TW202304961A - 用於將治療劑遞送至受體細胞之組合物及方法 - Google Patents

Abstract

本文中描述包含供體細胞、受體細胞之組合物，及涉及其之方法。在一些實施例中，供體細胞包含T細胞受體(TCR)及載物，且受體細胞包含MHC。在一些實施例中，TCR有助於載物轉移至受體細胞。在一些實施例中，供體細胞包含嵌合抗原受體(CAR)及載物，且受體細胞包含CAR所結合之抗原。在一些實施例中，CAR有助於載物轉移至受體細胞。

Description

用於將治療劑遞送至受體細胞之組合物及方法

多種治療策略包含對個體之細胞進行離體(接著使該等細胞返回至個體)或活體內修飾。然而，僅將修飾遞送至特定細胞仍然存在困難，尤其在活體內。需要用於將治療劑遞送至細胞之替代方法。

本發明係關於膜締合劑(例如T細胞受體(TCR)、嵌合抗原受體(CAR)或其功能片段或變異體)及/或載物分子自第一膜(例如，例如包含TCR、CAR或其功能片段或變異體之供體細胞之膜)至第二膜(例如目標細胞，例如受體細胞之膜)之轉移，供體細胞及受體細胞本身，以及包含其之系統及組合物，以及其製造及使用方法。不希望受理論束縛，認為細胞之細胞膜之一部分轉移至另一細胞的天然過程可用作一種修飾細胞(例如以表現外源性蛋白質、改變一或多種基因之表現或改變受體細胞之生物特性)之方法。

在一些態樣中，本發明提供一種供體細胞，其包含膜締合劑(例如包含TCR、CAR或其功能片段或變異體)，該膜締合劑包含膜締合部分及細胞外部分或細胞內部分中之一或兩者，其中該膜締合劑經組態以轉移至受體細胞。在一些實施例中，供體細胞包含經組態以轉移至受體細胞之載物分子。在一些實施例中，膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子中之至少一者對供體細胞為外源性的。

在另一態樣中，本發明提供一種供體細胞，其包含：膜締合劑，其包含膜締合部分及細胞外部分、細胞內部分、載物分子或其組合。在一些實施例中，膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子中之至少一者在供體細胞中以與源細胞(例如該供體細胞所源自的)不同之含量存在，例如，差異性表現。在一些實施例中，膜締合劑轉移至受體細胞。

在另一態樣中，本發明提供一種受體細胞，例如如本文所述，例如在膜締合劑藉由供體細胞遞送至受體細胞之後，該受體細胞包含膜締合劑(例如包含TCR、CAR或其功能片段或變異體)。在一些實施例中，受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸。在一些實施例中，例如如本文所述，受體細胞包含例如自供體細胞接收到之載物分子。在一些實施例中，膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子中之至少一者對受體細胞為外源性的。在一些實施例中，受體細胞包含膜締合劑及/或載物分子，例如已自供體細胞接收到膜締合劑及/或載物分子。

在另一態樣中，本發明提供一種受體細胞，其包含：膜締合劑，該膜締合劑包含：膜締合部分，及細胞外部分或細胞內部分中之一或兩者。在一些實施例中，受體細胞實質上不表現，例如不表現編碼膜締合劑之核酸。在一些實施例中，受體細胞包含例如自供體細胞接收到之載物分子。在一些實施例中，受體細胞自供體細胞接收到膜締合劑。

在另一態樣中，本發明提供一種組合物，例如製劑，其包含複數個本文所述之供體或受體細胞

在另一態樣中，本發明提供一種系統，例如反應混合物，其包含：本文所述之供體細胞及受體細胞，其中供體細胞及受體細胞提供在適合於膜締合劑及/或載物分子自供體細胞轉移至受體細胞之條件下。在一些實施例中，受體細胞不包含編碼膜締合劑及/或載物分子之核酸，或例如相對於內源性表現之膜締合劑及/或載物分子(若存在)，或相對於轉移之前的受體細胞，有差異地表現膜締合劑及/或載物分子。

在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之供體細胞(例如複數個供體細胞)、受體細胞(例如複數個受體細胞)或其組合。在一些實施例中，醫藥組合物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。

在另一態樣中，本發明提供一種修飾受體細胞之方法，其包含：使受體細胞與本文所述之供體細胞或系統在適合於膜締合劑及/或載物分子轉移至受體細胞之條件下接觸，藉此修飾受體細胞。在一些實施例中，受體細胞不包含編碼膜締合劑及/或載物分子之核酸。在一些實施例中，在轉移之後，受體細胞包含增加量之膜締合劑及/或載物分子。

在另一態樣中，本發明提供一種製造經修飾之細胞之方法，其包含：提供未經修飾之細胞，且使未經修飾之細胞與本文所述之供體細胞或系統在適合於膜締合劑及/或載物分子轉移至未經修飾之細胞的條件下接觸，藉此製得經修飾之細胞。在一些實施例中，未經修飾之細胞或經修飾之細胞均不包含編碼膜締合劑之核酸。在一些實施例中，在轉移之後，與未經修飾之細胞相比，經修飾之細胞包含增加量之膜締合劑及/或載物分子。在一些實施例中，未經修飾之細胞或經修飾之細胞均不包含編碼膜締合劑之核酸，且在轉移之後，與未經修飾之細胞相比，經修飾之細胞包含增加量之膜締合劑及/或載物分子。

在另一態樣中，本發明提供一種將載物分子遞送至細胞之方法，其包含：提供本文所述之供體細胞或系統，其中該供體細胞包含含有載物分子；提供不包含編碼膜締合劑及/或載物分子之核酸或實質上不表現(例如不表現)編碼膜締合劑及/或載物分子之核酸的受體細胞；及使受體細胞與供體細胞或系統在適合於膜締合劑轉移至受體細胞之條件下接觸，藉此將載物分子遞送至細胞。

在另一態樣中，本發明提供一種調節，例如增強或降低個體、目標組織或細胞中之生物功能的方法，其包含向該個體投與本文所述之供體細胞、受體細胞、系統或醫藥組合物或使目標組織或細胞與之接觸，藉此調節個體中之生物功能。

本文中之任一態樣，例如供體細胞、受體細胞、組合物或其製劑及上述方法，可與本文中之一或實施例，例如本文所述之一或多個實施例組合。

本發明之其他特徵、目標及優點將自實施方式及圖式及自申請專利範圍顯而易知。

除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域中一般技術者通常所理解相同的含義。本文中提及之所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻均以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，本文所提及之所有GenBank、Unigene及Entrez序列(例如本文中之任何表中)以引用之方式併入。除非另外說明，否則本文中(包括本文中之任何表中)指定之序列寄存編號係指截至2020年6月18日之資料庫條目。當一個基因或蛋白質參考複數個序列寄存編號時，包涵所有序列變異體。另外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張2021年4月6日申請之美國臨時申請案第63/171,285號、2021年4月8日申請之美國臨時申請案第63/172,467號及2021年12月22日申請之美國臨時申請案第63/292,873號的益處。前述申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。

本發明描述供體細胞、受體細胞、膜締合劑及相關方法，包括修飾受體細胞之方法、將膜締合劑及視情況一或多種載物分子遞送至受體細胞之方法、治療個體之方法、將膜締合劑自供體細胞轉移至受體細胞之方法及製造該等細胞之方法。不希望受理論束縛，認為多種天然及人工誘導方法有助於將膜締合劑自第一細胞(例如供體細胞)轉移至第二細胞(例如受體細胞)。採用此類方法調節第二細胞之特徵具有優於其他細胞修飾技術之多種優點。例如，在一些情況下，此類方法可能不需要對第二細胞(例如受體細胞)進行基因修飾。向個體投與之包含膜締合劑或載物分子(例如多肽、核酸分子或所關注之其他載物分子)的供體細胞或受體細胞可能夠比單獨膜締合劑或載物分子更有效地在個體中行進至目標細胞，例如目標組織，例如目標器官(例如遞送更高量，更確切而言，目標量，或以改良之藥物動力學(例如更長或更短半衰期)遞送膜締合劑或載物分子)。 定義

如本文所用，術語「受體細胞」係指能夠自供體細胞、膜締合體或膜封裝體接收膜締合劑之細胞(例如經純化之細胞)。在一些實施例中，受體細胞為組織內，例如器官內，例如個體(例如人類個體)內之細胞。在一些實施例中，受體細胞為經純化之細胞。在一些實施例中，受體細胞不包含膜締合劑(例如受體細胞尚未接收到膜締合劑)。在一些實施例中，受體細胞包含膜締合劑(例如已自供體細胞接收到膜締合劑)。相對於源細胞(例如受體細胞所源自的)，受體細胞可包含一或多個例如增強受體細胞接收膜締合劑(例如自供體細胞)之能力的修飾(例如除膜締合劑之外)。在一些實施例中，受體細胞能夠自供體細胞接收膜締合劑及/或載物分子(例如，如本文所述)。在一些實施例中，受體細胞為組織內，例如器官內，例如個體(例如人類個體)內之細胞。在一些實施例中，受體細胞為經純化之細胞。在一些實施例中，受體細胞不包含膜締合劑(例如受體細胞尚未接收到膜締合劑)。在一些實施例中，受體細胞包含膜締合劑(例如已自供體細胞接收到膜締合劑)。在一些實施例中，相對於源細胞(例如受體細胞所源自的)，受體細胞可包含例如增強受體細胞接收膜締合劑(例如自供體細胞)之能力的修飾(例如除膜締合劑之外)。在一些實施例中，受體細胞包含由供體細胞之膜締合劑特異性結合的對接部分(例如MHC (例如HLA)，例如結合於肽)。

一般而言，如本文所用，術語「試劑(agent)」可用於指包括例如肽、多肽、核酸(例如DNA、染色體(例如人類人工染色體)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA)、醣或多醣、脂質、小分子或其組合或複合物的化合物或實體。術語可指為或包含細胞器或其部分、提取物或組分的實體。

如本文所用，術語「抗體分子」係指蛋白質，例如免疫球蛋白鏈或其片段，其包含至少一個免疫球蛋白可變域序列。術語「抗體分子」包括例如全長成熟抗體及抗體之抗原結合片段。舉例而言，抗體分子可包括重(H)鏈可變域序列(本文中縮寫為VH)及輕(L)鏈可變域序列(本文中縮寫為VL)。在另一實例中，抗體分子包括兩個重(H)鏈可變域序列及兩個輕(L)鏈可變域序列，從而形成兩個抗原結合位點，諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、Fd、Fd'、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、單一可變域抗體、雙功能抗體(Dab) (二價及雙特異性)及嵌合(例如人類化)抗體，其可藉由修飾完全抗體或使用重組DNA技術重新合成之抗體產生。此等功能性抗體片段保留與其各別抗原或受體選擇性結合之能力。抗體及抗體片段可來自任何抗體類別，包括(但不限於) IgG、IgA、IgM、IgD及IgE，及來自抗體之任何子類(例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。抗體分子可為單株或多株的。抗體分子亦可為人類、人類化、CDR移植或活體外產生之抗體。抗體分子可具有選自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之重鏈恆定區。抗體分子亦可具有選自例如κ或λ之輕鏈。在本文中，術語「免疫球蛋白」(Ig)可與術語「抗體」互換使用。

如本文所用，「載物分子」包含可遞送至目標細胞(例如受體細胞)或藉由受體細胞遞送至另一目標細胞(例如受體細胞)之試劑。載物分子：與膜締合劑之組分(例如細胞外部分、細胞內部分或膜締合部分)非共價締合；或與膜締合劑之組分(例如細胞外部分、細胞內部分或膜締合部分)經由非肽鍵共價締合；或不與膜締合劑締合，例如載物分子可操作地締合或連接(例如繫栓)於供體細胞或膜封裝體之膜(例如與膜締合劑分開)。在一些實施例中，載物分子包含以下中之一或多種：蛋白質，例如酶、跨膜蛋白、受體或抗體；核酸，例如環狀或線性核酸，例如DNA、染色體(例如人類人工染色體)或RNA，例如mRNA、siRNA、miRNA、piRNA或lncRNA；脂質；或小分子(例如信號傳導分子(例如第二信使)或藥物分子)。在一些實施例中，載物為或包含細胞器。在一些實施例中，試劑可例如與膜締合劑締合而遞送(例如自供體細胞)至目標細胞(例如受體細胞)。在一些實施例中，載物分子與膜締合劑之組分(例如細胞外部分、細胞內部分或膜締合部分)非共價締合。在一些實施例中，載物分子與膜締合劑之組分(例如細胞外部分、細胞內部分或膜締合部分)經由非肽鍵共價締合。在一些實施例中，載物分子不與膜締合劑締合，例如載物分子可操作地締合或連接(例如繫栓)於供體細胞之膜(例如與膜締合劑分開)。

如本文所用，「經組態以轉移」係指與第一細胞(例如供體細胞)、第一含膜受質或第一膜封裝體之膜締合且能夠在第一細胞(例如供體細胞)、第一含膜受質或第一膜封裝體與第二細胞(例如受體細胞)、第二含膜受質或第二膜封裝體接觸之後藉由膜轉移過程轉移至第二細胞(例如受體細胞)、第二含膜受質或第二膜封裝體之膜的試劑之狀態。

如本文所用，術語「同源肽」係指與主要組織相容性複合體(MHC)分子(例如HLA分子)結合(例如呈遞)之肽，其在與MHC分子結合時，能夠特異性結合於例如供體細胞之表面上的所關注之TCR (或其功能片段或變異體)，例如其中TCR為膜締合劑。在一些實施例中，當TCR不結合於同源肽時，MHC分子實質上不結合於所關注之TCR。

如本文所用，術語「供體細胞」係指包含經組態以轉移至目標細胞，例如受體細胞之膜締合劑的細胞(例如經純化之細胞)。在一些實施例中，供體細胞包含編碼膜締合劑之一或多種核酸。在一些實施例中，相對於源細胞(例如供體細胞所源自的)，供體細胞包含一或多個例如增強供體細胞將膜締合劑遞送至目標細胞(例如受體細胞)之能力的修飾(例如除膜締合劑之外)。在一些實施例中，供體細胞包含待轉移至目標細胞，例如受體細胞之載物分子。

如本文所用，術語「外源性」係指在相關系統(例如細胞、組織、生物體、源細胞或目標細胞等)中未天然發現之試劑(例如蛋白質或脂質)。在實施例中，試劑經工程改造及/或引入至相關系統中。例如，在一些實施例中，當在供體細胞、受體細胞或膜封裝製劑所獲自或源自之源細胞(例如供體細胞、受體細胞或膜封裝之源細胞)中未天然發現相關脂質及/或蛋白質時，可稱供體細胞、受體細胞或膜封裝製劑含有一或多種「外源性」脂質及/或蛋白質。在一些實施例中，外源性膜締合劑為或包含內源性劑之變異體，諸如在一或多個結構方面(諸如胺基酸序列、轉譯後修飾等)與參考內源蛋白等不同之蛋白質變異體。

如本文所用，「膜締合劑」係指經組態以自第一細胞(例如供體細胞)或膜封裝體轉移至第二細胞(例如目標細胞，例如受體細胞)之試劑。膜締合劑包含膜締合部分及細胞外部分、細胞內部分或載物分子中之一或多者、一者、兩者或所有。在一些實施例中，膜締合劑包含超過一個膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子。在一些實施例中，膜締合劑之至少一個部分(例如膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子)對以下為外源性的：1)包含膜締合劑之供體；2)膜締合劑轉移或將轉移至之目標細胞，例如受體細胞；或3)兩者。在一些實施例中，外源性膜締合劑為融合蛋白。在一些實施例中，膜締合劑包含T細胞受體(TCR)、嵌合抗原受體(CAR)或其功能片段或變異體。在一些實施例中，膜締合劑包含單一分子(例如單一多肽)。在一些實施例中，膜締合劑包含複合物(例如包含複數個多肽及/或核酸次單元之複合物)。在實施例中，膜締合劑包含TCR複合物，該複合物例如包含以下中之一或多者：TCRα分子、TCRβ分子、TCRγ分子、TCRδ分子、CD3ζ分子或其任何功能片段或變體。

如本文所用，「膜締合部分」係指與膜(例如細胞膜)締合(例如位於當中及/或上面)或能夠與之締合的試劑。在一些實施例中，膜締合部分包含至少部分(例如完全)跨越膜，例如細胞膜之域。在一些實施例中，膜締合部分為完全跨越膜，例如細胞膜之跨膜部分。在一些實施例中，膜締合部分為或包含跨膜蛋白或跨膜蛋白之跨膜域。在一些實施例中，膜締合部分包含脂質化修飾序列，例如N-肉豆蔻醯化、N-棕櫚醯化或S-棕櫚醯化序列，或適合於添加糖基化磷脂醯肌醇(GPI)之疏水性信號序列，例如包含肉豆蔻醯基、棕櫚醯基或GPI修飾。在一些實施例中，膜締合部分與膜脂質雙層之內部(例如胞質)部分締合。在一些實施例中，膜締合部分與膜脂質雙層之外部部分(例如與細胞表面或與如本文所述之供體細胞、受體細胞或膜封裝製劑之表面)締合。在一些實施例中，膜締合部分與膜脂質雙層之外部部分締合且為或包含細胞表面蛋白。在一些實施例中，膜締合部分為天然存在之蛋白質。在一些實施例中，膜締合部分為經工程改造及/或合成蛋白質(例如嵌合抗原受體)。在一些實施例中，膜締合部分為治療劑。在一些實施例中，膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓)於細胞內部分、細胞外部分或載物分子中之一或多者。在一些實施例中，膜締合部分包含繫栓於膜，例如繫栓於膜之一個小葉(例如細胞膜之內葉)的域。

如本文所用，「膜轉移過程」係當第一細胞或膜封裝體與第二細胞或膜封裝體接觸或緊鄰時能夠自第一細胞(例如供體細胞)或膜封裝體移動膜之一部分(例如該膜之一或多種組分，例如膜締合劑)至第二細胞(例如目標細胞，例如受體細胞)或膜封裝體的任何過程。示例性膜轉移過程包括但不限於膜融合事件、受體-配位體相互作用、細胞橋接事件(例如抗體分子(例如雙特異性抗體)或細胞與細胞接觸事件。膜轉移過程可調整或部分使用天然存在之膜轉移過程之組分或機制，例如胞啃作用或胞吞作用。

如本文所用，「可操作地締合」或「連接」係指兩個實體以功能性方式連接之狀態。例如，啟動子及基因可均位於核酸上：若其可操作地連接，則啟動子可促進基因之表現(例如當核酸適當地位於細胞中時等)；若其不可操作地連接，則啟動子無法促進基因之表現。在該實例中，可操作地連接涵蓋功能性對齊，熟練技術人員應瞭解與啟動子及基因之功能性連接有關的若干細節，例如啟動子與基因之間的距離、基因之閱讀框架、轉錄起點之位置等。作為另一實例，膜締合部分與細胞外部分可操作地締合或連接；此類狀態可能意味，該等部分為融合蛋白之一部分，其中部分呈現其天然結構，提供其能夠進行之任何功能，及/或包含該等部分之膜締合劑為功能性的(例如經組態以轉移其組成部分或能夠提供其組成部分之功能)。作為又一實例，細胞內部分與載物分子可操作地締合或連接，其中細胞內部分與載物分子非共價締合，且細胞內部分及載物分子例如能夠呈現其天然結構，提供其能夠進行之任何功能，及/或包含該等部分之膜締合劑為功能性的(例如經組態以轉移其組成部分或能夠提供其組成部分之功能)。在一些實施例中，可操作地締合或連接包含非共價相互作用。在一些實施例中，可操作地締合或連接包含共價相互作用，例如肽鍵或連接子。

如本文所用，術語「目標細胞部分」用以指目標細胞(例如受體細胞)之一個特徵，其可用於使供體細胞或膜封裝體特異性(相對於相關系統中之至少一種其他細胞)靶向該細胞。在一些實施例中，目標細胞部分可用於促進膜締合劑及視情況一或多種載物分子自供體細胞或膜封裝體轉移至目標細胞，例如受體細胞。在一些實施例中，目標細胞部分為目標細胞(例如受體細胞)之一個特徵，其可用於使供體細胞特異性(相對於相關系統中之至少一種其他細胞)靶向該細胞。在一些實施例中，目標細胞部分包含MHC分子(例如HLA分子)。在一些實施例中，目標細胞部分包含例如由MHC呈遞之肽(例如相對於供體細胞之膜締合劑中包含之TCR為同源肽)。在一些實施例中，目標細胞部分包含由供體細胞包含之CAR特異性結合的部分。

如本文所用，術語「靶向域」為與目標細胞部分締合或相互作用(例如結合)之試劑(例如多肽)。在一些實施例中，目標細胞部分包含目標細胞，例如受體細胞之表面上的MHC/同源肽複合物。在一些實施例中，靶向域為膜締合劑之對接部分，例如如本文所述。在一些實施例中，靶向域(例如膜締合劑之對接部分)包含抗體分子(例如抗體或其功能片段或變異體，例如scFV)。

如本文所用，「TCR分子」係指能夠與其他TCR分子複合形成TCR之多肽。在一些實施例中，TCR分子包含TCRα、TCRβ、TCRγ、TCRδ或CD3ζ或其功能片段或變異體之序列。在一些實施例中，TCR分子為野生型蛋白質，例如來自哺乳動物(例如人類)之野生型蛋白質。在一些實施例中，TCR分子經工程改造(例如非天然及/或經修飾之TCR分子，例如突變TCR分子或融合蛋白)。在一些實施例中，TCR分子為對應野生型TCR蛋白質之功能片段或變異體。 細胞

本發明部分地針對包含膜締合劑及視情況存在之一或多種載物分子的細胞(例如供體細胞或受體細胞)。在一些實施例中，本文所述之供體細胞可用於將膜締合劑及視情況存在之一或多種載物分子遞送至目標細胞，例如受體細胞。在一些實施例中，細胞(例如源細胞、供體細胞或受體細胞)為經純化之細胞，例如自培養物、樣品(例如血球分離樣品)、組織、器官或個體分離。在一些實施例中，細胞(例如受體細胞)為樣品(例如血球分離樣品)、組織、器官或個體之一部分。

在一些實施例中，細胞為供體細胞，其包含經組態以轉移至目標細胞，例如受體細胞之膜締合劑且視情況包含亦經組態以轉移至該目標細胞，例如受體細胞之一或多種載物分子。在一些實施例中，供體細胞為免疫細胞(例如T細胞或NK細胞)。在一些實施例中，供體細胞為自患者獲得之自體T細胞或NK細胞，例如經修飾以包含膜締合劑(例如TCR、CAR或其功能片段或變異體)及/或載物分子，例如如本文所述。在一些實施例中，供體細胞為來自細胞株，例如Jurkat細胞之T細胞或NK細胞。

在一些實施例中，細胞為包含膜締合劑且視情況包含一或多種載物分子之受體細胞，其中該受體細胞不包含編碼膜締合劑或載物分子之核酸。在一些實施例中，受體細胞自供體細胞接收到該膜締合劑及視情況一或多種載物分子。在一些實施例中，受體細胞為抗原呈遞細胞(APC)，例如專職APC (例如樹突狀細胞、巨噬細胞或B細胞)或非專職APC。在一些實施例中，受體細胞包含與肽(例如同源肽，例如其中MHC/同源肽複合物特異性結合例如供體細胞上之膜締合劑)結合之MHC分子。

在一些實施例中，細胞為能夠自供體細胞接收到膜締合劑及視情況一或多種載物分子之受體細胞。在一些實施例中，該受體細胞不包含膜締合劑或載物分子(例如yet)。在一些實施例中，受體細胞包含一或多個增加自供體細胞接收到膜締合劑或載物分子之功效及/或可能性的修飾。

細胞(例如供體細胞或受體細胞)可為天然存在之細胞，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞。在一些實施例中，供體細胞為經修飾以包含膜締合劑且視情況包含一或多種載物分子之天然存在之細胞。在一些實施例中，受體細胞為經修飾以包含一或多個增加自供體細胞接收到膜締合劑或載物分子之功效及/或可能性之修飾的天然存在之細胞。

在一些實施例中，供體細胞或受體細胞源自源細胞。在一些實施例中，該細胞源自源細胞包含修飾源細胞，例如以含有或表現膜締合劑及視情況一或多種載物分子，或包含一或多個增加自供體細胞接收到膜締合劑或載物分子之功效及/或可能性之修飾。

在一些實施例中，供體細胞或受體細胞中之DNA或上述細胞所源自之源細胞中之DNA使用基因編輯技術，例如引導RNA及CRISPR-Cas9/Cpf1，或使用不同目標核酸內切酶(例如鋅指核酸酶、轉錄-活化因子樣核酸酶(TALEN))進行編輯。DNA編輯之非限制性實例包括小的插入/缺失、大的缺失、利用模板DNA之基因校正或大的DNA插入。在一些實施例中，基因編輯用非同源末端接合(NHEJ)或同源定向修復(HDR)實現。在一些實施例中，編輯為基因剔除。在一些實施例中，編輯為基因嵌入。在一些實施例中，編輯DNA之兩個對偶基因。在一些實施例中，編輯單一對偶基因。在一些實施例中，進行多次編輯。在一些實施例中，供體細胞(或供體細胞所源自之源細胞)源自個體，或與個體基因匹配，或在免疫學上與個體相容(例如具有相似MHC)。

在一些實施例中，細胞(例如源細胞、供體細胞或受體細胞)為幹細胞、紅血球、白血球、嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、淋巴球、血小板、神經細胞、神經膠細胞、肌肉細胞(例如骨骼、心肌或平滑肌細胞)、軟骨細胞、骨骼細胞(例如破骨細胞、成骨細胞或骨細胞)、襯細胞、皮膚細胞、內皮細胞、上皮細胞、脂肪細胞或性細胞(例如精子或卵)。

在一些實施例中，細胞(例如源細胞、供體細胞或受體細胞)為初級細胞或永生化細胞，例如細胞株(例如人類細胞株)。在一些實施例中，細胞(例如源細胞、供體細胞或受體細胞)係選自內皮細胞、纖維母細胞、血球(例如巨噬細胞、嗜中性球、顆粒球、白血球)、幹細胞(例如間葉幹細胞、臍帶幹細胞、骨髓幹細胞、造血幹細胞、經誘導之多潛能幹細胞，例如源自個體細胞之經誘導之多潛能幹細胞)、胚胎幹細胞(例如來自胚胎卵黃囊、胎盤、臍帶、胎兒皮膚、青少年皮膚、血液、骨髓、脂肪組織、紅血球生成組織、造血組織之幹細胞)、肌母細胞、實質細胞(例如肝細胞)、腺泡細胞、神經元(例如視網膜神經元細胞)、前驅細胞(例如視網膜前驅細胞、骨髓母細胞、骨髓前驅細胞、胸腺細胞、性母細胞、成巨核細胞、巨核球前驅細胞、黑色素母細胞、淋巴母細胞、骨髓前驅細胞、紅血球母細胞或血管母細胞)、先驅細胞(例如心肌先驅細胞、衛星細胞、放射狀膠細胞、骨髓基質細胞、胰臟先驅細胞、內皮先驅細胞、胚細胞)或永生化細胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ細胞)。在一些實施例中，細胞(例如源細胞、供體細胞或受體細胞)係除293細胞、HEK細胞、人類內皮細胞或人類上皮細胞、單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞或幹細胞以外。在一些實施例中，細胞(例如源細胞、供體細胞或受體細胞)為白血球或幹細胞。在一些實施例中，細胞(例如源細胞、供體細胞或受體細胞)係選自嗜中性球、淋巴球(例如T細胞、B細胞或自然殺手(NK)細胞)、巨噬細胞、顆粒球、間葉幹細胞、骨髓幹細胞、經誘導之多潛能幹細胞、胚胎幹細胞或骨髓母細胞。

在一些實施例中，細胞(例如供體細胞或受體細胞)為合成性細胞。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞或受體細胞)為重組細胞，例如包含非天然存在之核酸序列之細胞。

在一些實施例中，細胞(例如源細胞、供體細胞或受體細胞)為免疫效應細胞或源自免疫效應細胞。在一些實施例中，免疫效應細胞係指參與免疫反應，例如參與促進免疫效應反應之細胞。免疫效應細胞之實例包括但不限於T細胞，例如CD4+及CD8+ T細胞、α/β T細胞及γ/δ T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞及肥大細胞。

在一些實施例中，例如如藉由定量流動式細胞測量術所量測，每個細胞(例如供體細胞或受體細胞)存在複本數為至少或不超過10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本之膜締合劑或載物分子。在一些實施例中，例如如藉由定量流動式細胞測量術所量測，存在複本數為至少1,000個複本之膜締合劑或載物分子。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞或受體細胞)包含之膜締合劑或載物分子之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%置於細胞膜中。在實施例中，細胞(例如供體細胞或受體細胞)亦在內部，例如在細胞質或細胞器中包含載物分子。

在一些實施例中，例如如藉由定量流動式細胞測量術所量測，細胞(例如供體細胞或受體細胞)包含每個細胞之複本數為至少或不超過10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本之治療劑。在一些實施例中，例如如藉由定量流動式細胞測量術所量測，細胞(例如供體細胞或受體細胞)包含複本數為至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本之蛋白質治療劑。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞或受體細胞)包含複本數為至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本之核酸治療劑。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞或受體細胞)包含複本數為至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本之DNA治療劑。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞或受體細胞)包含複本數為至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本之RNA治療劑。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞或受體細胞)包含複本數為至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本之相對於源細胞為外源性之治療劑。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞或受體細胞)包含複本數為至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本之相對於源細胞為外源性之蛋白質治療劑。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞或受體細胞)包含複本數為至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本之相對於源細胞為外源性之核酸(例如DNA或RNA)治療劑。在一些實施例中，膜締合劑之複本數與治療劑之複本數之比率介於1,000,000:1與100,000:1之間、100,000:1與10,000:1之間、10,000:1與1,000:1之間、1,000:1與100:1之間、100:1與50:1之間、50:1與20:1之間、20:1與10:1之間、10:1與5:1之間、5:1與2:1之間、2:1與1:1之間、1:1與1:2之間、1:2與1:5之間、1:5與1:10之間、1:10與1:20之間、1:20與1:50之間、1:50與1:100之間、1:100與1:1,000之間、1:1,000與1:10,000之間、1:10,000與1:100,000之間或1:100,000與1:1,000,000之間。在一些實施例中，膜締合劑之複本數與載物分子之複本數之比率介於1,000,000:1與100,000:1之間、100,000:1與10,000:1之間、10,000:1與1,000:1之間、1,000:1與100:1之間、100:1與50:1之間、50:1與20:1之間、20:1與10:1之間、10:1與5:1之間、5:1與2:1之間、2:1與1:1之間、1:1與1:2之間、1:2與1:5之間、1:5與1:10之間、1:10與1:20之間、1:20與1:50之間、1:50與1:100之間、1:100與1:1,000之間、1:1,000與1:10,000之間、1:10,000與1:100,000之間或1:100,000與1:1,000,000之間。

在一些實施例中，細胞(例如供體細胞)將治療劑之至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本遞送至目標細胞(例如受體細胞)。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞)將蛋白質治療劑之至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本遞送至目標細胞(例如受體細胞)。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞)將核酸治療劑之至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本遞送至目標細胞(例如受體細胞)。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞)將RNA治療劑之至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本遞送至目標細胞(例如受體細胞)。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞)將DNA治療劑之至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本遞送至目標細胞(例如受體細胞)。

在一些實施例中，細胞(例如供體細胞)將細胞(例如供體細胞)遞送所包含之膜締合劑或載物分子(例如治療劑，例如相對於源細胞為內源性或外源性之治療劑)的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%遞送至目標細胞(例如受體細胞)。在一些實施例中，與目標細胞(例如受體細胞)相互作用之細胞(例如供體細胞)將與目標細胞相互作用之細胞(例如供體細胞)所包含之膜締合劑或載物分子的平均至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%遞送至目標細胞。在一些實施例中，供體細胞組合物將供體細胞組合物所包含之膜締合劑或載物分子的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%遞送至目標組織(例如包含複數個目標細胞，例如受體細胞)。

在一些實施例中，所提供之細胞(例如供體細胞或受體細胞)及/或其組合物或製劑每毫克細胞中之總蛋白包含0.00000001 mg外源性膜締合劑或載物分子至1 mg外源性膜締合劑或載物分子，例如每毫克細胞中之總蛋白0.00000001-0.0000001、0.0000001-0.000001、0.000001-0.00001、0.00001-0.0001、0.0001-0.001、0.001-0.01、0.01-0.1或0.1-1 mg外源性膜締合劑或載物分子。在一些實施例中，所提供之細胞(例如供體細胞或受體細胞)及/或其組合物或製劑每毫克細胞中之脂質包含0.00000001 mg外源性膜締合劑或載物分子至5 mg外源性膜締合劑或載物分子，例如每毫克細胞中之脂質0.00000001-0.0000001、0.0000001-0.000001、0.000001-0.00001、0.00001-0.0001、0.0001-0.001、0.001-0.01、0.01-0.1、0.1-1或1-5 mg外源性膜締合劑或載物分子。

在一些實施例中，所提供之細胞(例如供體細胞或受體細胞)及/或其組合物或製劑滿足醫藥學或優良製造規範(GMP)標準。在一些實施例中，所提供之細胞(例如供體細胞或受體細胞)及/或其組合物或製劑根據優良製造規範(GMP)製得。在一些實施例中，所提供之細胞(例如供體細胞或受體細胞)及/或其組合物或製劑的特徵為病原體含量低於預定參考值，例如實質上不含病原體。在一些實施例中，所提供之細胞(例如供體細胞或受體細胞)及/或其組合物或製劑的污染物(例如核組分，諸如核DNA)含量低於預定參考值，例如實質上不含一或多種指定污染物。在一些實施例中，所提供之細胞(例如供體細胞或受體細胞)及/或其組合物或製劑之特徵為低免疫原性，例如如本文所述。

在一些實施例中，供體細胞包含經組態以轉移至受體細胞之膜締合劑及視情況載物分子。在一些實施例中，供體細胞包含T細胞且受體細胞包含NK細胞。在一些實施例中，供體細胞包含樹突狀細胞且受體細胞包含T細胞。在一些實施例中，供體細胞包含樹突狀細胞且受體細胞包含NK細胞。在一些實施例中，供體細胞包含T細胞且受體細胞包含T細胞。在一些實施例中，膜締合劑及/或載物分子包含T細胞受體(TCR)，例如如本文所述。在一些實施例中，膜締合劑及/或載物分子包含CAR，例如如本文所述。

在一些實施例中，供體細胞包含經組態以轉移至受體細胞之膜締合劑及視情況載物分子。在一些實施例中，供體細胞為T細胞且受體細胞為癌細胞。

在一些實施例中，供體細胞包含經組態以轉移至受體細胞之膜締合劑及視情況載物分子。在一些實施例中，供體細胞為樹突狀細胞且受體細胞為已移植至個體中(例如作為組織或器官移植之一部分)之細胞。

在一些實施例中，供體細胞包含經組態以轉移至受體細胞之膜締合劑及視情況載物分子。在一些實施例中，供體細胞為先驅細胞且受體細胞為分化細胞。在一些實施例中，膜締合劑及/或載物分子包含再程式化因子。

在一些實施例中，供體細胞包含受體(例如TCR、CAR或其功能片段或變異體)且受體細胞包含該受體之配位體(例如呈遞同源肽之MHC，其中MHC/同源肽複合物由TCR特異性結合)。在一些實施例中，供體細胞包含受體(例如CAR)且受體細胞包含該受體之配位體(例如包含由CAR之第一對接部分識別之抗原決定基的分子)。在一些實施例中，膜締合劑包含受體或其功能部分，例如作為細胞外部分(例如靶向域)或膜締合部分之一部分。在一些實施例中，靶向域(例如未與膜締合劑或載物分子可操作地締合)包含受體配位體或其功能部分。 供體細胞

在一些實施例中，供體細胞包含經組態以轉移至目標細胞，例如受體細胞之膜締合劑，及視情況，亦經組態以轉移至目標細胞(例如受體細胞)之一或多種載物分子。

在一些實施例中，供體細胞或用於製得供體細胞之源細胞為T細胞、B細胞、NK細胞或源自其中任一者之細胞。在一些實施例中，供體細胞為T細胞。在一些實施例中，供體細胞為NK細胞。

在一些實施例中，供體細胞或用於製得供體細胞之源細胞為來自例如Jurkat、K562、Ramos、HUVEC、293T、RAW264.7、BT-474、SK-BR-3、MDA-MB-231或BT-20細胞(例如可自ATCC獲得)之細胞株(例如永生化細胞株)之細胞。

在一些實施例中，供體細胞能夠將膜締合劑(例如TCR、CAR或其功能片段或變異體)及視情況一或多種載物分子轉移至至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種或更多種(例如任何或所有)類型受體細胞。在一些實施例中，供體細胞能夠將膜締合劑及視情況一或多種載物分子轉移至特定受體細胞類型(例如且不轉移至其他受體細胞類型)。在一些實施例中，供體細胞能夠將膜締合劑及視情況一或多種載物分子轉移至特定受體細胞類型且不轉移至至少一種、兩種、三種、四種、五種或更多種(例如所有其他)類型細胞。

在一些實施例中，供體細胞及/或其組合物或製劑之特徵為個體中，例如小鼠中之半衰期在參考細胞，例如源細胞之半衰期的1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%內。在一些實施例中，供體細胞及/或其組合物或製劑之特徵為個體中，例如小鼠中之半衰期為例如人類個體中或小鼠中至少1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時或24小時。在一些實施例中，供體細胞及/或其組合物或製劑能夠遞送(例如遞送)特徵為在個體中之半衰期比供體細胞之半衰期長例如至少10%、20%、50%、2倍、5倍或10倍之外源性膜締合劑或載物分子(例如治療劑)。例如，供體細胞可將治療劑遞送至目標細胞(例如受體細胞)，且治療劑可在供體細胞不再呈現或可偵測之後存在。

在一些實施例中，藉由與參考細胞進行比較來描述所提供之細胞(例如供體細胞或受體細胞)及/或其組合物或製劑之特徵。在實施例中，參考細胞為供體細胞或受體細胞所源自之源細胞。在實施例中，參考細胞為Huvec、K562、THP-1、Jurkat、KHYG-1、Ramos、PBMC及經分離之PBMC子集細胞。在一些實施例中，藉由與參考細胞群體，例如源細胞群體或Huvec、K562、THP-1、Jurkat、KHYG-1、Ramos、PBMC及經分離之PBMC子集細胞群體進行比較來描述供體細胞、受體細胞群體及/或其組合物或製劑之特徵。

在一些實施例中，供體細胞包含T細胞受體(TCR)，例如如本文所述。

在一些實施例中，供體細胞(例如包含CAR之供體細胞，例如如本文所述)不包含TCR。在一些實施例中，供體細胞實質上不表現TCR。在一些實施例中，供體細胞中之TCR含量相對於供體細胞所源自之源細胞降低(例如至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。在一些實施例中，已剔除供體細胞之天然TCR基因。 自培養細胞產生之供體細胞

可自培養中之源細胞，例如培養之哺乳動物細胞，例如培養之人類細胞產生供體細胞之組合物。細胞可為先驅細胞或非先驅(例如分化)細胞。細胞可為初級細胞或細胞株(例如本文所述之哺乳動物，例如人類之細胞株)。

在一些實施例中，源細胞為內皮細胞、纖維母細胞、血球(例如巨噬細胞、嗜中性球、顆粒球、白血球)、幹細胞(例如間葉幹細胞、臍帶幹細胞、骨髓幹細胞、造血幹細胞、經誘導之多潛能幹細胞，例如源自個體細胞之經誘導之多潛能幹細胞)、胚胎幹細胞(例如來自胚胎卵黃囊、胎盤、臍帶、胎兒皮膚、青少年皮膚、血液、骨髓、脂肪組織、紅血球生成組織、造血組織之幹細胞)、肌母細胞、實質細胞(例如肝細胞)、腺泡細胞、神經元(例如視網膜神經元細胞)、前驅細胞(例如視網膜前驅細胞、骨髓母細胞、骨髓前驅細胞、胸腺細胞、性母細胞、成巨核細胞、巨核球前驅細胞、黑色素母細胞、淋巴母細胞、骨髓前驅細胞、紅血球母細胞或血管母細胞)、先驅細胞(例如心肌先驅細胞、衛星細胞、放射狀膠細胞、骨髓基質細胞、胰臟先驅細胞、內皮先驅細胞、胚細胞)或永生化細胞(例如HeLa、HEK293)或Huvec、K562、THP-1、Jurkat、KHYG-1、Ramos、PBMC或經分離之PBMC子集細胞。在一些實施例中，源細胞為Jurkat細胞或其變異體。

培養細胞可來自上皮、結締、肌肉或神經組織或細胞及其組合。供體細胞可為自來自任何真核(例如哺乳動物)器官系統之培養細胞產生，例如來自心血管系統(心臟、血管結構)；消化系統(食道、胃、肝臟、膽囊、胰臟、腸、結腸、直腸及肛門)；內分泌系統(下視丘、腦垂腺、松果體或松果體腺、甲狀腺、副甲狀腺、腎上腺)；排泄系統(腎臟、輸尿管、膀胱)；淋巴系統(淋巴、淋巴結、淋巴管、扁桃體、腺樣體、胸腺、脾)；表皮系統(皮膚、頭髮、指甲)；肌肉系統(例如骨骼肌)；神經系統(腦、脊髓、神經)；生殖系統(卵巢、子宮、乳腺、睪丸、輸精管、儲精囊、前列腺)；呼吸系統(咽、喉、氣管、支氣管、肺、子宮帽)；骨骼系統(骨骼、軟骨)及其組合。在實施例中，細胞來自高度有絲分裂組織(例如高度有絲分裂健康組織，諸如上皮細胞、胚胎組織、骨髓、腸隱窩)。在實施例中，組織樣品為高度代謝組織(例如骨骼組織、神經組織、心肌細胞)。

在一些實施例中，供體細胞(用於得到其之源細胞)為懸浮細胞。在一些實施例中，供體細胞(或用於得到其之源細胞)為黏附細胞。

在一些實施例中，供體細胞(或用於得到其之源細胞)來自幼齡供體，例如25歲、20歲、18歲、16歲、12歲、10歲、8歲、5歲、1歲或更低年齡之供體。在一些實施例中，供體細胞(或用於得到其之源細胞)來自胎兒組織。

在一些實施例中，供體細胞源自來自個體之細胞且投與相同個體或具有相似基因印記(例如MHC匹配)之個體。

供體細胞可自通常根據此項技術中已知之方法培養之細胞產生。在一些實施例中，細胞可分2或更多「期」培養，例如生長期，其中細胞在繁殖及增加培養物生物質之條件下培養；及「產生」期，其中細胞在改變細胞表型(例如最大化粒線體表型、增加粒線體數目或直徑、增加氧化磷酸化狀態)之條件下培養。亦可存在「表現」期，其中細胞在最大化外源性膜締合劑、載物分子或相對於源細胞為外源性之其他試劑在細胞膜上表現及限制轉移在其他期的條件下培養。

在一些實施例中，供體細胞自同步細胞，例如在生長期或產生期期間之細胞產生。例如，藉由自培養基(例如約12-24小時)消除血清，或藉由在培養基中使用DNA合成抑制劑，諸如胸苷、胺基喋呤、羥基脲及阿糖胞苷，細胞可同步在G1期。已知用於哺乳動物細胞週期同步之額外方法且揭示於例如Rosner等人 2013. Nature Protocols 8:602-626 (特別是Rosner中之表1)。

在一些實施例中，可評估細胞，且視情況針對所期望之表型或基因型進行富集，以用作如本文所述之供體細胞組合物之來源。舉例而言，可評估細胞且視情況，例如在培養之前、在培養期間(例如在生長期或產生期期間)或在培養之後但在產生供體細胞之前，針對例如以下各項中之一或多者進行富集：膜電位(例如-5至-200 mV之膜電位；心磷脂含量(例如總脂質1-20%之間)；膽固醇、磷脂醯乙醇胺(PE)、二甘油脂(DAG)、磷脂酸(PA)或脂肪酸(FA)含量；基因品質＞80%、＞85%、＞90%；外源性膜締合劑表現或含量；或載物分子表現或含量。

在一些實施例中，供體細胞自細胞純系產生，該細胞純系基於所期望之表型或基因型進行鑑別、挑選或選擇，以用作本文所述之供體細胞組合物之來源。舉例而言，細胞純系基於低粒線體突變負荷、長端粒長度、分化狀態或特定基因印記(例如與接受者匹配之基因印記)進行鑑別、挑選或選擇。

本文所述之供體細胞組合物可由來自一種細胞或組織來源或來自來源之組合的供體細胞構成。舉例而言，供體細胞組合物可包含來自異種來源(例如動物、上述物種之細胞之組織培養物)、同種異體、自體、引起不同蛋白質濃度及分佈之特定組織(肝臟、骨骼、神經、脂肪等)、不同代謝狀態之細胞(例如糖酵解、呼吸)的供體細胞。組合物亦可包含處於如本文中其他地方所描述之不同代謝狀態，例如偶合或非偶合的供體細胞。

在一些實施例中，供體細胞自表現膜締合劑(及視情況一或多種載物分子)，例如本文所述之膜締合劑之源細胞產生。在一些實施例中，膜締合劑置於源細胞之膜，例如脂質雙層膜，例如細胞表面膜或亞細胞膜(例如溶酶體膜)中。在一些實施例中，供體細胞自膜締合劑置於細胞表面膜中之源細胞產生。

在一些實施例中，供體細胞藉由誘導胞外體、微囊泡、膜囊泡、細胞外膜囊泡、質膜囊泡、巨質膜囊泡、細胞凋亡體、粒線體粒子(mitoparticle)、核細胞(pyrenocyte)、溶酶體或其他膜封裝囊泡之出芽來產生。

為避免疑問，應瞭解在許多情況下，實際上用於製成供體細胞之源細胞將在製得供體細胞之後不可用於測試。因此，源細胞與供體細胞之間的比較不需要分析實際上經修飾(例如去核)以製成供體細胞之源細胞。實際上，實際上可分析其他方面類似於源細胞，例如來自相同培養物、相同基因型、相同組織類型或其任何組合之細胞。 在產生供體細胞之前對細胞之修飾

在一些態樣中，在產生供體細胞之前對細胞進行修飾，諸如對個體、組織或細胞進行修飾。此類修飾可有效例如提高膜締合劑(及視情況一或多種載物分子)之轉移、目標細胞(例如受體細胞)之靶向、外源性膜締合劑表現或活性、載物分子之結構或功能或者目標細胞之結構或功能。

在一些實施例中，對源細胞或源自其之供體細胞進行修飾，以調節哪些膜締合劑(例如膜蛋白(例如內源性膜蛋白)、受體、配位體或細胞表面標記物)經組態以轉移至目標細胞(例如受體細胞)。此類修飾可降低經組態以轉移之一或多種(例如所有)膜締合劑之含量。不希望受理論束縛，可能需要此類修飾來控制供體細胞能夠將哪些膜締合劑轉移至目標細胞(例如受體細胞)。此類修飾包括但不限於：減少(例如消除)膜締合劑之表現(例如短暫或穩定地)；改變膜締合劑之定位(例如遠離細胞膜)；及將膜締合劑繫栓至不經組態用於轉移之試劑(例如膜締合劑連接至細胞骨架或細胞器之組分)。 物理修飾

在一些實施例中，細胞在產生供體細胞之前經物理修飾。舉例而言，如本文中其他地方所述，膜締合劑、一或多種載物分子及/或一或多個靶向域可連接於細胞表面。

在實施例中，供體細胞、受體細胞包含增加或降低含量之內源分子。舉例而言，供體細胞、受體細胞可包含在天然存在之源細胞中亦天然存在但含量高於或低於供體細胞或受體細胞中的內源分子。在一些實施例中，多肽自源細胞、供體細胞或受體細胞中之外源性核酸表現。在一些實施例中，多肽自來源分離且負載至或結合於源細胞、供體細胞或受體細胞。

在一些實施例中，在產生供體細胞、受體細胞之前，細胞用例如小分子之化學試劑處理，以增加細胞中內源性劑，例如靶向域之表現或活性(例如在一些實施例中，相對於源細胞為內源性的，且在一些實施例中，相對於目標細胞為內源性的)。在一些實施例中，小分子可增加內源性劑(例如靶向域)之轉錄活化因子之表現或活性。在一些實施例中，小分子可降低內源性劑(例如靶向域)之轉錄抑制因子之表現或活性。在一些實施例中，小分子為增加內源性劑(例如靶向域)之表現的表觀遺傳修飾劑。

在一些實施例中，在產生供體細胞之前，源細胞用例如CRISPR活化劑進行物理修飾，以添加或增加外源性膜締合劑、載物分子或靶向域之濃度。

在一些實施例中，細胞經物理修飾以增加或減少內源性劑在細胞膜上之存在。在一些實施例中，物理修飾增加細胞膜上內源性劑，例如靶向域之含量。在一些實施例中，物理修飾減少細胞膜中其他細胞膜組分(例如非膜締合劑、靶向域或載物分子之細胞膜組分)之含量。不希望受理論束縛，認為膜締合劑及視情況一或多個載物分子之轉移可藉由減少細胞膜上不必要或干擾內源性劑之含量及/或增加細胞膜上促進轉移之內源性劑(例如靶向域)之含量來提高。 基因修飾

在一些實施例中，在產生供體細胞之前對細胞進行基因修飾以增加內源性劑(例如靶向域)在細胞中之表現(例如相對於源細胞為內源性的或相對於目標細胞為內源性的)。在一些實施例中，基因修飾可增加內源性劑(例如靶向域)之轉錄活化因子之表現或活性。在一些實施例中，基因修飾可降低內源性劑(例如靶向域)之轉錄抑制因子之表現或活性。在一些實施例中，活化因子或抑制因子為連接於藉由引導RNA靶向內源性劑或編碼其之核酸的轉錄活化因子或抑制因子的核酸酶非活性Cas9 (dCas9)。在一些實施例中，基因修飾在表觀遺傳上調節內源性劑編碼基因以增加其表現。在一些實施例中，表觀遺傳活化因子核酸酶非活性Cas9 (dCas9)連接於藉由引導RNA靶向內源性劑之表觀遺傳修飾劑。

在一些實施例中，在產生供體細胞之前例如經由遞送轉殖基因，對細胞進行基因修飾以增加細胞中膜締合劑或載物分子之表現。在一些實施例中，在產生供體細胞之前，將核酸，例如DNA、mRNA或siRNA轉移至細胞，例如以增加或減少用於器官、組織或細胞靶向之細胞表面分子(蛋白質、聚糖、脂質或低分子量分子)，例如靶向域之表現。在一些實施例中，核酸靶向膜締合劑、靶向域或載物分子之抑制因子，例如shRNA、siRNA構築體。在一些實施例中，核酸編碼膜締合劑、靶向域或載物分子抑制因子之抑制劑。

在一些實施例中，方法包含將相對於源細胞為外源性之核酸引入至源細胞中，其中該核酸編碼膜締合劑、靶向域或載物分子中之一或多者。外源性核酸可為例如DNA或RNA。在一些實施例中，外源性核酸可為例如DNA、gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA、miRNA、siRNA等。在一些實施例中，外源性DNA可為線性DNA、環狀DNA或人工染色體。在一些實施例中，DNA維持游離。在一些實施例中，DNA整合至基因體中。外源性RNA可為經化學修飾之RNA，例如可包含一或多種主鏈修飾、糖修飾、非典型鹼基或帽。主鏈修飾包括例如硫代磷酸酯、N3'胺基亞磷酸酯、硼烷磷酸酯、磷醯基乙酸酯、硫基-PACE、N-嗎啉基胺基亞磷酸酯或PNA。糖修飾包括例如2'-O-Me、2'F、2'F-ANA、LNA、UNA及2'-O-MOE。非典型鹼基包括例如5-溴-U及5-碘-U、2,6-二胺基嘌呤、C-5丙炔基嘧啶、二氟甲苯、二氟苯、二氯苯、2-硫代尿苷、假尿苷及二氫尿苷。帽包括例如ARCA。額外修飾論述於例如Deleavey等人, 「Designing Chemically Modified Oligonucleotides for Targeted Gene Silencing」 Chemistry & Biology第19卷, 第8期, 2012年8月24日, 第937-954頁，其以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，在產生供體細胞之前細胞用化學試劑，例如小分子處理，以增加膜締合劑、載物分子或相對於源細胞為外源性之靶向域之表現、穩定性或活性。在一些實施例中，小分子可增加膜締合劑、載物分子或靶向域之轉錄活化因子之表現或活性。在一些實施例中，小分子可降低膜締合劑、載物分子或靶向域之轉錄抑制因子之表現或活性。在一些實施例中，小分子為增加膜締合劑、載物分子或靶向域之表現的表觀遺傳修飾劑。

在一些實施例中，核酸編碼經修飾之外源性膜締合劑、載物分子或靶向域。舉例而言，膜締合劑具有可調控之轉移活性，例如特定細胞類型、組織類型或局部微環境活性。此類可調控之轉移活性可包括藉由低pH值、高pH值、熱、紅外光、細胞外酶活性(真核或原核)或小分子、蛋白質或脂質之暴露來活化及/或引發轉移活性。舉例而言，具有可調控之轉移活性的經修飾之外源性膜締合劑僅可經組態以在特定小分子或一類小分子存在下自供體細胞轉移至受體細胞且在不存在該小分子下不經組態用於轉移。在一些實施例中，小分子、蛋白質或脂質展示在目標細胞上。

在一些實施例中，在產生供體細胞之前細胞(例如源細胞)進行基因修飾，以改變(亦即，上調或下調)信號傳導路徑(例如膜代謝，例如TOR路徑，例如ALG-2信號傳導)之表現。在一些實施例中，在產生供體細胞之前細胞(例如源細胞)進行基因修飾，以改變(亦即，上調或下調)所關注基因之表現。在一些實施例中，在產生供體細胞之前細胞(例如源細胞)進行基因修飾，以改變(例如上調或下調)所關注核酸(例如miRNA或mRNA)之表現。在一些實施例中，在產生供體細胞之前核酸，例如DNA、mRNA或siRNA，轉移至細胞(例如源細胞)，例如以增加或減少信號傳導路徑、基因或核酸之表現。在一些實施例中，核酸靶向信號傳導路徑、基因或核酸之抑制因子，或抑制信號傳導路徑、基因或核酸。在一些實施例中，核酸編碼上調或下調信號傳導路徑、基因或核酸之轉錄因子。在一些實施例中，活化因子或抑制因子為連接於藉由引導RNA靶向信號傳導路徑、基因或核酸之轉錄活化因子或抑制因子的核酸酶非活性Cas9 (dCas9)。在一些實施例中，基因修飾在表觀遺傳上調節內源性信號傳導路徑、基因或核酸之表現。在一些實施例中，表觀遺傳活化因子核酸酶非活性Cas9 (dCas9)連接於藉由引導RNA靶向信號傳導路徑、基因或核酸之表觀遺傳修飾劑。在一些實施例中，在產生供體細胞之前細胞DNA進行編輯，以改變(亦即，上調或下調)信號傳導路徑(例如膜代謝，例如TOR路徑，例如ALG-2信號傳導)、基因或核酸之表現。在一些實施例中，使用引導RNA及CRISPR-Cas9/Cpf1或其他基因編輯技術來編輯DNA。

可使用重組方法對細胞(例如源細胞)進行基因修飾。可使用重組方法，諸如藉由自表現基因之細胞篩選文庫，藉由自已知包括所需基因之載體得到基因，或藉由直接自細胞及含有細胞之組織分離，使用標準技術，獲得編碼所需基因之核酸序列。或者，所關注基因可以合成方式產生而非選殖。

天然或合成核酸之表現通常藉由將編碼所關注基因之核酸可操作地連接於啟動子及將構築體併入表現載體中來達成。載體可適合於在真核生物中複製且整合於真核生物中。典型選殖載體含有可用於所需核酸序列表現之轉錄及轉譯終止子、起始序列及啟動子。

在一些實施例中，細胞可用一或多個表現區域，例如基因進行基因修飾。在一些實施例中，細胞可用外源性基因(例如能夠表現外源性基因產物，諸如RNA，或多肽產物)及/或外源性調控核酸進行基因修飾。在一些實施例中，細胞可用編碼對源細胞或目標細胞為內源性之基因產物的外源性序列及/或能夠調節內源性基因之表現的外源性調控核酸進行基因修飾。在一些實施例中，細胞可用外源性基因及/或調節外源性基因表現之調控核酸進行基因修飾。在一些實施例中，細胞可用外源性基因及/或調節內源性基因表現之調控核酸進行基因修飾。熟習此項技術者應瞭解，本文所述之細胞可經基因修飾以表現多種外源性基因，該等外源性基因編碼可例如作用於源細胞或目標細胞之內源性或外源性基因體之基因產物的蛋白質或調控分子。在一些實施例中，此類基因賦予供體細胞特徵，例如調節目標細胞(例如受體細胞)下之轉移。在一些實施例中，細胞可經基因修飾以表現內源性基因及/或調控核酸。在一些實施例中，內源性基因或調控核酸調節其他內源性基因之表現。在一些實施例中，細胞可經基因修飾以表現內源性基因及/或調控核酸，該內源性基因及/或調控核酸以與其他染色體上內源性基因及/或調控核酸之型式不同的方式(例如誘導性、組織特異性、組成性或以更高或更低含量)表現。

啟動子元件(例如，強化子)調控轉錄起始頻率。通常，此等元件位於起始位點上游30-110 bp區中，但最近顯示多個啟動子含有亦位於起始位點下游之功能元件。啟動子元件之間的間距通常為靈活的，使得當元件相對於彼此倒置或移動時時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子元件之間的間距在活性開始下降之前可增加至相隔50 bp。視啟動子而定，個別元件似乎可合作地或獨立地起活化轉錄功能。

適合啟動子之一個實例為即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為能夠驅使任何與其可操作地連接之聚核苷酸序列之高表現量的強組成性啟動子序列。適合啟動子之另一實例為延伸生長因子-1α (EF-1α)。然而，亦可使用其他組成性啟動子序列，包括(但不限於)猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒即刻早期啟動子(Epstein-Barr virus immediate early promoter)、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)，以及人類基因啟動子，諸如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。

此外，本發明應不限於使用組成性啟動子。亦涵蓋誘導性啟動子作為本發明之部分。誘導性啟動子之使用提供分子開關，該分子開關能夠在需要此類表現時打開其可操作地連接之聚核苷酸序列之表現或在不需要表現時關閉表現。誘導性啟動子之實例包括(但不限於)組織特異性啟動子、金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。在一些實施例中，在產生供體細胞之前，例如在產生供體細胞之前3、6、9、12、24、26、48、60或72小時，上調內源性劑、外源性膜締合劑、靶向域或載物分子之表現。

待引入至源細胞中之表現載體亦可含有可選標記物基因或報導基因或兩者，以有助於自設法經由病毒載體轉染或感染之細胞群體鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，可選標記物可攜載於單獨的DNA段上且用於共轉染程序。可選標記物與報導基因均可側接適當的調控序列以實現在宿主細胞中之表現。適用可選標記物包括例如耐抗生素基因，諸如neo及其類似物。

報導基因可用於鑑別潛在經轉染之細胞及評估調控序列之功能性。一般而言，報導基因為不存在於接受者來源中或由接受者來源表現且編碼表現由一些容易偵測之特性(例如酶活性)顯現之多肽的基因。在DNA已引入接受者細胞中之後的適合時間分析報導基因之表現。適合報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、β-內醯胺酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌性鹼性磷酸酶之基因，或綠色螢光蛋白基因(例如Ui-Tei等人, 2000 FEBS Letters 479: 79-82)。適合表現系統係熟知的且可使用已知技術製備或購得。一般而言，其中最小5'側接區展示報導基因最高表現量之構築體鑑別為啟動子。此類啟動子區可連接於報導基因且用於評估試劑調節啟動子驅動之轉錄的能力。

在一些實施例中，細胞可經基因修飾以改變一或多種蛋白質之表現。一或多種蛋白質之表現可經修飾達特定時間，例如來源之發育或分化狀態。在一些實施例中，供體自經基因修飾以改變一或多種蛋白質，例如外源性膜締合劑、載物分子或其他影響受體細胞靶向或膜締合劑或載物分子轉移之蛋白質之表現的細胞來源產生。一或多種蛋白質之表現可限於特定位置或廣泛分佈在整個來源中。

在一些實施例中，內源性劑，例如靶向域之表現經修飾。在一些實施例中，供體細胞自內源性劑(例如靶向域)之表現經修飾，例如內源性劑之表現增加或減少至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、90%或更多之源細胞產生。

在一些實施例中，細胞可經工程改造以表現靶向膜締合劑、載物分子或靶向域之胞質酶(例如蛋白酶、磷酸酶、激酶、去甲基酶、甲基轉移酶、乙醯基酶)。在一些實施例中，胞質酶藉由改變轉譯後修飾而影響外源性膜締合劑、載物分子或靶向域中之一或多者。蛋白質之轉譯後蛋白質修飾可影響對營養物可利用性及氧化還原條件之反應性及蛋白質-蛋白質相互作用。在一些實施例中，供體細胞包含具有改變之轉譯後修飾，例如轉譯後修飾增加或減少至少10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、80%、90%或更多之外源性膜締合劑、載物分子或靶向域。

將修飾引入至細胞中之方法包括物理、生物學及化學方法。參見例如Geng.及Lu, Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab on a Chip. 13(19):3803-21. 2013；Sharei, A.等人 A vector-free microfluidic platform for intracellular delivery. PNAS第110卷第6期. 2013；Yin, H. 等人, Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15: 541-555. 2014。適合修飾用於產生本文所述之供體細胞或受體細胞之細胞的方法包括例如擴散、滲透、滲透脈衝、滲壓衝擊、低滲透壓溶解、低滲透壓透析、離子電泳、電穿孔、音波處理、顯微注射、鈣沈澱、膜嵌入、脂質介導之轉染、洗滌劑處理、病毒感染、受體介導之胞吞作用、使用蛋白質轉導域、粒子啟動(particle firing)、膜融合、凍融、機械破壞及過濾。

證實基因修飾之存在包括多種分析。此類分析包括例如分子生物分析，諸如南方及北方墨點法、RT-PCR及PCR；生化分析，諸如例如藉由免疫學手段(ELISA及西方墨點)或藉由本文所述之分析偵測特定肽之存在或不存在。 對供體細胞之修飾

在一些態樣中，對供體細胞進行修飾。此類修飾可有效例如提高靶向、功能或結構。

在一些實施例中，供體細胞用可非共價或共價連接於膜表面之膜締合劑、靶向域或載物分子處理。在一些實施例中，供體細胞用可非共價或共價連接或本身包埋在膜中之膜締合劑、靶向域或載物分子，例如蛋白質或脂質處理。

如本文所述，可將非外源性膜締合劑之添加劑添加至供體細胞中以修改其結構及/或特性。舉例而言，可將膽固醇或神經鞘磷脂添加至膜中以幫助使結構穩定及防止例如載物分子洩漏。此外，膜可由氫化卵磷脂醯膽鹼或卵磷脂醯膽鹼、膽固醇及磷酸二鯨蠟酯製備。(參見例如Spuch和Navarro, Journal of Drug Delivery, 第2011卷, 論文ID 469679, 12頁, 2011. doi:10.1155/2011/469679的綜述)。

在一些實施例中，供體細胞在外表面上包含一或多個靶向域以靶向特定細胞或組織類型(例如心肌細胞)。此等靶向域包括但不限於受體、配位體、抗體及其類似物。在一些實施例中，靶向域包含於TCR、TCR或其功能片段或變異體中。此等靶向域結合目標細胞(例如受體細胞)表面上之其搭配物(例如呈遞同源肽之MHC，其中該TCR特異性結合於MHC及/或同源肽；或由CAR特異性結合之配位體或結合搭配物)。在實施例中，靶向域對目標細胞部分，例如本文所述之目標細胞(例如受體細胞)上之細胞表面標記物具有特異性，該目標細胞為例如內皮細胞、纖維母細胞、血球(例如巨噬細胞、嗜中性球、顆粒球、白血球)、幹細胞(例如間葉幹細胞、臍帶幹細胞、骨髓幹細胞、造血幹細胞、經誘導之多潛能幹細胞，例如源自個體細胞之經誘導之多潛能幹細胞)、胚胎幹細胞(例如來自胚胎卵黃囊、胎盤、臍帶、胎兒皮膚、青少年皮膚、血液、骨髓、脂肪組織、紅血球生成組織、造血組織之幹細胞)、肌母細胞、實質細胞(例如肝細胞)、腺泡細胞、神經元(例如視網膜神經元細胞)、前驅細胞(例如視網膜前驅細胞、骨髓母細胞、骨髓前驅細胞、胸腺細胞、性母細胞、成巨核細胞、巨核球前驅細胞、黑色素母細胞、淋巴母細胞、骨髓前驅細胞、紅血球母細胞或血管母細胞)、先驅細胞(例如心肌先驅細胞、衛星細胞、放射狀膠細胞、骨髓基質細胞、胰臟先驅細胞、內皮先驅細胞、胚細胞)或永生化細胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ細胞)。

在一些實施例中，靶向域結合目標細胞(例如受體細胞)上之細胞表面標記物。在實施例中，細胞表面標記物包含蛋白質、糖蛋白、受體、細胞表面配位體、I類跨膜蛋白、II類跨膜蛋白或III類跨膜蛋白，或其片段或肽。

在一些實施例中，本文所述之供體細胞或受體細胞經診斷劑官能化。診斷劑之實例包括但不限於用於正電子發射斷層攝影術(PET)、電腦輔助斷層攝影術(CAT)、單光子發射電腦斷層攝影術、x射線、螢光檢查及磁共振成像(MRI)之市售顯影劑；及造影劑。適用作MRI中之造影劑之適合材料之實例包括釓螯合物，以及鐵、鎂、錳、銅及鉻。 免疫原性

在本文所述之任一態樣之一些實施例中，供體細胞組合物實質上為非免疫原性的。免疫原性可例如如本文所述進行定量。

在一些實施例中，與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞相比，供體細胞組合物包含升高含量之免疫抑制劑。在一些實施例中，升高含量為至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在一些實施例中，供體細胞組合物包含參考細胞中不存在之免疫抑制劑。在一些實施例中，與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞相比，供體細胞組合物包含降低含量之免疫活化劑。在一些實施例中，降低含量為與參考細胞相比至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%。在一些實施例中，供體細胞或受體細胞中實質上不存在免疫活化劑。

在一些實施例中，供體細胞組合物或供體細胞或受體細胞組合物所源自之源細胞具有以下特徵中之一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個或更多個： a) 與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞或HeLa細胞相比，I類MHC或II類MHC之表現小於50%、40%、30%、20%、15%、10%或5%或更少； b) 與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞或本文所述之參考細胞相比，一或多種共刺激蛋白質之表現小於50%、40%、30%、20%、15%、10%或5%或更少，共刺激蛋白質包括但不限於：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4； c) 與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞相比，抑制巨噬細胞吞沒之表面蛋白質，例如CD47之表現，例如藉由本文所述之方法可偵測之表現，例如超過1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍抑制巨噬細胞吞沒之表面蛋白質，例如CD47之表現； d) 與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞相比，可溶性免疫抑制性細胞介素，例如IL-10之表現，例如藉由本文所述之方法可偵測之表現，例如超過1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍可溶性免疫抑制性細胞介素，例如IL-10之表現； e) 與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞相比，可溶性免疫抑制性蛋白質，例如PD-L1之表現，例如藉由本文所述之方法可偵測之表現，例如超過1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍可溶性免疫抑制性蛋白質，例如PD-L1之表現； f) 與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞相比，可溶性免疫刺激性細胞介素，例如IFN-γ或TNF-a之表現小於50%、40%、30%、20%、15%、10%或5%或更少； g) 與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞相比，HLA-E或HLA-G之表現，例如藉由本文所述之方法可偵測之表現； h) 例如含有唾液酸之表面糖基化特徵，唾液酸用來例如抑制NK細胞活化； i) 與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞相比，TCRα/β之表現小於50%、40%、30%、20%、15%、10%或5%或更少； j) 與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞相比，次要組織相容性抗原(MHA)之表現小於50%、40%、30%、20%、15%、10%或5%或更少；或 k) 與參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞相比，具有小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少之粒線體MHA，或具有不可偵測之粒線體MHA。

在一些實施例中，供體細胞組合物實質上不引發免疫系統，例如先天性免疫系統之免疫原性反應。在一些實施例中，先天性免疫系統之免疫原性反應包含包括(但不限於)NK細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜鹼性球、嗜酸性球、樹突狀細胞、肥大細胞或γ/δ T細胞之先天性免疫細胞的反應。在一些實施例中，先天性免疫系統之免疫原性反應包含包括可溶性血液組分及膜結合組分之補體系統的反應。

在一些實施例中，供體細胞組合物實質上不引發免疫系統，例如適應性免疫系統之免疫原性反應。在一些實施例中，適應性免疫系統之免疫原性反應包含適應性免疫細胞之免疫原性反應，包括(但不限於) T淋巴球(例如CD4 T細胞、CD8 T細胞及或γ-δ T細胞)或B淋巴球之數目或活性的變化，例如增加。在一些實施例中，適應性免疫系統之免疫原性反應包括可溶性血液組分之含量增加，包括(但不限於)細胞介素或抗體(例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)之數目或活性變化，例如增加。

在一些實施例中，供體細胞組合物經修飾以具有降低之免疫原性。免疫原性可例如如本文所述進行定量。在一些實施例中，供體細胞組合物之免疫原性比參考細胞，例如在其他方面類似於源細胞之未經修飾之細胞的免疫原性小5%、10%、20%、30%、40%或50%更小。

在本文所述之任一態樣之一些實施例中，供體細胞組合物源自具有經修飾之基因體，例如使用本文所述之方法進行修飾以減少，例如減輕免疫原性之源細胞，例如哺乳動物細胞。免疫原性可例如如本文所述進行定量。

在一些實施例中，供體細胞組合物源自源細胞，例如哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞包含治療劑。

在一些實施例中，供體細胞組合物源自源細胞，例如哺乳動物細胞，其中該哺乳動物細胞為重組細胞。

在一些實施例中，供體細胞之表面或供體細胞所源自之哺乳動物細胞之表面用減少免疫原性及免疫介導之清除的聚合物，例如生物相容性聚合物，例如PEG共價或非共價地修飾。

在一些實施例中，供體細胞之表面或供體細胞所源自之哺乳動物細胞之表面用唾液酸，例如包含含有NK抑制性聚糖抗原決定基之含糖聚合物之唾液酸共價或非共價地修飾。

在一些實施例中，供體細胞之表面或供體細胞所源自之哺乳動物細胞之表面例如用糖苷酶，例如α-N-乙醯基胺基半乳糖苷酶進行酶處理，以移除ABO血型。

在一些實施例中，供體細胞之表面或供體細胞所源自之哺乳動物細胞之表面進行酶處理，以引起，例如誘導匹配接受者血型之ABO血型之表現。 受體細胞

本發明部分地針對能夠接收膜締合劑及視情況一或多種載物分子之受體細胞。另外，本發明部分地針對包含該外源性膜締合劑及視情況一或多種載物分子(例如已自供體細胞接收到膜締合劑及視情況一或多種載物分子)但不包含編碼膜締合劑及視情況一或多種載物分子之核酸的受體細胞。本發明進一步部分地針對包含此類受體細胞(例如在自如本文所述之供體細胞轉移之後包含載物分子及/或膜締合劑之受體細胞)之組合物。在一些實施例中，受體細胞不為癌細胞。在一些實施例中，受體細胞在未患癌症之個體中。在一些實施例中，受體細胞為離體的且來自未患癌症之個體。

在一些實施例中，受體細胞在活體內例如藉由投與至組織、器官或個體之供體細胞修飾。在實施例中，修飾包含將載物分子及/或膜締合劑自供體細胞轉移至受體細胞。

在一些實施例中，目標細胞，例如受體細胞，為免疫細胞(例如免疫效應細胞)，例如T細胞、B細胞、NK細胞、PMN (例如顆粒球)、單核球、樹突狀細胞或巨噬細胞，或者源自前述細胞。在一些實施例中，目標細胞，例如受體細胞，為抗原呈遞細胞(APC)，例如在其表面上包含MHC分子，例如在如本文所述之供體細胞之表面上將同源肽呈遞至TCR或其功能片段或變異體。在實施例中，APC係選自由以下組成之群：專職APC (例如樹突狀細胞、巨噬細胞或B細胞)及非專職APC (例如如本文所述之任何其他細胞類型)。

在一些實施例中，目標細胞在其表面上包含第二對接部分(例如，如本文所述之膜締合劑之第一對接部分的配位體)。在一些實施例中，目標細胞，例如受體細胞，為抗原呈遞細胞(APC)，例如在其表面上包含MHC分子，例如呈遞肽或其功能片段或變異體。在實施例中，APC係選自由以下組成之群：專職APC (例如樹突狀細胞、巨噬細胞或B細胞)及非專職APC (例如如本文所述之任何其他細胞類型)。

在一些實施例中，目標細胞，例如受體細胞，為來自細胞株(例如永生化細胞株)，例如NK92、THP1、Jurkat、RAW264.7、BT-474、SK-BR-3、MDA-MB-231、BT-20或KHYG-1 (例如如可自ATCC或AcceGen獲得)之細胞。

在一些實施例中，目標細胞，例如受體細胞，在生物體中。在一些實施例中，目標細胞，例如，受體細胞，為自生物體分離之初級細胞。在一些實施例中，靶向域與目標細胞(例如受體細胞)上之目標細胞部分，例如細胞表面特徵相互作用。在一些實施例中，供體細胞不包含該目標細胞部分。在一些實施例中，供體細胞包含與目標細胞(例如受體細胞)上之結合搭配物相互作用的膜締合劑或靶向域，藉此允許供體細胞結合於目標細胞(例如受體細胞)及/或將膜締合劑及視情況一或多種載物分子轉移至目標細胞(例如受體細胞)。在一些實施例中，供體細胞不包含該結合搭配物。在一些實施例中，靶向域不為膜締合劑或載物分子之一部分。在一些實施例中，膜締合劑包含靶向域。在一些實施例中，結合搭配物為來自目標細胞部分之不同實體或為其一部分。在一些實施例中，結合搭配物為目標細胞部分或其一部分。

在一些實施例中，在遞送供體細胞之前、同時或之後目標細胞(例如受體細胞)或包含其之組織經修飾(例如藉由誘導應力或細胞分裂)以增加轉移速率。一些非限制性實例包括誘導缺血、用化學療法治療、抗生素、輻照、毒素、炎症、發炎性分子、抗炎性分子、酸損傷、鹼損傷、灼傷、聚乙二醇、神經傳遞素、骨髓毒性藥物、生長因子或激素、組織割除、饑餓及/或運動。

在一些實施例中，目標細胞(例如受體細胞)或包含其之組織用血管擴張劑(例如一氧化氮(NO)、一氧化碳、前列環素(PGI2)、硝酸甘油酯、芬托拉明(phentolamine))或血管收縮劑(例如血管緊張素(AGT)、內皮素(EDN)、去甲腎上腺素)處理以增加供體細胞運輸至組織之速率。

在一些實施例中，目標細胞(例如受體細胞)或包含其之組織用化學劑，例如化學治療劑處理。在此類實施例中，化學治療劑誘發對目標細胞(例如受體細胞)或組織之損害，增強膜締合劑或載物分子轉移至目標細胞(例如受體細胞)或組織。

在一些實施例中，目標細胞(例如受體細胞)或包含其之組織用刺激或促進自供體細胞接收到膜締合劑及/或載物分子之活化劑處理。在一些實施例中，活化劑為DMSO或PMA或其組合。 目標細胞部分

目標細胞通常為能夠接收到膜締合劑及視情況一或多種載物分子之細胞。在一些實施例中，目標細胞為受體細胞，例如如本文所述。在一些實施例中，目標細胞自供體細胞接收到膜締合劑或視情況一或多種載物分子。在一些實施例中，目標細胞，例如受體細胞存在於活體內中。

在一些實施例中，目標細胞(例如受體細胞)包含一或多個目標細胞部分。在一些實施例中，目標細胞部分可用於促進膜締合劑及視情況一或多種載物分子自供體細胞轉移至目標細胞，例如受體細胞。在一些實施例中，目標細胞部分為目標細胞之表面特徵。在一些實施例中，目標細胞部分為與目標細胞之細胞膜締合之蛋白質或其一部分。在一些實施例中，目標細胞部分為與目標細胞之膜締合之肽或蛋白質或為其一部分。在一些實施例中，目標細胞部分為與目標細胞之膜締合之脂質或為其一部分。在一些實施例中，目標細胞部分為與目標細胞之膜締合之醣或為其一部分。在一些實施例中，目標細胞部分對目標細胞(例如受體細胞)為內源性的。在一些實施例中，目標細胞部分包含MHC。在一些實施例中，目標細胞部分包含呈遞肽之MHC，其中該肽為供體細胞上膜締合劑(例如供體細胞之表面上的TCR或其功能片段或變異體)之同源肽，例如其中該TCR或其功能片段或變異體特異性結合於MHC-同源肽複合物。在一些實施例中，目標細胞部分包括例如包含由膜締合劑(例如CAR)特異性結合之抗原決定基的配位體。

目標細胞部分可用於使供體細胞靶向目標細胞(例如受體細胞)。目標細胞部分可用於促進膜締合劑及/或一或多種載物分子自供體細胞轉移至目標細胞(例如受體細胞)。在一些實施例中，供體細胞結合(例如經由膜締合劑及/或靶向域)於目標細胞，例如受體細胞上之目標細胞部分。

在一些實施例中，目標細胞部分為置於例如本文揭示之目標細胞(例如受體細胞)之膜(例如脂質雙層)中的蛋白質(例如，如本文所述之MHC-同源肽複合物)。在一些實施例中，目標細胞部分可內源性表現、過度表現或外源性表現(例如藉由本文所述之方法)。在一些實施例中，目標細胞部分可與其他目標細胞部分聚集在膜處。

在一些實施例中，目標細胞部分或複數個目標細胞部分在目標細胞(例如受體細胞)之膜中的存在產生一個界面，其可有助於目標細胞(例如受體細胞)上之目標細胞部分與供體細胞上之膜締合劑或靶向域之間的相互作用，例如結合。在一些實施例中，供體細胞上之膜締合劑或靶向域與目標細胞(例如受體細胞)上，例如目標細胞之膜(例如脂質雙層)上之目標細胞部分相互作用，例如結合，以誘導膜締合劑及/或一或多種載物分子自供體細胞轉移至目標細胞(例如受體細胞)膜。 膜締合劑

本文所述之供體細胞及受體細胞可包含膜締合劑。膜締合劑最少包含膜締合部分及細胞外部分、細胞內部分或載物分子中之一或多者。使用本文所述之方法，包含膜締合劑之供體細胞可將該膜締合劑及/或一或多種載物分子轉移至目標細胞，例如受體細胞。

在一些實施例中，膜締合劑包含超過一個膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子。在一些實施例中，膜締合劑之至少一個部分(例如膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子)對以下為外源性的：1)包含膜締合劑之供體；2)膜締合劑轉移或將轉移至之目標細胞，例如受體細胞；或3)兩者。在一些實施例中，外源性膜締合劑為融合蛋白。在一些實施例中，膜締合劑包含TCR或其功能片段或變異體，例如如本文所述，該TCR例如包含TCRα分子及/或TCRβ分子，或TCRγ分子及/或TCRδ分子。

在一些實施例中，對於給定外源性膜締合劑，膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子中之至少一者對供體細胞、受體細胞或前述細胞所源自之源細胞為外源性的。在一些實施例中，膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子中之至少一者(例如一者、兩者、三者或所有)對供體細胞或供體細胞所源自之源細胞為外源性的。在一些實施例中，膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子中之至少一者(例如一者、兩者、三者或所有)對受體細胞或受體細胞所源自之源細胞為外源性的。在一些實施例中，膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子中之至少一者(例如一者、兩者、三者或所有)對供體細胞、受體細胞或供體或受體細胞所源自之源細胞為外源性的。

在一些實施例中，對於既定外源性膜締合劑，膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分或載物分子中無一者對供體細胞、受體細胞或上述細胞所源自之源細胞為外源性的，但在單一試劑中該一或多個部分及/或分子之組合對供體細胞、受體細胞或上述細胞所源自之源細胞為外源性的。在一些實施例中，膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分及/或載物分子中之每一者對供體細胞、受體細胞或上述細胞所源自之源細胞為內源性的，但在單一試劑中該一或多個部分及/或分子之組合對供體細胞、受體細胞或上述細胞所源自之源細胞為外源性的。

膜締合劑可使供體細胞靶向目標細胞，例如受體細胞。在一些實施例中，膜締合劑可使供體細胞特異性靶向目標細胞(例如受體細胞)類型，且不使供體細胞靶向一或多種(例如兩種、三種、四種、五種、六種或更多種)非目標細胞類型。在一些實施例中，靶向包含膜締合劑與例如目標細胞、例如受體細胞之表面上的目標細胞部分結合。在一些實施例中，細胞外部分特異性結合於目標細胞部分(例如且不結合非目標細胞之表面上的其他部分或受體)。在一些實施例中，細胞外部分特異性結合於複數個目標細胞部分。不希望受理論束縛，認為增加膜締合劑、靶向域或細胞外部分結合之目標細胞部分之數目可以組合方式增加特異性。

膜締合劑可促進膜締合劑及/或一或多種載物分子自供體細胞轉移至目標細胞，例如受體細胞。在一些實施例中，膜締合劑可特異性促進自供體細胞轉移至目標細胞(例如受體細胞)類型，且不促進自供體細胞轉移至一或多種(例如兩種、三種、四種、五種、六種或更多種)非目標細胞類型。在一些實施例中，促進轉移包含膜締合劑與例如目標細胞、例如受體細胞之表面上的目標細胞部分結合。在一些實施例中，促進轉移包含細胞外部分與如上所述之目標細胞部分特異性結合。

在一些實施例中，膜締合劑包含膜締合部分(例如來自TCR蛋白之跨膜域，或來自CD28、CD8或CD3ζ蛋白之跨膜域)及細胞外部分(例如與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓))，例如來自TCR蛋白或例如包含抗體分子(例如抗體或其功能片段或變異體，例如scFv)之細胞外域。在一些實施例中，膜締合劑包含膜締合部分一種細胞內部分(例如與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓))，例如來自TCR蛋白(例如CD3ζ)之細胞內域。在一些實施例中，膜締合劑包含膜締合部分及載物分子(例如與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓))。在一些實施例中，可操作地締合或連接包含非共價相互作用。在一些實施例中，可操作地締合或連接包含共價相互作用，例如肽鍵或連接子。

在一些實施例中，膜締合劑包含例如來自TCR之膜締合部分、細胞外部分及細胞內部分。在一些實施例中，細胞外部分及細胞內部分與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓)。

在一些實施例中，膜締合劑包含膜締合部分、細胞外部分及一或多種載物分子。在一些實施例中，細胞外部分與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓)，且一或多種載物分子與細胞外部分可操作地締合或連接(例如繫栓)。在一些實施例中，細胞外部分及一或多種載物分子與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓)。在一些實施例中，細胞外部分及一或多種載物分子與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓)，且一或多種不同載物分子與細胞外部分可操作地締合或連接(例如繫栓)。

在一些實施例中，膜締合劑包含膜締合部分、細胞內部分及一或多種載物分子。在一些實施例中，細胞內部分與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓)，且一或多種載物分子與細胞內部分可操作地締合或連接(例如繫栓)。在一些實施例中，細胞內部分及一或多種載物分子與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓)。在一些實施例中，細胞內部分及一或多種載物分子與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓)，且一或多種不同載物分子與細胞內部分可操作地締合或連接(例如繫栓)。

在一些實施例中，膜締合劑包含膜締合部分、細胞外部分、細胞內部分及一或多種載物分子。在一些實施例中，細胞外部分及細胞內部分與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓)，且一或多種載物分子與細胞外部分可操作地締合或連接(例如繫栓)。在一些實施例中，細胞外部分及細胞內部分與膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓)，且一或多種載物分子與細胞內部分可操作地締合或連接(例如繫栓)。在一些實施例中，一或多種載物分子與膜締合劑之多個不同部分可操作地締合或連接(例如繫栓)。舉例而言，膜締合劑可包含膜締合部分、細胞外部分及細胞內部分，其中一或多種載物分子與選自膜締合部分、細胞外部分及細胞內部分之第一及第二部分或第一、第二及第三部分可操作地締合或連接(例如繫栓)。

在一些實施例中，膜締合劑包含肽、多肽、核酸(例如DNA、RNA、mRNA、siRNA、miRNA)、醣或多醣、脂質、小分子或其組合或複合物。在一些實施例中，膜締合劑為或包含融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白包含膜締合部分及細胞外部分與細胞內部分中之一或兩者。在一些實施例中，融合蛋白包含載物分子。在一些實施例中，膜締合劑包含融合蛋白(例如包含膜締合部分及視情況細胞外部分與細胞內部分中之一或兩者)及載物分子，其中該載物分子與融合蛋白可操作地締合或連接(例如繫栓)。在一些實施例中，該載物分子不藉由肽鍵連接於融合蛋白。

在一些實施例中，膜締合劑包含一或多種連接子。在一些實施例中，膜締合部分藉由連接子連接於另一部分(例如細胞外部分或細胞內部分)或載物分子。在一些實施例中，細胞外部分藉由連接子連接於載物分子。在一些實施例中，細胞內部分藉由連接子連接於載物分子。在一些實施例中，細胞外部分(例如特異性部分及輔助部分)或細胞內部分(例如功能部分及輔助部分)之部分藉由連接子連接。連接子包含兩個試劑之間(例如兩個部分之間)的共價連接或一系列連接。在一些實施例中，連接子包含例如肽，且兩種試劑經由肽鍵連接。在一些實施例中，連接子包含非胺基酸組分。在一些實施例中，用於膜締合劑之連接子為可撓性連接子。 T細胞受體(TCR)

如本文所述之供體或受體細胞可包含T細胞受體(TCR)分子(例如TCR)。一般而言，TCR為通常在T細胞表面上發現之蛋白質複合物或其功能片段或變異體，其能夠結合於呈遞同源肽之主要組織相容性複合體(MHC)分子(例如，HLA分子)。在一些實施例中，如本文所述之TCR為野生型TCR，例如來自哺乳動物(例如人類)之野生型TCR。在一些實施例中，如本文所述之TCR為經工程改造之TCR (例如非天然及/或經修飾之TCR，例如突變TCR或包含融合蛋白)。在一些實施例中，如本文所述之TCR包含作為對應野生型TCR蛋白之功能片段或變異體的一或多種TCR分子。

在一些實施例中，供體細胞或受體細胞包含TCR分子，例如如本文所述。

在一些實施例中，供體細胞或受體細胞包括包含T細胞受體(TCR)之多肽，例如T細胞受體融合蛋白(TFP)。在一些實施例中，膜締合劑或載物分子包含T細胞受體，例如TFP。在一些實施例中，TFP包含源自包含TCR之各種多肽之重組多肽，該TCR通常能夠i)結合於目標細胞上之表面抗原及ii)通常當共定位於T細胞之表面中或上時，與完整TCR複合物之其他多肽組分相互作用。在一些實施例中，TFP當在T細胞中表現時併入至TCR中。在一些實施例中，膜締合劑或載物分子包含(i)抗原結合域，該抗原結合域可操作地連接於(ii) TCR域。

在一些實施例中，TFP包括TCR次單元之細胞外域，其包含選自由以下組成之群之蛋白質的細胞外域或其部分：T細胞受體之α或β鏈、CD3δ、CD3ε或CD3γ或其功能片段或變異體。在一些實施例中，TCR域包括跨膜域，例如至少TCRα鏈、TCRβ鏈、CD3ε TCR次單元、CD3γ TCR次單元、CD3δ TCR次單元或CD3ζ TCR次單元或其功能片段或變異體之跨膜域的跨膜區。

在其他實施例中，TCR域包含TCR細胞內域，其包含選自CD3ε、CD3γ或CD3δ或其變異體之細胞內信號傳導域的刺激域。

在其他實施例中，TCR域包含(i) TCR細胞外域、(ii) TCR跨膜域及(iii) TCR細胞內域，其中(i)、(ii)及(iii)中之至少兩者或所有三者來自相同TCR次單元。

在一些實施例中，TCR域包含CD3ε或其功能片段或變異體。在一些實施例中，TCR域(例如基於CD3ε之TCR域)結合內源性CD3ζ。在一些實施例中，TCR域(例如基於CD3ε之TCR域)結合內源性CD3γ及/或內源性CD3δ。在一些實施例中，TCR域包含CD3α或其功能片段或變異體。在一些實施例中，TCR域包含CD3β或其功能片段或變異體。在一些實施例中，TCR域(例如基於CD3α或基於CD3β之TCR域)結合內源性CD3ζ。在一些實施例中，TCR域(例如基於CD3α之TCR域)結合內源性CD3β。在一些實施例中，TCR域(例如基於CD3β之TCR域)結合內源性CD3α。在一些實施例中，TCR域(例如基於CD3α之TCR域或基於CD3β之TCR域)結合內源性CD3δ。 T 細胞受體 (TCR) 作為膜締合劑

在一些實施例中，膜締合劑包含TCR蛋白(例如TCRα分子、TCRβ分子、TCRγ分子及/或TCRδ分子)或其功能片段或變異體。在一些實施例中，膜締合劑包含TCRα及/或TCRβ。在一些實施例中，膜締合劑包含TCRγ及/或TCRδ。在一些實施例中，膜締合劑包含CD3ζ分子或其功能片段或變異體。示例性人類TCR蛋白為此項技術中已知的。在一些實施例中，TCR蛋白包含DMF5 TCR或其功能片段或變異體。在一些實施例中，TCR蛋白包含OT-1 TCR或其功能片段或變異體。在一些實施例中，TCR、CAR或其功能片段特異性結合於呈遞同源肽(例如在受體細胞之表面上)之MHC。在一些實施例中，TCR或其功能片段包含結合於CD3ζ分子之TCRα分子及/或TCRβ分子。在一些實施例中，TCR分子對供體細胞為內源性的。在一些實施例中，TCR分子對供體細胞為外源性的。

在一些實施例中，膜締合劑包含對接部分(例如如本文所述之第一對接部分)。在實施例中，對接部分包含TCR分子或其功能片段或變異體之細胞外部分(例如細胞外域)。在實施例中，對接部分包含TCRα分子或其功能片段或變異體之細胞外部分(例如細胞外域)。在實施例中，對接部分包含TCRβ分子或其功能片段或變異體之細胞外部分(例如細胞外域)。在實施例中，對接部分包含TCRγ分子或其功能片段或變異體之細胞外部分(例如細胞外域)。在實施例中，對接部分包含TCRδ分子或其功能片段或變異體之細胞外部分(例如細胞外域)。

在一些實施例中，膜締合劑包含細胞內部分。在實施例中，細胞內部分包含TCR分子或其功能片段或變異體之細胞內部分。在實施例中，細胞內部分包含TCRα分子或其功能片段或變異體之細胞內部分(例如細胞內域)。在實施例中，細胞內部分包含TCRβ分子或其功能片段或變異體之細胞內部分(例如細胞內域)。在實施例中，細胞內部分包含TCRγ分子或其功能片段或變異體之細胞內部分(例如細胞內域)。在實施例中，細胞內部分包含TCRδ分子或其功能片段或變異體之細胞內部分(例如細胞內域)。在實施例中，細胞內部分包含CD3ζ分子或其功能片段或變異體(例如CD3ζ突變體，例如包含酪胺酸殘基之一或多個(例如1、2、3、4、5或6個)突變(例如突變成苯丙胺酸)之細胞內部分(例如細胞內域)。在一實施例中，細胞內部分包含CD3ζ YFx6，例如如本文所述。

在一些實施例中，膜締合劑包含膜締合部分(例如跨膜域)。在實施例中，膜締合部分包含TCR分子之或其功能片段或變異體之跨膜域。在實施例中，膜締合部分包含TCRα分子或其功能片段或變異體之膜締合部分(例如跨膜域)。在實施例中，膜締合部分包含TCRβ分子或其功能片段或變異體之膜締合部分(例如跨膜域)。在實施例中，膜締合部分包含TCRγ分子或其功能片段或變異體之膜締合部分(例如跨膜域)。在實施例中，膜締合部分包含TCRδ分子或其功能片段或變異體之膜締合部分(例如跨膜域)。在實施例中，膜締合部分包含CD3ζ分子或其功能片段或變異體之膜締合部分(例如跨膜域)。

在一些實施例中，膜締合劑與載物分子締合(例如共價結合，非共價結合，存在於具有載物分子之膜中，或共定位於具有載物分子之膜中)，例如如本文所述。在實施例中，載物分子不結合於膜締合劑，但附接於細胞膜(例如包含跨膜域及/或例如經由內葉繫鏈，例如Lck之棕櫚醯化/肉豆蔻醯化域繫栓至膜，例如如本文所述)。在實施例中，載物分子及膜締合劑存在於膜中之相同脂筏中。在一些實施例中，膜締合劑存在於細胞之細胞質中。

在實施例中，載物分子共價附接於膜締合劑(例如載物分子與至少一部分膜締合劑為融合蛋白)。在一實施例中，載物分子共價結合於TCRα分子、TCRβ分子、TCRγ分子或TCRδ分子。在一實施例中，載物分子例如在CD3ζ分子之C端處共價結合於CD3ζ分子。

在實施例中，載物分子非共價結合於膜締合劑(例如TCR、CAR或其功能片段或變異體)。在一實施例中，載物分子非共價結合於TCRα分子。在一實施例中，載物分子非共價結合於TCRβ分子。在一實施例中，載物分子非共價結合於TCRγ分子。在一實施例中，載物分子非共價結合於TCRδ分子。在一實施例中，載物分子非共價結合於CD3ζ分子。在一實施例中，載物分子包含ZAP70分子或其功能片段或變異體(例如ZAP70分子之SH2域)。在一實施例中，CAP70分子為人類ZAP70分子。

在一些實施例中，膜締合劑包含核酸結合域(例如在細胞內部分中)，例如其中載物分子為核酸分子(例如DNA或RNA)，例如如本文所述。在實施例中，膜締合劑例如在細胞內部分中包含DNA結合域。在實施例中，膜締合劑例如在細胞內部分中包含RNA結合域。在實施例中，RNA結合域包含來自病毒蛋白(例如病毒外殼蛋白，例如噬菌體外殼蛋白，例如MS2外殼蛋白)之RNA結合域。在實施例中，核酸結合域與膜締合劑之域或次單元締合(例如共價或非共價結合)。在實施例中，在膜締合劑中核酸結合域共價附接於CD3ζ分子或其功能片段或變異體。在實施例中，在膜締合劑中，核酸結合域結合於ZAP70分子或其功能片段或變異體(例如ZAP70分子之SH2域)，其又非共價結合於CD3ζ分子或其功能片段或變異體。

在一些實施例中，膜締合劑(例如包含TCR、CAR或其功能片段或變異體)誘導或促進供體細胞(例如T細胞或NK細胞)之活化。在實施例中，供體細胞之活化包含供體細胞對膜締合劑(例如TCR、CAR或其功能片段或變異體)之上調。 嵌合抗原受體 (CAR)

在一些實施例中，本發明提供包含嵌合抗原受體(CAR)或其功能片段之供體細胞及/或受體細胞。通常，CAR為一種重組多肽構築體，其包含抗原結合域(其為細胞外的)、跨膜域及細胞內部分(例如包含功能信號傳導域，例如源自刺激分子)。在一些實施例中，細胞內部分包含功能信號傳導域。在一些實施例中，細胞內部分不包含信號傳導域。在一些實施例中，細胞內部分包含非功能信號傳導域。在一些實施例中，CAR多肽構築體中的區域處於同一多肽鏈中，例如構成嵌合融合蛋白。在一些實施例中，CAR多肽構築體中之域彼此不相鄰，例如在不同多肽鏈中。在一些實施例中，抗原結合域包含抗體分子(例如抗體或其功能片段或變異體，例如scFv)。在一些實施例中，信號傳導域包含主要信號傳導域(例如CD3-ζ之主要信號傳導域)。在一些實施例中，信號傳導域包含源自至少一種共刺激分子，例如4-1BB、CD27及/或CD28之一或多個功能信號傳導域。在一些實施例中，CAR包括包含抗原結合域、跨膜域及包含源自刺激分子之功能信號傳導域之信號傳導域的嵌合融合蛋白。在一些實施例中，CAR包括包含抗原結合域、跨膜域及包含源自共刺激分子之功能信號傳導域及源自刺激分子之功能信號傳導域之信號傳導域的嵌合融合蛋白。在一些實施例中，CAR在CAR融合蛋白之胺基端處包含視情況選用之前導序列，其中該前導序列在CAR之細胞加工及定位至細胞膜期間視情況自抗原結合域(例如scFv)裂解。在一些實施例中，例如當CAR結合於目標細胞(例如受體細胞)上之目標部分(例如第二對接部分)時，信號傳導域誘導或促進供體細胞中之信號傳導。在實施例中，信號傳導域誘導或促進供體細胞之活化(例如為T細胞或NK細胞之供體細胞之活化)。

在一些情況下，CAR包含以下中之一者、二者或所有三者：(i)細胞外部分，例如包含第一對接部分(例如包含特異性結合於目標細胞、例如受體細胞上之目標部分(例如第二對接部分)的結合域)，(ii)膜締合部分(例如包含跨膜域，例如如本文所述)，及/或(iii)細胞內部分(例如如本文所述)。在一些實施例中，CAR之第一對接部分包含抗原結合域(例如抗體分子，例如抗體或其功能片段或變異體，例如scFv)。在一些實施例中，CAR之膜締合部分包含跨膜域。在一些實施例中，CAR之細胞內部分包含信號傳導域。

在一些實施例中，CAR包含於供體細胞之膜締合劑中。在一些實施例中，例如在CAR自供體細胞轉移之後，CAR包含於受體細胞中之膜締合劑中。在一些實施例中，載物分子結合於CAR (例如藉由其細胞外部分或細胞內部分)。在一些實施例中，載物分子與CAR (例如藉由其細胞外部分或細胞內部分)可操作地締合或連接(例如繫栓)。

在一些實施例中，供體細胞或受體細胞包含CAR (例如第一代CAR)或編碼第一代CAR之核酸。在一些實施例中，膜締合劑或載物分子包含CAR (例如第一代CAR)或編碼第一代CAR之核酸。在一些實施例中，第一代CAR包含抗原結合域、跨膜域及信號傳導域。在一些實施例中，信號傳導域介導T細胞活化期間之下游信號傳導。

在一些實施例中，供體細胞或受體細胞包含第二代CAR或編碼第二代CAR之核酸。在一些實施例中，膜締合劑或載物分子包含第二代CAR或編碼第二代CAR之核酸。在一些實施例中，第二代CAR包含抗原結合域、跨膜域及兩個信號傳導域。在一些實施例中，信號傳導域介導T細胞活化期間之下游信號傳導。在一些實施例中，信號傳導域為共刺激域。在一些實施例中，共刺激域增強T細胞活化期間之細胞介素產生、CAR T細胞增殖及或CAR T細胞持久性。

在一些實施例中，供體細胞或受體細胞包含第三代CAR或編碼第三代CAR之核酸。在一些實施例中，膜締合劑或載物分子包含第三代CAR或編碼第三代CAR之核酸。在一些實施例中，第三代CAR包含抗原結合域、跨膜域及至少三個信號傳導域。在一些實施例中，信號傳導域介導T細胞活化期間之下游信號傳導。在一些實施例中，信號傳導域為共刺激域。在一些實施例中，共刺激域增強T細胞活化期間之細胞介素產生、CAR T細胞增殖及或CAR T細胞持久性。在一些實施例中，第三代CAR包含至少兩個共刺激域。在一些實施例中，該至少兩個共刺激域係不同的。

在一些實施例中，供體細胞或受體細胞包含第四代CAR或編碼第四代CAR之核酸。在一些實施例中，膜締合劑或載物分子包含第四代CAR或編碼第四代CAR之核酸。在一些實施例中，第四代CAR包含抗原結合域、跨膜域及至少兩個、三個或四個信號傳導域。在一些實施例中，信號傳導域介導T細胞活化期間之下游信號傳導。在一些實施例中，信號傳導域為共刺激域。在一些實施例中，共刺激域增強T細胞活化期間之細胞介素產生、CAR T細胞增殖及或CAR T細胞持久性。在一些實施例中，與其他方面類似之CAR相比，CAR具有降低之殺滅能力(例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。在一些實施例中，與其他方面類似之CAR相比，CAR具有減少之細胞介素釋放(例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。

在一些實施例中，第一代、第二代、第三代或第四代CAR進一步包含在CAR之成功信號傳導後誘導細胞介素基因表現之域。在一些實施例中，細胞介素基因對於包含CAR之目標細胞為內源性或外源性的，該CAR包含在CAR之成功信號傳導後誘導細胞介素基因表現之域。在一些實施例中，細胞介素基因編碼促炎性細胞介素。在一些實施例中，細胞介素基因編碼IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF或IFN-γ，或其功能片段。在一些實施例中，在CAR之成功信號傳導後誘導細胞介素基因表現之域為或包含轉錄因子或其功能域或片段。在一些實施例中，在CAR之成功信號傳導後誘導細胞介素基因表現之域為或包含轉錄因子或其功能域或片段。在一些實施例中，轉錄因子或其功能域或片段為或包含活化T細胞核因子(NFAT)、NF-kB或其功能域或片段。參見例如Zhang. C.等人, Engineering CAR-T cells. Biomarker Research. 5:22 (2017)；WO 2016126608；Sha, H.等人 Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumour immunotherapy. Bioscience Reports, 2017年1月27日, 37 (1)。 CAR 抗原結合域

在一些實施例中，CAR (例如包含於供體細胞或受體細胞中，例如膜締合劑或載物分子中)包含抗原結合域(CAR抗原結合域)。在一些實施例中，CAR抗原結合域結合癌症締合抗原。在一些實施例中，抗原結合域為細胞外的。在一些實施例中，抗原結合域包含於如本文所述之對接部分(例如膜締合劑之第一對接部分)中。在一些實施例中，CAR抗原結合域為或包含抗體分子(例如抗體或其功能片段、變異體或抗原結合部分)。在一些實施例中，CAR抗原結合域為或包含scFv或Fab。在一些實施例中，CAR抗原結合域為或包含全長抗體(例如包含兩條重鏈及兩條輕鏈之抗體)。在一些實施例中，CAR抗原結合域(例如包含scFv或Fab片段之抗原結合域)結合選自以下之抗原：T細胞α鏈；T細胞β鏈；T細胞γ鏈；T細胞δ鏈；CCR7；CD3；CD4；CD5；CD7；CD8；CD11b；CD11c；CD16；CD19；CD20；CD21；CD22；CD25；CD28；CD34；CD35；CD40；CD45RA；CD45RO；CD52；CD56；CD62L；CD68；CD80；CD95；CD117；CD127；CD133；CD137 (4-1 BB)；CD163；F4/80；IL-4Ra；Sca-1；CTLA-4；GITR GARP；LAP；顆粒酶B；LFA-1；或運鐵蛋白受體。

在一些實施例中，CAR所結合之抗原為在受體細胞之表面上完全或作為片段(例如MHC/肽)表現且可用於藥理學劑與受體細胞之優先結合的分子(通常為蛋白質、碳水化合物或脂質)。

在一些實施例中，抗原結合域結合於目標細胞(例如受體細胞)之細胞表面抗原。在一些實施例中，細胞表面抗原為一種類型之細胞所特有。在一些實施例中，細胞表面抗原為超過一種類型之細胞所特有。在一些實施例中，CAR抗原結合域結合於細胞表面受體、膜轉運蛋白(例如主動或被動轉運蛋白，諸如離子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受體、膜酶及/或細胞黏附蛋白。在一些實施例中，CAR抗原結合域結合於G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶或組胺酸激酶相關受體。

在一些實施例中，CAR抗原結合域結合於T細胞受體(TCR)。在一些實施例中，T細胞受體可為AKT1；AKT2；AKT3；ATF2；BCL10；CALM1；CD3D (CD3δ)；CD3E (CD3ε)；CD3G (CD3γ)；CD4；CD8；CD28；CD45；CD80 (B7-1)；CD86 (B7-2)；CD247 (CD3ζ)；CTLA4 (CD152)；ELK1；ERK1 (MAPK3)；ERK2；FOS；FYN；GRAP2 (GADS)；GRB2；HLA-DRA；HLA-DRB1；HLA-DRB3；HLA-DRB4；HLA-DRB5；HRAS；IKBKA (CHUK)；IKBKB；IKBKE；IKBKG (NEMO)；IL2；ITPR1；ITK；JUN；KRAS2；LAT；LCK；MAP2K1 (MEK1)；MAP2K2 (MEK2)；MAP2K3 (MKK3)；MAP2K4 (MKK4)；MAP2K6 (MKK6)；MAP2K7 (MKK7)；MAP3K1 (MEKK1)；MAP3K3；MAP3K4；MAP3K5；MAP3K8；MAP3K14 (NIK)；MAPK8 (JNK1)；MAPK9 (JNK2)；MAPK10 (JNK3)；MAPK11 (p38β)；MAPK12 (p38γ)；MAPK13 (p38δ)；MAPK14 (p38α)；NCK；NFAT1；NFAT2；NFKB1；NFKB2；NFKBIA；NRAS；PAK1；PAK2；PAK3；PAK4；PIK3C2B；PIK3C3 (VPS34)；PIK3CA；PIK3CB；PIK3CD；PIK3R1；PKCA；PKCB；PKCM；PKCQ；PLCY1；PRF1 (Perforin)；PTEN；RAC1；RAF1；RELA；SDF1；SHP2；SLP76；SOS；SRC；TBK1；TCRA；TEC；TRAF6；VAV1；VAV2；或ZAP70。

在一些實施例中，CAR抗原結合域結合贅生性細胞，例如癌症所特有之抗原。在一些實施例中，癌症所特有之抗原係選自細胞表面受體、離子通道關聯受體、酶聯受體、G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶、組胺酸激酶相關受體、表皮生長因子受體(EGFR) (包括ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3及ErbB4/HER4)、纖維母細胞生長因子受體(FGFR) (包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18及FGF21)、血管內皮生長因子受體(VEGFR) (包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及PIGF)、RET受體及Eph受體家族(包括EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4及EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、斑萎蛋白(Bestrophin)、TMEM16A、GABA受體、甘胺酸受體、ABC轉運蛋白、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、神經鞘胺醇-1-磷酸受體(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多次跨越之跨膜蛋白、T細胞受體模體；T細胞α鏈；T細胞β鏈；T細胞γ鏈；T細胞δ鏈；CCR7；CD3；CD4；CD5；CD7；CD8；CD11b；CD11c；CD16；CD19；CD20；CD21；CD22；CD25；CD28；CD34；CD35；CD40；CD45RA；CD45RO；CD52；CD56；CD62L；CD68；CD80；CD95；CD117；CD127；CD133；CD137 (4-1 BB)；CD163；F4/80；IL-4Ra；Sca-1；CTLA-4；GITR；GARP；LAP；顆粒酶B；LFA-1；運鐵蛋白受體；NKp46、穿孔素、CD4+；Th1；Th2；Th17；Th40；Th22；Th9；Tfh、典型Treg. FoxP3+；Tr1；Th3；Treg17；T _REG；CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、黏蛋白、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、葉酸結合蛋白、神經節苷脂(例如CD2、CD3、GM2)、路易斯-γ ²(Lewis-γ ²)、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、肌腱蛋白、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、平滑受體(Smoothened)、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR或ANTXR1、葉酸受體α (FRa)、ERBB2 (Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生長因子受體(EGFR)、間皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16 (CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Ra1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、介白素-11受體a (IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、路易斯Y (LewisY)、CD24、血小板衍生生長因子受體-β (PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、蝶素(Ephrin)B2、IGF-1受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆莢蛋白、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺蛋白、存活素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位斷點(sarcoma translocation breakpoint)、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸羧酸酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A、B、C) CD49f、CD151 CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC或其抗原片段或抗原部分。在其他實施例中，抗原並非癌細胞所特有。在一些實施例中，抗原為正常細胞與癌細胞所表現之標記物，例如譜系標記物，例如B細胞上之CD19。

在一些實施例中，CAR抗原結合域結合感染性疾病(例如病毒感染或細菌感染)所特有之抗原。在一些實施例中，抗原為選自以下之感染性疾病所特有：HIV、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人類疱疹病毒、人類疱疹病毒8 (HHV-8，卡堡氏肉瘤相關疱疹病毒(Kaposi sarcoma-associated herpes virus，KSHV))、人類T-淋巴病毒-1 (HTLV-1)、梅克爾細胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus，MCV)、猿猴病毒40 (SV40)、埃-巴二氏病毒(Eptstein-Barr virus)、CMV、人類乳頭狀瘤病毒。在一些實施例中，感染性疾病所特有之抗原係選自細胞表面受體、離子通道關聯受體、酶聯受體、G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶或組胺酸激酶相關受體。在一些實施例中，CAR抗原結合域結合感染性疾病所特有之抗原，其中該抗原係選自HIV Env、gpl20或HIV-1 Env上CD4誘導之抗原決定基。參見例如WO2015/077789，其內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，CAR抗原結合域包含CD4或其HIV結合片段。在其他實施例中，抗原並非感染性疾病所特有。

在一些實施例中，CAR抗原結合域結合自體免疫性或發炎性病症所特有之抗原。在一些實施例中，抗原為選自以下之自體免疫性或發炎性病症所特有：慢性移植物抗宿主疾病(GVHD)、狼瘡、關節炎、免疫複合物腎絲球腎炎、古巴士德氏症(goodpasture)、葡萄膜炎、肝炎、全身性硬化症或硬皮病、I型糖尿病、多發性硬化症、冷凝集素病、尋常性天疱瘡、格雷氏病(Grave's disease)、自體免疫溶血性貧血、A型血友病、原發性休格連氏症候群(Sjogren's Syndrome)、血栓性血小板減少性紫癜、視神經脊髓炎、艾瓦氏症候群(Evan's syndrome)、IgM介導之神經病變、冷球蛋白血症、皮肌炎、特發性血小板減少症、僵直性脊椎炎、大皰性類天疱瘡、後天性血管性水腫、慢性蕁麻疹、抗磷脂脫髓鞘多發性神經病及自體免疫性血小板減少症或嗜中性球減少症或純紅血球發育不全，而同種免疫疾病之示例性非限制性實例包括來自造血或實體器官移植、輸血之同種致敏作用(參見例如Blazar等人, 2015, Am. J. Transplant, 15(4):931-41)或異種致敏作用、孕期胎兒同種致敏作用、新生兒同種免疫血小板減少症、新生兒溶血性疾病、對外來抗原過敏，諸如在用酶或蛋白質替代療法、血液製品及基因療法治療之遺傳性或獲得性缺乏病症之替代下可能發生。在一些實施例中，自體免疫性或發炎性病症所特有之抗原係選自細胞表面受體、離子通道關聯受體、酶聯受體、G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶或組胺酸激酶相關受體。在一些實施例中，CAR之抗原結合域與B細胞、漿細胞或漿母細胞上表現之配位體結合。在一些實施例中，CAR抗原結合域結合自體免疫性或發炎性病症所特有之抗原，其中該抗原係選自CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干擾素受體、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2。參見US 2003/0077249；WO 2017/058753；WO 2017/058850，其內容以引用之方式併入本文中。在其他實施例中，抗原並非自體免疫性或發炎性病症所特有。 CAR跨膜域

在一些實施例中，CAR (例如包含於供體細胞或受體細胞中，例如膜締合劑或載物分子中)包含跨膜域(「CAR跨膜域」)。在一些實施例中，膜締合劑之膜締合部分包含CAR跨膜域。在一些實施例中，CAR包含T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能變異體之至少跨膜區。在一些實施例中，CAR包含CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS及FGFR2B或其功能變異體之至少跨膜區。在一些實施例中，跨膜域包含疏水性α螺旋。在一些實施例中，跨膜域包含CD28跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含CD8跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含CD3ζ跨膜域。在一些實施例中，細胞內部分包含CD3ζ細胞內域或其功能片段或變異體。 CAR細胞內域

在一些實施例中，CAR (例如包含於供體細胞或受體細胞中，例如膜締合劑或載物分子中)在例如細胞內域中包含信號傳導域(「CAR信號傳導域」)。在一些實施例中，CAR包含功能信號傳導域。在一些實施例中，CAR包含非功能信號傳導域。在一些實施例中，CAR不包含信號傳導域。在一些實施例中，CAR包含誘導或促進細胞(例如供體細胞或受體細胞)，例如T細胞或NK細胞之活化的信號傳導域。在一些實施例中，細胞之活化包含細胞，例如T細胞或NK細胞對CAR之上調。在一些實施例中，CAR包含以下中之一或多者的信號傳導域：B7-1/CD80；B7-2/CD86；B7-H1/PD-L1；B7-H2；B7-H3；B7-H4；B7-H6；B7-H7；BTLA/CD272；CD28；CTLA-4；Gi24/VISTA/B7-H5；ICOS/CD278；PD-1；PD-L2/B7-DC；PDCD6)；4-1BB/TNFSF9/CD137；4-1BB配位體/TNFSF9；BAFF/BLyS/TNFSF13B；BAFF R/TNFRSF13C；CD27/TNFRSF7；CD27配位體/TNFSF7；CD30/TNFRSF8；CD30配位體/TNFSF8；CD40/TNFRSF5；CD40/TNFSF5；CD40配位體/TNFSF5；DR3/TNFRSF25；GITR/TNFRSF18；GITR配位體/TNFSF18；HVEM/TNFRSF14；LIGHT/TNFSF14；淋巴毒素-α/TNF-β；OX40/TNFRSF4；OX40配位體/TNFSF4；RELT/TNFRSF19L；TACI/TNFRSF13B；TL1A/TNFSF15；TNF-α；TNF RII/TNFRSF1B)；2B4/CD244/SLAMF4；BLAME/SLAMF8；CD2；CD2F-10/SLAMF9；CD48/SLAMF2；CD58/LFA-3；CD84/SLAMF5；CD229/SLAMF3；CRACC/SLAMF7；NTB-A/SLAMF6；SLAM/CD150)；CD2；CD7；CD53；CD82/Kai-1；CD90/Thy1；CD96；CD160；CD200；CD300a/LMIR1；HLA I類；HLA-DR；Ikaros；整合素α4/CD49d；整合素α4β1；整合素α4β7/LPAM-1；LAG-3；TCL1A；TCL1B；CRTAM；DAP12；C型凝集素-1 (Dectin-1)/CLEC7A；DPPIV/CD26；EphB6；TIM-1/KIM-1/HAVCR；TIM-4；TSLP；TSLP R；淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)；NKG2C、CD3ζ域、基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)或其功能變異體。在一些實施例中，如本文所述之CAR實質上不誘導細胞毒性信號傳導，或相對於參考CAR誘導減少之細胞毒性信號傳導(例如至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。在一些實施例中，CAR包含無信號傳導域之細胞內域。在一些實施例中，細胞內域包含例如能夠結合於載物分子之抗體分子(例如scFv)，例如如本文所述。

在一些實施例中，CAR包含信號傳導域，其為共刺激域。在一些實施例中，CAR包含第二共刺激域。在一些實施例中，CAR包含至少兩個共刺激域。在一些實施例中，CAR包含至少三個共刺激域。在一些實施例中，CAR包含選自以下中之一或多者的共刺激域：CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配位體。

在一些實施例中，CAR包含CD3ζ域或基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)或其功能變異體。在一些實施例中，CAR包含(i) CD3ζ域或基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)或其功能變異體；及(ii) CD28域或CD8域或4-1BB域或其功能變異體。在一些實施例中，CAR包含(i) CD3ζ域或基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)或其功能變異體；(ii) CD28域、CD8域或其功能片段或變異體；及(iii)4-1BB域或CD134域或其功能變異體。在一些實施例中，CAR包含(i) CD3ζ域或基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)或其功能變異體；(ii) CD28域、CD8域或其功能片段或變異體；(iii) 4-1BB共刺激域或CD134域或其功能變異體；及(iv)細胞介素或共刺激配位體轉殖基因。 CAR間隔子

在一些實施例中，CAR (例如包含於供體細胞或受體細胞中，例如膜締合劑或載物分子中)包含一或多個間隔子。在一些實施例中，CAR包含抗原結合域與跨膜域之間的間隔子。在一些實施例中，CAR在跨膜域與細胞內信號傳導域之間包含間隔子。

除本文所述之CAR以外，各種嵌合抗原受體及編碼其之核苷酸序列為此項技術中已知的且適用於自供體細胞轉移至受體細胞，例如如本文所述。參見例如WO2013040557；WO2012079000；WO2016030414；Smith T等人, Nature Nanotechnology. 2017. DOI: 10.1038/NNANO.2017.57，其公開內容均以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，例如供體細胞中包含的包含CAR之膜締合劑轉移至受體細胞。在一些實施例中，受體細胞可包括但可能不限於以下中之一或多者：單核球、巨噬細胞、嗜中性球、樹突狀細胞、嗜酸性球、肥大細胞、血小板、大顆粒淋巴球、蘭格漢氏細胞(Langerhans'cell)、自然殺手(NK)細胞、T淋巴球(例如T細胞)、γδ T細胞、B淋巴球(例如B細胞)且可來自任何生物體，包括但不限於人類、小鼠、大鼠、兔及猴。 抗體分子

在一些實施例中，CAR (例如在膜締合劑中)包含(例如在其細胞外部分中，例如對接部分中)抗體分子(例如抗體或其功能片段或變異體)。在一些實施例中，CAR包含全長抗體(例如包含兩條重鏈及兩條輕鏈之抗體)。在實施例中，抗體附接於與CAR之細胞外區(例如鏈黴抗生物素蛋白部分)結合之部分(例如生物素部分)。在一些實施例中，CAR包含抗體之抗原結合片段。抗原結合片段之非限制性實例包括：(i) Fab片段，由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，包含兩個在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之Fab片段的二價片段；(iii) Fd片段，由VH及CH1域組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂之VL及VH域組成；(v)雙功能抗體(dAb)片段，其由VH域組成；(vi)駱駝科或駱駝化可變域；(vii)單鏈Fv (scFv)，參見例如Bird等人 (1988) Science 242:423-426；及Huston等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)；(viii)單域抗體。此等抗體片段可使用任何適合方法(包括熟習此項技術者已知之若干習知技術)獲得，且可以與完整抗體相同之方式針對效用來篩選此等片段。

抗體分子之VH及VL區可進一步細分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插有稱為構架區(FR或FW)之更保守區。如本文所用之術語「互補決定區」或「CDR」係指在抗體可變區內賦予抗原特異性及結合親和力之胺基酸序列。如本文所用，術語「構架」、「FW」及「FR」可互換地使用。

構架區及CDR之範圍已藉由多種方法準確界定(參見Kabat, E. A.等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號；Chothia, C.等人 (1987) J. Mol. Biol.196:901-917；及Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體使用之AbM定義。一般參見例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. Antibody Engineering Lab Manual (編輯：Duebel, S.及Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)。在一實施例中，使用以下定義：重鏈可變域之CDR1之AbM定義及其他CDR之Kabat定義。在一實施例中，所有CDR均使用Kabat定義。另外，關於Kabat或AbM CDR進行描述之實施例亦可使用Chothia高變環實施。各VH及VL通常包括三個CDR及四個FR，其自胺基端至羧基端按以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。

在一些實施例中，抗體分子為單鏈抗體。單鏈抗體(scFV)可加以工程改造(參見例如Colcher, D.等人 (1999) Ann N Y Acad Sci880:263-80；及Reiter, Y. (1996) Clin Cancer Res2:245-52)。單鏈抗體可二聚或多聚以產生對相同目標蛋白之不同抗原決定基具有特異性的多價抗體。本文所揭示之抗體分子亦可為單域抗體。單域抗體可包括互補決定區為單域多肽之一部分的抗體。實例包括(但不限於)重鏈抗體、天然不含輕鏈之抗體、來源於習知4鏈抗體之單域抗體、經工程改造之抗體及除來源於抗體之骨架以外的單域骨架。單域抗體可為此項技術中之任一者，或任何未來之單域抗體。單域抗體可來源於任何物種，包括(但不限於)小鼠、人類、駱駝、美洲駝、魚、鯊魚、山羊、兔及牛。根據一些態樣，單域抗體為天然存在之單域抗體，稱為缺乏輕鏈之重鏈抗體。此類單域抗體揭示於例如WO 94/04678中。為清楚之故，來源於天然缺乏輕鏈之重鏈抗體的此可變域在本文中稱為VHH或奈米抗體，以與四鏈免疫球蛋白之習知VH區分。此類VHH分子可來源於駱駝科物種(例如駱駝、美洲駝、單峰駝、羊駝及栗色駱馬)中產生之抗體。除駱駝科之外的其他物種可產生天然缺乏輕鏈之重鏈抗體；亦考慮此類VHH。

在一實施例中，抗體分子為完全人類抗體(例如已經基因工程改造以自人類免疫球蛋白序列產生抗體之小鼠中產生的抗體)，或非人類抗體，例如嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)、山羊、靈長類動物(例如猴)、駱駝抗體。在一實施例中，非人類抗體為嚙齒動物(小鼠或大鼠抗體)。產生嚙齒動物抗體之方法為此項技術中已知。

人類單株抗體可使用攜有人類免疫球蛋白基因而非小鼠系統之轉殖基因小鼠產生。利用來自經所關注之抗原免疫接種之此等轉殖基因小鼠的脾細胞產生融合瘤，此等融合瘤分泌對來自人類蛋白質之抗原決定基具有特異性親和力之人類mAb (參見例如Wood等人, 國際申請案WO 91/00906；Kucherlapati等人, PCT公開案WO 91/10741；Lonberg等人, 國際申請案WO 92/03918；Kay等人, 國際申請案92/03917；Lonberg, N.等人, 1994 Nature368:856-859；Green, L.L.等人, 1994 Nature Genet.7:13-21；Morrison, S.L.等人, 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855；Bruggeman等人, 1993 Year Immunol7:33-40；Tuaillon等人, 1993 PNAS90:3720-3724；Bruggeman等人, 1991 Eur J Immunol21:1323-1326)。

抗體可為其中可變區或其部分(例如CDR)在非人類生物體(例如大鼠或小鼠)中產生之抗體。嵌合、CDR移植及人類化抗體皆屬於本發明內。非人類生物體(例如大鼠或小鼠)中產生且接著經修飾(例如在可變構架或恆定區中經修飾)以降低在人類中之抗原性的抗體屬於本發明內。

嵌合抗體可藉由任何適合重組DNA技術產生。若干技術在此項技術中已知(參見Robinson等人, 國際專利申請公開案第WO1987/002671號；Akira,等人 ,歐洲專利申請公開案第184,187號；Taniguchi, M., 歐洲專利申請公開案第171,496號；Morrison等人, 歐洲專利申請公開案第173,494號；Neuberger等人, 國際專利申請公開案第WO 86/01533號；Cabilly等人, 美國專利第4,816,567號；Cabilly等人, 歐洲專利申請公開案第125,023號；Better等人 (1988 Science240:1041-1043)；Liu等人 (1987) PNAS84:3439-3443；Liu等人, 1987, J. Immunol.139:3521-3526；Sun等人 (1987) PNAS84:214-218；Nishimura等人, 1987, Canc. Res.47:999-1005；Wood等人 (1985) Nature314:446-449；及Shaw等人, 1988, J. Natl Cancer Inst.80:1553-1559)。

人類化或CDR移植抗體中至少一個或兩個，但通常全部三個接受者CDR (重鏈及或輕鏈免疫球蛋白鏈之CDR)經供體CDR置換。抗體可經非人類CDR之至少一部分置換或僅一些CDR可經非人類CDR置換。僅需要置換人類化抗體與脂多醣結合所需之數目的CDR。在一實施例中，供體將為嚙齒動物抗體，例如大鼠或小鼠抗體，且接受者將為人類構架或人類共同構架。在一些實施例中，供體免疫球蛋白為非人類(例如嚙齒動物)。受體構架通常為天然存在之(例如人類)構架或共同構架，或與其約85%或更高(例如90%、95%、99%或更高)一致的序列。

抗體可藉由任何適合方法人類化，且此項技術中已知若干此類方法(參見例如Morrison, S. L., 1985, Science229:1202-1207；Oi等人, 1986, BioTechniques4:214；及Queen等人US 5,585,089、US 5,693,761及US 5,693,762，所有之內容皆以引用之方式併入本文中)。

人類化或CDR移植抗體可藉由CDR移植或CDR取代來產生，其中免疫球蛋白鏈中之一個、兩個或所有CDR可經置換。參見例如美國專利5,225,539；Jones等人 1986 Nature321:552-525；Verhoeyan等人 1988 Science239:1534；Beidler等人 1988 J. Immunol.141:4053-4060；Winter US 5,225,539，所有之內容皆明確地以引用之方式併入本文中)。Winter描述可用於製備人類化抗體之CDR移植方法(英國專利申請案GB 2188638A，1987年3月26日申請；Winter US 5,225,539)，內容明確地以引用的方式併入。

在一實施例中，抗體分子具有重鏈恆定區，該重鏈恆定區選自例如IgG1、IgG2 (例如IgG2a)、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE之重鏈恆定區；特定言之，選自例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之(例如人類)重鏈恆定區。在另一實施例中，抗體分子具有輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區選自例如κ或λ之(例如人類)輕鏈恆定區。恆定區可經改變，例如經突變以修改抗體分子之特性(例如以增加或減少以下中之一或多者：Fc受體結合、抗體糖基化、半胱胺酸殘基之數目、效應細胞功能及/或補體功能)。在一實施例中，抗體分子具有效應功能且可固定補體。在另一實施例中，抗體分子不募集效應細胞或固定補體。在某些實施例中，抗體分子具有降低的結合Fc受體之能力或不具有該能力。舉例而言，其可為不支持與Fc受體結合的同型或次型片段或其他突變體，例如其具有誘變或缺失之Fc受體結合區。

在一實施例中，改變抗體分子之恆定區。用於改變抗體恆定區之方法在此項技術中已知。可藉由用不同殘基置換抗體之恆定部分中之至少一個胺基酸殘基來產生功能改變，例如對效應子配位體(諸如細胞上之FcR)或補體之C1成分的親和力改變的抗體分子(參見例如EP 388,151 A1、美國專利第5,624,821號及美國專利第5,648,260號，所有之內容皆以引用之方式併入本文中)。亦考慮人類IgG4中使抗體結構穩定之胺基酸突變，諸如S228P (EU命名法，在Kabat命名法中為S241P)。可描述若應用於鼠類或其他物種免疫球蛋白則會降低或消除此等功能的類似變化類型。 CAR 作為膜締合劑

在一些實施例中，膜締合劑包含CAR。在一些實施例中，膜締合劑包含例如特異性結合於目標細胞(例如受體細胞)之表面上之部分的抗體分子(例如抗體或其功能片段、變異體或抗原結合片段，例如scFv)。在一些實施例中，膜締合劑包含CD3ζ分子或其功能片段或變異體。

在一些實施例中，膜締合劑包含對接部分(例如如本文所述之第一對接部分)。在實施例中，對接部分包含CAR之細胞外部分(例如細胞外域)。在實施例中，對接部分包含例如特異性結合於目標細胞(例如受體細胞)之表面上之部分(例如第二對接部分)的抗體分子(例如抗體或其功能片段、變異體或抗原結合片段，例如scFv)。在實施例中，對接部分包含與抗體分子締合，例如與抗體分子共價或非共價結合之部分。在實施例中，與抗體分子締合之對接部分之部分包含親和素，例如鏈黴抗生物素蛋白(例如包含附接於鏈黴抗生物素蛋白之mSA2域)，且抗體分子經生物素化。在一實施例中，抗體為抗CD19抗體。在一實施例中，抗體為抗HLA抗體(例如抗HLA-G抗體)。

在一些實施例中，膜締合劑包含細胞內部分。在實施例中，細胞內部分包含CD3ζ分子或其功能片段或變異體(例如CD3ζ突變體，例如包含酪胺酸殘基之一或多個(例如1、2、3、4、5或6個)突變(例如突變成苯丙胺酸)之細胞內部分(例如細胞內域)。在一實施例中，細胞內部分包含例如如本文所述，例如具有由SEQ ID NO: 1之核酸序列編碼之胺基酸序列或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之胺基酸序列的CD3ζ YFx6域。 ＞CD3z_YFx6-EGFP ( 大寫字母序列對應於 CD3 ζ YFx6 域 )gccaccATGAAGTGGAAAGTGTCTGTTCTCGCCTGCATCCTCCACGTGCGGTTCCCAGGAGCAGAGGCACAGAGCTTTGGTCTGCTGGACCCCAAACTCTGCTACTTGCTAGATGGAATCCTCTTCATCTACGGAGTCATCATCACAGCCCTGTACCTGAGAGCAAAATTCAGCAGGAGTGCAGAGACTGCTGCCAACCTGCAGGACCCCAACCAGCTCTTCAATGAGCTCAATCTAGGGCGAAGAGAGGAATTTGACGTCTTGGAGAAGAAGCGGGCTCGGGACCCAGAGATGGGAGGCAAACAGCAGAGGAGGAGGAACCCCCAGGAAGGCGTATTCAATGCACTGCAGAAAGACAAGATGGCAGAAGCCTTCAGTGAGATCGGCACAAAAGGCGAGAGGCGGAGAGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTTCCAGGGTCTCAGCACTGCCACCAAGGACACCTTTGATGCCCTGCATATGCAGACCCTGGCCCCTCGCccacccgtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtataagtga (SEQ ID NO: 1)

在一實施例中，膜締合劑包含野生型CD3ζ分子，例如包含胺基酸序列MKWKVSVLACILHVRFPGAEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR (SEQ ID NO: 39)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。

在實施例中，細胞內部分包含標記物(例如螢光標記，例如螢光蛋白，例如GFP、RFP、YFP或mCherry)。

在一些實施例中，膜締合劑包含膜締合部分(例如跨膜域)。在實施例中，膜締合部分包含CD28或其功能片段或變異體之膜締合部分(例如跨膜域)。在實施例中，膜締合部分包含CD8之膜締合部分(例如跨膜域)或其功能片段或變異體。在實施例中，膜締合部分包含CD3ζ分子或其功能片段或變異體之膜締合部分(例如跨膜域)。

在一些實施例中，膜締合劑與載物分子締合(例如共價結合，非共價結合，存在於具有載物分子之膜中，或共定位於具有載物分子之膜中)，例如如本文所述。在實施例中，載物分子不結合於膜締合劑，但附接於細胞膜(例如包含跨膜域及/或例如經由內葉繫鏈，例如Lck之棕櫚醯化/肉豆蔻醯化域繫栓至膜，例如如本文所述)。在實施例中，載物分子及膜締合劑存在於膜中之相同脂筏中。在一些實施例中，膜締合劑存在於細胞之細胞質中。

在實施例中，載物分子共價附接於膜締合劑(例如CAR)。在實施例中，載物分子與至少一部分膜締合劑為融合蛋白。在一實施例中，載物分子共價結合於膜締合劑之細胞內部分。在一實施例中，載物分子例如在CD3ζ分子之C端處共價結合於CD3ζ分子。

在實施例中，載物分子非共價結合於膜締合劑(例如CAR)。在一實施例中，載物分子非共價結合於膜締合劑之細胞內部分。在一實施例中，載物分子非共價結合於CD3ζ分子。在一實施例中，載物分子包含ZAP70分子或其功能片段或變異體(例如ZAP70分子之SH2域)。在一實施例中，ZAP70分子為人類ZAP70分子。

在一些實施例中，膜締合劑包含核酸結合域(例如在細胞內部分中)，例如其中載物分子為核酸分子(例如DNA或RNA)，例如如本文所述。在實施例中，膜締合劑例如在細胞內部分中包含DNA結合域。在實施例中，膜締合劑例如在細胞內部分中包含RNA結合域。在實施例中，RNA結合域包含來自病毒蛋白(例如病毒外殼蛋白，例如噬菌體外殼蛋白，例如MS2外殼蛋白)之RNA結合域。在實施例中，核酸結合域與膜締合劑之域或次單元締合(例如共價或非共價結合)。在實施例中，在膜締合劑中核酸結合域共價附接於CD3ζ分子或其功能片段或變異體。在實施例中，在膜締合劑中，核酸結合域結合於ZAP70分子或其功能片段或變異體(例如ZAP70分子之SH2域)，其又非共價結合於CD3ζ分子或其功能片段或變異體。

在一些實施例中，膜締合劑(例如包含CAR)誘導或促進供體細胞(例如T細胞或NK細胞)之活化。在實施例中，供體細胞之活化包含供體細胞對膜締合劑(例如CAR)之上調。 對外源性膜締合劑之修飾

在一些實施例中，可改變膜締合劑以降低免疫反應性。舉例而言，膜締合劑可用減少免疫相互作用之分子，諸如PEG裝飾(DOI: 10.1128/JVI.78.2.912-921.2004)。因此，在一些實施例中，膜締合劑包含PEG，例如為聚乙二醇化多肽。免疫系統所靶向之膜締合劑中之胺基酸殘基可經改變以未被免疫系統識別(doi: 10.1016/j.virol.2014.01.027, doi:10.1371/journal.pone.0046667)。在一些實施例中，改變膜締合劑之蛋白質序列以類似於在人類中發現之胺基酸序列(人類化)。在一些實施例中，將膜締合劑之蛋白質序列變成不太強有力地結合MHC複合體之蛋白質序列。在一些實施例中，膜締合劑至少部分地源自不感染人類(且人類尚未進行疫苗接種)之病毒或生物體，增加患者之免疫系統對膜締合劑為天然(例如對膜締合劑之體液或細胞介導之適應性免疫反應可忽略)的可能性(doi:10.1006/mthe.2002.0550、doi:10.1371/journal.ppat.1005641、doi:10.1038/gt.2011.209、DOI 10.1182/blood-2014-02-558163)。在一些實施例中，可改變膜締合劑之糖基化以改變相互作用或降低免疫反應性。不希望受理論束縛，在一些實施例中，來源於不感染人類之病毒或生物體的膜締合劑在患者中不具有天然目標細胞部分(例如其結合的)，且因此具有高特異性。

在一些實施例中，膜締合劑包含一或多個(例如一個、兩個、三個或更多個)由蛋白酶識別之裂解位點。在一些實施例中，蛋白酶不存在於供體細胞或供體細胞所源自之源細胞中。在一些實施例中，蛋白酶存在於受體細胞或受體細胞所源自之源細胞中。不希望受理論束縛，包含供體細胞中不存在之蛋白酶之裂解位點的膜締合劑可藉由供體細胞安全地運送，例如不會裂解。僅在轉移至含有適當蛋白酶(例如受體細胞)之細胞時，膜締合劑方裂解。示例性裂解位點包括但不限於TEV蛋白酶裂解位點及菱形小靜脈樣2 (RHBDL2)裂解位點。

在一些實施例中，膜締合劑在膜締合部分中包含裂解位點。在一些實施例中，膜締合劑在細胞外部分中包含裂解位點。在一些實施例中，膜締合劑在細胞內部分中包含裂解位點。在一些實施例中，膜締合劑包含一種蛋白質，該蛋白質直至自膜締合劑裂解方有活性或活化其功能。舉例而言，在一些實施例中，細胞內部分包含轉錄因子及裂解位點，其中在裂解之後，轉錄因子游離以易位至細胞核且改變轉錄。作為另一實例，在一些實施例中，細胞內部分包含藉由裂解轉型為活性酶之酶原。 膜締合部分

膜締合部分與膜(例如細胞膜)締合(例如位於膜中及/或膜上)或能夠與膜締合。通常，膜締合部分將膜締合劑定位至膜。

在一些實施例中，膜締合部分為或包含跨膜蛋白或跨膜蛋白之跨膜域。在一些實施例中，膜締合部分包含來自TCR蛋白(例如TCRα分子及/或TCRβ分子或TCRγ分子及/或TCRδ分子)之跨膜域。在一些實施例中，膜締合部分包含來自CD28、CD8或CD3ζ之跨膜域。在一些實施例中，膜締合部分包含脂質化修飾序列，例如N-肉豆蔻醯化、N-棕櫚醯化或S-棕櫚醯化序列，或適合於添加糖基化磷脂醯肌醇(GPI)之疏水性信號序列，例如包含肉豆蔻醯基、棕櫚醯基或GPI修飾。在一些實施例中，膜締合部分與膜脂質雙層之內部(例如胞質)部分締合。在一些實施例中，膜締合部分與膜脂質雙層之外部部分(例如與細胞表面或與如本文所述之供體細胞、受體細胞或膜封裝製劑之表面)締合。在一些實施例中，膜締合部分與膜脂質雙層之外部部分締合且為或包含細胞表面蛋白。在一些實施例中，膜締合部分為天然存在之蛋白質。在一些實施例中，膜締合部分為經工程改造及/或合成蛋白質。在一些實施例中，膜締合部分為治療劑。在一些實施例中，膜締合部分可操作地締合或連接(例如繫栓)於細胞內部分、細胞外部分或載物分子中之一或多者。

在一些實施例中，膜締合部分為或包含脂質化修飾序列。脂質化修飾序列包含由細胞、例如源細胞或供體細胞中存在之脂肪酸轉移酶識別及/或修飾之胺基酸序列。包含脂質化修飾序列之膜締合部分可附接有脂質錨，該脂質錨將膜締合部分締合，例如錨定至膜。在一些實施例中，脂質錨可附接於多肽(例如膜締合劑，例如膜締合部分)之末端。示例性脂質錨包括但不限於肉豆蔻醯基、棕櫚醯基、法呢基、糖基化磷脂醯肌醇(GPI)或CAAX域。示例性脂質化修飾序列為熟習此項技術者所知且包括但不限於肉豆蔻醯化或棕櫚醯化(MYR/PA)結合序列(例如來自LCK酪胺酸激酶之MYR/PA序列)。

在一些實施例中，膜締合部分為或包含膜蛋白，例如天然存在或合成膜蛋白(例如TCR蛋白，例如TCRα分子及/或TCRβ分子、TCRγ分子及/或TCRδ分子、CD28、CD8或CD3ζ)或其一部分。在一些實施例中，膜締合部分為或包含本文所述之膜蛋白或其一部分。

在一些實施例中，與本發明相關之膜蛋白為整合膜蛋白；在一些實施例中，膜蛋白為膜周邊蛋白。在其他實施例中，膜蛋白與膜暫時締合。在一些實施例中，膜蛋白為與目標細胞之膜締合，及/或完全或部分跨越(例如跨膜蛋白)膜之蛋白質。在一些實施例中，膜蛋白為單側整合蛋白(亦即，僅與膜一側締合)。在一些實施例中，膜蛋白與或變成與目標細胞之膜之外表面締合(例如部分或完全存在於外表面上)。在一些實施例中，膜蛋白與或變成與目標細胞之膜之內表面締合(例如部分或完全存在於內表面上)。

在一些實施例中，與本發明相關之膜蛋白為治療性膜蛋白。在一些實施例中，與本發明相關之膜蛋白為或包含受體(例如細胞表面受體及/或跨膜受體)、細胞表面配位體、膜轉運蛋白(例如主動或被動轉運蛋白，諸如離子通道蛋白、成孔蛋白[例如毒素蛋白]等)、膜酶及/或細胞黏附蛋白)。

在一些實施例中，與本發明相關之膜蛋白包含天然存在之膜蛋白之序列。在一些實施例中，與本發明相關之膜蛋白為或包含天然存在之膜蛋白之變異體或經修飾型式。在一些實施例中，與本發明相關之膜蛋白為或包含經工程改造之膜蛋白。在一些實施例中，與本發明相關之膜蛋白為或包含融合蛋白。 細胞外部分

細胞外部分為膜締合劑安置於膜(例如細胞膜)外部(例如非內腔或非胞質側)上的視情況存在之部分。在一些實施例中，細胞外部分包含一或多個特異性部分、一或多個輔助部分或兩者。在一些實施例中，細胞外部分包含來自TCR蛋白(例如TCRα分子及/或TCRβ分子或TCRγ分子及/或TCRδ分子)之細胞外域或其一部分。在實施例中，細胞外部分附接於與所關注結合分子(例如抗體分子)結合之結合部分(例如親和素部分，例如鏈黴抗生物素蛋白部分)，該結合分子附接於與細胞外部分之結合部分結合的同源結合部分(例如生物素部分)。在一些實施例中，細胞外部分包含抗體分子(例如抗體或其功能片段，例如scFv)，例如如本文所述。在一些實施例中，抗體分子特異性結合於目標細胞(例如受體細胞)之表面上之分子上的抗原決定基，例如受體細胞之對接部分上之抗原決定基。

在一些實施例中，細胞外部分包含特異性部分，該特異性部分可包含靶向域或轉移促進域。在一些實施例中，靶向域特異性地(例如在暴露、例如供體細胞接觸/接近受體細胞之條件下)與目標細胞部分締合或相互作用。在一些實施例中，靶向域特異性地結合於目標細胞上存在之目標細胞部分。在一些實施例中，靶向域為或包含膜締合劑之域，例如共價連接於膜締合劑，例如為膜締合劑多肽之一部分。在一些實施例中，靶向域為來自任何外源性膜締合劑之單獨實體，例如不共價連接於膜締合劑，例如不為膜締合劑多肽之一部分。在一些實施例中，靶向域例如藉由結合目標細胞上之目標細胞部分或由目標細胞上之目標細胞部分結合來促進供體細胞與目標細胞、例如受體細胞之間的接觸。在一些實施例中，細胞外部分，例如特異性部分，例如靶向域，包含膜蛋白或其一部分(例如本文所述之膜蛋白)。示例性特異性部分(例如靶向域)包括但不限於抗體分子，例如抗體或其功能片段(例如Fab、F(ab')2、Fab'、scFv或雙-scFv)；鏈黴抗生物素蛋白域(例如與生物素化劑、例如生物素化抗體締合)；受體(例如表面受體) (例如特異性結合受體細胞上之配位體)；配位體(例如結合受體細胞上之目標細胞部分，例如受體之配位體)、細胞表面蛋白、糖或脂質。

在一些實施例中，轉移促進域促進膜締合劑自第一細胞(例如供體細胞)之膜轉移至第二細胞(例如受體細胞)之膜。示例性特異性部分，例如轉移促進域，包括但不限於一或多種TCR蛋白(例如TCRα分子及/或TCRβ分子或TCRγ分子及/或TCRδ分子)之細胞外域。

在一些實施例中，輔助部分提供對膜締合劑之輔助功能，例如與供體細胞靶向受體細胞無關或促進轉移。在一些實施例中，輔助部分包含標籤(例如標記(例如螢光或放射性標記)或裂解位點)、報導劑或標記物中之一或多者。 細胞內部分

細胞內部分為膜締合劑安置於膜(例如細胞膜)內部(例如內腔或胞質側)上的視情況存在之部分。在一些實施例中，細胞內部分包含一或多個功能部分、一或多個輔助部分或兩者。在一些實施例中，細胞內部分包含來自TCR蛋白(例如TCRα分子及/或TCRβ分子或TCRγ分子及/或TCRδ分子)之細胞內域。在一些實施例中，細胞內部分包含CD3ζ分子。

在一些實施例中，細胞內部分包含調節受體細胞中之生物功能(例如且視情況不調節或在較低程度上調節供體細胞中之生物過程)的功能部分。示例性調節包括但不限於：改變(例如減少或增加)基因表現、表觀遺傳修飾、增加或減少細胞內或細胞間信號傳導路徑之活性、改變一或多種細胞組分(例如信號傳導分子或蛋白質)之穩定性(例如降解及/或半衰期)、改變生物效應子之分泌、改變細胞代謝、誘導或抑制細胞遷移、誘導或抑制細胞凋亡或改變細胞之效力或細胞身分/分化。在一些實施例中，細胞內部分包含調節供體細胞中之生物功能(例如促進或誘導作為T細胞或源自T細胞之供體細胞之活化)的功能部分。

在一些實施例中，生物功能係選自： (i)    調節，例如增加或降低受體細胞或複數個受體細胞中分子(例如蛋白質、核酸或代謝物、藥物或毒素)之含量或活性； (ii)   調節，例如增加或降低受體細胞或複數個受體細胞中之酶活性； (iii)  調節，例如增加或降低受體細胞或複數個受體細胞中之遺傳或表觀遺傳事件； (iv)   調節，例如促進或抑制受體細胞分化或複數個受體細胞之分化； (v)    調節受體細胞再程式化；或 (vi)   調節，例如活化或抑制受體細胞或複數個受體細胞中之信號傳導路徑； (vii)  調節，例如增加、減少或重新分佈細胞黏附或運輸； (viii) 將基因改變(例如取代、插入或缺失)引入至受體細胞或複數個受體細胞中，例如插入外源性核酸(例如編碼基因)或內源性基因發生突變(例如基因剔除)。

在一些實施例中，細胞內部分，例如功能部分，包含以下中之一或多者：抗體或其功能片段(例如Fab、F(ab')2、Fab'、scFv或雙-scFv)、報導劑(例如螢光標籤)、信號傳導蛋白、酶(或其功能部分)、轉錄因子、表觀遺傳重塑劑、蛋白質結合域、RNA結合蛋白或域、疏水域、脂筏靶向域或藥物結合域。在一些實施例中，細胞內部分，例如功能部分，包含EGFP、β-半乳糖苷酶、β-內醯胺酶、Cre重組酶、CRISPR/Cas蛋白質(例如Cas9)及視情況引導RNA，或其任一者之功能部分或變異體。在一些實施例中，細胞內部分，例如功能部分，包含核酸結合域，例如RNA結合蛋白或域，例如mRNA結合蛋白或域。

在一些實施例中，細胞內部分，例如功能部分，包含結合於另一試劑之試劑(例如包含結合於載物分子之蛋白質)。在一些實施例中，細胞內部分，例如功能部分，包含MS2外殼蛋白(例如結合於mRNA)、scFV (例如結合於蛋白質或細胞器)、蛋白質結合對之一個部分(例如結合於蛋白質結合對之其他搭配物)、鏈黴抗生物素蛋白(例如結合於生物素或生物素結合劑)、細胞器特異性整合膜蛋白(例如與細胞器結合或締合)、CRISPR蛋白(例如Cas9、Cas12或MAD7蛋白) (例如與引導序列、例如gRNA結合或締合)或聚腺苷酸結合蛋白(例如與mRNA結合或締合)。

在一些實施例中，輔助部分向膜締合劑提供輔助功能，例如與功能部分之一或多種功能不相關。在一些實施例中，輔助部分包含標籤(例如標記(例如螢光或放射性標記)或裂解位點)、報導劑或標記物中之一或多者。在一些實施例中，細胞內部分，例如輔助部分，包含Lumio標籤、TEV蛋白酶裂解位點或菱形蛋白酶裂解位點，例如RHBDL2。

在一些實施例中，細胞內部分包含裂解位點。在一些實施例中，目標細胞(例如受體細胞)包含識別細胞內部分裂解位點之蛋白酶，但供體細胞不包含識別細胞內部分裂解位點之蛋白酶。不希望受理論束縛，認為此將允許包含可裂解細胞內部分之膜締合劑由供體細胞遞送，不會裂解，其中在到達目標細胞(例如受體細胞)之後，蛋白酶將識別位點且使細胞內部分或其一部分裂解。在一些實施例中，細胞內部分之裂解活化細胞內部分或其一部分之功能(例如酶促或信號傳導功能)。在一些實施例中，細胞內部分之裂解引起細胞內部分或其一部分例如自膜締合劑及/或膜解離，且使得其能夠滿足其功能。舉例而言，細胞內部分可包含可裂解Cre重組酶或轉錄因子，其中Cre重組酶或轉錄因子需要易位至細胞核方可發揮功能，且裂解使得能夠進行該易位。 載物分子

在一些實施例中，本文所述之供體細胞包括載物分子。在一些實施例中，載物分子為可自第一膜(例如供體細胞)轉移至第二膜(例如受體細胞膜)之試劑。可藉由膜締合劑促進載物分子之轉移。載物分子可與膜締合劑非共價締合，經由非肽鍵共價締合，或不與膜締合劑締合(例如且分別與例如供體細胞或受體細胞之膜締合)。

在一些實施例中，載物分子包含以下中之一或多種：蛋白質，例如酶、跨膜蛋白、受體或抗體；核酸，例如環狀或線性核酸，例如DNA、染色體(例如人類人工染色體)或RNA，例如mRNA、siRNA、miRNA、piRNA或lncRNA；脂質；或小分子(例如信號傳導分子(例如第二信使)或藥物分子)。在一些實施例中，載物為或包含細胞器。

在一些實施例中，載物分子可為或可編碼治療性蛋白質。在一些實施例中，本文所述之供體細胞包括為或包含複數個治療劑之載物分子。在一些實施例中，載物分子可為相對於供體細胞、受體細胞或上述細胞所源自之源細胞為外源性或內源性的治療劑。

在一些實施例中，供體細胞或受體細胞包含複數個不同載物分子。在一些實施例中，供體細胞或受體細胞包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種載物分子(及視情況不超過20、15或10種不同載物分子)。舉例而言，供體細胞可包括包含第一治療劑之第一載物分子及包含第二不同治療劑之第二載物分子。

在一些實施例中，供體細胞包含與供體細胞脂質雙層締合之載物分子。在一些實施例中，供體細胞包含安置於供體細胞之胞質液或內腔內之載物分子。在一些實施例中，供體細胞包含與供體細胞脂質雙層締合之載物分子及安置於供體細胞之胞質液或內腔內之載物分子。

在一些實施例中，載物分子不在供體細胞或供體細胞所源自之源細胞中天然表現。在一些實施例中，載物分子在供體細胞或供體細胞所源自之源細胞中天然表現。在一些實施例中，載物分子為在供體細胞或供體細胞所源自之源細胞中天然表現之野生型核酸或蛋白質的突變體，或載物分子為在供體細胞或供體細胞所源自之源細胞中天然表現之突變載物分子的野生型變異體。

在一些實施例中，載物分子經由在供體細胞所源自之源細胞中表現(例如自經由轉染、轉導或電穿孔引入之DNA表現)而負載至供體細胞中。在一些實施例中，載物分子自整合至供體細胞所源自之源細胞之基因體中或以游離體方式維持在供體細胞所源自之源細胞中的DNA表現。在一些實施例中，載物分子在供體細胞所源自之源細胞中組成性表現。在一些實施例中，誘導載物分子在供體細胞所源自之源細胞中表現。在一些實施例中，在即將產生供體細胞時，載物分子在供體細胞所源自之源細胞中誘導性表現。在一些實施例中，在膜締合劑在供體細胞所源自之細胞中表現的同時，誘導載物分子在供體細胞所源自之源細胞中表現。

在一些實施例中，載物分子經由電穿孔至供體細胞本身中或電穿孔至供體細胞所源自之源細胞中而負載至供體細胞中。在一些實施例中，載物分子經由轉染至供體細胞本身中或轉染至供體細胞所源自之源細胞中而負載至供體細胞中。

在一些實施例中，載物分子可包括一或多種核酸序列、一或多種多肽、核酸序列及/或多肽之組合、一或多種細胞器及其任何組合。在一些實施例中，載物分子可包括一或多種細胞組分。在一些實施例中，載物分子包括一或多種胞質及/或核組分。

在一些實施例中，載物分子包括核酸，例如DNA、nDNA (核DNA)、mtDNA (粒線體DNA)、蛋白質編碼DNA、基因、操縱子、染色體、基因體、轉座子、反轉錄轉座子、病毒基因體、內含子、外顯子、經修飾之DNA、mRNA (信使RNA)、tRNA (轉運RNA)、經修飾之RNA、微小RNA、siRNA (小干擾RNA)、tmRNA (轉運信使RNA)、rRNA (核糖體RNA)、mtRNA (線粒體RNA)、snRNA (小核RNA)、小核仁RNA (snoRNA)、SmY RNA (mRNA反式剪接RNA)、gRNA (引導RNA)、TERC (端粒酶RNA組分)、aRNA (反義RNA)、順式-NAT (順式-天然反義轉錄本)、CRISPR RNA (crRNA)、lncRNA (長非編碼RNA)、piRNA (piwi相互作用之RNA)、shRNA (短髮夾RNA)、tasiRNA (反式作用siRNA)、eRNA (強化子RNA)、衛星RNA、pcRNA (蛋白質編碼RNA)、dsRNA (雙股RNA)、RNAi (干擾RNA)、circRNA (環狀RNA)、再程式化RNA、適體及其任何組合。在一些實施例中，核酸為野生型核酸。在一些實施例中，蛋白質為突變核酸。在一些實施例中，核酸為多個核酸序列之融合物或嵌合體。

在一些實施例中，載物分子可包括核酸。舉例而言，載物分子可包含增強內源性蛋白質(例如在一些實施例中，相對於源細胞為內源性的，且在一些實施例中，相對於目標細胞為內源性的)之表現的RNA，或抑制內源性蛋白質之蛋白質表現的siRNA或miRNA。舉例而言，內源性蛋白質可調節目標細胞(例如受體細胞)中之結構或功能。在一些實施例中，載物分子可包括編碼調節目標細胞(例如受體細胞)中之結構或功能之經工程改造之蛋白質的核酸。在一些實施例中，載物分子為靶向調節目標細胞(例如受體細胞)中之結構或功能之轉錄活化因子的核酸。

在一些實施例中，載物分子包含自複製RNA，例如如本文所述。在一些實施例中，自複製RNA為單股RNA及/或線性RNA。在一些實施例中，自複製RNA編碼一或多種蛋白質，本文所述之蛋白質，例如膜蛋白或分泌蛋白。在一些實施例中，自複製RNA包含來自動脈炎病毒屬或α病毒之部分或完整基因體，或其變異體。

在一些實施例中，載物分子可包含可遞送至目標細胞(例如受體細胞)中之RNA，且RNA在目標細胞(例如受體細胞)內複製。自複製RNA之複製可涉及對目標細胞(例如受體細胞)為外源性的RNA複製機制，及/或對目標細胞(例如受體細胞)為內源性的RNA複製機制。

在一些實施例中，自複製RNA包含病毒基因體或其自複製部分或類似物。在一些實施例中，自複製RNA來自正義單股RNA病毒。在一些實施例中，自複製RNA包含部分或完整動脈炎病毒屬基因體或其變異體。在一些實施例中，動脈炎病毒屬包含馬動脈炎病毒(EAV)、豬呼吸及繁殖症候群病毒(PRRSV)、乳酸脫氫酶升高病毒(LDV)及猴出血熱病毒(SHFV)。在一些實施例中，自複製RNA包含部分或完整α病毒基因體或其變異體。在一些實施例中，α病毒屬於VEEV/EEEV組(例如委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus))、SF組或SIN組。

在一些實施例中，包含自複製RNA之供體細胞進一步包含：(i)一或多種促進RNA複製之蛋白質；或(ii)編碼一或多種促進RNA複製之蛋白質之核酸，例如作為自複製RNA之部分或在單獨核酸分子中。

在一些實施例中，相對於對應野生型基因體，自複製RNA缺乏編碼一或多種病毒結構蛋白之至少一種功能基因。舉例而言，在一些實施例中，自複製RNA完全缺乏病毒結構蛋白之一或多種基因或包含病毒結構蛋白之非功能性突變基因。在一些實施例中，自複製RNA不包含病毒結構蛋白之任何基因。

在一些實施例中，自複製RNA包含病毒衣殼強化子，例如如國際申請案WO2018/106615 (以全文引用之方式併入本文中)中所述。在一些實施例中，病毒衣殼強化子為一種RNA結構，其例如藉由允許編碼序列之非eIF2α依賴性轉譯而增加編碼序列之順式轉譯。在一些實施例中，宿主細胞例如由於PKR介導之eIF2α磷酸化而具有減弱之轉譯。在實施例中，病毒衣殼強化子包含來自病毒衣殼蛋白之下游環路(DLP)或DLP變異體。在一些實施例中，病毒衣殼強化子來自屬於披膜病毒科(Togaviridae)之病毒，例如披膜病毒科α病毒屬。在一些實施例中，病毒衣殼強化子具有WO2018/106615之SEQ ID NO: 1之序列(該序列以全文引用之方式併入本文中)，或與其具有至少70%、80%、85%、90%、95%或99%一致性之序列。在一些實施例中，序列具有WO2018/106615之圖1中所示的相同二級結構。

在一些實施例中，自複製RNA包含一或多種動脈炎病毒屬序列，例如如國際申請案WO2017/180770 (以全文引用之方式併入本文中)中所述。在一些實施例中，自複製RNA包含動脈炎病毒屬之ORF7 (或其功能片段或變異體)及/或自複製RNA缺乏功能性ORF2a (例如完全缺乏ORF2a，或包含ORF2a之非功能性突變體)。在一些實施例中，自複製RNA缺乏功能性ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5或ORF6或其任何組合(例如完全缺乏該(等)序列或包含序列之非功能性突變體)。在一些實施例中，自複製RNA缺乏ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5或ORF6中之一或多者之一部分。在一些實施例中，自複製RNA包含一或多種例如位於非天然位點之次基因體(sg)啟動子。在一些實施例中，啟動子包含sg啟動子1、sg啟動子2、sg啟動子3、啟動子4、sg啟動子5、sg啟動子6、sg啟動子7或其功能片段或變異體。在一些實施例中，自複製RNA包含一或多種轉錄終止信號，例如T7轉錄終止信號，例如突變T7轉錄終止信號，例如包含T9001G、T3185A或G3188A中之一或多者(例如任兩者或所有)的突變T7轉錄終止信號。

在一些實施例中，自複製RNA包含5' UTR，例如突變α病毒5' UTR，例如如國際申請案WO2018/075235 (以全文引用之方式併入本文中)中所述。在一些實施例中，突變α病毒5' UTR包含位置1、2、4處之一或多個核苷酸取代或其組合。在一些實施例中，突變α病毒5' UTR包含位置2處之U-＞ G取代。

在一些實施例中，載物分子包括蛋白質，例如酶、結構多肽、信號傳導多肽、調控多肽、轉運多肽、感覺多肽、運動多肽、防禦多肽、儲存多肽、轉錄因子、抗體、細胞介素、激素、分解代謝多肽、合成代謝多肽、蛋白水解多肽、代謝多肽、激酶、轉移酶、水解酶、裂解酶、異構酶、接合酶、酶調節型多肽、蛋白質結合多肽、脂質結合多肽、膜融合多肽、細胞分化多肽、表觀遺傳多肽、細胞死亡多肽、核轉運多肽、核酸結合多肽、再程式化多肽、DNA編輯多肽、DNA修復多肽、DNA重組多肽、轉座酶多肽、DNA整合多肽、目標核酸內切酶(例如鋅指核酸酶、轉錄活化因子樣核酸酶(TALEN)、cas9及其同源物)、重組酶、同源域蛋白、清道夫受體配位體、Ran GTP酶、RanQ69L及其任何組合。在一些實施例中，蛋白質靶向受體細胞中之蛋白質以進行降解。在一些實施例中，蛋白質靶向受體細胞中之蛋白質以藉由將蛋白質定位至蛋白酶體而進行降解。在一些實施例中，蛋白質為野生型蛋白質。在一些實施例中，蛋白質為突變蛋白。在一些實施例中，蛋白質為融合或嵌合蛋白。

在一些實施例中，載物分子為或包含受體、配位體或其中任一者之功能部分。在一些實施例中，受體為本文所述之受體，例如RTK或清道夫受體。

在一些實施例中，載物分子為或包含癌症驅動因子，例如由癌症驅動基因編碼之蛋白質或基因產物，如Bailey等人 Cell. 2018年4月5日;173(2):371-385中所述，其清單以引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，載物分子為或包含分化簇蛋白或其功能部分或變異體。

在一些實施例中，載物分子為在細胞膜表面上(例如質膜表面上)天然發現之蛋白質(或編碼其之核酸)。

示例性膜蛋白(及/或編碼其之核酸)包括本文所述之任何膜蛋白，且可見於例如美國專利公開案第2016/0289674號，該案之內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，載物分子(及/或編碼其之核酸)具有如美國專利公開案第2016/0289674號之SEQ ID NO: 8144-16131中之任一者中所示的序列，或其功能片段。在一些實施例中，載物分子為如美國專利公開案第2016/0289674號之SEQ ID NO: 8144-16131中之任一者中所示之質膜蛋白(編碼其之核酸)，或質膜蛋白之片段、變異體或同源物(或編碼其之核酸)。

在一些實施例中，與本發明相關之膜蛋白為治療性膜蛋白。在一些實施例中，與本發明相關之膜蛋白為或包含細胞表面受體、膜轉運蛋白(例如主動或被動轉運蛋白，諸如離子通道蛋白、成孔蛋白[例如毒素蛋白]等)、膜酶及/或細胞黏附蛋白)。

在一些實施例中，膜蛋白為單次跨越膜蛋白。在一些實施例中，單次跨越膜蛋白可採用具有胞質N端及胞質外C端(N _cyt/C _exo)或具有相反取向(N _exo/C _cyt)之最終拓樸結構。

在一些實施例中，膜蛋白為包含N端可裂解信號序列及停止轉移序列(N _exo/C _cyt)之I型膜蛋白。在一些實施例中，信號在C端。在一些實施例中，N端可裂解信號序列使新生肽靶向ER。在一些實施例中，N端可裂解信號序列包含通常7-15個主要為非極性殘基之疏水性區段。在一些實施例中，I型膜蛋白包含停止轉移序列，該序列停止多肽之進一步易位且充當跨膜錨。在一些實施例中，停止轉移序列包含約20個疏水性殘基之胺基酸序列。在一些實施例中，I型膜蛋白之N端為細胞外的且C端為細胞質的。在一些實施例中，I型膜蛋白可為血型糖蛋白或LDL受體。

在一些實施例中，膜蛋白為包含信號錨定序列(N _cyt/C _exo)之II型膜蛋白。在一些實施例中，信號在C端。在一些實施例中，信號錨定序列負責II型膜蛋白之插入及錨定兩方面。在一些實施例中，信號錨定序列包含約18-25個主要為非極性之殘基。在一些實施例中，信號錨定序列缺乏信號肽酶裂解位點。在一些實施例中，信號錨定序列可安置於多肽鏈內部。在一些實施例中，信號錨定序列誘導蛋白質之C端跨越細胞膜易位。在一些實施例中，II型膜蛋白之C端為細胞外的且N端為細胞質的。在一些實施例中，II型膜蛋白可為運鐵蛋白受體或半乳糖苷轉移酶受體。

在一些實施例中，膜蛋白為包含反向信號錨定序列(N _exo/C _cyt)之III型膜蛋白。在一些實施例中，信號在N端。在一些實施例中，反向信號錨定序列負責III型膜蛋白之插入及錨定兩方面。在一些實施例中，反向信號錨定序列包含約18-25個主要為非極性之殘基。在一些實施例中，信號錨定序列缺乏信號肽酶裂解位點。在一些實施例中，信號錨定序列可安置於多肽鏈內部。在一些實施例中，信號錨定序列誘導蛋白質之N端跨越細胞膜易位。在一些實施例中，III型膜蛋白之N端為細胞外的且C端為細胞質的。在一些實施例中，I型膜蛋白可為突觸結合蛋白、神經調節蛋白或細胞色素P-450。

在一些實施例中，I型、II型或III型膜蛋白經由包含SRP、SRP受體及Sec61易位子之細胞路徑插入至細胞膜中。

在一些實施例中，膜蛋白主要暴露於胞質液且藉由C端信號序列錨定至膜，但不與SRP相互作用。在一些實施例中，蛋白質為細胞色素 b ₅，或SNARE蛋白(例如突觸泡蛋白)。

在一些實施例中，載物分子包含使載物分子定位至細胞膜之信號序列。在一些實施例中，載物分子為一種核酸，其中該核酸編碼使由該核酸編碼之蛋白質定位至細胞膜之信號序列。

在一些實施例中，載物分子包括小分子，例如離子(例如Ca ²⁺、Cl ^-、Fe ²⁺)、碳水化合物、脂質、活性氧物種、活性氮物種、類異戊二烯、信號傳導分子、血紅素、多肽輔因子、接受電子化合物、供電子化合物、代謝物、配位體及其任何組合。在一些實施例中，小分子為與細胞中之目標相互作用之藥劑。在一些實施例中，小分子靶向細胞中之蛋白質以進行降解。在一些實施例中，小分子靶向細胞中之蛋白質以藉由將蛋白質定位至蛋白酶體而進行降解。在一些實施例中，該小分子為蛋白水解靶向嵌合體分子(PROTAC)。

在一些實施例中，載物分子包括蛋白質、核酸或代謝物之混合物，例如多種多肽、多種核酸、多種小分子；核酸、多肽及小分子之組合；核糖核蛋白複合物(例如Cas9-gRNA複合物)；多種轉錄因子、多種表觀遺傳因子、再程式化因子(例如Oct4、Sox2、cMyc及Klf4)；多種調控RNA；及其任何組合。

在一些實施例中，載物分子包括一或多種細胞器，例如粒線體(chondrisomes)、粒線體(mitochondria)、溶酶體、細胞核、細胞膜、細胞質、內質網、核糖體、液泡、胞內體、剪接體、聚合酶、衣殼、頂體、自噬小體、中心粒、糖酵解酶體、乙醛酸循環體、氫化酶體、黑素體、紡錘剩體、肌原纖維、刺絲囊、過氧化體、蛋白酶體、囊泡、應激顆粒、細胞器網路及其任何組合。

在一些實施例中，載物分子富集在供體細胞或受體細胞之細胞膜。在一些實施例中，載物分子藉由經由肽信號序列靶向至膜而富集。在一些實施例中，載物分子藉由與膜締合蛋白、脂質或小分子結合而富集。在一些實施例中，載物分子藉由與膜締合蛋白、脂質或小分子二聚而富集。在一些實施例中，載物分子為嵌合的(例如嵌合蛋白或核酸)且包含介導與膜締合蛋白、脂質或小分子之結合或二聚的域。所關注之膜締合蛋白包括但不限於本文所述之膜蛋白或具有穩定地與細胞膜締合、例如結合，整合至細胞膜中之域(亦即，膜締合域)的任何蛋白質，其中此類域可包括肉豆蔻醯基化域、法呢基化域、跨膜域及其類似域。所關注之特定膜締合蛋白包括但不限於：肉豆蔻醯基化蛋白，例如p 60 v-src及其類似物；法呢基化蛋白，例如Ras、Rheb及CENP -E、F；藉由結合於磷脂醯基-絲胺酸、細胞膜雙層之脂質組分及其類似物，結合蛋白質之特定脂質雙層組分，例如磷脂結合蛋白V；膜錨蛋白；跨膜蛋白，例如運鐵蛋白受體及其部分；及膜融合蛋白。

在一些實施例中，載物分子以高於膜締合劑之含量(例如更高的複本數)存在於供體細胞或受體細胞中。在一些實施例中，載物分子以高於膜締合劑或其一或多種組分(例如膜締合部分、細胞外部分或細胞內部分中之一者、兩者或所有)之含量存在於受體細胞中。在一些實施例中，受體細胞包含載物分子，但不包含膜締合劑，或膜締合部分、細胞內部分或細胞外部分中之一者、兩者或所有。在一些實施例中，受體細胞包含載物分子且僅包含剩餘含量之膜締合劑，或膜締合部分、細胞內部分或細胞外部分中之一者、兩者或所有(例如受體細胞樣品中小於30%、25%、20%、18%、16%、14%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之細胞包含外源性膜締合劑，或膜締合部分、細胞內部分或細胞外部分中之一者、兩者或所有)。

在一些實施例中，當在供體細胞中時，載物分子可操作地締合或連接(例如繫栓)至膜締合劑(例如膜締合部分、細胞外部分或細胞內部分)，但當在目標細胞、例如受體細胞中時，可能與膜締合劑分開。在一些實施例中，在供體細胞中載物分子可與膜締合劑非共價締合，且在目標細胞(例如受體細胞)中可與膜締合劑解離。在一些實施例中，在供體細胞中載物分子可與膜締合劑共價締合，且在目標細胞(例如受體細胞)中可打破共價締合。不希望受理論束縛，供體細胞與目標細胞(例如受體細胞)之間在一或多種條件方面的差異可促進載物分子自膜締合劑分離。此類條件差異包括但不限於以下方面之差異：pH值、信號傳導分子之含量、酶含量或活性、基因表現或外源性劑(例如化學或合成劑)之存在或含量。

在一些實施例中，當在供體細胞中時載物分子可操作地締合或連接(例如繫栓)至膜(例如細胞膜)，但當在目標細胞、例如受體細胞中時可與膜分開。在一些實施例中，在供體細胞中載物分子可與膜(例如細胞膜)非共價締合，且在目標細胞(例如受體細胞)中可與膜締合劑解離。在一些實施例中，在供體細胞中載物分子可與膜(例如細胞膜)共價締合，且在目標細胞(例如受體細胞)中可打破共價締合。不希望受理論束縛，供體細胞與目標細胞(例如受體細胞)之間在一或多種條件方面的差異可促進載物分子自膜(例如細胞膜)分離。此類條件差異包括但不限於以下方面之差異：pH值、信號傳導分子之含量、酶含量或活性、基因表現或外源性劑(例如化學或合成劑)之存在或含量。在一些實施例中，條件差異包含核酸酶或蛋白酶(例如識別載物分子中之可裂解序列)之存在、含量或活性方面的差異。在一些實施例中，目標細胞(例如受體細胞)包含識別載物分子中之可裂解序列的核酸酶或蛋白酶，例如其中裂解將載物分子自其與膜之締合中釋放出。在一些實施例中，供體細胞或上述細胞所源自之源細胞不包含識別載物分子中之可裂解序列之核酸酶或蛋白酶。適合蛋白酶及蛋白酶可裂解標籤包括但不限於本文所述之任一者。 信號序列

在一些實施例中，載物分子為一種蛋白質(或編碼其之核酸)，其包括將蛋白質導引至特定位點或位置(例如引導至細胞表面)之信號序列。熟習此項技術者將瞭解，在某些情況下，細胞使用「分選信號」使蛋白質靶向特定亞細胞位置(例如靶向目標細胞之特定細胞器或表面膜)，該等分選信號為至少暫時作為蛋白質之一部分(例如當最初產生時)的胺基酸模體。在一些實施例中，分選信號為信號序列、信號肽或前導序列，其將蛋白質導引至稱為內質網(ER)之細胞器；在一些此類實施例中，接著蛋白質遞送至質膜。參見US20160289674A1。在一些此類實施例中，接著分泌蛋白質。在一些此類實施例中，接著蛋白質運輸至溶酶體。在一些此類實施例中，接著蛋白質運輸至高基氏體(Golgi apparatus)。在一些此類實施例中，接著蛋白質運輸至分泌囊泡，且接著可自細胞分泌。在一些此類實施例中，接著蛋白質運輸至胞內體。

在一些實施例中，蛋白質靶向ER為共轉譯的。在一些實施例中，蛋白質易位及膜插入與蛋白質合成偶聯。在一些實施例中，信號序列可為疏水性的。在一些實施例中，信號序列可為部分疏水性的。在一些實施例中，信號序列由信號識別粒子(SRP)識別。在一些實施例中，SRP在其自核糖體出現時識別信號序列。在一些實施例中，新生肽鏈-核糖體複合物藉由結合於SRP受體而靶向ER。在一些實施例中，信號序列與易位子之Sec61α次單元相互作用且起始膜蛋白或該膜蛋白之部分鏈之易位。

在一些實施例中，載物分子包含所關注之蛋白質與跨膜蛋白之編碼序列的同框融合物，或所關注之蛋白質與蛋白質之跨膜域或膜錨定域的同框融合物(例如與運鐵蛋白受體膜錨定域融合)。參見例如Winndard, P等人, Development of novel chimeric transmembrane proteins for multimodality imaging of cancer cells, Cancer Biology & Therapy. 12:1889-1899 (2007)。

在一些實施例中，分選信號或信號肽附加至蛋白質(例如膜蛋白或分泌蛋白)之N端或C端。參見Goder, V.及Spiess, M., Topogenesis of membrane proteins: determinants and dynamics.  FEBS Letters.  504(3): 87-93 (2001)。在一些實施例中，蛋白質為天然蛋白質。在一些實施例中，膜蛋白為合成蛋白質。

在一些實施例中，信號僅在轉錄本之轉譯已達到終止密碼子之後方自核糖體出現。在一些實施例中，膜蛋白之插入在轉譯後進行。

在一些實施例中，信號序列係選自表1。在一些實施例中，信號序列包含選自表1之序列。在一些實施例中，表1之信號序列可附加至蛋白質、例如膜蛋白或分泌蛋白之N端。在一些實施例中，表1之信號序列可附加至蛋白質、例如膜蛋白或分泌蛋白之C端。一般技術者將瞭解，不限制以下信號序列用於其相應天然相關之蛋白質。在一些實施例中，核酸包括一或多種導引目標細胞表現編碼膜蛋白之序列的調控元件。

表 1 ：示例性信號序列

SEQ ID NO:	信號序列	天然相關蛋白質	相關蛋白導引之位置
2	MRVKEKYQHL WRWGWKWGTM LLGILMICSA TE	HIV-1 gp41	質膜
3	CAAL	p21ras	質膜
4	KKKKKK	p21ras	質膜
5	RRRRR	p21ras	質膜
6	MRLLLALLGV LLSVPGPPVL S	FGFR4	質膜
7	CSIMNLMCGS TC	ROP7 GTP酶	質膜
8	GHKSEEKREK MKRTLLKDWK TRLSYFLQNS STPGKPKTGK KSKQQ	RGS2	質膜
9	RSTLKLTTLQ CQYSTVMD	LHR	質膜\基側細胞表面
10	RQGLHNMEDV YELIENSH	TSHR	質膜\基側細胞表面
11	MDCRKMARFS YSVIWIMAIS KVFELGLVAG	TDGF1	質膜
12	MPAWGALFLL WATAEA	(GP)IX	質膜
13	RDYR	VPAC2	質膜
14	KMALRVALNN KQSGQITVKT SSSDHLSLAI AGLVPIALSI YQKFKPGVSP SYSIY	Toc159	質膜
15	MGSKIVQVFL MLALFATSAL A	經典阿拉伯半乳聚糖蛋白4	質膜
16	MNSKAMQALI FLGFLATSCL A	經典阿拉伯半乳聚糖蛋白2	質膜
17	MGAAASIQTT VN	L1R	質膜
	SVM	GTP結合蛋白Rheb	質膜
18	FALLGTHGAS G	CD147	質膜
19	RRRTFLK	PlcH	質膜
20	MGGKWSKSSV	Nef	質膜
21	DDPERE	Nef	質膜
22	EEANTGENNS LLHPMS	HIV-1 NA7	質膜
23	SRRGLV	DmsA	質膜
24	SRRRFL	TorA/ TorA-MalE	質膜
25	SRRQFI	SufI	質膜\胞外質
26	QRRDFL	YacK	質膜\胞外質
27	MNKIYSIKYS AATGGLIAVS ELAKKVICKT NRKISAALLS LAVISYTNII YA	Pet (絲胺酸蛋白酶pet自轉運體)	質膜
28	MNPNQKIITI GSICMVIGIV SLMLQIGNII SIWVSHSIQT	神經胺糖酸苷酶A型流感	質膜
29	LRCLACSCFR TPVWPR	prRDH	質膜
30	MGCGCSSHPE	Lck	質膜
31	MPFVNKQFN	BoNT/ A-LC	質膜
32	DEQNAKNAAQ DRNSNKSSKG FFSKLGCC	Yck2p	質膜
33	MLCCMRRTKQ	GAP-43	質膜
34	VTNGSTYILV PLSH	FSHR	質膜
35	AETENFV	M3 mAChR	質膜
36	RARHRRNVDR VSIGSYRT	pIgR	質膜
37	YEDQ	RhBG	質膜
38	LLVTSLLLCELPHPAFL IP	GM-CSF受體(GM_CSFR)	質膜

示例性構築體序列

在一些實施例中，膜締合劑包含如以下表2中所列出之胺基酸序列(或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)或其功能片段(例如由加下劃線或其缺乏所指示之子序列，或由加粗斜體或其缺乏所指示之子序列)。在一些實施例中，膜締合劑由如以下表3中所列出之核酸序列(或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)或其功能片段編碼。 表 2. 示例性胺基酸序列

名稱	序列
MCP蛋白質序列	NASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGIAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYAMASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGIAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYA
CD19CAR-MCP (MCP 序列加下劃線 )	MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGGDYKDDDDKGS NASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGIAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYAMASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGIAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYA*
EGFP-MS2	MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK
CD3z_YFx6-EGFP ( Y 至 F 取代藉由加粗加下劃線指示 ， EGFP 藉由加下劃線指示 )	MKWKVSVLACILHVRFPGAEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQL F NELNLGRREE F DVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGV F NALQKDKMAEA F SEIGTKGERRRGKGHDGL F QGLSTATKDT F DALHMQTLAPRPPVAT MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*
Lck棕櫚醯化/肉豆蔻醯化域	MGCVCSSNPE
PM-EGFP (EGFP 藉由加下劃線指示 )	MGCVCSSNPELPVAT MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*
CD3z-EGFP (EGFP 藉由加下劃線指示 )	MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRPPVAT MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*
EGFP-hZAP70_SH2 (EGFP 藉由加下劃線指示 )	MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGPGSASGEGLPGSAGPGMPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSA*
MCP-hZAP70_SH2 (MCP 藉由加下劃線指示 )	MGNASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGIAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYAMASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGIAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYAGPGSASGEGLPGSAGPGMPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQTWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYCLKEACPNSSA*
hCD3z-MCP (MCP 藉由加下劃線指示 )	MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGGDYKDDDDKGS NASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGIAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYAMASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGIAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYA*
OT1 TCR	MSNTVLADSAWGITLLSWVTVFLLGTSSADSGVVQSPRHIIKEKGGRSVLTCIPISGHSNVVWYQQTLGKELKFLIQHYEKVERDKGFLPSRFSVQQFDDYHSEMNMSALELEDSAMYFCASSRANYEQYFGPGTRLTVLEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKKKNSATNFSLLKQAGDVEENPGPMDKILTASFLLLGLHLAGVNGQQQEKRDQQQVRQSPQSLTVWEGETAILNCSYEDSTFNYFPWYQQFPGEGPALLISIRSVSDKKEDGRFTIFFNKREKKLSLHITDSQPGDSATYFCAASDNYQLIWGSGTKLIIKPDIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS*
mCD3z-EGFP (EGFP 藉由加下劃線指示 )	MKWKVSVLACILHVRFPGAEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPRPPVAT MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK*
EGFP-mZAP70_SH2 (EGFP 藉由加下劃線指示 )	MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGPGSASGEGLPGSAGPGMPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCQFYSQDPDGLPCNLRKPCNRPPGLEPQPGVFDCLRDAMVCDYVRQTWKLEGDALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGQQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLVYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYRLKEVCPNSSA*
Cre-mZAP70_SH2 (Cre 藉由加下劃線指示 )	MANLLTVHQNLPALPVDATSDEVRKNLMDMFRDRQAFSEHTWKMLLSVCRSWAAWCKLNNRKWFPAEPEDVRDYLLYLQARGLAVKTIQQHLGQLNMLHRRSGLPRPSDSNAVSLVMRRIRKENVDAGERAKQALAFERTDFDQVRSLMENSDRCQDIRNLAFLGIAYNTLLRIAEIARIRVKDISRTDGGRMLIHIGRTKTLVSTAGVEKALSLGVTKLVERWISVSGVADDPNNYLFCRVRKNGVAAPSATSQLSTRALEGIFEATHRLIYGAKDDSGQRYLAWSGHSARVGAARDMARAGVSIPEIMQAGGWTNVNIVMNYIRNLDSETGAMVRLLEDGDGPVGSENLYFQSGGGSMPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCQFYSQDPDGLPCNLRKPCNRPPGLEPQPGVFDCLRDAMVCDYVRQTWKLEGDALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGQQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLVYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYRLKEVCPNSSA*
MCP-mZAP70_SH2 (MCP 藉由加下劃線指示 )	MGNASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGIAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYAMASNFTQFVLVDNGGTGDVTVAPSNFANGIAEWISSNSRSQAYKVTCSVRQSSAQNRKYTIKVEVPKGAWRSYLNMELTIPIFATNSDCELIVKAMQGLLKDGNPIPSAIAANSGIYAGPGSASGEGLPGSAGPGMPDPAAHLPFFYGSISRAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAGGKAHCGPAELCQFYSQDPDGLPCNLRKPCNRPPGLEPQPGVFDCLRDAMVCDYVRQTWKLEGDALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGQQTDGKFLLRPRKEQGTYALSLVYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKADGLIYRLKEVCPNSSA*
Lck-Scarlet-I ( Scarlet-I 序列 藉由加下劃線指示 )	MGCVCSSNPELPVAT MVSKGEAVIKEFMRFKVHMEGSMNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFSWDILSPQFMYGSRAFIKHPADIPDYYKQSFPEGFKWERVMNFEDGGAVTVTQDTSLEDGTLIYKVKLRGTNFPPDGPVMQKKTMGWEASTERLYPEDGVLKGDIKMALRLKDGGRYLADFKTTYKAKKPVQMPGAYNVDRKLDITSHNEDYTVVEQYERSEGRHSTGGMDELYK*
CD19CAR-CD3z-mCherry (CD19 CAR 藉由加下劃線指示 ； mCherry 藉由加粗斜體指示 )	MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRPPVAT MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK *
mSA2-CAR-CD3z-mCherry (mSA2 CAR 藉由加下劃線指示 ； mCherry 藉由加粗斜體指示 )	METDTLLLWVLLLWVPGSTGGAEAGITGTWYNQHGSTFTVTAGADGNLTGQYENRAQGTGCQNSPYTLTGRYNGTKLEWRVEWNNSTENCHSRTEWRGQYQGGAEARINTQWNLTYEGGSGPATEQGQDTFTKVKPSAASGSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRPPVAT MVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK *

表 3. 編碼膜締合劑之示例性核酸序列

名稱	序列
MCP-ZAP70_SH2	gccaccatgggcaacgcttctaactttactcagttcgttctcgtcgacaatggcggaactggcgacgtgactgtcgccccaagcaacttcgctaacgggatcgctgaatggatcagctctaactcgcgttcacaggcttacaaagtaacctgtagcgttcgtcagagctctgcgcagaatcgcaaatacaccatcaaagtcgaggtgcctaaaggcgcctggcgttcgtacttaaatatggaactaaccattccaattttcgccacgaattccgactgcgagcttattgttaaggcaatgcaaggtctcctaaaagatggaaacccgattccctcagcaatcgcagcaaactccggcatctacgccatggccagcaacttcacccagttcgtgctggtggacaacggcggcaccggcgacgtgaccgtggcccccagcaacttcgccaacggcatcgccgagtggatcagcagcaacagcagaagccaggcctacaaggtgacctgcagcgtgagacagagcagcgcccagaacagaaagtacaccatcaaggtggaggtgcccaagggcgcctggagaagctacctgaacatggagctgaccatccccatcttcgccaccaacagcgactgcgagctgatcgtgaaggccatgcagggcctgctgaaggacggcaaccccatccccagcgccatcgccgccaacagcggcatctacgccggaccaggatcggcgtctggggaaggactgccaggatcagccggaccaggaatgccagaccccgcggcgcacctgcccttcttctacggcagcatctcgcgtgccgaggccgaggagcacctgaagctggcgggcatggcggacgggctcttcctgctgcgccagtgcctgcgctcgctgggcggctatgtgctgtcgctcgtgcacgatgtgcgcttccaccactttcccatcgagcgccagctcaacggcacctacgccattgccggcggcaaagcgcactgtggaccggcagagctctgcgagttctactcgcgcgaccccgacgggctgccctgcaacctgcgcaagccgtgcaaccggccgtcgggcctcgagccgcagccgggggtcttcgactgcctgcgagacgccatggtgcgtgactacgtgcgccagacgtggaagctggagggcgaggccctggagcaggccatcatcagccaggccccgcaggtggagaagctcattgctacgacggcccacgagcggatgccctggtaccacagcagcctgacgcgtgaggaggccgagcgcaaactttactctggggcgcagaccgacggcaagttcctgctgaggccgcggaaggagcagggcacatacgccctgtccctcatctatgggaagacggtgtaccactacctcatcagccaagacaaggcgggcaagtactgcattcccgagggcaccaagtttgacacgctctggcagctggtggagtatctgaagctgaaggcggacgggctcatctactgcctgaaggaggcctgccccaacagcagtgccccagggcaccatcatcatcatcattaa
hCD3z-MCP	gccaccATGAAGTGGAAGGCGCTTTTCACCGCGGCCATCCTGCAGGCACAGTTGCCGATTACAGAGGCACAGAGCTTTGGCCTGCTGGAcCCCAAACTCTGCTACCTGCTGGATGGAATCCTCTTCATCTATGGTGTCATTCTCACTGCCTTGTTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTAtAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCggtagcggtggtGATTACAAGGACGACGATGACAAGggtagcaacgcttctaactttactcagttcgttctcgtcgacaatggcggaactggcgacgtgactgtcgccccaagcaacttcgctaacgggatcgctgaatggatcagctctaactcgcgttcacaggcttacaaagtaacctgtagcgttcgtcagagctctgcgcagaatcgcaaatacaccatcaaagtcgaggtgcctaaaggcgcctggcgttcgtacttaaatatggaactaaccattccaattttcgccacgaattccgactgcgagcttattgttaaggcaatgcaaggtctcctaaaagatggaaacccgattccctcagcaatcgcagcaaactccggcatctacgccatggccagcaacttcacccagttcgtgctggtggacaacggcggcaccggcgacgtgaccgtggcccccagcaacttcgccaacggcatcgccgagtggatcagcagcaacagcagaagccaggcctacaaggtgacctgcagcgtgagacagagcagcgcccagaacagaaagtacaccatcaaggtggaggtgcccaagggcgcctggagaagctacctgaacatggagctgaccatccccatcttcgccaccaacagcgactgcgagctgatcgtgaaggccatgcagggcctgctgaaggacggcaaccccatccccagcgccatcgccgccaacagcggcatctacgccTAG
EGFP-MS2 mRNA	GccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtataagtaaagcgccgcgtgactacggtacttattgccaagaaaGCACGAGCATCAGCCGTGCctccaggtcgaatcttcaaaCGACGACGATCACGCGTCGctccagtattccagggttcatc
PM-EGFP	Gccaccatgggctgcgtgtgcagcagcaaccccgagctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa
CD3z-EGFP	gccaccATGAAGTGGAAGGCGCTTTTCACCGCGGCCATCCTGCAGGCACAGTTGCCGATTACAGAGGCACAGAGCTTTGGCCTGCTGGAcCCCAAACTCTGCTACCTGCTGGATGGAATCCTCTTCATCTATGGTGTCATTCTCACTGCCTTGTTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTAtAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCccacccgtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtataagtga
EGFP-ZAP70_SH2	gccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtataagggaccaggatcggcgtctggggaaggactgccaggatcagccggaccaggaATGCCCGATCCCGCGGCGCAtCTGCCATTCTTCTATGGCAGCATCTCGCGGGCTGAGGCCGAGGAGCACCTGAAGCTGGCAGGCATGGCCGACGGGCTGTTCCTCCTGCGCCAGTGTTTGCGCTCCCTGGGCGGCTACGTGCTGTCGTTGGTGCACGACGTGCGCTTCCACCATTTCCCCATCGAGCGCCAACTCAACGGCACGTACGCCATCGCGGGCGGGAAGGCGCACTGCGGCCCGGCCGAGCTCTGCCAGTTCTACTCTCAGGACCCCGATGGGCTGCCCTGCAACCTGCGTAAGCCGTGTAACCGGCCGCCCGGACTGGAGCCACAGCCCGGGGTCTTCGACTGCCTGCGTGATGCTATGGTGTGCGACTACGTGCGCCAGACCTGGAAGCTGGAGGGCGATGCACTAGAGCAGGCCATCATCAGCCAGGCCCCACAGGTGGAGAAGCTCATTGCTACCACAGCCCACGAGCGAATGCCCTGGTATCACAGCAGCCTGACTCGTGAGGAGGCCGAGCGCAAACTCTATTCCGGCCAGCAGACCGACGGCAAGTTCCTGCTGAGGCCCCGGAAGGAGCAGGGCACATATGCACTGTCCCTGGTCTATGGGAAAACTGTATACCACTATCTCATCAGCCAGGACAAGGCTGGCAAGTACTGCATCCCCGAAGGCACCAAGTTTGACACGCTCTGGCAGCTGGTGGAGTACCTGAAGCTGAAGGCGGATGGACTAATTTACCGCTTGAAGGAGGTCTGTCCCAACAGCAGCGCCccagggcaccatcatcatcatcattaa
OT1 TCR	atgtctaacactgtcctcgctgattctgcctggggcatcaccctgctatcttgggttactgtctttctcttgggaacaagttcagcagattctggggttgtccagtctccaagacacataatcaaagaaaagggaggaaggtccgttctgacgtgtattcccatctctggacatagcaatgtggtctggtaccagcagactctggggaaggaattaaagttccttattcagcattatgaaaaggtggagagagacaaaggattcctacccagcagattctcagtccaacagtttgatgactatcactctgaaatgaacatgagtgccttggaactggaggactctgctatgtacttctgtgccagctctcgggccaattatgaacagtacttcggtcccggcaccaggctcacggttttagaggatctgagaaatgtgactccacccaaggtctccttgtttgagccatcaaaagcagagattgcaaacaaacaaaaggctaccctcgtgtgcttggccaggggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatggcaaggaggtccacagtggggtcagcacggaccctcaggcctacaaggagagcaattatagctactgcctgagcagccgcctgagggtctctgctaccttctggcacaatcctcgaaaccacttccgctgccaagtgcagttccatgggctttcagaggaggacaagtggccagagggctcacccaaacctgtcacacagaacatcagtgcagaggcctggggccgagcagactgtggaatcacttcagcatcctatcatcagggggttctgtctgcaaccatcctctatgagatcctactggggaaggccaccctatatgctgtgctggtcagtggcctggtgctgatggccatggtcaagaaaaaaaattccgccacgaacttctctctgttaaagcaagcaggagacgtggaagaaaaccccggtcctatggacaagatcctgacagcatcgtttttactcctaggccttcacctagctggggtgaatggccagcagcaggagaaacgtgaccagcagcaggtgagacaaagtccccaatctctgacagtctgggaaggagagaccgcaattctgaactgcagttatgaggacagcacttttaactacttcccatggtaccagcagttccctggggaaggccctgcactcctgatatccatacgttcagtgtccgataaaaaggaagatggacgattcacaatcttcttcaataaaagggagaaaaagctctccttgcacatcacagactctcagcctggagactcagctacctacttctgtgcagcaagtgacaactatcagttgatctggggctctgggaccaagctaattataaagccagacatccagaacccagaacctgctgtgtaccagttaaaagatcctcggtctcaggacagcaccctctgcctgttcaccgactttgactcccaaatcaatgtgccgaaaaccatggaatctggaacgttcatcactgacaaaactgtgctggacatgaaagctatggattccaagagcaatggggccattgcctggagcaaccagacaagcttcacctgccaagatatcttcaaagagaccaacgccacctaccccagttcagacgttccctgtgatgccacgttgactgagaaaagctttgaaacagatatgaacctaaactttcaaaacctgtcagttatgggactccgaatcctcctgctgaaagtagccggatttaacctgctcatgacgctgaggctgtggtcctcctaa
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Lck-Scarlet-I	TCCGGAgccaccatgggctgcgtgtgcagcagcaaccccgagctacccgtcgccaccatggtgagcaagggcgaggcagtgatcaaggagttcatgcggttcaaggtgcacatggagggctccatgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttctcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccagggccttcatcaagcaccccgccgacatccccgactactataagcagtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgccgtgaccgtgacccaggacacctccctggaggacggcaccctgatctacaaggtgaagctccgcggcaccaacttccctcctgacggccccgtaatgcagaagaagacaatgggctgggaagcgtccaccgagcggttgtaccccgaggacggcgtgctgaagggcgacattaagatggccctgcgcctgaaggacggcggccgctacctggcggacttcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagatgcccggcgcctacaacgtcgaccgcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccgtggtggaacagtacgaacgctccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtataagtaaGGATCC
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醫藥組合物

在一個態樣中，本發明部分針對包含本文所述之供體細胞之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物包含複數個供體細胞。在一些實施例中，供體細胞包含如本文所述之膜締合劑(例如包含細胞內部分、膜締合部分及/或細胞外部分中之一者、兩者或所有三者)。在一些實施例中，供體細胞包含如本文所述之載物分子。在一些實施例中，膜締合劑及載物分子可操作地締合或連接。在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，醫藥組合物包含一種受體細胞或複數個受體細胞。在一些實施例中，醫藥組合物包含供體細胞(例如複數個供體細胞)及受體細胞(例如複數個受體細胞)。

在實施例中，本文所述之醫藥組合物具有以下特徵中之一或多者：

醫藥組合物滿足醫藥或優良製造規範(GMP)標準；

根據優良製造規範(GMP)製得醫藥組合物；

醫藥組合物具有低於預定參考值之病原體含量，例如實質上不含病原體；

醫藥組合物具有低於預定參考值之污染物含量(例如核DNA)，例如實質上不含污染物；或

醫藥組合物具有低免疫原性，例如如本文所述。 膜轉移過程

在一些實施例中，載物分子及/或膜締合劑藉由膜轉移過程自供體細胞轉移至受體細胞。在一些實施例中，膜轉移過程包含供體細胞(包含膜締合劑及視情況載物分子)與受體細胞之間的接觸。在一些實施例中，膜轉移過程包含供體細胞(包含膜締合劑及視情況載物分子)與受體細胞之間的緊密接近。在一些實施例中，緊密接近包含不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50 nm，或不超過1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 µm之距離。在一些實施例中，緊密接近包含不超過供體細胞或受體細胞之寬度(例如平均直徑)之0.1倍(亦即，0.1倍)、0.2倍、0.3倍、0.4倍、0.5倍、0.6倍、0.7倍、0.8倍、0.9倍、1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.75倍、2倍、2.25倍、2.5倍、2.75倍、3倍、3.25倍、3.5倍、3.75倍或4倍的距離。在一些實施例中，載物分子及/或膜締合劑藉由膜轉移過程自供體細胞轉移至受體細胞，例如其中經由膜轉移過程遞送之試劑之含量比與未經組態成轉移載物分子及/或膜締合劑之相似供體細胞接觸的參考受體細胞大0.01-0.6、0.01-0.1、0.1-0.3或0.3-0.6，或至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大。在一些實施例中，進入受體細胞之供體細胞組合物或製劑中至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%之載物分子及/或外源性膜締合劑經由膜轉移過程進入。在一些實施例中，膜轉移過程包含膜融合事件、受體-配位體相互作用、細胞橋接事件(例如抗體分子(例如雙特異性抗體)、奈米管轉移或細胞與細胞接觸事件。 使用方法

在某些態樣中，本發明提供將載物分子及/或外源性膜締合劑自供體細胞轉移至受體細胞之方法。

在一態樣中，本發明提供一種修飾細胞之方法，其包含使受體細胞與本文所述之供體細胞或系統在適合於膜締合劑轉移至受體細胞之條件下接觸，其中該受體細胞不包含編碼膜締合劑之核酸。在一些實施例中，修飾受體細胞包含將膜締合劑自供體細胞(例如第一供體細胞、第二供體細胞或兩者)轉移至受體細胞。

在一態樣中，本發明提供一種製造經修飾之細胞之方法，其包含：提供未經修飾之細胞，使未經修飾之細胞與本文所述之供體細胞或系統在適合於膜締合劑轉移至未經修飾之細胞之條件下接觸，其中未經修飾之細胞或經修飾之細胞均不包含編碼膜締合劑之核酸。在一些實施例中，經修飾之細胞包含膜締合劑，且其中在受體細胞中不產生膜締合劑。在一些實施例中，該方法進一步包含提供本文所述之供體細胞(例如第一供體細胞、第二供體細胞、兩者、第三供體細胞或所有三者)。在一些實施例中，該提供包含使細胞與編碼膜締合劑之核酸接觸，藉此提供包含編碼膜締合劑之核酸的供體細胞。

在一態樣中，本發明提供一種將載物分子遞送至細胞之方法，其包含：提供本文所述之供體細胞或系統，其中該供體細胞包括包含載物分子之膜締合劑；提供不包含編碼膜締合劑之核酸的受體細胞；及使受體細胞與供體細胞或系統在適合於膜締合劑轉移至受體細胞之條件下接觸。在一些實施例中，該方法進一步包含使供體細胞及受體細胞與特異性結合於供體細胞(例如特異性結合於膜締合劑)且特異性結合於受體細胞之多特異性分子，例如抗體分子((例如Fab、F(ab')2、Fab'、scFv或雙-scFv)，例如雙特異性抗體分子)在足以允許受體細胞獲取膜締合劑或載物分子之條件下接觸。

在一些實施例中，受體細胞獲取足夠量之膜締合劑及/或載物分子來提供所需功能(例如相對於未接收膜締合劑及/或載物分子之參考細胞)。熟習此項技術者將認識到，足夠量將視所討論之膜締合劑及/或載物分子及有待實現之功能而定。在一些實施例中，足夠量為膜締合劑及/或載物分子之單個複本(例如其中載物分子包含整合至受體細胞基因體中之病毒或核酸)。在一些實施例中，足夠量包含用源自供體細胞之膜(例如包含膜締合劑及/或載物分子)對受體細胞進行至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%表面重塑。

在任一上述方法之一些實施例中，該方法進一步包含以下中之一者、兩者、三者、四者或所有： i)   擴增受體細胞或包含受體細胞之群體； ii)  選擇該受體細胞或該包含受體細胞之群體； iii) 針對該受體細胞或該包含受體細胞之群體進行富集； iv) 純化該受體細胞或該包含受體細胞之群體；或 v)  調配該受體細胞或該包含受體細胞之群體。

在任一上述方法之一些實施例中，該方法進一步包含以下中之一者、兩者、三者、四者或所有： i)   擴增供體細胞或包含供體細胞之群體； ii)  選擇該供體細胞或該包含供體細胞之群體； iii) 針對該供體細胞或該包含供體細胞之群體進行富集； iv) 純化該供體細胞或該包含供體細胞之群體；或 v)  調配該供體細胞或該包含供體細胞之群體。

在一些實施例中，接觸在活體外或離體進行。在一些實施例中，接觸在活體內進行。

在一態樣中，本發明提供調節，例如增強或減少個體、目標組織或細胞中之生物功能的方法，其包含向該個體投與本文所述之供體細胞、本文所述之受體細胞、本文所述之系統或本文所述之醫藥組合物或使該目標組織或該細胞與之接觸。

在一些實施例中，一種調節，例如增加或減少生物功能之方法包含藉由向個體投與本文所述之供體細胞、本文所述之受體細胞、本文所述之系統或本文所述之醫藥組合物或使目標組織或細胞與之接觸來調節受體與配位體或介白素與受體，例如受體、配位體、介白素或其中一對之間的相互作用。在一些實施例中，該方法包含調節(例如增加或減少)本文所述之受體、配位體、介白素或其中一對(例如RTK、清道夫受體或分化簇蛋白)之信號傳導活性。在一些實施例中，供體細胞、受體細胞、系統或醫藥組合物包括包含該受體、配位體或介白素之膜締合劑或載物分子。

在一態樣中，本發明提供一種向個體遞送或靶向功能之方法，其包含向該個體投與本文所述之供體細胞、本文所述之受體細胞、本文所述之系統或本文所述之醫藥組合物，其中該供體細胞、該受體細胞或該醫藥組合物以遞送或靶向個體中之功能之量及/或時間投與。

在一些實施例中，個體患有癌症、發炎性病症、自體免疫性疾病、慢性疾病、炎症、受損器官功能、感染性疾病、退化性病症、遺傳疾病或損傷。

在某些態樣中，本發明提供一種將如本文所述之包含膜締合劑及視情況載物分子之供體細胞遞送至人類個體、目標組織或受體細胞的方法，其包含向該人類個體投與本文所述之供體細胞、包含一或多種本文所述之供體細胞之組合物或本文所述之醫藥組合物或使該目標組織或該受體細胞與之接觸，藉此向該個體投與該供體細胞。

在某些態樣中，本發明提供一種向個體、目標組織或受體細胞遞送膜締合劑(例如包含或可操作地締合或連接於載物分子)之方法，其包含向該個體投與本文所述之供體細胞或本文所述之組合物或製劑(例如本文所述之醫藥組合物)或使該目標組織或該受體細胞與之接觸，其中該供體細胞、組合物或製劑以遞送膜締合劑及/或載物分子之量及/或時間投與。

在某些態樣中，本發明提供一種將載物分子遞送至個體、目標組織或受體細胞之方法，其包含向該個體投與本文所述之供體細胞或本文所述之組合物或製劑(例如本文所述之醫藥組合物)或使該目標組織或該受體細胞與之接觸，其中該供體細胞、組合物或製劑以遞送載物分子之量及/或時間投與。

在某些態樣中，本發明提供一種調節，例如增強個體、目標組織或細胞(例如受體細胞)中之生物功能的方法，其包含向該個體投與本文所述之包含膜締合劑(例如包含或可操作地締合或連接於載物分子)之供體細胞、組合物或製劑，例如本文所述之醫藥組合物或使該目標組織或該細胞與之接觸，藉此調節該個體中之生物功能。

在某些態樣中，本發明提供一種向個體遞送或靶向膜蛋白功能之方法，其包含向該個體投與本文所述之包含膜締合劑(例如包含或可操作地締合或連接於載物分子)之供體細胞、組合物或製劑，其中該供體細胞、組合物或製劑以在個體中遞送或靶向膜蛋白功能之量及/或時間投與。在一些實施例中，膜締合劑具有有待遞送或靶向之膜蛋白功能。在一些實施例中，載物分子具有有待遞送或靶向之膜蛋白功能。在實施例中，個體患有癌症、發炎性病症、自體免疫性疾病、慢性疾病、炎症、受損器官功能、感染性疾病、退化性病症、遺傳疾病或損傷。

本文所述之醫藥組合物之投與可例如藉助於經口、吸入、經皮或非經腸(包括靜脈內、腫瘤內、腹膜內、肌肉內、腔內及皮下)投與來遞送。供體細胞可單獨投與或調配為醫藥組合物。

在一些實施例中，供體細胞、組合物或製劑可呈單位劑量組合物(諸如單位劑量口服、非經腸、經皮或吸入組合物)形式投與。此類組合物通常藉由混合來製備且宜經調適以用於經口、吸入、經皮或非經腸投與，且因此可呈錠劑、膠囊、口服液體製劑、散劑、顆粒、口含錠、可復原散劑、可注射及可輸注溶液或懸浮液或栓劑或氣溶膠形式。

在一些實施例中，如本文所述，經由供體細胞遞送膜締合劑及/或載物分子可誘導或阻斷細胞分化、去分化或轉分化。受體細胞可為前驅細胞。或者，受體細胞可為分化細胞，且細胞命運改變包括驅動去分化成多潛能前驅細胞或阻斷此類去分化。在需要細胞命運變化之情況下，將有效量的本文所述之包含(例如作為載物分子)細胞命運誘導分子或信號之供體細胞在誘導細胞命運改變之條件下引入至目標細胞中。在一些實施例中，本文所述之供體細胞適用於將細胞亞群自第一表型再程式化為第二表型。此類再程式化可為暫時性或永久性的。視情況，再程式化誘導目標細胞採用中間表型。

亦提供減少目標細胞群體中之細胞分化的方法。例如，使含有一或多種前驅細胞類型之目標細胞群體與本文所述之供體細胞或組合物在使組合物減少前驅細胞分化之條件下接觸。在某些實施例中，目標細胞群體(例如包含如本文所述之複數個受體細胞之群體)含有哺乳動物個體中之受傷組織或受手術程序影響之組織。前驅細胞為例如基質前驅細胞、神經前驅細胞或間葉前驅細胞。

本文所述之包含膜締合劑之供體細胞或其組合物可用於將載物分子(例如包含於膜締合劑中，可操作地締合或連接於或不附接於膜締合劑)遞送至細胞組織或個體。藉由投與本文所述之供體細胞或組合物遞送膜締合劑及/或載物分子可調節細胞蛋白質表現量。在某些實施例中，遞送劑或載物分子導引一或多種多肽或核酸之上調(經由細胞中之表現、細胞中之遞送或細胞內之誘導)，此提供在遞送劑或載物分子遞送至之細胞中實質上不存在或減少的功能活性。例如，缺失之功能活性本質上可為酶、結構、信號傳導或調控的。在相關實施例中，所投與之組合物導引一或多種多肽或核酸之上調，此增加(例如協同)在多肽或核酸上調之細胞中存在但實質上不足之功能活性。在相關實施例中，所投與之組合物導引一或多種多肽或核酸之下調，此減少(例如協同)在多肽或核酸下調之細胞中存在或上調之功能活性。在某些實施例中，所投與之試劑或載物分子導引某些功能活性之上調及其他功能活性之下調。

在實施例中，供體細胞或組合物或自其轉移之膜締合劑及/或載物分子介導對受體細胞之作用，且該作用持續至少1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、2週、3週或4週或1個月、2個月、3個月、6個月或12個月。在一些實施例中，該作用持續不到1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天、2週、3週或4週或1個月、2個月、3個月、6個月或12個月。 活體內使用

本文所述之供體細胞及組合物可投與至個體，例如哺乳動物，例如人類。在此類實施例中，個體可具有罹患特定疾病或病狀(例如，本文所述之疾病或病狀)之風險，可具有特定疾病或病狀之症狀，或可經診斷患有或鑑別為患有特定疾病或病狀。在一個實施例中，個體患有癌症。在一個實施例中，個體患有感染性疾病。

在一些實施例中，供體細胞(例如如本文所述)之來源係來自投與供體細胞或包含供體細胞之組合物的相同個體。在其他實施例中，其為不同的，例如同種異體的。舉例而言，供體細胞之來源及接受者組織可為自體(來自相同個體)或異源(來自不同個體)。在任一情況下，本文所述之供體細胞之供體組織可為與接受者組織不同的組織類型。舉例而言，供體組織可為肌肉組織且接受者組織可為結締組織(例如脂肪組織)。在其他實施例中，供體組織及接受者組織可具有相同或不同類型，但來自不同器官系統。

可向患有癌症、自體免疫性疾病、感染性疾病、代謝疾病、神經退化性疾病或遺傳疾病(例如酶缺乏症)之個體投與本文所述之供體細胞或組合物。在一些實施例中，個體之組織需要再生。

在一些實施例中，向個體投與治療有效量之本文所述之供體細胞或組合物。在一些實施例中，物質(例如供體細胞、外源性膜締合劑及/或載物分子)之治療有效量係當投與至患有或易罹患疾病、病症及/或病狀之個體時足以治療該疾病、病症及/或病狀及/或延遲其發作的量。舉例而言，在實施例中，調配物中供體細胞、外源性膜締合劑及/或載物分子治療疾病、病症及/或病狀之有效量係緩解、改善、減輕、抑制疾病、病症及/或病狀、延遲其發作、降低其嚴重程度及/或降低其一或多種症狀或特徵之發生率的量。

在一些實施例中，個體用如本文所述之供體細胞或組合物治療。在一些實施例中，治療部分或完全緩解、改善、減輕、抑制特定疾病、病症及/或病狀、延遲其發作、降低其嚴重程度及/或降低其一或多種症狀、特徵及/或病因之發生率。在一些實施例中，治療可為對已診斷為罹患相關疾病、病症及/或病狀之個體進行的治療。在一些實施例中，治療可為對已知具有一或多種在統計學上與相關疾病、病症及/或病狀發展風險增加相關的易感性因素之個體進行的治療。在一些實施例中，治療部分或完全改善相關疾病、病症及/或病狀之根本原因。在一些實施例中，疾病、病症或病狀係選自癌症、發炎性病症、自體免疫性疾病、慢性疾病、炎症、受損器官功能、感染性疾病、退化性病症、遺傳疾病及/或損傷。

在一些實施例中，供體細胞或組合物有效治療疾病，例如癌症。在一些實施例中，與投與之前個體中之癌細胞數目相比，供體細胞或組合物有效降低個體中之癌細胞數目。在一些實施例中，與無治療之預期病程相比，供體細胞或組合物有效降低個體中之癌細胞數目。在一些實施例中，在投與供體細胞或組合物之後，個體經歷完全反應或部分反應。

在一些實施例中，供體細胞與抑制膜融合之蛋白質之抑制劑一起共同投與。舉例而言，抑制素(Suppressyn)為抑制細胞-細胞融合之人類蛋白質(Sugimoto等人, 「A novel human endogenous retroviral protein inhibits cell-cell fusion」 Scientific Reports 3:1462 DOI: 10.1038/srep01462)。因此，在一些實施例中，供體細胞與抑制素之抑制劑，例如siRNA或抑制抗體一起共同投與。

供體細胞、受體細胞及/或載物分子對於個體可為自體、同種異體或異種的。供體細胞及/或載物分子對於目標細胞、例如受體細胞可為自體、同種異體或異種的。

包含本文所述之供體細胞、外源性膜締合劑及/或載物分子之組合物可投與至或靶向循環系統、肝臟系統、腎臟系統、心臟至肺系統、中樞神經系統、周邊神經系統、肌肉骨骼系統、淋巴系統、免疫系統、感覺神經系統(視覺、聽覺、氣味、觸覺、味道)、消化系統、內分泌系統(包括脂肪組織代謝調控)及生殖系統。

在實施例中，本文所述之供體細胞或組合物離體遞送至細胞或組織，例如人類細胞或組織。在一些實施例中，供體細胞或組合物遞送至處於受傷狀態(例如由創傷、疾病、缺氧、局部缺血或其他損傷引起)之離體組織。

在一些實施例中，供體細胞或組合物遞送至離體移植物(例如組織外植體或用於移植之組織，例如人類靜脈、肌肉骨胳移植物(諸如骨骼或肌腱)、角膜、皮膚、心瓣、神經；或經分離或培養之器官，例如待移植至人類中之器官，例如人類心臟、肝臟、肺、腎臟、胰臟、腸、胸腺、眼睛)。在一些實施例中，供體細胞或組合物提高移植物之活力、呼吸或其他功能。在移植之前、期間及/或之後可將供體細胞或組合物遞送至組織或器官。

在一些實施例中，本文所述之供體細胞或組合物離體遞送至源自個體之受體細胞或組織。在一些實施例中，受體細胞或組織再投與至個體(亦即，細胞或組織為自體的)，例如作為個體內受體細胞之供體細胞。

供體細胞可將膜締合劑(例如包含載物分子或可操作地締合或連接於載物分子)及/或載物分子轉移至來自任何哺乳動物(例如人類)組織，例如來自上皮、結締、肌肉或神經組織或細胞及其組合之受體細胞。膜締合劑及/或載物分子可例如遞送至任何真核(例如哺乳動物)器官系統，例如來自心血管系統(心臟、血管結構)；消化系統(食道、胃、肝臟、膽囊、胰臟、腸、結腸、直腸及肛門)；內分泌系統(下視丘、腦垂腺、松果體或松果體腺、甲狀腺、副甲狀腺、腎上腺)；排泄系統(腎臟、輸尿管、膀胱)；淋巴系統(淋巴、淋巴結、淋巴管、扁桃體、腺樣體、胸腺、脾)；表皮系統(皮膚、頭髮、指甲)；肌肉系統(例如骨骼肌)；神經系統(腦、脊髓、神經)；生殖系統(卵巢、子宮、乳腺、睪丸、輸精管、儲精囊、前列腺)；呼吸系統(咽、喉、氣管、支氣管、肺、子宮帽)；骨骼系統(骨骼、軟骨)及其組合。

在實施例中，當投與至個體時，供體細胞靶向組織，例如肝臟、肺、心臟、脾、胰臟、胃腸道、腎臟、睪丸、卵巢、腦、生殖器官、中樞神經系統、周邊神經系統、骨骼肌、內皮、內耳、脂肪組織(例如棕色脂肪組織或白色脂肪組織)或眼睛中之受體細胞，例如其中在24、48或72小時之後所投與供體細胞之群體中至少0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%膜締合劑及/或載物分子保持存在於目標組織中。在一些實施例中，供體細胞經由本文所述之例如包含於本文所述之膜締合劑中之細胞外部分(例如包含本文所述之目標域)靶向受體細胞。

在實施例中，供體細胞可將膜締合劑及/或載物分子自幹細胞來源或先驅細胞轉移至受體細胞，該等先驅細胞例如骨髓基質細胞、骨髓源性成人先驅細胞(MAPC)、內皮先驅細胞(EPC)、胚細胞、在室下區中形成之中間先驅細胞、神經幹細胞、肌肉幹細胞、衛星細胞、肝臟幹細胞、造血幹細胞、骨髓基質細胞、表皮幹細胞、胚胎幹細胞、間葉幹細胞、臍帶幹細胞、前驅細胞、肌肉前驅細胞、肌母細胞、心肌母細胞、神經前驅細胞、神經膠質前驅細胞、神經元前驅細胞、肝母細胞。 特異性遞送至目標細胞

在一些實施例中，與非目標細胞相比，本文所述之供體細胞或組合物將載物分子(例如與膜締合劑可操作地締合或連接)優先遞送至目標受體細胞。因此，在某些實施例中，本文所述之供體細胞具有以下特性中之一或兩者：(i)當複數個供體細胞與包含目標受體細胞及非目標細胞之細胞群體在適合於載物分子自供體細胞轉移至受體細胞之條件下接觸時，載物分子在目標受體細胞中之含量比非目標細胞中多至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，或(ii)複數個供體細胞轉移載物分子至目標受體細胞之速率比非目標細胞下高至少至少50%。

在一些實施例中，與缺乏第二對接部分之細胞群體(非目標細胞)相比，包含載物分子及第一對接部分之供體細胞群體遞送更多載物分子至包含第二對接部分之目標受體細胞群體。在一些實施例中，在遞送之後，載物分子在比非目標細胞多約2-5、5-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80或80-90倍之目標受體細胞中可偵測地存在。在一些實施例中，在遞送之後，在除供體細胞外之細胞中存在的載物分子之約70-80%、80-90%、90-95%或95-100%或至少約70%、80%、90%或95%存在於目標受體細胞(而非非目標細胞)中。在一些實施例中，在除供體細胞外之細胞中存在的載物分子之約0-5%、5-10%、10-20%或20-30%或小於30%、20%、10%或5%存在於非目標細胞(而非目標受體細胞)中。

在一些實施例中，包含第二對接部分之目標受體細胞之群體及非目標細胞之群體為較大細胞群體之一部分。在實施例中，目標受體細胞及非目標細胞一起混合或摻混在較大細胞群體中。在實施例中，目標受體細胞及非目標細胞在較大細胞群體內分開(例如目標受體細胞存在於較大細胞群體內之第一組織或區域中，且非目標細胞存在於較大細胞群體內之第二組織或區域中)。在一些實施例中，較大細胞群體為例如自個體獲得之生物樣品(例如血液樣品或切片)。在一些實施例中，較大細胞群體包含周邊血液單核細胞(PBMC)。在實施例中，PBMC包含B細胞、T細胞、NK細胞及/或單核球。在一些實施例中，目標受體細胞為B細胞(例如表現CD19之B細胞)。在實施例中，第一對接部分包含於CAR (例如結合CD19之CAR)中。在實施例中，第二對接部分包含於CD19或其抗原決定基(例如由結合CD19之CAR識別之CD19的片段或變異體)中。在一些實施例中，目標受體細胞為T細胞。在一些實施例中，目標受體細胞為NK細胞。在一些實施例中，目標受體細胞為單核球。

在一些實施例中，供體細胞以在24、48或72小時之後載物分子遞送至至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%目標細胞之速率將載物分子轉移至目標細胞。在實施例中，靶向轉移之量為約30%-70%、35%-65%、40%-60%、45%-55%或45%-50%。在實施例中，轉移量為約20%-40%、25%-35%或30%-35%。

在一些實施例中，與參考細胞群體或非目標細胞群體相比，供體細胞或組合物遞送至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%載物分子至目標受體細胞群體。在一些實施例中，與參考細胞群體或非目標細胞群體相比，供體細胞或組合物轉移至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%更多之載物分子至目標受體細胞群體。 治療方法

本文所述之供體細胞、受體細胞、載物分子、外源性膜締合劑及/或組合物可用於調節個體，例如患者，例如人類患者中之一或多種生物功能。

在一些實施例中，生物功能係選自：

調節，例如增加或減少兩種細胞之間的相互作用；

調節，例如增加或減少免疫反應；

調節，例如增加或減少細胞募集至目標組織；

降低癌症之生長速率；或

減少個體中之癌細胞數目。

在一些態樣中，本文提供一種向個體、例如人類個體投與供體細胞之方法，其包含向該個體投與如本文所述之供體細胞或包含複數個供體細胞之組合物、供體細胞組合物或醫藥組合物，藉此向該個體投與供體細胞。

在一些態樣中，本文提供一種將載物分子(例如與如本文所述之膜締合劑可操作地締合或連接)遞送至個體之方法，其包含向該個體投與如本文所述之供體細胞或包含複數個供體細胞之組合物、供體細胞或醫藥組合物，其中供體細胞以遞送載物分子之量及/或時間投與。

在一些態樣中，本文提供一種調節，例如增強個體中之生物功能之方法，其包含向該個體投與如本文所述之供體細胞或包含複數個供體細胞之組合物、供體細胞組合物或醫藥組合物，藉此調節該個體中之生物功能。

在一些態樣中，本文提供一種向個體遞送或靶向功能之方法，其包含向該個體投與如本文所述之供體細胞或包含複數個供體細胞之組合物、供體細胞組合物或醫藥組合物，其中供體細胞以遞送或靶向個體中之功能之量及/或時間投與。

在一些態樣中，本文提供一種治療患者之疾病或病症之方法，其包含向該個體投與如本文所述之供體細胞或包含複數個供體細胞之組合物、供體細胞組合物或醫藥組合物，其中供體細胞以治療疾病或病症之量及/或時間投與。

在一些實施例中，個體患有癌症、發炎性病症、自體免疫性疾病、慢性疾病、炎症、受損器官功能、感染性疾病、代謝疾病、退化性病症、遺傳疾病(例如遺傳缺陷或顯性遺傳病症)或損傷。在一些實施例中，個體患有感染性疾病且載物分子包含感染性疾病之抗原。在一些實施例中，個體患有遺傳缺陷且載物分子包含個體缺乏之蛋白質，或編碼該蛋白質之核酸(例如DNA、gDNA、cDNA、RNA、前mRNA、mRNA等)，或編碼蛋白質之DNA，或編碼該蛋白質之染色體，或包含編碼該蛋白質之核酸之細胞核。在一些實施例中，個體患有顯性遺傳病症，且載物分子包含顯性突變對偶基因之核酸抑制劑(例如siRNA或miRNA)或與之締合。在一些實施例中，個體患有顯性遺傳病症，且載物分子包含顯性突變對偶基因之核酸抑制劑(例如siRNA或miRNA)或與之締合，且載物分子包含編碼核酸抑制劑不靶向之突變基因之非突變對偶基因的mRNA或與之締合。在一些實施例中，個體需要疫苗接種。在一些實施例中，個體需要例如受傷位點之再生。

在一些實施例中，供體細胞、組合物或製劑向個體投與至少1、2、3、4或5次。

在一些實施例中，供體細胞、組合物或製劑全身性(例如經口、非經腸、皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內)或局部投與至個體。在一些實施例中，向個體投與供體細胞組合物或製劑，以使得供體細胞組合物或製劑到達選自肝臟、肺、心臟、脾、胰臟、胃腸道、腎臟、睪丸、卵巢、腦、生殖器官、中樞神經系統、周邊神經系統、骨骼肌、內皮、內耳或眼睛之目標組織。在一些實施例中，(例如其中個體患有自體免疫性疾病)，供體細胞組合物或製劑與免疫抑制劑，例如糖皮質激素、細胞生長抑制劑、抗體或免疫親和素調節劑一起共同投與。在一些實施例中，(例如其中個體患有癌症或感染性疾病)，供體細胞組合物或製劑與免疫刺激劑，例如佐劑、介白素、細胞介素或趨化介素一起共同投與。在一些實施例中，供體細胞組合物或製劑之投與引起個體中之目標細胞中基因之上調或下調，例如其中供體細胞包含轉錄活化因子或抑制子、轉譯活化子或抑制子、或表觀遺傳活化子或抑制子。

在一些實施例中，當複數個供體細胞與包含目標受體細胞及非目標細胞之細胞群體接觸時，載物分子以實質量存在於比非目標細胞多至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍之目標受體細胞中。在一些實施例中，在目標受體細胞下複數個供體細胞以比非目標細胞下高至少至少50%之速率轉移載物分子。

在一些實施例中，疾病或病症係選自癌症、自體免疫性病症或感染性疾病。在一些實施例中，個體患有癌症。在一些實施例中，載物分子包含新抗原。在一些實施例中，供體細胞或其組合物向個體投與至少1、2、3、4或5次。在一些實施例中，供體細胞或其組合物全身性(例如經口、非經腸、皮下、靜脈內、肌肉內、腹膜內)或局部投與至個體。在一些實施例中，向個體投與供體細胞或其組合物，以使得供體細胞或其組合物到達選自肝臟、肺、心臟、脾、胰臟、胃腸道、腎臟、睪丸、卵巢、腦、生殖器官、中樞神經系統、周邊神經系統、骨骼肌、內皮、內耳或眼睛之目標組織。在一些實施例中，供體細胞或其組合物與免疫抑制劑，例如糖皮質激素、細胞生長抑制劑、抗體或免疫親和素調節劑一起共同投與。在一些實施例中，供體細胞或其組合物與免疫刺激劑，例如佐劑、介白素、細胞介素或趨化介素一起共同投與。

術語「癌症」、「惡性病」、「贅瘤」、「腫瘤」及「癌瘤」在本文中用以指以下細胞：其展現相對異常、不受控制及/或自發之生長，以使得其展現特徵在於明顯喪失對細胞增殖之控制的異常生長表型。在一些實施例中，腫瘤可為或包含癌變前(例如良性)、惡性、轉移前、轉移性及/或非轉移性細胞。本發明具體標識其教示內容可能特定相關之某些癌症。在一些實施例中，相關癌症之特徵可為實體腫瘤。在一些實施例中，腫瘤可為分散性腫瘤或液體腫瘤。在一些實施例中，相關癌症之特徵可在於血液腫瘤。一般而言，此項技術中已知的不同類型癌症之實例包括例如白血病、淋巴瘤(霍奇金氏(Hodgkin's)及非霍奇金氏)、骨髓瘤及骨髓增生病症；肉瘤；黑色素瘤；腺瘤；實體組織癌；口腔、咽喉、喉部及肺之鱗狀細胞癌；肝癌；生殖泌尿癌症，諸如前列腺癌、子宮頸癌、膀胱癌、子宮癌及子宮內膜癌及腎細胞癌；骨癌；胰臟癌；皮膚癌；皮膚或眼內黑色素瘤；內分泌系統癌；甲狀腺癌；副甲狀腺癌；頭頸癌；乳癌；胃腸癌及神經系統癌；良性病灶，諸如乳頭狀瘤；及其類似癌症。

在一些實施例中，複數個供體細胞具有局部、遠端或全身作用(例如經由載物分子轉移至受體細胞)。

在一些實施例中，本文揭示之任一方法進一步包含監測生物體中之不良事件的步驟。在一些實施例中，不良事件包括以下中之一或多者：細胞介素釋放症候群、發熱、心搏過速、發冷、厭食、噁心、嘔吐、肌痛、頭痛、毛細血管滲漏症候群、低血壓、肺水腫、凝血病、腎功能障礙、腎損傷、巨噬細胞活化症候群、噬血細胞性淋巴組織細胞增生症、器官衰竭、腦水腫、T細胞活化引起之旁觀者炎症、神經症狀、腦病、意識模糊、幻覺、譫妄、遲鈍、失語、癲癇、B細胞發育不全、腫瘤溶解症候群及移植物抗宿主疾病。

在一些實施例中，生物體為人類。在一些實施例中，人類具有疾病、病症或病狀。在一些實施例中，目標細胞(例如受體細胞)中載物分子之存在改善疾病、病症或病狀之一或多種症狀。 額外治療劑

在一些實施例中，供體細胞或其組合物與額外藥劑，例如治療劑一起共同投與至個體，例如接受者，例如本文所述之接受者。在一些實施例中，共同投與之治療劑為免疫抑制劑，例如糖皮質激素(例如地塞米松(dexamethasone))、細胞生長抑制劑(例如甲胺喋呤(methotrexate))、抗體(例如莫羅單抗(Muromonab)-CD3)或免疫親和素調節劑(例如環孢素(Ciclosporin)或雷帕黴素(rapamycin))。在實施例中，免疫抑制劑降低免疫介導之供體細胞、外源性膜締合劑及/或載物分子之清除率。在一些實施例中，供體細胞或其組合物與免疫刺激劑，例如佐劑、介白素、細胞介素或趨化介素一起共同投與。

在一些實施例中，供體細胞或其組合物及免疫抑制劑同時投與，例如同期投與。在一些實施例中，在投與免疫抑制劑之前投與供體細胞或其組合物。在一些實施例中，在投與免疫抑制劑之後投與供體細胞或其組合物。

在一些實施例中，免疫抑制劑為小分子，諸如布洛芬(ibuprofen)、乙醯胺苯酚(acetaminophen)、環孢黴素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、雷帕黴素(rapamycin)、黴酚酸酯(mycophenolate)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、糖皮質激素、西羅莫司(sirolimus)、硫唑嘌呤(azathriopine)或甲胺喋呤。

在一些實施例中，免疫抑制劑為抗體分子，包括但不限於莫羅單抗(muronomab)(抗CD3)、達利珠單抗(Daclizumab) (抗IL12)、巴利昔單抗(Basiliximab)、英利昔單抗(Infliximab) (抗TNFa)或利妥昔單抗(rituximab) (抗CD20)。

在一些實施例中，與投與單獨供體細胞或其組合物相比，供體細胞或其組合物與免疫抑制劑之共同投與增強供體細胞或其組合物、外源性膜締合劑及/或載物分子在個體中之持久性。在一些實施例中，與供體細胞或其組合物、外源性膜締合劑及/或載物分子在單獨投與時之持久性相比，供體細胞或其組合物、外源性膜締合劑及/或載物分子在共同投與時持久性增強至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更長時間。在一些實施例中，與供體細胞或其組合物、外源性膜締合劑及/或載物分子在單獨投與時之存活期相比，供體細胞或其組合物、外源性膜締合劑及/或載物分子在共同投與時持久性增強至少1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25或30天或更長時間。 製造方法

在一些態樣中，本發明提供一種製造供體細胞或其組合物之方法，其包含： a) 提供包含，例如表現膜締合劑之源細胞； b) 自該源細胞產生供體細胞，其中該供體細胞包含脂質雙層、內腔、膜締合劑及載物分子(例如與膜締合劑可操作地締合或連接)，藉此製得供體細胞；及 c) 將供體細胞調配成例如適合於投與至個體之醫藥組合物。

在一些態樣中，本發明提供一種製造供體細胞組合物之方法，其包含： a) 提供本文所述之複數個供體細胞或本文所述之供體細胞組合物；及 b) 將供體細胞調配成例如適合於投與至個體之醫藥組合物。

在一些態樣中，本發明提供一種製造供體細胞組合物之方法，其包含： a) 提供，例如產生本文所述之複數個供體細胞或供體細胞製劑；及 b) 分析複數個(例如製劑)樣品以確定是否符合一或多個(例如2、3個或更多個)標準。在實施例中，標準係選自：

在目標受體細胞下樣品中之供體細胞轉移膜締合劑之速率比非目標細胞下高例如至少至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；

在目標受體細胞下樣品中之供體細胞轉移膜締合劑之速率比其他細胞高例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%；

樣品中之供體細胞以在24、48或72小時之後供體細胞中之載物分子(例如與膜締合劑可操作地締合或連接)遞送至至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%目標受體細胞的速率將膜締合劑轉移至目標受體細胞；

膜締合劑以每個供體細胞(例如樣品中之平均值)至少或不超過10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本之複本數存在；

載物分子以每個供體細胞(例如樣品中之平均值)至少或不超過10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本之複本數存在；

樣品之供體細胞(例如樣品中之平均值)中載物分子為可偵測的，複本數為至少或不超過10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000 1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000個複本；

膜締合劑之複本數與載物分子之複本數之比率介於1,000,000:1與100,000:1之間、100,000:1與10,000:1之間、10,000:1與1,000:1之間、1,000:1與100:1之間、100:1與50:1之間、50:1與20:1之間、20:1與10:1之間、10:1與5:1之間、5:1與2:1之間、2:1與1:1之間、1:1與1:2之間、1:2與1:5之間、1:5與1:10之間、1:10與1:20之間、1:20與1:50之間、1:50與1:100之間、1:100與1:1,000之間、1:1,000與1:10,000之間、1:10,000與1:100,000之間或1:100,000與1:1,000,000；

樣品之供體細胞的特徵為脂質組成與源細胞實質上類似，或其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM及TAG中之一或多者在源細胞中對應脂質含量之10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或75%內；

樣品之供體細胞的特徵為蛋白質體組成與源細胞類似；

樣品之供體細胞的特徵為脂質與蛋白質之比率在源細胞中之對應比率的10%、20%、30%、40%或50%內；

樣品之供體細胞的特徵為蛋白質與核酸(例如DNA)之比率在源細胞中之對應比率的10%、20%、30%、40%或50%內；

樣品之供體細胞的特徵為脂質與核酸(例如DNA)之比率在源細胞中之對應比率的10%、20%、30%、40%或50%內；

樣品之供體細胞的特徵為在個體中，例如實驗動物，諸如小鼠中之半衰期在參考細胞之半衰期的1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%內。

樣品之供體細胞的特徵為代謝活性程度在參考細胞，例如源細胞中之代謝活性的1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%內；

樣品之供體細胞的特徵為miRNA含量水準比源細胞大至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大；

供體細胞之可溶蛋白質:不可溶蛋白質比率在源細胞之比率之1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更大內，例如在源細胞之比率之1%-2%、2%-3%、3%-4%、4%-5%、5%-10%、10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-80%或80%-90%內。

樣品之供體細胞的特徵為LPS含量比源細胞或參考細胞之LPS含量低5%、1%、0.5%、0.01%、0.005%、0.0001%、0.00001%或更低；

樣品之供體細胞能夠信號轉導，例如傳輸細胞外信號，例如比陰性對照多至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%；

樣品之供體細胞能夠例如以比參考細胞大至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之速率分泌蛋白質；或

樣品之供體細胞的特徵為低免疫原性，例如如本文所述；及

c) 若符合一或多個標準，則(視情況)批准複數個供體細胞或供體細胞組合物釋放，或若符合一或多個標準，則(視情況)將複數個供體細胞或供體細胞組合物調配成藥品。

在一些態樣中，本發明亦提供一種製造供體細胞組合物之方法，其包含： a) 提供，例如產生本文所述之複數個供體細胞或本文所述之供體細胞組合物或製劑；及 b) 分析該複數個或製劑之樣品以確定以下因子中之一或多者的存在或含量：

免疫原性分子，例如免疫原性蛋白質，例如如本文所述；

病原體，例如細菌或病毒；或

污染物(例如核結構或組分，諸如核DNA)；及 i) c)若該等因子中之一或多者顯著偏離(例如超過指定量)參考值，則(視情況)批准複數個供體細胞或供體細胞組合物釋放，或若一或多個因子未顯著偏離(例如偏離不超過指定量)參考值，則(視情況)將複數個供體細胞或供體細胞組合物調配成藥品。

在一些態樣中，本文提供一種製造供體細胞組合物之方法，其包含： i) 提供本文所述之複數個供體細胞、供體細胞組合物或醫藥組合物；及 b) 分析來自該複數個之一或多個供體細胞以確定是否符合以下標準中之一或多個(例如2、3個或所有)：

在目標受體細胞下供體細胞轉移膜締合劑及/或載物分子(例如與膜締合劑可操作地締合或連接)之速率比非目標細胞下高例如至少至少10%；

在目標受體細胞下供體細胞轉移膜締合劑及/或載物分子(例如與膜締合劑可操作地締合或連接)之速率比其他細胞下高例如至少50%；

供體細胞以在24小時之後供體細胞中之試劑遞送至至少10%目標受體細胞的速率將膜締合劑及/或載物分子(例如與膜締合劑可操作地締合或連接)轉移至目標受體細胞；

在遞送之後膜締合劑以至少1,000個複本(例如至少1000、2000、3000、4000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、5000,000或1,000,000個複本)之複本數存在於受體細胞中；

在遞送之後載物分子以至少1,000個複本(例如至少1000、2000、3000、4000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、5000,000或1,000,000個複本)之複本數存在於受體細胞中；

供體細胞包含複本數為至少1,000個複本(例如至少1000、2000、3000、4000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、5000,000或1,000,000個複本)之膜締合劑；

供體細胞包含複本數為至少1,000個複本(例如至少1000、2000、3000、4000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000、300,000、400,000、5000,000或1,000,000個複本)之載物分子；

膜締合劑之複本數與載物分子之複本數之比率介於1,000,000:1與100,000:1之間、100,000:1與10,000:1之間、10,000:1與1,000:1之間、1,000:1與100:1之間、100:1與50:1之間、50:1與20:1之間、20:1與10:1之間、10:1與5:1之間、5:1與2:1之間、2:1與1:1之間、1:1與1:2之間、1:2與1:5之間、1:5與1:10之間、1:10與1:20之間、1:20與1:50之間、1:50與1:100之間、1:100與1:1,000之間、1:1,000與1:10,000之間、1:10,000與1:100,000之間或1:100,000與1:1,000,000；

供體細胞包含之脂質與蛋白質之比率在源細胞中對應比率之10%、20%、30%、40%或50%內；

供體細胞包含之蛋白質與核酸(例如DNA)之比率在源細胞中對應比率之10%、20%、30%、40%或50%內；

供體細胞包含之脂質與核酸(例如DNA)之比率在源細胞中對應比率之10%、20%、30%、40%或50%內；

供體細胞包含之代謝活性程度在參考細胞，例如源細胞中之代謝活性的90%內；

供體細胞之miRNA含量水準比源細胞至少1%；

供體細胞之可溶蛋白質：不可溶蛋白質比率在源細胞之比率的90%內；

供體細胞之LPS含量比供體細胞之脂質含量低5%；

供體細胞及/或其組合物或製劑能夠信號轉導，例如在胰島素不存在下其他方面相似之供體細胞；

供體細胞及/或其組合物或製劑能夠例如以比參考細胞大至少5%之速率分泌蛋白質，或

供體細胞具有低免疫原性，例如如本文所述；及 i) c)若符合一或多個標準，則(視情況)批准複數個供體細胞或供體細胞組合物釋放；

藉此製造供體細胞藥品組合物。

在一些態樣中，本文提供一種製造供體細胞組合物之方法，其包含： a) 提供本文所述之複數個供體細胞、供體細胞組合物或醫藥組合物；及 b) 分析來自該複數個之一或多個供體細胞以確定以下因子中之一或多者的存在或含量：

免疫原性分子，例如免疫原性蛋白質，例如如本文所述；

病原體，例如細菌或病毒；或

污染物； i) c)若因子中之一或多者低於參考值，則(視情況)批准複數個供體細胞或供體細胞組合物釋放；

藉此製造供體細胞藥品組合物。

在本文中之製造方法的一些實施例中，提供表現膜締合劑之源細胞包含在源細胞中表現膜締合劑或上調源細胞中內源性膜締合劑之表現。在一些實施例中，該方法包含使源細胞之細胞核失活。

在一些實施例中，複數個供體細胞之至少一個供體細胞源自源細胞。

在實施例中，供體細胞來自具有經修飾之基因體以例如降低免疫原性(例如藉由基因體編輯，例如以移除MHC蛋白)的哺乳動物細胞。在實施例中，該方法進一步包含例如在細胞核失活，例如細胞去核之前或之後使步驟a)之源細胞與免疫抑制劑接觸。

在一些實施例中，供體細胞不包含Cre或GFP，例如EGFP。

在本文所述之任一組合物的一些實施例中，組合物(例如供體細胞組合物)包含例如如本文所述之供體細胞及/或受體細胞。

源細胞

在一些實施例中，供體細胞或受體細胞源自源細胞。

在一些實施例中，源細胞或目標細胞為內皮細胞、纖維母細胞、血球(例如巨噬細胞、嗜中性球、顆粒球、白血球)、幹細胞(例如間葉幹細胞、臍帶幹細胞、骨髓幹細胞、造血幹細胞、經誘導之多潛能幹細胞，例如源自個體細胞之經誘導之多潛能幹細胞)、胚胎幹細胞(例如來自胚胎卵黃囊、胎盤、臍帶、胎兒皮膚、青少年皮膚、血液、骨髓、脂肪組織、紅血球生成組織、造血組織之幹細胞)、肌母細胞、實質細胞(例如肝細胞)、腺泡細胞、神經元(例如視網膜神經元細胞)、前驅細胞(例如視網膜前驅細胞、骨髓母細胞、骨髓前驅細胞、胸腺細胞、性母細胞、成巨核細胞、巨核球前驅細胞、黑色素母細胞、淋巴母細胞、骨髓前驅細胞、紅血球母細胞或血管母細胞)、先驅細胞(例如心肌先驅細胞、衛星細胞、放射狀膠細胞、骨髓基質細胞、胰臟先驅細胞、內皮先驅細胞、胚細胞)或永生化細胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ細胞)。在一些實施例中，源細胞除293細胞、HEK細胞、人類內皮細胞或人類上皮細胞、單核球、巨噬細胞、樹突狀細胞或幹細胞以外。在一些實施例中，源細胞或目標細胞為白血球或幹細胞。在一些實施例中，源細胞或目標細胞係選自嗜中性球、淋巴球(例如T細胞、B細胞或自然殺手細胞)、巨噬細胞、顆粒球、間葉幹細胞、骨髓幹細胞、經誘導之多潛能幹細胞、胚胎幹細胞或骨髓母細胞。

在一些實施例中，源細胞為在黏附或懸浮條件下生長之細胞。在一些實施例中，源細胞為初級細胞、培養細胞、永生化細胞或細胞株。在一些實施例中，源細胞為同種異體的，例如自與目標細胞相同物種之不同生物體獲得。在一些實施例中，源細胞為自體的，例如自與目標細胞相同之生物體獲得。在一些實施例中，源細胞為異源的，例如自與目標細胞不同之物種之生物體獲得。

在一些實施例中，源細胞包含或進一步包含對源細胞為外源性之第二藥劑，例如治療劑，例如蛋白質或核酸(例如RNA，例如mRNA或miRNA)。在一些實施例中，第二試劑以細胞(例如供體細胞或受體細胞)所包含之至少或不超過10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000個複本存在，或以每個細胞(例如供體細胞或受體細胞)至少或不超過10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000個複本之平均含量存在。

在一些實施例中，例如由於用siRNA或基因編輯酶處理源細胞，例如哺乳動物源細胞，所以與源細胞相比，細胞(例如供體細胞或受體細胞)之一或多種內源性分子，例如蛋白質或核酸之含量改變，例如增加或減少。在一些實施例中，細胞(例如供體細胞或受體細胞)包含至少或不超過10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000個複本之內源性分子，或以每個細胞(例如供體細胞或受體細胞)至少或不超過10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000個複本之平均含量存在。在一些實施例中，內源性分子(例如RNA或蛋白質)以比其在源細胞中之濃度大至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、10 ³、5.0×10 ³、10 ⁴、5.0×10 ⁴、10 ⁵、5.0×10 ⁵、10 ⁶、5.0×10 ⁶、1.0×10 ⁷、5.0×10 ⁷或1.0×10 ⁸之濃度存在於細胞(例如供體細胞或受體細胞)中。在一些實施例中，內源性分子(例如RNA或蛋白質)以比其在源細胞中之濃度小至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、10 ³、5.0×10 ³、10 ⁴、5.0×10 ⁴、10 ⁵、5.0×10 ⁵、10 ⁶、5.0×10 ⁶、1.0×10 ⁷、5.0×10 ⁷或1.0×10 ⁸之濃度存在於細胞(例如供體細胞或受體細胞)中。

在一些實施例中，所提供之供體細胞、受體細胞及/或其組合物或製劑包含按蛋白質質量計少於0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%或10%源細胞，或少於0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%或10%之細胞具有功能細胞核。在一些實施例中，本文所述之組合物或製劑中至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%之供體細胞及/或受體細胞包含細胞器，例如粒線體。

在一些實施例中，所提供之供體細胞及/或受體細胞及/或其組合物或製劑包含至少0.01%-0.05%、0.05%-0.1%、0.1%-0.5%、0.5%- 1%、1%-2%、2%-3%、3%-4%、4%-5%、5%-10%、10%-20%、20%-30%、30%-40%、40%-50%、50%-60%、60%-70%、70%-80%或80%-90%供體細胞及/或受體細胞，其中：i)膜締合劑以每個供體細胞或受體細胞至少1,000個複本之複本數存在；ii)每個供體細胞或受體細胞之膜締合劑之複本數與載物分子之複本數的比率介於1,000,000:1與100,000:1之間、100,000:1與10,000:1之間、10,000:1與1,000:1之間、1,000:1與100:1之間、100:1與50:1之間、50:1與20:1之間、20:1與10:1之間、10:1與5:1之間、5:1與2:1之間、2:1與1:1之間、1:1與1:2之間、1:2與1:5之間、1:5與1:10之間、1:10與1:20之間、1:20與1:50之間、1:50與1:100之間、1:100與1:1,000之間、1:1,000與1:10,000之間、1:10,000與1:100,000之間或1:100,000與1:1,000,000之間；或iii)載物分子以每個供體細胞及/或受體細胞至少1,000個複本之複本數存在。

在實施例中，源細胞為初級細胞、永生化細胞或細胞株。在實施例中，供體細胞或受體細胞來自具有經修飾之基因體，例如具有降低之免疫原性(例如藉由基因體編輯，例如以移除MHC蛋白，例如MHC複合體)的源細胞。在實施例中，源細胞來自用免疫抑制劑處理之細胞培養物。在實施例中，例如使用本文所述之分析，源細胞實質上為非免疫原性的。在實施例中，源細胞包含外源性劑，例如治療劑。在實施例中，源細胞為重組細胞。

在一些實施例中，源細胞來自用抗炎信號處理之細胞培養物。在一些實施例中，本文所述之製造方法進一步包含例如在細胞核失活，例如細胞去核之前或之後使源細胞與抗炎信號接觸。 所列舉之實施例  1.     一種修飾受體細胞之方法，該方法包含： 使該受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分；及 (b)外源性載物分子； 其中該受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分；且 其中在該轉移之後，該受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子； 藉此修飾該受體細胞。 2.     一種修飾受體細胞之方法，該方法包含： 使該受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分；及 (b)載物分子； 其中該受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分； 其中在該轉移之後，該受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子；且 其中該載物分子在該供體細胞中以與該供體細胞所源自之源細胞不同之含量存在，例如，差異性表現； 藉此修飾該受體細胞。 3.     實施例1或2的方法，其中該膜締合劑對該供體細胞為外源性的。 4.     前述實施例中任一例的方法，其中該載物分子在該供體細胞中以與該供體細胞所源自之源細胞不同之含量存在，例如，差異性表現。 5.     前述實施例中任一例的方法，其中該載物分子結合於(例如共價或非共價結合於)該膜締合劑。 6.     前述實施例中任一例的方法，其中該膜締合劑包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分。 7.     前述實施例中任一例的方法，其中該第二對接部分包含呈遞同源部分(例如肽、糖或脂質)之MHC (例如HLA或非經典MHC (例如CD1，例如CD1a、CD1b、CD1c或CD1d))。 8.     前述實施例中任一例的方法，其中該膜締合劑包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)細胞內部分。 9.     前述實施例中任一例的方法，其中該膜締合劑為嵌合抗原受體(CAR)。 10.   前述實施例中任一例的方法，其中該供體細胞為T細胞。 11.   前述實施例中任一例的方法，其包含活化該T細胞。 12.   前述實施例中任一例的方法，其中該供體細胞為自然殺手細胞(NK細胞)。 13.   前述實施例中任一例的方法，其包含活化該NK細胞。 14.   一種組合物，其包含複數個藉由前述實施例中任一例之方法製得的受體細胞。 15.   一種修飾受體細胞之方法，該方法包含： 使該受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)視情況，載物分子； 其中該受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分，其中該第二對接部分包含呈遞同源部分(例如其中該同源部分包含肽、糖或脂質)之MHC (例如HLA或非經典MHC (例如CD1，例如CD1a、CD1b、CD1c或CD1d))； 其中在該轉移之後，該受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子；且 其中： 該載物分子及/或該膜締合劑對該供體細胞為外源性的，或 該載物分子在該供體細胞中以與該供體細胞所源自之源細胞不同之含量存在，例如，差異性表現； 藉此修飾該受體細胞。 16.   一種將載物分子遞送至受體細胞之方法，該方法包含： (i)提供供體細胞，其包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)載物分子；及 受體細胞，其包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分，其中該第二對接部分包含呈遞同源部分(例如肽、糖或脂質)之MHC (例如HLA或非經典MHC (例如CD1，例如CD1a、CD1b、CD1c或CD1d))；及 (ii)使該受體細胞與該供體細胞在適合於將該膜締合劑及/或該載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 其中： 該載物分子及/或該膜締合劑對該供體細胞為外源性的，或 該載物分子在該供體細胞中以與該供體細胞所源自之源細胞不同之含量存在，例如，差異性表現； 藉此將該載物分子遞送至該受體細胞。 17.   一種調節個體中之目標組織或受體細胞之生物功能之方法，該方法包含： 向該個體投與供體細胞及/或使該目標組織或該受體細胞與供體細胞接觸，該供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)視情況，載物分子； 其中該受體細胞或該個體及/或該目標組織之細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分，其中該第二對接部分包含呈遞同源部分(例如肽、糖或脂質)之MHC (例如HLA或非經典MHC (例如CD1，例如CD1a、CD1b、CD1c或CD1d))；且 其中： 該載物分子及/或該膜締合劑對該供體細胞為外源性的，或 該載物分子在該供體細胞中以與該供體細胞所源自之源細胞不同之含量存在，例如，差異性表現； 藉此調節該個體中該目標組織或該受體細胞之生物功能。 18.   一種製造經修飾之細胞之方法，該方法包含： (i)提供未經修飾之受體細胞； (ii)使該未經修飾之受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該未經修飾之受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)視情況，載物分子；且 其中該未經修飾之受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分，其中該第二對接部分包含呈遞同源部分(例如肽、糖或脂質)之MHC (例如HLA或非經典MHC (例如CD1，例如CD1a、CD1b、CD1c或CD1d))； 其中： 該載物分子及/或該膜締合劑對該供體細胞為外源性的，或 該載物分子在該供體細胞中以與該供體細胞所源自之源細胞不同之含量存在，例如，差異性表現； 藉此製造經修飾之受體細胞，其中在該轉移之後，相對於該未經修飾之受體細胞，該經修飾之受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子。 19.   前述實施例中任一例的方法，其中該供體細胞為T細胞。 20.   實施例19的方法，其包含活化該T細胞。 21.   前述實施例中任一例的方法，其中該供體細胞為自然殺手細胞(NK細胞)。 22.   實施例21的方法，其包含活化該NK細胞。 23.   一種包含複數個受體細胞之組合物，該等受體細胞藉由實施例18-22中任一例之方法製得。 24.   實施例23之包含複數個受體細胞之組合物，其為根據本文所述之任何實施例之組合物。 25.   一種包含複數個受體細胞(例如藉由與供體細胞接觸所產生之受體細胞)之組合物，該複數個受體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)細胞外第二對接部分，其包含呈遞同源部分(例如肽、糖或脂質)之MHC (例如HLA或非經典MHC (例如CD1，例如CD1a、CD1b、CD1c或CD1d))，其中該TCR或其功能片段或變異體特異性結合於該細胞外第二對接部分；及 (c)視情況，載物分子； 其中該等受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸； 其中該TCR或其功能片段或變異體及/或該載物分子對該受體細胞為外源性的；且 其中該複數個中至少30%細胞(例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)包含可偵測量及/或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子。 26.   一種包含複數個受體細胞(例如藉由與供體細胞接觸產生之受體細胞)之組合物，該複數個受體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)細胞外第二對接部分，其包含呈遞同源部分(例如肽、糖或脂質)之MHC (例如HLA或非經典MHC (例如CD1，例如CD1a、CD1b、CD1c或CD1d))，其中該TCR或其功能片段或變異體特異性結合於該細胞外第二對接部分；及 (c)視情況，載物分子； 其中該等受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸； 其中該等受體細胞實質上不表現編碼該膜締合劑之核酸，或者若存在載物分子，則實質上不表現編碼該載物分子之核酸；且 其中該複數個中至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)細胞包含可偵測量及/或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子。 27.   實施例25或26的組合物，其中當供體細胞中包含該TCR或其功能片段或變異體且該受體細胞中包含該第二對接部分時，該TCR或其功能片段或變異體特異性結合於該第二對接部分。 28.   實施例25-27中任一例的組合物，其中當該受體細胞中包含該TCR或其功能片段或變異體及該第二對接部分兩者時，該TCR或其功能片段或變異體不結合於該第二對接部分。 29.   實施例25-28中任一例的組合物，其中該複數個受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸，且若存在載物分子，則不包含編碼該載物分子之核酸。 30.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑包含TCRα分子及/或TCRβ分子。 31.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑包含TCRγ分子及/或TCRδ分子。 32.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑包含CD3ζ分子或其功能片段或變異體。 33.   實施例32之方法或組合物，其中該CD3ζ分子或其功能片段或變異體包含該細胞內部分(例如其中該細胞內部分為該CD3ζ分子或其功能片段或變異體之細胞內域)。 34.   實施例32或33之方法或組合物，其中該TCRα分子及/或該TCRβ分子結合於該CD3ζ分子或其功能片段或變異體。 35.   實施例32或34之方法或組合物，其中該TCRγ分子及/或該TCRδ分子結合於該CD3ζ分子或其功能片段或變異體。 36.   實施例32-35中任一例之方法或組合物，其中該CD3ζ分子或其功能片段或變異體包含ITAM域，該ITAM域包含一或多個(例如1、2、3、4、5或6個)對野生型CD3ζ鏈序列(例如SEQ ID NO: 39之序列)之酪胺酸殘基的突變(例如突變成苯丙胺酸)。 37.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合部分包含該TCRα分子、該TCRβ分子、該TCRγ分子、該TCRδ分子及/或該CD3ζ分子之跨膜域。 38.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該第一對接部分包含該TCRα分子及/或該TCRβ分子之細胞外域。 39.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該第一對接部分包含該TCRγ分子及/或該TCRδ分子之細胞外域。 40.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該細胞內部分包含該TCRα分子、該TCRβ分子、該TCRγ分子、該TCRδ分子及/或該CD3ζ分子之細胞內域。 41.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞為活化免疫細胞(例如活化T細胞)。 42.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中相對於未活化之可比供體細胞，該供體細胞表現更大量之該TCR或其功能片段或變異體(例如其中相對於未活化之可比供體細胞，該供體細胞包含多至少10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%複本之該TCR或其功能片段或變異體，及/或其中該供體細胞包含至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000個複本之該TCR或其功能片段或變異體。 43.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中相對於未活化之可比供體細胞，該供體細胞表現更大量之該TCR或其功能片段或變異體(例如其中相對於未活化之可比供體細胞，該供體細胞包含至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更多倍複本之該TCR或其功能片段或變異體，及/或其中該供體細胞包含至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000個複本之該TCR或其功能片段或變異體。 44.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑包含複合物，該複合物包含： (i) (1) TCRα分子及/或TCRβ分子，或(2) TCRγ及/或TCRδ分子；及 (ii)結合於該TCRα分子、TCRβ分子、TCRγ分子或TCRδ分子之CD3ζ分子。 45.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該細胞內部分結合該載物分子。 46.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該載物分子與該膜締合劑(例如在該細胞內部分或該膜締合部分)締合(例如共價或非共價附接，或特異性結合於與該膜締合劑結合之分子)。 47.   實施例46之方法或組合物，其中該載物分子包含特異性結合於該膜締合劑之該細胞內部分的域(例如ZAP70域，或包含一或多個(例如2個) SH2域，例如ZAP70之SH域之域，或其片段或變異體)。 48.   實施例46之方法或組合物，其中該載物分子與該膜締合劑之該細胞內部分融合(例如與CD3ζ或其功能片段或變異體例如在C端融合)。 49.   實施例46之方法或組合物，其中該載物分子包含繫栓至質膜內葉之域(例如Lck之棕櫚醯化/肉豆蔻醯化域或其功能片段或變異體，例如由atgggctgcgtgtgcagcagcaaccccgag (SEQ ID NO: 40)之核酸序列或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列編碼；及/或包含胺基酸序列MGCVCSSNPE (SEQ ID NO: 41)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)。 50.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該載物分子包含多肽(例如CRISPR酶，例如Cas9)。 51.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該載物分子包含核酸分子(例如DNA分子或RNA分子，例如mRNA、miRNA或circRNA)；視情況其中該mRNA編碼CRISPR酶(例如Cas9)。 52.   實施例51之方法或組合物，其中該膜締合劑之該細胞內部分包含結合於核酸分子(例如該載物分子)之域，例如DNA結合域或RNA結合域，例如MS2外殼蛋白(MCP)之該RNA結合域，或其功能片段或變異體。 53.   實施例52之方法或組合物，其中該核酸分子包含結合於該DNA結合域或該RNA結合域(例如3' MS2模體或其功能片段或變異體)之序列。 54.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該受體細胞包含於個體(例如哺乳動物個體，例如人類個體)中。 55.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑對該供體細胞為內源性的。 56.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑對該供體細胞為外源性的。 57.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑或該細胞內部分包含由該複數個供體細胞中未表現之蛋白酶識別之蛋白酶裂解位點。 58.   一種組合物，其包含複數個供體細胞，該複數個供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分；及 (b)外源性載物分子； 其中該第一對接部分特異性結合於受體細胞之表面上的第二對接部分，且 其中該複數個供體細胞將可偵測量或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子轉移至複數個該等受體細胞之至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)中。 59.   一種組合物，其包含複數個供體細胞，該複數個供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分；及 (b)載物分子，其中該載物分子在該供體細胞中以與該供體細胞所源自之源細胞不同之含量存在，例如，差異性表現； 其中該第一對接部分特異性結合於受體細胞之表面上的第二對接部分，且 其中該複數個供體細胞將可偵測量或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子轉移至複數個該等受體細胞之至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)中。 60.   一種組合物，其包含複數個供體細胞，該複數個供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜相關部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)視情況，載物分子； 其中該第一對接部分特異性結合於受體細胞之表面上的第二對接部分，其中該第二對接部分包含呈遞同源部分(例如肽、糖或脂質)之MHC (例如HLA或非經典MHC (例如CD1，例如CD1a、CD1b、CD1c或CD1d))； 其中該複數個供體細胞將可偵測量或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子轉移至複數個該等受體細胞之至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)中；且 其中該TCR或其功能片段或變異體及/或該載物分子對該複數個供體細胞為外源性的。 61.   一種組合物，其包含複數個供體細胞，該複數個供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子，或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜相關部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)視情況，載物分子； 其中該第一對接部分特異性結合於受體細胞之表面上的第二對接部分，其中該第二對接部分包含呈遞同源部分(例如肽、糖或脂質)之MHC (例如HLA或非經典MHC (例如CD1，例如CD1a、CD1b、CD1c或CD1d))； 其中該複數個供體細胞將可偵測量或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子轉移至複數個該等受體細胞之至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)中；且 其中TCR或其功能片段或變異體及/或該載物分子在該供體細胞中以與該供體細胞所源自之源細胞不同之含量存在。 62.   前述實施例中任一例的方法，其中該方法包含例如藉由使該供體細胞與調節劑接觸來調節該供體細胞之活性(例如活化、耗盡或無反應性)，例如其中增加活化，減少耗盡，或減少無反應性。 63.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該TCR識別(例如特異性結合於) MART-1 (例如其中該TCR為DMF5 TCR)。 64.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該TCR識別(例如特異性結合於)卵白蛋白(例如其中該TCR為OT-1 TCR)。 65.   一種修飾受體細胞之方法，該方法包含： 使該受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為嵌合抗原受體(CAR)；及 (b)視情況，載物分子； 其中該受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分；且 其中在該轉移之後，該受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子； 藉此修飾該受體細胞。 66.   一種將載物分子遞送至受體細胞之方法，該方法包含： (i)提供供體細胞，其包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)視情況，載物分子；及 受體細胞，其包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分；及 (ii)使該受體細胞與該供體細胞在適合於將該膜締合劑及/或該載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 藉此將該載物分子遞送至該受體細胞。 67.   一種調節個體中之目標組織或受體細胞之生物功能之方法，該方法包含： 向該個體投與供體細胞及/或使該目標組織或該受體細胞與供體細胞接觸，該供體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)視情況，載物分子； 其中該受體細胞或該個體及/或該目標組織之細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分； 藉此調節該個體中該目標組織或該受體細胞之該生物功能。 68.   一種製造經修飾之細胞之方法，該方法包含： (i)提供未經修飾之受體細胞； (ii)使該未經修飾之受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該未經修飾之受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)視情況，載物分子；且 其中該未經修飾之受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分； 藉此製造經修飾之受體細胞，其中在該轉移之後，相對於該未經修飾之受體細胞，該經修飾之受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子。 69.   前述實施例中任一例的方法，其中該供體細胞為T細胞或NK細胞。 70.   實施例69的方法，其包含活化該T細胞或NK細胞。 71.   實施例70的方法，其中在該第一對接部分與該第二對接部分之間結合之後該CAR之該細胞內部分促進該T細胞或該NK細胞之活化。 72.   一種包含複數個受體細胞之組合物，該等受體細胞藉由實施例68-71中任一例之方法製得。 73.   實施例8之包含複數個受體細胞之組合物，其為根據前述實施例中任一例之組合物。 74.   一種組合物，其包含複數個受體細胞，該複數個受體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b) 細胞外第二對接部分，其特異性結合於該細胞外第二對接部分；及 (c)視情況，載物分子； 其中該等受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸；且 其中該複數個中至少30%細胞(例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)包含可偵測量及/或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子。 75.   一種組合物，其包含複數個受體細胞，該複數個受體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)細胞外第二對接部分，其特異性結合於該細胞外第二對接部分；及 (c)視情況，載物分子； 其中該等受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸； 其中該等受體細胞實質上不表現編碼該膜締合劑之核酸且實質上不表現編碼該載物分子之核酸；且 其中該複數個中至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)細胞包含可偵測量及/或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子。 76.   實施例74或75的組合物，其中當供體細胞中包含該CAR且該受體細胞中包含該第二對接部分時，該CAR之該第一對接部分特異性結合於該第二對接部分。 77.   實施例74-76中任一例的組合物，其中當該受體細胞中包含該CAR及該第二對接部分兩者時，該CAR之該第一對接部分不結合於該第二對接部分。 78.   實施例74-77中任一例的組合物，其中該複數個受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸且不包含編碼該載物分子之核酸。 79.   一種組合物，其包含複數個供體細胞，該複數個供體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)外源性載物分子，其中該載物分子與該膜締合劑(例如在該細胞內部分或該膜締合部分)締合(例如共價或非共價附接，或特異性結合於與該膜締合劑結合之分子)， 其中該第一對接部分特異性結合於受體細胞之表面上的第二對接部分。 80.   一種組合物，其包含複數個供體細胞，該複數個供體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及視情況(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)外源性載物分子，其中該載物分子與該膜締合劑(例如在該細胞內部分或該膜締合部分)締合(例如共價或非共價附接，或特異性結合於與該膜締合劑結合之分子)， 其中該第一對接部分特異性結合於受體細胞之表面上的第二對接部分。 81.   實施例79或80的組合物，其中該複數個供體細胞將可偵測量或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子轉移至複數個該等受體細胞之至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)中。 82.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該載物分子對該供體細胞為外源性的。 83.   如前述實施例中任一項之方法的組合物，其中該載物分子對該供體細胞為內源性的。 84.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該載物分子對該受體細胞為外源性的。 85.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該載物分子對該受體細胞為內源性的。 86.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該載物分子在該供體細胞中以與該供體細胞所源自之源細胞不同之含量存在，例如，差異性表現(例如過度表現或下調)。 87.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該CAR包括包含該第一對接部分之細胞外域。 88.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該第一對接部分包含抗體分子且該第二對接部分包含由該抗體分子識別之抗原決定基。 89.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該第一對接部分包含結合於生物素化結合域(例如抗體分子)之親和素(例如單體親和素，例如mSA2，或其功能片段或變異體)，其中該生物素化結合域(例如抗體分子)識別該第二對接部分所包含之抗原決定基。 90.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑之該細胞內部分包含CD3ζ細胞質域或其功能片段或變異體；視情況其中該載物分子結合於或共價附接於CD3ζ細胞質域或其功能片段或變異體。 91.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑包含融合蛋白，該融合蛋白包含： (i)該膜締合部分， (ii)該細胞外第一對接部分，及 (iii)該細胞內部分， 其中(i)位於(ii)與(iii)之間。 92.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該細胞內部分例如共價或非共價結合該載物分子。 93.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合部分包含跨膜域，例如CD28、CD8或TCR CD3ζ分子之跨膜域。 94.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞為活化免疫細胞(例如活化T細胞)。 95.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中相對於未活化之可比供體細胞，該供體細胞表現更大量之該CAR (例如其中相對於未活化之可比供體細胞，該供體細胞包含多至少10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%複本之該CAR，及/或其中該供體細胞包含至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500個複本之該CAR。 96.   前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該載物分子與該膜締合劑(例如在該細胞內部分或該膜締合部分)締合(例如共價或非共價附接，或特異性結合於與該膜締合劑結合之分子)。 97.   實施例96之方法或組合物，其中該載物分子包含特異性結合於該膜締合劑之該細胞內部分的域(例如ZAP70域，或包含一或多個(例如2個) SH2域，例如ZAP70之SH域之域，或其片段或變異體)。 98.   實施例97之方法或組合物，其中該膜締合劑之該細胞內部分包含結合於該ZAP70域或其片段或變異體之CD3ζ細胞質域或其功能片段或變異體。 99.   實施例96之方法或組合物，其中該載物分子與該膜締合劑之該細胞內部分融合(例如與CD3ζ或其功能片段或變異體例如在C端融合)。 100. 實施例96之方法或組合物，其中該載物分子包含繫栓至質膜內葉之域(例如Lck之棕櫚醯化/肉豆蔻醯化域或其功能片段或變異體，例如由atgggctgcgtgtgcagcagcaaccccgag (SEQ ID NO: 40)之核酸序列或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列編碼)；及/或包含胺基酸序列MGCVCSSNPE (SEQ ID NO: 41)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)。 101. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該載物分子包含多肽(例如CRISPR酶，例如Cas9)。 102. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該載物分子包含核酸分子(例如DNA分子或RNA分子，例如mRNA、miRNA或circRNA)；視情況其中該mRNA編碼CRISPR酶(例如Cas9)。 103. 實施例102之方法或組合物，其中該膜締合劑之該細胞內部分包含結合於核酸分子(例如該載物分子)之域，例如DNA結合域或RNA結合域，例如MS2外殼蛋白之該RNA結合域，或其功能片段或變異體。 104. 實施例103之方法或組合物，其中該核酸分子包含結合於該DNA結合域或該RNA結合域(例如3' MS2模體或其功能片段或變異體)之序列。 105. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該受體細胞包含於個體(例如哺乳動物個體，例如人類個體)中。 106. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑或該細胞內部分包含由該複數個供體細胞中未表現之蛋白酶識別之蛋白酶裂解位點。 107. 前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該受體細胞不為癌細胞。 108. 前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該受體細胞在未患癌症之個體中。 109. 前述實施例中任一例之組合物或方法，其中該受體細胞為離體的且來自未患癌症之個體。 110.  一種組合物，其包含複數個供體細胞，該複數個供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含CAR，該CAR包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況細胞內部分；及 (b)視情況，載物分子； 其中該第一對接部分特異性結合於受體細胞之表面上的第二對接部分； 其中該複數個供體細胞將可偵測量或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子轉移至複數個該等受體細胞之至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)中；且 其中該CAR及/或該載物分子對該複數個供體細胞為外源性的。 111.  一種組合物，其包含複數個供體細胞，該複數個供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含CAR，該CAR包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況細胞內部分；及 (b)視情況，載物分子； 其中該第一對接部分特異性結合於受體細胞之表面上的第二對接部分； 其中該複數個供體細胞將可偵測量或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子轉移至複數個該等受體細胞之至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)中；且 其中CAR及/或該載物分子在該供體細胞中以與該供體細胞所源自之源細胞不同之含量存在。 112.  前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該CAR經修飾以與另外相似的未經修飾之CAR相比具有降低之殺滅能力(例如降低至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。 113.  前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該CAR包含與另外相似的未經修飾之CAR相比，減少細胞介素釋放之誘導(例如減少至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)的修飾。 114.  前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞為或源自免疫細胞。 115.  實施例114之方法或組合物，其中該供體細胞為或源自T細胞。 116.  實施例115之方法或組合物，其中該供體細胞相對於野生型T細胞包含至少一個修飾(例如突變)。 117.  實施例114-116中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞經修飾以減少野生型T細胞之天然TCR之表現或活性(例如其中該供體細胞經修飾以剔除野生型T細胞之天然TCR)。 118.  實施例114之方法或組合物，其中該供體細胞為或源自人類T細胞，例如Jurkat細胞。 119.  實施例116-118中任一例之方法的組合物，其中該供體細胞為或源自CD4 T細胞譜系(例如Th1輔助T細胞、Th2輔助T細胞、Th17輔助T細胞、Th9輔助T細胞或Tfh輔助T細胞)。 120. 實施例116-119中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞為或源自調控T細胞(Treg)。 121. 實施例120之方法或組合物，其中該膜締合劑包含CAR。 122. 實施例120之方法或組合物，其中該Treg為人類Treg (例如HLA-02陽性Treg)。 123. 實施例1-113中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞為： (i)生脂細胞，例如脂肪細胞幹細胞(ASC)， (ii) CD34+脂肪細胞，或 (iii)成熟脂肪細胞。 124. 實施例1-113中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞為間葉幹細胞(MSC)。 125. 實施例116-120中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞經修飾以減少Jurkat細胞之天然TCR之表現或活性(例如其中該供體細胞經修飾以剔除Jurkat細胞之天然TCR)。 126. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該受體細胞為人類細胞，例如人類腎細胞，例如HEK293細胞。 127. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該受體細胞為人類淋巴母細胞，例如K562細胞。 128. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該受體細胞為B細胞，例如人類B細胞(例如Ramos細胞)。 129. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該受體細胞包含於該個體之血液、脾、骨髓、肺或肝臟中。 130. 實施例129之方法或組合物，其中該受體細胞為B細胞。 131. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑之該第一對接部分包含第一接附子域，該第一接附子域特異性結合於與結合部分(例如特異性結合於該受體細胞之該第二對接部分之結合部分)締合(例如共價或非共價結合)的第二接附子域。 132. 實施例131之方法或組合物，其中該第一接附子域包含親和素(例如鏈黴抗生物素蛋白)，且其中該結合部分包含生物素。 133. 實施例132之方法或組合物，其中該結合部分包含結合於該生物素之抗體分子(例如其中該結合部分包含生物素化抗體分子)。 134. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞實質上不刺激(例如促進、活化或增加) T細胞效應子活性。 135. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑之該細胞內部分實質上不刺激(例如促進、活化或增加) T細胞效應子活性(例如該供體細胞的)。 136. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑不包含CD3-ζ域或其功能片段或變異體。 137. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該第一對接部分非共價附接(例如非共價結合)於該膜締合劑之其餘部分。 138. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該第一對接部分非共價附接(例如非共價結合)於該膜締合部分。 139. 實施例137或138之方法或組合物，其中該第一對接部分包含結合於該膜締合劑上之生物素部分的親和素部分，例如鏈黴抗生物素蛋白部分(例如單鏈黴抗生物素蛋白部分)。 140. 實施例137或138之方法或組合物，其中該第一對接部分包含結合於該膜締合劑上之親和素部分，例如鏈黴抗生物素蛋白部分(例如單鏈黴抗生物素蛋白部分)的生物素部分。 141. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該第一對接部分共價附接(例如共價結合)於該膜締合劑之其餘部分。 142. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該第一對接部分共價附接(例如共價結合)於該膜締合部分。 143. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑之該第一對接部分特異性結合於MHC分子(例如受體細胞之表面上的MHC分子)上呈遞之抗原。 144. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該第二對接部分包含由該受體細胞上之MHC分子呈遞之抗原。 145. 實施例143或144之方法或組合物，其中由該MHC呈遞之該抗原包含肽(例如包含胺基酸序列SIINFEKL之肽)。 146. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞包含促融劑(例如vsv-g蛋白)。 147. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞及該受體細胞源自相同細胞類型(例如HEK 293T細胞)。 148. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞源自初級細胞(例如初級T細胞，例如初級CD3+ T細胞、CD4+ T細胞或CD8+ T細胞或Treg)。 149. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該細胞內部分包含CD28域(例如其中該細胞內部分包含CD3-ζ域及CD28域)。 150. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該供體細胞穩定地表現該膜締合劑(例如在其基因體中包含編碼該膜締合劑之核酸序列)。 151. 前述實施例中任一例之方法或組合物，其中該膜締合劑包含由SEQ ID NO: 42之核酸序列編碼之多肽，或具有與所編碼之多肽具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列； 視情況，其中： (i)該多肽不包含mRuby多肽，或 (ii)該多肽不包含由編碼mRuby多肽之SEQ ID NO: 42之部分編碼的胺基酸序列。 152. 一種經分離之細胞，其包含在基因體之內源性TCR基因座處的插入，其中該插入包含編碼膜締合劑(例如CAR)之核酸序列。 153. 實施例152之經分離之細胞，其中該細胞係調控T細胞(Treg)。 154. 實施例152或153之經分離之細胞，其中使用CRISPR (例如如本文所述)將該編碼膜締合劑之核酸序列插入至該內源性TCR基因座中。 155. 一種經分離之調控T細胞(Treg)，其包含編碼膜締合劑(例如CAR)之核酸序列。 156. 實施例155之經分離之Treg，其中編碼該膜締合劑之該核酸序列包含於該Treg之基因體中(例如插入至該Treg之內源性基因座，例如該Treg之內源性TCR基因座中)。 157. 一種細胞製劑，其富集實施例155或156之Treg。 158. 一種製造前述實施例中任一例之供體細胞的方法，該方法包含： (i)提供源細胞； (ii)將編碼膜締合劑(例如CAR)之核酸分子(例如mRNA)引入至該源細胞中；及 (iii)視情況，將編碼載物分子之核酸分子引入至該源細胞中； 藉此製造供體細胞。 159. 實施例158的方法，其進一步包含將該源細胞維持在適合於表現該膜締合劑之條件下。 160. 實施例158或159的方法，其中該源細胞為調控T細胞(Treg)，例如人類Treg。

本文中引用之所有參考文獻及公開案均以引用之方式併入本文中。

提供以下實例以進一步說明本發明之一些實施例，但不意欲限制本發明之範疇；藉由其示例性之性質，應瞭解，可替代地使用熟習此項技術者已知之其他程序、方法或技術。 實例 實例 1 ： TCR 特異性轉移至表現同源肽 -MHC 之細胞在此實例中，若T2細胞首先用MART-1抗原進行脈衝，則T細胞受體(TCR)自J76-DMF5 T細胞(供體)轉移至T2細胞(受體)。T2細胞上由HLA-A02呈遞之MART-1為DMF5 TCR之特定目標。此表明TCR與目標細胞上之同源肽-MHC的特異性結合介導TCR至目標細胞之細胞間轉移。 供體細胞組 ：1) Jurkat：表現不識別MART-1之TCR的人類T細胞株 2) J76-DMF5：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR且替換為DMF5 TCR，DMF5 TCR識別由HLA-A02受體呈遞之MART-1抗原。 3) 無供體 受體細胞組 ：1) 用MART-1肽脈衝之T2細胞 2) 無肽脈衝之T2細胞 T2細胞株用作抗原呈遞細胞。T2細胞包括抗原加工中之缺陷，允許藉由培育使表面MHC受體負載肽。在此實驗中，使用用MART-1肽脈衝或無肽脈衝之T2細胞。 細胞身分標記：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 供體標記 ：使用將生物素共價附接於一級胺(離胺酸殘基及蛋白質N端)之磺基-NHS-LC-生物素，將供體細胞之表面蛋白質用生物素進行化學標記。磺基阻止膜滲透性，引起蛋白質僅表面進行生物素化。 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(6個組合)。在標記之後，首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以1:1、5:1及10:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育2小時，接著置放於冰上，隨後加工用於流動式細胞測量術。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測膜蛋白質(生物素)及TCR自供體至受體之轉移。將所有共培養之細胞用活力染料、AlexaFluor750結合之鏈黴抗生物素蛋白(鑑別生物素化表面蛋白質)及MART-1四聚體(鑑別DMF5 TCR)染色。來自各共培養物之活T2細胞在其獨特CellTracker染料上進行閘控，隨後評估表面蛋白質及DMF5 TCR獲取。 結果所有共培養配對引起表面蛋白質轉移T2受體(圖1A及圖1B，及圖2，第二欄)。然而，DMF5 TCR僅轉移至負載有同源MART-1肽之T2細胞(圖2，第3欄)。兩種類型轉移之發生率隨著供體:受體比率增加而增加。圖2概述測試之條件及所引起之載物轉移。 實例 2 ： T 細胞活化增加轉移發生率及速率此實例證實，在共培養期間增加J76-DMF5供體細胞之活化引起更高速率之轉移至T2受體。此可能由於供體上之TCR上調(非針對活化之生理反應)、活化之一些其他態樣或兩者。 供體細胞 ：1) J76-DMF5：源自Jurkat細胞之供體細胞。剔除天然TCR且替換為DMF5 TCR，DMF5 TCR識別由HLA-A02受體呈遞之MART-1抗原。 受體細胞組 ：1) 用同源MART-1肽脈衝之T2細胞 2) 用非同源CMV肽脈衝之T2細胞 3) 無肽脈衝之T2細胞 T2細胞株用作抗原呈遞細胞。其包括抗原加工中之缺陷，允許藉由培育使表面MHC受體負載肽。在此實驗中，使用用MART-1肽脈衝或無肽脈衝之T2細胞。 細胞身分標記：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。在此情況下，將供體用CellTracker深紅標記且受體用CellTracker紫標記。 細胞 - 細胞接觸時程 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(3個組合)。在標記之後，首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以5:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育。在15分鐘至16小時之一系列不同時間點，對各組取樣，以評估隨著時間推移之TCR轉移。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測TCR自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料及MART-1四聚體染色(鑑別DMF5 TCR)。來自各共培養物之活T2細胞在CellTracker紫上進行閘控，隨後評估DMF5 TCR獲取。 結果 ：如先前所觀測，TCR轉移特異性針對用MART-1肽脈衝之受體(圖3A)。在共培養2小時之後，用MART-1肽脈衝之受體的轉移發生率(圖3B)及量(圖3C)均迅速增加。轉移增加與供體中NFAT信號傳導增加相關，如建構至J76-DMF5細胞株中之NFAT信號傳導GFP報導體所量測(圖4)。NFAT活化增加亦與供體表面上之TCR上調相關，如稍後時間點之MART-1四聚體染色所指示。總之，此等結果指示T細胞活化、TCR上調或兩者可驅動TCR至受體之轉移改良。 實例 3 ： RNA 載物經由 TCR 與 RNA 結合模體之直接及間接融合進行轉移此實例證實mRNA係經由結合於TCR融合之RNA結合蛋白轉移至目標細胞。亦證實次要貨物(經由另一載物結合於轉移受體之載物)之轉移。 供體細胞 ：1) J76-DMF5：此等供體細胞源自Jurkat細胞。已剔除天然TCR且替換為DMF5 TCR，DMF5 TCR識別由HLA-A02受體呈遞之MART-1抗原。 受體細胞組 ：2) 用同源MART-1肽脈衝之T2細胞 3) 無肽脈衝之T2細胞 T2細胞株常用作抗原呈遞細胞。其具有抗原加工中之缺陷，允許藉由培育使表面MHC受體負載肽。在此實驗中，使用用MART-1肽脈衝或無肽脈衝之T2細胞。 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 供體載物表現 ：將供體J76-DMF5細胞經構築體轉染，該等構築體表現含有來自MS2外殼蛋白(MCP)之經修飾之RNA結合域的融合蛋白。如先前實例中，融合搭配物包括CD3ζ及ZAP70_SH2域。(以下MCP-hZAP70_SH2及hCD3z-MCP序列) (圖5)。在相同轉染中，亦包括mRNA表現構築體。mRNA表現構築體含有具有3'MS2模體之EGFP編碼序列，其結合於MCP域。當在供體細胞中共表現時，含MS2之mRNA結合於CD3及ZAP70融合蛋白之MCP域。 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(各構築體2個組合)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以5:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育2小時。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測受體中之EGFP表現。所有共培養之細胞均用活力染料及MART-1四聚體染色(鑑別DMF5 TCR)。來自各共培養物之活T2細胞在CellTracker上進行閘控，隨後評估DMF5 TCR獲取及EGFP表現。 序列 ( 如表 3 中所列出 ) ：＞MCP-ZAP70_SH2 ＞hCD3z-MCP ＞EGFP-MS2 mRNA 結果：如圖6中所示，與無肽條件相比，在經肽脈衝之條件下MCP/EGFP mRNA構築體之Lck、CD3z及ZAP70型式每一者之GFP信號實質上增加。 實例 4 ： 在 TCR 轉移期間載物之共同轉移此實例證實用於將載物與TCR共轉移之四種不同策略。 供體細胞 ：1) J76-DMF5：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR且替換為DMF5 TCR，DMF5 TCR識別由HLA-A02受體呈遞之MART-1抗原。 受體細胞組 ：2) 用同源MART-1肽脈衝之T2細胞 3) 無肽脈衝之T2細胞 T2細胞株用作抗原呈遞細胞。其具有抗原加工中之缺陷，允許藉由培育使表面MHC受體負載肽。在此實驗中，使用用MART-1肽脈衝或無肽脈衝之T2細胞。 細胞身分標記：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 供體載物表現 ：將供體J76-DMF5細胞用表現以不同方式與TCR締合之EGFP (載物)的四種不同構築體中之一者轉染： 1) 膜締合 ：EGFP與Lck之棕櫚醯化/肉豆蔻醯化域融合(亦稱為PM-EGFP)。此產生繫栓至質膜內葉之EGFP蛋白(圖7A；「Lck」)。 2) TCR 繫栓 ：EGFP與人類CD3-ζ之c端融合。此產生與TCR共價連接之EGFP蛋白(圖7A)。 3) TCR 締合 ：EGFP與僅含有SH2域之人類ZAP70之截短型式的n端融合。此產生僅在觸發TCR時與TCR締合之EGFP蛋白(圖7A)。 4) 普遍性轉移 ：細胞質EGFP。此產生除在同一細胞中共表現以外不與TCR特異性締合之EGFP蛋白(圖7A；「細胞質」或「Cyto」)。 序列 ( 如表 3 中所列出 ) ：＞PM-EGFP ＞CD3z-EGFP ＞EGFP-ZAP70_SH2 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(2個組合)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以5:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育2小時。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測EGFP自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料及MART-1四聚體染色(鑑別DMF5 TCR)。來自各共培養物之活T2細胞在CellTracker上進行閘控，隨後評估DMF5 TCR獲取(MART-1四聚體染色)及EGFP螢光。 結果藉由流動式細胞測量術量測受體T2細胞對DMF5 TCR及EGFP之獲取(用MART-1肽對T2細胞進行或未進行預先脈衝)。在所有測試之四種共轉移條件下用MART-1肽進行預先脈衝增加GFP轉移(圖7B及7C)。 實例 5 ： 活體內遞送受體締合之貨物此實例測試先前實例中概述之載物轉移受體是否可在活體內遞送載物至目標細胞。 供體細胞 ：1) 小鼠初級CD8 T細胞：此等供體細胞自穿孔素剔除小鼠(Jax庫存號002407)收穫。穿孔素缺陷使細胞無法經由穿孔素/顆粒酶依賴性機制殺死目標細胞。 接受動物 ：1) RIP-mOVA小鼠(Jax庫存號05431)。此等小鼠在大鼠胰島素啟動子(其主要驅動在胰臟β細胞中表現)控制下表現卵白蛋白之表面繫栓型式(經由運鐵蛋白受體融合)。在腎臟之近端小管細胞中亦存在一些表現，且在睪丸中之表現較弱。此表現允許細胞被來自作為1型糖尿病模型之OT-1轉殖基因小鼠之卵特異性T細胞靶向。 細胞身分標記 ：為在活體內區分供體細胞，將其用與細胞質結構(Thermo CellTracker染料)共價交聯之染料標記。展示此等染料穩定地標記細胞以供在活體內長期追蹤。 供體細胞修飾 ：將供體T細胞與過度表現OT1 TCR (對呈遞在I類MHC上之卵白蛋白肽具有特異性)及包括以下之載物轉移受體系統的構築體共轉染： 1) mCD3z-EGFP + Lck-Scarlet-I + OT-1 TCR 2) mCD3z-EGFP + Lck-Scarlet-I 序列 ( 如表 3 中所列出 ) ：＞OT1 TCR ＞mCD3z-EGFP ＞Lck-Scarlet-I 接受動物調節 ：將RIP-mOVA接受小鼠用對胰臟β細胞具有特定毒性之鏈脲佐菌素(streptozotocin)預處理。低劑量之鏈脲佐菌素產生炎症，不殺滅β細胞。此意欲模擬糖尿病前狀態且促進OT-1 T細胞遷移至胰島以靶向β細胞。 細胞注射 ：經由尾靜脈注射將經轉染之供體細胞注射至接受動物中。 量測 ：在注射之後第1天、第2天及第3天，處死動物且收集胰臟、腎臟及睪丸用於分析。自胰臟純化胰島且解離成單細胞懸浮液。懸浮液根據表4中之小組染色且藉由流動式細胞測量術量測載物轉移。細胞在活/死上進行閘控，接著評估Cytotracker染料、細胞類型標記物及EGFP。腎臟及睪丸送去用於組織學以鑑別t細胞浸潤。將組織冷凍在OCT中以進行冰凍切片且藉由免疫螢光或IHC染色進行分析。 表 4. 來自胰島之單細胞懸浮液的染色

通道	中心	寬度	胰島+OTI T流動小組	OT I T	β細胞	註釋
VL1	440	50	升糖素-BV421	-	-	α細胞ID (細胞內)
VL2	525	50
VL3	610	20
VL4	660	20
VL5	710	50	CD8-BV711	++	+?	CD8 T細胞ID，可轉移
VL6	780	60
BL1	530	30	GFP	++	+?	貨物，轉移
BL2	695	40
YL1	585	16
YL2	620	15	PM-Scarlet	++	+?	OT I PM，轉移至β細胞
YL3	780	60	四聚體-PECy7	++	+?	OT I TCR，轉移至β細胞
RL1	670	14	CT深紅	++	-	授受性轉移之細胞初級ID
RL2	720	30	胰島素-A700	-	++	β細胞ID (細胞內)
RL3	780	60	L/D NIR			活力

結果 ：在注射之後2天分離胰島且解離成單細胞懸浮液。在來自經注射之小鼠中偵測到CytoTracker染料陽性細胞，但在未注射之對照小鼠中未偵測到(圖8A)。在胰臟β細胞上偵測到OT-1 TCR (藉由MHC四聚體染色量測)，藉由細胞內胰島素染色來鑑別(圖8B，右圖)。在α細胞上未偵測到OT-1 TCR，藉由細胞內升糖素染色鑑別(圖8B，左圖)。 實例 6 ： 嵌合抗原受體至目標 B 細胞之轉移在此實例中，評估嵌合抗原受體(CAR)是否轉移至目標細胞。 供體細胞組 ：1) J76：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR。 2) 無供體 受體細胞組 ：1) Ramos細胞：此係表現CD19之B細胞株。 2) Raji細胞。 3) T2細胞。 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 供體 CAR 表現 ：將供體J76細胞用表現識別CD19之CAR的構築體電穿孔(圖9)。CAR之細胞內域含有源自CD3-ζ之信號傳導域及c端mCherry螢光蛋白。 序列 ( 如表 3 中所列出 ) ：＞ CD19CAR-CD3z-mCherry 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(2個組合)。在標記之後，首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以1:1、5:1及10:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育2小時，接著置放於冰上，隨後加工用於流動式細胞測量術。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測CAR自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活T2細胞在CellTracker紫上進行閘控，接著評估mCherry螢光，mCherry螢光指示CAR轉移。 結果 ：量測CD19CAR-CD3z-mCherry至受體細胞之轉移。圖10及下表中概述轉移發生率，其測得為獲取CAR之受體細胞的百分比：

	未共培養	與 J76-CAR 共培養	與 J76-CAR + CD19 阻斷抗體共培養
Ramos	0.26%	80.27%	43.11%
Raji	0.23%	77.93%	62.13%
T2	0.45%	64.99%	23.85%

實例 7 ： 嵌合抗原受體至其他目標細胞之轉移先前實例展示CAR經由CD19之識別而目標特異性轉移至B細胞。此處，證實此CAR轉移係普遍適用的，且改變細胞外靶向域足以指派新目標細胞類型。 供體細胞 ：1) J76：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR。 2) 無供體 受體細胞組 ：1) HEK293細胞 2) 表現CD19之HEK293細胞 3) 表現EGFRt之HEK293細胞 細胞身分標記為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 供體 CAR 表現 ：將供體J76細胞用構築體轉染，該構築體表現由以下3個主要域構成之可重定目標之CAR：細胞內載物域(或載物結合域)、跨膜域及細胞外目標細胞結合域(圖11)。在此實例中，細胞外域含有可重定目標之單價鏈黴抗生物素蛋白突變體，稱為mSA2，其允許藉由識別目標之生物素化抗體重導向目標細胞特異性(在此實例中，使用抗HLA-G抗體)。細胞內部分含有源自CD3-ζ之信號傳導域及mCherry。(mSA2-CAR)。 mSA2-CAR 序列 ( 如表 3 中所列出 ) ：＞ mSA2 CAR-CD3z-mCherry 供體 CAR 靶向 ：將經轉染之供體細胞與識別CD19或EGFRt之生物素化抗體一起培育，視目標細胞表現而定。充分洗滌細胞以移除未結合抗體。此步驟藉由mSA2域與生物素-HLA-G之生物素結合而提供對CAR受體之目標特異性。 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(6個組合)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以5:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育2小時。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測CAR受體自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活HEK293細胞在CellTracker上進行閘控，接著評估mCherry表現，mCherry表現指示CAR轉移。 實例 8 ： RNA 載物經由 CAR 與 RNA 結合模體之直接及間接融合進行轉移此實例證實mRNA係經由結合於CAR融合之RNA結合蛋白轉移至目標細胞。亦證實次要貨物(經由另一載物結合於轉移受體之載物)之轉移。 供體細胞組 ：1) J76：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR。 2) 無供體 受體細胞組 ：1) Ramos細胞：此係表現CD19之B細胞株。 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 供體 CAR 及載物表現 ：將供體J76細胞用構築體電穿孔，該構築體表現CD19 CAR (實例6中所述)、RNA結合蛋白載物及編碼EGFP之mRNA (包括2個MS2莖環模體)。RNA結合蛋白為MS2外殼蛋白(MCP)，其特異性結合於稱為「MS2位點」之RNA莖環模體。測試四種不同載物轉移策略： 1) 膜締合：MCP與Lck之棕櫚醯化/肉豆蔻醯化域融合(亦稱為PM-MCP)。此產生繫栓至質膜內葉之MCP蛋白。 2) CAR 繫栓 ：MCP直接與CAR之c端融合 3) CAR 締合 ：MCP與僅含有SH2域之人類ZAP70之截短型式的n端融合。此產生僅在觸發CAR時與CAR締合之MCP蛋白。締合經由CD3-ζ域之磷酸化殘基進行。 4) 普遍性轉移 ：不提供MCP蛋白。此測試未繫栓之細胞質RNA是否可轉移。 胺基酸序列 ( 如表 2 中所列出 ) ：＞MCP蛋白序列 核酸序列 ( 如表 3 中所列出 ) ：＞MCP-ZAP70_SH2 ＞MCP DNA序列 ＞hCD3z-MCP ＞EGFP-MS2 mRNA 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(每個載物2個組合，總共8個)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以5:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育2小時。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測mRNA載物自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活Ramos細胞在CellTracker上進行閘控，接著藉由mCherry螢光評估CAR獲取且藉由EGFP螢光評估載物獲取(自轉移之mRNA表現)。 實例 9 ： RNA 載物與嵌合抗原受體共轉移此實例證實mRNA係經由結合於CAR融合之RNA結合蛋白轉移至目標細胞。 供體細胞 ：1) J76：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR。 受體細胞組 ：1) Ramos細胞：此係表現CD19之B細胞株。 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 供體載物表現 ：將供體J76細胞用以下中之任一者電穿孔： 1) 模擬：無質體下電穿孔 2) EGFP-MS2：具有3'MS2莖環序列之GFP mRNA 3) CAR-MCP：具有細胞內RNA結合蛋白域(MCP)之CD19 CAR。編碼GFP之經MS2標記之mRNA進行共轉染。 4) CAR-MCP及GFP-MS2：CD19 CAR (經由mCherry細胞內域可偵測)及ZAP70蛋白與MCP融合。編碼GFP之經MS2標記之mRNA進行共轉染。 圖12之左圖展示此等部分之圖。 胺基酸序列 ( 如表 2 中所列出 ) ：＞ CD19CAR-MCP 核酸序列(如表3中所列出)： ＞EGFP-MS2 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(各構築體2個組合)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以5:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育2小時。 量測 ：在共培養之後12小時，藉由流動式細胞測量術量測編碼EGFP之RNA自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活Ramos細胞在CellTracker上進行閘控，接著藉由量測EGFP螢光評估EGFP mRNA之獲取。 結果：當在供體細胞中表現單獨GFP mRNA時，觀測到轉移17.95% Ramos細胞。當GFP mRNA與CAR-MCP共表現時，此轉移大約加倍至34.83% Ramos細胞(圖12右圖)。 實例 10 ： 載物與嵌合抗原受體共轉移在此實例中，評估在負載CAR之細胞中表現之載物是否可共轉移至目標細胞。 供體細胞組 ( 如圖 13 中所示 ) ：1) J76 (模擬電穿孔)：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR。 2) J76 + CD19 CAR-mCherrry：mCherry與CAR之C端融合 3) J76 + ZAP70-EGFP：GFP與僅含有SH2域之人類ZAP70之截短型式的N端融合。此產生僅在觸發CAR時與CAR締合之EGFP蛋白。此條件不包括CAR。 4) J76 + CD19 CAR-mCherrry + ZAP70-EGFP：CAR與ZAP70-GFP載物共轉染。 受體細胞組 ：1) Ramos細胞：此係表現CD19之B細胞株。 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 供體 CAR 及載物表現 ：根據以上供體組，將供體J76細胞用表現CD19 CAR (如實例6中所述)及ZAP70-EGFP融合載物(序列如下)之構築體電穿孔。 序列 ( 如表 3 中所列出 ) ：＞ CD19CAR-CD3z-mCherry ＞EGFP-ZAP70_SH2 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(2個組合)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以5:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育2小時。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測EGFP自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活Ramos細胞在CellTracker上進行閘控，接著藉由mCherry螢光評估CAR獲取且藉由EGFP螢光評估載物獲取。 結果 ：如圖14中所示，觀測到CAR轉移至表現CD19之受體細胞(Ramos)，藉由mCherry螢光量測(在圖14中標記為「CAR」)。當在J76細胞中單獨表現時，ZAP70不轉移。(在圖14中標記為「ZAP70」)。然而，當與CAR一起表現時，ZAP70有效轉移至Ramos受體(圖14中「CAR+ZAP70」)。 實例 11 ： 使用不同供體細胞共轉移載物在此實例中，測試非T細胞是否可用作基於CAR之轉移的供體。 供體細胞 ：K562：源自骨髓白血病之人類細胞株 受體細胞 ：Ramos細胞：表現CD19之B細胞株。 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 供體 CAR 及載物表現 ：將供體K562細胞用表現CD19 CAR (例如，如實例6中所述)及載物(圖9)之構築體電穿孔。測試四種不同CAR/載物組合： 1) 模擬：無CAR或ZAP70-GFP載物之模擬電穿孔 2) CAR ：mCherry直接與CAR之C端融合 3) ZAP70-GFP ：GFP與僅含有SH2域之人類ZAP70之截短型式的n端融合。此產生僅在觸發CAR時與CAR締合之EGFP蛋白。此條件不包括CAR。 4) CAR + ZAP70-GFP ：CAR與ZAP70-GFP載物共轉染。 序列 ( 如表 3 中所列出 ) ：＞ CD19CAR-CD3z-mCherry ＞EGFP-ZAP70_SH2 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(4個條件)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以5:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育2小時。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測CAR (mCherry)及ZAP-70 (EGFP)自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活Ramos細胞在CellTracker上進行閘控，接著分別藉由mCherry及EGFP螢光評估CAR及/或ZAP70載物之獲取。 結果 ：如在T細胞供體的情況下所觀測，K562能夠將CD19CAR-CD3z-mCherry及ZAP70-GFP共轉移至Ramos受體。不同於T細胞，K562在不存在CAR下展示一些ZAP70轉移，但在共表現時CAR能夠增加轉移(圖15)。 實例 12 ： 活體內遞送受體締合之貨物此實例測試先前實例中概述之載物轉移受體是否可在活體內遞送載物至目標細胞。 供體細胞 ：1) 小鼠初級CD8 T細胞：此等供體細胞自穿孔素剔除小鼠(Jax原料#002407)收穫。穿孔素缺陷使細胞無法經由穿孔素/顆粒酶依賴性機制殺死目標細胞。 接受動物 ：1) 餵以卵白蛋白或SIINFEKL肽之C57BL/6J (Jax庫存號000664)或Ai6 (Jax庫存號007906)小鼠 2) 用卵白蛋白或SIINFEKL肽局部處理之C57BL/6J或Ai6小鼠 3) C57BL/6J或Ai6小鼠(未處理) 細胞身分標記 ：為在活體內區分供體細胞，將其用與細胞質結構(Thermo CellTracker染料)共價交聯之染料標記。展示此等染料穩定地標記細胞以供在活體內長期追蹤。 供體細胞修飾 ：將供體T細胞與過度表現OT1 TCR (對呈遞在I類MHC上之卵白蛋白肽具有特異性)及包括以下之載物轉移受體系統的構築體共轉染： 1) mCD3z-EGFP 2) EGFP-mZAP70_SH2 3) Cre-mZAP70_SH2 4) MCP-mZAP70_SH2 + MS2 Cre mRNA. 下文列出OT1 TCR及載物轉移受體序列。基於EGFP之構築體(1、2)用於C57Bl/6J接受者，而基於Cre之構築體(3、4)用於Ai6小鼠，其為Cre報導體品系。 序列 ( 如表 3 中所列出 ) ：＞OT1 TCR ＞mCD3z-EGFP ＞EGFP-mZAP70_SH2 ＞Cre-mZAP70_SH2 ＞MCP-mZAP70_SH2 抗原脈衝 ：在細胞注射之前將小鼠用抗原或媒劑預處理1週(膳食)或2天(局部，每天施用1次)。 細胞注射 ：經由尾靜脈注射將經修飾之供體細胞注射至接受動物中。 量測 ：在注射之後二至四天，將動物處死且收集皮膚及腸。自經局部處理及未經處理之區域取皮膚樣品。藉由流動式細胞測量術、組織學或整體顯微術量測載物轉移。對於流動式細胞測量術，將組織解離且針對細胞類型特異性標記物進行染色，接著評估Cytotracker染料、細胞類型標記物及EGFP或Cre報導體(ZsGreen)。對於組織學，將組織冷凍在OCT中以進行冰凍切片且藉由螢光顯微法進行分析。對於整體，使組織保持完整且針對EGFP/ZsGreen及cytotracker直接成像。Cytotracker陰性EGFP/ZsGreen陽性細胞指示成功的活體內轉移。 實例 13 ： 在混合群體中特異性轉移至目標細胞在此實例中，藉由使供體暴露於含有少量目標細胞之混合群體來測試轉移特異性。結果(下文展示)證實，CAR特異性轉移至B細胞，而不轉移至PBMC之目標/受體細胞混合物中存在的其他細胞。 供體細胞組 ( 如圖 16A 中所示 ) ：1) J76 (模擬電穿孔)：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR。 2) J76 + CD19 CAR-mCherrry：mCherry與CAR之C端融合 3) J76 + ZAP70-GFP：GFP與僅含有SH2域之人類ZAP70之截短型式的N端融合。此產生僅在觸發CAR時與CAR締合之GFP蛋白。此條件不包括CAR。 4) J76 + CD19 CAR-mCherrry + ZAP70-GFP：CAR與ZAP70-GFP載物共轉染。 受體細胞 ：由大約9.5% B細胞、73.5% T細胞、3.5% NK細胞、12.5%單核球及1%未分類細胞(其他)組成之人類周邊血液單核細胞(PBMC)。B細胞為期望目標，為表現CAR之目標抗原CD19之唯一細胞。 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與受體PBMC，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 供體 CAR 及載物表現 ：根據以上供體組，將供體J76細胞用表現CD19 CAR (如實例6及10中所述)及ZAP70-GFP融合載物(序列如下)之構築體電穿孔。 序列 ( 如表 3 中所列出 ) ：＞CD19CAR-CD3z-mCherry ＞EGFP-ZAP70_SH2 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行共培養(4個組合)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以5:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育1小時。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測EGFP自供體至受體之轉移。使用特異性抗體染色鑑別PBMC細胞類型。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活PBMC在CellTracker上進行閘控，接著藉由mCherry螢光評估CAR獲取且藉由EGFP螢光評估載物獲取。 結果 ：如圖16B中所示，觀測到每當CAR存在於供體中時(在圖16中條件標記為「CAR-mCherry」及「CAR+ZAP」)，CAR均轉移至表現CD19之B細胞。藉由mCherry螢光量測CAR獲取。CAR未顯著轉移至任何其他細胞類型。當在J76細胞中單獨表現時ZAP70未轉移(在圖16中標記為「ZAP70-GFP」)。然而，當與CAR-mCherry一起表現時，ZAP70-GFP (圖16C中「CAR+ZAP」)僅特異性轉移至B細胞，但無其他PBMC子集。 實例 14. 使用缺乏信號傳導之 CAR 進行轉移 供體細胞 ：1) J76 (模擬電穿孔)：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR。 2) J76 + CD19 CAR-mRuby：mRuby與CAR之C端融合 3) J76 + CD19 CAR-mRuby + ZAP70-GFP：與以上在額外ZAP70-GFP載物下相同。 4) J76 + CD19死CAR-mRuby：缺乏CD3z域之CD19 CAR-mRuby進行修飾，消除下游信號傳導及ZAP70結合 5) J76 + CD19死CAR-mRuby + ZAP70-GFP 受體細胞 ：Ramos細胞：表現CD19之B細胞株。 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(如上所列之5個條件)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以1:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育1小時。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測CAR (mRuby)及ZAP-70 (EGFP)自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活Ramos細胞在CellTracker上進行閘控，接著分別藉由mRuby及EGFP螢光評估CAR及/或ZAP70載物之獲取。 結果 ：如圖17中所示，在存在CAR之所有條件下CAR均發生轉移，包括缺乏CD3z之死CAR。ZAP70-EGFP轉移視CD3z之存在而定且在與死CAR組合時不發生轉移(圖17)。 實例 15. 使用 StrepCAR 之模組化重定目標 供體細胞 ：1) J76 (模擬電穿孔)：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR。 2) J76 + CD19 CAR-mRuby：mRuby與CAR之C端融合 3) J76 + StrepCAR-mRuby：除細胞外scFv替換為單鏈黴抗生物素蛋白域之外，StrepCAR-mRuby與CD19 CAR-mRuby均一致 4) J76 + StrepCAR-mRuby + 非特異性抗體：與#3相同，但所得到之細胞與識別受體細胞上不存在之HLA-G的生物素化抗體一起培育 5) J76 + StrepCAR-mRuby + 非特異性抗體：與#3相同，但所得到之細胞與識別受體細胞上存在之CD19的生物素化抗體一起培育 受體細胞 ：Ramos細胞：表現CD19之B細胞株。 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(5個條件)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以1:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育5分鐘。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測CAR (mRuby)及ZAP-70 (EGFP)自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活Ramos細胞在CellTracker上進行閘控，接著藉由mRuby螢光評估任一CAR之獲取。 結果 ：如圖18中所示，僅當與靶向受體細胞上存在之CD19的特異性抗體組合時，StrepCAR-mRuby方發生轉移。StrepCAR之總轉移達到針對CD19 CAR-mRuby觀測到之水準的大約一半。僅5分鐘共培養內，兩種CAR即顯著轉移至受體細胞。 實例 16. 用於靶向 MHC 呈遞抗原之 CAR 供體細胞 ：1) J76 (模擬電穿孔)：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR。 2) J76 + SIINFEKL CAR-mRuby：此CAR與來自先前實例之CD19 CAR-mRuby一致，但具有識別在HLA-A2上呈遞之模型抗原SIINFEKL而非CD19的scFV。 3) J76 + StrepCAR-mRuby：除細胞外scFv替換為單鏈黴抗生物素蛋白域之外，StrepCAR-mRuby與CD19 CAR-mRuby均一致 4) J76 + StrepCAR-mRuby + 非特異性抗體：與#3相同，但所得到之細胞與識別受體細胞不表現之CD19的生物素化抗體一起培育。 5) J76 + StrepCAR-mRuby + 非特異性抗體：與#3相同，但所得到之細胞與識別經抗原脈衝之受體細胞上存在之HLA呈遞SIINFEKL的生物素化抗體一起培育。 受體細胞 ：1) EL4細胞(無OVA)：HLA-A2陽性細胞株，無抗原 2) EG7細胞(低OVA)：表現卵白蛋白之HLA-A2陽性細胞株，引起低程度之SIINFEKL呈遞 3) EL4細胞(高OVA)：與以上#1相同，但用大量SIINFEKL肽脈衝 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(15個條件)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以1:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育1小時或8小時。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測CAR (mRuby)自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活Ramos細胞在CellTracker上進行閘控，接著藉由mRuby螢光評估CAR之獲取。 結果 ：如圖19中所示，在所有條件下CAR均發生轉移，但在高抗原及更長時間培育下顯著增加。 實例 17. 功能 Cre 重組酶至受體之轉移 供體細胞 ：1) HEK 293t細胞 + CD19 CAR-mRuby (CAR) + Cre-MS2 + vsv-g：含有所有元件，CAR、Cre效應子及促融劑 2) HEK 293t細胞 + Cre-MS2 + vsv-g：無CAR 3) HEK 293t細胞 + CAR + Cre-MS2：無促融劑 4) HEK 293t細胞 + Cre-MS2：無促融劑或CAR 受體細胞： 1) HEK 293t細胞 + Flex：Flex為當暴露於Cre時表現EGFP之Cre報導體 2) HEK 293t細胞 + Flex + CD19：與以上相同，但具有CAR識別之抗原 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(總共6個條件，在圖20之圖例中展示)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以1:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在37℃下培育48小時。 量測 ：使用Incucyte活細胞成像系統(Sartorius)在共培養時隨著時間推移量測受體之EGFP。每30分鐘使細胞成像，歷時48小時。亦經由mRuby螢光量測CAR陽性細胞。EGFP指示Cre之功能轉移。 結果 ：如圖20中所示，含有CAR、MS2-Cre及vsv-g之供體J76細胞誘導CD19+目標細胞中之GFP表現，在共培養約20小時開始(B中為CAR / Cre-MS2 / vsv-g → CD19/ Flex跡線且C中為圖像)。在所有對照條件下歷經48小時看到最小背景螢光。如所希望，GFP+細胞計數持續增加至實驗結束。 實例 18. 藉由人類初級調控 T 細胞 (Treg) 進行的 CAR 介導之轉移 供體細胞 ：1) J76：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR。 2) J76-CAR：表現CD19 CAR-mRuby之穩定T細胞株 3) 經分離之人類Treg (CD4+、CD25+) 4) 經CD19 CAR-mRuby慢病毒轉導之經分離之人類Treg (CD4+、CD25+) 受體細胞 ：Ramos細胞：表現CD19之B細胞株。 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與受體細胞，用與細胞質結構共價交聯之獨特染料(Thermo CellTracker染料)標記兩者。 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(4個條件)。首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以1:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在37℃下培育1小時。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測CAR (mRuby)自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活Ramos細胞在CellTracker上進行閘控，接著藉由mRuby螢光評估CAR之獲取。 結果 ：如圖21 (上圖)中所示，經轉導之Treg以與穩定J76-CAR細胞類似之模式轉移所表現之CAR。經轉導之Treg亦能夠將CAR轉移至受體Ramos細胞(圖21下圖)。 實例 19. 含有 CD3z 及 CD28 域之第二代 CAR CAR 設計 ：CD19 CAR-mRuby CAR經修飾以在跨膜域與CD3z域之間包括CD28細胞內域。此第二代CAR插入至慢病毒載體中以允許轉導初級細胞。 活體內測試 ：對於活體內遷移及持久性，比較第二代CAR與原始CAR。將初級人類Treg用病毒轉導，擴增且引入至人類化小鼠中。 分析：在常規時間點收集組織以測試CAR Treg之相對存活比及擴展。 實例 20. 使用轉座子產生表現 CAR 之穩定 Jurkat 細胞株 細胞 ：J76細胞株(TCR剔除之Jurkat T細胞株) 修飾 ：將J76細胞用編碼CD19CAR-mRuby及睡美人轉座酶之睡美人供體構築體電穿孔。 在電穿孔之後，評估細胞之CD19CAR-mRuby之穩定表現以證實DNA已穩定整合於基因體中。所得細胞株永久地表現CD19CAR-mRuby。 實例 21 ： 在活體內靶向遞送至 B 細胞在此實例中，供體細胞經工程改造以在人類化小鼠中將CAR轉移至人類B細胞，目標為證實細胞可經程式化以在活體內轉移至B細胞。 供體細胞 ：1) J76：源自Jurkat細胞之供體細胞。已剔除天然TCR。 2) J76-CAR：表現CD19 CAR-mRuby之穩定T細胞株。 3) hTreg-CAR：經慢病毒轉導以表現CD19 CAR-mRuby之初級人類Treg。hTreg為HLA-02陽性。 (附接CD19 CAR-mRuby序列且 圖 22展示該結構之示意圖。) 序列：＞CD19 CAR-mRuby

接受動物 ：Hu-CD34+ NSG (Jax庫存號000664)：Hu-CD34+ NSG為移植來自HLA-02陰性健康人類之臍帶血源性CD34+造血幹細胞(HSC)的NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl, Jackson Labs庫存號005557)小鼠。CD34+人類化-NSG小鼠展現功能人類造血細胞之穩定多譜系移植，無GvHD。此包括B細胞，為此實例中之目標細胞群體。 實驗組：如下表中所概述，向Hu-CD34+小鼠注射各供體細胞組：

供體細胞類型 ( 細胞數目 )	第 1 組 (1 小時 )	第 2 組 (24 小時 )	第 3 組 (48 小時 )
J76 (10×10 6)	2隻小鼠	2隻小鼠	2隻小鼠
J76-CAR (10×10 6)	3隻小鼠	3隻小鼠	3隻小鼠
hTreg-CAR (6.5×10 6)	2隻小鼠	2隻小鼠	2隻小鼠

細胞身分標記：為在活體內區分供體細胞，將其用與細胞質結構(Thermo CellTracker染料)共價交聯之染料標記。已展示此等染料穩定地標記細胞以供在活體內追蹤。 細胞注射 ：經由尾靜脈注射將供體細胞(於100 μL無菌鹽水中)注射至接受動物中。 量測 ：在注射之後1小時、1天及2天，將動物處死且收穫組織，包括血液、脾、骨髓、肺及肝臟。將組織各自解離成單細胞懸浮液，用抗體染色以區分細胞類型，且進行流動式細胞測量術。量測組織中供體細胞之存在以及CD19 CAR-mRuby轉移至人類B細胞之發生率。藉由量測mRuby (與CAR之C端融合)螢光鑑別CAR ( 圖 22)。 結果 ：在1小時組中觀測到顯著轉移至血液及肺之B細胞( 圖 23)。在兩個較晚時間點，可能由於供體細胞(可能被人類化小鼠之同種異體T細胞殺死)損失，轉移不太明顯。圖23展示所有組織之1小時時間點之資料。在授受性轉移之後1小時，在血液與肺中均偵測到實質高頻率之接收到CAR (mRuby)之人類B細胞(圖24)，最高轉移發生在hTreg組中。hTreg組亦展示轉移陽性B細胞當中之最大平均螢光強度(MFI)，MFI係轉移至各目標細胞之CAR之量的量度。 實例 22 ： 使用脂肪細胞幹細胞 (ASC) 作為供體細胞之轉移在此實例中，亦稱為脂肪源性間葉幹細胞之脂肪細胞幹細胞(ASC)經工程改造以在活體外表現靶向CD19之CAR且轉移至人類CD19+細胞株。ASC源自健康的非肥胖供體脂肪組織。在自脂肪組織分離之後，ASC能夠在培養物中繼代及擴增。此實例證實ASC可用作供體細胞。 供體細胞 ：1) 初級人類ASC 2) 經CD19CAR-mRuby工程改造之初級人類ASC (CD19 CAR-mRuby序列如實例21中所示。該結構之示意圖展示於 圖 22中。) 目標細胞 ：T2細胞(表現CD19之人類細胞株)。 細胞身分標記 ：為區分供體細胞與目標細胞，將兩者用與細胞質結構(Thermo CellTracker染料)共價交聯之染料標記。 細胞 - 細胞接觸 ：來自以上各組之供體及受體細胞進行成對共培養(2個組合)。在標記之後，首先分別在懸浮培養基中單一培養該等細胞。為進行共培養，將受體細胞以1:1比率(供體:受體)添加至供體細胞培養物中。將共培養之細胞在100 g下離心以迫使細胞接觸，接著在37℃下培育1小時，接著置放於冰上，隨後加工用於流動式細胞測量術。 量測 ：藉由流動式細胞測量術量測CAR自供體至受體之轉移。所有共培養之細胞均用活力染料染色。來自各共培養物之活目標細胞在適當CellTracker上進行閘控，接著評估mRuby螢光，mRuby螢光指示CAR轉移。 結果 ：量測CD19CAR-mRuby至受體細胞之轉移。 圖 25中概述轉移發生率，其測得為獲取CAR之受體細胞的百分比。如圖25中所示，大約54%目標細胞對於CAR呈陽性(亦即，mRuby+)。 實例 23 ： CRISPR 嵌入 TCR 基因座供體細胞：來自健康供體之人類初級調控T細胞 RNP製劑：核糖核蛋白複合物(RNP)藉由將純CAS-9蛋白與靶向人類TCRα及TCRβ之RNA引導寡核苷酸以1:5比率混合來形成。 DNA供體模板：編碼嘌呤黴素及GFP之DNA卡匣兩側為來自內源性TCRα上游及下游之DNA區的上游及下游同源臂( 圖 26B)。 程序：將購買之CD4/CD25 Treg解凍，接著一天後，用CD3/CD28 Dynabead活化。對於各條件，在活化2天後將2×10 ⁶個活化T細胞用RNP及供體模板電穿孔。在電穿孔之後2天評估基因剔除及基因嵌入( 圖 26A)。 量測：針對CD3，使用流動式細胞測量術來評估TCR之損失，CD3進行適當表面表現需要TCR。亦量測GFP之表現以評估基因嵌入效率。 結果：所有RNP電穿孔之條件的TCR剔除效率極高。最大剔除效率為約94%，在測試之兩個電穿孔條件之間觀測到差異極小( 圖 26C)。當靶向卡匣與RNP共同遞送時，在高達38% Treg中偵測到GFP表現。效率隨著供體DNA之劑量增加而增加( 圖 26D)。 實例 24 ： CAR 至初級 Treg 之 mRNA 遞送供體細胞：來自健康供體之人類初級調控T細胞 mRNA：編碼CD19 CAR-mRuby之mRNA藉由TriLink合成。CAR包括細胞外Flag標籤及細胞內與mRuby3之融合( 圖 27A)。 程序：將購買之CD4/CD25 Treg解凍，接著一天後，用CD3/CD28 Dynabead活化。對於各條件，在活化2天後將2×10 ⁶個活化T細胞用mRNA電穿孔。 量測：針對mRuby3及抗體標記之Flag標籤，使用流動式細胞測量術來量測CAR表現。 結果：藉由mRuby與Flag染色量測CAR之強力表現。值得注意地，mRuby指示CAR之總含量，而Flag染色僅偵測到存在於細胞表面上可用於抗體結合之CAR。由此可良好地指示功能性表面CAR相對於經由胞內體及分泌路徑運送之CAR的比率。總計，在超過90%細胞上偵測到CAR，大部分暴露在表面上( 圖 27B)。

當結合附圖閱讀時將更好地瞭解本發明之以下詳細描述。出於說明本發明之目的，在本文所述之圖式中展示目前示例之某些實施例。然而，應瞭解，本發明不限於圖式中所示之實施例之確切配置及手段。專利或申請案文件含有至少一個彩製圖式。在申請且支付必要費用後，專利局將提供附有彩圖之此專利或專利申請公開案之複本。

圖1A及1B展示表面蛋白質及DMF5 TCR之流動式細胞測量術量測。展示T2受體之Mart-1四聚體染色及利用鏈黴抗生物素蛋白-AF750之生物素化表面蛋白質染色。A)展示未用Mart-1脈衝之T2受體且B)展示經Mart-1脈衝之T2受體。直方圖展示各受體組(實心)對比供體輸入(點線輪廓)之相對螢光強度。

圖2展示多種共培養輸入之轉移定量。共培養輸入組合展示於最左欄中且所得轉移表型概述於最右欄中。中間欄展示通用表面蛋白質轉移(鏈黴抗生物素蛋白-AF750)及特定TCR轉移(MART-1四聚體)。

圖3A-3C展示TCR轉移時程之結果。在與J76-DMF5供體共培養之前，T2受體用不同肽脈衝。(A)在與J76-DMF5細胞共培養時受體對DMF5 TCR之獲取展示為隨時間而變。TCR陽性細胞之百分比指示於各四聚體陽性閘中。(B)展示TCR獲取之定量且(C)展示藉由平均螢光強度(MFI)轉移之TCR的量。

圖4展示在與J76-DMF5供體共培養之前T2受體用不同肽脈衝之時程的結果。展示J76-DMF5供體細胞在共培養時隨著時間推移之活化(GFP)及DMF5 TCR (MART-1四聚體)。

圖5為展示RNA載物經由TCR與RNA結合模體之直接或間接融合物轉移之示例性方法的圖。左圖：MCP RNA結合域與ZAP70 SH2域之融合，其又結合於CD3ζ。右圖：MCP RNA結合域與CD3ζ之融合。

圖6為展示與無肽條件相比，在經肽脈衝之條件下MCP/EGFP mRNA構築體之Lck、CD3z及ZAP70型式之GFP信號增加的圖。

圖7A-7C為展示經由四種不同的示例性方法將載物與TCR共轉移之一系列圖。在實例1及2中確立之模型中測試EGFP融合蛋白之轉移。(A)將J76-DMF5供體用4種不同的表現EGFP之構築體轉染，對比模擬轉染。(B)展示在T2細胞用MART-1肽預先脈衝及未預先脈衝下量測受體T2細胞對DMF5 TCR及EGFP之獲取的流動式細胞測量術。(C) (B)中之資料的定量。對於(C)中之各對條柱，無肽條件展示在左條柱上且+肽條件展示在右條柱。

圖8A-8B為展示載物轉移受體能夠將載物遞送至活體內目標細胞之一系列圖。(A)藉由流動式細胞測量術偵測胰島中之注射之T細胞。(B) OT-1 TCR轉移至胰臟β細胞。

圖9為展示表現特異性結合於CD19之CAR之示例性構築體的圖。CAR包括包含結合於CD19之scFv的細胞外域及包含CD3ζ信號傳導域及C端mCherry螢光蛋白之細胞內域。

圖10為以展現mCherry信號(指示獲取CAR)之受體細胞之百分比，展示CD19 CAR-mCherry轉移至受體細胞之圖。展示未共培養之陰性對照、與J76-CAR供體共培養及與J76-CAR供體及阻斷抗體兩者共培養的結果。

圖11為展示表現可重定目標CAR之示例性構築體的圖，該CAR包含細胞內載物域、跨膜域及包含可重定目標之單價鏈黴抗生物素蛋白突變體(mSA2)之細胞外受體細胞結合域。展示使用生物素化抗HLA-G抗體靶向HLA-G。

圖12為展示使用CAR共轉移RNA載物之示例性策略的一系列圖。左圖展示一種示例性CAR，其經工程改造以包括細胞外CD19結合域、跨膜域及附接於能夠結合於MS2 RNA髮夾之MCP的細胞內CD3ζ域。載物為編碼EGFP且包含MS2莖環之EGFP-MS2 mRNA，如所示。右圖展示在模擬背景、僅CAR-MCP背景、僅GFP-MS2 mRNA背景下及當GFP-MS2 mRNA與CAR-MCP共表現時GFP載物轉移至Ramos細胞之結果。

圖13為展示用於將載物轉移至在表面上表現CD19之受體細胞之示例性方法的圖。展示模擬供體細胞以及用於轉移載物分子之特定轉移策略。一種轉移策略利用與報導體(mCherry)融合之CD19 CAR。第二種轉移策略利用僅含有與報導體(GFP)融合之SH2域的截短人類ZAP70。第三種轉移策略涉及用CD19 CAR及ZAP70構築體兩者共轉染以轉移兩種報導體載物。

圖14為展示CAR-mCherry或ZAP70-GFP構築體轉移至表現CD19之Ramos受體細胞之圖。對於圖中之各組四條柱，自左至右展示以下條件：CAR-mCherry、具有CD19阻斷之CAR-mCherry、ZAP70-GFP及具有CD19阻斷之ZAP70-GFP。

圖15為展示使用CAR共轉移RNA載物之示例性策略的一系列圖。左圖展示表現與mCherry融合之CD19 CAR及與GFP融合之ZAP70 SH2域的K562供體細胞，及表現CD19之Ramos受體細胞。右圖展示在模擬背景、僅CAR-mCherry背景、僅ZAP70-GFP背景下及當ZAP70-GFP與CAR-mCherry共表現時GFP及mCherry載物轉移至Ramos細胞之結果。對於圖中之每對條柱，左條柱展示CAR-mCherry且右條柱展示ZAP70-GFP。

圖16A-16C為展示自供體細胞特異性轉移至混合細胞群體中存在之目標受體細胞的一系列圖。(A)示意性展示四種供體條件，包括模擬電穿孔J76細胞、包含與mCherry融合之CD19 CAR的J76細胞、包含ZAP70-GFP融合蛋白之J76細胞及包含CD19 CAR-mCherry融合及ZAP70-GFP融合之J76細胞。(B) mCherry自四種供體細胞條件中之每一者轉移至PBMC中之各種細胞類型，如所指示。(C) GFP自四種供體細胞條件中之每一者轉移至PBMC中之各種細胞類型，如所指示。對於(B)及(C)中之各組四條柱，自左至右展示以下條件：模擬、CAR-mCherry、ZAP70-GFP及CAR + ZAP。

圖17為展示使用缺乏CD3-ζ域之CD19 CAR-mRuby作為穿梭子將GFP載物成功轉移至受體細胞的一系列圖。

圖18為展示使用含有單鏈黴抗生物素蛋白部分之CAR (StrepCAR)作為穿梭子將載物成功轉移至受體細胞的一系列圖。此穿梭子允許使用生物素化抗體將穿梭子重定目標，因此各目標抗原不需要單獨CAR。

圖19為展示使用靶向MHC呈遞抗原(亦即，SIINFEKL肽)之CAR作為穿梭子將載物成功轉移至受體細胞的一系列圖。對於圖中之各組六條柱，自左至右展示以下條件：1小時無抗原、1小時低抗原、1小時高抗原、8小時無抗原、8小時低抗原及8小時高抗原。

圖20為展示載物在同型供體-受體對之間成功轉移的一系列圖。詳言之，使用包含vsv-g促融劑之HEK 293T供體細胞將載物轉移至HEK 293T受體細胞。使用Cre重組酶以促融劑依賴性方式將Cre報導體重組於受體細胞之細胞核中。

圖21為展示使用初級人類調控T細胞(Treg)作為供體細胞將載物成功轉移至受體細胞的一系列圖。Treg供體細胞經慢病毒轉導以引入CD19 CAR-mRuby穿梭子。

圖22為展示CD19 CAR-mRuby複合物之示例性結構的圖，該複合物包括包含抗人類CD19 scFv及Flag標籤之細胞外區、跨膜區及包含mRuby3之細胞內區。

圖23為展示在來自接受動物之各種組織中CAR轉移至B細胞之圖。在來自注射有hTreg-CAR供體細胞之動物之血液及肺中觀測到顯著CAR轉移至B細胞。亦在來自接收J76-CAR (純系4)供體細胞之動物之血液及肺中觀測到CAR轉移至B細胞。

圖24為展示在自接受動物獲得之組織中偵測到mRuby之圖，其中在接收hTreg-CAR供體細胞之動物中觀測到最高mRuby信號，且在接收J76-CAR (純系4)供體細胞之動物中觀測到較低含量之mRuby。在接收J76供體細胞之動物中幾乎未偵測到mRuby信號。

圖25為展示在與野生型脂肪細胞幹細胞(ASC) (左圖)或經工程改造以表現CD19 CAR-mRuby之ASC共培養之後CD19 CAR-mRuby轉移至目標細胞中之發生率的一系列圖。

圖26A-26D為展示使用CRISPR將外源性CAR插入至TRAC基因座中，藉此以單個步驟移除內源性TCR且將外源性CAR插入至可靠基因體基因座中的一系列圖。

圖27A-27B為展示如藉由流動式細胞測量術所量測的對Flag及mRuby信號之偵測，Flag標記之CD19 CAR-mRuby mRNA遞送至初級調控T細胞(Treg)的一系列圖。

Claims (87)

1. 一種修飾受體細胞之方法，該方法包含： 使該受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)細胞內部分；及 (b)外源性載物分子； 其中該受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分；且 其中在該轉移之後，該受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子； 藉此修飾該受體細胞。
2. 一種修飾受體細胞之方法，該方法包含： 使該受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)細胞內部分；及 (b)載物分子； 其中該受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分； 其中在該轉移之後，該受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子；且 其中該載物分子在該供體細胞中以與該供體細胞所源自之源細胞不同之含量存在，例如，差異性表現； 藉此修飾該受體細胞。
3. 一種修飾受體細胞之方法，該方法包含： 使該受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)載物分子； 其中該受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分，其中該第二對接部分包含呈遞同源肽之MHC (例如HLA)； 其中在該轉移之後，該受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子；且 其中該載物分子或該膜締合劑對該供體細胞為外源性的； 藉此修飾該受體細胞。
4. 一種將載物分子遞送至受體細胞之方法，該方法包含： (i)提供供體細胞，其包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)載物分子；及 受體細胞，其包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分，其中該第二對接部分包含呈遞同源肽之MHC (例如HLA)；及 (ii)使該受體細胞與該供體細胞在適合於將該膜締合劑及/或該載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 其中該載物分子或該膜締合劑對該供體細胞為外源性的； 藉此將該載物分子遞送至該受體細胞。
5. 一種調節個體中之目標組織或受體細胞之生物功能之方法，該方法包含： 向該個體投與供體細胞及/或使該目標組織或該受體細胞與供體細胞接觸，該供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)載物分子； 其中該受體細胞或該個體及/或該目標組織之細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分，其中該第二對接部分包含呈遞同源肽之MHC (例如HLA)；且 其中該載物分子或該膜締合劑對該供體細胞為外源性的； 藉此調節該個體中該目標組織或該受體細胞之該生物功能。
6. 一種製造經修飾之細胞之方法，該方法包含： (i)提供未經修飾之受體細胞； (ii)使該未經修飾之受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該未經修飾之受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)載物分子；且 其中該未經修飾之受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分，其中該第二對接部分包含呈遞同源肽之MHC (例如HLA)； 其中該載物分子或該膜締合劑對該供體細胞為外源性的； 藉此製造經修飾之受體細胞，其中在該轉移之後，相對於該未經修飾之受體細胞，該經修飾之受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子。
7. 如前述請求項中任一項之方法，其中該供體細胞為T細胞。
8. 如請求項7之方法，其包含活化該T細胞。
9. 如前述請求項中任一項之方法，其中該供體細胞為自然殺手細胞(NK細胞)。
10. 如請求項9之方法，其包含活化該NK細胞。
11. 一種組合物，其包含複數個藉由如請求項6至10中任一項之方法製得的受體細胞。
12. 一種組合物，其包含複數個受體細胞，該複數個受體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)細胞外第二對接部分，其包含呈遞同源肽之MHC (例如HLA)，其中該TCR或其功能片段或變異體特異性結合於該細胞外第二對接部分；及 (c)載物分子； 其中該等受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸； 其中該TCR或其功能片段或變異體及/或該載物分子對該受體細胞為外源性的；且 其中該複數個中至少30%細胞(例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)包含可偵測量及/或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子。
13. 一種組合物，其包含複數個受體細胞，該複數個受體細胞包含： (a)膜締合劑，其包含T細胞受體(TCR)或其功能片段或變異體，該TCR包含：(1) TCRα分子及/或TCRβ分子；或(2) TCRγ分子及/或TCRδ分子，其中該TCR包含(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)視情況，細胞內部分；及 (b)細胞外第二對接部分，其包含呈遞同源肽之MHC (例如HLA)，其中該TCR或其功能片段或變異體特異性結合於該細胞外第二對接部分；及 (c)載物分子； 其中該等受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸； 其中該等受體細胞實質上不表現編碼該膜締合劑之核酸，或者若存在載物分子，則實質上不表現編碼該載物分子之核酸；且 其中該複數個中至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)細胞包含可偵測量及/或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子。
14. 如請求項12或13之組合物，其中當供體細胞中包含該TCR或其功能片段或變異體且該受體細胞中包含該第二對接部分時，該TCR或其功能片段或變異體特異性結合於該第二對接部分。
15. 如請求項12至14中任一項之組合物，其中當該受體細胞中包含該TCR或其功能片段或變異體及該第二對接部分兩者時，該TCR或其功能片段或變異體不結合於該第二對接部分。
16. 如請求項12至15中任一項之組合物，其中該複數個受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸，且若存在載物分子，則不包含編碼該載物分子之核酸。
17. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合劑包含TCRα分子及TCRβ分子。
18. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合劑包含TCRγ分子及/或TCRδ分子。
19. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合劑包含CD3ζ分子或其功能片段或變異體。
20. 如請求項19之方法或組合物，其中該CD3ζ分子或其功能片段或變異體包含該細胞內部分(例如其中該細胞內部分為該CD3ζ分子或其功能片段或變異體之細胞內域)。
21. 如請求項19或20之方法或組合物，其中該TCRα分子及/或該TCRβ分子結合於該CD3ζ分子或其功能片段或變異體。
22. 如請求項19或20之方法或組合物，其中該TCRγ分子及/或該TCRδ分子結合於該CD3ζ分子或其功能片段或變異體。
23. 如請求項19至22中任一項之方法或組合物，其中該CD3ζ分子或其功能片段或變異體包含ITAM域，該ITAM域包含一或多個(例如1、2、3、4、5或6個)對野生型CD3ζ鏈序列(例如SEQ ID NO: 39之序列)之酪胺酸殘基的突變(例如突變成苯丙胺酸)。
24. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合部分包含該TCRα分子、該TCRβ分子、該TCRγ分子、該TCRδ分子及/或該CD3ζ分子之跨膜域。
25. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該第一對接部分包含該TCRα分子及/或該TCRβ分子之細胞外域。
26. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該第一對接部分包含該TCRγ分子及/或該TCRδ分子之細胞外域。
27. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該細胞內部分包含該TCRα分子、該TCRβ分子、該TCRγ分子、該TCRδ分子及/或該CD3ζ分子之細胞內域。
28. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該供體細胞為活化免疫細胞(例如活化T細胞)。
29. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中相對於未活化之可比供體細胞，該供體細胞表現更大量之該TCR或其功能片段或變異體(例如其中相對於未活化之可比供體細胞，該供體細胞包含多至少10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%複本之該TCR或其功能片段或變異體，及/或其中該供體細胞包含至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500個複本之該TCR或其功能片段或變異體。
30. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合劑包含複合物，該複合物包含： (i) (1) TCRα分子及/或TCRβ分子，或(2) TCRγ及/或TCRδ分子；及 (ii)結合於該TCRα分子、該TCRβ分子、該TCRγ分子或該TCRδ分子之CD3ζ分子。
31. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該細胞內部分結合該載物分子。
32. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該載物分子與該膜締合劑(例如在該細胞內部分或該膜締合部分)締合(例如共價或非共價附接，或特異性結合於與該膜締合劑結合之分子)。
33. 如請求項32之方法或組合物，其中該載物分子包含特異性結合於該膜締合劑之該細胞內部分的域(例如ZAP70域，或包含一或多個(例如2個) SH2域，例如ZAP70之SH域之域，或其片段或變異體)。
34. 如請求項32之方法或組合物，其中該載物分子與該膜締合劑之該細胞內部分融合(例如與CD3ζ或其功能片段或變異體例如在C端融合)。
35. 如請求項32之方法或組合物，其中該載物分子包含繫栓至質膜內葉之域(例如Lck之棕櫚醯化/肉豆蔻醯化域或其功能片段或變異體，例如由atgggctgcgtgtgcagcagcaaccccgag (SEQ ID NO: 40)之核酸序列或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列編碼；及/或包含胺基酸序列MGCVCSSNPE (SEQ ID NO: 41)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)。
36. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該載物分子包含多肽(例如CRISPR酶，例如Cas9)。
37. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該載物分子包含核酸分子(例如DNA分子或RNA分子，例如mRNA、miRNA或circRNA)；視情況其中該mRNA編碼CRISPR酶(例如Cas9)。
38. 如請求項37之方法或組合物，其中該膜締合劑之該細胞內部分包含結合於核酸分子(例如該載物分子)之域，例如DNA結合域或RNA結合域，例如MS2外殼蛋白之該RNA結合域，或其功能片段或變異體。
39. 如請求項38之方法或組合物，其中該核酸分子包含結合於該DNA結合域或該RNA結合域(例如3' MS2模體或其功能片段或變異體)之序列。
40. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該受體細胞包含於個體(例如哺乳動物個體，例如人類個體)中。
41. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合劑對該供體細胞為內源性的。
42. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合劑對該供體細胞為外源性的。
43. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合劑或該細胞內部分包含由該複數個供體細胞中未表現之蛋白酶識別之蛋白酶裂解位點。
44. 一種修飾受體細胞之方法，該方法包含： 使該受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為嵌合抗原受體(CAR)；及 (b)載物分子； 其中該受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分；且 其中在該轉移之後，該受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子； 藉此修飾該受體細胞。
45. 一種將載物分子遞送至受體細胞之方法，該方法包含： (i)提供供體細胞，其包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)載物分子；及 受體細胞，其包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分；及 (ii)使該受體細胞與該供體細胞在適合於將該膜締合劑及/或該載物分子轉移至該受體細胞之條件下接觸； 藉此將該載物分子遞送至該受體細胞。
46. 一種調節個體中之目標組織或受體細胞之生物功能之方法，該方法包含： 向該個體投與供體細胞及/或使該目標組織或該受體細胞與供體細胞接觸，該供體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)載物分子； 其中該受體細胞或該個體及/或該目標組織之細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分； 藉此調節該個體中該目標組織或該受體細胞之該生物功能。
47. 一種製造經修飾之細胞之方法，該方法包含： (i)提供未經修飾之受體細胞； (ii)使該未經修飾之受體細胞與供體細胞在適合於將膜締合劑及/或載物分子轉移至該未經修飾之受體細胞之條件下接觸； 其中該供體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)載物分子；且 其中該未經修飾之受體細胞包含特異性結合於該第一對接部分之第二對接部分； 藉此製造經修飾之受體細胞，其中在該轉移之後，相對於該未經修飾之受體細胞，該經修飾之受體細胞包含增加量之該膜締合劑及/或該載物分子。
48. 如前述請求項中任一項之方法，其中該供體細胞為T細胞或NK細胞。
49. 如請求項48之方法，其包含活化該T細胞或NK細胞。
50. 如請求項49之方法，其中在該第一對接部分與該第二對接部分之間結合之後該CAR之該細胞內部分促進該T細胞或該NK細胞之活化。
51. 一種包含複數個受體細胞之組合物，該等受體細胞藉由如請求項47至50中任一項之方法製得。
52. 如請求項51之包含複數個受體細胞之組合物，其為如請求項53至60中任一項之組合物。
53. 一種組合物，其包含複數個受體細胞，該複數個受體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)細胞外第二對接部分，其特異性結合於該細胞外第二對接部分；及 (c)載物分子； 其中該等受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸；且 其中該複數個中至少30%細胞(例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)包含可偵測量及/或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子。
54. 一種組合物，其包含複數個受體細胞，該複數個受體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)細胞外第二對接部分，其特異性結合於該細胞外第二對接部分；及 (c)載物分子； 其中該等受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸； 其中該等受體細胞實質上不表現編碼該膜締合劑之核酸且實質上不表現編碼該載物分子之核酸；且 其中該複數個中至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)細胞包含可偵測量及/或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子。
55. 如請求項53或54之組合物，其中當供體細胞中包含該CAR且該受體細胞中包含該第二對接部分時，該CAR之該第一對接部分特異性結合於該第二對接部分。
56. 如請求項53至55中任一項之組合物，其中當該受體細胞中包含該CAR及該第二對接部分兩者時，該CAR之該第一對接部分不結合於該第二對接部分。
57. 如請求項53至56中任一項之組合物，其中該複數個受體細胞不包含編碼該膜締合劑之核酸且不包含編碼該載物分子之核酸。
58. 一種組合物，其包含複數個供體細胞，該複數個供體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)外源性載物分子，其中該載物分子與該膜締合劑(例如在該細胞內部分或該膜締合部分)締合(例如共價或非共價附接，或特異性結合於與該膜締合劑結合之分子)， 其中該第一對接部分特異性結合於受體細胞之表面上的第二對接部分。
59. 一種組合物，其包含複數個供體細胞，該複數個供體細胞包含： (a)外源性膜締合劑，其包含：(i)膜締合部分、(ii)第一對接部分及(iii)細胞內部分，其中視情況該膜締合劑為CAR；及 (b)外源性載物分子，其中該載物分子與該膜締合劑(例如在該細胞內部分或該膜締合部分)締合(例如共價或非共價附接，或特異性結合於與該膜締合劑結合之分子)， 其中該第一對接部分特異性結合於受體細胞之表面上的第二對接部分。
60. 如請求項58或59之組合物，其中該複數個供體細胞將可偵測量或生物學上有效量之該膜締合劑及/或該載物分子轉移至複數個該等受體細胞之至少30% (例如至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)中。
61. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該載物分子對該供體細胞為外源性的。
62. 如前述請求項中任一項之方法組合物，其中該載物分子對該供體細胞為內源性的。
63. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該載物分子對該受體細胞為外源性的。
64. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該載物分子對該受體細胞為內源性的。
65. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該CAR包括包含該第一對接部分之細胞外域。
66. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該第一對接部分包含抗體分子且該第二對接部分包含由該抗體分子識別之抗原決定基。
67. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該第一對接部分包含結合於生物素化抗體分子之親和素(例如單體親和素，例如mSA2，或其功能片段或變異體)，其中該生物素化抗體分子識別該第二對接部分所包含之抗原決定基。
68. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合劑之該細胞內部分包含CD3ζ細胞質域或其功能片段或變異體；視情況其中該載物分子結合於或共價附接於CD3ζ細胞質域或其功能片段或變異體。
69. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合劑包含融合蛋白，該融合蛋白包含： (i)該膜締合部分， (ii)該細胞外第一對接部分，及 (iii)該細胞內部分， 其中(i)位於(ii)與(iii)之間。
70. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該細胞內部分例如共價或非共價結合該載物分子。
71. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合部分包含跨膜域，例如CD28、CD8或TCR CD3ζ分子之跨膜域。
72. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該供體細胞為活化免疫細胞(例如活化T細胞)。
73. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中相對於未活化之可比供體細胞，該供體細胞表現更大量之該CAR (例如其中相對於未活化之可比供體細胞，該供體細胞包含多至少10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%複本之該CAR，及/或其中該供體細胞包含至少5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500個複本之該CAR。
74. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該載物分子與該膜締合劑(例如在該細胞內部分或該膜締合部分)締合(例如共價或非共價附接，或特異性結合於與該膜締合劑結合之分子)。
75. 如請求項74之方法或組合物，其中該載物分子包含特異性結合於該膜締合劑之該細胞內部分的域(例如ZAP70域，或包含一或多個(例如2個) SH2域，例如ZAP70之SH域之域，或其片段或變異體)。
76. 如請求項75之方法或組合物，其中該膜締合劑之該細胞內部分包含結合於該ZAP70域或其片段或變異體之CD3ζ細胞質域或其功能片段或變異體。
77. 如請求項74之方法或組合物，其中該載物分子與該膜締合劑之該細胞內部分融合(例如與CD3ζ或其功能片段或變異體例如在C端融合)。
78. 如請求項74之方法或組合物，其中該載物分子包含繫栓至質膜內葉之域(例如Lck之棕櫚醯化/肉豆蔻醯化域或其功能片段或變異體，例如由atgggctgcgtgtgcagcagcaaccccgag (SEQ ID NO: 40)之核酸序列或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之核酸序列編碼)；及/或包含胺基酸序列MGCVCSSNPE (SEQ ID NO: 41)，或與其具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列)。
79. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該載物分子包含多肽(例如CRISPR酶，例如Cas9)。
80. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該載物分子包含核酸分子(例如DNA分子或RNA分子，例如mRNA、miRNA或circRNA)；視情況其中該mRNA編碼CRISPR酶(例如Cas9)。
81. 如請求項80之方法或組合物，其中該膜締合劑之該細胞內部分包含結合於核酸分子(例如該載物分子)之域，例如DNA結合域或RNA結合域，例如MS2外殼蛋白之該RNA結合域，或其功能片段或變異體。
82. 如請求項81之方法或組合物，其中該核酸分子包含結合於該DNA結合域或該RNA結合域(例如3' MS2模體或其功能片段或變異體)之序列。
83. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該受體細胞包含於個體(例如哺乳動物個體，例如人類個體)中。
84. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該膜締合劑或該細胞內部分包含由該複數個供體細胞中未表現之蛋白酶識別之蛋白酶裂解位點。
85. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該受體細胞不為癌細胞。
86. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該受體細胞在未患癌症之個體中。
87. 如前述請求項中任一項之組合物或方法，其中該受體細胞為離體的且來自未患癌症之個體。

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