JP2022533451A - アルツハイマー病のための遺伝子治療 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2019年5月24日出願の米国特許仮出願第62/852,716号の利益を主張する。前述の全内容は、参照により本明細書に組み込む。
本発明は、国立衛生研究所により与えられた認可番号NS041783の下、政府の援助により行った。政府は、本発明に対する特定の権利を有する。
本開示をさらに容易に理解するために、特定の用語を最初に以下の通り定義する。以下の用語および他の用語のさらなる定義は、本明細書を通して記載する。
本明細書において使用する場合、用語「投与」は、対象または系への組成物の送達または適用を指す。動物対象(例えば、ヒト)への投与は、任意の適切な経路によってであり得る。例えば、一部の実施形態では、投与は、気管支(気管支滴下によるものを含む)、頬側、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、くも膜下腔内、静脈内、脳室内、粘膜、経鼻、経口、直腸内、皮下、舌下、局所、気管(気管内注入によるものを含む)、経皮、膣内および硝子体内投与であり得る。
本明細書において使用する場合、句「生物学的に活性」は、生物系(例えば、細胞培養物、生物等)における活性を有する任意の物質の特性を指す。例えば、生物に投与した場合、この生物に対する生物学的作用を有する物質は、生物学的に活性であると考えられる。また、生物学的活性は、in vitroでのアッセイ(例えば、in vitroでの酵素アッセイ)により判定することができる。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、このタンパク質またはポリペプチドの少なくとも1つの生物学的活性を共有するタンパク質またはポリペプチドの部分は、典型的に、「生物学的に活性」な部分と呼ぶ。一部の実施形態では、タンパク質は、対象に投与した場合、生物学的活性を呈する細胞培養系から生成および/または精製する。
本明細書において使用する場合、用語「対照」は、結果を比較する標準であるという、当技術分野において理解される意味を有する。典型的には、対照は、変数を分離して、このような変数についての結論を出すことによる実験における完全性の拡大に使用する。一部の実施形態では、対照は、試験反応またはアッセイと同時に実施して比較物を提供する、反応またはアッセイである。一実験では、「試験」(すなわち、試験する変数)を適用する。第2の実験では、試験する変数である「対照」は、適用しない。一部の実施形態では、対照は、歴史的対照(すなわち、それまでに実施した試験またはアッセイ、またはそれまでに既知の量もしくは結果)である。一部の実施形態では、対照は、印刷されたか、もしくは保存された記録であるか、またはこれを含む。対照は、陽性対照または陰性対照であり得る。一部の実施形態では、対照は、差を調べるための試験試料との比較のため、または特性決定の目的のために使用する試料である「参照対照」であり得る。
本明細書において使用する場合、用語「遺伝子治療」は、核酸の対象への直接的または間接的投与を含む任意の治療を指す。特定の例では、治療的価値を有するタンパク質は、投与した核酸から発現する。
本明細書において使用する場合、用語「同一性」は、高分子間、例えば、核酸分子(例えば、DNA分子および/またはRNA分子)間および/またはポリペプチド分子間に全体的関連性を指す。例えば、2つの核酸配列の同一性の割合の計算は、最適に比較する目的で2つの配列をアラインメントすることにより実施することができる(例えば、最適なアラインメントのために第1および第2の核酸配列の一方または両方にギャップを導入し、比較目的で非同一配列を無視することができる)。特定の実施形態では、比較目的でアラインメントした配列の長さは、参照配列の少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または実質的に100%の長さである。次いで、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較する。第1の配列における位置が、第2の配列における対応する位置と同一のヌクレオチドにより占有される場合、分子は、この位置において同一である。2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要がある、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮すると、2つの配列間の同一性の割合は、配列により共有される同一の位置の数の関数である。2つの配列間の配列の比較および同一性の割合の決定は、数学アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、2つのヌクレオチド配列間の同一性の割合は、メイヤーズおよびミラーのアルゴリズム(CABIOS, 1989, 4: 11-17)を使用して決定することができ、これは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれており、PAM120残基重み付け表、ギャップ長ペナルティ12およびギャップペナルティ4を使用する。あるいは、2つのヌクレオチド配列間の同一性の割合は、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを使用して決定することができ、NWSgapdna.CMPマトリックスを使用する。例えば、Clustalのような他の種々の配列アラインメントプログラムが利用可能であり、配列同一性の決定に使用することができる。
本明細書において使用する場合、用語「向上」、「増加/上昇(increase)」もしくは「減少/低下(reduce)」、または文法的等価な用語は、ベースライン測定値、例えば、本明明細書に記載する治療の開始前の同一の個体における測定値、または本明細書に記載する治療の非存在下での対照個体(または複数の対照個体)における測定値と関連する値を示す。「対照個体」は、治療する個体と同一型であり、ほぼ同一の重症度の例えば、アルツハイマー病を患っている個体であり、治療する個体とほぼ同年齢である(治療する個体および対照個体(複数可)の病期が比較可能であることを確実とするため)。
本明細書において使用する場合、用語「神経変性」は、1つまたは複数の神経細胞が、損傷し、機能が低下し、機能不全となり、および/または細胞死により失われるプロセスを意味する。神経変性は、急速と漸進の両型および中間型を包含する。したがって、神経変性疾患、状態、または症状は、疾患が神経細胞損傷および/または細胞死と典型的に関連しているという点において特徴づけられるものである。
本明細書において使用する場合、用語「対象」は、ヒトまたは任意の非ヒト動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類などの哺乳動物)を指す。ヒトは、出生前および出生後の形態を含む。多くの実施形態では、対象は、ヒトである。対象は、患者であってもよく、疾患の診断または治療のために医療機関を受診するヒトを指す。用語「対象」は、「個体」または「患者」と互換的に本明細書において使用する。対象は、疾患もしくは障害を患っているか、またはこれに感受性であり得るが、疾患もしくは障害の症状を呈するかどうかはわからない。
疾患、障害、および/または状態(例えば、アルツハイマー病)「に罹患している」個体は、疾患、障害、および/または状態の1つまたは複数の症状と診断されているか、またはこれらを呈する。
疾患、障害、および/もしくは状態「に感受性である」個体は、疾患、障害、および/もしくは状態の症状と診断されておらず、ならびに/またはこれらを示していない場合がある。一部の実施形態では、疾患、障害、および/または状態(例えば、アルツハイマー病)に感受性の個体は、(1)疾患、障害、および/または状態の発症と関連する遺伝子変異、(2)疾患、障害、および/または状態の発症と関連する遺伝子多型、(3)疾患、障害、および/または状態と関連するタンパク質の発現および/または活性の上昇および/または低下、(4)疾患、障害、および/または状態の発症と関連する習慣および/または生活様式、(5)疾患、障害、および/または状態の家族歴、(6)特定の細菌またはウイルスに対する反応、(7)特定の化学物質への曝露、のうちの1つまたは複数により特徴づけられ得る。一部の実施形態では、疾患、障害、および/または状態に感受性の個体は、疾患、障害、および/または状態を発症する。一部の実施形態では、疾患、障害、および/または状態に感受性の個体は、疾患、障害、および/または状態を発症しない。
本明細書において使用する場合、用語「治療有効量」は、任意の医学的処置に適用可能な合理的ベネフィット/リスク比で、治療した対象に治療作用を付与する、治療タンパク質の量を指す。治療作用は、客観的(すなわち、一部の試験またはマーカーにより測定可能)であるか、または主観的(すなわち、対象が作用の徴候を示すか、または作用を感じる)であり得る。特には、「治療有効量」は、例えば、疾患と関連する症状を回復させ、疾患の発症を予防もしくは遅延させ、および/または同様に、疾患の症状の重症度もしくは頻度を低減させることにより、所望の疾患もしくは状態を治療、回復、もしくは予防するのに、または検出可能な治療もしくは予防作用を示すのに有効な治療タンパク質または組成物の量を指す。治療有効量は、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンにより、一般に投与する。特定の任意の治療タンパク質では、治療有効量(および/または有効な投薬レジメンにおける適切な単位用量)は、例えば、投与経路、他の医薬品との組合せに応じて、変化し得る。また、特定の任意の患者のための特定の治療有効量(および/または単位用量)は、治療する障害および障害の重症度;利用する特定の医薬品の活性;利用する特定の組成物;患者の年齢、体重、総体的健康、性別および食事;投与時間、投与経路、および/または利用する特定の融合タンパク質の排せつ率もしくは代謝率;治療の持続時間;ならびに医学的技術分野において周知のような同様の因子を含む多様な因子に依存し得る。
本明細書において使用する場合、用語「治療(treatment)」(また「治療する(treat)」または「治療(treating)」)は、その広い意味において、特定の疾患、障害、および/または状態の1つまたは複数の症状、特徴、および/または原因を部分的または完全に、軽減、回復、緩和、阻害、これらの発症を遅延、これらの重症度を低下、および/またはこれらの発症率を低下させる、物質(例えば、提供する組成物)の任意の投与を指す。一部の実施形態では、このような治療は、関連する疾患、障害および/もしくは状態の徴候を示さない対象、ならびに/または疾患、障害、および/もしくは状態の初期徴候のみを示す対象に投与し得る。あるいは、または加えて、一部の実施形態では、治療は、関連する疾患、障害および/または状態の1つまたは複数の確立された徴候を示す対象に投与し得る。一部の実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、および/または状態に罹患していると診断された対象への治療であり得る。一部の実施形態では、治療は、関連する疾患、障害、および/または状態の発症リスクの上昇と統計学的に相関する、1つまたは複数の感受性因子を有することがわかっている対象への治療であり得る。
本開示では、それを必要とする対象への機能性プレセニリン-1(PS1)タンパク質の送達に基づく、アルツハイマー病ならびに他の神経変性疾患、障害および状態を有する対象を治療するための組成物および方法を、特に提供する。特には、本開示では、プレセニリン-1(PS1)をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドを、AD、例えば早期発症型家族性アルツハイマー病(FAD)または晩期発症型孤発性ADに関連するPSEN1またはPSEN2変異、例えばドミナントネガティブ変異を有する、治療を必要とする対象に提供することによる遺伝子治療を検討する。
非限定的な例としては、本発明の方法は、例えば、PSEN1またはPSEN2におけるドミナントネガティブ変異と関連する神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病に罹患しているか、またはこれに感受性の対象(例えば、PSEN1もしくはPSEN2変異を保有する家族性AD患者または孤発性AD患者)において、野生型ヒトプレセニリン1を発現させる遺伝子治療を含む。このような遺伝子治療の目的は、特に、家族性または孤発性AD患者の脳において、PS1の発現を促進して、PS1またはPS2の発現および/または活性における欠陥を補正または克服することである。FAD患者では、本明細書に記載する遺伝子治療方法により、脳において野生型PS1の発現の増加が生じ、PS1またはPS2の変異と関連するγセクレターゼ活性の機能障害が回復することが期待される。
本明細書に記載の方法は、それらに限定されないが、家族性および孤発性アルツハイマー、早期発症型または遅発型アルツハイマー病を含む、すべての型のアルツハイマー病を有する、発症している対象を治療するか、またはこのリスクを低下させるのに使用し得る。一部の実施形態では、本発明の方法は、プレセニリン1(PS1)および/またはプレセニリン2(PS2)における変異と関連する、早期発症型家族性アルツハイマー病(AD)の発症を治療するか、またはこのリスクを低下させるのに使用し得る(Sherrington, et al., Nature 375:754-760 (1995);Rogaev, et al., Nature 376:775-778 (1995);Levy-Lahad, et al., Science 269:970-973 (1995);Hiltunen, et al., Eur. J. Hum. Genet. 8:259-266 (2000);Jonghe, et al., Hum. Mol. Genet. 8:1529-1540 (1999);Tysoe, et al., Am. J. Hum. Genet. 62:70-76 (1998);Crook, et al., Nat. Med. 4:452-455 (1998)、これらすべては、参照により本明細書に組み込む)。
アルツハイマー病に加えて、本発明の方法は、前頭側頭型認知症、種々の型の記憶喪失、それに限定されないが軽度認知機能障害(MCI)を含む認知機能障害、または例えば、ドミナントネガティブアイソフォームを生成する、例えば、PSEN1もしくはPSEN2における変異による、PS1もしくはPS2の欠失と関連する他の状態を含む、他の神経変性疾患、障害または状態を治療するのに使用し得る。
本明細書に記載の組成物および方法における使用に適する、コドン最適化プレセニリン1(PSEN1)をコードするポリヌクレオチドは、例えば、実施例の節に記載されているアッセイを含むin vitroでのγセクレターゼアッセイにより判定された(また、Watanabe et al., J. Neurosci. 32(15):5085-5096 (2012)を参照)、野生型タンパク質の相当なガンマセクレターゼ活性、例えば、少なくとも50%のガンマセクレターゼ活性、あるいは少なくとも60、70、80、90、もしくは95%、または100%を超える野生型タンパク質の活性を保持するタンパク質をコードする、完全長cDNAまたはこの部分もしくは断片を含み得る。一部の実施形態では、適切なコドン最適化PSEN1は、完全長野生型PS1またはPS2タンパク質配列とそれぞれ少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のタンパク質配列をコードする。ヒトPSEN1/PS1もしくはPSEN2/PS2の例となる野生型ゲノム、cDNAまたはタンパク質配列は、表1ならびに図4A-Cおよび5A-Bに示す。PS1は、通常、活性型のNおよびC末端断片に切断される。PS1は、処理して、N末端断片28kDaおよびC末端断片18kDaの2つの断片を生じ、主要な細胞内タンパク質切断が、大型の親水性ループの近位部のMet298において、およびこの付近で生じる(Podlisny et al., Neurobiol Dis. 1997;3(4):325-37;Marambaud et al., EMBO J. 2002 Apr 15;21(8):1948-56)。また、このような切断された形態を含むか、またはこれをコードする配列、例えば、配列番号5のアミノ酸1~291、1~292、1~293、1~294、1~295、1~296、1~297、1~298もしくは1~299をコードする配列、または配列番号6~8の対応する断片は、本明細書に記載の方法および組成物において使用することができる。
コドン最適化は、特異的宿主細胞、例えば細菌、マウス、ヒトの細胞においてタンパク質を発現することが望ましい。遺伝子コードの縮重の結果、その一部があらゆる既知のおよび天然の遺伝子のcDNAに最小の類似性を有している、ヒトプレセニリン1をコードする多数のcDNAを生成することができることは、当業者に理解されよう。したがって、本発明は、考えられるコドン選択に基づく組合せの選択によって生じ得る、考えられるcDNAのバリエーションのそれぞれおよびすべてを検討する。これらの組合せは、天然ヒトプレセニリン変異体をコードするポリヌクレオチドに適用されるような標準的なトリプレット遺伝子コードに従って作製され、すべてのこのようなバリエーションは、具体的に開示されることが考慮されるものである。典型的なコドン最適化ヒトPSEN1ヌクレオチド配列は、本明細書において開示されており、例えば配列番号9である。図2を参照。このコドン最適化ヒトPSEN1ヌクレオチド配列は、ヒト細胞において低頻度で生じる天然PSEN1ヌクレオチド配列内のコドンを、ヒト細胞において高頻度で生じるコドンに置換することによって生成された。コドン最適化ヒトPSEN1ヌクレオチド配列としては、コドンの100%未満が最適化されている配列、例えば、野生型非最適化コドンのわずか20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%が最適化されている配列を挙げることができる。コドンの発生頻度は、当技術分野において既知の方法によって計算的に決定することができる。これらのコドン頻度の典型的な計算を表1に開示する。
>コドン最適化ホモサピエンスプレセニリン1(PSEN1)cDNA(配列番号9)
一部の実施形態では、PS1タンパク質は、変異を含む。一部の実施形態では、変異は、保存的置換である。このような変異は、イソロイシン(I)、バリン(V)、およびロイシン(L)のうちのいずれかと、このような疎水性アミノ酸のうちの他のいずれかとの置換、アスパラギン酸(D)とグルタミン酸(E)との置換およびこの逆、グルタミン(Q)とアスパラギン(N)との置換およびこの逆、ならびにセリン(S)とスレオニン(T)との置換およびこの逆を含む。また、他の置換は、タンパク質の3次元構造における、特定のアミノ酸の環境およびこの役割に応じて、保存的であると考えることができる。例えば、グリシン(G)およびアラニン(A)は、アラニン(A)およびバリン(V)と同様に、しばしば互換的であり得る。比較的疎水性であるメチオニン(M)は、ロイシンおよびイソロイシン、ならびに場合によりバリンとしばしば交換することができる。リジン(K)およびアルギニン(R)は、アミノ酸残基の顕著な特徴がこの電荷であり、このような2つのアミノ酸残基の異なるpKが顕著でない位置において、しばしば互換的である。さらなる他の変異は、特定の環境において「保存的」であると考えることができる(例えば、Table III of US20110201052; pages 13-15 “Biochemistry” 2nd ED. Stryer ed (Stanford University);Henikoff et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919;Lei et al., J Biol Chem 1995 May 19; 270(20):11882-6を参照)。
PS1ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸または治療的に活性なその断片は、遺伝子構築物に組み込んで、遺伝子治療プロトコールの一部として使用することができる。例えば、in vivoでの送達のための発現ベクターの標的化、およびPS1ポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドまたはその活性断片の、特定の細胞型、特には、大脳皮質神経細胞における発現を本明細書において記載する。このような成分の発現構築物は、有効な任意の担体、例えば、遺伝子成分を細胞にin vivoで効果的に送達することが可能な、任意の製剤または組成物により投与することができる。方法は、遺伝子をウイルスベクター、好ましくは、アデノ随伴ウイルスに挿入するステップを含む。ウイルスベクターは、典型的に、細胞に直接形質導入する。
一部の実施形態では、標的組織へのin vivoでの送達のための本明細書に記載のポリヌクレオチドは、被包性であるか、またはナノ粒子と結合する。ナノ粒子へパッケージングするための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Bose S, et al (Role of Nucleolin in Human Parainfluenza Virus Type 3 Infection of Human Lung Epithelial Cells. J. Virol. 78:8146. 2004);Dong Y et al. Poly(d,l-lactide-co-glycolide)/montmorillonite nanoparticles for oral delivery of anticancer drugs. Biomaterials 26:6068. 2005);Lobenberg R. et al (Improved body distribution of 14C-labelled AZT bound to nanoparticles in rats determined by radioluminography. J Drug Target 5:171.1998);Sakuma S R et al (Mucoadhesion of polystyrene nanoparticles having surface hydrophilic polymeric chains in the gastrointestinal tract. Int J Pharm 177:161. 1999);Virovic L et al. Novel delivery methods for treatment of viral hepatitis: an update. Expert Opin Drug Deliv 2:707.2005);およびZimmermann E et al, Electrolyte- and pH-stabilities of aqueous solid lipid nanoparticle (SLN) dispersions in artificial gastrointestinal media. Eur J Pharm Biopharm 52:203. 2001)に記載されている。一部の実施形態では、1つまたは複数のポリヌクレオチドは、小胞、例えば、リポソームによりin vivoで標的組織に送達する(Langer, Science 249:1527-1533 (1990);Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989);Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327を参照;一般的に同書を参照)。一部の実施形態では、脂質をベースとするナノ粒子(LNP)を使用する。例えば、Robinson et al., Mol Ther. 2018 Aug 1;26(8):2034-2046;米国特許第9956271号明細書を参照されたい。
PSEN1変異と関連する、低下したγセクレターゼ活性が、野生型(WT)hPS1の導入により補正可能かどうかを判定するために、異なるPS遺伝子型、PS1+/+、PS1L435F/+、PS1+/-、PS1L435F/L435F、PS1-/-およびPS1-/-;PS2-/-(DKO)を保有する胚由来の初代MEFを得た。不死化MEFを、CMV-NΔEを用いて一過性にトランスフェクトし、NICDおよびPS1 NTF/CTFのレベルを測定することによりγセクレターゼ活性を評価した。NICDレベルは、PS1用量感受性に低下し、DKO細胞において検出不可能であった(図1A)。NICDレベルは、低下したが、PS1L435F/L435FMEF(「L435F KI/KI」MEF)およびPS1-/-MEFにおいて検出可能であったが(図1A)、de novoNICD生成は、L435F KI/KIおよびPS1-/-胚性脳を使用したin vitroでのγセクレターゼアッセイによって検出不可能であった(Xia et al., Neuron. 2015 Mar 4;85(5):967-81)。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、出願人は、これが、胚性脳において通常発現するPS2が、MEFと比較して低レベルであり、L435F KI/KIおよびPS1-/-脳において、MEFと比較して低い総PS活性が生じるためであり得るということに従う。この仮説を試験するために、PS1L435F/+;PS2-/-MEFにおいてγセクレターゼ活性を測定し、PS1L435F/+MEFと比較した。γセクレターゼ活性は、PS1L435F/+;PS2-/-MEFにおいて、PS1L435F/+MEFと比較して低かった(図1B)。
方法
細胞培養およびトランスフェクション
内因性PS1およびPS2を欠いているPsen-nullマウス胎児線維芽細胞(MEF)を、10%FBSを添加したDMEM中に維持し、γセクレターゼレポーターCMV-NΔEの存在下または不存在下で、リポフェクタミン3000を指示に従って使用して、野生型内因性hPSEN1 cDNA(wt_PS1)またはコドン最適化hPSEN1 cDNA(opti_PS1)のいずれかを発現するプラスミドを一過性にトランスフェクトした。細胞溶解物を24時間の時点で回収した。
細胞溶解物をSDS-PAGEにかけ、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。TBST/5%脱脂粉乳でブロックした後、膜を一次抗体と終夜インキュベートした。ロードを制御するために、膜をはぎ取り、抗β-アクチン抗体で再プローブした。ImageJソフトウェアを使用してバンドの強度を定量し、結果をβ-アクチンレベルに対して正規化した。使用した抗体としては、ラット抗PS1-NTF、ウサギ抗切断型Notch(Val1744)(NICD)、およびマウス抗β-アクチンが挙げられる。
まず、本発明者らは、wt_hPS1またはopti_hPS1をPsen-null MEFで発現させて、内因性PS1またはPS2のあらゆる影響を排除した。本発明者らは、wt_hPS1またはopti_hPS1をコードする増大量のベクターをPsen-null MEFにトランスフェクトした場合の、PS1 NTFレベルの漸進的な増大を検出した。最適化hPS1は、wt_hPS1よりも多くのPS1を一貫して発現した(図3A~3B)。
CAMK2Aプロモーターの制御下でヒトPSEN1野生型cDNAを構成的にまたは誘導的に発現するトランスジェニックマウスを開発する。PS1の生成および活性を最大にするために、hPS1をコドン最適化し(hPS1opti)、次いで、PS1レベルおよびγセクレターゼ活性を、増大量のpCI-hPS1またはpCI-hPS1optiのいずれかおよびCMV-NΔEをPS DKO MEFにコトランスフェクトすることによって、内因性hPS1 cDNAとhPS1opti cDNAとの間で比較した。NICD生成によって測定すると、内因性hPS1 cDNAと比較して、hPS1opti cDNAは、より高いレベルのPS1 NTFおよびより高いγセクレターゼ活性をもたらした(図3)。
表2に列挙するベクターが準備された。注射後4週間目および8週間目に最も高いGFP染色をもたらすベクターを同定する。このために、PS cDKO子マウス(ロット- F/F;-/-;F/Fと交配したCre/Cre;-/-の10個の飼育ケージ)に、P0~2に注射する。
表3に列挙するマウスを生成し、PS1およびAPPレベルを測定するためのウェスタンブロット分析;in vitroでのガンマセクレターゼ活性アッセイ;ELISA、6カ月齢での電気生理学的分析;6カ月齢および12カ月齢での行動分析;6、12、および18カ月齢での神経病分析を使用して分析する。
表2に列挙するようにベクターを調製し、CSF内を介して、10ulの注射液を大槽に送達するための50ulのHamiltonシリンジを使用した(1×1012vg)ICMを介して、実質内送達を介して、または10ulの3.3×1011vgの腰椎穿刺を使用したくも膜下腔内送達を介して、マウスに注射する。研究対象のマウスとしては、(i)PS cDKO、(ii)KI/+、(iii)KI/+;PS2-/-、および(iv)KI/fPS1;PS2-/-;Creが含まれる。本発明者らは、以下の分析をマウスで行う:PS1およびAPPレベルを測定するためのウェスタン分析;in vitroでのγセクレターゼアッセイ;AβペプチドのELISA測定、6カ月齢での電気生理学的分析;6カ月齢および12カ月齢での行動分析;6、12、および18カ月齢での神経病分析。
本発明を、この発明を実施するための形態とともに記載したが、前述の記載は例示することを意図し、本発明の範囲を制限せず、本発明は添付の特許請求の範囲により定義されることが理解される。他の態様、利点、および変更形態は、以下の特許請求の範囲内に存在する。
本明細書に記載の組成物および方法における使用に適する、コドン最適化プレセニリン1(PSEN1)をコードするポリヌクレオチドは、例えば、実施例の節に記載されているアッセイを含むin vitroでのγセクレターゼアッセイにより判定された(また、Watanabe et al., J. Neurosci. 32(15):5085-5096 (2012)を参照)、野生型タンパク質の相当なガンマセクレターゼ活性、例えば、少なくとも50%のガンマセクレターゼ活性、あるいは少なくとも60、70、80、90、もしくは95%、または100%を超える野生型タンパク質の活性を保持するタンパク質をコードする、完全長cDNAまたはこの部分もしくは断片を含み得る。一部の実施形態では、適切なコドン最適化PSEN1は、完全長野生型PS1またはPS2タンパク質配列とそれぞれ少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一のタンパク質配列をコードする。ヒトPSEN1/PS1もしくはPSEN2/PS2の例となる野生型ゲノム、cDNAまたはタンパク質配列は、表1及び以下に示す。PS1は、通常、活性型のNおよびC末端断片に切断される。PS1は、処理して、N末端断片28kDaおよびC末端断片18kDaの2つの断片を生じ、主要な細胞内タンパク質切断が、大型の親水性ループの近位部のMet298において、およびこの付近で生じる(Podlisny et al., Neurobiol Dis. 1997;3(4):325-37;Marambaud et al., EMBO J. 2002 Apr 15;21(8):1948-56)。また、このような切断された形態を含むか、またはこれをコードする配列、例えば、配列番号5のアミノ酸1~291、1~292、1~293、1~294、1~295、1~296、1~297、1~298もしくは1~299をコードする配列、または配列番号6~8の対応する断片は、本明細書に記載の方法および組成物において使用することができる。
Claims (23)
- ヒトプレセニリン1(PSEN1)をコードするヒトコドン最適化ポリヌクレオチドを含む組成物。
- ヒトPSEN1をコードする前記ヒトコドン最適化ポリヌクレオチドが、配列番号9と少なくとも95%同一であり、少なくとも1つのコドンが野生型に対して最適化されている、請求項1に記載の組成物。
- ヒトPSEN1をコードする前記ヒトコドン最適化ポリヌクレオチドが配列番号9を含む、請求項1に記載の組成物。
- エキソソームまたは脂質をベースとするナノ粒子(LNP)を伴う(例えば、これを使用して送達のために製剤化される)、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
- プロモーターに作動可能に連結している請求項1から3のいずれか一項に記載のヒトコドン最適化ポリヌクレオチドを含む、細胞においてヒトPSEN1を発現させるためのベクターを含む組成物。
- 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項5に記載の組成物。
- 前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項6に記載の組成物。
- 前記AAVベクターがAAV9またはAAVrh10である、請求項7に記載の組成物。
- 前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項6に記載の組成物。
- 前記プロモーターが汎神経プロモーターである、請求項5に記載の組成物。
- 前記汎神経プロモーターがシナプシンIプロモーターである、請求項10に記載の組成物。
- 前記プロモーターが神経細胞サブタイプ特異的プロモーターである、請求項5に記載の組成物。
- 前記神経細胞サブタイプ特異的プロモーターがアルファ-カルシウム/カルモジュリンキナーゼ2Aプロモーターである、請求項12に記載の組成物。
- 神経変性疾患、障害、または状態を治療するための方法であって、請求項1から13のいずれか一項に記載の組成物を、治療を必要とするヒト対象に投与するステップを含み、前記対象が、PSEN1の少なくとも1つのアレルにおける1つまたは複数の変異、好ましくは、ドミナントネガティブPSEN1タンパク質アイソフォームをコードする変異を有する、方法。
- 前記神経変性疾患、障害または状態が、アルツハイマー病である、請求項14に記載の方法。
- 前記アルツハイマー病が、家族性アルツハイマー病である、請求項15に記載の方法。
- 前記対象が、PSEN1遺伝子において、E280A、Y115H、L166P、C410Y、Δex9、G548、D257A、R278I、L435F、G384AもしくはL392V変異、またはPSEN1遺伝子において、N141I、G206A、H163R、A79V、S290C、A260P、A426P、A431E、R269H、L271V、C1410Y、E280G、P264L、E185D、L235VもしくはM146V変異を有する、請求項15または16に記載の方法。
- 前記アルツハイマー病が、孤発性アルツハイマー病である、請求項15に記載の方法。
- 前記アルツハイマー病が、遅発型または早期発症型アルツハイマー病である、請求項15に記載の方法。
- 前記神経変性疾患、障害または状態が、前頭側頭型認知症、記憶喪失、認知機能低下または認知機能障害である、請求項14に記載の方法。
- 前記認知機能障害が、軽度認知機能障害(MCI)である、請求項20に記載の方法。
- 前記組成物が、治療を必要とする前記対象のCNSに投与される、請求項14から20のいずれか一項に記載の方法。
- PSEN1および/もしくはPSEN2遺伝子またはmRNAをコードするポリヌクレオチドが、静脈内送達、くも膜下腔内送達、大槽内送達、脳室内送達、または特定の脳領域、任意選択で大槽、脳室、腰部髄腔内への定位的実質内注射、または海馬もしくは皮質野への直接注射によりCNSに投与される、請求項22に記載の方法。
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