JP2022553411A - シリアルキラーｔ細胞集団のインビトロ活性化及び拡大、ならびに腫瘍細胞殺傷細胞を有するがん患者の受動免疫化のための組成物及び方法 - Google Patents

シリアルキラーｔ細胞集団のインビトロ活性化及び拡大、ならびに腫瘍細胞殺傷細胞を有するがん患者の受動免疫化のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

記載された発明は、３つの必須免疫調節ペプチド、及び任意選択で追加のＲ免疫調節ペプチドのコアを発現するように遺伝子操作された操作された白血球刺激細胞の１つ以上の集団との接触による単核球のインビトロ免疫活性化の方法、ならびに現在免疫抑制レジメンの影響下にないがん患者の受動免疫化のための細胞傷害性シリアルキラー細胞の１つ以上の亜集団を含む、拡大及び活性化された単核球集団を含む細胞製品の使用を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１１月２２日に出願された米国仮出願６２／４２５，４２４の優先権を主張する２０１７年１１月２２日に出願された米国の非仮出願１５／８２１，１０５の一部継続出願である、２０１９年１０月２２日に出願された米国の非仮出願１６／６６０，４４２の優先権の権益を主張し、これらの内容は、参照によりその全体が組み込まれている。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年１０月２１日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、１２８６６３－００３２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、３０２，１１０バイトのサイズである。
記載された発明は、概して、がんの治療への免疫学的アプローチ、より具体的には、シリアルキラーＴ細胞集団のインビトロ誘導及び拡大、それに続く腫瘍細胞殺傷活性化及び拡大されたシリアルキラーＴ細胞によるがん患者の受動免疫に関する。
ヒトの免疫系は、免疫恒常性を維持して、危険であると判断されたすべての要素を排除することにより、生物の完全性を維持する細胞と分子の複雑な配置である。免疫系の応答は、一般的に「自然免疫」と「適応免疫」と呼ばれる２つの群に分けられる。
免疫系の自然免疫の群は、補体系及びケモカイン／サイトカイン系を含む多くの可溶性因子を介した初期の炎症応答の主な原因である病原体に対する非特異的な速い反応であり、マスト細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、及びナチュラルキラー細胞（ＮＫ）を含む、多くの特殊な細胞型がある。
適応免疫群は、特定の抗原に対する長期の免疫記憶を作り出すさまざまな型の細胞による、特異的な、遅延した長期的な応答を含む。それはさらに細胞性及び体液性の枝に細分することができ、前者は主にＴ細胞によって媒介され、後者はＢ細胞によって媒介される。Ｔ細胞はさらにＣＤ４＋分子の発現またはＣＤ８＋分子の発現によって分類することができ、その後者はＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の同定を可能にする。
免疫系の第３の群は、自然免疫の群でエフェクター機能を有する適応免疫の群の系統メンバーを含み、従って、自然免疫応答と適応免疫応答の間のギャップが埋められる。これらには、γδ Ｔ細胞などの細胞、ならびにナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及び粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞などのＴ細胞受容体レパートリーが制限されたＴ細胞が含まれる。第３の群は、本明細書では「自然様免疫」と呼ばれる。
免疫の３つの群は、互いに独立して機能するのではなく、効果的な免疫応答を引き出すために連携して機能する。適応免疫応答の開始には時間がかかるため、自然免疫と自然様免疫は、宿主が病原体にさらされた直後の臨界期に防御の第一線を提供する。
免疫系の構成要素
免疫系は、特異的な受容体とリガンドの対を介して発生する細胞相互作用で構成され、両方向にシグナルを送るため、それぞれの細胞はこれらのシグナルの時間的及び空間的な分布に基づいて命令を受け取る。
免疫系の細胞は、リンパ球、単球／マクロファージ、樹状細胞、密接に関連したランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マスト細胞、好塩基球、及び細胞の骨髄細胞系列の他のメンバーを含む。さらに、一連の特殊化された上皮細胞及び間質細胞は、しばしば免疫系の細胞において増殖及び／または遺伝子活性化を調節する重要な因子を分泌することによって免疫が起こる解剖学的環境を提供し、これはまた、応答における誘導及びエフェクターの相において直接的な役割を果たす。（Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ． Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９），ａｔ ｐ． １０２）．
免疫系の細胞は、脾臓、リンパ節、腸のパイエル板、扁桃腺などの末梢の組織化された組織に見られる。リンパ球はまた、中枢リンパ器官、胸腺、及び骨髄において見られ、そこでは、それらは成熟した免疫系の無数の応答を媒介するのに備える発達段階を経る。リンパ球とマクロファージの大部分は、血液とリンパ液に見られる細胞の再循環プールを構成し、免疫担当細胞をそれらが必要とされる部位に送達し、局所的に発生する免疫を全身性とすることを可能にする（同上）。
骨髄系列またはリンパ系列に由来する白血球は、自然免疫または特異的適応免疫のいずれかを提供する。骨髄細胞には、ほとんどの病原体に対する防御の第一線を提供する、食作用の強い、運動性の好中球、単球、及びマクロファージが含まれる。好酸球、好塩基球、及びそれらの組織の対応物であるマスト細胞を含む他の骨髄細胞は、寄生虫に対する防御及びアレルギー反応の発生に関与している。リンパ球は他の白血球の作用を調節し、慢性または再発性の感染を防ぐ特異的免疫応答を生成する（同上）。
補体系。自然免疫の一部である補体系は、血漿中を循環する３０を超える異なるタンパク質で構成されている。感染がない場合、補体タンパク質は不活性な形で循環する。病原体の存在下では、補体タンパク質が活性化されて、直接または食作用を促進することによって病原体を殺傷する。補体系が病原体に作用する経路は、抗体依存性細胞傷害を伴う古典的経路と補体依存性細胞傷害を伴う代替経路の２つ存在する。（Ｒｉｃｋｌｉｎ，Ｄａｎｉｅｌ，ｅｔ ａｌ． “Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ： ａ Ｋｅｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ａｎｄ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．” Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｅｐｔ． ２０１０，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ２９２４９０８／）．
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫系のエフェクター細胞が抗体に結合した標的細胞を能動的に溶解するメカニズムである。細胞傷害性エフェクター細胞による抗体被覆標的細胞のＡＤＣＣ殺傷メカニズムは、非食作用プロセスによるものである。このプロセスには、細胞傷害性顆粒の内容物の放出または細胞死誘導分子の発現が含まれる。ＡＤＣＣは、標的結合抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥクラスに属する）と、免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ領域に結合するエフェクター細胞表面に存在する特定のＦｃ受容体糖タンパク質との相互作用によって誘起される。ＡＤＣＣを媒介するエフェクター細胞には、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、樹状細胞が含まれる。ＡＤＣＣは、標的細胞表面上の抗原の密度と安定性、抗体親和性、ＦｃＲ結合親和性などの多くのパラメーターに依存する。
ＡＤＣＣとは対照的に、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣＣ）は、抗体の関与なしに標的細胞膜に損傷を与えることによって病原体を殺傷する免疫系のプロセスである。この副経路は、微生物表面に直接結合する補体成分Ｃ３の自発的な加水分解と活性化によって開始される。代替的に、レクチン経路は、微生物表面上の特定の糖分子に結合する可溶性糖結合タンパク質によって開始される。
ＡＤＣＣ及びＣＤＣＣメカニズムのそれぞれは、Ｃ３を切断するＣ３転換酵素を生成し、病原体の表面に結合したＣ３ｂを残し、Ｃ３ａを放出する。これは、補体カスケードの活性化、感染部位への食作用細胞の動員、免疫細胞による病原体の食作用、及び／または病原体細胞膜を破壊して細胞溶解を引き起こす膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成を含む多くの細胞活動をもたらす。
免疫応答
一般的に免疫応答は、個体と外来性抗原物質、例えば、感染性微生物との遭遇によって開始される。感染した個体は、免疫原の抗原決定基／エピトープに特異的な抗体分子の産生を伴う体液性免疫応答と、抗原特異的制御性Ｔ細胞ならびにサイトカインを産生する細胞及び感染細胞を溶解することのできるキラーＴ細胞を含むエフェクターＴリンパ球の拡大及び分化を伴う細胞媒介性免疫応答との両方で迅速に応答する。特定の微生物による一次免疫は、微生物に見られる抗原決定基／エピトープに特異的である抗体及びＴ細胞を誘発するが、通常、無関係の微生物が発現する抗原決定基を認識することをできないかまたは不十分にのみ認識する（Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ． Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９），ａｔ ｐ． １０２）。
この初期応答の結果として、免疫された個体は免疫学的記憶の状態を発達させる。同一のまたは密接に関係した微生物に再び遭遇する場合、二次応答が結果として起こる。この二次応答は、一般的により迅速でより大きな規模であり、より高い親和性で抗原に結合する抗体から構成され、生体から微生物をより効果的に除去する抗体応答、ならびに、同様に増強され、しばしばより効果的なＴ細胞応答からなる。しかしながら、感染性因子に対する免疫応答は、病原体の排除を常にもたらすわけではない（Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９），ａｔ ｐ． １０２）。
免疫恒常性
免疫系は厳しく調節されたネットワークであり、免疫系のさまざまなアクターが協調して免疫の不均衡を回避するために、通常の生理学的条件下で恒常性を維持することができる。通常、外来抗原で攻撃されると、平衡を回復することを目的とした特定の適切な応答が開始される。しかしながら、特定の状況下では、このバランスは維持されず、免疫応答は過小または過大に反応する。がんは、免疫応答が非効率的または無応答であり、がん細胞の制御不能の増殖をもたらし得る状況の例である。逆に、免疫応答が過剰反応すると、自己免疫、慢性炎症、及び／または感染後の病状などの状態を引き起こす可能性がある。
免疫寛容
免疫系は自己抗原に寛容であり、すなわち、それは外来物質上に発現する抗原決定基と宿主の組織により発現された抗原決定基とを識別することができる。免疫寛容または免疫学的寛容と呼ばれる、宿主抗原を無視するシステムの能力は、免疫学的寛容を通じて自己抗原を認識することができる細胞の排除または不活性化を含む能動的なプロセスである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｎ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ． Ｐａｕｌ，Ｅｄ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９），ａｔ ｐ． ２）。
自然免疫細胞は、３つの異なるメカニズムを通じて自己と非自己を認識して区別する。１）自然免疫細胞は、宿主によって発現されない保存産物を認識することにより、「非感染性自己」から「非自己」を認識できる；２）自然免疫細胞は、宿主に特異的で病原体が存在しない自己タンパク質を認識することにより、「自己性の喪失」を認識することができ；３）自然免疫細胞は、感染または細胞の形質転換によって上方制御される異常な細胞マーカーを認識することにより、「変化した自己」を認識することもできる（Ｓｐｅａｒ，Ｐａｕｌ，ｅｔ ａｌ． “ＮＫＧ２Ｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔａｒｇｅｔｓ．”Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１ Ｍａｙ ２０１３，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３７００７４６／）。
免疫寛容は、その状態が最初に誘導された場所、すなわち、それが胸腺及び骨髄（中枢）または他の組織及びリンパ節（末梢）のいずれかであるかに依存して、１）中枢性寛容または２）末梢性寛容に分類される。これらの形態の寛容が確立される生物学的機序は異なるが、生じる効果は類似する（Ｒａｋｅｒ Ｖ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｖｏｌ．，６（５６９）： １－１１，（２０１５））。
免疫系が非自己分子から自己分子を識別する重要な方法である中枢性寛容は、自己反応性リンパ球クローンが完全な免疫担当細胞へと成熟する前に除去することによって確立される。それは、Ｔンパ球及びＢリンパ球について、それぞれ胸腺及び骨髄におけるリンパ球発達中に起きる（Ｓｐｒｅｎｔ Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ，Ｖｏｌ． ３５６（１４０９）： ６０９－６１６，（２００１））。これらの組織において、成熟するリンパ球は、胸腺の上皮細胞及び胸腺樹状細胞または骨髄細胞によって提示される自己抗原に曝露される。自己抗原は、内因性発現、循環血液を介した末梢部位からの抗原の移入、及び胸腺間質細胞の場合、転写因子ＡＩＲＥの作用による他の非胸腺組織のタンパク質の発現のために存在する（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ． Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ： ８ｔｈ ｅｄ． Ｃｈａｐｔｅｒ １５： Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ． （２０１２），ｐｐ． ６１１－６６８；ｓｅｅ ａｌｓｏ，Ｋｌｅｉｎ Ｌ． Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ． １６３（４）：７９４－７９５，（２０１５））。自己抗原に強く結合する受容体を有するリンパ球は、自己反応性細胞のアポトーシスによって、またはアネルギーの誘導によって除去される（同上、ｐｐ．２７５～３３４における）。弱い自己反応性Ｂ細胞はまた、それらが、それらのＢ細胞受容体の刺激に応答しない免疫学的不活性の状態に維持される。いくつかの弱い自己認識Ｔ細胞は、代替的に内在性制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ細胞）へと分化し、それはＴ細胞の自己反応性の起こりうる場合を低下させるために末梢で見張りとして機能する（同上、ｐｐ．６１１～６６８における）。
Ｔ細胞が、直接的な組織損傷を引き起こすことのできる細胞の主な集団であるので、除去の閾値は、Ｂ細胞に対してよりもＴ細胞に対してより厳密である。さらに、Ｂ細胞がより多様な抗原を認識できるようにすることは生物にとってより有利であり、それにより、それらがより多様な病原体に対する抗体を誘発することができる。Ｂ細胞は、同じ抗原を認識する、より自己拘束的なＴ細胞による確認の後にのみ完全に活性化され得るので、自己反応性は非常にコントロールされる（同上、ｐｐ．２７５－３３４における）。
このネガティブセレクションのプロセスは、外来抗原を認識する能力を維持しながら、個体自身の組織に対して強力な免疫応答を起こす可能性があるＴ細胞とＢ細胞の破壊を確実にする。リンパ球の発達と教育は胎児の発生中に最も活発であるが、未熟なリンパ球が生成されると生涯続き、成人期に胸腺が変性し、骨髄が収縮するにつれて遅くなる（同上、ｐｐ．２７５～３３４における；Ｊｉａｎｇ Ｔ．Ｔ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ． １９２（１１）： ４９４９－４９５６，（２０１４）も参照されたい）。
末梢性免疫寛容は、Ｔ細胞とＢ細胞が成熟して末梢組織とリンパ節に入った後に発達する（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ． Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ： ８ｔｈ ｅｄ． Ｃｈａｐｔｅｒ ８： Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． ｐｐ． ２７５－３３４）。それは、免疫応答を調整し、抗体を産生するよう進行するためにＢ細胞が必要とする確認シグナルをＢ細胞にもたらすＴ細胞、特にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞のレベルでの制御を主に含む多くの重複する機序によって説明されている。胸腺において排除されなかった、正常な自己抗原に対する不適切な反応性は、胸腺を離れるＴ細胞が比較的安全だが完全に安全ではないために起こり得る。一部は、Ｔ細胞が胸腺で遭遇しなかった自己抗原に応答できるＴＣＲを有する（同上）。胸腺における胸腺内ネガティブセレクションを回避するそれらの自己反応性Ｔ細胞は、それらが主にｎＴｒｅｇ細胞によって末梢組織において除去されない限り、細胞傷害を与え得る。
通常、胸腺髄質上皮細胞で発現する自己免疫調節因子（Ａｉｒｅ）は、末梢自己抗原の異所性発現を媒介し、自己反応性Ｔ細胞の欠失を媒介することによって免疫寛容において役割を果たす（Ｍｅｔｚｇｅｒ Ｔ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ２０１１，２４１： ８９－１０３，（２０１１））。
特定の抗原に対する適切な反応性はまた、反復した曝露の後の寛容の誘導によっても抑制され得る。ナイーブＣＤ４＋ヘルパー細胞は、末梢組織において、または状況に応じて近隣のリンパ組織（リンパ節、粘膜関連リンパ組織など）において、誘導Ｔｒｅｇ細胞（ｉＴｒｅｇ細胞）へと分化する。この分化は、Ｔ細胞活性化の際に産生されるＩＬ－２、及び寛容化樹状細胞（ＤＣ）または他の抗原提示細胞を含む様々な供給源のいずれかからのＴＧＦ－βによって媒介される（Ｃｕｒｏｔｔｏ ｄｅ Ｌａｆａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３０（６）： ６２６－６３５，（２００９））。
免疫とがん
がんの免疫寛容
がんは特定の細胞の遺伝的不安定性を特徴とするが、免疫系が、少なくとも罹患したヒト集団の特定のセグメントにおいて、異質であると認識されるべき明らかに非自己の表現型を有するがん性細胞に最適に応答できないという事実に基づいて、免疫系の障害としても説明されている。この観察の根拠を説明するために、いくつかの理由が提示されている。例えば、第一に、がん細胞は主に自己抗原で構成されており、感染性生物の状況とは際立って対照的である。がん抗原として分類されるいくつかの抗原は、実際には過剰発現されている正常な抗原、またはポリペプチド鎖の１つまたは２つのアミノ酸のみに変異がある正常な抗原である。第二に、がん細胞はＭＨＣを下方制御するため、ＭＨＣを介して腫瘍細胞由来のペプチドをあまり提示しない。第三に、がん細胞及び関連する腫瘍関連マクロファージは、免疫応答を減衰させるサイトカインを発現する（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ （２００７） Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：４１－５１を参照されたい）。この減衰は、例えば、がん細胞または関連するマクロファージによるインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）の分泌によって引き起こされる。第四に、感染症の状況とは異なり、がん細胞は免疫アジュバントを提供しない。病原体は、ＴＬＲアゴニスト及びＮＯＤアゴニストの形をとるさまざまな天然に存在する免疫アジュバントを発現する（例えば、Ｋｌｅｉｎｎｉｊｅｎｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ （２０１１） Ｃｌｉｎ． Ｄｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４０５３１０ （１２ ｐａｇｅｓ）を参照されたい）。一般に、樹状細胞の最適な活性化には、樹状細胞によって発現される１つ以上のＴＬＲとの免疫アジュバントの接触が必要である。樹状細胞の活性化がなければ、樹状細胞とＴ細胞（免疫シナプス）との接触は、Ｔ細胞の最適な活性化をもたらすことができない。
腫瘍免疫監視と免疫編集
外因性腫瘍抑制因子として機能する機能的ながん免疫監視プロセスは確かに存在するが、免疫系は、腫瘍の免疫原性表現型を発達させるときにその形を変えることにより、少なくとも部分的に腫瘍の進行を促進できることが明らかになった。いわゆる「腫瘍免疫編集」は、排除段階、平衡段階、及び逃避段階の３つの段階に分けられる。免疫監視としても知られる排除段階は、免疫系ががん性または前がん性の細胞を識別し、それらが制御不能になる前にそれらを排除するプロセスである。この段階は、すべてのがん性または前がん性細胞が排除されたときに完了することができる。一部の腫瘍細胞が排除されない場合、免疫系と腫瘍細胞の増殖の間で一時的な平衡状態が達成され得る。この平衡段階では、腫瘍細胞は休眠状態を維持するか、存在する抗原を調節できるゲノムＤＮＡへのさらなる変化を蓄積することによって進化を続けることができる。このプロセスの間、免疫系は進化する細胞に選択圧をかけ、それによって認識されにくい腫瘍細胞は生存上の利点を持つ。最終的に、免疫応答は腫瘍の細胞を認識できなくなり、腫瘍細胞が次第に制御不能に増殖する逃避段階に移行する（Ｄｕｎｎ，ＧＰ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００４）： ３２９－６０）。
腫瘍免疫学
腫瘍は、多数の回避メカニズムによって進行及び進化することができる。
例えば、腫瘍は免疫応答からの選択圧の下で進化し、抗腫瘍免疫細胞を活性化する受容体を選択的に失うことができる。例えば、ＮＫＧ２Ｄを発現しているマウスでＮＫＧ２Ｄリガンドが欠損している腫瘍は、他の腫瘍細胞が失われているにもかかわらず持続することができると報告されている（Ｍａｒｃｕｓ，Ａｓｓａｆ，ｅｔ ａｌ． “Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ．” Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１４，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ４２２８９３１／）。
腫瘍はまた、選択的スプライシング、切断、タンパク質分解シェディング、またはエクソソーム分泌などのさまざまな技術を通じて抗腫瘍免疫細胞を活性化するリガンドを放出する。これは、ＭＩＣ（ＭＨＣクラスＩタンパク質に遠縁のＭＨＣクラスＩ関連分子）及びＭＩＣＢに結合するＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）などの可溶性リガンドの増加に見られ、これは、乳房、肺、結腸、及び卵巣のがん腫、グリオーマ、神経芽細胞腫、白血病、及び黒色腫を含むさまざまな腫瘍タイプの患者の血清で同定されている。リガンドの放出及び周囲の反応環境における可溶性リガンドの存在は、いくつかの明確な効果をもたらし得る。第一に、それは細胞表面の活性化リガンドのレベルを低下させ、したがってリンパ球による攻撃に対する腫瘍細胞の感受性を低下させる。例えば、腫瘍細胞からのＮＫＧ２Ｄリガンドの放出は、ＮＫ細胞またはＴ細胞による細胞溶解攻撃を受ける能力を低下させると仮定されている。代替的に、反応環境における可溶性リガンドの存在は、リンパ球上のリガンド受容体に結合し、腫瘍細胞に対する細胞障害活性を誘導するために必要な相互作用を妨げることにより、ＮＫを脱感作し得る（同上）。可溶性リガンドはまた、それらの受容体の発現を下方制御すると考えられている。例えば、血清中の可溶性ＭＩＣＡが上昇しているがん患者は、末梢血ＣＤ８＋Ｔ細胞のＮＫＧ２Ｄ染色を大幅に低下させた。（同上）。エクソソームとともに可溶性リガンドもまた、一緒に束ねられ、リンパ球の免疫応答に影響を及ぼすために協調して作用すると仮定されている。（同上）。
同様に、腫瘍は、細胞死を回避するために、受容体を発現する能力を失ったり、受容体を放出したりできる。例えば、腫瘍は、クラスＩ自体またはクラスＩ経路の構成要素の喪失により、ＭＨＣクラスＩ拘束抗原処理を妨害することにより、免疫認識を回避することができる。一部の黒色腫は、クラスＩの安定した集合に必要なβ２ミクログロブリン（β2Ｍ）の発現欠失、または腫瘍抗原処理（ＴＡＰ）に関連するトランスポーターの発現欠失により、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現を失っている（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｓ．，ａｎｄ Ｌ．Ｍ． Ｈｅｓｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ． ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＳ ＯＦ ＣＡＮＣＥＲ ＰＲＥＶＥＮＴＩＯＮ． ＳＰＲＩＮＧＥＲ ＮＡＴＵＲＥ，２０１９． Ｐｐｓ． ７９－１０８）。
腫瘍微小環境
腫瘍はさまざまな戦略とメカニズムを使用して抗腫瘍免疫応答のすべての段階を能動的に下方制御するため、腫瘍の微小環境は免疫細胞機能に対する一貫して効果的なバリアを提供する。腫瘍微小環境で免疫細胞の機能不全を引き起こす多くの分子メカニズムが特定されている。これには、腫瘍によって生成される因子によって直接媒介されるメカニズム、及びがんの存在下での正常組織の恒常性の変化に起因するメカニズムが含まれる。ほとんどのヒト腫瘍は、免疫細胞の発達、分化、遊走、細胞傷害性、及び他のエフェクター機能の１つ以上の段階を妨害できるらしい（Ｔ Ｌ Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ，Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ （２００８） ２７，５９０４－５９１２）。
そのようなメカニズムの１つは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｂｒｉｇｈｔ Ｆｏｘｐ３＋）及び骨髄由来細胞 （ＣＤ３４＋ＣＤ３３＋ＣＤ１３＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１５－）の腫瘍への蓄積を含み、これらはヒト腫瘍の一般的な特徴であり、がん患者の予後不良に関連している（同上）。通常の条件下では、Ｔｒｅｇ細胞は自己免疫の予防に関与するが、がんでは、Ｔｒｅｇ細胞は拡大し、腫瘍に遊走し、自家エフェクターＴ細胞の増殖を下方制御し、異なる分子経路を使用してＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞とＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞の両方の抗腫瘍応答を抑制する。腫瘍内のＴｒｅｇ細胞は、制御性ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の不均一な集団であり、天然のＴｒｅｇ、抗原特異的Ｔｒ１細胞、及びその他のあまり明確に定義されていないサプレッサー細胞のサブセットを含む。Ｔ制御性１型（Ｔｒ１）細胞は、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）が豊富な腫瘍微小環境で誘導され、これらはすべてＴｒ１生成を促進することが示されている（同上）。
好中球及び単球に密接に関連する骨髄系サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）は、健康人では定常状態では存在せず、慢性炎症またはストレスに関連するがん及び病的状態で現れる （Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，ＤＩ．，“Ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． （２０１７） ５（１）： ３－８）。それらは、好中球及び単球の機能的活性の比較的安定した、明確な状態である。これらの細胞の主な機能的特徴は、さまざまな種類の免疫応答を抑制する強力な能力である。ＭＤＳＣは、顆粒球または多形核（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）と呼ばれる２つの大きな細胞群で構成されており、表現型及び形態学的には好中球に類似している。及び単球（Ｍ－ＭＤＳＣ）は、表現型及び形態学的に単球に類似している。したがって、表現型の基準だけでは、細胞をＭＤＳＣとして識別するのに十分ではない。ほとんどの種類のがんでは、ＰＭＮ－ＭＤＳＣはすべてのＭＤＳＣの８０％以上を占めている。これらの２つの主要な集団に加えて、ＭＤＳＣには、骨髄前駆細胞と前駆細胞の混合物を表す骨髄コロニー形成活性を持つ細胞の小グループ（３％未満）が含まれる。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の中で、ＰＭＮ－ＭＤＳＣはＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４－ＣＤ１５＋またはＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４－ＣＤ６６ｂ＋として定義され、Ｍ－ＭＤＳＣはＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１４＋ＨＬＡ－ＤＲ－／ｌｏＣＤ１５－として定義される。Ｌｉｎ－（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ５６を含む）ＨＬＡ－ＤＲ－ＣＤ３３＋細胞には、より未成熟な前駆細胞を含むＭＤＳＣの混合グループが含まれている。この後者の集団には、「初期ＭＤＳＣ」（ｅ－ＭＤＳＣ）という用語が提案されている。
ＭＤＳＣは免疫系のさまざまな細胞の抑制に関与しているが、ＭＤＳＣの主な標的はＴ細胞である。ＭＤＳＣを介した免疫抑制に関与する主な因子には、アルギナーゼ（ＡＲＧ１）、ｉＮＯＳ、ＴＧＦβ、ＩＬ－１０、ＣＯＸ２、システインのインドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）隔離、Ｔ細胞によるＬ－セレクチン発現の減少、他の多くが含まれる。Ｍ－ＭＤＳＣとＰＭＮ－ＭＤＳＣは、免疫抑制の異なるメカニズムを利用している。Ｍ－ＭＤＳＣは、ＮＯ及びサイトカインの産生に関連するメカニズムを利用して、抗原特異的と非特異的な方法の両方でＴ細胞応答を抑制する（（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ，ＤＥ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｔｕｍｏｕｒｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）１２：２５３－６８を引用する、同上）でレビューされる）。一方、ＰＭＮ－ＭＤＳＣは、主に抗原特異的な方法で免疫応答を抑制することができる。抗原特異的Ｔ細胞寛容の誘導は、これらの細胞の主要な特徴の１つである（Ｋｏｅｈｎ ＢＨ，ｅｔ ａｌ． ＧＶＨＤ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｏｓｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ （２０１５） １２６：１６２１－８；Ｎａｇａｒａｊ Ｓ，Ｇｕｐｔａ Ｋ，Ｐｉｓａｒｅｖ Ｖ，Ｋｉｎａｒｓｋｙ Ｌ，Ｓｈｅｒｍａｎ Ｓ，Ｋａｎｇ Ｌ，ｅｔ ａｌ． Ａｌｔｅｒｅｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． （２００７） １３： ８２８－３５を引用する、同上）。この能力には、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成が不可欠である。ＮＯとスーパーオキシドとの反応はペルオキシナイトライト（ＰＮＴ）を生成し、これはＴ細胞受容体をニトロ化し、同族の抗原－ＭＨＣ複合体に対する応答性を低下させることによってＴ細胞を直接阻害する（Ｎａｇａｒａｊ Ｓ，ｅｔ ａｌ． Ａｌｔｅｒｅｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ Ｍｅｄ． （２００７） １３： ８２８－３５を引用する、同上）。ＰＮＴはまた、Ｔ細胞特異的ケモカインをニトロ化することにより、腫瘍細胞上のＭＨＣ分子への抗原ペプチドの結合を減少させ（Ｌｕ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ． （２０１１） １２１： ４０１５－２９を引用する、同上）、Ｔ細胞遊走を阻止する（Ｍｏｌｏｎ，Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｎｉｔｒａｔｉｏｎ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． （２０１１） ２０８： １９４９－６２を引用する、同上）。免疫抑制メカニズムに加えて、ＭＤＳＣは、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｂｖ８、及びＭＭＰ９の産生を介して腫瘍微小環境のリモデリング及び腫瘍血管新生に影響を及ぼすことによって腫瘍の進行を促進する（Ｔａｒｔｏｕｒ，Ｅ． ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ： ａ ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ． （２０１１） ３０： ８３－９５；Ｃａｓｅｌｌａ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ－ｐａｒａｃｒｉｎｅ ＶＥＧＦ ｌｏｏｐｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅ ｔｈｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｆｌｔ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ｂｌｏｏｄ． （２００３） １０１：１３１６－２３；Ｓｈｏｊａｅｉ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．，Ｇ－ＣＳＦ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｔｕｍｏｒ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ ｔｏ ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． （２００９） １０６： ６７４２－７を引用する、同上）。
ほとんどの場合、ＴＭＥに見られる樹状細胞は未成熟であり、特定のＴ細胞を活性化するように調整可能である。ＮＫＴはＩＬ－４とＩＦＮ－γを分泌し、ＣＤ４０Ｌをさらに上方制御し、それによってＤＣの成熟を誘導する。ＤＣ成熟は、ＭＨＣ分子のＣＤ８０及びＣＤ８６の上方制御を通じて、ならびに炎症促進性サイトカインＩＬ－１２及びケモカインＣＣＬ１７を産生することにより、共刺激能力の増加をもたらす。ケモカインの存在は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＣＣＲ４＋細胞を誘引し、次いでＣＤ８＋Ｔ細胞は「ライセンスされた」ＤＣ細胞によって活性化され得る（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ． （２０１５） “Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｌｉｃｅｎｓｉｎｇ，Ｃｒｏｓｓ－Ｐｒｉｍｉｎｇ，ａｎｄ Ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．” Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６：３７９）。
通常、ヒト腫瘍塊には２種類の腫瘍細胞がある。１つはＨＬＡクラスＩ陽性で、もう１つはＨＬＡクラスＩ陰性である。効果的な腫瘍免疫には、両方のタイプの腫瘍細胞を一度に排除する必要がある。ＮＫＴは、未成熟ＤＣと相互作用してそれらの成熟を誘導することと、ＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の機能を増強することとの両方ができる唯一の細胞型である。ＮＫＴはＤＣの成熟を誘導し、ＤＣがＣＤ８＋Ｔ細胞に腫瘍抗原を提示できるようにする。次いで、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡクラスＩ陽性の腫瘍細胞を排除することができる。ＮＫＴはまた、ＮＫを活性化するＩＦＮγを産生し、それによってＨＬＡクラスＩ陰性の腫瘍標的を殺傷する（Ｔｅｒａｂｅ，Ｍ．，＆ Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ． Ａ． （２０１２）． Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂａｌａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。
ＮＫＴはＢ細胞と双方向の相互作用を形成することができ、ＣＤ１ｄを介して一部のＮＫＴに脂質抗原を提示することができる。その見返りとして、ＮＫＴはＢ細胞にライセンスを供与して、抗腫瘍ＣＴＬ応答を効果的に刺激及び活性化し、体液性応答を強化及び維持するためのＢ細胞ヘルプを提供できる（Ｎａｉｒ ａｎｄ Ｄｈｏｄａｐｋａｒ （２０１７）． “Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８：１１７８）。
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、腫瘍微小環境に存在する顕著な免疫抑制免疫細胞である。ＴＡＭは、血管新生、腫瘍細胞の浸潤、ＮＫ細胞及びＴ細胞の応答の抑制を促進することにより、腫瘍の進行に寄与する。一部のＮＫＴは、神経芽細胞腫でＣＤ１ｄを発現するＴＡＭと共局在化し、ＩＬ－１５及びＣＤ１ｄに拘束された方法でＴＡＭを殺傷することが判明している。（同上）。
ＮＫＴは、ＣＤ１ｄ＋骨髄系サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を介した免疫抑制の効果を変えることもできる。ＭＤＳＣは腫瘍の増殖中に蓄積することが多く、免疫回避と腫瘍の進行に寄与する。研究によると、ＮＫＴはアルギネート１及び亜酸化窒素シンターゼを介したＭＤＳＣの抑制活性を阻害し得ることが見出された。ＭＤＳＣの免疫抑制活性を阻害するこの能力は、ＣＤ１ｄとＣＤ４０の相互作用に依存していると報告されている。（同上）。
一部のＮＫＴは強力な抗腫瘍免疫を促進できるが、他のタイプは、Ｔｒｅｇ及びＭＤＳＣと同様に、抗腫瘍免疫応答を抑制し、より調節的な役割を果たすことが知られている。免疫調節性ＮＫＴと免疫抑制性ＮＫＴのバランスにより、腫瘍に対する免疫応答が活性化されて腫瘍が排除されるか、それが抑制されて腫瘍が増殖するかが決まる（Ｔｅｒａｂｅ，Ｍ．，＆ Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ． Ａ． （２０１２）． Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂａｌａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）。
一部のＮＫＴタイプは、担腫瘍マウスにおけるＭＤＳＣの蓄積を促進することが示されている。ＮＫＴは、他のＮＫＴ細胞型、通常のＴ細胞、及びＤＣの炎症促進性機能を阻害することも示されている。免疫抑制性ＮＫＴの１つの属性は、それらのＩＬ－１３及びＩＬ－４サイトカインの産生の上昇であり、これらは主に腫瘍を促進するＴｈ２型に向けてサイトカイン応答を歪めることができる。研究によると、免疫抑制型ＮＫＴは、ＩＬ４Ｒ及びＳＴＡＴ６軸を介したＩＬ－１３産生を通じて細胞傷害性Ｔ細胞を抑制し、さらに免疫抑制性サイトカインＴＧＦ－Ｂを産生するＭＤＳＣを誘導することが示されている（Ｎａｉｒ ａｎｄ Ｄｈｏｄａｐｋａｒ （２０１７ “Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８：１１７８）。
免疫抑制性ＮＫＴは、ＣｐＧで刺激するとＩＬ－１３ではなくＩＦＮγを分泌するため、ＣＤ８＋細胞の活性化と機能を増強し、抗腫瘍効果に寄与するとの仮説が立てられている（同上）。したがって、免疫抑制性ＮＫＴと免疫調節性ＮＫＴのバランスは抗腫瘍活性を高める上で重要であるが、別の因子はＮＫＴ自体の活性化リガンドである。
腫瘍免疫療法
従来の化学療法は、正常かがん性かにかかわらず急速に増殖する細胞を殺傷することによって機能する。標的療法は、がんの特定の遺伝子、タンパク質、またはがんの増殖と生存に寄与する組織環境を標的にすることにより、細胞レベルでがんの増殖または拡散を停止または遅らせることによって機能する。
モノクローナル抗体は、例えば、がん細胞の外側及び／またはがんの周囲の領域で特異的な標的をブロックする。ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質を過剰発現する腫瘍に対して有効なトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、及び表皮増殖因子受容体阻害剤抗腫瘍薬であるセツキシマブ（エルビタックス（登録商標））などの抗体療法は、例えば、再発率、無増悪生存期間、全生存期間などの臨床転帰にかなりの改善をもたらした。
小分子薬は特異的な標的に対して設計されている。例えば、血管新生阻害剤は、腫瘍周辺の組織が血管を形成するのを防ぎ、それによって腫瘍を飢餓状態にする（例えば、ベバシズマム（アバスチン（登録商標））、メシル酸イマチニブ（グリベッく（商標））、タモキシフェンは、ＶＥＧＦを介した血管新生を減弱する（ＥＧＦを介した抗血管新生効果（ＭｃＮａｍａｒａ，ＤＡ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｏｎｃｏｌ． （２００１） ２７（８）： ７１４－７１８）。
免疫療法は、物質を使用して免疫系を刺激または抑制し、体ががん、感染症、その他の疾患と戦うのを助ける治療法の一種である。一部の種類の免疫療法は、免疫系の特定の細胞のみを標的とする。他のものはより一般的に免疫系に影響を及ぼす。
抗がん免疫療法は、長年にわたって達成されていない目標であった。１つの困難性は、標的抗原がしばしばがん細胞と正常細胞の両方に見られる組織特異的分子であり、免疫を誘発しないか、細胞殺傷に関して非特異性を示さないことである（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｗｏｌｃｈｏｋ ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈｐｔ ５，６７－１２１ （２００７））。さらに、腫瘍細胞には、免疫応答を誘発する抗原の発現の喪失、主要組織適合遺伝子（ＭＨＣ）クラスＩＩの欠如、及びＭＨＣクラスＩ発現の下方制御など、免疫認識を困難にする特徴がある。これらの特徴は、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の両方による腫瘍細胞の非認識をもたらす可能性がある（同上）。腫瘍はまた、免疫抑制性サイトカインの産生などの能動的なメカニズムを介して検出を回避する可能性がある（同上））。
樹状細胞ワクチンは、抗原と樹状抗原提示細胞（ＡＰＣ）で作られたワクチンである。腫瘍量を特異的に減少させることができ、腫瘍再発を制御するための免疫記憶を誘導することができる腫瘍特異的エフェクターＴ細胞を誘導するためのＤＣを含むワクチン接種戦略が開発された。例えば、造血前駆細胞または単球をサイトカインの組み合わせとともに培養することによってエクスビボで生成されたＤＣは、１０年を超えてがん患者の治療ワクチンとして試験されてきた（Ｕｅｎｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． （２０１０） ２３４： １９９－２１２）。前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）と顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ ＣＳＦ）の融合タンパク質で短期間培養された濃縮された血液ＡＰＣに基づく細胞製品ある、シプリューセル－Ｔ（ＡＰＣ ８０１５としても知られる）による転移性前立腺癌の治療は、第ＩＩＩ相試験で約４か月延長された生存期間中央値をもたらした（（Ｈｉｇａｎｏ Ｃ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ （２００９） １１５： ３６７０－３６７９；Ｋａｎｔｏｆｆ Ｐ Ｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． （２０１０） ３６３： ４１１－４２２）。この研究は、ＤＣベースのワクチンは安全であり、腫瘍抗原に特異的な循環ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大を誘導できると結論付けた。この研究及び同様の研究の結果、シプリューセル－Ｔは米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって転移性前立腺癌の治療として承認され、それにより次世代の細胞性免疫療法製品の臨床開発と規制の道を切り開いている（Ｐａｌｕｃｋａ Ｋ ａｎｄ Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ Ｊ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ （Ａｐｒｉｌ ２０１２） １２： ２６５－２７６）。
ＤＣ－腫瘍細胞融合は、親腫瘍細胞に由来する関連する腫瘍関連抗原を発現し、そのような抗原を処理して免疫系の適切な細胞に提示する能力も有するハイブリッド細胞を生成するために開発された。このようなＤＣ－腫瘍細胞融合は、より多様な腫瘍抗原を提供するが、おそらく要求される自家成分、ＤＣ細胞の成熟によって引き起こされる製品の不均一性、及びロードされる抗原の変動のために、ヒトの治験では限られた成功しか収めていない（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｍ．，Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ／ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｏｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ９：７，１５４５－１５４８；Ｊｕｌｙ ２０１３；Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｌ．，Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ： Ａｒｅ Ｗｅ Ｍａｋｉｎｇ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ？，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３ ４： ４５４）。
免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ－１及びＣＴＬＡ４阻害剤など）は、能動的な宿主免疫応答の個別のチェックポイントをブロックし、内因性の抗がん免疫応答を持続させることが報告されている。本明細書で使用される場合、「免疫チェックポイント」という用語は、自己寛容を維持するために必要であり、免疫応答の持続時間及び程度を調節して正常組織への損傷を最小限に抑える一連の抑制性経路を指す。ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイント分子は、腫瘍微小環境におけるＴ細胞応答の調節に役割を果たす細胞表面シグナル伝達受容体である。腫瘍細胞は、それらの発現と活性を上方制御することにより、これらのチェックポイントを利用して利益を得ることが示されている。免疫抵抗のメカニズムとしていくつかの免疫チェックポイント経路を指揮する腫瘍細胞の能力により、免疫細胞の分子に結合してそれらを活性化または不活性化するチェックポイント阻害剤が免疫応答の阻害を軽減する可能性があると仮定されている。最近の発見により、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＣＣＲ４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ、Ａ２ＡＲなどの免疫チェックポイントまたは標的が免疫回避に関与するタンパク質として特定されている。ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１受容体またはそのリガンドＰＤ－Ｌ１に対する抗体を含む特異的な免疫チェックポイント阻害剤は、診療所においてさまざまながんで印象的な結果を生み出し、複数の腫瘍の適応症であり、さらに多くの登録試験が進行中である、ヤーボイ（商標）（イピリムマブ；ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト）、オプジーボ（商標）（ニボルマブ；ＰＤ－１アンタゴニスト）及びキイトルーダ（商標）（ペムブロリズマブ；ＰＤ－１アンタゴニスト）のＦＤＡ承認をもたらした。
例えば、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーで免疫抑制受容体であるＴＩＧＩＴは、腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋ＴＩＬで過剰発現し、Ｔ細胞の増殖と活性化の抑制に重要な役割を果たし、腫瘍細胞の免疫回避、及び抗ウイルス免疫応答の阻害に関与している。抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体ＯＭＰ－３１３Ｍ３２は、この免疫チェックポイントを標的とし、Ｔ細胞の下方制御を防ぐ。投与すると、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体ＯＭＰ－３１３Ｍ３２は、Ｔ細胞を含むさまざまな免疫細胞で発現するＴＩＧＩＴに結合し、ＴＩＧＩＴとそのリガンドＣＤ１１２（ネクチン－２；ポリオウイルス受容体関連－２；ＰＶＲＬ２）及びＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体；ＰＶＲ；ネクチン様タンパク質５；ＮＥＣＬ－５）との相互作用を防ぐ。これにより、ＣＤ１１２及びＣＤ１５５は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞などの免疫細胞で発現する共刺激受容体ＣＤ２２６（ＤＮＡＸアクセサリー分子－１；ＤＮＡＭ－１）と自由に相互作用し、ＣＤ２２６の二量体化とＣＤ２２６を介したシグナル伝達をもたらす。これにより免疫系が活性化され、がん細胞に対してＴ細胞性免疫応答が発揮される。
膜貫通タンパク質及び免疫チェックポイント受容体であるＴＩＭ－３は、腫瘍を介した免疫抑制に関連している。抑制性Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞免疫グロブリン、及びムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ－３；ＴＩＭ３；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２；ＨＡＶＣＲ２）に対するモノクローナル抗体である、抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体ＴＳＲ－０２２、ならびにＴＩＭ－３に対する抗体である抗ＴＩＭ－３抗体ＢＭＳ－９８６２５８は、潜在的な免疫チェックポイント阻害及び抗腫瘍活性を有する。投与すると、抗ＴＩＭ－３モノクローナル抗体ＴＳＲ－０２２は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む特定のＴ細胞に発現するＴＩＭ－３に結合する。これにより、Ｔ細胞の阻害が無効になり、抗原特異的なＴリンパ球が活性化され、細胞傷害性Ｔ細胞を介した腫瘍細胞の溶解が促進され、腫瘍の増殖が抑制される。
ＬＡＧ－３は免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーであり、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩに結合する。ＴＩＬでのＬＡＧ－３の発現は、腫瘍を介した免疫抑制に関連している。
レラトリマブ（以前はＢＭＳ－９８６０１６、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂとして知られていた）は、潜在的な免疫チェックポイント阻害及び抗腫瘍活性を持つ、阻害受容体であるリンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）に対するモノクローナル抗体である。投与すると、レラトリマブは腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）上のＬＡＧ－３に結合し、抗原特異的Ｔリンパ球を活性化し、細胞傷害性Ｔ細胞を介した腫瘍細胞溶解を促進し、腫瘍増殖を抑制する。
抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体ＬＡＧ５２５は、潜在的な免疫チェックポイント阻害及び抗腫瘍活性を持つ、抑制性受容体であるリンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）に対するヒト化モノクローナル抗体である。投与すると、抗ＬＡＧ－３モノクローナル抗体ＬＡＧ５２５は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に発現するＬＡＧ－３に結合し、腫瘍細胞に発現する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子との結合をブロックする。これにより、抗原特異的なＴリンパ球が活性化され、細胞傷害性Ｔ細胞を介した腫瘍細胞の溶解が促進され、腫瘍の増殖が抑制される。免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーであり、さまざまな免疫細胞で発現するＬＡＧ－３は、細胞増殖とＴ細胞の活性化を負に調節する。ＴＩＬでのＬＡＧ－３の発現は、腫瘍を介した免疫抑制に関連している。
抗ＬＡＧ３モノクローナル抗体ＴＳＲ－０３３は、潜在的な免疫チェックポイント阻害及び抗腫瘍活性を持つ、抑制性受容体であるリンパ球活性化遺伝子－３タンパク質（ＬＡＧ３；ＬＡＧ－３）に対するヒト化免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）モノクローナル抗体である。
ＴＩＧＩＴ標的化剤ＭＫ－７６８４は、潜在的な免疫チェックポイント阻害及び抗腫瘍活性を持つ、共阻害分子と免疫チェックポイント阻害剤Ｔ細胞免疫グロブリン（Ｉｇ）及び免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）ドメイン（ＴＩＧＩＴ；ＩｇとＩＴＩＭドメインをもつＴ細胞免疫受容体；Ｔ細胞免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメイン）を標的とするアンタゴニスト薬である。投与すると、ＭＫ－７６８４はさまざまな免疫細胞、特に腫瘍浸潤Ｔリンパ球（ＴＩＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で発現するＴＩＧＩＴを標的にして結合し、それによってＴＩＧＩＴと、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び特定のがん細胞で発現する、そのリガンドＣＤ１１２（ネクチン－２；ポリオウイルス受容体関連－２；ＰＶＲＬ２）及びＣＤ１５５（ポリオウイルス受容体；ＰＶＲ；ネクチン様タンパク質５；ＮＥＣＬ－５）との相互作用を防ぐ。これにより、ＣＤ１１２及びＣＤ１５５と、ＮＫ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞などの免疫細胞上で発現する共刺激受容体ＣＤ２２６（ＤＮＡＸアクセサリー分子－１；ＤＮＡＭ－１）との相互作用を増強し、ＣＤ２２６を介したシグナル伝達を活性化する。これにより免疫系が活性化され、がん細胞に対してＴ細胞性免疫応答が発揮される。
しかしながら、この治療法は、既存の抗腫瘍免疫応答が患者内に存在する場合にのみ成功し得る（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．，Ｔｈｅ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ： Ｃａｎｃｅｒ，Ｖｏｌ． １２，Ａｐｒｉｌ ２０１２，２５３）。
キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）は、合成生物学を使用してＴ細胞を特異的な細胞表面腫瘍抗原に再誘導しようとする。Ｔ細胞の遺伝子改変は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のトランスジェニック発現による腫瘍抗原認識を与えるために使用される。ＣＡＲは、Ｔ細胞に導入して腫瘍抗原を標的にすることができるように操作された分子である（Ｆｒｅｙ，Ｎ．Ｖ．，Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｔｈｅ Ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ （２０１６）；３０（１）） ｐｉｉ ２１９２８１）。ＣＡＲ Ｔ細胞は、血液悪性腫瘍及び程度は低いが固形腫瘍に対してある程度の有効性があることが示されている。しかしながら、ＣＡＲ Ｔ療法は、サイトカイン放出症候群、神経毒性、非腫瘍認識、及びアナフィラキシーなど、いくつかの種類の毒性を引き起こすことが示されている（Ｂｏｎｉｆａｎｔ ＣＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ＣＡＲ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ － Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ （２０１６） ３，１６０１１）。
細胞ワクチンもがん治療として提案されている。ＧＶＡＸ（商標）は、腫瘍細胞の自家または同種異系集団のいずれかの中のＧＭ－ＣＳＦ遺伝子形質導入腫瘍ワクチンである。遺伝子改変腫瘍細胞のＧＭ－ＣＳＦ分泌は、ワクチン部位でのサイトカイン放出を刺激して抗原提示細胞を活性化し、腫瘍特異的細胞免疫応答を誘導すると考えられていた（Ｅａｇｅｒ，Ｒ． ＆ Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ，Ｊ．，ＧＭ－ＣＳＦ Ｇｅｎｅ－Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ Ｔｕｍｏｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ． １２，Ｎｏ． １，１８ （Ｊｕｌｙ ２００５））。しかしながら、ＧＶＡＸ（商標）は限られた臨床応答しか得られなかった。
腫瘍細胞株は幅広い抗原を有しており、その多くは特定の腫瘍タイプに共通しており、一部は腫瘍間で共有されている。数十年にわたる研究の結果として定義された多くの免疫調節の構成要素を使用して、これらの腫瘍細胞株を遺伝子操作することができる。少なくとも２／３／４の免疫調節因子を発現するように改変されたそのような同種異系腫瘍細胞株との関連での免疫活性化への同種異系アプローチが記載されている。
記載された発明は、インビトロ（またはインビボ）で活性化された単核球の養子移入による効果的な腫瘍細胞殺傷のための方法を提供する。本明細書に記載の方法は、少なくとも３つの免疫調節ペプチドをコードする同種異系の操作された白血球刺激細胞（ＥＮＬＳＴ（商標）細胞）とのそれらの共インキュベーションに続く単核球のインビトロ免疫活性化を含む。細胞との接触により、単核球は刺激されて分化し、増殖し、活性化された表現型を獲得する。活性化された単核球、またはシリアルキラー細胞からなるその亜集団は、患者への細胞製品の受動的養子移入に有用である。細胞は生理学的な方法で活性化されるため、刺激された細胞はそれらの細胞型の恒常性制御メカニズムを保持する。任意選択で、シリアルキラー細胞を含む亜集団を不死化することは、無限の供給を生み出す可能性を表す。
一態様によれば、活性化及び拡大されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化及び拡大された単核球の集団を含む細胞製品を含む組成物による、記載された本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞集団のインビトロ活性化と、それに続く免疫抑制レジメンンの影響下にないがん患者の受動免疫化の方法であって、滅菌状態下で：（ａ）（１）生体試料から単核球（ＭＮＣ）の集団を単離すること；（２）１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現し、免疫調節分子のコアグループがＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）である３つの免疫調節分子のコアグループを安定して発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞の集団を含む操作された白血球刺激細胞の集団を調製すること；（３）ステップ（ａ）（１）のＭＮＣの集団を、インビトロでステップ（ａ）（２）の操作された白血球刺激細胞と接触させることであって、接触させることが、細胞傷害性シリアルキラー細胞の相乗的拡大を刺激して、活性化された細胞傷害性シリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化されたＭＮＣの集団を形成するのに効果的である、接触させることによって、インビトロで免疫応答を誘導することと、（ｂ）活性化されたＭＮＣを培養して、拡大及び活性化されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む拡大及び活性化されたＭＮＣの集団を含む細胞製品を形成することにより、インビトロで活性化されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化されたＭＮＣの集団を拡大することと、（ｃ）活性化及び拡大された細胞製品の個々の用量を含む単位用量パッケージを調製すること、単位用量パッケージを凍結すること、及び凍結された単位用量パッケージを凍結保存に保存することと、（ｄ）制御された条件下で細胞製品を含む治療量の凍結された単位用量パッケージを解凍することと、（ｅ）任意選択で、凍結及び解凍された細胞製品を薬学的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物を形成することと、（ｆ）活性化及び拡大された細胞製品を含む（ｄ）の細胞製品または（ｅ）の医薬組成物の治療量を対象に投与することであって、治療量が腫瘍量を減少させるのに有効である、投与することと、を含む、方法を提供する。方法の一実施形態によれば、ヒトの発現に最適化された野生型ＯＸ４０リガンドコドンのアミノ酸配列は配列番号１０８であり、ヒトの発現に最適化された野生型ＣＤ２７リガンドコドンのアミノ酸配列は配列番号１０９であり、ヒトの発現に最適化された野生型ＣＤ２８リガンドコドンのアミノ酸配列は配列番号１１０、配列番号１１１、またはその両方である。別の実施形態によれば、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現し、３つの免疫調節分子のコアグループを発現するように遺伝子操作された操作された白血球刺激細胞集団は、３～２５個の免疫調節因子（「Ｒ群」）を含む追加の数の免疫調節分子を発現するようにさらに遺伝子操作されている。別の実施形態によれば、ＣＤ２８リガンドは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含む。別の実施形態によれば、コア免疫調節因子ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７リガンド、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンドを安定して発現するように形質導入または形質転換された操作された白血球刺激細胞は、未改変の対照細胞株と比較して、末梢血単核球において、活性化ＣＤ８＋細胞の２対数拡大を相乗的に誘導するのに有効である。別の実施形態によれば、ステップ（ｂ）（ｉ）において、活性化されたＭＮＣの亜集団は、フローサイトメトリーによって同定及び単離される。別の実施形態によれば、活性化及び拡大されたＭＮＣは、ＮＫ細胞集団、ＮＫＴ細胞集団、ＣＤ８ ＣＴＬ細胞集団、ＣＤ４細胞集団、及びＴＣＲγδ細胞集団のうちの１つ以上を含む活性化及び拡大されたシリアルキラー細胞の集団を含む。別の実施形態によれば、単核球の集団は、末梢血または臍帯血に由来する。別の実施形態によれば、単核球の集団は、対象に対して自家である。別の実施形態によれば、単核球の集団は、対象に対して同種異系である。別の実施形態によれば、活性化及び拡大されたシリアルキラー細胞の集団の細胞傷害性シリアルキラー活性は、正常細胞に影響を及ぼさず、遺伝子操作された白血球刺激細胞のがん抗原に特異的である。活性化及び拡大されたシリアルキラー細胞の集団（複数可）の細胞傷害性シリアルキラー活性は、正常細胞に影響を及ぼさず、がんの種類に関係なくがん細胞を殺傷するのに効果的である。別の実施形態によれば、投与することは、免疫チェックポイントの適合性のある阻害剤と組み合わせて行われる。別の実施形態によれば、適合性のある免疫チェックポイントは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、及びＬＡＧ－３のうちの１つ以上を含む。
別の態様によれば、記載された発明は、活性化された細胞傷害性シリアルキラー細胞の亜集団を含む拡大及び活性化された単核球の集団を含む細胞製品であって、（ａ）生体試料から単核球（ＭＮＣ）の集団を単離することと；（２）１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現し、免疫調節ペプチドのコアグループがＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）である３つの免疫調節分子のコアグループを発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞の集団を含む操作された白血球刺激細胞の集団を調製することと；（ｃ）ステップ（ａ）のＭＮＣの集団を、インビトロでステップ（ｂ）の操作された白血球刺激細胞と接触させて、活性化された細胞傷害性シリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化されたＭＮＣの集団を形成することと；（ｄ）活性化されたＭＮＣを培養して、拡大及び活性化されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化及び拡大されたＭＮＣの集団を含む細胞製品を形成することにより、インビトロで活性化されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化されたＭＮＣの集団を拡大することと、を含むプロセスによって調製された細胞製品を提供する。プロセスによって調製された細胞製品の一実施形態によれば、活性化及び拡大された細胞傷害性シリアルキラー細胞の集団を含む活性化及び拡大されたＭＮＣは、ＮＫ細胞集団、ＮＫＴ細胞集団、ＣＤ８ ＣＴＬ細胞集団、ＣＤ４細胞集団、及びＴＣＲγδ細胞集団のうちの１つ以上を含む。プロセスによって調製された細胞製品の別の実施形態によれば、細胞傷害性シリアルキラー細胞は殺腫瘍性である。プロセスによって調製された細胞製品の別の実施形態によれば、ヒトの発現に最適化された野生型ＯＸ４０リガンドコドンのアミノ酸配列は配列番号１０８であり、ヒトの発現に最適化された野生型ＣＤ２７リガンドコドンのアミノ酸配列は配列番号１０９であり、ヒトの発現に最適化された野生型ＣＤ２８リガンドコドンのアミノ酸配列は配列番号１１０、配列番号１１１、またはその両方である。プロセスによって調製された細胞製品の別の実施形態によれば、ステップ（ｃ）での接触させることは、ＣＤ８＋細胞の２対数拡大を相乗的に誘導するのに効果的である。プロセスによって調製された細胞製品の別の実施形態によれば、生体試料は末梢血または臍帯血である。
本発明のこれら及び他の利点は、以下の詳細な説明を参照することにより、当業者には明らかであろう。
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開の複写は、請求及び必要な料金の支払いにより特許庁より提供される。
ベクター１～７の概略図を示す。 ｓｃＦｖ－抗ビオチン－Ｇ３ヒンジ－ｍＩｇＧ１ ベクター１の構成の概略図を示す。 全長抗ビオチン－Ｇ３ヒンジ－ｍＩｇＧ１ ベクター２の構成の概略図を示す。 ｓＧＭ－ＣＳＦ／ｉｒｅｓ／ｍＦＬＴ３Ｌ ベクター３の構成の概略図を示す。 ｓＦＬＴ３Ｌ／ｉｒｅｓ／（ＦＬＴ３シグナル－ＧＭ－ＣＳＦ－Ｔｍ） ベクター４の構成の概略図を示す。 ｍＣＤ４０Ｌ ベクター５の構成の概略図を示す。 ｍＴＮＦａ ベクター６の構成の概略図を示す。 ｍＲＡＮＫＬ／ｉｒｅｓ／ＦＬＴ３シグナル－Ｖ５－ｓｃＦＶ抗ビオチン－Ｔｍベクター７の構成の概略図を示す。 ベクター４４の概略図を示す。 ベクター９７の概略図を示す。 ベクター８４の概略図を示す。 ベクター２９の概略図を示す。 ベクター１０７の概略図を示す。 ベクター１１６の概略図を示す。 ベクター８６の概略図を示す。 ベクター１８の概略図を示す。 ベクター１７の概略図を示す。 ベクター９８の概略図を示す。 ベクター３０の概略図を示す。 ベクター１０９の概略図を示す。 ベクター１０６の概略図を示す。 ベクター１６の概略図を示す。 ベクター８３の概略図を示す。 ベクター３１の概略図を示す。 ベクター１２の概略図を示す。 ベクター９９の概略図を示す。 ベクター１２１の概略図を示す。 ベクター１０５の概略図を示す。 ベクター３２の概略図を示す。 ベクター３７の概略図を示す。 ベクター２２の概略図を示す。 ベクター１９の概略図を示す。 ベクター２０の概略図を示す。 ベクター８９の概略図を示す。 ベクター２１の概略図を示す。 ベクター２３の概略図を示す。 ベクター１０８の概略図を示す。 ベクター１５の概略図を示す。 ベクター１２４の概略図を示す。 ベクター６５の概略図を示す。 ベクター６４の概略図を示す。 ベクター８８の概略図を示す。 ベクター９６の概略図を示す。 ベクター１４の概略図を示す。 ベクター１１９の概略図を示す。 ベクター１２０の概略図を示す。 ベクター４５の概略図を示す。 ベクター６０の概略図を示す。 ベクター５９の概略図を示す。 ベクター８の概略図を示す。 ベクター１２８の概略図を示す。 ベクター３５の概略図を示す。 Ａは、混合リンパ球腫瘍反応アッセイにおいて、親株ＳＫＭＥＬ２（５３Ａ）を、ＰＢＭＣとインキュベートした後のサイズ及び粒度のフローサイトメトリーフォワード（ＦＳＣ）及びサイドスキャッター（ＳＳＣ）のプロットを示す。点線の楕円形はリンパ球ゲートを示す。Ｂは、混合リンパ球腫瘍反応アッセイにおいて、免疫調節因子１４、１８、及び３０（図５３Ｂ）を含むＳＫＭＥＬ－２を、ＰＢＭＣとインキュベートした後のサイズ及び粒度のフローサイトメトリーフォワード（ＦＳＣ）及びサイドスキャッター（ＳＳＣ）のプロットを示す。点線の楕円形はリンパ球ゲートを示す。Ｃは、混合リンパ球腫瘍応答アッセイにおいて、親細胞株とのＰＢＭＣのインキュベーション後のＣＤ８集団を示す。グラフの下のパネルにある点線の円は、ＣＤ８ゲートを示す。親細胞株（ＳＫＭＥＬ－２）との共培養後のＰＢＭＣでは、ほぼ同数のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞が存在するが、免疫調節因子ＯＸ４０リガンド（ベクター１４）、ＣＤ２７リガンド（ベクター１８）、及びＣＤ２８リガンド（ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むベクター３０）を発現するよう操作された、操作された白血球刺激細胞（「ＥＮＬＳＴ（商標）細胞」）との共培養後のＰＢＭＣでは、約２対数の数のＣＤ８＋Ｔ細胞が存在する。ＣＤ８＋Ｔ細胞のこの大幅な増加は、３つのシグナルすべてが同時に送達される場合にのみ明らかであり、それぞれのシグナルが個別に送達される場合には存在しないため、これまで認識されていなかった相乗的シグナル伝達の例を提供する。Ｄは、混合リンパ球腫瘍応答アッセイにおいて、免疫調節因子ＯＸ４０リガンド（ベクター１４）、ＣＤ２７リガンド（ベクター１８）、及びＣＤ２８リガンド（ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むベクター３０）をコードする組換えＤＮＡ配列でトランスフェクトまたは形質導入されたＳＫＭＥＬ２とのＰＢＭＣのインキュベーション後のＣＤ８集団を示す。グラフの下のパネルにある点線の円は、ＣＤ８ゲートを示す。親細胞株（ＳＫＭＥＬ－２）との共培養後のＰＢＭＣでは、ほぼ同数のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞が存在するが、免疫調節因子ＯＸ４０リガンド（ベクター１４）、ＣＤ２７リガンド（ベクター１８）、及びＣＤ２８リガンド（ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むベクター３０）を発現するよう操作された、操作された白血球刺激細胞（「ＥＮＬＳＴ（商標）細胞」）との共培養後のＰＢＭＣでは、約２対数の数のＣＤ８＋Ｔ細胞が存在する。ＣＤ８＋Ｔ細胞のこの大幅な増加は、３つのシグナルすべてが同時に送達される場合にのみ明らかであり、それぞれのシグナルが個別に送達される場合には存在しないため、これまで認識されていなかった相乗的シグナル伝達の例を提供する。 位相差顕微鏡及びフローサイトメトリーによりインビトロで、未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２親腫瘍細胞株による誘導と比較した、ＳＫ－ＭＥＬ－２由来の操作された白血球刺激細胞（ＥＮＬＳＴ（商標）細胞）によるＰＢＭＣリンパ球集団誘導の特性評価の結果を示す。未改変の親５Ｋ－ＭＥＬ－２細胞で誘導された９日目のＰＢＭＣを示す。左、顕微鏡。右、フローサイトメトリー。フローサイトメトリーにおける楕円形の輪郭は、生細胞の未改変のＳＫＭＥＬ２親腫瘍細胞に対応する。 位相差顕微鏡及びフローサイトメトリーによりインビトロで、未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２親腫瘍細胞株による誘導と比較した、ＳＫ－ＭＥＬ－２由来の操作された白血球刺激細胞（ＥＮＬＳＴ（商標）細胞）によるＰＢＭＣリンパ球集団誘導の特性評価の結果を示す。ＳＫ－ＭＥＬ－２由来の１４－１８－３０ＥＮＬＳＴ（商標）細胞で誘導された９日目のＰＢＭＣを示す。左、顕微鏡、右、フローサイトメトリー。矢印は、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞が誘導されたＰＢＭＣによって排除されることを示す。 サイズと粒度のフローサイトメトリーフォワード（ＦＳＣ）及びサイドスキャッター（ＳＳＣ）プロットによる、ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞を伴う、１４－１８－３０を発現するＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による、ＰＢＭＣのインビトロ活性化後のＰＢＭＣの殺腫瘍特性の特性評価の結果を示す。５日目の二次混合リンパ球腫瘍応答アッセイを示す。未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２細胞と共培養したＳＫ－ＭＥＬ－２由来のＥＮＬＳＴ（商標）細胞。 サイズと粒度のフローサイトメトリーフォワード（ＦＳＣ）及びサイドスキャッター（ＳＳＣ）プロットによる、ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞を伴う１４－１８－３０を発現するＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による、ＰＢＭＣのインビトロ活性化後のＰＢＭＣの殺腫瘍特性の特性評価の結果を示す。５日目の二次混合リンパ球腫瘍応答アッセイを示す。未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２細胞と共培養したＳＫ－ＭＥＬ－２由来のＥＮＬＳＴ（商標）細胞活性化ＭＮＣ。 サイズと粒度のフローサイトメトリーフォワード（ＦＳＣ）及びサイドスキャッター（ＳＳＣ）プロットによる、ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞を伴う１４－１８－３０を発現するＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による、ＰＢＭＣのインビトロ活性化後のＰＢＭＣの殺腫瘍特性の特性評価の結果を示す。５日目の二次混合リンパ球腫瘍応答アッセイを示す。未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞と共培養したＳＫ－ＭＥＬ－２由来のＥＮＬＳＴ（商標）細胞。 サイズと粒度のフローサイトメトリーフォワード（ＦＳＣ）及びサイドスキャッター（ＳＳＣ）プロットによる、ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞を伴う１４－１８－３０を発現するＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による、ＰＢＭＣのインビトロ活性化後のＰＢＭＣの殺腫瘍特性の特性評価の結果を示す。５日目の二次混合リンパ球腫瘍応答アッセイを示す。未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞と共培養したＳＫ－ＭＥＬ－２由来のＥＮＬＳＴ（商標）細胞活性化ＭＮＣ。 サイズと粒度のフローサイトメトリーフォワード（ＦＳＣ）及びサイドスキャッター（ＳＳＣ）プロットによる、Ｍ１４細胞を伴う１４－１８－３０を発現するＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による、ＰＢＭＣのインビトロ活性化後のＰＢＭＣの殺腫瘍特性の特性評価の結果を示す。５日目の二次混合リンパ球腫瘍応答アッセイを示す。未改変のＭ１４細胞と共培養したＳＫ－ＭＥＬ－２由来のＥＮＬＳＴ（商標）細胞。 サイズと粒度のフローサイトメトリーフォワード（ＦＳＣ）及びサイドスキャッター（ＳＳＣ）プロットによる、Ｍ１４細胞を伴う１４－１８－３０を発現するＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による、ＰＢＭＣのインビトロ活性化後のＰＢＭＣの殺腫瘍特性の特性評価の結果を示す。５日目の二次混合リンパ球腫瘍応答アッセイを示す。未改変のＭ１４細胞と共培養したＳＫ－ＭＥＬ－２由来のＥＮＬＳＴ（商標）細胞活性化ＭＮＣ。 ＰＢＭＣ集団のＣｙＴＯＦ質量サイトメトリー単一細胞表現型分析マップを示す。 一次混合リンパ球腫瘍反応アッセイで９日後の、親ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞によるＰＢＭＣ誘導後のＣｙＴＯＦ染色のｖｉｓＮＥ密度コンタープロットを示す。親ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞による誘導後のＰＢＭＣ亜集団シフトを示す。ＮＫ細胞集団と骨髄細胞集団が存在しないことに留意されたい。 一次混合リンパ球腫瘍反応アッセイで９日後の、免疫調節因子発現ＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞によるＰＢＭＣ誘導後のＣｙＴＯＦ染色のｖｉｓＮＥ密度コンタープロットを示す。ベクター３で形質導入またはトランスフェクトされたＥＮＬＳＴ（商標）細胞による誘導後のＰＢＭＣ亜集団シフトを示し、Ｂ細胞及び骨髄性細胞の誘導を示す。 一次混合リンパ球腫瘍反応アッセイで９日後の、免疫調節因子発現ＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞によるＰＢＭＣ誘導後のＣｙＴＯＦ染色のｖｉｓＮＥ密度コンタープロットを示す。ベクター３及び４で形質導入またはトランスフェクトされたＥＮＬＳＴ（商標）細胞による誘導後のＰＢＭＣ亜集団シフトを示し、Ｂ細胞の誘導を示す。 一次混合リンパ球腫瘍反応アッセイで９日後の、免疫調節因子発現ＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞によるＰＢＭＣ誘導後のＣｙＴＯＦ染色のｖｉｓＮＥ密度コンタープロットを示す。ベクター３、４、及び５で形質導入またはトランスフェクトされたＥＮＬＳＴ（商標）細胞による誘導後のＰＢＭＣ亜集団シフトを示し、Ｂ細胞及び骨髄細胞の誘導を示す。 一次混合リンパ球腫瘍反応アッセイで９日後の、免疫調節因子発現ＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞によるＰＢＭＣ誘導後のＣｙＴＯＦ染色のｖｉｓＮＥ密度コンタープロットを示す。ベクター３、４、及び６で形質導入またはトランスフェクトされたＥＮＬＳＴ（商標）細胞による誘導後のＰＢＭＣ亜集団シフトを示す。 Ａは、フローサイトメトリーによって、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞を含む１４－１８－３０と以前に共培養されたＰＢＭＣが、未改変の腫瘍細胞を溶解することができることを示す。１４－１８－３０ＥＮＬＳＴ（商標）細胞との共培養によって以前に活性化されたＰＢＭＣの少なくとも２つの異なる亜集団は、未改変の腫瘍細胞の細胞溶解が可能である。初代混合リンパ球腫瘍細胞アッセイにおいて、１４－１８－３０発現ＥＮＬＳＴ（商標）細胞との９日間の共培養後のＰＢＭＣのＣＤ５６、ＣＤ３、及びＣＤ８の選別ゲートを示す。Ｂは、位相差顕微鏡法によって、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞を含む１４－１８－３０と以前に共培養されたＰＢＭＣが、未改変の腫瘍細胞を溶解することができることを示す。１４－１８－３０ＥＮＬＳＴ（商標）細胞との共培養によって以前に活性化されたＰＢＭＣの少なくとも２つの異なる亜集団は、未改変の腫瘍細胞の細胞溶解が可能である。ｔ＝０でのＣＤ５６＋ＣＤ３＋と未改変のＳＫＭＥＬ２を示す。黄色い矢印は、より小さい細胞がリンパ球であり、より大きい細胞が同種異系腫瘍細胞であることを示す。Ｃは、位相差顕微鏡法によって、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞を含む１４－１８－３０と以前に共培養されたＰＢＭＣが、未改変の腫瘍細胞を溶解することができることを示す。１４－１８－３０ＥＮＬＳＴ（商標）細胞との共培養によって以前に活性化されたＰＢＭＣの少なくとも２つの異なる亜集団は、未改変の腫瘍細胞の細胞溶解が可能である。ｔ＝８時間でのＣＤ５６＋ＣＤ３＋と未改変のＳＫＭＥＬ２を示す。黄色い矢印は、同種異系腫瘍細胞を取り巻く細胞溶解細胞のクラスターを示し、同種異系腫瘍細胞のバックグラウンドが除去されていることを示す。Ｄは、位相差顕微鏡法によって、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞を含む１４－１８－３０と以前に共培養されたＰＢＭＣが、未改変の腫瘍細胞を溶解することができることを示す。１４－１８－３０ＥＮＬＳＴ（商標）細胞との共培養によって以前に活性化されたＰＢＭＣの少なくとも２つの異なる亜集団は、未改変の腫瘍細胞の細胞溶解が可能である。ｔ＝０でのＣＤ５６－ＣＤ３＋ＣＤ８＋と未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２を示す。黄色い矢印は、より小さい細胞がリンパ球であり、より大きい細胞が同種異系腫瘍細胞であることを示す。Ｅは、位相差顕微鏡法によって、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞を含む１４－１８－３０と以前に共培養されたＰＢＭＣが、未改変の腫瘍細胞を溶解することができることを示す。１４－１８－３０ＥＮＬＳＴ（商標）細胞との共培養によって以前に活性化されたＰＢＭＣの少なくとも２つの異なる亜集団は、未改変の腫瘍細胞の細胞溶解が可能である。ｔ＝８時間でのＣＤ５６－ＣＤ３＋ＣＤ８＋と未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２を示す。黄色い矢印は、同種異系腫瘍細胞を取り巻く細胞溶解細胞のクラスターを示し、同種異系腫瘍細胞のバックグラウンドが除去されていることを示す。 ＮＧＳマウスを使用した異種移植片処理研究の結果を示す箱ひげ図である。各ボックスの端は、上位四分位数と下位四分位数である。中央値はボックス内の垂直線でマークされ、ひげはボックスの外側の２本の線で、最高と最低の観測値まで伸びている。ヒト腫瘍細胞をＮＧＳ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ）マウスの側腹部に移植した。腫瘍を１５０ｍｍ3まで増殖させた。マウスを対照群と処理群の２つの群に分け、１群あたり６匹のマウスを使用した。３０日目（ｔ＝０）に、対照群のマウスにビヒクルのみを接種し、処理群のマウスに、１４－１８－３０発現ＥＮＬＳＴ（商標）細胞（「ＳＵＰＬＥＸＡ（商標）細胞」）によって活性化された３×１０6のＰＢＭＣを接種した。腫瘍サイズは、接種後３６日まで間隔を置いて測定された。２つの群間の発散は５日以内に現れた。２２日後、発散は統計的に有意になった（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜００５）。
定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「ペプチド」への言及は、１つ以上のペプチド、及び当業者に知られるその均等物などへの言及である。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、それが使用されている数の数値のプラスマイナス１０％を意味する。したがって、約５０％は４０％～６０％の範囲を意味する。
「活性化」または「リンパ球活性化」という用語は、ＲＮＡ、タンパク質、及びＤＮＡの合成、ならびにリンホカインの産生をもたらす特異的抗原、非特異的マイトジェン、または同種異系細胞によるリンパ球の刺激を指し、それは、様々なエフェクター及びメモリー細胞の増殖及び分化が後に続く。例えば、成熟Ｂ細胞は、その細胞表面免疫グロブリンＩｇによって認識されるエピトープを示す抗原との遭遇によって活性化され得る。活性化プロセスは抗原による膜Ｉｇ分子の架橋に依存する直接的なもの（架橋依存性Ｂ細胞活性化）、またはヘルパーＴ細胞との密接な相互作用と関連して最も効率的に起こる間接的なもの（「同族ヘルププロセス」）であり得る。Ｔ細胞の活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子の溝に結合したペプチドである同族のリガンドとの相互作用に依存している。受容体の結合によって動く分子事象は複雑である。いくつかのシグナル伝達経路を制御する一連の基質のチロシンリン酸化をもたらすチロシンキナーゼの活性化は、最も初期のステップ中に起こるらしい。これらには、ＴＣＲをｒａｓ経路に結び付ける一連のアダプタータンパク質、そのチロシンリン酸化がその触媒活性を高め、イノシトールリン脂質代謝経路に関与し、細胞内遊離カルシウム濃度の上昇及びプロテインキナーゼＣの活性化をもたらすホスホリパーゼＣγ１、ならびに細胞増殖及び分化を制御する一連の他の酵素が含まれる。Ｔ細胞の完全な応答性は、受容体結合に加えて、アクセサリー細胞により送達される共刺激活性、例えば抗ＡＰＣ上のＣＤ８０及び／またはＣＤ８６によるＴ細胞上のＣＤ２８の結合を必要とする。活性化されたＢリンパ球の可溶性産物は免疫グロブリン（抗体）である。活性化Ｔリンパ球の可溶性産物はリンホカインである。
本明細書で使用される場合、「能動免疫」という用語は、能動免疫の生成を指し、自然に獲得された感染または意図的なワクチン接種（人工能動免疫）から生じる免疫を意味する。能動免疫は、自然または人工のメカニズムのいずれかによって誘発することができる。
本明細書で使用される場合、哺乳動物、細胞、組織、器官、または生体液に適用される「投与」という用語及びそれがその様々な文法的形態は、外因性リガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬品、治療薬、診断薬、または組成物の、対象、細胞、組織、器官、または生体液などに対する接触を指すが、それらに限定されない。「投与」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、プラセボ、及び実験的方法を指すことができる。「投与」はまた、例えば、試薬、診断、結合組成物、または別の細胞による、細胞のインビトロ及びエクスビボの処理を包含する。
本明細書で使用される場合、「同種異系」という用語は、ドナー及びレシピエントが異なる遺伝子構成であるが、同じ種であることを意味する。本明細書で使用される場合、「同種異系細胞」は、細胞が投与される個体に由来しない、すなわち、レシピエント個体とは異なる遺伝的構成を有する細胞を指す。同種異系細胞は、一般に、細胞が投与されるレシピエント個体と同じ種から得られる。例えば、同種異系細胞は、本明細書に開示されるように、ヒト患者に投与するためのヒト細胞であり得る。本明細書で使用される場合、「同種異系シリアルキラー細胞集団」という用語は、同種異系のシリアルキラー細胞集団が投与されるレシピエント個体とは異なる遺伝子構成のドナーに由来するその構成細胞型（ＮＫ、ＮＫＴ、及びＣＴＬなど）を含むシリアルキラー細胞集団を指す。
本明細書で使用される場合、「アロ認識」という用語は、自己以外のＭＨＣ分子（ヒトではＨＬＡ）のＴ細胞による認識を指す。本明細書で使用される場合、「直接アロ認識」という用語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞がドナー抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の無傷のアロＨＬＡ分子（それぞれＨＬＡクラスＩＩ及びＩ）を認識するプロセスを指す。「間接的なアロ認識」という用語は、ＡＰＣが最初にドナー細胞を飲み込み、次いでドナー抗原を処理してレシピエントの免疫系に再提示するプロセスを指す。次いで、レシピエントＴ細胞は、レシピエントＨＬＡ分子と結合した処理されたドナーＨＬＡペプチドに応答する。
「アミノ酸残基」または「アミノ酸」または「残基」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び天然に存在するアミノ酸と同様に機能することができる天然アミノ酸の既知の類似体を含むがこれらに限定されない、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに組み込まれるアミノ酸を指すために互換的に使用される。アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸またはＤ－アミノ酸であり得る。アミノ酸は、ペプチドの半減期を増加させる、ペプチドの効力を増加させる、またはペプチドのバイオアベイラビリティを増加させるように変更される合成アミノ酸によって置き換えることができる。アミノ酸の１文字の指定は、本明細書で主に使用される。このような一文字の指定は次のとおりである：Ａはアラニンである；Ｃはシステインである；Ｄはアスパラギン酸である；Ｅはグルタミン酸である；Ｆはフェニルアラニンである；Ｇはグリシンである；Ｈはヒスチジンである；Ｉはイソロイシンである；Ｋはリジンである；Ｌはロイシンである；Ｍはメチオニンである；Ｎはアスパラギンである；Ｐはプロリンである；Ｑはグルタミンである；Ｒはアルギニンである；Ｓはセリンである；Ｔはトレオニンである；Ｖはバリンである；Ｗはトリプトファンである；Ｙはチロシンである。以下は互いに保存的な置換であるアミノ酸を含む群を表す：１）アラニン（Ａ）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５） イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
本明細書で使用される場合、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」という用語は、抗原を処理し、ナイーブＴ細胞を活性化するために必要な他の共刺激タンパク質とともに細胞表面にそれらのペプチド断片を提示することができる高度に特殊化された細胞を指す。主な抗原提示細胞は、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、Ｂ細胞である。
本明細書で使用される場合、「自家」という用語は、同じ個体に由来することを意味する。
本明細書で使用される場合、「オートクリンシグナル伝達」という用語は、細胞がそれ自体にまたは他の同一の型の隣接細胞に作用するシグナル分子を分泌する細胞シグナル伝達の一種を指す。
「結合」という用語とその他の文法形式は、化学物質間の永続的な引力を意味する。
「結合特異性」という用語は、特異的なパートナーに結合することと、他の分子に結合しないことの両方を含む。機能的に重要な結合は、低から高までの親和性の範囲で発生する可能性があり、設計要素は、望ましくない相互作用を抑制し得る。翻訳後修飾も、相互作用の化学的性質と構造を変えることができる。「無差別結合」は、ある程度の構造的可塑性を伴うことができ、その結果、異なるパートナーへの結合に重要な残基の異なるサブセットが生じ得る。「相対的結合特異性」は、生化学的システムにおいて、分子がその標的またはパートナーと異なって相互作用し、それによって個々の標的またはパートナーの識別性に応じてそれらに明確に影響を及ぼすという特徴である。
ＣＤ３（ＴＣＲ複合体）は、４つの異なる鎖で構成されるタンパク質複合体である。哺乳動物では、その複合体はＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及び２つのＣＤ３ε鎖を含み、これらはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びζ鎖と会合してＴリンパ球において活性化シグナルを生成する。同時に、ＴＣＲ、ζ鎖、及びＣＤ３分子はＴＣＲ複合体を構成する。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナル伝達能力に必須である免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）として知られる保存モチーフを含む。ＩＴＡＭがリン酸化されると、ＣＤ３鎖は、Ｔ細胞のシグナル伝達カスケードに関与するキナーゼであるＺＡＰ７０（ゼータ関連タンパク質）に結合することができる。
本明細書で使用される場合、「細胞株」という用語は、単一の細胞から発達した恒久的に確立された細胞培養物を意味し、したがって、無期限に増殖する均一な遺伝的及び機能的構成を有する細胞の集団からなる。
本明細書で使用される場合、「ケモカイン」という用語は、多様な免疫機能及び神経機能を有する低分子量（８～１１ｋＤａ）の構造的に関連するタンパク質のファミリーを構成する走化性サイトカインを指し（Ｍａｃｋａｙ Ｃ．Ｒ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ． ２： ９５－１０１，（２００１）；Ｙｏｕｎ Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． （２０００） Ｖｏｌ． １７７： １５０－１７４）、これらは、保存されたシステイン残基の相対位置に基づいて４つのサブファミリー（Ｃ、ＣＣ、ＣＸＣ、及びＣＸ３Ｃ）に分類できる（Ｒｏｓｓｉ Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０００） １８： ２１７－２４２）。ケモカインは、血液、リンパ節、及び組織の間の白血球の遊走を誘導するのに不可欠な分子である。それらは常に１つのタイプの受容体に制限されているわけではないため、複雑なシグナル伝達ネットワークを構成する（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （２００１）． ２７６： ２９８６－２９９１）。ケモカインは、７回膜貫通ドメインＧタンパク質共役型受容体である表面受容体を活性化することによって細胞に影響を及ぼす。特定のケモカインに対する白血球の反応は、ケモカイン受容体の発現によって決定される。受容体に対するケモカインの結合は、生物学的応答の活性化をもたらすサイトカインの作用と同様に、様々なシグナル伝達カスケードを活性化する。ＣＣＲ５のリガンドである、活性化制御で、正常Ｔ細胞で発現、分泌される（ＲＡＮＴＥＳ）、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）－１α／及びＭＩＰ－１β（Ｓｃｈｒｕｍ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９６） １５７： ３５９８－３６０４）、ならびに、ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）のリガンドである誘導タンパク質（ＩＰ）－１０（Ｔａｕｂ Ｄ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． （１９９３） １７７：１８０９－１８１４））の分泌は、望ましくないＴＨ１応答の亢進と関連している。さらに、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γの有害な炎症促進性サイトカインレベルの上昇は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）と相関する（Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ． （２００７） ４８ （２－３）： １５９－６３）。ケモカインは、ＴＨ１膵臓浸潤及びＴ細胞浸潤を特徴とする他の炎症性病変で観察されている（Ｂｒａｄｌｅｙ Ｌ．Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９９）． １６２：２５１１－２５２０）。
本明細書で使用される場合、「ケモナイーブ」という用語は、化学療法の経験がないことか、または経験がないことを示していることを意味する。
本明細書で使用される場合、「化学療法」という用語は、がん細胞の増殖を停止するために薬物を使用する治療を指す。
本明細書で使用される場合、「組成物」という用語は、２つ以上の物質から形成された集合物質を指す。
本明細書で使用される場合、「接触」という用語及びその様々な文法形式は、接触しているか、あるいは直ぐ隣もしくは局所的に近接している状態または状態を指す。組成物を標的の目的地に接触させることは、当業者に知られている任意の投与手段によって起こり得る。
本明細書で使用される場合、「共刺激分子」という用語は、そのＴＣＲを介してすでに刺激されているＴ細胞の活性化を増強する役割を有する細胞表面に提示される分子を指す。例えば、Ｔ細胞受容体に外来抗原を提示するＨＬＡタンパク質は、Ｔ細胞の増強された活性化をもたらすために、Ｔ細胞表面の相補的受容体に結合する共刺激タンパク質を必要とする。本明細書で使用される場合、「共刺激分子」という用語は、適応免疫応答の発生及び維持において重要な役割を果たす高活性免疫調節タンパク質を指す（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｗｏｌｃｈｏｋ ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈｐｔ ５，６７－１２１ （２００７））。Ｔ細胞応答の２つのシグナル仮説には、ＨＬＡ分子に結合した抗原とその同族Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との相互作用、及び共刺激分子とそのリガンドの相互作用が含まれる。共刺激性の第２のシグナルのキャリアである特殊なＡＰＣは、ＨＬＡ分子とＴＣＲとの結合に続いてＴ細胞応答を活性化することができる。対照的に、体細胞組織は第２のシグナルを発現せず、それによってＴ細胞の無応答を誘発する（同上）。２つのシグナルモデルに関与する共刺激分子の多くは、正常組織によって発現される共抑制分子によってブロックされる可能性がある（同上）。実際、多種多様な組織で発現する多くの種類の相互作用する免疫調節分子は、免疫学的状況に応じて刺激機能と抑制機能の両方を発揮し得る（同上）。
本明細書で使用される場合、「サイトカイン」という用語は、他の細胞に対して様々な効果を有する、細胞によって分泌される小さな可溶性タンパク質物質を指す。サイトカインは、増殖、発生、創傷治癒、及び免疫応答を含む多くの重要な生理学的機能を媒介する。それらは細胞膜内に位置するそれらの細胞特異的受容体に結合することによって作用し、それは細胞内で明確なシグナル伝達カスケードを開始することを可能にし、それは最終的に標的細胞における生化学的及び表現型の変化をもたらす。サイトカインは、放出部位から局所的及び遠隔的に作用し得る。それらは、多くのインターロイキン、及びいくつかの造血増殖因子を包含するＩ型サイトカイン；インターフェロン及びインターロイキン－１０を含むＩＩ型サイトカイン；ＴＮＦα及びリンホトキシンを含む腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）関連分子；インターロイキン１（「ＩＬ－１」）を含む免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー、多種多様な免疫機能及び炎症機能において重要な役割を果たす分子のファミリーであるケモカインを含む。同一のサイトカインが、細胞の状態に応じて細胞に異なる影響を及ぼすことがある。サイトカインはしばしば他のサイトカインの発現を調節し、そして他のサイトカインのカスケードを誘発する。サイトカインの非限定的な例には、例えば、ＩＬ－１α、ＩＬ－β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２／ＩＬ－２３ Ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＧＦ－β、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇｒｏ－α、ＭＣＰ－１、及びＴＮＦ－αが含まれる。
本明細書で使用される場合、「由来する」という用語は、起源の供給源から何かを受け取り、入手し、または改変するための任意の方法を包含する。
本明細書で使用される場合、ペプチドまたはＤＮＡ配列（例えば、免疫調節因子ペプチド配列）に関する「誘導体」または「バリアント」という用語は、その元の配列から改変された同一でないペプチドまたはＤＮＡ配列を指す。本明細書で使用される場合、細胞に関する「誘導体」または「バリアント」という用語は、その起源の細胞株から改変された（例えば、組換えＤＮＡ配列を発現するように改変された）腫瘍細胞株を指す。
「検出可能なマーカー」という用語は、選択可能なマーカーとアッセイマーカーの両方を包含する。「選択可能なマーカー」という用語は、薬剤耐性マーカー、蛍光活性化細胞分取に有用な抗原マーカー、選択的接着を可能にする接着リガンドのための受容体などの接着マーカーなどを含む、発現構築物で形質転換された細胞を選択またはスクリーニングすることができる様々な遺伝子産物を指す。
「検出可能な応答」とは、検出試薬を用いてまたは用いずに実施することができるアッセイにおいて検出することができる任意のシグナルまたは応答を指す。検出可能な応答としては、放射性崩壊及びエネルギー（例えば、蛍光、紫外線、赤外線、可視）放出、吸収、偏光、蛍光、燐光、透過、反射、または共鳴移動が含まれるが、これらに限定されない。検出可能な応答としてはまた、クロマトグラフィー移動度、濁度、電気泳動移動度、質量スペクトル、紫外線スペクトル、赤外線スペクトル、核磁気共鳴スペクトル、及びＸ線回折が挙げられる。代替的に、検出可能な応答は、融点、密度、導電率、表面弾性波、触媒活性、または元素組成などの生体物質の１つ以上の特性を測定するためのアッセイの結果であり得る。「検出試薬」は、目的の物質の存在または非存在を示す検出可能な応答を生じる任意の分子である。検出試薬は、抗体、核酸配列、及び酵素などの任意の様々な分子を含む。検出を促進するために、検出試薬はマーカーを含み得る。
本明細書で使用される場合、「用量」という用語は、一度に服用するように処方された治療物質の量を指す。
本明細書で使用される場合、「染料」（「蛍光色素」または「蛍光色素分子」とも呼ばれる）という用語は、分子を蛍光性にする分子の成分を指す。成分は、特定の波長のエネルギーを吸収し、そして異なる（しかし同等に特異的な）波長でエネルギーを再放出する分子中の官能基である。放出されるエネルギーの量と波長は、色素と色素の化学的環境の両方に依存する。多くの染料が知られており、ＦＩＴＣ、Ｒ－フィコエリトリン（ＰＥ）、ＰＥ－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ Ｔａｎｄｅｍ、ＰＥ－Ｃｙ５ Ｔａｎｄｅｍ、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｅｍ、ＥＧＦＰ、ＥＹＧＰ、ＥＣＦ、ＤｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＰｅｒＣｐ、ＳＹＴＯＸ Ｇｒｅｅｎ、クマリン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ（３５０、４３０、４８８、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６３３、６４７、６６０、６８０、７００、７５０）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、ＳＹＴＯＸ Ｂｌｕｅ、クロモマイシンＡ３、ミトラマイシン、ＹＯＹＯ－１、ＳＹＴＯＸ Ｏｒａｎｇｅ、臭化エチジウム、７－ＡＡＤ、アクリジンオレンジ、ＴＯＴＯ－１、ＴＯ－ＰＲＯ－１、チアゾールオレンジ、ＴＯＴＯ－３、ＴＯ－ＰＲＯ－３、チアゾールオレンジ、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、ＬＤＳ ７５１、Ｉｎｄｏ－１、Ｆｌｕｏ－３、ＤＣＦＨ、ＤＨＲ、ＳＮＡＲＦ、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、ＥＢＦＰ、ＧＦＰｕｖ、ＥＣＦＰ、ＧＦＰ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｙ７７Ｗ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ単量体、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＨｃＲｅｄｌ、モノクロロビマン、カルセイン、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒｓ、シアニン、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、メトキシクマリン、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、ＮＢＤ、ＰＥ－Ｃｙ５コンジュゲート、ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート、ＡＰＣ－Ｃｙ７コンジュゲート、Ｒｅｄ ６１３、フルオレセイン、ＦｌｕｏｒＸ、ＢＯＤＩＤＹ－ＦＬ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ－ローダミン、リサミンローダミンＢ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＴｒｕＲｅｄ、及びそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「操作された白血球刺激細胞」（または「ＥＮＬＳＴ（商標）細胞」）という用語は、少なくとも３つのコア免疫調節ペプチドである、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７リガンド、及びＣＤ２８リガンドをコードする組換えＤＮＡ配列でトランスフェクトまたは形質導入された同種異系初代腫瘍細胞株を指す。
本明細書で使用される場合、「濃縮する」という用語は、所望の物質の割合を増加させること、例えば、細胞集団におけるその天然の頻度と比較して細胞のサブタイプの相対的頻度を高めることを指す。ポジティブ選択、ネガティブ選択、またはその両方は、一般的に、あらゆる濃縮スキームに必要であると考えられている。選択方法としては、蛍光活性化細胞分取（磁気分離及びＦＡＣＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。濃縮に使用される特定の技術に関係なく、発達段階と活性化特異的応答が細胞の抗原プロファイルを変化させる可能性があるため、選択プロセスで使用される特定のマーカーは重要である。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ｍＲＮＡの生合成、ポリペプチド生合成、例えば翻訳後修飾によるポリペプチド活性化、または細胞内位置の変化またはクロマチンへの動員による発現の活性化を包含する。
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞で発現する遺伝子を含むＤＮＡ分子を指す。典型的には、遺伝子発現は、プロモーター、組織特異的制御因子、及びエンハンサーを含むがこれらに限定されない特定の制御因子の制御下に置かれる。そのような遺伝子は、制御因子に「作動可能に連結されている」と言われている。
本明細書で使用される場合、「フローサイトメトリー」という用語は、細胞の表現型及び特徴を調べるためのツールを指す。それは、感知領域を通過するレーザー（放射線の誘導放出による光増幅）／光ビームを通って、流体の流れ中の細胞または粒子が移動するときに細胞または粒子を感知する。微小粒子の相対光散乱及び色識別される蛍光を測定する。細胞の流れの分析及び識別は、サイズ、粒度、及び細胞が抗体または染料のいずれかの形態で蛍光分子を担持しているかどうかに基づく。細胞がレーザービームを通過するにつれて、光はあらゆる方向に散乱され、軸から小さい角度（０．５～１０°）で前方に散乱される光は球の半径の二乗、すなわち細胞または粒子のサイズに比例する。光が細胞に入る可能性があり、したがって、９０°光（直角、側面）散乱は蛍光色素結合抗体で標識するか、蛍光膜、細胞質、または核色素で染色することができる。したがって、細胞型、膜受容体及び抗原の存在、膜電位、ｐＨ、酵素活性、ならびにＤＮＡ含有量の識別が促進され得る。フローサイトメーターはマルチパラメーターであり、それぞれの細胞についていくつかの測定値を記録し、したがって、異種集団内の同種亜集団を識別することが可能である（Ｍａｒｉｏｎ Ｇ． Ｍａｃｅｙ，Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００７）。蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）は、物理的特性が類似しすぎてサイズや密度で分離できない別個の細胞集団を分離できるようにし、蛍光タグを使用して、発現の異なる表面タンパク質を検出し、物理的に均質な細胞の集団間で細かく区別できるようにする。
「機能的同等物」または「機能的に同等な」という用語は、本明細書において互換的に使用され、類似または同一の効果または使用を有する物質、分子、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを指す。
「ヘテロクリティック」という用語は、本明細書では、元のペプチドよりも生物学的効力が高いバリアントペプチドを指すために使用される。「ヘテロクリティック免疫原」は、免疫応答を誘発する免疫原であり、元の非免疫原性または免疫原性の低い抗原と交差反応する。
「免疫応答」及び「免疫媒介性」という用語は、これらの反応の結果が対象に有益であるか有害であるかにかかわらず、外来または自己抗原のいずれかに対する対象の免疫系の任意の機能的発現を指すために本明細書で互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「免疫原」という用語及びその様々な文法的形態は、免疫応答を誘発する物質を指す。
「免疫調節」、「免疫調節因子」及び「免疫調節」という用語は、例えばケモカイン、サイトカイン、及び免疫応答の他のメディエーターによって、免疫応答を直接的に、または間接的に増加または減少させることができる、物質、剤、または細胞を指すために本明細書では互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「免疫刺激量」という用語は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の血液集団を定量化するか、または抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の血液集団を定量化して抗原特異的Ｔ細胞を検出及び定量化するか、あるいは、適切な対象と比較した場合、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも１００％の増加があるかどうかを検出及び定量化するための、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（細胞免疫応答）、ＩＣＳ（細胞内サイトカイン染色アッセイ）、及び主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ））テトラマーアッセイによって測定されるように、測定可能な量によって免疫応答を刺激するのに有効な免疫原性組成物の量を指す。
免疫に関して本明細書で使用される場合、「誘導する」という用語及びその様々な文法的形態は、免疫応答をもたらすまたは生じさせるプロセスまたは作用を指す。
本明細書で使用される場合、「阻害剤」という用語は、第１の分子に結合するか、接触するか、さもなければそれを妨害し、それによって第１の分子の活性を低下させる第２の分子を指す。
本明細書で使用される場合、「ゲノムに組み込まれる」という用語は、宿主細胞のゲノムを含むゲノムＤＮＡと付随して連結されている組換えＤＮＡ配列を指す。
「単離された」という用語は、本明細書では、（１）通常、その天然に存在する環境で見られるような、それに付随するか、またはそれと相互作用する成分を実質的または本質的に含まない、核酸、ペプチド、または細胞などであるがそれらに限定されない材料を指すために使用される。「実質的に含まない」または「本質的に含まない」という用語は、本明細書では、他の材料を実質的または顕著に含まない、あるいは約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超えて、または１００％含まないことを指すために使用される。単離された材料は、任意選択で、その自然環境においてその材料とともに見出されない材料、あるいは（２）材料がその自然環境にある場合、材料は、組成物への意図的なヒトの介入によって合成的に（非自然に）変更されている、及び／またはその環境で見出された材料にとって自然ではない細胞内の場所（例えば、ゲノムまたは細胞内小器官）に配置されている材料を含む。合成材料を生成するための変更は、その自然状態内の材料に対して、またはその自然状態から取り出された材料に対して実行することができる。
本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、追跡可能な成分を導入することによって、化合物、構造、タンパク質、ペプチド、抗体、細胞または細胞成分を区別するプロセスを指す。一般的な追跡可能な成分としては、蛍光抗体、フルオロフォア、色素または蛍光色素、染色または蛍光染色、マーカー、蛍光マーカー、化学染色、示差染色、示差標識、及びラジオアイソトープが挙げられるが、これらに限定されない。
「リンパ球」という用語は、生体全体のリンパ組織において形成され、正常な成人において、循環血中の総白血球数の約２２～２８％を構成する小さい白血球（白血球）を指し、疾患に対して生体を防御することにおいて大きな役割を果たす。個別のリンパ球は、それらが限られた組の構造的に関連した抗原に応答することが決定されているという点で特殊化されている。免疫系と所与の抗原との最初の接触の前に存在するこの決定は、リンパ球の表面膜上の抗原の決定基（エピトープ）に特異的な受容体の存在によって表される。それぞれのリンパ球は、Ｔ細胞の集合を有し、そのすべては同一の結合部位を有する。リンパ球の一組、すなわちクローンは、その受容体の結合領域の構造において別のクローンと異なり、したがってそれが認識することができるエピトープにおいて異なる。リンパ球は、それらの受容体の特異性においてのみではなく、それらの機能においても互いに異なる（同上）。
抗体分泌細胞の前駆体であるＢリンパ球（Ｂ細胞）及びＴリンパ球（Ｔ細胞）の、２つの広いクラスのリンパ球が認識されている。
Ｂリンパ球
Ｂリンパ球は骨髄の造血細胞に由来する。成熟Ｂ細胞は、その細胞表面によって認識されるエピトープを示す抗原によって活性化され得る。活性化プロセスは、直接的、すなわち抗原による膜免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の架橋に依存する（架橋依存性Ｂ細胞活性化）か、または非直接的、すなわち、同族ヘルプと呼ばれるプロセスにおける、ヘルパーＴ細胞との相互作用を介するものであり得る。多くの生理学的状況において、受容体架橋刺激及び同族ヘルプは、協調してより活発なＢ細胞応答をもたらす（Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ． Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
架橋依存性Ｂ細胞活性化は、それぞれのＢ細胞が同一の可変領域を有するＩｇ分子を発現するので、抗原が細胞表面受容体の結合部位に相補的なエピトープの複数のコピーを示すことを必要とする。このような要件は、微生物の莢膜多糖やウイルスエンベロープタンパク質など、反復エピトープを有する他の抗原によって満たされる。架橋依存性Ｂ細胞活性化は、これらの微生物に対してマウントされた主要な防御免疫応答である（同上）。
同族ヘルプは、Ｂ細胞が受容体を架橋することができない抗原に対する応答を開始することを可能にし、同時に、Ｂ細胞が弱い架橋事象によって刺激されるときに不活性化からＢ細胞を救出する共刺激シグナルを提供する。同族ヘルプは、Ｂ細胞の膜免疫グロブリン（Ｉｇ）による抗原の結合、抗原のエンドサイトーシス、及び細胞のエンドソーム／リソソーム区画内のペプチドへのその断片化に依存する。生じるペプチドのいくつかは、クラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子として知られる細胞表面タンパク質の特定のセットの溝へと積載される。生じるクラスＩＩ／ペプチド複合体は、細胞表面に発現し、ＣＤ４+Ｔ細胞として表される一組のＴ細胞の抗原特異的受容体のリガンドとして作用する。ＣＤ４+Ｔ細胞は、Ｂ細胞のクラスＩＩ／ペプチド複合体に特異的な受容体をそれらの表面に担持する。Ｂ細胞活性化は、Ｔ細胞とのそのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した結合のみに依存するのではなく、この相互作用はまた、Ｔ細胞の活性化リガンド（ＣＤ４０リガンド）が、Ｂ細胞上のその受容体（ＣＤ４０）への結合を可能し、Ｂ細胞活性化をシグナル伝達する。さらに、Ｔヘルパー細胞は、Ｂ細胞上のサイトカイン受容体に結合することによって刺激されたＢ細胞の増殖と分化を調節するいくつかのサイトカインを分泌する（同上）。
抗体産生の同族ヘルプの間に、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）は活性化されたＣＤ４+Ｔヘルパー細胞で一時的に発現され、抗原特異的Ｂ細胞のＣＤ４０に結合し、それによって第２の共刺激シグナルを伝達する。後者のシグナルは、Ｂ細胞の増殖と分化、及び抗原に遭遇した胚中心Ｂ細胞のアポトーシスを防ぐことによるメモリーＢ細胞の生成に不可欠である。Ｂ細胞とＴ細胞の両方でのＣＤ４０Ｌの過剰発現は、ヒトＳＬＥ患者の病原性自己抗体産生に関係している（Ｄｅｓａｉ－Ｍｅｈｔａ，Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｖｏｌ． ９７（９），２０６３－２０７３，（１９９６））。
Ｔリンパ球
Ｔリンパ球は、造血組織の前駆体に由来し、胸腺で分化し、そして次に末梢リンパ組織及びリンパ球の再循環プールに播種される。Ｔリンパ球またはＴ細胞は、広範囲の免疫機能を媒介する。これらは、Ｂ細胞が抗体産生細胞に発達するのを助ける能力、単球／マクロファージの殺菌作用を増加させる能力、ある種の免疫応答の阻害、標的細胞の直接殺傷、及び炎症応答の動員を含む。これらの効果は、Ｔ細胞の特異的な細胞表面分子の発現及びサイトカインの分泌に依存する（Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ． Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
Ｔ細胞はそれらの抗原認識のメカニズムにおいて、Ｂ細胞とは異なる。Ｂ細胞の受容体である免疫グロブリンは、可溶性分子または粒子状表面の個々のエピトープに結合する。したがって、Ｂ細胞受容体は、天然分子の表面上に示されるエピトープを認識する。抗体及びＢ細胞受容体は、細胞外流体中の微生物に結合し、それに対して防御するよう進化したが、Ｔ細胞は、他の細胞の表面上の抗原を認識し、これらの抗原提示細胞（ＡＰＣ）と相互作用し、その挙動を変えるすることによってＴ細胞の機能を媒介する。Ｔ細胞を活性化できる末梢リンパ器官のＡＰＣには、樹状細胞（「ＤＣ」）、マクロファージ、及びＢ細胞の３つの主要なタイプがある。これらの中で最も強力なのはＤＣであり、その唯一の機能は外来抗原をＴ細胞に提示することである。未熟なＤＣは、皮膚、腸、及び気道など、体全体の組織に存在する。それらがこれらの部位で侵入する微生物に遭遇すると、それらは病原体及びそれらの産物をエンドサイトーシスし、それらをリンパ節を介して局所リンパ節または腸管関連リンパ器官へと運搬する。病原体との遭遇は、抗原捕捉細胞から、Ｔ細胞を活性化することのできるＡＰＣへのＤＣの成熟を誘導する。ＡＰＣは、それらの表面に、Ｔ細胞がＴエフェクター細胞になるよう活性化することにおいて役割を有する３種類のたんぱく質分子を提示する：（１）外来抗原をＴ細胞受容体に提示するＨＬＡタンパク質；（２）Ｔ細胞表面上の相補的受容体に結合する共刺激タンパク質、及び（３）Ｔ細胞が活性化されるのに十分に長い期間、Ｔ細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合させることのできる細胞間接着分子（“Ｃｈａｐｔｅｒ ２４： Ｔｈｅ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ，” Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，（２００２））。
Ｔ細胞は、それらが発現する細胞表面受容体に基づいて、２つの異なるクラスに細分される。Ｔ細胞の大部分は、α鎖とβ鎖からなるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。Ｔ細胞の小さな群は、γ鎖とδ鎖でできた受容体を発現する。α／βＴ細胞の中には、補助受容体分子ＣＤ４を発現するもの（ＣＤ４+Ｔ細胞）及びＣＤ８を発現するもの（ＣＤ８+Ｔ細胞）の２つの亜系統がある。これらの細胞は、抗原を認識する方法と、エフェクター及び調節機能が異なる。
ＣＤ４＋Ｔ細胞。ＣＤ４+Ｔ細胞は、免疫系の主要な制御性細胞である。それらの制御性の機能は、Ｔ細胞が活性化されるときに発現が誘導されるＣＤ４０Ｌなどのそれらの細胞表面分子と、活性化されるときに分泌される広範囲のサイトカインとの両方の発現に依存する。Ｔ細胞はまた、重要なエフェクター機能をも媒介し、そのうちのいくつかは、それらの分泌するサイトカインのパターンによって決定される。サイトカインは、標的細胞に対して直接的に毒性であり得、強力な炎症メカニズムを動員し得る。
ＣＤ８＋Ｔ細胞。さらに、Ｔ細胞、特にＣＤ８+Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される抗原を発現する標的細胞を効果的に溶解することのできるＣＴＬへと発達することができる（Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ． Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、クラスＩＩまたはクラスＩＨＬＡタンパク質の特殊な溝に結合した抗原のたんぱく質分解に由来するペプチドからなる複合体を認識する。ＣＤ４+Ｔ細胞はペプチド／クラスＩＩ複合体のみを認識するが、ＣＤ８+Ｔ細胞はペプチド／クラスＩ複合体を認識する（同上）。
ＴＣＲのリガンド（すなわち、ペプチド／ＨＬＡタンパク質複合体）は、ＡＰＣ内で作成される。一般に、クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、エンドサイトーシスプロセスを通じてＡＰＣに取り込まれたタンパク質に由来するペプチドに結合する。次いで、これらのペプチドをロードしたクラスＩＩ分子は細胞の表面に発現し、発現した細胞表面複合体を認識できるＴＣＲを持つＣＤ４+Ｔ細胞と結合することができる。したがって、ＣＤ４+Ｔ細胞は、細胞外供給源に由来する抗原と反応するように特化されている（同上）。
対照的に、クラスＩ ＨＬＡ分子には、ウイルスタンパク質などの内部で合成されるタンパク質に由来するペプチドが主にロードされている。これらのペプチドは、プロテオソームによるタンパク質分解によって細胞質ゾルタンパク質から生成され、粗面小胞体に移動する。このようなペプチドは、一般に９アミノ酸の長さで構成され、クラスＩ ＨＬＡ分子に結合して細胞表面に運ばれ、適切な受容体を発現するＣＤ８+Ｔ細胞によって認識され得る。これにより、Ｔ細胞システム、特にＣＤ８+Ｔ細胞は、生物の残りの部分の細胞のタンパク質（ウイルス抗原など）または変異体の抗原（活性な腫瘍遺伝子産物など）とは異なる、またはそれよりもはるかに大量に産生されるタンパク質を、発現する細胞を、たとえ無傷の形態のそれらのタンパク質が細胞表面に発現も分泌もされていなくても検出することができる（同上）。
Ｔ細胞はまた、それらのヘルパーＴ細胞としての機能に基づいて分類できる：細胞性免疫の誘導に関与するＴ細胞；サプレッサーＴ細胞；及び細胞傷害性Ｔ細胞。
ヘルパーＴ細胞。ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞を刺激してタンパク質及びその他のＴ細胞依存性抗原に対する抗体反応を起こすＴ細胞である。Ｔ細胞依存性抗原は、個々のエピトープが１回だけ、または限られた回数しか出現しないため、Ｂ細胞の膜Ｉｇを架橋できないか、非効率的に架橋する免疫原である。Ｂ細胞は、それらの膜Ｉｇを介して抗原に結合し、複合体がエンドサイトーシスを経る。エンドソーム及びリソソーム区画内で、抗原はタンパク質分解酵素によってペプチドに断片化され、生成されたペプチドの１つ以上がクラスＩＩ ＨＬＡ分子に積載され、これがこの小胞区画を通過する。生じるペプチド／クラスＩＩ ＨＬＡ複合体は、続いてＢ細胞表面膜に輸送される。ペプチド／クラスＩＩ分子複合体に特異的な受容体を持つＴ細胞は、Ｂ細胞表面でこの複合体を認識する（同上）。
Ｂ細胞の活性化は、ＴＣＲを介したＴ細胞の結合と、Ｔ細胞ＣＤ４０ＬとＢ細胞上のＣＤ４０との相互作用との両方に依存する。Ｔ細胞は、構成的にＣＤ４０Ｌを発現しない。むしろ、ＣＤ４０Ｌの発現は、ＴＣＲによって認識される同族抗原とＣＤ８０またはＣＤ８６との両方を発現するＡＰＣとの相互作用の結果として誘導される。ＣＤ８０／ＣＤ８６は、一般的に、活性化されているが、休止していないＢ細胞によって発現され、活性化Ｂ細胞とＴ細胞を含むヘルパー相互作用は、効率的な抗体産生をもたらす。しかしながら、多くの場合、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌの最初の誘導は、ＤＣなどの、構成的にＣＤ８０／８６を発現するＡＰＣの表面上の抗原のそれらによる認識に依存する。次いで、そのような活性化ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞と効率的に相互作用して助ける。Ｂ細胞上の膜Ｉｇの架橋は、たとえ効率的でなくとも、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０と協調して、活発なＢ細胞活性化をもたらす。増殖、Ｉｇ分泌、及び発現されているＩｇクラスのクラススイッチを含む、Ｂ細胞応答におけるその後のイベントは、Ｔ細胞由来サイトカインの作用に依存するか、またはその作用によって増強される（同上）。
ＣＤ４+Ｔ細胞は、主にサイトカインＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、及びＩＬ－１０を分泌する細胞（ＴH２細胞）、または主にＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、及びリンホトキシン（ＴH１細胞）を産生する細胞に分化する傾向がある。ＴH２細胞は、Ｂ細胞の抗体産生細胞への発達を助けるのに非常に効果的であり、ＴH１細胞は、単球及びマクロファージの殺菌作用の増加、ならびに結果として起こる細胞内小胞区画における微生物を溶解する増加した効率を含む細胞免疫応答の効果的な誘導因子である。ＴH２細胞の表現型（すなわち、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、及びＩＬ－１０）を持つＣＤ４+Ｔ細胞は効率的なヘルパー細胞であるが、ＴH１細胞にはヘルパーになる能力もある（同上）。
細胞性免疫誘導におけるＴ細胞の関与。Ｔ細胞はまた、単球及びマクロファージの細胞内微生物を破壊する能力を増強するよう作用し得る。特に、ヘルパーＴ細胞によって産生されるインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）は、一酸化窒素の生成及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）産生の誘導を含む、単核食細胞が細胞内細菌及び寄生生物を破壊するいくつかの機序を増強する。ＴH1細胞は、ＩＦＮ－γを産生するため、殺菌作用を増強するのに効果的である。対照的に、ＴH2細胞によって産生される２つの主要なサイトカインであるＩＬ－４とＩＬ－１０は、これらの活性をブロックする（同上）。
細胞傷害性Ｔリンパ球。標的細胞内で産生されたタンパク質由来のペプチドを認識するＣＤ８+Ｔ細胞は、標的細胞の溶解を導くという点で細胞傷害性の性質を有する。ＣＴＬ誘導性熔解のメカニズムは、パーフォリン、すなわち、標的細胞の膜に挿入してその細胞の溶解を促進することのできる分子のＣＴＬによる産生を含む。パーフォリンを介した溶解は、活性化されたＣＴＬによって生成される一連の酵素であるグランザイムによって増強される。多くの活性ＣＴＬはまた、それらの表面に大量のＦａｓリガンドを発現する。ＣＴＬ表面のＦａｓリガンドと標的細胞表面のＦａｓとの相互作用は、標的細胞のアポトーシスを開始し、これらの細胞の死をもたらす。ＣＴＬを介した溶解は、ウイルスに感染した細胞を破壊するための主要なメカニズムのようである。
制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞。免疫恒常性は、免疫応答の開始と下方制御の間の制御されたバランスによって維持される。アポトーシスとＴ細胞アネルギー（抗原に遭遇した後、Ｔ細胞が本質的に機能的に不活性化される寛容メカニズム）の両方のメカニズムは、免疫応答の下方制御に寄与する（Ｓｃｗａｒｔｚ，Ｒ． Ｈ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１： ３０５－３３４ （２００３））。第３のメカニズムは、サプレッサーまたは制御性ＣＤ４+Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞による活性化Ｔ細胞の能動的抑制によって提供される（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ，４３５： ５９８－６０４ （２００５）でレビューされている）。ＩＬ－２受容体アルファ（ＩＬ－２Ｒα）鎖（ＣＤ４+ＣＤ２５+）を構成的に発現するＣＤ４+制御性Ｔ細胞は、アネルギー及び抑制性である天然に存在するＴ細胞サブセットである（Ｔａａｍｓ，Ｌ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１： １１２２－１１３１ （２００１））。ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔｒｅｇｓの枯渇は、マウスの全身性自己免疫疾患を引き起こす。さらに、これらのＴｒｅｇの移植は、自己免疫疾患の発症を防ぐ。ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔｒｅｇｓは、マウスの対応物と同様に胸腺で生成され、細胞間接触依存性メカニズムを介してレスポンダーＴ細胞の増殖を抑制する能力、ＩＬ－２を産生できないこと、及びインビトロでのアネルギー表現型を特徴とする。ヒトＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔ細胞は、ＣＤ２５発現のレベルに応じて、抑制性（ＣＤ２５high）細胞と非抑制性（ＣＤ２５low）細胞に分けることができる。転写因子のフォークヘッドファミリーのメンバーであるＦＯＸＰ３は、マウス及びヒトのＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔｒｅｇｓで発現することが示され、ＣＤ４+ＣＤ２５+Ｔｒｅｇの発生を制御するマスター遺伝子であるようである（Ｂａｔｔａｇｌｉａ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７７： ８３３８－８３４７，（２００６））。
Ｔメモリー細胞。適応免疫応答による病原体の認識と根絶に続いて、Ｔ細胞の大部分（９０～９５％）がアポトーシスを起こし、残りの細胞は中央メモリーＴ細胞（ＴCM）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴEM）、及び常駐メモリーＴ細胞（ＴRM）と呼ばれるメモリーＴ細胞のプールを形成する（Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ． Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ．，７，２６９ｒｖ１，（２０１５））。
標準的なＴ細胞と比較して、これらのメモリーＴ細胞は、特異的な表面マーカーの発現、異なるサイトカインプロファイルの迅速な産生、直接エフェクター細胞機能の能力、及び固有のホーミング分布パターンなどの異なる表現型を伴い長寿命である。メモリーＴ細胞は、攻撃者の再感染を排除し、それによって免疫系のバランスを迅速に回復するために、それらの対応する抗原に再曝露する際に迅速な反応を示す。増加する証拠は、自己免疫メモリーＴ細胞が自己免疫疾患を治療または治癒するほとんどの試みを妨げることを立証している（同上）。
樹状細胞（ＤＣ）
ＤＣは組織内に存在し、適応免疫応答の大きさと質を開始及び制御する上で重要な役割を果たす。未熟なＤＣは、がん細胞または微生物からの潜在的に危険なシグナルの見張りとして機能し、強力な食細胞抗原捕捉能力を備えている。成熟刺激を受けると、未成熟なＤＣは接着分子の発現を失い、細胞骨格の再編成を受け、流入領域リンパ節に遊走する。成熟したＤＣはプロフェッショナルな抗原提示細胞であり、それらの細胞表面でのＭＨＣクラスＩＩ及び共刺激分子の発現が増加している。自然免疫応答は、限られた数のパターンを認識するために生殖細胞系列でコード化されたパターン認識受容体を使用して、病原体に典型的な分子を検出する。これらの受容体としては、Ｔｏｌｌ様受容体、細胞表面Ｃ型レクチン受容体、及び細胞質内ヌクレオチドオリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体が挙げられる（以下の説明を参照されたい。Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｓ．，ａｎｄ Ｌ．Ｍ． Ｈｅｓｓ，ｅｄｉｔｏｒｓ． Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎａｔｕｒｅ，２０１９もまた参照されたい）。
単球（ＭＯ）及びマクロファージ（ＭΦ）
単球（ＭＯ）、マクロファージ（ＭΦ）、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、骨髄系（造血由来細胞の群）の一部である。単球は、造血幹細胞由来のマクロファージの直接の前駆体である。腫瘍組織に動員された後、それら、表現型が高く、腫瘍促進機能が不均一な多様性を持つ細胞集団である腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に分化することができる。それらは、腫瘍の開始、局所進行、及び遠隔転移をサポートすることが見出されている（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｄａｖｉｄ Ｍ，ｅｔ ａｌ． “Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ： Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．”Ｃａｎｃｅｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ： Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，Ａｕｇ． ２０１３，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３）。しかしながら、他の研究では、ＴＡＭにも抗腫瘍特性があることが示されている。
ＭＯ細胞は主に骨髄に見られるが、さらに血液及び脾臓にも見られる。研究によると、ＭＯ細胞は脾臓の髄外造血によっても生成され得、がんの存在などの炎症性条件下で増加し得る。造血幹細胞（ＨＳＣ）から生成されたＭＯは、総称して単球形成と呼ばれる分化とコミットメントのステップの連続プロセスを経る。単球形成は、微小環境の手がかりによって厳密に調節され、発生中の細胞における遺伝子発現を調節し、造血分化に関連するしばしば不可逆的、表現型及び機能的変化をもたらす。Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＩＬ－３などのサイトカインが単球形成に関与することは知られているが、間質細胞または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分など、他の比較的研究されていない因子も単球形成に影響を及ぼす可能性がある（同上）。
単球の異なるサブセットは、一般的な骨髄前駆細胞（ＣＭＰ）、顆粒球／マクロファージ前駆細胞（ＧＭＰ）などの別個の増殖因子前駆細胞段階を介して、ＭＯ、マクロファージ（ＭΦ）及びＤＣの前駆細胞として機能するマクロファージ樹状細胞前駆細胞（ＭＤＰ）に進行する単球形成を介して骨髄のＨＳＣから生成される。ＭＯに分化すると、それらは２つの群： 「古典的な」Ｌｙ６Ｃhigh（非パトロール）及び「非古典的」Ｌｙ６Ｃlow（パトロール）ＭＯに編成できるが、表現型または挙動の重要性はこれら２つのサブセット間で完全には理解されていないことに留意されたい。単球サブセットは骨髄から血流に移動し、そこで脾臓に局所的な貯留層を形成する。脾臓では、損傷や炎症に応答してそれらを再動員することができる。定常状態の恒常性の際には、血中単球はさまざまな組織に動員され、そこで組織の発達と恒常性の維持に関与するＭＯ由来のＭΦとＤＣを生じる（同上）。対照的に、腫瘍の存在下では、ＭＯは腫瘍微小環境で免疫抑制ＴＡＭ及び単球ＭＤＳＣの集団を生じさせることができ、そこでは腫瘍の進行及び免疫回避を促進し得る。
組織中のＭΦは、組織の発達または治癒における組織の発達／リモデリングのための恒常性または栄養のプロセスをサポートする。このサポートに関与するメカニズムとしては、食作用、増殖因子産生、血管新生、及びＥＣＭ成分の分解が挙げられる。ＴＬＲシグナルまたは炎症性サイトカインなどの免疫原性シグナルに応答して、マクロファージの機能特性は、免疫と病原体の防御に必要なプロセスに極性化される。これらには、病原体の食作用、細胞傷害性活性酸素／活性窒素種（ＲＯ／ＲＮＳ）の放出、炎症促進性サイトカインの産生、及びＨＬＡクラスＩＩを介した抗原提示が含まれる （同上を参照されたい）。
ＭΦは、極性化状態、すなわち、炎症促進性Ｍ１－ＭΦ（古典的活性化）から抗炎症性Ｍ２－ＭΦ（代替的活性化）までに応じて線形スケールで編成できる。ＴＡＭは、腫瘍由来の因子が誘引し、ＭΦに分化するときに生成される。非ＴＡＭのＭΦと同様に、ＴＡＭは表現型及び機能の不均一な多様性を示す。これは、組織及び腫瘍のタイプ、腫瘍の進行段階、及び腫瘍組織内の位置に依存する。例えば、Ｍ２様ＴＡＭの密度の増加は、特定の種類のがん（乳癌、子宮頸癌、及び膀胱癌など）の予後不良のマーカーであるが、Ｍ１様ＴＡＭの密度の増加は、他の種類のがん（前立腺、肺、及び脳など）の予後良好のマーカーである。
ＴＡＭは、腫瘍の発生と進行のほぼすべての段階に影響を及ぼし得る。研究によると、それらは、細胞傷害性因子の産生、腫瘍細胞（転移細胞など）の食作用、がんの免疫編集への関与など、さまざまな抗腫瘍機能を有していることが判明している（Ｂｉｎｇｌｅ Ｌ，Ｂｒｏｗｎ ＮＪ，Ｌｅｗｉｓ ＣＥ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｎｅｗ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ． Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． （２００２） １９６： ２５４－２６５；ｓｅｅ ａｌｓｏ Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ Ｔ，Ｓａｄｄａｗｉ－Ｋｏｎｅｆｋａ Ｒ，Ｖｅｒｍｉ Ｗ，Ｋｏｅｂｅｌ ＣＭ，Ａｒｔｈｕｒ Ｃ，Ｗｈｉｔｅ ＪＭ，Ｕｐｐａｌｕｒｉ Ｒ，Ａｎｄｒｅｗｓ ＤＭ，Ｎｇｉｏｗ ＳＦ，Ｔｅｎｇ ＭＷ，Ｓｍｙｔｈ ＭＪ，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ＲＤ，Ｂｕｉ ＪＤ． Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｔｈｅ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． （２０１２） ２０９： １８６９－１８８２を参照されたい）。
研究によると、ＴＡＭは抗腫瘍機能に分局化し得ることが判明している。例えば、ＣＤ４０経路の活性化は、ＴＡＭをプログラムして、腫瘍組織におけるＭＨＣクラスＩＩの発現と共刺激分子ＣＤ８６の蓄積を上方制御し、ＴＡＭを介した腫瘍細胞の溶解をもたらすことが報告されている。ＩＬ－１２及びＴＮＦ－αを介した治療は、ＴＡＭをプログラムして抗腫瘍エフェクター機能を示すことも報告されている（Ｗａｔｋｉｎｓ ＳＫ，Ｅｇｉｌｍｅｚ ＮＫ，Ｓｕｔｔｌｅｓ Ｊ，Ｓｔｏｕｔ ＲＤ． ＩＬ－１２ ｒａｐｉｄｌｙ ａｌｔｅｒｓ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００７） １７８：１３５７－１３６２を参照されたい）。ＣＤ４７は、ＭΦ及びＤＣで発現するタンパク質であるＳＩＲＰαに結合することにより、抗食作用シグナルとして機能する。ＣＤ４７活性をブロックするか、ＳＩＲＰαアクセスをブロックすると、腫瘍細胞のＭΦ依存性食作用が生じることが判明している（Ｃｈａｏ ＭＰ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＩＬ，Ｍａｊｅｔｉ Ｒ． Ｔｈｅ ＣＤ４７－ＳＩＲＰａｌｐｈａ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１２） ２４： ２２５－２３２を参照されたい）。
ＭＯ、ＭΦ、ＤＣ、及び関連する細胞は、現在、表１に示す表現型マーカーによって識別されている。
Figure 2022553411000002
Figure 2022553411000003
「主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）、ＭＨＣ様分子」及び「ＨＬＡ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、エピトープまたは抗原として知られる分子画分を示し、白血球と他の白血球または体細胞との相互作用を媒介する細胞表面分子を指す。ＭＨＣは大きな遺伝子群によってコードされており、クラスＩ、クラスＩＩ、及びクラスＩＩＩの３つのサブグループに編成できる。ヒトでは、ＭＨＣ遺伝子複合体はＨＬＡ（「ヒト白血球抗原」）と呼ばれる。マウスでは、それはＨ－２（「組織適合性」の略）と呼ばれる。どちらの種にも３つの主要なＭＨＣクラスＩ遺伝子があり、ヒトではＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃと呼ばれ、マウスではＨ２－Ｋ、Ｈ２－Ｄ、及びＨ２－Ｌと呼ばれる。これらは、それぞれのＭＨＣクラスＩタンパク質のα鎖をコードしている。ＭＨＣクラスＩ分子の他のサブユニットはβ２－ミクログロブリンである。クラスＩＩ領域には、ヒトのＭＨＣクラスＩＩ分子ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、及びＨＬＡ－ＤＱのα鎖とβ鎖（Ａ及びＢと指定）の遺伝子が含まれている。また、ＭＨＣクラスＩＩ領域には、ＴＡＰ１：ＴＡＰ２ペプチドトランスポーターの遺伝子、プロテアソームサブユニットをコードするＰＳＭＢ（またはＬＭＰ）遺伝子、ＤＭα及びＢＭβ鎖をコードする遺伝子（ＤＭＡ及びＤＭＢ）、ＤＯ分子のα及びＤＯ分子のβ鎖をコードする遺伝子（それぞれＤＯＡとＤＯＢ）、ならびにタパシンをコードする遺伝子（ＴＡＰＢＰ）がある。クラスＩＩ遺伝子は、免疫機能を有する他のさまざまなタンパク質をコードしている。ＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチド結合を触媒するＨＬＡ－ＤＭ分子のサブユニットをコードするＤＭＡ及びＤＭＢ遺伝子は、制御性ＨＬＡ－ＤＯ分子のサブユニットをコードするＤＯＡ及びＤＯＢ遺伝子と同様に、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子に関連している。Ｊａｎｅｗａｙｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ． ９ｔｈ ｅｄ．，ＧＳ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ，２０１７． ｐｐｓ． ２３２－２３３．
ＭＨＣ様分子は、真のＭＨＣと同じ遺伝子群によってコードされていないが、ＭＨＣ、特にＭＨＣクラスＩ分子と同じ折り畳みと全体構造を持っているため、抗原提示などの同様の生物学的機能を持っている。ＣＤ１ファミリーの分子は、ＭＨＣ様分子の一例である。これは、アミノ酸の相同性に基づく２つの群：ＣＤ１ａ、ｂ、及びｃが含まれる群１、ＣＤ１ｄで構成される群２で構成されている。群１のＣＤ１は多種多様なＴ細胞に抗原を提示できるが、ＣＤ１ｄは主にＮＫＴ細胞に抗原を提示する（Ｂｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚ． “ＣＤ１ｄ Ｌｉｇａｎｄｓ： Ｔｈｅ Ｇｏｏｄ，ｔｈｅ Ｂａｄ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｇｌｙ．” Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （２００６） １７７ （２） ７６９－７７５）。ＣＤ１ｄは構造的にＭＨＣクラスＩ分子に似ているが、外因性抗原提示経路のエンドソームを通過する。ＣＤ１ｄ分子の結合溝は糖脂質抗原の脂質テールをつなぎ、抗原の炭水化物頭部基はＮＫＴ細胞のＴＣＲによる認識のために溝から突き出ている（Ｗａｈ，ＭａｋＴａｋ，ｅｔ ａｌ． “Ｃｈａｐｔｅｒ １１： ＮＫ，γδ Ｔ ａｎｄ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ．” Ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１４）。
ＣＤ１ｄは脂質抗原を提示し、ＡＰＣによるこれらの分子の取り込みとそれに続くＣＤ１ｄ分子へのローディングを誘導するための特定のメカニズムの存在を必要とする。アポリポタンパク質Ｅ及び脂肪酸アミド加水分解酵素（ＦＡＡＨ）などの脂質転移タンパク質は、ＣＤ１ｄによる特定の抗原の提示を増強することが示されている。脂質抗原交換を促進することにより、細胞のエンドソーム及びリソソーム区画に存在するサポシン及びミクロソームトリグリセリド転移タンパク質などの特定のタンパク質によって、ローディング効率を増強することができる。ＭＨＣ抗原と同様に、脂質抗原もリソソーム酵素によって処理され、合成抗原、微生物抗原、及び自己抗原のＣＤ１ｄの場合に示されているように、活性化合物を生成する。Ｇｉｒａｄｉ ａｎｄ Ｚａｊｏｎｃ （２０１２）． “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＤ１ｄ ａｎｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ．” Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． ２５０（１）： １６７－１７９。
ＭＨＣクラスＩ様分子は、非古典的なＭＨＣタイプの分子であるが、Ｃｄ１ｄを含めると、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｅも含まれ、ＭＲ１もＡＰＣで発現し、Ｔ細胞のさまざまなサブセットを活性化できる。Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｄｅｌｏｖｉｔｃｈ （２０１４） “Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍａｙ ｖａｒｙ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．” Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４２： ３２１－３３６。他の非古典的な組織適合性分子には、ＭＡＩＴ細胞を活性化するＭＲ１が含まれる。
「マーカー」または「細胞表面マーカー」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特定のタイプの細胞の表面に見られる抗原決定基またはエピトープを指す。細胞表面マーカーは、細胞型の特性評価、その識別、そして最終的にはその単離を容易にすることができる。細胞分取技術は、細胞表面マーカー（複数可）がポジティブ選択またはネガティブ選択のいずれかに、すなわち細胞集団からの包含または排除に使用され得る細胞バイオマーカー（複数可）に基づく。
「混合リンパ球反応」または「ＭＬＲ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、２つの同種異系リンパ球集団間で起こるインビトロ細胞性免疫アッセイを指す。古典的な混合リンパ球反応（ＭＬＲ）では、レスポンダーＴ細胞の懸濁液を同種異系（ドナー）刺激細胞とともに培養する。同種異系刺激細胞で発現する外来ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子は、応答するＴリンパ球への活性化刺激として機能する。次いで、応答するＴリンパ球の増殖を測定する。Ｔ細胞も含む刺激細胞集団は、レスポンダー細胞の存在下で複製する（双方向混合リンパ球反応）。一方向混合リンパ球反応の場合、刺激細胞は、細胞の複製を防ぐために、例えば、照射またはマイトマイシンＣでの処理によって複製するのを防ぐ。
「混合リンパ球腫瘍反応」または「ＭＬＴＲ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、同種異系リンパ球を使用して応答を刺激するのではなく、同種異系腫瘍細胞が使用される混合リンパ球反応と同様の反応を指す。ＭＬＴＲ法は、混合リンパ球集団を同種異系腫瘍細胞と接触させることを含む。リンパ球の細胞増殖、リンパ球の細胞サブセット分化、リンパ球のサイトカイン放出プロファイル、及び腫瘍細胞死のうちの１つ以上が測定される。
本明細書で使用される場合、「改変する」という用語は、の形態または品質の変化を指す。
本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、特定の尺度または割合を調節、変更、適応、または調整することを意味する。このような調節は、検出できない変化を含む、任意の変化であってよい。ＮＫＣ、ＣＴＬ、及びＮＫＴなどのシリアルキラー細胞型の文脈で本明細書で使用される場合、「改変された」または「調節された」という用語は、１つ以上の組換えＤＮＡ技術を介して細胞型の形態または特性を変化させることを指し、それぞれの改変されたシリアルキラー細胞の免疫刺激効果または免疫抑制効果は、それぞれの親シリアルキラー細胞とは再現性よく異なる。
本明細書で使用される場合、「単核球」という用語は、例えば、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、単球、及びマクロファージなどの単一の円形核を有する細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「骨髄サプレッサー細胞」または「骨髄由来抑制細胞」または「ＭＤＳＣ」という用語は、骨髄起源、未成熟状態、及びＴ細胞応答を強力に抑制する能力を特徴とする細胞の不均一な集団を指す。これらの細胞は健常人の免疫応答と組織修復を調節し、炎症中に集団が急速に拡大する。
「核酸」という用語は、本明細書では、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指すために使用され、他に限定されない限り、それらが天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で一本鎖核酸（例えば、ペプチド核酸）にハイブリダイズするという点で天然ヌクレオチドの本質的な性質を有する既知の類似体を包含する（例えば、ペプチド核酸）。
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書では、複素環式塩基、糖、及び１つ以上のリン酸基からなる化合物を指すために使用される。最も一般的なヌクレオチドでは、塩基はプリンまたはピリミジンの誘導体であり、糖はペントースデオキシリボースまたはリボースである。ヌクレオチドは核酸のモノマーであり、核酸を形成するために３つ以上が一緒に結合している。ヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡと、ＣｏＡ、ＦＡＤ、ＤＭＮ、ＮＡＤ、及びＮＡＤＰを含むがこれらに限定されないいくつかの補因子との構造単位である。プリンには、アデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）が含まれる。ピリミジンには、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）が含まれる。
本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」という用語は、ペプチドまたはタンパク質をコードする可能性があるＤＮＡ分子中のヌクレオチドの配列を指す。それは、開始トリプレット（ＡＴＧ）で始まり、その後にそれぞれがアミノ酸をコードするトリプレットの鎖が続き、終止トリプレット（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わる。
「作動可能に連結された」という語句は、（１）第１の配列（複数可）またはドメインが第２の配列（複数可）もしくはドメインまたはその第２の配列またはドメインの制御下にある領域に影響を及ぼし得るように第２の配列（複数可）またはドメインに対して十分に近位に配置された第１の配列（複数可）またはドメイン、ならびに（２）プロモーター配列が第２の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始及び媒介する、プロモーターと第２の配列との間の機能的結合、を指す。一般に、作動可能に連結されるということは、連結された核酸配列が連続的であり、２つのタンパク質コード領域を繋げるために必要な場合、同じリーディングフレームにあることを意味する。いくつかの実施形態によれば、「作動可能に連結された」という語句は、２つ以上のタンパク質ドメインまたはポリペプチドが、得られた融合タンパク質のそれぞれのタンパク質ドメインまたはポリペプチドがその元の機能を保持するように、組換えＤＮＡ技術または化学反応を介して連結または結合される連結を指す。
本明細書で使用される場合、「全生存」（ＯＳ）という用語は、疾患と診断された患者がまだ生存している、疾患の診断日または治療の開始のいずれかからの期間の長さを指す。
本明細書で使用される場合、「パラクリンシグナル伝達」という用語は、隣接する細胞に作用する分泌シグナル分子を介した短距離の細胞間コミュニケーションを指す。
本明細書で使用される場合、「非経口」という用語及び他の文法的形態は、口または消化管以外の体内で発生する物質の投与を指す。例えば、本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、例えば、皮下（すなわち、皮膚の下の注射）、筋肉内（すなわち、筋肉内への注射）、静脈内（すなわち、静脈内への注射）、髄腔内（すなわち、脊髄の周りまたは脳のくも膜の下の空間への注射）、または注入技術を含む、注射（すなわち、注射による投与）による体内への導入を指す。
本明細書で使用される場合、「受動免疫」という用語は、受動免疫の生成を指し、母から胎児へのように自然に、または意図的な接種（人工受動免疫）によって抗体の導入から得られる免疫を意味する。受動免疫は、自然または人工のメカニズムのいずれかによって誘発することができる。抗体が導入される場合、導入される特定の抗体に関する受動免疫は特異的である。受動細胞性免疫は、免疫細胞源からの生きたリンパ系細胞の導入によって生成され、しばしば養子免疫または適応免疫と呼ばれる。
「末梢血単核球」または「ＰＢＭＣ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、末梢血に由来する単核球を指す。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、標的の状態、症候群、障害、または疾患を予防、強度の軽減、治癒またはその他の方法で治療するために使用される組成物を指す。「製剤」及び「組成物」という用語は、本明細書では互換的に使用され、すべての活性成分及び不活性成分を含む、記載された本発明の製品を指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、活性剤が安定で生物学的に利用可能であり続ける、記載される本発明の活性剤の投与に従来から使用可能な任意の実質的に非毒性の担体を指す。薬学的に許容される担体は、治療される哺乳動物への投与に適したものにするために、十分に高純度かつ十分に低い毒性のものでなければならない。さらに、活性剤の安定性とバイオアベイラビリティを維持する必要がある。薬学的に許容される担体は、液体または固体であってもよく、活性剤及び所与の組成物の他の成分と組み合わせた場合に、所望の容積、濃度などを提供するように計画された投与方法を考慮して選択することができる。
「薬学的に許容される塩」という用語は、本明細書で使用される場合、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答などを有さず、及び、合理的なベネフィット／リスク比に見合って、健全な医学的判断の範囲内においてヒト及び下等動物の組織に接触させて使用するのに適している塩を指す。医学で使用される場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容されない塩は、その薬学的に許容される塩を調製するために都合よく使用され得る。このような塩としては、次の酸から調製されたものが挙げられるが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸塩、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン－２－スルホン酸、及びベンゼンスルホン酸。また、そのような塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製することができる。「薬学的に許容される塩」とは、本明細書で使用される場合、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答などを有さず、及び、合理的なベネフィット／リスク比に見合って、健全な医学的判断の範囲内においてヒト及び下等動物の組織に接触させて使用するのに適している塩を意味する。製薬上許容される塩は当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｐ． Ｈ． Ｓｔａｈｌらは“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ” （Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ： ２００２）に、薬学的に許容される塩について詳しく説明している。塩は、本発明に記載されている化合物の最終的な単離及び精製中にその場で、または遊離塩基官能基を適切な有機酸と反応させることにより別々に調製することができる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルフィン酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、炭酸水素塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、及びウンデカン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。また、塩基性窒素含有基は、例えば、メチル、エチル、プロピル、及びブチル塩化物、臭化物、及びヨウ化物などの低級ハロゲン化アルキル、例えば、ジメチル、ジエチル、ジブチル、及びジアミル硫酸塩などの硫酸ジアルキル、例えば、デシル、ラウリル、ミリスチル、及びステアリル塩化物、臭化物、及びヨウ化物などの長鎖ハロゲン化物、例えば、ベンジル及びフェネチル臭化物などのハロゲン化アラルキル、ならびにその他のものなどの薬剤を用いて、四級化することができる。それによって、水または油溶性または分散性生成物が得られる。薬学的に許容される酸付加塩を形成するために使用できる酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、及びリン酸などの無機酸、ならびにシュウ酸、マレイン酸、コハク酸、及びクエン酸などの有機酸が挙げられる。塩基性付加塩は、カルボン酸含有部分を、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩、または重炭酸塩などの適切な塩基と、またはアンモニアもしくは有機一級、二級または三級アミンと反応させることによって、本発明に記載の化合物の最終的な単離及び精製中にその場で調製することができる。薬学的に許容される塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類金属に基づくカチオン、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミンなどを含む無毒の四級アンモニア及びアミンカチオンが挙げられるが、これらに限定されない。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジンなどが挙げられる。薬学的に許容される塩はまた、当該技術分野で周知の標準的な手順を使用して、例えば、アミンなどの十分に塩基性の化合物を適切な酸と反応させて生理学的に許容されるアニオンをもたらすことによって得ることができる。カルボン酸のアルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム、もしくはリチウム）、またはアルカリ土類金属（例えば、カルシウムもしくはマグネシウム）の塩もまた作製され得る。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。天然に存在するアミノ酸のそのような類似体の本質的な性質は、タンパク質に組み込まれると、そのタンパク質が同じタンパク質に対して誘発される抗体に特異的に反応するが、完全に天然に存在するアミノ酸からなることである。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語はまた、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマカルボキシル化、ヒドロキシル化、及びＡＤＰリボシル化を含むがこれらに限定されない修飾を含む。よく知られているように、そして上記のように、ポリペプチドは完全に線状ではない場合があることが理解されよう。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐し得、そしてそれらは、一般に、自然なプロセシングイベント及び自然には起こらない人工的な操作によってもたらされるイベントを含む翻訳後イベントの結果として、分岐を含むかまたは含まない環状であり得る。環状、分岐、及び分岐環状ポリペプチドは、非翻訳の天然のプロセスによって、及び完全に合成された方法によっても合成することができる。いくつかの実施形態によれば、ペプチドは任意の長さまたはサイズである。
「タンパク質ドメイン」及び「ドメイン」という用語は、それ自体の三次構造を有するタンパク質の一部を指すために互換的に使用される。大きなタンパク質は一般に、ポリペプチド鎖の柔軟な領域を介して互いに接続された複数のドメインで構成されている。
以下の用語は、本明細書では、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチドの間の配列の関係を説明するために使用される：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」、及び（ｅ）「実質的同一性」。（ａ）「参照配列」という用語は、配列比較の基礎として使用される配列を指す。参照配列は、例えば、完全長のｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントとして、あるいは完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列として、指定された配列のサブセットまたは全体であり得る。（ｂ）「比較ウィンドウ」という用語は、ポリヌクレオチド配列の連続する特定のセグメントを指し、ポリヌクレオチド配列は参照配列と比較され得、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントに関して参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。一般に、比較ウィンドウは、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドの長さであり、任意選択で、少なくとも３０個の連続するヌクレオチドの長さ、少なくとも４０個の連続するヌクレオチドの長さ、少なくとも５０個の連続するヌクレオチドの長さ、少なくとも１００個の連続するヌクレオチドの長さ、またはそれ以上であり得る。当業者は、ポリヌクレオチド配列にギャップが含まれることによる参照配列との高い類似性を回避するために、ギャップペナルティが典型的に導入され、一致の数から差し引かれることを理解している。比較のための配列のアライメントの方法は、当該技術分野において周知である。
比較のための最適なアライメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０）の相動性アライメントアルゴリズムによって；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５：２４４４ （１９８８）の類似性の検索方法によって；Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／遺伝子プログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ；を含むが、これらに限定されないこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって実施され得る。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７－２４４ （１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１－１５３ （１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１－９０ （１９８８）；Ｈｕａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，８：１５５－６５ （１９９２）、及びＰｅａｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４：３０７－３３１ （１９９４）によって詳細に記載されている。データベース類似性検索に使用できるプログラムのＢＬＡＳＴファミリーには、次のものが含まれる：ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＢＬＡＳＴＮ、タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＢＬＡＳＴＸ、タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのＢＬＡＳＴＰ、ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ、及びヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのＴＢＬＡＳＴＸ。Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ １９，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９５）を参照されたい。別段の記載がない限り、本明細書で提供される配列同一性／類似性の値は、デフォルトのパラメーターを使用してプログラムのＢＬＡＳＴ２．０スイートを使用して取得された値を指す。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２ （１９９７）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センターから公開されている。このアルゴリズムでは、データベース配列内の同じ長さの単語と整列したときに、正の値のしきい値スコアＴに一致するかそれを満たすクエリー配列中の最初に長さの短い単語Ｗを識別することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔは、近傍単語スコアしきい値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前出）。これらの最初の近隣単語ヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、単語ヒットは、累積アラインメントスコアを増やすことができる限り、それぞれの配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基の対の報酬スコア；常に＞０）及びＮ（不一致の残基のペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向の単語ヒットの拡張は、次の場合に停止される。累積アラインメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ低下する；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になる；またはいずれかの配列の末端に到達した。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）。パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７ （１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小の合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。ＢＬＡＳＴ検索は、タンパク質がランダム配列としてモデル化され得ることを前提としている。しかしながら、多くの実際のタンパク質は、ホモポリマートラクト、短周期リピート、または１つ以上のアミノ酸が豊富な領域であり得る非ランダム配列の領域を含む。このような複雑度の低い領域は、タンパク質の他の領域が完全に異なっていても、無関係のタンパク質間で整列し得る。そのような低複雑度のアラインメントを減らすために、いくつかの低複雑度のフィルタープログラムを使用することができる。例えば、ＳＥＧ（Ｗｏｏｔｅｎ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．，１７：１４９－１６３ （１９９３））及びＸＮＵ（Ｃｌａｖｅｒｉｅ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．，１７：１９１－２０１ （１９９３））の、複雑度の低いフィルターは、単独で使用することも、組み合わせて使用することもできる。（ｃ）２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウにわたって最大の対応のために整列されたときに同じである２つの配列の残基を指すために本明細書で使用される。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、すなわちアミノ酸残基が、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有し、したがって、分子の機能特性を変化させない他のアミノ酸残基で置換されていることが理解されよう。アミノ酸配列が保存的置換によって異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的な性質によって補正するように上方調整されてもよい。このような保守的な置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有していると言われる。この調整を行うための手段は、当業者にはよく知られている。典型的に、これには、完全な不一致ではなく部分的な不一致として保守的な置換をスコアリングすることが含まれ、それによって配列同一性のパーセンテージが増加する。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられる場合、保存的置換には０から１の間のスコアが与えられる。保守的置換のスコアリングは、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）に実装されているとおり、Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ．，４：１１－１７ （１９８８）に従って計算される。（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」という用語は、本明細書で使用され、比較ウィンドウ上で２つの最適に整列された配列を比較することによって決定される値を意味し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントに関して参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。（ｅ）ポリヌクレオチド配列の「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準パラメーターを使用して記載されたアラインメントプログラムの１つを使用して参照配列と比較して、少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、及び少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、これらの値を適切に調整して、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム配置などを考慮に入れることにより、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定できることを認識するであろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常、少なくとも６０％、または少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を意味する。ヌクレオチド配列が実質的に同一であるという別の指標は、２つの分子が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするかどうかである。しかしながら、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、依然として実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが、遺伝暗号によって許可された最大のコドン縮重を使用して作成された場合に発生する可能性がある。２つの核酸配列が実質的に同一であることの１つの指標は、第１の核酸がコードするポリペプチドが、第２の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。コドン縮重を考慮に入れることを含めて、遺伝暗号を参照することによって、本タンパク質のヌクレオチド配列に変異を加えることもできる。
本明細書で使用される場合、「プライム」（または「プライミング」）という用語は、に対する感受性を高めるプロセスを指す。免疫学的な意味で使用される場合、それは、Ｔ細胞及びＢ細胞の前駆体が、それらが特異的である抗原と遭遇するプロセスを指す。本明細書で使用される場合、「プライミングされていない細胞」（バージン、ナイーブ、または未経験細胞とも呼ばれる）という用語は、特定の特異性の抗原受容体（Ｔ細胞の場合はＴＣＲ、Ｂ細胞の場合はＢＣＲ）を生成したが、抗原に遭遇したことは一度もないＴ細胞及びＢ細胞を指す。例えば、ヘルパーＴ細胞及びＢ細胞が相互作用して特異的抗体を産生することができるようになる前に、抗原特異的Ｔ細胞前駆体はプライムされる必要がある。プライミングはいくつかのステップを含む：抗原取り込み、プロセシング、抗原提示細胞によるクラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合した細胞表面発現、リンパ組織におけるヘルパーＴ細胞前駆体の再循環及び抗原特異的捕捉、ならびにＴ細胞の増殖及び分化（Ｊａｎｅｗａｙ，ＣＡ，Ｊｒ．，Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９８９） １（１）： １３－２０）。ヘルパーＴ細胞はＣＤ４を発現するが、すべてのＣＤ４ Ｔ細胞がヘルパー細胞ではない（同上）。ヘルパーＴ細胞のクローン性拡大に必要なシグナルは、他のＣＤ４ Ｔ細胞によって必要とされるものとは異なる。ヘルパーＴ細胞プライミングのための極めて重要な抗原提示細胞はマクロファージのようであり、ヘルパーＴ細胞増殖のための極めて重要な第２のシグナルは、マクロファージ生成物のインターロイキン１（ＩＬ－１）である（同上）。プライミングされたＴ細胞及び／またはＢ細胞が第２の共刺激シグナルを受容した場合、それらは活性化されたＴ細胞またはＢ細胞になる。
本明細書で使用される場合、「無増悪生存期間」または「ＰＦＳ」という用語は、自己免疫疾患などの疾患の治療中及び治療後、患者がその疾患と共に生きるが、それが悪化しない期間の長さを指す。臨床試験では、無増悪生存期間を測定することは、新しい治療がどの程度機能するかを判断する１つの方法である。
本明細書で使用される場合、「精製」という用語及びその様々な文法形式は異質な、無関係な、または好ましくない因子を単離またはそれから解放するプロセスを指す。したがって、「精製された物質」という用語は、異質な、無関係な、または好ましくない因子がない物質を指す。
「レポーター遺伝子」（「レポーター」）または「アッセイマーカー」という用語は、検出することができる、または容易に同定及び測定することができる遺伝子及び／またはペプチドを指す。レポーターの発現は、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのいずれかで測定できる。実験的アッセイプロトコールで検出され得る遺伝子産物としては、マーカー酵素、抗原、アミノ酸配列マーカー、細胞表現型マーカー、核酸配列マーカーなどが挙げられるが、これらに限定されない。研究者は、細胞培養、細菌、動物、または植物で、レポーター遺伝子を目的の別の遺伝子に付加することができる。例えば、一部のレポーターは選択可能なマーカーであるか、それらを発現する生物に特性を付与して、生物を容易に識別及びアッセイできるようにする。レポーター遺伝子を生物に導入するために、研究者はレポーター遺伝子と目的の遺伝子を同じＤＮＡ構築物に配置して、細胞または生物に挿入することができる。培養中の細菌または真核細胞の場合、これはプラスミドの形であり得る。一般的に使用されるレポーター遺伝子としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ならびにクロラムフェニコール及びカノマイシンなどの選択可能なマーカーが挙げられ得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「シリアルキラー細胞」という用語は、複数の腫瘍または病原体に感染した細胞を殺傷する能力を示しながら、そのような殺傷作用に対する耐性を示す、細胞の集団を指す。このエフェクター機能を示す細胞には、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＬＡＫ細胞、ＣＩＫ細胞、ＭＡＩＴ細胞、ＣＤ８＋ＣＴＬ、ＣＤ４＋ＣＴＬなどの複数の種類がある。シリアルキラーエフェクター機能は、細胞溶解または細胞傷害性活性を介して直接的であり得るか、または病原性及びがん性細胞を標的とする他の細胞及びタンパク質の免疫調節を介して間接的であり得る。
エフェクターシリアルキラー細胞
免疫系のシリアルキラー細胞は、それらのシリアル殺傷作用を通じて病原体に対する迅速な免疫を提供し得る。このエフェクター機能を発揮する細胞には複数の種類がある。いくつかの実施形態によれば、シリアルキラー細胞としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ＣＤ８＋細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、及びＣＤ４＋ＣＴＬが挙げられる。シリアルキラーエフェクター機能は、複数の腫瘍または病原体に感染した細胞を殺傷しながら、そのような殺傷作用に対する耐性を示す能力として定義される。シリアルキラーエフェクター機能は、細胞溶解または細胞傷害性活性を介して直接的であり得るか、または病原性及びがん性細胞を標的とする他の細胞及びタンパク質の免疫調節を介して間接的であり得る。
活性化経路は異なり得るが、シリアルキラー細胞はパーフォリン／グランザイムまたはグラニュライシンメカニズムを介して標的細胞を直接殺傷することができる。細胞傷害性プロセスの最初のステップは、特異的（ＣＴＬの場合）または非特異的（ＮＫ及びＮＫＴの場合）の標的細胞認識である。次いで、シリアルキラー細胞と標的細胞の間に溶解シナプスが形成される。標的細胞上の接着分子（インテグリンＬＦＡ－１とそのリガンドＩＣＡＭ－１またはＩＣＡＭ－２など）は、免疫シナプスに向けて細胞傷害性顆粒を分極化する。ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞などの多くの免疫細胞によって発現されるＩｇスーパーファミリー受容体ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）がシリアルキラー細胞表面上の接着分子と結合すると、それはリン酸化されて活性化シグナルを送信する潜在能力を有するようになる。タンパク質のネクチンファミリーのメンバーであるＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン様タンパク質ファミリーのメンバーであるネクチン－２（ＣＤ１１）などのＤＮＡＭ－１のリガンドは、腫瘍細胞によって頻繁に発現される。シリアルキラー細胞が活性化されると、パーフォリンとグランザイム、特にグランザイムＢを含む細胞傷害性顆粒が放出される。（Ｍａｒｃｕｓ，Ａｓｓａｆ，ｅｔ ａｌ． “Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ．” Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１４，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ４２２８９３１／を参照されたい）。
パーフォリンは、Ｃａ２＋イオンの助けを借りて、重合し、標的細胞に結合し、標的細胞膜にチャネルを形成することができる。グランザイムは、アポトーシスを導くカスパーゼカスケードを酵素的に活性化するセリンプロテアーゼである。パーフォリンは膜リン脂質を介して結合し、Ｃａ２＋に結合するホスファチジコリンは、標的細胞膜へのパーフォリンの親和性を高める。パーフォリンによって形成された細孔は、細胞膜を破壊し、イオンとポリペプチドの自由な流入と流出を可能にし、さらにグランザイム分子の送達を可能にする。細胞の破壊と細胞傷害性グランザイムの送達は、最終的にアポトーシス促進経路の活性化とＤＮＡ分解を誘発し、細胞死を引き起こす。このメカニズムは、パーフォリン／グランザイムの発現だけでなく、温度、ｐＨ、カルシウム濃度などの他の多くの因子にも依存する（Ｌｏｐｅｚ，Ｊａｍｉｅ Ａ．，ｅｔ ａｌ． “Ｐｅｒｆｏｒｉｎ Ｆｏｒｍｓ Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ Ｐｏｒｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｌａｓｍａ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｏ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ Ｒａｐｉｄ Ａｃｃｅｓｓ ｏｆ Ｇｒａｎｚｙｍｅｓ ｄｕｒｉｎｇ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ａｔｔａｃｋ．” Ｂｌｏｏｄ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，４ Ａｐｒ． ２０１３，ｗｗｗ．ｂｌｏｏｄｊｏｕｒｎａｌ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１２１／１４／２６５９を参照されたい。Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．”Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．”Ｊａｎｅｗａｙｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ． ９ｔｈ ｅｄ．，ＧＳ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ，２０１７． ｐｐｓ．３８７－３９５も参照されたい）。
シリアルキラー細胞はまた、デスレセプター／リガンド経路を介してアポトーシスを誘導することができる。例えば、一部のシリアルキラー細胞は、それらの細胞膜上にＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）を発現する。ＦａｓＬが標的細胞の膜に存在するＦａｓと接触して結合すると、Ｆａｓは連結され、カスパーゼの活性化を引き起こし、標的細胞にアポトーシスを誘導する（Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，“Ｃｈａｐｔｅｒ １： Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｐａｕｌ，Ｗ． Ｅ．，Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９９））。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連のアポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体／ＴＲＡＩＬメカニズムは、別のデス受容体／リガンド経路である。ＴＲＡＩＬは、多くのシリアルキラー細胞タイプで発現する膜貫通タンパク質であり、さまざまな腫瘍細胞でアポトーシス死を誘導するが、ほとんどの正常細胞では誘導しない。ＴＲＡＩＬリガンドが２つのアポトーシス誘導受容体ＴＲＡＩＬ－Ｒ１またはＴＲＡＩＬ－Ｒ２のいずれかに結合すると、受容体は三量体化され、細胞死誘導シグナル伝達複合体（ＤＩＳＣ）が標的細胞上で組み立てられる（Ｆａｌｓｃｈｌｅｈｎｅｒ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ，ｅｔ ａｌ． “Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ＴＲＡＩＬ’ｓ Ｐａｔｈ ｉｎ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ．” Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，Ｊｕｎｅ ２００９，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ２６９１７７９／）。
Ｆａｓ／ＦａｓＬとＴＲＡＩＬ－Ｒ／ＴＲＡＩＬはどちらも、次のように進行する。アダプター分子であるＦａｓ関連デスドメイン（ＦＡＤＤ）は、受容体の細胞内デスドメインと相互作用するＤＩＳＣに移動する。ＦＡＤＤは、２番目の機能ドメインであるデスエフェクタードメイン（ＤＥＤ）を介して、プロカスパーゼ８及び１０をＤＩＳＣに動員し、そこで自己触媒的に活性化して、カスパーゼ依存性シグナル伝達カスケードを開始し、最終的に細胞死を引き起こす（同上）。
多くのシリアルキラー細胞は、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ－１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、形質転換増殖因子（ＴＧＦβ）、インターロイキン（ＩＬ－３（ＩＬ－３））、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ケモカイン（ＣＣＬ１、２、３、４）及び（ＣＸＣＬ８）など、周囲の細胞のエフェクター機能を調節するサイトカイン及びケモカインの分泌を介して免疫調節効果を発揮する。例えば、いくつかのシリアルキラー細胞は炎症促進性サイトカインを分泌する。標的細胞は、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γなどの炎症性サイトカインの存在により、ＴＲＡＩＬを介したアポトーシスに対して感作することができる。これらのサイトカインは、間接的な手段だけでなく、一酸化窒素及び他のフリーラジカルの生成を誘導する直接的な接触非依存性の細胞傷害性メカニズムを通じて、または腫瘍細胞内のデス経路を活性化することによって、アポトーシスを増強することができる。ＩＦＮ－γはマクロファージを活性化することも判明しており、エフェクター細胞機能とＡＰＣとしての両方で攻撃部位にマクロファージを動員する。ＩＦＮ－γは、ＴＮＦ－αまたはＴＮＦ－βと相乗的に作用し、ＴＮＦ受容体Ｉ（ＴＮＦＲ－Ｉ）との相互作用を通じて一部の標的細胞を殺傷する（Ｉｔｏ ａｎｄ Ｓｅｉｓｈｉｍａ （２０１０），“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ．” Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ａｒｔ． ＩＤ． ６４１７５７）。
免疫系の１つの単一の群に簡単に分類できないさまざまなタイプのＮＫＴ及びＮＫなど、いくつかのシリアルキラー細胞タイプがある。これらの細胞型には、Ｂ－１細胞、辺縁帯（ＭＺ）Ｂ細胞、γδＴ細胞の特定のサブセット、腸内のＣＤ８αα発現Ｔ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞、ＭＡＩＴ細胞が含まれる。これらの細胞型はそれぞれ、Ｂ細胞受容体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいずれかの抗原特異的受容体を発現する。これは、Ｔ細胞とＢ細胞が、多くの異なるタイプの分子を集合的に認識することができるユニークな抗原受容体を生成するための、可変（Ｖ）、多様（Ｄ）、及び結合（Ｊ）遺伝子として知られる異なる遺伝子セグメントをランダムに組み立てるプロセスであるＶＤＪ組換えによって生成される。これらの受容体の特異性のレパートリーは非常に限られているため、これらの細胞は限られた多様性の抗原と反応する。
さまざまな種類のＮＫＴ及びＮＫによって発現される受容体は、自然免疫系の細胞によって発現されるパターン認識受容体と類似している。Ｔリンパ球系統の細胞はさらに、免疫記憶を発達させることができない、エフェクター機能の迅速な誘発、及び自己反応性の傾向などの独特の特徴を示す。Ｔリンパ球系統を従来のＴ細胞と共有しているにもかかわらず、これらの細胞は、特定のサイトカインを産生する能力、他の免疫細胞（従来のＴ細胞、ＮＫ、及び／またはＤＣなど）を活性化する能力、ならびに細胞傷害性活性及び／またはＦａｓリガンド（ＦａｓＬ／Ｆａｓ）及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）などの細胞死誘導エフェクター分子の発現及びそれとの相互作用を通じて細胞死を誘導する能力など、明らかにＮＫ様及びＴ細胞様の特性を示す（Ｉｔｏ ａｎｄ Ｓｅｉｓｈｉｍａ （２０１０），“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ．” Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ａｒｔ． ＩＤ． ６４１７５７）。ＣＴＬを含む他の細胞はＮＫＴ及びＮＫＣとシリアル殺傷能力を共有する同様のエフェクター機能を示す。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ヒト及び他の哺乳動物に見られる細胞溶解性顆粒リンパ球である。それらは、標的に対する事前の免疫化がない場合でさえ、溶解活性に対するそれらの生来の能力によって特徴付けられる（Ｓｅａｍａｎ （２０００） “Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．” Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４３（６）： １２０４－１２１７）。
ＮＫは、活性化された細胞傷害性Ｔ細胞の形態を有しており、細胞傷害性で使用される顆粒を含む細胞質が拡張された状態で典型的には大きくなる。ＮＫは現在、表２に示すようなさまざまな表面受容体によって識別できる。
Figure 2022553411000004
Figure 2022553411000005
Figure 2022553411000006
Figure 2022553411000007
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特定のＮＫ細胞は典型的には、一連の活性化受容体に加えて２～４個の抑制性受容体を発現し、抑制性受容体と活性化受容体のさまざまな組み合わせにより、ＮＫ集団内にかなりの不均一性が生じる。このため、ＮＫはさまざまな病態において、さまざまな刺激に反応し、さまざまな免疫応答に関与する能力があると考えられている（Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎ （２０１５）． “Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ： Ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．” Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｏｎｃｏｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅ． ８（２）： ４７－５５）。
ＮＫ細胞は、Ｂ細胞及び骨髄由来細胞と同様に、主に骨髄で発生する。それらはリンパ節と肝臓で発生することも判明している。それらは、ＮＫ系統へのコミットメントを示す造血幹細胞（ＨＳＣ）から生成することができ、したがって、特定の転写因子の影響下で最終的にＮＫに成熟するＮＫ前駆体（ＮＫＰ）を生成する。ＮＫの発生に関与する転写、可溶性、及び膜因子には、生成段階で、Ｅｔｓ－１、Ｉｄ２、Ｉｋａｒｏｓ、及びＰＵ．１が含まれ、未熟なＮＫの成熟では、Ｇａｔａ－３、及びＩＲＦ－２が含まれ、成熟したＮＫの機能的分化では、ＣＥＢＰ－γ、ＭＥＦ、ＭＩＴＦが含まれる。サイトカインのインターロイキン１５（ＩＬ－１５）は、ＮＫの発生の恒常性と生存に不可欠であることが示されている。Ｔ細胞に由来するペプチドであるサイトカインインターロイキン－２（ＩＬ－２）は、ＮＫ細胞の細胞溶解機能の成熟に関与している（同上）。
ＮＫは典型的には、病原体に感染した細胞や悪性細胞を含むほとんどの組織に浸潤すると、活性化されるまで末梢血を循環していることが見出された。それらは、循環しているヒトリンパ球の全末梢血単核球（ＰＢＭＣ）集団の全細胞の１０％に相当する。扁桃腺、リンパ節、及び脾臓などの二次リンパ組織に見られるＮＫは、末梢血のＮＫとは異なり、リンパＮＫはＤＣによって活性化され、Ｔ細胞によるより効率的な殺傷反応を刺激するインターフェロンなどの特定のサイトカインを分泌する（同上）。
ＮＫ刺激とエフェクター機能は、そのさまざまな受容体に由来するシグナルの統合に依存している。ＮＫは、それらの細胞傷害性機能を介して、ウイルスに感染した細胞及び腫瘍細胞を認識して殺傷することができる。
ＮＫはさらに、ＮＫがサイトカインの産生を刺激する免疫調節の役割を果たす。このように、ＮＫは他の細胞、特に免疫系の細胞の活動を調節する能力を有する。ＮＫ誘導によって放出されるサイトカインのパターンは刺激によって異なる。したがって、ＮＫは、Ｔ細胞と同様に、適応免疫に対する有効性が異なる個別の機能サブセットに分化する。
ＮＫ上のＩＦＮ－γならびにＩＬ－２及びＩＬ－１２などの他の機能的免疫刺激因子の存在は、ＣＤ３、ＣＤ５６陽性、非主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）拘束、ナチュラルキラー（ＮＫ）様Ｔリンパ球であるサイトカイン誘導キラー細胞（ＣＩＫ）を生じさせ得るリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞へのＮＫの活性化及び拡大を引き起こす。ＬＡＫ細胞は、パーフォリン、ＮＫｐ４４、グランザイム、ＦａｓＬ、及びＴＲＡＩＬなどのエフェクターまたは接着分子を上方制御し、ＩＦＮ－γを分泌して腫瘍細胞に接着及び溶解する（Ｎａｉｒ ａｎｄ Ｄｈｏｄａｐｋａｒ （２０１７）． “Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８：１１７８）。ＣＩＫは、腫瘍標的に対する細胞溶解活性を増強し得る。
ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｉ型ＮＫＴ細胞、及びγδＴ細胞のサブセットの表面に発現する活性化受容体である （Ｌａｎｉｅｒ，ＬＬ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． （２０１５） ３（６）： ５７５－８２を参照されたい）。ヒトとマウスでは、ＮＫ細胞は２つの異なるＣ型レクチン様受容体ＣＤ９４とＮＫＧ２のヘテロ二量体を発現し、それは非多型ＭＨＣクラスＩ様分子（ヒトではＨＬＡ－Ｅ、マウスではＱａ１）と相互作用する。ＨＬＡ－Ｅ及びＱａ１は、病原体に由来するペプチドに結合する代わりに、ＥＲでの処理中に他のＭＨＣクラスＩ分子に由来するシグナルペプチドのフ断片に結合するという点で通常と異なる（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊａｎｅｗａｙｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ． ９ｔｈ ｅｄ．，ＧＳ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ，２０１７． ｐ． １２９を参照されたい）。これにより、ＣＤ９４：ＮＫＧ２は、その発現がウイルスの標的となり得るいくつかの異なるＭＨＣクラスＩ変異体の存在を検出し、ＭＨＣ分子の全体的な発現が減衰している細胞を殺傷することができる。
ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞の活性化に特化した役割を果たす。２つのＮＫＧ２Ｄ分子は、さまざまなタイプの細胞ストレスによって誘導されるいくつかのＭＨＣクラスＩ様分子に結合するホモ二量体を形成する。これらには、ストレスを受けた細胞及び悪性細胞によって発現されるヒト誘導性ＭＨＣクラスＩ関連分子であるＭＩＣ分子ＭＩＣ－Ａ及びＭＩＣ－Ｂ、及び主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連遺伝子のＲＡＥＴ１ファミリーが含まれる。ＲＡＥＴ１はＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドとして機能する。ＮＫＧ２Ｄのリガンドは、細胞ストレスまたは代謝ストレスに応答して発現し、細胞内細菌及びほとんどのウイルスに感染した細胞、ならびに悪性に形質転換された初期腫瘍細胞で上方制御される。したがって、ＮＫＧ２Ｄによる認識は、免疫系に対する一般化された「危険」シグナルとして機能する （Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊａｎｅｗａｙｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ． ９ｔｈ ｅｄ．，ＧＳ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ，２０１７． ｐ． １３０）。
ナチュラルキラー様Ｔ細胞（ＮＫＴ）
ＮＫＴは免疫系の迅速な応答者であり、さまざまな疾患環境において強力な免疫調節及びエフェクター機能を仲介する。活性化されると、ＮＫＴは最初にエフェクター細胞に分化することなく、サイトカイン分泌や細胞溶解活性などのエフェクター機能を即座に開始できる。ＮＫＴの反応の速さは、ＮＫＴを自然免疫の防御の非常に最前線の重要なプレーヤーにする。さらに、ＮＫＴによって分泌されるサイトカインの多くは、αβ Ｔ細胞の分化と機能に強力な影響を及ぼし、ＮＫＴを適応免疫の防御にも連携させる。
ＮＫＴは、従来のＴ細胞とＮＫの両方と形態学的及び機能的特徴を共有する細胞である。ＮＫＴはＴ系統を有し、従来のＴ細胞に特徴的なＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を発現するが、ＮＫに特徴的な細胞表面タンパク質も発現する。そのため、それらは自然免疫と適応免疫の間の架け橋とみなされる。
ＮＫＴは、脾臓、肝臓、胸腺、骨髄、リンパ節、臍帯血、及び末梢血など、Ｔ細胞及びＮＫが見られるほぼすべての場所で見られる。それらは典型的には、ヒト及び非ヒト霊長類の末梢血の１％未満を構成する（Ｗａｈ，ＭａｋＴａｋ，ｅｔ ａｌ． “Ｃｈａｐｔｅｒ １１： ＮＫ，γδ Ｔ ａｎｄ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ．” Ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１４）。様々なタイプのＮＫＴの活性化は、特定のサイトカインを産生する能力、従来のＴ細胞、ＮＫＣ、及び／またはＤＣなどの他の免疫細胞を活性化する能力、ならびに細胞傷害性活性及び／またはＦａｓリガンド（ＦａｓＬ／Ｆａｓ）及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）などの細胞死誘導エフェクター分子の発現及びそれとの相互作用を通じて細胞死を誘導する能力などの様々な免疫調節応答をもたらす。
以下の表３（Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ． （２００４）． “ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ： ｗｈａｔ’ｓ ｉｎ ａ ｎａｍｅ？” Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４：２３１－２３７より翻案）に示すように、３つのＮＫＴ細胞サブタイプ（Ｉ型、ＩＩ型、及びＮＫＴ様細胞）は、異なるＴＣＲ及びＴＣＲ活性化を発現し、特定の機能的活動を導くさまざまな細胞内イベントを促進する。それぞれの分類には、さまざまな表現型に応じて、さらに多くのサブタイプが含まれている。タイプ１ ＮＫＴ（ＮＫＴ－Ｉ、不変ＮＫＴ、またはｉＮＫＴとも呼ばれる）には、ＴＣＲβ鎖レパートリーが制限された不変ＴＣＲα鎖がある。ＩＩ型ＮＫＴ（多様なＮＫＴ、ｄＮＫＴ、バリアントＮＫＴ、ｖＮＫＴ、またはＮＫＴ－ＩＩとも呼ばれる）は、さまざまな異なるＴＣＲ鎖の組み合わせを表現するという点でより多様である。さらに、研究によれば、他のＣＤ１拘束Ｔ細胞及びＭＲ１拘束粘膜関連不変Ｔ細胞（ＭＡＩＴ）などのＮＫＴ様細胞が存在することが示唆されている。Ｂｅｎｎｓｔｅｉｎ （２０１７），“Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ－Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ” Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８：１９５０。しかしながら、今日知られていることの多くは、Ｉ型ＮＫＴに関するものである。
Figure 2022553411000009
Ｔ細胞と同様に、ＮＫＴは多様または半不変のαβ ＴＣＲを発現し、ＴＣＲは保存されたマルチサブユニットシグナル伝達装置であるＣＤ３複合体に非共有結合する。しかしながら、古典的なクラスＩ（ＣＤ８＋）またはクラスＩＩ（ＣＤ４＋）ＭＨＣ分子に結合したペプチド抗原によって活性化できるαβＴＣＲを発現するＴ細胞とは異なり、ほとんどのＮＫＴは、非古典的なクラスＩＭＨＣ様分子であるＣＤ１ｄに存在する糖脂質抗原に応答する（Ｓｅａｍａｎ （２０００） “Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．” Ａｒｔｈｉｒｉｔｓ ＆ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ ４３（６）： １２０４－１２１７）。換言すると、ＮＫＴのＴＣＲは、ＤＣ、マクロファージ（Ｍｏ）、Ｂ細胞、胸腺細胞、脂肪細胞、肝細胞、及び内皮細胞など、プロフェッショナル及び非プロフェッショナルのＡＰＣ（抗原提示細胞）によって発現される非多形性ＣＤ１ｄ分子に提示される糖脂質、スフィンゴ糖脂質、または脂質構造を認識する（Ｗａｈ，ＭａｋＴａｋ，ｅｔ ａｌ． “Ｃｈａｐｔｅｒ １１： ＮＫ，γδ Ｔ ａｎｄ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ．” Ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１４）。
ＣＤ５６は一部のタイプのＮＫＴに存在する。この分子は、神経細胞接着分子１（ＮＣＡＭ１）の一種であり、他の分子との結合を可能にする。したがって、ＣＤ５６を発現する分子は、同型接着（同一の細胞型間の未定義の接着分子によって媒介される接着を意味する）によって互いに結合することができる。ＣＤ５６はナチュラルキラー細胞の典型的な表現型マーカーであるが、実際には、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＤＣ、及び単球など、より多くの免疫細胞で発現し得る（Ｖａｎ Ａｃｋｅｒ，ＨＨ，ｔ ａｌ．，“ＣＤ５６ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ａ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ？” Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１７） ８： ８９２）。
一般に、ＮＫＴの活性化は、活性化シグナル伝達と抑制性シグナル伝達のバランスによって調節され得る。しかしながら、ＮＫＴによるＮＫ受容体の発現は、ＮＫＴの発生段階、その活性化状態、及び宿主の遺伝的背景によって異なる （Ｗａｈ，ＭａｋＴａｋ，ｅｔ ａｌ． “Ｃｈａｐｔｅｒ １１： ＮＫ，γδ Ｔ ａｎｄ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ．” Ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１４）。活性化は、ＮＫＴ ＴＣＲがＣＤ１ｄ分子上の適切な抗原と結合することによって直接、またはＡＰＣを介した誘導によって間接的に発生し得る。
ＮＫと同様に、ＮＫＴ刺激とエフェクター機能は、そのさまざまな受容体に由来するシグナルの統合に依存している。ＮＫＴは、それらの細胞傷害性機能を介して、ウイルスに感染した細胞及び腫瘍細胞を認識して殺傷することができる。ＮＫＴは、ＡＰＣを活性化して、適応性の抗腫瘍免疫を開始することもできる。さらに、ＮＫＴは、ＮＫ及びＣＴＬのシリアルキラー作用を活性化する炎症促進性サイトカインを分泌し得る。
ＮＫＴは、パーフォリン／グランザイム経路、Ｆａｓ／ＦａｓＬ経路、及びＴＲＡＩＬ経路を介して腫瘍細胞を殺傷することができる。活性化されたＮＫＴは、それらの表面にパーフォリンとＦａｓリガンドを発現し、腫瘍細胞を直接殺傷することができる。ＣＤ５６＋ＮＫＴは、ＣＤ５６－よりも効率的なキラー細胞のようである（Ｔｅｒａｂｅ，Ｍａｓａｋｉ，ａｎｄ Ｊａｙ Ａ． Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ． ”Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｂａｌａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．” Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１２，Ｃｈ． ５： Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１ｄ＋ ａｎｄ ＣＤ１ｄ－ Ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ： Ｔｈｅ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＣＤ１ｄ＋ ａｎｄ ＣＤ１ｄ－ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ” ｐｐ ７１－９３）。
ＮＫＴは、ＮＫによって媒介されるＡＤＣＣを増強することもできる（Ｔｅｒａｂｅ，Ｍａｓａｋｉ，ａｎｄ Ｊａｙ Ａ． Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ． ”Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｂａｌａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．” Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１２，Ｃｈ． ５： Ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１ｄ＋ ａｎｄ ＣＤ１ｄ－ Ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ： Ｔｈｅ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ＣＤ１ｄ＋ ａｎｄ ＣＤ１ｄ－ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ” ｐｐ ７１－９３）。
ＮＫＴはさらに免疫調節の役割を果たし、ＮＫＴは、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、コロニー刺激因子１（ＣＳＦ－１）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、形質転換増殖因子（ＴＧＦβ）、インターロイキン（ＩＬ）３（ＩＬ－３）、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ケモカイン（ＣＣＬ１、２、３、４）、及び（ＣＸＣＬ８）を含むが、これらに限定されない、サイトカインの産生を刺激する。
ＮＫＴは、直接的な細胞溶解、適応細胞機能の免疫調節、及び免疫抑制細胞の調節を通じて、がんを含む多くの疾患環境で免疫応答を調節することが示されている。活性化されると、脾臓、肝臓、または骨髄のＮＫＴは、抗原に遭遇してから３日以内に刺激され、急速なクローン拡大が起こる。しかしながら、上で論じたように、活性化されたＮＫＴは、分化を必要とせずにエフェクター機能を即座に実行できる。したがって、ＮＫＴは「事前に活性化された状態」で存在し、従来のＴ細胞が増殖及びより細かく調整された適応応答のエフェクターへの分化に必要な間隔でタイムリーかつ効果的な防御を提供すると言われている。
ＮＫＴは、サイトカインの放出を介して免疫の調節に役割を果たす。ＮＫＴはＩＬ－４及びＩＦＮγの前もって形成されたｍＲＮＡを運ぶため、これらのサイトカインは活性化から１～２時間以内に大量に産生される。ＩＦＮγの分泌はＴｈ１応答を促進するが、ＩＬ－４の産生は、特に細胞がＣＤ３に対する抗体と接触した場合に、Ｔｈ２応答を促進する。さらに、ＮＫＴは、他のインターロイキンの中でも、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、及びＴＧＦβ、ＴＮＦα、及び多数のケモカインを合成できる。
ＮＫと同様に、ＮＫＴは、マウスとヒトではＮＫＧ２ＤとＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａを含み、ヒトでは特定のＫＩＲを含む、抑制性と活性化のＮＫ受容体を発現する。ＮＫＴは、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、及びＰＤ－１も発現する（Ｗａｈ，ＭａｋＴａｋ，ｅｔ ａｌ． “Ｃｈａｐｔｅｒ １１： ＮＫ，γδ Ｔ ａｎｄ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ．” Ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１４）。
Ｉ型ＮＫＴ
Ｉ型ＮＫＴのＴＣＲは、主に生殖細胞系列のＶａ遺伝子（マウスではＶａ１４／Ｊａ１８、ヒトではＶａ２４／ＪａＱ）によってコードされ、さらに、より多様な非生殖細胞系列ＶＢ鎖遺伝子（マウスではＶＢ８．２／７／２、ヒトではＶＢ１１）によってコードされる。それらはα－結合糖脂質とβ－結合糖脂質の両方に応答し、主にα鎖を含む並列構成でＣＤ１ｄに結合する（Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｄｅｌｏｖｉｔｃｈ （２０１４） “Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍａｙ ｖａｒｙ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．” Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４２： ３２１－３３６）。
ＴＣＲα鎖は種のＮＫＴ間で本質的に不変であるが、ＴＣＲβ鎖は多様化され得る。例えば、ヒトでは、すべてのＮＫＴがＴＣＲを発現し、ＴＣＲα鎖はＶａ２４とＪａ１８を発現し、ＴＣＲβ鎖は通常Ｖβ２、７、または８を含む。細胞内シグナル伝達は結合するＣＤ３複合体によって伝達される（Ｗａｈ，ＭａｋＴａｋ，ｅｔ ａｌ． “Ｃｈａｐｔｅｒ １１： ＮＫ，γδ Ｔ ａｎｄ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ．” Ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１４）。
ＣＤ１ｄ依存性の活性化はＮＫＴ Ｉ型細胞の特徴であるが、ＮＫＴ Ｉ型細胞は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、またはＩＬ－１２及びＩ型ＩＦＮなどのいくつかのサイトカインへの曝露によってＣＤ１ｄ非依存的に刺激することもできる（Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｄｅｌｏｖｉｔｃｈ （２０１４） “Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍａｙ ｖａｒｙ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．” Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４２： ３２１－３３６．）。
研究者は、外因性抗原α－ガラクトシルセラミド（α－ＧａｌＣｅｒ）を認識する能力によって、実験室でＮＫＴ Ｉ型細胞を特定することができた。インビボで、マウスへの抗原の実験的投与は、そのＮＫＴ細胞を活性化し、それは次に、腫瘍拒絶を促進するか、または様々な病原体による感染から動物を保護するのを助ける（Ｗａｈ，ＭａｋＴａｋ，ｅｔ ａｌ． “Ｃｈａｐｔｅｒ １１： ＮＫ，γδ Ｔ ａｎｄ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ．” Ｐｒｉｍｅｒ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１４）。
一連のエフェクター分子を生成する能力があるため、Ｉ型ＮＫＴは、本質的にすべてのタイプの造血細胞の機能を調節する可能性がある。Ｉ型ＮＫＴは、ＤＣ、マクロファージ、及びＢ細胞などのＡＰＣ、ならびにＮＫ及び他のＴ細胞サブセットを含む他のリンパ球の機能を調節することが報告されている（Ｌｉａｏ ｅｔ ａｌ． （２０１４） “Ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｉ ａｎｄ Ｔｙｐｅ ＩＩ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｉ （ＮＫＴ） Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．” Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ． １９（６）： １３３０－１３３８）。
ＩＩ型ＮＫＴ
ＩＩ型ＮＫＴは、Ｉ型ＮＫＴよりもヒトに豊富に存在する。Ｉ型ＮＫＴとは異なり、ＩＩ型ＮＫＴはａ－ＧａｌＣｅｒまたは他のａ－結合型糖脂質に反応しない。代わりに、スルファチド、リゾスルファチド、リゾホスファチジルコリン（Ｌｙｓｏ－ＰＣ）、及びグルコシルスフィンゴシン（ｌｙｓｏ－ＧＬ１）などのＢ結合型糖脂質を認識する可能性がある。ＩＩ型ｄＮＫＴの大部分は、中枢神経系のミエリン、膵臓、腎臓、及び肝臓を含むいくつかの膜に富む、スルファチドとして知られる天然に存在する自己抗原を認識する。一般に、ＩＩ型ＮＫＴは、Ｉ型ＮＫＴによって誘発される炎症応答の下方制御によって自己免疫疾患からの保護を仲介する。ＩＩ型ＮＫＴのＴＣＲは、主に非生殖細胞型のＶａ鎖及びＶＢ鎖の遺伝子によってコードされている。ＩＩ型ＮＫＴは典型的には、リガンドをａ鎖ではなくＢ鎖と接触させる。これは、従来のＴ細胞（ｃｏｎｖＴＣ）が共有するメカニズムであり、Ｉ型ＮＫＴに対して程度が低い（Ｋｕｍａｒ ａｎｄ Ｄｅｌｏｖｉｔｃｈ （２０１４） “Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍａｙ ｖａｒｙ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．” Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４２： ３２１－３３６）。
研究によると、スルファチドで刺激すると、ＩＩ型ＮＫＴはＩ型ＮＫＴの機能を調節する能力を持っている。
ＮＫＴ様細胞（例えば、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞）
ＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）とＣＤ５６（ＮＫマーカー）の組み合わせを発現するＮＫＴは、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞としても知られるＮＫＴの主要な細胞傷害性サブセットである。ＣＩＫ細胞の表現型は、ＣＤ３+ＣＤ５６+、ＣＤ３+ＣＤ５６-、及びＣＤ３-ＣＤ５６+の間で変動するが、Ｆｃ受容体ＣＤ１６を発現しない場合がある。他のシリアルキラー細胞と同様に、ＮＫＴ様細胞は免疫調節エフェクター機能を有する（Ｇｕｔｅｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． （２００７）． “Ｃｙｔｏｋｉｎｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｔｙｐｅ ＩＩ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ．” ＧＭＳ Ｇｅｒｍａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５： １－４）。
Ｉ型及びＩＩ型ＩＩのＮＫＴからのＣＩＫ及びＮＫＴ様細胞の分化はよく理解されていない。
サイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）
ＣＩＫ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の不均一な集団であり、抗ＣＤ３抗体、ＩＦＮ－γ、及びＩＬ－２とのインキュベーションを介してエクスビボで拡大することができる。それらは、ＦａｓＬ／Ｆａｓ及びパーフォリン／グランザイムの作用によって媒介される細胞傷害性活性を有する。ＣＩＫは通常、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋タイプとＣＤ３＋ＣＤ５６－タイプの２つの主要なサブセットに分けられる。ＣＤ３＋ＣＤ５６＋Ｔ細胞（ＮＫＴ細胞）は、ＣＩＫの主要エフェクター細胞であると考えられている。ＣＩＫ細胞は、ＤＮＡＸアクセサリー分子－１、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及びＮＫｐ３０などのＮＫ細胞受容体を活性化することにより、ＭＨＣに拘束されない方法でがん細胞を溶解できる。いくつかの研究では、腫瘍細胞による刺激後、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－α、ＩＦＮ－γ、ＣＩＫ細胞から分泌されるＩＬ－２などの炎症促進性サイトカインのレベルが大幅に上方制御されることが示されている。これらのサイトカインは、全身の抗腫瘍活性をさらに高め、Ｔｈ１免疫応答を誘導する （Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ． “Ｃｙｔｏｋｉｎｅ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ａｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．” Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ，１９ Ｊｕｎｅ ２０１７，ｗｗｗ．ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎ．ｏｒｇ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１７．００７７４／ｆｕｌｌ）。
γδ Ｔ細胞（ＧＤＴ）
γδ Ｔ細胞（ＧＤＴ）は、自然免疫と適応免疫の間のギャップを橋渡しする別のシリアルキラー細胞集団である。Ｔ細胞系列で表面ＴＣＲを発現しているにもかかわらず、γδ Ｔ細胞はＮＫ受容体であるＮＫＧ２Ｄも提示し、細胞傷害性及び免疫調節エフェクター機能を活性化する非特異的認識を示す（Ｗｕ ＹＬ，Ｄｉｎｇ ＹＰ，Ｔａｎａｋａ Ｙ，Ｓｈｅｎ ＬＷ，Ｗｅｉ ＣＨ，Ｍｉｎａｔｏ Ｎ，Ｚｈａｎｇ Ｗ． γδ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ ２０１４；１０（２）：１１９－１３５． ｄｏｉ：１０．７１５０／ｉｊｂｓ．７８２３．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｊｂｓ．ｃｏｍ／ｖ１０ｐ０１１９．ｈｔｍより入手可能）。
ＧＤＴは、αβ ＴＣＲ（以下で説明）とγδ ＴＣＲの表面発現によって区別される２つの主要な集団に編成できる。αβ ＴＣＲを発現するＴ細胞は、一般にＣＤ４またはＣＤ８系統マーカーも発現する（上記で説明）。しかしながら、ＧＤＴは一般にこれらのマーカーを発現せず、さらにＭＨＣ提示に関連して従来の抗原提示を必要としない。ＧＤＴは、δ鎖の発現、具体的にはＶδ１、Ｖδ２、及びＶδ３鎖に基づいて集団にさらに編成できる。αβ ＴＣＲレパートリーの組み合わせの多様性と同様に、ＧＤＴの多様性は、広範な非遺伝的メカニズムのために、少なくともαβ ＴＣＲレパートリーの多様性と同じくらい大きい（同上）。
他のシリアルキラー細胞と同様に、ＧＤＴは、パーフォリン／グラニュライシン－グランザイム経路及びＦａｓ／ＦａｓＬなどのデス受容体／リガンド経路を介して細胞溶解／細胞傷害性エフェクター機能を有する。さらに、ＧＤＴはＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７サイトカインを分泌し、そのそれぞれが自然免疫及び適応免疫に免疫調節の影響を及ぼす。
細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）
細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、別個のリンパ球亜集団を構成する。ＮＫＴとは異なり、それらは主要組織適合抗原、タンパク質抗原、ウイルス、細胞内細菌、及びペプチドを含むいくつかの多様な刺激によって誘発される。
本明細書で論じられる他の多くの細胞と同様に、ＣＴＬは細胞溶解性エフェクター機能を有する。しかしながら、ＮＫ及びＮＫＴとは異なり、ＣＴＬは細胞傷害性タンパク質であるパーフォリンとグランザイムを抗原依存的に放出する。
ＣＤ８＋ＣＴＬ
一部のＮＫＴ及びＮＫとは異なり、ＣＤ８＋ＣＴＬはクラスＩＭＨＣに結合したペプチドを認識する。ＣＴＬの活性化と増殖は、特異的な抗原への曝露によって誘導される。ＮＫＴと同様に、ＣＤ８＋ＣＴＬの活性化により、腫瘍細胞などの標的細胞にアポトーシスを誘導するパーフォリン及びグランザイムなどの細胞溶解性メディエーターが分泌される。この作用は細胞特異的である： 研究は、ＣＤ８＋ＣＴＬが分泌装置をそれぞれの細胞に向け直し、一度に１つの接触点でのみ攻撃することを示唆している（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｊａｎｅｗａｙｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ． ９ｔｈ ｅｄ．，ＧＳ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ，２０１７． ｐｐｓ．３８７－３９５）。
ＮＫＴとさらに類似して、ＣＴＬはＩＦＮγ及びＴＮＦ－αなどのさまざまなサイトカインを分泌する。これらのサイトカインは、抗原提示を増強し、抗病原性効果を仲介する。ＩＦＮ－ｙは、感染細胞で新たに合成されたＭＨＣクラスＩタンパク質のペプチドローディングに関与するＭＨＣクラスＩ及びその他の分子の発現増加を誘導する。これにより、標的細胞が細胞傷害性攻撃で認識される機会が増加する。ＴＮＦ－αはＩＦＮ－γと相乗的に作用して、そのエフェクター機能を高める。効果的なＣＴＬ免疫の生成には、ＣＤ４＋Ｔ細胞を産生するＩＬ－２またはＩＦＮγなどのさまざまなサイトカインが必要であることが報告されている（Ｉｔｏ ａｎｄ Ｓｅｉｓｈｉｍａ （２０１０），“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ．” Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ａｒｔ． ＩＤ． ６４１７５７）。
Ｉ型ＮＫＴ活性化を介したＣＤ８＋ＣＴＬ誘導及び活性化の増強は、腫瘍または微生物に対する免疫増強を引き起こす。前出で論じたように、ＩＬ－１２（ＣＩＫ）またはａ－ＧａｌＣｅｒ（非ＣＩＫ ＮＫＴ）などによるＩ型ＮＫＴの活性化は、Ｔｈ１サイトカイン産生（ＩＦＮｙ）をもたらし得る。しかしながら、研究によると、ａ－ＧａｌＣｅｒによるＩ型ＮＫＴの活性化により、ＮＫＴがＴｈ１サイトカイン（ＩＦＮｙ）とＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－４）の両方を分泌し得ることを示される。一方、活性化されたＩＩ型ＮＫＴは、サイトカイン産生、すなわちＩＬ－４、ＩＬ－１３、及びＴＧＦ－Ｂを介してＣＤ８＋ＣＴＬ活性を抑制する（Ｉｔｏ ａｎｄ Ｓｅｉｓｈｉｍａ （２０１０），“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ．” Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ａｒｔ． ＩＤ． ６４１７５７）。
ＣＤ８＋ＣＴＬは、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞がＡＰＣと相互作用するときに活性化される。この活性化は、ＡＰＣ上に存在するＭＨＣ複合体の数、ＭＨＣ複合体に対するＣＴＬのＴＣＲの親和性、及び共刺激分子の形でＡＰＣによって提供されるシグナルに依存する。Ｂ７／ＣＤ２８及びＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの共刺激経路は、Ｔ細胞の活性化と産生に寄与する共刺激相互作用経路のよく知られた例である。ＮＫＴの活性化は、ＣＤ８＋ＤＣとＣＤ８－ＤＣのサブセットの両方で共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６など）を上方制御し得る。Ｂ７／ＣＤ２８とＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの両方の共刺激経路は、ＮＫＴの活性化にさらに関連している（Ｉｔｏ ａｎｄ Ｓｅｉｓｈｉｍａ （２０１０），“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｂｙ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ．” Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ａｒｔ． ＩＤ． ６４１７５７）。
したがって、ＮＫＴのさまざまな刺激物質は、ＣＴＬ活性化のレベルを調節するさまざまなタイプのサイトカイン産生を示す。
ＣＤ４＋ＣＴＬ
細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞の表現型、機能、転写プロファイルについてはほとんど知られていない。ＮＫＴと同様に、ＣＤ４＋ＣＴＬは、適応免疫と自然免疫を交差させる多数のマーカーとエフェクター機能を示す。
表現型的にはＴｈ１系列細胞であるにもかかわらず、ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞マーカープロファイルは他のＴｈ１系統細胞とは異なる。例えば、ＣＤ４＋細胞は、ＩＬ－２を分泌する能力を失い、ＣＤ２８及びＣＤ２７の発現を欠き、さらにＣＤ１１ａ及びＣＤ１１ｂならびにＣＤ５７のインテグリンａ鎖の発現を上方制御する。ＮＫと同様に、細胞溶解性ＣＤ４＋細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ２ＤＳ２、及びＫＡＲＡＰ／ＤＡＰ１２受容体を発現する。ＮＫＧ２Ｄは、ＣＤ２８ＣＤ２８を欠く細胞溶解性ＣＤ４＋Ｔ細胞の受容体として作用すると仮定されている。さらに、ＣＴＬはＴｒｅｇの特徴である細胞マーカーであるＣＤ２５を発現する（Ｓｏｇｈｏｉａｎ，Ｄａｍｉｅｎ Ｚ，ａｎｄ Ｈｅｎｄｒｉｋ Ｓｔｒｅｅｃｋ． “Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ＣＤ４（ ） Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．” Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｄｅｃ． ２０１０，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３０３３０４９／）。
細胞溶解性ＣＤ４＋細胞はさらにＦａｓＬを発現し、Ｆａｓを発現する標的を殺傷することが示されている。ＣＤ４＋ＣＴＬはさらに高レベルのパーフォリンとグランザイムまたはグラニュライシンを発現し、抗原依存的に標的細胞を溶解することが示されている。抗原刺激によるこれらの細胞の脱顆粒は、他のシリアルキラー細胞によって分泌される可能性のあるＩＬ－２の利用可能性によって増強され得る。さらに、研究により、ＴＲＡＩＬを発現するＣＤ４＋ＣＴＬは、抗原提示細胞及びＴＲＡＩＬ感受性腫瘍細胞株でバイスタンダーアポトーシスを誘導し得ることが示されている（同上）。
ＣＤ４＋ＣＴＬは、ＴＮＦ－α及びＩＮＦ－γを分泌することが判明しているため、免疫調節の役割も果たす。前出で論じられているように、標的細胞は、炎症促進性サイトカインの存在により、ＴＲＡＩＬを介したアポトーシスに対して感作することができる。これらのサイトカインは、間接的な手段により、ＮＯ及び他のフリーラジカルの生成を誘導してそれにより細胞妖怪性活性を活性化する直接的な接触非依存性の細胞傷害性メカニズムを通じて、または腫瘍細胞内のデス経路を活性化することによって、アポトーシスを増強することができる（同上）。
粘膜関連不変Ｔ細胞（ＭＡＩＴ細胞）
ＭＡＩＴ細胞は不変のＶα７．２ＴＣＲ発現細胞であり、腫瘍細胞に対する免疫応答はＮＫＴと類似している。ＮＫＴとは異なり、ＭＡＩＴ細胞は、ＣＤ１ｄと同様に、１番染色体によってコードされる非古典的なＭＨＣクラスＩｂ分子であるＭＲ１によって刺激される。いくつかの証拠は、ＭＲ１がＮＫＴ細胞刺激と同様に、ＭＡＩＴ細胞にリガンド、おそらく糖脂質を提示することを示唆している。さらに、それらは共受容体に依存しない方法でも活性化される。ＣＤ５６－サブセットは腫瘍浸潤Ｔ細胞に関連していると考えられているが、ＭＡＩＴ細胞には末梢ＣＤ５６＋サブセットとＣＤ５６－サブセットの両方がある。ＭＡＩＴ細胞のＣＤ５６－サブセットは炎症促進性サイトカインの発現と相関しているが、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０とは相関していない（Ｐｅｔｅｒｆａｌｖｉ，ｅｔ ａｌ． “Ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｖα７．２－Ｊα３３ ＴＣＲ Ｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｋｉｄｎｅｙ ａｎｄ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｕｃｏｓａｌ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｔ （ＭＡＩＴ） Ｃｅｌｌｓ．”ＯＵＰ Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１６ Ｏｃｔ． ２００８，ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ｉｎｔｉｍｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０／１２／１５１７／６８４３３７）。
リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）
リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）は、異なる起源の正常細胞と悪性細胞を含む非常に広い標的細胞スペクトルを有する細胞傷害性エフェクター細胞である。それらは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）の存在下で活性化されるキラー細胞リンパ球である。ＬＡＫ細胞は、表現型表面マーカーの発現に関して深刻な不均一性を示す。それらがユニークな細胞系統を表すかどうかはまだ決定されていない。
シリアルキラー細胞集団の活性化
シリアルキラー細胞は、同じ種内の遺伝的に異なる個体間の組織適合性分子を直接的または間接的に認識することができる。これは「非自己認識」としても知られている。一部のシリアルキラー細胞は、直接非自己認識により、抗原処理を必要とせずに、宿主細胞（すなわち腫瘍浸潤細胞）の表面に表示されるＭＨＣ、ＭＨＣ様複合体、及び他の分子の決定因子を認識できる。一部のシリアルキラー細胞は、自己拘束的な方法で間接的な非自己認識を介して、ＭＨＣ分子によって提示された抗原の処理されたペプチドを認識することができる。生来のシリアルキラー細胞集団は、非自己認識の単一のメカニズム（例えば、直接非自己認識）によって活性化され得るが、一部のシリアルキラー細胞は、エフェクター機能（すなわち、間接及び直接非自己認識）を誘導するために複数の刺激シグナルを必要とする。シリアルキラー細胞の機能を阻害するシリアルキラー細胞表面に存在する多くの抑制性受容体もある。したがって、シリアルキラー細胞エフェクター機能の活性化は、宿主細胞の表面または反応環境のいずれかでの抑制性受容体リガンド結合の防止、シリアルキラー細胞の表面での抑制性受容体の干渉、またはシリアルキラー細胞で誘導される抑制性シグナルの遮断をさらに必要とし得る（Ｂｅｎｉｃｈｏｕ，Ｇ，ａｎｄ Ａ Ｗ Ｔｈｏｍｓｏｎ． “Ｄｉｒｅｃｔ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ａｌｌｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙｓ： ｏｎ ｔｈｅ Ｒｉｇｈｔ Ｔｒａｃｋ．”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ： Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｓｕｒｇｅｏｎｓ，Ｕ．Ｓ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｐｒ． ２００９，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ３７４６７５１／）。
Ｔ細胞の大部分は、細胞表面のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子、及び／またはＭＨＣ様分子によって提示される線状ペプチドを認識する。しかしながら、ほとんどのシリアルキラーＴ細胞は、最初にプロフェッショナルなＡＰＣによって刺激され、さらに共刺激分子及びサイトカインからのシグナルを受信して活性化される必要がある。
ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＣＲ）は、ＮＫ、ＮＫＴ、ＧＤＴ、マクロファージ、ＣＤ４＋ＣＴＬ、及びＣＤ８＋ＣＴＬなどのシリアルキラー細胞の表面に存在する。一例であるＮＫＧ２Ｄは、Ｃ型レクチン様ＩＩ型膜貫通型糖タンパク質である。他の天然の細胞傷害性受容体としては、ＮＫｐ４６（ＮＣＲ１、ＣＤ３３５）、ＮＫｐ４４（ＮＣＲ２、ＣＤ３３６）、及びＮＫｐ３０（ＮＣＲ３、ＣＤ３３７）が挙げられるが、これらに限定されない。これらのナチュラルキラー細胞傷害性受容体は、シリアルキラー細胞の活性化因子として、またはヘテロクリティック交差反応性活性化における共刺激シグナルとして機能する。
病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる外因性微生物成分、または損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）として知られる壊死細胞から放出される内因性炎症性因子は、トール様受容体（ＴＬＲ）を含む生殖系列細胞コード化パターン認識受容体（ＰＲＲ）、ヌクレオチドオリゴマー化ドメイン（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）、及びＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）に結合する。未成熟樹状細胞は、細胞表面に存在するＴＬＲを介してさまざまなＰＡＭＰを認識する。ＰＡＭＰの存在を感知した後、未成熟ＤＣは成熟ＤＣ型に変換され、その結果、ＭＨＣタンパク質と共刺激分子の表面レベルが上昇する。この成熟プロセスの有効性は、ナイーブＴ細胞をプライミングし、ＮＫのプライミングも助ける（Ｅｂｉｈａｒａ，ｅｔ ａｌ． “Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＴＬＲ Ｌｉｇａｎｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．” ＯＵＰ Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１８ Ｓｅｐｔ． ２００７，ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ｉｎｔｉｍｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／１９／１０／１１４５／７４３６８０）。
ＡＰＣ上のＴＬＲによるＰＡＭＰの誘発は、Ｉ型ＩＦＮ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、及びＩＬ－１５の産生をもたらし、活性化のためにいくつかのシリアルキラー細胞をプライミングするのを助ける。
ＡＰＣでＰＲＲを誘発すると、複数の免疫系効果が生じる：１）Ｔ細胞応答を誘発する、細胞表面にＭＨＣ複合体を提示する安定した「非自己」タンパク質の高レベルの発現；２）抗原特異的Ｔ細胞をプライミング及び活性化するＣＤ８０及びＣＤ８６などの高レベルの共刺激分子の発現；３）ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＩＦＮ－γなどの炎症促進性サイトカインの分泌。次いで、炎症促進性サイトカインの分泌は、ＡＰＣの活性化を誘導し、これは、非特異的シリアルキラー細胞を直接活性化し、適応免疫を媒介する抗原特異的ヘルパーＴ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞へのＴ細胞分化を促進するのを助ける（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，Ｊｏｈｎ，ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１５，ｐｐ． ６９５－７３９）。
ＰＡＭＰを識別する同じＴＬＲは、ＤＡＭＰによっても活性化できる。ＤＡＭＰは病原体由来ではなく、細胞死を起こした細胞の細胞内内容物などの分子である。ＴＬＲを介したＤＡＭＰシグナル伝達が病原体に依存しない応答を開始し、増幅するという証拠がある。通常の組織監視と関連して、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は細胞ストレスを示し、細胞傷害性リンパ球の自己識別マークを表す。ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、ＰＡＭＰによる未成熟ＤＣの刺激によって上方制御されることが判明している。同様に、ＤＡＭＰも「危険」シグナルを表す。細胞傷害の状況において、ＴＬＲの活性化とＮＫＧ２Ｄリガンドの発現増加との間に相関関係が示されている。ＮＫＧ２Ｄの活性化は細胞傷害に応答して起こり、ＮＫ細胞などの自然免疫の細胞が将来の活性化に過敏に反応することが提案されている（Ｗｏｒｔｈａｍ，Ｂｒｉａｎ Ｗ．，ｅｔ ａｌ． “ＴＬＲ ａｎｄ ＮＫＧ２Ｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙｓ Ｍｅｄｉａｔｅ ＣＳ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ．”ＰＬＯＳ ＯＮＥ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｊｏｕｒｎａｌｓ．ｐｌｏｓ．ｏｒｇ／ｐｌｏｓｏｎｅ／ａｒｔｉｃｌｅ？ｉｄ＝１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００７８７３５）。
最終的に、ＰＡＭＰＳのＰＲＲへの結合は、アダプタータンパク質骨髄分化一次応答タンパク質８８（ＭｙＤ８８）及びＩＦＮβを誘導するＴ１Ｒドメイン含有アダプタータンパク質（ＴＲＩＦ）を介したＭＡＰＫカスケードの活性化を誘発する（Ｑｉａｎ，Ｃ． ａｎｄ Ｃａｏ，Ｘ，（２０１３），“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，” Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １２８３： ６７－７４を引用する、Ｑｉａｎ，Ｆ． ｅｔ ａｌ，（２０１６） “Ｐｉｖｏｔａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ２ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ，” Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ． Ｓｃｉ． １７（４）： ３３２－４２） 。
標準的なシグナル伝達では、ｐ３８ ＭＡＰＫはＭＡＰＫＫ（ＭＫＫ３及びＭＫＫ６）によって選択的にリン酸化され、ＭＡＰＫＫはＴＧＦβ活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）、アポトーシスシグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）、混合系統キナーゼ２（ＭＬＫ２）またはＭＬＫ３を含むＭＡＰＫＫＫによって活性化される。ｐ３８ ＭＡＰＫを介したシグナルは、ＣＲＥＢ、ＡＴＦ２、及びＭｙｃを含むいくつかの転写因子、ならびにＭＫ２だけでなく、ＭＫ３、ＭＮＫ１／２、及びＭＳＫ１／２を含む、他のキナーゼの活性化を開始する（Ｏｂａｔａ，Ｔ． ｅｔ ａｌ，（２０００） Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２８ （４ Ｓｕｐｐｌ．： Ｎ６７－Ｎ７７；Ｄｏｎｇ，Ｃ． ｅｔ ａｌ，（２００２） “ＭＡＰ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ，” Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０： ５５－７２）を引用する同上を引用する同上）。これらの遠位キナーゼの中で、ＭＫ２の役割は、炎症性サイトカイン及びケモカイン、活性酸素種（ＲＯＳ）、及び一酸化窒素（ＮＯ）の産生の調節を含む、自然免疫応答の調節に不可欠であると判断されている （同上）。
本明細書で使用される場合、「安定」という用語は、分子または化学変化に抵抗することを指す。記載された本発明のＥＮＬＳＴ（商標）細胞と関連して、それは、インビトロでＭＬＴＲにおいて用量依存的に再現可能なレベルのＭＮＣ免疫刺激をもたらす、安定にトランスフェクトされたＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団を指す。これには、安定的にトランスフェクトされた生きているＥＮＬＳＴ（商標）細胞、外因性免疫調節タンパク質を含むＥＮＬＳＴ（商標）細胞の膜断片、及びそれらの表面に発現する免疫調節タンパク質を含む死んだ壊死性ＥＮＬＳＴ（商標）細胞が含まれ、そのそれぞれが直接的または間接的にＭＮＣ免疫刺激が可能である。
「幹細胞」という用語は、最終分化を経て１種以上の異なる細胞表現型へと分化することができる娘細胞を生成することができる、自己複製する能力を有する高い増殖能を有する未分化細胞を指す。本明細書で使用される場合、「複製」または「自己複製」という用語は、幹細胞が分裂して、母細胞と区別できない発達の可能性を有する１つ（非対称分裂）または２つ（対称分裂）の娘細胞を生成するプロセスを指す。自己複製には、増殖と未分化状態の維持の両方が含まれる。
本明細書で使用される場合、「刺激する」という用語及びその様々な文法形式のいずれかは、活性化を誘導することまたは活性を増加させることを指す。
本明細書で使用される場合、「対象」または「個体」または「患者」という用語は、ヒトを含む哺乳動物起源の動物種のメンバーを指すために互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」という用語は、語句の文脈及び使用法が別段の指示をしない限り、（ｉ）記載された発明による組成物を投与されるか、（ｉｉ）記載された発明による組成物を受け取るか、または（ｉｉｉ）記載された発明による組成物を受け取った患者を指す。「それを必要とする対象」はまた、記載された本発明の組成物による治療を受けやすい障害を有するか、または有することが疑われる対象を指し得る。
本明細書で使用される場合、組成物の細胞成分に関する「実質的に純粋な」という用語は、それが生体系において関連し得る物質から実質的に分離されているその細胞成分を指す。これは、分析プロトコールによって決定されるとき、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の純度を指す。そのようなプロトコールには、例えば、ＦＡＣＳが含まれ得るが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、「抑制する」という用語及びその文法形式のいずれかは、活性化を阻害することまたは活性を減少させることを指す。
本明細書で使用される場合、「症状」という用語は、特に、正常な機能、感覚、または外観からの変化として個体が経験する場合の、障害または疾患の徴候または徴候を指す。
本明細書で使用される場合、「治療薬」という用語は、治療効果を提供する薬物、分子、核酸、タンパク質、代謝産物、細胞、組成物、または他の物質を指す。本明細書で使用される場合、「活性」という用語は、意図された治療効果を担う、記載された本発明の組成物の活性成分、成分、または構成要素を指す。「治療薬」及び「活性剤」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「治療成分」という用語は、集団のある割合における特定の疾患徴候の進行を排除、低減、または予防する治療有効投与量（すなわち用量及び投与頻度）を指す。一般的に使用される治療成分の例はＥＤ５０であり、これは集団の５０％における特定の疾患発現に対して治療的に有効である特定の投与量における用量を表す。
活性剤の「治療量」、「有効量」、または「薬学的有効量」という用語は、治療の意図された利益を提供するのに十分な量を指すために互換的に使用される。しかしながら、投与量レベルは、年齢、体重、性別、患者の病状、病状の重症度、投与経路、及び使用される特定の活性剤を含む様々な因子に基づく。したがって、投与計画は大きく異なり得るが、標準的な方法を用いて医師によって日常的に決定され得る。さらに、「治療量」、及び「薬学的有効量」という用語は、記載された本発明の組成物の予防的または予防的な量を含む。記載された発明の予防的または予防的適用において、医薬組成物または医薬は、危険性を排除または減少させるのに十分な量で、または、疾患、障害もしくは状態の生化学的、組織学的及び／もしくは行動上の症状、その合併症、ならびに疾患、障害もしくは状態の発症中に現れる中間の病理学的表現型を含む、疾患、障害もしくは状態の発症を遅らせるのに十分な量で、疾患、障害もしくは状態に罹患しやすいかもしくは他の危険性がある患者に投与される。一般に、最大用量、すなわち、何らかの医学的判断によると最も安全な用量を使用することが好ましい。「用量」及び「投与量」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、治療の結果を指し、その結果は、望ましくかつ有益であると判断される。治療効果としては、直接的または間接的に、疾患の症状の阻止、軽減、または排除が挙げられ得る。治療効果としてはまた、直接的または間接的な、疾患の徴候の進行の阻止、軽減、または排除が挙げられ得る。
本明細書に記載の任意の治療薬について、治療有効量は、予備的なインビトロ研究及び／または動物モデルから最初に決定され得る。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定され得る。適用される用量は、投与される化合物の相対的なバイオアベイラビリティ及び効力に基づいて調整することができる。上述の方法及び他の周知の方法に基づく、最大有効性を達成するための用量の調整は、当業者の能力の範囲内である。
参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） （２００１）の第１章に見出され得る治療効果を決定するための一般原則を以下に要約する。
薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定し、治療ウィンドウに関連付けることができる状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを取得できる。
医薬品は、同じ有効成分を含み、強度または濃度、剤形、及び投与経路が同一である場合、薬学的に均等であるとみなされる。２つの薬学的に均等の医薬品は、適切な試験条件下で２つの製品の有効成分のバイオアベイラビリティの速度と程度が有意に異ならない場合、生物学的に同等であるとみなされる。
「治療ウィンドウ」という用語は、許容できない毒性を伴わずに治療効果をもたらす濃度範囲を指す。ある用量の薬物の投与後、その効果は通常特徴的な時間的パターンを示す。薬物濃度が所望の効果のための最小有効濃度（「ＭＥＣ」）を超える前に遅延期間が存在する。応答の開始に続いて、薬物が吸収されそして分配され続けるにつれて効果の強度は増加する。これはピークに達し、その後、薬物除去は効果の強度の低下をもたらし、それは薬物濃度がＭＥＣを下回るときに消失する。したがって、薬物の作用の持続期間は、濃度がＭＥＣを超える期間によって決定される。治療の目的は、最小限の毒性で所望の応答のための治療ウィンドウ内の濃度を得て維持することである。所望の効果についてのＭＥＣ以下の薬物応答は治療量以下であろうが、有害作用については毒性の確率はＭＥＣを超えて増加するであろう。薬物投与量を増減することは、反応曲線が強度スケールの上下にシフトし、これは薬物の効果を調節するために使用される。服用量を増加すると、薬の作用時間も長くなるが、副作用の可能性が高まる危険性がある。したがって、薬物が無毒でない限り、用量を増やすことは薬物の作用期間を拡張するための有用な戦略ではない。
代替的に、治療ウィンドウ内で濃度を維持するために別の用量の薬物を投与する必要がある。一般に、薬物の治療範囲の下限は、可能な限り最大の治療効果の約半分をもたらす薬物濃度にほぼ等しいと思われ、治療範囲の上限は、約５％以下から約１０％までの患者に毒性作用があるようなものである。これらの数値は非常に変動しやすく、そしてある患者は治療範囲を超える薬物濃度から大いに恩恵を受け得るが、他の患者ははるかに低い値で顕著な毒性を被り得る。治療目的は、治療ウィンドウ内で定常状態の薬物レベルを維持することである。ほとんどの薬物について、この所望の範囲に関連する実際の濃度が知られているわけでも知られている必要もなく、有効性及び毒性が一般に濃度依存的であること、ならびに薬物投与量及び投与の頻度が薬物のレベルにかに影響を及ぼすかということを理解すれば十分である。有効性と毒性をもたらす濃度の間にわずかな（２～３倍の）違いがある少数の薬物については、効果的な治療に関連する血漿中濃度範囲が定義されている。
この場合、有効性及び最小の毒性に関連する薬物の所望の目標定常状態濃度（通常は血漿中）が選択され、この値を達成すると予想される投与量が計算される、目標レベル戦略が合理的である。続いて薬物濃度を測定し、必要な場合には投与量を調整して標的をより厳密に近似させる。
ほとんどの臨床状況では、薬物は、治療ウィンドウに関連する薬物の定常状態濃度を維持するために、一連の反復用量でまたは連続注入として投与される。選択された定常状態または目標濃度（「維持用量」）を維持するために、投入速度が損失速度と等しくなるように薬物投与速度を調整する。臨床医が血漿中の薬物の所望の濃度を選択し、そして特定の患者におけるその薬物のクリアランス及びバイオアベイラビリティを知っている場合、適切な用量及び投与間隔を計算することができる。しかし、生きている細胞による治療は、自家細胞治療の場合、それらが分裂し、体内に永続的に滞留する可能性があるため、この概念を破る。したがって、最初に投与されるものは、時間の経過とともにレシピエントに存在するものとほとんど相関関係がない可能性がある。
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、状態の進行を無効にすること、実質的に阻害すること、遅延させること、または逆転させること、状態の臨床症状を実質的に改善すること、または状態の臨床症状の出現を実質的に防止することを含む。治療することは、以下の１つ以上を達成することをさらに指す：（ａ）障害の重篤度を低減すること；（ｂ）治療される障害（複数可）に特徴的な症状の発症を制限すること；（ｃ）治療される障害（複数可）に特徴的な症状の悪化を制限すること；（ｄ）以前に障害（複数可）を経験したことのある患者における障害（複数可）の再発を制限すること；及び（ｅ）以前にその障害（複数可）に対して無症候性であった患者における症状の再発を制限すること。治療には、過剰なレベルの副作用なしに、検出可能か検出不可能かにかかわらず、臨床的に重要な反応を誘発することも含まれる。
「腫瘍量」と「腫瘍負荷」という用語は、体内のがん細胞の数、腫瘍のサイズ、またはがんの量を指すために互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「野生型」、「天然に存在する」という用語、またはそれらの文法的同等物は、天然に見出され、対立遺伝子バリエーションを含むアミノ酸配列またはヌクレオチド配列、すなわち、通常は意図的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指すことを意味する。したがって、「天然に存在しない」、「合成」、及び「組換え」という用語、またはそれらの文法的同等物は、天然に見出されないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列、すなわち、通常は意図的に改変されているアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指すために互換的に使用される。組換え核酸が作製されて宿主細胞または生物に再導入されると、それは非組換え的に、すなわち、インビトロ操作ではなく、宿主細胞のインビボ細胞機構を使用して複製するが、そのような核酸は、一度組換え的に産生されると、その後非組換え的に複製されるが、それでも、記載された本発明の目的のために組換え性であるとみなされる。
がん患者の受動免疫のための抗腫瘍細胞療法を調製するための方法
一態様によれば、記載された 本発明は、現在免疫抑制レジメンの影響下にないがん対象の、活性化及び拡大されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化及び拡大された単核球を含む細胞製品を含む組成物による、細胞傷害性Ｔ細胞集団のインビトロ活性化と、それに続く、受動免疫の方法とを提供し、この方法は、無菌条件下で以下を含む：
ステップ１：
（ａ）生体試料から単核球（ＭＮＣ）の集団を単離すること；
（ｂ）少なくとも３つの必須免疫調節ペプチドをコードする組換えＤＮＡ配列でトランスフェクトまたは形質導入された同種異系腫瘍細胞株を含む操作された白血球刺激細胞（「ＥＮＬＳＴ（商標）細胞」）の集団を調製することであって、３つの必須免疫調節ペプチドがＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及び、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）である、調製すること；
（ｃ）ステップ（ａ）のＭＮＣの集団をステップ（ｂ）のＥＮＬＳＴ（商標）細胞とインビトロで接触させて、腫瘍細胞を殺傷するのに有効な活性化シリアルキラー細胞を含むＭＮＣの活性化集団を含む免疫応答を誘導すること、によって、インビトロで免疫応答を誘導すること；
ステップ２：活性化ＭＮＣを培養して細胞製品を形成することにより、インビトロでシリアルキラー細胞の活性化亜集団を含むＭＮＣの活性化集団を拡大すること；
ステップ３：細胞製品の個別用量を含む単位用量パッケージを調製し、細胞製品を含む単位パッケージを－８６°Ｃで凍結し、凍結した単位用量パッケージを液体窒素冷凍庫の気相で凍結保存すること（以下「凍結保存」）；
ステップ４：制御された条件下で、細胞製品を含む治療量の凍結単位用量パッケージを解凍し、任意選択で、ステップ４の凍結及び解凍された細胞生成物を、薬学的に許容される担体成分と組み合わせて、医薬組成物を形成すること；
ステップ５：治療量の細胞製品または活性化及び拡大された細胞製品を含むステップ４の医薬組成物を対象に投与すること。
いくつかの実施形態によれば、現在免疫抑制レジメンの影響下にないがん対象の免疫系は無傷であり、これは、免疫抑制レジメンによって枯渇していないことを意味する。いくつかの実施形態によれば、免疫抑制レジメンは化学療法を含む。いくつかの実施形態によれば、対象は黒色腫患者である。いくつかの実施形態によれば、対象は前立腺癌患者である。いくつかの実施形態によれば、対象は乳癌患者である。
ステップ１：インビトロで免疫応答を誘導すること
（ｉ）生体試料から単核球（ＭＮＣ）の集団を単離すること
いくつかの実施形態によれば、単核球は、生体試料に由来する。いくつかの実施形態によれば、生体試料は、レシピエント対象に対して自家である。いくつかの実施形態によれば、生体試料は、レシピエント対象に対して同種異系である。いくつかの実施形態によれば、生体試料は、レシピエントではない免疫抑制レジメンの影響下にない対象に由来する。いくつかの実施形態によれば、生体試料は哺乳動物起源のものである。いくつかの実施形態によれば、生体試料はヒトである。いくつかの実施形態によれば、単核球集団の供給源は体液である。いくつかの実施形態によれば、体液は、臍帯血、全血、末梢血、動員された末梢血、または骨髄である。いくつかの実施形態によれば、単核球集団の供給源は全血である。いくつかの実施形態によれば、生体試料は骨髄試料である。いくつかの実施形態によれば、生体試料は臍帯血である。
いくつかの実施形態によれば、生体試料は末梢血試料である。いくつかの実施形態によれば、生体試料は動員された末梢血試料である。造血増殖因子による治療は、ＣＤ３４＋細胞の存在によって測定されるとき、またはＣＦＵとしてコロニー形成アッセイで測定されるとき、末梢血中の造血前駆細胞の数の著しい増加を引き起こすことが示されている。このような動員された末梢血造血幹細胞（ＨＳＣ）は、移植、免疫療法、及び心臓血管再生医療に使用されてきた。例えば、コロニー刺激因子は、造血幹細胞の動員に使用される薬剤である。コロニー刺激因子の例としては、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びそれらの薬学的に許容される類似体及び誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、組換え技術によって製造されたＧ－ＣＳＦ類似体であるフィルグラスチムは、ニューポジェン（登録商標）（Ａｍｇｅｎ）、Ｒｅｌｉｇｒａｓｔ（登録商標）（Ｒｅｌｉａｎｃｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｎｕｇｒａｆ（登録商標）（Ｚｅｎｏｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．）、及びＮｅｕｋｉｎｅ（登録商標）（Ｉｎｔａｓ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）というブランド名で販売されている。
いくつかの実施形態によれば、単核球は、親水性コロイド（例えば、スクロースとエピクロロヒドリンの共重合によって形成されたポリマー（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標））またはポリビニルピロリドンでコーティングされたコロイドシリカ（Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）））を使用する密度勾配遠心分離によって全血から単離することができる。例示的なプロトコールでは、ＰＢＳと末梢血の希釈混合物をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）の上にある５０ｍｌの遠心分離管に重層し、４００×ｇで２０℃で３０～４０分間、ブレーキなしでスイングバケットローターで遠心分離する。上層は吸引され、単核球層（リンパ球、単球、血小板）が界面で乱されないままになる。単核球層を新しい５０ｍｌ遠心管に注意深く移す。細胞を２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄し、３００×ｇで１０分間室温で遠心分離し、上清を捨てる。血小板を除去するために、細胞ペレットを５０ｍＬの緩衝液に再懸濁し、２００×ｇで１０～１５分間室温で遠心分離する。血小板を含む上清を取り除く。このステップが繰り返される。細胞ペレットは、下流の用途に適した緩衝液または培地に再懸濁される。
ＰＢＭＣを単離するための代替の例示的なプロトコールは、白血球アフェレーシスを介するものである。例えば、インフォームドコンセントを得て患者から全血を採取し、血漿及び赤血球などの血液の他の成分から標的ＰＢＭＣ画分を自動的に分離するデバイスを通過させることができる。分離されたＰＢＭＣが収集されている間、他のコンポーネントは患者に戻される。収集されたＰＢＭＣは、さらなる処理、例えば、溶解による残留赤血球の除去を受けることができる。
いくつかの実施形態によれば、単核球はまた、同種異系の供給源、例えば、臍帯血から単離することができる。臍帯血の単核球（ＭＮＣ）画分は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、単球、樹状細胞、及び幹細胞／前駆細胞で構成されている。抗凝固処理された臍帯血クエン酸リン酸デキストロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は、５ｍＬ緩衝液を含む５０ｍＬチューブに直接引き込まれ、分離前に４℃で保存される。抗凝固処理された臍帯血は、３倍量の緩衝液で希釈される。希釈した細胞懸濁液を５０ｍｌコニカルチューブ内のＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）上に注意深く重層し、ブレーキなしでスイングバケットローター内で２０℃で３５分間４００×ｇで遠心分離する。上層は吸引され、相間で単核細胞層が乱されないままにされる。単核層を新しい５０ｍＬコニカルチューブに注意深く移す。チューブに緩衝液を充填し、混合し、３００×ｇで１０分間、２０℃で遠心分離する。上清を注意深く吸引する。血小板を除去するために、細胞ペレットを５０ｍＬの緩衝液に再懸濁し、２００×ｇで１０～１５分間２０℃で遠心分離する。上清を注意深く完全に吸引する。細胞ペレットは、下流の用途のために適切な量の緩衝液に再懸濁される。
いくつかの実施形態によれば、単核球は骨髄から単離することができる： 吸引針を使用して、骨髄を上部腸骨稜または胸骨から収集する。吸引されたヒト骨髄は、適切な緩衝液で７：１の比率で希釈される。細胞を１００μｍフィルターに通して、骨片及び細胞塊を取り除く。希釈した細胞懸濁液を５０ｍｌコニカルチューブ内のＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）上に重層し、ブレーキなしでスイングバケットローター内で２０℃で３５分間４４５×ｇで遠心分離する。上層は吸引され、単核細胞層が乱されないままにされる。相間の骨髄ＭＮＣは、新しい５０ｍｌコニカルチューブに注意深く移される。細胞を緩衝液で洗浄し、穏やかに混合し、３００×ｇで１０分間２０℃で遠心分離する。上清を注意深く除去する。血小板を除去するために、細胞ペレットを５０ｍＬの緩衝液に再懸濁し、２００×ｇで１０～１５分間２０℃で遠心分離する。上清を注意深く吸引する。細胞ペレットは、下流の用途のために適切な緩衝液に再懸濁される。
いくつかの実施形態によれば、単離されたＭＮＣの集団は、リンパ球の混合集団、単球の集団、及び樹状細胞の集団を含む。ヒトでは、末梢血中のこれらの集団の頻度は個人によって異なるが、典型的には、リンパ球は７０～９０％の範囲、単球は１０～２０％であるが、樹状細胞はまれで、１～２％しか占めていない（Ｋｌｅｉｖｅｌａｎｄ，Ｃ．Ｒ．，“Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌｓ” ｉｎ： Ｖｅｒｈｏｅｃｋｘ，Ｋ． ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ）． Ｔｈｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅｓ ｏｎ Ｈｅａｌｔｈ （２０１５），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｃｈａｍ． Ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００７／９７８－３－３１９－１６１０４０４＿１５）。いくつかの実施形態によれば、リンパ球の混合集団は、Ｔ細胞の亜集団、Ｂ細胞の亜集団、及びＮＫ細胞の亜集団を含む。いくつかの実施形態によれば、Ｔリンパ球は、ＣＤ８ Ｔリンパ球の亜集団及びＣＤ４ Ｔリンパ球の亜集団を含む。
（ｉｉ）操作された白血球刺激細胞（ＥＮＬＳＴ（商標）細胞）の集団の調製
本明細書で使用される場合、「ＥＮＬＳＴ（商標）細胞」という用語は、操作された白血球刺激細胞を指す。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、組換えＤＮＡ配列でトランスフェクトまたは形質導入された初代腫瘍細胞株を含む。いくつかの実施形態によれば、組換えＤＮＡ配列は、以下の必須免疫調節ペプチドのコアをコードする： ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）。いくつかの実施形態によれば、組換え配列は、Ｒ基として指定される免疫調節因子の１つ以上の追加のサブセットを含むことができ（コア化学構造のものと同様に）、それぞれのサブセットは３～２５個の免疫調節因子を含む。
いくつかの実施形態によれば、この方法は、細胞の不均一性を最小限に抑えるために、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団（複数可）のクローン細胞バンクを開発することをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）はクローン性である。
腫瘍細胞株（複数可）
腫瘍特異的抗原
いくつかの実施形態によれば、本開示は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現するＥＮＬＳＴ（商標）細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態によれば、腫瘍特異的抗原は、正常組織によってではなく、腫瘍によって差次的に発現される遺伝子産物の一次オープンリーディングフレームによってコードされ得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍特異的抗原は、変異遺伝子、イントロン配列、または翻訳された代替のオープンリーディングフレーム、偽遺伝子、アンチセンス鎖によってコードされ得るか、または遺伝子転座イベントの産物を表し得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞は、広範囲の腫瘍特異的抗原を提供し、それらの多くは、性質が未知である。いくつかの実施形態によれば、腫瘍抗原はネオ抗原である。
腫瘍特異的抗原の例としては、以下が含まれるが、これらに限定されない： （ａ）変異していない共有抗原（例えば、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、Ｂ－黒色腫抗原（ＢＡＧＥ）、腎腫瘍抗原（ＲＡＧＥ）、及びがん精巣抗原（例えばＮＹ－ＥＳＯ）；（ｂ）分化抗原（例えば、前立腺癌における前立腺特異的膜抗原［ＰＳＭＡ］及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、多くの黒色腫に存在するＭａｒｔ１／ＭｅｌａｎＡ及びチロシナーゼ、及び結腸癌の大部分に存在する癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、これは組織が制限されており、系統特異的腫瘍細胞に存在する；（ｃ）免疫認識のための新規エピトープを提供する、変異した腫瘍遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子（例えば、変異したｒａｓ、再配列されたｂｃｒ／ａｂｌ、変異したｐ５３）；（ｄ）固有のイディオタイプ（例えば、骨髄腫及びＢ細胞骨髄腫の免疫グロブリン抗原、ＣＴＣＬで発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ））；（ｅ）オンコウイルス由来のエピトープ（例えば、ヒトパピローマウイルスにコードされたＥ６及びＥ７タンパク質、原発性脳リンパ腫に存在するエプスタイン－バーウイルス関連抗原）；（ｆ）ＣＥＡ、α－フェトプロテイン、サバイビンなどの変異していない癌胎児性タンパク質。いくつかの実施形態によれば、腫瘍特異的抗原は、公的に利用可能な癌抗原ペプチドデータベース（ワールドワイドウェブ上のｃａｐｅｄ．ｉｃｐ．ｕｃｌ．ａｃ．ｂｅ／Ｐｅｐｔｉｄｅ／ｌｉｓｔで、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に列挙された抗原から選択される。いくつかの実施形態によれば、腫瘍特異的抗原は、以下に示される表４に示される抗原を含む。
Figure 2022553411000010
Figure 2022553411000011
Figure 2022553411000012
Figure 2022553411000013
Figure 2022553411000014
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞の集団は、黒色腫、結腸直腸癌、白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌、頭頸部癌、扁平上皮癌、舌癌、喉頭癌、扁桃腺癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、乳癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、肝細胞癌、神経膠芽細胞腫、及び脳癌からなる群から選択されるがんに由来する。
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞の集団は、ｇｐ１００、チロシナーゼ、Ｍｅｌａｎ－Ａ、チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ－２－ＩＮＴ２）、黒色腫抗原－１（ＭＡＧＥ－Ａ１）、ＮＹ－ＥＳＯ－１、黒色腫の優先的に発現される抗原（ＰＲＡＭＥ）、ＣＤＫ４及び多発性骨髄腫腫瘍遺伝子１（ＭＵＭ－１）のうちの１つ以上の発現によって特徴付けられる。
いくつかの実施形態によれば、結腸直腸癌腫瘍細胞の集団は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＡＧＥ、ＨＰＶ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ＥＰＣＡＭ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ｐ５３、細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）のうちの１つ以上の発現によって特徴付けられる。
免疫学的抗原特異性は、抗原の１つ以上のアミノ酸配列から、腫瘍細胞によるその抗原の発現の程度から、抗原の翻訳後修飾などから生じ得る。
特定のタイプの癌細胞に対する免疫学的抗原特異性は、複数の腫瘍抗原の特定の指紋の１つ以上から、特定の抗原が多種多様な腫瘍細胞によって発現される一方で、少数の腫瘍タイプに対する免疫療法で特定の用途を有するという事実から、ＭＨＣクラスＩ提示可能及びＭＨＣクラスＩＩ提示可能エピトープの特定のコレクションが特定のポリペプチドまたはポリペプチド断片上に存在するという事実から、ならびに免疫寛容を誘発する可能性のある１つ以上のペプチドを省略することにより、発生し得る。当業者は、例えば、米国政府のウェブサイト、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈで、関連する核酸及びポリペプチド配列を見つけることができる。
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞は、対象由来の試料に由来する。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞は、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントに由来する。
いくつかの実施形態によれば、記載された本発明の腫瘍抗原特異性は、免疫調節因子による改変のために選択される親腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントによって決定され得る。
親細胞株
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、いずれかの公的供給源（例えば、ＮＩＨ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．が運営するＤＣＴＤ腫瘍リポジトリ）または商用供給源（例えば、ＡＴＣＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｒｉｃｈ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ、ＤＳＭ２）のいずれかから確立された細胞株に由来し得る。いくつかの実施形態によれば、新しい細胞株は、がん患者の腫瘍に由来する腫瘍細胞から新たに確立することができる。
いくつかの実施形態によれば、がん組織、がん細胞、がんを引き起こす因子に感染した細胞、他の前腫瘍性細胞、及びヒト起源の細胞株を供給源として使用することができる。いくつかの実施形態によれば、がん細胞は、非限定的に、確立された非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膀胱癌、黒色腫、卵巣癌、腎細胞癌、前立腺癌、肉腫、乳癌、扁平上皮癌、頭頚部癌、肝細胞癌、すい臓癌、または結腸癌の細胞株などの、確立された腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントから得ることができる。
いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、それ自体がリンパ節に移動した転移性前立腺癌に由来するＬＮＣａＰクローンＦＧＣ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１７４０）を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、それ自体が骨に移動した転移性前立腺癌に由来するＰＣ－３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１４３５）細胞株を含む。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、以下のＡＴＣＣ細胞株のうちの１つ以上に由来する：ＶＣａＰ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２８７６）；ＭＤＡ ＰＣａ ２ｂ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２４２２）；またはＤＵ １４５（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－８１）。
いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、それ自体が大腿の皮膚への転移に由来するＳＫ－ＭＥＬ－２クローン（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－６８）を含む。
いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＣＯＯ－Ｇ、ＤＵ４４７５、ＥＬＬ－Ｇ、ＨＩＧ－Ｇ、ＭＣＦ／７、ＭＤＡ－ＭＢ－４３６、ＭＸ－１、ＳＷ－６１３、及びＶＡＮ－Ｇと呼ばれる乳がん細胞株のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＡＳＰＳ及びＡＳＰＳ－１と呼ばれる胞巣状軟部肉腫細胞株のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＬＸ－１、ＣＯＳ－Ｇ、Ｈ－ＭＥＳＯ－１、Ｈ－ＭＥＳＯ－１Ａ、ＮＣＩ－Ｈ２３、及びＮＣＩ－Ｈ４６０と呼ばれる肺細胞株のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＣＸ－５、ＧＯＢ－Ｇ、ＨＣＣ－２９９８、ＨＣＴ－１５、ＫＬＯ－Ｇ、ＫＭ２０Ｌ２、ＭＲＩ－Ｈ－１９４、ＬＯＶＯ Ｉ、ＬＯＶＯＩＩ、及びＭＲＩ－Ｈ－２５０と呼ばれる結腸癌細胞株のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＮＩＳ－Ｇ、ＴＲＩ－Ｇ、ＷＩＬ－Ｇ、ＭＲＩ－Ｈ－１２１Ｂ、ＭＲＩ－Ｈ－１８７、ＭＲＩ－Ｈ－２２１、及びＭＲＩ－Ｈ－２５５と呼ばれる黒色腫細胞株のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＭＲＩ－Ｈ－１７７、ＭＲＩ－Ｈ－１８６、ＭＲＩ－Ｈ－１９６、及びＭＲＩ－Ｈ－２１５と呼ばれる子宮頸癌細胞株のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＭＲＩ－Ｈ－１２１及びＭＲＩ－Ｈ－１６６と呼ばれる腎臓癌細胞株のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＭＲＩ－Ｈ－１４７及びＭＲＩ－Ｈ－２２０と呼ばれる子宮内膜癌細胞株のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＭＲＩ－Ｈ－２５８、ＭＲＩ－Ｈ－２７３、ＭＲＩ－Ｈ－１８３４、及びＳＷＡ－Ｇと呼ばれる卵巣癌細胞株のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＨＳ－１、ＯＧＬ－Ｇ、及びＤＥＬ－Ｇと呼ばれる肉腫細胞株のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＤＥＡＣ－１と呼ばれる類表皮細胞株を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＳＦ２９５と呼ばれる神経膠芽腫細胞株を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＣＷＲ－２２と呼ばれる前立腺癌細胞株を含む。いくつかの実施形態によれば、確立された細胞株は、ＤＡＵと呼ばれるバーキットリンパ腫細胞株を含む。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の前述の確立された細胞株は、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ヨーロッパ細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）、またはブダペスト条約第７条の国際寄託機関（ＩＤＡ）として列挙されている任意の寄託機関から市販されている。
いくつかの実施形態によれば、例示的な確立された細胞株は、以下の表の細胞株のうちの１つ以上を含む：

Figure 2022553411000015
Figure 2022553411000016
Figure 2022553411000017
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントが由来し得る親細胞株の選択は、所与の操作された白血球刺激細胞の免疫特異性に影響を及ぼし得る。例えば、患者の骨に遊走した転移性前立腺癌に由来する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントの使用は、患者の骨における転移性前立腺癌に特異的な免疫応答を誘発するＥＮＬＳＴ（商標）細胞をもたらし得る。
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、普遍的な癌特異的抗原を含む親細胞に由来し得る。例えば、患者の骨に遊走した転移性前立腺癌に由来する親腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントの使用は、すべての前立腺癌細胞に対する免疫応答を誘発するＥＮＬＳＴ（商標）細胞をもたらし得る。
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、さまざまながんに由来する患者由来細胞に由来する。いくつかの実施形態によれば、腫瘍から外科的に除去された新鮮な組織は、ＩＶ型コラゲナーゼによって酵素的に消化され、続いて、分解された細胞の収集が行われる。いくつかの実施形態によれば、次に、脱凝集した細胞を、接着を促進するためのコラーゲンまたはフィブロネクチンなどの細胞外マトリックス基質上に１０％ウシ胎仔血清を含む増殖培地中でインビトロで増殖させることができる。次いで、いくつかの実施形態によれば、接着細胞は、不死のがん細胞が非がん性線維芽細胞よりも増殖するまで継代され得る。
例えば、いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、がん幹細胞を含む腫瘍細胞を含む固形腫瘍、がん幹細胞を含む転移性腫瘍細胞を含む転移性がん、または非転移性がんに由来し得る。いくつかの実施形態によれば、がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、胸部、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮を起源とし得る。いくつかの実施形態によれば、がんは、組織学的タイプ、例えば、皮膚または内臓を裏打ちまたは覆う組織で発生するがん（がん腫）；軟骨、脂肪、筋肉、血管、線維組織（肉腫）を含む骨または体の軟部組織で発生するがん；造血組織から発生するがん（白血病）；免疫系の細胞から発生するがん（リンパ腫）；形質細胞で発生するがん（骨髄腫）、または脳／脊髄がんであり得る。
がん腫の例としては、巨大細胞癌及び紡錘細胞癌、小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛様体癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺がん；ガストリノーマ、胆管細胞癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管癌の複合；小柱腺癌；アデノイド嚢胞癌；腺腫性ポリープの腺癌；腺癌、家族性大腸腺腫症；固形がん；カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞性腺癌；乳頭腺癌；色素嫌性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基球癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺癌；非カプセル化硬化癌；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；子宮頸部腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性乳管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳腺腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；セルトリ細胞がん；胚性癌；絨毛癌が挙げられるが、これらに限定されない。
肉腫の例としては、グロマンギオ肉腫；肉腫；線維肉腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質性肉腫；癌肉腫；滑膜肉腫；血管肉腫；カポジ肉腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；間葉性軟骨肉腫；骨の巨大細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；骨髄芽球性歯肉肉腫；エナメル上皮腫、悪性；骨髄芽球性線維肉腫；骨髄性肉腫；マスト細胞肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
白血病の例としては、白血病、リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；有毛細胞白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
リンパ腫及び骨髄腫の例としては、悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；傍肉芽腫；悪性リンパ腫、小さなリンパ球；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞性；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在性黒色腫；巨大な色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；多発性骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。
脳／脊髄がんの例としては、松果体腫瘍、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質星状細胞腫；原線維性星状細胞腫；アストロブラストーマ；膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起芽細胞腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節神経芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性が挙げあれるが、これらに限定されない。
他の癌の例としては、胸腺腫；卵巣間質腫瘍；莢膜；顆粒膜細胞腫；アンドロブラストーマ；ライディッヒ細胞腫瘍；脂質細胞腫瘍；傍神経節腫；乳腺外傍神経節腫；褐色細胞腫；青色母斑、悪性；線維性組織球腫、悪性；混合腫瘍、悪性；ミュラー混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；中腎腫、悪性；血管内皮腫、悪性；血管周囲細胞腫、悪性；軟骨芽細胞腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性組織球増殖症；免疫増殖性小腸疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
任意の所与の腫瘍タイプについて、いくつかの腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントが市販されている可能性がある。いくつかの実施形態によれば、全細胞の混合物として、または全細胞の混合物から膜調製物を作製することによるこれらの細胞株のいくつかのプールは、その腫瘍タイプの細胞表面腫瘍抗原のアレイを提供し得る。
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞または腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、照射によって増殖を無能にすることができる。
外因性免疫調節分子
いくつかの実施形態によれば、本発明の外因性免疫調節分子は、単独で、または他の外因性免疫調節分子と組み合わせて、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞の集団に組み込まれると、免疫細胞の刺激を媒介するポリペプチドである。
いくつかの実施形態によれば、本発明の外因性免疫調節分子は、単独で、または他の外因性免疫調節分子と組み合わせて、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球の刺激を媒介するポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞は、メモリー様ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態によれば、Ｔリンパ球は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（ＣＤ８＋Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態によれば、Ｔリンパ球は、メモリーＴ細胞である。いくつかの実施形態によれば、Ｔリンパ球は、制御性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態によれば、Ｔリンパ球は、ヘルパーＴ細胞である。いくつかの実施形態によれば、Ｂリンパ球は、メモリーＢ細胞である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも３つのコア外因性免疫調節分子を含む腫瘍細胞の集団が、１つを超えるタイプの免疫細胞を刺激するのに有効であることが本発明の特徴である。例えば、本開示の腫瘍細胞の集団を含む同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するのに有効である。
いくつかの実施形態によれば、「免疫細胞を刺激すること」という表現は、免疫細胞の活性化を指す。いくつかの実施形態によれば、「免疫細胞を刺激すること」は、免疫細胞の拡大を指す。いくつかの実施形態によれば、「免疫細胞を刺激すること」は、免疫細胞の細胞傷害性の増加を指す。いくつかの実施形態によれば、「免疫細胞を刺激すること」は、免疫細胞の活性化、拡大、及び／または細胞傷害性の増加のうちの１つ以上の組み合わせを指す。いくつかの実施形態によれば、少なくとも３つのコア外因性免疫調節分子を含む腫瘍細胞のＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）またはＢリンパ球）をエクスビボで活性化及び／または拡大するのに有効である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも３つのコア外因性免疫調節分子を含む腫瘍細胞のＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、免疫キラー細胞（例えば、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）またはＢリンパ球）をインビボで活性化及び／または拡大するのに有効である。少なくとも３つのコア外因性免疫刺激分子を含む腫瘍細胞のＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団が免疫キラー細胞集団を刺激するのに有効であるかどうかを検出するためのアッセイが本明細書に記載されている。したがって、一態様によれば、本開示は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現し、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するのに有効な複数の免疫調節分子を安定して発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞の集団を含むＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団を提供する。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも３つの安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも４つの安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも５つの安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも６つの安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも７つの安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、
樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも８つの安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも９つの安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも１０個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも１１個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも１２個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも１３個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも１４個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも１５個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも１６個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも１７個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも１８個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも１９個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも２０個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも２１個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも２２個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも２３個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも２４個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも２５個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも２６個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも２７個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも２８個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも２９個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な少なくとも３０個の安定して発現する外因性免疫調節分子を含む。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な３つの必須の安定して発現する外因性免疫調節分子によって特徴付けられ、３つの必須の安定して発現する外因性免疫調節分子は、ＧＭＣＳＦ、ＯＸ４０Ｌ、及び４ＩＢＢ－Ｌである。
いくつかの実施形態によれば、３～２５個の包括的免疫調節因子を含む追加のＲサブセットを構成する外因性免疫調節分子は、抗腫瘍免疫応答を開始する、及び／または抗腫瘍免疫応答を維持する能力について、及び／またはがん患者に特徴的に存在する既存の免疫抑制を無効にするそれらの能力について、または３つすべての組み合わせについて、群から特に選択され得る。いくつかの実施形態によれば、免疫調節分子の組み合わせは、ヒト混合リンパ球腫瘍細胞反応によって評価及び選択される。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子の例示的なクラスとしては、サイトカイン、ＴＮＦファミリーメンバー、分泌受容体、シャペロン、ＩｇＧスーパーファミリーメンバー、及びケモカイン受容体または他の免疫調節分子が挙げられる。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、１つ以上のＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するように遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な複数の安定して発現される外因性免疫調節分子を含み、外因性免疫調節分子は１つ以上のサイトカインファミリーメンバータンパク質と１つ以上のＴＮＦファミリーメンバータンパク質を含み；外因性免疫調節分子は、１つ以上のサイトカインファミリーメンバータンパク質と１つ以上の分泌受容体タンパク質を含み；外因性免疫調節分子は、１つ以上のサイトカインファミリーメンバータンパク質と１つ以上のシャペロンタンパク質を含み；外因性免疫調節分子は、１つ以上のサイトカインファミリーメンバータンパク質と１つ以上のＩｇＧスーパーファミリーメンバータンパク質を含み；外因性免疫調節分子は、１つ以上のサイトカインファミリーメンバータンパク質と１つ以上のケモカイン受容体タンパク質を含む。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、１つ以上のＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するように遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な複数の安定して発現される外因性免疫調節分子を含み、外因性免疫調節分子は１つ以上のＴＮＦファミリーメンバータンパク質と１つ以上の分泌受容体タンパク質を含み；外因性免疫調節分子は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバータンパク質と１つ以上のシャペロンタンパク質を含み；外因性免疫調節分子は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバータンパク質と１つ以上のＩｇＧスーパーファミリーメンバータンパク質を含み；外因性免疫調節分子は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバータンパク質と１つ以上のケモカイン受容体タンパク質を含む。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、１つ以上のＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するように遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な複数の安定して発現される外因性免疫調節分子を含み、外因性免疫調節分子は１つ以上の分泌受容体タンパク質と１つ以上のシャペロンタンパク質を含み；外因性免疫調節分子は、１つ以上の分泌受容体タンパク質と１つ以上のＩｇＧスーパーファミリーメンバータンパク質を含み；外因性免疫調節分子は、１つ以上の分泌受容体タンパク質と１つ以上のケモカイン受容体タンパク質を含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示からなるＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、１つ以上のＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するように遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な複数の安定して発現される外因性免疫調節分子を含み、外因性免疫調節分子は１つ以上のＴＮＦファミリーメンバータンパク質と１つ以上の分泌受容体タンパク質を含み；外因性免疫調節分子は、１つ以上のシャペロンタンパク質と１つ以上のＩｇＧスーパーファミリーメンバータンパク質を含み；外因性免疫調節分子は、１つ以上のシャペロンタンパク質と１つ以上のケモカイン受容体タンパク質を含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示からなるＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を刺激するのに有効な複数の安定して発現する外因性免疫調節分子を含み、外因性免疫調節分子は、１つ以上のＩｇＧスーパーファミリーメンバータンパク質と１つ以上のケモカイン受容体タンパク質を含む。
例示的な免疫調節因子を以下の表６に示す。いくつかの実施形態によれば、Ｒサブセット中の外因性免疫調節分子は、ＴＮＦファミリーメンバー、分泌受容体、シャペロンタンパク質、ＩｇＧスーパーファミリーメンバー、ケモカイン受容体のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＴＮＦファミリーメンバーは、表６に列挙されるＴＮＦファミリーメンバーから選択される。いくつかの実施形態によれば、分泌受容体は、表６に列挙された分泌受容体から選択される。いくつかの実施形態によれば、シャペロンタンパク質は、表６に列挙されるシャペロンタンパク質から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＩｇＧスーパーファミリーメンバーは、表６に列挙されるＩｇＧスーパーファミリーメンバーから選択される。いくつかの実施形態によれば、ケモカイン受容体は、表６に列挙されるケモカイン受容体から選択される。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、マウスに由来する。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、ヒトに由来する。
Figure 2022553411000018
Figure 2022553411000019
いくつかの実施形態によれば、表６の外因性免疫調節分子は、膜結合型である（すなわち、膜アンカーを含む）。他の実施形態によれば、表６の外因性免疫調節分子は分泌型である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節因子の膜結合型は、４－１ＢＢリガンド、ＢＡＦＦ、Ａｐｒｉｌ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｆｌｔ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＳＰ９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ７、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０リガンド、ＲＡＮＫリガンド、及びＴＮＦからなる群から選択される１つ以上である。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の分泌型は、Ｆｌｔ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ７及びＴＧＦβ受容体からなる群から選択される１つ以上である。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、野生型アミノ酸配列を有する分子である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、バリアントアミノ酸配列を有する分子である。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、４－１ＢＢリガンド、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ互換シグナル配列で操作されたＧＭＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８膜アンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ－４０リガンド、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される１つ以上である。
いくつかの実施形態によれば、１つ以上の外因性免疫調節分子は、少なくとも３つの必須免疫調節分子を含み、３つの必須免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ８０、ＣＤ８６またはその両方を含むＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）である。いくつかの実施形態によれば、Ｒとして識別される追加の免疫調節成分もまた存在し得る。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団と、ＭＮＣ集団を刺激するのに有効な３つの安定して発現される必須の外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ２８Ｌと、を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団と、ＣＴＬの相乗的拡大を刺激するのに有効な３つの安定して発現される必須の外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８Ｌと、を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の免疫調節因子を含むＲ免疫調節因子の１つ以上のサブセットをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、少なくとも４つの安定して発現される外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８Ｌと、３～２５個の包括的免疫調節因子を含む１つのＲサブセットと、を発現するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、少なくとも４つの安定して発現される外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８Ｌと、３～２５個の包括的免疫調節因子を含む２つのＲサブセットと、を発現するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、少なくとも４つの安定して発現される外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８Ｌと、３～２５個の包括的免疫調節因子を含む３つのＲサブセットと、を発現するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、少なくとも３つの必須の安定して発現される外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８Ｌと、３～２５個の包括的免疫調節因子を含む４つのＲサブセットと、を発現するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、少なくとも３つの必須の安定して発現される外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８Ｌと、３～２５個の包括的免疫調節因子を含む５つのＲサブセットと、を発現するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、少なくとも３つの必須の安定して発現される外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８Ｌと、３～２５個の包括的免疫調節因子を含む６つのＲサブセットと、を発現するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、少なくとも３つの必須の安定して発現される外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８Ｌと、３～２５個の包括的免疫調節因子を含む７つのＲサブセットと、を発現するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、少なくとも３つの必須の安定して発現される外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８Ｌと、３～２５個の包括的免疫調節因子を含む８つのＲサブセットと、を発現するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、少なくとも３つの必須の安定して発現される外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８Ｌと、３～２５個の包括的免疫調節因子を含む９つのＲサブセットと、を発現するように遺伝子操作される。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、少なくとも３つの必須の安定して発現される外因性免疫調節分子、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８Ｌと、３～２５個の包括的免疫調節因子を含む１０個のＲサブセットと、を発現するように遺伝子操作される。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ1は、ＡＰＲＩＬである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ2は、ＢＡＦＦである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ3は、４－ＩＢＢリガンドである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ4は、ＣＤ３０リガンドである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ5は、ＣＤ４０リガンドである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ6は、ＣＤ８０である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ7は、ＣＤ８６である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ8は、ＦＬＴ－３リガンドである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ9は、ＨＳＰ－７０である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ10は、ＨＳＰ－９０である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ11は、ＩＣＯＳリガンドである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ12は、ＩＬ－１０Ｒである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ13は、ＩＬ－１２である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ14は、ＩＬ－１５である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ15は、ＩＬ－１８である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ16は、ＩＬ－２である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ17は、ＩＬ－２１である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ18は、ＩＬ－２３である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ19は、ＩＬ－７である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ20は、ＬＩＧＨＴである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ21は、ＲＡＮＫリガンドである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ22は、ＴＧＦ－ｂ受容体である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ23はＴＮＦであり、いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ24はＧＭ－ＣＳＦである。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒは、１～３０個の包括的な、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の免疫調節分子、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、４－ＩＢＢリガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８膜アンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＧＭ－ＣＳＦからなる群から選択される外因性免疫調節分子を含む。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、１～３０個の包括的な、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の外因性免疫調節分子を含み、少なくとも３つの免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンドであり、追加の免疫調節コンポーネントは、Ｒ1－Ｒ24であると識別され、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、４－ＩＢＢリガンド（４－ＩＢＢＬ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ互換シグナル配列で操作されたＧＭＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８メンブレンアンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、１～２０個の包括的な、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の外因性免疫調節分子を含み、４－１ＢＢリガンド、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ２８リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ互換シグナル配列で操作されたＧＭＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８メンブレンアンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ－４０リガンド、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒは、１～２０個の包括的な、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の外因性免疫調節分子を含み、少なくとも３つの免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド、及びＣＤ２８リガンドであり、追加の免疫調節コンポーネントは、Ｒ1－Ｒ24であると識別され、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、４－ＩＢＢリガンド、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ互換シグナル配列で操作されたＧＭＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８メンブレンアンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、１～１０個の包括的な、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の外因性免疫調節分子を含み、４－１ＢＢリガンド、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ２８リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ互換シグナル配列で操作されたＧＭＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８膜アンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ－４０リガンド、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、１～１０個の包括的な、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の外因性免疫調節分子を含み、少なくとも３つの免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド、及びＣＤ２８リガンドであり、追加の免疫調節コンポーネントは、Ｒ1－Ｒ24であると識別され、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、４－ＩＢＢリガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ互換シグナル配列で操作されたＧＭＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８メンブレンアンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、５～２０個の包括的な、すなわち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の外因性免疫調節分子Ｒを含み、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、４－１ＢＢリガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ互換シグナル配列で操作されたＧＭＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８メンブレンアンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、５～２０個の包括的な、すなわち、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の外因性免疫調節分子を含み、少なくとも３つの免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）であり、追加の免疫調節因子は、Ｒ1－Ｒ24であると識別され、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、４－ＩＢＢリガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ互換シグナル配列で操作されたＧＭＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８メンブレンアンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒは、１０～１５個の包括的な、すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の外因性免疫調節分子を含み、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、４－ＩＢＢリガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８メンブレンアンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、１０～１５個の包括的な、すなわち、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の外因性免疫調節分子を含み、少なくとも３つの免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）であり、追加の免疫調節因子は、Ｒ1－Ｒ24であると認識され、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、４－ＩＢＢリガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ互換シグナル配列で操作されたＧＭＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８メンブレンアンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、１４個の外因性免疫調節分子を含み、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、４－ＩＢＢリガンド、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８メンブレンアンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子は、１４個の外因性免疫調節分子を含み、少なくとも３つの免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンドであり、追加の免疫調節因子は、Ｒ1－Ｒ24であると認識され、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、４－ＩＢＢリガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ－３リガンド、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ互換シグナル配列で操作されたＧＭＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＣＤ８メンブレンアンカーで操作されたＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦからなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子４－１ＢＢリガンド、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ２８リガンド、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ－４０リガンド、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦのそれぞれは、野生型分子である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子４－１ＢＢリガンド、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ２８リガンド、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＦＬＴ－３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＳＰ－７０、ＨＳＰ－９０、ＩＣＯＳリガンド、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ－４０リガンド、ＲＡＮＫリガンド、ＴＧＦ－ｂ受容体、及びＴＮＦのそれぞれは、変異体またはバリアントの配列である。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ1は、ＡＰＲＩＬである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ2は、ＢＡＦＦである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ3は、４－ＩＢＢリガンドである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ4は、ＣＤ３０Ｌである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ5は、ＣＤ４０リガンドである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ6は、ＣＤ８０である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ7は、ＣＤ８６である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ8は、ＦＬＴ－３リガンドである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ9は、ＨＳＰ－７０である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ10は、ＨＳＰ－９０である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ11は、ＩＣＯＳリガンドである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ12は、ＩＬ－１０Ｒである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ13は、ＩＬ－１２である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ14は、ＩＬ－１５である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ15は、ＩＬ－１８である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ16は、ＩＬ－２である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ17は、ＩＬ－２１である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ18は、ＩＬ－２３である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ19は、ＩＬ－７である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ20は、ＬＩＧＨＴである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ21は、ＲＡＮＫリガンドである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ22は、ＴＧＦ－ｂ受容体である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ23は、ＴＮＦである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ24は、ＩＲＥＳ適合シグナル配列で操作されたＣＤ８６バリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ25は、膜貫通領域を除去するように操作されたＦＬＴ３Ｌバリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ26は、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ適合シグナル配列で操作されたＧＭ－ＣＳＦバリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ27は、ＣＤ８膜アンカーで操作されたＨＳＰ７０バリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ28は、ＣＤ８膜アンカーで操作されたＨＳＰ－９０Ｂ１（ＧＲＰ９４／９６）バリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ29は、ＣＤ８膜アンカーで操作されたＨＳＰ９０バリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ30は、ＩＲＥＳ適合シグナル配列で操作されたＩＣＯＳＬバリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ31は、膜貫通領域を除去するように操作されたＩＬ１０Ｒバリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ32は、膜貫通領域を除去するように操作されたＩＬ－Ｒαバリアント（ＶＳＶ－ＧＭ－ＣＳＦタグ）である。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ33は、ＣＤ８膜アンカーを含む単一鎖となるよう操作されたＩＬ１２バリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ34は、ＣＤ８膜アンカーで操作されたＩＬ１５バリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ35は、ＣＤ８膜アンカーで操作されたＩＬ１８バリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ36は、ＣＤ８膜アンカー及びＩＲＥＳ適合配列で操作されたＩＬ２バリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ37は、ＣＤ８膜アンカーで操作されたＩＬ２１バリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ38は、ＣＤ８膜アンカーを含む単一鎖となるよう操作されたＩＬ２３バリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ39は、ＣＤ８膜アンカーで操作されたＩＬ１７バリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ40は、膜貫通領域を除去するように操作されたＴＧＦｂ－Ｒバリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ41は、膜貫通領域を除去するように操作されたＴＧＦｂ受容体ＩＩＩバリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ42は、膜結合型となるよう操作されたｍＩＦＮαバリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ43は、膜結合型となるよう操作されたｍＩＦＮαγバリアントである。いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子Ｒ44は、切断耐性であるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）バリアントである。以下の表７は、Ｒ群、Ｒ1－Ｒ44を示している。
Figure 2022553411000020
Figure 2022553411000021
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１２個のベクターは１４個の免疫調節因子を含み、３つの必須免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）であり、残りの１１個の免疫調節因子は、表７のＲ1－Ｒ44から選択される。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１１個のベクターは１４個の免疫調節因子を含み、３つの必須免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）であり、残りの１１個の免疫調節因子は、表７のＲ1－Ｒ44から選択される。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１０個のベクターは１４個の免疫調節因子を含み、３つの必須免疫調節分子はＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）であり、残りの１１個の免疫調節因子は表７のＲ1－Ｒ44から選択される。いくつかの実施形態によれば、１４個の免疫調節因子は表６から選択され、少なくとも３つの免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）であり、残りの１１個の免疫調節因子は表７のＲ1－Ｒ44から選択され、１４個の免疫調節因子が１２個のベクターに含まれている。いくつかの実施形態によれば、１４個の免疫調節因子は表６から選択され、３つの必須免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）であり、残りは１１個の免疫調節因子は表７のＲ1－Ｒ44から選択され、１４個の免疫調節因子は１１個のベクターに含まれている。いくつかの実施形態によれば、１４個の免疫調節因子は表６から選択され、３つの必須免疫調節分子は、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）であり、残りは１１個の免疫調節因子は表７のＲ1－Ｒ44から選択され、１４個の免疫調節因子は１０個のベクターに含まれている。ベクターはさらにタグを含み得る。
いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子はコドン最適化されている。「コドン最適化」は、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを、コードされたタンパク質をより効率的に特定の生物において発現できるように、特定の生物において他の生物よりも先に使用されるコドンで改変することを意味する。ほとんどのアミノ酸は「同義語」または「同義コドン」と呼ばれるいくつかのコドンによって記述されるため、遺伝暗号には縮重がある。しかしながら、特定の生物によるコドン使用頻度はランダムではなく、特定のコドントリプレットに偏っている。このようなコドン使用頻度のバイアスは、特定の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、低コピー数のタンパク質に対して高レベルで発現されるタンパク質、または生物のゲノムのグループタンパク質コード領域に関連してさらに高くなる可能性がある。
サイトカイン
いくつかの実施形態によれば、本開示は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現し、３つの免疫調節分子と１つ以上のサイトカインを含む免疫調節分子の１つ以上のＲ群を発現するよう遺伝子操作された、腫瘍細胞の集団を含むＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団を包含し、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球を含むシリアルキラー細胞の１つ以上の集団を刺激するのに効果的である。したがって、本開示は、サイトカインの全長、断片、相同体、バリアント、または変異体を含むサイトカインを包含する。サイトカインには、別の細胞の生物学的機能に影響を及ぼすことができるタンパク質が含まれる。サイトカインによって影響を受ける生物学的機能としては、細胞増殖、細胞分化、または細胞死が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、本開示のサイトカインは、細胞の表面上の特定の受容体に結合することができ、それによって免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球）を刺激する。
いくつかの実施形態によれば、サイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３ＬＧ）、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、ＩＬ－１ａ、ＩＬ－１ｂ、Ｉｌ－１ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２ｐ４０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１２／ＩＬ－２３ Ｐ４０、ＩＬ１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５／ＩＬ１５－ＲＡ、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＴＧＦ－β、ＭＣＰ－１、ＴＮＦ－α及びインターフェロンα（ＩＦＮα）、ＩＦＮγ、ＭＩＰ１ｂ、Ｒａｎｔｅｓ、Ｔｗｅａｋ、及びＴＲＥＭ－１から選択される。いくつかの実施形態によれば、サイトカインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）である。いくつかの実施形態によれば、サイトカインは、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３ＬＧ）である。
いくつかの実施形態によれば、サイトカインは分泌される。いくつかの実施形態によれば、サイトカインは膜結合型である。
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ；コロニー刺激因子２；ＣＳＦ２）は、単球／マクロファージ及び活性化Ｔ細胞に見られ、樹状細胞を刺激及び動員する増殖因子として作用する。ＧＭ－ＣＳＦは、免疫系の細胞、ならびに内皮細胞及び線維芽細胞から分泌される単量体糖タンパク質である。ヒトＧＭ－ＣＳＦは１４４アミノ酸のタンパク質であり、１７アミノ酸のシグナルペプチドを含み、これを切断して成熟した１２７アミノ酸のタンパク質を生成することができる。ＧＭ－ＣＳＦの生物活性は、単球、マクロファージ、顆粒球、リンパ球、内皮細胞、肺胞上皮細胞に発現するヘテロマーの細胞表面受容体への結合を介して発生する。ＧＭ－ＣＳＦ受容体（ＧＭ－ＣＳＦＲ）は典型的には、発現が低い（例えば、２０～２００／細胞）が、親和性は高い（Ｓｈｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ （ＧＭ－ＣＳＦ） ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ： ｗｈａｔ ｗｅ ｄｏ ａｎｄ ｄｏｎ‘ｔ ｋｎｏｗ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２００６） １６： １２６－１３３）。
アジュバント療法として可溶性ＧＭ－ＣＳＦで治療された黒色腫患者は、対照と比較して無病生存期間の増加を示した。ＧＭ－ＣＳＦは、可溶性ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ融合タンパク質の全身及び局所適用、ＧＭ－ＣＳＦによる腫瘍細胞のトランスフェクション、ＧＭ－ＣＳＦ ＤＮＡの注射を含む、さまざまな方法で免疫アジュバントとして使用されてきた。組換えＧＭ－ＣＳＦは、さまざまなペプチド、タンパク質、及びウイルスワクチンのアジュバントとして使用されており、黒色腫、乳癌、及び卵巣癌の患者に効果的なアジュバントであることが示されている。ＧＭ－ＣＳＦを含む融合タンパク質は、抗原の免疫原性を高めることも示されている。ＧＭ－ＣＳＦは、同種異系または自家のＧＭ－ＣＳＦ発現細胞をワクチンとして使用する遺伝子治療アプローチでの使用が試験されている（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｗｏｌｃｈｏｋ ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈｐｔ ５，６７－１２１ （２００７））。このような治療法は、いくつかの異なる種類のがんの間でさまざまな程度の有効性を有している。
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１３のＧＭ－ＣＳＦペプチドを発現し得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１３のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１３のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１３のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１３のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１３のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１３のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１３のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１３のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１３のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、膜発現を可能にするためのＧＭ－ＣＳＦとＨＬＡ－１との間の融合を含む１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号４２または配列番号５のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号４２または配列番号５のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞系統変異体は、配列番号４２または配列番号５のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号４２または配列番号５のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号４２または配列番号５のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号４２または配列番号５のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号４２または配列番号５のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号４２または配列番号５のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号４２または配列番号５のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。
Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）
いくつかの実施形態によれば、ヒトＦｌｔ３Ｌタンパク質は、ＦＬＴ３ＬＧ遺伝子によってコードされる膜結合型造血４ヘリックスバンドルサイトカインである。Ｆｌｔ３Ｌは、さまざまな血球前駆細胞の増殖と分化を刺激する増殖因子として機能し、樹状細胞の産生と発達に不可欠である。Ｆｌｔ３Ｌを欠くマウスは樹状細胞のレベルが低く、Ｆｌｔ３Ｌをマウスまたはヒトに投与すると、樹状細胞のレベルが非常に高くなる（Ｓｈｏｒｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅａｄｙ－ｓｔａｔｅ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ－ｃｅｌｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． ７． １９－３０ （２００７））。
いくつかの実施形態によれば、Ｒ免疫調節因子のサブセットは、Ｆｌｔ－３Ｌの膜結合型を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は配列番号１４のＦｌｔ３Ｌペプチドを発現する。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１４のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１４のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１４のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１４のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１４のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１４のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１４のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１４のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１４のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子のＲサブセットは、Ｆｌｔ３Ｌの可溶型を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４４のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４４のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４４のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４４のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４４のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号４４のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４４のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４４のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４４のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
当業者は、本明細書で提供される教示を備えた後、本発明が、現在当業者でよく知られて いるか、または将来発見されるかを問わず、任意のサイトカインを包含することを理解するであろう。
いくつかの実施形態によれば、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現し、３つの免疫調節因子のコア群を発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞の集団を含む同種異系 ＥＮＬＳＴ（商標）細胞の集団は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）のサイトカイン、またはそのバリアントまたは断片を含む。
ＴＮＦファミリーメンバー
いくつかの実施形態によれば、本開示は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現し、３つの免疫調節分子と１つ以上のＴＮＦファミリーメンバーを含む免疫調節分子の１つ以上のＲ群を発現するよう遺伝子操作された、腫瘍細胞の集団を含むＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団を包含し、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を含むシリアルキラー細胞を活性化し、腫瘍細胞を殺傷するのに効果的である。したがって、本開示は、ＴＮＦファミリータンパク質の全長、断片、相同体、バリアント、または変異体を含む、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバータンパク質を包含する。いくつかの実施形態によれば、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、ＣＤ３０リガンド（ＣＤ３０Ｌ）、ＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ）、ＴＮＦＳＦ８、ＴＮＦＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１１、ＴＮＦＳ１２、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦβ、ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＴＮＦγ、エクトジスプラシンＡ（ＥＤＡ）、４－ＩＢＢ、及びそのリガンド４－ＩＢＢリガンド（４－ＩＢＢＬ）のうちの１つ以上から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＴＮＦαである。いくつかの実施形態によれば、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＣＤ４０Ｌである。いくつかの実施形態によれば、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＯＸ４０リガンドである。いくつかの実施形態によれば、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーはＣＤ２７リガンドである。いくつかの実施形態によれば、ＴＮＦスーパーファミリーメンバーは４－ＩＢＢＬである。
いくつかの実施形態によれば、ＴＮＦファミリーメンバーは膜結合型である。
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーは、ＴＮＦ相同性ドメインを含み三量体を形成するＩＩ型膜貫通タンパク質のタンパク質スーパーファミリーである。このスーパーファミリーのメンバーは、細胞外タンパク質分解切断によって細胞膜から放出され、サイトカインとして機能し得る。これらのタンパク質は主に免疫細胞によって発現され、免疫応答及び炎症の調節だけでなく、増殖、分化、アポトーシス、胚形成などの多様な細胞機能を調節する。スーパーファミリーには、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの２９のメンバーに結合する１９のメンバーが含まれている。
いくつかのＴＮＦファミリー分子は共刺激シグナルを伝達する。これらは、ＴＲＡＦ依存性経路を介してＮＦκＢを活性化することによって機能しているようである。例えば、樹状細胞上のＣＤ７０がナイーブＴ細胞上の構成的に発現するＣＤ２０受容体に結合すると、活性化プロセスの早い段階で強力な共刺激シグナルがＴ細胞に伝達される。樹状細胞上の受容体ＣＤ４０は、Ｔ細胞上に発現するＣＤ４０リガンドに結合し、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する双方向シグナル伝達を開始し、樹状細胞に増加したＢ７を発現させるよう誘導する ことで、さらなる細胞増殖を刺激する。Ｔ細胞分子４－ＩＢＢ（ＣＤ１３７）とそのリガンドである４－ＩＢＢＬは、活性化された樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞で発現し、ＴＮＦファミリー共刺激因子の対を構成する。この相互作用の効果は双方向であり、Ｔ細胞と抗原提示細胞の両方が活性化シグナルを受け取る。別の共刺激受容体とそのリガンドであるＯＸ４０とＯＸ４０Ｌは、それぞれ活性化Ｔ細胞と樹状細胞に発現している。Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ． Ｊａｎｅｗａｙ‘ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ： ８ｔｈ ｅｄ． Ｃｈａｐｔｅｒ １５： Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ． （２０１２），ａｔ ３７０。
ＴＮＦＲファミリーメンバーであるＯＸ４０（ＣＤ１３４）及び４－ＩＢＢ（ＣＤ１３７）は、ＣＤ４とＣＤ８Ｔ細胞の両方の共刺激受容体として主要な役割を果たすことが判明している。ＯＸ４０と４－ＩＢＢはどちらも、共有されている明確なＴＲＡＦアダプター分子を介してシグナルを送り；炎症性カスケードもこれらの受容体を介して引き起こされ得る。ＯＸ４０及びＣＤ２８シグナル伝達は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ、ＡＰ－１、ＮＦ－κＢ経路などの複数のシグナル伝達経路を活性化する。さらに、ＯＸ４０及び４－ＩＢＢは、Ｔｒｅｇを含む免疫抑制または免疫調節細胞の強力な制御因子である。Ｓｏ，Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． （２００８） １９ （３－４）： ２５３－６２）。
ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４、ｂＴＮＦスーパーファミリーメンバー４）
もともと糖タンパク質３４ｋＤａ（ＧＰ３４）と呼ばれていたＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）（ＣＤ２５２、ＴＮＦＳＦ４）は、ＴＮＦスーパーファミリーに属している。それは主に、活性化樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、及び内皮細胞を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現する［ＤｅＳｍｅｄｔ，Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ （２００２） １６８： ６６１－６７０． ｄｏｉ： １０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１６８．２．６６１を引用するＨｕａｎｇ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｔｒａｎｓ． Ｍｅｄ． （２０１８） １６： ７４；ｄｏｉ： １０．１１８６／ｓ１２９６７－０１８－１４３６－４；Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ （１９９８） ９２： ３３３８－３３４５］。
ＯＸ４０（ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４）は、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞表面で構成的に発現する［Ｏｇａｗａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． （２００８） １９：２５３－２６２． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃｙｔｏｇｆｒ．２００８．０４．００３を引用する同上、Ｐａｔｅｒｓｏｎ ＤＪ，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９８７） ２４：１２８１－１２９０． ｄｏｉ： １０．１０１６／０１６１－５８９０（８７）９０１２２－２］。それはＯＸ４０Ｌに特異的に結合し、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖と生存及びサイトカイン分泌を促進するのに寄与する一連の反応を開始することができる［Ｋａｕｒ Ｄ，Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｇ Ｃ． Ｃｈｅｓｔ． （２０１２） １４１：４９４－４９９． ｄｏｉ： １０．１３７８／ｃｈｅｓｔ．１１－１７３０を引用する同上］。ＯＸ－４０受容体（ＯＸ－４０Ｒ）は、活性化ＣＤ４（＋）Ｔ細胞の表面に見られる膜貫通型タンパク質である。Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，ＡＤ，ｅｔ ａｌ．，“ＯＸ－４０： ｌｉｆｅ ｂｅｙｏｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｔａｇｅ，” Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９８） １０（６）： ４７１－８０）。Ｔ細胞株への抗原提示中に抗ＯＸ－４０抗体またはＯＸ－４０リガンド（ＯＸ－４０Ｌ）などのアゴニストが結合すると、ＯＸ－４０ＲはＣＤ２８共刺激と同じくらい強力な共刺激シグナルを生成する（同上）。ＯＸ－４０Ｒの結合は、ＩＬ－２産生を上方制御し、エフェクターＴ細胞の寿命を延ばすことにより、エフェクターＴ細胞及びメモリーエフェクターＴ細胞の機能を増強する（同上）。
ＣＤ２５－Ｆｏｘｐ３－ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞は、ＴＧＦ－βＲ及びＩＬ－２Ｒシグナルによって駆動されるＦｏｘｐ３を獲得し、誘導性Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）への分化をもたらす。Ｓｏ，Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ． （２００８） １９ （３－４）： ２５３－６２。ＯＸ４０からの共刺激シグナルは、抗原応答性のナイーブＣＤ４ Ｔ細胞におけるＦｏｘｐ３誘導に拮抗し、多数のＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ｉＴｒｅｇの発生を抑制することが判明している（Ｖｕ ＭＤ，ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ． （２００７） １１０：２５０１－１０を引用する同上；Ｓｏ Ｔ，Ｃｒｏｆｔ Ｍ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００７） １７９：１４２７－３０）。
開示された発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞の膜上にＯＸ４０Ｌの膜結合型を発現するように操作され得る。開示された発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＯＸ４０Ｌの可溶型を発現するように操作され得る。
開示された発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞の膜上に配列番号１０８のＯＸ４０Ｌの膜結合型を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１０８のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０８のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０８のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞バリアントは、配列番号１０８のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０８のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０８のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０８のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０８のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０８のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。
ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）
タイプＩＩ膜貫通タンパク質であるＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーである。それは、活性化されたＴリンパ球及びＢリンパ球、ならびにＮＫ細胞に発現する。ＣＤ２７リガンドとその受容体ＣＤ２７は、Ｔ細胞の拡大と分化、及びＮＫの増強を促進することにより、免疫応答を調節する。ＣＤ２７シグナルは、一次ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の後期に、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のアポトーシスを防ぐ。ＣＤ２７シグナルの欠如は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答の質を低下させる。しかしながら、ナイーブ細胞と同様に表面ＣＤ２７を発現するメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は、二次応答時にＣＤ２７共刺激を必要としない。したがって、インビボでは、ＣＤ２７は間接的に作用して一次応答の後期にＣＤ８＋Ｔ細胞のアポトーシスを防ぐことにより一次抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を調節し、メモリー細胞の最適な品質に必要であるが、通常はプライミングされた二次ＣＤ８＋Ｔ細胞応答には必要とされない（Ｄｏｌｆｉ，ＤＶ，ｅｔ ａ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００８） １８０（５）： ２９１２－２９２１）。全長ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）は１９３アミノ酸のタンパク質であり、１７アミノ酸の細胞質ドメイン、２１アミノ酸の膜貫通ドメイン、及び１５５アミノ酸の細胞外ドメインで構成されている。ヒト可溶性ＣＤ７０は、全長ＣＤ７０タンパク質の１５５アミノ酸の細胞外ドメインに対応する。
開示された発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞の膜上にＣＤ７０の膜結合型を発現するように操作され得る。
開示された発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、ＣＤ７０の可溶型を発現するように操作され得る。
開示された発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞の膜上に配列番号１０９のＣＤ７０の膜結合型を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０９のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０９のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０９のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０９のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０９のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０９のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０９のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０９のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１０９のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。
４－ＩＢＢＬ
ナイーブＣＤ８ Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４ Ｔ細胞となるよりも、活性化エフェクター細胞になるように駆動するために、より多くの共刺激活性を必要とする。この要件は、２つの方法で満たすことができる。最も単純なのは、高い固有の共刺激活性を持つ活性化ＤＣによるプライミングである。一部のウイルス感染症では、樹状細胞が十分に活性化され、ＣＤ４ Ｔ細胞のヘルプなしに、ＣＤ８ Ｔ細胞を直接誘導してそれらの細胞傷害性エフェクター細胞への分化に必要なＩＬ－２を産生する。ＤＣのこの特性は、腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を生成するために利用されている。しかしながら、ウイルス感染の大部分では、ＣＤ８ Ｔ細胞の活性化には、ＣＤ４エフェクターＴ細胞によって提供される追加のヘルプが必要である。ＡＰＣによって提示される関連抗原を認識するＣＤ４ Ｔ細胞は、ＡＰＣをさらに活性化することにより、ナイーブＣＤＴ細胞の活性化を増幅することができる。ＤＣによって発現されるＢ７は、最初にＣＤ４ Ｔ細胞を活性化して、ＩＬ－２及びＣＤ４０Ｌを発現させる。ＣＤ４０ＬはＤＣ上のＣＤ４０に結合し、樹状細胞によるＢ７及び４－ＩＢＢＬの発現を増加させる追加のシグナルを伝達する。これにより、ナイーブＣＤ８Ｔ細胞に追加の共刺激が提供される。活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞によって産生されるＩＬ－２はまた、エフェクターＣＤ８ Ｔ細胞の分化を促進するよう作用する。Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ． Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ： ８ｔｈ ｅｄ． Ｃｈａｐｔｅｒ １５： Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ． （２０１２），ａｔ ３７２。
４－ＩＢＢは、Ｔ細胞の一次活性化に続く発現パターンを有し、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞に拘束される。Ｇｕｉｎｎ，Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ． （１９９９） １６２： ５００３－５０１０。４－ＩＢＢ受容体の結合は、活性化Ｔ細胞内で強力な共刺激シグナルを中継することが示されている。これにより、それらの増殖とサイトカイン分泌が増強される（同上）。このようなシグナル伝達は、他のアクセサリーシグナルがない場合のＴＣＲ架橋後の活性化誘導細胞死を防ぐ（同上）。活性化ＡＰＣの表面に発現する４－ＩＢＢの高親和性リガンドである４－ＩＢＢＬは、ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーと相同性を示すＩＩ型膜タンパク質である。ＣＤ２８－／－マウスから精製されたＴ細胞は、サイトカインを分泌し、４－ＩＢＢＬを発現するリンパ腫に応答して増殖することが示されている。この応答は、可溶性４－ＩＢＢ受容体融合タンパク質によって阻害され得る（同上）。ＣＤ２８シグナルがない場合、４－ＩＢＢＬ：４－ＩＢＢ相互作用は、混合リンパ球反応におけるＴｈ２応答の生成に役割を果たすことが示されている（同上）。
開示された発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、４－ＩＢＢＬの膜結合型を発現するように操作され得る。開示された発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、４－ＩＢＢＬの可溶型を発現するように操作され得る。
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）
ＣＤ１５４またはＣＤ４０Ｌとして知られるＣＤ４０のリガンドは、ＩＩ型膜貫通タンパク質であり、翻訳後修飾のために分子量が３２～３９ｋＤａの間で変動する（ｖａｎ Ｋｏｏｔｅｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ． ２０００ Ｊａｎ；６７（１）：２－１７を引用する、Ｅｌｇｕｅｔａ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ． ２００９；２２９（１）：１０．１１１１／ｊ．１６００－０６５Ｘ．２００９．００７８２．ｘ． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１６００－０６５Ｘ．２００９．００７８２．ｘ）。膜貫通型と同様の活性を有する可溶型のＣＤ４０Ｌが報告されている（Ｇｒａｆ Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９５ Ｊｕｎ；２５（６）：１７４９－５４；Ｍａｚｚｅｉ ＧＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９５ Ｍａｒ ３１；２７０（１３）：７０２５－８を引用する、同上）。
自然界では、ＣＤ４０ＬはＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、ＣＤ４０Ｌの三量体化を可能にするβシート、αヘリックスループ、及びβシートで構成されるサンドイッチ細胞外構造を特徴としている（Ｋａｒｐｕｓａｓ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． １９９５ Ｏｃｔ １５；３（１０）：１０３１－９を引用する、同上）。ＣＤ４０Ｌは、主に活性化Ｔ細胞、ならびに活性化Ｂ細胞及び血小板によって発現される。炎症性条件下では、それは、単球細胞、ナチュラルキラー細胞、マスト細胞、及び好塩基球にも誘導される（Ｃａｒｂｏｎｅ Ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９９７ Ｊｕｎ １６；１８５（１２）：２０５３－６０を引用する、同上）。ＣＤ４０ＬとＣＤ４０の共刺激対の広範な発現は、それらがさまざまな細胞性免疫プロセスで果たす極めて重要な役割を示している。
ＣＤ４０Ｌには、ＣＤ４０、α５β１インテグリン、αＩＩｂβ３インテグリンの３つの結合パートナーがある。ＣＤ４０Ｌは共刺激分子として作用し、Ｔ濾胞ヘルパー細胞（ＴＦＨ細胞）と呼ばれるＴ細胞のサブセットで特に重要である。ＣＤ４０ＬはＢ細胞表面でＣＤ４０と結合し、細胞間コミュニケーションを促進することで、Ｂ細胞の成熟と機能を促進する。ＣＤ４０Ｌ遺伝子の欠損は、免疫グロブリンクラススイッチを受けることができなくなり、高ＩｇＭ症候群に関連する。ＣＤ４０Ｌがないと、胚中心の形成も停止し、適応免疫系の重要なプロセスである抗体の親和性成熟が妨げられる。
ＣＤ４０はＡＰＣで発現することが判明しているが、そのリガンドであるＣＤ４０Ｌは活性化Ｔ細胞で見出される。ＣＤ４０は、体液性免疫応答において重要な役割を果たすことが判明しており、ＡＰＣがＴ細胞を活性化できるようにすることが確認されている。ループス及びアテローム性動脈硬化症を含む、いくつかの病状がＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路に関連しているが、抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、活性化血小板でのＣＤ４０発現による血栓性合併症の臨床応用に限定されている（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｗｏｌｃｈｏｋ ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈｐｔ ５，６７－１２１ （２００７））。
ＣＤ４０は、固形腫瘍及び血液悪性腫瘍を含む、いくつかの種類のがんにも見られる。血液がんにおけるＣＤ４０を介したシグナル伝達は増殖または退行を媒介し得るが、固形腫瘍におけるＣＤ４０シグナル伝達は殺腫瘍性のみである。これらの特徴は、ＳＣＩＤマウスモデルでさえも見られるため、ＴＮＦデスドメインシグナル伝達が原因である可能性がある。免疫調節の証拠もある。例えば、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路の遮断は、ＧＭ－ＣＳＦ分泌黒色腫ワクチンの保護効果を軽減する（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｗｏｌｃｈｏｋ ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈｐｔ ５，６７－１２１ （２００７））。
ＣＤ４０Ｌを発現する腫瘍細胞ワクチンは、がんモデルで有用であることが証明されている。例えば、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌまたは抗ＣＤ４０抗体とのライゲーションは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、、及びＣＴＬＡ－４遮断との相乗効果を示している。さらに、抗ＣＤ４０抗体は、前臨床マウスモデルにおいて抗腫瘍活性を有することが報告されている（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｗｏｌｃｈｏｋ ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈｐｔ ５，６７－１２１ （２００７））。
いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子のＲサブセットは、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）を含み得る。開示された発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号６の切断不可能なＣＤ４０Ｌペプチドを発現するように操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号６のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号６のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号６のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号６のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号６のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号６のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号６のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号６のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号６のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、腫瘍細胞の膜表面上に配列番号７の切断不可能な膜結合型ＣＤ４０Ｌペプチドを発現するように操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号７のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号７のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号７のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号７のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号７のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号７のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号７のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号７のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号７のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ；腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）；カケキシン、カケクチン）はサイトカインであり、主に活性化マクロファージ及びリンパ球によって産生され、全身性炎症に関与する。それはまた、免疫原性応答の急性期に関与するサイトカインの１つである。ＴＮＦは、例えば、ＣＤ４＋リンパ球、ＮＫ細胞、好中球、マスト細胞、好酸球、及びニューロンなどの他の細胞型によって産生され得る。
免疫細胞の調節因子としてのその主要な役割において、ＴＮＦは、発熱、アポトーシス細胞死、悪液質、炎症、及び腫瘍形成の阻害；ウイルス複製の阻害；敗血症バイアルＩＬ－１及びＩＬ－６産生細胞への応答の開始を誘発することができる。調節不全のＴＮＦ産生は、アルツハイマー病、大うつ病、乾癬、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を含む、さまざまなヒトの疾患に関連している。ＴＮＦは、悪性腫瘍の状況で異所的に産生される可能性があり、二次性高カルシウム血症の原因と過剰産生が関連するがんの両方で副甲状腺ホルモンと平行する。
ＴＮＦは、２６ｋＤａの膜結合型と１７ｋＤａの可溶性サイトカイン型で構成されている。ＴＮＦの可溶型は、ＴＮＦ－α変換酵素（ＴＡＣＥ）による膜結合型のタンパク質分解的切断に由来する（Ｇｒｅｌｌ Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｏｒｍ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ Ｉｓ ｔｈｅ Ｐｒｉｍｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ ｏｆ ｔｈｅ ８０ ｋＤａ Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ． ８３，７９３－８０２）。ＴＡＣＥは、全長ＴＮＦの細胞外ドメインの切断部位を認識するマトリックスメタロプロテアーゼである（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｒ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｆｏｒｍ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ａｌｐｈａ ｈａｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００９，１６，５３－６４）。ＴＮＦの切断部位を削除すると、ＴＮＦの膜安定性が向上する（同上）。
ＴＮＦは細胞に対して抗増殖作用と細胞傷害性作用を有し、腫瘍の血流と腫瘍の血管損傷を軽減することが知られており、マクロファージとＮＫ細胞の活性を刺激することで免疫応答を調節することができる。しかしながら、治療薬としてのＴＮＦの使用自体は、敗血症のような症候群を引き起こす可能性のある用量依存的な低血圧と毛細血管漏出によって制限されてきた。そのため、全身への影響を制限する方法で提供する必要がある。ＴＮＦは、奏効率を改善するために標準的な化学療法剤に追加された。ＴＮＦを投与するための他のアプローチには、胃腸の悪性腫瘍においてＴＮＦを発現するように改変されたアデノウイルスの注射が含まれる。腫瘍血管を標的とするＴＮＦ化合物も開発されている（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｗｏｌｃｈｏｋ ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈｐｔ ５，６７－１２１ （２００７））。組換えＴＮＦはタソネルミンという名称で免疫賦活剤として使用されてきたが、ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）はＴＮＦに対する抗体であり、炎症性疾患（例えば、乾癬及び関節リウマチ）の治療に有用である。この役割を認識して、抗体などの分子はＴＮＦ活性を妨害するように設計されている。しかしながら、そのような治療法は、サイトカインの不適切な全身放出によって引き起こされるサイトカインストームを開始し、致命的となる可能性のある白血球活性化／サイトカイン放出の正のフィードバックループをもたらすリスクをもたらす。
いくつかの実施形態によれば、Ｒメンバーのサブセットは、ＴＮＦを含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、腫瘍細胞の膜上に、ＴＮＦの膜結合型を発現するよう遺伝子操作され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、細胞株バリアントは、配列番号８のペプチドを含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号８のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号８のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号８のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号８のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号８のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号８のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号８のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号８のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号８のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＴＮＦの切断不可能な膜結合型を発現するように遺伝子操作され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、アミノ酸ＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰ（配列番号１０４）のうちの１つ以上が削除された配列番号８のＴＮＦタンパク質を含むように遺伝子操作され得る（例えば、配列番号２６を参照されたい）。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＴＮＦの可溶型を発現するように遺伝子操作され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、膜貫通領域の一部または全体が除去された配列番号８のＴＮＦタンパク質を発現するように遺伝子操作され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、アミノ酸Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ａ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｔ、Ｌ、Ｆ、Ｃ、Ｌ、Ｌ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｖ、Ｉのうちの１つ以上が削除された配列番号８の誘導体ＴＮＦタンパク質を含むように遺伝子操作され得る（例えば、配列番号２７を参照されたい）。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＣＤ４０ＬとＴＮＦの切断不可能な膜結合キメラ型を発現するように遺伝子操作され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、ＴＮＦ分子のリガンド結合部分は、ＴＮＦが定義されたＴＮＦアルファ切断酵素（ＴＡＣＥ）部位を欠くように、ＣＤ４０Ｌの膜貫通ドメイン及び近位細胞外ドメインと融合され得る。いくつかの実施形態によれば、細胞内、膜貫通、及び部分的な細胞外部分のＣＤ４０Ｌは、ＴＡＣＥ切断部位の遠位にあるＴＮＦの細胞外領域と融合され得る。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ４０Ｌ／ＴＮＦのキメラ型は、配列番号９のＣＤ４０Ｌ配列と配列番号１０のＴＮＦ配列を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ４０Ｌ／ＴＮＦ配列は、長さが１～３０アミノ酸の間の連結ペプチドを介して作動可能に連結されている。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号９と配列番号１０のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号９と配列番号１０のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号９と配列番号１０のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号９と配列番号１０のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号９と配列番号１０のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号９と配列番号１０のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号９と配列番号１０のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号９と配列番号１０のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号９と配列番号１０のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１１のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するＴＮＦの切断不可能な膜結合型を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１１のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するＴＮＦの切断不可能な膜結合型を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１１のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＴＮＦの切断不可能な膜結合型を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１１のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＴＮＦの切断不可能な膜結合型を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１１のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＴＮＦの切断不可能な膜結合型を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１１のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有するＴＮＦの切断不可能な膜結合型を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１１のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するＴＮＦの切断不可能な膜結合型を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１１のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するＴＮＦの切断不可能な膜結合型を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１１のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するＴＮＦの切断不可能な膜結合型を発現するように遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＣＤ４０ＬとＴＮＦの切断不可能な膜結合キメラ型を発現するように遺伝子操作され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、ＴＮＦ分子のリガンド部分は、ＣＤ４０Ｌの細胞外部分と融合され得、ＣＤ４０Ｌは、切断不可能な細胞外部分を含み、ＴＮＦは、定義されたＴＡＣＥ部位（例えば、アミノ酸７６位と７７位の間の切断部）を欠く。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ４０Ｌペプチド配列のいくつかまたはすべては、ＴＡＣＥ切断部位の遠位にあるＴＮＦペプチド配列の細胞外領域と融合している。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ４０Ｌ／ＴＮＦのキメラ型は、配列番号３１の配列を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号３１のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号３１のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号３１のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号３１のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号３１のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号３１のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号３１のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号３１のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号３１のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する融合タンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
分泌受容体
いくつかの実施形態によれば、本開示は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、１つ以上の分泌受容体を含むＲ免疫調節因子のサブセットを含む、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団を包含する。いくつかの実施形態によれば、Ｒ免疫調節因子は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）の分泌受容体タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片を含み得る。いくつかの実施形態によれば、分泌受容体は、ＩＬ１０Ｒ、ＴＧＦβＲ３、またはその両方である。
インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）は、さまざまな白血球及び非造血細胞によって産生される重要な免疫抑制性サイトカインである。Ｓｈｏｕｖａｌ，ＤＳ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ （２０１４） ４０： ７０６－７１９。ＩＬ－１０は、細胞表面から発せられるＩＬ－１０受容体（ＩＬ－１０Ｒ）依存性シグナルを介してその抗炎症効果を仲介する。ＩＬ－１０Ｒは、ＩＬ－１０Ｒαの２つのサブユニットとＩＬ－１０Ｒβの２つのサブユニットで構成されるヘテロテトラマーである（Ｍｏｏｒｅ，ＫＷ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００１） １９： ６８３－７６５を引用する、同上）。ＩＬ－１０ＲαサブユニットはＩＬ－１０シグナル伝達に固有であるが、ＩＬ－１０ＲβサブユニットはＩＬ－２２、ＩＬ－２６、インターフェロンλなどの他のサイトカイン受容体と共有されている（ 同上）。ＩＬ－１０Ｒを介したＩＬ－１０下流シグナル伝達は、ＮＦ－κＢ依存性シグナルを遮断することにより炎症促進性サイトカインの誘導を阻害する（Ｓａｒａｉｖａ，Ｍ．，ａｎｄ Ｏ’Ｇａｒｒａ，Ａ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１０） １０： １８０－１８１を引用する、同上）。
形質転換増殖因子－β受容体３（ＴβＲＩＩＩまたはＴβＲ３）は、短い４１アミノ酸の細胞質ドメインを含む８５３アミノ酸の膜貫通型プロテオグリカンである。それは、ほぼすべての細胞型で遍在的に発現している。ＴβＲＩＩＩの発現レベルは細胞型に特異的である。これは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーのシグナル伝達経路のメンバーであり、ほとんどのヒト組織における細胞増殖、アポトーシス、分化、及び遊走の媒介に不可欠な役割を果たしている。ＴβＲＩＩＩは、最も豊富に発現するＴＧＦ－βスーパーファミリー受容体であり、ＴＧＦ－βスーパーファミリーメンバーであるＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、またはＴＧＦ－β３、インヒビン、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－７、及びＧＤＦ－５に結合することにより、ＴＧＦ－βスーパーファミリー共受容体として機能し、これらのリガンドをそれぞれのシグナル伝達受容体に提示して、Ｓｍａｄ転写因子へのＴＧＦ－β１、ＢＭＰ、またはアクチビンシグナル伝達を活性化または抑制（インヒビンの場合）する。例えば、ＴＧＦ－β１、２、または３の場合、ＴβＲＩＩＩはＴＧＦ－βＩＩ型受容体（ＴβＲＩＩ）へのリガンドを提示する。リガンドに結合すると、ＴβＲＩＩはＴＧＦ－βＩ型受容体（ＴβＲＩ）を動員してトランスリン酸化し、そのキナーゼ機能を活性化してＳｍａｄ２／３のリン酸化を引き起こす。Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３のリン酸化は、Ｓｍａｄ４との複合体の形成、及び核内でのこの複合体の蓄積をもたらし、コアクチベーター及びコリプレッサーとともに、増殖、血管新生、アポトーシス、及び分化に関与する遺伝子の転写を調節する。受容体を介したＳｍａｄシグナル伝達の調節に加えて、ＴβＲＩＩＩはリガンド依存性及び非依存性のｐ３８経路シグナル伝達も媒介する。ＴβＲＩＩＩは、外部ドメインシェディングを受けて可溶性ＴβＲＩＩＩ（ｓＴβＲＩＩＩ）を生成することもできる。これは、ＴＧＦ－βスーパーファミリーのメンバーに結合して隔離し、それらのシグナル伝達を阻害する。ｓＴβＲＩＩＩの発現はＴβＲＩＩＩの細胞表面の発現と相関することが実証されているが、ｓＴβＲＩＩＩの産生の調節についてはほとんど知られてない。ＴβＲＩＩＩのシェディングは、膜型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ－ＭＭＰ）ＭＴ１－ＭＭＰ及び／またはＭＴ３－ＭＭＰ、ならびにＴβＲＩＩＩの細胞外ドメインを切断することが示されているセリンプロテイナーゼであるプラスミンによって部分的に媒介され得る。さらに、ＴβＲＩＩＩのシェディングは、チロシンホスファターゼ阻害剤であるペルバナデートによって調節される。これを裏付けるために、ＭＴ－ＭＭＰ及びＡＤＡＭプロテアーゼ阻害剤であるＴＡＰＩ－２は、ＴβＲＩＩＩのシェディングを阻害することが示されている。ＴβＲＩＩＩ発現の調節は、ＴＧＦ－βシグナル伝達を変化させるのに十分である。ＴβＲＩＩＩの細胞質ドメインは、ＰＤＺドメイン含有タンパク質である、ＧＡＩＰ相互作用タンパク質Ｃ末端（ＧＩＰＣ）と相互作用する。これは、ＴβＲＩＩＩ細胞表面の発現を安定させ、ＴＧＦ－βシグナル伝達を増加させる。ＴβＲＩＩＩとＧＩＰＣの間の相互作用は、ＴＧＦ－βシグナル伝達、細胞遊走、及び乳癌の進行中の浸潤のＴβＲＩＩＩを介した阻害においても重要な役割を果たす。ＴβＲＩＩＩの細胞質ドメインは、ＴβＲＩＩによってリン酸化され、その結果、ＴβＲＩＩＩが足場タンパク質β－アレスチン２に結合する。ＴβＲＩＩＩ／β－アレスチン２の相互作用により、β－アレスチン２／ＴβＲＩＩＩ／ＴβＲＩＩの共内在化と、ＴＧＦ－βシグナル伝達の下方制御が起こる。ＴβＲＩＩＩとβ－アレスチン２の間の相互作用は、ＢＭＰシグナル伝達とＴＧＦ－ｂｅｔａシグナル伝達を調節する。ＴβＲＩＩＩは、ベータアレスチン２依存的にＢＭＰＩ型受容体であるＡＬＫ６と複合体を形成し、ＡＬＫ６の内在化とＡＬＫ６特異的ＢＭＰシグナル伝達イベントの刺激を仲介する。ＴβＲＩＩＩは、β－アレスチン２との相互作用を通じて、乳癌との関連でＮＦκ－Ｂシグナル伝達を負に調節し、フィブロネクチンへの上皮細胞接着、原線維形成、及びα５β１の内在化と発生している接着斑への輸送の調節を介した接着斑形成を調節し、Ｃｄｃ４２を活性化し、アクチン細胞骨格を変化させ、正常及びがん性の卵巣上皮細胞の遊走を抑制する。発生中、ＴβＲＩＩＩは心臓の房室隆起の形成に重要な役割を果たす。発生中のＴβＲＩＩＩの重要な役割と一致して、ＴＧＦβＲ３ ｎｕｌｌマウスは、心臓と肝臓の欠陥のために胚致死性である。ＴＧＦβＲ３は最近、乳癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌など、複数の種類のヒトのがんの腫瘍抑制因子として同定された。これらのがんの種類におけるＴＧＦβＲ３の喪失は、疾患の進行と相関しており、インビトロでの運動性と浸潤の増加、及びインビボでの浸潤と転移の増加をもたらす（ｈｔｔｐ：／／ａｔｌａｓｇｅｎｅｔｉｃｓｏｎｃｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／Ｇｅｎｅｓ／ＴＧＦＢＲ３ＩＤ４２５４１ｃｈ１ｐ３３．ｈｔｍｌ、２０１９年８月２６日訪問）。
シャペロン
いくつかの実施形態によれば、本開示は、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現する腫瘍細胞の集団を含み、腫瘍細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上を刺激するよう遺伝子操作され、その集団は、１つ以上のシャペロンタンパク質を含むＲ免疫調節因子のサブセットを含む、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団を包含する。いくつかの実施形態によれば、本開示は、シャペロンタンパク質の全長、断片、相同体、バリアント、または変異体を含むシャペロンタンパク質を包含する。
シャペロンは、生理学的及びストレス条件下で細胞内のタンパク質のフォールディングを支援する、機能的に関連するタンパク質の群である。いくつかの実施形態によれば、シャペロンタンパク質は、ＧＲＰ７８／ＢｉＰ、ＧＲＰ９４、ＧＲＰ１７０、カルネキシン、カルレティキュリン、ＨＳＰ４７、ＥＲｐ２９、プロテインジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、ペプチジルプロリルシス－トランス－イソメラーゼ（ＰＰＩ）、Ｅｒｐ５７、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００のうちの１つ以上から選択される。
いくつかの実施形態によれば、シャペロンタンパク質は膜結合型である。
いくつかの実施形態によれば、１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現するＥＮＬＳＴ（商標）細胞の集団は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）のシャペロンタンパク質、またはそのバリアントまたは断片を含むように遺伝子操作され得る。
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）
いくつかの実施形態によれば、Ｒ免疫調節因子のサブセットは、１つ以上のＩｇＳＦタンパク質を含み得る。したがって、本開示は、ＩｇＳＦスーパーファミリーメンバーの全長、断片、相同体、バリアント、または変異体を含むＩｇＳＦスーパーファミリーのメンバーを包含する。
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、細胞の接着、結合、及び認識プロセスに関連するタンパク質のクラスである。分子は、免疫グロブリンとの共通の構造的特徴に基づいて、このスーパーファミリーのメンバーとして分類される。それらはすべて免疫グロブリンドメインまたはフォールドとして知られるドメインを持っている。ＩｇＳＦのメンバーには、細胞表面抗原受容体、免疫系の共受容体及び共刺激分子、リンパ球への抗原提示に関与する分子、細胞接着分子、特定のサイトカイン受容体及び細胞内筋タンパク質が含まれる。ＩｇＳＦのメンバーは、次のように分類できる。抗原受容体（例えば、抗体または免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）；抗原提示分子（例えば、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ）；共受容体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８）；共刺激分子または抑制性分子（例えば、ＣＤ２８、Ｃｄ８０、ＣＤ８６）；ナチュラルキラー細胞上の受容体（例えば、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ））；白血球上の受容体（例えば、白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＬＲ））；ＩＧＳＦ ＣＡＭ（例えば、ＮＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１）；サイトカイン受容体；増殖因子受容体；受容体型チロシンキナーゼ／ホスファターゼ；ＩｇＧ結合受容体。
いくつかの実施形態によれば、ＩｇＳＦファミリーメンバーは膜結合型である。
ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ／ＣＤ１５５）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通型糖タンパク質である。ＰＶＲ／ＣＤ１５５は、ＮＫ細胞の接着を仲介し、ＮＫ細胞のエフェクター機能を誘起する。ＰＶＲ／ＣＤ１５５は、ＣＤ９６とＣＤ２２６の２つの異なるＮＫ細胞受容体に結合する。これらの相互作用は細胞間接触部位に蓄積し、ＮＫ細胞と標的細胞の間の成熟した免疫シナプスの形成をもたらす。これは、接着、ならびに溶解性顆粒及びＩＦＮ－γ（ＩＦＮγ）の分泌を引き起こし、活性化ＮＫ細胞の細胞傷害性を活性化し、ＮＫ細胞－標的細胞のモジュラー交換及びＮＫ細胞へのＰＶＲ転移を促進し得る。
ネクチン－２としても知られるポリオウイルス受容体関連２（ＰＶＲＬ２）は、２つのＩｇ様Ｃ２型ドメインとＩｇ様Ｖ型ドメインを持つシングルパスＩ型膜糖タンパク質である。このタンパク質は、接着結合の原形質膜成分の１つである。
ＣＤ４８抗原（表面抗原分類４８）は、Ｂリンパ球活性化マーカー（ＢＬＡＳＴ－１）またはシグナル伝達リンパ球活性化分子２（ＳＬＡＭＦ２）とも呼ばれ、ヒトではＣＤ４８遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＣＤ４８は、ＩｇＳＦのＣＤ２サブファミリーのメンバーであり、ＣＤ８４、ＣＤ１５０、ＣＤ２２９、及びＣＤ２４４などのＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）タンパク質が含まれている。ＣＤ４８は、リンパ球及びその他の免疫細胞、樹状細胞、内皮細胞の表面に見られ、これらの細胞の活性化経路及び分化経路に関与している。
ＮＫ－Ｔ－Ｂ抗原（ＮＴＢＡ）は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞に発現する表面分子である。ヒトＮＫ細胞では、ＮＴＢＡは、ナチュラル細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）の高い表面密度を発現する細胞でのみ細胞溶解活性を引き起こし得るため、主に共受容体として作用することが示されている。分子クローニングにより、ＮＴＢＡはＣＤ２ファミリーへの割り当てを可能にする構造的特徴を特徴とするＩｇスーパーファミリーのメンバーであることが明らかになった。
いくつかの実施形態によれば、ＩｇＳＦタンパク質はＩｇＧである。いくつかの実施形態によれば、ＩｇＳＦタンパク質はＰＶＲ／ＣＤ１５５である。いくつかの実施形態によれば、ＩｇＳＦタンパク質はＣＤ４８である。いくつかの実施形態によれば、ＩｇＳＦタンパク質はＮｅｃｔｉｎ２である。いくつかの実施形態によれば、ＩｇＳＦタンパク質はＮＫ－Ｔ－Ｂ抗原である。
免疫グロブリン（Ｉｇ）は、免疫細胞によって産生される糖タンパク質である。抗体は血清タンパク質であり、その分子は、それらの標的上の小さな化学的集団に相補的なそれらのそれらの表面の小さな領域を持っている。これらの相補的領域（相補的決定領域（ＣＤＲ）、または抗体結合部位、または抗原結合部位と呼ばれる）は、抗体分子ごとに少なくとも２つあり、一部のタイプの抗体分子では１０、８、または一部の種では１２もの多くが、抗原上の対応する相補性領域（抗原決定基またはエピトープ）と反応して、多価抗原のいくつかの分子を一緒に結合して格子を形成し得る。免疫グロブリンは、細菌やウイルスによって示される抗原などの特定の抗原に結合することにより、免疫応答において重要な役割を果たす。いくつかの実施形態によれば、免疫グロブリンの抗原への結合は、それらを、対象の免疫細胞による破壊の標的となし得る。
抗体分子全体の基本的な構造単位は、４つのポリペプチド鎖、２つの同一の軽（Ｌ）鎖（それぞれ約２２０アミノ酸を含む）及び２つの同一の重（Ｈ）鎖（それぞれ約４４０アミノ酸を含む）で構成される。２本の重鎖と２本の軽鎖は、非共有結合と共有（ジスルフィド）結合の組み合わせによって一緒に結合されている。分子は２つの同一の半分で構成され、それぞれが軽鎖のＮ末端領域と重鎖のＮ末端領域で構成される同一の抗原結合部位を持っている。通常、軽鎖と重鎖の両方が協力して抗原結合表面を形成する。
哺乳動物には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つのクラスの抗体があり、それぞれ独自のクラスの重鎖がある－α（ＩｇＡの場合）、δ（ＩｇＤの場合）、ε（ＩｇＥの場合）、γ（ＩｇＧの場合）、及びμ（ＩｇＭの場合）。さらに、ＩｇＧ免疫グロブリンには４つのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）があり、それぞれγ１、γ２、γ３、及びγ４重鎖を持っている。分泌型のＩｇＭは、５つの４鎖ユニットで構成される五量体であり、合計１０の抗原結合部位を提供する。それぞれの五量体には、２つの隣接するテール領域の間に共有結合で挿入されたＪ鎖のコピーが１つ含まれている。
末梢血リンパ球からの免疫グロブリン重（ＶＨ）鎖可変遺伝子ならびに軽（Ｖκ及びＶλ）鎖可変遺伝子の多様なライブラリーも、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって増幅することができる。重鎖と軽鎖の可変ドメインがポリペプチドスペーサーによって連結されている単一のポリペプチド鎖をコードする遺伝子は、ＰＣＲを使用して重鎖と軽鎖のＶ遺伝子をランダムに組み合わせることによって作製することができる。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を発現するように操作され得る。自然界では、Ｉｇガンマ－１（ＩｇＧ－１）鎖Ｃ領域は、ヒトのＩＧＨＧ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号１のＩｇＧ－１鎖Ｃタンパク質の膜結合型を発現し得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号２のＩｇＧ－１鎖Ｃの分泌型を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号３のＩｇＧ－１鎖Ｃの分泌型を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１、配列番号２、及び配列番号３を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、及び配列番号４６を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、及び配列番号４６を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、及び配列番号４６を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、及び配列番号４６を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、及び配列番号４６を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、及び配列番号４６を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、及び配列番号４６を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、及び配列番号４６を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸配列配列番号１２、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４５、及び配列番号４６を有する１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、腫瘍細胞特異的抗原に結合することができるＩｇＧタンパク質を発現するように操作され得る。例えば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、前立腺癌特異的抗原、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の細胞外領域に結合できるＩｇＧタンパク質を発現するように操作することができる（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．，Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｒｏｓｔａｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６ Ｓｕｐｐｌ． １０，Ｓ１３ （２００４）を参照されたい）。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、免疫細胞特異的抗原に結合することができるＩｇＧタンパク質を発現するように操作され得る。例えば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、Ｔ細胞マーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８に結合することができるＩｇＧタンパク質を発現するように操作され得る。別の例によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、樹状細胞マーカー、例えば、ＣＤ１１ｃまたはＣＤ１２３に結合することができるＩｇＧタンパク質を発現するように操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＩｇＧ３重鎖定常領域を発現するように操作され得る。自然界では、ＩｇＧ３重鎖定常領域はＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメインを含み、ヒトではＩＧＨＧ３遺伝子によってコードされている。ＩＧＨＧ３遺伝子は、異なるヒンジ長を含む構造多型を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４のＩｇＧ－３重鎖定常領域を発現するように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、アミノ酸１～７６が欠落している配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、アミノ酸１～７６が欠落している配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、アミノ酸７７～９８がアミノ酸ＱＭＱＧＶＮＣＴＶＳＳ（配列番号１０１）と置き換えられた配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、Ｅ２１３Ｑバリアント（配列番号１６）を含む配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、Ｐ２２１Ｌバリアント（配列番号１７）を含む配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、Ｅ２２４Ｑバリアント（配列番号１８）を含む配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、Ｙ２２６Ｆバリアント（配列番号１９）を含む配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、Ｄ２４２Ｎバリアント（配列番号２０）を含む配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、Ｎ２４５Ｄバリアント（配列番号２１）を含む配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、Ｔ２６９Ａバリアント（配列番号２２）を含む配列番号４の誘導体を発現し得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、Ｓ３１４Ｎバリアント（配列番号２３）を含む配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、Ｓ３１４の欠失（配列番号２４）を含む配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、細胞は、Ｆ３６６Ｙバリアント（配列番号２５）を含む配列番号４の誘導体を発現するよう遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、１つ以上のＩｇＧ重鎖可変領域を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ラムダ／カッパ軽鎖定常領域及び／または軽鎖可変領域を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＩｇＧのヒンジ領域は、免疫細胞上のＦｃｙＲ受容体に結合する。いくつかの実施形態によれば、ＩｇＧは、ＦｃｙＲを活性化し、抗原（例えば、前立腺癌細胞に関連するＰＳＡ）の提示を増強するのに効果的である。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、腫瘍細胞の細胞表面上に無傷のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態によれば、無傷のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、免疫原性応答を誘発する分子を送達するように操作され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、無傷なモノクローナル抗体は、ＤＮＡに結合して、ＣｐＧモチーフを免疫細胞に送達するように操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、細菌ＤＮＡの免疫刺激活性は、非メチル化ＣｐＧモチーフを免疫細胞に送達するように免疫調節因子を操作することによって模倣することができる。例えば、いくつかの実施形態によれば、ＩｇＧは、ビオチンに結合し、次いで、ビオチン化されたＣｐＧを免疫系の細胞に送達することができるように操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧモチーフは、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞の腫瘍細胞の表面に直接的または間接的に結合し得る。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧモチーフは、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントからの腫瘍細胞の表面に提示される１つ以上の抗原にコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧはクラスＡ ＣｐＧである。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧはクラスＢ ＣｐＧである。いくつかの実施形態によれば、ＣｐＧはクラスＣ ＣｐＧである。いくつかの実施形態によれば、配列５’ＥＥＡＡＣＣＧＴＡＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＣＧＧＴＴＥＥＥＥＥＧ３’（配列番号１０２）の３０－ｍｅｒのＣｐＧである。ＣｐＧモチーフに関して本明細書で使用される場合、「Ｅ」はＧ－ホスホロチオエートであり、この結合はヌクレオチドの３‘末端を指す（すなわち、ホスホロチオエート結合は、ヌクレオチド骨格の非架橋酸素を硫黄原子に置き換える）。いくつかの実施形態によれば、配列５’－ビオチン－ＥＥＡＡＣＣＧＴＡＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＣＧＧＴＴＥＥＥＥＥＧ－３’（配列番号１０２）のビオチン化された３０－ｍｅｒである。いくつかの実施形態によれば、配列５’ＥＥＡＡＣＣＧＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＡＴＣＧＧＴＴＥＥＥＥＥＧ３’（配列番号１０３）の３０－ｍｅｒのＣｐＧである。いくつかの実施形態によれば、配列５’－ビオチン－ＥＥＡＡＣＣＧＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＡＴＣＧＧＴＴＥＥＥＥＥＧ－３’（配列番号１０３）の３０－ｍｅｒのビオチン化されたＣｐＧである。
いくつかの実施形態によれば、ＩｇＧは、１つ以上のＩｇＧサブクラスのハイブリッドとして操作され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３からの配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ＩｇＧは、ビオチンに対して親和性を有するように操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４５のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４５のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４５のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４５のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４５のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４５のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４５のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４５のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４５のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
いくつかの実施形態によれば、ＩｇＧは、ＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃｙＲ）への親和性を増強する、野生型ＩｇＧと比較した１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、変異Ｔ３２３Ａ及びＥ３２５Ａのうちの１つ以上を有する配列番号４５の１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４１、配列番号３０、及び配列番号４３のうちの１つ以上のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４１、配列番号３０、及び配列番号４３のうちの１つ以上のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４１、配列番号３０、及び配列番号４３のうちの１つ以上のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４１、配列番号３０、及び配列番号４３のうちの１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４１、配列番号３０、及び配列番号４３のうちの１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４１、配列番号３０、及び配列番号４３のうちの１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４１、配列番号３０、及び配列番号４３のうちの１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４１、配列番号３０、及び配列番号４３のうちの１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、配列番号４１、配列番号３０、及び配列番号４３のうちの１つ以上のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含むように遺伝子操作され得る。
ケモカイン受容体
いくつかの実施形態によれば、Ｒメンバーのサブセットは、１つ以上のケモカイン受容体を含み得る。ケモカイン受容体は、ケモカインの結合時に細胞応答を活性化する調節因子として定義されている。ヒトケモカイン受容体の２３のサブタイプが同定されており、そのすべてが受容体の７回膜貫通（７ＴＭ）ドメインスーパーファミリーのメンバーである。それらは２つの主要なグループに分けることができる：Ｇタンパク質共役型走化性ケモカイン受容体（ｎ＝１９）と非定型ケモカイン受容体（ｎ＝４）。両方の群の受容体のケモカイン結合、膜固定、及びシグナル伝達ドメインは、単一のポリペプチド鎖に由来する。これらの受容体がホモダイマーとヘテロダイマーを形成するという構造的及び生化学的証拠が存在する。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、ケモカイン受容体の全長、断片、相同体、バリアント、または変異体を含むケモカイン受容体を包含する。サイトカインには、別の細胞の生物学的機能に影響を及ぼすのに効果的であるタンパク質が含まれる。サイトカインによって影響を受ける生物学的機能としては、細胞増殖、細胞分化、または細胞死が挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、本開示のケモカイン受容体は、免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球）を刺激することができる。
いくつかの実施形態によれば、ケモカイン受容体は、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ８、ＣＣＲ８、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、及びＣＸＣＲ３から選択される。いくつかの実施形態によれば、ケモカイン受容体は膜結合型である。
いくつかの実施形態によれば、３つ以上の別個の生物学的製剤は、可溶性または膜結合型のいずれかで、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントによって発現される。いくつかの実施形態によれば、可溶性及び膜結合型の発現と活性は、インビトロで、それぞれフローサイトメトリーと混合リンパ球腫瘍アッセイによって確認することができる。いくつかの実施形態によれば、可溶性及び膜結合型の発現と活性は、インビトロで、フローサイトメトリーと混合リンパ球腫瘍アッセイによって確認される。
いくつかの態様によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントをトランスフェクトまたは形質導入するための遺伝物質は、１つ以上の免疫調節分子を腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントに安定に導入するのに有効である。いくつかの実施形態によれば、遺伝物質は、ウイルス形質導入技術によって導入され得、そして遺伝的に導入された免疫調節因子のポジティブ選択によって単離され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、遺伝的に導入された免疫調節因子分子のポジティブ選択は、抗体を使用する選択を含む。
ＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）
Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体のライゲーションは、ナイーブＴ細胞活性化のためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ライゲーションと並んで重要な２番目のシグナルを提供する。Ｅｓｅｎｓｔｅｉｎ，ＪＨ ｅｔ ａｌ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ （２０１６） ４４（５）： ９７３－９８８）。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の長期的な拡大と分化に不可欠な、独特のリン酸化と転写シグナル伝達、代謝、主要なサイトカイン、ケモカイン、生存シグナルの産生を含む、重要な細胞内生化学的イベントを促進する（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，ＪＡ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． （２００６）２４： ２３３－２３８を引用する、同上；Ｂｏｕｒ－Ｊｏｒｄａｎ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ． （２０１１） ２４１：１８０－２０５；Ｍａｒｔｉｎ，ＰＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９８６） １３６： ３２８２－３２８７；Ｗｅｉｓｓ，Ａ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９８６） １３７：８１９－８２５）。
ＣＤ２８は、細胞外可変免疫グロブリン様ドメインを特徴とする共刺激分子のサブファミリーの初期のメンバーである。サブファミリーの他のメンバーには、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ１Ｈ、及びＢＴＬＡが含まれる（Ｃｈｅｎ，Ｌ． ａｎｄ Ｆｌｉｅｓ，Ｄ．Ｂ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１３；１３：２２７－２４２を引用する、同上）。ＣＤ２８はマウスＴ細胞で構成的に発現するが、他のファミリーメンバーであるＩＣＯＳ及びＣＴＬＡ４の発現は、Ｔ細胞受容体刺激及びインターロイキン２（ＩＬ－２）などのサイトカインに応答して誘導される。ＣＤ２８は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の約８０％及びＣＤ８＋Ｔ細胞の５０％に発現している。ヒトにおけるＣＤ２８陽性Ｔ細胞の割合は年齢とともに低下する。ＣＤ２８の発現は、骨髄間質細胞、形質細胞、好中球、好酸球を含む他の細胞系統で確認されているが、これらの細胞でのＣＤ２８の機能的重要性は完全には理解されていない（Ｇｒａｙ Ｐａｒｋｉｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００２） １６９：２２９２－２３０２を引用する、同上；Ｒｏｚａｎｓｋｉ，ＣＨ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． （２０１１） ２０８：１４３５－１４４６；Ｖｅｎｕｐｒａｓａｄ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００１） ３１：１５３６－１５４３；Ｗｏｅｒｌｙ，Ｇ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ａｌｌｅｒｇｙ． （２００４） ３４：１３７９－１３８７）。
ＣＤ２８リガンドＣＤ８０とＣＤ８６は、発現パターン、多量体状態、及び機能性が異なり、ＣＤ２８シグナル伝達の調節にさらに複雑な別の層を追加する。ＣＤ８０は主に細胞表面に二量体の形で存在するが、ＣＤ８６は単量体である（Ｂｈａｔｉａ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． （２００５） １０２：１５５６９－１５５７４２００５を引用する、同上）。ＣＤ８６は抗原提示細胞（ＡＰＣ）で構成的に発現し、ＡＰＣの自然免疫の刺激によって急速に上方制御される（Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，ＤＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９４） １５３：１９９０－１９９７を引用する、同上）が、他のＣＤ２８リガンドであるＣＤ８０は、後の時点で上方制御される（Ｓｈａｒｐｅ，ＡＪ ａｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ，ＧＪ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００２） ２：１１６－１２６を引用する、同上）。したがって、ＣＤ８６は免疫応答の開始においてより重要であり得る。ＣＤ８０とＣＤ８６は、異なる細胞型の異なる刺激によって誘導され、機能的に互換的ではない。
ＣＤ２８とＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞刺激に対して反対の効果がある。ＣＤ２８は活性化シグナルを提供し、ＣＴＬＡ４は阻害シグナルを提供する。これは現在、典型的な免疫チェックポイントとみなされている（Ｋｒｕｍｍｅｌ，ＭＦ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，ＪＰ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９９５；１８２：４５９－４６５を引用する、同上；Ｗａｌｕｎａｓ，ＴＬ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． （１９９４） １：４０５－４１３）。活性化にも寄与するＩＣＯＳは、そのリガンドＢ７Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）に結合する。これは、ヒトＣＤ２８及びＣＴＬＡ４のリガンドとしても機能する（Ｃｈｅｎ，Ｌ． ａｎｄ Ｆｌｉｅｓ，ＤＢ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１３） １３：２２７－２４２を引用する、同上；Ｙａｏ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ （２０１１） ３４：７２９－７４０）。したがって、この受容体とリガンドのファミリーは、結合パターンと生物学的効果の両方においてかなり複雑である。全体として、ＣＴＬＡ４と比較したＣＤ２８とＩＣＯＳの反対の役割により、この受容体とリガンドのファミリーは、競合する炎症促進性と抗炎症性の効果を通じて免疫応答の加減抵抗器として機能することができる（同上）。
ＣＴＬＡ４ＩｇとのライゲーションがＡＰＣのトリプトファン代謝を調節することが示されているため、ＣＤ８０及びＣＤ８６はそれ自体がシグナル伝達受容体としても機能し得ることが示唆されている（Ｇｒｏｈｍａｎｎ，Ｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００２） ３：１０９７－１１０１を引用する、同上）。Ｔ細胞に加えて、形質細胞もＣＤ２８を発現する。ＣＤ２８シグナルは、形質細胞による抗体産生または形質細胞の生存を調節し得るが、形質細胞生物学においてＣＤ２８が果たす正確な役割はまだ不明である（Ｎｊａｕ，ＮＭ ａｎｄ Ｊａｃｏｂ，Ｊ．，Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ． （２０１３） ７８５：６７－７５）を引用する、同上）。
ＣＤ２８遺伝子は、細胞表面に４４ｋＤａのグリコシル化ジスルフィド結合ホモ二量体として発現する２２０アミノ酸のタンパク質をコードする４つのエクソンで構成されている。ＣＤ２８ファミリーのメンバーは、多くの共通の機能を共有している。これらの受容体は、単一の膜貫通ドメインに結合した対のＶセット免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）ドメインと、重要なシグナル伝達モチーフを含む細胞質ドメインで構成されている（Ｃａｒｒｅｎｏ，ＢＭ ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００２） ２０： ２９－５３を引用する、同上）。ＣＤ２８とＣＴＬＡ４のリガンドであるＣＤ８０及びＣＤ８６は、単一のＶセット及びＣ１セットのＩｇＳＦドメインで構成されている。これらの共刺激受容体とリガンドとの相互作用は、受容体Ｖセットドメイン内のＭＹＰＰＰＹモチーフ（配列番号１０５）を介して媒介される（Ｅｖａｎｓ，ＥＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００５） ６：２７１－２７９；Ｍｅｔｚｌｅｒ，ＷＪ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． （１９９７） ４： ５２７－５３１を引用する、同上）。
そのリガンドによるＣＤ２８の結合は、ＣＤ２８の細胞質尾部とのタンパク質の特異的な結合に依存するシグナル伝達イベントを開始する。固有の酵素活性がないにもかかわらず、ヒトＣＤ２８の４１アミノ酸の細胞質尾部には、ＴＣＲまたはＣＤ２８刺激に応答してリン酸化され、ホスホチロシン依存的にＳＨ２ドメインと標的を結合する高度に保存されたチロシンベースのシグナル伝達モチーフが含まれている。細胞質尾部内のプロリンリッチ配列もＳＨ３ドメイン含有タンパク質に結合する。特に、膜近位ＹＭＮＭモチーフ（配列番号１０６）及び遠位ＰＹＡＰモチーフ（配列番号１０７）は、いくつかのキナーゼ及びアダプタータンパク質と複合体を形成し、一部のタンパク質はＳＨ２及び／またはＳＨ３ドメイン相互作用を介していずれかまたは両方のモチーフに結合できることが示されている（Ｂｏｏｍｅｒ，ＪＳ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，ＪＭ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ． （２０１０） ２： ａ００２４３６を引用する、同上）。これらのモチーフは、ＮＦＡＴ、ＡＰ－１、及びＮＦ－κＢファミリー転写因子のＣＤ２８依存性活性化によって媒介されるＩＬ－２遺伝子発現にとって重要である（Ｆｒａｓｅｒ，ＪＤ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ． （１９９１） ２５１：３１３－３１６を引用する、同上；Ｊｕｎｅ，ＣＨ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． （１９８７） ７： ４４７２－４４８１；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＣＢ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． （１９８９） ８６：１３３３－１３３７）。
膜近位ＹＸＸＭモチーフは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、及びＩＣＯＳ間で共有され、脂質キナーゼホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）のｐ８５サブユニットのコンセンサス部位である（Ａｕｇｕｓｔ，Ａ． ａｎｄ Ｄｕｐｏｎｔ，Ｂ． Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９４） ６：７６９－７７４を引用する、同上；Ｐａｇｅｓ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ． （１９９４） ３６９： ３２７－３２９；Ｐｒａｓａｄ，ＫＶ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． （１９９４） ９１： ２８３４－２８３８；Ｒｕｄｄ，ＣＥ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００３） ３： ５４４－５５６）。ＰＩ３Ｋ特異性を付与する、ＣＤ２８配列の＋３メチオニンであるＹＭＮＭ（配列番号１０６）に加えて、＋２アスパラギンは、ＣＤ２８上のアダプタータンパク質ＧＲＢ２及びＧＡＤＳに特異性を付与する（Ｃａｉ，ＹＣ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． （１９９５） ３： ４１７－４２６を引用する、同上；Ｋｉｍ，ＨＨ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． （１９９８） ２７３： ２９６－３０１；Ｏｋｋｅｎｈａｕｇ，Ｋ． ａｎｄ Ｒｏｔｔａｐｅｌ，Ｒ．，１９９８；Ｏｋｋｅｎｈａｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． （１９９８） ２７３： ２１１９４－２１２０２；Ｒａａｂ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． （１９９５） ９２： ８８９１－８８９５；Ｓｔｅｉｎ，ＰＨ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． （１９９４） １４： ３３９２－３４０２）。ＩＣＯＳとＣＴＬＡ４はどちらもＰＩ３Ｋに結合できるが、ＧＲＢ２に結合する能力がない。これは、これらの共刺激受容体間の機能的及びシグナル伝達の違いの一部を説明し得る（Ｒｕｄｄ，ＣＥ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００３） ３： ５４４－５５６を引用する、同上）。増殖とＩＬ－２分泌の媒介におけるＹＭＮＭモチーフ（配列番号１０６）の重要性については議論の余地がある。Ｃ末端ＰＹＡＰモチーフ（配列番号１０７）の下流のシグナル伝達イベントには、キナーゼＰＤＫ１とＰＫＣθのリン酸化と活性化が含まれると考えられている。その後のＧＳＫ３βの不活性化により、最終的にはＩＬ－２を含むＮＦＡＴ依存性遺伝子の転写が増強される。ＳＨ３を介したＳｒｃキナーゼＬｃｋの結合と活性化（Ｈｏｌｄｏｒｆ，ＡＤ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． （１９９９） １９０： ３７５－３８４；Ｋｉｎｇ，ＰＤ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （１９９７） １５８： ５８０－５９０を引用する、同上）は、この経路の潜在的な調節因子として提案されている。アダプタータンパク質であるＧＲＢ２及びＧＡＤＳは、それらの遠位ＰＹＡＰモチーフのＳＨ３ドメイン（配列番号１０７）を介して、または膜それらの近位ＹＭＮＭモチーフ（配列番号１０６）のＳＨ２ドメインを介してＣＤ２８に結合できる。しかしながら、ＮＦ－κＢの活性化に大きな役割を果たすと考えられているのはＣ末端のＰＹＡＰモチーフ（配列番号１０７）であり、上述のように、ＮＦ－κＢの活性化に重要なＬｃｋなどの他のシグナル伝達分子がＣ末端のＰＹＡＰモチーフ（配列番号１０７）に結合することを示唆している（Ｈｏｌｄｏｒｆ，ＡＤ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． （１９９９） １９０： ３７５－３８４を引用する、同上；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００６） １７７：１０８５－１０９１）。
ＣＤ２８ライゲーションは、従来のＴ細胞の増殖とエフェクター機能を促進する上で重要であるが、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の抗炎症機能も促進する。したがって、ＣＤ２８は、細胞の種類とそれが発現する状況に応じて、炎症促進性と抗炎症性の両方の役割を果たす。ＣＤ２８シグナルは、エフェクターＴ細胞がＴｒｅｇ細胞を介した免疫抑制を克服できるようにするために重要である（Ｌｙｄｄａｎｅ，Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２００６） １７６： ３３０６－３３１０を引用する、同上）が、別の状況でのＣＤ２８は、Ｔｒｅｇ機能を促進することにより自発的な自己免疫を防ぐ（Ｓａｌｏｍｏｎ Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２０００；１２：４３１－４４０を引用する、同上）。
ＣＤ２８は、Ｔ細胞の恒常性をサポートし、さまざまな方法で機能する。ＣＤ２８シグナルは、Ｔｒｅｇ細胞による最大のＩＬ－１０産生に重要なｍｉＲ１７－９２ファミリーメンバーの発現をサポートする（ｄｅ Ｋｏｕｃｈｋｏｖｓｋｙ，Ｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１３） １９１： １５９４－１６０５）。胸腺細胞は、Ｆｏｘｐ３を上方制御し、Ｔｒｅｇ細胞に分化するために、ＴＣＲとＣＤ２８の同時のシグナルを必要とする。ＣＤ２８は、末梢で誘導されるＴｒｅｇ細胞の産生にも必要である。ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞は、ＴＧＦ－βで活性化されたときに機能的なＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞に分化するためにＣＤ２８ライゲーションを必要とした。
開示された発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＥＮＬＳＴ（商標）の膜上に配列番号１１０のＣＤ８０の膜結合型を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１０のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１０のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１０のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１０のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１０のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１０のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１０のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１０のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１０のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。
開示された発明のいくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、ＥＮＬＳＴ（商標）の膜上に配列番号１１１のＣＤ８６の膜結合型を発現するように操作され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１１のタンパク質に対して少なくとも６０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１１のタンパク質に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１１のタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１１のタンパク質に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１１のタンパク質に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１１のタンパク質に対して少なくとも９６％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１１のタンパク質に対して少なくとも９７％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１１のタンパク質に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、配列番号１１１のタンパク質に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する１つ以上のタンパク質を含み得る。
（ｃ）ステップ（ｉ）のＭＮＣの集団をステップ（ｉｉ）のＥＮＬＳＴ（商標）細胞とインビトロで接触させて、ＭＮＣの活性化集団を含む免疫応答を誘導すること（インビトロ免疫活性化）。
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団とＭＮＣ集団とを接触させることは、１つ以上のシリアルキラー細胞の亜集団を含むＭＮＣの活性化された集団を含む免疫応答を誘導するのに効果的である。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のシリアルキラー細胞亜集団には、ＮＫ細胞亜集団、ＮＫＴ亜集団、ＣＩＫ亜集団、ＧＤＴ亜集団、ＭＡＩＴ細胞亜集団、ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞集団、またはＣＤ４＋ＣＴＬ細胞亜集団のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、活性化されたシリアルキラー細胞集団は、活性化されたＮＫ細胞集団を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化されたシリアルキラー細胞集団は、活性化されたＮＫＴ集団を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化されたシリアルキラー細胞集団は、活性化されたＮＫ細胞集団を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化されたシリアルキラー細胞集団は、活性化されたＣＩＫ集団を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化されたシリアルキラー細胞集団は、活性化されたＧＤＴ集団を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化されたシリアルキラー細胞集団は、活性化されたＭＡＩＴ細胞集団を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化されたシリアルキラー細胞集団は、活性化されたＣＤ８＋ＣＴＬ集団を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化されたシリアルキラー細胞集団は、活性化されたＣＤ４＋ＣＴＬ集団を含む。
いくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞亜集団は、細胞傷害性エフェクター様ＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、ＮＫＴ細胞亜集団は、細胞傷害性エフェクターＴeff細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＩＫ細胞集団は、細胞傷害性Ｔeff細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、ＧＤＴ細胞集団は、細胞傷害性エフェクターＴeff細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、ＭＡＩＴ細胞集団は、細胞傷害性Ｔeff細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞亜集団は、細胞傷害性Ｔeff細胞を含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＤ４＋ＣＴＬ細胞亜集団は、細胞傷害性Ｔeff細胞を含む。
いくつかの実施形態によれば、ＭＮＣ集団に関連して、「刺激する」という用語は、活性化されたＭＮＣ集団の拡大、活性化されたＭＮＣ集団の１つ以上の亜集団の活性化、または活性化されたＭＮＣ集団の１つ以上の亜集団の細胞傷害性活性の増加のうちの１つ以上を指す。いくつかの実施形態によれば、「シリアルキラー細胞を刺激すること」は、活性化されたＭＮＣ集団の１つ以上の亜集団の拡大、活性化、及び／または増加した細胞傷害性活性の組み合わせを指す。いくつかの実施形態によれば、活性化されたＭＮＣは、１つ以上の活性化されたシリアルキラー細胞集団（複数可）を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化されたシリアルキラー細胞集団（複数可）は、活性化されたＮＫ細胞集団、活性化されたＮＫＴ集団、活性化されたＣＩＫ集団；活性化されたＧＤＴ集団；活性化されたＭＡＩＴ細胞集団；活性化されたＣＤ８＋ＣＴＬ集団；及び活性化されたＣＤ４＋ＣＴＬ集団のうちの１つ以上を含み得る。
シリアルキラー細胞集団（複数可）
シリアルキラー細胞集団（複数可）の誘導及び活性化
いくつかの実施形態によれば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞の集団は、混合リンパ球腫瘍細胞反応（ＭＬＴＲ）においてＭＮＣの集団の亜集団を活性化するのに有効である。ＭＮＣ集団を活性化するための例示的な方法は、ＭＮＣ集団をインキュベートすることと、ＭＮＣの集団をＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団とインビトロで数日間接触させて、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞が混合リンパ球から免疫応答を誘発できるようにすることと、を含む。いくつかの実施形態によれば、同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞に対する免疫応答は、ＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントに固有のペプチドと患者の腫瘍細胞に固有のペプチドとの間のヘテロクリティック交差反応を含む。いくつかの実施形態によれば、ヘテロクリティック交差反応は、通常は非免疫原性表面を提供する腫瘍細胞ペプチド－ＭＨＣ複合体とのＴ細胞受容体の増強された結合を介して免疫原性を増強する。
混合リンパ球腫瘍細胞の反応性
いくつかの実施形態によれば、遺伝子操作された免疫調節因子は、混合リンパ球腫瘍細胞反応（ＭＬＴＲ）によってそれらの免疫原性の可能性について評価され得る。ＭＬＴＲアッセイは、混合リンパ球を腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアント（または対照）と数日間インキュベートして、インビトロでＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団（複数可）の腫瘍細胞が混合リンパ球から免疫応答を誘発できるようにすることを含む。この方法は、腫瘍細胞または溶解物に対する混合リンパ球応答（リンパ球の細胞増殖、リンパ球の細胞サブセット分化、リンパ球のサイトカイン放出プロファイル、及び腫瘍細胞死など）を評価するための迅速なインビトロ法である。このアプローチにより、ヒト末梢血単核球を使用して、表現型が改変されたトランスフェクト腫瘍細胞に対する細胞性、体液性、またはその両方の免疫応答の包括的なモニタリングを可能にできる。ＭＬＴＲはまた、マウス腫瘍生存研究の代替手段を提供することができ、抗腫瘍応答のための最適な腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントの選択をもたらすことができる。同様のアッセイが Ｈｕｎｔｅｒ ＴＢ ｅｔ ａｌ．，（２００７） Ｓｃａｎｄａｎａｖｉａｎ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６５，４７９－４８６，によって記述され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントのＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、トランスフェクトされた腫瘍細胞をＭＮＣからの混合リンパ球、例えば末梢血単核球と接触させ、続いて細胞増殖、細胞サブセットの分化、サイトカイン放出プロファイル、及び腫瘍細胞溶解物を測定することによって免疫原性の可能性について試験され得る。
いくつかの実施形態によれば、混合リンパ球集団を含むＭＮＣは、遺伝子操作されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞と最大２８日間共培養することができる。
ＭＮＣ集団と遺伝子操作されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団の共培養の例示的なプロトコールは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの定義された形状（容積、表面積、及び細胞数）のＴフラスコでＬｏｎｚａのＸ－Ｖｉｖｏ培地＋抗生物質＋グルタマックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、細胞濃度が１億から３億細胞／リットルに達するまで、ＭＮＣをＥＮＬＳＴ（商標）細胞と組み合わせることを含む。いくつかの実施形態によれば、ニコチンアミド５ｍＭが培地に添加され得る。いくつかの実施形態によれば、単核球に対して自家である２．５体積％のヒト血漿が培地に添加され得る。培養物は、３７℃及び５％ＣＯ2で最大２８日間、毎分６傾斜で６°の角度で揺り動かされる。
いくつかの実施形態によれば、遺伝子操作されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞とのＭＮＣ集団の共培養は、１つ以上のシリアルキラー細胞集団を活性化するのに効果的である。いくつかの実施形態によれば、シリアルキラー細胞亜集団には、ＮＫ細胞集団、ＮＫＴ細胞集団、ＣＩＫ細胞集団、ＧＤＴ細胞集団、ＭＡＩＴ細胞集団、ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞集団、またはＣＤ４＋ＣＴＬ細胞集団のうちの１つ以上が含まれる。いくつかの実施形態によれば、遺伝子操作されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞とのＭＮＣ集団の共培養は、１つ以上の抗原提示細胞集団を活性化するのに効果的である。いくつかの実施形態によれば、抗原提示細胞集団は、マクロファージ細胞集団、樹状細胞集団、またはその両方を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化されたシリアルキラー細胞の集団のシリアルキラー活性は、正常細胞に影響を及ぼさず、遺伝子操作されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞のがんのがん抗原に特異的である。いくつかの実施形態によれば、シリアルキラー細胞集団（複数可）のシリアルキラー活性はがん一般化されている、すなわち、シリアルキラー細胞集団は、がんの種類に関係なくがん細胞を殺傷することができるが、正常細胞には影響を及ぼさない。
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞を殺傷するのに有効な活性化されたＭＮＣの亜集団は、例えばフローサイトメトリーによって同定、単離／選別され得、次いでそれぞれの亜集団は拡大されて、シリアルキラー細胞の拡大され、濃縮され、単離された亜集団を形成する。
フローサイトメトリーは、流体のストリームに浮遊している微細な粒子を数え、調べ、選別するための技術である。これにより、光学的及び／または電子的検出装置を流れる単一細胞の物理的及び／または化学的特性の同時マルチパラメトリック分析が可能になる。
フローサイトメトリーは、流体力学的に集束された流体のストリームに向けられる単一波長の光線（通常はレーザー光）を利用する。多くの検出器は、ストリームが光ビームを通過する点を対象としている。１つは光ビームに沿っており（前方散乱またはＦＳＣ）、いくつかはそれに垂直である（側面散乱（ＳＳＣ）及び１つ以上の蛍光検出器）。ビームを通過するそれぞれの浮遊粒子は何らかの方法で光を散乱し、粒子内にあるか粒子に付着している蛍光化学物質が励起されて、光源よりも低い周波数で発光する可能性がある。この散乱光と蛍光の組み合わせが検出器によって検出され、それぞれの検出器（通常は蛍光発光ピークごとに１つ）の輝度の変動を分析することにより、それぞれ個々の粒子の物理的及び化学的構造に関するさまざまなタイプの情報を導き出すことができる。ＦＳＣは細胞の体積と相関し、ＳＳＣは粒子の内部の複雑さ（すなわち、核の形状、細胞質顆粒の量と種類、または膜の粗さ）に依存する。
フローサイトメトリーでのフルオロフォア標識抗体などの蛍光分子の使用は、細胞特性を研究するための一般的な方法である。これらのタイプの実験では、標識抗体が細胞試料に追加される。次いで、抗体は細胞表面または細胞内の特定の分子に結合する。最後に、適切な波長のレーザー光がフルオロフォアに当たると、蛍光シグナルが放出され、フローサイトメーターによって検出される。
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）は、特殊なタイプのフローサイトメトリーである。これは、それぞれの細胞の特定の光散乱及び蛍光特性に基づいて、生物学的細胞の不均一な混合物を一度に１つの細胞で２つ以上の容器に分類する方法を提供する。これは、個々の細胞からの蛍光シグナルの高速で客観的かつ定量的な記録、及び特に関心のある細胞の物理的分離をもたらす。
ＦＡＣＳを利用して、細胞懸濁液は、狭くて急速に流れる液体のストリームの中心に搭載される。流れは、細胞の直径に対して細胞間に大きな間隔ができるように配置される。振動メカニズムにより、細胞のストリームが個々の液滴に分裂する。システムは、１つを超える細胞が液滴に含まれる可能性が低くなるように調整される。ストリームが液滴に分割される前に、フローは蛍光測定ステーションを通過し、そこでそれぞれの細胞の対象となる蛍光特性が測定される。充電リングまたは平面は、ストリームが液滴に分裂する点に配置される。以前の光散乱及び蛍光強度の測定に基づいて電荷がリングに配置され、液滴がストリームから分離するときに反対の電荷が液滴に捕捉される。次いで、帯電した液滴は、帯電に基づいて液滴を容器にそらす静電偏向システムを通って落下する。一部のシステムでは、近くの平面またはリングが接地電位に保持されている間、電荷がストリームに直接適用され、液滴の崩壊により、ストリームと同じ符号の電荷が保持される。液滴が壊れた後、ストリームはニュートラルに戻る。
マスサイトメトリー、またはＣｙＴＯＦ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）は、抗体が蛍光色素ではなく重金属イオンタグで標識されているフローサイトメトリーのバリエーションである。読み取りは飛行時間型質量分析によるものである。ｖｉＳＮＥは、散布図と同様の視覚で個々の細胞をプロットし、高次元であるすべてのペアワイズ距離を使用して、プロット内の各細胞の位置を決定する。
いくつかの実施形態によれば、活性化されたＮＫ細胞及び非ＮＫ細胞は、マーカーＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ８、及びＣＤ４の発現に基づいて分類及び単離され得る。いくつかの実施形態によれば、活性化されたＭＮＣ細胞集団の例示的な表現型は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ５６＋ＣＤ３＋、ＣＤ５６＋ＣＤ３－、ＴＣＲγδ＋、及びＴＣＲＶα７．２＋を含み得る。
いくつかの実施形態によれば、活性化された混合単核球集団における活性化されたシリアルキラー細胞は、活性化されたリンパ球の細胞増殖、活性化されたリンパ球の細胞サブセット分化、リンパ球のサイトカイン放出プロファイル、及び腫瘍細胞死のうちの１つ以上によって同定され得る。
細胞傷害性マーカー
いくつかの実施形態によれば、ＭＮＣ集団及びＥＮＬＳＴ集団は、最大２８日間共培養される。培養中の１つ以上の時間において、活性化されたリンパ球の細胞増殖、リンパ球の細胞サブセット分化、リンパ球のサイトカイン放出プロファイル、及び腫瘍細胞死を示すパラメーターが測定され得る。
ＮＫ細胞の明確な機能的特徴は、事前の感作なしに細胞標的の「ナチュラルキラー」を行う固有の能力を保持する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団（複数可）は、ＮＫ細胞を活性化及び拡大するのに有効であり、その結果、活性化及び拡大されたＮＫ細胞は、対照ＮＫ細胞と比較してより高い脱顆粒活性を示す。いくつかの実施形態によれば、細胞傷害性脱顆粒活性は、脱顆粒活性と相関する細胞マーカーの発現を決定することによって推定することができる。例えば、ＣＤ１０７ａの表面発現は、細胞傷害性顆粒の脱顆粒及び放出と密接に関連している。ＣＤ１０７ａの発現は、例えば、フローサイトメトリーによって測定することができる（例えば、ＢＤ ＦａｓｔＩｍｍｕｎｅ（商標）ＣＤ１０７ａ（Ｈ４Ａ３，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．；Ａｌｔｅｒ Ｇ，Ｍａｌｅｎｆａｎｔ Ｊ Ｍ，Ａｌｔｆｅｌｄ Ｍ． ＣＤ１０７ａ ａｓ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ． （２００４） ２９４： １５－２２を参照されたい。その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態によれば、記載された本発明のＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団（複数可）との接触によって得られる拡大及び活性化されたＮＫ細胞は、例えば脱顆粒活性によって測定されるとき、非増殖型ＮＫ細胞と比較して、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％増加した細胞傷害性を含む。いくつかの実施形態によれば、拡大及び活性化されたＮＫ細胞は、拡大されていないＮＫ細胞と比較して、少なくとも約１００％増加した細胞傷害性を含む。いくつかの実施形態によれば、拡大及び活性化されたＮＫ細胞は、拡大されていないＮＫ細胞と比較して、少なくとも約２００％増加した細胞傷害性を含む。いくつかの実施形態によれば、拡大及び活性化されたＮＫ細胞は、エクスビボで拡大されていないＮＫ細胞と比較して、少なくとも約３００％増加した細胞傷害性を含む。いくつかの実施形態によれば、拡大及び活性化されたＮＫ細胞は、エクスビボで拡大されていないＮＫ細胞と比較して、少なくとも約４００％増加した細胞傷害性を含む。
いくつかの実施形態によれば、記載された本発明のＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団（複数可）との接触後の拡大及び活性化されたＮＫ細胞は、非増殖型ＮＫ細胞と比較して、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％増加した脱顆粒活性を含む。いくつかの実施形態によれば、拡大及び活性化されたＮＫ細胞は、拡大されていないＮＫ細胞と比較して、少なくとも約１００％増加した脱顆粒活性を含む。いくつかの実施形態によれば、拡大及び活性化されたＮＫ細胞は、拡大されていないＮＫ細胞と比較して、少なくとも約２００％増加した脱顆粒活性を含む。いくつかの実施形態によれば、拡大及び活性化されたＮＫ細胞は、エクスビボで拡大されていないＮＫ細胞と比較して、少なくとも約３００％増加した脱顆粒活性を含む。いくつかの実施形態によれば、拡大及び活性化されたＮＫ細胞は、エクスビボで拡大されていないＮＫ細胞と比較して、少なくとも約４００％増加した脱顆粒活性を含む。
腫瘍細胞傷害性
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞傷害性を使用して、活性化されたシリアルキラー細胞を含む混合リンパ球を含むＭＮＣの免疫活性化を測定することができる。例えば、いくつかの実施形態によれば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）－細胞傷害性比色分析キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎカタログ番号Ｋ３１１－４００）を使用して、腫瘍細胞の細胞傷害性を測定することができる。ほとんどの真核細胞に存在する可溶性細胞質ゾル酵素であるＬＤＨは、原形質膜の損傷による細胞死の際に培地中に放出される。培養上清中のＬＤＨ活性の増加は、溶解した細胞の数に比例する。簡潔に述べると、対照群（トランスフェクトされていないＭＳＣを含む）、実験群（免疫調節因子でトランスフェクトされたＭＳＣを含む）、及び培地のみのそれぞれからの１００μｌの培地を９６ウェルプレートのウェルにピペットで移す。次いで、色素溶液と触媒溶液を含む１００μｌのＬＤＨ反応混合物を、９６ウェルプレートのウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートすることができる。次いで、マイクロタイタープレートリーダーを使用して、４９０～５００ｎｍでの吸光度を測定できる。
表現型マーカー
いくつかの実施形態によれば、シリアルキラー細胞型は、それらの表現型マーカーによって識別され得る。ＮＫ、ＬＡＫ、ＣＩＫ、ＮＫＴ、ＧＤＴ、ＭＡＩＴ細胞、ＣＤ８＋ＣＴＬ、及びＣＤ４＋ＣＤＬの代表的な表現型マーカーを表８に示す。
Figure 2022553411000022
Figure 2022553411000023
Figure 2022553411000024
Figure 2022553411000025
Figure 2022553411000026
Figure 2022553411000027
例えば、ヒトＮＫ細胞は、表現型的にＣＤ５６の発現とＣＤ３の非存在を特徴とし、ＣＤ５６bright集団とＣＤ５６dim集団にさらに細分化することができる。ＣＤ５６bright集団は、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子－β（ＴＮＦ－Ｂ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１３（４）を含む、免疫調節性サイトカインを産生する。ＣＤ５６dimサブセットは、ＣＤ５６bright集団の最終分化した後継者であり、主に細胞溶解機能の発揮に関与している。しかしながら、ＣＤ５６dimＮＫ細胞は、ＮＫｐ３０活性化受容体のＮＫｐ４６を介して細胞を誘起した後、またはＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５の組み合わせで刺激した後、サイトカイン、具体的にはＩＦＮγを産生することができる。
いくつかの実施形態によれば、ＮＫ細胞の成熟及び／または活性化の様々なマーカーは、例えば、フローサイトメトリー法を使用して検出することができる。例えば、ＮＫ細胞の古典的なマーカーは、ＣＤ１６とも呼ばれる活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩである。
ＮＫ細胞の活性化は、パーフォリンとさまざまなグランザイムを含む細胞傷害性顆粒の放出と、サイトカイン産生、最も顕著にインターフェロン－γ（ＩＦＮγ）をもたらす。さらに、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）及びＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）などの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するデス誘導リガンドの細胞表面での発現も、標的細胞上のデス受容体（ＤＲ）、すなわちＦａｓ、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ－ＲＩ）、及びＤＲ５（ＴＲＡＩＬ－ＲＩＩ）への結合を介したカスパーゼ酵素カスケードの活性化を誘導する。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の同種ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による免疫応答の誘導は、少なくとも１つのＮＫ細胞活性化受容体（例えば、表３に列挙される活性化受容体）を少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、またはそれ以上上方制御する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による免疫応答の誘導 は、少なくとも１つのＮＫ細胞活性化受容体を少なくとも約７５％、すなわち少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％を上方制御する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞 による免疫応答の誘導は、少なくとも１つのＮＫ細胞活性化受容体を少なくとも約１００％上方制御する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞 による免疫応答の誘導は、少なくとも１つのＮＫ細胞活性化受容体を少なくとも約２００％上方制御する。
別の実施形態によれば、本明細書に記載の同種ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による免疫応答の誘導は、抑制性受容体またはケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ７）などの少なくとも１つのＮＫ細胞受容体の発現を下方制御する。例えば、特定のＮＫ細胞抑制性受容体はＫＩＲ（キリング抑制性受容体またはＣＤ１５８）と呼ばれる。抑制性受容体の非限定的な例は、抑制性キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＧＬ１８３、ＫＩＲ２ＤＬ１、Ｌｉｒ－１、ＮＫＢ１、及びＮＫＧ２Ａである。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による免疫応答の誘導は、少なくとも１つのＮＫ細胞抑制性受容体（例えば、表４に列挙される抑制性受容体）を、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、１２０％、少なくとも約１３０％、約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％，、少なくとも約２９０％、少なくとも約３００％、またはそれ以上、下方制御する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による免疫応答の誘導は、少なくとも１つのＮＫ細胞抑制性受容体を少なくとも約７５％下方制御する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による免疫応答の誘導は、少なくとも１つのＮＫ細胞抑制性受容体を少なくとも約１００％下方制御する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による免疫応答の誘導は、少なくとも１つのＮＫ細胞抑制性受容体を少なくとも約２００％下方制御する。
受容体発現の変化は、平均蛍光強度（ＭＦＩ）比によって計算できる。
ＭＦＩdayX／ＭＦＩday0
ここで、ｘはＮＫ細胞の拡大の日数である。
Ｘ日目の試料のＭＦＩが０日目よりも高い場合、ＭＦＩ比は１より高くなる。これは、その受容体の上方制御の相対的な程度を示している。したがって、例えば１．５のＭＦＩ比は、特定の受容体の５０％の上方制御を意味する。ＭＦＩ比の計算は当業者によく知られている。
例示的なＮＫ細胞活性化または抑制性受容体を以下の表９に示す。
Figure 2022553411000028
ヒトキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ；ＣＤ１５８としても知られる）は、ＮＫ細胞及びＴ細胞のサブセットで発現する膜貫通型糖タンパク質のファミリーである（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｕｒｄｙ，Ａ．Ｋ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ： ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，” Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１１） １３２（３）： ３１５－３２５）。ＫＩＲは、ＮＫ細胞の発達、寛容、活性化の重要な調節因子である（同上）。ＫＩＲの主なリガンドは、ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ、または－Ｃ）分子であり、体内のほぼすべての正常な有核細胞の表面に発現し、ヒトで最も多型の遺伝子によってコードされ、免疫’自己’を定義する（同上）。正常細胞に対するＮＫ細胞の寛容は、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ／ＣＤ９４、ＣＤ８５ｊ（ＩＬＴ２、ＬＩＲ１）などのＭＨＣ－Ｉ結合抑制性受容体の発現によって達成される（同上）。例えば、ＬＩＲ－１（ＫＩＲに関連するクラスＩ ＭＨＣ受容体）またはＫＩＲがクラスＩ分子に結合すると、抑制性シグナルが発生する。Ｃｈａｐｍａｎ，ＴＬ，ｅｔ ａｌ，“Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＬＩＲ－１ ｕｓｅｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｃｌａｓｓ Ｉ ＭＨＣ ｍｏｌｅｃｕｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｈｏｍｏｌｏｇ ＵＬ１８，” Ｉｍｍｕｎｉｔｙ （１９９９） １１ （５）： ６０３－１３）を参照されたい。ＫＩＲファミリーは１４の高度に多型の遺伝子（２ＤＬ１から２ＤＬ５、３ＤＬ１から３ＤＬ３、２ＤＳ１から２ＤＳ５、及び３ＤＳ１）によってコードされ、別個のファミリーメンバーは活性化または抑制性シグナルのいずれかを伝達できる（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｋ．Ｓ． ａｎｄ Ｐｕｒｄｙ，Ａ．Ｋ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ： ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ｓ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，” Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１１） １３２（３）： ３１５－３２５）。ＫＩＲの命名法は、細胞外領域のＣ２型免疫グロブリン様ドメインの数（２つのドメインの場合は２Ｄ、３つのドメインの場合は３Ｄ）と細胞質ドメインの長さ（長い尾部の受容体の場合はＬ、短い場合はＳ）に基づいている（同上）。すべての抑制性ＫＩＲは、免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ；Ｉ／ＶｘＹｘｘＬ／Ｖ）を有する長い細胞質ドメインを有し、抑制性機能の媒介に重要なタンパク質チロシンホスファターゼを動員する（同上）。対照的に、短い細胞質ドメインを持つＫＩＲは、膜貫通シグナル伝達アダプタータンパク質であるＤＡＰ１２（ＫＡＲＡＰとも呼ばれる）と結合している（同上）。抗原受容体シグナル伝達と一致して、ＤＡＰ１２依存性活性化は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ［ＩＴＡＭ；Ｙｘｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ｘ６－８Ｙｘｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）］によるＳｙｋ／ＺＡＰ－７０チロシンキナーゼの動員を通じて起こる（同上）。この短い／長い尾部のルールの唯一の例外は、ＫＩＲ２ＤＬ４である。これは、ユニークな長い尾部の活性化ＫＩＲである。他のＫＩＲファミリーメンバーと比較して、２ＤＬ４はＣＤ５６ｈｉｇｈ ＮＫ細胞でのみ発現し、細胞傷害性ではなくサイトカイン産生のより強力な活性化因子として機能し、ＤＡＰ１２Ｉｄの代わりにＩＴＡＭを含むＦｃεＲＩ－γアダプターと結合する。ＫＩＲはＣＤ８＋ＴＩＬの５～４０％で発現し、腫瘍反応性ＣＴＬの細胞傷害性活性の変化に寄与する（Ｇａｔｉ，Ａ． ｅｔ ａｌ．，ＣＤ１５８ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｔ－Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｔｕｍｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ｂｙ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｆａｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，”Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （２００３） ６３ （２１）： ７４７５－８２を参照されたい）。ＫＩＲ３ＤＬ１は元々ＮＫＢ１という名前で、ＨＬＡＢｗ４に特異的である。ＧＬ１８３は、ヒトＣＤ３－ＣＤ１６＋ＮＫ細胞のサブセットによって選択的に発現される細胞活性化を媒介することができる表面分子である。Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ． ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｎｏｖｅｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＣＤ３－ＣＤ１６＋ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．” Ｊ． Ｅｘｐｔｌ． Ｍｅｄ． （１９９０） ３： ６９５）。
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化と拡大
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による免疫応答の誘導は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するのに有効である。いくつかの実施形態によれば、同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による免疫応答の誘導は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大するのに有効である。いくつかの実施形態によれば、同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞による免疫応答の誘導は、親細胞の対照と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団の活性化及び拡大をもたらすのに有効である。
Ｔ細胞の活性化及び拡大は、本明細書に記載されるような様々なアッセイによって測定することができる。例えば、測定され得るＴ細胞活性には、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞における活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、及びＴ細胞の細胞傷害活性が含まれる。例えば、特定の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化は、増殖アッセイによって測定される。
サイトカイン分泌
本発明の同種異系ＥＮＬＳＴ（商標）細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を含む免疫応答の誘導 は、γインターフェロン（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、またはインターロイキン２（ＩＬ－２）などのサイトカインの分泌を決定することによって評価または測定され得る。いくつかの実施形態によれば、ＥＬＩＳＡは、サイトカイン分泌、例えば、γインターフェロン（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦａ）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、またはインターロイキン２（ＩＬ－２）の分泌を決定するために使用される。ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポット）技術を使用して、本明細書に記載の操作されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞による刺激に応答して、所与のサイトカイン（例えば、γインターフェロン（ＩＦＮγ））を分泌するＴ細胞を検出することができる。Ｔ細胞は、抗ＩＦＮγ抗体でコーティングされたウェル内で操作されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞とともに培養される。分泌されたＩＦＮγはコーティングされた抗体によって捕捉され、発色基質に結合した二次抗体で明らかになる。したがって、局所的に分泌されるサイトカイン分子はスポットを形成し、各スポットは１つのＩＦＮγ分泌細胞に対応する。スポットの数により、分析された試料中のＩＦＮγ分泌細胞の頻度を決定することができる。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、腫瘍壊死因子α、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、及びグランザイムＢ分泌リンパ球の検出についても記載されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｌｉｎｍａｎ Ｄ，Ｎｕｔｍａｎ Ｔ． Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ： Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；１９９４． ｐｐ． ６．１９．１－６．１９．８）。
細胞内サイトカインのフローサイトメトリー分析は、培養上清中のサイトカイン含有量を測定するために使用できるが、実際にサイトカインを分泌するＴ細胞の数に関する情報は提供しない。Ｔ細胞がモネンシンまたはブレフェルジンＡなどの分泌阻害剤で処理される場合、それらは、活性化時にそれらの細胞質内にサイトカインを蓄積する（例えば、本発明の操作されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞と共に）。リンパ球の固定と透過処理の後、細胞内サイトカインはサイトメトリーによって定量化できる。この技法により、産生されたサイトカイン、これらのサイトカインを産生する細胞のタイプ、及び細胞あたりに産生されたサイトカインの量を決定することができる。
細胞傷害性
記載された発明のＥＮＬＳＴ（商標）細胞との接触によるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性活性をアッセイすることによって評価することができる。
Ｔ細胞の細胞傷害性活性は、当業者に知られている任意の適切な技術によって評価することができる。例えば、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞に曝露されたＴ細胞を含む試料は、適切な期間の後に、標準的な細胞傷害性アッセイ、例えばＣｒ51放出、またはＡｌｍａｒＢｌｕｅ（商標）蛍光で細胞傷害性活性をアッセイできる（例えば、Ｗｏｌｉｎｔ，Ｐｅｔｒａ，ｅｔ ａｌ． “Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ Ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｓ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｎｄ Ｍｅｍｏｒｙ Ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌｓ．” Ｊ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｔｈｅ Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，（５ Ａｐｒ． ２００４），ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｍｃ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ＰＭＣ２２１１８８４／を参照されたい）。
クロム51放出アッセイでは、標的細胞（ＥＮＬＳＴ（商標）細胞）を、51ＣｒＥＮＬＳＴ（商標）細胞で標識し、ＭＮＣを適切な培地に追加する。標識は細胞溶解によって標的細胞から放出され、試料を遠心分離して上清を収集することで分離できる。遠心分離からの上清は、ガンマカウンターで直接カウントするか、マイクロプレートでシンチレーションカクテルと混合して（またはＬｕｍａＰｌａｔｅ（商標）で乾燥させて）、液体シンチレーションカウンターでカウントすることができる。
ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）蛍光生存率アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）の場合、ＭＮＣ及びＥＮＬＳＴ（商標）細胞を適切な培地でマイクロプレートウェルに添加する。ａｌａｒｍａＢｌｕｅ ＨＳまたはａｌａｒｍａＢｌｕｅ試薬のいずれかをウェルに添加し、３７℃で１～４時間インキュベートする。蛍光（５６０／５９０ｎｍ）または吸光度（５７０）を読み取る（シグナルは７時間安定している）。生細胞に入ると、レサズリンは還元されて、赤色で蛍光性の高い化合物であるレゾルフィンになる。生存率を決定した後、希釈したａｌａｍａｒＢｌｕｅ ＨＳまたはａｌａｍａｒＢｌｕｅ試薬を完全培地と交換し、インキュベーターに戻すことができる。細胞は正常に増殖し続ける。
増殖／拡大
ＥＮＬＳＴ（商標）細胞がＴ細胞集団の拡大を刺激する能力は、ＣＦＳＥ染色を使用して評価できる。細胞拡大の初期速度を比較するために、細胞をＣＦＳＥ染色に供して、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞がＴ細胞の増殖をどの程度誘導したかを決定する。ＣＦＳＥ染色は、はるかに定量的な評価項目を提供し、増殖した細胞の同時表現型決定を可能にする。刺激後、毎日、細胞のアリコートを各培養物から取り出し、フローサイトメトリーで分析する。ＣＦＳＥ染色は細胞を非常に蛍光性にする。細胞分裂すると、蛍光は半分になり、細胞が分裂する回数が増えると、蛍光は弱くなる。ＥＮＬＳＴ（商標）細胞のＴ細胞増殖を誘導する能力は、１回、２回、３回など分割した細胞の数を測定することによって定量化される。特定の時点で最大数の細胞分裂を誘発するＥＮＬＳＴｃｅｌｌｓ（商標）集団（複数可）は、最も強力な拡大因子とみなされる。
ＥＮＬＳＴｃｅｌｌｓ（商標）集団がＴ細胞の長期増殖をどの程度促進するかを判断するために、細胞増殖曲線を作成できる。これらの実験は、前述のＣＦＳＥ実験のように設定されているが、ＣＦＳＥは使用されていない。培養の２～３日ごとに、Ｔ細胞をそれぞれの培養物から取り出し、存在する細胞の数と細胞の平均体積を測定するコールターカウンターを使用してカウントする。平均赤血球体積は、いつ細胞を再刺激するかについての最良の予測因子である。一般に、Ｔ細胞が適切に刺激されると、細胞の体積は３倍になる。この体積が最初のブラストの約半分以上減少した場合、対数線形膨張を維持するためにＴ細胞を再刺激する必要があり得る（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１９３９－１９４３；Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５９：５９２１－５９３０）。Ｔ細胞集団が２０の集団倍加を誘導するのにかかる時間を計算する。このレベルのＴ細胞拡大を誘導するためのそれぞれのＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団の相対的な違いは、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団の効力を評価するための１つの基準である。
さらに、それぞれのＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団によって拡大された細胞の表現型を特徴づけて、特定のサブセットが優先的に拡大しているかどうかを判断することができる。それぞれの再刺激の前に、拡大するＴ細胞集団の表現型分析を実行して、Ａｐｐａｙら（２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ８，３７９－３８５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって提案されたＣＤ２７及びＣＤ２８の定義、ならびにＳａｌｌｕｓｔｏら（１９９９，Ｎａｔｕｒｅ ４０１：７０８－７１２、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって提案されたＣＣＲ７の定義を使用して拡大したＴ細胞の分化状態を定義する。パーフォリン及びグランザイムＢの細胞内染色を使用して、細胞溶解能を推定するための肉眼的測定を行うことができる。
アポトーシスマーカー
本発明の特定の実施形態によれば、本明細書に記載のＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団（複数可）との接触後のＴ細胞の刺激、活性化、及び拡大は、インビボまたはインビトロで、アポトーシスから保護するか、さもなければ生存を延長するＴ細胞における特定の主要な分子の発現を増強する。アポトーシスは通常、Ｔ細胞における特定のシグナルの誘導に起因する。したがって、本発明のＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、Ｔ細胞の刺激に起因する細胞死からＴ細胞を保護することを提供し得る。したがって、本発明には、早期死からの保護、またはＴ細胞の生存に通常必要なＢｃｌ－ｘＬ、増殖因子、サイトカイン、またはリンホカインなどの認識されたＴ細胞増殖マーカーの欠如または枯渇からの保護、ならびにＦａｓまたは腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の架橋からの保護、または特定のホルモンまたはストレスへの曝露による、増強されたＴ細胞増殖も含まれる。
免疫抑制性集団
Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）は、高レベルのインターロイキン（ＩＬ）－２受容体α鎖（ＣＤ２５）の構成的発現を特徴としている。ＤｅＭａｔｔｅｉｓ，Ｓ． ｅｔ ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｔｒｅｇ ｃｅｌｌｓ ａｃｑｕｉｒｅ ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ，” Ｊ． Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （２０１８） １６： ａｒｔｉｃｌｅ １７２）。ＣＤ４＋ＣＤ２５highＴｒｅｇｓの大部分は、それらの分化とそれらの免疫抑制機能の両方に必要なフォークヘッドファミリー転写因子（ＦｏｘＰ３）も発現している （同上）。理論に制限されることなく、Ｔｒｅｇの抑制機能は、細胞間接触を介した標的細胞シグナル伝達の調節、及び／またはＩＬ－１０、ＩＬ－３５、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）などの免疫抑制性サイトカインの分泌など、さまざまな因子に関連し得る（同上）。
いくつかの実施形態によれば、ＦｏｘＰ３＋細胞は、活性化されたＭＮＣ集団の１％未満を構成する。
ステップ２： インビトロで、活性化されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化されたＭＮＣの集団を拡大し、活性化されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化されたＭＮＣの集団を含む細胞製品を形成する
増殖／拡大
いくつかの実施形態によれば、シリアルキラー細胞の活性化された亜集団を含む活性化されたＭＮＣ集団は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの定義された形状（容積、表面積、及び細胞数）のＴフラスコでＬｏｎｚａのＸ－Ｖｉｖｏ培地＋抗生物質＋グルタマックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、拡大することができる。いくつかの実施形態によれば、ニコチンアミド５ｍＭが培地に添加され得る。いくつかの実施形態によれば、単核球に対して自家である２．５体積％のヒト血漿が培地に添加され得る。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のサイトカイン（ＲＮＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ、５～１０ｎｇ／ｍｌ）を培地が添加され得る。いくつかの実施形態によれば、サイトカインは、ＩＬ２、ＩＬ７、及びＩＬ１５から選択される１つ以上である。いくつかの実施形態によれば、拡大の条件は、細胞数を少なくとも２倍にブーストするのに効果的である。増殖は、シリアルキラー細胞の活性化された亜集団を含む活性化されたＭＮＣ集団、またはシリアルキラー細胞の単離され、拡大され、濃縮された集団の１つ以上を含む細胞製品のいずれかを含む細胞製品の形成をもたらす。
シリアルキラー細胞の活性化亜集団を含む活性化ＭＮＣ集団の拡大は、細胞蛍光測定技術、例えば、５－（及び６－）カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）染色の使用によって評価することができる。いくつかの実施形態によれば、細胞拡大の初期速度を比較するために、細胞は、ＣＦＳＥ染色に供される。ＣＦＳＥ染色は定量的な評価項目を提供し、ＣＦＳＥ染色は細胞を高度に蛍光性にするため、拡大した細胞の同時表現型解析を可能にする。刺激後、毎日、細胞のアリコートを各培養物から取り出し、フローサイトメトリーで分析する。細胞分裂すると、蛍光は半分になり、細胞が分裂する回数が増えると、蛍光は弱くなる。
ＥＮＬＳＴ（商標）細胞のＭＮＣ増殖を誘導する能力は、１回、２回、３回など分割した細胞の数を測定することによって定量化される。
いくつかの実施形態によれば、細胞増殖曲線を生成することができる。これらの実験は、前述のＣＦＳＥ実験と同様に設定されているが、ＣＦＳＥは使用されない。培養の２～３日ごとに、シリアルキラー細胞を含むＭＮＣをそれぞれの培養物から取り出し、存在する細胞の数と細胞の平均体積を測定するコールターカウンターを使用してカウントする。平均赤血球体積は、いつ細胞を再刺激するかについての最良の予測因子である。一般に、シリアルキラー細胞が適切に刺激されると、細胞の体積は３倍になる。この体積が最初のブラストの約半分以上減少した場合、対数線形膨張を維持するためにシリアルキラー細胞を含むＭＮＣを再刺激する必要があり得る（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：１９３９－１９４３；Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：５９２１－５９３０）。それぞれの操作された細胞が２０の集団倍加を誘導するのにかかる時間を計算する。シリアルキラー細胞の拡大を含むそれぞれのＭＮＣのこのレベルを誘導するために少なくとも４つの免疫調節ペプチドをコードする組換えＤＮＡ配列でトランスフェクトまたは形質導入されたそれぞれの同種異系初代腫瘍細胞株の相対的差異は、少なくとも４つの免疫調節ペプチドをコードする組換えＤＮＡ配列でトランスフェクトまたは形質導入された特定の同種初代腫瘍細胞株が評価される１つの基準である。
いくつかの実施形態によれば、増殖は、3Ｈ－チミジンの取り込みによって検出することができる。次に、細胞をフィルターマットに回収し、シンチレーションカウンターを使用して3Ｈ－チミジンの取り込みを測定できる。例えば、トランスフェクトされていない腫瘍細胞対照と比較して、腫瘍細胞株バリアントを有する１つ以上のシリアルキラー細胞集団（複数可）を含むＭＮＣの増殖を測定することができる。対照と比較して増殖の増加、減少、または変化がないことは、考えられる結果である。
いくつかの実施形態によれば、シリアルキラー細胞の活性化された亜集団を含む拡大された活性化されたＭＮＣ集団の増殖は、フローサイトメトリー分析によって特徴付けることができる。
ステップ３：細胞製品の個別用量を含む単位用量パッケージを調製し、細胞製品を含む単位パッケージを－８６°Ｃで凍結し、凍結した単位用量パッケージを凍結保存、例えば、液体窒素冷凍庫の気相で凍結保存すること；
いくつかの実施形態によれば、活性化されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む拡大された活性化されたＭＮＣ集団を含む細胞製品は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）を通して遠心分離され、Ｘ－Ｖｉｖｏ基礎培地＋凍結防止剤流体を含む医薬組成物に再懸濁される。いくつかの実施形態によれば、組換えヒトアルブミンを添加することができる。細胞製品は、個別にラベル付けされた単位用量パッケージに分注され、－８６℃で凍結される。液体窒素冷凍庫の気相で凍結保存される。
凍結防止剤は、凍結中に細胞を保護する化学物質であるため、溶質濃度の上昇と氷晶形成の悪影響を最小限に抑える。最も一般的に使用される凍結防止剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）とグリセロールであり、これらは一般に５～１０％（ｖ／ｖ）の範囲の濃度で使用される。使用されてきた他の凍結防止剤としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ポリビニルピロリドン、ソルビトール、デキストラン、及びトレハロースが挙げられる。
凍結防止剤は、凍結プロセス中にいくつかの機能を果たす。凝固点降下は、細胞内凍結の前に細胞のより大きな脱水を促進するのに役立つＤＭＳＯが使用されるときに観察される。凍結防止剤は、細胞に浸透し、細胞内凍結を遅らせ、溶液の影響を最小限に抑えることができる場合にも最も効果的であるように思われる。
凍結防止剤の選択は、保存する細胞の種類によって異なる。例えば、哺乳動物細胞を凍結保存用に準備する場合、適切な回復を確実にするレベルに細胞集団を調整する必要がある。ほとんどの哺乳動物細胞では、１０6～１０7細胞／ｍＬの開始集団が最適である。
細胞懸濁液は、最初に保存に必要な濃度の２倍で調製できるため、等量の凍結防止剤（２×凍結防止剤＋培地）を加えることができる。代替的に、細胞ペレットを凍結防止剤（１×凍結防止剤＋培地）に再懸濁して、目的の細胞濃度にすることもできる。
細胞と凍結防止剤を組み合わせて凍結用の容器に分注したら、次のステップは懸濁液を冷却することである。冷却速度は、氷晶の形成速度とサイズ、及び凍結中に発生する溶液効果に影響を及ぼす。細胞の種類によって必要な冷却速度は異なるが、さまざまな細胞や生物に対して、周囲温度から１分あたり１℃の均一な冷却速度が効果的である。プログラム可能な速度の細胞凍結装置を使用して、均一で制御された冷却速度を達成することができる。
いくつかの実施形態によれば、活性化及び拡大されたシリアルキラー細胞を含む活性化及び拡大されたＭＮＣ集団は、長期の刺激によるエフェクター機能の喪失（Ｔ細胞疲弊）なしに、複数回凍結及び解凍することができる。いくつかの実施形態によれば、活性化及び拡大されたシリアルキラー細胞亜集団の少なくとも一部は、一旦休止されると、再活性化され得る。
いくつかの実施形態によれば、記載された発明による医薬組成物は、細胞製品によって提供されるものに加えて別の医薬効果を有する組成物を証明することを目的とする１つ以上の適合性活性成分をさらに含み得る。本明細書で使用されるとき、「相溶性」は、通常の使用条件下で各活性成分または組成物の効力を実質的に低下させるような相互作用がないような方法でそのような組成物の活性成分を互いに組み合わせることができることを意味する。
ステップ４：制御された条件下で、細胞製品を含む治療量の凍結単位用量パッケージを解凍し、任意選択で、ステップ４の凍結及び解凍された細胞生成物を、薬学的に許容される担体成分と組み合わせて、医薬組成物を形成すること；
凍結された単位用量パッケージを液体窒素冷凍庫から取り出すとき、それらは制御された条件下で解凍される。すなわち、細胞の健康を維持するために温度がゆっくりと変化する。単位用量パッケージの内容物が解凍されるとすぐに、単位用量パッケージの外部表面は開封前に消毒される。いくつかの実施形態によれば、単位用量パッケージの細胞製品内容物は、凍結保護剤への曝露を最小限にするために、解凍後すぐに新鮮なＸ－Ｖｉｖｏ培地に移され得る。いくつかの実施形態によれば、細胞製品は、最初の希釈後、１００×ｇで１０分間遠心分離され、上澄みが除去され、細胞は、新鮮なＸ－Ｖｉｖｏ増殖培地に再懸濁され得る。いくつかの実施形態によれば、細胞回復は、生細胞の数を推定することによって決定される。
ステップ５： それを必要とする対象に治療量のステップ４の細胞製品または医薬組成物を投与すること
記載された発明による治療に適格な患者は、現在免疫抑制レジメンの影響下にない患者、例えば、骨髄腫、前立腺癌、及び早期乳癌と診断された患者である。
いくつかの実施形態によれば、現在免疫抑制レジメンの影響下にないがんを有する患者を治療するための例示的なレジメンは、対象の生涯中の１つ以上の日付に、シリアルキラー細胞の活性化及び拡大された亜集団を含む、拡大されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞で活性化されたＭＮＣ集団を含む治療量の細胞製品を非経口投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、「非経口」という用語は、例えば、皮下（すなわち、皮膚の下の注射）、筋肉内（すなわち、筋肉内への注射）、静脈内（すなわち、静脈内への注射）、髄腔内（すなわち、脊髄の周りまたは脳のくも膜の下の空間への注射）、または注入技術を含む、注射（すなわち、注射による投与）による体内への導入を指す。
いくつかの実施形態によれば、組成物は、複数回、または治療する医師の判断において必要に応じて投与される。そのような一実施形態によれば、組成物は、第１の注入日、及び任意選択で第２の注入日、第３の注入日、第４の注入日、第５の注入日、第６の注入日、第７の注入日、第８の注入日、第９の注入日、第１０の注入日などに、投与される。
いくつかの実施形態によれば、第１の注入日は、診断後の、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約２６日、少なくとも約２７日、少なくとも約２８日、少なくとも約２９日、少なくとも約３０日、またはそれ以上後である。いくつかの実施形態によれば、第２の注入日は、第１の注入日後の、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約２６日、少なくとも約２７日、少なくとも約２８日、少なくとも約２９日、少なくとも約３０日、またはそれ以上後である。いくつかの実施形態によれば、第３の注入日は、第２の注入日後の、少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２１日、少なくとも約２２日、少なくとも約２３日、少なくとも約２４日、少なくとも約２５日、少なくとも約２６日、少なくとも約２７日、少なくとも約２８日、少なくとも約２９日、少なくとも約３０日、またはそれ以上後である。腫瘍量または腫瘍の再発（通常、元の（原発性）腫瘍の場所と同じ場所で、または体内の別の場所で、がんを検出できなかった期間の後に再発した（戻ってきた）がんを意味する）を減らすために、必要に応じて時間の経過とともにさらなる注入が想定される。
カテーテルを介して注入された場合、記載された発明の細胞製品の生存率及び潜在的有効性は、シリアルキラー細胞の活性化亜集団を含む拡大された活性化されたＭＮＣ集団に依存し、それらがカテーテルを通過するときにそれらの効力を維持する。いくつかの実施形態によれば、記載された発明の方法で使用されるカテーテルは、少なくとも０．３１７５ｃｍの内径を有する。少なくとも０．３１７５ｃｍの内径を有する任意のタイプのカテーテルは、記載された発明の医薬組成物を送達するのに有効であり得る。
例えば、血管系を通る血液の排出を遅らせるフロー制御カテーテルは、活性化された細胞が血管壁を通過して 組織に入る時間を可能にする。いくつかの実施形態によれば、カテーテルはバルーンカテーテルである。
いくつかの実施形態によれば、カテーテルを使用して、医薬組成物は、腫瘍と接触させて直接注射される。
いくつかの実施形態によれば、記載された本発明の細胞製品組成物は、免疫チェックポイントの適合性阻害剤と組み合わせて投与され得る。例示的な適合性のある免疫チェックポイントとしては、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、及びＬＡＧ－３が挙げられる。いくつかの実施形態によれば、これらの免疫チェックポイントの阻害剤は、免疫逃避腫瘍細胞を制御するのに有効であり得る。
いくつかの実施形態によれば、治療量の細胞製品または医薬組成物の投与は、腫瘍量を減少させるのに有効である。
一定の範囲の値が提供されるとき、文脈が他を明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間、及び、その述べられた範囲内の他の述べられた値または中間の値における、各々の中間の値は、その下限の単位の１０分の１まで本発明に包含される。独立してより小さな範囲に含まれ得るこれらのより小さい範囲の上限及び下限はまた、述べられた範囲内の任意の具体的に除外された限定を有することを条件として、本発明に包含される。述べられる範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界の両方のいずれかを除外する範囲はまた、本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明の所属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等の任意の方法及び物質はまた、本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法及び物質が記載されている。本明細書において述べられたすべての刊行物は、関連して刊行物が引用されている方法及び／または物質を開示及び記載するための参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上、明らかに別段に解される場合を除き、複数の指示対象を含むことに留意されたい。
本明細書において論じられている刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみが提供されており、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書中のいかなるものも、先行発明のために、本発明がそのような刊行物に先行する権利がないということの承認として解釈されるべきではない。さらに、提示される公開日が、実際の公開日と異なることがあり得、それは、個別に確認する必要がある場合がある。
以下の実施例は、当業者に本発明を以下に作製及び使用するかの完全な開示及び説明を提供するために進められ、本願発明者が彼らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また以下の実験が実施された全部または唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確実にするための努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、そして圧力は大気圧または大気圧付近である。
実施例１．
実施例は、以下に記載される方法を利用するが、これに限定されない。
ウェスタンブロッティング
簡潔に述べると、細胞を冷溶解緩衝液で溶解し、遠心分離して細胞破片をペレット化する。上清のタンパク質濃度は、タンパク質定量アッセイ（例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって決定される。次いで、溶解物の上清を等量の２×ＳＤＳ試料バッファーと合わせ、１００℃で５分間煮沸する。試料バッファー中の等量のタンパク質を分子量マーカーとともにＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのウェルにロードし、１００Ｖで１～２時間電気泳動する。次いで、タンパク質をニトロセルロースまたはＰＶＤＦのメンブレンに転写する。次いで、ＴＢＳＴブロッキングバッファー中の５％脱脂粉乳を使用して、メンブレンを室温で１時間ブロッキングする。次いで、メンブレンをＴＢＳＴブロッキングバッファー中の５％脱脂粉乳中の一次抗体の１：５００希釈液とインキュベートし、続いて２０ｍＭのＴｒｉｓ、Ｐｈ７．５；１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％の Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ） 中で５分間で３回洗浄する。次いで、メンブレンを、ＴＢＳＴブロッキングバッファー中の５％脱脂粉乳で１：２０００に希釈したコンジュゲート二次抗体とともに、室温で１時間インキュベートした後、ＴＢＳＴでそれぞれ５分間３回洗浄する。ブロットの画像は、化学発光検出のための暗室現像技術を使用して、または比色または蛍光検出のための画像スキャン技術を使用して取得される。
リアルタイムＰＣＲ
ｍＲＮＡの発現レベルを分析するために記載されているようにリアルタイムＰＣＲ技術を実施することができる（Ｚｈａｏ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３６０ （２００７） ２０５－２１１）。簡潔に述べると、Ｑｕｉａｇｅｎキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）を使用して細胞から全ＲＮＡを抽出した後、ランダムヘキサマープライマー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ ＭＤ）を使用して第１鎖ｃＤＮＡを合成する。リアルタイムＰＣＲは、Ｍｘ３０００ｐ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、対象のそれぞれの遺伝子に対して検証済みの遺伝子特異的ＲＴ－ＰＣＲプライマーセットを使用して４０サイクル実行される。それぞれの転写産物の相対的な発現レベルは、内部対照としてのハウスキーピング遺伝子ベータアクチンの発現レベルに対して補正されている。
免疫蛍光
簡潔に述べると、接着性腫瘍細胞株バリアント細胞を、加温したＰＢＳで希釈した４％ホルムアルデヒドで、室温で１５分間固定する。固定液を吸引し、細胞をＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄する。細胞を５％ＢＳＡブロッキングバッファーで室温で６０分間ブロッキングする。次いでブロッキングバッファーを吸引し、一次抗体の溶液（例えば、１：１００希釈）を細胞と４℃で一晩インキュベートする。次いで細胞をＰＢＳで３回、それぞれ５分間リンスし、続いて蛍光色素コンジュゲート二次抗体（例えば、１：１０００希釈）の溶液と室温で１～２時間インキュベートする。次いで、細胞をＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄し、蛍光顕微鏡で可視化する。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析は、記載されているように実施することができる（Ｚｈａｏ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，３１２，２４５４ （２００６））。簡潔に述べると、トリプシン／ＥＤＴＡで処理された、または未処理のままにされたかのいずれかの腫瘍細胞株変異細胞は、遠心分離によって収集され、ＰＢＳに再懸濁される。細胞を４％ホルムアルデヒドで、３７℃で１０分間固定する。抗体による細胞外染色の場合、細胞は透過処理されない。細胞内染色では、氷冷した１００％メタノールを、事前に冷却した細胞に最終濃度が９０％メタノールになるように添加し、氷上で３０分間インキュベートして細胞を透過処理する。最初に細胞をインキュベーションバッファーに再懸濁し、一次抗体の希釈液を加えることにより、細胞を免疫染色する。細胞を一次抗体とともに室温で１時間インキュベートした後、インキュベーションバッファーで３回洗浄する。次いで、細胞をコンジュゲート二次抗体の希釈液を含むインキュベーションバッファーに室温で３０分間再懸濁し、続いてインキュベーションバッファーで３回洗浄する。次いで、染色した細胞をフローサイトメトリーで分析する。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
簡潔に述べると、目的のタンパク質に特異的な捕捉抗体をマイクロプレートのウェルにコーティングする。目的のタンパク質を含む標準、対照検体、及び未知のタンパク質を含む試料は、マイクロプレートのウェルにピペットで移され、そこでタンパク質抗原が捕捉抗体に結合する。４回洗浄した後、検出抗体をウェルに１時間添加し、最初のインキュベーション中に捕捉された固定化タンパク質に結合する。過剰な検出抗体を除去し、４回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（二次抗体またはストレプトアビジン）を３０分間添加して、検出抗体に結合させる。さらに４回洗浄して過剰なＨＲＰコンジュゲートを除去した後、基質溶液を暗所で３０分間添加し、酵素によって検出可能な形態（色シグナル）に変換する。マイクロプレートのそれぞれのウェルに停止溶液を加え、反応を停止してから３０分以内に評価する。着色された産物の強度は、元の検体に存在する抗原の濃度に正比例し得る。
ヒト混合リンパ球腫瘍反応（ＭＬＴＲ）試験
混合リンパ球腫瘍反応（ＭＬＴＲ）は、リード候補を最適化するように設計された、すべてヒトのインビトロアッセイである。ＭＬＴＲでは、最適化は、操作された同種異系腫瘍細胞に対するヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の応答の定性的及び定量的評価を通じて達成される。ＭＬＴＲは、フローサイトメトリー及びマスサイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）によって、細胞傷害性によって、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによって、ならびにサイトカインプロファイルによって増殖と分化を測定する。いくつかの実施形態によれば、単一の免疫調節タンパク質を発現する同種異系細胞プールがＭＬＴＲで使用される。いくつかの実施形態によれば、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上の免疫調節タンパク質を発現する同種異系細胞プールがＭＬＴＲで使用される。
基本的なＭＬＴＲの１日の手順は、次のように実行される。
ＰＢＭＣのバイアル（２０ＭＮ細胞）を解凍する。次いで細胞をｄＰＢＳで洗浄する。ＰＭＢＣ細胞は、Ｘ－ＶＩＶＯ（約８ｍｌ）に２．５×１０6細胞／ｍｌで再懸濁される。細胞は、細胞集団の性質を記録するためのフローサイトメトリーによって特徴付けられる。
ＭＬＴＲでの使用は、次のように実行される。
２．５×１０5細胞のＰＢＭＣ（１００μｌのストック）
０．５×１０5の同種異系細胞（１００μｌのストック）、使用時
０．５×１０5の同種異系細胞（１００μｌのストック）。これらの細胞はマイトマイシンＣで不活化される。
陽性対照５０μｌの６×ストック（抗ＣＤ２８／ＣＤ３）
９６ウェル平底での総量３００μｌ－９６ウェルの総量は３６０μｌである。
４日間インキュベートする
Ｌｕｍｉｎｅｘによるサイトカイン分析のために１００μｌが取り出される
ＣｙＴＯＦは残りの２００μｌで実施される。
サイトカインプロファイリングのための上清は、１日後に除去される。
ＣｙＴＯＦは、例えば、Ｂｅｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ． （Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ． ３３２，６ Ｍａｙ ２０１１）及びＢｅｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｎｏｌａｎ（（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． ３０ Ｎｏ． ７，Ｊｕｌｙ ２０１２）に以前に記載されており、これらは両方とも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣｙＴＯＦ染色で使用されるヒトマーカーを以下の表１０に示す。
Figure 2022553411000029
Figure 2022553411000030
Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスアッセイ
Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰテクノロジー（以前のＬａｂＭＡＰ，ＦｌｏｗＭｅｔｒｉｘ）は、異なる比率の赤及び近赤外線フルオロフォアで染色されたポリスチレンビーズ（ミクロスフェア）を分類できるデジタルシグナル処理を使用する。これらの比率は、それぞれのビーズ集団の「スペクトルアドレス」を定義する。その結果、非常に少量の試料体積で、さまざまなビーズ集団に対して最大１００の異なる検出反応を同時に実行できる（Ｅａｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ． Ｒｅｐｏｒｔ ｆｒｏｍ ａ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｏｎ Ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ａｒｒａｙｓ． Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２００２；５０：２３９－２４２；Ｏｌｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９８；４４（９）：２０５７－２０６０；Ｅｉｓｈａｌ ａｎｄ ＭｃＣｏｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３８（４）： ３１７－３２３，Ａｐｒｉｌ ２００６、これらはすべて参照により本明細書にその全体が組み込まれている）。
Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレックスアッセイは市販されており、ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｕｓ／ｅｎ／ｈｏｍｅ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂｉｏｌｏｇｙ／ｐｒｏｔｅｉｎ－ａｓｓａｙｓ－ａｎａｌｙｓｉｓ／ｌｕｍｉｎｅｘ－ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ－ａｓｓａｙｓ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブで説明されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
細胞のマイトマイシンＣ調製
マイトマイシンＣは、乾燥粉末（バイアルあたり２ｍｇ）から４００μｌのＤＭＳＯ（５００×ストック＝５ｍｇ／ｍｌ）を使用して調製し、完全に溶解して２５ｕｌの容量に分注し、－８０℃で保存する。２０μｌの１アリコートを１０ｍｌの加温したＣ５に使用して、１０μｇ／ｍｌ の最終作業溶液を生成する。溶液は濾過滅菌されている。
この溶液は、フラスコ内の再懸濁した細胞または接着細胞に使用できる。
細胞を暗所で３７℃で３０分間インキュベートし、次いで加温したＣ５で３回洗浄する。細胞を１ｍｌのＸ－ＶＩＶＯに再懸濁する。４０ｕｌをカウントしてプレート上の２００ｕｌに入れる。細胞をＸ－ＶＩＶＯ（無血清培地、Ｌｏｎｚａ）に最終濃度１×１０6／ｍｌで再懸濁する。
実施例２
腫瘍細胞株を改変のために選択することができ、組換え免疫調節因子配列のレンチウイルストランスフェクションを使用して、免疫調節因子を細胞のゲノムに安定して組み込むことができる。以下の実施例３は、免疫調節因子を細胞のゲノムに安定して組み込むために使用され得る７つのレンチウイルスベクター（ベクター１、ベクター２、ベクター３、ベクター４、ベクター５、ベクター６、及びベクター７）を記載している。
いくつかの実施形態によれば、２つの組換え免疫調節タンパク質を同時にトランスフェクトし、続いてさらに２つの組換え免疫調節タンパク質を同時にトランスフェクトし、続いて単一の組換え免疫調節タンパク質をトランスフェクトして、合計５つの組換えペプチドを達成することができる。いくつかの実施形態によれば、２つの組換えペプチドを同時にトランスフェクトし、続いて単一の組換えペプチドをトランスフェクトし、続いて単一の組換えペプチドをトランスフェクトし、続いて単一の組換えペプチドをトランスフェクトして、合計５つの組換えペプチドを達成することができる。いくつかの実施形態によれば、単一の組換え免疫調節タンパク質を同時にトランスフェクトし、続いて２つの組換え免疫調節タンパク質を同時にトランスフェクトし、続いて２つの組換え免疫調節タンパク質をトランスフェクトして、合計５つの組換えペプチドを達成することができる。
以下の実施例３は、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞のゲノムに安定して組み込むために使用され得るレンチウイルスベクターを記載する。
レンチウイルスベクター
記載された発明は、原核細胞及び真核細胞で発現され得る２つ以上の免疫調節因子をコードする核酸構築物を提供する。例えば、記載された発明は、２つ以上の免疫調節因子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡベースのベクター）を提供する。さらに、記載された発明は、本明細書に記載されたベクターを作製するための方法、ならびにコードされたポリペプチドの発現のためにベクターを適切な宿主細胞に導入するための方法を提供する。一般に、本明細書で提供される方法は、２つ以上の免疫調節因子をコードする核酸配列を構築することと、配列を発現ベクターにクローニングすることと、を含む。発現ベクターは、宿主細胞に導入するか、またはウイルス粒子に組み込むことができ、そのいずれかを、例えば、がんを治療するために対象に投与することができる。
２つ以上の免疫調節因子をコードするｃＤＮＡまたはＤＮＡ配列は、従来のＤＮＡクローニング及び変異導入法、ＤＮＡ増幅法、及び／または合成法を使用して取得（及び必要に応じて改変）することができる。一般に、２つ以上の免疫調節因子をコードする配列は、発現前に遺伝子改変及び複製の目的でクローニングベクターに挿入することができる。それぞれのコード配列は、インビトロ及びインビボで適切な宿主細胞においてコードされたタンパク質を発現させる目的で、プロモーターなどの制御因子に作動可能に連結することができる。
発現ベクターは、分泌免疫調節因子を産生するために宿主細胞に導入することができる。核酸を生きた細胞に導入するために使用可能な様々な技法が存在する。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の導入に適した技術としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ポリマーベースのシステム、ＤＥＡＥ－デキストラン、ウイルス形質導入、リン酸カルシウム沈殿法などが挙げられる。インビボ遺伝子導入について、リポソーム、ならびにキトサン及びゼラチンなどの天然高分子ベースの送達ビヒクルを含む多くの技術及び試薬も使用することができる。ウイルスベクターもまた、インビボ形質導入に適している。状況によっては、細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体またはリガンドなどの標的化剤を提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスと関連付けられた細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型に指向性のカプシドタンパク質またはその断片、循環中に内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内限局化を標的とし、細胞内半減期を強化するタンパク質を標的とするため、及び／またはそれらの取り込みを促進するために使用され得る。受容体媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２，４４２９－４４３２ （１９８７）；及びＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７，３４１０－３４１４ （１９９０）によって記載される。
必要に応じて、例えば、組み込み配列などの遺伝子送達因子も使用することができる。多数の組み込み配列が当該技術分野で知られている（例えば、Ｎｕｎｅｓ－Ｄｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６：３９１－４０６，１９９８；Ｓａｄｗｏｓｋｉ，Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：３４１－３５７，１９８６；Ｂｅｓｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１２２（３）：３２２－３２５，２００５；Ｐｌａｓｔｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ １５：３２６－３３２，１９９９；Ｋｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３－４３９，２００３を参照されたい）。これらには、リコンビナーゼとトランスポザーゼが含まれる。例としては、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７－４８６，１９８１）、ラムダ（Ｎａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，５４３－５４５，１９７４）、ＦＩｐ （Ｂｒｏａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２９：２２７－２３４，１９８２）、Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：６１０－６１８，１９９０）、ｃｐＣ３１（例えば、Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３５：６６７－６７８，２００４を参照されたい）、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、マリナーファミリーのトランスポサーゼ（Ｐｌａｓｔｅｒｋ ｅｔ ａｌ．、前出）、及びＡＡＶなどのウイルスを組み込むための構成要素、レトロウイルス、及びレトロウイルスまたはレンチウイルスのＬＴＲ配列などのウイルス組み込みを提供する構成要素を有するアンチウイルス、ならびにＡＡＶのＩＴＲ配列（Ｋｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３－４３９，２００３）が挙げられる。
細胞は、例えば、インビトロで培養され得るか、または遺伝子操作され得る。宿主細胞は、健康なヒト、がん患者、私的研究室の寄託物、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関などの公的培養コレクションを含む正常または罹患した対象から、または商業的供給業者から入手することができる。
インビボで２つ以上の免疫調節因子の産生及び分泌に使用することができる細胞としては、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、または顆粒球などの血液細胞、造血幹細胞または前駆細胞（例えば、骨髄から得られる）などのさまざまな幹細胞または前駆細胞、臍帯血、末梢血、胎児肝臓など、及び腫瘍細胞（例えば、ヒト腫瘍細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞型の選択は、治療または予防されている腫瘍または感染症の種類に依存し、当業者によって決定することができる。
異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。レシピエントがその熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）を処理する方法と同様の特定の方法で発現された遺伝子産物を改変及び処理する宿主細胞を選択することができる。
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供されるような発現構築物は、抗原性細胞に導入することができる。本明細書で使用される場合、抗原性細胞は、ウイルスなどのがんを引き起こす感染性因子に感染しているがまだ腫瘍性ではない前腫瘍性細胞、または例えば、ＤＮＡ損傷剤または放射線などの変異誘発物質またはがんを引き起こす薬剤に曝露された抗原性細胞を含むことができる。使用できる他の細胞は、形態または生理学的または生化学的機能によって特徴付けられるように、正常な形態から腫瘍性の形態に移行している前腫瘍性細胞である。いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される発現構築物は、非抗原性細胞、例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ、ＣＩＫ、ＧＤＴ、ＤＣ、ＭＡＩＴ細胞、ならびにＣＤ８＋及び／またはＣＤ４＋ＣＴＬ細胞などのシリアルキラー細胞に導入することができる。
典型的には、本明細書で提供される方法で使用されるがん細胞及び前腫瘍性細胞は、哺乳動物起源のものである。いくつかの実施形態によれば、がん細胞（例えば、ヒト腫瘍細胞）は、本明細書に記載の方法で使用することができる。前腫瘍性病変、がん組織、またはがん細胞に由来する細胞株も使用することができる。がん組織、がん細胞、がんを引き起こす因子に感染した細胞、その他の前腫瘍性細胞、ヒト由来の細胞株などを使用できる。いくつかの実施形態によれば、がん細胞は、非限定的に、確立された非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膀胱癌、黒色腫、卵巣癌、腎細胞癌、前立腺癌、肉腫、乳癌、扁平上皮癌、頭頚部癌、肝細胞癌、すい臓癌、または結腸癌の細胞株などの、確立された腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントから得ることができる。
親細胞株は前出に記載されている。
さらに、いくつかの実施形態によれば、活性化シリアルキラー細胞組成物は、本明細書に記載の様々な方法で使用される場合、患者の免疫系が目的の疾患に対して活性化されることをさらに可能にするアジュバント効果を提供する。
原核生物と真核生物の両方のベクターを、本明細書で提供される方法における２つ以上の免疫調節因子の発現に使用することができる。原核生物ベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ配列に基づく構築物が挙げられる（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９９６，６０：５１２－５３８を参照されたい）。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に使用できる調節領域の非限定的な例としては、ｌａｃ、ｔｒｐ、１ｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７、及び ｌａｍｄａ ＰＬが挙げられる。原核生物発現ベクターの非限定的な例としては、．ｌａｍｄａ．ｇｔ１１などのＡｇｔベクターシリーズ（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ． Ｉ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，” １９８４，（Ｄ． Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．），ｐｐ． ４９－７８，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、及びｐＥＴベクターシリーズ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９９０，１８５：６０－８９）が挙げられ得る。
哺乳動物宿主細胞における外因性免疫調節因子の発現には、さまざまな調節領域を使用することができる。例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルスの長い末端反復（ＲＳＶ－ＬＴＲ）プロモーターを使用できる。哺乳動物細胞で有用であり得る誘導性プロモーターとしては、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳がんウイルスのグルココルチコイド応答性長い末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ）、ｎ－インターフェロン遺伝子、及びｈｓｐ７０遺伝子に関連するプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８９，４９：２７３５－４２；及びＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９０，１０：１６５－７５を参照されたい）。熱ショックプロモーターまたはストレスプロモーターもまた、組換え宿主細胞における融合タンパク質の発現を促進するために有利であり得る。
組織特異性を示し、トランスジェニック動物で利用されている以下の動物調節領域は、特定の組織タイプの腫瘍細胞でも使用できる。膵臓腺房細胞で活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９８４，３８：６３９－６４６；Ｏｒｎｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ １９８６，５０：３９９－４０９；及びＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １９８７，７：４２５－５１５）；膵臓ベータ細胞で活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ １９８５，３１５：１１５－１２２）、リンパ系細胞で活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９８４，３８：６４７－６５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８５，３１８：５３３－５３８；及びＡｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９８７，７：１４３６－１４４４）、精巣、乳房、リンパ球、及びマスト細胞で活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９８６，４５：４８５－４９５）、肝臓で活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ，１９８７，１：２６８－２７６）、肝臓で活性であるα－フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９８５，５：１６３９－１６４８；及びＨａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８７，２３５：５３－５８）；肝臓で活性であるα１－アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ １９８７，１：１６１－１７１）、骨髄細胞で活性であるβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８５，３１５：３３８－３４０；及びＫｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９８６，４６：８９－９４）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９８７，４８：７０３－７１２）；骨格筋で活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ １９８５，３１４：２８３－２８６）、ならびに視床下部で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８６，２３４：１３７２－１３７８）。
発現ベクターはまた、ＳＶ４０ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、免疫グロブリン遺伝子、メタロチオネイン、及びβ－アクチンに見られるものなどの転写エンハンサー因子を含むことができる（Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８７，１５３：５１６－５４４；及びＧｏｒｍａｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９０，１：３６－４７を参照されたい）。さらに、発現ベクターは、１種を超える宿主細胞におけるベクターの維持及び複製、または宿主染色体へのベクターの組み込みを可能にする配列を含むことができる。このような配列としては、複製起点、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメアＤＮＡ、及びテロメアＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、発現ベクターは、本明細書に記載の免疫原性タンパク質をコードするＤＮＡを含む宿主細胞を最初に単離、同定、または追跡するための１つ以上の選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含むことができる。ｇｐ９６－ＩｇとＴ細胞共刺激融合タンパク質の長期にわたる高収量生産のために、哺乳動物細胞での安定した発現が有用であり得る。哺乳動物細胞には多くの選択システムを使用できる。例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９７７，１１：２２３）、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ ａｎｄ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９６２，４８：２０２６）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９８０，２２：８１７）の遺伝子を、それぞれｔｋ－細胞、ｈｇｐｒｔ－細胞またはａｐｒｔ－細胞において使用できる。さらに、代謝拮抗剤耐性は、メトトレキサートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８０，７７：３５６７；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８１，７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８１，７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９８１，１５０：１）；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９８４，３０：１４７）についての選択の基礎として使用できる。ヒスチジノール及びゼオシン（商標）などの他の選択可能なマーカーも使用できる。
いくつかのウイルスベースの発現システムを哺乳動物細胞で使用して、同種異系のＥＮＬＳＴ（商標）細胞を作製することもできる。ＤＮＡウイルスバックボーンを使用するベクターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９７９，１７：７２５）、アデノウイルス（Ｖａｎ Ｄｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９８４，４：１６５３）、アデノ随伴ウイルス（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９８８，６２：１９６３）、及びウシ乳頭腫ウイルス（Ｚｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８２，７９：４８９７）に由来している。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、ドナーＤＮＡ配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三部分リーダー配列に連結され得る。次に、この融合遺伝子は、インビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染した宿主において生存可能で異種産物を発現することができる組換えウイルスをもたらし得る（例えば、Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８４，８１：３６５５－３６５９を参照されたい）。
ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）は、ヒトを含む多くの高等脊椎動物に感染でき、そのＤＮＡはエピソームとして複製される。組換え遺伝子発現のために多くのシャトルベクターが開発されており、哺乳動物細胞では安定したマルチコピー（２０～３００コピー／細胞）の染色体外要素として存在する。典型的には、これらのベクターには、ＢＰＶ ＤＮＡのセグメント（ゲノム全体または６９％の形質転換断片）、広い宿主範囲を持つプロモーター、ポリアデニル化シグナル、スプライスシグナル、選択可能なマーカー、及びベクターがＥ．ｃｏｌｉで増殖できるようにする「無毒」なプラスミド配列が含まれている。細菌での構築及び増幅に続いて、発現遺伝子構築物は、例えば、リン酸カルシウム共沈殿によって、培養された哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。形質転換された表現型を示さない宿主細胞の場合、形質転換体の選択は、ヒスチジノール及びＧ４１８耐性などの優性選択マーカーを使用することによって達成される。
代替的に、ワクシニア７．５Ｋプロモーターを使用することができる（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８２，７９：７４１５－７４１９；Ｍａｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９８４，４９：８５７－８６４；及びＰａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８２，７９：４９２７－４９３１を参照されたい）。ヒト宿主細胞を使用する場合、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）起源（ＯｒｉＰ）及びＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ－１；トランス作用性複製因子）に基づくベクターを使用できる。このようなベクターは、例えば、ＥＢＯ－ｐＣＤ（Ｓｐｉｃｋｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｔｅｃｈ １９９０，２：１４－１８）；ｐＤＲ２及び．ｌａｍｄａ．ＤＲ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）などの広範囲のヒト宿主細胞で使用できる
ＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、レトロウイルスベースの発現システムで作成することもできる。モロニーマウス白血病ウイルスなどのレトロウイルスは、ほとんどのウイルス遺伝子配列を除去して外因性コード配列に置き換えることができ、不足しているウイルス機能をトランスで供給することができるため、使用できる。トランスフェクションとは対照的に、レトロウイルスは、遺伝子を効率的に感染させ、例えば、初代造血細胞を含む広範囲の細胞型に導入することができる。さらに、レトロウイルスベクターによる感染の宿主範囲は、ベクターのパッケージングに使用されるエンベロープの選択によって操作することができる。
例えば、レトロウイルスベクターは、５’長い末端反復（ＬＴＲ）、３’ＬＴＲ、パッケージングシグナル、細菌の複製起点、及び選択可能なマーカーを含むことができる。例えば、ｇｐ９６－Ｉｇ融合タンパク質コード配列は、５’ＬＴＲプロモーターからの転写がクローン化されたＤＮＡを転写するように、５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間の位置に挿入することができる。５’ＬＴＲは、プロモーター（例えば、ＬＴＲプロモーター）、Ｒ領域、Ｕ５領域、及びプライマー結合部位をこの順序で含む。これらのＬＴＲエレメントのヌクレオチド配列は当該技術分野でよく知られている。異種プロモーターならびに複数の薬物選択マーカーもまた、感染細胞の選択を容易にするために発現ベクターに含めることができる。ＭｃＬａｕｃｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９０，３８：９１－１３５；Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９９０，１８：３５８７－３５９６；Ｃｈｏｕｌｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９６，７０：１７９２－１７９８；Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ １９９４，６：２９１－３０２；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９９３，４：１２９－１４１；及びＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖｅｌ １９９３，３：１１０－１１４を参照されたい。
本明細書に記載のクローニング及び発現ベクターのいずれも、当該技術分野で知られている技術を使用して、既知のＤＮＡ配列から合成及び組み立てることができる。調節領域及びエンハンサー因子は、天然と合成の両方の様々な起源のものであり得る。いくつかのベクター及び宿主細胞は、商業的に入手することができる。有用なベクターの非限定的な例は、参照により本明細書に組み込まれるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８８，ｅｄ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈ． Ａｓｓｏｃ． ＆ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅの付録５、ならびにＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．などの商用サプライヤーのカタログに記載される。
組換え免疫調節因子
いくつかの実施形態によれば、２つ以上の免疫調節因子は、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントの細胞へのトランスフェクション（例えば、脂質、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥデキストラン、活性化デンドリマー、磁気ビーズ、エレクトロポレーション、バイオリスティック技術、マイクロインジェクション、レーザーフェクション／オプトインジェクションを介して）のために、または形質導入（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスを介して）のために、２つ以上のプラスミド構築物にクローン化され得る。いくつかの実施形態によれば、それぞれの免疫調節因子タンパク質をコードする組換えＤＮＡは、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントの細胞のゲノムに組み込むためにレンチウイルスベクタープラスミドにクローン化され得る。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子タンパク質をコードする組換えＤＮＡは、抗生物質耐性遺伝子などの選択可能な形質をコードするプラスミドＤＮＡ構築物にクローン化され得る。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子タンパク質をコードする組換えＤＮＡは、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントの細胞においてそれぞれの組換えタンパク質を安定的に発現するよう適応したプラスミド構築物にクローン化され得る。いくつかの実施形態によれば、トランスフェクトまたは形質導入された腫瘍細胞は、クローン拡大されて、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントの細胞のゲノムへのそれぞれの免疫調節因子タンパク質をコードする組換えＤＮＡの均一な組み込み部位を有する細胞株バリアントを達成し得る。
レンチウイルス構築物
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子をコードするＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞への形質導入のためにレンチウイルスベクターにクローン化され得る。いくつかの実施形態によれば、レンチウイルスシステムは、２つ以上の免疫調節因子配列をコードするレンチウイルス導入プラスミド、ＧＡＧ、ＰＯＬ、ＴＡＴ、及びＲＥＶ配列をコードするパッケージングプラスミド、ならびにＥＮＶ配列をコードするエンベローププラスミドを含み得る。いくつかの実施形態によれば、レンチウイルス導入プラスミドは、遺伝子発現のためにウイルスＬＴＲプロモーターを使用する。いくつかの実施形態によれば、レンチウイルス導入プラスミドは、ハイブリッドプロモーターまたは他の特殊なプロモーターを使用する。いくつかの実施形態によれば、レンチウイルス導入プラスミドのプロモーターは、他の免疫調節配列と比較して所望のレベルで２つ以上の免疫調節因子配列を発現するように選択される。いくつかの実施形態によれば、相対レベルは、ｍＲＮＡ転写物としての転写のレベルで測定される。いくつかの実施形態によれば、相対レベルは、タンパク質発現としての翻訳のレベルで測定される。
マルチシストロンプラスミド構築物
いくつかの実施形態によれば、１つ以上の免疫調節因子配列は、第２の免疫調節因子または他の組換え配列との１つの免疫調節因子の共発現のためにマルチシストロン性ベクターにクローン化され得る。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子配列は、単一の転写物からの２つ以上のタンパク質の翻訳を促進するために、ＩＲＥＳエレメントを含むプラスミドにクローン化され得る。いくつかの実施形態によれば、１つ以上の免疫調節因子配列は、自己切断２Ａペプチドの配列を含むマルチシストロン性ベクターにクローン化されて、単一の転写物から２つ以上の外因性免疫調節分子を生成する。
外因性免疫調節分子の遺伝的導入
いくつかの実施形態によれば、組換え免疫調節因子配列を含むプラスミド構築物は、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントにトランスフェクトまたは形質導入され得る。
いくつかの実施形態によれば、最大２５個の免疫調節因子（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個）は、哺乳動物細胞への形質導入のために１０個の別々のベクターにクローン化することができる。いくつかの実施形態によれば、最大２５個の免疫調節因子（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個）は、哺乳動物細胞への形質導入のために１１個の別々のベクターにクローン化することができる。いくつかの実施形態によれば、最大２５個の免疫調節因子（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個）は、哺乳動物細胞への形質導入のために１２個の別々のベクターにクローン化することができる。いくつかの実施形態によれば、１４個以上の免疫調節因子（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個、またはそれ以上）は、哺乳動物細胞への形質導入のために１０個の別々のベクターにクローン化することができる。いくつかの実施形態によれば、１４個以上の免疫調節因子（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個、またはそれ以上）は、哺乳動物細胞への形質導入のために１１個の別々のベクターにクローン化することができる。いくつかの実施形態によれば、１４個以上の免疫調節因子（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個、またはそれ以上）は、哺乳動物細胞への形質導入のために１２個の別々のベクターにクローン化することができる。いくつかの実施形態によれば、１４個以上の免疫調節因子（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個、またはそれ以上）は、哺乳動物細胞への形質導入のために１３個の別々のベクターにクローン化することができる。いくつかの実施形態によれば、１４個以上の免疫調節因子（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４個、またはそれ以上）は、哺乳動物細胞への形質導入のために１４個の別々のベクターにクローン化することができる。
いくつかの実施形態によれば、ベクター構築物は、本明細書に記載されるように、１つ以上のタグをさらに含む。
レンチウイルスシステム
いくつかの実施形態によれば、レンチウイルスシステムを使用することができ、免疫調節因子配列を有する導入ベクター、エンベロープベクター、及びパッケージングベクターがそれぞれ、ウイルス産生のために宿主細胞にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態によれば、レンチウイルスベクターは、リン酸カルシウム沈殿トランスフェクション、脂質ベースのトランスフェクション、またはエレクトロポレーションのいずれかによって２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされ、一晩インキュベートされ得る。免疫調節因子配列が蛍光レポーターを伴う可能性がある実施形態の場合、蛍光についての２９３Ｔ細胞の検査は、一晩のインキュベーション後にチェックされ得る。ウイルス粒子を含む２９３Ｔ細胞の培地は、８～１２時間ごとに２または３回採取し、遠心分離して剥離した細胞及び破片を沈殿させることができる。次いで、培地を直接使用するか、必要に応じて凍結または濃縮することができる。
ＥＮＬＳＴ（商標）細胞腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、標準的な組織培養条件下で約７０％のコンフルエンシーまで増殖させることができる。次いで、細胞を新鮮な培地中で、臭化ヘキサジメトリン（細胞の形質導入を増強するため）及び組換え構築物を含むレンチウイルス粒子で処理し、１８～２０時間インキュベートした後、培地を交換することができる。
脂質ベースのトランスフェクション
いくつかの実施形態によれば、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントのＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、脂質ベースのトランスフェクション法を使用して免疫調節因子配列でトランスフェクトされ得る。いくつかの実施形態によれば、リポフェクタミンなどの確立された脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用することができる。腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、組織培養容器中で、約７０～９０％のコンフルエントまで増殖させることができる。適切な量のリポフェクタミン（登録商標）及び免疫調節因子配列を含むプラスミド構築物を組織培養培地で別々に希釈し、室温で短時間インキュベートすることができる。培地で希釈したリポフェクタミン（登録商標）とプラスミド構築物を一緒に混合し、室温で短時間インキュベートすることができる。次いで、プラスミドとリポフェクタミンの混合物を、組織培養容器中の腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントの細胞に添加し、標準的な組織培養条件下で１～３日間インキュベートすることができる。
発現するクローンの選択
いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子配列でトランスフェクトされた腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントの腫瘍細胞のＥＮＬＳＴ（商標）細胞集団は、様々なレベルの発現のために選択され得る。
いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子配列は、抗生物質耐性遺伝子を伴うことができ、これを使用して、免疫調節因子配列をコードする組換えＤＮＡの安定した組み込みを有するクローンを選択することができる。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子配列は、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性を含むプラスミド構築物にクローニングされ得る。トランスフェクトされた細胞は、製造元のプロトコールに従って毎日培地を交換しながら抗生物質で１～２週間以上処理される。抗生物質処理中のある時点で、抗生物質耐性遺伝子を安定して組み込んでいないすべての細胞の大量の腫瘍細胞死があり、安定して発現するクローンの小さなコロニーが残る。安定して発現しているクローンのそれぞれを選び、別々の組織培養容器で培養し、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡などの確立された方法で免疫調節因子の発現レベルを試験することができる。
いくつかの実施形態によれば、トランスフェクトされたＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）による免疫調節因子の高発現について選択され得る。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子配列は、免疫調節因子の発現を定量化するために使用することができる１つ以上の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）を伴うことができる。例えば、ＩＲＥＳ配列を介してＧＦＰ配列に接続された免疫調節因子配列を含むバイシストロン性プラスミドは、同じ転写物から翻訳された免疫調節因子とＧＦＰタンパク質の両方をもたらす。したがって、ＧＦＰ発現レベルは免疫調節因子の発現レベルの代用として機能する。免疫調節因子／ＧＦＰトランスフェクト腫瘍細胞の単一細胞懸濁液は、蛍光強度に基づいて、ＦＡＣＳによって所望の発現レベルについて選択することができる。この点に関しては、任意の蛍光タンパク質を使用することができる。例えば、次の組換え蛍光タンパク質（ｒＸＦＰ）のいずれかを使用できる：ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ。
代替的に、組換え免疫調節因子の発現は、それぞれの免疫調節因子に特異的であるか、またはそれぞれの免疫調節因子上に操作されたタグに特異的である蛍光抗体によって直接観察され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子配列の細胞外領域は、ＦＬＡＧタグまたはＨＡタグと融合され得る。トランスフェクトされた腫瘍細胞の表面での免疫調節因子の発現を検出するために、抗ＦＬＡＧまたは抗ＨＡ抗体を一次抗体または二次抗体に結合したフルオロフォアとともに使用することができる。所望のレベルの免疫調節因子を発現する腫瘍細胞は、ＦＡＣＳ分取によって選択され、別々に培養され得る。
クローンに新しいプラスミド構築物を逐次的に追加する
いくつかの実施形態によれば、１つ以上の免疫調節因子配列（複数可）を発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、逐次的に安定した発現のために追加の免疫調節因子でトランスフェクトされる。連続的な方法で組換え免疫調節因子を逐次的に追加することにより、いくつかの免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントの細胞を作製することができる。いくつかの実施形態によれば、２つの免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、３つの免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、４つの免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、５つの免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、６つの免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、７つの免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、８つの免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、９つの免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、１０個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、１１個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、１２個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、１３個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、１４個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、１５個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、１６個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、１７個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、１８個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、１９個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、２０個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、２１個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、２２個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、２３個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、２４個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、２５個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、２６個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、２７個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、２８個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、２９個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。いくつかの実施形態によれば、３０個の免疫調節因子を同時に発現する腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製することができる。
可変的に発現するクローン
開示された発明の一態様によれば、複数の組換え免疫調節ペプチドは、単一のクローン由来の腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントで発現され得る。いくつかの実施形態によれば、それぞれの細胞で発現される個々の免疫調節因子の量（またはレベル）は、他のすべての免疫調節因子ペプチドの発現レベルと同じである。しかしながら、いくつかの実施形態によれば、それぞれの細胞で発現される個々の免疫調節因子のレベルは、細胞で発現される他の免疫調節因子の発現レベルと異なる。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の同じ補体を発現するクローン由来の腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントは、それらの免疫調節因子を互いに変動する量で安定して発現する。
クローン由来のそれぞれの腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアント内、及び腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアント間で発現される組換え免疫調節因子の相対量は、転写または翻訳のレベルで測定することができる。例えば、組換え免疫調節因子の相対量は、とりわけ、ウエスタンブロット、ＲＴ－ＰＣＲ、フローサイトメトリー、免疫蛍光抗体法、及びノーザンブロットによって定量化することができる。
いくつかの実施形態によれば、発現された免疫調節因子の量の相互の違いは、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントのゲノムの、より高い転写活性領域またはより低い転写活性領域へのランダムな組み込みの結果であり得る。いくつかの実施形態によれば、発現される免疫調節因子の量の相対的な差異は、腫瘍細胞株または腫瘍細胞株バリアントを作製するために使用されるトランスフェクトまたは形質導入されたＤＮＡに操作される因子によって達成され得る。
例えば、いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子の発現レベルは、免疫調節因子遺伝子の発現を制御するために、より強いまたはより弱い遺伝子プロモーター配列を操作することによって、転写レベルで達成され得る。いくつかの実施形態によれば、次のプロモーターの１つ以上を使用して、免疫調節因子の発現を制御することができる：シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ヒト伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１Ａ）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター（ＰＧＫ）、及びＣＭＶ初期エンハンサーと結合したニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧＧ）。
いくつかの実施形態によれば、外因性免疫調節分子の発現レベルは、免疫調節因子の転写物の開始コドン付近により強いまたはより弱いコザックコンセンサス配列を操作することによって、翻訳レベルで達成され得る。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の翻訳を制御するために、次のヌクレオチド配列を提供することができる：ＧＣＣＧＣＣ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号１５）。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の翻訳を制御するために、配列番号１５と少なくとも６０％同一である配列を提供することができる。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の翻訳を制御するために、配列番号１５と少なくとも７０％同一である配列を提供することができる。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の翻訳を制御するために、配列番号１５と少なくとも８０％同一である配列を提供することができる。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の翻訳を制御するために、配列番号１５と少なくとも９０％同一である配列を提供することができる。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の翻訳を制御するために、配列番号１５と少なくとも９５％同一である配列を提供することができる。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の翻訳を制御するために、配列番号１５と少なくとも９６％同一である配列を提供することができる。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の翻訳を制御するために、配列番号１５と少なくとも９７％同一である配列を提供することができる。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の翻訳を制御するために、配列番号１５と少なくとも９８％同一である配列を提供することができる。いくつかの実施形態によれば、免疫調節因子の翻訳を制御するために、配列番号１５と少なくとも９９％同一である配列を提供することができる。
非ウイルスアプローチはまた、腫瘍または腫瘍細胞株またはバリアントを有する患者に由来する細胞への１つ以上の免疫調節分子をコードするベクターの導入のために使用され得る。例えば、免疫調節分子をコードする核酸分子は、リポフェクション（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１：５１２，１９８３、アシアロロソムコイド－ポリリジンコンジュゲーション（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４：１６９８５，１９８９）の存在下で核酸分子を投与することによって、または外科的条件下でのマイクロインジェクション（Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５，１９９０）によって、細胞に導入することができる。好ましくは、核酸は、リポソーム及びプロタミンと組み合わせて投与される。
インビトロでトランスフェクションを達成するための方法には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、及びプロトプラスト融合の使用が含まれる。リポソームはまた、細胞へのＤＮＡの送達に潜在的に有益であり得る。
いくつかの実施形態によれば、その機能が遺伝子操作によって改変された免疫調節因子は、特許請求される発明の範囲内に含まれることが意図されている。例えば、免疫調節因子は、遺伝子操作によって改変されて、シグナル配列を変化させて免疫調節因子産物を分泌産物にすることができ、膜における免疫調節因子の安定性を高めることができ、重要なアミノ酸を変更することができ、またはヒトのための配列をコドン最適化することができる。そのような改変はすべて、特許請求された発明の範囲内に含まれる。
以下の実施例３は、免疫調節因子を細胞のゲノムに安定的に組み込むために使用され得る４７個のレンチウイルスベクター（ベクター４４、ベクター９７、ベクター８４、ベクター２９、ベクター１０７、ベクター１１６、ベクター８６、ベクター１８、ベクター１７、ベクター９８、ベクター５、ベクター３０、ベクター１０９、ベクター３、ベクター４、ベクター１０６、ベクター１６、ベクター８３、ベクター３１、ベクター１２、ベクター９９、ベクター１２１、ベクター１０５、ベクター３２、ベクター３７、ベクター２２、ベクター１９、ベクター２０、ベクター８９、ベクター２１、ベクター２３、ベクター１０８、ベクター１５、ベクター１２４、ベクター６５、ベクター６４、ベクター８８、ベクター９６、ベクター１４、ベクター１１９、ベクター１２０、ベクター４５、ベクター６０、ベクター５９、ベクター８、ベクター１２８、ベクター３５、及びベクター６）を記載する。
いくつかの実施形態によれば、ベクター４４は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター２９は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１８は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１７は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター５は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１６は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター９９は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１５は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１４は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター４５は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター６は、１つ以上のＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のＴＮＦファミリー免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
いくつかの実施形態によれば、ベクター４４は、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター２９は、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１８は、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１７は、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター５は、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１６は、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター９９は、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１５は、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１４は、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター４５は、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター６は、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、３～２５個の、包括的なＴＮＦファミリーメンバー免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
いくつかの実施形態によれば、ベクター９７は、１つ以上のＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８４は、１つ以上のＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１０７は、１つ以上のＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター９８は、１つ以上のＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター３０は、１つ以上のＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８３は、１つ以上のＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２１は、１つ以上のＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１１９は、１つ以上のＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のＩｇファミリーメンバー免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
いくつかの実施形態によれば、ベクター９７は、３～２５個の、包括的なＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８４は、３～２５個の、包括的なＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１０７は、３～２５個の、包括的なＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター９８は、３～２５個の、包括的なＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター３０は、３～２５個の、包括的なＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８３は、３～２５個の、包括的なＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２１は、３～２５個の、包括的なＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１１９は、３～２５個の、包括的なＩｇファミリーメンバー免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、３～２５個の、包括的なＩｇファミリーメンバー免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
いくつかの実施形態によれば、ベクター１１６は、１つ以上のケモカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のケモカイン免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
いくつかの実施形態によれば、ベクター１１６は、３～２５個の、包括的なケモカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、３～２５個の、包括的なケモカイン免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
いくつかの実施形態によれば、ベクター１０９は、１つ以上の増殖因子免疫調節因子を含む。
いくつかの実施形態によれば、ベクター１０９は、３～２５個の、包括的な増殖因子免疫調節因子を含む。
いくつかの実施形態によれば、ベクター３は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター４は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター３２は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター２２は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１９は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター２０は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８９は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター２１は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター２３は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２１は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター６５は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター６４は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８８は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター９６は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター６０は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター５９は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２８は、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のサイトカイン免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
いくつかの実施形態によれば、ベクター３は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター４は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター３２は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター２２は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１９は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター２０は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８９は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター２１は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター２３は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２１は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター６５は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター６４は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８８は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター９６は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター６０は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター５９は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２８は、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、３～２５個の、包括的なサイトカイン免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
いくつかの実施形態によれば、ベクター３７は、１つ以上の受容体免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２４は、１つ以上の受容体免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８８は、１つ以上の受容体免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８は、１つ以上の受容体免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上の受容体免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
いくつかの実施形態によれば、ベクター３７は、３～２５個の、包括的な受容体免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２４は、３～２５個の、包括的な受容体免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８８は、３～２５個の、包括的な受容体免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター８は、３～２５個の、包括的な受容体免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、３～２５個の、包括的な受容体免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
いくつかの実施形態によれば、ベクター８６は、１つ以上のその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１０６は、１つ以上のその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１０７は、１つ以上のその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター３１は、１つ以上のその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２は、１つ以上のその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１０５は、１つ以上のその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１０８は、１つ以上のその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２０は、１つ以上のその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター３５は、１つ以上のその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、１つ以上のその他の免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
いくつかの実施形態によれば、ベクター８６は、３～２５個の、包括的なその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１０６は、３～２５個の、包括的なその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１０７は、３～２５個の、包括的なその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター３１は、３～２５個の、包括的なその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２は、３～２５個の、包括的なその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１０５は、３～２５個の、包括的なその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１０８は、３～２５個の、包括的なその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター１２０は、３～２５個の、包括的なその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、ベクター３５は、３～２５個の、包括的なその他の免疫調節因子を含む。いくつかの実施形態によれば、３～２５個の、包括的なその他の免疫調節因子は、表６または表７に列挙されているものから選択される。
開示された発明の一実施形態によれば、それぞれが単一の免疫調節タンパク質を発現する同種異系細胞プールの組み合わせを使用して、複数の免疫調節タンパク質を発現する単一の細胞が行う可能性があること（例えば、相加性、相乗効果、干渉）をモデル化する。
実施例３．
使用されるコアレンチウイルスベクターの概略図を図１に示す。プロモーターはヒト伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーターであり、配列内リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）は脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来する。コアベクターについては、以下で詳しく説明する。
ベクター１。免疫調節因子：ｓｃＦｖ－抗－ビオチン－Ｇ３ヒンジ－ｍＩｇＧ１（表面ＩｇＧを生成するため）。免疫調節因子ｓｃＦｖ－抗ビオチン－Ｇ３ヒンジ－ｍＩｇＧ１に使用されるベクター１の構成の概略図を図２に示す。以下の表１１は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネーム、及び説明を示している。
Figure 2022553411000031
Figure 2022553411000032
ベクター１を使用する場合、フロー検出には抗ＩｇＧが使用される。二次検出法としてビオチン＋蛍光標識オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を使用している。以下は、免疫調節因子ｓｃＦｖ－抗－ビオチン－Ｇ３ヒンジ－ＩｇＧ１－Ｔｍの説明である。
タイプ：免疫グロブリン
アノテーション：
・Ｈ７重鎖リーダー
・抗ビオチン可変重鎖（ＶＨ）により、ＣｐＧで標識されたビオチンをロードできる
・ドメイン間ジスルフィド結合ＶＨ４４（Ｇ－＞Ｃ）及びＶＬ１００（Ｇ－＞Ｃ）
・ＦｃｙＲ相互作用を強化するＩｇＧ３ヒンジ
・リンケージは標準である
・ＦｃｙＲ／ＦｃＲｎとの相互作用及び膜固定に使用されるＩｇＧ１（ＣＨ２－ＣＨ３－Ｔｍ－Ｃｙｔ）
・ＦｃＲｎとＦｃｙＲの相互作用を強化するＴ２３３Ａ変異
ベクター２。免疫調節因子：全長抗ビオチン－Ｇ３ヒンジ－ｍＩｇＧ１（重鎖／ｉｒｅｓ／軽鎖を使用）
免疫調節因子の全長抗ビオチン－Ｇ３ヒンジ－ｍＩｇＧ１に使用されるベクター２の構成の概略図を図３に示す。ベクター２はバイシストロン性である。
以下の表１２は、ベクターコンポーネントの名称、配列番号４８の対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000033
Figure 2022553411000034
ベクター２を使用する場合、フロー検出には抗ＩｇＧが使用される。二次検出法としてビオチン＋蛍光標識ＯＤＮを使用している。
以下は、免疫調節因子全長抗ビオチン－Ｇ３ヒンジ－ｍＩｇＧ１（重鎖／ｉｒｅｓ／軽鎖を使用）の説明である。
タイプ：膜固定免疫グロブリン
アノテーション：
・Ｈ７重鎖リーダー
・ＦｃｙＲ相互作用を強化するＩｇＧ３ヒンジ
・ＦｃＲｎとＦｃｙＲの相互作用を強化するＴ２３３Ａ変異
・抗ビオチン可変Ｈにより、ＣｐＧで標識されたビオチンをロードできる
・ＣＨ１（ジェネリック）
・ＬＣ可変（ヒトラムダ可変）
・ラムダ由来のＬＣ定常領域１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０ＣＧ０４）
・間ジスルフィド結合ＶＨ４４（Ｇ－＞Ｃ）及びＶＬ１００（Ｇ－＞Ｃ）（ｒｅｆ）
・リンケージは標準である
・ＦｃｙＲ／ＦｃＲｎとの相互作用及び膜固定のためのＩｇＧ１（ＣＨ２－ＣＨ３－Ｔｍ－Ｃｙｔ）
ベクター３。免疫調節因子：ｓＧＭ－ＣＳＦ／ｉｒｅｓ／ｍＦＬＴ３Ｌ
免疫調節因子のｓＧＭ－ＣＳＦ／ｉｒｅｓ／ｍＦＬＴ３Ｌに使用されるベクター３の構成の概略図を図４に示す。ベクター３はバイシストロン性である。以下の表１３は、ベクターコンポーネントの名称、配列番号４９の対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000035
Figure 2022553411000036
ベクター３を使用する場合、フロー検出には抗ＦＬＴ３Ｌが使用される。最高の表面ＦＬＴ３Ｌを発現するものは最高の分泌ＧＭ－ＣＳＦ発現を示す。
以下は、免疫調節因子ｓＧＭ－ＣＳＦ／ｉｒｅｓ／ｍＦＬＴ３Ｌの説明である。
タイプ： サイトカイン、増殖、及び分化因子
アノテーション： 野生型配列
ベクター４。免疫調節因子：ｓＦＬＴ３Ｌ／ｉｒｅｓ／（ＦＬＴ３シグナル－ＧＭ－ＣＳＦ－Ｔｍ）
免疫調節因子のｓＦＬＴ３Ｌ／ｉｒｅｓ／（ＦＬＴ３シグナル－ＧＭ－ＣＳＦ－Ｔｍ）に使用されるベクター４の構成の概略図を図５に示す。ベクター４はバイシストロン性である。以下の表１４は、ベクターコンポーネントの名称、配列番号５０の対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000037
Figure 2022553411000038
ベクター４を使用する場合、フロー検出には抗ＧＭ－ＣＳＦが使用される。最高の表面ＧＭＣＳＦを発現するものは最高の分泌ＦＬＴ３Ｌ発現を示す。
以下は、免疫調節因子ｓＦＬＴ３Ｌ／ｉｒｅｓ／（ＦＬＴ３シグナル－ＧＭ－ＣＳＦ－Ｔｍ）の説明である。
タイプ：サイトカイン、増殖、及び分化因子
アノテーション：野生型配列
ベクター５。免疫調節因子：ｍＣＤ４０Ｌ
免疫調節因子のｍＣＤ４０Ｌに使用されるベクター５の構成の概略図を図６に示す。ベクター５はモノシストロン性である。以下の表１５は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000039
Figure 2022553411000040
ベクター５を使用する場合、フロー検出には抗ＣＤ４０Ｌが使用される。
以下は、免疫調節因子ｍＣＤ４０Ｌの説明である。
タイプ：ＴＮＦタイプＩＩ膜貫通タンパク質
アノテーション：切断不可能なバージョンを作成するために導入された変異
ベクター６。免疫調節因子：ｍＴＮＦａｌｐｈａ（ＴＮＦａ）
免疫調節因子のｍＴＮＦαに使用されるベクター６の構成の概略図を図７に示す。ベクター６はモノシストロン性である。以下の表１６は、ベクターコンポーネントの名称、配列番号５２の対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000041
Figure 2022553411000042
ベクター６を使用する場合、フロー検出には抗ＴＮＦαが使用される。
以下は、免疫調節因子ｍＴＮＦαの説明である。
タイプ：ＴＮＦタイプＩＩ膜貫通タンパク質
アノテーション：切断不可能なバージョンを作成するために変異が導入された
ベクター７。免疫調節因子：ｍＲＡＮＫＬ／ｉｒｅｓ／ＦＬＴ３シグナル－Ｖ５－ｓｃＦＶ抗ビオチン－Ｔｍ
免疫調節因子のｍＲＡＮＫＬ ／ｉｒｅｓ／ＦＬＴ３シグナル－Ｖ５－ｓｃＦＶ抗－ビオチン－Ｔｍに使用されるベクター７の構成の概略図を図８に示す。以下の表１７は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000043
Figure 2022553411000044
ベクター７を使用する場合、フロー検出には抗ＲＡＮＫＬが使用される。抗Ｖ５ ｍＡｂは、二次検出方法として使用される。
以下は、免疫調節因子 ｍＲＡＮＫＬ／ｉｒｅｓ／ＦＬＴ３シグナル－Ｖ５－ｓｃＦＶ抗－ビオチン－Ｔｍの説明である。
タイプ：ＴＮＦタイプＩＩ膜貫通タンパク質
アノテーション：野生型配列
ベクター４４。
図９はベクター４４の概略図を示す。
以下の表１８は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000045
ベクター９７。
図１０はベクター９７の概略図を示す。
以下の表１９は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000046
ベクター８４。
図１１はベクター８４の概略図を示す。
以下の表２０は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000047
ベクター２９。
図１２はベクター２９の概略図を示す。
以下の表２１は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000048
ベクター１０７。
図１３はベクター１０７の概略図を示す。
以下の表２２は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000049
ベクター１１６
図１４はベクター１１６の概略図を示す。
以下の表２３は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000050
ベクター８６
図１５はベクター８６の概略図を示す。
以下の表２４は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000051
ベクター１８
図１６はベクター１８の概略図を示す。
以下の表２５は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000052
ベクター１７
図１７はベクター１７の概略図を示す。
以下の表２６は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000053
ベクター９８
図１８はベクター９８の概略図を示す。
以下の表２７は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000054
ベクター３０
図１９はベクター３０の概略図を示す。
以下の表２８は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000055
ベクター１０９
図２０はベクター１０９の概略図を示す。
以下の表２９は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000056
ベクター１０６
図２１はベクター１０６の概略図を示す。
以下の表３０は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000057
ベクター１６
図２２はベクター１６の概略図を示す。
以下の表３１は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000058
ベクター８３
図２３はベクター８３の概略図を示す。
以下の表３２は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000059
ベクター３１
図２４はベクター３１の概略図を示す。
以下の表３３は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000060
ベクター１２
図２５はベクター１２の概略図を示す。
以下の表３４は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000061
ベクター９９
図２６はベクター９９の概略図を示す。
以下の表３５は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000062
ベクター１２１
図２７はベクター１２１の概略図を示す。
以下の表３６は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000063
ベクター１０５
図２８はベクター１０５の概略図を示す。
以下の表３７は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000064
ベクター３２
図２９はベクター３２の概略図を示す。
以下の表３８は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000065
ベクター３７
図３０はベクター３７の概略図を示す。
以下の表３９は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000066
ベクター２２
図３１はベクター２２の概略図を示す。
以下の表４０は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000067
ベクター１９
図３２はベクター１９の概略図を示す。
以下の表４１は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000068
ベクター２０
図３３はベクター２０の概略図を示す。
以下の表４２は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000069
ベクター８９
図３４はベクター８９の概略図を示す。
以下の表４３は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000070
ベクター２１
図３５はベクター２１の概略図を示す。
以下の表４４は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000071
ベクター２３
図３６はベクター２３の概略図を示す。
以下の表４５は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000072
ベクター１０８
図３７はベクター１０８の概略図を示す。
以下の表４６は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000073
ベクター１５
図３８はベクター１５の概略図を示す。
以下の表４７は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000074
ベクター１２４
図３９はベクター１２４の概略図を示す。
以下の表４８は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000075
ベクター６５
図４０はベクター６５の概略図を示す。
以下の表４９は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000076
ベクター６４
図４１はベクター６４の概略図を示す。
以下の表５０は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000077
ベクター８８
図４２はベクター８８の概略図を示す。
以下の表５１は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000078
ベクター９６
図４３はベクター９６の概略図を示す。
以下の表５２は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000079
ベクター１４
図４４はベクター１４の概略図を示す。
以下の表５３は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000080
ベクター１１９
図４５はベクター１１９の概略図を示す。
以下の表５４は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000081
ベクター１２０
図４６はベクター１２０の概略図を示す。
以下の表５５は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000082
ベクター４５
図４７はベクター４５の概略図を示す。
以下の表５６は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000083
ベクター６０
図４８はベクター６０の概略図を示す。
以下の表５７は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000084
ベクター５９
図４９はベクター５９の概略図を示す。
以下の表５８は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000085
ベクター８
図５０はベクター８の概略図を示す。
以下の表５９は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000086
ベクター１２８
図５１はベクター１２８の概略図を示す。
以下の表６０は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000087
ベクター３５
図５２はベクター３５の概略図を示す。
以下の表６１は、ベクターコンポーネントの名称、対応するヌクレオチド位置、コンポーネントのフルネームと説明を示している。
Figure 2022553411000088
実施例４． インビトロ活性化のための初代ヒト混合リンパ球腫瘍反応（ＭＬＴＲ）試験
同種異系ヒト黒色腫細胞株（ＳＫ－ＭＥＬ２）に由来するＥＮＬＳＴ（商標）細胞は、以下のプロセスにより、コアの３つの必須ヒト免疫調節因子ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）を発現するように遺伝子操作されている。
安定して発現される免疫調節分子をコードする外因性核酸を含み、免疫調節分子がＯＸ４０Ｌであるベクター１４は、生きている５Ｋ－ＭＥＬ２腫瘍細胞の集団に導入される。安定して発現される免疫調節分子をコードする外因性核酸を含み、免疫調節分子がＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）であるベクター１８は、生きている５Ｋ－ＭＥＬ２腫瘍細胞の第２の集団に導入される。安定して発現される免疫調節分子をコードする外因性核酸を含み、免疫調節分子がＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）であるベクター３０は、生きている５Ｋ－ＭＥＬ２腫瘍細胞の第３の集団に導入される。生きている５Ｋ－ＭＥＬ－２腫瘍細胞の第４の集団は、安定して発現されるＯＸ４０Ｌをコードする外因性核酸を含むベクター１４、安定して発現されるＣＤ７０をコードする外因性核酸を含むベクター１８、及び安定して発現されるＣＤ２８Ｌをコードする外因性核酸含むベクター３０で形質導入またはトランスフェクトされる。得られた生きている５Ｋ－ＭＥＬ２腫瘍細胞は、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、及びＣＤ２８Ｌを安定して発現する（以下「１４－１８－３０」）。
同じプロセスを使用して、Ｒとして指定された免疫調節因子の１つ以上の追加のサブセットを導入することができ、それぞれのサブセットは３～２５個の包括的免疫調節因子を含む。
腫瘍細胞株バリアントは、免疫原性量の免疫調節分子の外因性サブセットを安定して発現する腫瘍細胞クローンを選択することによって生成される。クローン由来の細胞株バリアントは、混合リンパ球腫瘍細胞反応（ＭＬＴＲ）において、細胞増殖、細胞サブセット分化、サイトカイン放出プロファイル、及び腫瘍細胞溶解から選択される１つ以上のパラメーターによって選択される。選択されたクローン由来の細胞株バリアントは、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞（ＤＣ）、またはＢリンパ球のうちの１つ以上の活性化を刺激するのに効果的である。
同種異系の遺伝子操作されたＳＫ－ＭＥＬ２腫瘍細胞株は、一次及び二次ＭＬＴＲアッセイによって免疫調節能について試験される。
ＳＫ－ＭＥＬ２ ＥＮＬＳＴ（商標）細胞、ならびに ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７リガンド、及びＣＤ２８リガンドの免疫調節因子を同時に発現するように遺伝子操作されたＳＫ－ＭＥＬ２ ＥＮＬＳＴ（商標）細胞 によるＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０－Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、またはＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）の安定した発現は、発現した免疫調節分子に応答して増殖するＰＢＭＣの１つ以上の亜集団を誘導し、腫瘍細胞を殺傷するためのエフェクター段階に入るのに効果的である。
一次ＭＬＴＲアッセイ。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、健常人の末梢血及びがん患者から得られ、血液細胞はＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ勾配を使用して分離される。抗凝固剤で処理された血液は、赤血球の凝集を減らすために、ＰＢＳ／ＥＤＴＡで１：２から１：４の範囲で希釈される。次いで、希釈された血液は、混合せずに、遠心分離管内のＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ溶液の上に層状にされる。層状の血液／Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅは、遠心ブレーキを使用せずに、４００×ｇで１８℃～２０℃で４０分間遠心分離され、上から下までに、血漿を含む第１の画分、単核球を含む第２の画分、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ培地を含む第３の画分、顆粒球と赤血球を含む第４の画分を含む、血液画分が形成される。単核球を含む画分は、さらなる処理のために選択される。
トランスフェクトされたＥＮＬＳＴ（商標）細胞及び親腫瘍細胞株ＳＫ－ＭＥＬ２（対照）のそれぞれの細胞を、標準的な組織培養条件下で最大２８日間ＰＢＭＣと共培養した後、免疫細胞増殖、フローサイトメトリー及びＣｙＴＯＦで測定される免疫細胞分化、サイトカイン放出プロファイル、及びＬＤＨ放出アッセイで測定される細胞傷害性を評価する。
ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化及び拡大に対する免疫調節因子ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７リガンド、及びＣＤ２８リガンドの１つ以上をコードする組換えＤＮＡ配列でトランスフェクトまたは形質導入されたＳＫＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞とＰＢＭＣを接触させる効果を決定するために実験を実施した。親細胞株ＳＫＭＥＬ２は、ＯＸ４０Ｌをコードするベクター１４（「１４」）、ＣＤ２７リガンドのみをコードするベクター１８（「１８」）、ＣＤ８０とＣＤ８６のみを含むＣＤ２８リガンドをコードする ベクター３０（「３０」）、ならびにベクター１４、１８、及び ３０（「１４－１８－３０」）で改変された。ＥＮＬＳＴ（商標）細胞の免疫刺激効果の機能的特徴づけは、実施例１に記載されているように、一次ＭＬＴＲアッセイを使用して実施された。ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖はフローサイトメトリーによって測定された。腫瘍細胞の殺傷は９日目に観察された。
図５３Ａ及び５３Ｂは、混合リンパ球腫瘍反応アッセイにおいて、親株ＳＫＭＥＬ２（図５３Ａ）ならびに免疫調節因子１４、１８、３０を含むＳＫＭＥＬ－２（図５３Ｂ）を、ＰＢＭＣとインキュベートした後のサイズ及び粒度のフローサイトメトリーフォワード（ＦＳＣ）及びサイドスキャッター（ＳＳＣ）のプロットを示す。図５３Ａ及び図５３Ｂにおける楕円形はリンパ球ゲートを示す。図５３Ｃ及び図５３Ｄは、混合リンパ球腫瘍応答アッセイにおいて、親細胞株（図５３Ｃ）ならびに免疫調節因子ＯＸ４０リガンド（ベクター１４）、ＣＤ２７リガンド（ベクター１８）、及びＣＤ２８リガンド（ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むベクター３０）をコードする組換えＤＮＡ配列でトランスフェクトまたは形質導入されたＳＫＭＥＬ２（図５３Ｄ）とのＰＢＭＣのインキュベーション後のＣＤ８集団を示す。グラフの下のパネルにある点線の円は、ＣＤ８ゲートを示す。親細胞株（ＳＫＭＥＬ－２）との共インキュベーション後のＰＢＭＣには、ほぼ同数のＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞が存在する。フローサイトメトリーでは誘導は観察されず、腫瘍細胞の殺傷は観察されなかった。免疫調節因子ＯＸ４０リガンド（ベクター１４）、ＣＤ２７リガンド（ベクター１８）、及びＣＤ２８リガンド（ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むベクター３０）を発現するよう操作されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞との共培養後のＰＢＭＣでは、大幅に増加した数のＣＤ８＋Ｔ細胞が存在する。フローサイトメトリーで測定するとき、１４－１８－３０の同時発現を含むＥＮＬＳＴとの共培養後のＰＢＭＣでは、未改変の親細胞株との共培養後のＰＢＭＣと比較して２対数多い数の活性化ＣＤ８＋細胞を発現した。ＣＤ８＋Ｔ細胞のこの大幅な増加は、３つのシグナルすべてが同時に送達される場合にのみ明らかであり、それぞれのシグナル（すなわち、ＯＸ４０リガンド単独、ＣＤ２７リガンド単独、及びＣＤ２８リガンド単独）が個別に送達される場合には存在しないため、これまで認識されていなかった相乗的シグナル伝達の例を提供する。
実施例５． ＳＫ－ＭＥＬ－２由来のＥＮＬＳＴ（商標）細胞によるＰＢＭＣリンパ球集団誘導の特性評価
ナイーブＰＢＭＣは、未改変のＳＤ－ＭＥＬ－２細胞）（「ＳＫ」）（対照）と共培養するか、１４－１８－３０ を発現するように遺伝子操作されたＳＫ－ＭＥＬ－２ＥＮＬＳＴ（商標）細胞で活性化され、細胞集団の構成が９日目に評価された。
一次ＭＬＴＲ－ＰＢＭＣ刺激（誘導期）。結果を図５４Ａ及び図５４Ｂに示す。９日目に、ＰＢＭＣは未改変の５Ｋ－ＭＥＬ２（ＳＫ）細胞（対照）（図５４Ａ）または遺伝子操作された１４－１８－３０ ５Ｋ－ＭＥＬ２ＥＮＬＳＴ（商標）細胞（「活性化細胞」）（図５４Ｂ）で誘導された。図５４Ａは、未改変の親５Ｋ－ＭＥＬ－２細胞で誘導された９日目のＰＢＭＣを示す。図５４Ａに示すように、リンパ球集団は、未改変の腫瘍細胞に反応して拡大することも、それらを溶解することもない。図５４ＢはＳＫ－ＭＥＬ－２由来のＥＮＬＳＴ（商標）細胞で誘導された９日目のＰＢＭＣを示す。左、顕微鏡、右、フローサイトメトリー。、図５４Ａのフローサイトメトリーにおける楕円形の輪郭は、生細胞の未改変のＳＫＭＥＬ２親腫瘍細胞に対応する。図５４Ｂにおける矢印は、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞が誘導されたＰＢＭＣによって排除されることを示す。
実施例６． インビトロ活性化後のＭＮＣの殺腫瘍特性の特性評価
１４－１８－３０を発現するように遺伝子操作されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞はＳＫ黒色腫細胞に由来するため、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞によって他の黒色腫細胞株、未改変の黒色腫細胞株、及び非黒色腫細胞株に対して活性化されたＰＢＭＣの細胞溶解活性が評価された。
二次ＭＬＴＲアッセイ。二次エフェクターアッセイを使用して、フローサイトメトリーにより、インビトロ活性化後のＭＮＣの殺腫瘍特性を評価した。ＰＢＭＣ は、親細胞株ＳＫ－ＭＥＬ－２、ならびに５Ｋ－ＭＥＬ－２とは異なる２つの無関係な黒色腫細胞株（ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞株及びＭ１４細胞株）に対して試験された。未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２８及び未改変のＭ１４は、ＳＫ－ＭＥＬ－２由来の活性化ＰＢＭＣがナイーブである第三者である細胞株を表している。
サイズ及び粒度のフローサイトメトリーのフォワード（ＦＳＣ）及びサイドスキャッター（ＳＳＣ）プロットによる結果を図５５Ａ、５５Ｂ、５５Ｃ、５５Ｄ、５５Ｅ、及び５５Ｆに示す。図５５Ａ、図５５Ｃ、及び図５５Ｅは、未改変の腫瘍標的に対するＰＢＭＣの細胞溶解を評価する５日目の二次混合リンパ球腫瘍応答アッセイを示す。図５５Ａは、未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２細胞と以前にインキュベートされたＰＢＭＣが未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２細胞を溶解しないことを示している。図５５Ｃは、未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２細胞と以前にインキュベートされたＰＢＭＣが未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞を溶解しないことを示している。図５５Ｅは、未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２細胞とインキュベートしたＰＢＭＣが未改変のＭ１４細胞を溶解しないことを示している。図５５Ｂ、図５５Ｄ、及び図５５Ｆは、以下と共培養したＳＫ－ＭＥＬ－２由来の１４－１８－３０ＥＮＬＳＴ（商標）細胞活性化ＭＮＣを用いた５日目の二次混合リンパ球腫瘍応答アッセイを示す。図５５Ｂ、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞と予め共培養したＰＢＭＣは未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２細胞を溶解する。図５５Ｄ、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞と予め共培養したＰＢＭＣは未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞を溶解する。図５５Ｆ、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞と予め共培養したＰＢＭＣは未改変のＭ１４細胞を溶解する。したがって、細胞溶解活性は、遺伝子操作されたＥＮＬＳＴ（商標）腫瘍細胞株による前処理に依存していた。
したがって、未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２細胞、ＳＫ－ＭＥＬ－２８細胞、またはＭＬ１４細胞は、ＰＢＭＣの活性化を誘導することができない。しかしながら、これらの細胞株のそれぞれは、活性化されたＰＢＭＣが形成されると、ＳＫ－ＭＥＬ－２由来のＥＮＬＳＴ（商標）細胞によって活性化されたＰＢＭＣによって溶解される。したがって、細胞溶解活性は、遺伝子操作されたＥＮＬＳＴ（商標）細胞による前処理に依存していた。
以下の非黒色腫腫瘍株も、遺伝子操作された１４－１８－３０ＳＫＭＥＬ－２ＥＮＬＳＴ（商標）細胞によって活性化されたＰＢＭＣによる二次アッセイで溶解された。
Figure 2022553411000089
しかしながら、１４－１８－３０ＥＮＬＳＴ（商標）細胞によって活性化されたＰＢＭＣは、自家または同種異系にかかわらず、通常のＭＮＣを殺傷しない（データ示さず）。
したがって、誘発される細胞傷害性活性は広く、黒色腫を超えて広がる。
実施例７． 一次混合リンパ球腫瘍応答アッセイにおける９日後のＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞によるＰＢＭＣ誘導後のＰＢＭＣ集団の特性評価。
図５６Ａは、ＰＢＭＣ集団のＣｙＴＯＦ質量サイトメトリー単一細胞表現型分析マップを示す。図５６Ｂ、５６Ｃ、５６Ｄ、５６Ｅ、５６Ｆは、一次混合リンパ球腫瘍反応アッセイで９日後の、親ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞（図５６Ｂ）、または免疫調節因子発現ＳＫ－ＭＥＬ－２由来ＥＮＬＳＴ（商標）細胞（図５６Ｃ、５６Ｄ、５６Ｄ、５６Ｅ、５６Ｆ）によるＰＢＭＣ誘導後のＣｙＴＯＦ染色のｖｉｓＮＥ密度コンタープロットを示す。図５６Ｂは、親ＳＫ－ＭＥＬ－２細胞による誘導後のＰＢＭＣ亜集団シフトを示す。ＮＫ細胞集団と骨髄細胞集団が存在しないことに留意されたい。図５６Ｃは、ベクター３で形質導入またはトランスフェクトされたＥＮＬＳＴ（商標）細胞による誘導後のＰＢＭＣ亜集団シフトを示し、Ｂ細胞及び骨髄性細胞の誘導を示す。図５６Ｄは、ベクター３及び４で形質導入またはトランスフェクトされたＥＮＬＳＴ（商標）細胞による誘導後のＰＢＭＣ亜集団シフトを示し、Ｂ細胞の誘導を示す。図５６Ｅは、ベクター３、４、及び５で形質導入またはトランスフェクトされたＥＮＬＳＴ（商標）細胞による誘導後のＰＢＭＣ亜集団シフトを示し、Ｂ細胞及び骨髄細胞の誘導を示す。図５６Ｆは、ベクター３、４、及び６で形質導入またはトランスフェクトされたＥＮＬＳＴ（商標）細胞による誘導後のＰＢＭＣ亜集団シフトを示す。
図５７Ａ、５７Ｂ、５７Ｃ、５７Ｄ、５７Ｅ、及び５７Ｆは、フローサイトメトリーによって（図５７Ａ）、及び位相差顕微鏡法によって（図５７Ｂ、図５７Ｃ、図５７Ｄ、図５７Ｅ、及び５７Ｆ）、ＥＮＬＳＴ（商標）細胞を含む１４－１８－３０と以前に共培養されたＰＢＭＣが、未改変の腫瘍細胞を溶解することができることを示す。１４－１８－３０ＥＮＬＳＴ（商標）細胞との共培養によって以前に活性化されたＰＢＭＣの少なくとも２つの異なる亜集団は、未改変の腫瘍細胞の細胞溶解が可能である。図５７Ａは、初代混合リンパ球腫瘍細胞アッセイにおいて、１４－１８－３０発現ＥＮＬＳＴ（商標）細胞との９日間の共培養後のＰＢＭＣのＣＤ５６、ＣＤ３、及びＣＤ８の選別ゲートを示す。図５７Ｂは、ｔ＝０でのＣＤ５６＋ＣＤ３＋と未改変のＳＫＭＥＬ２を示す。図５７Ｃは、ｔ＝８時間でのＣＤ５６＋ＣＤ３＋と未改変のＳＫＭＥＬ２を示す。図５７Ｄは、ｔ＝０でのＣＤ５６－ＣＤ３＋ＣＤ８＋と未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２を示す。図５７Ｅは、ｔ＝８時間でのＣＤ５６－ＣＤ３＋ＣＤ８＋と未改変のＳＫ－ＭＥＬ－２を示す。
実施例８． インビボ異種移植マウス実験
６週齢のメスの同系交配ＳＣＩＤマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｈａｒｔｆｏｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）から入手する。動物は、施設の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコールに従って取り扱われる。マウスは動物飼育場に順応させた。
ヒト腫瘍異種移植片がＮＳＧ（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンママウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））で確立された。ヒト腫瘍をＮＳＧマウスの側面に移植した。ヒト腫瘍細胞をＮＧＳ（ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ）マウスの側面に移植し、１５０ｍｍ3まで増殖させた。マウスを対照群と処理群の２つの群に無作為に分け、１群あたり６匹のマウスを使用した。処理群は、１４－１８－３０を発現するＥＮＬＳＴ（商標）細胞によって活性化された拡大活性化シリアルキラー細胞を含む拡大活性化ＰＢＭＣで処理された。３０日目（ｔ＝０）に、対照群のマウスにビヒクルのみを接種し、処理群のマウスに、拡大活性化シリアルキラー細胞を含む３×１０6の拡大活性化ＰＢＭＣを接種した。腫瘍サイズは、両方の群で接種後、経時的にキャリパーによって測定された。
図５８は、ＮＧＳマウスを使用した異種移植片処理研究の結果を示す箱ひげ図である。各ボックスの端は、上位四分位数と下位四分位数である。中央値はボックス内の垂直線でマークされ、ひげはボックスの外側の２本の線で、最高と最低の観測値まで伸びている。ヒト腫瘍細胞をＮＧＳ（ＮＯＤ ｓｃｉｄ ｇａｍｍａ）マウスの側腹部に移植した。腫瘍を１５０ｍｍ3まで増殖させた。マウスを対照群と処理群の２つの群に無作為に分け、１群あたり６匹のマウスを使用した。３０日目（ｔ＝０）に、対照群のマウスにビヒクルのみを接種し、処理群のマウスに、１４－１８－３０発現ＥＮＬＳＴ（商標）細胞（「ＳＵＰＬＥＸＡ細胞」）によって活性化された３×１０6のＰＢＭＣを接種した。腫瘍サイズは、接種後３６日まで間隔を置いて測定された。２つの群間の発散は５日以内に現れた。２２日後、発散は統計的に有意になった（＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜００５）。
本発明をその具体的な実施態様を参照して説明したが、本発明の真の趣旨と範囲を逸脱することなく様々な変更がなされたり、均等物と置き換えたりすることができることは当業者によって理解されるであろう。さらに、特定の状況、物質、物質の組成、プロセス、プロセスステップ、またはステップを本発明の目的である、趣旨及び範囲に適合させるために多くの改変がなされ得る。すべてのそのような改変は、本明細書に添付の特許請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。

Claims (20)

  1. 活性化及び拡大されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化及び拡大された単核球の集団を含む細胞製品を含む組成物による、細胞傷害性Ｔ細胞集団のインビトロ活性化と、それに続く免疫抑制レジメンンの影響下にない癌患者の受動免疫化の方法であって、滅菌状態下で：
    （ａ）
    （１）生体試料から単核球（ＭＮＣ）の集団を単離すること；
    （２）１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現し、免疫調節分子のコアグループがＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）である３つの前記免疫調節分子のコアグループを安定して発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞の集団を含む操作された白血球刺激細胞の集団を調製すること；
    （３）ステップ（ａ）（１）の前記ＭＮＣの集団を、インビトロでステップ（ａ）（２）の前記操作された白血球刺激細胞と接触させることであって、前記接触させることが、細胞傷害性シリアルキラー細胞の相乗的拡大を刺激して、活性化された細胞傷害性シリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化されたＭＮＣの集団を形成するのに効果的である、前記接触させることによって、インビトロで免疫応答を誘導することと、
    （ｂ）前記活性化されたＭＮＣを培養して、拡大及び活性化されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む拡大及び活性化されたＭＮＣの集団を含む細胞製品を形成することにより、インビトロで活性化されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化されたＭＮＣの集団を拡大することと、
    （ｃ）前記活性化及び拡大された細胞製品の個々の用量を含む単位用量パッケージを調製すること、前記単位用量パッケージを凍結すること、及び前記凍結された単位用量パッケージを凍結保存に保存することと、
    （ｄ）制御された条件下で前記細胞製品を含む治療量の前記凍結された単位用量パッケージを解凍することと、
    （ｅ）任意選択で、前記凍結及び解凍された細胞製品を薬学的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物を形成することと、
    （ｆ）前記活性化及び拡大された細胞製品を含む（ｄ）の細胞製品または（ｅ）の医薬組成物の治療量を前記対象に投与することであって、
    前記治療量が腫瘍量を減少させるのに有効である、投与することと、を含む、前記方法。
  2. ヒトの発現に最適化された野生型ＯＸ４０リガンドコドンのアミノ酸配列が配列番号１０８であり、ヒトの発現に最適化された野生型ＣＤ２７リガンドコドンのアミノ酸配列が配列番号１０９であり、ヒトの発現に最適化された野生型ＣＤ２８リガンドコドンのアミノ酸配列が配列番号１１０、配列番号１１１、またはその両方である、請求項１に記載の方法。
  3. １つ以上の腫瘍特異的抗原を発現し、３つの免疫調節分子のコアグループを発現するように遺伝子操作された前記操作された白血球刺激細胞集団が、３～２５個の免疫調節因子（「Ｒ群」）を含む追加の数の免疫調節分子を発現するようにさらに遺伝子操作されている、請求項１に記載の方法。
  4. ＣＤ２８リガンドが、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記コア免疫調節因子ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７リガンド、及びＣＤ８０、ＣＤ８６、またはその両方を含むＣＤ２８リガンドを安定して発現するように形質導入または形質転換された前記操作された白血球刺激細胞が、未改変の対照細胞株と比較して、末梢血単核球において、活性化ＣＤ８＋細胞の２対数拡大を相乗的に誘導するのに有効である、請求項１に記載の方法。
  6. ステップ（ｂ）（ｉ）において、前記活性化されたＭＮＣの亜集団が、フローサイトメトリーによって同定及び単離される、請求項１に記載の方法。
  7. 前記活性化及び拡大されたＭＮＣが、ＮＫ細胞集団、ＮＫＴ細胞集団、ＣＤ８ ＣＴＬ細胞集団、ＣＤ４細胞集団、及びＴＣＲγδ細胞集団のうちの１つ以上を含む活性化及び拡大されたシリアルキラー細胞の集団を含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記単核球の集団が、末梢血または臍帯血に由来する、請求項１に記載の方法。
  9. 前記単核球の集団が、前記対象に対して自家である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記単核球の集団が、前記対象に対して同種異系である、請求項１に記載の方法。
  11. 前記活性化及び拡大されたシリアルキラー細胞の集団の細胞傷害性シリアルキラー活性が、正常細胞に影響を及ぼさず、前記遺伝子操作された白血球刺激細胞のがん抗原に特異的である、請求項１に記載の方法。
  12. 前記活性化及び拡大されたシリアルキラー細胞の集団（複数可）の細胞傷害性シリアルキラー活性が、正常細胞に影響を及ぼさず、がんの種類に関係なくがん細胞を殺傷するのに効果的である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記投与することが、免疫チェックポイントの適合性のある阻害剤と組み合わせて行われる、請求項１に記載の方法。
  14. 前記適合性のある免疫チェックポイントが、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、及びＬＡＧ－３のうちの１つ以上を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 活性化された細胞傷害性シリアルキラー細胞の亜集団を含む拡大及び活性化された単核球の集団を含む細胞製品であって、
    （ａ）生体試料から単核球（ＭＮＣ）の集団を単離することと；
    （ｂ）１つ以上の腫瘍特異的抗原を発現し、免疫調節ペプチドのコアグループがＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ７０）、及びＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）である３つの前記免疫調節分子のコアグループを発現するように遺伝子操作された腫瘍細胞の集団を含む操作された白血球刺激細胞の集団を調製することと；
    （ｃ）ステップ（ａ）の前記ＭＮＣの集団を、インビトロでステップ（ｂ）の前記操作された白血球刺激細胞と接触させて、活性化された細胞傷害性シリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化されたＭＮＣの集団を形成することと；
    （ｄ）前記活性化されたＭＮＣを培養して、拡大及び活性化されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化及び拡大されたＭＮＣの集団を含む前記細胞製品を形成することにより、インビトロで活性化されたシリアルキラー細胞の亜集団を含む活性化されたＭＮＣの集団を拡大することと、を含むプロセスによって調製された前記細胞製品。
  16. 前記活性化及び拡大された細胞傷害性シリアルキラー細胞の集団を含む活性化及び拡大されたＭＮＣが、ＮＫ細胞集団、ＮＫＴ細胞集団、ＣＤ８ ＣＴＬ細胞集団、ＣＤ４細胞集団、及びＴＣＲγδ細胞集団のうちの１つ以上を含む、請求項１５に記載のプロセスによって調製された細胞製品。
  17. 前記細胞傷害性シリアルキラー細胞が殺腫瘍性である、請求項１５に記載のプロセスによって調製された細胞製品。
  18. ヒトの発現に最適化された野生型ＯＸ４０リガンドコドンのアミノ酸配列が配列番号１０８であり、ヒトの発現に最適化された野生型ＣＤ２７リガンドコドンのアミノ酸配列が配列番号１０９であり、ヒトの発現に最適化された野生型ＣＤ２８リガンドコドンのアミノ酸配列が配列番号１１０、配列番号１１１、またはその両方である、請求項１６に記載のプロセスによって調製された細胞製品。
  19. ステップ（ｃ）における前記接触させることが、ＣＤ８＋細胞の２対数拡大を相乗的に誘導するのに効果的である、請求項１５に記載のプロセスによって調製された細胞製品。
  20. 前記生体試料が末梢血または臍帯血である、請求項１５に記載のプロセスによって調製された細胞製品。
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