示す。ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＯＶＡ２５７－２６４でプライミングされたＤＣ－ＦＴ（左パネル）により、近接ベースビオチン化を介して頑強に標識された。対照的に、細胞表面上でビオチンで前標識された、ＯＶＡ２５７－２６４でプライミングされたＤＣと共培養されたＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞においては、特異的ビオチン化シグナルは検出されなかった（中央パネル）。また、ＤＣ上に標識されたＦＴはトロゴサイトーシスによりＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞表面に転移されなかった（右パネル）。このことは、無視しうる量のＦｕｃ－ＢｉｏまたはＦＴ－Ｈｉｓがトロゴサイトーシスにより転移されたに過ぎないことを示している。 図７は、ＦＴ結合樹状細胞（ＤＣ）がインビボでのＤＣ－ＣＤ８＋ Ｔ細胞相互作用の検出のためのプローブとして使用されうることを示す。図７Ａは、ＦＴの基質であるビオチン化ＧＤＰ－フコースを使用してインビボでＤＣ－ＣＤ８＋ Ｔ細胞相互作用を検出する実験方法の例示図を示す。図７Ｂはフローサイトメトリーの結果の定量を示す。これが示すところによると、ＳＩＩＴＦＥＫＬ Ｎ４（配列番号７１）でパルスされたＤＣ－ＦＴは、リンパ節と脾臓との両方において、ドナーマウスからのナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞と選択的に相互作用し、該Ｔ細胞を標識することが可能であったが、これは対照ＤＣ、およびＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１でパルスされたＤＣ－ＦＴにおいては観察されなかった。図７の全ての図において、ｎｓ Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析およびそれに続くテューキーの多重比較検定。 図８は、Ｂ１６黒色腫（Ｏｖｅｒｗｉｊｋ，Ｗ．Ｗ．；Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００１，Ｃｈａｐｔｅｒ ２０，Ｕｎｉｔ ２０ ２１）における浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から腫瘍反応性Ｔ細胞を検出し単離するためのプローブとして、ＦＴ機能化ＤＣが使用されうることを示す。図８Ａは、腫瘍ライセートで前処理されたＤＣ－ＦＴを使用して腫瘍反応性Ｔ細胞を検出し単離する、ＦＡＣＳに基づく実験方法の例示図を示す。ＤＣ－ＦＴ細胞は腫瘍ライセートからの新生抗原を提示することが可能であり、ついで、新生抗原特異的ＴＣＲを含有するＴ細胞との免疫シナプスの形成に際して、Ｔ細胞の相互作用に基づくビオチンのタグ付けが生じる。このようにして、新生抗原特異的Ｔ細胞のごく一部が更なる分析のために選択される。図８ＢはＢ１６黒色腫のＴＩＬからの腫瘍反応性Ｔ細胞の単離の直接検出のためのワークフローを示す。図８Ｃは、図８Ｂに記載されている実験からのＦＡＣＳデータを示し、ここでは、プライミングされたＤＣ－ＦＴ細胞と実際に相互作用するＴＳＡ反応性Ｔ細胞を特定し選別するために、腫瘍特異的抗原ＴＳＡ反応性Ｔ細胞マーカーＰＤ－１およびビオチン標識のためにＣＤ８＋ Ｔ細胞を標識した。図８Ｄは、図８Ｃに記載されている実験から選別された細胞を使用したエクスビボ腫瘍殺傷アッセイの結果を示す。ビオチン＋（赤）およびビオチン－（青）ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＦＡＣＳにより選別し、Ｔ細胞培地（ＩＬ２：１００ ＩＵ／ｍＬ）内でＩＬ－２と共に１２時間培養し、ついでＢ１６黒色腫細胞（ホタルルシフェラーゼが安定に導入されたもの）を選別ＣＤ８＋ Ｔ細胞と共に１：４の比で２０時間共培養した。ついでＢ１６腫瘍の殺傷をルシフェラーゼ活性により定量した。図８Ｅは、ヒト黒色腫抗原ｇｐ１００（ＫＶＰＲＮＱＤＷＬ、配列番号７３）のアミノ酸２５～３３の断片（ＧＰ１００２５－３３としても公知である）または腫瘍ライセートでパルスされたＤＣとの共培養の後のＩＦＮγ分泌に基づく、図８Ｄに記載されているとおりに増殖された細胞の腫瘍反応性を評価するための、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いた追跡実験を示す。図８の全ての図において、ｎｓ Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析およびそれに続くテューキーの多重比較検定。 図９は、トリプルネガティブ乳房腫瘍Ｅ０７７１における浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から腫瘍反応性Ｔ細胞を検出し単離するためのプローブとして、ＦＴ機能化ＤＣが使用されうることを示す。図９Ａは、腫瘍ライセートで前処理されたＤＣ－ＦＴを使用してＥ０７７１腫瘍のＴＩＬから腫瘍反応性Ｔ細胞を直接検出し単離するための、ＦＡＣＳに基づくワークフローの例示図を示す。図９ＢはＦＡＣＳの結果を示し、これは、Ｅ０７７１腫瘍ライセートでプライミングされたＤＣ－ＦＴが１７．３％のＣＤ８＋ ＴＩＬを特異的に標識したこと、およびこれらの細胞が全てがＰＤ－１＋であることを示している。対照的に、無抗原、ＯＶＡ２５７－２６４および健常乳腺ライセートで処理されたＤＣ－ＦＴはＣＤ８＋ ＴＩＬへの最小限度のビオチン化をもたらした。図９Ｃは、図９Ｂに記載されている実験に従い単離された増殖細胞を使用したエクスビボ腫瘍殺傷アッセイ（細胞溶解）の結果を示す。図９Ｄは、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、無抗原またはＯＶＡ２５７－２６４、腫瘍ライセートまたは腫瘍ライセート＋抗マウスＭＨＣＩでパルスされたＤＣとの共培養の後のＩＦＮγ分泌に基づく、図９Ｂに記載されている実験に従い単離された増殖細胞の腫瘍反応性を示す。全ての図において、ｎｓ Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析およびそれに続くテューキーの多重比較検定。図９ＥはＭＣ３８結腸癌モデルにおけるＣＤ８＋ ＴＩＬの腫瘍抗原依存的Ｆｕｃ－ビオチン化の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図９Ｆは、１：１のエフェクター対標的比におけるＭＣ３８癌細胞に対する増殖全ＰＤ－１＋ ＴＩＬおよびＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬの特異的細胞溶解反応性を示す（ｎ＝３）。図９Ｇは、ＭＣ３８腫瘍抗原再刺激時の増殖ＰＤ－１－、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－およびＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬの顕著な反応性を示すＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴを示す（ｎ＝３）。 図１０は、酵素を細胞表面に結合させるための、フコシルトランスフェラーゼに基づく結合方法の汎用性を示し、結合の化学的手段も示す。図１０Ａ（左側）は、図２Ａ（方法１）に記載されている、フコシルトランスフェラーゼに基づく方法を使用して、任意の酵素を細胞表面に結合させるための方法を示す。図１０Ａ（右側）は、化学的結合に基づく方法（方法２）を使用して、任意の酵素を細胞表面に結合させるための方法を示す。図１０Ｂは、ストレプトアビジン－ＡＰＣを使用したフローサイトメトリー分析を示し、これは、方法１を使用して、ビオチン化ヒト２，６αシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｇａｌ１）が未熟ＤＣの表面に結合してＤＣ－ＳＴ６Ｇａｌ１結合体を形成したことを証明している。図１０Ｃは、抗ｈｉｓタグ－フィコエリトリン（ＰＥ）を使用したフローサイトメトリー分析を示し、これは、方法１を使用して、Ｈｉｓタグ付きヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）、Ｈｉｓタグ付きヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）およびＨｉｓタグ付きソルターゼＡ（５Ｍ）が未熟ＤＣの表面に結合して、それぞれ、ＤＣ－ＦＴ結合体およびＤＣ－ソルターゼ結合体を形成したことを証明している。図１０Ｄは、抗ｈｉｓタグ－フィコエリトリン（ＰＥ）を使用したフローサイトメトリー分析を示し、これは、方法２の化学的結合を用いて、Ｈｉｓタグ付きヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）およびヘリコバクター・ピロリα１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（（１，３／４）ＦＴ）が未熟ＤＣの表面に結合して、ＤＣ－ＮＨＳ－ＦＴ結合体およびＤＣ－ＮＨＳ－（１，３／４）ＦＴ結合体を形成したことを証明している。図１０Ｅは、方法１および方法２により作製されたＤＣ－酵素結合体により誘導されたＤＣ－ＣＤ８＋ Ｔ細胞近接標識の比較を示す。図１０Ｅの上パネルはこの実験のワークフローを示す。図１０Ｅの下パネルは、抗ＣＤ８－パシフィックブルー、抗ＣＤ４５．１－ＦＩＴＣおよびストレプトアビジン－ＡＰＣで染色された細胞混合物のフローサイトメトリー分析を示す。 図１１は、例えば樹状細胞のようなベイト細胞におけるヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼの細胞表面発現を誘導するためのレンチウイルス発現ベクターの地図を示す。 図１２はＥ０７７１腫瘍（図１２Ａ）およびＭＣ３８腫瘍（図１２Ｂ）からのＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬおよびＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬの代表的なＴＣＲβ ＲＮＡ配列決定の結果を示す。プロットにおける各スポットはユニーク・クロノタイプＶＪ－ＣＤＲ３を表し、スポットのサイズは相対頻度を示す。プロット領域全体はＶの使用頻度に応じて部分領域に分けられ、これはＪの使用頻度に応じて細分され、ついでＣＤＲ３の頻度に応じて細分される。各集団における最も豊富なＣＤＲ３コード化ペプチド配列の第１０位までが示されている。ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ 集団でのみ見られるユニーク配列は赤色で強調表示されている。ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬにおけるＴＣＲクロノタイプの富化を確認するために、３つの独立した生物学的重複実験を分析した。 図１３は急速増殖プロトコル下の全ＰＤ－１＋ ＴＩＬ、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬおよびＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬの細胞増殖曲線を示す。３つの重複実験からの代表的な増殖曲線が示されている。 図１４は、図８Ｄ、９Ｃおよび９Ｆに関連する、種々のエフェクター対標的細胞比における増殖した全ＰＤ－１＋ ＴＩＬおよびＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬの癌細胞殺傷活性の比較を示す。平均値±ＳＤ（エラーバー）、ｎ＝３；ｎｓ、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；二元配置分散分析およびそれに続くシダックの多重比較検定。 図１５はＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬおよびＰＤ－１＋ ＴＩＬのインビボ腫瘍反応性を示す。図１５ＡはマウスＢ１６転移腫瘍モデルにおけるインビボ腫瘍反応性を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに０．５×１０６個のＢ１６－ｌｕｃ細胞を静脈内注射した。腫瘍接種の第３日に、方法に記載されているとおりにＴＩＬ処置を行った。ＴＩＬ導入の第８日に、腫瘍をＩＶＩＳ系によりイメージングした。腫瘍のサイズおよび代表的なイメージが示されている（平均±ＳＤ）；ＨＢＳＳ：７匹のマウス、全ＰＤ－１＋：８匹のマウス；ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋：６匹のマウス。図１５ＢはマウスＭＣ３８皮下腫瘍モデルにおけるＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬおよびＰＤ－１＋ ＴＩＬのインビボ腫瘍反応性を示す。ＭＣ３８細胞を雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した（マウス当たり０．５×１０６個の細胞）。腫瘍接種の第２日にマウスに放射線照射（５Ｇｙ）した。ついで、腫瘍接種の第３日に、方法に記載されているとおりにＴＩＬ処置を行った。ＴＩＬ処置の第１０日から２日ごとに腫瘍体積を測定した。処置第２日までの各群の腫瘍の平均サイズが示されている；ＨＢＳＳ：７匹のマウス；抗ＰＤ－１：７匹のマウス；全ＰＤ－１＋：７匹のマウス；ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋：８匹のマウス。前記図において、平均値±ＳＤ（エラーバー）；ｎｓ、Ｐ＞０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析およびそれに続くテューキーの多重比較検定またはｔ検定によりデータを分析した。生存データをログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定により分析した。 図１６は、ＭＣ３８腫瘍から単離されたＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－およびＰＤ－１－ ＣＤ８＋ ＴＩＬの特徴的な遺伝子発現シグネチャを示す。図１６Ａは、マウスＭＣ３８腫瘍から単離されたＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋（赤色の左端のクラスター）、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－（青色の中央のクラスター）およびＰＤ－１－（緑色の右端のクラスター）ＣＤ８＋ ＴＩＬのトランスクリプトームの主成分分析（ＰＣＡ）を示す。ドットは合計３つの生物学的重複実験（形状でグループ分け）からの３つの異なる集団（色でグループ分け）のサンプルを表す。ＰＣＡ１および２は変動の最大原因を表す。図１６Ｂは、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬとＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬとにおける、アップレギュレーション（赤色）された遺伝子およびダウンレギュレーションされた遺伝子（青色）のボルケーノ・プロットを示す。有意性はベンジャミン－ホッホバーグ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）ＦＤＲ（ｐ調整）＜０．０５および｜ｌｏｇ２（変化倍数）｜＞０．６として決定された。図１６Ｃは、図１６Ｂにおいて特定されたアップレギュレーションされた遺伝子およびダウンレギュレーションされた遺伝子に富む生物学的プロセス（ＧＯターム）を示す。図１６Ｄは、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬのトランスクリプトームおよびそれと比較されるＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬのトランスクリプトームにおける活性化／機能不全ＣＤ８遺伝子モジュール（Ｓｉｎｇｅｒら，２０１６）の遺伝子セット富化分析（ＧＳＥＡ）を示す。図１６Ｅは、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬのトランスクリプトームおよびそれと比較されるＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬのトランスクリプトームにおける、アップレギュレーションされた、およびダウンレギュレーションされた腫瘍特異的ＣＤ８遺伝子シグネチャー（Ｓｃｈｉｅｔｉｎｇｅｒら，２０１６）のＧＳＥＡを示す。図１６ＦはＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬ、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬおよびＰＤ－１－ ＴＩＬの代表的な遺伝子発現の比較を示す。図１６Ｇは、フローサイトメトリー分析による、マウスＭＣ３８腫瘍由来のＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－およびＰＤ－１－ ＣＤ８ ＴＩＬにおけるＰＤ－１、ＣＤ１３７、ＴＩＭ－３、ＣＤ３９およびＣＤ１０３の発現を示す。少なくとも２つの独立した重複実験から得られたデータである。 図１７は、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬおよびそれと比較されるＰＤ－１－ ＴＩＬのアップレギュレーションされた遺伝子（赤色）およびダウンレギュレーションされた遺伝子（青色）のボルケーノ・プロットを示す。有意性はベンジャミン－ホッホバーグ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ）ＦＤＲ（ｐ調整）＜０．０５および｜ｌｏｇ２（変化倍数）｜＞０．６（±１．５倍）として決定された。 図１８は、図１６Ｃに関連する、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬおよびそれと比較されるＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬにおける、アップレギュレーションされた遺伝子（図１８Ａ）およびダウンレギュレーションされた遺伝子（図１８Ｂ）による富化生物学的プロセスを示す。ジーンオントロジー（ＧＯ）過剰提示分析に従い遺伝子概念ネットワークを作成した。これは、各富化ＧＯタームに関与する遺伝子を示す。 図１９は、図１６Ｄおよび１６Ｅに関連する、報告されている遺伝子シグネチャーを使用した、ＭＣ３８ ＴＩＬのサブセットの遺伝子セット富化分析（ＧＳＥＡ）を示す。図１９Ａは、互いに比較されたＭＣ３８ ＴＩＬの３つのサブセットを示す。ナイーブ／メモリーＣＤ８遺伝子シグネチャーがＰＤ－１－ＴＩＬのトランスクリプトームにおいて有意に富化された。図１９Ｂ：３つのサブセットを互いに比較した。ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬのトランスクリプトームをＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬのトランスクリプトームと比較したところ、枯渇ＣＤ８遺伝子シグネチャーの富化は観察されなかった。ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬおよびＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬのトランスクリプトームは、別々にＰＤ－１－ ＴＩＬと比較した場合、枯渇ＣＤ８シグネチャーの同様の富化を示した。図１９Ｃは、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬのトランスクリプトームおよびそれと比較されるＰＤ－１－ＴＩＬのトランスクリプトームにおける活性化／機能不全ＣＤ８遺伝子モジュールのＧＳＥＡを示す。図１９Ｄは、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬのトランスクリプトームおよびそれと比較されるＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬのトランスクリプトームにおける、ならびにＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬのトランスクリプトームおよびそれと比較されるＰＤ－１－ ＴＩＬのトランスクリプトームにおける、アップレギュレーションされた細胞周期遺伝子モジュールのＧＳＥＡを示す。図１９Ｅは、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬのトランスクリプトームおよびそれと比較されるＰＤ－１－ ＴＩＬのトランスクリプトームにおける、アップレギュレーションされた、およびダウンレギュレーションされた腫瘍特異的ＣＤ８遺伝子シグネチャーのＧＳＥＡを示す。 図２０は、図１６Ｇに関連する、マウスＭＣ３８腫瘍由来のＣＤ８＋ ＴＩＬの３つのサブセットのフローサイトメトリー分析を示す。図２０Ａは、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬ、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬおよびＰＤ－１－ ＴＩＬのマーカーを分析するためのゲーティング戦略を示す。図２０Ｂは、ＴＩＬの３つのサブセットにおけるＴＩＭ－３、ＴＣＦ１、ＣＤ３９およびＣＤ１０３の染色を示す代表的なフローサイトメトリー分析を示す。 図２１は、Ｐａｎ０２膵臓癌マウスモデル（Ｃｏｒｂｅｔｔら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８４，４４：７１７－７２６）における浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から腫瘍反応性Ｔ細胞を検出し単離するためのプローブとして、ＦＴ機能化ｉＤＣが使用されうることを示す。図２１Ａ（左パネル）は、ＦｕｃｏＩＤ近接標識によりＣＤ８＋ Ｔ細胞上に沈着したビオチンタグを検出するためにＣＤ８＋ Ｔ細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ストレプトアビジンで標識したＦＡＣＳデータを示す。図２１Ａ（右パネル）は、図２１Ａに記載されている実験から選別された細胞を使用したエクスビボ腫瘍殺傷アッセイの結果を示す。ビオチン＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびビオチン－ ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＦＡＣＳにより選別し、Ｔ細胞培地（ＩＬ２：１００ＩＵ／ｍＬ）内でＩＬ－２と共に１２時間培養し、ついでＰａｎ０２細胞（ホタルルシフェラーゼが安定に導入されたもの）を選別ＣＤ８＋ Ｔ細胞と共に２０時間共培養した。ついでＰａｎ０２腫瘍の殺傷をルシフェラーゼ活性（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ，Ｐｒｏｍｅｇａ）により定量した。ｎｓ Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；一元配置分散分析およびそれに続くテューキーの多重比較検定。図２１Ｂは、ＦｕｃｏＩＤ近接標識によりＣＤ４＋ Ｔ細胞上に沈着したビオチンタグを検出するためにＣＤ４＋ Ｔ細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７－ストレプトアビジンで標識したＦＡＣＳデータを示す。
詳細な説明
定義：
特に示されていない限り、本明細書中で用いる全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用されうるが、可能性がある及び好ましい幾つかの方法および材料がここに記載されている。本明細書に挙げられている全ての刊行物を、該刊行物の引用対象に関連する方法および／または材料を開示および記載するために、参照により本明細書に組み入れることとする。矛盾が生じる場合には、本開示は、組み入れられた刊行物のいずれの開示にも優先する（特に、本出願に具体的に記載されているいずれの用語の定義も、参照により組み入れられた刊行物に開示されているその用語のいずれの矛盾する定義にも優先する）と理解される。
本開示を読んだ当業者に明らかなとおり、本明細書に記載され例示されている個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、その他の幾つかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されうる又はそれと組合されうる別々の成分および特徴を有する。任意の列挙されている方法は、列挙されている事象の順序で、または論理的に可能な他の任意の順序で実施されうる。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる単数形は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「細胞」に対する言及は複数のそのような細胞を含み、「ペプチド」に対する言及は１以上のペプチド、および当業者に公知の等価体、例えばポリペプチドなどに対する言及を含む。
本明細書に記載されている刊行物は本出願の出願日の前のそれらの開示のために記載されているに過ぎない。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明ゆえに、そのような刊行物に先行する権利がないと認めるものと解釈されるべきではない。更に、示されている公開日は実際の公開日と異なる可能性があり、これは個々に確認されることを要しうる。
「内毒素非含有（エンドトキシンフリー）」または「実質的に内毒素非含有」なる語は、一般に、せいぜい微量（例えば、臨床的に有害な生理学的作用を対象にもたらさない量）の内毒素、好ましくは、検出不可能な量の内毒素を含む組成物、溶媒および／または血管に関するものである。内毒素は、細菌、典型的にはグラム陰性菌のような特定の微生物に関連する毒素であるが、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のようなグラム陽性菌においても見られうる。最も一般的な内毒素は、種々のグラム陰性菌の外膜に見られるリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）であり、該糖は、これらの細菌が疾患を引き起こす能力における中心的な病原性の特徴を表す。ヒトにおける少量の内毒素は、有害な生理学的作用のなかでもとりわけ、発熱、血圧低下ならびに炎症および凝固の活性化を引き起こしうる。
したがって、医薬品製造においては、しばしば、医薬品および／または薬品容器から内毒素の痕跡のほとんど又は全てを除去することが望ましい。なぜなら、たとえ少量であってもヒトにおいて有害な作用を引き起こしうるからである。ほとんどの内毒素を分解するには、通常、３００℃を超える温度を要するため、この目的には発熱物質除去オーブンが使用されうる。例えば、シリンジまたはバイアルのような一次包装材に基づく場合、２５０℃のガラス温度と３０分間の保持時間との組合せは、しばしば、内毒素レベルにおける３ｌｏｇの減少を達成するのに十分である。本明細書に記載されている及び当技術分野で公知である、例えばクロマトグラフィーおよび濾過法を含む、内毒素を除去する他の方法も想定される。本発明の組成物中に内毒素が存在するリスクを、排除しないとしても低減するために、哺乳類細胞のような真核細胞においてＣＡＲ－ＥＣスイッチを生成させ、該細胞からそれを単離する方法も含まれる。無血清細胞においてＣＡＲ－ＥＣスイッチを生成させ、該細胞からそれを単離する方法が好ましい。
内毒素は、当技術分野で公知の常套的な技術を用いて検出されうる。例えば、カブトガニの血液を利用するカブトガニ血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｏｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）アッセイは、内毒素の存在を検出するための非常に高感度なアッセイである。この試験においては、非常に低レベルのＬＰＳがカブトガニ血球抽出成分の検出可能な凝固を、この反応を増幅する強力な酵素カスケードにより引き起こしうる。内毒素は酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によっても定量されうる。実質的に内毒素非含有となるためには、内毒素レベルは約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０８、０．０９、０．１、０．５、１．０、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９または１０ＥＵ／ｍｇタンパク質未満でありうる。典型的には、１ｎｇのリポ多糖（ＬＰＳ）は約１～１０ＥＵに相当する。
本明細書に開示されているクエリ（問い合わせ）アミノ酸配列に対して少なくとも例えば９５％「同一」であるアミノ酸配列を有する対象ポリペプチド配列の場合、対象ポリペプチド配列が該クエリアミノ酸配列の１００アミノ酸ごとに最大５アミノ酸の改変を含みうることを除き、該対象ポリペプチドのアミノ酸配列は該クエリ配列と同一であると意図される。換言すれば、クエリアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する対象ポリペプチドを得るためには、対象配列におけるアミノ酸残基の最大５％が挿入され、欠失され、または別のアミノ酸で置換されうる。参照配列と比較した場合のこれらの改変は参照アミノ酸配列のアミノ末端またはカルボキシ末端の位置に存在することが可能であり、あるいは、それらの末端位置の間のいずれかの位置に、参照配列の残基にわたって個々に、または参照配列内の１以上の連続的なグループとして散在することが可能である。２以上の配列（例えば、アミノ酸配列）の同一性は、Ｊｏｈｎｓｏｎ Ｍら，（２００８） ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ：ａ ｂｅｔｔｅｒ ｗｅｂ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：Ｗ５－Ｗ９（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているベーシック・ローカル・アラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、すなわち「ＢＬＡＳＴ」アルゴリズムを使用して、お互いに、または公開配列と比較されうる。同様に、同一性は２つのヌクレオチド配列間で同様に決定されうる。したがって、クエリヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一である対象ヌクレオチド配列（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ配列）を得るためには、対象配列におけるヌクレオチド残基の最大５％が挿入され、欠失され、または別のヌクレオチドで置換されうる。
本明細書中で用いる「クリックケミストリー」または「銅触媒アジド－アルキン環状付加反応」または「ＣｕＡＣＣ反応」なる語は、１，２，３－トリアゾールを生成する、末端アルキンおよびアジドの銅（Ｉ）触媒［３＋２］－ヒュスゲン１，３－双極環状付加を意味する。それはまた、同様に使用されうる、この反応の２５銅不使用変法をも意味する（Ｊ．Ｍ．Ｂａｓｋｉｎ，Ｊ．Ａ Ｐｒｅｓｃｈｅｒ，Ｓ．Ｔ．Ｌａｕｇｈｌｉｎ，Ｎ．Ｊ．Ａｇａｒｄ，Ｐ．Ｖ．Ｃｈａｎｇ，Ｉ．Ａ Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ Ｌｏ，Ｊ．Ａ Ｃｏｄｅｌｌｉ，Ｃ．Ｒ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００７，１０４，１６７９３．）。
「フコシルトランスフェラーゼ」、「ＦｕｃＴ」および「ＦＴ」なる語は本明細書において互換的に用いられ、ＧＤＰ－β－Ｌ－フコース（「ＧＤＰ－フコース」）からアクセプター基質へのフコースの転移を触媒する酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）を意味する。アクセプター基質はオリゴ糖および／またはタンパク質上に存在しうる。例えば、フコシルトランスフェラーゼは、Ｎ－グリカン（例えば、１型：Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ）に存在する最も内側のＧｌｃＮＡｃ（Ｎ－アセチルグルコサミン）残基にフコースを転移させて、「コアフコシル化」として公知のα－１，６－フコシル化をもたらしうる。フコシルトランスフェラーゼは「末端フコシル化」をも触媒することが可能であり、これにより、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ（ＩＩ型；ＬａｃＮＡｃとも称される）またはＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ（ＩＩＩ型）のようなオリゴ糖上の末端ガラクトース残基にフコースが結合する。現在のところ、１３種類のフコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ１－ＦＵＴ１１、ＰＯＦＵＴ１およびＰＯＦＵＴ２を含む）が記載されており、これらは異なる種類のフコシル化を触媒する。例えば、ＦＵＴ１（ＮＭ＿０００１４８．１）およびＦＵＴ２（ＮＭ＿０００５１１．１）はα－１，２－フコシル化の合成を触媒する。ＦＵＴ３（ＮＭ＿０００１４９．１）はα－１，３－およびα－１，４－フコシル化（α－１，３／４フコシル化）の合成を触媒する。ＦＵＴ４（ＮＭ＿００２０３３．１）、ＦＵＴ５（ＮＭ＿００２０３４．１）、ＦＵＴ６（ＮＭ＿０００１５０．１）、ＦＵＴ７（ＮＭ＿００４４７９．１）、ＦＵＴ９（ＮＭ＿００６５８１．１）、ＦＵＴ１０（ＮＭ＿０３２６６４．２）およびＦＵＴ１１（ＮＭ＿１７３５４０．１）はα－１，３－フコシル化を触媒する。ＦＵＴ８（ＮＭ＿００４４８０．１）はα－１，６－フコシル化を触媒する。ＰＯＦＵＴ１（ＮＭ＿０１５３５２．１）およびＰＯＦＵＴ２（ＮＭ＿０１５２２７．１）は、セリンおよびスレオニン残基へのＯ－グリコシド結合による、ポリペプチドへのフコースの直接付加を触媒する。前記の１３個のフコシルトランスフェラーゼ酵素の前記ＮＣＢＩ参照配列番号に対応する配列のそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」なる語は、アミノ酸残基の単離重合体を意味するものとして交換的に用いられ、特に示されていない限り、最小の長さに限定されない。ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体なども、ペプチド結合により連結された線形配置アミノ酸から構成され、これらは生物学的に産生され、天然環境から単離され、組換え技術を用いて産生され、または典型的には天然アミノ酸を使用して合成的に産生されうる。幾つかの態様においては、ポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在しないアミノ酸を含む「修飾ポリペプチド」である。幾つかの態様においては、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸と天然に存在しないアミノ酸との組合せを含み、幾つかの実施形態においては、ペプチドは、天然に存在しないアミノ酸のみを含む。本明細書中で用いる「ペプチド」なる語は、天然ペプチド（分解産物、合成ペプチドまたは組換えペプチドのいずれか）および３０個のペプチド模倣物（典型的には合成ペプチド）、ならびにペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイドを含み、これらは、例えば、ペプチドを体内でより安定にする修飾、または細胞内への浸透能を高める修飾を有しうる。そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾、バックボーン修飾および／または側鎖修飾が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本明細書中で用いる「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」なる語は、一般に、数個（例えば、２～４個）～数百個の単量体単位のサイズ範囲のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらの１５個のアルファ－アノマー形態などを含む、天然または修飾ヌクレオシドの線状ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような文字配列により表される場合、ヌクレオチドは左から右に５’から３’への順序であると理解される。本明細書中で用いるポリヌクレオチドには、塩基性糖ホスファートまたは糖ホスホロチオアート重合体も含まれる。
ＬａｃＮＡｃなる語はＮ－アセチルラクトサミンを意味し、Ｇａｌ１，４ＧｌｃＮＡｃと互換的に呼称される。
ｓＬａｃＮＡｃおよびシアリルＬａｃＮＡｃはα２，３－シアリル化ＬａｃＮＡｃを意味し、本明細書においてはシアリルラクトサミンとも称される。
「実質的」または「本質的」は、十分または相当な量、数量、サイズ；ほぼ全てまたは完全；例えば、ある所与量の９５％以上を意味する。
「実質的に類似」する配列は、互いに対して少なくとも約９０％の配列（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド配列）同一性、または互いに対して少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９％を超える同一性を含む配列である。
本明細書中で用いる「タグ付き基質」または「検出可能なタグを含む基質」なる語は、本明細書に記載されているタグを含む酵素基質を意味する。種々の実施形態においては、タグ付き基質は、ベイト細胞の表面に結合または配置される酵素に対する基質である。当業者に明らかなとおり、種々の実施形態においては、本開示の特定の実施形態に関連して使用されうる厳密なタグ付き基質は、ベイト細胞の表面結合または配置される酵素に左右される。したがって、例えば、ベイト細胞が、その細胞表面上にグリコシルトランスフェラーゼを有するように操作されている場合、タグ付き基質は、タグに結合されたドナー糖ヌクレオチドを含み、ドナー糖ヌクレオチドは、その酵素に対する適切な基質であるものである。対照的に、ベイト細胞がその表面にソルターゼ酵素を含む場合、基質は、ソルターゼ認識配列とタグとを含むペプチドを含む。
概要：
本明細書は、とりわけ、細胞間（「細胞－細胞」）相互作用をインビトロ、エクスビボおよびインビボでモニターするための組成物および方法を開示する。幾つかの実施形態においては、本開示は、（ｉ）腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または循環Ｔ細胞から腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を特定し富化（濃縮）するための、（ｉｉ）特定の自己免疫疾患における自己抗原を認識するＴ細胞を特定し富化するための、および／または（ｉｉｉ）自己免疫疾患の治療に利用される可能性を有する抗原特異的制御性Ｔ細胞を特定し富化するための、これらの組成物および方法の使用を提供する。
過去１０年間で、免疫チェックポイントインヒビターおよび養子細胞移入（ＡＣＴ）に基づく療法の開発は癌患者に非常に大きな希望をもたらしている７，１７－１９。これら２つのタイプの免疫療法の大きな成功にもかかわらず、癌患者の５０％以上はチェックポイント遮断治療に応答しない。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断後の抗腫瘍免疫応答の成功は腫瘍微小環境中に存在する新生抗原特異的Ｔ細胞の再活性化およびクローン増殖を要すると考えられている２０－２４。新生抗原特異的Ｔ細胞の不適切な生成、新生抗原特異的Ｔ細胞のエフェクター機能の抑制および記憶Ｔ細胞の形成障害はチェックポイントインヒビター療法の失敗の主要要因である。したがって、これらの抑制メカニズムを克服しうる戦略が強く求められている。
一方、癌免疫療法のための実用的な腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を見出すことに相当な努力がなされている。これらのＴＳＡは治療用癌ワクチンにおいて使用可能であり１、あるいは、癌患者の治療に使用されるＴＣＲ操作Ｔ細胞（ＴＣＲ－Ｔ）を構築するためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）２７および抗原特異的腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）２６を特定するために使用可能である。
現在、ＴＳＡを特定するための最も一般的な戦略は逆免疫学（ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）に基づくものであり、この場合、腫瘍細胞に対してエクソーム解析（エクソーム配列決定）を行って、非同義突然変異を特定する２８。特定された非同義突然変異のいずれかを含有するペプチドを作製するために、インシリコ手段を用いる。これらのペプチドはフィルタリングに付されず２９、またはＭＨＣ結合の予測アルゴリズムの使用によりフィルタリングされ、または質量分析と組合せることによりＭＨＣ関連ＴＳＡを特定するためのガイドとして使用される。ついで、ＴＳＡ候補をコードするＲＮＡまたは対応ペプチドを自己樹状細胞（ＤＣ）内に導入して、培養ＴＩＬまたは単離循環Ｔ細胞におけるＴ細胞反応性を調べる。そのような方法は、黒色腫患者および少数の上皮癌患者のＴＳＡおよびＴＳＡ反応性ＴＣＲを特定することに成功している。これらの高評価の成功にもかかわらず、特定されたＴＳＡ候補の大部分は免疫原性ではない。なぜなら、利用可能な計算手段はＴ細胞反応性を正確に予測できないからである。
エクソームはヒトゲノムのわずか２％を構成するに過ぎないことから、潜在的に全てのゲノム領域によりコードされるＴＳＡを見出すために、代替的なプロテオゲノミック技術が開発されている。この技術を用いて、非コード領域とされる領域に由来するＴＳＡが見出されているが、これは、標準的なエクソームに基づくアプローチでは見逃されていたであろう。しかし、そのような方法は少数の高度に専門化された実験室でしか行うことができない。なぜなら、「このアプローチは、古典的な偽発見率の計算に適合せず、ＴＳＡはＭＳスペクトルの手動検査による綿密な検証を受ける必要がある」からである。
新規癌免疫療法戦略を開発するためのトランスレーショナルリサーチを加速するためには、研究所および臨床現場で簡単に採用されうるＴＳＡ反応性Ｔ細胞を富化し単離するための迅速かつハイスループットな方法はこの分野にとって歓迎すべき進歩である。本発明は、とりわけ、そのような戦略を提供する。
種々の実施形態においては、本開示の組成物および方法は、細胞表面上に酵素を含有するように操作された細胞を提供し、操作された細胞上の酵素は、別の細胞と接触すると、その他の細胞上に標識（または「タグ」）を結合させる標識反応を触媒する。本明細書においては、このプロセスを「相互作用依存的標識」と称し、標識反応を触媒する操作された細胞を「ベイト細胞」と称し、ベイト細胞により標識される細胞を「プレイ細胞」と称する。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている技術を用いることにより、抗原、例えば腫瘍ライセートでプライミングされたフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）（または他の酵素）修飾自己ｉＤＣは、ＤＣと相互作用する細胞（例えば、ＴＩＬまたは循環Ｔ細胞）の表面へのビオチン（または他の）タグの近接ベース転移を誘発するベイト細胞として使用されうる。例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）（または他の富化方法）を用いて、ビオチン化Ｔ細胞（またはタグ付き細胞）は、真正な抗原反応性の、例えばＴＳＡ反応性のＴＩＬとして単離されうる。これらの単離された細胞は、有望なＴＳＡ反応性を示す現在使用されている表面マーカー（例えば、ＰＤ－１、ＣＤ１３４またはＣＤ１３７）、または他のマーカー、例えばＣＸＣＲ５および／もしくはＴＩＭ３をも発現しうる。そのような実施形態においては、近接ベースビオチン化は、抗原提示ＤＣと相互作用する細胞上でのみ生じるため、この方法を使用すると、ＰＤ－１、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＸＣＲ５および／またはＴＩＭ３３０をも発現するヒト腫瘍浸潤物において見出されるバイスタンダーＣＤ８＋ Ｔ細胞は有効に除外される。したがって、種々の実施形態においては、本開示は、本明細書に開示されている近接標識法を使用して単離されたＴＳＡ反応性ＴＩＬまたはＴ細胞およびそのようなＴＳＡ反応性ＴＩＬまたはＴ細胞の増殖集団の組成物（医薬組成物を含む）を含む。そのような組成物は、例えば癌のような疾患の治療または予防に使用されうる。
Ｉ．ベイト細胞
種々の実施形態においては、本開示のベイト（ｂａｉｔ）細胞は、ベイト細胞とプレイ（ｐｒｅｙ）細胞とが接触した際に標的プレイ細胞への標識（または「タグ」）の転移を触媒するためのベイト細胞表面上の酵素を含む。ベイト細胞の表面で使用するための適切な酵素は本明細書に開示されており、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、フコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ）、ソルターゼおよび無差別ビオチンリガーゼを包含するが、これらに限定されるものではない。
ベイト細胞型： 別の細胞と接触しうる任意の細胞がベイト細胞として使用されうる。ただし、それは、接触したプレイ細胞の接触誘発性相互作用依存的標識を触媒するためにその表面上に適切な酵素を含有するように操作されうるものでなければならない。幾つかの実施形態においては、ベイト細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。幾つかの場合には、ベイト細胞はプロフェッショナル（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）ＡＰＣである。幾つかの場合には、ベイト細胞は非プロフェッショナルＡＰＣである。幾つかの場合には、ベイト細胞はＭＨＣクラスＩ分子を発現する。幾つかの場合には、ベイト細胞はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する。幾つかの場合には、ベイト細胞は白血球である。幾つかの場合には、ベイト細胞は非定型ＡＰＣである。幾つかの場合には、ベイト細胞は、ＤＣ、マクロファージ、Ｂ細胞、顆粒球、肥満細胞、好中球、内皮細胞、上皮細胞から選択される細胞である。幾つかの実施形態においては、ベイト細胞は、操作されたＡＰＣ、例えば人工ＡＰＣ（「ａＡＰＣ」）である。そのようなａＡＰＣは当技術分野で公知である。ａＡＰＣは、細胞に基づくａＡＰＣまたは細胞に基づかないａＡＰＣでありうる。幾つかの場合には、細胞に基づかないａＡＰＣはナノ粒子または微粒子上にシグナル１およびシグナル２を含み、そして所望によりシグナル３を含むことが可能であり、ａＡＰＣは、２つのシグナル、すなわち、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）シグナルおよび共刺激分子を含む。幾つかの場合には、ａＡＰＣにおけるＭＨＣシグナルはＭＨＣクラスＩである。幾つかの場合には、ａＡＰＣにおけるＭＨＣシグナルはＭＨＣクラスＩＩである。幾つかの場合には、ａＡＰＣにおける共刺激シグナルは、ＣＤ８０（Ｂ７．１）またはＣＤ８６（Ｂ７．２）により生成される。ａＡＰＣは、サイトカイン分泌を刺激してＴ細胞の刺激および増殖を促進する第３シグナルをも含みうる。幾つかの場合には、ａＡＰＣは、ａＡＰＣがＴ細胞に結合した後にＩＬ－２分泌を刺激する第３シグナルを含みる。幾つかの場合には、ａＡＰＣは、第１シグナルおよび第２シグナル、そして所望により第３シグナルを発現するように操作された線維芽細胞である。線維芽細胞はＩＣＡＭ－１および／またはＬＦＡ－３をも発現しうる。例えば、特定の実施形態においては、ベイト細胞は樹状細胞であり、プレイ細胞はエフェクター細胞である。樹状細胞は未熟樹状細胞でありうる。樹状細胞は抗原でプライミングされうる。幾つかの実施形態においては、抗原は癌、病原性感染、自己免疫疾患、炎症性疾患または遺伝性障害に由来する。幾つかの実施形態においては、樹状細胞であるベイト細胞と組合せて本発明においてプレイ細胞として使用されるエフェクター細胞には、ナイーブＴ細胞、記憶幹細胞Ｔ細胞、中央記憶Ｔ細胞、エフェクター記憶Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ８／ＣＤ４＋ Ｔ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージから選択されるエフェクター細胞が含まれる。そのような方法においては、腫瘍ライセートでプライミングされた自己未熟ＤＣは、幾つかの実施形態においては、ベイト細胞ＤＣと相互作用するプレイ細胞（すなわち、ＴＩＬまたは循環Ｔ細胞）の表面へのタグ（例えば、ビオチン）の近接ベース転移を誘発する酵素で修飾されうる。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）（または他の適切な単離方法）を用いて、有望なＴＳＡ反応性を示す現在使用されている表面マーカー（例えば、ＰＤ－１、ＣＤ１３４またはＣＤ１３７）２８－３０または例えばＣＸＣＲ５および／もしくはＴＩＭ３のような他のマーカーをも発現しうるタグ付き（例えば、ビオチン化）Ｔ細胞が単離されうる。単離されたＴ細胞は、抗原反応性Ｔ細胞、例えば、ＴＳＡに対する反応性を有する腫瘍反応性Ｔ細胞に関して高度に富化される。同様に、自己免疫患者生検からの組織ライセートでプライミングされたＤＣは、ベイト細胞ＤＣと相互作用するプレイ細胞（循環自己反応性Ｔ細胞）の表面へのタグ（例えば、ビオチン）の近接ベース転移を誘発する酵素で修飾されうる。このアッセイから、有望な自己反応性Ｔ細胞であるタグ付き（例えば、ビオチン＋）ＣＤ８＋ Ｔ細胞、および有望な抗原特異的制御性Ｔ細胞であるタグ付き（例えば、ビオチン＋）ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋ Ｔ細胞が単離されうる。
幾つかの実施形態においては、ベイト細胞はＢ細胞である。幾つかの実施形態においては、ベイト細胞はＢ細胞であり、プレイ細胞はＴ細胞である。幾つかの実施形態においては、ベイト細胞はナイーブＢ細胞または胚中心Ｂ細胞である。
同様に、幾つかの実施形態においては、ベイト細胞はそのようなエフェクター細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、メモリー幹細胞Ｔ細胞、中央記憶Ｔ細胞、エフェクター記憶Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ８／ＣＤ４＋ Ｔ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナチュラルキラー細胞またはマクロファージ）であり、したがって、エフェクター細胞は、接触したプレイ細胞の接触誘発性相互作用依存的標識を触媒するためにその表面に適切な酵素を含有するように操作されている。幾つかの実施形態においては、ベイト細胞は、接触したプレイ細胞の接触誘発性相互作用依存的標識を触媒するためにその表面上に適切な酵素を発現するＴ細胞であり、プレイ細胞はＢ細胞である。幾つかの実施形態においては、ベイト細胞は、接触したプレイ細胞の接触誘発性相互作用依存的標識を触媒するためにその表面上に適切な酵素を発現するＴ細胞であり、プレイ細胞はナイーブＢ細胞、胚中心Ｂ細胞である。幾つかの実施形態においては、ベイト細胞は、接触したプレイ細胞の接触誘発性相互作用依存的標識を触媒するためにその表面上に適切な酵素を発現するＴ細胞であり、プレイ細胞は樹状細胞である。本開示の特定の実施形態においては、ベイト細胞は、接触したプレイ細胞の接触誘発性相互作用依存的標識を触媒するためにその表面上に適切な酵素を発現するＢ細胞であり、プレイ細胞はＣＤ４＋ Ｔ細胞である。
ベイト細胞酵素
タグ付き基質を利用する接触したプレイ細胞の接触誘発性相互作用依存的標識を触媒しうる任意の酵素がベイト細胞の表面上に配置され、本発明において使用されうる。そのような酵素は本明細書においては「適切な酵素」と称される。幾つかの実施形態においては、本発明による相互作用依存的標識を促進するためにベイト細胞上で使用するための適切な酵素は、（ｉ）バックグラウンド標識が最小になるように、プレイ細胞の表面上に見出されるアクセプター基質に対する高いＫｍを有し、（ｉｉ）ベイト細胞とプレイ細胞との間の相互作用が生じた際に相互作用依存的標識を誘発する高いｋｃａｔを有する。酵素はヒト酵素でありうる。酵素は非ヒト酵素でありうる。酵素は組換え酵素でありうる。酵素は、単離された酵素でありうる。酵素は天然酵素でありうる。酵素は非天然酵素でありうる。酵素はタグ（例えば、エピトープタグ）を含みうる。そのようなタグは当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている任意のタグ（これらに限定されるものではない）を包含するタグが本発明において使用されうる。
幾つかの場合には、ベイト細胞の表面上の酵素はトランスフェラーゼである。一般に、トランスフェラーゼは或る分子から別の分子への或る分子基の転移を触媒する。例えば、そのような分子基には、とりわけ、ホスファート、アミノ、メチル、アセチル、アシル、ホスファチジル、ホスホリボシルが含まれ、本発明において使用される適切なトランスフェラーゼには、或る分子から別の分子への転移を、たとえ該分子がタグ（例えば、当技術分野で公知の又は本明細書に記載されているタグ）で標識されていたとしても、触媒しうる任意のトランスフェラーゼが含まれる。
例えば、特定の実施形態においては、本開示は、グリコシルトランスフェラーゼである酵素を表面上に含有するベイト細胞を提供する。グリコシルトランスフェラーゼは、例えばタンパク質および他の糖部分（グリカン）、例えば糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖などを含みうるアクセプター分子への糖ヌクレオチドドナーの転移を触媒する。
特定の実施形態においては、本開示は、フコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを表面上に含有するベイト細胞を提供する。
フコシルトランスフェラーゼは、ＧＤＰ－ＦｕｃからＧａｌへのα１，２－結合での、およびＧｌｃＮＡｃへのα１，３－、α１，４－またはα１，６－結合でのフコースの転移を触媒する。公知フコシルトランスフェラーゼは同一ヌクレオチド糖を利用するため、それらの特異性はアクセプターの認識および形成される結合のタイプにあると考えられている。タンパク質配列の類似性に基づいて、これらの酵素は以下の４つの異なるファミリーに分類されている：（１）アルファ－２－フコシルトランスフェラーゼ、（２）アルファ－３－フコシルトランスフェラーゼ、（３）哺乳類アルファ－６－フコシルトランスフェラーゼおよび（４）細菌α－６－フコシルトランスフェラーゼ。保存された構造的特徴およびコンセンサスペプチドモチーフが原核生物および真核生物由来の全てのα－２－フコシルトランスフェラーゼおよびα－６－フコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインにおいて特定されている。これらの配列類似性に基づいて、アルファ－２－フコシルトランスフェラーゼおよびアルファ－６－フコシルトランスフェラーゼは１つのスーパーファミリーにグループ化されている。また、このスーパーファミリーにおいては少数のアミノ酸が厳密に保存されていることが判明しており、これらの残基の２つはヒトα－２－フコシルトランスフェラーゼの酵素活性に必須であると報告されている。アルファ－３－フコシルトランスフェラーゼはコンセンサスペプチドを欠いているため、別個のファミリーを構成するが、幾つかの領域はアルファ－２－フコシルトランスフェラーゼおよびアルファ－６－フコシルトランスフェラーゼに対する類似性を示す。これら観察結果の全ては、フコシルトランスフェラーゼが幾つかの共通の構造的および／または触媒的特徴を共有していることを強く示唆している。ヒトにおいては、少なくとも１１個のフコシルトランスフェラーゼが記載されており、これらはヒト遺伝子ＦＵＴ１、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３、ＦＵＴ４、ＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、ＦＵＴ８、ＦＵＴ９、ＦＵＴ１０およびＦＵＴ１１によりコードされている。
シアリルトランスフェラーゼは、触媒ドメインにおける保存相同領域を含有する、糖タンパク質、糖脂質およびオリゴ糖の炭水化物基の末端シアリル化に関与するグリコシルトランスフェラーゼである。シアリルトランスフェラーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは、Ｇａｌ／３１，３ＧａｌＮＡｃ α２，３シアリルトランスフェラーゼおよびＧａｌｌ，３（４）ＧｌｃＮＡｃ α２，３シアリルトランスフェラーゼを含む。シアリル化は、糖タンパク質、糖脂質、オリゴ糖などの糖鎖上の末端位置へのシアル酸の転移を意味する。酵素的に機能的であるシアリルトランスフェラーゼの例としては、シアル酸をＣＭＰ－シアル酸からアクセプターオリゴ糖に転移しうるものが挙げられ、この場合、オリゴ糖アクセプターは個々のシアリルトランスフェラーゼによって様々である。多数のシアリルトランスフェラーゼが当技術分野で公知であり、ヒトシアリルトランスフェラーゼＳＩＡＴ４Ｃ、ＳＩＡＴ９、ＳＴ３ＧＡＬ１、ＳＴ３ＧＡＬ２、ＳＴ３ＧＡＬ３、ＳＴ３ＧＡＬ４、ＳＴ３ＧＡＬ５、ＳＴ３ＧＡＬ６、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴ６ＧＡＬ２、ＳＴ６Ｇａｌ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＴ８ＳＩＡ２、ＳＴ８ＳＩＡ３、ＳＴ８ＳＩＡ４、ＳＴ８ＳＩＡ５、ＳＴ８ＳＩＡ６およびＳＴ８Ｓｉａを包含するが、これらに限定されるものではない。
典型的には、グリコシルトランスフェラーゼは厳密なドナー基質特異性を有する。しかし、本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）α１，３フコシルトランスフェラーゼが顕著な基質耐性を有し（ＷＯ２０１８／１４４７６９として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１６５０３；その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）、望ましいあらゆるものがそのＧＤＰ－フコース基質に例えばリンカーを介して結合されるのを実質的に可能にし、フコシル化反応を尚も触媒しうることを見出し、最近報告した。本発明者らは、ＳＴ６Ｇａｌ１、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）α（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）およびフォトバクテリウム・ダムセル（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌ）α（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）が機能化ＣＭＰ－シアル酸ドナー基質に対して許容性であることを本発明者らの以前の研究において同様に示している（同誌およびＨｏｎｇ，Ｓら，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ－ｓｕｒｆａｃｅ ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｇｌｙｃａｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １０，Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１７９９（２０１９）；その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）。また、本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリα１，３／１，４フコシルトランスフェラーゼ、ヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）およびヒトα２，６αシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｇａｌ１）も、ヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼＦＵＴ９と同様に、結合ドナー基質に対して同様に許容性であることを、本明細書に示す（非表示データ）。
したがって、本発明の幾つかの実施形態は、表面上に配置されたフコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを含むベイト細胞を提供し、また、相互作用依存的標識を達成することにより、ベイト細胞が別の細胞に接触したかどうかを検出するための、そのようなベイト細胞の使用方法を提供する。特定の態様においては、表面上に配置されたフコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを含有するベイト細胞が、それぞれのグリコシルトランスフェラーゼのための適切なドナー糖ヌクレオチド（すなわち、フコシルトランスフェラーゼの場合のＧＤＰ－フコース、およびシアリルトランスフェラーゼの場合のＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ）のタグ付き結合体の存在下、適切なグリカンアクセプター部分を含むプレイ細胞に接触すると、ベイト細胞上の酵素はグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒し、この反応は、それぞれのタグ付きドナー糖ヌクレオチドの、プレイ細胞への結合をもたらして、ベイト細胞とプレイ細胞との間で細胞間相互作用が生じたことを示す持続的指標をもたらす。
１つの実施形態においては、本開示は、ヒトフコシルトランスフェラーゼ酵素を表面上に含むベイト細胞を提供し、また、プレイ細胞の相互作用依存的標識におけるその使用方法を提供する。１つの実施形態においては、ヒトフコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼは組換え法により製造される。１つの実施形態においては、本開示は、ヘリコバクター・ピロリフコシルトランスフェラーゼ酵素を表面上に含むベイト細胞を提供する。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリフコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリフコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３／１，４－フコシルトランスフェラーゼである。
１つの実施形態においては、本開示は、ヒトシアリルトランスフェラーゼ酵素を表面上に含むベイト細胞を提供し、また、プレイ細胞の相互作用依存的標識におけるその使用方法を提供する。１つの実施形態においては、ヒトシアリルトランスフェラーゼはＳＴ６ＧＡＬ１である。１つの実施形態においては、ヒトシアリルトランスフェラーゼはＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。本開示の１つの実施形態においては、ベイト細胞の表面上の酵素は非ヒトシアリルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、非ヒトシアリルトランスフェラーゼはパスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）α（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａ）α（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）である。
１つの実施形態においては、本開示は、ソルターゼ酵素を表面上に含むベイト細胞を提供し、また、プレイ細胞の相互作用依存的標識におけるその使用方法を提供する。ソルターゼは、トランスアミド化により第１タンパク質のＣ末端を第２タンパク質のＮ末端に結合させるペプチド転移反応を行いうる酵素のファミリーである。ベイト細胞の表面上に含まれるソルターゼ酵素が、ソルターゼ認識配列［例えば、ＬＰＴＸＧ（配列番号２８）（ここで、ＸはソルターゼＡの任意のアミノ酸）］を含むタグ付きペプチドの存在下、ソルターゼアクセプターペプチド（例えば、ＧＧＧ残基）をＮ末端に含むポリペプチドを表面上に含有するプレイ細胞に接触すると、ソルターゼは、ソルターゼ認識を含むポリペプチドのＮ末端へのタグ付きペプチドの結合を触媒することにより、プレイ細胞にタグを結合させる。本明細書に記載されているプレイ細胞の相互作用依存的標識を促進する目的でベイト細胞の表面に結合させるための適切な酵素として、当技術分野に公知の又は本明細書に開示されている任意のソルターゼが本発明に関して使用されうる。
ソルターゼはトランスアミダーゼとも称され、典型的には、プロテアーゼ活性とペプチド転移活性との両方を示す。原核生物由来の種々のソルターゼが特定されている。例えば、グラム陽性菌由来の幾つかのソルターゼはタンパク質を切断し、無傷細胞壁におけるプロテオグリカン部分に転移させる。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から単離されたソルターゼとしては、ソルターゼＡ（Ｓｒｔ Ａ）およびソルターゼＢ（Ｓｒｔ Ｂ）が挙げられる。したがって、特定の実施形態においては、本明細書に記載されている相互作用依存的標識法に従い使用されるトランスアミダーゼは、例えば、本明細書においてＳｒｔＡａｕｒｅｕｓとも称されるスタヒロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＡである。他の実施形態においては、トランスアミダーゼは、例えば、本明細書においてＳｒｔＢａｕｒｅｕｓとも称されるスタヒロコッカス・アウレウス由来のソルターゼＢである。
ソルターゼは、グラム陽性菌ゲノム由来の６１個のソルターゼの配列アラインメントおよび系統発生分析に基づいて、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと称される４つのクラス（すなわち、それぞれ、ソルターゼＡ、ソルターゼＢ、ソルターゼＣおよびソルターゼＤ）に分類されている（Ｄｒａｍｓｉら，Ｒｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５６（３）：２８９－９７，２００５；その全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）。これらのクラスは、ＣｏｍｆｏｒｔおよびＣｌｕｂｂ（Ｃｏｍｆｏｒｔら，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．，７２（５）：２７１０－２２，２００４；その全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）によっても分類されている以下のサブファミリーに対応する：クラスＡ（サブファミリー１）、クラスＢ（サブファミリー２）、クラスＣ（サブファミリー３）およびクラスＤ（サブファミリー４および５）。前記の参考文献は多数のソルターゼおよびそれらの認識モチーフを開示している。また、Ｐａｌｌｅｎら，ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，９（３），９７－１０１（その全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）も参照されたい。当業者は、例えばＤｒａｍｉら（前掲）に記載されているその配列および／または他の特性に基づいて、ソルターゼを正しいクラスに容易に割り当てることができるであろう。
「ソルターゼＡ」なる語は、本明細書においては、いずれかの特定の細菌種における、ＳｒｔＡと通常称されるクラスＡソルターゼ、例えば、スタヒロコッカス・アウレウス由来のＳｒｔＡを意味するものとして用いられる。同様に、「ソルターゼＢ」は、本明細書においては、いずれかの特定の細菌種における、ＳｒｔＢと通常称されるクラスＢソルターゼ、例えば、スタヒロコッカス・アウレウス由来のＳｒｔＢを意味するものとして用いられる。本開示は、当技術分野で公知のソルターゼクラス（例えば、任意の細菌種または株に由来するソルターゼＡ、任意の細菌種または株に由来するソルターゼＢ、任意の細菌種または株に由来するクラスＣソルターゼ、および任意の細菌種または株に由来するクラスＤソルターゼ）のいずれかに関連する実施形態を含む。
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている相互作用依存的標識法において使用されるソルターゼは野生型酵素である。他の実施形態においては、ソルターゼは、野生型対応物と比較して優れた特徴（例えば、より高い触媒活性）を有しうる修飾形態である。幾つかの例において、ソルターゼは、以下の位置の１以上を含みうるＳｒｔＡの突然変異体でありうる：Ｐ９４、Ｓ１０２、Ａ１０４、Ｅ１０５、Ｋ１３８、Ｋ１５２、Ｄ１６０、Ｋ１６２、Ｔ１６４、Ｄ１６５、Ｋ１７３、Ｉ１８２、Ｋ１９０およびＫ１９６。例えば、ＳｒｔＡ突然変異体は以下の変異の１以上を含みうる：Ｐ９４ＲまたはＰ９４Ｓ、Ｓ１０２Ｃ、Ａ１０４Ｈ、Ｅ１０５Ｄ、Ｋ１３８Ｐ、Ｋ１５２Ｉ、Ｄ１６０ＫまたはＤ１６０Ｎ、Ｋ１６２Ｈ、Ｔ１６４Ｎ、Ｄ１６５Ａ、Ｋ１７３Ｅ、Ｉ１８２Ｖ、Ｋ１９０Ｅ、およびＫ１９６ＳまたはＫ１９６Ｔ。一例においては、ソルターゼはスタヒロコッカス・アウレウス由来のＳｒｔＡの三重突然変異体Ｐ９４Ｓ／Ｄ１６０Ｎ／Ｋ１９６Ｔである。
他の実施形態においては、本明細書に記載されている細胞間標識法において、基質特異性が変化した修飾ソルターゼが使用されうる。例えば、Ｓ１０２（例えば、Ｓ１０２Ｃ）、Ａ１０４（例えば、Ａ１０４ＨまたはＡ１０４Ｖ）、Ｅ１０５（例えば、Ｅ１０５Ｄ）、Ｋ１３８（例えば、Ｋ１３８Ｐ）、Ｋ１５２（例えば、Ｋ１５２Ｉ）、Ｎ１６２（例えば、Ｎ１６２Ｎ）、Ｔ１６４（例えば、Ｔ１６４Ｎ）、Ｋ１７３（例えば、Ｋ１７３Ｅ）、Ｉ１８２（例えば、Ｉ１８２Ｖ）、Ｔ１９６（例えば、Ｔ１９６Ｓ）、Ｎ９８（例えば、Ｎ９８Ｄ）、Ａ１１８（例えば、Ａ１１８Ｔ）、Ｆ１２２（例えば、Ｆ１２２Ａ）、Ｋ１３４（例えば、Ｋ１３４Ｒ）、Ｆ１４４（例えば、Ｆ１４４Ｌ）およびＥ１８９（例えば、Ｅ１８９Ｆ）位の１以上の突然変異を有する突然変異体が挙げられる。そのような修飾ソルターゼは、例えばＬＡＸＴＧ（配列番号６）および／またはＬＰＸＳＧ（配列番号７）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基でありうる）のような配列を認識しうる。具体例には、突然変異体Ｓ１０２Ｃ／Ａ１０４Ｈ／Ｅ１０５Ｄ／Ｋ１３８Ｐ／Ｋ１５２Ｉ／Ｎ１６２Ｎ／Ｔ１６４Ｎ／Ｋ１７３Ｅ／Ｉ１８２Ｖ／Ｔ１９６Ｓ、および突然変異体Ｎ９８Ｄ／Ａ１０４Ｖ／Ａ１１８Ｔ／Ｆ１２２Ａ／Ｋ１３４Ｒ／Ｆ１４４Ｌ／Ｅ１８９Ｆが含まれうる。基質特異性が変化した追加的なソルターゼ突然変異体はＵＳ２０１４００５７３１７およびＤｏｒｒら，ＰＮＡＳ １１１（３７）：１３３４３－１３３４８（２０１４）（それらにおける関連開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。
野生型ソルターゼの修飾形態は野生型対応物に対して少なくとも８５％（例えば、９０％、９５％、９８％またはそれ以上）の配列同一性を共有しうる。それは、野生型ソルターゼのアミノ酸配列をＳｒｔＡのアミノ酸配列で分析することにより特定されうる、前記のものに対応する１以上の位置における突然変異を含有しうる。２つのアミノ酸配列の「同一性の割合」は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３のとおりに修飾したものを使用して決定されうる。そのようなアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索が行われうる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されているとおりに、ギャップ化（Ｇａｐｐｅｄ）ＢＬＡＳＴが使用されうる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用されうる。
幾つかの実施形態においては、相互作用依存的標識法はソルターゼの活性断片を使用しうる。特定のソルターゼのそのような断片は、当技術分野の知見に基づいて、またはそのソルターゼのアミノ酸配列を、既知の構造／機能相関を有するソルターゼと比較することにより、特定されうる（例えば、活性ドメインが特定される）。幾つかの例においては、本発明において使用されるソルターゼは、スタヒロコッカス・アウレウス由来のＳｒｔＡのようなソルターゼＡの活性断片、例えば、Ｎ末端の５９または６０アミノ酸残基を欠くソルターゼＡ断片、またはその機能的変異体であることが可能であり、これは、本明細書に記載されている突然変異の１以上を含みうる。
Ｓｒｔ ＡおよびＳｒｔ Ｂのアミノ酸配列ならびにそれらをコードするヌクレオチド配列は当業者に公知であり、本明細書に引用されている多数の参考文献に開示されており、それらの全ての全内容を参照により本明細書に組み入れることとする。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿３７５６４０およびＹＰ＿０４３１９３を参照されたい。スタヒロコッカス・アウレウスＳｒｔＡおよびＳｒｔＢのアミノ酸配列は相同であり、例えば、２２％の配列同一性および３７％の配列類似性を共有している。スタヒロコッカス・アウレウス由来のソルターゼ－トランスアミダーゼのアミノ酸配列も他のグラム陽性菌由来の酵素の配列に対して相当な相同性を有し、そのようなトランスアミダーゼは、本明細書に記載されている連結プロセスにおいて使用されうる。例えば、ＳｒｔＡの場合、エス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）オープンリーディングフレームの配列決定領域全体にわたる最良アライメントで、約３１％の配列同一性（および約４４％の配列類似性）が存在する。エイ・ネスルンジイ（Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）オープンリーディングフレームの配列決定領域全体にわたる最良アラインメントで、約２８％の配列同一性が存在する。細菌株は、細菌株によって異なる、特定のポリペプチドの配列における差異を示しうると理解され、本明細書における配列は例示的なものである。
特定の実施形態においては、ソルターゼをコードするエス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エイ・ネスルンジイ（Ａ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ），エス・ムタンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、イー・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）またはビー・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のオープンリーディングに対して１８％以上の配列同一性、２０％以上の配列同一性または３０％以上の配列同一性を有するトランスアミダーゼソルターゼがスクリーニングされることが可能であり、スタヒロコッカス・アウレウス由来のＳｒｔＡまたはＳｒｔＢと同等のトランスアミダーゼ活性を有する酵素が使用されうる（例えば、同等の活性は、時には、ＳｒｔＡまたはＳｒｔＢ活性の１０％以上である）。
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている相互作用依存的標識法はソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）またはその活性断片を使用する。ＳｒｔＡはモチーフＬＰＸＴＸ（配列番号４）（ここで、Ｘの各存在は、独立して、任意のアミノ酸残基を表す）を認識し、一般的な認識モチーフは、例えば、ＬＰＫＴＧ（配列番号８）、ＬＰＡＴＧ（配列番号９）またはＬＰＮＴＧ（配列番号１０）である。幾つかの実施形態においては、ＬＰＥＴＧ（配列番号５）がソルターゼ認識モチーフとして使用される。しかし、このコンセンサスに当てはまらないモチーフも認識されうる。例えば、幾つかの実施形態においては、該モチーフは、例えばＬＰＸＡＧ（配列番号１１）またはＬＰＮＡＧ（配列番号１２）のように、４位に「Ｔ」の代わりに「Ａ」を含む。幾つかの実施形態においては、該モチーフは、例えばＬＰＸＴＡ（配列番号１３）またはＬＰＮＴＡ（配列番号１４）のように、５位に「Ｇ」の代わりに「Ａ」を含む。幾つかの実施形態においては、該モチーフは、例えばＬＧＸＴＧ（配列番号１５）またはＬＧＡＴＧ（配列番号１６）のように、２位に「Ｐ」の代わりに「Ｇ」を含む。幾つかの実施形態においては、該モチーフは、例えばＩＰＸＴＧ（配列番号１７）、ＩＰＮＴＧ（配列番号１８）またはＩＰＥＴＧ（配列番号１９）のように、１位に「Ｌ」の代わりに「Ｉ」を含む。追加的な適切なソルターゼ認識モチーフは当業者には明らかであり、本発明はこの点において限定されない。トランスアミダーゼまたはソルターゼにより認識される配列に関する「認識モチーフ」および「認識配列」なる語は互換的に用いられると理解される。幾つかの実施形態においては、ＳｒｔＡは、本明細書に記載されている突然変異体であり、これは、野生型対応物と比較して改善された酵素活性を有しうる。そのような突然変異体はＬＡＥＴＧ（配列番号２０）を認識し、該認識配列を含むペプチドを基質として利用しうる。そのようなソルターゼ認識モチーフは、本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて使用されうる。
本発明の幾つかの実施形態においては、ソルターゼは、ソルターゼＢ（ＳｒｔＢ）またはその活性断片、例えば、スタヒロコッカス・アウレウス、ビー・アンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）またはエル・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のソルターゼＢである。Ｂクラスのソルターゼ（ＳｒｔＢ）により認識されるモチーフは、しばしば、コンセンサス配列ＮＰＸＴＸ、例えばＮＰ［Ｑ／Ｋ］－［Ｔ／ｓ］－［Ｎ／Ｇ／ｓ］（配列番号２１）に含まれ、例えば、ＮＰＱＴＮ（配列番号２２）またはＮＰＫＴＧ（配列番号２３）である。例えば、スタヒロコッカス・アウレウスまたはビー・アンスラシス（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）のソルターゼＢは、それぞれの細菌におけるＩｓｄＣのＮＰＱＴＮ（配列番号２２）またはＮＰＫＴＧ（配列番号２３）モチーフを切断する（例えば、Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８９（１７）：６４２５－６４３６，２００７を参照されたい）。クラスＢソルターゼの推定基質において見出される他の認識モチーフはＮＳＫＴＡ（配列番号２４）、ＮＰＱＴＧ（配列番号２５）、ＮＡＫＴＮ（配列番号２６）およびＮＰＱＳＳ（配列番号２７）である。例えば、エル・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）由来のＳｒｔＢは、２位のＰを欠くおよび／または３位のＱもしくはＫを欠く特定のモチーフ、例えばＮＡＫＴＮ（配列番号２６）およびＮＰＱＳＳ（配列番号２７）を認識する（Ｍａｒｉｓｃｏｔｔｉら，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００９ Ｊａｎ．７）。そのようなソルターゼ認識モチーフも、本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて使用されうる。
１つの実施形態においては、ソルターゼ酵素は、ソルターゼＡ、ソルターゼＢ、ソルターゼＣもしくはソルターゼＤまたはそれらの活性断片から選択される。
ソルターゼアクセプターペプチドはソルターゼ認識配列［例えば、ソルターゼＡの場合のＬＰＴＸＧ（配列番号２８）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸残基である）］を含むことが可能であり、ここで、該ペプチドには、検出可能な標識またはタグ、例えばビオチンまたは蛍光色素が結合している。
幾つかの実施形態においては、ベイト細胞の表面上に配置されるソルターゼは、その野生型対応物と比較して改善された触媒活性を示す突然変異ソルターゼ（例えば、突然変異ソルターゼＡ）である。幾つかの例においては、突然変異ソルターゼＡ（ＳｒｔＡ）は、Ｐ９４ＲまたはＰ９４Ｓ、Ｓ１０２Ｃ、Ａ１０４Ｈ、Ｅ１０５Ｄ、Ｋ１３８Ｐ、Ｋ１５２Ｉ、Ｄ１６０ＫまたはＤ１６０Ｎ、Ｋ１６２Ｈ、Ｔ１６４Ｎ、Ｄ１６５Ａ、Ｋ１７３Ｅ、Ｉ１８２Ｖ、Ｋ１９０Ｅ、およびＫ１９６ＳまたはＫ１９６Ｔの１以上の突然変異を含む。一例においては、突然変異体ＳｒｔＡは突然変異Ｐ９４Ｓ、Ｄ１６０ＮおよびＫ１９６Ｔを含む。
１つの実施形態においては、ソルターゼ酵素は、ソルターゼＡ：（５Ｍ）およびｍｇＳｒｔＡから選択される。
幾つかの特定の実施形態においては、ベイト細胞は、前記のソルターゼ酵素をその細胞表面上に含むように操作されている。１つの特定の実施形態においては、ベイト細胞は、実施例７の方法１として記載されている糖結合法により、前記のソルターゼ酵素をその表面上に含むように操作されており、ここで、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素結合体はＧＤＰ－Ｆｕｃ－ソルターゼ酵素結合体であり、これは、ソルターゼ酵素を該細胞の表面上に結合させるためのドナーヌクレオチド基質として使用される。１つの特定の実施形態においては、ベイト細胞は、実施例７の方法１として記載されている糖結合法により、前記のソルターゼ酵素をその表面上に含むように操作されている。ただし、この場合には、フコシルトランスフェラーゼを使用してＧＤＰ－Ｆｕｃ－ソルターゼ酵素結合体を結合させる代わりに、該方法は、シアリルトランスフェラーゼ酵素およびＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ－ソルターゼ酵素結合体を使用して、シアリル化反応によりソルターゼを細胞の表面上に結合させる。
幾つかの特定の実施形態においては、前記のソルターゼは、例えば実施例７の方法２により、ベイト細胞の表面に化学的に結合される。
幾つかの特定の実施形態においては、ソルターゼは、ベイト細胞の遺伝的修飾によりソルターゼ酵素を発現させることを含まない方法により、ベイト細胞の表面上に配置される。
１つの実施形態においては、本開示は、ＴｕｒｂｏＩＤ、ｍｉｎｉＴｕｒｂｏ、ＢｉｏＩＤおよびＢｉｏＩＤ２から選択される無差別ビオチンリガーゼである酵素を表面上に含むベイト細胞を提供し、また、プレイ細胞の相互作用依存的標識におけるその使用方法を提供する。無差別ビオチンリガーゼの場合、ビオチンの存在下、隣接タンパク質を表面上に含有するプレイ細胞にベイト細胞が接触すると、相互作用依存的標識が生じ、この場合、無差別ビオチンリガーゼはビオチンを隣接タンパク質に転移する。
アクセプター分子： 当業者に明らかなとおり、プレイ細胞上のアクセプター分子、およびベイト細胞によりプレイ細胞に結合されるドナー糖ヌクレオチド－タグ－結合体または他のタグ付き基質の性質は、種々の実施形態においては、ベイト細胞上に配置された酵素により駆動される。例えば、種々の実施形態においては、ベイト細胞がその細胞表面上にフコシルトランスフェラーゼを含む場合、プレイ細胞上のアクセプター分子は、フコシルトランスフェラーゼによりフコシル化されうるフコースアクセプターであり、ドナー糖ヌクレオチド－タグ結合体は、タグを含むＧＤＰ－フコース結合体である。そのようなフコースアクセプターは当技術分野で公知であり、ＬａｃＮＡｃおよびα２，３－シアリル化ＬａｃＮＡｃ（ｓＬａｃＮＡｃ）を包含し、これらは、ほとんどの細胞表面を修飾する複合およびハイブリッドＮ－グリカンにおいて一般に見出される。同様に、ベイト細胞がその細胞表面上にシアリルトランスフェラーゼを含む場合、プレイ細胞上のアクセプター分子は、シアリルトランスフェラーゼによりシアリル化されうるシアル酸（ＮｅｕＡｃ）－アクセプターであり、ドナー糖ヌクレオチド－タグ結合体は、タグを含むＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ結合体である。そのようなＮｅｕＡｃアクセプターは当技術分野で公知であり、ガラクトースおよびＮ－アセチルガラクトサミンＧａｌＮＡｃを包含する。
ＩＩ．タグ付き基質
種々の実施形態においては、本明細書に開示されている組成物および方法は、タグ付けされたドナーヌクレオチド糖基質、ソルターゼ認識配列を含むタグ付きソルターゼアクセプターペプチド、または他のタグ付き基質を使用する。近接標識転移の検出を可能にするために、任意の適切なタグが結合されうる。そのようなタグには、以下のものが含まれるが、これらに限定されるものではない：モノまたはポリヒスチジン配列（例えば、６×Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｖ５、ＶＳＶＧ、ＧＦＰ（およびその変異体）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）；アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ、マルトース結合タンパク質；ＳＵＭＯタグ、チオレドキシン、ポリ（ＮＡＮＰ）、ポリＡｒｇ、カルモジュリン結合タンパク質、ＰｕｒＦ断片、ケトステロイドイソメラーゼ、ＰａＰ３．３０、ＴＡＦ１２ヒストンフォールドドメイン、ＦＫＢＰタグ、ＳＮＡＰタグ、Ｈａｌｏタグ、免疫グロブリンＦｃ部分（およびその変異体）、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、カルモジュリン、Ｓタグ、ＳＢＰ、ＣＢＰ、ソフタグ（ｓｏｆｔａｇ）１、ソフタグ３、Ｘｐｒｅｓｓ、イソペプタグ、スパイタグ、ＢＣＣＰ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｎｕｓ、チオレドシン、ＮＡＮＰ、ＴＣ、Ｔｙ、ＧＣＮ４、蛍光分子またはプローブ（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ；フルオレセイン、例えばＦＡＭ）、蛍光プローブＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（または他のシアニン色素）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、蛍光タンパク質［例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）］、フィコエリトリン（ＰＥ）など。所望により、タグは、例えばプロテアーゼにより、切断可能であり、したがって除去されうる。幾つかの実施形態においては、これは、例えば、プロテアーゼ切断部位を、タグの機能的部分に隣接させて又は該部分に連結させて、タグに含有させることにより達成される。このようにして使用されうるプロテアーゼタグの非限定的な例には、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子およびＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼが含まれる。特定の実施形態においては、タグはビオチンである。また、幾つかの実施形態においては、基質とタグとは一体であり同一である。例えば、ベイト細胞の表面上に配置される酵素が無差別ビオチンリガーゼである場合、基質はビオチンである。前記のとおり、ビオチンは適切なタグである。したがって、プレイ細胞上へのタグ付き基質の接触誘発性結合後のプレイ細胞上の基質の存在の検出を促進させるためには、ビオチン基質へのタグの結合は不要である。
ＩＩＩ．ベイト細胞を酵素に結合させるための方法
本発明のベイト細胞は、任意の適切な方法により、それらの表面上に酵素を含有するように操作されうる。特定の実施形態においては、ベイト細胞は、コンジュゲート化（結合）によりその細胞表面に結合した酵素を含む。結合は任意の適切な方法によるものでありうる。例えば、幾つかの実施形態においては、結合は化学的または酵素的結合によるものである。そのような結合方法は当技術分野で公知であり、本明細書に開示されている。幾つかの実施形態においては、酵素は遺伝的修飾によりベイト細胞の表面上で発現される。
酵素的結合
例えば、特定の実施形態においては、ベイト細胞は、グリコシル化に基づく結合方法によりその細胞表面に結合された酵素を含む。例えば、本発明者らは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１６５０３（ＷＯ２０１８／１４４７６９として公開されている）（その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）において、そのような方法を既に記載している。グリコシル化に基づく適切な結合には、本明細書において実施例に開示されており図面に例示されている方法が含まれる（例えば、図１Ｂおよび図２を参照されたい）。ヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼは顕著な基質耐性を有し、望ましい実質的にあらゆるものがＧＤＰ－フコース基質に例えばリンカーを介して結合可能であり、グリコシル化反応において該酵素により尚も利用されうる。したがって、幾つかの実施形態においては、該酵素は、以下の工程を含む方法（例えば、実施例７の方法１）によりベイト細胞の表面に結合されうる。まず、アミンカップリングまたは部位特異的修飾（例えば、アルデヒドタグまたは非天然アミノ酸修飾）により、「クリック可能」基、例えばテトラジン、アジドまたはアルキンに酵素を連結する。ついで、相補的「クリック可能」基を含有する容易に利用可能なＧＤＰ－フコース誘導体に該酵素を更に連結して、クリックケミストリーによりＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素を形成させる。最後に、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素をヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼによる触媒により細胞表面上に転移させる。該フコシルトランスフェラーゼはＬａｃＮＡｃ／シアリルＬａｃＮＡｃグリカンのような細胞表面上の糖アクセプターをグリコシル化する。同様に、幾つかの実施形態においては、ベイト細胞の表面上へのＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素の転移を触媒するために、他のフコシルトランスフェラーゼが使用されうる。例えば、特定の実施形態においては、ベイト細胞の表面上へのＧＤＰ－ＦＵＣ－酵素の転移を触媒するために、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）α１－２－フコシルトランスフェラーゼ（Ｈｍ１，２ＦＴ）、ヘリコバクター・ピロリα１，３／１，４フコシルトランスフェラーゼまたはヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）が使用される。同様に、特定の実施形態においては、ベイト細胞の表面上へのＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ－酵素の転移を触媒するために、シアリルトランスフェラーゼが使用される。例えば、特定の実施形態においては、ベイト細胞の表面上へのＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ－酵素の転移を触媒するために、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１、ＳＴ３Ｇａｌ１、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）α（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｓｅｌａ）α（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）が使用される。
化学的結合
幾つかの実施形態においては、酵素は化学的結合法によりベイト細胞の表面に結合される。特定の実施形態においては、酵素は、実施例７の方法２に記載されている工程を含む方法により、ベイト細胞の表面に化学的に結合される。まず、酵素をアミンカップリングによりテトラジンに連結して、酵素－テトラジン結合体（酵素－Ｔｚ）を形成させる。次に、酵素に結合することになる細胞をＴＣＯ－ＮＨＳエステルで処理して、その細胞表面上にＴＣＯ部分を導入する。最後に、酵素－Ｔｚ結合体を双直交（ｂｉｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）反応により細胞表面上のＴＣＯ－ＮＨＳ部分と反応させて、細胞－酵素表面結合体を形成させる。
遺伝的発現
幾つかの実施形態においては、遺伝的修飾により酵素をベイト細胞の表面上で発現させる。細胞を遺伝的に改変するための方法は当技術分野で周知であり、任意の適切な方法を用いて、本発明のベイト細胞を操作することが可能である。幾つかの実施形態においては、よく知られている分子生物学における標準的な組換え技術（例えば、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，１．５３［Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９］（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい）を用いて、酵素をベイト細胞の表面上で発現させる。該方法はいずれの特定のクローニング方法にも限定されない。本開示によるベイト細胞上での発現ための酵素を含有する発現ベクターを製造するために、いずれかの種々のクローニング方法が使用されうる、と当業者は十分に理解するであろう。例えば、酵素をコードする１以上のポリヌクレオチドを適切なベクター要素と共に発現ベクター内にクローニングして、ベイト細胞の表面上での酵素の発現を駆動することが可能である。幾つかの場合には、酵素のヌクレオチド配列（所望により「コドン最適化」配列）を決定したら、遺伝子（または互換的に「ポリヌクレオチド」）を新たに合成して、該遺伝子の５’末端および３’末端にユニーク制限酵素切断部位を含有する追加的ヌクレオチド配列を該遺伝子に加えて含むｃＤＮＡを形成させる。この目的には、幾つかの直接遺伝子合成法が利用可能であり、これらの方法は当業者によく知られている（Ｍｏｎｔａｇｕｅ ＭＧ，Ｌａｒｔｉｇｕｅ Ｃ，Ｖａｓｈｅｅ Ｓ．（２０１２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（５）：６５９－６６５（これを参照により本明細書に組み入れることとする））。酵素遺伝子全体に相当するポリヌクレオチドおよび前記の追加的ヌクレオチド配列は直接的に合成可能であり、あるいは、遺伝子の部分断片を直接的に合成し、ついで、ＰＣＲプライマーを使用し、これらの断片を連結して、完全長遺伝子を作製することが可能である。遺伝子合成後、所望により使用されうる調節要素と共に隣接制限部位を含有する新規遺伝子のヌクレオチド配列は、当業者によく知られているｃＤＮＡの直接遺伝子配列決定により確認されうる（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ Ｅ，Ｌｕｎｄｅｂｅｒｇ Ｊ，Ａｈｍａｄｉａｎ Ａ．（２００９）Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９３：（２）１０５－１１１（これを参照により本明細書に組み入れることとする））。ｃＤＮＡ配列を確認したら、分子生物学における標準的な組換え技術を用いて、ｃＤＮＡを組換えタンパク質発現ベクター内にクローニングする。発現される組換えタンパク質の量および質を最適化するために、典型的には、組換えタンパク質を発現させるために使用される個々の宿主細胞に適合するように、発現ベクターを選択する。典型的には、発現ベクターを、個々の宿主細胞における新規遺伝子の発現を最適化するのに必要な追加的な要素に相当するヌクレオチド配列で操作し、該追加的要素は、新規遺伝子を含有するｃＤＮＡの挿入を容易にするクローニング部位、効率的で高レベルの遺伝子発現を可能にするプロモーター／エンハンサー要素、ｃＤＮＡインサートの配列決定を可能にするプライマー部位、新規遺伝子のｍＲＮＡの効率的な転写終結およびポリアデニル化を可能にするポリアデニル化シグナル、ならびに細菌および哺乳類細胞における形質転換体の選択を可能にする選択遺伝子を包含するが、これらに限定されるものではない。発現ベクターは真核生物発現ベクターでありうる。発現ベクターは哺乳類発現ベクターでありうる。発現ベクターはウイルス発現ベクターでありうる。発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターでありうる。該方法は、発現ベクターの配列決定、ベクターのゲル電気泳動の実施および／またはＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上の酵素の観察を含む、酵素をコードする１以上のポリヌクレオチドの、発現ベクター内へのクローニングを検証することを更に含みうる。該方法は、酵素をコードするポリヌクレオチドを増幅し、酵素を発現ベクター内にクローニングすることを更に含みうる。酵素をコードするポリヌクレオチドの増幅は、遺伝子に少なくとも部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを合成することを含みうる。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドにアニーリングするのに十分な程度に、遺伝子に相補的でありうる。オリゴヌクレオチドはリンカー配列を含みうる。多数の適切なリンカーが当技術分野で公知であり、本発明における使用に適している。
該方法は、細胞を発現ベクターでトランスフェクトし又は感染させることを含みうる。該方法は、細胞内で酵素を発現させることを更に含みうる。該方法は、無細胞株で酵素を発現させることを更に含みうる。該方法は、発現ベクターを含むウイルスを産生させることを更に含みうる。該方法は、ウイルスを増殖させることを更に含みうる。該方法は、発現ベクターを含むウイルスを細胞に感染させることを更に含みうる。該方法は、細胞を増殖させることを更に含みうる。
１つの特定の実施形態においては、図１１に示されているレンチウイルスベクターを使用して、酵素を発現させる。この図は、ベイト細胞の表面上でヒトＦＵＴ６を発現させるためのベクター地図を示す。この構築物は、２つのグリシンアミノ酸を介してＨＡタグに連結された膜アラニルアミノペプチダーゼ膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、およびＨＡタグ付きＴＭＤをＦＵＴ６外部ドメインに連結するリンカー（ＴＥＶ切断部位を含有する）を、Ｎ末端からＣ末端への方向に含む。ＦＵＴ６レンチウイルス構築物インサートのタンパク質配列は４１６アミノ酸であり、以下のアミノ酸配列を有する４７．２１ｋＤａタンパク質をコードすると推定される。
Figure 2022535045000006
ＦＵＴ６レンチウイルス構築物インサートは以下のＤＮＡ配列（１２５１ｂｐ）によりコードされうる。
Figure 2022535045000007
レンチウイルス発現ベクターにおけるインサートを含有するＦＵＴ６レンチウイルス構築物は以下のＤＮＡ配列（８６２２ｂｐ）によりコードされうる。
Figure 2022535045000008
Figure 2022535045000009
Figure 2022535045000010
Figure 2022535045000011
Figure 2022535045000012
ＩＶ．ベイト細胞の使用方法
幾つかの実施形態においては、本開示は、ベイト細胞を使用してプレイ細胞を相互作用依存的に標識するための方法を提供し、該方法は、適切なタグ付き基質の存在下、プレイ細胞をベイト細胞と接触させることを含む。本明細書における「適切なタグ付き基質」に対する言及は、ベイト細胞の表面上に結合した酵素によって相互作用依存的標識反応において利用されうる基質を意味し、ここで、基質は、本明細書に開示されているとおり、タグを含む。したがって、何ら限定的なものではないが例えば、ベイト細胞上に配置された酵素がフコシルトランスフェラーゼである場合、「適切なタグ付き基質」に対する言及はタグ付きＧＤＰ－フコース（例えば、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン）を意味する。同様に、ベイト細胞上に配置された酵素がシアリルトランスフェラーゼである場合、「適切なタグ付き基質」に対する言及はタグ付きＣＭＰ－シアル酸（例えば、ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ－ビオチン）を意味する。ベイト細胞の表面上の酵素の存在ゆえに、そのような接触事象は相互作用依存的標識、すなわち、プレイ細胞上へのタグ付き基質の接触誘発性結合をもたらす。前記のとおり、適切な基質の選択は当業者に明らかであり、ベイト細胞上で操作される酵素に左右される。
プレイ細胞上のタグの存在（すなわち、「標識された細胞」）は、例えば、免疫蛍光、免疫組織化学、イムノブロット、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、マイクロアレイ分析、ＳＤＳ ＰＡＧＥ、質量分析、ＨＰＬＣ（これらに限定されるものではない）を含む任意の適切な手段により決定されうる。標識された細胞は、例えば、標識の存在に関するＦＡＣＳ選別を利用するために、更に富化されうる。標識された細胞は、他のマーカー、例えば細胞表面マーカー、例えばＰＤ－１、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＸＣＲ５および／もしくはＴＩＭ３、ならびに／または細胞型を示すための追加的マーカー、例えばＣＤ４５、ＣＤ８、ＣＤ４などの存在または存在欠如によって、更に選別されうる。
１つの実施形態においては、本開示は、酵素、例えばフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）を短いＰＥＧリンカーを介してその基質ＧＤＰ－Ｆｕｃに結合させてＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴを形成させる組成物および方法を提供する。ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴは、Ｆｕｃ－ＦＴを細胞表面糖衣におけるＬａｃＮＡｃに約１５分で転移させる自己触媒として機能する。細胞－ＦＴ結合体は、細胞間相互作用の検出のために、プローブ分子（例えば、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチンまたはＧＤＰ－Ｆｕｃ－タグ）を接触プレイ細胞の表面グリカンに転移させうる。更に、細胞表面への幾つかの他の酵素の結合の成功を示す本明細書で提供するデータは、新たな酵素機能を細胞に付与するための、この結合法の汎用性を示している。この技術は幾つかの利点を有する。（１）それは種々の細胞型に適している。なぜなら、ＧＤＰ－フコースアクセプター－グリカンＬａｃＮＡｃまたはα２，３－シアリル化ＬａｃＮＡｃ（ｓＬａｃＮＡｃ）は、ほとんどの細胞表面を修飾する複合およびハイブリッドＮ－グリカンにおいて一般に見出されるからである。（２）長時間を要する複雑な遺伝的修飾は必要ない。そして（３）細胞間相互作用を検出／モニターし、このようにして近接標識された細胞を選別するために、蛍光顕微鏡イメージングおよびフローサイトメトリー／ＦＡＣＳのような一般的な実験技術が用いられる。
幾つかの実施形態においては、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団に存在する腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞にタグ付けするための方法を提供し、該方法は、
プレイ細胞上の相互作用依存的標識反応を触媒するための適切な酵素を細胞表面上に含むように操作された樹状細胞であるベイト細胞を準備し、
該樹状細胞を１以上のＴＳＡでプライミングするために、１以上のＴＳＡまたは１以上のＴＳＡの供給源（例えば、腫瘍細胞ライセート）と共にベイト細胞をインキュベートし、
ベイト細胞を腫瘍浸潤リンパ球（例えば、腫瘍サンプルから得られる細胞の集団に含まれるもの）の集団と接触させることを含み、ここで、該集団は少なくとも１つの腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を含み、該接触は該酵素のタグ付き基質の存在下で生じる。
幾つかの実施形態においては、該方法は、タグのみの存在に関して、または所望の細胞集団を富化するための１以上の追加的な細胞マーカーと組合されたタグの存在に関して、タグ付き細胞をＦＡＣＳにより選別することにより、タグ付きＴＳＡ反応性Ｔ細胞を富化することを更に含む。例えば、幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞マーカーを発現するタグ付き細胞を富化するために（すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞の場合にはＣＤ８＋細胞を富化し、ヘルパーＴ細胞の場合にはＣＤ４＋を富化するために）、ならびに／またはＤＣマーカーを発現する細胞を除外するために（すなわち、ＣＤ４５．１－／－ 細胞を富化するために）、ならびに／または有望なＴＳＡ反応性を示すマーカーを富化するために（すなわち、ＰＤ－１＋、ＣＤ１３４＋、ＣＤ１３７＋である細胞を富化するために）、ならびに／または他のマーカー、例えばＣＸＣＲ５＋および／もしくはＴＩＭ３＋を富化するために、細胞を選別する。該方法の幾つかの実施形態においては、酵素はフコシルトランスフェラーゼであり、タグ付き基質は、タグに結合したＧＤＰ－フコースである。幾つかの実施形態においては、タグは、本明細書に開示されているタグのいずれかである。幾つかの実施形態においては、タグはビオチンである。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトフコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼは組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトフコシルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３／１，４－フコシルトランスフェラーゼである。該方法の幾つかの実施形態においては、酵素はシアリルトランスフェラーゼであり、タグ付き基質は、タグに結合したＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃである。幾つかの実施形態においては、タグはビオチンである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧＡＬ１である。１つの実施形態においては、ヒトＳＴ６ＧＡＬ１は組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。１つの実施形態においては、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１は組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はパスツレラ・マルトシダα（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）である。幾つかの実施形態においては、ベイト細胞は、細胞表面への酵素の結合により、または細胞内での酵素の組換え発現により、その表面上に酵素を含むように操作される。幾つかの実施形態においては、結合は化学的結合（化学結合）である。幾つかの実施形態においては、化学的結合は、本明細書の実施例７に開示されている方法２によるものである。幾つかの実施形態においては、結合は細胞表面への酵素の酵素的結合によるものである。幾つかの実施形態においては、酵素的結合は、本明細書の実施例７に開示されている方法１に従うＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素結合体による細胞のフコシル化によるものである。特定の実施形態においては、細胞の表面への酵素の結合を触媒するフコシル化酵素はヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ酵素である。幾つかの実施形態においては、細胞の表面への酵素の結合を触媒するフコシル化酵素はヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）またはヘリコバクター・ピロリα１，３／４フコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、酵素的結合は、本明細書の実施例７に開示されている方法１に記載されているとおりに実施される。ただし、この場合、フコシルトランスフェラーゼ酵素および（ドナーヌクレオチド基質として）ＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素結合体を使用する代わりに、該方法は、細胞の表面上に酵素を結合させるためにシアリルトランスフェラーゼ酵素およびＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ－酵素を使用する。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧＡＬ１ ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はパスツレラ・マルトシダα（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）である。
幾つかの実施形態においては、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団に存在する腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞にタグ付けするための方法を提供し、該方法は、
樹状細胞を準備し、
樹状細胞を１以上のＴＳＡでプライミングするために、１以上のＴＳＡまたは１以上のＴＳＡの供給源（例えば、腫瘍細胞ライセート）と共に樹状細胞をインキュベートし、
樹状細胞を、その細胞表面上で、プレイ細胞上の相互作用依存的標識反応を触媒するための適切な酵素に結合させ、
ベイト細胞を腫瘍浸潤リンパ球（例えば、腫瘍サンプルから得られる細胞の集団に含まれるもの）の集団と接触させることを含み、ここで、該集団は少なくとも１つの腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を含み、該接触は該酵素のタグ付き基質の存在下で生じる。
幾つかの実施形態においては、該方法は、タグのみの存在に関して、または所望の細胞集団を富化するための１以上の追加的な細胞マーカーと組合されたタグの存在に関して、タグ付き細胞をＦＡＣＳにより選別することにより、タグ付きＴＳＡ反応性Ｔ細胞を富化することを更に含む。例えば、幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞マーカーを発現するタグ付き細胞を富化するために（すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞の場合にはＣＤ８＋細胞を富化し、ヘルパーＴ細胞の場合にはＣＤ４＋を富化するために）、ならびに／またはＤＣマーカーを発現する細胞を除外するために（すなわち、ＣＤ４５．１－／－ 細胞を富化するために）、ならびに／または有望なＴＳＡ反応性を示すマーカーを富化するために（すなわち、ＰＤ－１＋、ＣＤ１３４＋、ＣＤ１３７＋である細胞を富化するために）、ならびに／または他のマーカー、例えばＣＸＣＲ５＋および／もしくはＴＩＭ３＋を富化するために、細胞を選別する。該方法の幾つかの実施形態においては、酵素はフコシルトランスフェラーゼであり、タグ付き基質は、タグに結合したＧＤＰ－フコースである。幾つかの実施形態においては、タグは、本明細書に開示されているタグのいずれかである。幾つかの実施形態においては、タグはビオチンである。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトフコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼは組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトフコシルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３／１，４－フコシルトランスフェラーゼである。該方法の幾つかの実施形態においては、酵素はシアリルトランスフェラーゼであり、タグ付き基質は、タグに結合したＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃである。幾つかの実施形態においては、タグはビオチンである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧＡＬ１である。１つの実施形態においては、ヒトＳＴ６ＧＡＬ１は組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。１つの実施形態においては、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１は組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はパスツレラ・マルトシダα（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）である。幾つかの実施形態においては、樹状細胞の細胞表面上の酵素の結合は化学的結合（化学結合）によるものである。幾つかの実施形態においては、化学的結合は、フコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを使用して、本明細書の実施例７に開示されている方法２におけるとおりに実施される。幾つかの実施形態においては、樹状細胞の細胞表面上の酵素の結合は細胞表面への酵素の酵素的結合によるものである。幾つかの実施形態においては、酵素的結合は、本明細書の実施例７に開示されている方法１に従うＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素結合体による細胞のフコシル化によるものである。特定の実施形態においては、細胞の表面への酵素の結合を触媒するフコシル化酵素はヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ酵素である。幾つかの実施形態においては、細胞の表面への酵素の結合を触媒するフコシル化酵素はヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）またはヘリコバクター・ピロリα１，３／４フコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、酵素的結合は、本明細書の実施例７に開示されている方法１に記載されているとおりに実施される。ただし、この場合、細胞の表面上に酵素を結合させるためにフコシルトランスフェラーゼ酵素および（ドナーヌクレオチド基質として）ＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素結合体を使用するフコシル化反応を用いる代わりに、該方法は、細胞の表面上に酵素を結合させるためにシアリルトランスフェラーゼ酵素およびＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ－酵素を使用する。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧＡＬ１ ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はパスツレラ・マルトシダα（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）である。
幾つかの実施形態においては、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を特定し富化するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）プレイ細胞上の相互作用依存的標識反応を触媒するための適切な酵素を細胞表面上に含むように操作された樹状細胞であるベイト細胞を準備し、
（ｂ）該樹状細胞を１以上のＴＳＡでプライミングするために、１以上のＴＳＡまたは１以上のＴＳＡの供給源（例えば、腫瘍細胞ライセート）と共にベイト細胞をインキュベートし、
（ｃ）ベイト細胞を腫瘍浸潤リンパ球（例えば、腫瘍サンプルから得られる細胞の集団に含まれるもの）の集団と接触させ、ここで、該集団は少なくとも１つの腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を含み、該接触はベイト細胞上の酵素のための適切なタグ付き基質の存在下で生じ、
（ｄ）タグ付き基質を含有しない腫瘍浸潤リンパ球の集団から、タグ付き基質を含む細胞を単離することを含む。
単離工程（ｄ）は任意の適切な方法で実施される。例えば、１つの実施形態においては、単離工程（ｄ）は、基質上のタグに対する特異性を有する結合性部分に結合した固体基体、例えばビーズを使用するプルダウンアッセイにより実施される。１つの好ましい実施形態においては、単離工程（ｄ）は、ＦＡＣＳを使用して実施される。
幾つかの実施形態においては、該方法は、タグのみの存在に関して、または所望の細胞集団を富化するための１以上の追加的な細胞マーカーと組合されたタグの存在に関して、タグ付き細胞をＦＡＣＳにより選別することにより、タグ付きＴＳＡ反応性Ｔ細胞を富化することを更に含む。例えば、幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞マーカーを発現するタグ付き細胞を富化するために（すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞の場合にはＣＤ８＋細胞を富化し、ヘルパーＴ細胞の場合にはＣＤ４＋を富化するために）、ならびに／またはＤＣマーカーを発現する細胞を除外するために（すなわち、ＣＤ４５．１－／－ 細胞を富化するために）、ならびに／または有望なＴＳＡ反応性を示すマーカーを富化するために（すなわち、ＰＤ－１＋、ＣＤ１３４＋および／またはＣＤ１３７＋である細胞を富化するために）、または他のマーカー、例えばＣＸＣＲ５＋および／もしくはＴＩＭ３＋に関する発現プロファイルに基づいて富化するために、細胞を選別する。１つの実施形態においては、ＣＤ８＋およびＰＤ－１＋でもあるタグ付き細胞ならびに／またはＣＤ４＋でもあるタグ付き細胞を単離することにより、細胞傷害性ＴＳＡ反応性Ｔ細胞を富化する。そのようなＴＳＡ反応性Ｔ細胞を増殖させ、養子Ｔ細胞療法において使用する。また、そのようなＴＳＡ反応性Ｔ細胞を単離し、単一細胞Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列決定により配列決定して、研究および治療目的のＴＳＡ反応性ＴＣＲ Ｔ細胞の組換え構築を可能にするＴＳＡ反応性ＴＣＲの配列を決定する。該方法の幾つかの実施形態においては、酵素はフコシルトランスフェラーゼであり、タグ付き基質は、タグに結合したＧＤＰ－フコースである。幾つかの実施形態においては、タグは、本明細書に開示されているタグのいずれかである。幾つかの実施形態においては、タグはビオチンである。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトフコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼは組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトフコシルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３／１，４－フコシルトランスフェラーゼである。該方法の幾つかの実施形態においては、酵素はシアリルトランスフェラーゼであり、タグ付き基質は、タグに結合したＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃである。幾つかの実施形態においては、タグはビオチンである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧＡＬ１である。１つの実施形態においては、ヒトＳＴ６ＧＡＬ１は組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。１つの実施形態においては、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１は組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はパスツレラ・マルトシダα（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）である。幾つかの実施形態においては、樹状細胞の細胞表面上の酵素の結合は化学的結合（化学結合）によるものである。幾つかの実施形態においては、化学的結合は、フコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを使用して、本明細書の実施例７に開示されている方法２におけるとおりに実施される。幾つかの実施形態においては、樹状細胞の細胞表面上の酵素の結合は細胞表面への酵素の酵素的結合によるものである。幾つかの実施形態においては、酵素的結合は、本明細書の実施例７に開示されている方法１に従うＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素結合体による細胞のフコシル化によるものである。特定の実施形態においては、細胞の表面への酵素の結合を触媒するフコシル化酵素はヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ酵素である。幾つかの実施形態においては、細胞の表面への酵素の結合を触媒するフコシル化酵素はヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）またはヘリコバクター・ピロリα１，３／４フコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、酵素的結合は、本明細書の実施例７に開示されている方法１に記載されているとおりに実施される。ただし、この場合、細胞の表面上に酵素を結合させるためにフコシルトランスフェラーゼ酵素および（ドナーヌクレオチド基質として）ＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素結合体を使用するフコシル化反応を用いる代わりに、該方法は、細胞の表面上に酵素を結合させるためにシアリルトランスフェラーゼ酵素およびＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ－酵素を使用する。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧＡＬ１ ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はパスツレラ・マルトシダα（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）である。
例えば、実施例５～６は本方法の１つの実施形態を示し、ここで、ベイト細胞は、その表面にフコシルトランスフェラーゼ（例えば、ヘリコバクター・ピロリα１，３－フコシルトランスフェラーゼ）を有するように操作された樹状細胞であり、タグ付き基質はビオチン－結合ＧＤＰ－フコースである。工程（ｂ）において、樹状細胞ベイト細胞を腫瘍細胞ライセートと共にインキュベートすると、ＤＣが、該ライセート中に存在するＴＳＡに結合し、それを提示する。（ｃ）の接触工程において、ライセート中に存在しＤＣにより提示されるＴＳＡに対するアフィニティを有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する腫瘍浸潤リンパ球の集団に存在するＴ細胞はＤＣ表面結合フコシルトランスフェラーゼにより近接標識されて、細胞の糖衣上のＬａｃＮＡｃおよびシアロ－ＬａｃＮＡｃのフコシル化によりＴ細胞表面上にビオチン部分が取り込まれる。ついで細胞を（例えば、ストレプトアビジン－ＡＰＣまたはフルオレセイン結合ストレプトアビジンを使用して）ビオチンおよびＣＤ４５、ＣＤ８、ＣＤ４、ＰＤ－１、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＸＣＲ５およびＴＩＭ３のような細胞型の他のマーカーに関して染色し、ストレプトアビジンシグナルを有する細胞をＦＡＣＳにより単離し、他のマーカーの存在または非存在に関して更に選別する。ＰＤ－１を発現するビオチン化ＣＤ８＋細胞は細胞傷害性ＴＳＡ反応性Ｔ細胞に関して高度に富化される。ついで、これらの細胞の単一細胞ＴＣＲ配列決定を用いて、ＴＳＡ特異的ＴＣＲの正体を決定する。
幾つかの実施形態においては、本発明は、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞の集団を提供し、その全てまたは実質的に全ては、（ｉ）それらの表面上で１以上のタグ付きフコースまたはタグ付きＮｅｕＡｃ部分に結合しており、（ｉｉ）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であり、そして、所望により、ＰＤ－１＋およびＣＤ４５．１－／－でありうる。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は実質的または完全にＣＤ８＋である。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は実質的または完全にＣＤ４＋である。
幾つかの実施形態においては、本開示は、組織浸潤リンパ球（ＴｉＩＬ）または循環Ｔ細胞の集団に存在する自己反応性Ｔ細胞にタグ付けするための方法を提供し、該方法は、
樹状細胞を準備し、
１以上の自己抗原で樹状細胞をプライミングするために、１以上の自己抗原または１以上の自己抗原の供給源（例えば、自己免疫疾患を有する対象からの罹患組織生検細胞ライセート）と共に樹状細胞をインキュベートし、
樹状細胞を、その細胞表面上で、プレイ細胞上の相互作用依存的標識反応を触媒するための適切な酵素に結合させ、
ベイト細胞をＴｉＩＬ（例えば、自己免疫疾患を有する対象からの罹患組織生検から得られる細胞の集団に含まれるもの）の集団と接触させることを含み、ここで、該集団は少なくとも１つの自己反応性Ｔ細胞を含み、該接触は該酵素のタグ付き基質の存在下で生じる。
幾つかの実施形態においては、該方法は、タグのみの存在に関して、または所望の細胞集団を富化するための１以上の追加的な細胞マーカーと組合されたタグの存在に関して、タグ付き細胞をＦＡＣＳにより選別することにより、タグ付き自己反応性Ｔ細胞を富化することを更に含む。例えば、幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞マーカーを発現するタグ付き細胞を富化するために（すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞の場合にはＣＤ８＋細胞を富化し、有望な抗原特異的制御性Ｔ細胞であるＴ細胞の場合にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋を富化するために）、および／またはＤＣマーカーを発現する細胞を除外するために（すなわち、ＣＤ４５．１－／－ 細胞を富化するために）、細胞を選別する。該方法の幾つかの実施形態においては、酵素はフコシルトランスフェラーゼであり、タグ付き基質は、タグに結合したＧＤＰ－フコースである。幾つかの実施形態においては、タグは、本明細書に開示されているタグのいずれかである。幾つかの実施形態においては、タグはビオチンである。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトフコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼは組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトフコシルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３／１，４－フコシルトランスフェラーゼである。該方法の幾つかの実施形態においては、酵素はシアリルトランスフェラーゼであり、タグ付き基質は、タグに結合したＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃである。幾つかの実施形態においては、タグはビオチンである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧＡＬ１である。１つの実施形態においては、ヒトＳＴ６ＧＡＬ１は組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。１つの実施形態においては、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１は組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はパスツレラ・マルトシダα（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）である。幾つかの実施形態においては、樹状細胞の細胞表面上の酵素の結合は化学的結合（化学結合）によるものである。幾つかの実施形態においては、化学的結合は、フコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを使用して、本明細書の実施例７に開示されている方法２におけるとおりに実施される。幾つかの実施形態においては、樹状細胞の細胞表面上の酵素の結合は細胞表面への酵素の酵素的結合によるものである。幾つかの実施形態においては、酵素的結合は、本明細書の実施例７に開示されている方法１に従うＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素結合体による細胞のフコシル化によるものである。特定の実施形態においては、細胞の表面への酵素の結合を触媒するフコシル化酵素はヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ酵素である。幾つかの実施形態においては、細胞の表面への酵素の結合を触媒するフコシル化酵素はヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）またはヘリコバクター・ピロリα１，３／４フコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、酵素的結合は、本明細書の実施例７に開示されている方法１に記載されているとおりに実施される。ただし、この場合、該方法は、細胞の表面上に酵素を結合させるためにフコシルトランスフェラーゼ酵素および（ドナーヌクレオチド基質として）ＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素結合体を使用するフコシル化反応を用いる代わりに、細胞の表面上に酵素を結合させるためにシアリルトランスフェラーゼ酵素およびＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ－酵素を使用し、該方法は、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞を特定するために腫瘍細胞ライセートを使用する代わりに、自己反応性Ｔ細胞を特定するために、自己免疫疾患を有する対象からの罹患組織生検細胞ライセートを使用することを含む。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧＡＬ１ ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はパスツレラ・マルトシダα（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）である。
幾つかの実施形態においては、本開示は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または循環Ｔ細胞から自己反応性Ｔ細胞を特定し富化するための方法を提供し、該方法は、
（ａ）プレイ細胞上の相互作用依存的標識反応を触媒するための適切な酵素を細胞表面上に含むように操作された樹状細胞であるベイト細胞を準備し、
（ｂ）該樹状細胞を１以上の自己抗原でプライミングするために、１以上の自己抗原または１以上の自己抗原の供給源（例えば、自己免疫疾患を有する対象からの罹患組織生検細胞ライセート）と共に樹状細胞をインキュベートし、
（ｃ）ベイト細胞をＴｉＩＬ（例えば、自己免疫疾患を有する対象からの罹患組織生検から得られる細胞の集団に含まれるもの）の集団と接触させ、ここで、該集団は少なくとも１つの自己反応性Ｔ細胞を含み、該接触はベイト細胞および酵素のための適切なタグ付き基質の存在下で生じ、
（ｄ）タグ付き基質を含有しないＴｉＩＬまたは循環Ｔ細胞の集団から、タグ付き基質を含む細胞を単離することを含む。
単離工程（ｄ）は任意の適切な方法で実施される。例えば、１つの実施形態においては、単離工程（ｄ）は、基質上のタグに対する特異性を有する結合性部分に結合した固体基体、例えばビーズを使用するプルダウンアッセイにより実施される。１つの好ましい実施形態においては、単離工程（ｄ）は、ＦＡＣＳを使用して実施される。
幾つかの実施形態においては、該方法は、タグのみの存在に関して、または所望の細胞集団を富化するための１以上の追加的な細胞マーカーと組合されたタグの存在に関して、タグ付き細胞をＦＡＣＳにより選別することにより、タグ付き自己反応性Ｔ細胞を富化することを更に含む。
例えば、幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞マーカーを発現するタグ付き細胞を富化するために（すなわち、細胞傷害性Ｔ細胞の場合にはＣＤ８＋細胞を富化し、有望な抗原特異的制御性Ｔ細胞であるＴ細胞の場合にはＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋を富化するために）、および／またはＤＣマーカーを発現する細胞を除外するために（すなわち、ＣＤ４５．１－／－ 細胞を富化するために）、細胞を選別する。該方法の幾つかの実施形態においては、酵素はフコシルトランスフェラーゼであり、タグ付き基質は、タグに結合したＧＤＰ－フコースである。幾つかの実施形態においては、タグは、本明細書に開示されているタグのいずれかである。幾つかの実施形態においては、タグはビオチンである。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトフコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヒトα１，３－フコシルトランスフェラーゼは組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヒトフコシルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、フコシルトランスフェラーゼ酵素はヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３－フコシルトランスフェラーゼである。１つの実施形態においては、ヘリコバクター・ピロリ フコシルトランスフェラーゼはヘリコバクター・ピロリα１，３／１，４－フコシルトランスフェラーゼである。該方法の幾つかの実施形態においては、酵素はシアリルトランスフェラーゼであり、タグ付き基質は、タグに結合したＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃである。幾つかの実施形態においては、タグはビオチンである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧＡＬ１である。１つの実施形態においては、ヒトＳＴ６ＧＡＬ１は組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。１つの実施形態においては、ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１は組換え的に製造される。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はパスツレラ・マルトシダα（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）である。幾つかの実施形態においては、樹状細胞の細胞表面上の酵素の結合は化学的結合（化学結合）によるものである。幾つかの実施形態においては、化学的結合は、フコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを使用して、本明細書の実施例７に開示されている方法２におけるとおりに実施される。幾つかの実施形態においては、樹状細胞の細胞表面上の酵素の結合は細胞表面への酵素の酵素的結合によるものである。幾つかの実施形態においては、酵素的結合は、本明細書の実施例７に開示されている方法１に従うＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素結合体による細胞のフコシル化によるものである。特定の実施形態においては、細胞の表面への酵素の結合を触媒するフコシル化酵素はヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ酵素である。幾つかの実施形態においては、細胞の表面への酵素の結合を触媒するフコシル化酵素はヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）またはヘリコバクター・ピロリα１，３／４フコシルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、酵素的結合は、本明細書の実施例７に開示されている方法１に記載されているとおりに実施される。ただし、この場合、該方法は、細胞の表面上に酵素を結合させるためにフコシルトランスフェラーゼ酵素および（ドナーヌクレオチド基質として）ＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素結合体を使用するフコシル化反応を用いる代わりに、細胞の表面上に酵素を結合させるためにシアリルトランスフェラーゼ酵素およびＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ－酵素を使用し、該方法は、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞を特定するために腫瘍細胞ライセートを使用する代わりに、自己反応性Ｔ細胞を特定するために、自己免疫疾患を有する対象からの罹患組織生検細胞ライセートを使用することを含む。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼである。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトＳＴ６ＧＡＬ１ ヒトＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１である。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はヒトシアリルトランスフェラーゼではない。幾つかの実施形態においては、シアリルトランスフェラーゼ酵素はパスツレラ・マルトシダα（２，３）シアリルトランスフェラーゼＭ１４４Ｄ突然変異体（Ｐｍ２，３ＳＴ－Ｍ１４４Ｄ）またはフォトバクテリウム・ダムセラα（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（Ｐｄ２，６ＳＴ）である。
また、幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞および自己反応性Ｔ細胞にタグ付けし、それらを単離するための前記方法は、過度の実験を伴うことなく任意の抗原に適応するように容易に適合される。例えば、別の抗原、例えば病原性抗原、例えば細菌またはウイルス抗原に対する特異性を有するＴ細胞にタグ付けし、それを単離するためには、前記と同じプロトコルに従うだけでよい。ただし、この場合、関連抗原供給源を使用してベイト細胞樹状細胞をプライミングし、ついで、適切な供給源からの組織浸潤または循環Ｔ細胞の適切な供給源を使用し、この場合、これらの供給源が、プライミングされる抗原に対するＴＣＲ特異性を有する１以上のＴ細胞を含有するようにする。したがって、簡潔に説明すると、ウイルス特異的反応性を有するＴ細胞を特定するためには、ベイト細胞樹状細胞をウイルス特異的抗原またはその供給源（例えば、罹患組織細胞ライセート）のいずれかと共にインキュベートしてＤＣをプライミングし、ついで、プライミングされたＤＣ－酵素結合体を、適切なタグ付き基質の存在下、組織浸潤または循環Ｔ細胞と混合し、前記のとおりにタグ付きＴ細胞を検出し、富化するだけでよい。種々の実施形態においては、樹状細胞をプライミングするための適切な抗原／抗原供給源を単離する方法に関して記載されている方法に若干の変更を加え、本明細書に記載されている相互作用依存的標識法を用いて特定および単離される抗原特異的Ｔ細胞を含む関連Ｔ細胞集団を単離する方法に若干の変更を加えるだけで、関心のある任意の抗原に同じことが当てはまる。例えば、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬのような血液悪性腫瘍に関する有望なＴＳＡ特異的Ｔ細胞を特定するために、幾つかの実施形態においては、以下のプロトコルに従うことが可能である。癌細胞を患者（骨髄または血液）から単離し、細胞溶解して、同じ患者に由来するｉＤＣをプライミングする。プライミングされたｉＤＣまたはプライミングされていない（対照）ｉＤＣをＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色し、細胞表面上でフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）に結合させ、種々の比率の、同じ患者の自己ＰＢＭＣと共に１～２時間培養する。ついでＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン（５０μＭ）を加え、更に３０分間インキュベートする。Ｎ－アセチル－Ｄ－ラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）で反応をクエンチした後、細胞混合物をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ストレプトアビジンおよび細胞同一性マーカーで染色し、フローサイトメトリー分析に付す。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７＋でもあるＣＤ４＋（Ｆｏｘｐ３－）および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞を、有望なＴＳＡ特異的Ｔ細胞として単離する。
同様に、固形腫瘍（ヒト）に関する有望なＴＳＡ特異的Ｔ細胞を特定するために、幾つかの実施形態においては、以下のプロトコルに従うことが可能である。患者から単離された腫瘍を小さな断片に横切りし、細かく刻んで、腫瘍ライセートを調製し、または単細胞懸濁液を調製する。単細胞懸濁液の調製は、当技術分野でよく知られている予め確立されたフィコールパック密度勾配遠心分離プロトコルを用いて行う。例えば、Ｔａｎ Ｙ．Ｓ．，Ｌｅｉ Ｙ．Ｌ．（２０１９）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ａｌｌｅｎ Ｉ．（編）Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ １９６０．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。腫瘍ライセートを使用して、同じ患者に由来するｉＤＣをプライミングする。プライミングされたｉＤＣまたはプライミングされていないｉＤＣ（陰性対照）または正常組織ライセートでプライミングされたｉＤＣ（陰性対照）をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色し、細胞表面上でフコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）に結合させ、腫瘍から単離された自己単細胞懸濁液と共に種々の比率（自己単細胞：ＤＣ＝５：１～１０：１）で１～２時間培養する。ついでＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン（５０μＭ）を加え、更に３０分間インキュベートする。ＬａｃＮＡｃで反応をクエンチした後、細胞混合物をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ストレプトアビジンならびに細胞同一性マーカーおよび表現型マーカーで染色し、ＦＡＣに付す。ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＣＤ２５－／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ＋またはＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＰＤ－１＋／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７＋細胞を、それぞれ、有望なＴＳＡ特異的ＣＤ４またはＣＤ８ Ｔ細胞として単離する。
Ｖ．Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体およびそれらを含有する医薬組成物
幾つかの実施形態においては、本発明は抗原反応性Ｔ細胞のインビトロまたはエクスビボ増殖集団を提供し、ここで、Ｔ細胞は、本明細書に記載されている方法を使用して単離された。抗原反応性Ｔ細胞は、幾つかの実施形態においては、癌、病原性感染、自己免疫疾患、炎症性疾患または遺伝的障害からの抗原を認識しうる。
幾つかの実施形態においては、本発明はＴＳＡ反応性Ｔ細胞のインビトロまたはエクスビボ増殖集団を提供し、ここで、Ｔ細胞は、本明細書に記載されている方法を使用して単離された。
１つの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞のインビトロまたはエクスビボ増殖集団は、実施例５または６に記載されている方法を使用して単離された。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は実質的または完全にＣＤ４＋である。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は実質的または完全にＣＤ８＋である。ＴＳＡ反応性Ｔ細胞およびその増殖集団は医薬組成物に製剤化（処方）されうる。医薬組成物は、本明細書に開示されている任意の組成物でありうる。
特定の実施形態においては、Ｔ細胞は、野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαおよびＶβを含むＴＳＡ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合性フラグメントを発現し、ここで、ＶαおよびＶβのそれぞれは、相補性決定領域１（ＣＤＲ－１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ－２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ－３）を含み、ここで、Ｖα ＣＤＲ－３は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Figure 2022535045000013
幾つかの実施形態においては、そのようなＴ細胞は、前記の群から選択されるＶα ＣＤＲ－３配列を発現するように操作される。操作されたＴ細胞は、前記の群から選択されるＶα ＣＤＲ－３配列を含むキメラＴＣＲを発現しうる。幾つかの実施形態においては、本開示は、１以上のＴＳＡ反応性Ｔ細胞と１以上の薬学的に許容される担体、塩、ビヒクルおよび／または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は内毒素非含有または実質的に内毒素非含有でありうる。
幾つかの実施形態においては、本開示は、１以上のＴＳＡ反応性Ｔ細胞と薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む医薬組成物、またはそのようなＴＳＡ反応性Ｔ細胞の増殖集団を含む医薬組成物を提供し、ここで、該細胞の全てまたは実質的に全ては、（ｉ）それらの表面上で１以上のタグ付きフコースまたはタグ付きＮｅｕＡｃ部分に結合しており、（ｉｉ）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であり、そして、所望により、ＰＤ－１＋およびＣＤ４５．１－／－である。幾つかの実施形態においては、増殖集団の全てまたは実質的に全てはタグを含まない。むしろ、そのような実施形態においては、増殖のためのＴＳＡ反応性Ｔ細胞の適切な集団を単離するために、本明細書に記載されているタグ付け方法を用いる。１つの実施形態においては、医薬組成物は対象における疾患の治療のためのものである。１つの実施形態においては、本明細書において提供するのは、１以上のＴＳＡ反応性Ｔ細胞と薬学的に許容される担体、塩、ビヒクルおよび／または賦形剤とを含む医薬組成物の治療的有効量を対象に投与することを含む、対象における癌を治療し、軽減させ、抑制し、または縮小させる方法であり、ここで、該細胞の全てまたは実質的に全ては、（ｉ）それらの表面上で１以上のタグ付きフコースまたはタグ付きＮｅｕＡｃ部分に結合しており、（ｉｉ）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋であり、そして、所望により、ＰＤ－１＋およびＣＤ４５．１－／－である。医薬組成物は内毒素非含有または実質的に内毒素非含有でありうる。１つの実施形態においては、癌は、黒色腫、乳癌腫瘍、および以下ものからなる群から選択される腫瘍から選択される：毛様細胞性星状細胞腫、ＡＭＬ、ＡＬＬ、甲状腺、腎臓嫌色素、ＣＬＬ、髄芽腫、神経芽細胞腫、低悪性度神経膠腫、膠芽腫、前立腺、卵巣、骨髄腫、膵臓、腎乳頭、Ｂ細胞リンパ腫、腎明細胞、頭頸部、肝臓、子宮頸、子宮、膀胱、結腸直腸、肺小細胞、食道、胃、肺腺および肺扁平上皮の腫瘍。１つの実施形態においては、癌は乳癌である。
幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は実質的または完全にＣＤ８＋である。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は実質的または完全にＣＤ４＋である。
幾つかの実施形態においては、本発明はＴＳＡ反応性Ｔ細胞のインビトロまたはエクスビボ増殖集団を提供し、ここで、Ｔ細胞は、本明細書に記載されている方法を使用して単離された。１つの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞のインビトロまたはエクスビボ増殖集団は、実施例５または６に記載されている方法を使用して単離された。幾つかの実施形態においては、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞は実質的または完全にＣＤ４＋である。
幾つかの実施形態においては、本発明は、本明細書に記載されている方法を使用して単離されたＴＳＡ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合性フラグメントを提供する。ＴＳＡ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合性フラグメントは、実施例７に記載されている方法を使用して単離されうる。特定の実施形態においては、本発明は、野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαおよびＶβを含むＴＳＡ特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合性フラグメントを提供し、ここで、ＶαおよびＶβのそれぞれは、相補性決定領域１（ＣＤＲ－１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ－２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ－３）を含み、ここで、Ｖα ＣＤＲ－３は、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
Figure 2022535045000014
ＴＳＡ反応性Ｔ細胞受容体はキメラＴ細胞受容体でありうる。
ＴＳＡ反応性Ｔ細胞受容体は単鎖Ｔ細胞受容体でありうる。ＴＳＡ反応性Ｔ細胞受容体は、Ｖα－リンカー－ＶβまたはＶβ－リンカー－Ｖαの構造を含む単鎖Ｔ細胞受容体でありうる。単鎖ＴＣＲは、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶα ＣＤＲ－３を含みうる。
Figure 2022535045000015
ＴＳＡ反応性Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲまたはその抗原結合性フラグメントおよび抗体を含む二重特異性Ｔ細胞受容体でありうる。ＴＣＲは、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶα ＣＤＲ－３を含みうる。
Figure 2022535045000016
本開示はまた、本明細書に開示されているＴＣＲ、キメラＴＣＲ、単鎖ＴＣＲおよび二重特異性ＴＣＲを含む医薬組成物を提供する。１つの実施形態においては、そのような医薬組成物は、本明細書に開示されているＴＣＲ、単鎖ＴＣＲおよび／または二重特異性ＴＣＲと、１以上の薬学的に許容される担体、塩、ビヒクルおよび／または賦形剤とを含む。医薬組成物は内毒素非含有または実質的に内毒素非含有でありうる。
ＶＩ．治療方法
本開示はまた、本明細書に記載されている方法により単離された抗原反応性細胞またはそれを含む医薬組成物を使用する、疾患および状態の治療方法を提供する。本開示はまた、前記で開示されているＴＣＲ、キメラＴＣＲ、単鎖ＴＣＲおよび／または二重特異性ＴＣＲを使用する、疾患および状態の治療方法を提供する。幾つかの実施形態においては、任意の免疫疾患または障害が、本明細書に開示されている組成物および方法で治療されうる。幾つかの場合には、本開示はまた、本明細書に記載されている方法により単離された抗原反応性Ｔ細胞（または抗原反応性Ｔ細胞の集団）またはそれを含む医薬組成物を使用する、疾患および状態の治療方法を提供する。幾つかの実施形態においては、細胞の表面上での疾患特異的抗原の発現をもたらす任意の疾患または障害が、本明細書に記載されている方法により単離された抗原反応性Ｔ細胞またはそれを含む医薬組成物で治療されうる。該方法は、本明細書に記載されている方法により単離され増殖されたＴ細胞の１以上の異なる集団を、それを必要とする対象に投与することを含みうる。例えば、特定のＴＳＡに対するＴ細胞の集団が、本明細書に開示されている方法により特定され増殖されることが可能であり、別の異なるＴＳＡに対するＴ細胞の別の集団が、本明細書に開示されている方法により特定され増殖されることが可能であり、両方の集団が、それを要する対象に投与されうる。
幾つかの例においては、本開示は、本明細書に記載されている方法により単離された抗原反応性Ｂ細胞（または抗原反応性Ｂ細胞の集団）またはそれを含む医薬組成物を使用する、疾患および状態の治療方法を提供する。そのような抗原反応性Ｂ細胞は当技術分野で公知であり、癌およびインフルエンザを含む種々の疾患および障害を治療するのに有効であることが示されている。例えば、Ｗｅｎｎｈｏｌｄ，Ｋ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １ ２０１７（５）（９）７３０－７４３；ＤＯＩ：１０．１１５８／２３２６－６０６６；およびＤｏｕｇａｎ ＳＫら，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ｎｏｖ ２１；５０３（７４７６）：４０６－９．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１２６３７（それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。
幾つかの実施形態においては、細胞の表面上での疾患特異的抗原の発現をもたらす任意の疾患または障害が、本明細書に記載されている方法により単離された抗原反応性Ｂ細胞またはそれを含む医薬組成物で治療されうる。該方法は、本明細書に記載されている方法および当技術分野で公知である方法により単離され増殖されたＢ細胞の１以上の異なる集団を、それを必要とする対象に投与することを含みうる。例えば、Ｂ細胞増殖キットは商業的に入手可能であり、よく知られている（例えば、ＣｅｌｌＸＶｉｖｏ Ｈｕｍａｎ Ｂ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；また、ｖｏｎ Ｂｅｒｇｗｅｌｔ－Ｂａｉｌｄｏｎ ＭＳ．ら，Ｂｌｏｏｄ ２００２；９９：３３１９－２５； Ｓｃｈｕｌｔｚ ＪＬら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９７；１００：２７５７－６５；およびＬａｐｏｉｎｔｅ Ｒ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００３；６３：２８３６－４３も参照されたい；それらのそれぞれの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）。例えば、特定のＴＳＡに対するＢ細胞の集団が、本明細書に開示されている方法により特定され増殖されることが可能であり、別の異なるＴＳＡに対するＢ細胞の別の集団が、本明細書に開示されている方法により特定され増殖されることが可能であり、両方の集団が、それを要する対象に投与されうる。
同様に、該方法は、本明細書に記載されている方法により単離され増殖されたＴ細胞の１以上の異なる集団、および本明細書に記載されている方法により単離され増殖されたＢ細胞の１以上の異なる集団を、それを必要とする対象に投与することを含みうる。
該方法は、本明細書に記載されている方法により単離され増殖された抗原反応性Ｔ細胞の、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２４、３０、３５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、１００、１２０、１５０、２００、３００、３８４、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個以上の集団を投与することを含みうる。該方法は、本明細書に記載されている方法により単離され増殖された抗原反応性Ｂ細胞の、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２４、３０、３５、４８、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９６、１００、１２０、１５０、２００、３００、３８４、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個以上の集団を投与することを含みうる。抗原反応性Ｔ細胞もしくは抗原反応性Ｔ細胞の集団または抗原反応性Ｂ細胞もしくは抗原反応性Ｂ細胞の集団の投与は静脈内送達を含みうる。抗原反応性Ｔ細胞もしくは抗原反応性Ｔ細胞の集団または抗原反応性Ｂ細胞もしくは抗原反応性Ｂ細胞の集団の投与は腹腔内送達を含みうる。抗原反応性Ｔ細胞もしくは抗原反応性Ｔ細胞の集団または抗原反応性Ｂ細胞もしくは抗原反応性Ｂ細胞の集団の投与は静脈内送達および腹腔内送達を含みうる。抗原反応性Ｔ細胞もしくは抗原反応性Ｔ細胞の集団または抗原反応性Ｂ細胞もしくは抗原反応性Ｂ細胞細胞の集団の投与は１回行われうる。抗原反応性Ｔ細胞もしくは抗原反応性Ｔ細胞の集団または抗原反応性Ｂ細胞もしくは抗原反応性Ｂ細胞の集団の投与は複数回行われうる（例えば、反復注射）。
１つの実施形態においては、本明細書に記載されている方法により特定され富化されたＴＳＡ反応性Ｔ細胞を増殖させ、癌の治療のために患者に投与する。１つの実施形態においては、本明細書に記載されている方法により２つの異なるＴＳＡ反応性Ｔ細胞を特定し、個々に富化し、別々のＴ細胞を増殖させ、細胞増殖性障害の治療のために患者に投与する。１つの実施形態においては、本明細書に記載されている方法により２つの異なるＴＳＡ反応性Ｔ細胞を特定し、個々に富化し、別々のＴ細胞を増殖させ、癌の治療のために患者に投与する。１つの実施形態においては、本明細書に記載されている方法により特定され富化されたＴＳＡ反応性Ｂ細胞を増殖させ、癌の治療のために患者に投与する。１つの実施形態においては、本明細書に記載されている方法により２つの異なるＴＳＡ反応性Ｂ細胞を特定し、個々に富化し、別々のＢ細胞を増殖させ、細胞増殖性障害の治療のために患者に投与する。１つの実施形態においては、本明細書に記載されている方法により２つの異なるＴＳＡ反応性Ｂ細胞を特定し、個々に富化し、別々のＢ細胞を増殖させ、癌の治療のために患者に投与する。幾つかの実施形態においては、癌は、黒色腫、乳癌腫瘍、および以下ものからなる群から選択される腫瘍から選択される：毛様細胞性星状細胞腫、ＡＭＬ、ＡＬＬ、甲状腺、腎臓嫌色素、ＣＬＬ、髄芽腫、神経芽細胞腫、低悪性度神経膠腫、膠芽腫、前立腺、卵巣、骨髄腫、膵臓、腎乳頭、Ｂ細胞リンパ腫、腎明細胞、頭頸部、肝臓、子宮頸、子宮、膀胱、結腸直腸、肺小細胞、食道、胃、肺腺および肺扁平上皮の腫瘍。幾つかの実施形態においては、投与は医薬組成物としてのものである。
１つの実施形態においては、本明細書に記載されている方法により抗原反応性Ｔ細胞または抗原反応性Ｔ細胞の集団を特定し富化し、増殖させ、疾患または病態の治療のために患者に投与する。疾患または病態は細胞増殖性障害でありうる。細胞増殖性障害は、固形腫瘍、リンパ腫、白血病および脂肪肉腫から選択されうる。細胞増殖性障害は急性、慢性、再発性、難治性、促進性、寛解期、Ｉ期（ステージＩ）、ＩＩ期、ＩＩＩ期、ＩＶ期、若年性または成人性でありうる。細胞増殖性障害は、骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、好中球性白血病、骨髄異形成症候群、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、大細胞リンパ腫、混合細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、再発性小リンパ球性リンパ腫、毛状細胞白血病、多発性骨髄腫、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、巨核芽球性白血病、単芽球性白血病、単球性白血病、赤白血病、赤芽球性白血病および肝細胞癌から選択されうる。細胞増殖性障害は血液学的悪性腫瘍を含みうる。血液学的悪性腫瘍はＢ細胞悪性腫瘍を含みうる。細胞増殖性障害は慢性リンパ性白血病を含みうる。細胞増殖性障害は急性リンパ芽球性白血病を含みうる。細胞増殖性障害はＣＤ１９陽性バーキットリンパ腫を含みうる。
疾患または病態は癌、病原性感染、自己免疫疾患、炎症性疾患または遺伝的障害でありうる。
幾つかの場合には、前記の１以上の疾患は癌を含む。癌は再発性および／または難治性の癌を含みうる。癌の例には、肉腫、癌腫、リンパ腫または白血病が含まれるが、これらに限定されるものではない。
癌は神経内分泌癌を含みうる。癌は膵臓癌を含みうる。癌は外分泌膵臓癌を含みうる。癌は甲状腺癌を含みうる。甲状腺癌は甲状腺髄様癌を含みうる。癌は前立腺癌を含みうる。
癌は上皮癌を含みうる。癌は乳癌を含みうる。癌は子宮内膜癌を含みうる。癌は卵巣癌を含みうる。卵巣癌は間質性卵巣癌を含みうる。癌は子宮頸癌を含みうる。
癌は皮膚癌を含みうる。皮膚癌は血管新生皮膚癌を含みうる。皮膚癌は黒色腫を含みうる。
癌は腎臓癌を含みうる。
癌は肺癌を含みうる。肺癌は小細胞肺癌を含みうる。肺癌は非小細胞肺癌を含みうる。
癌は結腸直腸癌を含みうる。癌は胃癌を含みうる。癌は結腸癌を含みうる。
癌は脳癌を含みうる。脳癌は脳腫瘍を含みうる。癌は膠芽腫を含みうる。癌は星状細胞腫を含みうる。
癌は血液癌を含みうる。血液癌は白血病を含みうる。白血病は骨髄性白血病を含みうる。癌はリンパ腫を含みうる。リンパ腫は非ホジキンリンパ腫を含みうる。
癌は肉腫を含みうる。肉腫はユーイング肉腫を含みうる。
肉腫は骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管または他の結合組織もしくは支持組織の癌である。肉腫には、骨癌、線維肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、両側前庭肉腫、骨肉腫、軟部組織肉腫（例えば、肺胞軟部肉腫、管肉腫、葉状腫瘍、皮膚線維肉腫、類腱腫、類上皮肉腫、骨格外骨肉腫、線維肉腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫および滑膜肉腫）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
癌腫は、上皮細胞から発生する癌であり、上皮細胞は、体表面を覆いホルモンを産生し腺を構成する細胞である。非限定的な例として挙げると、癌腫には、乳癌、膵臓癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管癌、頭頸部癌、胃腸間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門領域の癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、尿道癌、腎骨盤癌、尿管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、下垂体癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫および脊髄軸腫瘍が含まれる。幾つかの場合には、癌は皮膚癌、例えば基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、非黒色腫または光線性（日光性）角化症である。
幾つかの場合には、癌は肺癌である。肺癌は、気管から分岐して肺（気管支）または肺の小さな空気嚢（肺胞）に入る気道で発生しうる。肺癌には、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌および中皮腫が含まれる。ＮＳＣＬＣの例には、扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌が含まれる。中皮腫は、肺および胸腔の裏層（胸膜）または腹部の裏層（腹膜）の癌性腫瘍でありうる。中皮腫はアスベスト曝露によるものでありうる。癌は脳癌、例えば膠芽腫でありうる。
あるいは、癌は中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍でありうる。ＣＮＳ腫瘍は神経膠腫または非神経膠腫に分類されうる。神経膠腫は悪性神経膠腫、高悪性度神経膠腫、びまん性内因性橋膠腫でありうる。神経膠腫の例には、星状細胞腫、乏突起膠腫（または乏突起膠腫要素と星状細胞腫要素との混合物）および上衣腫が含まれる。星状細胞腫には、低悪性度星状細胞腫、退形成性星状細胞腫、多形性膠芽腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状細胞腫および上衣下巨細胞星状細胞腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。乏突起膠腫には、低悪性度の乏突起膠腫（または乏突起星細胞腫）および退形成性乏突起膠腫が含まれる。非神経膠腫には、髄膜腫、下垂体腺腫、原発性ＣＮＳリンパ腫および髄芽腫が含まれる。幾つかの場合には、癌は髄膜腫である。
白血病は急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病または慢性骨髄性白血病でありうる。追加的なタイプの白血病には、有毛細胞白血病、慢性骨髄単球性白血病および若年性骨髄単球性白血病が含まれる。
リンパ腫はリンパ球の癌であり、Ｂリンパ球またはＴリンパ球のいずれかから発生しうる。リンパ腫の２つの主要タイプはホジキンリンパ腫（以前はホジキン病として公知であった）および非ホジキンリンパ腫である。ホジキンリンパ腫はリードシュテルンベルク細胞の存在により特徴づけられる。非ホジキンリンパ腫は、ホジキンリンパ腫ではない全てのリンパ腫である。非ホジキンリンパ腫は無痛性リンパ腫および侵攻性リンパ腫でありうる。非ホジキンリンパ腫には、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、節性辺縁体Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾臓辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫およびリンパ腫様肉芽腫症が含まれるが、これらに限定されるものではない。
癌は固形腫瘍を含みうる。癌は肉腫を含みうる。癌は、膀胱癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、肺癌、黒色腫、骨髄腫、甲状腺癌、膵臓癌、神経膠腫、脳の悪性神経膠腫、神経膠芽細胞腫、卵巣癌および前立腺癌からなる群から選択されうる。癌は不均一な抗原発現を示しうる。癌は、モジュレーションされた抗原発現を示しうる。抗原は表面抗原でありうる。癌は骨髄腫を含まないことがある。癌は黒色腫を含まないことがある。癌は結腸癌を含まないことがある。癌は急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）でありうる。癌は再発性ＡＬＬでありうる。癌は難治性ＡＬＬでありうる。癌は再発性難治性ＡＬＬでありうる。癌は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）でありうる。癌は再発性ＣＬＬでありうる。癌は難治性ＣＬＬでありうる。癌は再発性難治性ＣＬＬでありうる。
癌は乳癌を含みうる。乳癌は三重（トリプル）陽性乳癌（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨｅｒ２陽性）でありうる。乳癌は三重陰性（トリプルネガティブ）乳癌（エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨｅｒ２陰性）でありうる。乳癌はエストロゲン受容体陽性でありうる。乳癌はエストロゲン受容体陰性でありうる。乳癌はプロゲステロン受容体陽性でありうる。乳癌はプロゲステロン受容体陰性でありうる。乳癌はＨｅｒ２陰性乳癌を含みうる。乳癌は低発現性Ｈｅｒ２乳癌を含みうる。乳癌はＨｅｒ２陽性乳癌を含みうる。Ｈｅｒ２を発現する細胞株は抗原密度に関して十分に特徴づけられており、０（細胞当たり２０，０００個未満のＨｅｒ２抗原）、１＋（細胞当たり１００，０００個のＨｅｒ２抗原）、２＋（細胞当たり５００，０００個のＨｅｒ２抗原）および３＋（細胞当たり２，０００，０００個を超えるＨｅｒ２抗原）として悪性度を分類する臨床免疫組織化学の特徴付けを反映している。本発明はこれらの分類の乳癌の治療方法を提供する。乳癌は、Ｈｅｒ２ ０として分類される乳癌を含みうる。乳癌は、Ｈｅｒ２ １＋として分類される乳癌を含みうる。乳癌は、Ｈｅｒ２ ２＋として分類される乳癌を含みうる。乳癌は、Ｈｅｒ２ ３＋として分類される乳癌を含みうる。
疾患または病態は病原性感染でありうる。病原性感染は１以上の病原体により引き起こされうる。幾つかの場合には、病原体は細菌、真菌、ウイルスまたは原生動物である。
例示的な病原体には、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）またはエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。幾つかの場合には、病原体により引き起こされる疾患または病態は結核であり、不均一なサンプルは、細菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する外来分子および対象に由来する分子を含む。幾つかの場合には、疾患または病態は細菌により引き起こされ、それは結核、ストレプトコッカスおよびシュードモナスのような細菌により引き起こされうる肺炎、シゲラ、カンピロバクターおよびサルモネラのような細菌により引き起こされうる食中毒、ならびに破傷風、腸チフス、ジフテリア、梅毒およびライのような感染症である。疾患または病態は、天然に存在する細菌叢の不均衡により引き起こされる膣の疾患である細菌性膣炎でありうる。あるいは、疾患または病態は、髄膜（例えば、脳および脊髄を覆う保護膜）の細菌性炎症である細菌性髄膜炎である。細菌により引き起こされる他の疾患または病態には、細菌性肺炎、尿路感染症、細菌性胃腸炎および細菌性皮膚感染症が含まれるが、これらに限定されるものではない。細菌性皮膚感染症の例には、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）またはストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）により引き起こされうる膿痂疹；リンパへの広がりを伴う深部表皮のストレプトコッカス細菌（連鎖球菌）感染により引き起こされうる丹毒；正常な皮膚フローラまたは外因性細菌により引き起こされうる蜂巣炎が含まれるが、これらに限定されるものではない。
病原体は真菌、例えばカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）およびスタキボトリス（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）でありうる。真菌により引き起こされる疾患または病態の例には、陰金田虫、酵母菌感染症、白癬および足部汗ぽう状白癬が含まれるが、これらに限定されるものではない。
病原体はウイルスでありうる。ウイルスの例には、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタインバーウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型およびＣ型肝炎）、単純ヘルペスウイルス（１型および２型）、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、風疹ウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。ウイルスにより引き起こされる疾患または病態の例には、風邪、インフルエンザ、肝炎、エイズ、水痘、風疹、流行性耳下腺炎、麻疹、疣贅およびポリオが含まれるが、これらに限定されるものではない。
病原体は原生動物、例えば、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）［例えば、エイ・アストロニキス（Ａ．ａｓｔｒｏｎｙｘｉｓ）、エイ・カステラニイ（Ａ．ｃａｓｔｅｌｌａｎｉｉ）、エイ・クルベルトソニ（Ａ．ｃｕｌｂｅｒｔｓｏｎｉ）、エイ・ハトチェッティイ（Ａ．ｈａｔｃｈｅｔｔｉ）、エイ・ポリファガ（Ａ．ｐｏｌｙｐｈａｇａ）、エイ・リソデス（Ａ．ｒｈｙｓｏｄｅｓ）、エイ・ヘアリイ（Ａ．ｈｅａｌｙｉ）、エイ・ディビオネンシス（Ａ．ｄｉｖｉｏｎｅｎｓｉｓ）］、ブラキオラ（Ｂｒａｃｈｉｏｌａ）［例えば、ビー・コンノリ（Ｂ ｃｏｎｎｏｒｉ）、ビー・ベシクラルム（Ｂ．ｖｅｓｉｃｕｌａｒｕｍ）］、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）［例えば、シー・パルブム（Ｃ．ｐａｒｖｕｍ）］、シクロスポラ（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ）［例えば、シー・カイエタネンシス（Ｃ．ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）］、エンセファリトゾーン（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ）［例えば、イー・クニクリ（Ｅ．ｃｕｎｉｃｕｌｉ）、イー・ヘレム（Ｅ．ｈｅｌｌｅｍ）、イー・インテスチナリス（Ｅ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）］、エントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）［例えば、イー・ヒストリティカ（Ｅ．ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）］、エンテロシトゾーン（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ）［例えば、イー・ビエネウシ（Ｅ．ｂｉｅｎｅｕｓｉ）］、ジアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ）［例えば、ジー・ランブリア（Ｇ．ｌａｍｂｌｉａ）］、イソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）［例えば、アイ・ベリ（Ｉ．ｂｅｌｌｉ）］、ミクロスポリジウム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）［例えば、エム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、エム・セイロネンシス（Ｍ．ｃｅｙｌｏｎｅｎｓｉｓ）］、ネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）［例えば、エヌ・フォーレリ（Ｎ．ｆｏｗｌｅｒｉ）］、ノセマ（Ｎｏｓｅｍａ）［例えば、エヌ・アルゲレ（Ｎ．ａｌｇｅｒａｅ）、エヌ・オクラルム（Ｎ．ｏｃｕｌａｒｕｍ）］、プレイストフォラ（Ｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ）、トラキプレイストフォラ（Ｔｒａｃｈｉｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ）［例えば、ティー・アントロポフテラ（Ｔ．ａｎｔｈｒｏｐｏｐｈｔｈｅｒａ）、ティー・ホミニス（Ｔ．ｈｏｍｉｎｉｓ）］、およびヴィタフォルマ（Ｖｉｔｔａｆｏｒｍａ）［例えば、ヴイ・コルネエ（Ｖ．ｃｏｒｎｅａｅ）］でありうる。
疾患または病態は自己免疫疾患または自己免疫関連疾患でありうる。自己免疫疾患は、身体に自己組織を攻撃させる、身体の免疫系の機能不全でありうる。自己免疫疾患および自己免疫関連疾患の例には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：アディソン病、脂肪性脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性心筋炎、ベーチェット病、セリアックスプルー、クローン病、皮膚筋炎、好酸球性筋膜炎、結節紅斑、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、グッドパスチャー症候群、グレイブス病、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、糖尿病、若年性糖尿病、川崎病、ランバート－イートン症候群、ループス（ＳＬＥ）、混合結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、多発性硬化症、重力筋無力症、天疱瘡、結節性多発性動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型多腺性自己免疫症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、乾癬、乾癬性関節炎、ライター症候群、再発性多軟骨炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、精子および精巣自己免疫、全身硬直症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症。
疾患または病態は炎症性疾患でありうる。炎症性疾患の例には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：肺胞炎、アミロイドーシス、血管炎、強直性脊椎炎、阻血性壊死、バセドウ病、ベル麻痺、滑液包炎、手根管症候群、セリアック病、胆管炎、膝蓋軟骨軟化症、慢性活動性肝炎、慢性疲労症候群、コーガン症候群、先天性股関節形成不全、肋軟骨炎、クローン病、嚢胞性線維症、デ・ケルベイン腱炎、糖尿病関連関節炎、びまん性特発性骨格過骨症、円板状ループス、エーラーズ・ダンロス症候群、家族性地中海熱、筋膜炎、結合組織炎／線維筋痛症、五十肩、神経節嚢胞、巨細胞動脈炎、痛風、グレイブス病、ＨＩＶ関連リウマチ性疾患症候群、副甲状腺機能亢進症関連関節炎、感染性関節炎、炎症性腸症候群／刺激性腸症候群、若年性関節リウマチ、ライム病、マルファン症候群、ミクリチス病、混合結合組織疾患、多発性硬化症、筋筋膜性疼痛症候群、骨関節炎、骨軟化症、骨粗鬆症およびコルチコステロイド誘発性骨粗鬆症、パジェット病、パリンドロームリウマチ、パーキンソン病、プランマー病、多発性筋痛リウマチ、多発性筋炎、偽性痛風、乾癬性関節炎、レイノー現象／症候群、ライター症候群、リウマチ熱、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、座骨神経痛（腰椎神経根障害）、強皮症、壊血病、鎌状細胞関節炎、シェーグレン症候群、脊柱管狭窄症、脊椎すべり症、スティル病、全身性エリテマトーデス、高安（脈なし）病、腱炎、テニス肘／ゴルフ肘、甲状腺関連関節炎、弾発指、潰瘍性大腸炎、ウェゲナー肉芽腫症およびウィップル病。
該方法は、所望の効果に関してＴ細胞またはＴ細胞の集団を力価測定（滴定）することを含みうる。Ｔ細胞またはＴ細胞の集団の力価測定は抗原密度の識別を可能にしうる。例えば、肺における低レベルのＨｅｒ２発現に対するＨｅｒ２標的化ＣＡＲ－Ｔ細胞の致命的なオンターゲット（ｏｎ－ｔａｒｇｅｔ）腫瘍外（ｏｆｆ－ｔｕｍｏｒ）反応性は臨床における固形腫瘍へのＣＡＲ－Ｔ細胞の適用を妨げている。臨床において、これは、治療を適切な治療指数に力価調整するために使用されうる。
１つの実施形態においては、本明細書に記載されている方法により特定され富化された病原性抗原反応性Ｔ細胞を増殖させ、病原性感染の治療のために患者に投与する。幾つかの実施形態においては、病原体はウイルス、寄生生物または細菌である。幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞を医薬組成物として投与する。
１つの実施形態においては、本明細書に記載されている方法により特定され富化された自己抗原反応性制御性Ｔ細胞を増殖させ、自己免疫疾患または障害の治療のために患者に投与する。１つの実施形態においては、疾患は多発性筋炎である。幾つかの実施形態においては、Ｔ細胞を医薬組成物として投与する。
実施例
以下の実施例は、フコシルトランスフェラーゼで修飾された樹状細胞がＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞での抗原特異的ビオチン化を誘発することが可能であり、ビオチンタグの規模がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対する抗原の結合アフィニティと相関するという本発明者らの知見に関するものである。これらの知見に基づいて、本発明者らは、単離されたＴ細胞が腫瘍反応性Ｔ細胞に関して高度に富化され、それらの反応性がＴＳＡに対するものであると仮定した。この仮定は、マウスＢ１６黒色腫モデルおよびＥ０７７１三重陰性乳癌モデルにおける本発明者らのデータによって強く支持されている。富化されたＴＳＡ反応性Ｔ細胞を、ＴＳＡ特異的ＴＣＲを特定するために単一細胞ＴＣＲ配列決定に付し、または患者特異的免疫細胞療法のために直接増殖させることが可能である。この技術は幾つかの利点を有する。（１）ＴＳＡを特定するための、費用および長時間を要するアプローチを回避する。（２）ヒト腫瘍浸潤物において見出される非機能的バイスタンダーＣＤ８＋ Ｔの細胞表面上でも発現される抑制性受容体（例えば、ＰＤ－１）３１－３２または活性化マーカー（例えば、ＣＤ１３４またはＣＤ１３７）の発現ではなく、相互作用媒介性ビオチン化に基づいている。（３）ＴＳＡ反応性Ｔ細胞候補を検出することが可能であり、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞を同等の精度で特定する。要約すると、本発明はＴＳＡ反応性ＴＣＲの発見のペースを大幅に加速し、そしてこれは個別化癌治療のコストおよび利用障壁を低減する道を開く、と本発明者らは期待している。
実施例１
ヘリコバクター・ピロリアルファ１，３フコシルトランスフェラーゼをＣＨＯ細胞の表面に結合させるためのグリコシルトランスフェラーゼ媒介性細胞表面操作の適用
背景：
本発明者らの以前の研究（ＷＯ２０１８／１４４７６９として公開されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１６５０３；その内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）において、本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）が顕著なドナー基質耐性を有することを見出した。それは、ＧＤＰ－フコース（ＧＤＰ－Ｆｕｃ）ドナーに結合した蛍光プローブ、核酸の短鎖および更には全長抗体（＞１００ｋＤａ）が、生細胞の表面上の糖衣の一般的構成要素であるＬａｃＮＡｃ（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ）に数分以内に定量的に転移されることを可能にする。本発明者らのグループは、インビトロおよびインビボでＴ細胞の遊走を促進することおよびＮＫ細胞を癌細胞に導くことを含む新しい機能を導入するために培養細胞株と初代細胞との両方の表面上の天然基質（例えば、ＬａｃＮＡｃ／ｓＬａｃＮＡｃ含有グリカン）を効率的に修飾する単一工程法を開発した１５。標的細胞集団の遺伝的操作を要しない最もよく知られている酵素利用共有結合反応であるソルタギング（ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ）１６と比較して、ＦＴに基づくこの方法は著しく効率的である。これらの結果に基づいて、本発明者らは、細胞に新機能をもたらすために、ＦＴを含む酵素を種々の細胞表面上に効率的に導入するための種々の方法を開発した。
一般的プロセス：
図１Ａは、ヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼで細胞表面を糖鎖工学処理することにより、プローブまたは標識で細胞にタグ付けする酵素的方法を示す。簡潔に説明すると、リンカーを介してプローブまたはタグ（例えば、ビオチン）に結合したＧＤＰ－フコース誘導体に、細胞表面上に存在するフコースアクセプターグリカン（例えば、ＬａｃＮＡｃ、ｓＬａｃＮＡｃ）を結合させるために、外因性ヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ酵素を使用する。プローブまたはタグの存在にもかかわらず、該酵素は、フコシルトランスフェラーゼの前記のドナー基質耐性ゆえに、細胞表面フコースアクセプターグリカンのフコシル化を触媒する。当業者が容易に理解するとおり、他のフコシルトランスフェラーゼもこれらの反応に使用されうる［例えば、ヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）、そしてまた、ヘリコバクター・ピロリα１，３／４フコシルトランスフェラーゼでの同様のドナー基質耐性を示す実施例７を参照されたい］。
図１Ｂは、細胞表面フコースアクセプターグリカン（例えば、ＬａｃＮＡｃ、ｓＬａｃＮＡｃ）を含む「プレイ細胞」の同様の細胞表面糖鎖工学を実施するための代替手段を示す。簡潔に説明すると、ヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）を「ベイト細胞」の表面に結合させ、リンカーを介してプローブまたはタグ（例えば、ビオチン）に結合したＧＤＰ－フコース誘導体の存在下、プレイ細胞と混合する。標識ＧＤＰ－フコースの存在下でベイト細胞がプレイ細胞と接触すると、ベイト細胞の表面上のＦＴはプレイ細胞上のフコースアクセプターグリカンのフコシル化を触媒して、プレイ細胞上の標識フコースの結合をもたらす。
膜固定ＦＴは、その高いＫｍ（１．３ｍＭ）および高いｋｃａｔ（４４２分－１）（Ｚｈｅｎｇら，２０１１，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５０，４１１３－４１１８；その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）ゆえに、該酵素を含有するベイト細胞と相互作用するプレイ細胞の近接依存的標識を可能にするのに理想的である（図１Ｂ）。相互作用の非存在下では、ＦＴ近傍のＬａｃＮＡｃ（ｓＬａｃＮＡｃ）アクセプターの濃度はＦＴ－ＬａｃＮＡｃのＫｍより遥かに低い。そのような状況下では、二分子反応速度はｋｃａｔ／Ｋｍにより支配される。Ｋｍを高くすることにより、バックグラウンド標識付けが最小化される。２つの細胞が相互作用すると、ＦＴ付近のＬａｃＮＡｃ（ｓＬａｃＮＡｃ）の局所濃度が高くなり、その結果、擬似ゼロ次反応速度はｋｃａｔにより決定される。ｋｃａｔを高くすることにより、真正な細胞間相互作用の存在下の標識シグナルが最大化される。
ＦＴ結合細胞の構築
図２Ａに示されているとおり、本発明者らは、標準的なアミンカップリング法を用いて、ＰＥＧリンカーを含有するバイオ直交型ハンドル トランスシクロオクテン（ＴＣＯ）をＦＴ（Ｈｉｓ６タグ付き組換えタンパク質として発現される）に導入した。ついで、ＴＣＯ官能基化ＦＴをテトラジン官能基化ＧＤＰ－Ｆｕｃ（ＧＦ－Ａｚ－Ｔｚ）と反応させて、ＧＤＰ－Ｆｕｃ結合ＦＴ（ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴ）を得た。未修飾ＦＴとＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴとで触媒活性における差異はない（データは示していない）。ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴは、細胞表面糖衣におけるＬａｃＮＡｃにＦｕｃ－ＦＴを転移させる自己触媒として機能する。ＣＨＯ細胞をＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）と共に室温で３０分間インキュベートし、細胞表面結合ＦＴを抗Ｈｉｓ－ＰＥ抗体（ＦＴはＨｉｓタグを有する）でプローブした。
図２Ｂはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の細胞表面上へのＦＴの配置の成功を示す。これは、ＣＨＯ ＋ ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴ処理実験において強いヒットタグシグナルを示したフローサイトメトリー分析により確認された（図２Ｂ、右ピーク）。未処理ＣＨＯ細胞においてはバックグラウンドのｈｉｓタグシグナルが認められた（図２Ｂ、最も高い左ピーク）。更に、第１の対照実験において、ＣＨＯ細胞を遊離ＦＴで処理した。処理後、細胞表面上でｈｉｓタグ由来のシグナルは検出できなかった（図２Ｂ、ピークの左クラスター、下のピーク）。第２の対照として、膜ＬａｃＮＡｃを発現しないＬｅｃ８細胞をＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴで処理したところ、バックグラウンドシグナルのみが生成した（図２Ｂ、ピークの左クラスター、下側のピーク － 第１対照実験のピークと重ね合わされている）。右の棒グラフはＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴの種々の濃度でのＣＨＯ細胞表面上のＦＴ結合を示す。０．２０ｍｇ／ｍＬを飽和濃度として決定した。
該方法を用いて、本発明者らは更に、例えば活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞（図２Ｃ、左上パネル）、マウス骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）（図２Ｃ、右上パネル）、ヒトリンパ球（図２Ｃ、左下パネル）およびヒトＰＢＭＣ由来ＤＣ（図２Ｃ、右下パネル）を含む他の細胞にＦＴが２０分以内に頑強に結合しうることを更に実証した。重要なことに、配置されたＦＴは約１０時間細胞表面上に留まり（図Ｓ３Ｃ）、細胞生存度（図Ｓ３Ｄ）および機能、例えばＤＣ媒介性ＣＤ８＋ Ｔ細胞プライミング（図Ｓ４）に影響を及ぼさなかった。
ＦＴ標識細胞の蛍光ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析を用いて、前記の方法により細胞表面に結合したＦＴ分子の数を定量した。図２ＤはＦＴ標識細胞の蛍光ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析を示す。１つの細胞表面に結合したＦＴ分子の数を定量するための実験において、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で修飾されたＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴ分子を使用した。０．２０ｍｇ／ｍＬのＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴ濃度において、約６．６×１０５個のＦＴ分子を１つのＣＨＯ細胞に導入し、約４．０×１０５個のＦＴ分子を１つのＤＣ細胞に導入した。重要なことに、ＦＴは、ＣＨＯおよびＯＴ－Ｉ結合細胞の表面上で約６時間、およびＤＣ細胞上で約１０時間、検出可能なままであった（図３Ａ）。ＦＴ結合が細胞生存率に影響を及ぼしたかどうかを決定するために、活性化ＣＤ８＋ Ｔ細胞およびＣＤ８＋ Ｔ－ＦＴ結合体を別々にインキュベーター内でＴ細胞培地内で３７℃で６時間培養し、ついで、フローサイトメトリーで同様の数の細胞において、ＤＡＰＩ染色および前方散乱光（ＦＳＣ）シグナルにより細胞生存率を測定した。未修飾ＣＤ８＋ Ｔ細胞（生細胞比率９５．６％）と比較して、ＣＤ８＋ Ｔ－ＦＴ細胞（生細胞比率９５．１％）の生存率における差は観察されなかった（図３Ｂ）。
更に、ＦＴ修飾がＤＣ抗原提示能に影響を及ぼさないことを確認した。図３Ｃ（左パネル）は、この実験で用いた種々の治療プロトコルを示す。簡潔に説明すると、ＣＤ４５．１＋／＋ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するｉＤＣをＦＴで標識した後でＯＶＡ２５７－２６４でパルスし、またはＯＶＡ２５７－２６４でパルスした後でＦＴで標識した。ついでそれらをＣＤ４５．１－ ＯＴ－Ｉマウスの脾細胞と共に細胞比１：１で共培養した。ＯＶＡ２５７－２６４または無抗原でローディングされた未処理ｉＤＣを対照として使用した。２時間の共培養の後、フローサイトメトリー分析のために、細胞混合物を抗ｍＣＤ４５．１－ＦＩＣＴ、抗ｍＣＤ８ａ－ＰＢおよび抗ｍＣＤ６９－ＰＥで染色した。３つの重複実験からの代表的なフローサイトメトリーの図が示されている（図３Ｃ（右パネル））。これらのデータは、ｉＤＣのＦＴ機能化がＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＣＤ６９のｉＤＣ媒介性アップレギュレーションに影響を及ぼさなかったことを示している。したがって、本発明は、細胞の生存度および機能（例えば、ＤＣ媒介性ＣＤ８＋ Ｔ細胞プライミング）に影響を及ぼすことなく細胞の表面に酵素を安定に結合させる汎用的方法を提供する。
実施例２
ＦＴ機能化ＣＨＯ細胞は接触細胞を標識しうる
細胞（例えば、図１Ｂに記載されているベイト細胞）への酵素の安定な結合が実証されたため、本発明者らは、結合酵素が機能的活性を保持し、プレイ細胞の接触媒介標識を促進しうるかどうかを判定することにした。
図４Ａは、その目的のために用いた実験方法の概要図を示す。簡潔に説明すると、ＣＨＯ細胞（細胞Ａ）をガラスチャンバー内で１２時間インキュベートした。ついで、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ（細胞Ｂ）で予め染色されたＦＴ修飾ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－ＦＴ）をＡ：Ｂ＝５：１の細胞数比で該ガラスチャンバーに加えた。細胞を３７℃で２時間インキュベートし、ついでＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン（最終濃度２０μＭ）を加えた。２０分間インキュベートした後、細胞を２回洗浄し、蛍光顕微鏡イメージングのためにＤＡＰＩおよびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７－ストレプトアビジンで染色した。図４Ｂは細胞の顕微鏡イメージを示し、これは、（１）全ての細胞Ｂ（緑）は膜（赤）上に頑強に標識されたこと；（２）細胞Ｂと接触していない細胞Ａは標識されなかったが（例２）、細胞Ｂと接触している細胞Ａは細胞間接触領域において選択的に標識されたこと（例１）を明らかに示している。対照的に、遊離ＦＴの処理は全ての細胞の非選択的標識をもたらした（写真は示されていない）。
したがって、細胞の表面上に結合したＦＴは酵素的に活性であり、ＦＴ結合ベイト細胞は、それらが相互作用するプレイ細胞を標識しうる。
実施例３
ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞とのＤＣ相互作用を検出するための「ベイト」ＦＴ機能化樹状細胞（ＤＣ）のエクスビボ使用
適応応答は、ナイーブ抗原特異的Ｔ細胞がリンパ節および脾臓において抗原提示ＤＣに遭遇した際に開始される。このプロセスはＴ細胞プライミングと称される。このアッセイにおいては、本発明者らは、ＦＴ修飾ＤＣ（「ベイト」細胞）を使用して、ＤＣ媒介性Ｔ細胞プライミングの詳細を調べることを目的としている。図５Ａは、ＦＴ修飾ＤＣをこのように使用して、抗原プライミングＤＣと、プライミング抗原に特異的なＴＣＲを含有するＴ細胞との間の接触を検出する方法の一例を示す例示図を示す。簡潔に説明すると、ＳＩＩＮＦＥＫＬ Ｎ４ペプチド（ＯＶＡ２５７－２６４）（配列番号６９）でパルスされたＦＴ修飾ＤＣは、ＯＴ－ＩトランスジェニックマウスからのＭＨＣ Ｉ上に提示されるオボアルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬ Ｎ４（配列番号６９）に特異的なトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞と選択的に相互作用し、それを標識する。対照的に、ＧＰ３３－４１ペプチド［ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ（配列番号７５）；リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）糖タンパク質に由来する］でパルスされたＦＴ修飾ＤＣはＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞により認識されない。
図５Ｂは、この研究実施例において用いた実験的アッセイ手順を示す。簡潔に説明すると、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＣＤ４５．２＋）の骨髄細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）と共に培養して、ｉＤＣへと分化させた。ｉＤＣをＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴ（０．２０ｍｇ／ｍＬ）（実施例１に記載されているとおりに製造されたもの）で処理して、実施例１に記載されているとおりに表面上にＦＴを導入した。ＦＴ修飾ｉＤＣを同族ＳＩＩＮＦＥＫＬ Ｎ４ペプチド（配列番号６９）（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）またはＬＣＭＶペプチドＧＰ３３－４１（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）でパルスした後、適切なＣＤ４５．１マーカー（ＣＤ４５．１＋／－）を含有するナイーブＯＴ－Ｉマウスの脾細胞と共に細胞数比１：１で２時間培養した。ついでＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン（５０μＭ）を加え、更に３０分間インキュベートした。反応をクエンチした後、細胞混合物をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ストレプトアビジンで染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。
図５Ｃはこの研究のフローサイトメトリー分析を示し、これは、それぞれ１０：１および６６：１のシグナル対バックグラウンド比での相互作用性ＯＴ－１ ＣＤ８＋細胞上の頑強な標識を示した（図５Ｃ、上および下、右端のパネル）。この場合、バックグラウンドは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号６９）でパルスされたＤＣ（膜固定ＦＴの非存在下）をナイーブＯＴ－Ｉ脾細胞と共に同じ時間にわたってインキュベートすることによってＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋細胞上で生成されるシグナルとして定義される。対照的に、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）ＧＰ３３－４１ペプチドでローディングされたｉＤＣ－ＦＴは、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の、バックグラウンドレベルの標識を誘発したに過ぎなかった。このことは、標識が非常に特異的であることを示している（図５Ｃ、上および下、中央パネル）。ｉＤＣ－ＦＴ対Ｔ細胞比が増加するにつれて、それに応じてＦＴ媒介性細胞間標識の強度が増加し、これはＴ細胞初期活性化マーカーＣＤ６９の付随的アップレギュレーションを伴っていた（図５Ｉ）。
ついで、ｉＤＣ－ＯＴ－Ｉ脾細胞共培養系を使用して、標識条件を最適化した。ｉＤＣ結合のための最適なＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴ濃度を決定するために、ｉＤＣ（ＣＤ４５．１ ＋／＋）を、図５Ｊに示されている種々の量のＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴで処理し、ついで、抗原ＯＶＡ２５７－２６４またはＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１（１００ｎＭ）でローディングされたｉＤＣ－ＦＴをＣＤ４５．１－ ＯＴ－Ｉ脾細胞と共にｉＤＣ／Ｔ比１：１で２時間共培養し、ついでＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン（５０μＭ）を加え、更に３０分間インキュベートした。ＬａｃＮＡｃ（２ｍＭ）でクエンチした後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析のために抗ｍＣＤ４５．１－ＦＩＴＣ、抗ｍＣＤ８ａ－ＰＢおよびストレプトアビジン－ＡＰＣで染色した。図５Ｊに示されているとおり、最適な標識は、０．２ｍｇ／ｍＬのＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴで修飾されたｉＤＣを使用して達成された。
Ｔ細胞とｉＤＣとの最適な共培養時間を決定するために、ｉＤＣ（ＣＤ４５．１ ＋／＋）を０．２ｍｇ／ｍＬＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴで処理した。ついで、抗原ＯＶＡ２５７－２６４またはＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１（１００ｎＭ）でローディングされたｉＤＣ－ＦＴを、ＣＤ４５．１－ ＯＴ－Ｉ脾細胞と共に、ｉＤＣ／Ｔ比１：１で、図５Ｋに示されている時間にわたって共培養し、ついでＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン（５０μＭ）を加え、更に３０分間インキュベートした。ＬａｃＮＡｃ（２ｍＭ）でクエンチした後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー分析のために抗ｍＣＤ４５．１－ＦＩＴＣ、抗ｍＣＤ８ａ－ＰＢおよびストレプトアビジン－ＡＰＣで染色した。ｉＤＣ／Ｔ比＝１：１。図５Ｋに示されているとおり、０．２ｍｇ／ｍＬ ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴで修飾されたｉＤＣを使用すると、２時間以内に最適な標識が達成された（図５Ｊおよび５Ｋ）。この条件下、抗原特異的標識はｉＤＣプライミングのためのＯＶＡ２５７－２６４の量と正に相関した（図５Ｌ）。
ＦｕｃｏＩＤにより達成された標識強度が相互作用の強度を反映しているかどうかを調べるために、前記のＯＴ－Ｉ標識研究を繰り返した。ただし、この場合には、別の２つの改変ペプチドリガンド（ＡＰＬ）、すなわち、元のＯＴ－ＩリガンドＳＩＩＮＦＥＫＬ Ｎ４（配列番号６９）に由来するＳＡＩＮＦＥＫＬ（Ａ２）（配列番号７０）およびＳＩＩＴＦＥＫＬ（Ｔ４）（配列番号７１）を更に使用した。これらのＡＰＬはＮ４と同等に良好にＭＨＣ Ｉ Ｈ－２Ｋｂに結合するが、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋細胞のＴＣＲと相互作用する能力において異なる［結合強度：ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｎ４）（配列番号６９）＞ＳＡＩＮＦＥＫＬ（Ａ２）（配列番号７０）＞ＳＩＩＴＦＥＫＬ（Ｔ４）（配列番号７１）］。ＦＴ修飾ｉＤＣをこれらのペプチドおよびＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１により１００ｎＭの最終濃度となるように個々に３０分間パルスし、前記のパイロット研究の実験手順を繰り返した。図５Ｄ（フローサイトメトリーの結果）および図５Ｅ（種々の実験群においてビオチン＋であった細胞の比率の定量）に示されているとおり、標識の規模は、ＳＩＩＮＦＥＫＬ（Ｎ４）（配列番号６９）＞ＳＡＩＮＦＥＫＬ（Ａ２）（配列番号７０）＞ＳＩＩＴＦＥＫＬ（Ｔ４）（配列番号７１）＞ＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１＝未プライミング体＝対照［膜固定ＦＴの非存在下のＳＩＩＮＦＥＫＬ Ｎ４（配列番号６９）でパルスされたＤＣ］であり、これはＡＰＬの結合強度と厳密に相関していた。Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９によると、ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋細胞の活性化の規模もこの傾向に適合していることは注目に値する。このアッセイには３つの独立した反復実験が含まれていた。要約すると、ビオチンタグの規模はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対する抗原の結合アフィニティと相関する。
図５Ｂに示されているとおりに実験手順を繰り返した。ただし、この場合には、図５Ｂにおいて使用されたＯＴ－１マウス脾細胞の代わりに、ＯＴ－ＩＩマウス脾細胞を使用した。ＦＴ修飾ＤＣを１００ｎＭのＯＶＡ３２３－３３９ペプチドまたはＬＣＭＶ ＧＰ６１－８０でプライミングした。この実験のフローサイトメトリー分析の結果を図５Ｆに示す。この図は相互作用性ＯＴ－ＩＩ ＣＤ４＋細胞上の頑強な標識を示している。ＯＶＡ３２３－３３９でパルスされたｉＤＣ－ＦＴは、２時間の共培養下、対応ＴＣＲがＯＶＡ３２３－３３９に対して反応性であったＯＴ－ＩＩ ＣＤ４＋ Ｔ細胞の１１．３％を特異的にビオチン化した。対照的に、ＬＣＭＶ ＧＰ６１－８０でパルスされたＤＣ－ＦＴを使用した群では、バックグラウンド標識（１．６８％）が観察されたに過ぎなかった。重要なことに、これは、ＭＨＣ－ＩＩ結合ペプチドとＣＤ４との間の結合が有意に弱いにもかかわらず、ｉＤＣ－ＣＤ４＋相互作用をプローブするためにも、ＦｕｃｏＩＤが適用されうることを示している。
より困難な状況でのＦｕｃｏＩＤの感度および特異性を更に評価するために、ナイーブＯＴ－Ｉ（ＣＤ４５．１＋／－）およびＰ１４ ＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ｔｈｙ１．１＋／－）（ＭＨＣ－Ｉにより提示されるＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１を認識するもの）を混合し、混合物を、ＯＶＡ２５７－２６４またはＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１でパルスされたｉＤＣ－ＦＴと共に、それぞれ１：１：１の比で共培養した（図５Ｇ、左パネル）。２時間の共培養の後、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチンを加えた。図５Ｇ、右パネルおよび図５Ｈに示されているとおり、ＯＴ－ＩおよびＰ１４ ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、それぞれ、ＯＶＡ２５７－２６４およびＬＣＭＶＧＰ３３－４１でプライミングされたｉＤＣ－ＦＴによって選択的に標識された。
トロゴサイトーシスと称される、提示細胞とリンパ球との間の細胞膜断片の双方向転移は、これらの細胞が互いに結合している際に生じうることが公知である３６，３７。したがって、本発明者らは、前記実施例で観察されたＴ細胞ビオチン化が、相互作用依存的標識によってではなくトロゴサイトーシスによって非特異的に生じた可能性を排除するための実験を計画した。該実験の実験計画を図６Ａに示す。簡潔に説明すると、ｉＤＣをＦＴ（ＦＴはＨｉｓ６タグ付き組換えタンパク質として発現された）またはＦｕｃ－Ｂｉｏで標識し、標識ＤＣをＯＶＡ２５７－２６４またはＧＰ３３－４１でプライミングし、これらの群と、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチンで処理されたＦＴ結合ｉＤＣとの間に検出可能な差異があるかどうかを試験した。ついで、プライミングされたＤＣをＯＴ－Ｉ脾細胞と共にインキュベートした。細胞混合物にＧＤＰ－Ｆｕｃ－Ｂｉｏを加えて、近接ベース標識を開始させた。あるいは、ストレプトアビジン－ＡＰＣまたは抗Ｈｉｓ抗体で細胞を直接染色して、それぞれＦｕｃ－ＢｉｏまたはＦＴがトロゴサイトーシスにより転移されたかどうかを検出した。図６Ｂは、近接ベースビオチン化（左）またはトロゴサイトーシス［Ｆｕｃ－Ｂｉｏ（中）またはＦＴ（右）の転移］により標識されたＴ細胞のヒストグラムを示す。ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞は近接ベースビオチン化により頑強に標識された（左パネル）。対照的に、ストレプトアビジン－６４７または抗Ｈｉｓ抗体（中央パネルおよび右パネル）で染色された細胞ではバックグラウンドシグナルが検出されたに過ぎず、このことは、無視しうる量のＦｕｃ－ＢｉｏまたはＦＴがトロゴサイトーシスにより転移されたことを示している。
したがって、総合すると、本実施例は、抗原でプライミングされたＦＴ結合ベイトＤＣが、プライミング抗原に対する結合アフィニティを有するＴ細胞受容体を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋ プレイＴ細胞を特異的に標識しうることを示している。
実施例４
ナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞とのＤＣ相互作用を検出するための「ベイト」ＦＴ機能化樹状細胞（ＤＣＳ）のインビボ使用
抗原特異的ＤＣ－Ｔ細胞相互作用をインビトロ／エクスビボでプローブするための信頼しうる技術としてのＦｕｃｏＩＤの検証により、本発明者らは、インビボでそのような相互作用を検出するためにこの方法を用いる可能性を評価した。図７Ａはそのようなインビボ実験のプロトコルを示す。簡潔に説明すると、実施例３に記載されているとおりにＤＣを得、図５Ｂに記載されているとおりにＦＴ結合ＤＣを製造した。ＣＤ４５．１＋／－ ＯＴ－Ｉマウス（ドナーマウス）の脾細胞を静脈内（ＩＶ）注射によりＣ５７ＢＬ／６マウス（ＣＤ４５．２＋）に導入した（マウス当たり１０×１０６個の細胞）。２４時間後、ＳＩＩＴＦＥＫＬ Ｎ４（配列番号７１）またはＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１でパルスされた未修飾ＤＣ（対照ＤＣ）またはＦＴ修飾ＤＣ（ＣＤ４５．２＋）細胞をＩＶ注射によりマウスに導入した（マウス当たり２×１０６個の細胞）。４時間後、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチンをＩＶ注射によりマウスに注射した（マウス当たり０．４μｍｏｌ）。ついで鼠径リンパ節および脾臓を単離し、細胞溶解し、フローサイトメトリー分析のために染色した。図７Ｂはフローサイトメトリーの結果の定量を示す。ＳＩＩＴＦＥＫＬ Ｎ４（配列番号７１）でパルスされたＤＣ－ＦＴはリンパ節と脾臓との両方においてドナーマウスのナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞と選択的に相互作用し、それを標識することが可能であったが、これは、対照ＤＣおよびＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１でパルスされたＤＣ－ＦＴにおいては観察されなかった。興味深いことに、本発明者らは、ドナーマウスのＣＤ８－細胞のごく一部が脾臓において標識されることを見出した。これは、ＤＣと、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびマクロファージを含む他の細胞型との相互作用の結果でありうる。要約すると、この標識法はインビボでの細胞間相互作用の詳細を有効にモニターしうる。
実施例５
「ベイト」ＦＴ機能化ＤＣを使用したＢ１６黒色腫の浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）からの腫瘍反応性Ｔ細胞の検出
腫瘍組織においては、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、新生抗原特異的ＴＣＲを含有する少数のＴ細胞しか含有せず、このことは免疫応答の非効率性につながる３３。現在の患者特異的腫瘍免疫療法の第１段階は、これらの特異的Ｔ細胞またはそれらが発現するＴＣＲを特定するための複雑な手順を含む３４－３５。腫瘍組織における新生抗原特異的Ｔ細胞を特定するためのより簡便なアプローチは患者特異的免疫療法の効率を著しく改善する。図８Ａは、ＦＴ機能化ＤＣを使用して、腫瘍組織における新生抗原特異的Ｔ細胞を検出し選別するための方法を示す。簡潔に説明すると、ＤＣを前記実施例のとおりに機能化し、ＦＴ機能化ＤＣを腫瘍ライセートで前処理し、ついで、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチンの存在下、ＴＩＬを含む腫瘍細胞懸濁液と混合する。ＦＴ機能化ＤＣは腫瘍ライセートからの新生抗原を提示し、提示された新生抗原に特異的なＴＣＲを含有するＴＩＬ由来Ｔ細胞はＦＴ機能化ＤＣに結合し、ＦＴ媒介性相互作用依存的標識により標識される。このようにして、新生抗原特異的Ｔ細胞のごく一部が更なる分析のために選択されうる。
図８Ｂは、Ｂ１６黒色腫のＴＩＬからの腫瘍反応性Ｔ細胞の単離を直接検出するための、より詳細な実験ワークフローを示す。Ｂ１６腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下接種（ｓ．ｃ．）した（５０万細胞／マウス）。第１３日～第１５日に、腫瘍を収集し、小片に横切りした。ついで、腫瘍片を細かく切り刻み、細胞ストレーナー（１００μＭ）で濾過して、腫瘍ライセートおよび単細胞懸濁液を調製した。腫瘍ライセートの調製の場合には、腫瘍細胞をＴ細胞培地に再懸濁させ（５００万細胞／ｍＬ）、ついで細胞を超音波処理で１分間細胞溶解し、ついで２０００×ｇで１０分間遠心分離した。ついで上清を採取し、使用のために－８０℃で保存した。単細胞懸濁液の場合には、細かく刻んだ腫瘍細胞をＰＤＢで洗浄し、ついで４０％ パーコール溶液（２５ｍＬ、１×ＤＰＢＳ中）に再懸濁させた。ついで細胞懸濁液を８０％ パーコール（２５ｍＬ、１×ＤＰＢＳ中）の上に、界面を乱すことなくゆっくりと加えた。８００×ｇで２０分間の遠心分離の後（加速：５、減速：５）、中間層（４０％ パーコールと８０％ パーコールとの界面付近）の細胞を回収した。ＰＢＳで洗浄した後、回収した細胞を、使用のためにＴ細胞培地に再懸濁させた。一晩の培養を要する場合には、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２を培地に供給した。
ＣＤ４５．１＋／＋ Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製されたｉＤＣを以下の４つの群に分けた。（ｉ）ペプチド無しで処理された群、（ｉｉ）ＯＶＡ２５７－２６４（５ｎＭ）で処理された群、（ｉｉｉ）Ｂ１６特異的ヒトＧＰ１００（５ｎＭ）で処理された群、および（ｉｖ）腫瘍ライセート（超音波処理により調製されたもの）で一晩処理された群。ついで、前記の４つの群のｉＤＣを図５ＢのとおりにＦＴで機能化し、腫瘍細胞をそれらの４つの各群のＦＴ機能化ＤＣと共に３７℃で２時間インキュベートした（細胞比：腫瘍由来単一細胞：ｉＤＣ＝１０：１）。ついでＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン（５０μＭ）を加え、更に３０分間インキュベートした。最後に、ＬａｃＮＡｃ（５ｍＭ）で反応をクエンチした後、細胞混合物をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ストレプトアビジンおよび細胞同一性マーカーで染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。ＰＤ－１＋／ＣＤ８＋／Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７＋ Ｔ細胞を有望なＴＳＡ特異的Ｔ細胞として単離した。
図８Ｃに示されているとおり、ＯＶＡ２５７－２６４でプライミングされたＤＣと共に腫瘍細胞懸濁液をインキュベートした場合には、無視しうる数のＣＤ８＋ ＴＩＬがビオチン化されたに過ぎなかった（図８Ｃ、右上のパネル）。対照的に、黒色腫／メラノサイト共有分化抗原ＧＰ１００または腫瘍ライセートでプライミングされたＤＣと共にインキュベートした後、ＴＩＬは頑強に標識された（それぞれ左下および右下のパネル）。腫瘍ライセート処理群における全てのＣＤ８＋ ＴＩＬのうち、約７０％はＰＤ－１＋であり、そのうちの約５０％はビオチン化され、ほとんど全てのビオチン化ＴＩＬはＰＤ－１＋であった。このことは、これらのＴＩＬがそれらの同族抗原に遭遇したことを示唆している。ＰＤ－１＋ ＴＩＬの残りの半分は、腫瘍ライセートでプライミングされたＤＣによってはビオチン化されなかった。このことは、この画分がバイスタンダー細胞でありうることを示唆している（図８Ｃ、右下のパネル）。重要なことに、ＰＤ－１－Ｔ細胞はいずれもビオチン化されなかった。次に、示されているとおりのＰＤ－１－（緑、右下パネルの左下四分の一）、ビオチン＋（赤、右下パネルの右上四分の一）およびビオチン－（青、右下パネルの左上四分の一）ＴＩＬを選別し、Ｔ細胞培地（ＩＬ２：１００ＩＵ／ｍＬ）内で７２時間静置し、ついで、選別された細胞をエクスビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイにおいて評価した。
Ｂ１６－ＯＶＡ黒色腫細胞（ホタルルシフェラーゼで安定に形質導入されたもの）を選別ＣＤ８＋ Ｔ細胞と共に１：４の比で２０時間にわたって共培養した。ついでＢ１６－ＯＶＡ細胞数をルシフェラーゼ活性（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ，Ｐｒｏｍｅｇａ）により定量した。ＰＤ－１＋／ビオチン＋のＴ細胞（右の柱状グラフ）はＰＤ－１＋／ビオチン－（中央の柱状グラフ）およびＰＤ－１－（左の柱状グラフ）のＴ細胞よりも有意に高い殺傷活性を示したが、このことは、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞がビオチン＋集団に豊むことを強く示唆している（図８Ｄ）。データは３つの独立した実験から得られた。
追跡実験において、本発明者らは、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、腫瘍ライセートまたはＧＰ１００２５－３３でパルスされたＤＣとの共培養の後のＩＦＮγ分泌に基づいて、増殖した細胞の腫瘍反応性を評価した。この実験からのデータを図８Ｅに示す。ＰＤ－１－（図８Ｅ、各群における左の柱状グラフ）の細胞およびＰＤ－１＋／ビオチン－（図８Ｅ、各群における中央の柱状グラフ）の細胞はバックグラウンドレベル付近の反応性を示したに過ぎなかった（バックグラウンド反応性は、プライミングされていないＤＣまたはＯＶＡ２５７－２６４ペプチドでプライミングされたＤＣと共に増殖細胞をインキュベートすることにより検出されたスポット数として定義される）。対照的に、ビオチン＋細胞に関しては、相当な腫瘍反応性が観察された（図８Ｅ、各群における右の柱状グラフ）。データは３つの独立した実験から得られた。プライミングされていないＤＣを陰性対照として使用し、ＰＭＡイオノマイシンを陽性対照として使用した。全ての図において、ｎｓ Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析およびそれに続くテューキーの多重比較検定。
実施例６
「ベイト」ＦＴ機能化ＤＣＳを使用した三重陰性乳房腫瘍Ｅ０７７１における浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からの腫瘍反応性Ｔ細胞の検出
ＦｕｃｏＩＤが、Ｂ１６－ＯＶＡ黒色腫モデルおよびＢ１６黒色腫腫瘍からＴＳＡ反応性ＴＩＬを検出し富化するための非常に有効なアプローチであることを確認した後、本発明者らは、この方法がＥ０７７１三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）腫瘍およびＭＣ３８結腸癌腫瘍においても機能するかどうかを調べることにした。ＴＮＢＣは、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびＨＥＲ２増幅を欠く複雑で攻撃的な乳癌であり、このことはその治療戦略を非常に限られたものにしている。本実施例は、ＭＣ３８結腸癌腫瘍およびＥ０７７１乳房腫瘍のＴＮＢＣから腫瘍反応性ＴＩＬを富化するための本発明の可能性を示す。Ｅ０７７１細胞株はＣ５７ＢＬ／６マウス由来の自然発生髄質乳房腺癌である（Ｙａｎｇ，Ｙ．；Ｙａｎｇ，Ｈ．Ｈ．；Ｈｕ，Ｙ．；Ｗａｔｓｏｎ，Ｐ．Ｈ．；Ｌｉｕ，Ｈ．；Ｇｅｉｇｅｒ，Ｔ．Ｒ．；Ａｎｖｅｒ，Ｍ．Ｒ．；Ｈａｉｎｅｓ，Ｄ．Ｃ．；Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．；Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｅ．；Ｌｅｅ，Ｍ．Ｐ．；Ｈｕｎｔｅｒ，Ｋ．Ｗ．；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｌ．Ｍ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７，８，３０６２１－３０６４３）。ＭＣ３８細胞株は超突然変異結腸直腸癌の検証済みモデルである（Ｅｆｒｅｍｏｖａら，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，３２，２０１８）。
図９Ａは、Ｅ０７７１腫瘍のＴＩＬからの腫瘍反応性Ｔ細胞の単離を直接検出するための実験ワークフローを示し、ＭＣ３８実験は同様のプロトコルに従った。簡潔に説明すると、Ｅ０７７１の場合には、１×１０６個のＥ０７７１腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの乳腺に接種（ｓ．ｃ．）し、ＭＣ３８の場合には、腫瘍細胞を雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（特別な徴候がなければＣＤ４５．１－）の側腹に皮下移植し、いずれの場合にも、Ｂ１６腫瘍細胞に関して前記実施例５に記載されているのと同じ方法を用いて、腫瘍組織の単離の前の約１４日間にわたってそれらを行った。前記実施例５に記載されているのと同じ方法を用いて、腫瘍ライセートおよび単細胞懸濁液を調製した。ＣＤ４５．１＋／＋ Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製されたＤＣを以下の４つの群に分けた。（ｉ）ペプチド無しで処理された群、（ｉｉ）ＯＶＡ２５７－２６４（１００ｎＭ）で処理された群、（ｉｉｉ）健常Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの乳腺ライセートで処理された群、および（ｉｖ）Ｅ０７７１腫瘍ライセートで一晩処理された群。ついで前記の４つの群のＤＣを図５ＢのとおりにＦＴで機能化し、腫瘍細胞を各群のＦＴ機能化ＤＣと共に２時間インキュベートした（細胞比：腫瘍由来単一細胞：ｉＤＣ＝１０：１）。ついでＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン（５０μＭ）を加え、更に３０分間インキュベートした。ＬａｃＮＡｃ（５ｍＭ）で反応をクエンチした後、細胞混合物をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ストレプトアビジンおよび細胞同一性マーカーで染色し、ＦＡＣＳを用いて分析した。図９Ｂおよび９ＥはＦＡＣＳの結果を示し、Ｅ０７７１腫瘍ライセートまたはＭＣ３８細胞株ライセートでプライミングされたＦＴ機能化ＤＣが、それぞれ、ＣＤ８＋ ＴＩＬの１７．３％および２４．９％を特異的に標識し、これらの細胞の全てがＰＤ－１＋であることを示している（図９Ｂおよび９Ｅにおける右端のパネル、右上の四分の一）。対照的に、抗原無し（図９Ｂおよび９Ｅにおける左から２番目のパネル）、ＯＶＡ２５７－２６４（図９ＢにおけるＥ０７７１の中央パネル）および健常乳腺ライセート（図９Ｂにおける右から２番目のパネル）または健常結腸ライセート（図９Ｅにおける右から２番目のパネル）で処理されたＦＴ機能化ＤＣはＣＤ８＋ ＴＩＬへの最小限のビオチン化を示した。
選別されたＣＤ８＋ Ｔ細胞をＴ細胞培地（ＩＬ２：１００ＩＵ／ｍＬ）内で７２時間静置した。ついで選別細胞をエクスビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイにおいて評価した。Ｅ０７７１またはＭＣ３８細胞（ホタルルシフェラーゼで安定に形質導入されたもの）を選別ＣＤ８＋ Ｔ細胞と共に１：４の比で２０時間にわたって共培養した。ついでＥ０７７１またはＭＣ３８腫瘍細胞数をルシフェラーゼ活性（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ，Ｐｒｏｍｅｇａ）により定量した。Ｅ０７７１の場合、ＰＤ－１＋／ビオチン＋ Ｔ細胞（図９Ｃ、右の柱状グラフ）は、ＰＤ－１＋／ビオチン－ Ｔ細胞（約２０％）（図９Ｃ）およびＰＤ－１－ Ｔ細胞（約５％）よりも有意に高い殺傷活性（＞９０％）を示した。このことは、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞がビオチン＋ 集団において富化していることを強く示唆している。データは３つの独立した実験から得られた。ＭＣ３８腫瘍細胞においても同様の結果が観察された（図９Ｆ）。
ついで、Ｅ０７７１の場合には（ｉ）抗原無し、（ｉｉ）ＯＶＡ２５７－２６４、（ｉｉｉ）腫瘍ライセート、または（ｉｖ）腫瘍ライセート ＋ 抗マウスＭＨＣＩでパルスされたＤＣ、およびＭＣ３８の場合には腫瘍ライセートまたは腫瘍ライセート ＋ 抗マウスＭＨＣＬでパルスされたＤＣと共培養した後、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ＩＦＮγ分泌に基づいて増殖細胞の腫瘍反応性を評価した。Ｅ０７７１に関して図９Ｄに示されているとおり、ＰＤ－１－ 細胞およびＰＤ－１＋／ビオチン－ 細胞（それぞれ、各群における左および中央の柱状グラフ）はバックグラウンドレベル付近の反応性を示したに過ぎなかった。対照的に、ビオチン＋ 細胞においては、相当な腫瘍反応性が観察された（各群における右の柱状グラフ）。図９Ｇに示されているとおり、ＭＣ３８においても同様の結果が観察され、ＰＤ－１－ 細胞およびＰＤ－１＋／ビオチン－ 細胞（各群における左の２つの柱状グラフ）はほぼバックグラウンドレベルを示したが、腫瘍ライセートに曝露されたＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ 細胞は相当な腫瘍反応性を示した。ＰＭＡ／イオノマイシンで処理されたＴ細胞は、ビオチン＋ 集団において、有意に強力なＩＮＦγ放出を示し、このＩＦＮγ放出はＭＨＣＩ抗体の添加によって完全に遮断されたことは注目に値する。データは３つの独立した実験から得られた。全ての図において、ｎｓ Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析およびそれに続くテューキーの多重比較検定。
実施例７
Ｅ０７７１およびＭＣ３８腫瘍モデルから単離されたＴＩＬのＴＣＲクロノタイプレパートリーの特徴づけ
ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬとＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＣＤ８＋ ＴＩＬとのＴＳＡ反応性の差異はそれらのＴＣＲクロノタイプレパートリーの差異に起因する。本発明者らは、更なるインビトロ増殖を行うことなくＦＡＣＳ単離の直後に、Ｅ０７７１およびＭＣ３８腫瘍モデルから単離されたこれら２つのＴＩＬサブセットのＴＣＲクロノタイプレパートリーを特徴づけした。各サブセットにおける個々のＴ細胞クロノタイプの頻度を定量するために、ＴＣＲβのディープシーケンシング（ディープ配列決定）を用いた。終止コドンまたはフレームシフトを含有しない生産的ＣＤＲ３配列はユニークＴＣＲクロノタイプを表し、各サブセットが同等のＣＤＲ３リード（ｒｅａｄ）総数を有する場合にはユニーク配列の総数は各サブセットにおけるクローン多様性を決定する。本発明者らは、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ 集団におけるＴＣＲβが、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ サブセットにおけるそれらの対応物よりも有意にオリゴクローナルであることを見出した。このことは、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ サブセットにおける細胞が相当なＴＳＡ誘導性クローン増殖を受けたことを示唆している（図１２）。更に、どちらの腫瘍モデルにおいても、これら２つのサブセット間で見出された最も豊富な１０個のＴＣＲβ ＣＤＲ３の重複は存在しなかった（図１２）。ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイおよびＴＣＲβディープシーケンシングからの結果は、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬとＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬとが、同一腫瘍において共存し或る程度の表現型類似性（例えば、ＰＤ－１＋）を共有する機能的に及びクロノタイプ的に異なる２つのＴ細胞サブセットに相当することを示した。
ＰＤ－１＋ ＴＩＬはＴＳＡ反応性Ｔ細胞だけでなくバイスタンダーＴ細胞からも構成されるため、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞とバイスタンダーＴ細胞とが同様の増殖速度を有する場合には、インビトロ増殖後、ＰＤ－１＋ ＴＩＬ集団全体の抗腫瘍細胞傷害性はＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬサブセットの場合よりかなり弱いはずである。この仮定を評価するために、同一腫瘍から単離されたＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬ、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬおよび総ＰＤ－１＋ ＴＩＬを急速増殖プロトコルに付した。記録された増殖曲線によると、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬおよび総ＰＤ－１＋ ＴＩＬは非常に類似した増殖速度を示し、これは増殖の全過程においてＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬの増殖速度よりも有意に速かった（図１３）。これらの観察は、増殖の終了時に、バイスタンダーＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬが、増殖した総ＰＤ－１＋ ＴＩＬにおける優勢な細胞集団になることを示唆している。増殖の第１０日に、各サブセットの腫瘍殺傷能を評価した。種々のエフェクター／ターゲット比において、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬは、対応するＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬおよび総ＰＤ－１＋ ＴＩＬよりも有意に強い腫瘍細胞殺傷を示した（図８Ｄ、９Ｃ、９Ｆおよび図１４）。これらの結果は、ＰＤ－１＋ ＴＩＬ集団全体においてバイスタンダーＴ細胞の増殖がより速いため、急速な増殖の終点において、ＰＤ－１＋ ＴＩＬ全体の抗腫瘍活性が、増殖したＴＳＡ反応性ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬの抗腫瘍活性よりも有意に弱くなることを示唆している。
実施例８
増殖したＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬは総ＰＤ－１＋ ＴＩＬよりも有意に高い抗腫瘍活性をインビボで示す
増殖したＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬおよび総ＰＤ－１＋ サブセットの抗腫瘍活性をインビボで比較するために、本発明者らは、まず、確立された肺微小転移を有するマウスにおける腫瘍増殖を抑制するための、Ｂ１６黒色腫モデルから単離されたＴＩＬの使用を検討した。肺転移を誘発するためのホタルルシフェラーゼ安定形質導入Ｂ１６腫瘍細胞（Ｂ１６－ｌｕｃ）の静脈内接種の３日後、腫瘍接種マウスを、それぞれ、増殖した総ＰＤ－１＋ ＴＩＬおよびＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬ（マウス当たり３×１０６個）で処理し、一方、対照群にはバッファーのみを注射した。腫瘍増殖を縦方向非侵襲的生物発光イメージングによりモニターした。図１５Ａに示されているとおり、総ＰＤ－１＋ ＴＩＬは、処理第８日に、ＨＢＳＳ対照群より６０％低い生物発光を示して、腫瘍増殖を予防する中程度の治療効力を示した。比較として、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬは腫瘍増殖を有意に抑制し、ＨＢＳＳ対照群より９８％低い生物発光シグナルを示した。注目すべきことに、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬで処理すると、腫瘍担持マウスの生存期間が有意に延長した。バッファーのみの投与を受けた、および総ＰＤ－１＋ ＴＩＬの投与を受けた全てのマウスは、それぞれ、処理第２日および第２６日に死亡した。対照的に、全てのＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬ被投与マウスは処理第２７日まで生存し、実験の終了までに、尚も２０％のマウスが生存していた（処理第４０日）。
固形腫瘍の増殖を抑制する、増殖したＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬの能力を評価するために、本発明者らは、皮下ＭＣ３８腫瘍から単離されたＴＩＬを使用することにした。増殖した総ＰＤ－１＋ ＴＩＬおよびＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬ（マウス当たり５×１０６個）を、それぞれ、確立された皮下ＭＣ３８腫瘍を有するマウスに静脈内注射し、ついで抗ＰＤ－１を投与した。対照群においては、マウスを、それぞれ、抗ＰＤ－１およびＨＢＳＳで処理した。抗ＰＤ－１ ＴＩＬ処理および抗ＰＤ－１＋ 総ＰＤ－１＋ ＴＩＬ処理は中程度の腫瘍抑制を示したに過ぎなかったが、抗ＰＤ－１と組合されたＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬは腫瘍増殖を有意に遅らせ、腫瘍サイズの中央値は、抗ＰＤ－１＋ 総ＰＤ－１＋ ＴＩＬで処理された場合の僅か１／４であった（治療第２２日、図１５Ｂ）。更に、どの対照群においてもマウスは第２８日までは生存しなかったが、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬ ＋ 抗ＰＤ－１で処理されたマウスの５０％は第３４日まで尚も生存していた。そして１匹のマウスは第４０日まで腫瘍非含有であることが判明した（図１５Ｂ）。これらの結果が示したところによると、増殖したＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬは、バイスタンダーＴ細胞を大きな割合で含有する増殖した総ＰＤ－１＋ ＴＩＬよりも、インビボで腫瘍増殖を抑制する著しく高い活性を有する。
実施例９
フコシル化による細胞表面への他の酵素の結合、および酵素に化学的に結合した細胞とのその比較
前記実施例の汎用性を拡張するために、本実施例においては、本発明者らの糖結合法（前記実施例に記載されているもの）または化学的結合法を用いて、種々の酵素が細胞表面に結合可能であり、いずれの方法で結合された細胞も細胞間近接実験における使用に適していることを実証する。図１０Ａは、フコシル化（方法１、左スキーム）または化学的結合（方法２、右スキーム）による、細胞の細胞表面上の任意の酵素の結合のためのこれらの２つのスキームを例示する。
方法１は前記実施例に記載されている。まず、アミンカップリングまたは部位特異的修飾（例えば、アルデヒドタグまたは非天然アミノ酸修飾）により、テトラジン、アジドまたはアルキンのような「クリック可能」基に酵素を連結した。ついで、連結された酵素を、クリックケミストリーにより、相補的「クリック可能」基を含有するＧＤＰ－フコース誘導体に結合させてＧＤＰ－フコース－酵素結合体を形成させた。ついで、該酵素機能化ＧＤＰ－フコース（ＧＤＰ－Ｆｕｃ－酵素）を、フコシルトランスフェラーゼにより触媒される細胞表面に転移させ（この例においては、酵素を細胞表面に転移させるためにヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼを使用したが、この工程を促進させるために他のフコシルトランスフェラーゼも使用されうる。例えば、酵素機能化ＧＤＰ－フコースの代わりに酵素機能化ＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃ類似体が使用される場合には、シアリルトランスフェラーゼが使用されうる）、それにより酵素を細胞表面に結合させた。この実験においては、方法１の糖結合技術により、ビオチン化ヒトα２，６αシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｇａｌ１）、Ｈｉｓタグ付きヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）、Ｈｉｓタグ付きヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）およびＨｉｓタグ付きソルターゼＡ（５Ｍ）を未熟ＤＣ表面上に結合させて、ＤＣ－酵素結合体を形成させた。
方法２（図１０Ａ、右スキーム）においては、酵素をアミンカップリングによりテトラジンに連結して、酵素－テトラジン結合体（酵素－Ｔｚ）を形成させた。次に細胞をＴＣＯ－ＮＨＳエステルで処理して、細胞表面上にＴＣＯ部分を導入した。最後に、酵素－Ｔｚ結合体を双直交（ｂｉｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）反応により細胞表面のＴＣＯ－ＮＨＳ部分と反応させて、細胞－酵素表面結合体を形成させた。この実験においては、方法２の化学的結合技術により、Ｈｉｓタグ付きヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）およびＨｉｓタグ付きヘリコバクター・ピロリα１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（（１，３／４）ＦＴ）を未熟ＤＣ表面上に結合させて、ＤＣ酵素結合体を形成させた。
ストレプトアビジン－ＡＰＣを使用したフローサイトメトリーの結果を図１０Ｂに示す。これは、方法１を使用して、ヒトα２，６αシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｇａｌ１）が未熟樹状細胞の表面に効率的に連結されたことを証明している。検出目的のタグとしてのビオチンでＳＴ６Ｇａｌ１を予め修飾した。左ピークは未結合ＤＣにおけるバックグラウンドのストレプトアビジン－ＡＰＣシグナルを示し、右ピークは、フコシル化法によりＳＴ６Ｇａｌ１に結合した細胞におけるストレプトアビジン－ＡＰＣシグナルの顕著な増加を示す。同様に、図１０Ｃは、方法１を使用して、Ｈｉｓタグ付きヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）、Ｈｉｓタグ付きヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）およびＨｉｓタグ付きソルターゼＡ（５Ｍ）を未熟ＤＣ表面上に導入して、それぞれＤＣ－ＦＴ（前記実施例に記載されているとおり）およびＤＣ－ソルターゼ結合体を形成させる例を用いた、フローサイトメトリーの結果を示す。左ピークは未結合ＤＣにおけるバックグラウンドの抗ｈｉｓタグ－フィコエリトリン（ＰＥ）シグナルを示し、残りの３つのピークは、フコシル化法１によりＨｉｓタグ付きソルターゼＡ（５Ｍ）、Ｈｉｓタグ付きヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ６）およびＨｉｓタグ付きヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）に結合された細胞における抗ｈｉｓタグ－フィコエリトリン（ＰＥ）シグナルの増加を、左から右に示す。
図１０Ｄには、方法２の化学的結合プロトコルを使用したＤＣ－ＮＨＳ－ＦＴおよびＤＣ－ＮＨＳ－（１，３／４）ＦＴ結合体の形成の成功を示す、フローサイトメトリー実験からの結果が示されている。具体的には、図１０Ｄは、方法２によりＨｉｓタグ付きヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）およびＨｉｓタグ付きヘリコバクター・ピロリα１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（（１，３／４）ＦＴ）に表面上で結合した未熟ＤＣの抗ｈｉｓタグ－フィコエリトリン（ＰＥ）を使用したフローサイトメトリー分析を示す。左ピークは未結合ＤＣにおけるバックグラウンドの抗ｈｉｓタグ－フィコエリトリン（ＰＥ）シグナルを示し、残りの２つのピークは、ヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）およびＨｉｓタグ付きヘリコバクター・ピロリα１，３／４フコシルトランスフェラーゼ（（１，３／４）ＦＴ）に結合した細胞における抗ｈｉｓタグ－フィコエリトリン（ＰＥ）シグナルの増加を、左から右に示す。
方法１および２のそれぞれが多種多様な酵素を細胞表面に結合させうることが実証されたため、本発明者らは、これらの結合細胞のそれぞれが細胞間相互作用依存的標識反応における使用に適しているかどうかを判定することにした。図１０Ｅはこれらの実験の実験ワークフローを示す（上パネル）。簡潔に説明すると、適切なＣＤ４５．１マーカー（ＣＤ４５．１＋／＋）を含有するＣ５７ＢＬ／６マウスからの骨髄細胞を顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）と共に培養して、未熟ＤＣへと分化させた。前記の方法１または方法２のいずれかを使用して、未熟ＤＣを酵素に結合させた。ついでＤＣ－酵素結合体を同族ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）ペプチド（ＯＶＡ２５７－２６４）（配列番号６９）またはＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１でプライミングした後、ＯＴ－Ｉマウス（ＣＤ４５．１－／－）からのナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞と共に細胞数比１：１で２時間培養した。ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ）ペプチド（ＯＶＡ２５７－２６４）（配列番号６９）は、ＯＴ－ＩトランスジェニックマウスからのＭＨＣ Ｉ上に提示されるオボアルブミンのＳＩＩＮＦＥＫＬ Ｎ４（配列番号６９）に特異的なトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するナイーブＣＤ８＋ Ｔ細胞と選択的に相互作用する。次に、対応する基質－ビオチン誘導体（ＳＴ６Ｇａｌ１の場合は１００μＭ ＣＭＰ－シアル酸－ビオチン；ＦＴ、ＦＵＴ６および１，３／４ＦＴの場合は５０μＭ ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン；ＤＣ－ソルターゼの場合は５００μＭ ビオチン－ＬＰＥＴＧ（配列番号５））を加え、更に３０分間インキュベートした（ＤＣ－ソルターゼの場合は２時間）。反応をクエンチした後、細胞混合物を抗ＣＤ８－パシフィックブルー、抗ＣＤ４５．１－ＦＩＴＣおよびストレプトアビジン－ＡＰＣで染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。
これらのフローサイトメトリー実験の結果を図１０Ｅの下パネルに示す。全ての条件（方法１および２のいずれかにより生成されたＤＣ酵素を含む）において、ＯＶＡペプチドでプライミングされたＤＣ酵素結合体と共にインキュベートされたＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ 細胞は、ＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１ペプチドでプライミングされたＤＣ－酵素結合体と共にインキュベートされた類似したＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ 細胞と比較して上昇したストレプトアビジン－ＡＰＣシグナルを示した。更に、興味深いことに、方法１（ＤＣ－ＦＴ）による酵素的カップリングにより生成されたＦＴ結合ＤＣ（７７％ ストレプトアビジン－ＡＰＣ＋ 細胞；シグナル／バックグラウンド比５９２）は、方法２（ＤＣ－ＮＨＳ－ＦＴ）により生成されたＦＴ結合ＤＣ（１６％ ストレプトアビジン－ＡＰＣ＋ 細胞；シグナル／バックグラウンド比９．２）より遥かに優れた近接転移を示した。ここで、バックグラウンドは、ＬＣＭＶ ＧＰ３３－４１でプライミングされたＤＣ－酵素によるビオチン化ＯＴ－Ｉ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の比として定義される。
したがって、これらの結果は、（ｉ）接触細胞の相互作用依存的標識を触媒するために、多種多様な酵素が本方法において使用されうること、（ｉｉ）ＤＣ－酵素結合体により触媒される相互作用依存的標識は特異的であり、対応プライミング抗原に特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞に結合した場合にのみ生じること、（ｉｉｉ）化学的に結合したＤＣ－酵素－結合体は活性であり、したがって、化学的結合は、機能的酵素を細胞表面に結合させるためのもう１つの適切な手段であること、および（ｉｖ）少なくともＦＴに関しては、方法１を使用するＤＣ表面への酵素の糖結合は、方法２による化学的結合より優れたＤＣ－ＦＴ結合体を与えることを示している。
したがって、要約すると、本発明は、酵素を細胞の表面に結合させてそれらに新たな酵素機能を付与するための頑強で汎用的な方法を提供し、このようにして操作された細胞は、インビトロ、エクスビボおよびインビボで細胞間相互作用をモニターするのに適している。
実施例１０
細胞表面上で酵素を発現するように遺伝的に修飾された樹状細胞を使用するＴ細胞の相互作用依存的標識
ＤＣと相互作用するＴ細胞の近接ベース標識を促進させるために、ＤＣの細胞表面に化学的に結合した又は糖結合した酵素が使用されうることが示されたため、本発明者らは、ＤＣにおいて組換え発現された酵素（例えば、ＦＴ）もこの目的に適切でありうるかどうかを判定することにした。
この目的のために、ｉＤＣをＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＬＬのような血液悪性腫瘍の患者のＰＢＭＣから分化させ、レンチウイルストランスフェクションに付して、図１１に示されているレンチウイルス発現ベクター地図を使用して細胞表面上でＦＵＴ６を発現させる。ＦＵＴ６インサートを含有するＤＮＡ配列またはこのベクターは配列番号３として示されている。このベクターは配列番号２のＦＵＴ６インサートＤＮＡ配列を含有し、これは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＦＵＴ６ポリペプチドをコードしている。並行して、癌細胞を同じ患者（骨髄または血液）から単離し、ｉＤＣをプライミングするために細胞溶解する。プライミングされたｉＤＣまたはプライミングされていない（対照）ｉＤＣをＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡで染色し、同じ患者の自己ＰＢＭＣと共に種々の比率で１～２時間培養する。ついでＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン（５０μＭ）を加え、更に３０分間インキュベートする。ＬａｃＮＡｃで反応をクエンチした後、細胞混合物をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７－ストレプトアビジンおよび細胞同一性マーカーで染色し、フローサイトメトリー分析に付す。ＣＤ４＋（ＦＯＸＰ３－）および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７＋でもあるもの）を有望なＴＳＡ特異的Ｔ細胞として単離する。
実施例１１
自己免疫疾患における自己反応性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞ならびに抗原特異的制御性Ｔ細胞の検出
多発性筋炎は、筋圧痛、筋力低下、そして最終的に筋萎縮および線維症を引き起こす炎症性筋疾患である。その原因は不明であるが、筋肉組織におけるＴ細胞、マクロファージおよび樹状細胞の存在ならびに疾患特異的自己抗体の存在は、自己免疫反応がこの疾患の病因および／または進行において何らかの役割を果たしている可能性が高いことを示唆している。Ｖｅｎａｌｉｓ Ｐ，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ）．２０１４ Ｍａｒ；５３（３）：３９７－４０５。しかし、公知の自己抗体は全て、遍在的に発現する自己抗原に対するものであり、Ｔ細胞反応性の特異性は不明である（同誌）。
したがって、本実施例においては、本発明者らの相互作用依存的標識法を使用して、多発性筋炎における自己反応性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞ならびに抗原特異的制御性Ｔ細胞を特定することにする。特定の実施形態においては、該方法は任意の自己免疫疾患における使用に適している。
組織生検サンプル（１つは罹患組織由来、もう１つは隣接正常組織由来）を多発性筋炎患者から得、２つの部分に分ける。１つは組織ライセートの調製に使用し、１つは単細胞懸濁液の調製に使用する。未熟ＤＣを同じ患者からのＰＢＭＣから分化させ、ついでｉＤＣを罹患組織または対照正常組織からのライセートでプライミングする。
ついで、ヘリコバクター・ピロリα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴ）を、本明細書の実施例７に記載されている方法１のプロトコルを使用してＤＣの全群の細胞表面上に結合させ、修飾されたＤＣを、筋細胞、組織浸潤リンパ球および他の細胞型を含有する単細胞懸濁液と共にインキュベートした後、ＧＤＰ－Ｆｕｃ－Ｂｉｏを加えて、近接依存的標識を開始させる。遊離ＬａｃＮＡｃで反応をクエンチした後、細胞混合物を活性化マーカーおよび細胞同一性に関する抗体で染色し、ＦＡＣＳにより分析し、選別する。このアッセイから、ビオチン＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（有望な自己反応性Ｔ細胞）を単離する。また、ビオチン＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＦＯＸＰ３＋ Ｔ細胞（有望な抗原特異的制御性Ｔ細胞）を単離する。
富化されたＴＳＡ反応性Ｔ細胞をシグナル単一細胞ＴＣＲ配列決定に付して、抗原特異的ＴＣＲを特定する。また、ＲＮＡ－ｓｅｑを実施して、ビオチン＋ 集団とビオチン－ 集団とを比較する。
実施例１２
ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬはＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬとは異なり、活性化／機能不全遺伝子シグネチャを表す
ＴＳＡ反応性ＴＩＬおよび２つの異なる群のバイスタンダーＴＩＬの表現型的および機能的特徴の根底にある遺伝的プログラムを理解するために、ＭＣ３８皮下腫瘍から単離されたＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ Ｔ細胞、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ Ｔ細胞およびＰＤ－１－ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の転写プロファイルを特徴づけした。主成分分析（ＰＣＡ）は、ＴＩＬのこれら３つのサブセットの転写産物プロファイルが実質的な相違を共有することを示した（図１６Ａ）。ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬとＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＣＤ８＋ ＴＩＬとの間のボルケーノ・プロット・メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）比較により特定されるとおり、２９０個の転写産物が有意にアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションされた（図１６Ｂ）。対照的に、合計３７０４個の遺伝子がＰＤ－１－ ＴＩＬとＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬとの間で差次的に発現された（図１７）。
ついで、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬとＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＣＤ８＋ ＴＩＬとの、それほど顕著ではない転写差異を分析することに焦点を合わせた。遺伝子オントロジーデータベースにより注釈付けされた生物学的プロセスにおける２９０個の遺伝子の富化を調べるために、過剰提示分析を実施した。ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬと比較して、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬの、アップレギュレーションされた幾つかの遺伝子は、ＭＳＭＯ１およびＤＨＣＲ７のように、ステロイド生合成および関連代謝経路において有意に富化していた（図１６Ｃおよび図１８）。これは、Ｔ細胞のコレステロール代謝が、細胞増殖を支持するために、細胞活性化に際して完全に再プログラムされるという、以前に報告された知見に合致している（Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒら，２００８；ＴｕｏｓｔｏおよびＸｕ，２０１８）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞の細胞膜コレステロールレベルの増加は、Ｔ細胞受容体のクラスター化、シグナル伝達、および免疫シナプスのより効率的な形成を増強し、それはＣＤ８＋ Ｔ細胞のエフェクター機能に不可欠である（Ｙａｎｇら，２０１６）。対照的に、ダウンレギュレーションされた遺伝子は、リンパ球の分化、Ｔ細胞の遊走および活性化、ウイルス応答ならびにカルシウム恒常性を含む、より多様な生物学的プロセスネットワークにおいて富化している（図１６Ｃおよび図１８）。これらの知見は、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＣＤ８＋ ＴＩＬが、ウイルス反応性を有するバイスタンダーＴ細胞であり、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬと比較して変化した、コア細胞プロセスのスペクトルを有することを強く示唆している（Ｓｃｈｅｐｅｒら，２０１９；Ｓｉｍｏｎｉら，２０１８）。
ＴＩＬのこれら３つのサブセットの遺伝的差異を更に特徴づけるために、慢性ウイルス感染誘発性Ｔ細胞枯渇および腫瘍関連Ｔ細胞活性化／機能不全モデルにおいて確立された遺伝子シグネチャーおよび遺伝子モジュールを使用して、遺伝子セット富化分析（ＧＳＥＡ）を実施した。まず、以前に報告されたナイーブ／メモリー様Ｔ細胞遺伝子モジュールの富化に関して、これら３つのサブセットＴＩＬを比較し、このモジュールがＰＤ－１－ Ｔにおいて富化していることを見出した（図１９Ａおよび表１）（Ｓｉｎｇｅｒら，２０１６）。次に、慢性ＬＣＭＶ感染ＴＩＬから単離された枯渇Ｔ細胞から誘導された枯渇シグネチャの富化に関して、３つのサブセットＴＩＬを評価し（Ｗｈｅｒｒｙら，２００７）、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ サブセットとＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＣＤ８＋ サブセットとの両方において、ＰＤ－１－ＴＩＬと比較して類似した、このシグネチャの富化を見出した（図１８Ｂおよび表２）。ついで、ヒトまたはマウス腫瘍に浸潤するＴ細胞により共有される遺伝子モジュールの富化に関して、ＴＳＡ反応性ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬをバイスタンダーＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬおよびＰＤ－１－ ＴＩＬと比較した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫に関して確立されたＴ細胞活性化／機能不全遺伝子モジュール（Ｓｉｎｇｅｒら，２０１６）は、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬとＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬとの比較において、有意に富化していた。このモジュールにおける注目すべき遺伝子には、サイトカインＩＬ２アクセプターをコードする遺伝子（ＩＬ２ＲＡ）、Ｔ細胞活性化関連解糖酵素ＧＡＰＤＨをコードする遺伝子（ＧＡＰＤＨ）、ならびに乳酸およびピルビン酸のようなモノカルボン酸の細胞膜輸送体をコードする遺伝子（ＳＬＣ１６Ａ３）が含まれる（図１６Ｄ、図１９Ｃおよび表３）。この知見に合致して、ヒト黒色腫ＴＩＬに関して検証されたアップレギュレーションされた細胞周期遺伝子シグネチャーの富化が、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬとＰＤ－１－ バイスタンダーＴＩＬとの両方と比較してＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬにおいて見出された（図１９Ｄおよび表４）。この知見は、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬの観察されたクローン増殖と組合されて、この機能不全であるがＴＳＡ反応性であるＴ細胞サブセットにおける進行中の増殖に関する強力な証拠を提供した。この特徴は、腫瘍反応性を有すると考えられているヒトおよびマウス腫瘍に浸潤するＣＤ８＋ Ｔ細胞の亜集団に関しても以前に観察されている。初期および後期のマウス腫瘍に浸潤するタグエピトープＩ（Ｔａｇ－Ｉ；ＳＡＩＮＮＹＡＱＫＬ（配列番号７４））に特異的なモノクローナルＣＤ８＋ Ｔ細胞の転写産物プロファイルを、慢性ＬＣＭＶ感染から単離されたＤ３０枯渇Ｔ細胞のものと比較することにより、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇおよび共同研究者は、慢性ウイルス感染により惹起される機能不全Ｔ細胞により共有されていない機能不全な腫瘍特異的Ｔ細胞のユニーク遺伝子シグネチャーを発見した（Ｓｃｈｉｅｔｉｎｇｅｒら，２０１６）。本発明者らは、この腫瘍特異的Ｔ細胞遺伝子セットの富化に関して、本発明者らのポリクローナルＴＳＡ反応性ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬをバイスタンダーＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬおよびＰＤ－１－ ＴＩＬと比較し、それがＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ サブセットにおいて有意に富化していることを見出した（図１６Ｅ、図１９Ｅならびに表５Ａおよび５Ｂ）。
最後に、本発明者らは、ＭＣ３８結腸癌モデルから単離されたＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬおよびＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬサブセットにおける腫瘍反応性ＴＩＬ選択マーカーとして以前に報告された遺伝子の転写産物レベルを分析した。驚いたことに、両方のＴＩＬサブセットにおいて、ＰＤＣＤ１（ＰＤ－１）、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ－３）、ＬＡＧ３（ＬＡＧ－３）、ＥＮＴＰＤ－１（ＣＤ３９）、ＩＴＡＧＥ（ＣＤ１０３）、ＴＮＦＲＳＦ４（ＯＸ－４０）およびＴＮＦＲＳＦ９（ＣＤ１３７）を含むこれらの選択マーカーの全てに関して、類似した転写産物発現レベルが検出された（図１６Ｆ）。本発明者らは更に、細胞表面上のこれらの選択マーカーの幾つかの発現をフローサイトメトリーにより分析した（図１６Ｇおよび図２０）。ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ ＴＩＬサブセットはＰＤ－１＋ Ｂｉｏ－ ＴＩＬより高いレベルのＴＩＭ－３およびＣＤ１３７を発現することが判明したが、両方のサブセットにおいて、種々のレベルのＬＡＧ－３、ＣＤ３９およびＣＤ１０３の発現が見出された（Ｄｕｈｅｎら，２０１８；Ｇｒｏｓら，２０１４ａ；Ｙｏｓｓｅｆら，２０１８）。総合すると、ＦｕｃｏＩＤは、以前に報告されたこれらの機能マーカーに基づく選択アプローチより一般的に、ＴＳＡ反応性ＴＩＬを特定するために適用可能でありうる、と本発明者らは結論づける。個々の腫瘍内のＴＩＬは、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞だけでなく、癌に無関係な広範なエピトープ（例えば、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルスまたはインフルエンザウイルスからの抗原）を認識するＴ細胞を含む不均一な集団からなる（Ｓｃｈｅｐｅｒら，２０１９；Ｓｉｍｏｎｉら，２０１８）。これらのバイスタンダーＣＤ８＋ ＴＩＬは、腫瘍特異的Ｔ細胞の表現型と重複する多様な表現型を有するが、腫瘍反応性ではない（Ｄｕｈｅｎら，２０１８；Ｙｏｓｓｅｆら，２０１８）。バイスタンダーＣＤ８＋ ＴＩＬを排除するために幾つかの選択マーカー（例えば、ＰＤ－１、ＣＤ３９、ＣＤ１０３）が利用されているが、それらは経験的なものであり、偽陽性選択をもたらしうる。更に、そのような間接的選択法を使用すると、それほど豊富でない又は稀有な集団におけるＴＳＡ反応性ＴＩＬが見逃されうる。なぜなら、これらのＴＩＬは、最も豊富なＴＳＡ反応性ＴＩＬと同じ枯渇状態または表現型を共有しない可能性があるからである。対照的に、本発明において開発されたＦｕｃｏＩＤ戦略は、直接的なＴＣＲ－ｐＭＨＣ相互作用に基づいて、例えばビオチンのような選択マーカーを生成し、したがって、ＴＳＡ反応性ＴＩＬの特定のための偏りのないアプローチを提供する。ＦｕｃｏＩＤにより、ＴＳＡ反応性であるＴ細胞候補を、増殖のために、および対応ＴＣＲの迅速単離のために、直接的に富化して、機能評価のためにＴＣＲ操作Ｔ細胞を構築することが可能である。結果として、研究の時間およびコストが、前記の逆免疫学に基づくｐＭＨＣ四量体アプローチと比較して劇的に低減される（Ａｒｎａｕｄら，２０２０）。重要なことに、ＴＳＡ反応性ＴＣＲが確認されたら、最近開発された他の方法を使用して、対応抗原を特定することが可能である（Ｇｅｅら，２０１８；Ｋｕｌａら，２０１９；Ｌｉら，２０１９）。
この研究においてマウス腫瘍モデルからＦｕｃｏＩＤにより単離されたＴＳＡ反応性ＣＤ８＋ Ｔ細胞（すなわち、ＰＤ－１＋ Ｂｉｏ＋ Ｔ細胞）は機能不全表現型を示したが、有意な増殖能および腫瘍殺傷能を尚も有していた。これらのＴＳＡ反応性Ｔ細胞の亜集団（約５％）は前駆細胞枯渇Ｔ細胞の特徴（ＴＣＦ１＋ ＴＩＭ－３－）を有しており（図２０Ｂ）、これは以前の研究からの四量体選別腫瘍特異的Ｔ細胞に合致している（Ｍｉｌｌｅｒら，２０１９）。抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法後に増殖バーストおよびエフェクター機能をもたらすのはＣＤ８＋ Ｔ細胞のこのサブセットであることが実証されている（Ｈｅｌｄら，２０１９；Ｉｍら，２０１６；Ｍｉｌｌｅｒら，２０１９；Ｓｉｄｄｉｑｕｉら，２０１９）。したがって、将来の努力は、ＴＩＬに基づく養子細胞移入の治療可能性を高めるために、急速増殖中にこのサブセットを増殖させるためのアプローチに向けられるべきである。
本発明者らはここで、ＦＴ修飾マウスＤＣが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞だけでなくＣＤ４＋ Ｔ細胞の抗原特異的フコシル－ビオチン化を誘発しうること、および標識強度がＴＣＲへのｐＭＨＣの結合アフィニティと相関することを示した。したがって、ＦｕｃｏＩＤは、腫瘍においてだけでなく自己免疫疾患においても初代抗原特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞を研究するための新たな扉を開く。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、通常のアプローチを用いて研究するのが困難な標的である。これは、部分的には、ＭＨＣ－ＩＩ結合エピトープの多様性および長さ変動（１１～３０アミノ酸）、ならびにＭＨＣ－ＩＩとのそれらの弱い相互作用によるものである（Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ，２０１７；Ｒａｃｌｅら，２０１９）。同様に、高いアフィニティのＴＣＲを有するＴ細胞を、より弱いものを有するＴ細胞から分離して、腫瘍および関連感染モデルにおけるそれらの機能を研究するために、ＦｕｃｏＩＤが適用されうる。
細胞間相互作用をプローブするための最初のグリコシルトランスフェラーゼ媒介性タグ付けアプローチとして、ＦｕｃｏＩＤは遺伝的操作に基づくものではなく、その結果、それは、一次細胞相互作用をプローブするために容易に適用可能である。重要なことに、ＦＴをヒトＤＣ上に配置することは、ヒトＤＣの機能化に関して本明細書に示されているものと同じくらいに簡便かつ直接的である。したがって、ＦｕｃｏＩＤは、ヒト患者からのＴＳＡ反応性ＴＩＬを検出し単離するために臨床場面に導入される高い可能性を有する。ＦｕｃｏＩＤの普及により、ＴＳＡ反応性ＴＩＬおよびそのＴＣＲの発見のペースが大幅に加速し、そしてこれは個別化癌治療のコストおよび利用障壁を低減する道を開く、と本発明者らは期待している（Ａｒｎａｕｄら，２０２０；Ｙａｍａｍｏｔｏら，２０１９）。
実施例１３
「ベイト」ＦＴ機能化ＤＣを使用した膵臓腫瘍細胞における浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からのＣＤ８＋およびＣＤ４＋ 腫瘍反応性Ｔ細胞の検出
本明細書に記載されているＦｕｃｏ－ＩＤ近接標識法の汎用性を更に実証するために、本発明者らは、膵臓癌のマウスモデルから単離された膵臓腫瘍特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞を標識することが可能であるかどうか、ならびにそのようなＴＩＬが腫瘍細胞の特異的殺傷をもたらしうるかどうかを調べた。膵臓癌は最も致命的な癌の１つであり、５年生存率は僅か１０％である（ＮＣＩ統計；ワールド・ワイド・ウェブ・アドレスｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｔｙｐｅｓ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃにおいて入手可能）。そして膵管腺癌（ＰＤＡＣ）が最も一般的であり、また、最も攻撃的な形態の外分泌膵臓癌であり、症例の約９０％を引き起こす（Ａｄａｍｓｋａら，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１７ Ｊｕｌ；１８（７）：１３３８）。Ｐａｎ０２は膵臓のグレードＩＩＩ管状腺癌の十分に確立されたマウスモデルである。このモデルにおいては、３－ＭＣＡ（３－メチルコラントレン）を使用して、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて膵臓癌が化学的に誘発された（Ｃｏｒｂｅｔｔら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８４，４４：７１７－７２６）。本実施例は、Ｐａｎ０２膵臓腫瘍から腫瘍反応性ＴＩＬを富化するための本発明の可能性を示す。
この実験の実験ワークフローは、図９Ａに示されているものと同様であった。ただし、この場合には、その図に示されているＥ０７７１腫瘍細胞の代わりに、Ｐａｎ０２細胞を使用した。簡潔に説明すると、前記実施例５に記載されているのと同じ方法を用いて、［１×１０６］Ｐａｎ０２腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスに接種（ｓ．ｃ．）し、ついで、接種の約２１日後に腫瘍組織を単離した。前記実施例５に記載されているのと同じ方法を用いて、腫瘍ライセートおよび単細胞懸濁液を調製した。ＣＤ４５．１＋／＋ Ｃ５７ＢＬ／６マウスから調製されたｉＤＣを２つの群に分けて、それぞれ健常膵臓（健常Ｐａｎ）ライセートおよびＰａｎ０２腫瘍ライセートで一晩処理した。ついで、それらの２つの群のｉＤＣを図５ＢのとおりにＦＴで機能化して、ｉＤＣ－ＦＴを形成させた。
並行して、腫瘍組織を機械的に解離した後で不連続パーコール勾配（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で遠心分離することにより、Ｐａｎ０２腫瘍からＴＩＬを単離した。得られたＴＩＬをＰＢＳで洗浄し、それぞれ２つの群のｉＤＣ－ＦＴと共に、ＣＤ８＋ ＴＩＬの場合には２時間、そしてＣＤ４＋ ＴＩＬの場合には４時間にわたってインキュベートした（ＴＩＬ：ＤＣ＝１０：１）。ついでＧＤＰ－Ｆｕｃ－ビオチン（５０μＭ）を加え、更に３０分間インキュベートした。ＬａｃＮＡｃ（５ｍＭ）で反応をクエンチした後、細胞混合物をＡＰＣ－ストレプタビジンおよび細胞同一性マーカー（ＣＤ８ Ｔ細胞の場合にはＣＤ８／ＰＤ－１、そしてＣＤ４ Ｔ細胞の場合にはＣＤ３／ＣＤ４）で染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。図２１Ａおよび２１Ｂは、Ｐａｎ０２腫瘍ライセートでプライミングされたＦＴ機能化ｉＤＣがＣＤ８＋ ＴＩＬおよびＣＤ４＋ ＴＩＬのそれぞれ８．３９％および１２．２％を特異的に標識したことを示すＦＡＣＳ結果を示す（図２１Ａにおける右端のパネル、右上の四分の一、および図２１Ｂにおける右パネル、右ボックス）。対照的に、健常膵臓ライセートで処理されたＦＴ機能化ｉＤＣ（図２１Ａにおける右から２番目のパネルおよび図２１Ｂにおける左パネル）はＣＤ８＋ ＴＩＬおよびＣＤ４＋ ＴＩＬへの最小限のビオチン化を示した。
ＣＤ８＋ ビオチン標識ＴＩＬが実際に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞であるかどうかを判定するために、ビオチン＋（赤）およびビオチン－（青）ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＦＡＣＳにより選別し、Ｔ細胞培地内でＩＬ－２（ＩＬ２：１００ＩＵ／ｍＬ）と共に１２時間培養し、ついでＢ１６黒色腫細胞（ホタルルシフェラーゼで安定に形質導入されたもの）を選別ＣＤ８＋ Ｔ細胞と共に１：４の比で２０時間にわたって共培養した。ついで、前記実施例に記載されているとおりに、Ｂ１６腫瘍の殺傷をルシフェラーゼ活性（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ，Ｐｒｏｍｅｇａ）により定量した。簡潔に説明すると、ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＰａｎ０２腫瘍細胞と共に１０：１、２０：１および４０：１のエフェクター対標的比で２０時間にわたって共培養し、ついでＬＤＨアッセイを行って、細胞生存度を評価した。ビオチン－およびビオチン＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞の腫瘍殺傷能力の比較を図２１Ａの棒グラフに示す。ビオチン＋ 細胞はビオチン－ 細胞よりも有意に高い殺傷活性を示し（図２１Ａ）、明らかな用量依存効果が存在し、最高レベルの殺傷は、試験された最高のエフェクター対標的比（４０：１）において生じた。前記実施例において示されたデータと同様に、これらのデータは、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞がビオチン＋ 集団において富化していることを強く示唆している。データは３つの独立した実験から得られた。全ての図において、ｎｓ Ｐ＞０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；一元配置分散分析およびそれに続くテューキーの多重比較検定。
参考文献
（１）Ｒｏｏｚｅｎｄａａｌ，Ｒ．；Ｍｅｂｉｕｓ，Ｒ．Ｅ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１１，２９，２３－４３．
（２）Ｋｉｍ，Ｈ．；Ｃｒｕｚ，Ｍ．；Ｂｏｕｒｄｅａｕ，Ａ．；Ｄｕｍｏｎｔ，Ｄ．Ｊ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１３，８，ｅ５２１９７．
（３）Ｃｈａｏ，Ｄ．Ｌ．；Ｍａ，Ｌ．；Ｓｈｅｎ，Ｋ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００９，１０，２６２－７１．
（４）Ｃａｈａｌａｎ，Ｍ．Ｄ．；Ｐａｒｋｅｒ，Ｉ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００８，２６，５８５－６２６．
（５）Ｐａｓｑｕａｌ，Ｇ．；Ｃｈｕｄｎｏｖｓｋｉｙ，Ａ．；Ｔａｓ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．；Ａｇｕｄｅｌｏ，Ｍ．；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ｌ．Ｄ．；Ｃｕｉ，Ａ．；Ｈａｃｏｈｅｎ，Ｎ．；Ｖｉｃｔｏｒａ，Ｇ．Ｄ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１８，５５３，４９６．
（６）Ｌｉｕ，Ｄ．Ｓ．；Ｌｏｈ，Ｋ．Ｈ．；Ｌａｍ，Ｓ．Ｓ．；Ｗｈｉｔｅ，Ｋ．Ａ．；Ｔｉｎｇ，Ａ．Ｙ．ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１３，８，ｅ５２８２３．
（７）Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｆ．；Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１５，２７，４３９－４９．
（８）Ｃｏｒｎｅｔｔａ，Ｋ．；Ｐｏｌｌｏｋ，Ｋ．Ｅ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２００８，２００８，ｐｄｂ．ｐｒｏｔ４８８４．
（９）Ｄｕｐｒｅ，Ｌ．；Ｔｒｉｆａｒｉ，Ｓ．；Ｆｏｌｌｅｎｚｉ，Ａ．；Ｍａｒａｎｇｏｎｉ，Ｆ．；Ｌａｉｎ ｄｅ Ｌｅｒａ，Ｔ．；Ｂｅｒｎａｄ，Ａ．；Ｍａｒｔｉｎｏ，Ｓ．；Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｓ．；Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ，Ｃ．；Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．；Ａｉｕｔｉ，Ａ．；Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ，Ｍ．－Ｇ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００４，１０，９０３－９１５．
（１０）Ｓｈｅａｒｅｒ，Ｒ．Ｆ．；Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｄ．Ｎ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２０１５，２０，１－１０．
（１１）Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｍ．Ｔ．；Ｉｒｖｉｎｅ，Ｄ．Ｊ．Ｎａｎｏ Ｔｏｄａｙ ２０１１，６，３０９－３２５．
（１２）Ｓｗａｒｔｚ，Ｍ．Ａ．；Ｈｉｒｏｓｕｅ，Ｓ．；Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｊ．Ａ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１２，４，１４８ｒｖ９－１４８ｒｖ９．
（１３）Ｐａｒｍａｒ，Ｓ．；Ｌｉｕ，Ｘ．；Ｎａｊｊａｒ，Ａ．；Ｓｈａｈ，Ｎ．；Ｙａｎｇ，Ｈ．；Ｙｖｏｎ，Ｅ．；Ｒｅｚｖａｎｉ，Ｋ．；ＭｃＮｉｅｃｅ，Ｉ．；Ｚｗｅｉｄｌｅｒ－ＭｃＫａｙ，Ｐ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．；Ｗｏｌｐｅ，Ｓ．；Ｂｌａｚａｒ，Ｂ．Ｒ．；Ｓｈｐａｌｌ，Ｅ．Ｊ．Ｂｌｏｏｄ ２０１５，１２５，１５０２－１５０６．
（１４）Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ，Ｒ．；Ｍｅｒｚａｂａｎ，Ｊ．Ｓ．；Ｃａｉｎ，Ｄ．Ｗ．；Ｄａｇｉａ，Ｎ．Ｍ．；Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｊ．Ａ．；Ｌｉｎ，Ｃ．Ｐ．；Ｗｏｈｌｇｅｍｕｔｈ，Ｒ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００８，１４，１８１．
（１５）Ｌｉ，Ｊ．；Ｃｈｅｎ，Ｍ．；Ｌｉｕ，Ｚ．；Ｚｈａｎｇ，Ｌ．；Ｆｅｌｄｉｎｇ，Ｂ．Ｈ．；Ｍｏｒｅｍｅｎ，Ｋ．Ｗ．；Ｌａｕｖａｕ，Ｇ．；Ａｂａｄｉｅｒ，Ｍ．；Ｌｅｙ，Ｋ．；Ｗｕ，Ｐ．ＡＣＳ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１８，４，１６３３－１６４１．
（１６）Ｐｏｐｐ，Ｍ．Ｗ．；Ａｎｔｏｓ，Ｊ．Ｍ．；Ｇｒｏｔｅｎｂｒｅｇ，Ｇ．Ｍ．；Ｓｐｏｏｎｅｒ，Ｅ．；Ｐｌｏｅｇｈ，Ｈ．Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００７，３，７０７．
（１７）Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．；Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，３４８，５６－６１．
（１８）Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．；Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，３４８，６２－６８．
（１９）Ｇｕｅｄａｎ，Ｓ．；Ｒｕｅｌｌａ，Ｍ．；Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１８．
（２０）Ｒｉａｚ，Ｎ．；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｌ．；Ｈａｖｅｌ，Ｊ．Ｊ．；Ｍａｋａｒｏｖ，Ｖ．；Ｄｅｓｒｉｃｈａｒｄ，Ａ．；Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１６，２８，４１１－９．
（２１）Ｌｅ，Ｄ．Ｔ．；Ｕｒａｍ，Ｊ．Ｎ．；Ｗａｎｇ，Ｈ．；Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｂ．Ｒ．；Ｋｅｍｂｅｒｌｉｎｇ，Ｈ．；Ｅｙｒｉｎｇ，Ａ．Ｄ．；Ｓｋｏｒａ，Ａ．Ｄ．；Ｌｕｂｅｒ，Ｂ．Ｓ．；Ａｚａｄ，Ｎ．Ｓ．；Ｌａｈｅｒｕ，Ｄ．；Ｂｉｅｄｒｚｙｃｋｉ，Ｂ．；Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｚａｈｅｅｒ，Ａ．；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｇ．Ａ．；Ｃｒｏｃｅｎｚｉ，Ｔ．Ｓ．；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｊ．；Ｄｕｆｆｙ，Ｓ．Ｍ．；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｒ．Ｍ．；ｄｅ ｌａ Ｃｈａｐｅｌｌｅ，Ａ．；Ｋｏｓｈｉｊｉ，Ｍ．；Ｂｈａｉｊｅｅ，Ｆ．；Ｈｕｅｂｎｅｒ，Ｔ．；Ｈｒｕｂａｎ，Ｒ．Ｈ．；Ｗｏｏｄ，Ｌ．Ｄ．；Ｃｕｋａ，Ｎ．；Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．；Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｎ．；Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．；Ｚｈｏｕ，Ｓ．；Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｔ．Ｃ．；Ｔａｕｂｅ，Ｊ．Ｍ．；Ａｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ａ．；Ｅｓｈｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．；Ｄｉａｚ，Ｌ．Ａ．，Ｊｒ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１５，３７２，２５０９－２０．
（２２）Ｒｉｚｖｉ，Ｎ．Ａ．；Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ｍ．Ｄ．；Ｓｎｙｄｅｒ，Ａ．；Ｋｖｉｓｔｂｏｒｇ，Ｐ．；Ｍａｋａｒｏｖ，Ｖ．；Ｈａｖｅｌ，Ｊ．Ｊ．；Ｌｅｅ，Ｗ．；Ｙｕａｎ，Ｊ．；Ｗｏｎｇ，Ｐ．；Ｈｏ，Ｔ．Ｓ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．；Ｒｅｋｈｔｍａｎ，Ｎ．；Ｍｏｒｅｉｒａ，Ａ．Ｌ．；Ｉｂｒａｈｉｍ，Ｆ．；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ，Ｃ．；Ｇａｓｍｉ，Ｂ．；Ｚａｐｐａｓｏｄｉ，Ｒ．；Ｍａｅｄａ，Ｙ．；Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．；Ｇａｒｏｎ，Ｅ．Ｂ．；Ｍｅｒｇｈｏｕｂ，Ｔ．；Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｔ．Ｎ．；Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，３４８，１２４－８．
（２３）Ｓｎｙｄｅｒ，Ａ．；Ｍａｋａｒｏｖ，Ｖ．；Ｍｅｒｇｈｏｕｂ，Ｔ．；Ｙｕａｎ，Ｊ．；Ｚａｒｅｔｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．；Ｄｅｓｒｉｃｈａｒｄ，Ａ．；Ｗａｌｓｈ，Ｌ．Ａ．；Ｐｏｓｔｏｗ，Ｍ．Ａ．；Ｗｏｎｇ，Ｐ．；Ｈｏ，Ｔ．Ｓ．；Ｈｏｌｌｍａｎｎ，Ｔ．Ｊ．；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ，Ｃ．；Ｋａｎｎａｎ，Ｋ．；Ｌｉ，Ｙ．；Ｅｌｉｐｅｎａｈｌｉ，Ｃ．；Ｌｉｕ，Ｃ．；Ｈａｒｂｉｓｏｎ，Ｃ．Ｔ．；Ｗａｎｇ，Ｌ．；Ｒｉｂａｓ，Ａ．；Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．；Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１４，３７１，２１８９－２１９９．
（２４）ＭｃＧｒａｎａｈａｎ，Ｎ．；Ｆｕｒｎｅｓｓ，Ａ．Ｊ．；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｒ．；Ｒａｍｓｋｏｖ，Ｓ．；Ｌｙｎｇａａ，Ｒ．；Ｓａｉｎｉ，Ｓ．Ｋ．；Ｊａｍａｌ－Ｈａｎｊａｎｉ，Ｍ．；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．；Ｂｉｒｋｂａｋ，Ｎ．Ｊ．；Ｈｉｌｅｙ，Ｃ．Ｔ．；Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｔ．Ｂ．；Ｓｈａｆｉ，Ｓ．；Ｍｕｒｕｇａｅｓｕ，Ｎ．；Ｍｉｔｔｅｒ，Ｒ．；Ａｋａｒｃａ，Ａ．Ｕ．；Ｌｉｎａｒｅｓ，Ｊ．；Ｍａｒａｆｉｏｔｉ，Ｔ．；Ｈｅｎｒｙ，Ｊ．Ｙ．；Ｖａｎ Ａｌｌｅｎ，Ｅ．Ｍ．；Ｍｉａｏ，Ｄ．；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，Ｂ．；Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ，Ｄ．；Ｇａｒｒａｗａｙ，Ｌ．Ａ．；Ｍａｋａｒｏｖ，Ｖ．；Ｒｉｚｖｉ，Ｎ．Ａ．；Ｓｎｙｄｅｒ，Ａ．；Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ｍ．Ｄ．；Ｍｅｒｇｈｏｕｂ，Ｔ．；Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．；Ｓｈｕｋｌａ，Ｓ．Ａ．；Ｗｕ，Ｃ．Ｊ．；Ｐｅｇｇｓ，Ｋ．Ｓ．；Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．；Ｈａｄｒｕｐ，Ｓ．Ｒ．；Ｑｕｅｚａｄａ，Ｓ．Ａ．；Ｓｗａｎｔｏｎ，Ｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６，３５１，１４６３－９．
（２５）Ｙａｒｃｈｏａｎ，Ｍ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ａ．，３ｒｄ；Ｌｕｔｚ，Ｅ．Ｒ．；Ｌａｈｅｒｕ，Ｄ．Ａ．；Ｊａｆｆｅｅ，Ｅ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ ２０１７，１７，２０９－２２２．
（２６）Ｔｒａｎ，Ｅ．；Ａｈｍａｄｚａｄｅｈ，Ｍ．；Ｌｕ，Ｙ．Ｃ．；Ｇｒｏｓ，Ａ．；Ｔｕｒｃｏｔｔｅ，Ｓ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｆ．；Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｊ．Ｊ．；Ｚｈｅｎｇ，Ｚ．；Ｌｉ，Ｙ．Ｆ．；Ｒａｙ，Ｓ．；Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｊ．Ｒ．；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｒ．Ｐ．；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，３５０，１３８７－９０．
（２７）Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｃ．Ａ．；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．；Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１６，２２，２６－３６．
（２８）Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｔ．Ｎ．；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１５，３４８，６９－７４．
（２９）Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ，Ｃ．；ｖａｎ Ｂｕｕｒｅｎ，Ｍ．Ｍ．；Ｂｉｅｓ，Ｌ．；Ｖｅｒｄｅｇａａｌ，Ｅ．Ｍ．Ｅ．；Ｓｃｈｏｔｔｅ，Ｒ．；Ｃａｌｉｓ，Ｊ．Ｊ．Ａ．；Ｂｅｈｊａｔｉ，Ｓ．；Ｖｅｌｄｓ，Ａ．；Ｈｉｌｋｍａｎｎ，Ｈ．；Ａｔｍｉｏｕｉ，Ｄ．ｅ．；Ｖｉｓｓｅｒ，Ｍ．；Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｍ．Ｒ．；Ｈａａｎｅｎ，Ｊ．Ｂ．Ａ．Ｇ．；Ｓｐｉｔｓ，Ｈ．；ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ，Ｓ．Ｈ．；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｔ．Ｎ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１４，２１，８１．
（３０）Ｓｉｍｏｎｉ，Ｙ．；Ｂｅｃｈｔ，Ｅ．；Ｆｅｈｌｉｎｇｓ，Ｍ．；Ｌｏｈ，Ｃ．Ｙ．；Ｋｏｏ，Ｓ．－Ｌ．；Ｔｅｎｇ，Ｋ．Ｗ．Ｗ．；Ｙｅｏｎｇ，Ｊ．Ｐ．Ｓ．；Ｎａｈａｒ，Ｒ．；Ｚｈａｎｇ，Ｔ．；Ｋａｒｅｄ，Ｈ．；Ｄｕａｎ，Ｋ．；Ａｎｇ，Ｎ．；Ｐｏｉｄｉｎｇｅｒ，Ｍ．；Ｌｅｅ，Ｙ．Ｙ．；Ｌａｒｂｉ，Ａ．；Ｋｈｎｇ，Ａ．Ｊ．；Ｔａｎ，Ｅ．；Ｆｕ，Ｃ．；Ｍａｔｈｅｗ，Ｒ．；Ｔｅｏ，Ｍ．；Ｌｉｍ，Ｗ．Ｔ．；Ｔｏｈ，Ｃ．Ｋ．；Ｏｎｇ，Ｂ．－Ｈ．；Ｋｏｈ，Ｔ．；Ｈｉｌｌｍｅｒ，Ａ．Ｍ．；Ｔａｋａｎｏ，Ａ．；Ｌｉｍ，Ｔ．Ｋ．Ｈ．；Ｔａｎ，Ｅ．Ｈ．；Ｚｈａｉ，Ｗ．；Ｔａｎ，Ｄ．Ｓ．Ｗ．；Ｔａｎ，Ｉ．Ｂ．；Ｎｅｗｅｌｌ，Ｅ．Ｗ．，Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ａｂｕｎｄａｎｔ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１８，５５７（７７０６），５７５－５７９．
（３１）Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ，Ｓ．；Ｐａｓｅｔｔｏ，Ａ．；Ｈｅｌｍａｎ，Ｓ．Ｒ．；Ｇａｒｔｎｅｒ，Ｊ．Ｊ．；Ｐｒｉｃｋｅｔｔ，Ｔ．Ｄ．；Ｈｏｗｉｅ，Ｂ．；Ｒｏｂｉｎｓ，Ｈ．Ｓ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｆ．；Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ，Ｃ．Ａ．；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．；Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，Ｃ．Ｓ．，Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｖｉｒａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１７，３５６（６３３４），２００．
（３２）Ｇｒｏｓ，Ａ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｆ．；Ｙａｏ，Ｘ．；Ｌｉ，Ｙ．Ｆ．；Ｔｕｒｃｏｔｔｅ，Ｓ．；Ｔｒａｎ，Ｅ．；Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｊ．Ｒ．；Ｍｉｘｏｎ，Ａ．；Ｆａｒｉｄ，Ｓ．；Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．；Ｈａｎａｄａ，Ｋ．；Ａｌｍｅｉｄａ，Ｊ．Ｒ．；Ｄａｒｋｏ，Ｓ．；Ｄｏｕｅｋ，Ｄ．Ｃ．；Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｃ．；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ＰＤ－１ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｐａｔｉｅｎｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８（＋）ｔｕｍｏｒ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２０１４，１２４（５），２２４６－５９．
（３３）Ｙａｒｃｈｏａｎ，Ｍ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｂ．Ａ．，ＩＩＩ；Ｌｕｔｚ，Ｅ．Ｒ．；Ｌａｈｅｒｕ，Ｄ．Ａ．；Ｊａｆｆｅｅ，Ｅ．Ｍ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ ａｕｇｍｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ２０１７，１７（９），５６９．
（３４）Ｓｔｒｏｎｅｎ，Ｅ．；Ｔｏｅｂｅｓ，Ｍ．；Ｋｅｌｄｅｒｍａｎ，Ｓ．；ｖａｎ Ｂｕｕｒｅｎ，Ｍ．Ｍ．；Ｙａｎｇ，Ｗ．；ｖａｎ Ｒｏｏｉｊ，Ｎ．；Ｄｏｎｉａ，Ｍ．；Ｂｏｅｓｃｈｅｎ，Ｍ．－Ｌ．；Ｌｕｎｄ－Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｆ．；Ｏｌｗｅｕｓ，Ｊ．；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，Ｔ．Ｎ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１６，３５２（６２９１），１３３７－１３４１．
（３５）Ｏｔｔ，Ｐ．Ａ．；Ｈｕ，Ｚ．；Ｋｅｓｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．；Ｓｈｕｋｌａ，Ｓ．Ａ．；Ｓｕｎ，Ｊ．；Ｂｏｚｙｍ，Ｄ．Ｊ．；Ｚｈａｎｇ，Ｗ．；Ｌｕｏｍａ，Ａ．；Ｇｉｏｂｂｉｅ－Ｈｕｒｄｅｒ，Ａ．；Ｐｅｔｅｒ，Ｌ．；Ｃｈｅｎ，Ｃ．；Ｏｌｉｖｅ，Ｏ．；Ｃａｒｔｅｒ，Ｔ．Ａ．；Ｌｉ，Ｓ．；Ｌｉｅｂ，Ｄ．Ｊ．；Ｅｉｓｅｎｈａｕｒｅ，Ｔ．；Ｇｊｉｎｉ，Ｅ．；Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．；Ｌａｎｅ，Ｗ．Ｊ．；Ｊａｖｅｒｉ，Ｉ．；Ｎｅｌｌａｉａｐｐａｎ，Ｋ．；Ｓａｌａｚａｒ，Ａ．Ｍ．；Ｄａｌｅｙ，Ｈ．；Ｓｅａｍａｎ，Ｍ．；Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ，Ｅ．Ｉ．；Ｙｏｏｎ，Ｃ．Ｈ．；Ｈａｒｄｅｎ，Ｍ．；Ｌｅｎｎｏｎ，Ｎ．；Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｓ．；Ｒｏｄｉｇ，Ｓ．Ｊ．；Ｂａｒｏｕｃｈ，Ｄ．Ｈ．；Ａｓｔｅｒ，Ｊ．Ｃ．；Ｇｅｔｚ，Ｇ．；Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ，Ｋ．；Ｎｅｕｂｅｒｇ，Ｄ．；Ｒｉｔｚ，Ｊ．；Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．；Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．；Ｈａｃｏｈｅｎ，Ｎ．；Ｗｕ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｅｒｓｏｎａｌ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｖａｃｃｉｎｅ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１７，５４７（７６６２），２１７－２２１．
（３６）Ｌｉ，Ｇ．；Ｂｅｔｈｕｎｅ，Ｍ．Ｔ．；Ｗｏｎｇ，Ｓ．；Ｊｏｇｌｅｋａｒ，Ａ．Ｖ．；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｍ．Ｔ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｋ．；Ｋｉｍ，Ｊ．Ｔ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｄ．；Ｐｅｎｇ，Ｓ．；Ｚａｒｅｔｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．；Ｓｕ，Ｙ．；Ｌｕｏ，Ｙ．；Ｈｅａｔｈ，Ｊ．Ｒ．；Ｒｉｂａｓ，Ａ．；Ｗｉｔｔｅ，Ｏ．Ｎ．；Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｖｉａ ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１９，１６，１８３－１９０．
（３７）Ｇａｒｙ，Ｒ．；Ｖｏｅｌｋｌ，Ｓ．；Ｐａｌｍｉｓａｎｏ，Ｒ．；Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｅ．；Ｂｏｓｃｈ，Ｊ．Ｊ．；Ｍａｃｋｅｎｓｅｎ，Ａ．Ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ＡＰＣｓ ｏｎｔｏ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１２，１８８，７４４－７５２．
前記の種々の実施形態は、更なる実施形態を得るために組合されうる。本明細書中で言及されているおよび／または出願データシートに挙げられている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物の全ての全体を参照により本明細書に組み入れることとする。実施形態の態様は、必要に応じて、更に他の実施形態が得られるように、そのような種々の特許、出願および刊行物の概念を用いるために修飾されうる。
これらの及び他の変更は、前記の詳細な説明を考慮して、実施形態に対して施されうる。一般に、以下の特許請求の範囲において、用いられる用語は、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲に含まれる均等物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されるものではない。

Claims (170)

  1. 腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または循環Ｔ細胞から腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を特定するための方法であって、該方法は、
    ａ．標識に結合したドナー糖ヌクレオチドの存在下、Ｔ細胞の集団を修飾樹状細胞と接触させ、
    ｉ．ここで、修飾樹状細胞は、その細胞表面上に、ドナー糖ヌクレオチドを使用してＴ細胞上の細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒しうる活性グリコシルトランスフェラーゼを含むように操作されており、
    ｉｉ．ここで、修飾樹状細胞は１以上の腫瘍抗原でプライミングされており、
    ｂ．接触後、Ｔ細胞の集団の細胞表面を分析して、標識が存在するかどうかを決定することを含み、
    ここで、Ｔ細胞の細胞表面上の標識の存在は、Ｔ細胞が、前記の１以上の腫瘍抗原のうちの少なくとも１つに対する特異性を有するＴＳＡ反応性Ｔ細胞であることを示す、前記方法。
  2. 分析が、標識を含む細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって富化することを含む、請求項１記載の方法。
  3. 分析が、標識を含む細胞が、ＴＳＡ反応性を示す他のマーカーを更に含むかどうかを決定することを更に含む、請求項１または２記載の方法。
  4. ＴＳＡ反応性を示す他のマーカーを含む細胞をＦＡＣＳによって富化することを更に含む、請求項３記載の方法。
  5. 前記の他のマーカーが、ＰＤ－１発現、ＣＤ１３４発現、ＣＤ１３７発現、ＣＸＣＲ５発現およびＴＩＭ３発現の１以上を含む、請求項３または４記載の方法。
  6. 該方法が、標識とＰＤ－１発現との両方を含む細胞を富化することを含む、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 該方法が、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋発現を含む細胞を富化することを更に含む、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。
  8. ａ．標識を含み、ＣＤ８＋発現とＰＤ－１＋発現との両方を示す任意の細胞が、ＴＳＡ反応性細胞傷害性Ｔ細胞である、および
    ｂ．標識を含み、ＣＤ４＋発現とＰＤ－１＋発現との両方を示す任意の細胞が、ＴＳＡ反応性ヘルパーＴ細胞である、
    請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. Ｔ細胞上に存在する標識の規模が、Ｔ細胞の表面上で発現されるＴ細胞受容体の、ＴＳＡに対する結合アフィニティを示す、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. Ｔ細胞上に存在する標識の規模が、ＴＳＡを発現する他の細胞を殺傷する富化Ｔ細胞の能力および／またはＴＳＡの存在下で活性化される富化Ｔ細胞の能力を示す、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 細胞により発現されるＴＳＡ特異的ＴＣＲを特定するために、単一細胞Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列決定により、細胞表面上に標識を有する細胞を配列決定することを更に含む、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。
  12. 患者特異的免疫細胞療法のために富化細胞を増殖させることを更に含む、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 修飾樹状細胞が、腫瘍抗原を含有する腫瘍ライセートでプライミングされている、請求項１～１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 腫瘍ライセートが、新生抗原を産生する腫瘍に由来する、請求項１３記載の方法。
  15. ＴＳＡが、黒色腫腫瘍；乳癌腫瘍；ならびに毛様細胞性星状細胞腫、ＡＭＬ、ＡＬＬ、甲状腺、腎臓嫌色素、ＣＬＬ、髄芽腫、神経芽細胞腫、低悪性度神経膠腫、膠芽腫、前立腺、卵巣、骨髄腫、膵臓、腎乳頭、Ｂ細胞リンパ腫、腎明細胞、頭頸部、肝臓、子宮頸、子宮、膀胱、結腸直腸、肺小細胞、食道、胃、肺腺および肺扁平上皮の腫瘍からなる群から選択される腫瘍から選択される腫瘍に由来する、請求項１～１４のいずれか１項記載の方法。
  16. グリコシルトランスフェラーゼがフコシルトランスフェラーゼである、請求項１～１５のいずれか１項記載の方法。
  17. グリコシルトランスフェラーゼがヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）α１，３フコシルトランスフェラーゼである、請求項１～１６のいずれか１項記載の方法。
  18. ドナー糖ヌクレオチドがＧＤＰ－フコースである、請求項１～１７のいずれか１項記載の方法。
  19. グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼである、請求項１～１５のいずれか１項記載の方法。
  20. ドナー糖ヌクレオチドがＣＭＰ－シアル酸である、請求項１９記載の方法。
  21. 標識が小分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、化学的または生物学的なマーカーおよび／またはプローブから選択される、請求項１～２０のいずれか１項記載の方法。
  22. 化学的または生物学的部分がビオチン、ビオチンプローブ、蛍光分子、蛍光分子を含むプローブ、色素、色素を含むプローブ、色素標識一本鎖ＤＮＡ、ＦＬＡＧタグまたはＳｔｒｅｐタグである、請求項２１記載の方法。
  23. 色素がＦＡＭまたはシアニン色素である、請求項２２記載の方法。
  24. 蛍光分子がＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５またはＣｙ７である、請求項２２記載の方法。
  25. 色素がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素またはＪａｎｅｌｉａ Ｆｌｕｏｒ色素である、請求項２２記載の方法。
  26. 細胞表面グリカンがＧａｌ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリルＬａｃＮＡｃから選択される、請求項１～２５のいずれか１項記載の方法。
  27. グリコシルトランスフェラーゼが第２ベイト細胞に固有ではない、請求項１～２６のいずれか１項記載の方法。
  28. グリコシルトランスフェラーゼが第２細胞の細胞表面に結合している、請求項１～２７のいずれか１項記載の方法。
  29. グリコシルトランスフェラーゼが第２細胞の細胞表面に共有結合している、請求項１～２８のいずれか１項記載の方法。
  30. グリコシルトランスフェラーゼが、第２細胞の表面上に存在する第２細胞表面グリカンに共有結合している、請求項１～２９のいずれか１項記載の方法。
  31. グリコシルトランスフェラーゼおよび第２細胞表面グリカンがグリコシル化反応により共有結合している、請求項３０記載の方法。
  32. グリコシルトランスフェラーゼがリンカー部分を介して第２ドナー糖ヌクレオチドに結合している、請求項１～３１のいずれか１項記載の方法。
  33. グリコシルトランスフェラーゼが第２ベイト細胞の細胞表面上で組換え的に発現される、請求項１～２７のいずれか１項記載の方法。
  34. グリコシルトランスフェラーゼの発現が条件的活性化プロモーターにより駆動される、請求項３３記載の方法。
  35. 条件的活性化プロモーターが外因性化合物の存在下で活性化される、請求項３４記載の方法。
  36. 外因性化合物が小分子またはポリペプチドである、請求項３５記載の方法。
  37. 該方法が完了に２週間未満を要する、請求項１～３６のいずれか１項記載の方法。
  38. 該方法が、ＴＳＡ反応性Ｔ細胞を富化する前にＴＳＡ候補を特定することを含まない、請求項１～３７のいずれか１項記載の方法。
  39. 該方法が、富化Ｔ細胞からバイスタンダーＴ細胞を排除することを含む、請求項１～３８のいずれか１項記載の方法。
  40. 第１プレイ細胞を標識でタグ付けするための方法であって、該方法は、
    標識に結合しているドナー糖ヌクレオチドの存在下、第１プレイ細胞を第２ベイト細胞と接触させることを含み、
    ｉ．ここで、第１プレイ細胞は第１細胞表面グリカンを含み、第２ベイト細胞は、その細胞表面上に、ドナー糖ヌクレオチドを使用して第１細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒しうる活性グリコシルトランスフェラーゼを含み、
    ｉｉ．ここで、第２ベイト細胞は、第１プレイ細胞と接触すると、ドナー糖ヌクレオチドを使用して第１細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒し、それにより、標識を第１プレイ細胞に結合させる、前記方法。
  41. 細胞間相互作用を検出するための方法であって、該方法は、
    ａ．標識に結合しているドナー糖ヌクレオチドの存在下、第１プレイ細胞を第２ベイト細胞と接触させ、
    ｉｉｉ．ここで、第１プレイ細胞は第１細胞表面グリカンを含み、第２ベイト細胞は、その細胞表面上に、ドナー糖ヌクレオチドを使用して第１細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒しうる活性グリコシルトランスフェラーゼを含み、
    ｂ．接触後、第１プレイ細胞を分析して、標識が第１プレイ細胞の細胞表面上に存在するかどうかを決定することを含み、
    ここで、第１プレイ細胞の細胞表面上の標識の存在は、第１プレイ細胞および第２ベイトが細胞間相互作用を受けたことを示す、前記方法。
  42. グリコシルトランスフェラーゼがフコシルトランスフェラーゼである、請求項４０または４１記載の方法。
  43. グリコシルトランスフェラーゼがヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）α１，３フコシルトランスフェラーゼである、請求項４０～４２のいずれか１項記載の方法。
  44. ドナー糖ヌクレオチドがＧＤＰ－フコースである、請求項４０～４３のいずれか１項記載の方法。
  45. グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼである、請求項４０または４１記載の方法。
  46. ドナー糖がＣＭＰ－シアル酸である、請求項４５記載の方法。
  47. 標識が小分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体から選択される、請求項４０～４６のいずれか１項記載の方法。
  48. 標識が化学的または生物学的なマーカーおよび／またはプローブである、請求項４０～４７のいずれか１項記載の方法。
  49. 化学的または生物学的部分がビオチンプローブ、蛍光分子、蛍光分子を含むプローブ、色素、色素を含むプローブ、色素標識一本鎖ＤＮＡ、ＦＬＡＧタグまたはＳｔｒｅｐタグである、請求項４８記載の方法。
  50. 色素がＦＡＭまたはシアニン色素である、請求項４９記載の方法。
  51. 標識がＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５またはＣｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素またはＪａｎｅｌｉａ Ｆｌｕｏｒ色素である、請求項４９記載の方法。
  52. 細胞表面グリカンがＧａｌ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリルＬａｃＮＡｃから選択される、請求項４０～５１のいずれか１項記載の方法。
  53. グリコシルトランスフェラーゼが第２ベイト細胞に固有ではない、請求項４０～５２のいずれか１項記載の方法。
  54. グリコシルトランスフェラーゼが第２細胞の細胞表面に結合している、請求項４０～５３のいずれか１項記載の方法。
  55. グリコシルトランスフェラーゼが第２細胞の細胞表面に共有結合している、請求項４０～５４のいずれか１項記載の方法。
  56. グリコシルトランスフェラーゼが、第２細胞の表面上に存在する第２細胞表面グリカンに共有結合している、請求項４０～５５のいずれか１項記載の方法。
  57. グリコシルトランスフェラーゼおよび第２細胞表面グリカンがグリコシル化反応により共有結合している、請求項５６記載の方法。
  58. グリコシルトランスフェラーゼがリンカー部分を介して第２ドナー糖ヌクレオチドに結合している、請求項４０～５７のいずれか１項記載の方法。
  59. グリコシルトランスフェラーゼが第２ベイト細胞の細胞表面上で組換え的に発現される、請求項４０～５３のいずれか１項記載の方法。
  60. グリコシルトランスフェラーゼの発現が条件的活性化プロモーターにより駆動される、請求項５９記載の方法。
  61. 条件的活性化プロモーターが外因性化合物の存在下で活性化される、請求項６０記載の方法。
  62. 外因性化合物が小分子である、請求項６１記載の方法。
  63. 第１プレイ細胞がＴ細胞である、請求項４０～６２のいずれか１項記載の方法。
  64. 第１プレイ細胞がＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項４０～６３のいずれか１項記載の方法。
  65. 第１ベイト細胞が未熟樹状細胞である、請求項４０～６４のいずれか１項記載の方法。
  66. 第１ベイト細胞がＢ細胞である、請求項４０～６４のいずれか１項記載の方法。
  67. 請求項１１記載の方法により特定されるＴＳＡ特異的ＴＣＲまたは該ＴＣＲの抗原結合性部分を含むＴＣＲ操作Ｔ細胞。
  68. 癌の治療を要する患者に請求項６７記載のＴＣＲ操作Ｔ細胞を投与することを含む、癌の治療方法。
  69. 請求項１～１０のいずれか１項記載の方法によりＴＳＡ反応性Ｔ細胞を特定し、単一細胞Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）配列決定によりＴＳＡ特異的Ｔ細胞を配列決定して、該細胞により発現されるＴＳＡ特異的ＴＣＲを特定することを含む、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を特定するための方法。
  70. 請求項１～３９のいずれか１項記載の方法により特定または富化されたＴＳＡ反応性Ｔ細胞を、癌の治療を要する患者に投与することを含む、癌の治療方法。
  71. ＧＤＰ－Ｆｕｃ－ＦＴと１以上の未熟樹状細胞（ｉＤＣ）とを含む組成物。
  72. ＣＭＰ－ＮｅｕＡｃ－シアリルトランスフェラーゼと１以上の未熟樹状細胞（ｉＤＣ）とを含む組成物。
  73. 細胞表面に結合したフコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼを有するように操作された未熟樹状細胞を含む組成物。
  74. 樹状細胞が抗原でプライミングされている、請求項７１～７３のいずれか１項記載の組成物。
  75. 樹状細胞が腫瘍抗原でプライミングされている、請求項７４記載の組成物。
  76. フコシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼが、未熟樹状細胞を請求項７１または７２記載の組成物と接触させることを含む方法により未熟樹状細胞の細胞表面に結合している、請求項７３記載の組成物。
  77. ＴＳＡ反応性Ｔ細胞を増殖させるための方法であって、請求項１～３９のいずれか１項記載の方法を行うこと；標識細胞をＦＡＣＳ選別して、標識と１以上のＰＤ－１、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＸＣＲ５またはＴＩＭ３マーカーとを共発現する細胞を富化すること；ならびに照射同種異系フィーダー細胞、ＩＬ－２およびＯＫＴ３抗体の存在下、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）条件で低濃度で該細胞を培養することにより該細胞を増殖させることを含む前記方法。
  78. ＴＳＡ特異的Ｔ細胞の増殖集団の製造方法であって、該製造方法は、請求項１～３９のいずれか１項記載の方法によりＴＳＡ反応性Ｔ細胞を特定すること；ＴＳＡ反応性Ｔ細胞を単離すること；およびＴＳＡ反応性Ｔ細胞をインビトロで１以上のサイトカインと接触させてＴＳＡ反応性Ｔ細胞の増殖を促進させることを含み、ここで、所望により、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）条件を利用することにより該増殖を誘導してもよく、ここで、照射同種異系フィーダー細胞、３，０００ ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２および抗ＣＤ３ε（ＯＫＴ３）の存在下、選別Ｔ細胞を９６ウェルプレート内で３細胞／ウェルで培養する、前記製造方法。
  79. 単離がＦＡＣＳによるものである、請求項７８記載の製造方法。
  80. 組織浸潤リンパ球（ＴｉＩＬ）または循環Ｔ細胞から抗原反応性Ｔ細胞を特定するための方法であって、該方法は、
    ａ．ＴｉＩＬまたは循環Ｔ細胞から得られたＴ細胞の集団を、標識に結合したドナー糖ヌクレオチドの存在下、修飾樹状細胞と接触させ、
    ｉ．ここで、修飾樹状細胞は、その細胞表面上に、ドナー糖ヌクレオチドを使用してＴ細胞上の細胞表面グリカンのグリコシル化を触媒しうる活性グリコシルトランスフェラーゼを含むように操作されており、
    ｉｉ．修飾樹状細胞は１以上の抗原でプライミングされており、
    ｂ．接触後、Ｔ細胞の集団の細胞表面を分析して、標識が存在するかどうかを決定することを含み、
    ここで、Ｔ細胞の集団におけるＴ細胞の細胞表面上の標識の存在は、Ｔ細胞が、樹状細胞をプライミングするのに使用した抗原の１以上のうちの少なくとも１つに対する特異性を有する抗原反応性Ｔ細胞であることを示す、前記方法。
  81. 抗原が病原体に由来する、請求項８０記載の方法。
  82. 抗原がウイルス抗原または細菌抗原である、請求項８０または８１記載の方法。
  83. 第１ Ｔ細胞および１以上の第２ Ｔ細胞上で発現されるそれぞれ第１ ＴＣＲおよび１以上の第２ ＴＣＲの抗原に対する相対的結合アフィニティを決定するための方法であって、該方法は、（ｉ）請求項１～３９のいずれか１項記載の方法を行い、（ｉｉ）第１ Ｔ細胞および各第２ Ｔ細胞に転移された標識のレベルを定量し、転移された標識のレベルにより細胞のアフィニティをランク付けすることを含み、ここで、最も多い標識を含有するＴ細胞は、抗原に対する最も高いアフィニティを有するＴ細胞であり、最も少ない標識を含有するＴ細胞は、抗原に対する最も低いアフィニティを有するＴ細胞であり、中間レベルの標識を有するＴ細胞は、抗原に対する対応する中間レベルのアフィニティを有する、前記方法。
  84. 標識がビオチンである、請求項８３記載の方法。
  85. Ｔ細胞のそれぞれにおける標識の相対量が、抗原を発現する細胞を殺傷するＴ細胞の有効性に対応する、請求項８３または８４記載の方法。
  86. Ｔ細胞のそれぞれにおける標識の相対量が、抗原への曝露に応答してＩＦＮγを産生するＴ細胞の有効性に対応する、請求項８３～８５のいずれか１項記載の方法。
  87. 組織浸潤リンパ球（ＴｉＩＬ）または循環Ｔ細胞の集団に存在する自己反応性Ｔ細胞を特定し富化するための方法であって、該方法は、
    樹状細胞を準備すること；
    樹状細胞を１以上の自己抗原または１以上の自己抗原の供給源と共にインキュベートして、樹状細胞を１以上の自己抗原でプライミングすること；
    樹状細胞を、その細胞表面上で、プレイ細胞上の相互作用依存的標識反応を触媒するための適切な酵素と結合させること；
    ベイト細胞をＴｉＩＬの集団と接触させること（ここで、該集団は少なくとも１つの自己反応性Ｔ細胞を含み、該接触を酵素のタグ付き基質の存在下で行う）を含む、前記方法。
  88. 組織浸潤リンパ球（ＴｉＩＬ）または循環Ｔ細胞の集団に存在する自己反応性Ｔ細胞を特定し富化するための方法であって、該方法は、
    プレイ細胞上の相互作用依存的標識反応を触媒するための適切な酵素が樹状細胞表面上に結合している樹状細胞を準備すること；
    樹状細胞を１以上の自己抗原または１以上の自己抗原の供給源と共にインキュベートして、樹状細胞を１以上の自己抗原でプライミングすること；
    ベイト細胞をＴｉＩＬの集団と接触させること（ここで、該集団は少なくとも１つの自己反応性Ｔ細胞を含み、該接触を酵素のタグ付き基質の存在下で行う）を含む、前記方法。
  89. １以上の自己抗原の供給源が、自己免疫疾患を有する対象からの罹患組織生検から調製された細胞ライセートである、請求項８７または８８記載の方法。
  90. 細胞の集団に含まれるＴ細胞が、自己免疫疾患を有する対象からの罹患組織生検から、または患者から採取された自己ＰＢＭＣから得られる、請求項８７または８８記載の方法。
  91. 酵素がフコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼから選択される、請求項８７～９０のいずれか１項記載の方法。
  92. 酵素がα１，３フコシルトランスフェラーゼである、請求項８７～９１のいずれか１項記載の方法。
  93. 酵素がヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）α１，３フコシルトランスフェラーゼである、請求項９２記載の方法。
  94. 組織浸潤リンパ球（ＴｉＩＬ）または循環Ｔ細胞の集団に存在する抗原反応性Ｔ細胞を特定するための方法であって、該方法は、
    ａ．樹状細胞を準備すること；
    ｂ．樹状細胞を１以上の抗原または１以上の抗原の供給源と共にインキュベートして、樹状細胞を該抗原の１以上でプライミングすること；
    ｃ．樹状細胞を、その細胞表面上で、プレイ細胞上の相互作用依存的標識反応を触媒するための適切な酵素と結合させること（ここで、該結合はインキュベーション工程（ｂ）の前または後に行われる）；
    ｄ．結合工程（ｃ）の後、樹状細胞をＴｉＩＬまたは循環Ｔ細胞の集団と接触させること（ここで、該集団は少なくとも１つの抗原反応性Ｔ細胞を含み、該接触を該酵素の基質の存在下で行い、該基質は、検出可能なタグを含む）；
    ｅ．タグを含む細胞を検出し、それにより、抗原反応性Ｔ細胞を特定することを含む、前記方法。
  95. タグを含む細胞を富化することを含む、請求項９４記載の方法。
  96. タグを含む単一細胞を単離することを含む、請求項９５記載の方法。
  97. タグを含む細胞を増殖させることを含む、請求項９５または９６記載の方法。
  98. 酵素がソルターゼであり、基質が、ソルターゼ認識配列とタグとを含むペプチドである、請求項９４～９７のいずれか１項記載の方法。
  99. 酵素が、ソルターゼＡ：（５Ｍ）およびｍｇＳｒｔＡから選択されるソルターゼである、請求項９４～９８のいずれか１項記載の方法。
  100. 酵素がソルターゼＡであり、基質が、ソルターゼ認識配列とタグとを含むペプチドである、請求項９９記載の方法。
  101. ソルターゼ認識配列が、ＬＰＸＴＸ（配列番号４）（ここで、Ｘの各存在は、独立して、任意のアミノ酸残基を表す）、ＬＰＫＴＧ（配列番号８）、ＬＰＡＴＧ（配列番号９）、ＬＰＮＴＧ（配列番号１０）、ＬＰＥＴＧ（配列番号５）、ＬＰＸＡＧ（配列番号１１）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す）、ＬＰＮＡＧ（配列番号１２）、ＬＰＸＴＡ（配列番号１３）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す）、ＬＰＮＴＡ（配列番号１４）、ＬＧＸＴＧ（配列番号１５）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す）、ＬＧＡＴＧ（配列番号１６）、ＩＰＸＴＧ（配列番号１７）（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す）、ＩＰＮＴＧ（配列番号１８）およびＩＰＥＴＧ（配列番号１９）から選択される、請求項１００記載の方法。
  102. 酵素が無差別ビオチンリガーゼであり、基質がビオチンである、請求項９４～９７のいずれか１項記載の方法。
  103. 無差別ビオチンリガーゼがＴｕｒｂｏＩＤ、ｍｉｎｉＴｕｒｂｏ、ＢｉｏＩＤおよびＢｉｏＩＤ２から選択される、請求項１０２記載の方法。
  104. 酵素がグリコシルトランスフェラーゼであり、基質が標識ドナー糖ヌクレオチドである、請求項９４～９７のいずれか１項記載の方法。
  105. 酵素がフコシルトランスフェラーゼであり、基質がタグ付きＧＤＰ－フコースである、請求項１０４記載の方法。
  106. フコシルトランスフェラーゼがヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）α１，３フコシルトランスフェラーゼである、請求項１０５記載の方法。
  107. 酵素がシアリルトランスフェラーゼであり、基質がタグ付きＣＭＰ－Ｎｅｕ５Ａｃである、請求項１０４記載の方法。
  108. ＴＳＡ反応性を示す他のマーカーを、タグを含む細胞が更に含むかどうかを決定することを更に含む、請求項９４～１０７のいずれか１項記載の方法。
  109. ＴＳＡ反応性を示す他のマーカーが存在する場合には、該マーカーを含む細胞をＦＡＣＳによって富化することを更に含む、請求項９４～１０８のいずれか１項記載の方法。
  110. 他のマーカーがＰＤ－１発現、ＣＤ１３４発現、ＣＤ１３７発現、ＣＸＣＲ５発現およびＴＩＭ３発現の１以上を含む、請求項１０８または１０９記載の方法。
  111. 該方法が、タグとＰＤ－１発現との両方を含む細胞を富化することを含む、請求項１０８～１１０のいずれか１項記載の方法。
  112. 該方法が、ＣＤ８＋および／またはＣＤ４＋発現を含む細胞を富化することを更に含む、請求項９４～１１１のいずれか１項記載の方法。
  113. タグがビオチン、蛍光分子、色素、ＦＡＭ色素、シアニン色素、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素およびＪａｎｅｌｉａ Ｆｌｕｏｒ色素から選択される、請求項９４～１１２のいずれか１項記載の方法。
  114. 野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαとＶβとを含む操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合性フラグメントであって、ここで、ＶαおよびＶβのそれぞれは相補性決定領域１（ＣＤＲ－１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ－２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ－３）を含み、ここで、Ｖα ＣＤＲ－３は、
    Figure 2022535045000017
     からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記の操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはその抗原結合性フラグメント。
  115. 野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαとＶβとを含むＴＳＡ特異的ＴＣＲを含む単鎖Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、ここで、ＶαおよびＶβのそれぞれは相補性決定領域１（ＣＤＲ－１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ－２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ－３）を含み、ここで、Ｖα ＣＤＲ－３は、
    Figure 2022535045000018
     からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記単鎖Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
  116. 請求項１１４記載のＴＣＲを発現するＴ細胞。
  117. 野生型Ｔ細胞受容体に由来するＶαとＶβとを含むＴＳＡ特異的ＴＣＲを含む二重特異性ＴＣＲであって、ここで、ＶαおよびＶβのそれぞれは相補性決定領域１（ＣＤＲ－１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ－２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ－３）を含み、ここで、Ｖα ＣＤＲ－３は、
    Figure 2022535045000019
     からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記二重特異性ＴＣＲ。
  118. 請求項１１４記載の操作されたＴＣＲ、請求項１１５記載の単鎖ＴＣＲまたは請求項１１７記載の二重特異性Ｔ細胞を含む医薬組成物。
  119. １以上の担体、塩、ビヒクルおよび／または賦形剤を更に含む、請求項１１８記載の医薬組成物。
  120. ドナー糖ヌクレオチドを介して間接的に細胞表面に結合した標識を含む１以上の腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）反応性Ｔ細胞を含む組成物。
  121. ドナー糖ヌクレオチドがグリコシル化によりＴＳＡ反応性Ｔ細胞に結合している、請求項１２０記載の組成物。
  122. グリコシル化がグリコシルトランスフェラーゼによりもたらされた、請求項１２０または１２１記載の組成物。
  123. グリコシルトランスフェラーゼがフコシルトランスフェラーゼである、請求項１２２記載の組成物。
  124. グリコシルトランスフェラーゼがα１，３フコシルトランスフェラーゼである、請求項１２３記載の組成物。
  125. グリコシルトランスフェラーゼがヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）α１，３フコシルトランスフェラーゼである、請求項１２２～１２４のいずれか１項記載の組成物。
  126. ドナー糖ヌクレオチドがＧＤＰ－フコースである、請求項１２０～１２５のいずれか１項記載の組成物。
  127. グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼである、請求項１２２記載の組成物。
  128. ドナー糖ヌクレオチドがＣＭＰ－シアル酸である、請求項１２３または１２４記載の組成物。
  129. 標識が小分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、化学的または生物学的なマーカーおよび／またはプローブから選択される、請求項１２０～１２８のいずれか１項記載の組成物。
  130. 化学的または生物学的部分がビオチン、ビオチンプローブ、蛍光分子、蛍光分子を含むプローブ、色素、色素を含むプローブ、色素標識一本鎖ＤＮＡ、ＦＬＡＧタグまたはＳｔｒｅｐタグである、請求項１２９記載の組成物。
  131. 色素がＦＡＭまたはシアニン色素である、請求項１３０記載の組成物。
  132. 蛍光分子がＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５またはＣｙ７である、請求項１３０記載の組成物。
  133. 色素がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素またはＪａｎｅｌｉａ Ｆｌｕｏｒ色素である、請求項１３０記載の組成物。
  134. 標識がＴＳＡ反応性Ｔ細胞上の細胞表面グリカンに結合している、請求項１２０～１３３のいずれか１項記載の組成物。
  135. 細胞表面グリカンがＧａｌ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリルＬａｃＮＡｃから選択される、請求項１３４記載の組成物。
  136. 請求項１２０～１３５のいずれか１項記載の組成物からインビトロで増殖されたＴＳＡ反応性Ｔ細胞の集団を含む組成物。
  137. ＴＳＡ反応性Ｔ細胞が、１以上のサイトカインの存在下で該Ｔ細胞を培養することによりインビトロで増殖された、請求項１３６記載の組成物。
  138. ＴＳＡ反応性Ｔ細胞が、請求項７７～７９のいずれか１項記載の方法により増殖された、請求項１３６または１３７記載の組成物。
  139. ＴＳＡ反応性Ｔ細胞が、患者特異的免疫細胞療法に使用するためのものである、請求項１３６～１３８のいずれか１項記載の組成物。
  140. ＴＳＡ反応性Ｔ細胞が、癌の治療に使用するためのものである、請求項１３６～１３８のいずれか１項記載の組成物。
  141. 癌が、黒色腫、乳癌および毛様細胞性星状細胞腫、ＡＭＬ、ＡＬＬ、甲状腺癌、腎臓嫌色素、ＣＬＬ、髄芽腫、神経芽細胞腫、低悪性度神経膠腫、膠芽腫、前立腺癌、卵巣癌、骨髄腫、膵臓癌、腎乳頭癌、リンパ腫、Ｂ細胞癌、腎明細胞癌、頭頸部癌、肝臓癌、子宮頸癌、子宮癌、膀胱癌、結腸直腸癌、肺小細胞癌、食道癌、胃癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌から選択される、請求項１４０記載の組成物。
  142. ドナー糖ヌクレオチドを介して間接的に細胞表面に結合した標識を含む１以上の抗原特異的Ｔ細胞を含む組成物。
  143. 抗原が病原体に由来する、請求項１４２記載の組成物。
  144. 抗原がウイルス抗原または細菌抗原である、請求項１４２または１４３記載の組成物。
  145. 抗原が自己免疫疾患、炎症性疾患または遺伝的障害に由来する、請求項１４２記載の組成物。
  146. ドナー糖ヌクレオチドがグリコシル化により抗原特異的Ｔ細胞に結合している、請求項１４２～１４５のいずれか１項記載の組成物。
  147. グリコシル化がグリコシルトランスフェラーゼによりもたらされた、請求項１４２～１４６のいずれか１項記載の組成物。
  148. グリコシルトランスフェラーゼがフコシルトランスフェラーゼである、請求項１４７記載の組成物。
  149. グリコシルトランスフェラーゼがα１，３フコシルトランスフェラーゼである、請求項１４７記載の組成物。
  150. グリコシルトランスフェラーゼがヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）α１，３フコシルトランスフェラーゼである、請求項１４７記載の組成物。
  151. ドナー糖ヌクレオチドがＧＤＰ－フコースである、請求項１４７～１５０のいずれか１項記載の組成物。
  152. グリコシルトランスフェラーゼがシアリルトランスフェラーゼである、請求項１４７記載の組成物。
  153. ドナー糖ヌクレオチドがＣＭＰ－シアル酸である、請求項１５２記載の組成物。
  154. 標識が小分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、化学的または生物学的なマーカーおよび／またはプローブから選択される、請求項１４２～１５３のいずれか１項記載の組成物。
  155. 化学的または生物学的部分がビオチン、ビオチンプローブ、蛍光分子、蛍光分子を含むプローブ、色素、色素を含むプローブ、色素標識一本鎖ＤＮＡ、ＦＬＡＧタグまたはＳｔｒｅｐタグである、請求項１５４記載の組成物。
  156. 色素がＦＡＭまたはシアニン色素である、請求項１５５記載の組成物。
  157. 蛍光分子がＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５またはＣｙ７である、請求項１５５記載の組成物。
  158. 色素がＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素またはＪａｎｅｌｉａ Ｆｌｕｏｒ色素である、請求項１５５記載の組成物。
  159. 標識が抗原特異的Ｔ細胞上の細胞表面グリカンに結合している、請求項１４２～１５８のいずれか１項記載の組成物。
  160. 細胞表面グリカンがＧａｌ、ＬａｃＮＡｃおよびシアリルＬａｃＮＡｃから選択される、請求項１５９記載の組成物。
  161. 請求項１４２～１６０のいずれか１項記載の組成物からインビトロで増殖された抗原特異的Ｔ細胞の集団を含む組成物。
  162. 抗原特異的Ｔ細胞が、１以上のサイトカインの存在下で該Ｔ細胞を培養することによりインビトロで増殖された、請求項１６１記載の組成物。
  163. 抗原特異的Ｔ細胞が、請求項７７～７９のいずれか１項記載の方法により増殖された、請求項１６１または１６２記載の組成物。
  164. 抗原特異的Ｔ細胞が患者特異的免疫細胞療法に使用するためのものである、請求項１６１～１６３のいずれか１項記載の組成物。
  165. 抗原特異的Ｔ細胞が、癌の治療に使用するためのものである、請求項１６１～１６４のいずれか１項記載の組成物。
  166. 抗原特異的Ｔ細胞が、病原体の治療に使用するためのものである、請求項１６１～１６４のいずれか１項記載の組成物。
  167. 病原体がウイルスである、請求項１６６記載の組成物。
  168. 病原体が細菌である、請求項１６６記載の組成物。
  169. 抗原特異的Ｔ細胞が、自己免疫疾患、炎症性疾患または遺伝的障害の治療に使用するためのものである、請求項１６１～１６４のいずれか１項記載の組成物。
  170. 請求項１２０～１６９のいずれか１項記載の組成物と、１以上の担体、塩、ビヒクルおよび／または賦形剤とを含む医薬組成物。
JP2021571590A 2019-06-03 2020-06-03 細胞間近接相互作用の検出および免疫療法用の腫瘍特異的抗原反応性ｔ細胞の単離のための化学酵素的方法 Pending JP2022535045A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962856551P 2019-06-03 2019-06-03
US62/856,551 2019-06-03
US202062990383P 2020-03-16 2020-03-16
US62/990,383 2020-03-16
PCT/US2020/035940 WO2020247510A1 (en) 2019-06-03 2020-06-03 A chemoenzymatic method for the detection of cell-cell proximity interaction and isolation of tumor-specific antigen reactive t cells for immune therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022535045A true JP2022535045A (ja) 2022-08-04
JPWO2020247510A5 JPWO2020247510A5 (ja) 2023-11-30

Family

ID=71842819

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021571590A Pending JP2022535045A (ja) 2019-06-03 2020-06-03 細胞間近接相互作用の検出および免疫療法用の腫瘍特異的抗原反応性ｔ細胞の単離のための化学酵素的方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220298475A1 (ja)
EP (1) EP3977121A1 (ja)
JP (1) JP2022535045A (ja)
CA (1) CA3142474A1 (ja)
WO (1) WO2020247510A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022159193A1 (en) * 2021-01-20 2022-07-28 The Regents Of The University Of California Proximity-dependent photoactivation

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9267127B2 (en) 2012-06-21 2016-02-23 President And Fellows Of Harvard College Evolution of bond-forming enzymes
US10053683B2 (en) * 2014-10-03 2018-08-21 Whitehead Institute For Biomedical Research Intercellular labeling of ligand-receptor interactions
KR20200100858A (ko) * 2015-12-23 2020-08-26 메디진 이뮤노테라피스 게엠바하 수지상 세포 조성물
CN110475566A (zh) 2017-02-02 2019-11-19 斯克里普斯研究学院 工程细胞和使用方法
US11467166B2 (en) * 2017-10-23 2022-10-11 Shanghaitech University Compositions and methods for detecting molecule-molecule interactions
CN109797194B (zh) * 2019-01-24 2021-07-09 北京大学 标记细胞膜表面及研究细胞-细胞相互作用的酶和方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20220298475A1 (en) 2022-09-22
WO2020247510A1 (en) 2020-12-10
EP3977121A1 (en) 2022-04-06
CA3142474A1 (en) 2020-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Detecting tumor antigen-specific T cells via interaction-dependent fucosyl-biotinylation
KR20200144093A (ko) 막 단백질 전달을 위한 조성물 및 방법
SA518391219B1 (ar) التركيبات والطرق اللازمة لمجاورة النوع الأول والنوع الثاني من المجالات خارج الخلية كبروتينات كيميرية متغايرة
KR20200056980A (ko) 유전자 발현의 조건부 조절을 위한 방법 및 시스템
KR20210131991A (ko) 구획-특이적 카고 전달을 위한 조성물 및 방법
JP2022535421A (ja) 配列類似ペプチドを使用した対抗選択による選別
CN112512594A (zh) 经由基因调节多肽的条件性核定位的基因调节
KR20220147106A (ko) 항원 제시 세포 외 소포, 그것을 포함하는 조성물, 및 그들을 제조하기 위한 방법
CN112888481A (zh) 包含tnfr2结构域的新型car构建体
JP2022553411A (ja) シリアルキラーｔ細胞集団のインビトロ活性化及び拡大、ならびに腫瘍細胞殺傷細胞を有するがん患者の受動免疫化のための組成物及び方法
WO2020172627A2 (en) Chimeric polypeptides and methods of using the same
JP2022535045A (ja) 細胞間近接相互作用の検出および免疫療法用の腫瘍特異的抗原反応性ｔ細胞の単離のための化学酵素的方法
JP2021523945A (ja) 活性化剤
JP2020532300A (ja) がんの処置のためのｂｃｍａおよびｔａｃｉ抗原に特異的な免疫原性ペプチド
JP7386852B2 (ja) ペプチド活性化剤
CN116018158A (zh) 新抗原知情的肿瘤浸润性淋巴细胞癌免疫疗法
CN116368222A (zh) 破坏cd28-唾液酸糖苷配体复合物以增强t细胞活化
Šimonová Interaction of a surface marker of immune cells with low-molecular weight ligands and their polymer conjugates
JP2023536042A (ja) 同種異系腫瘍細胞ワクチン
JP2024503044A (ja) Ｔ細胞の抗腫瘍免疫を再プログラミングするための小分子
AU2022258567A9 (en) Novel compositions enriched in gamma delta t cells, methods of preparation, and uses thereof
WO2023081455A2 (en) Immune cells expressing glucose transporter 5 (gluts) and compositions and methods including the same
WO2024059740A1 (en) Genetically modified polynucleotides and cells expressing modified mhc proteins and uses thereof
TW202304961A (zh) 用於將治療劑遞送至受體細胞之組合物及方法
WO2024064366A2 (en) Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230601

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230601

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231120