JP2022534694A - 角膜を作製するためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

角膜を作製するための方法は、フレームを、近位端および遠位端を有するほぼ円筒形の構造、近位端に配置された基部、ならびに近位端と遠位端との間に配置された多孔質膜を含む少なくとも１つの細胞培養インサートに取り付けるステップと、フレーム内の多孔質膜にドーム型部材を取り付けるステップであって、ドーム型部材は、クラウン、ドーム基部、およびクラウンとドーム基部とを接続する表面を含む、ステップと、クラウンおよびドーム型部材の表面の少なくとも一部がマトリックス形成化合物を含む材料でコーティングされるように、マトリックス形成化合物を含む材料をフレーム上に堆積させるステップと、フレームに付着した作製済角膜を生成するために、ドーム型部材を除去するステップと、を含む。角膜および角膜足場を作製するためのシステムもまた、本明細書に記載されている。

Description

関連出願との相互参照
本開示は、２０１９年６月３日に出願された「ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＦＡＢＲＩＣＡＴＩＮＧ Ａ ＬＩＶＩＮＧ ＣＯＲＮＥＡ」という名称の米国仮出願第６２／８５６，３８０号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本開示は、角膜の作製、より具体的には、生きている角膜を作製するための操作可能なシステムの使用に関する。

角膜は、目の前部にある透明で湾曲した組織であり、目の内部を保護すると同時に、光が目の外側から目の内部の視覚処理構造およびシステムおよび神経系に通過することを可能にする。角膜交換療法は、円錐角膜、フックスジストロフィ、角膜の菲薄化、角膜の瘢痕化、角膜の曇り、角膜の腫れ、角膜潰瘍、眼科手術による合併症などの状態から角膜が損傷した人の視力を回復するために使用される。角膜交換療法に加えて、これらの状態や他の状態に対処するための研究を行うために角膜の供給も必要である。現在、角膜交換および関連する科学的研究には、死体ドナーからの組織提供が必要である。したがって、角膜交換療法のために、および角膜研究のためのサンプルの供給として、角膜を効率的に作製するための人工技術の必要性が存在する。

一実施形態では、角膜を作製するための方法は、フレームを、近位端および遠位端を有するほぼ円筒形の構造、近位端に配置された基部、ならびに近位端と遠位端との間に配置された多孔質膜を含む少なくとも１つの細胞培養インサートに取り付けるステップと、フレーム内の多孔質膜にドーム型部材を取り付けるステップであって、ドーム型部材は、クラウン、ドーム基部、およびクラウンとドーム基部とを接続する表面を含む、ステップと、クラウンおよびドーム型部材の表面の少なくとも一部がマトリックス形成化合物を含む材料でコーティングされるように、マトリックス形成化合物を含む材料をフレーム上に堆積させるステップと、フレームに付着した作製済角膜を生成するために、ドーム型部材を除去するステップと、を含む。

別の実施形態では、角膜を作製するためのシステムは、少なくとも１つの細胞培養インサートであって、細胞培養インサートが、近位端および遠位端を有するほぼ円筒形の構造、近位端に配置された基部、ならびに近位端と遠位端との間に配置された多孔質膜を含む、少なくとも１つの細胞培養インサートと、少なくとも１つの細胞培養インサート上に配置されたフレームと、を含む。

さらに別の実施形態では、作製済角膜足場は、凸面および凹面を有し、少なくとも１つのマトリックス形成化合物を含むマトリックスを含む非天然ドーム構造を含む。

本開示の特定の実施形態の以下の詳細な説明は、以下の図面と併せて読むと最もよく理解することができ、ここで、同様の構造は、同様の符号で示され、以下の通りである。

本明細書に示され説明される１つまたは複数の実施形態による、角膜を作製するためのシステムを示す図である。 本明細書に示され説明される１つまたは複数の実施形態による、角膜を作製するためのシステムで使用されるフレームの中実構成要素を示す図である。 本明細書に示され説明される１つまたは複数の実施形態による、角膜を作製するためのシステムで使用されるフレームの多孔質構成要素を示す図である。 本明細書に示され説明される１つまたは複数の実施形態による、犠牲ドーム型部材を含む角膜を作製するためのシステムを示す図である。 本明細書に示され説明される１つまたは複数の実施形態による、角膜を作製するためのシステムのマニホルド構成要素を示す図である。 本明細書に示され説明される１つまたは複数の実施形態による、角膜を作製するためのシステムのブランク細胞培養インサート構成要素を示す図である。 本明細書に示され説明される１つまたは複数の実施形態による、図２の中実構成要素および図３の多孔質構成要素から構成されるフレームが取り付けられた、図６Ａのブランク細胞培養インサートを示す図である。 本明細書に示され説明される１つまたは複数の実施形態による、図６Ｂに示すシステムに取り付けられた犠牲ドーム型部材を含む角膜を作製するためのシステムを示す図である。 本明細書に示され説明される１つまたは複数の実施形態による、犠牲ドーム型部材および図６Ｃに示すシステムに取り付けられた角膜を含む角膜を作製するためのシステムを示す図である。 本明細書に示され説明される１つまたは複数の実施形態による、犠牲ドーム型部材が除去された、図６Ｄに示すシステムに取り付けられた角膜を含む角膜を作製するためのシステムを示す図である。 本明細書に示され説明される１つまたは複数の実施形態による、マニホルドのウェルに収容された図６Ｅに示すシステムを示す図である。

一般的に図面を参照すると、本開示の実施形態は、角膜を作製するためのシステムおよび方法に関する。本明細書に記載されるような角膜を作製するためのシステムおよび方法は、交換および研究のための角膜の供給を可能にするであろう。本明細書に記載のシステムおよび方法は、作製および培養中に角膜に接触することなく角膜を操作するための場所を提供することにより、作製済角膜のさらなる処理を容易にする。

ここで、作製システムの実施形態を詳細に参照し、そのようなシステムの例を添付の図面に示す。可能な限り、同じまたは同様の部品を参照するために、図面全体で同じ符号が使用される。作製システムの様々な実施形態は、添付の図面を特に参照して、本明細書でさらに詳細に説明される。

最初に図１を参照すると、角膜を作製するためのシステム１０は、少なくとも１つの細胞培養インサート１２と、少なくとも１つの細胞培養インサート１２上に配置されたフレーム１４と、を含む。例示的な細胞培養インサート１２は、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）透過性支持体として市販されている。細胞培養インサート１２は中空で、ほぼ円筒形であってもよく、近位端１６は円筒形の外面２０によって遠位端１８から分離されている。基部２２は、細胞培養インサート１２の近位端１６に配置され得、シリンダ２４の中空内部へのアクセスを可能にする開口部２３を含むことができる。多孔質膜２５は、近位端１６と遠位端１８との間に配置され得る。実施形態では、多孔質膜２５は、近位端１６よりも細胞培養インサート１２の遠位端１８に近くてもよい。

図２および図３を参照すると、フレーム１４を使用して、角膜の作製中に角膜を細胞培養インサート１２に取り付けることができる。フレーム１４は、構造が単一であってもよいが、中実構成要素１４ａおよび中実構成要素１４ａに隣接する多孔質構成要素１４ｂの両方から構成され得る。中実構成要素１４ａおよび多孔質構成要素１４ｂの両方は、概してトロイダルまたは環状の形状である。トロイダルまたは環状の形状は、内半径および外半径により特徴付けることができる。したがって、中実構成要素１４ａおよび多孔質構成要素１４ｂは、それぞれ、厚さ３０によって分離された、外半径の外側限界にある外面２６ａ、２６ｂと、内半径の内側限界にある内面２８ａ、２８ｂと、を含む。多孔質構成要素１４ｂは、フレームワーク構造３５によって分離された外側リング３１および内側リング３３を含み、それらの隙間は細孔３７を形成する。実施形態では、内面２８ａ、２８ｂは、細胞培養インサート１２に取り付けられると、細胞培養インサート１２の外面２０に当接することができる。

実施形態では、フレーム１４は、高分子有機ケイ素などのケイ素含有材料から作製されてもよい。例えば、制限なしに、フレーム１４は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作製されてもよい。他の実施形態では、フレーム１４は、非毒性合成ポリマー、非毒性天然ポリマー、非毒性金属、非毒性セラミック材料、およびこれらの２つ以上の組み合わせなどの任意の非毒性材料から作製されてもよい。フレーム１４を作製するための可能な材料の特定の例は、ポリカプロラクトン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、フィブリン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ポリエチレンテレフタレート、およびこれらの２つ以上の組み合わせを含むが、これらに限定されない。

実施形態では、中実構成要素１４ａは、多孔質構成要素１４ｂを取り付ける前に、細胞培養インサート１２に取り付けられてもよい。したがって、中実構成要素１４ａは、細胞培養インサート１２の近位端１６の基部２２に空間的に近くてもよく、多孔質構成要素１４ｂは、遠位端１８に空間的に近くてもよい。

実施形態では、フレーム１４は、任意の便利な方法で作製することができる。例えば、フレーム１４は、３次元（３Ｄ）印刷などによる積層造形プロセスによって作製されてもよい。３Ｄ印刷のための例示的なシステムおよびワークステーションは、「ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＷＯＲＫＳＴＡＴＩＯＮ ＦＯＲ ＴＨＥ ＤＥＳＩＧＮ，ＦＡＢＲＩＣＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＡＳＳＥＭＢＬＹ ＯＦ ＢＩＯ－ＭＡＴＥＲＩＡＬ ＣＯＮＳＴＲＵＣＴＳ」と題された、２０１８年３月６日に発行された米国特許第９，９１０，９３５号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、中実構成要素１４ａおよび多孔質構成要素１４ｂは、３Ｄ印刷によってＰＤＭＳから作製され得、４０℃から８０℃の温度のオーブン中で０．５時間以上の時間硬化される。硬化温度を上げると、硬化時間が短くなる場合がある。次に、硬化された構成要素１４ａ、１４ｂは、例えば、プラズマ酸化などのプロセスを使用して酸化され得る。他の実施形態では、フレーム１４は、モールド手法、およびより大きな材料シートからフレーム１４の形状に材料を切断または打ち抜くことを含むがこれらに限定されない代替的な方法によって作製されてもよい。

図４を参照すると、システム１０は、略ドーム型部材３２を含んでもよい。ドーム型部材３２は、クラウン３４、ドーム基部３６、およびクラウン３４とドーム基部３６とを接続する表面３８を含む。表面３８は、クラウン３４が細胞培養インサート１２の近位端１６に配置された基部２２から最大距離だけ離れて延在するように、多孔質膜２５から離れて突出している。実施形態では、ドーム型部材３２のクラウン３４は、作製時に角膜を成形するための表面が細胞培養インサート１２から離れて延在するように、細胞培養インサート１２の遠位端１８を超えて延在してもよい。

ドーム型部材３２は、犠牲材料から作製され得る。例えば、これらに限定されないが、犠牲材料は、ゼラチン、ポロキサマー、アルギン酸塩、コラーゲン、アガロース、砂糖ガラス、フィブリン、溶解性合成ポリマー、およびこれらの２つ以上の組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。実施形態では、犠牲材料は３Ｄ印刷可能であり得る。他の実施形態では、犠牲材料は、ピペッティング、物理的配置、または細胞培養インサート１２上に犠牲材料を堆積させる他の任意の便利な手段によって堆積することができる可能性がある。

図５を参照すると、システム１０は、形成後に角膜をさらに処理するためのウェルプレートマニホルド４０をさらに含むことができる。ウェルプレートマニホルド４０を含む例示的なシステムは、２０２０年３月６日に出願された「Ｍｏｄｕｌａｒ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ Ｌｏｗ Ｆｌｏｗ Ｐｕｍｐｉｎｇ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ」と題された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２１４２７号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ウェルプレートマニホルド４０を含む例示的なシステムは、２０２０年３月６日に出願された「Ｍｏｄｕｌａｒ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ Ｌｏｗ Ｆｌｏｗ Ｐｕｍｐｉｎｇ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ」と題する米国特許出願第１６／８１１，８０８号にも記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。図５では、１つまたは複数のウェル４２は、作製後に、細胞培養インサート１２の少なくとも遠位端１８および角膜を収容するようなサイズになっている。１つまたは複数のウェル４２は、ウェルプレートアセンブリ４４に配列され得る。さらに、モジュラポンプアセンブリ４６は、ウェルプレートアセンブリ４４を１つまたは複数の流体リザーバ４８に流体結合するように構成されてもよい。

ウェルプレートアセンブリは、２０１８年９月１９日に出願された「Ｗｅｌｌ－ｐｌａｔｅ ａｎｄ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」と題された米国特許出願第１６／１３５，２９９号に詳細に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、ウェルプレートアセンブリ４４は、複数のウェルグループ５２を画定するウェルプレート５０を含む。各ウェルグループ５２は、１つまたは複数のウェル４２を含むことができる。本開示によるウェルプレートは、６以上のウェル、１２以上のウェル、２４以上のウェル、４８以上のウェル、９６以上のウェルなどを有してもよいことに留意されたい。モジュラポンプアセンブリ４６は、単一のウェルプレート５０内の各ウェル４２またはウェルグループ５２への流れパラメータが互いに変化し得るように、ウェルプレート５０内の任意の数のウェル４２またはウェルグループ５２に個別の流れ制御を提供するように拡張されてもよい。

ウェルプレートマニホルド４０は、ウェルプレート５０の上に配置され、ウェルプレート５０の各ウェル４２に出入りする流体流路を提供することができる。例えば、ウェルプレートマニホルド４０は、複数の流体入口経路５６および複数の流体出口経路５８を提供することができる。複数の流体入口経路５６は、各ウェルグループ５２のウェルへの入口を提供することができ、複数の流体出口経路５８は、各ウェルグループ５２からレセプタクル６０または他の場所への流体の出口を提供することができる。図示した実施形態では、各ウェルグループ５２には３つのウェル４２が存在するが、本開示の範囲から逸脱することなく、より多くのまたはより少ない数のウェル４２が各ウェルグループ５２に存在してもよいことに留意されたい。例えば、個々のウェル４２はそれぞれウェルグループ５２であってもよく、各個々のウェル４２への流れが別々に制御され得るように、専用の流体入口経路５６および流体出口経路５８を有してもよい。

入口ポンプ６２は、各ウェルグループ５２を１つまたは複数の流体リザーバ４８に流体結合する。各入口ポンプ６２は、図５に示すように、同じ流体リザーバ４８に流体結合され得る。しかしながら、入口ポンプ６２は、異なる流体リザーバ４８に流体結合されてもよいことが企図される。したがって、異なる流体リザーバ４８を使用して、異なるウェルグループ５２に異なる流体を供給してもよい。いくつかの実施形態では、ウェルプレート５０の各ウェル４２は、異なる流体リザーバ４８から流体を供給されてもよい。

いくつかの実施形態では、流体リザーバ４８からの流体は、最初に、１つまたは複数の入口ポンプ６２によって流体マニホルド６３に引き込まれ、流体マニホルド６３は、流体リザーバ４８から流体入口ライン６４に流体を分離することができる。すなわち、単一の第１の流体入口ライン６６は、流体リザーバ４８を流体マニホルド６３に流体結合することができ、流体マニホルド６３は、次に、様々な流体入口ライン６４に分離される。

ウェルプレートマニホルド４０を通る流体の流れは、モジュラポンプアセンブリ４６で制御することができる。モジュラポンプアセンブリ４６は、ポンプのアレイを含むことができる。ポンプのアレイは、ウェルプレート５０のウェルグループ５２を通して流体を押し出すように構成された入口ポンプ６２のアレイ、ウェルプレート５０のウェルグループ５２を通して流体を引っ張るように構成された出口ポンプ６８のアレイ、および／またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、ポンプのアレイはポンプ対のアレイを含む。各ポンプ対は、入口ポンプ６２および出口ポンプ６８を含むことができる。流体入口ライン６４は、入口ポンプ６２をウェルプレートマニホルド４０の流体入口経路５６に流体結合することができ、流体出口ライン７０は、出口ポンプ６８をウェルプレートマニホルド４０の流体出口経路５８に流体結合することができる。流体入口ライン６４および流体出口ライン７０は、流体の流れを封じ込めるための任意のタイプの管、パイプなどであってもよい。

入口ポンプ６２および／または出口ポンプ６８は、マイクロポンプ（例えば、ｔｔｐｖｅｎｔｕｓ ＢＬシリーズポンプ、ｔｔｐｖｅｎｔｕｓ ＸＰシリーズポンプ、ｔｔｐｖｅｎｔｕｓ ＬＴシリーズポンプ、ｔｔｐｖｅｎｔｕｓ ＨＰシリーズポンプ、Ｂａｒｔｅｌｓ Ｍｉｋｒｏｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ ｍｐ６マイクロポンプ）を含むがこれらに限定されない任意のタイプのポンプであってもよい。入口ポンプ６２および出口ポンプ６８は、小さなフォームファクタで機能することができ得る。例えば、本開示によるポンプは、１～２μｌ／分の低流量をサポートすることができる。しかしながら、より大きなまたはより小さな流量が企図され、可能である。ウェルプレートアセンブリ４４を通る流体の流れを制御するために、各流体入口ライン６４は、流れ制御バルブ７２、流れセンサ７４、および／または圧力センサ７６を含むことができる。

別の態様では、図６Ａ～図６Ｆを参照して、角膜を作製する方法は、フレーム１４を細胞培養インサート１２に取り付けるステップを含む。フレーム１４および細胞培養インサート１２は上記の通りである。フレーム１４が所定の位置に配置される前または後に、ドーム型部材３２が、細胞培養インサート１２の多孔質膜２５に取り付けられる。次に、マトリックス形成化合物を含む材料をフレーム１４上およびドーム型部材３２上に堆積させて、クラウン３４およびドーム型部材の表面３８の少なくとも一部をマトリックス形成化合物を含む材料でコーティングすることができる。次に、ドーム型部材３２を除去して、作製済角膜７８をフレーム１４に取り付けたままにすることができる。

図６Ａおよび図６Ｂを参照すると、フレーム１４は、遠位端１８の近くで多孔質膜２５を取り囲むブランク細胞培養インサート１２に取り付けられ得る。上記のように、フレーム１４は、中実構成要素１４ａおよび多孔質構成要素１４ｂから構成され得る。そのような実施形態では、中実構成要素１４ａは、典型的には、最初に細胞培養インサート１２に取り付けられ、続いて多孔質構成要素１４ｂに取り付けられる。マトリックス形成化合物を含む材料が最初にフレーム１４および細胞培養インサート１２に付加される場合、材料は液相で付加され、多孔質構成要素１４ｂを通過し、中実構成要素１４ａ上にプールする。

図６Ｃを参照すると、ドーム型部材３２は、細胞培養インサート１２の多孔質膜２５上に直接堆積され得る。このドーム型部材３２は、本方法の後の段階で犠牲になるので、容易に除去できる材料から構築されるべきである。例えば、ドーム型部材３２は、所望の最終角膜の特定の解剖学的構造に正確に一致するように、コラーゲンから３Ｄ印刷されてもよい。図６Ｄを参照すると、ドーム型部材３２は、マトリックス形成化合物を含む材料で少なくとも部分的にコーティングされて、作製済角膜７８を与える。

実施形態では、マトリックス形成化合物は、官能化ポリエチレングリコールヒドロゲル、キトサン、絹、角膜細胞外マトリックス、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸、コラーゲン２、コラーゲン３、コラーゲン４、コラーゲン１０、マウス肉腫細胞、細胞外マトリックス、ラミニン、ポリカプロラクトン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリエチレングリコールおよびその誘導体、フィブリン、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ポリエチレンテレフタレート、ならびにこれらの２つ以上の組み合わせを含むが、これらに限定されない。

実施形態では、マトリックス形成化合物は、任意の都合のよい濃度で処方されてもよい。例えば、マトリックス形成化合物は、１ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌから２９ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌから２８ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌから２７ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌから２６ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌから２５ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌから２４ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌから２３ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌから２２ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌから２１ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌから２０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌから１９ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌから１８ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌから１７ｍｇ／ｍｌ、さらには１５ｍｇ／ｍｌから１６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶液中に処方されてもよい。

実施形態では、マトリックス形成化合物を含む材料はまた、細胞材料を含んでもよい。例えば、材料はコラーゲンおよび細胞材料を含んでもよい。実施形態では、細胞材料は、角膜線維芽細胞（角膜実質細胞としても知られている）および／または角膜内皮細胞および／または角膜上皮細胞を含む。実施形態では、角膜実質細胞および／または内皮細胞および／または上皮細胞は、マトリックス形成化合物を含む材料と事前に混合されてもよい。他の実施形態では、角膜実質細胞および／または内皮細胞および／または上皮細胞は、作製後に角膜の表面に適用されてもよい。細胞材料の可能な供給源には、幹細胞が含まれるが、これに限定されない。

作製済角膜７８がドーム型部材３２上に形成されると、図６Ｅに示すように、ドーム型部材３２が細胞培養インサート１２から除去され、作製済角膜７８が細胞培養インサート１２に付着されたままになる。ドーム型部材３２の除去を達成するために、細胞培養インサート１２および関連する作製済角膜７８およびドーム型部材３２を、溶解媒体として作用することができる水溶液に沈めることができる。例示的な溶解媒体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むが、これに限定されない。

形成されると、作製済角膜７８は、図６Ｆに示すように、ウェル４２内で灌流プロセスを受ける。灌流は、作製済角膜７８を通してある量の流体の流れをゆっくりと導入するために使用される。特定の理論に拘束されることを意図することなく、流体の流れは細胞に小さな力を生み出し、これらの小さな力は作製済角膜７８の性能に影響を与えると考えられている。さらに、灌流は、作製済角膜７８への酸素および栄養素の輸送、および作製済角膜７８からの老廃物の輸送を助けると考えられている。細胞材料が作製済角膜７８に含まれない場合、灌流は、角膜を外側に押す流体に続発する間質性対流および円周方向の伸長により、マトリックス構成要素の整列を容易にすることが期待される。細胞培養インサート１２は、灌流流体が、細胞培養インサート１２の基部２２の開口部２３を通して、シリンダ２４の中空内部に追加されることを可能にする。次に、灌流流体は、多孔質膜２５を通って、そして作製済角膜７８を通って流れることができる。このようにして、入口ポート４４（図５を参照）と作製済角膜７８との間に多孔質膜２５が存在するため、作製済角膜７８の物理的完全性が灌流流体の注入の全圧から保護され得る。灌流時間は変動する可能性があり、少なくとも約８時間である可能性があるが、それより短い場合もある。一態様では、灌流時間は、８時間から１ヶ月、１日から２ヶ月、１週間から７週間、２週間から６週間、あるいは３週間から５週間でさえあり得る。灌流時間は、本明細書に記載のそのような灌流時間の下限のいずれかから、本明細書に記載のそのような灌流時間の上限のいずれかまでであり得ることを理解されたい。

灌流後に、作製済角膜７８とフレーム１４との間の接触を断ち切ることにより、作製済角膜７８を細胞培養インサート１２から除去することができる。

別の態様では、作製済角膜足場は、凸面および凹面を有する非天然ドーム型構造を含む。実施形態では、非天然ドーム型構造は、上記のマトリックス形成化合物の少なくとも１つを含むマトリックスを含む。実施形態では、マトリックスはコラーゲンを含んでもよい。実施形態では、作製済角膜は、作製済角膜足場、マトリックス内に分散した複数の角膜実質細胞、凹面に配置された複数の角膜内皮細胞、および凸面に配置された複数の角膜上皮細胞を含む、作製された生きている角膜であってもよい。

実施形態では、角膜実質細胞の少なくとも一部は、自己由来であってもよく、すなわち、作製済角膜の意図されたレシピエントの細胞から培養されてもよく、残りの角膜実質細胞は、同種異系であり、すなわち、意図されたレシピエントではないドナーの細胞から培養されてもよい。他の実施形態では、すべての角膜実質細胞は自己由来である。他の実施形態では、すべての角膜実質細胞は同種異系である。

実施形態では、内皮細胞の少なくとも一部は、自己由来であってもよく、すなわち、作製済角膜の意図されたレシピエントの細胞から培養されてもよく、残りの内皮細胞は、同種異系であり、すなわち、意図されたレシピエントではないドナーの細胞から培養されてもよい。他の実施形態では、すべての内皮細胞は自己由来である。他の実施形態では、すべての内皮細胞は同種異系である。実施形態では、内皮細胞は幹細胞に由来してもよい。

実施形態では、上皮細胞の少なくとも一部は自己由来であってもよく、残りの上皮細胞は同種異系である。他の実施形態では、すべての上皮細胞は自己由来である。他の実施形態では、すべての上皮細胞は同種異系である。実施形態では、上皮細胞は幹細胞に由来してもよい。

本明細書に記載のシステムおよび方法は、特定の操作上の利点を可能にする。第１に、トロイダルフレームは、作製済角膜の外寸を設定し、これは、灌流プロセス中に角膜の残りの部分を移動できるようにしながら、角膜のレシピエントに適切に適合させるための重要な寸法である。したがって、角膜は作製中に最適な形状を採用することができる。第２に、犠牲ドーム型部材は、マトリックス形成化合物を含む材料の適切な成形を可能にし、その後に、角膜のその後の処理のために容易に除去することができ、例えば、灌流プロセス中に、灌流液の流れを妨げるモールド構造は存在しない。第３に、細胞培養インサートの遠位端で角膜を成長させることにより、壊れやすい角膜に直接触れる必要なしに、処理中に角膜の向きを簡単に操作することができる。細胞培養インサートの近位端は、作製システムを把持するための便利な場所を提供する。

第１の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、角膜を作製するための方法は、フレームを、近位端および遠位端を有するほぼ円筒形の構造、近位端に配置された基部、ならびに近位端と遠位端との間に配置された多孔質膜を含む少なくとも１つの細胞培養インサートに取り付けるステップと、フレーム内の多孔質膜にドーム型部材を取り付けるステップであって、ドーム型部材は、クラウン、ドーム基部、およびクラウンとドーム基部とを接続する表面を含む、ステップと、クラウンおよびドーム型部材の表面の少なくとも一部がマトリックス形成化合物を含む材料でコーティングされるように、マトリックス形成化合物を含む材料をフレーム上に堆積させるステップと、フレームに付着した作製済角膜を生成するために、ドーム型部材を除去するステップと、を含む。

第２の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、フレームは、少なくとも１つの細胞培養インサートの外面に当接する内面を有するトロイダル形状を含む。

第３の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、フレームは、中実構成要素と、中実構成要素に隣接して配置された多孔質構成要素と、を含む。

第４の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、堆積させるステップは、マトリックス形成化合物を含む材料を多孔質構成要素に適用し、前記材料が多孔質構成要素を通過して中実構成要素に蓄積することを可能にするステップを含む。

第５の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、ドーム型部材を多孔質膜に取り付けるステップは、犠牲材料を多孔質膜上に３Ｄ印刷するステップを含む。

第６の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、堆積させるステップは、角膜実質細胞を含むコラーゲンマトリックスをフレーム上に３Ｄ印刷するステップを含む。

第７の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、ドーム型部材を除去するステップは、ドーム型部材を溶解媒体と接触させるステップを含む。

第８の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、本方法は、マトリックス形成化合物を含む材料に培地を８時間から１ヶ月間流すステップをさらに含む。

第９の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、本方法は、作製済角膜をフレームから分離するステップをさらに含む。

第１０の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、角膜を作製するためのシステムは、少なくとも１つの細胞培養インサートであって、細胞培養インサートが、近位端および遠位端を有するほぼ円筒形の構造、近位端に配置された基部、ならびに近位端と遠位端との間に配置された多孔質膜を含む、少なくとも１つの細胞培養インサートと、少なくとも１つの細胞培養インサート上に配置されたフレームと、を含む。

第１１の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、システムは、多孔質膜上に配置された略ドーム型部材をさらに含み、ドーム型部材が、クラウン、ドーム基部、およびクラウンとドーム基部とを接続する表面を含み、表面が、クラウンが、少なくとも１つの細胞培養インサートの近位端に配置された基部から離れて、少なくとも１つの細胞培養インサートの遠位端を超えて延在するように、多孔質膜から突出している。

第１２の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、ドーム型部材は犠牲材料を含む。

第１３の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、犠牲材料はゼラチンを含む。

第１４の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、ゼラチンは３Ｄ印刷可能なゼラチンである。

第１５の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、システムは、少なくとも１つの細胞培養インサートを保持するためのアセンブリをさらに含み、アセンブリは、ウェルプレートマニホルドと、少なくとも１つの細胞培養インサートを収容するサイズの複数のウェルを含むウェルプレートアセンブリと、を含む。

第１６の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、アセンブリは、少なくとも１つの細胞培養インサートの近位端に配置された基部に流体を導入するための少なくとも１つの流体入口ラインと、複数のウェルから流体を除去するための少なくとも１つの出口ラインと、を含む。

第１７の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、システムは、少なくとも１つの入口ラインに流体接続された少なくとも１つのポンプと、少なくとも１つの出口ラインに流体接続された少なくとも１つのポンプと、をさらに含む。

第１８の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、作製済角膜足場は、凸面および凹面を有し、少なくとも１つのマトリックス形成化合物を含むマトリックスを含む非天然ドーム構造を含む。

第１９の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、作製済角膜足場は、マトリックス内に分散された複数の角膜実質細胞、凹面に配置された複数の角膜内皮細胞、および凸面に配置された複数の角膜上皮細胞をさらに含む。

第２０の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、複数の角膜実質細胞、複数の角膜内皮細胞、および複数の角膜上皮細胞のうちの少なくとも１つの少なくとも一部は自己由来である。

第２１の態様では、単独で、または他の任意の態様と組み合わせて、複数の角膜実質細胞、複数の内皮細胞、および複数の角膜上皮細胞のうちの少なくとも１つの少なくとも一部は同種異系である。

実施例
フレームの作製：ＳＥ１７００ポリマー基部（２０ｇ）を硬化剤（２ｇ）と組み合わせて混合した。これとは別に、ＳＹＬＧＡＲＤ（登録商標）１８４ポリマー基部（１０ｇ）を硬化剤（１ｇ）と組み合わせて混合した。ＳＹＬＧＡＲＤ（登録商標）１８４混合物をＳＥ１７００混合物に１：４ｗ／ｗの比率で添加し、完全に混合して、３Ｄ印刷可能なＰＤＭＳ組成物を提供した。次に、このＰＤＭＳ組成物を目的の形状に印刷し、６０℃のオーブンで少なくとも１時間硬化させた後に、１分間プラズマ酸化した。得られたフレームをＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサートに配置した。

ゼラチンドームの作製：６％ゼラチン溶液を調製し、４℃の冷却装置で約３０分間部分的にゲル化した。部分的にゲル化したゼラチンを２４℃で１時間平衡化させた。このゼラチン溶液を使用して、フレームが以前に追加されたＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサートの多孔質膜にドームを直接印刷した。

角膜足場の作製：６ｍｇ／ｍｌコラーゲン溶液を調製し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）および超純水と組み合わせた。水酸化ナトリウム溶液を加えて、溶液のｐＨを７．４にすることができる。次に、このコラーゲン溶液を、以前に作製されたフレームおよびゼラチンドームにピペットで移した。

ゼラチンドームの除去と培養：角膜とドームを備えたＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサートをインキュベータに３０分間入れてコラーゲンをゲル化させた後に、ＰＢＳ溶解培地に浸した。浸している間、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサートをインキュベータに戻し、ゼラチンを一晩溶解させた。次に、培養培地をＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサートを通して、多孔質膜を横切って、そして角膜を横切って流すことによって、角膜を培養した。

次に、作製済角膜をＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（登録商標）インサートから切り離した。

本開示を説明および定義する目的で、本明細書でのパラメータまたは別の変数の「関数」である変数への言及は、その変数がリストされたパラメータまたは変数の関数のみであることを示すことを意図しないことに留意されたい。むしろ、リストされたパラメータの「関数」である変数へのここでの参照は、変数が単一のパラメータまたは複数のパラメータの関数であり得るように、制限がないことを意図している。

ここでの「少なくとも１つの」構成要素、要素などの引用は、冠詞「ａ」または「ａｎ」の代替使用が単一の構成要素、要素などに限定されるべきであるという推論を作成するために使用されるべきではないことにも留意されたい。

特定の特性を具体化するため、または特定の方法で機能するために、特定の方法で「構成」または「プログラム」されている本開示の構成要素の本明細書の説明は、意図された使用の説明とは対照的に、構造的説明であることに留意されたい。より具体的には、本明細書での構成要素が「構成」または「プログラム」される方法への言及は、構成要素の既存の物理的状態を示し、したがって、構成要素の構造的特徴の明確な説明と見なされるべきである。

本明細書で使用される場合、「好ましくは」、「一般的に」、および「典型的に」のような用語は、請求された開示の範囲を制限するため、または特定の特徴が請求された開示の構造または機能にとって決定的、本質的、または重要でさえあることを意味するために使用されないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は、本開示の実施形態の特定の態様を識別すること、または本開示の特定の実施形態で利用されてもされなくてもよい代替または追加の特徴を強調することを単に意図している。

本開示を説明および定義する目的で、「実質的に」および「近似的に」という用語は、任意の定量的な比較、値、測定、または他の表現に起因し得る固有の不確実性の程度を表すために本明細書で使用されることに留意されたい。「実質的に」および「近似的に」という用語はまた、問題の主題の基本機能に変化をもたらすことなく、定量的表現が記載された参照から変化し得る程度を表すために本明細書で使用される。

本開示の主題を詳細に説明し、その特定の実施形態を参照することにより、本明細書に開示する様々な詳細は、本説明に付随する各図面に特定の要素が示されている場合であっても、これらの詳細が、本明細書に記載の様々な実施形態の必須構成要素である要素に関連することを意味すると解釈されるべきではないことに留意されたい。さらに、添付の特許請求の範囲で定義される実施形態を含むがこれらに限定されない、本開示の範囲から逸脱することなく、修正および変形が可能であることは明らかであろう。より具体的には、本開示のいくつかの態様は、本明細書において好ましいまたは特に有利であると特定されているが、本開示は必ずしもこれらの態様に限定されないことが企図される。

以下の特許請求の範囲の１つまたは複数は、「ここで（ｗｈｅｒｅｉｎ）」という用語を移行句として使用していることに留意されたい。本開示を定義する目的で、この用語は、構造の一連の特徴の列挙を導入するために使用される自由形式の移行句として特許請求の範囲で導入され、より一般的に使用されるオープンエンドの前文用語「を含む」と同様に解釈されるべきであることに留意されたい。

Claims (21)

1. 角膜を作製するための方法であって、
   フレームを少なくとも１つの細胞培養インサートに取り付けるステップであって、前記少なくとも１つの細胞培養インサートは、近位端および遠位端を有するほぼ円筒形の構造、前記近位端に配置された基部、ならびに前記近位端と前記遠位端との間に配置された多孔質膜を含む、ステップと、
   前記フレーム内の前記多孔質膜にドーム型部材を取り付けるステップであって、前記ドーム型部材は、クラウン、ドーム基部、および前記クラウンと前記ドーム基部とを接続する表面を含む、ステップと、
   前記クラウンおよび前記ドーム型部材の前記表面の少なくとも一部がマトリックス形成化合物を含む材料でコーティングされるように、前記マトリックス形成化合物を含む前記材料を前記フレーム上に堆積させるステップと、
   前記フレームに付着した作製済角膜を生成するために、前記ドーム型部材を除去するステップと、を含む方法。
2. 前記フレームが、前記少なくとも１つの細胞培養インサートの外面に当接する内面を有するトロイダル形状を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記フレームが、中実構成要素と、前記中実構成要素に隣接して配置された多孔質構成要素と、を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記堆積させるステップが、前記マトリックス形成化合物を含む前記材料を前記多孔質構成要素に適用し、前記材料が前記多孔質構成要素を通過して前記中実構成要素に蓄積することを可能にするステップを含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記ドーム型部材を前記多孔質膜に取り付けるステップが、犠牲材料を前記多孔質膜上に３Ｄ印刷するステップを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記堆積させるステップが、角膜実質細胞を含むコラーゲンマトリックスを前記フレーム上に３Ｄ印刷するステップを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ドーム型部材を除去するステップが、前記ドーム型部材を溶解媒体と接触させるステップを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記マトリックス形成化合物を含む前記材料に培地を８時間から１ヶ月間流すステップをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記作製済角膜を前記フレームから分離するステップをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 角膜を作製するためのシステムであって、
    少なくとも１つの細胞培養インサートであって、前記細胞培養インサートが、近位端および遠位端を有するほぼ円筒形の構造、前記近位端に配置された基部、ならびに前記近位端と前記遠位端との間に配置された多孔質膜を含む、少なくとも１つの細胞培養インサートと、
    前記少なくとも１つの細胞培養インサート上に配置されたフレームと、を含むシステム。
11. 前記多孔質膜上に配置された略ドーム型部材をさらに含み、
    前記ドーム型部材が、クラウン、ドーム基部、および前記クラウンと前記ドーム基部とを接続する表面を含み、
    前記表面が、前記クラウンが、前記少なくとも１つの細胞培養インサートの前記近位端に配置された前記基部から離れて、前記少なくとも１つの細胞培養インサートの前記遠位端を超えて延在するように、前記多孔質膜から突出している、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記ドーム型部材が犠牲材料を含む、請求項１１に記載のシステム。
13. 前記犠牲材料がゼラチンを含む、請求項１２に記載のシステム。
14. 前記ゼラチンが３Ｄ印刷可能なゼラチンである、請求項１３に記載のシステム。
15. 前記少なくとも１つの細胞培養インサートを保持するためのアセンブリをさらに含み、前記アセンブリが、ウェルプレートマニホルドと、前記少なくとも１つの細胞培養インサートを収容するサイズの複数のウェルを含むウェルプレートアセンブリと、を含む、請求項１０から１４のいずれか一項に記載のシステム。
16. 前記アセンブリが、前記少なくとも１つの細胞培養インサートの前記近位端に配置された前記基部に流体を導入するための少なくとも１つの流体入口ラインと、前記複数のウェルから前記流体を除去するための少なくとも１つの出口ラインと、を含む、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記少なくとも１つの入口ラインに流体接続された少なくとも１つのポンプと、前記少なくとも１つの出口ラインに流体接続された少なくとも１つのポンプと、をさらに含む、請求項１６に記載のシステム。
18. 凸面および凹面を有し、少なくとも１つのマトリックス形成化合物を含むマトリックスを含む非天然ドーム構造を含む、
    作製済角膜足場。
19. 前記マトリックス内に分散された複数の角膜実質細胞、前記凹面に配置された複数の角膜内皮細胞、および前記凸面に配置された複数の角膜上皮細胞をさらに含む、請求項１８に記載の作製済角膜足場。
20. 前記複数の角膜実質細胞、前記複数の角膜内皮細胞、および前記複数の角膜上皮細胞のうちの少なくとも１つの少なくとも一部が自己由来である、請求項１９に記載の作製済角膜足場。
21. 前記複数の角膜実質細胞、前記複数の内皮細胞、および前記複数の角膜上皮細胞のうちの少なくとも１つの少なくとも一部が同種異系である、請求項１９に記載の作製済角膜足場。

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